JP4838722B2 - ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物 - Google Patents
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Description
この出願は、2003年10月24日に出願された米国特許仮出願第60/513,983号、及び2004年5月5日に出願された米国特許仮出願第60/568,436号の利益、及び優先権を主張する。許容される場合には、この両者の内容は、その全体が、引用により取り込まれるものとする。
下記開示の態様は、部分的にNIH-NIA SBIR助成第AG022780号により助成された。それゆえ、米国は、本開示における一定の権利を有する。
この出願に、添付コンピュータ可読媒体上の配列リスト、ファイル名120701-2030.txtその全体が、引用により取り込まれるものとする。該ファイルは、2004年10月14日、又はその前後に作製され、約696 Kbである。
(1.技術分野)
本開示は、一般にポリヌクレオチドの送達のための組成物、及び方法、さらに具体的には、細胞小器官のトランスフェクションなどの、トランスフェクションの組成物、及び方法に関するものである。
ミトコンドリアDNA (mtDNA)における単一同質細胞質の突然変異から生じる、多くのミトコンドリア疾患が記載されてきている。通常、これらの疾患は、非分裂組織(脳、網膜、筋肉)に影響を及ぼし、様々な表現型を示し、弧発的に現れ、かつ治療不可能である。判明しつつある証拠から、パーキンソン病、及びII型糖尿病などの疾患におけるmtDNA異常の関与が示されているが、これらの状態の具体的な原因となる突然変異は、依然として明らかにされていない。mtDNA 遺伝子型-表現型の関係を理解すること、及びmtDNA基盤の疾患に対する具体的な治療を開発することは、該ミトコンドリアゲノムを操作できないために妨げられている。
非ウイルスポリヌクレオチド送達媒体、及びその使用方法を提供する。一般に、本開示は、例えば、非核性細胞小器官標的シグナルなどの、標的シグナルに機能的にリンクされたタンパク質導入領域を含む、改質されたポリヌクレオチド結合タンパク質を提供する。一態様は、少なくとも1種のHMG ボックス領域、より一般的には、少なくとも2種のHMG ボックス領域、及び少なくとも1種のタンパク質導入領域を含む、ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、ポリヌクレオチドと会合し、該ポリヌクレオチドを凝縮させることができる。また、該ポリペプチドは、該ポリヌクレオチドをコーティングできる。該ポリヌクレオチドをコーティングすること、及び/或いは凝縮することは、該ポリヌクレオチドの分解から保護する上で役立つ。該タンパク質導入領域は、該ポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体が膜を通過し、細胞の内部、又は細胞小器官に進入するのに役立つ。該標的シグナルは、該複合体を対象の部位へ導くのに役立ち、それにより該ポリヌクレオチドを送達する。
本開示された主題を記載、及び請求する際に、下記の専門用語を以下に示す定義に従って用いる。
"ポリペプチド"という用語は、タンパク質、及びその断片を含む。ポリペプチドを、アミノ酸残基配列として本明細書中で開示する。それらの配列を、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、左から右へ書く。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列を、下記のとおり、3文字、又は1文字のいずれかで表示する: アラニン (Ala、A)、アルギニン (Arg、R)、アスパラギン (Asn、N)、アスパラギン酸 (Asp、D)、システイン (Cys、C)、グルタミン (Gln、Q)、グルタミン酸 (Glu、E)、グリシン (Gly、G)、ヒスチジン (His、H)、イソロイシン (Ile、I)、ロイシン (Leu、L)、(Lys、K)、メチオニン (Met、M)、フェニルアラニン (Phe、F)、プロリン (Pro、P)、セリン (Ser、S)、トレオニン (Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、及びバリン(Val、V)である。
