CN103933542A - 预防和治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防和治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法，具体的公开内容涉及通过对受试者施用有效量的芳香族-阳离子肽来治疗遭受烧伤损伤或相关并发症的受试者的方法。例如，烧伤损伤可以与远端病理生理学效应，诸如高代谢、骨骼肌功能障碍、和器官损伤有关。公开内容还涉及通过对有烧伤损伤风险的受试者施用有效量的芳香族-阳离子肽来保护受试者免于烧伤损伤的方法。

Description

预防和治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法
本申请是申请日为2010年03月19日，申请号为201080021769.1（国际申请号为PCT/US2010/027953），发明名称为“预防和治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法”的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月9日提交的美国临时申请No.61/259,349、2009年11月5日提交的美国临时申请No.61/258,533、2009年10月8日提交的美国临时申请No.61/249,658、和2009年3月20日提交的美国临时申请No.61/162,060的优先权，在此通过提及而完整收录其全部内容。
技术领域
一般而言，本技术涉及通过施用芳香族-阳离子肽来预防或治疗烧伤损伤及相关并发症的方法。
发明背景
提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献无一承认是本发明的现有技术。
烧伤创伤(burn trauma)每年在美国引起约二百万例伤害、100,000例医院收治、和10,000例死亡。过去，许多受害者没能在最初的复苏期幸存下来。随着侵蚀性烧伤创面切除技术(aggressive burn wound excision technicques)、移植疗法、和卓越的重点监护设施，以及对烧伤后生理学因子和流体需要的更好的了解，目前的存活率和临床结果已经逐渐改善。
系统性损伤，诸如严重烧伤损伤继发性的并且不可归因于烧伤损伤的器官功能障碍或衰竭仍然持续是发病率和死亡率的来源。严重烧伤与炎性介导物的释放有关，所述炎性介导物最后引起局部和远端的病理生理学效应。包括活性氧类别(ROS)和活性氮类别(RNS)的介导物在受累组织中是增加的，它们牵涉烧伤患者中观察到的病理生理学事件。已经发现了自由基对抗微生物作用和创伤愈合具有有益的效果。然而，在烧伤后，存在着大量生成的ROS，其是有害的，而且牵涉炎症、系统性炎性应答综合征、免疫抑制、感染和败血症、组织损伤和多器官衰竭。如此，对烧伤的临床响应依赖于自由基的生成与其解毒之间的平衡。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了治疗遭受烧伤损伤的受试者的方法。该方法包括对该受试者施用有效量的芳香族-阳离子肽。芳香族-阳离子肽可以具有(a)至少一个净正电荷；(b)最少三个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最少数目(pm)与氨基酸残基总数(r)间的关系，其中3pm是小于或等于r+1的最大数目；及(e)芳香基的最少数目(a)与净正电荷的总数(pt)间的关系，其中3a是小于或等于pt+1的最大数目，只是在a是1时，pt也可以是1。在一个实施方案中，肽是D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。
在另一个方面，本公开内容提供了一种保护受试者免于烧伤损伤的继发性效应(secondary effect)的方法。在一个实施方案中，在烧伤损伤后对受试者施用肽以治疗或改善高代谢的发病率。在一个实施方案中，在烧伤损伤后对受试者施用肽以治疗或改善对肝的损伤，其继烧伤损伤后发生。
在另一个方面，本公开内容提供了一种保护受试者免于烧伤的原发性效应(primary effect)的方法，其通过在受试者暴露于能够引起烧伤的因素(agent)，例如日光(UV)、热辐射、或与放射疗法有关的辐射前施用有效量的芳香族-阳离子肽来进行。例如，可以对有风险遭受烧伤的受试者表面(topically)施用所述肽。
在一个实施方案中，系统性损伤是器官功能障碍或衰竭，诸如影响肺、肝、肾、或肠中一种或多种的器官功能障碍或衰竭。在一个实施方案中，在烧伤损伤后，但在器官功能障碍或衰竭的症状发作前施用所述肽。在另一个实施方案中，在器官功能障碍或衰竭的症状发作后施用所述肽。
在一个实施方案中，所述系统性损伤是高代谢。在一个实施方案中，在烧伤损伤后，但在高代谢的症状发作前施用所述肽。在另一个实施方案中，在高代谢的症状发作后施用所述肽。
在一个实施方案中，所述系统性损伤是骨骼肌功能障碍，诸如骨骼肌萎缩和恶病质。在一个实施方案中，在烧伤损伤后，但在骨骼肌功能障碍的症状发作前施用所述肽。在另一个实施方案中，在骨骼肌功能障碍的症状发作后施用所述肽。
在一个方面，本公开内容提供了在哺乳动物组织中提高ATP合成率的方法，该方法包括对受试者施用有效量的芳香族-阳离子肽。在一个实施方案中，芳香族-阳离子肽是具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
在一个实施方案中，在施用所述肽后，所述哺乳动物组织中的所述ATP合成率与对照组织相比是升高的。在一个实施方案中，所述对照组织是来自没有施用所述肽的哺乳动物受试者的组织。在一个实施方案中，提高所述ATP合成率是通过恢复线粒体氧化还原状态来实现的。在一个实施方案中，提高所述ATP合成率是通过提高过氧化物酶体增殖子(proliferator)激活受体-γ辅激活物-1β(PGC-1β)蛋白的表达或活性来实现的。
在一个方面，本公开内容提供了治疗以ATP合成率降低为特征的疾病或状况的方法，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用有效量的芳香族-阳离子肽。在一个实施方案中，芳香族-阳离子肽是具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。在一个实施方案中，所述疾病或状况是烧伤损伤。
在一个实施方案中，所述肽以式I限定：
其中R1和R2各自独立选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的C1-C6烃基(alkyl)；
(iii)其中m=1-3；
(iv)
(v)
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、和R12各自独立选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的C1-C6烃基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烃基氨基；
(vi)C1-C4二烃基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”涵盖氯代、氟代、溴代、和碘代；且n是1至5的整数。
在一个具体的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、和R12均是氢；且n是4。在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R11均是氢；R8和R12是甲基；R10是羟基；且n是4。
在一个实施方案中，所述肽以式II限定：
其中R1和R2各自独立选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的C1-C6烃基；
(iii)其中m=1-3；
(iv)
(v)
R3和R4各自独立选自
(i)氢；
(ii)直链或支链的C1-C6烃基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烃基氨基；
(vi)C1-C4二烃基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”涵盖氯代、氟代、溴代、和碘代；R5、R6、R7、R8、和R9各自独立选自：
(i)氢；
(ii)直链或支链的C1-C6烃基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烃基氨基；
(vi)C1-C4二烃基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”涵盖氯代、氟代、溴代、和碘代；且n是1至5的整数。
在一个具体的实施方案中，R1和R2是氢；R3和R4是甲基；R5、R6、R7、R8、和R9均是氢；且n是4。
本发明还涉及如下方面：
1.一种治疗遭受烧伤损伤或烧伤继发性系统性损伤或状况的受试者的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
2.项1的方法，其中所述系统性损伤是器官功能障碍或衰竭。
3.项2的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭影响肺、肝、肾、或肠中的一种或多种。
4.项3的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭是肝衰竭。
5.项2的方法，其中在烧伤损伤后，但在器官功能障碍或衰竭的症状发作前施用所述肽。
6.项2的方法，其中在器官功能障碍或衰竭的症状发作后施用所述肽。
7.项1的方法，其中所述系统性损伤是高代谢。
8.项7的方法，其中在烧伤损伤后，但在高代谢的症状发作前施用所述肽。
9.项7的方法，其中在高代谢的症状发作后施用所述肽。
10.项1的方法，其中所述系统性损伤是骨骼肌功能障碍。
11.项10的方法，其中所述骨骼肌功能障碍是骨骼肌萎缩或恶病质。
12.项10的方法，其中在烧伤损伤后，但在骨骼肌功能障碍的症状发作前施用所述肽。
13.项10的方法，其中在骨骼肌功能障碍的症状发作后施用所述肽。
14.一种治疗或预防烧伤继发性高代谢的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
15.一种治疗或预防烧伤继发性器官功能障碍或衰竭的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
16.项15的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭影响肺、肝、肾、或肠中的一种或多种。
17.项16的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭是肝衰竭。
18.项1-17中任一项的方法，其中所述烧伤是二或三度烧伤。
19.依照项1-18中任一项的方法，其中所述受试者是人。
20.依照项1-19中任一项的方法，其中所述肽是静脉内、口服、皮下、经皮、腹膜内、或表面施用的。
21.一种保护受试者免于烧伤损伤的方法，该方法包括在烧伤之前对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
22.项21的方法，其中表面施用所述肽。
23.项21的方法，其中所述烧伤是晒伤。
24.项21的方法，其中所述烧伤是放射性烧伤。
