JP4817657B2 - 誘導性の真核生物発現システム - Google Patents
誘導性の真核生物発現システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP4817657B2 JP4817657B2 JP2004508560A JP2004508560A JP4817657B2 JP 4817657 B2 JP4817657 B2 JP 4817657B2 JP 2004508560 A JP2004508560 A JP 2004508560A JP 2004508560 A JP2004508560 A JP 2004508560A JP 4817657 B2 JP4817657 B2 JP 4817657B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- interest
- expression
- ligand
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Description
本出願は、米国特許法119(e)の下で、米国仮出願第60/384,004号(2002年5月29日出願)の優先権を主張し、その出願は、本明細書中で、本出願中にその全体が参考として援用される。
本発明は、真核細胞における誘導性の遺伝子発現のための方法に関する。本発明は、誘導性の遺伝子発現が可能な細胞、このような細胞を含むトランスジェニック動物、ならびに調節融合タンパク質を含むヌクレオチド配列およびタンパク質を、さらに含む。
細胞における目的の組換えヌクレオチド配列の制御された発現のための種々の方法が、当該分野で公知である。例えば、Noら(Noら(1996)Proc.Natl Acad.Sci.USA 93:3346−3351)は、VP16転写活性化ドメインに融合するエクジソン核レセプターからなるキメラ転写活性化因子を利用する、誘導性の遺伝子発現システムを記載する。誘導物質の存在下で、このキメラ転写活性化因子は、プロモーターから上流の認識配列に結合し、目的のヌクレオチド配列の転写を刺激する。誘導物質の非存在下で、目的のヌクレオチド配列の発現は、減少し、目的のプロモーターのヌクレオチド配列からの転写の基礎レベルに依存する。Gossenら(Gossenら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551)は、キメラタンパク質tTA(VP16転写活性化ドメインに融合するTetRリプレッサータンパク質からなる)に基づく目的のヌクレオチド配列の発現を制御するシステムを記載する。エクジソンシステムと同様に、TetR DNA結合部位を特定するDNA配列は、遺伝子プロモーターの上流に挿入され、それにより、TetR−VP16融合タンパク質の結合が、プロモーターからの転写および目的のヌクレオチド配列の発現を刺激する。VP16転写活性化ドメインを利用する、標的化された転写調節のための最小プロモーターに近位の特定のDNA結合部位に標的化された他のシステムもまた、開発されており、これらとしては、以下が挙げられる:GAL4−VP16(Sadowskiら(1988)Nature 335:563−564)、LexA−VP16(Brentら(1985)Cell 40:729−736)、およびLacI−VP16(Labowら(1990)Mol.Cell.Biol.10:3342−3356)。他のTetRベースのシステムは、以下において記載される:Deuschleら(1995)Mol.Cell.Biol.15:1907−1914およびYaoら(1998)Hum.Gene Ther.13:1939−1950。
本発明は、真核細胞における目的の組換え分子の大量産生に適切な、厳密に調節された誘導性遺伝子発現システムに関する。本発明のシステムの構成要素としては、以下が挙げられる:転写ブロッキングドメインおよびリガンド結合ドメインを有する融合タンパク質;この融合タンパク質の転写ブロッキングドメインに結合し、ヌクレオチド配列の転写を阻害するオペレーター;およびオペレーターの制御下にあるプロモーター。目的のヌクレオチド配列の発現が阻害されることが所望される場合、このシステムは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合可能なリガンドを含み、これにより、融合タンパク質が安定化される。目的のヌクレオチド配列が発現されることが所望される場合、リガンドは除去され、融合タンパク質の不安定化および分解を生じる。従って、認識リガンドの非存在において、融合たんぱく質は、オペレーターから除去され、そして目的のヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターのオペレーター阻害が除去され、それにより、目的のヌクレオチド配列の発現が可能になる。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法および特定の実験条件に限定されず、このような方法および条件は変わり得ることが、理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するのみの目的であり、限定することを意図しない。何故なら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲にのみ限定されるからである。
本発明は、真核細胞における遺伝子発現が、オペレーター(このオペレーターは、調節融合タンパク質(RFP)によって調節される)によって制御される強いプロモーターを使用して厳密に調節され得るという概念に、一部基づく。このRFPは、本質的に転写ブロッキングドメイン、およびその活性を調節するリガンド結合ドメインからなる。リガンド結合ドメインの同族リガンドの存在下において、RFPはオペレーターに結合し、それにより、GOIの転写を妨げる。同族リガンドが取り除かれた場合、RFPは、不安定化され、そして目的のヌクレオチド配列の転写が進行する。
本発明の方法は、任意の目的のヌクレオチド配列の転写を制御するために広範に使用され得る。本発明の方法は、所望のタンパク質またはタンパク質フラグメント(例えば、融合またはキメラのタンパク質またはペプチド)を産生するために使用され得る。さらに、目的の産物は、転写産物(例えば、mRNAもしくは触媒活性RNA、または最初の転写産物の作用から生じる下流産物)であり得る。
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、作動可能に連結した(すなわち、適切なシグナルが存在する場合、目的のヌクレオチド配列の転写を可能にする方法で連結した)DNA配列の直接転写に十分なDNA配列を示す。目的のヌクレオチド配列の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントの制御下に置かれ得る。