(A. ポリヌクレオチド結合領域)
本明細書中で提供するポリヌクレオチドの送達のための組成物、及び方法は、ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、又はPTD、及び任意に標的シグナル、又は領域を有する、ポリヌクレオチドをパッケージングするポリペプチドを含む。該改質された、又は組み換えポリペプチドは、ポリヌクレオチドと結合、又はパッケージングすることが公知の、任意のポリペプチドであり得る。該組み換えポリペプチドは、単独、又はポリヌクレオチドと組合せてのいずれかで、治療薬として用いることができる。一実施態様において、該ポリヌクレオチド結合ポリペプチドは、少なくとも高移動性グループ(HMG)のタンパク質の一員の一部分、特に少なくとも1種のHMGボックス領域を含む。一般に、該HMG領域は、2種の疎水性コアによる“L 型"構造で安定化された、広範囲の三重らせんの折り畳みを含む。高移動性グループ染色体タンパク質HMG1、又はHMG2は、全ての真核生物で共通であり、DNAに非特異的に結合し、例えば、クロマチン機能、及び遺伝子調節を促進する。それらは、ヌクレオソームと直接相互作用することができ、クロマチン構造のモジュレーターであると考えられている。また、それらは、そのDNAに対する親和性を増大させることにより、p53、Hox転写因子、及びステロイドホルモン受容体などの、様々な遺伝子発現調節因子を活性化する上で重要である。HMGタンパク質は、HMG-1/2、HMG-I(Y)、及びHMG-14/17を含む。
該ポリヌクレオチド結合ポリペプチドを改質し、細胞貫通ペプチド(CPPS)としても知られている、タンパク質導入領域(PTD)を含むことができる。PTDは、当技術分野で知られており、例えば、受容体非依存な機構で細胞膜を通過できるタンパク質の小さな領域であるが、それらに限定しない(Kabouridis, Pらの論文、(2003) Trends in Biotechnology (11):498-503)。PTDのいくつかは、実証されているが、2種の最もよく使用されるPTDは、HIVのTAT (Frankel and Pabo, 1988) タンパク質、及びショウジョウバエからののアンテナペディア転写因子に由来し、後者のPTDはペネトラチンとして知られている (Derossiらの論文、(1994) J Biol Chem. 269(14):10444-50)。
さらに他の実施態様において、該改質されたポリヌクレオチド結合ポリペプチドを、任意に改質し、標的シグナル、又は領域を含む。該標的シグナル、又は配列は、組織、器官、細胞、細胞小器官、非核性細胞小器官、又は細胞内コンパートメントに特異的であり得る。例えば、本明細書中で開示される組成物を、ガラクトシル末端マクロ分子で改質し、該組成物を肝臓、又は肝細胞へ標的とすることができる。該改質された組成物は、該担体ガラクトース残基の、肝細胞上にのみ大量に、かつ高アフィ二ティーで存在するアシアロ糖タンパク質受容体との相互作用の後、肝細胞に選択的に進入する。さらに、本明細書中で開示される組成物を、特定の細胞内領域、コンパートメント、又は細胞小器官へ標的とすることができる。
本明細書中で開示される組成物は、1種以上の核局在化シグナルを含むことができる。核局在化シグナル(NLS)、又は領域は、当技術分野で知られており、SV 40 T抗原、又はその断片などを含み、例を挙げるとPKKKRKV (配列番号: 10)がある。該NLSは、約4〜約8アミノ酸の単純なカチオン性配列であり得るか、或いは約10〜12アミノ酸の突然変異耐性リンカー領域により分離された、2種の相互依存的な正に荷電されたクラスターを有する、二連構造であり得る。さらなる典型的なNLSは、例えば、GKKRSKV (配列番号: 11);KSRKRKL (配列番号: 12);KRPAATKKAGQAKKKKLDK (配列番号: 13);RKKRKTEEESPLKDKAKKSK (配列番号: 14);KDCVMNKHHRNRCQYCRLQR (配列番号: 15);PAAKRVKLD (配列番号: 16);及びKKYENVVIKRSPRKRGRPRK (配列番号: 17)があるが、それらに限定されない。