25.一种在哺乳动物组织中提高ATP合成率的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
26.项25的方法，其中在施用所述肽后，所述哺乳动物组织中的所述ATP合成率与对照组织相比是升高的。
27.项26的方法，其中所述对照组织是来自没有施用所述肽的哺乳动物受试者的组织。
28.项25的方法，其中通过恢复线粒体氧化还原状态来提高所述ATP合成率。
29.项25的方法，其中通过提高过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅激活物-1β(PGC-1β)蛋白的表达或活性来提高所述ATP合成率。
30.一种治疗以ATP合成率降低为特征的疾病或状况的方法，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
31.项30的方法，其中所述疾病或状况是烧伤损伤。
附图简述
图1是显示实施例1中所呈现的研究的方案和剂量给药日程表的流程图。
图2是显示已经烧伤并施用SS-31肽的例示性大鼠的随时间的VCO2浓度的图。
图3是显示实施例2中所呈现的研究的方案和剂量给药日程表的流程图。
图4是显示来自实施例2的多种处理组的肝组织的切片的一系列显微照片。
图5是对来自实施例2的多个处理组的胱天蛋白酶-3切割的Western印迹分析的照片。
图6是显示来自实施例2的多个处理组的胱天蛋白酶-3活性的图。
图7是Western印迹分析的照片，其显示了来自实施例2的多个处理组的蛋白质氧化。
图8是显示未处理的与经SS-31肽处理的组间的创伤大小比较的图。
图9是显示在烧伤损伤之前和之后的腓肠肌肌肉中的硝基氧(nitroxide)还原的图。
图10是显示在施用盐水或SS-31肽的受试者中在烧伤损伤后0小时的腓肠肌中的硝基氧还原的图。
图11是显示在施用盐水或SS-31肽的受试者中在烧伤损伤后3小时的腓肠肌中的硝基氧还原的图。
图12是显示在施用盐水或SS-31肽的受试者中在烧伤损伤后6小时的腓肠肌中的硝基氧还原的图。
图13是显示在施用盐水或SS-31肽的受试者中在烧伤损伤后24小时的腓肠肌中的硝基氧还原的图。
图14是显示在施用盐水或SS-31肽的受试者中在烧伤损伤后48小时的腓肠肌中的硝基氧还原的图。
图15是对照(C)、对照+SS-31肽(C+P)、烧伤的(B)、和烧伤的+肽SS-31(B+P)中的ATP合成率(μmol/g/s)的图，如通过在烧伤后6小时的31P NMR所测量的。
图16是对照、烧伤、和经肽治疗的受试者中的线粒体顺乌头酸酶活性的图。
发明详述
本公开内容基于发明人的令人惊讶的发现，即某些芳香族-阳离子肽可以治疗或改善烧伤损伤的局部和远端病理生理学效应，包括但不限于高代谢和器官损伤。应当领会，下文以多种详细水平描述了本发明的某些方面、模式、实施方案、变型、和特征以提供对本发明的实质性理解。
在实施本发明中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是公知的，并且分别在例如Current Protocols in Molecular Biology,第I卷-第III卷,Ausubel编(1997);Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989);DNA Cloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷,Glover编(1985);OligonucleotideSynthesis,Gait编(1984);Nucleic Acid Hybridization,Hames和Higgins编(1985);Transcription and Translation,Hames和Higgins编(1984);Animal CellCulture,Freshney编(1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);Perbal A Practical Guide to Molecular Cloning;the series,Meth.Enzymol.,(Academic Press,Inc.,1984);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,Miller和Calos编(Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1987);及Meth.Enzymol,第154卷和155卷,Wu和Grossman及Wu编中进行解释。
下文提供了如本说明书中所使用的某些术语的定义。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语一般与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“该/所述”(“a”,“an”,and“the”)包括复数提及物，除非上下文另有明确指明。例如，提及“(一个/一种)细胞(a cell)”包括两个或更多个/两种或更多种细胞的组合，等等。
如本文中所使用的，“约”会是本领域普通技术人员理解的，并且会根据其使用的上下文而存在一定程度的变化。若该术语的使用之处对于本领域普通技术人员而言不清楚，鉴于其使用的上下文，“约”会意指所列举值的多至±10%。
如本文中所使用的，对受试者“施用”药剂、药物、或肽包括对受试者导入或投递化合物以执行其意图的功能的任何途径。施用可以通过任何合适的路径，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内、或皮下)、直肠、或表面实施。施用包括自身施用和由他人施用。
如本文中所使用的，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，及那些后来修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团、和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的化合物。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。
如本文中所使用的，术语“烧伤”或“烧伤状况”意图涵盖整个范围的此类状况，包括那些源自：过度暴露于辐射，例如导致晒伤的太阳辐射、热辐射、焊接火花(welding flash)、火、放电、接触化学品、摩擦、接触非常热的物体诸如烹饪装置元件或热流体诸如烫水、热油等。
如本文中所使用的，术语“有效量”指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致烧伤损伤或与烧伤损伤有关的一种或多种状况的预防或减少的量。在治疗性或预防性应用的背景中，对受试者施用的组合物的量会取决于疾病的类型和严重性及个体的特征，诸如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还会取决于损伤的程度、严重性和类型。根据这些和其它因素，熟练技术人员会能够决定合适的剂量。还可以与一种或多种其它治疗性化合物组合施用所述组合物。
“分离的”或“纯化的”多肽或肽基本上没有来自衍生出该药剂的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染性多肽，或者在化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品。例如，分离的芳香族-阳离子肽将没有会干扰该药剂的治疗性用途的材料。此类干扰性材料可以包括酶、激素和其它蛋白质性和非蛋白质性溶质。
如本文中所使用的，术语“医学状况”包括但不限于以期望治疗和/或预防的一种或多种物理和/或心理学症状显现的任何状况或疾病，并且包括先前及新近鉴定的疾病和其它病症。例如，医学状况可以是烧伤损伤或任何相关的状况或并发症。
如本文中所使用的，术语“器官”指身体中适应一种或多种特殊功能的部分或结构，并且包括但不限于肺、肝、肾、和肠，包括胃和肠。具体地，涵盖的是，此术语涵盖对源自对身体的另一部分的烧伤的功能障碍和衰竭特别易感的器官。
如本文中所使用的，术语“器官功能障碍”指连续的指征，范围从器官的正常功能的微小干扰(minor perturbation)至“器官衰竭”，即足以维持生命的器官输出的停止。可以使用本领域中已知的各种诊断和临床标志物来评估器官功能。
如本文中所使用的，术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指包含两个或更多个通过肽键或经修饰的肽键，即肽电子等排体彼此连接的氨基酸的聚合物。多肽指短链(通常称为肽、糖肽或寡聚物)和较长的链(一般称为蛋白质)两者。多肽可以含有与20种基因编码的氨基酸不同的氨基酸。多肽包括通过天然过程，诸如翻译后加工，或者通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰是基础教科书及多卷的研究文献中充分描述的。
如本文中所使用的，病症或状况的“预防”指在统计学样本中相对于未处理的对照样品降低经处理的样品中的疾病或状况的发病率，或者相对于未处理的对照样品延迟病症或状况的一种或多种症状的发作或降低其严重程度的化合物。
如本文中所使用的，词语“保护”指降低用本发明的肽治疗的受试者会形成给定疾病或病症，例如烧伤损伤或相关状况或并发症的概率和/或风险。通常，认为形成所述疾病或病症的概率是降低的，若与未用本发明的肽治疗的同一受试者会形成损伤的概率和/或风险相比，概率降低至少约10%，优选地至少约25%，更优选地至少约50%，甚至更优选地至少约75%，且最优选地至少约90%。在具体的实施方案中，在受试者遭受烧伤损伤之后，但是在系统性损伤的症状发作前施用所述肽时，所述肽保护受试者免于烧伤损伤的远端病理生理学效应。在一个实施方案中，在受试者暴露于能够引起烧伤的因素，例如日光或辐射前表面或系统施用时，所述肽会保护受试者免于原发性烧伤损伤。
如本文中所使用的术语“受试者”指任何脊椎动物物种的成员。目前公开的主题的方法对于温血脊椎动物特别有用。本文中提供了对哺乳动物诸如人，及那些由于濒危而具有有意义的、对人有经济学意义的(为了人的消费而在农场饲养的动物)和/或有社会意义的(作为宠物或在动物园中饲养的动物)哺乳动物的治疗。在具体的实施方案中，所述受试者是人。
如本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”、或“减轻”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者，其中目的是预防或减缓(减少)靶定的病理学状况或病症。若在依照本文中所描述的方法接受治疗量的芳香族-阳离子肽后，受试者显示特定疾病或状况的一种或多种体征和症状的可观察到的和/或可测量的减少或缺乏，则该受试者在疾病或状况方面获得成功“治疗”。例如，对于烧伤损伤，治疗或预防可以包括烧伤创伤的大小或严重性的降低；高代谢、肝损伤或功能的降低；和对其它器官系统的影响的改善。还应当领会，如所描述的医学状况的治疗或预防的各种模式意图意指“实质性的”，其包括完整的但还有不完整(less than total)的治疗或预防，且其中实现一些生物学或医学相关结果。
肽
可用于本方法的芳香族-阳离子肽是水溶性且高极性的。尽管有这些特性，但是所述肽可以容易地穿过细胞膜。可用于本方法的芳香族-阳离子肽包括最少3个氨基酸，且优选地包括最少4个氨基酸，其通过肽键共价连结。存在于本方法的芳香族-阳离子肽中的氨基酸的最大数目是通过肽键共价连结的约20个氨基酸。优选地，氨基酸的最大数目是约12个，更优选地约9个，且最优选地约6个。最优地，存在于所述肽中的氨基酸的数目是4个。