本明細書中で使用される場合、「オペレーター」は、遺伝子がRFPのオペレーターへの結合によって調節され得、結果としてGOIの転写を妨げるかまたは可能にするような方法によって、遺伝子内またはその近傍に導入される、DNA配列を示す。原核細胞およびバクテリオファージにおける多くのオペレーターは、よく特徴付けられている(Neidhardt編,Escherichia coli and Salmonella;Cellular and Molecular Biology 2d. Vol2 ASM Press,Washington D.C.1996)。これらとしては、E.coliのLexA遺伝子のオペレーター領域(LexAペプチドに結合する)ならびに乳糖オペレーターおよびトリプトファンオペレーター(E.coliのLacIおよびtrpR遺伝子にコードされるリプレッサータンパク質に結合する)が挙げられるが、これらに限定されない。これらとしてはまた、λPR遺伝子およびファージP22ant/mnt遺伝子に由来するバクテリオファージオペレーター(λcIおよびP22arcによってコードされるリプレッサータンパク質に結合する)が挙げられる。代替の実施形態において、RFPの転写ブロッキングドメインが制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、このオペレーターが、プロモーターに隣接するか、または3’側でなければならず、これにより、プロモーターによって転写を制御し得ることを理解する。例えば、米国特許第5,972650号(本明細書中で参考として援用される)は、tetO配列が、TATAボックスから特定の距離の範囲内に存在することを明確に述べている。特定の実施形態において、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に置かれる。他の実施形態において、このオペレーターは、プロモーターから10塩基対以内に置かれる。
本明細書中で使用される場合、転写ブロッキングドメインは、オペレーターとのその相互作用の結果として転写をブロッキング可能な任意のドメインであり得る。このようなドメインは、細菌、バクテリオファージ、または酵母に由来し得、そしてその機能がリガンド結合に依存するリプレッサーまたはその誘導体(例えば、TetR、LexA、LacIおよびArc)が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、転写ブロッキングドメインは、哺乳動物細胞(例えば、Yinら1995 J.Virol.69:6209−6218に記載されるように)または植物細胞(例えば、Wildeら1994 Plant Mol.Biol.24:38に記載されるように)に由来し得る。転写ブロッキングドメインはまた、合成的に作製され得る。例えば、転写ブロッキングドメインは、DNAを切断し得ないように変異された制限酵素であり得る。このような場合、この酵素の認識配列は、オペレーターとして使用される。
融合タンパク質のオペレーターと相互作用する能力が転写ブロッキングドメインで制御される一方、融合タンパク質の活性は、リガンド結合ドメインによって調節される。リガンド結合ドメインは、その同族リガンドに結合した場合、機能的なポリペプチドを与える(例えば、ポリペプチドを安定化する)、任意のポリペプチドに由来し得る。リガンド結合ドメインは、天然に存在するリガンド結合ドメインおよびその機能的誘導体を含むことを意味する。本明細書中で使用する場合、「同族リガンド」は、リガンド結合ドメイン、およびその機能的誘導体に結合する天然に存在するリガンドを含む。このようなリガンド結合ドメインの例としては、ステロイドレセプター、グルココルチコイドレセプター、レチノイドレセプターおよび甲状腺レセプターのリガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない(Eilersら(1989)Nature 340:66−68;Picardら(1988)Cell 54:1073−1080)。実施例1〜3は、融合タンパク質の転写ブロッキングドメインがTetRであり、リガンド結合ドメインがT2変異を有するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン(ERLBDT2;Feilら(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.237:752−757)である本発明の1つの実施形態を説明する。TetO配列が強力なCMV−MIEプロモーターの下流および近位に置かれる場合、CMV−MIE/TetOプロモーターからの目的のヌクレオチド配列(この場合hFcγRI)の転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、タモキシフェンの除去によりブロック解除される。
本発明の方法は、目的のヌクレオチド配列について高産生率を有する細胞を産生する。以下の実験の章において記載される方法に加えて、当該分野で公知の種々の選択プロセスが使用され得る。1つの好ましい実施形態において、選択プロセスは、2002年11月14日に公開されたUSSN 20020168702(本明細書中で詳細に参考として援用される)に記載される、「FASTR」方法論である。FASTR方法論は、融合タンパク質の直接スクリーニングによる、本発明のサイトカイン特異的融合タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための高スループットスクリーニング方法である。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製を企図する。例えば、哺乳動物において、目的のヌクレオチド配列の発現を調節することが望ましい場合がある。本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、哺乳動物のゲノムに統合され得、それにより、そのプロモーターが融合タンパク質に反応し得るように操作される、目的のヌクレオチド配列の発現を調節する。さらに、トランスジェニック動物は、目的のヌクレオチド配列の供給源として有用であり得る。
本発明はまた、本発明の少なくとも1つの融合タンパク質を満たした1つ以上の容器を含むキットを提供する。必要に応じて、このような容器は、
医薬品または生物学的製品の製造、使用、販売を規制する行政機関により定められた形態で認められ得、この形態は、(a)ヒト投与のための製造、使用、販売の機関による承認、(b)使用の説明、またはこの両方を反映する。
実施例1は、pTE313プラスミド、pTE084プラスミド、およびpTE158プラスミドの構築を記載する。pTE313を、調節融合タンパク質TetR−ERLBDT2の高レベル発現のために設計した。これは、TetR−ERLBDT2融合遺伝子がCMV−MIEプロモーターによって駆動される第1の独立した発現カセット、およびSV40プロモーターによって駆動されるブラスチシジン(blasticidin)抵抗性遺伝子である第2の独立したカセットを含む(図1)。pTE084を、hFcγRI(ヒトIgGのFcドメインに対する高親和性細胞表面レセプター)の高レベル発現のために設計した。2つの縦列のTetRオペレーターを、pTE084内のCMV−MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置することによって、pTE158を産生した(図2)。pTE313によるトランスフェクション後にTetR−ERLBDT2 RFPによって調節されたhFcγRI遺伝子を発現するCHO K1細胞を、実施例2において記載されるように産生し、そして同定した。