本開示の他の実施態様は、特にポリヌクレオチドをミトコンドリアへ送達する、改質されたポリヌクレオチド結合ポリペプチドを開示する。ミトコンドリアは、グルコースの分解からアデノシン三リン酸(ATP)へのエネルギー変換のための、分子機構を含む。その後、ATPの高エネルギーリン酸結合に蓄えられたエネルギーは、細胞機能に動力を供給する。ミトコンドリアはほとんどタンパク質であるが、いくつかの脂質、DNA、及びRNAが存在する。これらの通常球状の細胞小器官は、酸化的リン酸反応、及び電子伝達系酵素の足場に折り込まれている(クリステ)内膜を囲む外膜を有する。多くのミトコンドリアは、棚状のクリステを有するが、ステロイド分泌細胞のミトコンドリアは、管状のクリステを有する。ミトコンドリアマトリックスは、クエン酸回路の酵素、脂肪酸酸化、及びミトコンドリアの核酸を含む。
別の実施態様において、特に、本明細書中で開示された改質された組成物は、葉緑体局在化シグナル、又は領域を含むことにより、ポリヌクレオチドを葉緑体へ送達する。葉緑体に関して、いくつかのアミノ末端標的シグナルが推定されてきており、部分的に表2に含める。該葉緑体は、二重に囲まれた膜を有する、真核生物における光合成の細胞小器官である。該二重膜の内部の液体は、ストロマと呼ばれる。該葉緑体は核様体領域を有し、その環状の裸のDNAを内蔵する。また、該ストロマは、カルビン回路の部位である。該カルビン回路は、一連の酵素触媒される化学反応で、二酸化炭素から炭水化物、及び他の化合物を合成する。
タンパク質導入領域、及び任意に標的シグナルを有する、改質されたポリヌクレオチド結合ポリペプチドを、対象のポリヌクレオチドと組合せ、ポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成することができる。例えば、該改質されたポリペプチドは、該対象のポリヌクレオチドを可逆的に結合する。該改質されたポリペプチドと該対象のポリヌクレオチドの間の結合、又は相互作用は、十分強く、該ポリヌクレオチドを分解から保護するが、可逆的であり、該ポリヌクレオチドは、細胞、又は細胞小器官に送達された時点で、その生物活性を保持する。該ポリヌクレオチドの生物活性は、該ポリヌクレオチドによりコードされる該ポリペプチドを発現すること、或いはそれがリボザイム、又はDNAザイムであれば、該ポリヌクレオチドの酵素活性を含むことができる。
細胞を作製し、内在性mtDNAを除去することができ、次いでミトコンドリアトランスフェクションを行い、細胞の全ミトコンドリアゲノムが置換されることになる。代わりとして、Rho0細胞の作製を伴う最初の手順なしに、ミトコンドリアをトランスフェクトすることができる。この場合、該導入された核酸が、既存の内在性mtDNA配列に取り込まれ(組み換えられ)、該mtDNA配列の操作をもたらされる。どちらの方法を用いても、損傷されたミトコンドリアに対して完全な機能を回復させることができる。
別の実施態様は、ポリヌクレオチドの葉緑体への送達などの、植物のトラスフェクションのための方法、及び組成物を提供する。植物のトランスフェクションの技術は、当技術分野において知られている。例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、及びアグロバクテリウム リゾネゲス(Agrobacterium rhizogenes)の両者は、そのDNAを植物のゲノムに転移することができ、それらを用いて植物細胞をトランスフェクトすることができる。それらがDNAを転移する機構は同一であるが、得られる表現型の相違は、アグロバクテリウム ツメファシエンスにおけるTi プラスミド、及びアグロバクテリウム リゾネゲスにおけるRi プラスミドの存在によるものである。該TiプラスミドDNAが、宿主植物に腫瘍塊を生育させる一方、該Ri プラスミドDNAは、根の大量増殖をもたらす。アグロバクテリウム ツメファシエンスが、ほとんど全ての植物を感染できる一方、アグロバクテリウム リゾネゲスは、根だけを感染するしかない。