芳香族-阳离子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括例如20种最常见的通常存在于哺乳动物蛋白质中的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Glu)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、和缬氨酸(Val)。其它天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，氨基酸鸟氨酸和瓜氨酸是在哺乳动物代谢中在尿素生成期间合成的。
任选地，所述肽可以含有一个或多个非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸可以是L-、右旋(D)、或其混合物。所述肽可以没有天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸是那些通常不在活生物体中的正常代谢过程中合成，而且不在蛋白质中天然存在的氨基酸。另外，非天然存在的氨基酸不被常见的蛋白酶识别。
非天然存在的氨基酸可以存在于所述肽中的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以在N端、C端、或在N端和C端之间的任何位置。非天然的氨基酸可以例如包含烃基、芳香基、或烃基芳香基。烃基氨基酸的一些例子包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸、和ε-氨基己酸。芳香基氨基酸的一些例子包括正-、间-、和对-氨基苯甲酸。烃基芳香基氨基酸的一些例子包括正-、间-、和对-氨基苯乙酸、和γ-苯基-β-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸还包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以例如包括对天然存在的氨基酸添加一个或多个化学基团。
例如，可以将一个或多个化学基团添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’、或6’位置，或者色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位置之一处或多处。所述基团可以是可对芳香环添加的任何化学基团。此类基团的一些例子包括分支的或不分支的C1-C4烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基、C1-C4烃基氧基(即烷氧基)、氨基、C1-C4烃基氨基和C1-C4二烃基氨基(例如，甲基氨基、二甲基氨基)、硝基、羟基、卤素(即，氟代、氯代、溴代、或碘代)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些具体例子包括正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、和羟脯氨酸(Hyp)。
氨基酸修饰的另一个例子是肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基基团的衍生化。衍生化的一个例子是用氨或者用伯胺或仲胺，例如，甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺的酰胺化。衍生化的另一个例子包括用例如甲醇或乙醇的酯化。另一种此类修饰包括赖氨酸、精氨酸、或组氨酸残基的氨基基团的衍生化。例如，此类氨基基团可以是酰化的。一些合适的酰基基团包括例如苯甲酰基团或包含上文所提及的任何C1-C4烃基基团的烷酰基基团，诸如乙酰基或丙酰基基团。
非天然存在的氨基酸对常见的蛋白酶是具有适当抗性的，且更优选是不敏感的。对蛋白酶有抗性或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上文所提及的天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)形式，以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。D-氨基酸正常不存在于蛋白质中，尽管它们存在于通过与细胞的正常核糖体蛋白质合成方法(machinery)不同的手段合成的某些肽抗生素中。如本文中所使用的，认为D-氨基酸是非天然存在的氨基酸。
为了使蛋白酶敏感性最少化，肽应当具有小于5、小于4、小于3、小于2个由常见的蛋白酶识别的连续L-氨基酸，而不管该氨基酸是否是天然或非天然存在的。若肽含有氨基酸的蛋白酶敏感性序列，则至少一个氨基酸可以是非天然存在的D-氨基酸，由此赋予蛋白酶抗性。蛋白酶敏感性序列的例子包括两个或更多个连续的碱性氨基酸，其容易被常见的蛋白酶，诸如内肽酶和胰蛋白酶切割。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
在合适的实施方案中，与所述肽中的氨基酸残基的总数相比，芳香族-阳离子肽在生理学pH具有净正电荷的最少数目。在生理学pH的净正电荷的最少数目在下文会称为(pm)。肽中的氨基酸残基的总数在下文会称为(r)。下文所讨论的净正电荷的最少数目均为在生物学pH下。如本文中所使用的术语“生理学pH”指哺乳动物身体的组织和器官的细胞中的正常pH。例如，人的生理学pH通常是约7.4，但是哺乳动物中的正常的生理学pH可以是约7.0-约7.8的任何pH。
如本文中所使用的“净电荷”指由存在于肽中的氨基酸所携带的正电荷的数目与负电荷的数目的平衡。在此说明书中，应当理解，在生理学pH测量净电荷。在生理学pH带正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸、和L-组氨酸。在生理学pH带负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。通常，肽具有带正电荷的N端氨基基团和带负电荷的C端羧基基团。电荷在生理学pH彼此抵消。
在一个实施方案中，芳香族-阳离子肽具有在生理学pH的净正电荷的最少数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系，其中3pm是小于或等于r+1的最大数目。在此实施方案中，净正电荷的最少数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
表1：氨基酸数目和净正电荷(3pm小于等于p+1)
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(pm) 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施方案中，芳香族-阳离子肽具有净正电荷的最少数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系，其中2pm是小于或等于r+1的最大数目。在此实施方案中，净正电荷的最少数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
表2：氨基酸数目和净正电荷(2pm小于等于p+1)
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(pm) 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在一个实施方案中，净正电荷的最少数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)是相等的。在另一个实施方案中，所述肽具有3或4个氨基酸残基和最少1个净正电荷，优选地最少2个净正电荷，且更优选地最少3个净正电荷。在合适的实施方案中，与净正电荷的总数(pt)相比，芳香族-阳离子肽具有芳香基的最少数目。芳香基的最少数目在下文会称为(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括氨基酸组氨酸、色氨酸、酪氨酸、和苯丙氨酸。例如，六肽Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp具有2(由赖氨酸和精氨酸残基贡献)和3个芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基贡献)的净正电荷。
在一个实施方案中，芳香族-阳离子肽具有芳香基的最少数目(a)与生理学pH的净正电荷的总数(pt)之间的关系，其中3a是小于或等于pt+1的最大数目，只是在pt是1时，a也可以是1。在此实施方案中，芳香基的最少数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系如下：
表3：芳香基和净正电荷(3a小于等于pt+1或a=pt=1)
(pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施方案中，芳香族-阳离子肽具有芳香基的最少数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系，其中2a是小于或等于pt+1的最大数目。在此实施方案中，芳香族氨基酸残基的最少数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系如下：
表4：芳香基和净正电荷(2a小于等于pt+1或a=pt=1)
(pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在另一个实施方案中，芳香基的数目(a)和净正电荷的总数(pt)是相等的。
羧基基团，特别是C端氨基酸的末端羧基基团可以用例如氨来酰胺化以形成C端酰胺。或者，C端氨基酸的末端羧基基团可以用任何伯胺或仲胺来酰胺化。伯胺或仲胺可以例如是烃基，特别是分支或不分支的C1-C4烃基，或芳基胺。因而，可以将肽C端的氨基酸转化成氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N,N-二甲基氨基、N,N-二乙基氨基、N-甲基-N-乙基氨基、N-苯基氨基或N-苯基-N-乙基氨基基团。
不存在于本发明的芳香族-阳离子肽的C端的天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、和谷氨酸的游离的羧酸基团也可以酰胺化，无论它们存在于肽内的什么地方。这些内部位置处的酰胺化可以用氨或上文所描述的任何伯胺或仲胺进行。
在一个实施方案中，芳香族-阳离子肽是具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一个具体的实施方案中，芳香族-阳离子肽是具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
芳香族-阳离子肽包括但不限于下列例示性的肽：
Lys-D-Arg-Tyr-NH2
Phe-D-Arg-His
D-Tyr-Trp-Lys-NH2
Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2
Tyr-His-D-Gly-Met
Phe-Arg-D-His-Asp