pTE313を、pTA−ER−LBD−T2(T2変異を有するヒトエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン(ERLBDT2)(Feilら,1997 Biochem Biophys Res Commun 237:752−757)をコードする)由来の975bpのEcoR Iフラグメント(平滑化)をpcDNA6/TR(Invitrogenカタログ番号V−1025−20)のEcoR I部位(平滑化、TetR C末端のすぐ後のリンカー領域中)内に連結することにより、構築した。T2変異であるG400V、M543A、およびL544Aにより、エストラジオールアナログであるドキシサイクリンとの結合に対する特異性を与えられる。ライゲーションによって生じた所望のプラスミドにおいてERLBDT2をコードするフラグメントの、連結から生じる適切な方向を、DNA配列決定によって確かめた。この構築により、エストロゲンレセプターのアミノ酸N304〜V595(Genbank登録番号P03372)と融合したTetR(Genbank登録番号AAF75608)のアミノ酸M1〜S207からなる融合タンパク質をコードする遺伝子が生じた。この遺伝子によってコードされるキメラタンパク質もまた、エストロゲンレセプターにおいて、T2変異であるG400V、M543A、およびL544Aを有する。プラスミドpTE313は、CMV−MIEプロモーターによって駆動されるTetR−ERLBDT2融合遺伝子であるカセットを含み、そしてSV40プロモーターによって駆動されるブラスチシジン抵抗性遺伝子である第2のカセットを含む(図1)。
CHO K1細胞(3×106細胞)を、LipofectamineTM(Life Technologies;Rockville,MD)を製造業者の指示に従って用いて、pTE158でトランスフェクトした。細胞を、500μg/mlのG418(Life Technologies)を含む培地(10%ウシ胎仔血清、90%Ham’s F−12、2mM L−グルタミン;全ての試薬は、Life Technologies,Rockville,MDから)内に、12日間置いた。G418抵抗性の細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてFITC結合ヒトIgG Fcフラグメント(FITC−hFc;Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)で染色した。簡潔には、10cm培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム非含有のダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(Life Technologies)で1回洗浄した。2mlの0.25%トリプシン(Life Technologies)を、各プレートに添加し、そして37℃で4〜5分インキュベートした。このプレートを、細胞がプレートから解離するまで旋回した。4mlの培地を、細胞の離れた各プレートに直ちに加えた。細胞を、次いで、1,000×g、4分間の遠心分離によって回収し、培地で希釈した、4mlの2μg/ml FITC−hFcに再懸濁した。細胞を、次いで、プラットフォーム振盪機(platform shaker)上に置き、そして1時間室温で染色した。未結合のFITC−hFcを除去するため、細胞を、8mlのPBSで2回洗浄した。FITC−hFcと結合することが可能な洗浄した細胞を、MofloTMセルソーター(Cytomation;Fort Collins,CO)においてフローサイトメトリで測定した。FITC−hFcは、非トランスフェクト親CHO K1細胞を染色しなかったが、G418抵抗性pTE158トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた。G418抵抗性集団由来の蛍光細胞の全プールを、フローサイトメトリによって収集し、展開し、次いでhFcγRIの発現についてのフローサイトメトリによって分析した。この集団における、最高15%蛍光を有する細胞を単離し、プールし、そして展開し、hFcγRIを高レベルで発現するG418抵抗性細胞の集団を生じた。この細胞の集団を、CHO K1−FcRと名付け、そしてpTE313のトランスフェクション後、TetR−ERLBDT2 RFPによって調節されるhFcγRI遺伝子を発現するクローンを単離するために、使用した。
CHO K1−FcR細胞(2×106細胞)を、LipofectamineTMを用いてpTE313でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、500μg/mlのG418および10μg/mlのブラスチシジンで14日間、pTE158およびpTE313の両プラスミドについて選択した。フローサイトメトリによる分析の2日前、細胞を、200nMタモキシフェン(OHT)含有培地中でインキュベートし、TetR−ERLBDT2の活性を安定化し、hFcgRIの発現を抑制した。細胞を、FITC−hFcで染色し、そして最低2%の蛍光を有し、hFcγRI発現の抑制を示すこれらの細胞を、回収し、プールA1を得た。次いで、このプールを、図3において概略される2つの戦略のための細胞の供給源として使用した。
ファージP22 Arcリプレッサー遺伝子は、53アミノ酸(ファージP22ゲノムDNA(GenBank登録番号NC002371)のヌクレオチド38,336〜38,494にコードされる、M1〜A53)の転写リプレッサーをコードする。Arcによって媒介される転写抑制は、ダイマーのオペレーターの半分部分への配列付加に関する。以前、15アミノ酸リンカーによって繋げられた2つのArcタンパク質からなる単一鎖ダイマーは、野生型リプレッサーよりもarcオペレーターDNAに対する高親和性を有することが示された(Robinsonら(1996)Biochemistry 35:109−116)。単一鎖ダイマーのオペレーターDNAについてのより高い親和性の利点を得るために、6個のヒスチジン残基からなるHisタグ配列を融合したこの単一鎖Arcダイマーをコードした合成DNAを、設計した。444bpのこの合成XhoI/NotI DNAフラグメントを、pUC119内にクローン化し、そしてpCU119−Arc2−His6(Blueheron Technology Inc.)を得た。次いで、このArc2ダイマー遺伝子を、このプラスミドから切り出し、Arc2遺伝子の発現がUbcプロモーター/β−グロブリンイントロンに依存するように、pRG985のXhoI部位およびNotI部位にクローン化し、pTE528を得た。