別の実施態様において、該トランスフェクション複合体は、タンパク質導入領域、及び細胞小器官局在化シグナルを有する組み換えポリペプチドを、ポリヌクレオチドと組合せて含む。該複合体を細胞株由来の細胞の細胞小器官へ導入することができる。該細胞株は、細胞培養で永久に維持できる形質転換された細胞株であり得るか、或いは該細胞株は、初期培養であり得る。植物細胞株などの典型的な細胞株は、米国微生物系統保存機関から入手可能なものであり、それらは引用により、本明細書に取り込まれるものとする。該核酸は、該トランスフェクトされた細胞株の細胞の核内で、複製、及び転写され得る。該標的シグナルは、必要に応じて酵素的に切断され、該複合体は該標的細胞小器官に自由にとどまることができる。
一実施態様において、本開示をツールとして用いて、細胞の遺伝子発現の因果関係を調べる。例えば、mtDNA 発現、ヘテロプラスミーの機構、mtDNA 複製、及び継承と同様に、閾値効果がある。変異型マウスを、このアプローチを用いて作製することができ、研究者が、天然にない核、及びmtDNA の変異型を研究することを可能にする。特に、本明細書中で開示された方法、及び組成物を用いて、同一の遺伝子型、又は様々な程度のヘテロプラスミーを有するミトコンドリアを含む、細胞を作製することができる。同種形成の細胞を製造するために、最初にRNA干渉(RNAi)を用いて、(mtDNAを欠いている)Rho0 細胞を作製する。例えば、Rho0細胞を、ヒトミトコンドリアDNA ポリメラーゼに対するRNAi を用いながら、作製することができる。典型的なRho0細胞株を、mtDNA管理に関与するミトコンドリアタンパク質に対するRNAiで作製する。これらのRho0細胞を、ピルビン酸含有支持培地上で維持、及び増殖させ、その後、機能的なミトコンドリアゲノムでトランスフェクトする。支持培地からピルビン酸を除くことによる、代謝的選択の後に、うまくトランスフェクトされたミトコンドリアを含有する細胞だけが、生き残る。従って、全てが同一のミトコンドリアゲノムを有する細胞の集団をもたらす。
本開示に記載された技術を用い、ヒト以外のトランスジェニック動物を作成することができる。具体的には、受精卵マイクロインジェクション、核移植、割球の電気融合、及び胚幹(ES)細胞細胞質雑種の胚盤胞注入は、各々、トランスフェクトされた細胞株(すなわち、トランスフェクトされたミトコンドリアを含有する細胞)由来のmtDNAを含有するヘテロ、及びホモプラスミーなマウスを作製する実行可能なストラテジーを提供している。一実施態様において、キメラマウスを作製する手段として、胚幹(ES)細胞をトランスフェクトし、哺乳動物胚の胚盤胞中へ注入する。別の実施態様において、最初に、(トランスフェクトされた細胞、及びES細胞rhosから、又は2種の個別にトランスフェクトされた細胞から)胚幹(ES)細胞細胞質雑種を作成し、次いで胚への胚盤胞の注入をする。特定の対象のmtDNAをもつ細胞の使用により、該トランスフェクトされたDNAにヘテロプラスミー、又はホモプラスミーである、ミトコンドリア導入マウスの作製ができる。理論的には、この技術は、トランスフェクトされた培養細胞から得られる任意の変異型mtDNAを、生物全体のモデルに移行する可能性を提供する。例えば、この開示された方法、及び組成物を用いて、ヒトmtDNA疾患のマウスモデルを作製することができる。
また、本開示は、真核、又は原核生物のトランスフェクション、特に細胞小器官のトランスフェクションを行うのに必要な成分を供給するキット、又はセットを対象にする。一実施態様に従って、タンパク質導入領域、及び任意に、標的シグナル、及び領域を含む、DNA結合タンパク質コンストラクトを含むキットを提供する。該タンパク質コンストラクトをポリヌクレオチドを組合せ、複合体を形成することができ、それを用いて宿主、又は宿主細胞をトランスフェクトすることができる。別の実施態様において、該キットと提供される該タンパク質コンストラクトは、核、ミトコンドリア、又は葉緑体局在化シグナルを含む。該シグナルは、細胞小器官を標的とすることが知られているものから選択し、表I 、及びIIに部分的に示す。別の実施態様において、該タンパク質コントラストは、11アルギニン残基伸長、又はHIV- Tatアミノ酸配列をコードする配列、次いで任意に、標的シグナルに機能的にリンクされた、TFAMの局在化シグナルなどの、ミトコンドリア局在化シグナルを含む。
