JP2002505077A - 抗病原体システムおよびその使用方法 - Google Patents

抗病原体システムおよびその使用方法

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    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
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Abstract

(57)【要約】 本発明は形質導入ドメインと細胞障害性ドメインを含む１種以上の融合タンパク質を含んでなる抗病原体システムを提供する。細胞障害性ドメインは病原体の感染により特異的に活性化される。該抗病原体システムは異なる病原体の１種またはその組合わせに感染した細胞を効果的に殺滅または損傷する。さらに提供されるのは、形質導入効率の増強されたタンパク質形質導入ドメインである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【参照されるべき関連出願】
本出願は、１９９８年４月２０日出願の同時係属米国仮出願番号６０／０８２
，４０２の一部継続出願であり、また１９９７年１２月１０日出願の同時係属米
国仮出願番号６０／０６９，０１２の一部継続出願である。これら同時係属仮出
願の開示の全文は参照により本明細書に取込まれている。
【０００２】
【発明の背景】
１．発明の分野 本発明は、タンパク質形質導入ドメインと細胞障害性ドメインとを含んでなる
融合タンパク質を病原体感染細胞に導入することにより、該細胞を殺滅または損
傷する抗病原体システムに関する。該細胞障害性ドメインは、病原体の感染した
細胞中で特異的に活性化され得る。さらに提供されるのは、該融合タンパク質の
形質導入能力を増強する特定の形質導入ドメインである。本発明は１種またはそ
れ以上の病原性ウイルスまたはプラスモジウムが感染した細胞を殺滅または損傷
するなど多様な用途を有する。
【０００３】 ２．背景 多様な病原体が哺乳動物、とりわけヒトなどの霊長類に感染する。例えば、あ
る種のウイルス、細菌、カビ、酵母、蠕虫、プラスモジウム、および原虫類が認
知されたヒト病原体である。例えば、内科のハリソン原理（Harrison’s Princi
ples of Internal Medicine）、１２版、マックグロウ−ヒル、インク（１９９ １）参照。 病原体は多くの場合、形態学的特性を外部に表すメカニズムにより細胞を殺し
、または損傷する。例えば、アポトーシスまたは壊死を受ける病原体感染細胞は
、容易に同定し得る細胞の変化を示す。 アポトーシスに関わる細胞タンパク質および特に酵素についての理解は進歩し
つつある。例えば、カスパーゼ類（すなわち、システイニルアスパルテート特異
プロテアーゼ；cysteinyl aspartate−specific proteases）、シー・エレガン ス（C.elegans）ｃｅｄ−３およびグランザイムＢなどのある種細胞プロテアー ゼがアポトーシスに関係している。数種のカスパーゼおよびそれに対するタンパ
ク質分解性基質をエンコードする核酸配列が知られている。例えば、カスパーゼ
−３（すなわち、ＣＰＰ３２）は特によく研究されている。トンプソン（Thomps
on，C.B.）、Science、２６７：１４５６（１９９５）；およびウオーカー（Wal
ker,N．P．C．）ら、Cell、７８：３４３（１９９４）。
【０００４】 壊死に関与するタンパク質を同定する試みも関連性がある。例えば、壊死はあ
る種のＤＮＡウイルス、例えば、ヘルペスウイルスなどの発現に続くと考えられ
ている。
【０００５】 病原体は多くの場合、ある種のタンパク質、特にプロテアーゼなどの酵素の合
成を誘発する。殆どすべての病原体が生産的感染を遂行するために１種またはそ
れ以上の特異プロテアーゼを必要とするように思われる。例えば、以下に例示す
るヒト病原体は少なくとも１つの病原体特異プロテアーゼの発現を必要とする；
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス、例えば、タイプ−１
（ＨＳＶ−１）、肝炎ウイルス、例えば、Ｃ型（ＨＣＶ）、ある種のプラスモジ
ウム、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）、ヒト免疫不全ウイルスタ
イプ１（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡ
Ｖともいう）、ヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２）、カポジ肉腫関連
ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶまたはヒトヘルペスウイルス８）、黄熱病ウイルス
、ある種フラビウイルス、およびライノウイルスである。
【０００６】 ある場合には、プロテアーゼは病原体それ自体によってエンコードされる。こ
のような場合には、プロテアーゼは多くの場合病原体特異プロテアーゼといわれ
る。例えば、ＣＭＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＫＳＨＶ、および熱帯
熱マラリア原虫は病原体特異プロテアーゼをエンコードする病原体の代表である
。これらのプロテアーゼは多様な機能を発揮し、生産的感染のためにまず絶対的
に必要とされる。
【０００７】 特定の病原体特異プロテアーゼ、例えば、ＨＣＶがエンコードするセリン型プ
ロティナーゼ、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）がエンコードするアスパラ
ギン酸プロテアーゼ（すなわち、プラスメプシンＩおよびＩＩ）、およびＨＳＶ
−１がエンコードする成熟プロテアーゼなどについては分析努力が払われている
。ディランニイ（Dilanni, C.L.）ら、J. Biol. Chem.、２６８：２０４８（１ ９９３）；およびフランシス（Francis, S.E.）ら、EMBOJ.、１３：３０６（１ ９９４）参照。 それに対し、ある種の宿主細胞プロテアーゼの誘発可能な発現は、他の病原体
による生産的感染を調節すると信じられる。これらの宿主細胞プロテアーゼは時
として誘発可能な宿主細胞プロテアーゼといわれる。例えば、ある種植物などの
真核細胞の細菌感染は、正常に静止状態にある宿主細胞プロテアーゼの発現を誘
導することができる。宿主細胞プロテアーゼの誘導は病原体を損傷するための試
行であり、それによって宿主細胞を感染から防御する。
【０００８】 ＨＩＶウイルスによる感染は多くの注目を集めている。現在、略全世界で一致
していることは、これらヒト族のレトロウイルスが後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）および関連疾病の病因作用因子であるということである。殆どすべてのＨ
ＩＶウイルスによる生産的感染はある種のＨＩＶ特異プロテアーゼの発現を必要
とする。例えば、バー−シヌーシー（Barre−Sinoussi）ら、Science、２２０：
８６８〜８７１（１９８３）；ガロ（Gallo）ら、Science、２２４：５００〜５
０３（１９８４）。 ＨＩＶ感染などの病原体感染を標的とする治療薬の開発は進行しつつある。一
般的な方法の一つは病原体感染の明瞭な段階を中断させることに絞られている。
特に、治療薬はある種のＨＩＶ特異酵素、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）および病
原体特異プロテアーゼなどを除去するために開発されている。 他の薬品、例えば、ある種サイトカインはＣＭＶおよびＨＳＶ感染を治療する
試行に使用されている。
【０００９】 病原体感染を治療する他の提案された方法は、「細胞内免疫化」といわれる方
法に関する。簡単に説明すると、この方法は、宿主細胞が生産的感染を維持し得
ないようにする試行において、宿主細胞を遺伝子的に修飾することである。例え
ば、ある種真核細胞はこの方法を用いて病原体感染に対し免疫することが可能で
あると示唆されている。例えば、ボルチモア（Baltimore）、Nature、３３５： ７３９５（１９８８）；ハリソン（Harrison）ら、Human Gene Therapy、３：４
６１（１９９２）；および米国特許５，５５４，５２８（ハリソンら）参照。 遺伝子修飾のより特異的な形態は、細胞毒をエンコードする遺伝子構築物の投
与を伴うと報告されている。この場合、該構築物は遺伝子が一度細胞内に入ると
細胞毒を発現し得るように設計する。
【００１０】 しかし、病原体感染を治療するこれまでの方法にはいくつかの制限がある。 例えば、細胞を殺すために細胞毒を使用する方法は、常に成功するとは限らな
い。一つの解釈は多くの細胞内細胞毒について報告されている多面的効果に関係
しているのかもしれない。これらの効果は多くの場合、細胞殺滅の分析を複雑な
ものとする。さらに、細胞毒をエンコードする多くの遺伝子構築物は、宿主細胞
内で不所望の高い基本活性を示す。これらの問題は、感染および非感染細胞の死
に導く、「漏出」細胞毒発現として知られるものを生み出す。
【００１１】 病原体感染を治療するための他の方法もまた問題をもっている。例えば、薬物
の使用による方法は完全に有効なわけではない。より詳しくは、攻撃的なあるい
はしつこい病原体に感染した被験者は、多くの場合、長期の治療介入を必要とし
、時には数ヶ月または数年にも及ぶことがある。薬物耐性病原体の増殖が次第に
問題化している。このように、この方法の長期的評価には議論がある。
【００１２】 特に、今日のＨＩＶ治療ではＨＩＶプロテアーゼを標的とする小型の阻害分子
を利用する。しかし、抵抗性のＨＩＶ株の出現が次第に問題化している。例えば
、コフィン（Coffin, J.M.）ら、Retroviruses、コールド・スプリング・ハーバ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９９７）；カ
プラン（Kaplan, A.H.）ら、ウイルスプロテアーゼの阻害剤に対し感受性を低下
させたウイルスプロテアーゼをエンコードする多発性ヒト免疫不全ウイルスタイ
プ１変異体の選択、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：５５９７（１９９４） ；コンドラ（Condra, J.H.）ら、多重プロテアーゼ阻害剤に抵抗するＨＩＶ−１
変異体の生体内出現、Nature ３７４：５６９（１９９５）；グルニック（Gulni
k, S.V.）ら、薬物圧下に選択されるＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異体の動態 特性と交差耐性パターン、Biochemistry ３４：９２８２（１９９５）；および チスデール（Tisdale, M.）ら、５種の異なるプロテアーゼ阻害剤に対する抵抗 性について個々に選択したヒト免疫不全ウイルスタイプ１変異体の交差耐性分析
、Antimicrob. Agents Chemother. ３９：１７０４（１９９５）。
【００１３】 レトロウイルスＴＡＴタンパク質は、ある種の治療設定に用途を見出す可能性
があるとの認識がある。ＴＡＴはある種のＨＩＶ遺伝子をトランス活性化すると
の報告があり、殆どのヒトＨＩＶレトロウイルスによる生産的感染にとって必須
であると信じられている。ＴＡＴタンパク質はある型の融合タンパク質を細胞内
に持込むのに使用されている。この過程は一般に形質導入と言われる。米国特許
５，６５２，１２２（フランケル（Frankel）ら）、およびチェン（Chen, L.L. ）ら、Anal. Biochem.、 ２２７：１６８（１９９５）参照。
【００１４】 しかし、融合タンパク質を細胞に形質導入するのにＴＡＴを使用することは、
重要な欠陥と関係することでもある。 例えば、融合タンパク質の適切なレベルを細胞内に維持するのは困難であった
。この問題を克服する試みは、大量の融合タンパク質を投与して、適切な細胞内
レベルを維持する助けとすることであった。大量の融合タンパク質を投与する必
要性は、ある種治療用融合タンパク質の広範な使用を阻みまたは妨げる。例えば
、大量のあるＴＡＴ融合タンパク質を使用すると、ある種の宿主細胞の生存能力
にマイナスの影響を与える。
【００１５】 さらに、これまでの形質導入する融合タンパク質の多くは、治療上適切なコン
ホメーションを維持するのが困難であった。実例として、多くのこれまでのＴＡ
Ｔ融合タンパク質は形質導入に際し、部分的にまたは完全にほぐれると信じられ
ている。この変性は多くの場合、形質導入を有意に減少させる、あるいは除去す
る潜在性を有する。 さらに、これまでの形質導入融合タンパク質を正しく折りたたむことの必要性
は、該タンパク質の精製および保存努力を複雑なものとしてきた。
【００１６】 さらなる欠点は、ＴＡＴまたはある種のＴＡＴフラグメントに融合したタンパ
ク質と関連すると報告されている。これらの欠点は、ＴＡＴが如何に細胞内で作
用すると信じられているかに関係する。さらに詳しくは、ＴＡＴまたはＴＡＴフ
ラグメントが融合タンパク質に対してある種の生物学的特性を付与している可能
性があるとの認識がある。これら特性の一部、特に核局在化およびＲＮＡの結合
は常に望ましいとは限らない。特に、多くのＴＡＴ融合タンパク質は核外に、あ
るいはＲＮＡから離して位置させることが難しいという懸念があった。例えば、
ダン（Dang）ら、J. Biol. Chem.、２６４：１８１０９（１９８９）；ＴＡＴ−
関連性質の考察については、カルナン（Calnan，B.J.）ら、Genes Dev.、５：２
０１（１９９１）参照。 高い形質導入効率を示し、病原体感染細胞に特異的に細胞毒を送達し得る抗病
原体システムを保有することが望ましい。さらに望まれることは、病原体感染細
胞により活性化され得る本質的に不活性な分子として該細胞毒を送達し得る抗病
原体システムを保有することである。
【００１７】
【発明の要約】
本発明は高い形質導入効率を示し、１種以上の病原体が感染した細胞を特異的
に殺滅または損傷する抗病原体システムに関する。一般に、該抗病原体システム
は形質導入ドメインおよび細胞障害性ドメインを含んでなり、枠内融合分子とし
て遺伝子的に、したがって共有結合によりともに結合している融合分子を含んで
いる。さらに、本発明は融合分子の形質導入効率を上昇させる形質導入ドメイン
に関する。該抗病原体システムは非感染細胞中では本質的に不活性であるが、病
原体が感染した細胞内では特異的に活性化される。さらに提供されることは、病
原体による感染、特にある種のウイルスおよびプラスモジウムなどのヒト病原体
による感染を治療するための該抗病原体システムの使用方法である。
【００１８】 該抗病原体システムの好適な使用は、病原体感染が少なくとも１種の病原体特
異プロテアーゼを誘導することを必然的に伴う。好ましいことに、このプロテア
ーゼは標的とするアミノ酸配列を特異的に切断することができる。標的とするア
ミノ酸配列は融合分子の１成分であり、本明細書では場合によりこれをプロテア
ーゼ認識または切断部位という。プロテアーゼ認識部位の特異的切断は、融合分
子を、一般に細胞障害性ドメインで、あるいはその近傍で切断して細胞毒を形成
する。そのように形成された細胞毒は、病原体が感染した細胞を特異的に殺滅ま
たは損傷することができる。
【００１９】 重要なことは、本抗病原体システムが、細胞毒の形成を病原体誘導プロテアー
ゼの存在につなぎ、それによって細胞障害作用を感染細胞に高度に集中させるこ
とである。細胞毒の形成は、非感染細胞および病原体が不活性である感染細胞で
は最少であるか除外されている。したがって、該抗病原体システムは、生産的に
感染した細胞と非感染細胞との間で有効に特異的に識別することができる。
【００２０】 本抗病原体システムは多くの重要な利点を有する。例えば、病原体の血清型の
変化に対応して容易に操作することができる。すなわち、本抗病原体システムが
１種以上の病原株に感染した細胞を殺す、または損傷するために特異的に適合さ
せ得るということである。これに対し、これまでの感染阻止方法、とりわけ薬物
ベースの方法は病原体血清型の変化に対応して通常設計されていない。この欠陥
は多くの場合、薬物耐性病原株の増殖を制御し得ないものとする。以下の考察か
らより明らかとなるように、該抗病原体システムは１種以上の病原体誘発プロテ
アーゼの産生を利用する能力を有し、病原体血清型に感染した細胞を殺滅または
損傷する。顕著な違いは、殆どのこれまでの薬物ベースの方法では、例えば、病
原体遺伝子産物の活性を阻止することにより、病原性経路を阻害することばかり
試行している。本抗病原体システムはより柔軟性に富み、感染した細胞を細胞毒
に特異的に露呈することで病原株の出現を減少させるか、あるいはさらに除去す
るのに用いることができる。
【００２１】 本発明の柔軟性の一例として、該抗病原体システムはＨＩＶ血清型の出現に対
して特に有用である。例えば、ＨＩＶに感染した多くの患者は数種のウイルス株
を表出する。常套の薬物ベース療法では、通常、ＲＴまたはＨＩＶプロテアーゼ
などのＨＩＶ酵素活性を阻止しようとする。かかる治療の臨床結果は、多くの場
合、ＨＩＶ血清型スペクトルの出現である。ＨＩＶ血清型は、該治療に対し部分
的またはさらに完全に耐性を進展させ得ることが認められる。さらにいわゆる「
カクテル」療法といわれる複数の抗ＨＩＶ剤を使用する療法には問題がある。そ
れに対し、本発明の抗病原体システムは非常に柔軟性に富み、ＨＩＶプロテアー
ゼを使用することによりＨＩＶ血清型を産生する細胞を殺滅または損傷するのに
適合させることができる。重要なことは、該抗病原体システムは、これらＨＩＶ
プロテアーゼ活性の増大または該システムの活性化が増強された感染細胞数の増
大に対処するように形成される。
【００２２】 本抗病原体システムの柔軟性は、一部、ほぼどのような数のＨＩＶ血清型が感
染した細胞でも殺滅または損傷するように仕上げることができるという理由で生
じるものである。このように、本発明によると、特定の患者において１種または
それ以上のＨＩＶ株を撲滅する抗病原体システムを形成することが可能である。
この特徴はいくつもの観点で非常に有用である。例えば、一人の患者において、
潜在的に有害なまたは無効な薬物に頼ることなしに、ＨＩＶ感染と闘う特異的な
方法を提供する。重要なことは、該抗病原体システムがナノモル以下の用量で有
効であるように形成することができる。この抗ウイルス活性の低レベルは多くの
現存薬物ベース療法よりも有意に低い。本発明のこの特徴は該抗病原体システム
に対する患者の寛容にプラスの衝撃を与える。
【００２３】 さらに、本抗病原体システムは、認知された抗ＨＩＶ療法、例えば、感染細胞
を殺すまたは損傷する「カクテル」方式（すなわち、抗ＨＩＶ薬物の併用）を用
いる療法と十分に両立する。 本発明の特定の態様において、該抗病原体システムは、ウイルス産生のＨＩＶ
プロテアーゼを活用することにより、ＨＩＶ血清型の出現を減少させるまたは除
去するため採用される。ＨＩＶ感染細胞を殺す例示となる融合タンパク質は、下
記実施例１１および１２に示す。
【００２４】 さらに、本抗病原体システムは予想外に大型の融合分子を細胞内に形質導入す
ることができる。とりわけ、該抗病原体システムは誤って折りたたまれた（すな
わち、部分的にまたは完全にほぐれた）融合分子を適応させ、これらの分子が細
胞内に効率的に形質導入されるようにする。とりわけ、該抗病原体システムは、
分子量が約１ないし約５００ｋＤａまたはそれ以上の範囲の誤って折りたたまれ
た融合分子と両立し得ると信じられる。したがって、該抗病原体システムは、広
大なスペクトルの融合分子を細胞内に形質導入するのに広く適用することができ
る。
【００２５】 さらに詳しくは、誤って折りたたまれた融合分子を形質導入する能力は、これ
までの形質導入方法を越えた本質的な利点を有する。例えば、本発明に従い使用
される誤って折りたたまれた融合タンパク質は、時には約１０倍またはそれ以上
にまで形質導入効率を有意に上昇させることが判明した。さらに、融合タンパク
質をミスフォールディングする（誤って折りたたむ）ことにより、細胞内部の融
合分子の量を最適化し得ることも判明した。融合分子の調製と保存もまたミスフ
ォールディングによりプラスの影響を与えられる。
【００２６】 考察したように、該抗病原体システムは柔軟性に富む。例えば、病原体が少な
くとも１種の特定プロテアーゼをその細胞内に誘導し得るものであれば、該シス
テムは特定型の病原体または細胞に限定されるものではない。該プロテアーゼは
病原体誘導性または宿主細胞誘導性プロテアーゼであってもよいが、感染に応答
して特異的に誘導される（すなわち、合成または活性化される）ものである。し
かし、特定されたプロテアーゼは融合分子上のプロテアーゼ認識部位を切断して
細胞毒を活性化することができなければならない。
【００２７】 本抗病原体システムおよびそれを使用する方法は生体外または生体内で使用す
ることができる。さらに、融合分子成分の順序または数は、分子上の各成分が操
作可能に結合していて、かつ、意図した特定の機能を遂行し得る限り、重要では
ない。
【００２８】 該抗病原体システムが産生する細胞毒は、好ましくは、１種以上の細胞プロテ
アーゼおよび通常は病原体−または宿主細胞誘導プロテアーゼの存在下に、感染
細胞を殺滅または損傷するように選択する。好ましくは、該細胞毒は、標準の細
胞生存度試験によりアッセイしたときに、細胞の少なくとも約２０％、２５％、
５０％、７５％、８０％または９０％を殺し、また、好ましくは病原体に感染し
た細胞の約９５％、９８％または１００％まで殺すことが可能である。好適な生
存度試験は標準トリパンブルー排除アッセイ法であるが、他のアッセイ法も必要
により使用してもよい。細胞障害活性はそれを産生する細胞に限定するのが好ま
しい。
【００２９】 すでに言及したように、本抗病原体システムは枠内融合分子を含んでいる。該
融合は常套の組換え核酸法により達成することができる。所望により、該融合は
下記の常套法に従い、形質導入タンパク質を細胞障害性ドメインに化学的に結合
することにより達成することもできる。 一般に、融合分子の形質導入ドメインは、融合分子の形質導入において形質導
入し得るか、または介助となり得る殆どすべての合成もしくは天然産アミノ酸配
列である。例えば、形質導入は、融合分子に共有結合により結合しているタンパ
ク質配列、特にＨＩＶ ＴＡＴタンパク質またはそのフラグメントを使用するこ とにより、本発明に従い達成することができる。あるいは、該形質導入化タンパ
ク質はアンテナペディア・ホメオドメイン（Antennapedia homeodomain）または
ＨＳＶ ＶＰ２２配列、または当該分野で既知の適切なその形質導入化フラグメ ントであってもよい。
【００３０】 形質導入化アミノ酸配列のタイプとサイズは、所望の形質導入の範囲を含め、
いくつかのパラメーターにより導かれる。好適な配列は対象とする細胞の少なく
とも約２０％、２５％、５０％、７５％、８０％または９０％、より好ましくは
、細胞の少なくとも約９５％、９８％および１００％までを形質導入し得るもの
である。形質導入の効率は、一般に形質導入した細胞の百分比で表すが、いくつ
かの常套方法、例えば、下記の特異顕微鏡的方法により定量し得る（例えば、フ
ロー・サイトメトリー分析）。 さらに好ましい形質導入配列は、細胞内の融合分子の少なくともピコモル量で
有利な細胞の侵入と放出の率（場合により、それぞれｋ１およびｋ２という）を
明らかにする。アミノ酸配列の侵入と放出の率は、検出可能な標識融合分子を用
いる標準動態分析により容易に定量し得るか、または少なくとも近似させ得る。
一般に、侵入率と放出率の比は約５〜約１００の間から約１０００までの範囲に
ある。
【００３１】 特に、形質導入アミノ酸配列は実質的にαらせん性を特徴とする少なくとも１
つのペプチドを含む。形質導入は、形質導入化アミノ酸配列が有意なαらせん性
をもつときに最適化されることが見出された。また、好適なのは、これらの配列
が該ペプチドの少なくとも一面にそって実質的に配列されている塩基性アミノ酸
残基を有する場合である。一般にかかる好適な形質導入配列は合成タンパク質ま
たはペプチド配列である。 さらに好適な形質導入アミノ酸配列は、クラスＩ形質導入化ドメインまたは同
様の名称のものであり、堅固なαヘリックス構造であって、ヘリックスシリンダ
ーの下方にわずかにアルギニン（Ａｒｇ）残基を有する。 一態様において、クラスＩ形質導入ドメインは、下記一般式により示されるペ
プチドである： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｂ３ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なって塩基性
アミノ酸である；そして、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立に
同一または異なってαヘリックス増強アミノ酸である。 他の態様において、クラスＩ形質導入化ペプチドは下記一般式により示される
： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｂ３ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なって塩基性
アミノ酸である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立に同一また
は異なってαヘリックス増強アミノ酸である。
【００３２】 さらに好適な形質導入化ペプチドは、「クラスＩＩ」ドメインまたは同様の名
称のものとして本明細書でしばしば言及する。これらのドメインは一般に塩基性
残基、例えば、リジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）、好ましくはアル
ギニン（Ａｒｇ）を必要とし、そしてさらに該ドメインに「屈曲」を導入するの
に十分な少なくとも１個のプロリン（Ｐｒｏ）残基を含む。 一態様において、クラスIＩドメインは、下記一般式により示されるペプチド である： Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−（Ｐ／Ｘ）−（Ｂ／Ｘ）−Ｂ−（Ｐ／Ｘ）−Ｘ−Ｂ−（Ｂ／Ｘ
） ただし、式中Ｘはαヘリックス促進残基、好ましくはアラニンである；Ｐ／Ｘは
プロリンまたは前記定義のＸのいずれかである；Ｂは塩基性アミノ酸残基、例え
ば、アルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）、好ましくはアルギニン（Ａ
ｒｇ）である；Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）であり、そしてＢ／ＸはＢまたは前記
定義のＸのいずれかである。
【００３３】 本発明によるさらなる形質導入化配列は、ＴＡＴの少なくとも４９〜５６アミ
ノ酸ないしＴＡＴの全長配列を含んでなるＴＡＴフラグメントを含む。好適なＴ
ＡＴフラグメントはそのフラグメントのαらせん性を増大させるに十分な１個ま
たはそれ以上のアミノ酸の変化を含む。殆どの事例で、導入されるアミノ酸の変
化は、認知されたαヘリックス増強アミノ酸を加えることからなる。あるいは、
アミノ酸の変化はＴＡＴフラグメントからαヘリックスの形成または安定性を妨
害する１個以上のアミノ酸を取除くことである。さらに特定の態様において、Ｔ
ＡＴフラグメントは、少なくとも１個のアミノ酸をαヘリックス増強アミノ酸と
置換したものを含む。好ましくは、ＴＡＴフラグメントは標準的なペプチド合成
技法により調製し得るが、ある場合には組換えＤＮＡ法が好ましい。
【００３４】 本発明のさらなる形質導入タンパク質はＴＡＴフラグメントを包含し、その場
合、ＴＡＴ４９〜５６配列は、該配列の少なくとも２つの塩基性アミノ酸がＴＡ
Ｔフラグメント、好ましくはＴＡＴ４９〜５６配列の少なくとも一面に沿って実
質的に配列されるように修飾してある。一態様において、この整列はＴＡＴ４９
〜５６配列に対して少なくとも１個の特定アミノ酸を付加するかまたは置換する
ことにより達成される。実例としてのＴＡＴフラグメントは少なくともＴＡＴの
アミノ酸４９〜５６に少なくとも１個の特定アミノ酸を置換することからなり、
その置換は該４９〜５６配列の塩基性アミノ酸残基を、該セグメント、好ましく
はＴＡＴ４９〜５６配列の少なくとも一面に沿って配列する。
【００３５】 本発明によるさらなる形質導入タンパク質はＴＡＴフラグメントを含み、その
場合ＴＡＴ４９〜５６配列はαヘリックス増強アミノ酸による少なくとも１つの
置換を含む。一態様において、該置換は、ＴＡＴフラグメントの少なくとも２つ
の塩基性アミノ酸残基が該ＴＡＴフラグメントの少なくとも一面に沿って実質的
に配列されるように選択する。より特定した態様において、該置換は、ＴＡＴ４
９〜５６配列の少なくとも２つの塩基性アミノ酸残基が該配列の少なくとも一面
に沿って実質的に配列されるように選定する。
【００３６】 さらに提供されるのは、少なくとも２つの異なる形質導入化タンパク質の一部
を含むキメラ形質導入化タンパク質である。例えば、キメラ形質導入化タンパク
質は２つの異なるＴＡＴフラグメント、例えば、一方はＨＩＶ−１からのもの、
他方はＨＩＶ−２からのものを融合することにより形成させることができる。あ
るいは、他の形質導入化タンパク質は所望の形質導入化タンパク質を非相同アミ
ノ酸配列、例えば、６ＸＨｉｓ（場合により「ＨＩＳ」という）、ＥＥ、ＨＡま
たはＭｙｃなどに融合することにより形成させることができる。
【００３７】 上に言及したように、本発明の融合分子はまた、融合した細胞障害性ドメイン
を含む。一般に、該細胞障害性ドメインは潜在的に毒性の分子と１個以上の特定
プロテアーゼ開裂部位を含む。「潜在的に毒性の」という用語は、該分子が細胞
障害性ドメインの一部として存在する場合、感染または非感染細胞に対し有意に
細胞障害性ではない（標準的細胞生存度試験によりアッセイした場合に、細胞の
致死率が、好ましくは、約３０％、２０％、１０％、５％、３％または２％以下
である。より好ましくは細胞の致死率が１％以下である）ということを意味する
。上に言及したように、該プロテアーゼ開裂部位は、病原体感染により誘導され
る１種またはそれ以上のプロテアーゼにより特異的に切断される得る。
【００３８】 とりわけ、該プロテアーゼ切断部位は、非感染細胞では実質的に未切断のまま
となるように選択し、それによって細胞障害性ドメインを不活性状態に維持する
。これらのプロテアーゼ切断部位は、病原体が不活性な細胞でも実質的に未切断
のままとなるように選択するとよい。しかし、特異病原体誘導または宿主細胞誘
導プロテアーゼの存在下では、該プロテアーゼ切断部位が特異的に切断され、潜
在的に毒性の分子から細胞毒を生成する。すなわち、該プロテアーゼ部位の切断
は融合分子から細胞障害性ドメインを放出し、それによって活性な細胞毒を形成
する。１つまたはそれ以上のプロテアーゼ切断部位は一般に細胞障害性ドメイン
に位置しており、融合タンパク質からのドメインの全部または一部の放出を最適
化し、細胞毒の形成を増強する。
【００３９】 より好適なプロテアーゼ切断部位は、非感染細胞と正常に会合したプロテアー
ゼにより切断されないように選択する。これらのプロテアーゼは一般に「ハウス
キーピング」プロテアーゼといわれており、よく知られている。 プロテアーゼ切断部位は、本明細書において場合により「病原特異」切断部位
ともいい、病原体感染により誘導される１種以上のプロテアーゼにより特異的に
切断される許容能力を意味する。該プロテアーゼ切断部位は、それら部位の切断
が融合分子から細胞障害性ドメインを放出する限り、病原体（または１種を超え
る病原体）に「応答」し、それによって細胞毒を活性化する。
【００４０】 細胞障害性ドメインは、もしそれが考察したように融合分子から放出され得る