CHO K1細胞(2×106)を、上述のように、LipofectamineTMを使用して、pTE534でトランスフェクトした。この細胞を、400μg/mlのG418(Invitrogen Life Technologies)含有の培養培地(10%ウシ胎仔血清、90%Ham’s F−12、2mM L−グルタミン;全ての試薬は、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CAから)内に、12日間置いた。G418耐性の細胞を、上述のように、トリプシン処理し、プールし、そして2μg/mlのFITC結合ヒトIgG Fcフラグメント(FITC−hFc)で染色した。FITC−hFcは、非トランスフェクト親CHO K1細胞を染色しなかった。hFcγRIを発現する細胞は、FITC−hFcと結合し、そしてその蛍光に基づいて、MofloTMセルソーターにおいて、フローサイトメトリによって単離した。この集団において、最高3%の蛍光を有する細胞を、単離し、プールし、そして展開した。このhFcγRI陽性プールを、FITC−hFcでの細胞表面染色を繰り返し、集団中の上位30%の最も蛍光を発する細胞をソーティングすることによって富化し、プールBを得た。hFcγRIを発現する上位20%以内の細胞プールBを単離し、プールCを得た。プールC2(CHOK1/pTE534)を使用し、Arc−ERLBDT2によって調節される誘導性細胞株を産生した。
CHO K1/pTE534細胞(2×106/シャーレ)を、LipofectamineTMを使用して、pRG985(空ベクター)またはpTE529のどちらかでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、OHT非存在下で、400μg/mlのG418および10μg/mlのピューロマイシンで14日間選択した。細胞を、上述のように、FITC−hFcで染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。pRG985でトランスフェクトした細胞は、親細胞に類似し、分析の前にOHTの存在下で増殖させてもさせなくても、同様のhFcγRI染色プロフィールを有した。対照的に、pTE529でトランスフェクトされたCHO K1/pTE534細胞におけるhFcγRI発現は、増殖培地中のOHTの存在に対し、顕著な応答を示した。増殖培地中のOHTの非存在下において、G418およびピューロマイシンに耐性な細胞の大部分が、hFcγRI発現に対し陽性であり、そしてhFcγRI陽性細胞の上位30%を、プールとしてソートした。このプールをOHT存在下で10日間展開し、hFcγRI発現について染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。このプール中の70%以上の細胞が、OHT存在下でhFcγRIを発現せず、そして最低30%を発現するこれらの細胞を、プールとしてソートした。次いで、これらの細胞を、培地中のOHTの非存在下で展開した。OHT非存在下で最高レベルのhFcγRIを発現した細胞(上位1%)を、96ウェルプレート中に1ウェルにつき1細胞でソートした。
Claims (12)
- 真核細胞において、目的のヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって、該方法は、以下:
(a)真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下:(i)調節融合タンパク質(RPR)をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:(1)該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび(2)タモキシフェンに結合するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;(ii)該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーターであって、該オペレーターがTetOまたはArcOである、プロモーター;および(iii)該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程;
(b)該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程(a)の細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程;ならびに
(c)該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導される、工程、
を包含し、ここで、該転写ブロッキングドメインが、TetR、LexA、LacI、TrpR、ArcおよびλClからなる群から選択される、細菌性転写ブロッキングタンパク質に由来し、該リガンドの非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも20倍高い、方法。 - 前記目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結する前記プロモーターが、CMV、SV40、ラウス肉腫ウイルス、メタロチオネイン、ノパリンシンテターゼ、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA、リブロース2リン酸カルボキシラーゼ、Gal4、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ、アルカリホスファターゼ、エラスターゼI;インスリン;免疫グロブリン;マウス乳癌ウイルス;アルブミン;α−胎児タンパク質;α1−アンチトリプシン;β−グロビン;およびミオシン軽鎖−2に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記プロモーターが、CMV−MIEである、請求項2に記載の方法。
- 前記真核細胞が、COS細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞、またはNSO細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記オペレーターが、前記プロモーターのすぐ下流に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記オペレーターが、前記プロモーターの10塩基対以内に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記リガンドの非存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも50倍高い、請求項1に記載の方法。