本開示の実施態様は、遺伝子治療プロトコル、及び遺伝子関連疾患、又は障害の治療に適用できる組成物、及び方法を提供する。本明細書中で開示された組成物で治療できる適切な遺伝子基盤疾患は、癌;カナバン病;アルツハイマー病;パーキンソン病;高コレステロール血症;嚢胞性線維症;貧血;動脈硬化症;筋ジストロフィー;AIDS;喘息;糖尿病;関節炎;アデノシンデアミナーゼ欠損症;ゴーシェ病;鎌状赤血球貧血、及びセラサミアなどの異常ヘモグロビン症;及び自己免疫疾患を含むが、それらに限定しない。
また、本開示は、トランスフェクトされた、及びトランスフェクトされていないミトコンドリアを有する細胞を作製することにより、ミトコンドリア疾患の症状を緩和することを意図する。代わりとして、細胞のミトコンドリアのすべてを、トランスフェクト、又は置換することができる。
本明細書中で提供された組成物を、宿主に生理学的に許容し得る担体の中で投与することができる。好ましい投与方法は、全身性、又は細胞への直接投与である。該組成物を、遺伝子治療適用の技術において一般的に公知のとおり、細胞、又は患者に投与することができる。遺伝子治療適用において、該組成物を細胞に導入し、細胞小器官をトランスフェクトする。"遺伝子療法"は、継続効果が単一の治療で達成される従来の遺伝子治療と、治療上効果的なDNA、又はRNAの1回、又は反復投与を伴う、遺伝子治療薬剤の投与を含む。
HIV Tatタンパク質の11アミノ酸タンパク質導入領域 (PTD)を、ヒトミトコンドリア転写因子A (TFAM)のミトコンドリア局在化シグナル(MLS)の上流で、フレーム内にクローニングした。核のトランスフェクションでは、該MLSをSV40ウイルスT抗原の9アミノ酸核局在化シグナルで置換した。組み換えタンパク質を細菌内で発現させ、ニッケルキレートカラム上で、エンテロキナーゼ部位のすぐ下流のC末端で発現された6X ヒスチジンタグを用いて単離した。該精製されたタンパク質を、エンテロキナーゼとインキュベートし、さらに、フロースルーを集めたニッケルカラム上で精製した。該タンパク質を、33%リン酸緩衝生理食塩水を含有する生理食塩水に対して、4℃で一晩透析した。精製されたタンパク質を濃縮し、タンパク質濃度をブラッドフォード測定法(Biorad社)で決定した。精製されたタンパク質は、SDS-Pageで分析し、純度を確認した。
GFP(緑色蛍光タンパク質)cDNAを270番目のヌクレオチドで突然変異させ、次のコドン変化を起こした(UGG→UGA)。UGAが、ミトコンドリア翻訳機構によりトリプトファンとして解読される一方、核翻訳機構は、それを終止コドンとして解読する。核機構により翻訳された場合は、非蛍光の短縮されたGFPが生じるが、ミトコンドリアで翻訳された場合は、全長蛍光生成物である。得られたミトコンドリアでコードされたGFP cDNAを先に記載のとおりPTD-MLS-Tfamと複合体化し、MitoTracker Redで予め染色されたSY5Y細胞培養に導入した。該細胞を、トランスフェクション時間後、共焦点顕微鏡で観察した。GFPシグナル(緑色)が、Mitotracker Red(赤色)と共局在していることが観察され、重ね合わせると、黄色の蛍光を生じた(図1B、及び1C)。
組み換えPTD-NLS-TFAMを、Alexa 488色素(Molecular Probes社)で標識し、ミトトラクカーレッド(MitoTracker Red)色素(Molecular Probes社)で予めインキュベートされたSy5y細胞上で、共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。緑色蛍光は、該Alexa 488標識された組み換えPTD-NLS-TFAMを示し、赤色蛍光はミトコンドリアを示し、核の境界の分析のための、核周辺の分布を提供する。該標識された組み換えタンパク質を細胞培地に導入後5、10、及び20分でのいくつかの画像を、共焦点顕微鏡を用いて撮った。該組み換えコンストラクトが、核内にある場合、より強い局在化(20分の画像記録)をもたらすことに注目されたい。これから、DNAの存在下での凝縮が示唆される。