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2
Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg
D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg
Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2
Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His
Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2
Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2
Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys
Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2
Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys
Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-GIy-LyS-NH2
D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2
Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe
Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe
Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2
Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr
Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys
Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2
Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly
D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2
Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe
His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2
Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp
Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH2
在一些实施方案中，肽是那些具有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物的肽。酪氨酸的合适的衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)；2’,6’-二甲基酪氨酸(2’6’Dmt)；3’,5’-二甲基酪氨酸(3’5’Dmt)；N,2’,6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；和2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一个实施方案中，所述肽具有式Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(本文中称为SS-01)。SS-01具有由氨基酸酪氨酸、精氨酸、和赖氨酸贡献的净正电荷3，并且具有由氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸贡献的2个芳香族基团。SS-01的酪氨酸可以是酪氨酸的经修饰的衍生物，诸如在2’,6’-二甲基酪氨酸中以生成具有式2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2的化合物(本文中称为SS-02)。
在一个合适的实施方案中，N端的氨基酸残基是精氨酸。此类肽的例子是D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2(本文中称为SS-31)。在另一个实施方案中，N端的氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。苯丙氨酸的衍生物包括2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’,6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N,2’,6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)、和2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。此类肽的例子是Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(本文中称为SS-20)。在一个实施方案中，SS-02的氨基酸序列重新排列为使得Dmt不在N端。此类芳香族-阳离子肽的例子具有式D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。
在又一个实施方案中，芳香族-阳离子肽具有式Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2(本文中称为SS-30)。或者，N端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物诸如2’,6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’Dmp)。在氨基酸位置1含有2’,6’-二甲基苯丙氨酸的SS-01具有式2’,6’-Dmp-D-Arg-Dmt-Lys-NH2。
肽的合适的取代变体包括保守氨基酸取代。氨基酸可以依照其物理化学特征如下分组：
(a)非极性氨基酸：Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G)Cys(C)；
(b)酸性氨基酸：Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q)；
(c)碱性氨基酸：His(H)Arg(R)Lys(K)；
(d)疏水性氨基酸：Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V)；和
(e)芳香族氨基酸：Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H)。
将肽中的氨基酸用同一组中的另一种氨基酸取代称为保守取代，并且可以保留原始肽的物理化学特征。相反，将肽中的氨基酸用不同组中的另一种氨基酸取代一般很有可能改变原始肽的特征。肽的例子包括但不限于表5中所显示的芳香族-阳离子肽。
表5：芳香族-阳离子肽的例子
Cha=环己基丙氨酸
在某些情况下，使用还具有阿片样物质受体激动剂活性的肽可以是有利的。mu-阿片样物质类似物的例子包括但不限于表6中所显示的芳香族-阳离子肽。
表6：具有阿片样物质受体激动剂活性的芳香族-阳离子肽
Dab=二氨基丁酸
Dap=二氨基丙酸
Dmt=二甲基酪氨酸
Mmt=2’-甲基酪氨酸
Tmt=N,2’,6’-三甲基酪氨酸
Hmt=2’-羟基,6’-甲基酪氨酸
dnsDap=β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸
atnDap=β-邻氨基苯甲酰-L-α,β-二氨基丙酸
Bio=生物素
表5和表6中所显示的肽的氨基酸可以为L-或D-构型。
肽的合成
可用于本发明方法的肽可以是通过本领域中公知的任何方法化学合成的。适合于合成所述蛋白质的方法包括例如那些由Stuart和Young于SolidPhase Peptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical Company(1984),及于SolidPhase Peptide Synthesis,Methods Enzymol.,289,Academic Press,Inc,NewYork(1997)中所描述的。
治疗和预防烧伤损伤及继发性并发症的方法
本文中所描述的芳香族-阳离子肽可用于治疗或预防烧伤损伤和与烧伤损伤有关的系统性状况。在一些实施方案中，可以在烧伤后并在系统性损伤的可检测症状发作后对受试者施用芳香族-阳离子肽。如此，术语“治疗/处理”在本文中以其最广义使用，指使用芳香族-阳离子肽来部分或完全治愈烧伤和/或继发性并发症，诸如器官功能障碍和高代谢。
在其它实施方案中，可以在烧伤后，但在系统性损伤的可检测症状发作前对受试者施用本发明的芳香族-阳离子肽以针对系统性损伤诸如器官损伤或高代谢提供保护或者为系统性损伤诸如器官损伤或高代谢提供预防。如此，术语“预防”在本文中以其最广义使用，指完全或部分预防对皮肤的局部损伤或系统性损伤诸如烧伤后的器官功能障碍或高代谢的预防性用途。还涵盖的是，可以对有风险遭受烧伤的受试者施用所述化合物。
烧伤一般依照其严重性和程度来分类。一度烧伤是最轻微的，并且通常仅影响表皮。烧伤部位为红色的、疼痛的、干燥的、没有水疱、对触摸非常敏感，并且受损伤的皮肤可以由于皮肤较深层中的流体泄漏而略微潮湿。感觉神经末端也被暴露，并且产生疼痛。轻微的晒伤是一度烧伤的典型。二度烧伤是影响表皮和真皮二者的情况。损伤较深，而且通常在皮肤上出现水疱。皮肤仍然是疼痛且敏感的，因为神经及该区域中的皮脂腺已经受到影响。三度烧伤是最严重的，因为所有皮肤层中的组织都是死亡的。通常，受损伤的区域向下深入皮下组织中。通常，没有水疱，但是烧过的表面可以具有数类外观，从白色至黑色(烧焦的)或来自创伤底部的血液的鲜红色。在大多数病例中，它可以向下穿透浅筋膜，并进入肌肉层中，在那里多个动脉和静脉可能受到影响。因为皮肤神经受到损伤，所以烧伤可以是完全无痛的，并且在触碰皮肤时，有时它无论如何都没有感觉。按压时缺乏感觉或皮肤血管变白指明受损伤的皮肤。
涵盖的是，本发明可适用于治疗来自任何原因的烧伤，包括干热或冷烧伤、烫伤、晒伤、电烧伤、化学剂诸如酸和碱，包括氢氟酸、甲酸、无水氨、粘固剂(cement)、和酚、或放射性烧伤(radiation burn)。源于暴露于高温或低温的烧伤在本发明的范围内。烧伤的严重性和程度可以存在变化，但是当烧伤是非常广泛或非常严重(二或三度烧伤)时通常会出现继发性器官损伤或高代谢。继发性器官功能障碍或衰竭的形成取决于烧伤的程度、患者免疫系统的应答和其它因素，诸如感染和败血症。
在一些实施方案中，使用所述芳香族-阳离子肽来治疗或预防烧伤继发性器官功能障碍。在烧伤后导致器官功能障碍的一系列生理学过程是复杂的。在患有严重烧伤的受试者中，儿茶酚胺、加压素、和血管紧张肽的释放引起外周和内脏床血管收缩，其可能累及远离损伤的器官的灌注。心肌收缩性也可以通过TNF-α的释放来降低。活化的嗜中性粒细胞在烧伤损伤后数小时内在皮肤和远端器官诸如肺中被隔离，导致毒性活性氧类别和蛋白酶的释放，并产生血管内皮细胞损伤。在肺部毛细管和肺泡上皮细胞的完整性受到危害时，血浆和血液泄露到间质和肺泡内间隙中，导致肺水肿。由于由体液因子，诸如组胺、5-羟色胺、和血栓烷A2引起的支气管收缩，可以在严重烧伤的患者中发生肺部功能的降低。