- 目的のヌクレオチド配列の発現を誘導し得る真核生物であって、該真核生物は、以下:
(i)調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:(1)該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび(2)タモキシフェンに結合するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;
(ii)該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーターであって、該オペレーターがTetOまたはArcOである、プロモーター;および
(iii)該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター
を含み、ここで、該転写ブロッキングドメインが、TetR、LexA、LacI、TrpR、ArcおよびλClからなる群から選択される、細菌性転写ブロッキングタンパク質に由来し、該リガンドの非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも20倍高い、真核細胞。 - 請求項8に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
- 真核細胞において、目的のヌクレオチド配列由来の産物の生成を制御する方法であって、該方法は、以下:
(a)真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下:(i)調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:(1)該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび(2)タモキシフェンに結合するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;(ii)該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーターであって、該オペレーターがTetOまたはArcOである、プロモーター;および(iii)該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程;
(b)該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程(a)の細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程;
(c)該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導され、そして該目的のヌクレオチド配列の産物が生成される、工程
を包含し、ここで、該転写ブロッキングドメインが、TetR、LexA、LacI、TrpR、ArcおよびλClからなる群から選択される、細菌性転写ブロッキングタンパク質に由来し、該リガンドの非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも20倍高い、方法。 - 前記目的のヌクレオチド配列の産物が、RNA、タンパク質またはタンパク質フラグメントである、請求項10に記載の方法。
- 前記リガンドの存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より100倍低い、請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38400402P | 2002-05-29 | 2002-05-29 | |
US60/384,004 | 2002-05-29 | ||
PCT/US2003/016676 WO2003101189A1 (en) | 2002-05-29 | 2003-05-28 | Inducible eukaryotic expression system |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011110860A Division JP2011152152A (ja) | 2002-05-29 | 2011-05-17 | 誘導性の真核生物発現システム |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005527227A JP2005527227A (ja) | 2005-09-15 |
JP2005527227A5 JP2005527227A5 (ja) | 2006-06-01 |
JP4817657B2 true JP4817657B2 (ja) | 2011-11-16 |
Family
ID=29711966
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004508560A Expired - Lifetime JP4817657B2 (ja) | 2002-05-29 | 2003-05-28 | 誘導性の真核生物発現システム |
JP2011110860A Withdrawn JP2011152152A (ja) | 2002-05-29 | 2011-05-17 | 誘導性の真核生物発現システム |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011110860A Withdrawn JP2011152152A (ja) | 2002-05-29 | 2011-05-17 | 誘導性の真核生物発現システム |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7455988B2 (ja) |
EP (1) | EP1531666B1 (ja) |
JP (2) | JP4817657B2 (ja) |
AU (1) | AU2003237259B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0311201B1 (ja) |
CA (1) | CA2485939C (ja) |
DK (1) | DK1531666T3 (ja) |
ES (1) | ES2439874T3 (ja) |
HK (1) | HK1075364A1 (ja) |
MX (1) | MXPA04011679A (ja) |
WO (1) | WO2003101189A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2421118A1 (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-14 | Basf Plant Science Gmbh | Modified tet-inducible system for regulation of gene expression in plants |