図1に描かれた遺伝子送達ベクター分子を用い、DNAを送達した。このベクターは、先に記載した遺伝子送達の3種の要素を組合せ、初めて、全長ミトコンドリアゲノム、及びmtDNAにクローニングされた外来遺伝子の、分裂細胞、及び非分裂細胞の両者におけるミトコンドリアのマトリックスコンパートメントへの導入を可能にする。
図2から、アレクサ488(Alexa 488)色素で標識され、PTD-MLS-TFAMと複合体化されている野生型mtDNAは、15分以内に、SY5Y細胞のミトコンドリアに速やかに進入することが示される。
トランスフェクトされたDNAの機能性を、rho0表現型の救済により確認した。Rho0細胞は、エチジウムブロマイドと長期間インキュベートすることにより、内在性のmtDNAを消失された培養細胞である。そのような細胞は、ウリジン、及びピルビン酸を補充された培地でのみ生存し、サブユニットが部分的に該ミトコンドリアゲノムでコードされている、電子伝達系の測定可能な活性をもたない。LHON mtDNAと複合体化されたMTD-TFAMを、Sy5y細胞から作製されたrho0細胞の培地に加えた。図4から、成功したrho0細胞への導入、及びrho0細胞におけるLHON mtDNAの複製が示される。該LHON 11778A突然変異は、野生型mtDNAに存在するSfaNI部位の喪失をもたらす。rho0細胞において、類似の野生型様偽遺伝子を増幅し、SfaN1により切断する。LHON mtDNAのrho0へのトランスフェクション、及び代謝選択での継代の後に、主に、SfaNI部位のない該導入されたLHON mtDNAが見い出される。
DNAのミトコンドリアへの送達のさらなる確認は、緑色蛍光タンパク質、EGFPの遺伝子の導入により達成した。ミトコンドリア翻訳表は、核のコーディングとは異なる。従って、核の翻訳が、蛍光活性のない短縮型タンパク質をもたらし得る一方、ミトコンドリアは全長蛍光タンパク質を翻訳し得る(mtEGFPの第173番目のヌクレオチドでの、UGGから→UGAのコドン変更の)ように、EGFPのcDNAを設計した。該突然変異ミトコンドリアEGFP(mtEGFP)を、2箇所の部位(mtEGFPに融合しているND6を産生するBamHI 部位、及びCOX3遺伝子とATP遺伝子の結合部)の1つでミトコンドリアゲノムにクローニングした。これにより、ミトコンドリア遺伝子産物の複製、及び転写が影響を受けないこと、かつ該ミトコンドリアの複製、及び転写機構のみがリポーター遺伝子-mtDNAコンストラクトを維持できることが確実になる。両者の場合において、該ミトコンドリアゲノムの転写のため、共通のプロモーターからのポリシストロニックな転写物として、該導入されたmtEGFP配列は、ミトソームの内在性ミトコンドリア遺伝子と同時に転写され、機能的な蛍光産物に翻訳された。一方、核にトランスフェクトされたmtEGFPは、全く蛍光を産生しなかった(図5)。ミトコンドリアによるmtEGFPの発現をさらに確認するために、mtDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼガンマ(PolG)に対するRNA干渉を用いた。3種のsiRNAの組合せを用いて、PolGレベルは、3日以内に検出不能になり、mtDNAの急激な喪失をもたらした。同様に、mtEGFPは、PolGに対するRNAiを用いると検出不能である(図6)が、EGFPに対するコントロールsiRNAではそうでないことを見い出した。
さらに、遺伝子送達をミトコンドリアに導き、mtDNA、及びクローニングされた遺伝子を発現させる、本開示された組成物、及び方法の一般的な実用性を拡大し、ミトコンドリアで発現された遺伝子を他の細胞内コンパートメントに導かせる可能性を調べた。この可能性を調べるために、mtEGFPを、PTD、及びSv40大型T抗原由来の核局在化シグナル(NLS)の組合せをコードする配列と融合し、該COX3-ATP6部位にクローニングした。得られたタンパク質は、EGFP、及びNLS+PTD(ミトコンドリア逃避領域、MED)の融合である。該MEDは、該融合タンパク質がミトコンドリアから離れ、かつ核を標的とすることを可能にする。図7に示すとおり、該MED-NLS-EGFPは、有意な程度に核に集中し、ミトコンドリアでは検出可能である。該プロセスはかなり効果的であり、10%以上の細胞が、ミトコンドリアで翻訳されたタンパク質の着実な核での蓄積を示す。