ならば、一種以上の多様な潜在的に毒性の分子を含む。融合分子に使用する細胞
障害性ドメインの一例は未成熟酵素である。これら未成熟酵素は場合によりチモ
ーゲン、プロ酵素、プレプロ酵素または単により成熟した酵素の「プレ−」「プ
レ−プロ」または「プロ−」型という。好適なチモーゲンは、該チモーゲン上で
１種以上の天然産プロテアーゼ切断部位において、部位特異的タンパク質分解に
より、細胞毒（すなわち、細胞障害性酵素）に特異的に活性化される。チモーゲ
ンは自己タンパク質分解により、ある例ではさらに加工処理され得る。
【００４１】 特に、好適なチモーゲンを含む細胞障害性ドメインは１つ以上の特定のプロテ
アーゼ切断部位を含み、それがチモーゲン内および／またはその周辺に加わって
いる。該切断部位は任意に位置して、チモーゲンの放出と成熟した、またはより
成熟した細胞障害性酵素への処理加工を容易にしている。 とりわけ、チモーゲンにプロテアーゼ切断部位が加わることは、当のチモーゲ
ンにおいて天然産プロテアーゼ切断部位に関して補充的である。しかし、該切断
部位が１つ以上の天然産切断部位と置換わることは好ましいことである。この態
様において、チモーゲンの置換されたプロテアーゼ切断部位は１種以上の病原体
特異プロテアーゼにより特異的に切断され得る。チモーゲンの天然産プロテアー
ゼ切断部位を部分的にまたは完全に１つ以上の病原体応答切断部位と置換するこ
とにより、チモーゲンの細胞毒への成熟は病原体感染による実質的または完全な
制御下に置かれる。
【００４２】 多様な特異チモーゲンは下記考察のように細胞障害性ドメインへの封入に適し
ている。これらチモーゲンの活性型は、一般に、細菌毒素、特に外毒素、植物毒
素、および無脊椎動物毒素、例えば、コノトキシン、蛇毒およびクモ毒を包含す
る。
【００４３】 さらに考慮すべき細胞障害性ドメインは、遺伝的に優性の特性を及ぼす潜在能
力保有の既知タンパク質を包含する。すなわち、該タンパク質は融合タンパク質
から特異的に切断され、次いで、細胞複製などの１種以上の細胞機能を無効とす
る。この態様において、潜在的に優性のタンパク質は、当該タンパク質が融合タ
ンパク質から放出されるまで、優性な特性（場合により優性は表現型として知ら
れる）を表明しないにちがいない。本発明による潜在的に優性なタンパク質の例
は、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）、ｐ１６およびｐ５３などの細胞複製を阻
害するタンパク質を包含する。
【００４４】 さらに考慮すべき細胞障害性ドメインは、ある種のヌクレオシドまたはその類
似体を細胞毒に変換する許容能力を有する実質的に不活性な酵素を含む。この態
様において、細胞障害性ドメインは１つ以上の特定プロテアーゼ切断部位を含み
、それが好適に位置づけられていて、融合タンパク質から不活性酵素を放出する
。この放出に続いて、該酵素は該ヌクレオシドまたはその類似体を細胞毒に変換
する。かかる酵素の例は、ウイルスチミジンキナーゼおよびヌクレオシドデアミ
ナーゼ、例えば、シトシンデアミナーゼなどを含む。また考慮すべきは、酵素の
触媒活性フラグメント、例えば、当該分野で一般に知られた酵素のフラグメント
を含んでなる細胞障害性ドメインである。
【００４５】 本抗病原体システムは多くのさらなる重要な利点を提供する。例えば、該抗病
原体システムは予期に反して誤って折りたたまれた融合タンパク質をも適応させ
る。以下の考察と実施例からさらに明確となるように、その特徴は細胞内部で融
合タンパク質のレベルを実質的に高めることで見出された。一般に、対応して投
与する融合タンパク質の量を増加する必要はない。理論に結びつける積もりはな
いが、誤って折りたたまれた融合分子の形質導入には、適度の数の分子が必要で
あり、有効な細胞障害性効果を表出するためには、その内のわずかな部分が再生
される必要がある。例えば、下記実施例５〜６に示したようなある種の好適な融
合タンパク質では、約１０〜１００個の正しく再生された融合タンパク質のみが
感染細胞を殺滅または損傷するために必要とされる。このように、本発明は、有
意な抗病原体活性を達成するために、細胞内部の大量の細胞障害性分子を濃縮さ
せる必要性を減じあるいは不要なものとさえすることができる。
【００４６】 さらに、本抗病原体システムの活性は多くの事例で質量作用により増強される
ことが判明した。さらに詳しくは、細胞障害性ドメインの特異切断は追加の融合
分子を感染細胞内に引き入れることができることを見出した。この特徴は、最適
以下の用量で好適に投与される細胞障害性ドメインを含むこれらの融合タンパク
質にとって特に有利である。かかる事例において、融合タンパク質は特異的に感
染細胞内に濃縮され、それによって細胞毒のレベルを致死レベルまたは略致死レ
ベルにまで上昇させる。重要なのは、細胞毒が非感染細胞において最適以下のレ
ベルのままにあることである。
【００４７】 本発明の特定の融合タンパク質に関して提供されるなおさらなる利点は、該タ
ンパク質が上記のＴＡＴフラグメントを含んでいることである。例えば、ＴＡＴ
フラグメントに融合したタンパク質の細胞障害性ドメインは、細胞核またはＲＮ
Ａに向いている必要がない。さらに詳しくは、本融合分子は感染細胞内部のＴＡ
Ｔフラグメントから細胞障害性ドメインを分離するように形状化されており、そ
れによって核内またはＲＮＡでのタンパク質の不要な濃縮を避けている。非感染
細胞では、かかる融合タンパク質が核またはＲＮＡに向けられている可能性があ
ると認識される。このように、感染細胞および非感染細胞における融合タンパク
質の差異のある局在化が、かかる細胞を互いに識別する手段、例えば、精査によ
る手段を提供する。
【００４８】 本発明の抗病原体システムは、ある種薬物ベースの抗病原体療法にプラスの影
響をも与える。さらに詳しくは、レトロウイルス、特にＨＩＶに感染した細胞は
長期間、時には数ヶ月ないし数年もの間、感染性粒子を留め置くことができる。
この期間、レトロウイルスは、時には１つまたはほんの僅かのゲノム配列を変化
させることによって、殆どの薬物に対し実質的な耐性を発達させることができる
。一旦、レトロウイルスが１つのクラスの薬物に対し耐性になると、かかるウイ
ルスはそのスペクトルの薬物にも耐性となる。このように、薬物ベースの方法を
使用する治療法は一般に柔軟性を欠き、耐性ウイルスの存在に対しては容易に適
合しない。関連した重要な問題が、ある種プラスモジウムなど、他の耐性病原株
の発達に関して起こっている。
【００４９】 それに対し、本抗病原体システムは、薬物耐性を獲得する病原体の許容能力に
関係なく、病原体に感染した細胞を殺し、または損傷する。薬物耐性病原体、特
に薬物耐性ＨＩＶ株の生育は、本抗病原体システムによると、このシステムが備
える多数のプロテアーゼ切断部位のために、殆ど不可能であると信じられる。例
示として、ＨＩＶウイルスは約８〜１０個のかかる切断部位をもつと報告されて
いる。該抗病原体システムに対し実質的な耐性を発達させるためには、このシス
テムがこれら部位１つまたはそれ以上を含んでいるので、当該ウイルスはこれら
の切断部位ならびに対応するウイルスプロテアーゼを改変しなければならない。 したがって、本抗病原体システムを使用することによって、多くの病原性耐性
株、特にある種薬物耐性のＨＩＶ株の存在を有意に減少させる、あるいはさらに
除去することが期待される。
【００５０】 さらに、本発明の抗病原体システムは様々な薬物ベースの治療と両立し得る。
このように、該抗病原体システムは単独の活性剤として使用し、あるいは１種以
上の治療薬と併用し、例えば、病原体、特に薬物耐性病原性株を最少化または除
去することができる。 さらに提供されるのは、実質的に純粋な本発明の融合分子である。
【００５１】 本発明はまた、該融合タンパク質をエンコードする核酸、特に自己複製ＤＮＡ
ベクターとして構成された染色体外ＤＮＡ配列を提供する。 本発明はまた、哺乳動物、特にヒトなどの霊長類における１種またはそれ以上
の病原体による感染を抑制または除去する方法を提供する。より詳しくは、該方
法は治療有効量の本抗病原体システムを投与することからなる。さらに、該方法
は１種以上の病原体に罹患しているか、または罹患し易い哺乳動物の治療を含む
。 １種またはそれ以上の病原体による感染を抑制または除去するための本発明に
よる好適な方法は、該抗病原体システムをエアロゾルとして提供し、該システム
を、例えば、鼻腔または経口経路経由で投与することからなる。特に考慮すべき
ことは、該抗病原体システムを肺組織に投与し、肺上皮との接触を容易にし、か
つ血流への移行を高めるように特に設計した投与方式である。
【００５２】 さらに提供されるのは、所定母集団の細胞にアポトーシスを誘導する方法であ
って、該方法は霊長類などの哺乳動物に、治療上十分量の抗病原体システムを１
種以上の病原体の存在下に投与することからなる。 １種以上の病原体に感染した細胞は、培養物中に維持された細胞、例えば、不
死化細胞系または細胞もしくは組織の一次培養物であってもよい；または該細胞
は生体内の組織または器官（例えば、肺）の一部であってもよい。このように、
本抗病原体システムは必要により生体外および生体内で使用することができる。
【００５３】 本発明はまた、上記の形質導入ドメインおよび細胞障害性ドメインに加えて、
必要により他の成分をも含むことのできる実質的に純粋な融合分子、特に融合タ
ンパク質を提供する。これらの成分は共有結合によりまたは非共有結合によりそ
こに結合し、特に１個以上のポリペプチド配列を含む。付加したポリペプチド配
列は場合により本明細書においてはタンパク質の精製または同定「タグ」という
。かかるタグの例はＥＥ、６Ｘｈｉｓ、ＨＡおよびＭＹＣである。
【００５４】 考察したように、本明細書に記載した融合タンパク質は誤って折りたたまれた
形状で提供されるのが好ましいが、ある事例では適切に折りたたまれた融合タン
パク質を使用するのが望ましい。誤って折りたたまれた融合タンパク質は一般に
クロマトグラフ法で精製されるが、要すれば、所望の融合分子を、本来それを含
む細胞成分から精製するように仕上げておくことができる。一般に、この方法は
適切な宿主細胞からの封入体の単離、誤って折りたたまれた融合タンパク質の変
性、および融合分子を精製する通常のクロマトグラフ法の使用からなる。封入体
において誤って折りたたまれた融合タンパク質を発現することは、誤って折りた
たまれた融合タンパク質を宿主細胞プロテアーゼによる分解から防御するなど、
いくつかの利点をもつ。さらに、融合タンパク質を誤って折りたたまれた形状で
提供することにより、時間が掛かり、コストのかさむタンパク質再生技法が回避
される。
【００５５】 本発明によりさらに提供されるのは、実質量の該融合分子を調製する方法であ
る。一般的に、該方法は適切な宿主細胞で所望の融合分子を発現させること、該
細胞を培養すること、およびそこから融合分子を精製し、実質的に純粋な融合分
子を得ることからなる。該方法は所望の融合タンパク質を大規模に（すなわち、
少なくともミリグラム量）種々の実施形態、例えば、ローラーボトル、攪拌フラ
スコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または醗酵槽から発現・精製する
のに使用することができる。
【００５６】 本発明の融合タンパク質を単離・精製する本方法は非常に有用である。例えば
、所望の殺滅または損傷活性を示す融合タンパク質のために、融合タンパク質を
発現・精製する方法をもつことは、非常に有用である。該融合タンパク質を大量
に製造し得る方法を手にすることは特に有用であり、その結果、該融合タンパク
質は医学用、研究用、家庭用または商業用用途に適したキットの１成分として作
製することができる。さらに、構造分析を単純化すること、同様に所望によりさ
らなる精製および／または試験のために利用し得る融合タンパク質を大規模大量
に手にすることは有用である。
【００５７】 本発明はまた、病原体感染により誘導されるタンパク質、特にプロテアーゼを
調節する、好ましくは阻害する治療上の許容能力を有する化合物を検出するため
の生体外および生体内スクリーニングを特徴とする。例えば、その一つの方法は
一般に、所望の細胞を病原体で感染させること、該細胞を本発明の融合タンパク
質と接触させること、該融合タンパク質を形質導入すること、該化合物を該細胞
に添加すること、および該融合タンパク質により殺滅または損傷した細胞を検出
することからなる。特定化合物の有効性は、細胞殺滅または損傷の程度を添加し
た化合物濃度の関数として定量することにより、容易に評価することができる。
【００５８】 さらに提供されるのは、哺乳動物、とりわけヒトなどの霊長類の病原体感染抑
制方法であって、該抗病原体システムの治療有効量を該哺乳動物に投与すること
を特徴とする。一態様において、該融合タンパク質は共有結合により結合したタ
ンパク質形質導入ドメインおよび細胞障害性ドメインを含んでいる。該方法は、
融合タンパク質を哺乳動物の細胞に形質導入すること、該融合タンパク質を切断
して細胞障害性ドメインを融合タンパク質から十分に放出させること、細胞内の
細胞障害性ドメインを濃縮すること、そして細胞毒を産生させて哺乳動物の病原
体感染を十分に抑制することからなる。病原体の例としは、レトロウイルス、ヘ
ルペスウイルス、インフルエンザまたは肝炎の原因となり得るウイルス、および
マラリアの原因となり得るプラスモジウムなどであるが、これらに限定されるも
のではない。好適な細胞障害性ドメインおよび細胞毒については以下に詳細に説
明する。 哺乳動物において病原体感染を抑制する方法の他の態様においては、プロドラ
ッグが投与されるが（例えば、適切なヌクレオシドまたはその類似体）、該プロ
ドラッグが濃縮された細胞障害性ドメインと接触して細胞毒を産生する。
【００５９】 本発明によりさらに提供されるのは、配列内に共有結合により結合した、１）
ＴＡＴセグメント、特に、そのタンパク質形質導入フラグメント、および２）病
原体誘導または宿主細胞誘導プロテアーゼ、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、また
はその触媒活性フラグメントを含む融合タンパク質である。 本発明によりさらに提供されるのは、抗病原体システムであって、その融合タ
ンパク質が配列内に共有結合により結合した、１）形質導入ドメイン、２）第一
のチモーゲンサブユニット、３）プロテアーゼ切断部位、および４）第二のチモ
ーゲンサブユニットを含んでなる。また提供されるのは、該形質導入ドメインが
ＴＡＴであり、該第一のチモーゲンサブユニットがｐ５ビッドであり、該プロテ
アーゼ切断部位がＨＩＶプロテアーゼ切断部位であり、かつ、該第二のチモーゲ
ンサブユニットがｐ１５ビッドである抗病原体システムである。
【００６０】 本発明はまた、抗病原体システムであって、その融合タンパク質が配列内に共
有結合により結合した、１）形質導入ドメイン、２）第一のプロテアーゼ切断部
位、３）第一のチモーゲンサブユニット、４）第二のプロテアーゼ切断部位、お
よび５）第二のチモーゲンサブユニットを含んでなる抗病原体システムを提供す
る。また提供されるのは、該形質導入ドメインがＴＡＴであり、該第一のプロテ
アーゼ切断部位がＨＩＶ ｐ７−ｐ１プロテアーゼ切断部位であり、該第一のチ モーゲンサブユニットがｐ１７カスパーゼ−３であり、該第二のプロテアーゼ切
断部位がＨＩＶ ｐ１７−ｐ２４プロテアーゼ切断部位であり、かつ、該第二の チモーゲンサブユニットがｐ１２カスパーゼ−３である抗病原体システムである
。
【００６１】 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法をも提供する。一態様において
、該方法は該細胞を融合タンパク質の有効用量と接触させることからなり、その
際の融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、１）形質導入ドメイン
、２）第一のチモーゲンサブユニット、３）プロテアーゼ切断部位、および４）
第二のチモーゲンサブユニットを含んでなるか、または１）形質導入ドメイン、
２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第一のチモーゲンサブユニット、４）第
二のプロテアーゼ切断部位、および５）第二のチモーゲンサブユニットを含んで
なる。該融合タンパク質は必要なときに生体外または生体内に投与することがで
きる。例えば、該融合タンパク質はかかる治療を必要とする哺乳動物、例えば、
霊長類、特にＨＩＶウイルスに感染しているヒト患者に生体内投与することがで
きる。 本発明の他の側面は後に説明する。
【００６２】 ［発明の詳細な説明］ 上に言及したように、本発明は高い形質導入効率を示し、１種以上の病原体が
感染した細胞を特異的に殺滅または損傷する抗病原体システムを特徴とする。該
抗病原体システムは一般に遺伝子枠内融合タンパク質として細胞障害性ドメイン
に融合した形質導入ドメインを含む融合タンパク質を含む。好適な融合タンパク
質は、例えば、以下のようにアッセイして定量したときに、上昇した形質導入効
率を示す。該形質導入ドメインは融合タンパク質を細胞内に形質導入し、一旦、
細胞内にあると、細胞障害性ドメインが融合タンパク質から放出され、感染細胞
内に細胞毒を形成する。好適な態様において、該融合タンパク質の機能は、例え
ば、形質導入ドメイン構造を最適化することにより、また融合分子を誤って折り
たたむことにより、特異的に増強される。 好適な融合タンパク質は、下記に考察する標準の細胞生存度試験によりアッセ
イしたときに、病原体に感染した細胞の少なくとも約２５％、４０％、５０％、
６０％、または７０％、好ましくは８０％、９０％、より好ましくは少なくとも
９５％、また１００％まで殺すことが可能である。 本発明による「抗病原体システム」は、本明細書記載の融合分子の１つまたは
それ以上、ならびにそれに添加し得る追加の成分、例えば、形質導入効率を含む
可溶化、安定化および／または活性化を容易にする成分を含む。例としては、血
清タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン、バッファー、例えば、リン酸緩衝
化塩水、または医薬的に許容し得る媒体または安定剤などであるが、これらに限
定されるものではない。一般的には、医薬的に許容し得る媒体、安定剤などの考
察については「レミントンの製剤科学」（下記）を参照。好適な抗病原体システ
ムは、約１〜３種、好ましくは１種の融合タンパク質を医薬的に許容し得る担体
、例えば、水または緩衝化塩水に溶解して含む。好ましくは、該抗病原体システ
ムは無菌で提供される。
【００６３】 下記により詳細に考察するように、該抗病原体システムは単独の活性剤として
、あるいは下記に特定して例示した１種以上の治療薬と併用し、投与することが
できる。 「融合分子」という用語を本明細書にて使用する場合、形質導入分子であって
、通常、組換え、化学的または他の適当な方法により細胞障害性ドメインに共有
結合により結合（すなわち、融合）させたタンパク質またはペプチド配列を意味
する。所望により、該融合分子はペプチドリンカー配列を介して１または数個の
部位に融合してもよい。当該ペプチド配列は病原体誘導または宿主細胞誘導プロ
テアーゼによる切断用の１ヶ所以上の部位を含んでもよい。あるいは、該ペプチ
ドリンカーは融合分子の構築を介助するように使用してもよい。該細胞障害性ド
メインは通常１個のチモーゲンなどの潜在的に毒性の分子を含むが、時にはかか
る分子は約２の間から約５〜１０までである。特に好適な融合分子は融合タンパ
ク質である。
【００６４】 すでに言及したように、本明細書に開示した融合タンパク質の成分、例えば、
形質導入化アミノ酸配列、細胞障害性ドメイン、プロテアーゼ切断部位（１ヶ所
または複数個所）およびペプチドリンカーは、もし該融合タンパク質が意図した
機能をもつならば、ほぼ如何なる様式で構成されてもよい。特に、融合タンパク
質の各成分は、要すれば、少なくとも１個の適切なペプチドリンカー配列により
、他の成分から隔てられていてもよい。さらに、融合タンパク質はタグを、例え
ば、融合タンパク質の同定および／または精製を容易にするために含んでもよい
。さらに特定の融合タンパク質を以下に記載する。
【００６５】 好適なペプチドリンカー配列は、一般に、約２０〜３０個までのアミノ酸、よ
り好ましくは約１０〜１５個までのアミノ酸、そしてさらに好ましくは約１〜５
個のアミノ酸を含んでなる。該リンカー配列は一般に柔軟性であり、その結果、
該融合分子を単一の固まったコンホメーションに維持することはない。該リンカ
ー配列は、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質を融合分子から隔てておくために使用
することができる。とりわけ、該リンカー配列は、タンパク質形質導入ドメイン
と細胞障害性ドメインとの間に位置させ、例えば、それを化学的に交差結合させ
、分子に柔軟性を与えることができる。
【００６６】 「誤って折りたたまれた」という用語が融合タンパク質に関係している場合、
部分的にまたは完全にほどけている（すなわち、変性している）ことを意味する
。融合タンパク質は下に考察するように１種以上のカオトロピック試薬との接触
により部分的にまたは完全に誤って折りたたまれることもある。より一般的には
、本明細書に開示された誤って折りたたまれた融合タンパク質は、対応する未変
性タンパク質の高ギッブス（Gibbs）自由エネルギー（ΔＧ）形状の代表である 。好適なのは、水溶液に十分に溶解する誤って折りたたまれた融合タンパク質で
ある。それに対し、未変性の融合タンパク質は通常正しく折りたたまれており、
水溶液に十分に溶解し、かつ比較的低いΔＧをもつ。したがって、当該未変性融
合タンパク質は殆どの場合に安定である。
【００６７】 融合タンパク質が誤って折りたたまれている（ミスフォールディング）のは、
通常の方法の一つまたは組合わせによって検出することが可能である。例えば、
ミスフォールディングは、様々な常套的生物物理学的技法、例えば、未変性分子
（対照）と誤って折りたたまれている分子をもちい、旋光度を測定することによ
り検出し得る。すでに言及したように、該抗病原体システムの好適な投与法は、
生体外および生体内で誤って折りたたまれている融合タンパク質の形質導入であ
る。理論に結びつける積もりはないが、融合タンパク質を細胞内に形質導入した
後、誤って折りたたまれている融合タンパク質は、例えば、シャペロネンにより
有意に再生されて、病原体感染に応答して活性化されるよりも十分に融合タンパ
ク質を産生する。
【００６８】 「完全に溶解」という用語または同様の用語は、融合分子、特に融合タンパク
質が低Ｇ−力遠心分離（例えば、標準的遠心分離機において毎分約３０，０００
回転以下）では、バッファー水溶液、例えば、細胞培地から容易に沈降しないこ
とを意味する。さらに、融合分子は、それが５〜３７℃を超える温度で、中性の
ｐＨもしくはその近辺において、アニオン性または非イオン性洗剤の低濃度存在
下または不存在下に水溶液のままであるならば、可溶性である。これらの条件下
、可溶性のタンパク質は多くの場合、低沈降値、例えば、約１０〜５０スヴェー
ドベリー単位以下の値をもつ。
【００６９】 ここに言及した水溶液は、一般的に、ｐＨを一般的には約５〜９の範囲に、ま
た、イオン強度を約２ｍＭと５００ｍＭの範囲に設定するための緩衝化化合物を
含んでいる。ある場合には、プロテアーゼ阻害剤または緩和な非イオン性洗剤が
添加される。さらに、所望により、担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を数ｍｇ／ｍｌまで添加してもよい。代表的な水性バッファーは、
標準的リン酸緩衝化塩水、トリス緩衝化塩水、または他の周知のバッファーおよ
び細胞培地製剤である。
【００７０】 「ペプチド」とは、好ましくは本質的にそのサイズに関係なく２０種の天然ア
ミノ酸からなるポリマーをいう。「タンパク質」という用語は比較的大きなタン
パク質に関して多く用い、「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して多く用い
るが、当該分野でのこれら用語の使用は多くの場合互いに重なり合う。「ポリペ
プチド」という用語は、一般に、特にことわらない限り、タンパク質、ポリペプ
チド、およびペプチドについていう。
【００７１】 「潜在的に毒性の分子」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペ
プチド、糖または多糖類、脂質または糖脂質、糖タンパク質、またはリポタンパ
ク質などであって、本明細書にて考察した所望の毒性効果を生じ得るものを意味
する。また考慮すべきことは、毒性のまたは潜在的に毒性のタンパク質、ポリペ
プチド、またはペプチドをエンコードする潜在的に毒性の核酸である。このよう
に、適切な分子は、調節因子、酵素、抗生物質、または薬物、ならびにＤＮＡ、
ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドを包含する。潜在的に毒性の分子は天然産で
あってもよく、あるいは既知化合物から、例えば、組換えまたは化学合成によて
合成してもよく、さらに非相同成分を含んでもよい。潜在的に毒性の分子は、標
準的な分子サイズ測定技法、例えば、遠心分離またはＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により判定した場合、一般に、約０．１〜１００ＫＤの間また
はそれ以上、約１０００ＫＤまでであって、好ましくは約０．１、０．２、０．
５、１、２、５、１０、２０、３０および５０ＫＤの間である。
【００７２】 本明細書にて用いる場合、「細胞」という用語は、すべての初代細胞または不
死化細胞系、組織または器官に存在するような細胞の群を含むものとする。好ま
しくは、該細胞は哺乳動物、特にヒト起源のものであり、１種またはそれ以上の
病原体に感染し得るものである。本発明による「宿主細胞」とは、感染した細胞
、あるいは大腸菌など、本明細書に記載の核酸を増幅させるのに使用し得る細胞
である。
【００７３】 本抗病原体システムは、１種またはそれ以上の病原体に感染する、または感染
する可能性のある多様な細胞での生体外または生体内使用に適している。 本抗病原体システム使用の一例として、培養した細胞を単一血清型の病原体に
感染させる。感染した細胞は、次いで、特定の融合タンパク質と生体外で接触さ
せる。すでに考察したように、この融合タンパク質は、その細胞障害性ドメイン
が病原体感染により誘導される１種以上のプロテアーゼの存在下、活性化される
ように形成する。細胞中への形質導入を実施した後（一般に約３０分未満）、細
胞を約２〜２４時間、一般には約１８時間放置して融合タンパク質を切断させる
。その後、細胞を適当なバッファーまたは細胞培地で洗浄し、次いでその生存度
を評価する。融合タンパク質が細胞を殺すまたは損傷するために振り当てられる
時間は、選択した特定の細胞障害性ドメインにより多様である。しかし、生存度
は約２〜６時間後、約２４時間までには多くの場合評価し得る。下記により詳細
に説明するように、細胞の生存度はある種周知の色素（例えば、トリパンブルー
）または蛍光体の取込みをモニターすることにより容易に測定または定量するこ
とができる。
【００７４】 上に言及したように、該抗病原体システムは柔軟性に富み、特定の用途に合わ
せて作製した形態で提供することができる。例えば、該システムは、２種の融合
タンパク質を備えるようにして、その第一の融合タンパク質は形質導入ドメイン
と細胞障害性ドメインを含み、そして第二の融合タンパク質は形質導入化ドメイ
ンと病原体誘導または宿主細胞誘導のプロテアーゼを含むようにすることができ
る。
【００７５】 本発明の融合分子により形質導入された細胞は、標準方法によりその生存度を
アッセイすることができる。その一つの方法では、細胞生存度が形質導入後また
はその間のＤＮＡ複製を測定することにより容易にアッセイすることができる。
例えば、好適なアッセイ法は、１種以上の検出可能な標識ヌクレオシド、例えば
、放射標識チミジンなどの細胞取込みからなる。この取込みはいくつかの常套法
、例えば、トリクロロ酢酸（ＴＡＣ）沈殿に続くシンチレーション計測により簡
便に測定することができる。他の細胞生存度測定法は周知のトリパンブルー排除
技法である。
【００７６】 すでに言及したように、本発明の融合分子は効率的に標的細胞またはかかる細
胞の群に形質導入される。形質導入効率は、要すれば、異なる方法の１つまたは
その組合わせによってモニターし、定量することができる。 例えば、その一つの方法は細胞による融合タンパク質の取込みを測定する生体
外アッセイ法である。該アッセイ法は、融合タンパク質を、例えば、放射活性原
子、蛍光物質、燐光物質、または発光物質タグ（例えば、フルオレセイン、ロー
ダミンまたはＦＩＴＣ）などで検出可能に標識し、次いで標識した融合タンパク
質の取込みを測定することからなる。あるいは、該融合タンパク質は、検出可能
な標識を形成し得る酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはルシフェラ
ーゼなどで標識してもよい。好適な方法においては、所望の融合タンパク質を周
知の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に遺伝子的に融合させ、次いでその融合タン
パク質をアッセイすることも可能である。取込みはいくつかの常套法により、例
えば、標準細胞ソーター（例えば、ＦＡＣＳ）で標識した細胞を定量することに
より、蛍光顕微鏡によいり、またはオートラジオグラフィーにより測定すること
ができる。アッセイ法に関する開示については、一般的にはサムブルーク（Samb
rook）らおよびオウスベル（Ausubel）ら（下記）を参照。
【００７７】 本発明の好適な融合タンパク質は、細胞によるタンパク質取込みをモニターす
る常套法、特にＦＡＣＳまたは関連する顕微鏡技法により定量した場合、標的細
胞総数の少なくとも約２０％〜８０％、より好ましくは約９０％、９５％、９９
％ないし１００％まで形質導入することができる。標的細胞の総数は標準技法に
より推定することができる。
【００７８】 すでに言及したように、本発明は融合タンパク質と該融合タンパク質をエンコ
ードする核酸（例えば、ＤＮＡ）に関する。細胞障害性ドメインがポリペプチド
配列である場合、融合タンパク質という用語は、一般的には異なる起源からの少
なくとも２種のポリペプチドが操作可能に結合しているものを企図するものであ
る。ポリペプチドに関して、「操作可能に結合している」という用語は、２種の
ポリペプチドが、それぞれのポリペプチドがその意図した機能を発揮し得るよう
な方式で、結合していることを意味しようとするものである。一般に、２つのポ
リペプチドはペプチド結合を介して共有結合により結合している。すでに考察し
たように、要すれば、２つのポリペプチドはペプチドリンカーにより隔てられて
いてもよい。
【００７９】 ここで記載する融合タンパクは、好ましくは標準組換えＤＮＡ技術によって作
成する。たとえば、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、第２のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ分子を連結することができる。この例では、好適な
宿主細胞において出来あがったハイブリッドＤＮＡ分子を発現させ、融合タンパ
クを作成することができる。ＤＮＡ分子は互いに５’から３’方向に連結し、ポ
リペプチドをコードした翻訳フレームが連結後変化しないようにする（すなわち
、ＤＮＡ分子を互いにインフレームで連結する）。出来あがったＤＮＡ分子はイ
ンフレームの融合タンパクをコードする。
【００８０】 それぞれが意図する機能を遂行するという条件で、融合タンパクの成分はほと
んどいかなる順序で組織されてもよい。たとえば、１つの実施態様では、タンパ
ク形質導入ドメインは、細胞傷害性ドメインの中に包含される病原体特異的プロ
テアーゼの開裂部位に近接する。さらに、細胞傷害性ドメインは、その片方また
は両方がタンパク形質導入ドメインに近接してもよい病原体特異的プロテアーゼ
の開裂部位に隣接することができる。本発明は環状融合タンパクについても考慮
する。
【００８１】 病原体特異的開裂部位を包含する好ましい細胞傷害性ドメインは、そのような
ドメインが意図する機能につながるようなサイズを有するであろう。特に、好ま
しい細胞傷害性ドメインは、少なくとも約０．１、０．２、０．５、０．７５、
１、５、１０、２５、３０、５０、１００、２００、５００ｋＤから約１０００
ｋＤ以上まででありうる。通常細胞傷害性ドメインのサイズが融合タンパクのサ
イズを支配することは明らかなはずである。好ましい病原体特異的開裂部位は、
約４〜約３０個または４０個、好ましくは約８〜約２０個、より好ましくは約１
４個のアミノ酸長である。以下の表１を参照されたい。病原体特異的プロテアー
ゼ開裂部位は、既知の化学架橋法を含む種々の方法によって作成し、融合するこ
とができる。たとえば、Means, G. E. (1974) タンパクの化学修飾、Holden~Day
を参照されたい。また、S. S. Wong (1991) タンパクの抱合と架橋、CRC Press も参照されたい。しかしながら、組換え操作を用い、インフレームでの融合タン
パクを作成することが一般的に好まれる。
【００８２】 述べたように、発明に合致した融合分子は数種の方法によって組織することが
できる。見本となる構成では、形質導入ドメインのＣ末端を操作できるように細
胞傷害性ドメインのＮ末端に連結する。所望ならば、その連結は組換え法により
達成することができる。しかしながら、別の構成では、形質導入ドメインのＮ末
端が細胞傷害性ドメインのＣ末端に連結する。細胞傷害性ドメインの中で、第１
の病原体特異的プロテアーゼの開裂部位は形質導入ドメインのＣ末端に操作でき
るように連結することができ、プロテアーゼ開裂部位のＣ末端は傷害性を持つ分
子のＮ末端に操作できるように連結することができる。さらに別の構成では、細
胞傷害性ドメインのＣ末端は第１の病原体特異的部位と同様の、または異なった
第２の病原体特異的プロテアーゼの開裂部位のＮ末端に連結することができる。
好ましくは、第１および第２の病原体開裂部位は具体的には、病原体の感染によ
り誘導される同一のプロテアーゼによって切断される。
【００８３】 別の方法として、または追加として、必要によって１つか複数の別のプロテア
ーゼ開裂部位を傷害性のある分子に挿入することができる。 本発明に合致する好ましい融合タンパクは、配列（Ｎ末端からＣ末端へ）にお
いて操作できるように連結した：１）形質導入ドメイン／１つか複数の病原体特
異的プロテアーゼ開裂部位／および傷害性を持つ分子；２）形質導入ドメイン／
病原体特異的プロテアーゼ開裂部位／およびチモーゲン；および３）形質導入ド
メイン／第１の病原体特異的プロテアーゼ開裂部位／第１のチモーゲンサブユニ
ット／第２の病原体特異的プロテアーゼ開裂部位／第２のチモーゲンサブユニッ
トを典型的に包含する。さらに所望のように、ＥＥ、ＨＡ、Ｍｙｃおよびポリヒ
スチジン特に６Ｘｈｉｓのようなタンパクタグを１つか複数、形質導入ドメイン
のＮ末端に融合することができ、たとえば、溶解性または円滑な単離および融合
タンパクの同定を改良する。以下の実施例を参照されたい。
【００８４】 一般的には好まれないが、融合タンパクにポリペプチド配列を操作できるよう
に連結し、細胞核への輸送を促進することも可能である。タンパクに包含された
場合、核へのタンパク輸送を促進するように作用するアミノ酸配列は既知であり
、核局在シグナル（ＮＬＳ）と呼ばれている。核局在シグナルは典型的には塩基
性アミノ酸の伸展で構成されている。非相同性タンパク（たとえば発明の融合タ
ンパク）に取り付けた場合、核局在シグナルは細胞核へのタンパクの輸送を促進
する。核局在シグナルは、タンパク表面に曝し、タンパクの機能を妨害しないよ
うに非相同性タンパクに取り付ける。好ましくは、タンパクの一方の末端、たと
えばＮ末端にＮＬＳを取り付ける。ＳＶ４０核局在シグナルは、発明の融合タン
パクに包含することができる非限定的な例である。ＳＶ４０核局在シグナルは以
下のアミノ酸配列：Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ（配列番号３）を有する。好ましくは、核局在シグナルをコードする核
酸は、標準組換えＤＮＡ法によって融合タンパクをコードする核酸に（たとえば
５’末端）インフレームでスプライスする。
【００８５】 上述したように、発明の融合タンパクは一部分、第１のポリペプチドで構成さ
れ、ここではタンパク形質導入ドメイン、形質導入ドメイン、形質導入タンパク
または「ＰＴＤ」と呼ばれることがあり、融合タンパクの細胞へのエントリーに
備えている。共役したタンパクを細胞にエントリーさせる能力を有するペプチド
は既知であり、ＴＡＴ、アンテナペディア・ホメオドメイン、「ペネトラチン」
と呼ばれる、 Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号１）(Der
ossi et al., J. Bio. Chem., 269:10444(1994))およびＨＳＶ ＶＰ２２(Ellio
t and O'Hare, Cell, 88:223(1997))のような前述したものが挙げられる。
【００８６】 形質導入タンパクの実例となるものは、少なくともＴＡＴ塩基性領域（天然Ｔ
ＡＴタンパクにおける４９〜５７番目のアミノ酸）を包含するＴＡＴ断片である
。ＴＡＴ断片はアミノ酸の長さで約９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、
または５０個から約８６個までの長さであってもよい。ＴＡＴ断片は、好ましく
は、ＴＡＴシステイン−リッチ領域（天然ＴＡＴタンパクの２２〜３６番目のア
ミノ酸）およびカルボキシ末端ドメインによりコード化されているＴＡＴエクソ
ン２（天然ＴＡＴの７３〜８６番目のアミノ酸）を欠いている。ＴＡＴ形質導入
ドメインは、以下のアミノ酸配列： ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２） を有する。そのアミノ酸配列はここでは「最小ＴＡＴ配列」と呼ばれることもあ
る。米国特許第５，６７４，９８０号およびＴＡＴ構造に関連した開示のために
その明細書で引用した参考文献を参照されたい。また、ＴＡＴ配列については、
Green, M. and Lowenstein, P. M. (1988)も参照されたい。
【００８７】 上で議論したように、および以下の実施例の中で、ＴＡＴ断片について形質導
入を向上させるような種々の修飾が熟慮されている。たとえば、断片のタンパク
形質導入ドメインは自由回転できるようにグリシン残基に隣接することができる
。図２の図面を参照されたい。別の方法としては、ほかのアミノ酸配列および特
に中性および／または親水性残基を所望のようにＴＡＴ断片に付加してもよい。
当該分野で既知のようなＴＡＴ断片にタンパクタグを付加してもよい。そのよう
なタンパクタグの例には、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、ＥＥおよびＭｙｃが挙げられる。
一般に、修飾されたＴＡＴ断片は、アミノ酸の長さで少なくとも１０、１２、１
５、２０、２５、３０、５０、１００、２００個から約５００個までである。
【００８８】 融合タンパクの形質導入ドメインは、細胞への融合タンパクのエントリーを補
佐することができるようないかなるタンパクまたはその一部から得ることができ
る。述べたように、好ましいタンパクにはたとえば、非天然に生じる配列同様に
、ＴＡＴ、アンテナペディア・ホメオドメインおよびＨＳＶ ＶＰ２２が挙げら
れる。合成タンパク形質導入ドメインの好適性は、たとえば、単純に融合タンパ
クを調べ、合成タンパク形質導入ドメインが融合タンパクを所望のように細胞に
エントリーできるかどうかを定めることによって、容易に評価することができる
。
【００８９】 「合成タンパク」などの用語によって、組換え法または化学的ペプチド合成に
よって作成された非天然に生じたアミノ酸配列を称する。 当該分野では形質導入するＴＡＴタンパクについて多数の変異体が記載されて
きた。本発明に合わせてこのような変異体を用いることができる。形質導入する
ＴＡＴの作成法および使用法を報告している、参考として組み入れられている開
示である、米国特許第５，６５２，１２２号を参照されたい。
【００９０】 別の形質導入ドメインおよび特に形質導入タンパクは従来の技術によって容易
に同定することができる。たとえば、１つのアプローチでは、所望のＴＡＴ断片
のような形質導入ドメイン候補を、標準組換え操作を用いて所望の細胞傷害性ド
メインに融合してインフレームで融合タンパクを形成する。続いて、たとえば放
射性原子またはＦＩＴＣのような蛍光標識によって、融合タンパクを検出できる
ように標識する。次いで検出できるように標識された融合タンパクを上述したよ
うに細胞に加え、融合タンパクのレベルを測定する。好ましい形質導入ドメイン
は約１ピコモル〜約１００マイクロモル、好ましくは約５０ピコモル〜約７５マ
イクロモル、より好ましくは約１〜約１００ナノモルの融合タンパク細胞内濃度
を達成することができる。
【００９１】 特に熟慮された形質導入タンパクは、たとえば上述したＴＡＴ、ＶＰ２２、ま
たはアンテナペディア・ホメオドメイン配列のような既知の形質導入タンパクま
たは断片の標的突然変異誘発によって得られたものである。典型的には、突然変
異誘発された形質導入タンパクは、対応する完全長の形質導入タンパク配列を含
む同一の融合タンパクに比べた場合、所望の融合タンパクの形質導入が少なくと
も２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０倍優れている。
【００９２】 本発明に合致した好ましい形質導入タンパクはクラスＩアミノ酸配列であり、
好ましくは少なくとも以下の一般式：Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ
５−Ｂ３で表されるペプチドを包含するペプチド配列であり；式中Ｂ１、Ｂ２お
よびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なった塩基性アミノ酸であり；およびＸ
１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にアルファ−へリックス増強ア
ミノ酸であり、同一または異なっている。典型的にはこのような配列は合成した
ものである。
【００９３】 「塩基性アミノ酸」などの用語は、ここで用いられるように第一級、第二級、
または第三級アミンのような塩基性残基、または窒素環メンバーを含有する環状
基を有するアミノ酸のことをいう。好ましい塩基性アミノ酸はリジン（Ｌｙｓ）
およびアルギニン（Ａｒｇ）であり、アルギニンが特に好ましい。ヒスチジンも
好適な塩基性アミノ酸でありうる。
【００９４】 「アルファ−へリックス増強」アミノ酸などの用語は、当業界で周知のアッセ
イによって測定されるようなアルファ−へリックスを形成するまたは安定化する
ような認知された傾向を有するアミノ酸を意味する。一般にO'Neil, K. T. and
DeGrado, W. F. (1990) Science 250:646およびそのようなアッセイに関してそ こで引用された参考文献を参照されたい。好ましいアルファ−ヘリックス増強ア
ミノ酸には、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ）が挙げられる。特に好ましい
アルファ−ヘリックス増強アミノ酸はアラニンである。「実質的なアルファ螺旋
性」という用語によって、たとえばヘリカルホイールダイヤグラムまたはそのほ
かの従来の方法によって測定されるような、認識できるアルファ−へリックス構
造を特定のペプチドが有することを意味する。
【００９５】 １つの実施態様では、ペプチドは式 Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−
Ｘ５−Ｂ３で表され、式中、Ｂ１、Ｂ２またはＢ３はのうち少なくとも１つはア
ルギニンであり、好ましくはＢ１、Ｂ２およびＢ３の全てがアルギニンである；
およびＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にアルファ−へリック
ス増強アミノ酸であり、同一または異なっている。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ
３、Ｘ４またはＸ５のうち少なくとも１つはアラニンであり、より好ましくは、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の全てがアラニンである。もう１つの実施態
様では、ペプチドは式 Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｂ３で表
され、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なった塩基性
アミノ酸であり；およびＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５のうち少なくとも１
つはアラニンであり、好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の全てが
それぞれアラニンである。このような実施態様では、アルギニンのような塩基性
アミノ酸残基は実質的にペプチドの少なくとも１つの面に沿って、典型的には１
つの面に沿って配置する。
【００９６】 さらに、本発明に合致した好ましい形質導入タンパクは、合成アミノ酸配列で
あり、好ましくは少なくとも以下の一般式：Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｂ２−Ｂ３−Ｘ
３−Ｘ４−Ｂ４で表されたペプチドを包含するペプチド配列である；式中、Ｂ１
、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４はそれぞれ独立に、同一または異なった塩基性アミノ酸
であり；およびＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立にアルファ−へリ
ックス増強アミノ酸であり、同一または異なっている。１つの実施態様では、Ｂ
１、Ｂ２、Ｂ３またはＢ４はのうち少なくとも１つはアルギニンであり、好まし
くはＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４の全てがアルギニンである；およびＸ１、Ｘ２
、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立にアルファ−へリックス増強アミノ酸であり
、同一または異なっている。もう１つの実施態様では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３および
Ｂ４はそれぞれ独立に、同一または異なった塩基性アミノ酸であり；およびＸ１
、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ４のうち少なくとも１つはアラニンであり、好ましくは
、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の全てがアラニン残基である。このような実施
態様では、アルギニンのような塩基性アミノ酸残基は実質的にペプチドの少なく
とも１つの面に沿って、典型的には１つの面に沿って配置する。
【００９７】 塩基性アミノ酸残基の「実質的な配置」などの用語によって、約３〜約４オン
グストローム、好ましくは約３．６オングストロームの概念的に説明されたアル
ファ−へリックス上で各残基がほかとの間隔を空けることができるように、塩基
性アミノ酸が少なくとも他の１つの塩基性アミノ酸に関して位置付けされること
を意味する。以下の図７に示すような標準ヘリカルホイールダイヤグラムの検査
を含む通常のいくつかの方法によって配置を達成することができる。好ましい形
質導入ドメインは約２、３、４、５、６、または約７個から約１０個までの実質
的に配置した塩基性アミノ酸残基を示す。
【００９８】 本発明のより好ましい形質導入タンパクは、以下の具体的なペプチド配列：Ｙ
ＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号４）
、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号５）、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号
６）、ＹＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）、およびＹＡＡＡＲＲＲＲＲＲＲ
（配列番号８）によって表される少なくとも１つのペプチドを包含する。特に好
ましいのは、以下のペプチド配列：ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号３）、Ｙ
ＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号４）、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号５）
、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号６）、ＹＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号
７）、およびＹＡＡＡＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号８）から成る形質導入ペプチド
配列である。
【００９９】 本発明における別の形質導入タンパクは、アミノ酸配列、好ましくは、ＴＡＴ
の少なくとも４９〜５６番目のアミノ酸にて少なくとも１つのアミノ酸修飾を包
含する合成配列である。たとえば、１つの実施態様では、合成ペプチド配列は、
好適なＴＡＴ対照配列に比してそのＴＡＴ配列のアルファ螺旋性を高めるように
ＴＡＴ配列を修飾したＴＡＴの４７〜５６、４８〜５６、４７〜５７、４８〜５
７または４９〜５７番目のアミノ酸を少なくとも包含する。好ましくは、ＴＡＴ
配列はアラニンのようなアルファ−へリックス増強アミノ酸による少なくとも１
つのアミノ酸置換を包含する。
【０１００】 別の形質導入タンパクはアミノ酸配列であり、好ましくは２つ以上のアルギニ
ンのような塩基性アミノ酸が、そのＴＡＴ配列の少なくとも１つの面に沿って実
質的に配置するようにＴＡＴ配列を修飾したＴＡＴの４７〜５６、４８〜５６、
４７〜５７、４８〜５７または４９〜５７番目のアミノ酸を少なくとも包含する
合成ペプチド配列である。ヘリカルホイール上のアルファ−へリックスのように
ＴＡＴ配列を可視化することを含めた多様なアプローチによって配置を円滑にす
ることができる。以下の図７を参照されたい。
【０１０１】 本発明のさらなる形質導入タンパクは、少なくともＴＡＴの４９〜５６番目の
アミノ酸、好ましくはＴＡＴの４７〜５６、４８〜５６、４９〜５６、４７〜５
７、４８〜５７または４９〜５７番目のアミノ酸を包含し、そこではＴＡＴ配列
がアルファ−へリックス増強アミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含
むようなペプチド配列である。この実施態様では、そのＴＡＴ配列の少なくとも
１つの面に沿って、好ましくはＴＡＴ配列の１面だけに沿って、２個以上のアル
ギニン残基を実質的に配置するようにアミノ酸置換を選択する。１つの実施態様
では、好ましくは、約２、３、４または５個のアルギニンをヘリックスの少なく
とも１面に沿って、より具体的にはへリックスの１面に沿って実質的に配置する
。たとえば、ＴＡＴ配列の約１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基から約
６個のまでのアミノ酸残基をアラニン残基で置換し、アルファ螺旋性を高め、へ
リックスの少なくとも１面でアルギニンを配置することができる。
【０１０２】 本発明に合致する別の形質導入タンパクは、少なくともＡｎｔｐ配列（配列番
号１０；以下の表２を参照されたい）の形質導入部分、好ましくは特定のＴＡＴ
配列について上述した線に沿って修飾されたＡｎｔｐ配列を含むアミノ酸配列を
包含する。特に、修飾には、形質導入タンパクのアルファ螺旋性を高め、または
Ａｎｔｐ配列の少なくとも１面に沿って塩基性アミノ酸残基（たとえばアルギニ
ン）を配置する、またはその両方のために選択された、少なくとも１個のアミノ
酸の置換、欠失または付加が含まれる。実例としては、たとえばＡｎｔｐ配列（
配列番号１０）のような好適な対照ペプチドに比べて、２、５または１０から１
００倍以上までの間でタンパクの形質導入効率を充分に高めるような少なくとも
１個のアミノ酸修飾を含むようにＡｎｔｐ配列を修飾したＡｎｔｐ配列を含む形
質導入タンパクである。
【０１０３】 さらに好ましいのは上述したようなクラスＩＩ形質導入アミノ酸配列である。
１つの実施態様では、クラスＩＩ配列は以下の式：Ｘ１−Ｘ２−ＲＸ３−（Ｐ／
Ｘ４）−（Ｂ／Ｘ５）−Ｂ−（Ｐ／Ｘ６）−Ｘ４−Ｂ−（Ｂ／Ｘ７）で表される
ペプチドであり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７はそれぞれ
、同一または異なった、アルファ螺旋性を促進する残基であり；（Ｐ／Ｘ４）お
よび（Ｐ／Ｘ６）はそれぞれ独立にプロリンまたはアルファ螺旋性を促進する残
基であり；Ｂは塩基性アミノ酸残基であり；（Ｂ／Ｘ５）（Ｂ／Ｘ７）はそれぞ
れ独立にＢまたはアルファ螺旋性を促進する残基であり；およびＲはアルギニン
（Ａｒｇ）である。 好ましいアルファ螺旋性を促進する残基はアラニン（Ａｌ
ａ）である。好ましい塩基性アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙ
ｓ）であり、特にＡｒｇである。特に好ましいクラスＩＩ形質導入アミノ酸配列
は少なくとも１個の、通常は約１個から約３個の間でプロリン残基を包含する。 より具体的に好ましいクラスＩＩペプチド配列は以下の実施例１３（配列番号
３６−４１）に提供されている。
【０１０４】 ここで記載する形質導入ドメインの分子量は、意図する用途および所望の形質
導入効率のようなパラメータによって変化する。一般に形質導入ドメインは、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法またはそのほかの好適なアッセイによって約１、
２、３、５、１０、２０から約５０ｋＤａの間の分子量を示す。具体的に好まし
い形質導入ドメインは以下にさらに詳しく、以下の実施例の中に記載されている
。
【０１０５】 述べたように、本発明に合致する形質導入ドメインは増強された形質導入効率
を示す。その増強は、以下に具体的に記載するような１つまたは種々の常法によ
って評価することができる。ここでは形質導入効率アッセイまたは類似の用語で
呼ばれることもある１つの一般的なアプローチでは、所望の形質導入タンパクと
並行して１つか複数の好適な対照分子を細胞に形質導入するような、対照アッセ
イを参照することによって形質導入効率を測定する。好ましくは特定の形質導入
ドメインの形質導入率および細胞内の量を測定し、対照分子と比較する。好適な
実例としての対照分子にはＴＡＴ（配列番号１）の４７〜５７番目のアミノ酸、
ＴＡＴの４９〜５７番目のアミノ酸およびＡｎｔｐ配列（配列番号１０）が挙げ
られる。 本発明の２個以上のタンパク形質導入ドメイン、たとえば、約２、３、４、５
、６個から１０個以上までのタンパク形質導入ドメインは、形質導入されるべき
所望の分子に共有結合することができる。この実施態様では、タンパク形質導入
ドメインを直列に結合することができ、また、所望のような好適なペプチドリン
カー少なくとも１つによって分離することができる。
【０１０６】 本発明の好ましい形質導入タンパクは、好適な対照配列、たとえば最小ＴＡＴ
配列またはそのほかの好適な対照分子と比較した場合、約５〜１０から１００倍
以上形質導入効率が高まっていることを示す。好ましい形質導入アッセイの例を
以下の実施例７にて記載する。 本発明の形質導入タンパクは、種々の常法によって作成することができる。た
とえば、天然資源からＤＮＡを単離することにより、また既知の合成法、たとえ
ばリン酸三エステル法によって、所望の形質導入タンパクをコードするＤＮＡを
得ることができる。たとえば、オリゴヌクレオチド合成、ＩＲＬ出版(M. Gait e
d., 1984)を参照されたい。市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合 成オリゴヌクレオチドを調製してもよい。形質導入タンパクをコードした合成オ
リゴヌクレオチドを種々の好適なベクター（たとえば、ｐＴＡＴベクター）に挿
入し、適当な宿主細胞で発現させてもよい。一般にAusubel et al. およびSambr
ook et al.下記を参照されたい。
【０１０７】 議論したように、いくつかの方法で融合タンパクの成分を連結することができ
る。１つの実施態様では、形質導入ドメインは操作できるように細胞傷害性ドメ
イン（ここでは「ＣＤ」と呼ぶこともある）に連結する。また議論したように、
この例における細胞傷害性ドメインの融合は、特定の条件下で感染した細胞を殺
傷することができる細胞毒素を生じるためである。細胞傷害性ドメインは融合分
子の一部として細胞に形質導入され、病原体感染によって誘導される１つか複数
の特定のプロテアーゼの存在下で融合タンパクから放出されるように具体的に意
図されている。例えば、細胞毒素の放出は、宿主細胞のさらなる処理または成熟
を伴う。形質導入ドメインと細胞傷害性ドメインを操作できるように連結する、
好ましい方法は、同時に一緒に連結したものをコードする核酸配列を用いてイン
フレームで遺伝的な融合タンパクを形成することである。
【０１０８】 前述したように、本発明は種々の細胞傷害性ドメインに適合している。好まし
い細胞傷害性ドメインには既知のチモーゲンのような毒性を持った分子が挙げら
れる。一般に、チモーゲンのほとんどは不充分な触媒活性しか示さない。しかし
ながら、タンパク修飾および１つか複数のプロテアーゼ開裂部位における部分的
タンパク分解によって一旦活性化されると、チモーゲンは成熟酵素に変換される
。変換（成熟）にタンパク分解が含まれる例では、開裂はチモーゲンの部位特異
的な位置で起きる。チモーゲンから放出された断片はそれ自体が触媒活性を持つ
ことがあり、放出でさらに未熟酵素を処理し、ほとんど未熟ではない型、または
完全な成熟型となる。そのような断片を含むチモーゲンは自己触媒酵素と呼ばれ
ることが多い。ほかの場合では、しかしながら、断片は充分な触媒活性を欠き、
成熟酵素を形成するためには開裂しなければならない。特定の触媒断片が元々チ
モーゲンに会合していてもよいし、また常法によって組換え的にチモーゲンに付
加し、非相同性チモーゲンを形成してもよい。チモーゲンにおいて元々生じるプ
ロテアーゼ開裂部位は通常、チモーゲンの中でサブユニットを区分するように作
用する。
【０１０９】 本発明に合致して用いるための特定のチモーゲンには、アポトーシスに関連す
るもの、特にシステニルアスパラギン酸特異的プロテイナーゼ（カスパーゼ）お
よび特にカスパーゼ−３（ＣＰＰ３２、アポパイン、ヤマ）、カスパーゼ−５（
ＩＣＥ−ＩＩＩ、ＴＹ）、カスパーゼ−４（ＩＣＥ−ＩＩＴＸ、ＩＣＨ−２）、
カスパーゼ−１（ＩＣＥ）、カスパーゼ−７（Ｍｃｈ３、ＩＣＥ−ＬＡＰ３、Ｃ
ＭＨ−１）、カスパーゼ−６（Ｍｃｈ２）、カスパーゼ−８（ＭＡＣＨ、ＦＬＩ
ＣＥ、Ｍｃｈ５）、カスパーゼ−１０（Ｍｃｈ４）、カスパーゼ−２（ＩＣＨ−
１）、カスパーゼ−９（ＩＣＨ−ＬＡＰ６、Ｍｃｈ６）および相対的に不活性な
チモーゲン断片であるそれらの触媒活性断片が挙げられる。
【０１１０】 特にカスパーゼ−３（Ｃａｓｐ３）の活性化は、カスパーゼ活性化ＤＮエース
阻害剤（ＩＣＡＤ）の開裂によってアポトーシスを導き、結果的にはＣＡＤを活
性化し、最終的には細胞死を招くことが以前示された。 たとえば、Salvesen,
G. S., et al., カスパーゼ：タンパク分解による細胞内シグナル伝達、Cell, 9
1:443(1997); Henkart, P. A., ＩＣＥファミリープロテアーゼ：「あらゆるア ポトーシス細胞死に介在するか？」Immunity, 4:195(1996); Cohen, H. M., 「 カスパーゼ：アポトーシスの遂行者」、J. Biochem. 326(1997); Woo, M. et al
., 「カスパーゼ３／Ｃａｓｐ３のアポトーシスへの本質的な寄与およびそれに 関連した核の変化」、Gene & Dev., 12:806(1998); Enari, M.,et al., 「カス パーゼ−アポトーシスの間にＤＮＡを分解する活性化ＤＮエース、およびその阻
害剤ＩＣＡＤ」、Nature 391:43(1998); Liu, X. et al.,「ＤＦＦ４０はアポト
ーシス中にＤＮＡの断片化とクロマチンの濃縮を誘導する」、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 15:8461(1998)を参照されたい。さらに、Ｃａｐｓ３の活性化は不 活化Ｃａｓｐ３の活性化の触媒となり、それによってアポトーシスシグナルを増
幅する。
【０１１１】 Ｃａｓｐ３チモーゲンの構造は、Ｎ末端Ｐｒｏドメイン、次いでカスパーゼ開
裂認識部位、次に触媒Ｃｙｓ残基を含有するｐ１７ドメイン、第２のカスパーゼ
開裂部位および最後にｐ１２ドメインを包含することが知られている（図９Ａ参
照）。Ｃａｓｐ３のチモーゲン型は不活性のままである；しかしながら、アポト
ーシスのシグナル伝達の間にＴ細胞におけるカスパーゼ−８のような上流カスパ
ーゼによって開裂が起き、Ｐｒｏドメインを失って、活性型ｐ１７：ｐ１２ヘテ
ロ四量体となる。Woo, M. et al. （上記）を参照されたい。
【０１１２】 以下の実施例１２ではＨＩＶ感染細胞を治療するためにＨＩＶウイルス複製機
構の具体的な不活性化を説明する。作戦では、非感染細胞を損なわずに感染細胞
を殺すためにＨＩＶプロテアーゼを利用する。実施例１２にさらに詳しく記載さ
れているように、修飾されたカスパーゼ−３タンパク、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３を作
成した。この融合タンパクは感染細胞および非感染細胞の１００％に形質を導入
する。しかしながら、ＨＩＶタンパク分解開裂部位に関して内因性開裂部位を置
換しているために、感染細胞におけるＨＩＶプロテアーゼによってのみＴＡＴ−
Ｃａｓｐ３が特異的に活性化され、アポトーシスを引き起こすが、非感染細胞で
は不活性のチモーゲン型のままである。Ratner, L. et al., ＡＩＤＳウイルス の完全なヌクレオチド配列、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、Nature, 313:277(1985)を参照 されたい。タンパク分解開裂部位を置換することによって、この作戦はＣ型肝炎
ウイルス、サイトメガロウイルスおよびマラリアのような特異的プロテアーゼを
コードするそのほかの病原体に応用することができた。Rice, C. M., Flaviviri
dae:ウイルスとその複製、Fields Virology (eds Fields, B. N., Knipe, D. M.
, & Howley, P. M.)931~960 (Lippincott~Raven Publishers, フィラデルフィア
1996)；Welch,A. R. et al., 肝炎ウイルス成熟プロテアーゼ、アセンブリン： その遺伝子、推定活性部位ドメインおよび開裂部位、Proc. natl. Acad. Sci. U
SA, 88:10792(1991); Francis,SE, et al., マラリア原虫Plasmodium falciparu
mにおけるヘモグロビン代謝 Ann. Rev. Microbiol., 51:97(1997)を参照された い。
【０１１３】 また、Ratner, L. et al., ＡＩＤＳウイルスの完全なヌクレオチド配列の開 示について、上記を参照されたい。また、ＨＩＶ感染の治療に関する開示につい
てはWong, J.K.(1997) Science 278:1291およびFinzi, D. et al., (1997) Scie
nce 278:1295を参照されたい。 ＨＩＶウイルスの構造および機能に関するさらに具体的な情報については以下
を参照されたい：Wu, X. et al. EMBO J. (1997) 16:5113; Lillehoj, E.P. et
al.(1998); Kohl, N.E. et al. (1998) PNAS(USA)85:4686; Gottlinger, H.G. e
t al. (1998) PNAS(USA) 86:5781.
【０１１４】 特に実施例１２では、内因性の開裂部位についてＨＩＶタンパク分解開裂部位
を置換する、形質導入可能な、修飾した、アポトーシスを促進するカスパーゼ−
３タンパク（すなわちＴＡＴ−Ｃａｓｐ３）を示す。さらに、融合分子は、効率
的に〜１００％の細胞に形質導入するが、非感染細胞では不活性のままである。
ＨＩＶ感染細胞では、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３はＨＩＶプロテアーゼにより処理され
、活性型となり、感染細胞におけるアポトーシスを引き起こす。付随する実施例
および考察で明らかなように、この特異的な作戦は一般に、Ｃ型肝炎ウイルス、
サイトメガロウイルスおよびマラリアのような特異的プロテアーゼをコードする
その他の病原体に適用でき、戦うのに用いることができる。
【０１１５】 さらに好ましいチモーゲンはグランザイムＢである。 さらに好ましいチモーゲンはＢｉｄである。Ｂｉｄタンパクは、アポトーシス
調節タンパクであるＢｃｌ／Ｂａｘファミリーに関連した２０ｋＤａのタンパク
であることが報告されている。Luo et al. (1998) Cell 94:481; Li et al. (19
98 Cell 94:491; Wang et al. (1996) Gene & Dev.10: 2859を参照されたい。マ
ウスのＢｉｄ配列はゲンバンク受入番号：Ｕ７５５０６；ＮＩＤ：ｇ１６６９５
１３で見つけることができる。実施例１１を参照されたい。
【０１１６】 前述したように、質量作用は、抗病原体システムの特定の実施態様の活性を高
めることが知られている。さらに特に、極めて低い用量（すなわち、ナノモルレ
ベル）で多くの例に抗病原体システムを投与するのは可能であると考えられる。
この特徴は、抗病原体システムに対して細胞（および患者）の認容性を高めるこ
とができるので特に有利である。
【０１１７】 さらに具体的には、細胞傷害性ドメインの開裂は、感染細胞において別の融合
分子を描き出すと思われ、それによってこのような感染細胞中に細胞傷害性ドメ
インと細胞毒素の特異的な濃度を生じる。その濃度はある種の細胞毒素、特に最
適な効果を示す濃度を要求するようなものにとって特に重要でありうる。そのよ
うな細胞毒素の実例には、トロンビンおよびフィブリンのような血液凝固プロテ
アーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ジフテリア毒素、リシン、シガ毒素、ア
ブリン、コレラ毒素、サポニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗
ウイルスタンパクおよびゲロニンが挙げられる。追加の例にはジフテリア毒素Ａ
鎖およびリシンＡ鎖の生物活性のある断片が含まれる。
【０１１８】 さらに好ましいのは、タンパク特に、壊死に関連した特定のキナーゼおよびヌ
クレオシドデアミナーゼを包含する細胞傷害性ドメインである。そのような酵素
には、たとえばＨＳＶチミジンキナーゼのようなウイルス性チミジンキナーゼ、
およびシトシンデアミナーゼ、および触媒活性のあるそれらの断片が含まれる。
【０１１９】 さらに好ましいチモーゲンには、ホスフォリパーゼ酵素、特にホスフォリパー
ゼＣのような病原体に感染した細胞表面で活性のあるものが含まれる。 好ましいチモーゲンおよび酵素は一般に、たとえばトリパンブルー除外法のよ
うな好適な細胞生存アッセイによって測定されるように細胞を殺すことができる
。さらに好ましいチモーゲンおよび酵素は、常法によって測定されるような、約
５、１０、２０、３０、４０、５０ｋＤから１００〜５００ｋＤ以上までの間の
分子量を有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法、沈降遠心法およびカラムク
ロマトグラフィのような従来からの多くの技術によって分子量を測定することが
できる。 特に好ましいチモーゲンはカスパーゼ−３（ＣＰＰ３２、アポパイン、ヤマ）
または触媒活性のあるその断片である。以下の実施例５−６を参照されたい。
【０１２０】 もう１つの特に好ましい酵素は、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼまたは触媒活性
のあるその断片である。以下の実施例８を参照されたい。 一般に発明の融合分子の調製には、たとえば、ポリメラーゼ鎖増幅反応（ＰＣ
Ｒ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの開裂、オリゴヌクレオ
チドの調製、ＤＮＡの連結、ｍＲＮＡの単離、好適な細胞へのＤＮＡの導入およ
び細胞の培養を含む通常の組換えステップが含まれる。さらに、カオトロピック
剤および周知の電気泳動、遠心分離およびクロマトグラフィ法を用いて融合分子
を単離し、精製することができる。一般に、このような方法に関する開示につい
ては、Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル（第２版 (1989)
）；およびAusubel et al., 分子生物学における現在のプロトコール、John Wil
ey & Sons, New York(1989)を参照されたい。 以下の表１に、病原体特異的なプロテアーゼおよび既知の多くの病原体のプロ
テアーゼ開裂部位の例を示す。載せられているプロテアーゼ開裂部位は本発明に
従って用いることができるものの実例である。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】 また、Gluzman,I.Y. et al., J. Clin. Invest., 94:1602(1994); Grakoui, A
. et al., J. Virol., 67:2832(1993); Kolykholov, AA. et al., J. Virol., 6
8:7525(1994); およびBarrie, K.A. et al., Virology, 219:407(1996)を参照さ
れたい。これらの開示は参考として明細書に取り入れる。
【０１２３】 追加の病原体特異的プロテアーゼおよび特定の開裂部位が記載されており、抗
病原体システムに従って用いることができる。 たとえば、ＨＳＶ−１成熟プロテアーゼおよびプロテアーゼ開裂部位が記載さ
れている。たとえば、Hall, M.R.T and W. Gibson, Virology, 227:160(1997)を
参照されたい。これらの開示は参考として明細書に取り入れる。
【０１２４】 さらに、プラスメプシンＩおよびＩＩと呼ばれる２つのアスパラギン酸プロテ
イナーゼがP. falciparumの消化胞で見い出された。相当するプロテイナーゼ開 裂部位も記載された。たとえば、Moon, R. P., Eur. J. Biochem. 244:552(1997
)を参照されたい。 部位が意図されたように病原体特異的プロテアーゼで特異的に切断される限り
、上で引用したプロテアーゼ開裂部位はいかなるものも所望のように（たとえば
部位特異的突然変異誘発によって）修飾できるのは喜ばしいことである。例えば
、特異的なタンパク分解的開裂に必要な最小配列を決めることは、たとえば、融
合タンパクに関してサイズおよび空間的事項を最適化するために有用かも知れな
い。そのような最小配列は病原体特異的な多くの開裂部位について報告されてい
る。別の方法としては、所望の開裂部位に対する最小配列は、突然変異誘発、特
に欠失解析および部位特異的突然変異誘発（たとえば、アラニンスキャニング突
然変異誘発）によって容易に得ることができる。修飾された開裂部位は、以下に
記載したような標準プロテアーゼ開裂アッセイによって容易に測定することがで
きる。
【０１２５】 用語「特異的に切断される」によって、病原体感染によって誘導される１つ以
上のプロテアーゼにより、特定のプロテアーゼ切断部位が特異的に破壊される（
すなわち加水分解される）ことが意味される。すなわち、プロテアーゼ切断部位
は、ハウスキーピングプロテアーゼに言及されるプロテアーゼのような感染され
たまたは未感染の細胞に天然に存在するプロテアーゼによって破壊されない。こ
れらのプロテアーゼの特異的な切断は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を含む多様な技術によってモニターされ得る。
【０１２６】 好ましい病原体特異的プロテアーゼ切断部位としては、ＨＳＶ−１プロテアー
ゼ切断部位ｐ１７−ｐ２４（ＳＱＶＳＱＮＹ−−−ＰＩＶＱＮＬＱ；配列番号９
）、ｐ７−ｐＩ（ＣＴＥＲＱＮ−−−ＦＬＧＫＩＷＰ；配列番号１０）、および
ｐｒ−ＲＴ（ＩＧＣＴＬＮＦ−−−ＰＩＳＰＩＥＴ；配列番号１１）が挙げられ
る。上述の表１および以下の実施例を参照のこと。
【０１２７】 特に好ましい融合タンパク質としては、配列中で作動可能に連結される（Ｎか
らＣ末端）：１）ＴＡＴまたはその適切な形質導入フラグメント（例えば、最小
ＴＡＴ配列）／ｐ１７−ｐ２４またはプロテアーゼ−ＲＴ切断部位／ＨＳＶ Ｔ
Ｋ；２）ＴＡＴまたはその適切な形質導入フラグメント（例えば、最小ＴＡＴ配
列）／プロテアーゼ−ＲＴ切断部位／ＣＰＰ３２のラージドメイン／ｐ１７−２
４切断部位／およびＣＰＰ３２の小サブユニット；３）ＴＡＴまたはまたはその
適切な形質導入フラグメント（例えば、最小ＴＡＴ配列）／ｐ１７−ｐ２４また
はプロテアーゼ−ＲＴ切断部位／およびｐ１６野生型またはその変異体形態、お
よび４）ＴＡＴまたはその適切な形質導入フラグメント（例えば、最小ＴＡＴ配
列）／（ｐ７−ｐ１）プロテアーゼ切断部位／ＨＩＶプロテアーゼが挙げられる
。
【０１２８】 上記のように、本発明の抗病原体系の使用は、誤って折畳まれた形態において
融合タンパク質を提供することにより促進される。例えば、ネイティブな融合タ
ンパク質は、本発明の抗病原体系に従って使用される場合、対応の誤って折畳ま
れた配列よりも非常に効率悪く形質されることが見出された。従って、本発明の
融合タンパク質が本発明の抗病原体系において使用される前に完全にまたは部分
的に変性されることが一般に好ましい。タンパク質を完全にまたは部分的に変性
するための方法は周知であり、および尿素、特に約６〜８Mの尿素、β−メルカ プトエタノール、ＤＴＴ、ＳＤＳ、または他の界面活性剤、特にイオン性の界面
活性剤のような認識されるカオトロピックな薬剤での処理を含む。さらに意図さ
れるものは、加熱処理および超音波処理のようなタンパク質およびポリぺプチド
を変性し得る物理的処理である。また想定されるものは、１つ以上のカオトロピ
ックな薬剤および物理的処理を包含する方法である。
【０１２９】 本発明の好ましい方法において、融合タンパク質は誤って折畳まれた融合タン
パク質として細胞に導入される。以前に記載されるように、細胞に取込まれる融
合タンパク質の速度および量は、低いエネルギーおよび効率のネイティブな配座
において同じ細胞に導入される同じ融合タンパク質に比較される場合、有意に増
強される。
【０１３０】 本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸および特にＤＮＡ
配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列はファージ、ウイルス、プラスミド、
ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、またはエピソームのような染色体外複製に適
するベクターにより運搬される。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａベクターは、本明細書中に記載される調製方法を容易にするために、および融
合タンパク質の有意な量を得るために使用され得る。ＤＮＡ配列は、適切な発現
ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳
に必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。多様な宿主−ベクター系
がタンパク質をコードする配列を発現するために利用され得る。これらとしては
、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された
哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞
系；酵母ベクターを含有する酵母のような微生物、またはバクテリオファージＤ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質変換された細菌が挙げ
られる。利用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適切な転写および翻訳
エレメントの任意の１つが使用され得る。概してSambrookら、前出、およびAusu
belら、前出を参照のこと。
【０１３１】 一般に、本発明の好ましいＤＮＡベクターは、リン酸ジエステル結合により連
結されるヌクレオチド配列を含み、５’〜３’の方向に、タンパク質形質導入ド
メイン、作動可能に連結される細胞傷害ドメインをコードする配列をコードする
第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部位を含み、。好ま
しくは、コードされる細胞傷害ドメインは、チモーゲンのようなコードされる潜
在的に毒性の分子についてのさらなるクローニング部位を含む。細胞傷害ドメイ
ンがコードされるプロテアーゼ切断部位についてのさらなるクローニング部位を
含むことは、さらに好ましい。
【０１３２】 図３Ａ、Ｂ及び図４Ａは、本発明の特に好ましいＤＮＡベクターを描く。ＤＮ
Ａベクターは、図１において図示されるｐＴＡＴ／ｐＴＡＴ−ＨＡベクターに由
来する。ｐＴＡＴ／ｐＴＡＴ−ＨＡベクターとの使用のために好ましい核酸リン
カー配列は、図２において示される。
【０１３３】 ほとんどの場合において、ＤＮＡによりコードされる融合タンパク質成分のそ
れぞれが「カセット」形式において提供されることが好ましい。「カセット」に
より、各成分が別の成分を標準的な組換え法によって容易に置換えられ得ること
が意味される。特に、カセット形式に配置されるＤＮＡベクターは、コードされ
る融合タンパク質が血清型を発生する能力を有し得るかまたは有する病原体に対
して使用される場合、特に望ましい。 より具体的には、いくつかの場合において、ある病原体血清型が、その血清型
に特異的な個々のプロテアーゼ切断部位と関連し得ることが想定される。この場
合において、カセットとして形式化されるＤＮＡベクター中の１つ以上の既存の
プロテアーゼ切断部位は、別の予め決定されたプロテアーゼ切断部位で必要とさ
れるように置換えられ得る。特定のプロテアーゼ切断部位は、個々の患者におけ
る病原体の存在に従って選択され得る。
【０１３４】 より一般には、本発明のＤＮＡベクターは、必要とされるように融合タンパク
質成分を付加または置換する手段を提供することによって、哺乳動物および特に
ヒトの処置の間に病原体血清型の出現を最小にするかまたは排除するカセットと
して形式化される。 特に、ＨＩＶのような病原性ウイルスに関して、ＤＮＡベクターは、新規なＨ
ＩＶタンパク質分解性切断部位を融合タンパク質中に置換する手段を提供するこ
とによって、ウイルスの特定の株またはウイルスの将来の変異に適合するように
特異的に形式化される。これらの部位は、患者から得られるＤＮＡのポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、および標準的なプライマーを使用するウイルス切断
部位をわたるＤＮＡ配列決定により、患者において容易に決定され得る。例えば
、多様な適切なオリゴヌクレオチドプライマーは、公開された配列に従って、増
幅のために選択され得た。次いで、新規な／変化された切断部位は、融合タンパ
ク質、例えば、以下の実施例において記載されるｐＴＡＴ−ＣＰＰ３２細菌発現
ベクターに挿入され、タンパク質が精製され得および誤って折畳まれ得、次いで
比較的短い時間枠（約３〜４週間）において患者に投与され得る。
【０１３５】 重要なことに、本発明の抗病原体系は従って、インビトロおよびインビボで病
原体血清型の変化を記録し得る有効な「警告系」として作用し得る。特に病原体
血清型の発生は、抗病原体系による減少された殺傷および傷害により明らかであ
る。遺伝子変化された病原体の血清型の出現を迅速に検出する能力は特に、関連
の治療を開発することに関連し、そして例えば、上記のように融合タンパク質を
改変することによっておよび／または以下に記載するように「カクテル」治療ア
プローチを実行することによって改善され得る。 用語「クローニング部位」は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位
を含むことが意図される。典型的に、複数の異なる制限エンドヌクレアーゼ部位
（例えば、ポリリンカー）が、核酸内に含まれる。ＤＮＡベクター中のクローニ
ング部位の至適な配置は、カセット形式を容易にする。
【０１３６】 本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組み合わせによって分離およ
び精製され得る。これらの方法としては、例えば、可溶性を利用する方法（例え
ば、塩沈降および溶媒沈降）、分子量における差異を利用する方法（例えば、透
析、限外濾過、ゲル濾過、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、
電気的変化における差異を利用する方法（例えば、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー）、特異的な親和性を利用する方法(例えば、アフィニティークロマト グラフ)、疎水性における差異を利用する方法（例えば逆相高速液体クロマトグ ラフィー）、ならびに等電点における差異を利用する方法（例えば、等電点電気
泳動、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属アフィニティーカラム）が挙げられる。これら
の方法に関連する開示について概して、SambrookらおよびAusubelら、前出を参 照のこと。
【０１３７】 本発明の融合タンパク質は、実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、
融合タンパク質は、それに天然で付随する細胞成分から単離されて、それによっ
て融合タンパク質は少なくとも８０％、または９０％〜９５％の均一性（ｗ／ｗ
）で存在する。少なくとも９８〜９９％の均一性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパ
ク質は、多くの薬学的、臨床的、および研究的な適用に最も好ましい。一旦実質
的に精製されると、融合タンパク質は、治療学的な適用について実質的に夾雑物
がないべきである。一旦部分的にまたは実質的な純度に精製されると、可溶性融
合タンパク質は治療学的に、または本明細書中に記載されるようなインビボもし
くはインビトロアッセイを行うにおいて、使用され得る。実質的な純度は、クロ
マトグラフィーおよびゲル電気泳動のような多様な標準的な技術によって決定さ
れ得る。
【０１３８】 上述で考察されるように、本発明の融合タンパク質は、不溶性形態において発
現され得る。これは、融合タンパク質のタンパク質分解を回避し得、タンパク質
収量を有意に増加し得、および標的細胞への融合タンパク質の送達を増加し得る
。不溶性タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーまたは上述で詳述さ
れる他の方法のような公知の手順によって精製され得る。 概して上記されるように、宿主細胞は所望の融合タンパク質をコードする核酸
を増殖する調製目的のために使用され得る。従って、宿主細胞は、融合タンパク
質の産生が特に意図される原核生物細胞または真核生物細胞を含み得る。従って
、細胞は、融合物をコードする核酸を増殖し得る酵母、ハエ、ケムシ、植物、カ
エル、哺乳動物の細胞および器官を特に含む。使用され得る哺乳動物細胞株の制
限されない例としては、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（UrlaubおよびChasm、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、77:4216（1980））、２９３細胞（Grahamら、J. Gen. Vi
rol.、36:59（1977））、またはＳＰ２またはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Galfr
eおよびMilstein、Meth. Enzymol.、73(B):3(1981)）が挙げられる。
【０１３９】 所望の融合タンパク質をコードする核酸を増殖し得る宿主細胞は、非哺乳動物
真核生物細胞をまた含み、昆虫（例えば、Sp. frugiperda）、酵母（例えば、S.
cerevisiae、S. pombe、P. pastoris.、K. lactis、H. polymorpha；Fleer、R.
、Current Opinion in Biotechnology、3(5):486496（1992）により概説される ）、真菌、および植物の細胞が挙げられる。また意図されるものは、E.coliおよ
びBacillusのようなある原核生物である。
【０１４０】 所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするため
の標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。用語「トランスフェクトする
」または「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従
来の技術を含むことが意図され、リン酸カルシウム同時沈澱、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入、および／またはインテグ
レーションが挙げられる。宿主細胞をトランスフェクトするための適切な方法は
、Sambrookら、前出および他の実験室教科書において見出され得る。
【０１４１】 本発明はさらに、目的の融合タンパク質を単離するための生成プロセスを提供
する。プロセスにおいて、宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌、または
動物の細胞）は、調節配列に作動可能に連結された目的のタンパク質をコードす
る核酸が導入されており、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
の転写を刺激するために、融合タンパク質の存在下で培養培地中で生産規模で増
殖される。続いて、目的の融合タンパク質は採集された宿主細胞からまたは培養
培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術が、培地からまたは採集され
た細胞から目的のタンパク質を単離するために使用され得る。特に、精製技術は
、多様な器具（回転式ボトル、攪拌フラスコ、組織培養プレート、バイオリアク
ター、または発酵器を含む）から大規模で（すなわち、少なくともミリグラムの
量において）所望の融合タンパク質を発現および精製するために使用され得る。
【０１４２】 より詳細には、本発明に従う使用のための誤って折畳まれた融合タンパク質は
、多様な方法によって生成され得る。例えば、好ましい方法において、所望の融
合タンパク質は適切な細菌細胞中で発現され、次いでこれらの細胞から封入体と
して単離される。続いて融合タンパク質は、約６〜８M尿素のような強力なカオ トロピックな薬剤中で変成され、次いで第１のカラムに対するクロマトグラフィ
ーによりそれに付随する他の細菌細胞成分から融合タンパク質が分離される。次
いで結合された融合タンパク質は、標準的な手段によりカラムから溶出され、次
いで適切な緩衝液中で透析されるかまたは第２のカラムに対してさらにクロマト
グラフィーされて尿素が取り除かれる。このような透析またはクロマトグラフィ
ーは、配座の混合物として融合タンパク質を提供し、最も低いエネルギーの正確
に再折畳みされた配座が小さな部分でのみ生じ、例えば、タンパク質の約２５％
が、低いエネルギーの折畳まれた形態にあり得る。本明細書中で言及されるよう
に、少なくとも部分的に変性される融合タンパク質は、タンパク質サンプルの少
なくとも部分（例えば、実質的に純粋な融合タンパク質サンプルにおけるアミノ
酸残基の総数の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０
、または７５パーセント）が、最も低いエネルギーの再折畳みされた配座以外の
配座にあることを意味する。
【０１４３】 次いで、配座の混合物に誤って折畳まれる融合タンパク質は、所望の細胞に形
質導入され得る。例えば、融合タンパク質は、培養細胞に、またはそれらの細胞
が増殖されている培地に直接的に添加され得る。 理論に束縛されることを望まないが、本発明の融合タンパク質のより高いエネ
ルギーの変性された形態は、目的の細胞により容易に形質導入され得るより低い
エネルギーの配座を採用し得ることが考えられる。対照的に、その好ましい折畳
まれた配座におけるタンパク質は、必然的に低いエネルギー状態で存在し、そし
て比較的より高いエネルギーを採用し得ず、従ってより容易に細胞に導入される
不安定な配座である。
【０１４４】 以前に記載されるように、本発明は従って、ウイルス感染のような病原体の感
染およびウイルスと関連する疾患に対する処置の方法を提供し、この方法は概し
て、病原体感染を被るまたはその疑いのある動物、特にヒトへの、上述で考察さ
れる融合タンパク質の１つ以上の治療学的有効量の投与を包含する。 例えば、本発明の融合タンパク質は、免疫不全病を特にヒトにおいて引き起こ
し得るウイルスで感染された細胞を処置するために有用である。融合タンパク質
は、細胞およびヒト、特にＨＩＶ感染されたヒト細胞において、レトロウイルス
の感染を処置するために特に有用である。本発明に従って処置され得るレトロウ
イルス感染の特定の例としては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびヒトＴ細胞リ
ンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）（例えば、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ
）の感染のようなヒトレトロウイルス感染が挙げられる。
【０１４５】 本発明はまた、インフルエンザ（インフルエンザＡおよびＢを含む）のような
ウイルスによって引き起こされるか、またはそうでなければこのウイルスと関連
する他の疾患、ならびにヘルペスファミリーのウイルス（例えば、単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ）（単純ヘルペスＩ型ウイルスおよび単純ヘルペスＩＩ型ウイ
ルス（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２）、水痘−帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ；帯状ヘル
ペス）、ヒトヘルペス６型ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプス
タイン−バーウイルス（ＥＢＶ））、および他のヘルペスウイルスの感染（例え
ば、ネコヘルペスウイルスの感染）と関連する疾患、ならびに肝炎ウイルス（Ｃ
型肝炎ウイルスを含む）と関連する疾患の処置の方法を提供する。このようなウ
イルスによって引き起こされる臨床的な状態の例としては、ヘルペス性の角膜炎
、ヘルペス性の脳炎、口辺ヘルペス、および生殖感染（単純ヘルペスによって引
き起こされる）、水痘および帯状ヘルペス（水痘−帯状ヘルペスによって引き起
こされる）、ならびにＣＭＶ−肺炎および網膜炎（特に、腎臓および骨髄移植患
者を含む免疫無防備状態の患者、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を伴
う患者において）が挙げられる。エプスタイン−バーウイルスは、感染性の単核
球症を引き起こし得、そしてまた、上咽頭ガン、免疫芽細胞リンパ腫、およびバ
ーキットリンパ腫の原因因子として示唆される。
【０１４６】 病原体は、病原性形態、潜伏性形態、または減弱化形態において存在し得るこ
とが意図される。また意図されるものは、これらの形態の混合物を含む病原体の
集団である。目的の特定の病原体の例は、ウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＨＳＶ−
１、ＨＣＶ、特にＨＣＶ Ｃ型、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＫＳＨ、黄熱病ウイ
ルス、あるフラビウイルスおよびライノウイルス）である。さらに、病原体は、
例えばP.falciparum、P.vivax、P.avale、またはP.malariaeのようなウイルスに
関連するマラリアまたは医学的状態を引き起こし得る任意の病原体であり得る。
典型的に、プラスモディウム属は、マラリアまたはマラリアに関連する種々の医
学的合併症を引き起こす。本発明は、既存の状態を処置するために使用され得る
か、または１つ以上の病原体による感染を防止するために予防的に使用され得る
。
【０１４７】 本発明の抗病原体系および特に融合タンパク質は、１つまたは組合せのストラ
テジーによってインビボまたはインビトロで細胞に投与され得る。 例えば、上記されるように、融合タンパク質は、一般に細胞と融合タンパク質
とを接触する工程および特定の期間融合タンパク質を細胞を介して形質導入させ
る工程を包含する従来の細胞培養技術によって、インビトロで培養において増殖
する一次または不死化細胞に投与され得る。典型的に、細胞培地は、融合タンパ
ク質の濃度を増加するために接触の前に細胞から除去される。
【０１４８】 さらに、融合タンパク質は、例えば、細胞への融合タンパク質の導入に適切な
特定の送達機構を使用することによって、インビボでこれらの細胞に投与され得
る。一般に、選択される送達機構のタイプは、細胞の位置、病原体により感染さ
れる細胞を殺傷または傷害するために必要とされる形質導入の程度、および細胞
の全体的な健常性を含むいくつかの考慮により導かれる。 特に、本発明の融合タンパク質は、常態、特にヒトのような増進者に投与され
得、多様な適切な経路としては、経口、局所（経皮、頬、または舌下を含む）、
鼻および非経口（腹腔内、皮内、静脈内、皮内、または筋肉内を含む）の注射が
挙げられる。概して、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Pub.Co.、
Easton、PA、1980を参照のこと。有意な接触を導く鼻および経口経路は、１つ以
上の融合タンパク質を考慮し、気道上皮、肺組織が一般に好ましい。
【０１４９】 本発明の融合タンパク質は、本明細書中に提供されるような１つ以上の他の融
合タンパク質と組み合わせて、またはジデオキシヌクレオシドのような逆転写酵
素インヒビター（ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、ＦＴＣ、ＤＡＰＤ
、１５９２Ｕ８９、またはＣＳ９２を含む）；ＴＡＴアンタゴニスト（例えば、
Ｒｏ３−３３３５およびＲｏ２４−７４２９）；および他の薬剤（例えば、９−
（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン（アシクロビル）、ガンシクロビル
、もしくはペンシクロビル、インターフェロン（例えばα−インターフェロン）
、もしくはインターロイキンＩＩのような他の薬物との組み合わせて、または他
の免疫調節剤（ウシ骨髄またはリンパ球移植片を含む）もしくは他の処方物（例
えば、適切にリンパ球の数および／または機能を増加するレバミゾールまたはチ
モシンのような他の薬物と組み合わせて、唯一の活性な薬剤として投与され得る
。
【０１５０】 本発明の１つ以上の融合タンパク質と同時投与され得るさらなる薬物としては
、Goodman，G.ら（1993）、The Pharmacological Basts of Therapeutics、第８
版、McGraw~Hill Inc. 978~998頁において開示されるような標準的な抗マラリア
剤を含む。好ましい抗マラリア剤としては、クロロキン、クロログアニジン、ピ
リメタニン、メフロキン、プリマキン（primaquaine）、およびキニンが挙げら れる。 本発明の融合タンパク質を含む上記の薬剤の２つ以上の投与は、「カクテル」
または「カクテル」治療の例である。
【０１５１】 本発明の１つ以上の融合タンパク質は単独で投与され得るが、これらはまた従
来の腑形剤、好ましくは以前に記載されるように経口および鼻送達に一般に適切
である薬学的に受容される有機または無機キャリア物質との混合物中の薬学的組
成物の部分として存在し得る。しかし、いくつかの場合において、投与の他の態
様が、融合タンパク質が、非経口、経口、または他の所望の投与に適切なベヒク
ルと組み合される場合において、ならびに融合タンパク質と有害に反応しないお
よびそのレシピエントに対して有害でない場合において、示され得る。適切な薬
学的に受容されるキャリアとしては、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエ
チレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、マグネシウムステアレ
ート、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジ
グリセリド、石油脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピ
ロリドンなどが挙げられるが、これらに制限されない。薬学的調製物は滅菌され
得、所望であれば、補助剤（例えば、融合タンパク質と有害に反応しない潤滑剤
、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を影響するための塩、緩衝液、発色
剤、香料、および／または芳香族物質など）と混合され得る。
【０１５２】 非経口投与について、特に適切であるのは、溶液、好ましくは油性または水性
溶液、および懸濁液、乳濁液、または移植片（坐薬を含む）である。アンプルは
簡便な単位投薬量である。 経腸投与について、特に適切であるのは、タルクおよび/または炭水化物キャ リア結合剤などを有する錠剤、ドラジェ、またはカプセルである。キャリアは、
好ましくはラクトースおよび／またはコーンスターチおよび／またはジャガイモ
スターチである。シロップ、エリキシルなどが使用され得、ここでは加糖ベヒク
ルが用いられる。これらを含む持続性放出組成物が処方され得、ここでは有効成
分は、マイクロカプセル化、複数のコーティングなどにより異なって分解される
コーティング剤で保護される。
【０１５３】 本発明の治療学的融合タンパク質は、リポソーム中に取込まれ得る。取込みは
、公知のリポソーム調製手順（例えば、超音波処理および押し出し成形）に従っ
て行われ得る。 所定の治療において使用される活性な融合タンパク質の実際の好ましい量は、
利用される特定の融合タンパク質、処方される特定の抗病原系、適用の態様、投
与の特定の部位などに従って変化することが理解される。投与の所定のプロトコ
ルについての至適な投与速度は、上述の指針に関して行われる従来の投薬量決定
試験を使用して、当業者によって容易に確認され得る。 一般に、病原体感染（例えば、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染）の処置のた
めに、適切な有効用量の１つ以上の融合タンパク質が、１日当たりレシピエント
の体重の１ｋｇ当たり０．０１〜１００ミリグラムの範囲、好ましくは、１日当
たりレシピエントの体重の１ｋｇ当たり０．１〜５０ミリグラムの範囲、より好
ましくは、１日当たりレシピエントの体重の１ｋｇ当たり１〜２０ミリグラムの
範囲である。所望の用量は、毎日１回、または数回のサブ用量であり、例えば、
２〜５回のサブ用量が１日を介して適切な間隔で、または他の適切なスケジュー
ルで投与される。 以前に記載されるように、投与の好ましい態様は、エアロゾル形式であり、特
に鼻および経口経路による。
【０１５４】 本発明の別の局面は、本発明の抗病原体系の成分を含むキットに関する。この
ようなキットは、１つ以上の予め決定される病原体により感染される細胞を殺傷
または傷害するために使用され得る。１つの実施態様において、キットはその中
の囲まれた区画に少なくとも２つの容器手段を備え：第１の容器手段は本発明の
１つ以上の融合タンパク質を含み、および必要に応じて第２の容器手段は融合タ
ンパク質をコードする組換えベクターを含む。 キットの成分を用いる場合、抗病原体系を使用するために、融合タンパク質は
上記の方法に従ってインビトロまたはインビボで細胞に投与される。
【０１５５】 本発明は、病原体の１つまたは組み合わせによって感染された細胞を殺傷また
は傷害することが所望される多様な状況に広範に適用可能である。上述で詳述さ
れた使用に加えて、本発明はまた、植物、昆虫、または動物起源の細胞（例えば
、霊長類、およびあるトリ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシなどを含む家畜の
ような他の哺乳動物からの細胞）のような真核生物細胞の病原体感染の機構を研
究することに適用可能である。さらに、本発明は病原体攻撃に対する作物または
食物材料の防御のために使用され得る。
【０１５６】 本発明の別の局面において、抗病原体系は、感染された細胞におけるあるタン
パク質、および特に病原体特異的プロテアーゼを阻害する治療学的能力について
候補化合物をスクリーニングするために使用され得る。特に、好ましいスクリー
ニング法は、抗病原体を所望の細胞、好ましくは培養細胞（不死化および一次細
胞を含む）に形質導入する工程；病原体で細胞を感染する工程、病原体特異的プ
ロテアーゼを阻害し得る潜在的な治療学的能力を有する候補化合物を添加する工
程、および例えば、従来の細胞生存度アッセイを行うことによって、病原体に対
する耐性について細胞を試験する工程を包含する。
【０１５７】 アッセイは通常、ベースラインコントロールに比較されて、細胞に対する目的
の化合物の効果（例えば、得られる表現型）を決定する。さらに、候補化合物は
、抗病原体系での細胞を形質導入する前、間、または後に添加され得る。 ベースラインコントロールは、融合タンパク質の導入の前の細胞、融合タンパ
ク質が導入されなかった細胞、または融合タンパク質が機能的でない（例えば、
非機能的な転写アクチベーター領域を有する）細胞であり得る。１つ以上の予め
決定された病原体が、化合物の投与の前、後、または間に細胞に添加され得る。
【０１５８】 目的の候補化合物は、いくつかの分子の１つであり得、サイトカイン、腫瘍抑
制因子、抗体、レセプター、ムテイン、このようなタンパク質のフラグメントま
たは部分、および活性なＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子もしくは
リボザイム）、または薬物が挙げられる。例えば、ＡＺＴのような公知の ＨＩ
Ｖ ＲＴインヒビターの誘導体のコンビナトリアルライブラリーは、本発明の方
法によって容易に試験され得る。本発明の好ましい化合物は、トリパンブルー排
除試験によるような標準的な細胞生存度アッセイによってアッセイされるように
、細胞殺傷を少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、好ましくは少なく
とも約８０％、およびより好ましくは少なくとも９０％以上まで減少し得る。
【０１５９】 病原体特異的プロテアーゼを阻害する治療学的能力について候補化合物をスク
リーニングするための好ましい方法は、以下の工程： ａ）細胞の集団に本発明の融合タンパク質を形質導入し、病原体特異的プロテ
アーゼを発現または誘導し得るプロテアーゼで細胞を感染し、そしてプロテアー
ゼを発現する工程、 ｂ）サイトトキシンを生成するのに十分な病原体特異的プロテアーゼと融合タ
ンパク質とを接触する工程；および ｃ）病原体特異的プロテアーゼを調節する候補化合物の治療学的能力に任意の
細胞傷害効果を相関する工程、を包含する。
【０１６０】 タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、アンテナペディア・ホメオドメイン
、ＨＳＶ ＶＰ２２；その適切なフラグメント；または形質導入し得る任意の天
然に存在しない配列から選択され得る。細胞傷害ドメインは、カスパーゼおよび
１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含み得る。
【０１６１】 本明細書中に記載されるＤＮＡおよびタンパク質の配列は、具体的に記載され
る供給源のような多様な公共の供給源から得ることができる。好ましい供給源は
、米国国立医学図書館、38A 8N05、Rockville Pike, Bethesda，MD 20894の生物
工学情報センター（NCBI）−遺伝子配列データバンク（ジェンバンク：Genbank ）である。ジェンバンクはまた、「http://www.nbi.nlm.nih.gov.」にてインタ ーネットで利用可能である。ジェンバンクの記載については概して、Benson, D.
A.ら、Nucl. Acids. Res.、25:1(1997)を参照のこと。 実施例において使用された、抗体、細胞、およびウイルスのような他の試薬は
、Linscott’s Directory（40 Glen Drive、Mill Valley California 94941）、
およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）12301 Parklawn Drive
，Rockville、MD 20852のような認識される市販のまたは公共の供給源から得る ことができる。
【０１６２】 本明細書中に記載される全ての書類は本明細書中に参考として援用される。 本発明はさらに以下の実施例によって説明される。これらの実施例は本発明の
理解を補助するために提供され、本発明の制限として解釈されない。
【０１６３】 実施例１−ＴＡＴ融合タンパク質発現ベクターの生成 ＴＡＴ融合タンパク質発現ベクターについての好ましいプラスミドを、以下の
ように調製した。このプラスミドのマップを図面の図１において描く。図２は、
ｐＴＡＴリンカーのヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配
列番号１３）、ならびにｐＴＡＴ−ＨＡリンカーのヌクレオチド配列（配列番号
１４）およびアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。 ｐＴＡＴおよびｐＴＡＴ−ＨＡ（ｔａｇ）細菌発現ベクターを、ＴＡＴドメイ
ン（Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ）（配列番号１６）の自由な結合回転を考慮す
るためにグリシン残基に隣接される１１アミノ酸のＴＡＴドメインに対応するオ
リゴヌクレオチドをｐＲＥＳＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ部位
に挿入することによって作製した。ＮｃｏＩ部位（５’またはＮ’）およびＥｃ
ｏＲＩ部位に第２のオリゴヌクレオチドを挿入することによって、ポリリンカー
をＴＡＴドメインのＣ’末端に添加し、これはＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ−ＡｇｅＩ−
ＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩクローニング部位を含んだ（図１を参照のこと
）。これに、ＢｓｔＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むｐＲＥＳＴ−Ａプラスミド
の残存する元来のポリリンカーが続いた。 ｐＴＡＴ−ＨＡプラスミドを、グリシンに隣接されるＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰ
ＤＹＡ；配列番号１７；図２を参照のこと、ここでは配列が太字で示される）を
コードするオリゴヌクレオチドをｐＴＡＴのＮｃｏＩ部位に挿入することによっ
て作製した。５’またはＮ’ ＮｃｏＩ部位を上述のポリリンカーが続くＨＡタ
グの３’またはＣ’のみを残して不活化した。ＨＡタグは、１２ＣＡ５抗ＨＡ抗
体を使用することにより、イムノブロット、免疫沈降、または免疫組識染色によ
る融合タンパク質の検出を許容する。 各リンカーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２において記載される。
ｐＲＳＥＴ−Ａ骨格は、アンピシリン耐性、ｆｌ、ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ
（プラスミド複製）をコードし、そして転写は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターによって駆動される。
【０１６４】 実施例２−誤って折畳まれたＴＡＴ融合タンパク質の調製 以下に記載されるＴＡＴ融合タンパク質を宿主細胞から精製し、そして形質導
入を増強するために意図的に誤って折畳んだ。より具体的には、５時間の１Ｌ培
養物から得られたトランスフェクトしたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（No
vagen）の超音波処理によって、融合タンパク質を精製した。培養物を１０ｍｌ の緩衝液Ａ（８Ｍ 尿素／20mM HEPES(pH7.2)100mM NaCl）中、一晩培養物から の１００ｍｌで接種した。細胞溶解物を遠心分離により分離し、緩衝液Ａ＋２０
ｍＭ イミダゾール中でＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）にロードした。次いで、
カラムを１０×カラム容量中で洗浄し、緩衝液Ａ中のイミダゾールの濃度を増加
する（段階的に行う）ことによって溶出し、次いで４M尿素／20mM HEPES(pH7.2(
50mM NaCl))中でＦＰＬＣ(Pharmacia)上のＭｏｎｏ−Ｑカラムに適用した。ＴＡ
Ｔ融合タンパク質を１Ｍ ＮａＣｌ工程で溶出し、ＰＤ−１０脱塩カラム（Phar
macia）においてＰＢＳまたは20m M HEPES [pH7.2]／137mM NaClに脱塩し、そ して１０％グリセロール中で−８０℃にて凍結した。 ＦＩＴＣ標識されたＴＡＴ融合タンパク質を、蛍光標識化（Pierce）によって
作製し、次いでＦＰＬＣ（Pharmacia）に付着されるＳ−１２カラムにおいてＰ ＢＳ中でゲル精製し、そして培養培地に直接的に添加した。
【０１６５】 実施例３−ＴＡＴ ｐ１６融合タンパク質の生成 ＨＩＶプロテアーゼ切断部位（ｐ１７−ｐ２４またはｐ７−ｐ１）を含むＴＡ
Ｔ ｐ１６融合タンパク質を以下の方法に従って作製した。 Ａ．ｐＴＡＴ−（ＨＩＶ切断部位）構築物の調製： このプラスミドを、ｐ１７−ｐ２４およびｐ７−ｐ１ ＨＩＶ切断部位をコー
ドする２本鎖オリゴマーをｐＴＡＴおよびｐＴＡＴ−ＨＡのＮｃｏＩ部位に挿入
することによって作製した。切断部位は１４アミノ酸からなり、ＨＩＶ切断部位
の各側は７アミノ酸であった。 ｐ１７−ｐ２４部位（５７ ｍｅｒ）、ポジティブな鎖： ５’ CAT GTC AGG CTC CCA GGT GTC ACA GAA CTA TCC AAT CGT GCA GAA CCT GCA
GGG CGC ３’（配列番号18） ｐ７−ｐ１ ＨＴＶ切断部位（６０ ｍｅｒ）、ポジティブ鎖： ５’ CAT GCA TTC AGG CTG CAC CGA ACG CCA GGG TAA CTT CCT GGG CAA AAT CTG
GCC AGG CGC ３’（配列番号１９） ＨＩＶ切断部位ｐ１７−ｐ２４（配列番号１８）またはｐ７−ｐ１（配列番号
１９）に対応するオリゴヌクレオチドを、実施例１において記載されるｐＴＡＴ
ベクターに融合して（ＰＴＤ部位に対して３’）、それぞれ、ｐＴＡＴ−ＨＩＶ
１またはｐＴＡＴ−ＨＩＶ２ベクターを生成した。ｐＴＡＴ−ＨＩＶ１、２ベク
ターは、図３Ａ、Ｂ及び図４Ａにおいて実施例のために示される構築物について
の親ベクターとして作用した。ｐ１６タンパク質ｃＤＮＡ配列を、ｐ１７−ｐ２
４ ＨＩＶ切断部位に融合して、インフレームのＴＡＴ−１６融合タンパク質ｃ
ＤＮＡを生成した（図４Ａ）。第２のｐ１６融合タンパク質を、ｐ１６ｃＤＮＡ
をｐＴＡＴ−ＨＩＶ２ベクターに融合することによって作製した。各ベクター構
築物中の成分の順番（Ｎ’末端からＣ’末端）は：HIS~TAT~PTD~CLEAVAGE SITE~
p16~PROTEIN であり、ここで「開裂部位(cleavage site)」は、それぞれ、ｐ１７−ｐ２４ま たはｐ７−ｐ１切断部位を示す。上述の実施例２において記載される方法に従っ
て、融合タンパク質をぞれぞれ精製し、そして誤って折畳んだ。ＴＡＴ−ｐ１６
ｃＤＮＡベクターを、ＤＨ５−α細菌中で増殖した。 精製されたｐ１６融合タンパク質を、ＨＩＶにより感染されたＪｕｒｋａｔ
Ｔ細胞に個々に形質導入した。ＨＩＶでＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を感染するための
方法および融合タンパク質を形質導入する方法は以下の実施例において記載され
る。４、８、および１２時間後、細胞を、市販の抗ｐ１６抗体（Santa Cruz）を
使用するウェスタン/イムノブロット分析により融合タンパク質の切断について 分析した。対照として、ｐ１６ ｃＤＮＡを実施例１において記載されるｐＴＡ
Ｔベクターに融合して、図４Ｂにおいて示されるベクター（ＨＩＶプロテアーゼ
切断部位がない）を生成した。このベクターは、感染された細胞において切断さ
れないＴＡＴに融合されるｐ１６融合タンパク質をコードした。しかし、効率的
な切断が、図４Ａにおいて示されるベクターによりコードされるｐ１６融合タン
パク質で観察され、ＴｈｔはＨＩＶ切断部位を含んだ。
【０１６６】 実施例４−ｐ１６融合タンパク質内側形質導入化細胞の検出 ｐ１６融合タンパク質がＨＩＶ感染された細胞の細胞質ゾルに残存し得るか否
かを見るために、実施例３において生成されたＴＡＴ−ＨＩＶ１、２ ｐ１６融
合タンパク質を上記のように精製し、そしてＦＩＴＣで標識した。次いで、約３
５〜４５ナノモルの標識された融合タンパク質を、以下の実施例６に従ってＨＩ
Ｖ（ＮＬＨＸ株）感染されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞および未感染のＪｕｒｋａｔ
Ｔ細胞に添加した。次いで、形質導入されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＦＡＣＳ
により分析した。ＨＩＶ感染された／未感染の細胞の混合集団において全て（１
００％）の細胞が、ＦＩＴＣ結合融合タンパク質の添加の１、２、４、８、およ
び１６時間後にｐ１６タンパク質で形質導入された。しかし、細胞を新鮮な培地
中で洗浄し、そして濃度勾配に起因してＰＴＤが細胞の外に押し出された場合、
ＦＡＣＳにより分析されるようにＦＩＴＣで標識されたｐ１６の継続される存在
によって決定されるように、感染された細胞は切断された物質（ｐ１６タンパク
質）を保持したが、未感染の対照は形質導入されたタンパク質の全てを喪失した
（これは、形質導入を戻した）。
【０１６７】 実施例５−ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質の生成 ヒトＣＰＰ３２ ｃＤＮＡ（Alnemriら、J.Biol.Chem.、269:30761（1994）；
ジェンバンク・アクセス番号U13737）を、ＣＰＰ３２ ｐ１７およびｐ１２ドメ
インを個々にＰＣＲし（すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程を行い
）、次いでこれらのＤＮＡフラグメントをともに添加し、そして外側のＰＣＲプ
ライマーを使用してＰＣＲすることにより作製した。プロトコルは図６において
概説される。これは、二重ＰＣＲクローニングアプローチと呼ばれ、および２つ
の独立したＤＮＡフラグメントをともに連結するための一般的な方法論的アプロ
ーチであり、以下のようである： ＣＰＰ３２ ｃＤＮＡのｐ１７ドメインを、Ａ（＋鎖）およびＢ（−鎖）プラ
イマー（以下を参照のこと）を使用してＰＣＲし、そしてｐ１２ドメインをＢ（
＋鎖）およびＣ（−鎖）プライマーを使用することによりＰＣＲした。Ａプライ
マーは、ＣＰＰ３２ ｐ１７ドメインコード配列とインフレームにｐ１７−ｐ１
ＨＩＶ切断部位をコードし、そしてＢプライマーは、ｐ１７−ｐ２４ ＨＩＶ
切断部位をコードする。この第１のＰＣＲ後、２つの精製されたフラグメントを
ともに混合し、そしてＡ（＋鎖）およびＣ（−鎖）プライマーのみを使用してＰ
ＣＲした。ｐ１７のＰＣＲされたドメインの３’末端は、ｐ１２のＰＣＲされた
ドメインの５’末端の（−）鎖を含んだので２つのＤＮＡフラグメント塩基対は
調和した。このＰＣＲ後、得られるＤＮＡフラグメントを５’末端をＸｈｏＩで
、および３’末端をＥｃｏＲＩで消化して、約９００ｂｐのフラグメントを得た
。このフラグメントをｐＴＡＴおよびｐＴＡＴ−ＨＡプラスミドのＸｈｏＩおよ
びＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。タンパク質、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型を
、上述で概説されるようにＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）細胞中で生成した。 Ａ（＋鎖）プライマー、（９０ ｍｅｒ）： ５’ CGC CTC GAG GGC GGC TGC ACC GAA CGC CAG GCT AAC TTC CTG GGC AAA ATC
TGG CCA GGC GGA ATA TCC CTG GAC AAC AGT TAT AAA ATG ３’（配列番号２０ ） Ｂ（＋鎖）プライマー、（７２ ｍｅｒ）： ５’ GGC GGC TCC CAG GTG TCA CAG AAC TAT CCA ATC GTG CAG AAC CTG CAG GGG
GGT GTT GAT GAT GAC ATG GCG ３’（配列番号２１） Ｂ（−鎖）プライマー、（７５ ｍｅｒ）： ５’ ACC GCC CTG CAG GTT CTG CAC GAT TGG ATA GTT CTG TGA CAC CTG GGA GCC
GCC TGT CTC AAT GCC ACA GTC CAG ３’（配列番号２２） Ｃ（−鎖）プライマー、（３７ ｍｅｒ）： ５’ CGA GCT ACG CGA ATT CTT AGT GAT AAA AAT AGA GTT C ３’（配列番号２ ３） 得られる構築物中の成分の順番（Ｎ’末端からＣ’末端）は：ＨＩＳ−ＴＡＴ
−ＰＴＤ−ＨＩＶ２−ＣＰＰのサブユニット−ＨＩＶ１−ＣＰＰ３２の小サブユ
ニットであった。ＨＩＳ−ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＨＩＶ２−ＣＰＰ３２ ＣＤＮＡの
大サブユニット−ＨＩＶ−ＣＰＰ３２ ｃＤＮＡの小サブユニット融合タンパク
質をコードするベクターをぞれぞれ、ＤＨ５−α細菌中で増殖した。上述の実施
例２において記載されるように融合タンパク質を発現させ、そして精製した。Ｈ
ＩＳ−ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＨＩＶ２−ＣＰＰ３２の大サブユニット−ＨＩＶ１−Ｃ
ＰＰ３２の小サブユニットの融合タンパク質は、「ＴＡＴ−ＣＰＰ３２」と呼ば
れる。
【０１６８】 実施例６−ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質での特異的な細胞殺傷 実施例５において生成されたＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質がＨＩＶで感
染された細胞を殺傷し得ることを示すために、融合タンパク質を、実施例２にお
いて上記されるように精製し、そしてＦＩＴＣで検出可能に標識した。標識され
たＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質を以下の方法によって試験した。 約５×１０６個のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＨＩＶ（NLHX株：１ml当たり約１
×105〜１×106感染性ウイルス）により感染した。細胞をＲＰＭＩ培地中で増殖
した。感染の約４〜７日間後、培地をプレートから除去し、そして約３５〜４５
ナノモルのＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質を細胞に添加した。細胞を融合タ
ンパク質とともに約３０分間インキュベートして、細胞に形質導入させた。ＦＡ
ＣＳ分析を用いて、細胞の約１００％が融合タンパク質によって形質導入された
ことが見出された。続いて、培地をプレートに戻し、そして形質導入の約１８時
間後、従来のトリパンブルー排除および顕微鏡を使用して、細胞を細胞殺傷につ
いて試験した。 ほとんどすべての感染された細胞が、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２によって殺傷された
ことが見出された。この結果は、これがＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質がＨ
ＩＶで感染された細胞を特異的に殺傷するが、集団中の未感染の細胞を殺傷しな
いことを示すので重要である。
【０１６９】 実施例７−ＴＡＴ ＣＰＰ３２殺傷活性の阻害 １．ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの投与 ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質がＨＩＶ−プロテアーゼの特異的な導入を
必要とする機構によりＨＩＶで感染されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を殺傷したこと
を示すために、プロテアーゼインヒビターのリトナビル（Ritonavir）（Abbott ）を、融合タンパク質の形質導入後、感染された細胞に添加した。簡潔には、細
胞を上述の実施例６において記載されるように感染および形質導入した。形質導
入後、約１μｇ／ｍｌのリトナビルを細胞培地に添加し、そして約１８時間細胞
とともにインキュベートした。次いで、細胞を従来のトリパンブルー排除および
顕微鏡によって細胞殺傷についてアッセイした。 リトナビルの投与は、感染された細胞を殺傷するＴＡＴ−ＣＰＰ３２の能力を
本質的にブロックしたことが見出された。従って、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タン
パク質がＨＩＶで感染された細胞を殺傷するには、活性なＨＩＶプロテアーゼを
必要とする。
【０１７０】 ２．ＣＰＰ３２融合タンパク質の変異（ＴＡＴ−ＣＰＰ３２変異体Ｃ１６３Ｍ ） ＴＡＴ−ＣＰＰ細胞殺傷が、ＨＩＶ特異的切断後のＣＰＰ３２タンパク質の活
性化に起因したことを実証するために、ＣＰＰ３２を１６３残基で触媒性システ
インをメチオニンに変異することによって不活化した。簡潔には、実施例５にお
いて作製されたＴＡＴ−ＣＰＰ３２分子を、部位特異的変異誘発により活性部位
における触媒的に活性なＣｙｓ残基（１６３番目）をＭｅｔに変化するように、
変異誘発した。以下の２本鎖オリゴマーヌクレオチドをＳｔｕＩ部位（インサー
トの５’末端にてｐ１７ドメインにおいて）およびＰｓｔＩ部位（ＴＡＴ−ＣＰ
Ｐ３２中のｐ１７ドメインとｐ１２ドメインとの間のｐ１７−ｐ２４ ＨＩＶ切
断部位中に存在する）に挿入した。２本鎖オリゴマーは、ＳｔｕＩ ５’末端で
平滑末端を有し、そしてＰｓｔＩ ３’末端で３’オーバーハングを有する。 ポジティブ鎖オリゴ（８５ ｍｅｒ）： ５’ CCA TGC GTG CTA CCG AAC TGG ACT GTG GCA TTG AGA CAG GCG GCT CCC AGG
TGT CAC AGA ACT ATC CAA TCG TGC AGA ACC TGC A ３’ （配列番号２４）（太字はＣｙｓからＭｅｔへのコドンの変化を示す）。
【０１７１】 融合タンパク質は、ＣＰＰ３２融合タンパク質の１６３位で変異された触媒性
Ｃｙｓ残基を示すために、「ＴＡＴ−ＣＰＰ３２ｍｕｔ」または「ＴＡＴ−ＣＰ
Ｐ３２変異体」と呼ばれた。 ＴＡＴ−ＣＰＰ３２変異体融合タンパク質を、実施例６において上記されるよ
うに精製し、そしてＨＩＶで感染されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に形質導入した。
この融合タンパク質は、ＨＩＶで感染された細胞を殺傷し得ないことが見出され
た。対照的に、実施例６の結果は、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質（野生型
の触媒性Ｃｙｓ残基を有する）がＨＩＶで感染されたＪｕｒｋａｔ細胞を特異的
に殺傷したことを示す。 カスパーゼおよび特にＣＰＰ３２の活性化がアポトーシスを誘発することが認
識され、当該分野において「帰らざる点（point~of~no~return）」として知られ
る。結果はこの認識と一致する。結果は、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質が
、ＨＩＶで感染された細胞をおそらくアポトーシスを受けることによって特異的
に殺傷することを示す。特に、放出されるＣＰＰ３２分子は、ＰＡＲＰのような
特異的な基質を切断することによりまたはその切断により内因性カスパーゼを活
性化することによって、感染された細胞においてのみアポトーシスを開始すると
考えられる。
【０１７２】 HIV複製は、その感染性の生活環の部分として成熟のために、ｇａｇおよびｇ ａｇ−ｐｏｌのようなウイルスポリタンパク質を切断およびプロセスするのにＨ
ＩＶプロテアーゼの存在および特異的な活性を一般に必要とすることが、当該分
野において認識される。ＨＩＶ複製を受けるＨＩＶで感染された細胞への抗ＨＩ
Ｖ殺傷分子の形質導入は、本発明の任意の抗ＨＩＶ殺傷分子における操作された
ＨＩＶ切断部位の特異的な認識を生じ、これを不活性なタンパク質から活性な殺
傷分子へ変換するが、未感染の細胞へ形質導入はこれを生じない。しかし、未感
染の細胞は、ＨＩＶ特異的プロテアーゼを含まず、それゆえ、未感染の細胞中に
存在するがこれは不活性な形態のままである。 任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２分子の
ような抗ＨＩＶ融合タンパク質にり形質導入された細胞はアポトーシスを受け、
それによって新規にパッケージングされたウイルス粒子のウイルス群発を減少す
る。さらに、いくつかのタンパク質はビリオンの内側にパッケージングされ、プ
ロテアーゼおよびＲＴを含むので、任意の逃避するパッケージングされたウイル
ス粒子は、１）新規な細胞の感染の前に粒子を殺傷し得るか、または２）新規に
感染された細胞中でアポトーシスを開始し得る（もしそうであれば、任意のウイ
ルス粒子の複製の前に生じるべきである）活性なＨＩＶ殺傷分子を含み得る。
【０１７３】 実施例８−ＴＡＴ−ＴＫ融合タンパク質の生成およびこの融合タンパク質での
特異的な細胞殺傷 図４は、ＴＫを含有する融合タンパク質を細胞に形質導入し、次いで形質導入
された細胞とプロドラッグ（アシクロビル（Glaxo Wellcome））とを接触するこ
とによって、ＨＩＶで感染されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を殺傷するための方法を
概説する。融合タンパク質から放出されるＴＫはアシクロビルを活性な殺傷分子
に変換し、それによって感染された細胞を殺傷する。しかし、未感染（対照）の
細胞は、ＴＫ融合タンパク質の形質導入およびアシクロビルの導入により傷つけ
られない。 ＴＡＴ−ＴＫ融合タンパク質は、以下の方法によって作製された。ＨＳＶ−１
ＴＫ配列を、ジェンバンク（アクセス番号J02224）から得た。ＴＫのＮ’およ
びＣ’に対応するＰＣＲプライマーを作製した。ＰＣＲ後、ＤＮＡフラグメント
をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そしてｐＴＡＴ−（ＨＩＶ ｐ１７−ｐ
２４切断部位）またはｐＴＡＴ−（ＨＩＶ ｐ７−ｐ１切断部位）のＮｃｏＩお
よびＥｃｏＲＩ部位に挿入した。 ＴＫ正方向ＰＣＲプライマー（３４ ｍｅｒ）： ５’ CGG GCC GGC CCC ATG GCT TCG TAC CCC TGC CAT C ３’（配列番号２５） ＴＫ逆方向プライマー（３９ ｍｅｒ）： ５’ GGC GGG CCG GGA ATT CTC AGT TAG CCT CCC CCA TCT CCC ３’（配列番号 ２６）
【０１７４】 融合タンパク質を、実施例２において上述で考察されるようにそれぞれ精製し
、そして誤って折畳んだ。 約５×１０６ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、実施例６において上記されるように
ＨＩＶ（NLHX株）によって感染した。感染の約４〜７日後、培地をプレートから
除去し、そして約３５〜４５ナノモルのＴＡＴ−ＴＫ融合タンパク質（ｐ１７−
ｐ２４またはｐ７−ｐ１切断部位）を細胞に添加した。細胞を融合タンパク質と
ともに約３０分間インキュベートして、細胞に形質導入させた。ＦＡＣＳ分析を
用いて、細胞の約１００％が融合タンパク質によって形質導入されたことが見出
された。 形質導入された細胞を約１８時間インキュベートさせてＴＡＴ−ＴＫ融合タン
パク質から切断されたＴＫを確立させた。この期間の後、細胞を培地中で洗浄し
、そしてさらに４時間インキュベートさせた。この時点で、約１〜１００ナノモ
ルのアシクロビルをプレートに添加した。約３日後、感染された細胞および非感
染細胞を、従来のトリパンブルー排除および顕微鏡により細胞殺傷について試験
した。感染された細胞の総数の約１００％が、ＴＡＴ−ＴＫ融合タンパク質およ
びアシクロビルの投与によって殺傷されたことが見出された。 結果は、ＴＫ酵素が感染された細胞中に特異的に濃縮されたことを示した。し
かし、未感染の細胞において、ＴＫ酵素は濃縮されず；ＴＡＴ−ＴＫ融合タンパ
ク質は、洗浄後これらの細胞の外に形質導入が戻ることが見出された。従って、
ＨＳＶ ＴＫは、これが保持される細胞、感染された細胞においてのみ、プロド
ラッグを活性な殺傷薬物にプロセスし、ヒト／哺乳動物 ＴＫがプロドラッグを
プロセスし得ないことに起因して正常な細胞においてプロセスしないことが考え
られる。従って、結果はＴＡＴ−ＴＫ融合タンパク質が有効な抗ＨＩＶ殺傷分子
であることを実証する。
【０１７５】 ＴＫに加えて、ＨＳＶシトシンデアミナーゼｃＤＮＡはＴＫ遺伝子について容
易に置換され得、当該分野において公知のあるヌクレオチドアナログと組み合わ
せて、ＨＳＶで感染された細胞の特異的な殺傷または傷害を提供する。 詳細に記載されるＴＡＴ−ＴＫおよびＴＡＴ−ＣＰＰ融合タンパク質は、注射
可能な形態として、または好ましくは融合タンパク質が血流中に形質導入される
肺に融合タンパク質を送達するための吸入デバイスを介してのいずれかでＨＩＶ
で感染された患者に投与され得る。融合タンパク質は、全ての接触された細胞（
気道および肺組識、血球など）に形質導入され、血流中のある免疫細胞のような
ＨＩＶで典型的に感染される細胞を含む。 実験的および理論的モデリングに基づいて、インビボでのＨＩＶで感染された
Ｔ細胞の平均半減期は約１．６日であることが報告されている。それゆえ、ＨＩ
Ｖで感染された細胞についての好ましい処置プロトコルは、注射、およびより好
ましくはいくつかの７日間周期の吸入による。方法の有効性は、血液のような生
物学的液体中のＨＩＶウイルス粒子を検出するための周知の操作（例えば、ＰＣ
Ｒ）を行うことによってモニターされ得る。このプロセスは、患者のウイルス負
荷を見積もるとして時折知られる。操作は、単独でまたは以前に記載されるよう
な抗ＨＩＶ薬物と組み合わせてのいずれかでの融合タンパク質の正確な投薬量を
決定することを補助し得る。
【０１７６】 実施例９−ＴＡＴ−ＨＩＶプロテアーゼでの未感染のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の
形質導入 ＨＩＶ感染は、インビトロでモニターすることが困難であり得ること、および
感染される細胞のパーセントに関してしばしば変化し得ることが認識される。さ
らに、病原体によって感染され得る全ての細胞が、ＨＩＶウイルスによって感染
されるわけではない。これらの問題を克服するために、およびＴＡＴ−ＣＰＰ３
２融合タンパク質により誘導される殺傷をさらに理解することを補助するために
、同時形質導入実験を、ＴＡＴに融合されたＨＩＶプロテアーゼを用いて行った
。目的は、２つの融合タンパク質で未感染のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を同時形質導
入することであり、第１の融合タンパク質は、細胞殺傷分子を含み（ＴＡＴ−Ｃ
ＰＰ３２）、および第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質を切断する
ためのＨＩＶプロテアーゼを含む（ＴＡＴ−プロテアーゼ）。 簡潔には、形質導入可能なＨＩＶプロテアーゼを、ｐＴＡＴ−（ｐ７−ｐ１切
断部位）ベクターにＨＩＶ ＮＬＨＸ株由来のプロテアーゼをＰＣＲクローニン
グすることによって構築した。ＰＣＲプライマーを、プロテアーゼの開始ＡＴＧ
（メチオニン）および翻訳終結部位に対応して合成した。ＤＮＡフラグメントを
、ＮｃｏＩ ５’／Ｎ’末端およびＥｃｏＲＩ部位 ３’／Ｃ’末端にて、ｐＴ
ＡＴ−（ｐ７−ｐ１切断部位）ベクターに挿入した。タンパク質を、ＢＬ２１（
ＤＥ３）細胞中でプラスミド、ｐＴＡＴ−（ｐ７−ｐ１）−プロテアーゼから発
現し、そして上記のように精製した。融合タンパク質は、「ＴＡＴ−プロテアー
ゼ」と呼ばれる。
【０１７７】 ＴＡＴ−プロテアーゼによるＴＡＴ−ＣＰＰ３２の活性化を試験するために、
２×１０６ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を２ｍｌの培養（ＲＰＭＩ培地）中に置いた
。これらの細胞に対して、対照および実験的な形質導入可能なタンパク質の種々
の組み合わせを、５０〜１００ｎＭの範囲に以下のように添加した： １． 対照 ２． ＴＡＴ−プロテアーゼ（５０〜１００ｎＭ） ３． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型（５０〜１００ｎＭ） ４． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２変異体（５０〜１００ｎＭ） ５． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型＋ＴＡＴ−プロテアーゼ ６． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２変異体＋ＴＡＴ−プロテアーゼ ７． Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ（ＨＩＶプロテアーゼインヒビター） ８． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型＋Ｒｉｔｎｏｖｉｒ ９． ＴＡＴ−ＣＰＰ３２変異体＋Ｒｉｔｎｏｖｉｒ 細胞を、トリパンブルー排除色素顕微鏡により添加の１８時間後での生存につ
いてアッセイした。ＴＡＴ−プロテアーゼ、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型および変
異体タンパク質は、単独で添加される場合最小の細胞傷害を示した。図７および
図８を参照のこと。しかし、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型＋ＴＡＴ−プロテアーゼ
の添加は、生存細胞の実質的な喪失、従ってＴＡＴ−ＣＰＰ３２野生型タンパク
質の活性化を生じたが、変異体＋ＴＡＴ−プロテアーゼの添加では生じなかった
。この実験へのプロテアーゼインヒビターの添加は、特異的なＴＡＴ−ＣＰＰ３
２野生型殺傷の喪失を生じた。従って、ＴＡＴ−ＣＰＰ３２の活性化は、ＨＩＶ
プロテアーゼの存在を必要とする。総合すれば、これらの観察は、ＨＩＶプロテ
アーゼを発現する細胞においてのみＴＡＴ−ＣＰＰ３２タンパク質の活性化の特
異性を実証する。 同時形質導入法は、ＨＩＶウイルスによって通常感染されない細胞を殺傷また
は傷害するために一般に適用可能であると考えられる。このような細胞の例とし
ては、ＣＤ４−（マイナス）免疫細胞および非免疫細胞（例えば、線維芽細胞）
が挙げられる。従って、この方法は、本明細書中に記載される他の形質導入融合
タンパク質（例えば、プロドラッグの投与を必要とする本明細書中に記載される
ＴＡＴ融合タンパク質（例えば、ＴＡＴ−ＴＫおよびアシクロビル））を含むよ
うに容易に適応されることが理解される。
【０１７８】 実施例１０−増強された形質導入効率を伴う合成形質導入ドメイン 以下の人工的な（すなわち、合成の）ペプチドを、上記のように従来のペプチ
ド合成によって作製した。この実験の目的は、形質導入された細胞中の細胞内濃
度により判断されるように、より効率的に形質導入し得る形質導入ドメインを生
成することである。形質導入ドメインを、適切な対照に対して試験し、これは典
型的に「天然の」ＴＡＴまたはＡｎｔｐ形質導入ドメインであった。簡潔には、
ＦＩＴＣ基は、各ペプチドの１００％のＮ末端に合成的に付加され、それによっ
て形質導入速度および各ペプチドの細胞内濃度は、平衡状態で定量され得た。Ｔ
ＡＴ形質導入ドメインは、α−螺旋であるとして認識される。各合成ペプチド配
列において、α−螺旋は、１つの表面上に種々の量のＡｒｇを伴って構築される
。すなわち、表面上に種々の量のＡｒｇ残基を含み、およびＡｌａ残基で置換し
た一連の合成ペプチドが設計された。ＡｌａおよびＡｒｇ残基の両方は、α−螺
旋構造を維持するための最も高い可能性／エネルギー論を有する。図９及び図１
０を参照のこと、これは螺旋車輪投影図として各ペプチドを描く。ペプチドは表
２において以下に示される。
【０１７９】
【表２】
【０１８０】 合成ペプチドを、実施例４において上述される道筋に沿って、Ｊｕｒｋａｔ
Ｔ細胞に形質導入した。表２において見られ得るように、合成ペプチドの全てが
、細胞に形質導入された。データは、最も好ましい速度および細胞内ペプチド濃
度を有する合成ペプチドは、置換されたＡｌａ残基に起因してα螺旋構造を有す
る最も高い可能性を有したことを示す（天然に存在するＴＡＴに比較して）。さ
らに、最も良好な合成ペプチドは、螺旋車輪図によって示唆されるように、螺旋
の単一の表面上に配列されるＡｒｇ残基を有した。図９及び図１０を参照のこと
。特に、配列番号３〜８によって示される改変された合成ぺプチドは、天然に存
在するＴＡＴ（配列番号１）に比較した場合細胞内濃度の約５〜１０倍の増加を
示した。 データは、ＴＡＴと比較して増強された形質導入効率を有する合成ペプチドを
設計することが可能であることを示す。例えば、データは、ペプチド中のα螺旋
ヘリックス形成の可能性を増加することによって、および単一のペプチド螺旋面
上に少なくとも２つのＡｒｇ残基を配列することによって、天然に存在するＴＡ
Ｔの形質導入効率を増加することが可能であることを示す。表２において示され
る合成ペプチド配列は、合成ペプチド配列に融合された多様なアミノ酸配列（例
えば、２、５、１０、２０、５０、および１００アミノ酸の付加）の形質導入効
率を増加するために使用され得る。合成ペプチド配列はまた、約１０、１５、２
０、３０、５０、または約１００、約５００ｋＤ以上のタンパク質配列に融合さ
れ得る。得られる融合タンパク質は、上記のように形質導入効率の増加について
試験され得る。
【０１８１】 天然に存在するＡｎｔｐペプチド（配列番号１０）は、典型的にＴＡＴペプチ
ドよりも遅い形質導入速度を示す。従って、上記の天然に存在するＴＡＴおよび
合成ペプチドはしばしば、アミノ酸配列および特に大きなタンパク質を細胞に形
質導入するために好ましい。 表２は、細胞膜を介する細胞への増強された形質導入により迅速な輸送を生じ
る合成ペプチド配列を示す。データは、１）強力なα螺旋性質および２）Ａｒｇ
によって覆われる少なくとも１つの面／表面を有するそれらのペプチドが、最も
良好な形質導入ドメインであることを示す。図７は残基の置換を示す螺旋車輪プ
ロットを示す。全ての合成ペプチドは、ＴＡＴ（４７〜５７）の形質導入速度に
近い形質導入速度を有するが、いくつかは細胞内濃度の増加を生じる。特定のペ
プチド配列は、Ａｒｇのような塩基残基を含有する螺旋の面を少なくとも有する
。
【０１８２】 実施例１１−改変されたＴＡＴ−Ｂｉｄタンパク質の形質導入によりＨＩＶ／
病原体感染された細胞を殺傷する プロアポトーシスタンパク質Ｂｉｄは、２０ｋＤａのタンパク質であり、アポ
トーシス調節タンパク質のＢｃｌ２／Ｂａｘファミリーに関連する。Ｂｉｄは、
細胞質中のチモーゲン前駆形態に存在する。Ｆａｓのようなレセプターを介する
シグナル伝達によってアポトーシスを受ける細胞の活性化は、２つの別々のプロ
アポトーシスカスケード／経路を生じる。さらに、Ｃａｓｐａｓｅ−８活性化は
、Ａｓｐ５９残基（マウスにおいてアスパラギン残基５９およびヒトにおいてＡ
ｓｐ６０）で細胞質ゾルｐ２０Ｂｉｄの直接的な切断を生じる。これは、Ｂｉｄ
の５ｋＤａの「プロ」ドメインの喪失を生じ、そしてミトコンドリアへのｐｌ５
Ｂｉｄの迅速な移行を生じ、チトクロームｃの放出およびミトコンドリアの減
弱、続いて死を生じる。従って、Ｂｉｄは、不活性な前駆形態／チモーゲンとし
て存在し、これはタンパク質分解性の切断によって特異的に活性化され得、ＤＮ
Ａ分解経路を介するＣａｓｐａｓｅ−３（ＣＰＰ３２）とは異なる経路を介して
アポトーシス誘導を生じる。
【０１８３】 形質導入可能なＴＡＴ−Ｂｉｄタンパク質は、Ｎ’末端にＴＡＴを添加し、Ｂ
ｉｄの内因性Ｃａｓｐａｓｅ切断部位を除去し、そしてこれをＨＩＶ切断部位で
置換えることによって作製され得る（ＴＡＴ−ｐ５ Ｂｉｄ−ＨＩＶ切断−ｐｌ
５ Ｂｉｄ）。目的は、ＨＩＶで感染された細胞またはＨＩＶプロテアーゼを発
現する細胞を殺傷するにおける融合タンパク質の有効性を試験することであった
。 ＴＡＴ−ＨＩＶ切断−ｐｌ５ Ｂｉｄタンパク質はまた、２つの形質導入可能
なＢｉｄタンパク質間の比較を提供するために作製され得る。クローニングスト
ラテジーは、以下に概説され、そしてＴＡＴ−ＣＰＰ３２タンパク質でのように
、任意の病原体プロテアーゼ切断部位がこの殺傷タンパク質にクローン化され得
た。ＨＩＶ切断部位は、モデル系のようにこの実施例において使用される。さら
に、ＴＡＴ−Ｂｉｄによる殺傷は、いくつかの細胞型／疾患においてＴＡＴ−Ｃ
ＰＰ３２よりも有効であり得るか、またはおそらくＴＡＴ−ＣＰＰ３２に補足的
であり、両方の殺傷タンパク質の同時形質導入は、感染された細胞のさらなる殺
傷に対する相乗効果を、潜在的により低い濃度レベルで生じ得る。
【０１８４】 １．クローニングストラテジー −マウスＢｉｄを、以下のＤＮＡプライマーを利用することによってＰＣＲ増
幅し、二重ＰＣＲを行うことにより最終産物がＮｃｏＩ（ＤＮＡ切断部位）−ｐ
Ｓ Ｂｉｄドメイン−ＨＩＶタンパク質分解部位（コードされたタンパク質にお
ける）−ｐ１５ Ｂｉｄドメインを生じる。ＴＡＴ−ＨＩＶ切断−ｐｌＳ Ｂｉ
ｄもまた記載され、構築中である。 先ず、ｐ５ドメインをプライマーＩＦおよび２ＲでＰＣＲ増幅し、そして別個
のＰＣＲ反応においてｐＩＳドメインを、プライマー２Ｆおよび４ＲでＰＣＲす
る。これらのＤＮＡフラグメントを精製し、ともに混合し、そしてそれぞれのＤ
ＮＡフラグメントの３’および５’末端に存在する２Ｆおよび２Ｒに存在する共
通の領域を介してハイブリダイズする。このＤＮＡフラグメントの末端を伸長し
、そして最終のＰＣＲ反応を完全長ＤＮＡフラグメントを選択するプライマーＩ
Ｆおよび４Ｒのみを使用して行う。これは一般的なクローニング技術である。次
いで、５’末端にてＮｃｏＩでのおよび３’末端にてＥｃｏＲＩでの切断により
、完全長のフラグメントをｐＴＡＴ−ＨＡにクローン化／連結する。得られるプ
ラスミドｐＴＡＴ−Ｂｉｄを、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ株に、次いでＢ１２１（
ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、そしてタンパク質をＴＡＴ
−ＣＰＰ３２タンパク質について概説されたように精製した。得られるタンパク
質は、ＴＡＴ−ｐ５とｐ１５ドメインとの間にＨＩＶプロテアーゼ切断部位を接
触し、およびＴＡＴ−ｐ５−ＨＩＶ−ｐ１５ Ｂｉｄと命名される。 ＴＡＴ−ＨＶ−ｐ１５ Ｂｉｄは、単回のＰＣＲ反応が必要とされる以外は上
述に類似して構築され得る。プライマー３Ｆは、ＮｃｏＩ ＤＮＡ切断部位、続
いてＨＩＶタンパク質分解性切断部位、およびｐ１５ Ｂｉｄドメインの５’末
端に相同なＤＮＡ配列を含む。プライマー３Ｆおよびプライマー４ＲとのＰＣＲ
反応から作製されるＤＮＡフラグメントを、上述で概説されるように、ＮｃｏＩ
およびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＴＡＴ−ＨＡのＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ
部位にクローン化する。
【０１８５】 ２．プライマー： プライマーＩＦ（８７ ｍｅｒ）：CgC gCC ATg ggC ggC TCC CAg gTg TCA CA
g AAC TAT CCA ATC gTg CAg AAC CTg CAg ggC ggC gAC TCT gAg gTC AgC AAC gg
T TCC（配列番号27） プライマー２Ｆ（５２ ｍｅｒ）：TTC CTg ggC AAA ATC Tgg CCA ggC ggC Ag
C CAg gCC AgC CgC TCC TTC AAC C（配列番号28） プライマー２Ｒ（４６ ｍｅｒ）：gTT AgC CTg gCg TTC ggT gCA gCC TgT CT
g CAg CTC gTC TTC gAg g（配列番号29） プライマー３Ｆ（８８ ｍｅｒ）：CgC gCC ATg ggC ggC TgC ACC gAA CgC C
Ag gCT AAC TTC CTg ggC AAA ATC Tgg CCA ggC ggC AgC CAg gCC AgC CgC TCC T
TC AAC C（配列番号30） プライマー４Ｒ（７１ ｍｅｒ）：CgC gAA TTC TCA gTC AgC ATA gTC Tgg gA
g gTC ATA Tgg ATA gCC gTC CAT CTC gTT TCT AAC CAA gTT CC（配列番号31） ＴＡＴ−ｐ５−ＨＩＶ−ｐ１５およびＴＡＴ−ＨＩＶ−ｐ１５をクローン化す
る上記のストラテジーは、図１１Ａ〜Ｃにおいて図示される。
【０１８６】 実施例１２−ＨＩＶプロテアーゼ活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３タンパク質の形質
導入によるＨＩＶで感染された細胞の殺傷 ＨＩＶプロテアーゼ活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３タンパク質を、ＨＩＶウイルス
によって感染された細胞を特異的に殺傷するために作製した。融合タンパク質を
以下のように作製した： 先ず、改変されたＣａｓｐ３タンパク質を、Ｃａｓｐ３における２つの内因性
カスパーゼ切断部位（Ａｓｐ−Ｓｅｒ）からの２残基の欠失およびＨＩＶ ｐ１
７−ｐ２４ｇａｇ切断部位（「Ａ」部位）およびｐ７−ｐ１切断部位（「Ｄ」部
位）２０を含む１４残基の挿入によって作製した（図１Ａ）。細胞に改変された
Ｃａｓｐ３を導入するために、完全長のタンパク質を細胞に形質導入する以前に
記載された方法を使用した。Barrie,K.A.ら、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ｇａｇ ｐ１７およびｐ６、およびｇａｇ／ｐｏｌポリタンパク質内のプロテアーゼ切
断部位における天然の変異：ヒト免疫不全ウイルスＩ型によって感染される母親
および子供におけるプロテアーゼインヒビターの不在下でのアミノ酸の置換、Vi
rology 219:407(1996)；Ezhevsky, S.A.ら、サイクリンＤ：Ｃｄｋ４／６複合体
による網膜芽腫タンパク質の低リン酸化は活性なｐＲｂを生じる、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:10699(1997)；Lissy，N.A.ら、ＴＣＲ抗原誘導性の細胞死（
ＡＩＤ）はＧ１後期細胞周期チェックポイントから生じる、Immunity 8:57（199
8）；Nagahara，H.ら、哺乳動物細胞への直接的な完全長TAT融合タンパク質の高
効率の形質導入：ｐ２７ｋｉｐ１は細胞移入を媒介する、Nature Med.（印刷中 ）（1998）；Vocero~Akbani，Aら、哺乳動物細胞への直接的な完全長ＴＡＴ癒合
タンパク質の形質導入：ＴＣＲ活性化誘導性の細胞死（ＡＩＤ）の分析、Method
in Enzymology（Reed，J.C.編）（Academic Press，San Diego）（印刷中）（1
998）を参照のこと。
【０１８７】 簡潔には、細菌により生成され、誤って折畳まれた、ＨＩＶ ＴＡＴ由来のイ
ンフレームのＮ’末端タンパク質形質導入ドメインを含有する融合タンパク質は
、約１００％の全ての標的細胞型（抹消血リンパ球（ＰＢＬ）、全血中に存在す
る全ての細胞、二倍体線維芽細胞、線維肉腫細胞、肝細胞ガン腫細胞、および白
血病Ｔ細胞を含む）に迅速におよび濃度依存性の様式で形質導入し得る。Ezhevs
ky, S.A.ら、Lissy，N.A.ら、Nagahara，Hら、およびVocero~Akbaniら（前出） を参照のこと。改変されたＣａｓｐ３のＰｒｏドメインを除去し、そしてＴＡＴ
形質導入ドメインで置換してＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ融合タンパク質を得た（図
１２）。さらに、触媒的に不活性なＴＡＴ−Ｃａｓｐ３変異体タンパク質をＣａ
ｓｐ３活性部位のＣｙｓ’６３残基をＭｅｔ残基で置換することによって作製し
た（ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ）。 細胞に形質導入するＴＡＴ−Ｃａｓｐ３の能力を試験するために、ＴＡＴ−Ｃ
ａｓｐ３タンパク質をフルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合し、次いでＪｕｒｋａ
ｔ Ｔ細胞の培地に直接的に添加し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
によって分析した（図１３Ａ及びＢ）。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ ＷＴおよびＴＡＴ
−Ｃａｓｐ３ＭＵＴタンパク質は、約１００％の細胞に迅速に形質導入し、２０
分間未満で最大細胞内濃度を達成した。さらに、ＦＩＴＣ標識化タンパク質の添
加の前および後の狭いピーク幅に基づいて、集団内の個々の細胞は、ＴＡＴ−Ｃ
ａｓｐ３−ＦＩＴＣタンパク質の理想的に近い細胞内濃度を含む。共焦点顕微鏡
分析は、細胞質区画および核区画の両方においてＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＦＩＴＣタ
ンパク質の存在を示し、細胞膜にはほとんど付着されなかった。３、６、および
１２ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ−ＦＩＴＣタンパク質の添加の１時間後の平
衡状態での形質導入された細胞のＦＡＣＳ分析は、タンパク質形質導入について
濃度依存性を実証した（図１３Ｄ）。従って、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質は
、迅速なおよび濃度依存性の様式で１００％の全ての細胞に容易に形質導入する
。 形質導入された異種基質のＨＩＶプロテアーゼ切断の概念を試験するために、
モデル基質を以前に特徴付けられたＴＡＴ−ｐ１６融合タンパク質にHIVタンパ ク質分解性切断部位を挿入することによって作製した。Ezhevsky, S.A.ら、Liss
y，N.A.ら、およびVocero~Akbaniら（前出）を参照のこと。ＨＩＶ Ａ切断部位
をＴＡＴドメインとｐ１６ドメインとの間に挿入し、ＴＡＴ−Ａ−ｐ１６融合タ
ンパク質を得た（図１２）。さらに、形質導入可能なＨＩＶプロテアーゼ（ＴＡ
Ｔ−ＨＩＶ Ｐｒ）を作製した。図１２を参照のこと。ＦＩＴＣ−標識化ＴＡＴ
−Ａ−ｐ１６、ＴＡＴ−１６タンパク質（Ezhevsky, S.A.ら、Vocero~Akbaniら （前出）を参照のこと）およびＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質（図１３Ｃ）は
、１００％の細胞に迅速に形質導入したことが見出された。
【０１８８】 図１２Ａ及び図１３において示されるＴＡＴ融合タンパク質の作製および形質
導入は、以下により詳細に説明される：図１２、ＨＩＶ切断部位配列およびＴＡ
Ｔ融合タンパク質のドメインを描く図面。図１３Ａ〜Ｃ、０、２０、および３０
分で細胞に添加されたフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識化ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３Ｗ
Ｔ、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、およびＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質のＦＡ
ＣＳ動力学分析。図１３Ｄ、添加の１時間後での、細胞に添加された３、６、お
よび１２ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ−ＦＩＴＣタンパク質のＦＡＣＳ用量分
析。対照対形質導入細胞のＦＡＣＳピーク幅により測定されるように、約１００
％の細胞への全てのＦＩＴＣで標識されたタンパク質の迅速な、濃度依存性の形
質導入、および集団内の理想に近い細胞内濃度に注目のこと。 インビボ切断についてアッセイするために、ｐ１６（−）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細
胞を１００ｍＭ ＴＡＴ−Ａｐ１６または対照ＴＡＴ−ｐ１６タンパク質（ＨＩ
Ｖ切断部位なし）で、単独でまたは５０ｎＭ ＴＡＴＨＩＶ Ｐｒ融合タンパク
質と組み合わせて５時間形質導入し、そしてＨＩＶ Ａタンパク質分解性切断部
位でのインビボ切断について抗ｐ１６イムノブロットにより分析した（図１４Ａ
）。ＴＡＴ−Ａ−ｐ１６タンパク質基質とＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒとの同時形質導
入は、特異的な基質切断を生じたが、対照ＴＡＴ−ｐ１６タンパク質（ＨＩＶ切
断部位なし）は切断されなかった。切断されたＴＡＴ−Ａ−ｐ１６タンパク質の
サイズ分析は、ｐ１６のＮ’末端に存在する残りのＨＩＶの半分の部位の保持と
一致した（図１４Ａ、レーン４対５を参照のこと）。このアッセイにおいて、Ｈ
ＩＶ Ａ部位がＴＡＴ−Ｄｐ１６タンパク質を含有するＤ部位よりも優先的に切
断されたことがまた注目された。
【０１８９】 さらに、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴタンパク質を、ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタン
パク質と組み合わせて細胞に形質導入した（図１４Ｂ）。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３と
ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒとの同時形質導入は、ＨＩＶプロテアーゼ依存性の様式に
おいて、ｐ１７とｐ１２ドメインとの間のＨＩＶ「Ａ」部位にてＴＡＴ−Ｃａｓ
ｐ３の特異的な切断の検出を生じ、ＴＡＴ−Ｄ部位 ｐ１７−Ａの半分の部位の
タンパク質を生じた。これらの観察は、異種ＨＩＶ切断部位を含有する形質導入
されたＴＡＴ−Ａｐ１６およびＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質が、インビボでＴ
ＡＴ−ＨＩＶプロテアーゼにより基質として認識され得ることを実証する。 図１４Ａおよび図１４Ｂにおいて示される同時形質導入された細胞におけるイ
ンビボプロセシングは、以下により詳細に説明される。図１４Ａ、ｐ１６（−）
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の培養物を、ＴＡＴＨＩＶ Ｐｒタンパク質を組み合わせ
てＴＡＴ−ｐ１６またはＴＡＴ−Ａ−ｐ１６で５時間形質導入し、抗ｐ１６イム
ノブロット分析に供した。ＴＡＴ−ｐ１６タンパク質とＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタ
ンパク質との同時投与は、ＨＩＶ Ａ部位での特異的な切断を生じた。野生型内
因性ｐ１６；Ａ−ｐ１６を含有するＷＣＥ、ＨｅｐＧ２全細胞溶解物は、ＴＡＴ
−Ａ−１６産物を切断し、ｐ１６においてＨＩＶの半分の部位を保持した。図１
４Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の培養物を、ＴＡＴＣａｓｐ３Ｍ
ＵＴタンパク質（ＴＡＴ−「Ｄ」部位−ｐ１７ドメイン−「Ａ」部位−ｐ１２ド
メイン）単独でまたはＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒ（Ｐｒ）タンパク質と組み合わせて
形質導入し、そしてｐ１７ドメインに特異的な抗Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体でイム
ノブロットした。ＴＡＴ−Ｄ−ｐ１７−Ａは、Ｎ’末端のＨＩＶ Ａの半分の部
位を含有するＴＡＴ−Ｃａｓｐ３の産物を切断した。
【０１９０】 さらに、ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質で同時形質導入された細胞中でアポ
トーシスを誘導するＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質の能力を試験した。Ｊｕｒｋ
ａｔ Ｔ細胞を１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴまたはＴＡＴＣａｓｐ３Ｍ
ＵＴタンパク質単独でまたは５０ｎＭ ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質と組み
合わせて処理し、そして処理の１６時間後の細胞生存度についてアッセイした（
図１５Ａ）。細胞へのＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質単独の形質導入は、小
レベルの細胞傷害を実証した。しかし、細胞へのＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴとＴＡ
Ｔ ＨＩＶ Ｐｒタンパク質との同時形質導入は、顕著な細胞傷害を生じた。細
胞へのＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴとＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質との同時投
与は、かろうじて細胞傷害を示し、細胞に対するＴＡＴ−ＨＩＶプロテアーゼ細
胞傷害の効果の不在をまた実証した。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質を活性化す
るためのＨＩＶプロテアーゼの必要性をさらに実証するために、細胞を先ずＨＩ
ＶプロテアーゼインヒビターのＲｉｔｏｎａｖｉｒ（１μｇ／ｍｌ）で予め処理
し、次いでＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質と組み合わせてＴＡＴ−Ｃａｓｐ３
ＷＴまたはＴＡＴ−ＣａｓｐＭＵＴで同時形質導入した（図１５Ａ）。Ｒｉｔｏ
ｎａｖｉｒでの細胞の予めの処理は、ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質と同時形
質導入される場合、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質の細胞傷害効果からの防
御を生じた。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３−依存性細胞死の動力学的分析は、形質導入の
４時間後に検出される細胞死との線形の殺傷曲線を実証した（図１５Ｂ）。これ
らの結果は、細胞傷害が触媒的に活性なＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質の存
在下でのみ生じること、およびＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴの活性化が活性なＨＩＶ
プロテアーゼを必要とすることを実証し、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３のＨＩＶプロテア
ーゼ切断と一致する（図１４Ｂ）。Salvensen，G.S.ら、Henkart，P.A.、Cohen ，G.M.、Woo，M.ら、Enari，M.ら、Liu，X.ら（前出）を参照のこと。
【０１９１】 図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて示される同時形質導入された細胞におけるＴ
ＡＴ−Ｃａｓｐ３の活性化およびアポトーシスの誘導は、以下により詳細に説明
される。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の図１５Ａの培養物を、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ
（ＷＴ）、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ（ＭＵＴ）、およびＴＡＴ−ＨＩＶプロテ
アーゼ（Ｐｒ）タンパク質の組み合わせで１６時間形質導入し、そして細胞生存
度について分析した。ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質とＴＡＴ−Ｃａｓｐ３Ｗ
Ｔとの同時形質導入は、特異的な細胞傷害を生じたが、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵ
ＴとＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒとの形質導入は生じなかった。ＨＩＶプロテアーゼイ
ンヒビターのＲｉｔｏｎａｖｉｒ（Ｒｉｔ）の包含は、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ
タンパク質の活性化をブロック死、そして細胞傷害効果から細胞を防御した。図
１５ＢのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の培養物を、ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒ（Ｐｒ）タン
パク質と組み合わせてＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ（ＷＴ）、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３Ｍ
ＵＴ（ＭＵＴ）タンパク質で同時形質導入し、そして示されるように細胞の生存
度の動力学について分析した。 さらに、形質導入された培養物をＴＵＮＥＬアッセイによって分解されたゲノ
ムＤＮＡについて試験した。Coates，P.J.、組識におけるアポトーシスの同定の
ための分子方法、J. Histotechnology 17:261（1994）。細胞への１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ、１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、または５０
ｎＭ ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質単独の形質導入は、ＴＵＮＥＬポジティ
ブ細胞のバックグラウンドレベルのみを示した（図１６Ａ）。しかし、ＴＡＴ−
Ｃａｓｐ３ＷＴとＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質との同時形質導入は、ＴＵＮ
ＥＬポジティブ細胞の顕著な増加を生じた。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴとＴＡＴ
−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質との同時形質導入は、バックグラウンドのＴＵＮＥＬ
ポジティブ細胞のみを示した（図１６Ａ）。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３の活性化をまた
、人工的なＣａｓｐａｓｅ−３基質を切断するその能力によりアッセイした。Ｊ
ｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴまたはＴＡＴ−Ｃ
ａｓｐ３ＭＵＴタンパク質単独で、または５０ｎＭ ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタン
パク質と組み合わせて６時間処理し、次いで蛍光ＡＦＣの放出によってＤＥＶＤ
−ＡＦＣの切断についてアッセイした（図１６Ｂ）。Xiang，J.ら、Ｂａｘ誘導 性の細胞死はインターロイキン１Ｂ転換酵素様プロテアーゼしないかもしれない
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14550（1996）。上述からのＴＵＮＥＬの結 果と一致して、細胞へのＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴとＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタンパ
ク質との同時形質導入は、カスパーゼ活性の顕著な増加を生じ、これはαＦＡＳ
処理よりも大きかった。
【０１９２】 図１６Ａ〜Ｂにおいて示されるようにＨＩＶプロテアーゼが、ＴＡＴ−Ｃａｓ
ｐ３ＷＴタンパク質を活性化することが以下により詳細に説明される。図１６Ａ
、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の培養物を、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ（ＷＴ）およびＴ
ＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒ（Ｐｒ）タンパク質で同時形質導入して、特異的なＴＵＮＥ
Ｌポジティブ細胞、アポトーシスの末端マーカーを得た。しかし、ＴＡＴ−ＨＩ
Ｖ Ｐｒタンパク質と組み合わせたＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ（ＭＵＴ）の形質
導入およびＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、またはＴＵＴ
−ＨＩＶ Ｐｒタンパク質の単一の形質導入は、ＴＵＮＥＬポジティブ細胞のバ
ックグラウンドレベルのままであった。横座標：高倍率の顕微鏡場当たりのＴＵ
ＮＥＬポジティブ細胞；Ｃｔｒｌ、培養物へのＰＢＳのコントロール添加；エラ
ーバーはＳＤを示す。図１６Ｂ、上述のようなＴＡＴ−ＨＩＶプロテアーゼと組
み合わせたＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴの形質導入は、ＤＥＶＤＡＦＣ切断および酵
素活性として報告されるＡＦＣ蛍光により測定されるようにＣａｓｐａｓｅ−３
活性の特異的な活性化を生じる。Ｃｔｒｌ、コントロールＰＢＳ添加；αＦＡＳ
架橋、ポジティブコントロール。
【０１９３】 ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、またはＴＡＴ−ＨＩＶ
Ｐｒ単独の形質導入は、バックグラウンドレベルのカスパーゼ活性のみを示し
た。さらに、２Ｎ ＤＮＡ含量未満を含有する細胞の出現が、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ
３およびＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒの同時形質導入細胞において検出され、Ｃａｓｐ
ａｓｅ−３の伝統的な特徴は、壊死とは対照的にアポトーシスを誘導した。Ｗｏ
ｏ， Ｍ．ら（前出）を参照のこと。これらの観察は、形質導入されたＴＡＴ−
Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質は、ＨＩＶプロテアーゼを欠損する細胞中で不活性な
ままであるが、アポトーシスの特徴および最終的に死を導く活性なＨＩＶプロテ
アーゼを保有する細胞中で特異的に活性化されるようになることを実証する。
【０１９４】 ＨＩＶについての一般的な動物モデルの不在に起因して、ＴＡＴＣａｓｐ３Ｗ
Ｔタンパク質が培養において生きたＨＩＶで感染された細胞を殺傷し得るか否か
を決定することは興味深かった。 この決定を行うために、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＨＩＶ−１のＮＬＨＸ株で７
〜１４日間感染し、そしてHIV細胞変性効果について顕微鏡で実験した。Westerv
elt，P.らＨＩＶ−１表面エンベロープ糖タンパク質内の決定基の同定は培養さ れた一次単球の生産的な感染に重要である、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:30
97（1991）。各形質導入実験の開始時に、約５０％の培養物がＨＩＶポジティブ
であった。ＨＩＶで感染された培養物を、１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ
またはＴＡＴＣａｓｐ３ＭＵＴタンパク質で１６時間形質導入し、次いで細胞生
存度についてアッセイした（図１７）。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質での
ＨＩＶで感染された細胞の処理は、培養物からのＨＩＶポジティブ細胞の劇的な
喪失を生じた。さらに、本発明者らは、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３で処理した細胞にお
いて２Ｎ ＤＮＡ含量未満を含有する細胞および縮合された核を有する細胞の両
方の出現を検出した。しかし、ＴＡＴＣａｓｐ３ＭＵＴタンパク質の形質導入は
、ほとんど効果を示さなかった。
【０１９５】 ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ誘導性のアポトーシスが感染された培養物中の活性な
ＨＩＶプロテアーゼに依存したかを決定するために、ＨＩＶで感染された培養物
を、１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質での形質導入の前に１μｇ
／ｍｌ Ｒｉｔｏｎａｖｉｒで予め処理した（図６）。上述の実験と一致して、
ＲｉｔｏｎａｖｉｒでのＨＩＶで感染された培養物の予めの処理は、ＴＡＴ−Ｃ
ａｓｐ３ＷＴ誘導性のアポトーシスからの防御を生じた。さらに、Ｒｉｔｏｎａ
ｖｉｒで処理される細胞の観察される増加された生存は、プロテアーゼインヒビ
ターで処理したＨＩＶで感染された細胞の増加された長生と一致する。Coffin，
J.M.ら（前出）を参照のこと。これらの観察は、活性なＨＩＶプロテアーゼを含
有するＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質によるＨＩＶで感染される細胞の特異
的な殺傷を実証し、細胞におけるアポトーシス誘導の欠損はＨＩＶプロテアーゼ
活性がないことを実証する。
【０１９６】 図６において示されるＨＩＶで感染された細胞の特異的な殺傷は、以下により
詳細に説明される。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＨＩＶ株 ＮＬＨＸで７〜１４日間
感染し、次いでＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴ（ＷＴ）またはＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵ
Ｔ（ＭＵＴ）タンパク質で１６時間形質導入し、そして細胞生存度についてアッ
セイした。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質は、単一の投与でＨＩＶポジティ
ブ細胞の大きなパーセントを効率的に殺傷するが、触媒的に不活性なＴＡＴ−Ｃ
ａｓｐ３ＭＵＴタンパク質は、効果を有しなかった。ＨＩＶプロテアーゼインヒ
ビターＲｉｔｏｎａｖｉｒ（Ｒｉｔ）でのＨＩＶで感染された細胞の予めの処理
は、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴタンパク質殺傷から感染された細胞を防御した。Ｃ
ｔｒｌ、培養物へのＰＢＳのコントロール添加；横座標、形質導入開始時での集
団中のＨＩＶポジティブ細胞の生存度の％；エラーバーはＳＤを示す。
【０１９７】 本実施例は、ＨＩＶで感染された細胞を殺傷するための新規なストラテジーを
実証する。重要なことに、このストラテジーは、タンパク質形質導入送達系と組
み合わせてアポトーシス誘導因子、Ｃａｓｐ３の改変されたチモーゲン形態を利
用することによって、ＨＩＶにコードされるプロテアーゼを利用する。結果は、
細胞へのタンパク質の形質導入は迅速な、濃度依存性のプロセスであり、約１０
０％の細胞を標的することを示す。重要なことに、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク
質は、未感染の細胞において不活性であり、そしてＨＩＶで感染された細胞にお
いてＨＩＶプロテアーゼ依存性の切断によって特異的に活性化される。この特異
性の程度は、ＨＩＶで感染された細胞をこのようなストラテジーによって殺傷す
ることが、患者において高い治療学的指数を生じる得ることを示唆する。
【０１９８】 考察されるように、プロテアーゼインヒビターでのＨＩＶで感染された細胞の
現在の処置は、感染された細胞の増加された長生を導く。プロテアーゼインヒビ
ターでの処理と全く対照的に、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質はＨＩＶで感染さ
れた細胞を特異的に殺傷する。さらに、広範な範囲のインヒビターに耐性なＨＩ
Ｖプロテアーゼを与える変異の選択は、ＨＩＶの流行と合わせて継続するおよび
増大する問題である。しかし、ＨＩＶ切断部位を置換することによって、本実施
例および本明細書の開示の他のどこかにおいて提供されるアプローチは、ＨＩＶ
株タンパク質分解性切断部位の分散および／または変異へのＴＡＴ−Ｃａｓｐ３
タンパク質の継続的な適合性を許容する。 本明細書中に記載されるＴＡＴ−Ｃａｓｐ３タンパク質は、関連の病原体特異
的プロテアーゼ切断部位を含むようにタンパク質を操作することによって、他の
病原体と闘うために使用され得る。
【０１９９】 以下の方法が本実施例において使用された。 １．細胞培養−ｐ１６（−）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を記載される
ように増殖した。Lissy，N.A.ら（前出）を参照のこと。インビボ基質切断のた めに、１×１０６細胞を１００ｎＭ ＴＡＴ−ｐ１６、ＴＡＴ−Ａ−ｐ１６、Ｔ
ＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、および／または５０ｎＭ ＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒタン
パク質で示されるように１、５、または８時間形質導入し、そして抗ｐ１６（Sa
nta Cruz）または抗Ｃａｓｐ３（Pharmingen）イムノブロット分析によって分析
した。Ezhevsky，S.A.ら（前出）を参照のこと。未感染の細胞に対するＴＡＴ−
Ｃａｓｐ３の細胞傷害について、１×１０６細胞を１００ｎＭ ＴＡＴ−Ｃａｓ
ｐ３ＷＴ、ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴ、および／または５０ｎＭ ＴＡＴ−ＨＩ
Ｖ Ｐｒタンパク質で１６時間形質導入し、そしてトリパンブルー排除および／
またはＴＵＮＥＬアッセイ（Trevigen）によるゲノムＤＮＡ障害によって生存度
についてアッセイした。高倍率の顕微鏡場当たり報告されるＴＵＮＥＬポジティ
ブ細胞の数を、実験当たり４場で平均した。ＴＡＴ−Ｃａｓｐ３活性を、２０μ
ｇの全細胞溶解物と５０μＭ ＤＥＶＤ−ＡＦＣとのインキュベーションによっ
て測定し、そして蛍光ＡＦＣ形成を、記載されるようにＦＬ５００マイクロプレ
ート蛍光読み取り器（Bio~Tek）において測定した。Xiang，J.ら（前出）を参照
のこと。細胞を形質導入の前に１μｇ／ｍｌ Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ（Abbott Lab
s）で１時間予めインキュベートした。感染された細胞に対するＴＡＴ−Ｃａｓ ｐ３の細胞傷害について、Ｊｕｒｋａｔ培養物を１００ｎｇ ｐ２４ Ａｇ相当
のＮＬＨＸ ＨＩＶ−１株で７〜１４日間感染し、細胞変性効果について顕微鏡
でアッセイし、次いで１×１０６／ｍｌで反復し、そして１００ｎＭのＴＡＴ−
Ｃａｓｐ３ＷＴまたはＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴタンパク質で１６時間形質導入
し、続いて排除色素生存度アッセイを行った。感染された細胞を、ＴＡＴ−Ｃａ
ｓｐ３ＷＴタンパク質での形質導入の前に１μｌｇ／ｍｌ Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ
で２４時間予め処理した。Xiang, J.ら（前出）を参照のこと。フローサイトメ トリー（ＦＡＣＳ）分析について、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合ＴＡＴ融合
タンパク質をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞培養培地に添加し、そして１×１０４細胞を
記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。Ezhevsky，S.A.ら（前出）を参照
のこと。
【０２００】 ２．ＴＡＴ融合タンパク質−ｐＴＡＴ−Ａ／Ｄ−ｐ１６発現ベクターをＨＩＶ
ｐ１７−ｐ２４（「Ａ」）切断部位（単一のアミノ酸コード：ＳＱＶＳＱＮＹ−
ＰＩＶＱＮＬＱ 配列番号９）またはＨＩＶ ｐ７−ｐ１（「Ｄ」）切断部位（
ＣＴＥＲＱＡＮ−ＦＬＧＫＩＷＰ；配列番号１０）の１４残基をコードする２本
鎖オリゴマー核酸を、ｐＴＡＴ−ｐ１６のＮｃｏＩ部位に挿入することによって
構築した。Ratner，L.ら、Welch，A.R.ら、Nagahara, H.ら、およびVocero~Akba
ni，Aら（前出）を参照のこと。ｐＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＷＴベクターを、プライ マー（ｐ１７正方向プライマー： ５’- CGCCTCGAGGGCGGCTGCACCGAACGCCAGGCTAACTTCCTGGGCAAAATCTGGCCAGGCGGAATA
TCCCTGGACAACAGTTATAAAATG~３’（配列番号３２）； ｐ１７逆方向プライマー： ５’~CCGCCCTGCAGGTTCTGCACGATTGGATAGTTCTGTGACACCTGGGAGCCGCCTGT CTCAATGCCACAGTCCAG ３’（配列番号３３）； ｐ１２正方向プライマー： ５’~GGCGGCTCCCAGGTGTCACAGAACTATCCAATCGTGCAGAACCTGCAGGGCGGTGTTGATGATGACA
TGGCG ３’（配列番号３４）； ｐ１２逆方向プライマー： ５’~CGAGCTACGCGAATTCTTAGTGATAAAAATAGAGTTC ３’（配列番号３５）） 中に操作されたＨＩＶ ＡおよびＤ切断部位を含有するｐ１７およびｐ１２ドメ
インを独立してＰＣＲ増幅し、次いでＰＣＲ産物を混合し、そしてｐ１７正方向
プライマーおよびｐ１２逆方向プライマー（ｐ１７逆方向プライマー配列および
ｐ１２正方向プライマー配列は重複する）を使用してＰＣＲ増幅することによっ
て構築した。得られるＰＣＲフラグメントをｐＴＡＴ−ＨＡ２３ ２４にサブク
ローン化して、ＴＡＴ−Ｄ−ｐ１７−Ａ−ｐ１２配座を得た（図１２を参照のこ
と）。ｐＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ＭＵＴベクターを２本鎖オリゴマーヌクレオチド（
ポジティブ鎖： ５’CCATGCGTGGTACCGAACTGGACTGTGGCATTGAGACAGGCGGCTCCCAGGTGTCACAGAACTATCCA
ATCGTGCAGAACCTGCA~３’（配列番号３６） 活性部位Ｃｙｓ’６３残基の代わりにＭｅｔ残基を含有する）をＴＡＴ−Ｃａｓ
ｐ３ＷＴベクターのＳｔｕＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入することによって構築し
た。
【０２０１】 ｐＴＡＴ−ＨＩＶ Ｐｒベクターを、ＨＸＢＲ ＨＩＶ株からＨＩＶプロテア
ーゼ遺伝子をＰＣＲクローン化し（正方向プライマー： ５’CGGTCCATGGGCGGCGGCCCTCAGGTCACTCTTTGGCAACG ３’（配列番号３７）；逆方
向プライマー： ５’CGGGAATTCTCAAAAATTTAAAGTGCAACCAATCTG~３’（配列番号３８））、 そしてｐＴＡＴ２３ ２４にクローン化することによって構築した。簡潔には、
ＴＡＴ融合タンパク質を、高発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen ）の８M尿素中での超音波処理によって精製し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上で精製し 、そして２３ ２４に記載されるようにＭｏｎｏ Ｓカラム上で誤って折畳んだ
。ＦＩＴＣ結合ＴＡＴ融合タンパク質を、フルオレセインイソチオシアネート標
識（Ｐｉｅｒｃｅ）によって作製し、次いでＦＰＬＣ（Pharmacia）またはＰＤ −１０脱塩カラム（Pharmacia）に付着されるＳ−１２カラム上でＰＢＳ中でゲ ル精製し、次いで細胞培地中の細胞に直接的に添加して、ＦＡＣＳまたは顕微鏡
によって分析した。
【０２０２】 実施例１３−クラスＩＩ合成形質導入ドメインの生成および試験 螺旋円柱の下方のアルギニン残基の面を伴う強力なα螺旋構造を必要とする合
成形質導入ドメイン（現在クラスＩ型の合成形質導入ドメインと呼ばれる）のさ
らなる調査の過程において、明らかな第２のクラスの形質導入ドメイン（クラス
ＩＩ型と呼ばれる）が発見された。クラスＩＩ合成形質導入ドメインはまた、ア
ルギニンまたはリシン（しかし、好ましくはアルギニン）のような塩基残基を必
要とするが、プロリン残基の包含に起因する二次構造におけるよじれの導入が、
クラスＩドメインからこれらを区別する。 以下は、クラスＩＩ型の合成形質導入ドメインおよびＨＩＶ ＴＡＴ ４７−
５７に比較される相対的な形質導入能の列挙される６つの例であり、一文字アミ
ノ酸コードを使用する。
【０２０３】
【表３】
【０２０４】 本発明は、その好ましい実施態様に関して詳細に記載された。しかし、本開示
を考慮して、当業者が改変および改良を本発明の精神および範囲内でなし得るこ
とが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はｐＴＡＴ／ｐＴＡＴ−ＨＡのプラスミドマップである。
【図２】 図２はｐＴＡＴリンカーとｐＴＡＴ ＨＡリンカーのヌクレオチド配列とアミ ノ酸配列を示す。最小のＴＡＴドメインは太字部分である。下線を付した配列は
グリシン残基が側面を接する最小のＴＡＴドメインを示す。
【図３】 図３Ａ〜ＢはｐＴＡＴ／ｐＴＡＴ−ＨＡプラスミドにもとづく本発明による例
示としてのＤＮＡベクターを図示したものである。図３Ａは、ＴＡＴ−ＨＳＶ ＴＫ融合タンパク質ベクター、図３ＢはＴＡＴ−カスパーゼ−３融合タンパク質
ベクターである。ＨＩＳと指定した四角の囲みは６ＸＨＩＳタグを任意に付加し
たことを意味する；タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）；ＨＩＶプロテアー
ゼ−ＲＴ切断部位（ＨＩＶ１）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳ
Ｖ ＴＫ）；大型カスパーゼ−３ドメイン（Ｌｇ）；小型カスパーゼ−３ドメイ ン（Ｓｍ）；ＨＩＶｐ１７−ｐ２４プロテアーゼ切断部位（ＨＩＶ２）；ｐ１６
（突然変異体または野生型ｐ１６タンパク質）。ベクター分子量の概数を示して
ある。
【図４】 図４Ａ〜ＢはｐＴＡＴ／ｐＴＡＴ−ＨＡプラスミドにもとづく本発明による例
示としてのＤＮＡベクターを図示したものである。図４ＡはＴＡＴ−ｐ１６融合
タンパク質ベクター、および図４ＢはＰＴＤ−ｐ１６融合ベクターである。ＨＩ
Ｓと指定した四角の囲みは６ＸＨＩＳタグを任意に付加したことを意味する；タ
ンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）；ＨＩＶプロテアーゼ−ＲＴ切断部位（Ｈ
ＩＶ１）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）；大型カス パーゼ−３ドメイン（Ｌｇ）；小型カスパーゼ−３ドメイン（Ｓｍ）；ＨＩＶｐ
１７−ｐ２４プロテアーゼ切断部位（ＨＩＶ２）；ｐ１６（突然変異体または野
生型ｐ１６タンパク質）。ベクター分子量の概数を示してある。
【図５】 図５はプロドラッグを活性薬物に変換し得る酵素を含んでなる融合タンパク質
により細胞を殺す概略模式図である。ＨＩＶ１，２については上記の図３及び図
４に定義してある。
【図６】 図６は本発明によるＴＡＴ−ＣＰＰ３２融合タンパク質を構築する１つの方法
を示す模式図である。
【図７】 図７はＴＡＴ融合タンパク質を形質導入し、抗ＨＩＶ薬物で処理した後の生存
細胞の百分比を示す棒グラフである。
【図８】 図８は図７の棒グラフに用いた生存細胞の百分比（２欄）を示す表である。
【図９】 図９は本発明の好適な形質導入タンパク質のらせんホイール型射影を示す図面
である。「ＴＡＴ（４７〜５７）」はＴＡＴペプチド（配列番号２）のアミノ酸
４７〜５７を意味する。「ＳＦＤ」は特定された形質導入ドメイン配列を意味す
る。図９の「相対細胞内濃度」という用語はＴＡＴペプチドに関係する形質導入
ペプチド配列の細胞内量を意味する。
【図１０】 図１０も本発明の好適な形質導入タンパク質のらせんホイール型射影を示す図
面である。「ＴＡＴ（４７〜５７）」はＴＡＴペプチド（配列番号２）のアミノ
酸４７〜５７を意味する。「ＳＦＤ」は特定された形質導入ドメイン配列を意味
する。図１０の「相対細胞内濃度」という用語はＴＡＴペプチドに関係する形質
導入ペプチド配列の細胞内量を意味する。
【図１１】 図１１Ａ〜Ｃは種々のタンパク質構築物を説明する図面である。図１１Ａはｐ
５およびｐ１５ドメインを強調するビッド（Ｂｉｄ）タンパク質の図式である。
Ａｒｇ５９でのカサパーゼ切断部位を示す。図１１ＢはＴＡＴ−ｐ５−ＨＩＶ−
ｐ１５融合タンパク質のクローニングを概説する。図１１ＣはＴＡＴ−ＨＩＶ−
ｐ１５融合タンパク質を示す。プライマー名称の説明については本文参照。斜線
枠＝ＨＩＶ切断を表すプライマー２Ｒと２Ｆ間の張り出し部分。
【図１２】 図１２はＴＡＴ融合タンパク質の生成と形質導入を示す図面である。図１２は
カスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）タンパク質とＣａｓｐ３ｐ１７およびｐ１２ドメイ
ンを用いて作製された種々のＴＡＴ／ＨＩＶ融合タンパク質を示す。
【図１３】 図１３Ａ〜ＤはＴＡＴ融合タンパク質の生成と形質導入による種々のフルオレセ
イン（ＦＩＴＣ）標識ＴＡＴ融合タンパク質のＦＡＣＳ分析を示すグラフである
。
【図１４】 図１４Ａ〜Ｂはジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞において種々のＴＡＴ融合タン
パク質の生体内プロセシングを示す免疫ブロットの描写である。免疫ブロットは
抗ｐ−１６抗体（図１４Ａ）または抗カスパーゼ−３抗体（図１４Ｂ）により探
査した。
【図１５】 図１５Ａ〜Ｂは同時導入細胞におけるＴＡＴ−Ｃａｓｐ３の活性化およびアポ
トーシス誘導を示すグラフである。図１５ＡはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤リトナ
ビル（Ritonavir）（Ｒｉｔ）とともに種々のＴＡＴ融合タンパク質で形質導入 した後の細胞生存度を示す。図１５Ｂは種々のＴＡＴ融合タンパク質で形質導入
した後の細胞生存度を図解する。
【図１６】 図１６Ａ〜ＢはＨＩＶプロテアーゼがＴＡＴ−Ｃａｓｐ３ｗｔタンパク質を活
性化することを示すグラフである。図１６ＡはＴＡＴ融合タンパク質を用いるＴ
ＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシス性終末マーカー）の結果を示す。図１６ＢはＴ
ＡＴ融合タンパク質を用いるカスパーゼ−３酵素アッセイの結果を示す。
【図１７】 図１７はＨＩＶ感染細胞の特異的殺滅を図示するグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 37/465 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA03 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ02 QQ43 QQ96 QR32 QR55 QS34 4C084 AA02 BA44 MA01 NA13 NA14 ZB332 4C085 AA05 BA02 BA69 BA78 BA83 BA92 BB24 CC08 4H045 AA11 BA10 BA41 CA40 DA01 DA75 EA29 FA74

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 共有結合により結合したタンパク質形質導入ドメインおよ び細胞障害性ドメインを含んでなる融合タンパク質を含んでなることを特徴とす
    る抗病原体システム。
  2. 【請求項２】 該細胞障害性ドメインがさらに少なくとも１つの病原体特 異プロテアーゼ切断部位を含んでなることを特徴とする請求項１記載の抗病原体
    システム。
  3. 【請求項３】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、１ ）形質導入ドメイン、２）第一の病原体特異プロテアーゼ切断部位、および３）
    チモーゲンを含んでなることを特徴とする請求項２記載の抗病原体システム。
  4. 【請求項４】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、１ ）形質導入ドメイン、２）第一の病原体特異プロテアーゼ切断部位、３）触媒チ
    モーゲンフラグメント、および４）第一のチモーゲンサブユニットを含んでなる
    ことを特徴とする請求項２記載の抗病原体システム。
  5. 【請求項５】 該融合タンパク質が第一のチモーゲンサブユニットのＣ− 末端に共有結合により結合して、５）第二の病原体特異プロテアーゼ切断部位、
    および６）第二のチモーゲンサブユニットを含んでなることを特徴とする請求項
    ４記載の抗病原体システム。
  6. 【請求項６】 該チモーゲンがカスパーゼ（caspase）、トロンビン、細菌
    外毒素、グランザシムＢまたは無脊椎動物毒素である請求項３記載の抗病原体シ
    ステム。
  7. 【請求項７】 該カスパーゼがカスパーゼ−３（ＣＰＰ３２アポペイン（a
    popain）、ヤーナ（Yarna））、カスパーゼ−５（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩＩ、ＴＹ ）、カスパーゼ−４（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩ ＴＸ、ＩＣＨ−２）、カスパーゼ− １（ＩＣＥ）、カスパーゼ−７（Ｍｃｈ３、ＩＣＥ−ＬＡＰ３、ＣＭＨ−１）、
    カスパーゼ−６（Ｍｃｈ２）、カスパーゼ−８（ＭＡＣＨ、ＦＬＩＣＥ、Ｍｃｈ
    ５）、カスパーゼ−１０（Ｍｃｈ４）、カスパーゼ−２（ＩＣＨ−１）、カスパ
    ーゼ−９（ＩＣＨ−ＬＡＰ６、Ｍｃｈ６）、または触媒活性チモーゲンからなる
    群から選択される請求項６記載の抗病原体システム。
  8. 【請求項８】 該カスパーゼがカスパーゼ−３（ＣＰＰ３２アポペイン、
    ヤーナ）またはその触媒活性フラグメントである請求項７記載の抗病原体システ
    ム。
  9. 【請求項９】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、１ ）形質導入ドメイン、２）病原体特異プロテアーゼ切断部位、および３）酵素を
    含んでなることを特徴とする請求項２記載の抗病原体システム。
  10. 【請求項１０】 該酵素がチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ま たはその触媒活性酵素フラグメントである請求項９記載の抗病原体システム。
  11. 【請求項１１】 該酵素がチミジンキナーゼである請求項１０記載の抗病 原体システム。
  12. 【請求項１２】 該病原体特異プロテアーゼ切断部位がサイトメガロウイ ルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルスタイプ−１（ＨＳＶ−１）、Ｃ型肝炎ウ
    イルス（ＨＣＶ）、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
    −２およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）プロテアーゼ切断部位
    からなる群から選択される請求項２記載の抗病原体システム。
  13. 【請求項１３】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、 １）ＴＡＴまたはそのタンパク質形質導入化フラグメント、２）カスパーゼ−３
    プロドメイン、３）第一ＨＳＶ−１プロテアーゼ切断部位、４）カスパーゼ−３
    大型サブユニット、５）第二ＨＳＶ−１プロテアーゼ切断部位、および６）カス
    パーゼ−３小型サブユニットを含んでなり、その場合、該大型および小型サブユ
    ニットが二量化して細胞毒を形成し得るものである請求項２記載の抗病原体シス
    テム。
  14. 【請求項１４】 該タンパク質形質導入ドメインがＴＡＴ、アンテナペデ ィア・ホメオドメイン、ＨＳＶ ＶＰ２２またはそのフラグメントである請求項 ２記載の抗病原体システム。
  15. 【請求項１５】 共有結合により結合したタンパク質形質導入ドメインお よび細胞障害性ドメインを含んでなることを特徴とする実質的に純粋な融合タン
    パク質。
  16. 【請求項１６】 請求項１記載の融合タンパク質をエンコードする核酸セ グメント。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の核酸セグメントを含んでなることを特 徴とするＤＮＡベクター。
  18. 【請求項１８】 請求項１記載の抗病原体システムの治療有効量を哺乳動 物に投与することを特徴とする哺乳動物の病原体感染抑制方法。
  19. 【請求項１９】 さらに、逆転写酵素阻害剤、サイトカイン、または免疫 調節剤を含んでなる医薬の治療有効量を投与することを特徴とする請求項１８記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 該医薬が、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、 ＦＴＣ、ＤＡＰＤ、１５９２Ｕ８９、ＣＳ９２、アシクロビル、ガンシクロビル
    、ペンシクロビル、またはインターフェロンの少なくとも１種を含んでなる請求
    項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該抗病原体システムをエアロゾルとして投与する請求項 １８記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該投与が経口または鼻腔投与である請求項２１記載の方 法。
  23. 【請求項２３】 細胞の所定母集団にアポトーシスを誘導する方法であっ て、病原体の存在下、請求項１記載の抗病原体システムの治療有効量を哺乳動物
    に投与することをを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 該病原体が弱毒化したものである請求項２３記載の方法 。
  25. 【請求項２５】 病原体特異プロテアーゼを阻害する治療能力につき候補 化合物をスクリーニングする方法であって、 請求項１記載の融合タンパク質を細胞の母集団に形質導入し、 病原体特異プロテアーゼを発現または誘導し得る病原体で該細胞を感染させ、
    かつ該プロテアーゼを発現させ、 該融合タンパク質を、細胞毒を産生するのに十分な病原体特異プロテアーゼと
    接触させ、そして いずれかの細胞障害性効果を、病原体特異プロテアーゼを調節する候補化合物
    の治療能力と相関させること、 を特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 該タンパク質形質導入ドメインがＴＡＴ、アンテナペデ ィア・ホメオドメイン、ＨＳＶ ＶＰ２２またはそのフラグメントである請求項 ２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該細胞障害性ドメインがカスパーゼおよび１つまたはそ れ以上のプロテアーゼ切断部位を含んでなることを特徴する請求項２６記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】 該細胞障害性ドメインが１つまたはそれ以上のＨＩＶ− １プロテアーゼ切断部位、チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼを含ん
    でなることを特徴する請求項２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 さらに、タンパク質精製または同定タグを含んでなるこ とを特徴する請求項１記載の融合タンパク質。
  30. 【請求項３０】 該タンパク質精製または同定タグがポリヒスチジン、Ｅ Ｅ、ＭＹＣまたはＨＡ配列である請求項１記載の融合タンパク質。
  31. 【請求項３１】 融合タンパク質を細胞内に入れるためのタンパク質形質 導入ドメインを含んでなる融合タンパク質、および１つまたはそれ以上の病原体
    による感染に応答して細胞毒を特異的に産生する細胞障害性ドメインを含んでな
    る抗病原体システム、 を含んでなることを特徴とするキット。
  32. 【請求項３２】 哺乳動物の病原体感染を抑制する方法であって、 共有結合により結合したタンパク質形質導入ドメインと細胞障害性ドメインを
    含んでなる融合タンパク質を含んでなる抗病原体システムの治療有効量を哺乳動
    物に投与し、 該哺乳動物の細胞に該融合タンパク質を形質導入し、 該融合タンパク質を切断して、該融合タンパク質から細胞障害性ドメインを十
    分に放出させ、 該細胞中の細胞障害性ドメインを濃縮し、そして 哺乳動物において病原性感染を抑制するのに十分な細胞毒を産生させる、 ことを特徴とする方法。
  33. 【請求項３３】 該細胞毒がトロンビン、フィブリン、トリプシン、キモ トリプシン、ジフテリア毒素、リシン、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、サポ
    ニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク
    質、ゲロニン、ジフテリア毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、ホスフォリパーゼＣまたはシ
    トシンデアミナーゼ、またはそれらの触媒活性フラグメントからなる群から選択
    される請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 さらに、プロドラッグを投与し、該プロドラッグと濃縮 された細胞障害性ドメインとを接触させることにより細胞毒を産生させることを
    特徴とする請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 該プロドラッグがアシクロビルであり、該濃縮された細 胞障害性ドメインがＨＳＶ−１チミジンキナーゼである請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該タンパク質形質導入ドメインが合成ペプチドまたは他 の形質導入タンパク質である請求項２記載の抗病原性システム。
  37. 【請求項３７】 該哺乳動物がウイルス感染症またはウイルス関連疾患に 罹患しているか、または罹患し易いものである請求項１８、１９、２０、２１ま
    たは２２のいずれかに記載の方法。
  38. 【請求項３８】 該哺乳動物がレトロウイルス感染症に罹患している請求 項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該哺乳動物がＨＩＶ感染症に罹患している請求項３８記 載の方法。
  40. 【請求項４０】 該哺乳動物がプラスモジウム感染症またはプラスモジウ ム感染症と関連する疾患に罹患しているか、または罹患し易いものである請求項
    １８、１９、２０、２１または２２のいずれかに記載の方法。
  41. 【請求項４１】 該哺乳動物がウイルス感染症またはウイルス関連疾患に 罹患しているか、または罹患し易いものである請求項２３または２４に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】 該哺乳動物がレトロウイルス感染症に罹患している請求 項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該哺乳動物がＨＩＶ感染症に罹患している請求項４２記 載の方法。
  44. 【請求項４４】 該哺乳動物がプラスモジウム感染症またはプラスモジウ ム感染症と関連する疾患に罹患しているか、または罹患し易いものである請求項
    ２３または２４に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 該哺乳動物がウイルス感染症またはウイルス関連疾患に 罹患しているか、または罹患し易いものである請求項３２、３３、３４または３
    ５のいずれかに記載の方法。
  46. 【請求項４６】 該哺乳動物がレトロウイルス感染症に罹患している請求 項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 該哺乳動物がＨＩＶ感染症に罹患している請求項４６記 載の方法。
  48. 【請求項４８】 該哺乳動物がプラスモジウム感染症またはプラスモジウ ム感染症と関連する疾患に罹患しているか、または罹患し易いものである請求項
    ３２、３３、３４または３５のいずれかに記載の方法。
  49. 【請求項４９】 該哺乳動物がヘルペス感染症に罹患しているか、または 罹患し易いものである請求項３７、４１または４５のいずれかに記載の方法。
  50. 【請求項５０】 該哺乳動物が肝炎感染症に罹患しているか、または罹患 し易いものである請求項３７、４１または４５のいずれかに記載の方法。
  51. 【請求項５１】 該ウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純 ヘルペスウイルス、例えば、タイプ−１（ＨＳＶ−１）、肝炎ウイルス、例えば
    、Ｃ型（ＨＣＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶまたはヒトヘル
    ペスウイルス８）、黄熱病ウイルス、フラビウイルス、およびライノウイルスか
    らなる群から選択される請求項３７、４１または４５のいずれかに記載の方法。
  52. 【請求項５２】 該レトロウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルスタイ プ１（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ
    ）またはヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２）と関連している請求項３
    ８、４１または４５のいずれかに記載の方法。
  53. 【請求項５３】 プラスモジウム感染症が以下のプラスモジウムのいずれ か１種またはそれ以上と関連する請求項４０、４０または４８のいずれかに記載
    の方法：熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、または
    四日熱マラリア原虫。
  54. 【請求項５４】 融合タンパク質を細胞に導入する方法であって、該融合 タンパク質が共有結合により結合したタンパク質形質導入ドメインおよび細胞障
    害性ドメインを含んでなり、該方法が、宿主細胞から融合タンパク質を単離し、
    該融合タンパク質をミスフォールディングし、次いで融合タンパク質を細胞中に
    形質導入することからることを特徴とする方法。
  55. 【請求項５５】 下記式により示される少なくとも１つのペプチドを含ん でなることを特徴とするタンパク質形質導入ドメイン： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｂ３ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なって塩基性
    アミノ酸である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立に同一また
    は異なってαヘリックス増強アミノ酸である。
  56. 【請求項５６】 下記式により示されるタンパク質形質導入ドメイン： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｂ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｂ３ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に同一または異なって塩基性
    アミノ酸である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立に同一また
    は異なってαヘリックス増強アミノ酸である。
  57. 【請求項５７】 少なくとも１種の塩基性アミノ酸がアルギニンである請 求項５５または５６に記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  58. 【請求項５８】 少なくとも１種のαヘリックス増強アミノ酸がアラニン である請求項５５または５６に記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  59. 【請求項５９】 少なくとも１種のαヘリックス増強アミノ酸がアラニン であり、複数個の塩基性アミノ酸が該ペプチドの少なくとも一面にそって実質的
    に配列されているアルギニンである請求項５５または５６に記載のタンパク質形
    質導入ドメイン。
  60. 【請求項６０】 下記式により示される少なくとも１つのペプチドを含ん でなることを特徴とするタンパク質形質導入ドメイン： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｂ２−Ｂ３−Ｘ３−Ｘ４−Ｂ４ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４はそれぞれ独立に同一または異なって
    塩基性アミノ酸である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立に同一また
    は異なってαヘリックス増強アミノ酸である。
  61. 【請求項６１】 下記式により示されるタンパク質形質導入ドメイン： Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｂ２−Ｂ３−Ｘ３−Ｘ４−Ｂ４ ただし、式中Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４はそれぞれ独立に同一または異なって
    塩基性アミノ酸である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立に同一また
    は異なってαヘリックス増強アミノ酸である。
  62. 【請求項６２】 少なくとも１種の塩基性アミノ酸がアルギニンである請 求項６０または６１に記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  63. 【請求項６３】 少なくとも１種のαヘリックス増強アミノ酸がアラニン である請求項６０または６１に記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  64. 【請求項６４】 少なくとも１種のαヘリックス増強アミノ酸がアラニン であり、複数個の塩基性アミノ酸が該ペプチドの少なくとも一面にそって実質的
    に配列されているアルギニンである請求項５６または６１に記載のタンパク質形
    質導入ドメイン。
  65. 【請求項６５】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＡＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）。
  66. 【請求項６６】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号３）。
  67. 【請求項６７】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号４）。
  68. 【請求項６８】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号５）。
  69. 【請求項６９】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号６）。
  70. 【請求項７０】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）。
  71. 【請求項７１】 少なくとも以下の配列を含んでなるタンパク質形質導入 ドメイン： ＹＡＡＡＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号８）。
  72. 【請求項７２】 形質導入ドメインが、ＡＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番 号２）、 ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号３）、 ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号４）、 ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号５）、 ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号６）、 ＹＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）または、 ＹＡＡＡＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号８） からなる請求項６５〜７１のいずれかに記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  73. 【請求項７３】 少なくとも以下の配列の１つを含んでなるタンパク質形 質導入ドメイン： ＹＡＲＡＡＰＲＲＲ； ＹＡＲＡＰＲＲＡＲＲＲ； ＹＡＲＡＰＲＲＰＲＲＲ； ＹＡＲＡＡＡＲＰＡＲＡ； ＹＡＲＡＰＡＲＱＡＲＡ；または、 ＹＡＲＡＰＡＲＰＡＲＡ。
  74. 【請求項７４】 該形質導入ドメインの分子量が約１ｋＤａないし５０ｋ Ｄａである請求項５８〜７３のいずれかに記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  75. 【請求項７５】 形質導入効率アッセイにより定量したとき、該タンパク 質形質導入ドメインが約５〜約１０倍ないし約１００倍まで形質導入効率を上昇
    させている請求項５８〜７３のいずれかに記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  76. 【請求項７６】 形質導入効率が形質導入ドメインの細胞内濃度の上昇と して表される請求項７５記載のタンパク質形質導入ドメイン。
  77. 【請求項７７】 請求項５８〜７３に記載のタンパク質形質導入ドメイン のいずれか１つをエンコードするＤＮＡセグメント。
  78. 【請求項７８】 請求項５８〜７３に記載のタンパク質形質導入ドメイン のいずれか１つを含んでなる融合分子。
  79. 【請求項７９】 該融合分子が、遺伝子枠内融合として遺伝子的に形質導 入ドメインに結合したアミノ酸配列を含んでなる請求項７８記載の融合分子。
  80. 【請求項８０】 融合分子を細胞内に形質導入する方法であって、該方法 が融合分子を供与し、該融合分子を該細胞内に形質導入することからなり、その
    際の融合分子が該細胞に形質導入すべき分子に共有結合により結合している請求
    項５８〜７３に記載のタンパク質形質導入ドメインのいずれか１つを含んでなる
    ことを特徴とする方法。
  81. 【請求項８１】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、 １）形質導入ドメイン、２）第一のチモーゲンサブユニット、３）プロテアーゼ
    切断部位、および４）第二のチモーゲンサブユニットを含んでなることを特徴と
    する請求項２記載の抗病原体システム。
  82. 【請求項８２】 該形質導入ドメインがＴＡＴであり、該第一のチモーゲ ンサブユニットがｐ５ビッドであり、該プロテアーゼ切断部位がＨＩＶプロテア
    ーゼ切断部位であり、かつ、該第二のチモーゲンサブユニットがｐ１５ビッドで
    ある請求項８１記載の抗病原体システム。
  83. 【請求項８３】 該融合タンパク質が配列内に共有結合により結合した、 １）形質導入ドメイン、２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第一のチモーゲ
    ンサブユニット、４）第二のプロテアーゼ切断部位、および５）第二のチモーゲ
    ンサブユニットを含んでなることを特徴とする請求項２記載の抗病原体システム
    。
  84. 【請求項８４】 該形質導入ドメインがＴＡＴであり、該第一のプロテア ーゼ切断部位がＨＩＶ ｐ７−ｐ１プロテアーゼ切断部位であり、該第一のチモ ーゲンサブユニットがｐ１７カスパーゼ−３であり、該第二のプロテアーゼ切断
    部位がＨＩＶ ｐ１７−ｐ２４プロテアーゼ切断部位であり、かつ、該第二のチ モーゲンサブユニットがｐ１２カスパーゼ−３である請求項８３記載の抗病原体
    システム。
  85. 【請求項８５】 該ｐ１７カスパーゼ−３がＣｙｓ１６３からＭｅｔ１６ ３ への突然変異を含んでなる請求項８４記載の抗病原体システム。
  86. 【請求項８６】 ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、該方法が該細 胞を融合タンパク質の有効用量と接触させることからなり、その際の融合タンパ
    ク質が配列内に共有結合により結合した、１）形質導入ドメイン、２）第一のチ
    モーゲンサブユニット、３）プロテアーゼ切断部位、および４）第二のチモーゲ
    ンサブユニットを含んでなるか、または１）形質導入ドメイン、２）第一のプロ
    テアーゼ切断部位、３）第一のチモーゲンサブユニット、４）第二のプロテアー
    ゼ切断部位、および５）第二のチモーゲンサブユニットを含んでなることを特徴
    とする方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009051078A1 (ja) * 2007-10-15 2009-04-23 Takara Bio Inc. 治療用遺伝子発現システム
JP2010535508A (ja) * 2007-08-07 2010-11-25 パデュー リサーチ ファンデイション キナーゼ阻害薬およびその使用
JP2014513926A (ja) * 2011-03-11 2014-06-19 メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー ボツリヌス神経毒生物活性の決定のための方法
US9327008B2 (en) 2008-12-10 2016-05-03 Purdue Research Foundation Cell-permeant peptide-based inhibitor of kinases
US9452218B2 (en) 2012-03-09 2016-09-27 Purdue Research Foundation Compositions and methods for delivery of kinase inhibiting peptides
US9493508B2 (en) 2007-01-10 2016-11-15 Purdue Research Foundation Polypeptide inhibitors of HSP27 kinase and uses therefor
US9890195B2 (en) 2009-07-27 2018-02-13 Purdue Research Foundation MK2 inhibitor compositions and methods to enhance neurite outgrowth, neuroprotection, and nerve regeneration

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645490B2 (en) * 1998-03-02 2003-11-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Chimeric proteins with cell-targeting specificity and apoptosis-inducing activities
CA2354044A1 (en) * 1998-12-10 2000-06-15 Washington University Protein transduction system and methods of use thereof
JP2003514765A (ja) * 1999-02-28 2003-04-22 ワシントン ユニバーシティー 新規形質導入分子およびその使用方法
JP3734634B2 (ja) * 1999-03-03 2006-01-11 ヒゲタ醤油株式会社 タンパク質の活性化方法及び該装置
US20030219826A1 (en) * 1999-09-01 2003-11-27 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US6881825B1 (en) 1999-09-01 2005-04-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Identication of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and virues
AU7577600A (en) * 1999-09-13 2001-04-17 Cornell Research Foundation Inc. Delivering to eucaryotic cells bacterial proteins that are secreted via type iiisecretion systems
US6864355B1 (en) 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
US6890896B1 (en) * 1999-11-18 2005-05-10 Ceremedix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
CA2392490A1 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells
CA2393333A1 (en) * 1999-12-16 2001-06-21 University Of Louisville Research Foundation Incorporated Compositions and methods for caspase-induced apoptosis
EP1244796A2 (en) * 2000-01-07 2002-10-02 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Transduction of recombinases for inducible gene targeting
MXPA02007939A (es) * 2000-02-24 2003-02-10 Genentech Inc Terapia con profarmacos activados por la caspasa.
GB2360771A (en) * 2000-03-28 2001-10-03 Antisoma Res Ltd Compounds for targeting
US7049395B2 (en) 2000-05-02 2006-05-23 Yale University Anti-inflammatory compounds and uses thereof
US6664040B2 (en) * 2000-05-23 2003-12-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for delivery of a molecule into a cell
US7807780B2 (en) * 2000-07-21 2010-10-05 Revance Therapeutics, Inc. Multi-component biological transport systems
US20040220100A1 (en) * 2000-07-21 2004-11-04 Essentia Biosystems, Inc. Multi-component biological transport systems
DK1320387T3 (da) 2000-09-13 2012-07-16 Glaxosmithkline Llc Farmaceutiske sammensætninger til vedvarende afgivelse af peptider
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
DE10128832A1 (de) * 2001-06-15 2003-02-06 Jochen Reis Vektor und dessen Verwendung in gentherapeutischen Verfahren
WO2003004599A2 (en) * 2001-07-02 2003-01-16 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of making and using expression constructs for the expression of recombinant proteins
DE10133307A1 (de) * 2001-07-12 2003-02-06 Deutsches Krebsforsch PNA-Konjugat zur Therapie von mit HIV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen
US7374896B2 (en) * 2001-08-28 2008-05-20 Allergan, Inc. GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity
US7332567B2 (en) * 2001-08-28 2008-02-19 Allergan, Inc. Fret protease assays for clostridial toxins
US8022172B2 (en) * 2001-08-28 2011-09-20 Allergan, Inc. Luminescence resonance energy transfer (LRET) assays for clostridial toxin activity
US20030083262A1 (en) * 2001-08-30 2003-05-01 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating inflammatory disorders
AU2003208275A1 (en) * 2002-01-27 2003-09-02 Viromics Gmbh Trojan inhibitors, method for the production and use thereof
JP4959110B2 (ja) * 2002-02-07 2012-06-20 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 抗病原体治療
AU2003217415B2 (en) * 2002-02-14 2009-01-08 William J Rutter Chimeric molecules for cleavage in a treated host
EP1357127A1 (de) * 2002-04-10 2003-10-29 Immusystems GmbH CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope
ATE489462T1 (de) * 2002-04-25 2010-12-15 Toagosei Co Ltd Antimikrobielles polypeptid und nutzung davon
US7118877B2 (en) * 2002-07-08 2006-10-10 Wyeth Caspase 9 activation and uses therefor
KR100472937B1 (ko) * 2002-07-25 2005-03-10 학교법인 한림대학교 세포침투성 티에이티-사이토신 디아미네이즈 융합단백질및 그 용도
US20050287648A1 (en) * 2002-08-05 2005-12-29 University Of Rochester Protein Transducing Domain/Deaminase Chimeric Proteins, Related Compounds, and Uses Thereof
US20040043949A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-04 Christopher Richardson Therapeutic system targeting pathogen proteases and uses thereof
US7183066B2 (en) 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
SI2656854T1 (sl) 2003-02-04 2015-09-30 Cornell Research Foundation, Inc. Uporabe aromatsko-kationskega peptida
KR101161823B1 (ko) 2003-05-01 2012-07-03 코넬 리서치 화운데이션,인크. 세포로 분자를 전달하는 방법 및 이것을 위한 캐리어 복합체
US6936288B2 (en) * 2003-06-10 2005-08-30 Klearsen Corporation Method and composition for the treatment of shingles and related afflictions
AU2004316996A1 (en) * 2003-06-20 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Polypeptide transduction and fusogenic peptides
ATE554108T1 (de) 2003-07-25 2012-05-15 Amgen Inc Verfahren bezüglich ldcam und crtam
US20090123468A1 (en) * 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
JP4838722B2 (ja) * 2003-10-24 2011-12-14 ゲンシア コーポレーション ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物
US7674771B2 (en) 2003-10-29 2010-03-09 Toagosei Co., Ltd Antimicrobial peptides and utilization of the same
NZ549393A (en) 2004-01-23 2009-07-31 Cornell Res Foundation Inc Methods for reducing oxidative damage
US9211248B2 (en) 2004-03-03 2015-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
SG10201803560WA (en) 2004-03-03 2018-06-28 Revance Therapeutics Inc Compositions And Methods For Topical Application And Transdermal Delivery Of Botulinum Toxins
AU2005251676B2 (en) * 2004-03-03 2011-09-29 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport
US7514088B2 (en) 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
JP4507080B2 (ja) 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US20060068469A1 (en) * 2004-08-17 2006-03-30 Research Development Foundation Bacterial vector systems
US20090098049A1 (en) * 2004-09-07 2009-04-16 The Regents Of The University Of California Targeting transducible molecules to specific cell types
EP1805210A4 (en) * 2004-09-09 2007-10-24 Auckland Uniservices Ltd NOVEL PEPTIDES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASE
US7399607B2 (en) 2004-09-22 2008-07-15 Allergan, Inc. Fluorescence polarization assays for determining clostridial toxin activity
JP4730584B2 (ja) 2004-12-06 2011-07-20 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
AU2006218431B2 (en) 2005-03-03 2012-12-06 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
EP1856139B1 (en) * 2005-03-03 2011-04-27 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of an oligopeptide
US7465537B2 (en) * 2005-05-01 2008-12-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compounds and methods for inhibiting hepatitis C virus replication
CN103784937B (zh) 2005-09-16 2017-04-26 科内尔研究基金会 用于减少cd36表达的方法
ES2341892T5 (es) 2005-09-19 2019-03-27 Allergan Inc Toxina clostridial activable por toxinas clostridiales
JP2009511081A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ナショナル ジューイッシュ メディカル アンド リサーチ センター 条件的に不死化された長期幹細胞およびそのような細胞を作製および使用する方法
BRPI0618753A2 (pt) 2005-11-17 2011-09-13 Revance Therapeutics Inc composição para liberação transdérmica de toxina botulìnica e método de administração
JP2009532017A (ja) * 2006-02-10 2009-09-10 ザ レジェンツ オブ ザ ユニヴァースティ オブ カリフォルニア ＰＴＤ／ＣＰＰＳへのｄｓＲＮＡ結合ドメイン融合体によるｓｉＲＮＡの導入可能な送達
CN101506368B (zh) * 2006-07-12 2017-02-08 加利福尼亚大学董事会 通过可逆的磷酸三酯电荷中和保护基转导运输核酸
US8993295B2 (en) * 2006-07-20 2015-03-31 The General Hospital Corporation Methods, compositions, and kits for the selective activation of protoxins through combinatorial targeting
EP2074138A4 (en) * 2006-09-19 2009-12-30 Phylogica Ltd NEUROPROTECTIVE PEPTIDE AP-1 SIGNALING INHIBITORS AND USES THEREOF
US20100021502A1 (en) * 2006-12-28 2010-01-28 Waugh Jacob M Compositions and Methods of Topical Application and Transdermal Delivery of Botulinum Toxins Stabililzed with Polypeptide Fragments Derived from HIV-TAT
KR20080076622A (ko) * 2007-02-16 2008-08-20 포항공과대학교 산학협력단 올리고머화된 단백질 전달체와 이를 이용한 세포내바이러스 벡터 전달 방법
US8822409B2 (en) 2007-06-20 2014-09-02 Phylogica Limited Compositions and uses thereof for the treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and clinical disorders associated with therewith
AU2008278593B2 (en) * 2007-07-26 2015-04-09 Revance Therapeutics, Inc. Antimicrobial peptide, compositions , and methods of use
ES2328776B1 (es) * 2007-11-19 2010-07-06 Proyecto De Biomedicina Cima S.L. Peptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones.
US20110023194A1 (en) * 2007-12-11 2011-01-27 Syngenta Participations Ag Engineering zymogen for conditional toxicity
CA2712900A1 (en) * 2008-01-30 2009-08-06 Oregon Health & Science University Dna repair polypeptides and methods of delivery and use
CN101939019B (zh) 2008-02-07 2014-07-16 康奈尔大学 用于预防或治疗胰岛素抵抗性的方法
GB0803352D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof
EP2262520B1 (en) 2008-02-26 2017-05-03 Cornell University Compositions for prevention and treatment of renal injury
EP2285832B1 (en) * 2008-05-16 2020-08-26 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
US8709758B2 (en) * 2008-07-28 2014-04-29 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for inhibition of neutrophil exocytosis
ES2561599T3 (es) 2008-08-28 2016-02-29 Taiga Biotechnologies, Inc. Moduladores de MYC, métodos de uso de los mismos, y métodos para identificar agentes que modulan MYC
CN103933542A (zh) 2009-03-20 2014-07-23 通用医疗公司以马萨诸塞州通用医疗公司名义经营 预防和治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法
EP3427746A1 (en) * 2009-08-12 2019-01-16 Cornell University Methods for preventing or treating metabolic syndrome
SI3708178T1 (sl) 2009-08-24 2024-01-31 Stealth Biotherapeutics Inc. Peptid za uporabo pri preprečevanju ali zdravljenju degeneracije makule
EP2485749A4 (en) * 2009-10-05 2013-07-24 Univ Cornell METHODS FOR PREVENTING OR TREATING HEART FAILURE
GB201001602D0 (en) 2010-02-01 2010-03-17 Cytovation As Oligopeptidic compounds and uses therof
US9321847B2 (en) 2010-09-20 2016-04-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Activatable toxin complexes comprising a cleavable inhibitory peptide
CA2879667C (en) 2012-07-20 2021-11-16 Taiga Biotechnologies, Inc. Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment comprising a myc polypeptide
CA2880869A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
US9701714B2 (en) * 2012-10-22 2017-07-11 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating arterial tone
WO2014066916A2 (en) 2012-10-28 2014-05-01 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for safe treatment of rhinitis
CN105228642A (zh) * 2013-02-22 2016-01-06 纽约市哥伦比亚大学理事会 通过抑制转录因子atf5来抑制肿瘤细胞的组合物和方法
US9365825B2 (en) 2013-03-11 2016-06-14 Taiga Biotechnologies, Inc. Expansion of adult stem cells in vitro
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
US11484580B2 (en) 2014-07-18 2022-11-01 Revance Therapeutics, Inc. Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease
GB201507722D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Anti-bacterial agents and their use in therapy
KR20190092472A (ko) 2016-12-02 2019-08-07 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 나노입자 제제
WO2018152446A2 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Sapience Therapeutics, Inc. Cell-penetrating atf5 polypeptides and uses thereof
EP3375871A1 (en) 2017-03-13 2018-09-19 SIT Biotech GmbH Selective cell death-inducing enzyme system
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma
CA3203983A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Sapience Therapeutics, Inc. Atf5 peptide variants and uses thereof
GB201915454D0 (en) 2019-10-24 2019-12-11 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Antibacterial bone cement and uses thereof
EP4125992A4 (en) * 2020-03-24 2024-04-03 Young Therapeutics Llc PROTEIN KINASE C MODULATORS
GB202006699D0 (en) 2020-05-06 2020-06-17 Therapim Pty Ltd Dosage regimen
GB202008888D0 (en) 2020-06-11 2020-07-29 Norwegian Univ Of Science And Technology (Ntnu) Peptides for sepsis treatment
CN111778269B (zh) * 2020-06-11 2022-05-17 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 抗h5n1病毒入胞抗体ptd-3f及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132213A (en) 1986-10-02 1992-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing proteins and polypeptides using ubiquitin fusions
AU3756789A (en) * 1988-06-16 1990-01-12 St. Louis University Antagonists of viral transactivating proteins
US5747641A (en) * 1989-12-21 1998-05-05 Biogen Inc Tat-derived transport polypeptide conjugates
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5219990A (en) 1991-01-28 1993-06-15 Biogen, Inc. Papillomavirus e2 trans-activation repressors
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
GB9718609D0 (en) * 1997-09-02 1997-11-05 Imp College Innovations Ltd Fusion protein
WO1999055899A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Washington University Methods for transducing fusion molecules

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8741849B2 (en) 2007-01-10 2014-06-03 Purdue Research Foundation Kinase inhibitors and uses thereof
US9447158B2 (en) 2007-01-10 2016-09-20 Purdue Research Foundation Kinase inhibitors and uses thereof
US9493508B2 (en) 2007-01-10 2016-11-15 Purdue Research Foundation Polypeptide inhibitors of HSP27 kinase and uses therefor
US9649354B2 (en) 2007-01-10 2017-05-16 Purdue Research Foundation Polypeptide inhibitors of HSP27 kinase and uses therfor
JP2010535508A (ja) * 2007-08-07 2010-11-25 パデュー リサーチ ファンデイション キナーゼ阻害薬およびその使用
WO2009051078A1 (ja) * 2007-10-15 2009-04-23 Takara Bio Inc. 治療用遺伝子発現システム
US9327008B2 (en) 2008-12-10 2016-05-03 Purdue Research Foundation Cell-permeant peptide-based inhibitor of kinases
US9890195B2 (en) 2009-07-27 2018-02-13 Purdue Research Foundation MK2 inhibitor compositions and methods to enhance neurite outgrowth, neuroprotection, and nerve regeneration
JP2014513926A (ja) * 2011-03-11 2014-06-19 メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー ボツリヌス神経毒生物活性の決定のための方法
US9452218B2 (en) 2012-03-09 2016-09-27 Purdue Research Foundation Compositions and methods for delivery of kinase inhibiting peptides
US10034839B2 (en) 2012-03-09 2018-07-31 Purdue Research Foundation Compositions and methods for delivery of kinase inhibiting peptides

Also Published As

Publication number Publication date
US20030054000A1 (en) 2003-03-20
EP1037911A4 (en) 2003-07-23
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AU1818299A (en) 1999-06-28
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CA2314267A1 (en) 1999-06-17
EP1037911A1 (en) 2000-09-27

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