US8673589B2 (en) | 2002-05-29 | 2014-03-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Inducible eukaryotic expression system |
EP2418281B1 (en) | 2003-10-24 | 2016-06-01 | Gencia Corporation | Methods and compositions for delivering polynucleotides |
US8062891B2 (en) | 2003-10-24 | 2011-11-22 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants |
US8133733B2 (en) | 2003-10-24 | 2012-03-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues |
US20090123468A1 (en) | 2003-10-24 | 2009-05-14 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
US8507277B2 (en) | 2003-10-24 | 2013-08-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides |
GB0418651D0 (en) * | 2004-08-20 | 2004-09-22 | Medical Res Council | Method |
CA3065947C (en) * | 2005-10-18 | 2023-03-07 | National Jewish Health | Conditionally immortalized long-term stem cells and methods of making and using such cells |
WO2010089387A1 (en) | 2009-02-09 | 2010-08-12 | Morphosys Ag | Production of oligoclonal mixtures of immunoglobulins in single cells |
TWI641687B (zh) | 2012-05-29 | 2018-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 生產細胞株增強子 |
AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
CN104211814A (zh) | 2013-05-29 | 2014-12-17 | 三星电子株式会社 | 用于消耗靶膜蛋白的组合物 |
TW202340452A (zh) | 2015-08-04 | 2023-10-16 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
WO2017134137A1 (en) * | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Polygene Ag | Glucocorticoid-based gene regulation system |
BR112018071283A2 (pt) | 2016-04-20 | 2019-02-12 | Regeneron Pharma | célula, conjunto de vetores para expressar uma proteína de ligação a antígeno biespecífica em uma célula, conjunto de vetores, método, e, método para produção de uma proteína de ligação a antígeno. |
KR20180134894A (ko) | 2016-04-20 | 2018-12-19 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 발현 강화 유전자좌의 사용에 기초하여 항체를 만들기 위한 조성물 및 방법 |
WO2022216825A1 (en) * | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Senti Biosciences, Inc. | Ert2 mutants and uses thereof |
WO2022216823A1 (en) * | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Senti Biosciences, Inc. | Ert2 mutants and uses thereof |
AU2022371200A1 (en) * | 2021-10-18 | 2024-05-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Controlled transcription of polynucleotides |
US20240010737A1 (en) | 2022-03-02 | 2024-01-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Manufacturing process for high titer antibody |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999010510A2 (en) * | 1997-08-26 | 1999-03-04 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Fusion proteins comprising a dimerization, trimerization or tetramerization domain and an additional heterologous transcription activation, transcription repression, dna binding or ligand binding domain |
WO2000012741A2 (fr) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Transgene S.A. | Systeme d'expression inductible |
WO2001030843A1 (en) * | 1999-10-25 | 2001-05-03 | Novartis Ag | Ligand activated transcriptional regulator proteins |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4833080A (en) | 1985-12-12 | 1989-05-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of eucaryotic gene expression |