严重烧伤损伤还引起组织的凝固坏死。这在每种器官系统中启动生理学响应，其严重性与烧伤的程度有关。组织破坏还导致毛细管渗透性的升高，伴有流体从血管内间隙大量流出到与烧伤创伤相邻的组织。过量的流体通过自受损伤的表面(其不再能够保留水)蒸发而损失。与蒸发水损失偶联的此毛细管渗透性升高引起低血容量性休克，其继而还可以促成远距离的器官功能障碍或衰竭。
遭受严重烧伤的受试者还有很大的败血症风险。因为皮肤不再充当阻止微生物进入的屏障，所以烧伤患者中发生细菌侵入。由于其发动有效的系统性免疫应答的能力降低，严重烧伤患者对形成败血症和危及生命的败血性休克易感。然而，败血症是与器官功能障碍或衰竭不同的单独并发症，其继烧伤后发生。可以在没有败血症的情况中发生烧伤继发性器官功能障碍或衰竭。
遭受烧伤损伤的受试者还有骨骼肌功能障碍的风险。虽然不希望受限于理论，烧伤中的线粒体骨骼肌功能障碍的主要原因可以源自经由刺激活性氧类物质(ROS)的线粒体生成的氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷和所致的对线粒体DNA(mtDNA)的损伤。在一些实施方案中，芳香族-阳离子肽经由线粒体氧化还原状态的恢复或者经由早至烧伤后6小时即下调的过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅激活物-1β而诱导ATP合成。如此，随着所述芳香族-阳离子肽的施用，由烧伤损伤引起的线粒体功能障碍恢复。
在一个方面，所述方法涉及通过对受试者施用有效量的芳香族-阳离子肽来治疗源自烧伤损伤的创伤。可以对创伤系统或表面施用所述肽。烧伤创伤通常在深度和严重性方面不等。在凝固的组织周围有重要的区域，在那里损伤可能是可逆的，并且可以阻止炎性和免疫细胞介导的对皮肤的微血管系统的损伤。在一个实施方案中，所述肽的施用会减缓或改善创伤收缩的效应。创伤收缩是缩小全厚度(full thickness)开放性创伤，特别是全厚度烧伤的大小的过程。在挛缩和皮下纤维性组织的形成过程中形成的张力可以导致畸形，且特别是对关节的固定挠曲或固定延伸的(在创伤牵涉关节上的区域处)。此类并发症在烧伤愈合中是特别相关的。当没有对组织的损伤时不会发生创伤收缩；当烧伤是全厚度，而且没有可见的组织保留在创伤中时会发生最大收缩。在另一个实施方案中，所述肽的施用阻止烧伤自二度烧伤行进到三度烧伤。
治疗烧伤损伤的方法也可以有效降低伴随烧伤部位的愈合过程的瘢痕化或瘢痕组织形成。瘢痕化是在正常组织已经被破坏的部位形成纤维性组织。如此，本公开内容还包括在特异性地二或三度烧伤的皮肤组织区域降低瘢痕化的方法。此方法包括用有效量芳香族阳离子肽来治疗具有二或三度烧伤的动物。
在一个具体的实施方案中，对遭受烧伤的受试者施用所述芳香族-阳离子肽以治疗或预防对远端器官或组织的损伤。具体地，在皮肤或身体的其它部位的烧伤后的肺、肝、肾、和/或肠的功能障碍或衰竭对发病率和死亡率具有显著的影响。虽然不希望受限于理论，认为在烧伤损伤后在受试者中出现系统性炎性应答，而且导致表现为远离损伤部位的器官功能障碍和衰竭的远距离组织损伤的正是此全身性炎症。系统性损伤(包括器官功能障碍和高代谢)通常与二度和三度烧伤有关。系统性损伤，即器官功能障碍或高代谢的特征在于引起随后的损伤或状况的烧伤不直接影响所讨论的器官，即该损伤对于烧伤是继发性的。
在一个实施方案中，施用所述芳香族-阳离子肽以治疗或保护烧伤继发性的对肝组织的损伤。评估肝功能的方法是本领域中公知的，并且包括但不限于使用针对血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、碱性磷酸酶(AP)、或胆红素水平的血液测试。评估肝结构衰退的方法也是公知的。此类方法包括肝成像(例如MRI、超声)、或肝活检的组织学评估。
在一个实施方案中，施用所述芳香族-阳离子肽以治疗或保护烧伤继发性的对肝组织的损伤。评估肝功能的方法是本领域中公知的，并且包括但不限于使用针对血清肌酸酐、或肾小球滤过率的血液测试。评估肾结构衰退的方法也是公知的。此类方法包括肾成像(例如MRI、超声)、或肾活检的组织学评估。
在一个实施方案中，施用所述芳香族-阳离子肽以预防或治疗与烧伤有关的高代谢。高代谢状态可以与高血糖、蛋白质损失、和瘦体重的显著降低有关。可以通过施用所述芳香族-阳离子肽，并经由施用特定的营养物、生长因子、或其它药剂通过操作受试者的生理学和生物化学环境来实现高代谢应答的反转。如实施例中所表明的，本发明人发现了可以对遭受烧伤的受试者施用本发明的芳香族-阳离子肽以治疗或预防高代谢。
在一个方面，本公开内容提供了一种在受试者中预防烧伤损伤或与烧伤损伤有关的状况的方法，其通过对受试者施用芳香族-阳离子肽来进行。涵盖的是，可以对有风险遭受烧伤的受试者施用所述芳香族-阳离子肽。在预防性应用中，向对烧伤损伤易感，或者在其它情况中有烧伤损伤风险的受试者施用芳香族-阳离子肽的药物组合物和药物以消除或降低烧伤损伤及其并发症的风险、减轻严重性、或者延迟其起始。
本公开内容的另一个方面包括出于治疗目的治疗受试者中的烧伤损伤及相关并发症的方法。在治疗性应用中，以足以治愈，或者至少部分阻止损伤的症状(包括其并发症和疾病形成中的中间病理学表型)的量对已经遭受烧伤损伤的受试者施用组合物或药物。涵盖的是，可以在烧伤后，但在系统性损伤，诸如器官功能障碍或衰竭的可检测症状形成前对受试者施用所述芳香族-阳离子肽，并且如此，如本文中所使用的术语“治疗”以其最广义使用，指完全或部分预防系统性损伤，诸如烧伤后的器官功能障碍或衰竭或高代谢的预防性使用。因此，所述公开内容提供了治疗受烧伤损伤折磨的个体的方法。
施用模式和有效剂量
可以采用本领域技术人员已知的使细胞、器官或组织与肽接触的任何方法。合适的方法包括体外、离体(ex vivo)、或体内方法。体内方法通常包括对哺乳动物，优选人施用芳香族-阳离子肽，诸如上文所描述的。在体内用于治疗时，以有效量(即具有期望的治疗效果的量)对受试者施用本发明的芳香族-阳离子肽。它们通常会胃肠外、表面、或口服施用。剂量和剂量方案会取决于烧伤或继发性并发症的程度、所使用的特定芳香族-阳离子肽的特征，例如，其治疗指数、受试者、和受试者史。
可以通过内科医生和临床医生熟悉的方法在临床前试验和临床试验期间确定有效量。可以通过施用药用化合物的许多公知方法之任一种来对有此需要的哺乳动物施用有效量的肽，优选地在药物组合物中。可以系统或局部施用所述肽。
所述肽可以配制为药学可接受盐。术语“药学可接受盐”意指从对于对患者，诸如哺乳动物的施用可接受的碱或酸制备的盐(例如，对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应当理解，盐不需要是药学可接受的盐，诸如不意图对患者施用的中间化合物的盐。药学可接受盐可以源自药学可接受无机或有机碱和药学可接受无机或有机酸。另外，在肽含有碱性模块诸如胺、吡啶或咪唑和酸性模块诸如羧酸或四唑两者时，可以形成两性离子，并且其包含在如本文中所使用的术语“盐”内。源自药学可接受无机碱的盐包括铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、和锌盐，等等。源自药学可接受有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N’-二苯甲基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇(tromethamine)等的盐。源自药学可接受的无机酸的盐包括硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、氢氯酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸的盐。源自药学可接受的有机酸的盐包括脂肪族羟酸(例如，柠檬酸、葡糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸、和酒石酸)、脂肪族一元羧酸(例如，乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如，苯甲酸、对-氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸、和三苯基乙酸)、芳香族羟酸(例如，邻-羟基苯甲酸、对-羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-羧酸和3-羟基萘-2-羧酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如，延胡索酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、扁桃酸、粘酸、烟酸、乳清酸、扑酸(pamoic acid)、泛酸、磺酸(例如，苯磺酸、樟脑磺酸(camphosulfonicacid)、乙二磺酸(edisylic acid)、乙磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-l,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对-甲苯磺酸)、昔萘酸(xinafoic acid)等的盐。
可以将本文中所描述的芳香族-阳离子肽掺入药物组合物种以对受试者单独或组合施用，用于治疗或预防本文中所描述的病症。此类组合物通常包括活性剂和药学可接受载体。如本文中所使用的，术语“药学可接受载体”包括与药学施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂，等等。还可以将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
通常将药物组合物配制成与其预想的施用路径相容。施用路径的例子包括胃肠外(例如静脉内、真皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(表面)、经粘膜、和直肠施用。用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列成分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，及供调节张力用的试剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱来调节，诸如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶中。
适合用于可注射使用的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，供胃肠外施用的组合物必须是无菌的，而且应当是流体的，其程度使得存在容易的可注射性。它在制造和贮存条件下应该是稳定的，而且必须是针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用受到防护的。
所述芳香族-阳离子肽组合物可以包括载体，其可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液态聚乙二醇等)、及其合适的混合物。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。各种抗细菌化合物和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以实现防止微生物的作用。在许多情况中，组合物中包含等张剂(例如糖类，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠)会是优选的。可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来引起可注射组合物的吸收延长。
可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着过滤灭菌。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌因素中来制备分散体，所述无菌因素含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，典型的制备方法包括自其先前经无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其它期望成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥。
一般而言，口服组合物包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗施用的目的，可以与赋形剂一起掺入活性化合物，并以片剂、锭剂、或胶囊，例如明胶胶囊形式使用。还可以使用流体载体来制备口服组合物以供作为漱口液使用。可以包含药学相容的结合剂和/或佐剂物质作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分或具有相似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；滑润剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味剂。
如本文中所描述的治疗性化合物的系统施用也可以是通过经粘膜或经皮手段。对于经粘膜或经皮施用，在配制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。一般而言，此类渗透剂是本领域中已知的，并且包括例如对于经粘膜施用，去污剂、胆汁盐、和梭链孢酸衍生物。可以经由使用鼻喷雾或栓剂来实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂、或乳膏，如本领域中普遍知道的。在一个实施方案中，可以通过离子电渗疗法来实施经皮施用。
可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程，例如用于测定LD50(对于群体的50%致死的剂量)和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量)来确定治疗剂的剂量、毒性和治疗功效。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。展现出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用展现出毒性副作用的化合物，但是应当注意设计如下的投递系统，其将此类化合物靶向至受累组织的部位以使对其它细胞的潜在损伤最小化，并且由此降低副作用。
可以在配制人中使用的剂量范围中使用自这些细胞培养测定法和动物研究获得的数据。优选地，此类化合物的剂量位于循环浓度范围内，其包括具有少许毒性或没有毒性的ED50。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所利用的施用路径。对于本发明方法中所使用的任何化合物，最初可以自细胞培养测定法评估治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，其包括IC50(即，实现对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)，如在细胞培养物中所测定的。可以使用此类信息来更精确地确定可用于人的剂量。可以例如通过高效液相层析来测量血浆中的水平。
典型地，足以实现治疗性或预防性效果的芳香族-阳离子肽的有效量的范围为每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。优选地，剂量范围为每天每千克体重约0.0001mg至每天每千克体重约100mg。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，单剂肽的范围为每kg体重0.1-10,000微克。在一个实施方案中，载体中的芳香族-阳离子肽浓度的范围为投递的每毫升0.2至2000微克。例示性的治疗方案需要每天一次或每周一次进行施用。此后，可以对患者施用预防性方案。
在一些实施方案中，芳香族-阳离子肽的治疗有效量可以定义为在目标组织的10-11至10-6摩尔，例如约10-7摩尔的肽浓度。可以通过0.01至100mg/kg的系统性剂量或根据体表面积的等同剂量来投递此浓度。会优化剂量的日程表以维持目标组织的治疗性浓度，最优选地通过单一每天或每周施用，但是还包括连续施用(例如胃肠外输注或经皮应用)进行。
在一些实施方案中，以“低”、“中等”、或“高”剂量水平提供所述芳香族-阳离子肽的剂量。在一个实施方案中，提供约0.001至约0.5mg/kg/h，适当地约0.01至约0.1mg/kg/h的低剂量。在一个实施方案中，提供约0.1至约1.0mg/kg/h，适当地约0.1至约0.5mg/kg/h的中等剂量。在一个实施方案中，提供约0.5至约10mg/kg/h，适当地约0.5至约2mg/kg/h的高剂量。
熟练技术人员会领会，某些因素可以影响有效治疗受试者所需要的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄、和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文中所描述的治疗性组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。
依照本发明治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括例如家畜动物诸如绵羊、猪、牛、和马；宠物动物，诸如犬和猫；实验室动物，诸如大鼠、小鼠和兔。在一个优选的实施方案中，哺乳动物是人。
实施例
本发明通过以下实施例来进一步例示，所述实施例不应以任何方式解释为限制性的。
实施例1：SS-31在大鼠模型中减弱烧伤损伤后的高代谢
高代谢(HYPM)是烧伤损伤后代谢紊乱的一项标志特征。能量消耗(EE)增加与加速的底物氧化有关，而燃料利用的转换与脂质氧化向总能量生成的贡献增加有关。线粒体是发生底物氧化的细胞器。在烧伤后发生线粒体功能障碍。它与HYPM的形成和改变的底物氧化紧密相关。SS-31(D-Arg-2’,6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2)是一种透入线粒体、抑制线粒体膨胀、并降低氧化性细胞死亡的四肽。此实施例测试SS-31肽对总EE及随后对烧伤损伤后的底物氧化的潜在功能。
将Sprague Dawley大鼠随机化成三组；假烧伤(SB)、用盐水处理的烧伤(B)和用肽处理的烧伤(BP)。用外科手术将导管放入颈静脉和颈动脉中。通过在立即流体复苏的情况中将背部部分浸没于100℃水中达12秒，B和BP动物受到了30%总体表面积全厚度烧伤。BP动物接受SS-31的IV注射(每12小时2mg/kg)达三天(图1)。在TSE间接量热法系统(TSE Co.Germany)中对动物的EE不断监测12小时。
表7和图2中显示了实验的结果。烧伤损伤后3天，与SB组中的动物相比，B组中的动物显示显著升高的VO2、VCO2和EE。SS-31处理显著降低了VO2、VCO2和EE(BP对B，P<0.05)。
表7
结果指明在遭受烧伤损伤的大鼠中用SS-31的处理可以减弱烧伤诱导的HYPM。因此，本发明的芳香族-阳离子肽可用于在有此需要的受试者中治疗烧伤损伤和继发性并发症的方法。
实施例2：SS-31在小鼠中保护肝免于烧伤诱导的凋亡
系统性炎性应答综合征(SIRS)和多器官衰竭(MOF)是严重烧伤患者中的发病率和死亡率的主要原因。在此实施例中，检查了本发明的芳香族-阳离子肽在烧伤损伤的小鼠模型中对肝损伤的影响。使6至8周龄雄性C57BL小鼠受到30%总体表面积(TBSA)烧伤损伤，并随后每天注射盐水或SS-31肽(5mg/kg体重)。将受到微温(约37℃)水处理、但是在其它方面完全相同地处理的重量和时间匹配的假烧伤组充当对照(图3)。烧伤损伤处理后1、3和7天收集肝组织，并用于通过TUNEL法来检查凋亡、通过Western印迹来检查激活的胱天蛋白酶蛋白水平、及通过酶促反应测定法来检查胱天蛋白酶活性。
烧伤损伤在检查的所有日期提高了肝中的凋亡率，但是在烧伤损伤后第7天发生最显著的升高。然而，用SS-31肽的处理使经历凋亡的细胞的数目最小化，其效果在烧伤后第7天最明显(图4)。Western印迹分析揭示了，与假对照组相比，激活形式的胱天蛋白酶-3的蛋白质水平随烧伤损伤后的时间逐渐升高(图5)。SS-31肽在烧伤后第3天和第7天将激活形式的胱天蛋白酶-3蛋白水平的升高反转至与假对照动物的那些水平相似的水平。与蛋白质水平的变化相似，胱天蛋白酶活性在烧伤后第7天显著升高，但是用SS-31肽的处理将胱天蛋白酶活性降低至与假对照组的水平没有显著差异的水平(图6)。在第3天有用SS-31肽处理反转烧伤损伤后升高的胱天蛋白酶活性的趋势(图6)。在用SS-31肽处理的小鼠中还有烧伤损伤后降低的蛋白质氧化(图7)。
如此，此研究提供了如下的证据，即SS-31肽可以降低胱天蛋白酶信号传导途径的烧伤诱导的激活，并随后减弱小鼠肝中的凋亡。因此，本发明的芳香族-阳离子肽可用于预防或治疗烧伤继发性系统性器官损伤，诸如肝损伤的方法。
实施例3：SS-31阻止烧伤损伤后的创伤收缩
烧伤创伤通常在深度和严重性方面不等。在凝固的组织周围有重要的区域，在那里损伤可以是可逆的，并且可以阻止炎性和免疫细胞介导的对皮肤的微血管系统的损伤。创伤收缩是缩小全厚度开放性创伤，特别是全厚度烧伤的大小的过程。在挛缩和皮下纤维性组织的形成过程中形成的张力可以导致畸形，且特别是关节的固定弯曲或固定延伸的畸形(在创伤牵涉关节上的区域处)。此类并发症在烧伤愈合中是特别相关的。当没有对组织的损伤时不会发生创伤收缩；当烧伤是全厚度，而且没有可见的组织保留在创伤中时会发生最大收缩。此实施例表明本发明的芳香族-阳离子肽降低或阻止创伤收缩的能力。
在烧伤(在下背部用65℃水达25秒)前1小时用IP施用的1mg SS-31肽(这对应于约3mg/kg)预处理Sprague-Dawley大鼠(雄性，300-350g)，接着是表面处理(在创伤之上用1mg)，及每12小时IP施用的1mg SS-31肽持续72小时。在烧伤后对创伤观察多至约3周。一般地，创伤呈现硬痂的外观，并且出于此实验的目的，将痂的面积量化为创伤大小的量度。在烧伤后大于等于8天的时间点在经肽处理的组中观察到了创伤收缩的较缓速率(根据ANOVA的p=0.06)(图8)。用SS-31的处理减缓了创伤收缩，这指明烧伤损伤与在所述没有肽处理的动物中的烧伤相比严重性较低。因此，本发明的芳香族-阳离子肽可用于治疗与烧伤损伤有关的创伤的方法。
实施例4：SS-31减轻烧伤损伤后的骨骼肌功能障碍