多くのグループが、突然変異mtDNAの、野生型のものに対する選択優位性を報告している。該導入されたmtDNA に、突然変異体であるかないかにかかわらず、内在性mtDNA制圧させるために、クローニングされたmtDNAのND6内のBamHI部位を無効にした。該突然変異誘発は、アミノ酸変化をもたらさない。BamHI制限エンドヌクレアーゼを該COX3-ATP6部位内にクローニングした。該BamHI部位を無効にし、該BamHI制限エンドヌクレアーゼを該クローニングされたmtDNAの一部分として含むことにより、該BamHI酵素は、全ての内在性mtDNAを制限消化し、該導入されたmtDNAを消化することはできない。Sy5y細胞にトランスフェクション後24時間で、PCRを用いて内在性mtDNAは検出不能である(図8A)。さらに、ミトコンドリア溶解液から、有意なBamHI活性が示された(図8B )。
Claims (23)
- タンパク質導入領域及びミトコンドリア局在化シグナルに機能的にリンクされた配列番号210のアミノ酸56-259を含むミトコンドリア転写因子A (TFAM)ポリペプチドを含む、組み換えポリペプチド。
- 前記組み換えポリペプチドが、10〜100ヌクレオチドの、標的とされた細胞小器官に送達されるべきポリヌクレオチドと会合し、それにより、該標的とされた細胞小器官への送達のために該ポリヌクレオチドをパッケージングする、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- 前記組み換えポリペプチドが、配列番号210のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- (a)タンパク質導入領域及びミトコンドリア局在化シグナルに機能的にリンクされた配列番号210のアミノ酸56-259を含むミトコンドリア転写因子A (TFAM)ポリペプチドを含む、組み換えポリペプチド;及び
(b)該組み換えポリペプチドと物理的に会合するポリヌクレオチド;
を含む、組成物。 - 前記物理的会合が、前記ポリヌクレオチドを分解から保護する、請求項4記載の組成物。
- 前記組み換えポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドの領域に可逆的に結合する、請求項4記載の組成物。
- 前記ミトコンドリア局在化シグナルが、へキソキナーゼI、アミンオキシダーゼ(フラビン含有)A、へキソキナーゼ IV、膵臓ベータ細胞型、末梢型ベンゾジアゼピン受容体関連タンパク質、メタキシン2、推定ミトコンドリア外膜タンパク質輸入受容体(hTOM)、グルタチオントランスフェラーゼ、電位依存性アニオンチャンネル2 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、へキソキナーゼIV、チトクロム b5、末梢ベンゾジアゼピン受容体、生殖細胞キナーゼアンカーS-AKAP84、A キナーゼアンカータンパク質、カルニチンO-パルミトイルトランスフェラーゼ I 前駆体、へキソキナーゼ II、アミンオキシダーゼ(フラビン含有)B、長鎖脂肪酸-CoA リガーゼ 2、長鎖脂肪酸-CoA リガーゼ 1 (パルミトイル-CoA リガーゼ)、電位依存性アニオンチャンネル1、 メタキシン 1、ヒト推定ミトコンドリア外膜34 kDa トランスロカーゼ hTOM34、電位依存性アニオンチャンネル 4 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、チトクロムb5 還元酵素、電位依存性アニオンチャンネル3 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、ミトコンドリア輸入受容体サブユニットTOM20ホモログ(ミトコンドリア20 kd 外膜タンパク質)(ミトコンドリア外膜受容体TOM20)、及び腫瘍性成虫原基ホモログ前駆体 (HTID-1)からなる群から選択されるタンパク質のミトコンドリア局在化シグナル配列に80〜100%同一性を有する配列を含む、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- 前記タンパク質導入領域が、生理的条件下で正味の正電荷を有する複数のアミノ酸残基を含む、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- 前記タンパク質導入領域が8〜15アミノ酸残基を含む、請求項8記載の組み換えポリペプチド。