US4981784A (en) | 1987-12-02 | 1991-01-01 | The Salk Institute For Biological Studies | Retinoic acid receptor method |
US5096815A (en) * | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
US5756448A (en) | 1992-02-26 | 1998-05-26 | The General Hospital Corporation | Constitute activator of retinoid (CAR) receptor polypeptides |
US5814618A (en) * | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
US5650298A (en) * | 1993-06-14 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
US5866755A (en) * | 1993-06-14 | 1999-02-02 | Basf Aktiengellschaft | Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor |
GB2301991B (en) * | 1995-06-06 | 1999-06-30 | Plessey Telecomm | SDH Network |
US5739018A (en) * | 1996-08-07 | 1998-04-14 | The Regents Of The University Of California | Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors |
US6133027A (en) * | 1996-08-07 | 2000-10-17 | City Of Hope | Inducible expression system |
US5972650A (en) * | 1997-06-26 | 1999-10-26 | Brigham And Women's Hospital | Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch |
US6153383A (en) | 1997-12-09 | 2000-11-28 | Verdine; Gregory L. | Synthetic transcriptional modulators and uses thereof |
FR2814642B1 (fr) | 2000-10-03 | 2005-07-01 | Ass Pour Le Dev De La Rech En | Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee |
CA2440367A1 (en) * | 2000-10-20 | 2002-08-15 | Canji, Inc. | Aptamer-mediated regulation of gene expression |
US20040102367A1 (en) | 2001-02-23 | 2004-05-27 | Gage Fred H | Gene expression system based on chimeric receptors |
US7153685B2 (en) | 2002-03-11 | 2006-12-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Tamoxifen and 4-hydroxytamoxifen-activated system for regulated production of proteins in eukaryotic cells |
-
2003
- 2003-05-28 CA CA2485939A patent/CA2485939C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-28 MX MXPA04011679A patent/MXPA04011679A/es active IP Right Grant
- 2003-05-28 US US10/447,243 patent/US7455988B2/en active Active
- 2003-05-28 BR BRPI0311201-2A patent/BRPI0311201B1/pt active IP Right Grant
- 2003-05-28 EP EP03736725.7A patent/EP1531666B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-28 ES ES03736725.7T patent/ES2439874T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-28 DK DK03736725.7T patent/DK1531666T3/da active
- 2003-05-28 WO PCT/US2003/016676 patent/WO2003101189A1/en active Application Filing
- 2003-05-28 AU AU2003237259A patent/AU2003237259B2/en not_active Expired
- 2003-05-28 JP JP2004508560A patent/JP4817657B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-07-19 HK HK05106115.2A patent/HK1075364A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-13 US US11/332,431 patent/US7514545B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-17 JP JP2011110860A patent/JP2011152152A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999010510A2 (en) * | 1997-08-26 | 1999-03-04 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Fusion proteins comprising a dimerization, trimerization or tetramerization domain and an additional heterologous transcription activation, transcription repression, dna binding or ligand binding domain |