为了表明对烧伤后并发症的治疗和预防，对哺乳动物烧伤损伤的鼠模型测试本发明的芳香族-阳离子肽。烧伤中的线粒体骨骼肌功能障碍的主要原因可以源自经由刺激活性氧类物质(ROS)的线粒体生成的氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷及所致的对线粒体DNA(mtDNA)的损伤。此假设得到数据支持，所述数据指明响应于烧伤损伤骨骼肌中的ROS生成升高并且ATP合成率显著降低。此行进过程构成烧伤病理生理学的依据，其包括骨骼肌萎缩和恶病质。如此，此研究调查芳香族-阳离子肽作为减轻烧伤后的骨骼肌功能障碍的治疗形式的潜力。
使用临床相关鼠非致死局部烧伤损伤模型来解决芳香族-阳离子肽是否可以阻止/减弱烧伤损伤对线粒体功能障碍和ER应激的不利影响。通过硝基氧EPR来评估就在局部皮肤烧伤(90℃达3秒)下(immediately below a localcutaneous burn)的腓肠肌肌肉的氧化还原状态。发现烧伤小鼠的肌肉中的氧化还原状态受到破坏，在烧伤后6小时具有最剧烈的影响(与第0天对照相比P<0.05，n=4)，如根据硝基氧还原的低速率所证明的(图8)。
接着，测试烧伤前30分钟，及烧伤后立即IP施用的SS-31肽处理(3mg/kg每剂)的效果。在6小时时间点时，肽处理显著提高了硝基氧还原的速率(降低强度对时间的曲线，图9)。效果是统计学显著的，提示肽处理确实降低烧伤下肌肉中的氧化应激。这些数据指明本发明的芳香族-阳离子肽可用于预防或治疗烧伤损伤的继发性并发症，诸如骨骼肌功能障碍的方法。
实施例5：SS-31治疗烧伤创伤和减弱烧伤后的组织损伤的行进(预示性 的)
为了证明治疗烧伤损伤，对哺乳动物烧伤损伤的大鼠模型测试本发明的芳香族-阳离子肽。这些实验的目的是为了测定线粒体定向的抗氧化剂肽SS-31是否在部分厚度烧伤创伤中改善创伤愈合(即，加速愈合或导致较小的瘢痕化)。假设是SS-31阻止凋亡和在初始损伤的0至48小时的时段中导致烧伤创伤扩张(在深度和面积两方面)的其它不利的过程，诸如氧化应激、微血管损伤等。如此，通过阻止烧伤创伤的扩张，期望创伤愈合会更快，导致较少的瘢痕化，及愈合后更好的外观。实施例3中所显示的结果与SS-31在创伤愈合中的预防性效果一致，并且提示SS-31可以降低大鼠部分厚度烧伤模型中的创伤收缩。其它实验会测试SS-31处理是否导致大鼠模型中的烧伤创伤的更快愈合。
首先，期望SS-31会加速烧伤损伤的大鼠模型中的创伤愈合。会将SpragueDawley大鼠随机化成三组；假烧伤(SB)、用盐水处理的烧伤(B)和用肽处理的烧伤(BP)。通过在立即流体复苏的情况中将背部部分浸没于100℃水中达12秒，B和BP动物会接受30%总体表面积全厚度烧伤。BP动物会接受SS-31的IV注射(每12小时2mg/kg)达3天。在一段21天的时间里经由总体形态学和组织学判断创伤表皮细胞再生、收缩、和深度。出于此目的，在愈合后立即将深色标记应用于创伤边缘及离该边缘1cm处的动物皮肤上。在21天里对创伤进行数码照相，并使用图像分析软件来测量烧伤(定义为痂)面积。另外，使用标记离创伤部位的距离来评估收缩。
在选定的时间点时，会从动物收获创伤。因为预期主要在最开始的48小时中发生二度至三度创伤的转化，所以在12、24、和48小时时收获样品。另外，为了监测对创伤愈合过程的长期影响，在2、7、14、和21天时收获样品。会将组织固定并包埋，并产生穿过创伤中心的切片以供组织学和用H&E的染色及三色染色。会在显微镜下显现载玻片。
其次，分析会确定SS-31是否阻止部分厚度烧伤转化成全厚度烧伤。出于此目的，实施TUNEL染色和胱天蛋白酶-3测定法以观察是否在皮肤的毛囊中发生凋亡。出于此目的，使用0-48小时的时间点获得的皮肤样品。使用正常的皮肤作为“空白”样品。使用商业试剂盒依照制造商的规程来实施TUNEL测定法。通过使用兔抗活性胱天蛋白酶-3抗体的免疫荧光在载玻片上检测活性胱天蛋白酶-3。在数字获得图像上以高放大率(at high power)完成胱天蛋白酶-3阳性和TUNEL的量化。测定每个高放大率视野的阳性细胞数目，并在组间比较。
再次，使用多普勒成像来实施发光定位以评估创伤血流量。烧伤后2小时，在扫描激光多普勒装置上对动物的背部成像以量化烧伤区内及外部的皮肤中的浅层血流量分布。对于发光定位，使用100只雄性Sprague-Dawley大鼠。80只动物在背部上接受大的(覆盖30%的总体表面积)全厚度烧伤损伤。这是完善建立的模型。将它们分成2组，一组用SS-31处理，并且另一组用安慰剂(盐水)处理。将每组进一步分成4个亚组，其由4个时间点组成，在这些时间点处死动物以供进一步分析。在处死前，实施发光成像，接着实施安乐死和皮肤组织取样以供随后的组织学。剩余的20只动物会接受“假烧伤”，并会用SS-31或盐水处理。在相应的4个时间点之每个对两只动物实施安乐死。平均地，会在分开的笼中将每只动物收容10天(包括在畜牧场中的烧伤前天数)。
预测SS-31施用会加速创伤愈合，并减弱通常在大鼠模型中形成的烧伤损伤的行进。测量的结果包括创伤收缩、表皮细胞再生距离、及真皮中可能感兴趣的任何其它特征，诸如细胞性质和胶原构造。会评估Ki67增殖抗原，及TUNEL和胱天蛋白酶-3阳性。还会测量血流量(如通过发光定位所测量的)。在施用SS-31的烧伤大鼠和对照大鼠间进行比较。通过与上文所列举的烧伤损伤行进有关的一种或多种标志物的降低来指明本发明的芳香族-阳离子肽对烧伤损伤的成功治疗。
实施例6：SS-31针对晒伤提供保护并减弱晒伤后的组织损伤的行进(预示 性的)
在此实施例中，检查芳香族-阳离子肽在哺乳动物模型中针对晒伤损伤提供保护的效果。在一周过程里将无毛小鼠(具有与人相似的皮肤特征)暴露于过度的UV辐射。将受试者随机分成三组：(i)烧伤-盐水、(ii)烧伤-SS-31(4mg/kg/天；低剂量组)、(ii)烧伤-SS-31(40mg/kg/天；高剂量组)。会一天两次将溶解于1ml/kg盐水中的肽静脉内施用7天。
预测SS-31施用会加速创伤愈合，并减弱通常在该模型中形成的晒伤损伤的行进。测量的结果包括创伤收缩、表皮细胞再生距离、及真皮中可能感兴趣的任何其它特征，诸如细胞性质和胶原构造。会评估Ki67增殖抗原，及TUNEL和胱天蛋白酶-3阳性。还会测量血流量(如通过发光定位所测量的)。在施用SS-31的烧伤大鼠和对照大鼠间进行比较。对照包括假烧伤(SB)和用盐水处理的烧伤(B)。通过与上文所列举的烧伤损伤行进有关的一种或多种标志物的降低来指明本发明的芳香族-阳离子肽对晒伤损伤的成功预防和缓解。
实施例7：SS-31通过下调褐色脂肪组织中的UCP-1表达来减弱烧伤诱导 的高代谢
高代谢是烧伤损伤后代谢紊乱的一项标志特征。在烧伤后发生线粒体功能障碍，并且它与高代谢的形成(和改变的底物氧化)紧密相关。显示了线粒体靶向性小肽SS-31(其透入线粒体中)抑制线粒体膨胀，并且降低氧化性细胞死亡，减弱烧伤损伤后的高代谢。解偶联蛋白1(UCP-1)在褐色脂肪组织中特异性表达，并且在产热中发挥关键的作用。此实施例的目的是阐明UCP-1的下调是在用SS-31处理的烧伤中减弱高代谢的关键机制。
方法。将Sprague Dawley大鼠随机分成5组；假的(S)、用盐水处理的假(SSal)、用SS-31处理的假的(SPep)、用盐水处理的烧伤(BSal)和用SS-31处理的烧伤(BPep)。在烧伤组中，将动物背部浸没于100℃水中达12秒以在全身麻醉下产生III度30%TBSA烧伤。通过以相同的方式浸没微温水来产生假烧伤。这两组动物都接受40ml/kg腹膜内盐水注射以在损伤后复苏。假的或烧伤损伤后，用手术将静脉导管放入右颈静脉中。注射SS-31(2mg/kg)或盐水作为引发，并使用渗透泵(Durect,CA)来灌注7天(4mg/kg/天)。S组意味着对照组，其不接受任何全身麻醉、假的或烧伤损伤和导管放置。在烧伤损伤后6天在TSE间接量热法系统(TSE Co.Germany)中实施间接量热法达24小时，并每6分钟记录VO2、VCO2和能量消耗。在间接量热法后收集肩胛间褐色脂肪组织，并通过Western印迹来评估褐色脂肪组织中的UCP-1表达。
结果。与SSal组相比，VO2、VCO2和能量消耗在BSal组中是显著升高的(分别为p=0.000、p=0.000和p=0.000)。与BSal组相比，那些在BPep组中的VO2、VCO2和能量消耗是显著减弱的(分别为p<0.01、p<0.05和p<0.05)。BSal组中的UCP-1表达与SSal组中的相比为1.5倍高(p<0.05)。同时，与BSal组相比，BPep组中的UCP-1表达降低了32%(p=0.057)。
这些结果显示了，SS-31通过下调褐色脂肪组织中的UCP-1表达来减弱烧伤诱导的高代谢。因此，本文中所描述的芳香族阳离子肽可用于治疗遭受烧伤损伤的受试者的方法。
实施例8：SS-31在小鼠烧伤模型中在烧伤后诱导ATP合成率
为了证明对烧伤后并发症的治疗和预防，对哺乳动物烧伤损伤的鼠模型测试了本发明的芳香族-阳离子肽。烧伤中线粒体骨骼肌功能障碍的主要原因可以源自经由刺激活性氧类物质(ROS)的线粒体生成的氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷和所致的对线粒体DNA(mtDNA)的损伤。此假设得到数据支持，所述数据指明响应于烧伤损伤ROS在骨骼肌中的生成升高并且ATP合成率显著降低。此行进过程构成烧伤病理生理学的依据，其包括骨骼肌萎缩和恶病质。如此，此研究调查芳香族-阳离子肽作为减轻烧伤后的骨骼肌功能障碍的治疗形式的潜力。
此实施例在体内使用31P NMR和电子顺磁共振(EPR)来评估芳香族阳离子肽SS-31在临床相关烧伤创伤模型中的效果。结果显示了SS-31肽通过在烧伤后6小时引起线粒体氧化还原状态的恢复来诱导ATP合成率。
材料和方法。通过腹膜内(i.p.)注射40mg/kg戊巴比妥钠来麻醉重量为20-25g的雄性6周龄CD1小鼠。对所有组中的所有小鼠的左后肢剃毛。通过将其左后肢浸没于90℃水中达3秒来将每只烧伤小鼠进行3-5%总体表面积(TBSA)的非致死烫伤损伤。
NMR光谱学详细记载于Padfield等,Proc Natl Acad Sci USA102:5368-5373(2005)。简言之，将小鼠随机化成烧伤、烧伤+SS-31肽、对照、和对照+肽组。在烧伤前30分钟腹膜内注射SS-31肽(3mg/kg)，并在烧伤后立即进行第二次注射。使用Bruker Avance控制台在水平孔磁体(质子频率400MHz，21cm直径，Magnex Scientific)中实施NMR实验。优化90°脉冲以检测磷谱(重复时间2秒，400平均值，4K数据点)。使用饱和90°-选择性脉冲串(持续时间36.534ms，带宽75Hz)，接着是破碎梯度来使γ-ATP峰饱和。还与γ-ATP共振对称地在无机磷酸盐(Pi)共振的低场应用相同的饱和脉冲串。在存在γ-ATP饱和的情况中使用反转恢复脉冲序列来测量Pi和磷酸肌酸(PCr)的T1弛豫时间。使用绝热脉冲(400次扫描，以10KHz扫频，4K数据)来以152ms-7651ms的反转时间反转Pi和PCr。
EPR光谱学详细记载于Khan等,“Burn Trauma in skeletal muscle results inoxidative stress as assessed by in vivo electron paramagnetic resonance”.MolMed Reports1:813-819(2008)。简言之，将小鼠随机化成烧伤、烧伤+SS-31肽和对照组。在烧伤后0、3、6、24、和48小时腹膜内注射SS-31肽(3mg/kg)。用1.2-GHz EPR分光仪来实施EPR测量，所述分光仪装备有微波电桥和外部环共振器，其特别设计用于体内实验。最佳的分光仪参数是：入射微波功率，10mW；磁场中心，400高斯；调控频率，27kHz。在多个时间点时测量静脉内注射的硝基氧(150mg/kg)的衰变动力学，其指明肌肉的线粒体氧化还原状态。
结果。使用EPR来测量烧伤后多个时间的烧伤和烧伤+肽组的氧化还原状态。图9是显示烧伤损伤之前及之后的腓肠肌肌肉中的硝基氧还原的图。这些结果显示了，受试者在烧伤损伤后6小时时经历显著提高的氧化还原状态。图10-14分别显示了在烧伤损伤后0、3、6、24、和48小时时在对照、烧伤和烧伤+肽组中在烧伤损伤之前和之后的腓肠肌肌肉中的硝基氧的还原。依照EPR，在烧伤后6小时检测到与对照相比烧伤和烧伤+肽组的氧化还原状态的显著降低(p<0.05)；还有，检测到与烧伤相比烧伤+肽组的氧化还原状态的显著升高(恢复)(p<0.05)(图15)。
烧伤损伤在6小时时引起ATP合成率的显著降低(图11，表1)。肽SS-31在烧伤小鼠中诱导ATP合成率的显著升高，而在对照中诱导统计学不显著的升高。
表8：体内31P-NMR饱和转移实验的结果
如表8中所显示的及图15中所显示的：烧伤后6小时的ATP合成率(Pi→γATP)在烧伤(B)小鼠中显著降低；而SS-31处理导致ATP合成率在对照(C+P)和烧伤(B+P)小鼠两者中都显著升高。重要的是，与仅烧伤的小鼠(B)相比，ATP合成率在注射SS-31的烧伤小鼠(B+P)中显著升高(P=0.0001)。此外，在烧伤小鼠和注射SS-31的小鼠中比较ATP合成率(反应PCr→γATP)时，升高是统计学显著的(P=0.006)(表9)。依照EPR，检测到与对照相比烧伤和烧伤+SS-31组的氧化还原状态的显著降低(p<0.05)；还有，观察到与单独的烧伤相比烧伤+肽组的氧化还原状态的显著升高(恢复)(p<0.05)(图12)。
表9：对小鼠ATP合成率(反应PCr→γATP)的后肢骨骼肌实施的体内31P-NMR饱和转移实验的结果
总之，该结果显示了SS-31可能经由线粒体氧化还原状态的恢复或者经由在烧伤后早至6小时下调的过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅激活物-1β(PGC-1β)来诱导ATP合成率。参见Tzika等,Int J Mol Med21:201-208,2008。如此，由烧伤损伤引起的线粒体功能障碍在施用SS-31肽的情况中恢复。SS-31肽的施用即使在对照健康小鼠中也实质性提高ATP合成率。这些数据指明本发明的芳香族-阳离子肽可用于预防或治疗烧伤损伤继发性并发症，诸如骨骼肌功能障碍的方法。
实施例9：SS-31对线粒体顺乌头酸酶活性的影响
线粒体顺乌头酸酶是TCA循环的一部分，并且已经将其活性与TCA流直接联系起来。此外，其活性受到ROS的抑制，并且如此，将它视为氧化应激的指数。在这里，使用5%TBSA小鼠烧伤模型，我们提出烧伤对线粒体顺乌头酸酶活性的局部和系统性影响。还已经检查了线粒体肽(SS-31)的影响。
虽然在烧伤中，我们会预期由ROS生成增加所致的线粒体顺乌头酸酶活性水平降低，但是在我们的研究中，我们在烧伤(局部烧伤效应)和烧伤腿对侧(系统性烧伤效应)两者中都观察到线粒体顺乌头酸酶活性升高，这最可能是由于烧伤损伤诱导的高代谢(图16)。如此，就线粒体顺乌头酸酶活性而言，且如此就TCA流而言，已知在烧伤损伤中发生并可以抑制此线粒体顺乌头酸酶活性的ROS生成增加不能克服烧伤中还存在的高代谢。还已经在完整的人和分离的小鼠骨骼肌中的锻炼/重复收缩的情况中显示了相似的观察结果，虽然也在此情况中观察到ROS的增加。鉴于降低的ATP合成率，我们还观察到，在来自相同烧伤模型的骨骼肌中，此结果可以认为是在此特定的高代谢综合征中TCA是无效的间接证据。
这些结果显示了在烧伤动物中的SS-31施用降低了线粒体顺乌头酸酶活性直至对照水平，指明如此SS-31恢复TCA流，可能响应更有效的有氧呼吸，因为这点通过与未处理的烧伤动物相比升高的ATP合成率得到了提示。
实施例10：单剂SS-31在小鼠烧伤模型中在烧伤后诱导ATP合成率。
此实施例在体内使用31P NMR来评估芳香族阳离子肽SS-31在临床相关烧伤创伤模型中的效果。结果显示了SS-31肽通过在烧伤后引起线粒体氧化还原状态的恢复来诱导ATP合成率。
通过腹膜内注射40mg/kg戊巴比妥钠来麻醉雄性6周龄CD1小鼠(20-25g)，并对所有小鼠的左后肢剃毛。通过将左后肢浸没于90℃水中达3秒通过3-5%总体表面积的非致死烫伤损伤来施加烧伤损伤。将小鼠随机化成烧伤(B)、烧伤+SS-31(B+P)、对照(C)和对照+SS-31(C+P)组。在烧伤前30分钟及烧伤后立即腹膜内注射SS-31(3mg/kg)。不同组的烧伤动物在烧伤后立即接受了唯一一剂SS-31肽。
表10：体内31P-NMR饱和转移实验的结果。
表10中显示了结果。数值是均值±SE；ΔM/M0是由饱和转移所致的Pi磁化的分数变化；T1obs是在γATP饱和过程中以秒观察到的Pi自旋晶格弛豫时间；ATP合成以[Pi]x k计算；[Pi]是从基线NMR谱外推的Pi的浓度，比较Pi与γATP峰，并用生物发光测定法来测量ATP浓度；k以(1/T1obs)x(ΔM/M0)计算；P值(未配对斯氏t检验)用于比较实验和对照组；*标示在烧伤后立即对动物注射唯一一剂SS-31肽(3mg/kg)。如此，表的最后一栏显示了SS-31在烧伤后即使以单剂也标准化ATP合成率。这些数据指明本发明的芳香族-阳离子肽可用于预防或治疗烧伤损伤继发性并发症的方法。
本发明不限于在本申请中所描述的具体实施方案，所述实施方案意图为本发明的个别方面的单独例示。本发明的许多修饰和变型可以在不背离本发明精神和范围的前提下做出，如本领域技术人员会显而易见的。在本文中所列举的方法和组合物外，本发明范围内的功能等同方法和组合物通过上述说明书对于本领域技术人员会是显而易见的。此类修饰和变型意图落入所附权利要求书的范围内。本发明应当仅由所附权利要求书的条款及此类权利要求享有权利的等同方案的整个范围限制。应当理解，本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以存在变化。还应当理解，本文中所使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，而并不意图是限制性的。
另外，在根据Markush组描述公开内容的特征或方面的情况中，本领域技术人员应当认可，公开内容由此还根据Markush组的任何个别成员或成员亚组来描述。
如本领域技术人员应当理解的，出于任何及所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文中所公开的所有范围还涵盖其任何及所有可能的亚范围和亚范围组合。可以容易地认可任何所列的范围充分描述，并使相同的范围能够分解成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性例子，本文中所讨论的每个范围可以容易地分解成下部的三分之一、中间的三分之一和上部的三分之一，等等。如本领域技术人员还应当理解的，所有语言诸如“多至”、“至少”、“大于”、“小于”等包括列举的数字，并且指随后可以分解成亚范围的范围，如上文所讨论的。最后，如本领域技术人员应当理解的，范围包括每个个别的数字。如此，例如，具有1-3个细胞的组指具有1、2、或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组指具有1、2、3、4、或5个细胞的组，等等。
通过提及而将本文中所引用的所有参考文献完整且出于所有目的而收入本文，其程度就像出于所有目的通过提及而明确且单独收录每篇单独的出版物、专利、或专利申请的全部内容。
在所附权利要求书内列出了其它实施方案。

Claims (31)

1.一种治疗遭受烧伤损伤或烧伤继发性系统性损伤或状况的受试者的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
2.权利要求1的方法，其中所述系统性损伤是器官功能障碍或衰竭。
3.权利要求2的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭影响肺、肝、肾、或肠中的一种或多种。
4.权利要求3的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭是肝衰竭。
5.权利要求2的方法，其中在烧伤损伤后，但在器官功能障碍或衰竭的症状发作前施用所述肽。
6.权利要求2的方法，其中在器官功能障碍或衰竭的症状发作后施用所述肽。
7.权利要求1的方法，其中所述系统性损伤是高代谢。
8.权利要求7的方法，其中在烧伤损伤后，但在高代谢的症状发作前施用所述肽。
9.权利要求7的方法，其中在高代谢的症状发作后施用所述肽。
10.权利要求1的方法，其中所述系统性损伤是骨骼肌功能障碍。
11.权利要求10的方法，其中所述骨骼肌功能障碍是骨骼肌萎缩或恶病质。
12.权利要求10的方法，其中在烧伤损伤后，但在骨骼肌功能障碍的症状发作前施用所述肽。
13.权利要求10的方法，其中在骨骼肌功能障碍的症状发作后施用所述肽。
14.一种治疗或预防烧伤继发性高代谢的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
15.一种治疗或预防烧伤继发性器官功能障碍或衰竭的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
16.权利要求15的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭影响肺、肝、肾、或肠中的一种或多种。
17.权利要求16的方法，其中所述器官功能障碍或衰竭是肝衰竭。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述烧伤是二或三度烧伤。
19.依照权利要求1-18中任一项的方法，其中所述受试者是人。
20.依照权利要求1-19中任一项的方法，其中所述肽是静脉内、口服、皮下、经皮、腹膜内、或表面施用的。
21.一种保护受试者免于烧伤损伤的方法，该方法包括在烧伤之前对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
22.权利要求21的方法，其中表面施用所述肽。
23.权利要求21的方法，其中所述烧伤是晒伤。
24.权利要求21的方法，其中所述烧伤是放射性烧伤。
25.一种在哺乳动物组织中提高ATP合成率的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
26.权利要求25的方法，其中在施用所述肽后，所述哺乳动物组织中的所述ATP合成率与对照组织相比是升高的。
27.权利要求26的方法，其中所述对照组织是来自没有施用所述肽的哺乳动物受试者的组织。
28.权利要求25的方法，其中通过恢复线粒体氧化还原状态来提高所述ATP合成率。
29.权利要求25的方法，其中通过提高过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅激活物-1β(PGC-1β)蛋白的表达或活性来提高所述ATP合成率。
30.一种治疗以ATP合成率降低为特征的疾病或状况的方法，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用有效量的具有式D-Arg-2’6’-二甲基酪氨酸-Lys-Phe-NH2的肽。
31.权利要求30的方法，其中所述疾病或状况是烧伤损伤。
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