- 前記タンパク質導入領域が11アルギニン残基を含む、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- 前記タンパク質導入領域が、YGRKKRRQRRR (配列番号: 1)、RKKRRQRRR (配列番号: 2)、HIV-1 TATタンパク質のアミノ酸48-60、アンテナペディアホメオドメインの第3へリックス、RQIKIWFQNRRMKWKK (配列番号: 207)、ポリアルギニン領域、7〜15アルギニン残基、RRQRRTSKLMKR (配列番号: 7)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (配列番号: 8)、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (配列番号: 9)、又はその組合せからなる群から選択される、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
- 前記タンパク質導入領域が膜を通過することを促進し、かつ該膜が、細胞膜、原形質膜、細胞小器官膜、ミセル膜、二重層膜、単層膜、小胞膜、核膜、又はミトコンドリア膜である、請求項1〜3及び7〜11のいずれか1項記載の組み換えポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、ポリペプチド、siRNA、又はアンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸配列に機能的にリンクされたプロモーターを含む、請求項2記載の組み換えポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドがRNA、DNA、又はその組合せを含む、請求項2記載の組み換えポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドが酵素RNA、又は酵素DNAを含む、請求項2記載の組み換えポリペプチド。
- 前記ポリヌクレオチドが一本鎖、又は多重鎖である、請求項2記載の組み換えポリペプチド。
- ポリヌクレオチドをパッケージングする方法であって:
ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドをパッケージングするのに十分な量の組み換えポリペプチドと組合せることを含み、
該組み換えポリペプチドが、タンパク質導入領域及びミトコンドリア局在化シグナルと機能的にリンクされた配列番号210のアミノ酸56-259を含むTFAMポリペプチドを含み、
該タンパク質導入領域及びミトコンドリア局在化シグナルが、該パッケージングされたポリヌクレオチドの外面に示される、前記方法。 - 前記組み換えポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドと可逆的に会合する、請求項17記載の方法。
- 前記組み換えポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドをコーティングする、請求項17記載の方法。
- 前記組み換えポリペプチドの前記ポリヌクレオチドとの会合が、該ポリヌクレオチドの立体構造変化を誘導する、請求項17記載の方法。
- 前記組合せ工程がインビトロで生じる、請求項17記載の方法。
- 治療に使用するための請求項1〜3及び7〜16のいずれか1項記載の組み換えポリペプチド。
- 前記ミトコンドリア局在化シグナルが、配列番号18〜51及び配列番号53〜188からなる群から選択されるタンパク質のミトコンドリア局在化シグナルであり、かつ配列番号52のアミノ酸によってコードされるタンパク質である、請求項1記載の組み換えポリペプチド。
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