WO2000012741A2 (fr) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Transgene S.A. | Systeme d'expression inductible |
WO2001030843A1 (en) * | 1999-10-25 | 2001-05-03 | Novartis Ag | Ligand activated transcriptional regulator proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005527227A (ja) | 2005-09-15 |
US7514545B2 (en) | 2009-04-07 |
DK1531666T3 (da) | 2014-01-13 |
US7455988B2 (en) | 2008-11-25 |
AU2003237259B2 (en) | 2008-01-24 |
US20060107341A1 (en) | 2006-05-18 |
JP2011152152A (ja) | 2011-08-11 |
AU2003237259A1 (en) | 2003-12-19 |
HK1075364A1 (en) | 2005-12-16 |
US20030235886A1 (en) | 2003-12-25 |
BRPI0311201B1 (pt) | 2017-08-08 |
EP1531666B1 (en) | 2013-10-23 |
ES2439874T3 (es) | 2014-01-27 |
BRPI0311201B8 (ja) | 2021-05-25 |
EP1531666A1 (en) | 2005-05-25 |
WO2003101189A1 (en) | 2003-12-11 |
CA2485939C (en) | 2013-10-29 |
BR0311201A (pt) | 2005-02-22 |
EP1531666A4 (en) | 2006-05-24 |
CA2485939A1 (en) | 2003-12-11 |
MXPA04011679A (es) | 2005-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10696973B2 (en) | Inducible eukaryotic expression system | |
US7514545B2 (en) | Inducible eukaryotic expression system | |
EP0832254B1 (en) | An autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes | |
JP3769573B2 (ja) | テトラサイクリンリプレッサーによる哺乳動物細胞における転写およびウイルス複製の調節 | |
JP3073009B2 (ja) | 組換えdna法及びそこに使用するベクター | |
CA2386180C (en) | Vectors and methods for recombinant protein expression | |
JP2002512015A (ja) | 迅速分解性gfp融合タンパク質および使用方法 | |
WO2002048379A1 (en) | Expression vector for animal cell containing nuclear matrix attachment region fo interferon beta | |
US9062326B2 (en) | Expression vector for animal cells | |
JP2023528291A (ja) | テトラサイクリンとCumateに基づく共制御配列 | |
US7189506B1 (en) | DNA binding compound-mediated molecular switch system | |
Zeng et al. | A single plasmid vector (pSTAR) mediating efficient tetracycline-induced gene expression | |
EP2085475A1 (en) | Method for production of cell strain capable of tetracycline-induced gene expression or cell strain having conditional gene knockout, and use of the cell strains | |
CA2450780A1 (en) | Novel recombinant gene expression method by stop codon suppression | |
AU2002331365A1 (en) | Novel recombinant gene expression method by stop codon suppression | |
JP2008543283A (ja) | インスレーターエレメントを含むベクターを使用する抗体発現の改良 | |
CN109790214B (zh) | 用于选择产生多肽的细胞的改进方法 | |
WO2000052179A2 (en) | Dna binding compound-mediated molecular switch system |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060404 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060404 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110517 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110613 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110829 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110830 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140909 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4817657 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |