JP2002512015A - 迅速分解性ｇｆｐ融合タンパク質および使用方法 - Google Patents
迅速分解性ｇｆｐ融合タンパク質および使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は遺伝子発現およびタンパク質局在化を測定する際のレポーターとして広く用いられている。本発明は、約１０時間以下の半減期、幾つかの態様においては４時間以下の半減期を有する融合タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、ＰＥＳＴ配列を含むマウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）の分解性ドメインのＣ末端アミノ酸を、ＧＦＰの増強変異体（ＥＧＦＰ）のＣ末端に融合させることにより構築できる。トランスフェクションした細胞における融合タンパク質の蛍光強度はＥＧＦＰのものに類似するが、この融合タンパク質はＥＧＦＰと異なり、シクロヘキシミドの存在下で不安定である。ＭＯＤＣ領域の種々の変異により、異なる半減期をもつ、多様な目的に有用な変異体が得られた。
Description
【０００１】 発明の背景
【０００２】関連出願の引照 本出願は、米国特許出願第０９／０６２，１０２号（１９９８年４月１７日出
願）の一部継続出願である。
願）の一部継続出願である。
【０００３】発明の分野 本発明は、生化学的アッセイ法および試薬の分野に関する。より詳細には、本
発明は修飾された蛍光タンパク質およびそれらの使用方法に関する。
発明は修飾された蛍光タンパク質およびそれらの使用方法に関する。
【０００４】先行技術の説明 クラゲ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）エクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ
ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のグリーン蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）は検出しやすいグリーン蛍光であるため
、遺伝子発現およびタンパク質局在化を調べるために広く用いられている。ＧＦ
Ｐ蛍光は基質または補因子を必要としない；したがってこのレポーターは多数の
種および多様な細胞に使用できる。ＧＦＰはきわめて安定なタンパク質であり、
蓄積する可能性があるので、哺乳動物細胞にとってしばしば有毒となる。
ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のグリーン蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）は検出しやすいグリーン蛍光であるため
、遺伝子発現およびタンパク質局在化を調べるために広く用いられている。ＧＦ
Ｐ蛍光は基質または補因子を必要としない；したがってこのレポーターは多数の
種および多様な細胞に使用できる。ＧＦＰはきわめて安定なタンパク質であり、
蓄積する可能性があるので、哺乳動物細胞にとってしばしば有毒となる。
【０００５】 最近、野生型ＧＦＰおよび変異ＧＦＰ Ｓ６５Ｔの結晶学的構造から、ＧＦＰ
の三次元構造はバレル（ｂａｒｒｅｌ）に似ていることが明らかになった（Ｏｒ
ｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１３９２−１３９５
；Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｏｓｓ，Ｌ．Ｇ．ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｎ．Ｊ
ｒ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４：１２４６−１２５１）
。このバレルは、密な（コンパクトな）逆並行構造のベータシートからなる。バ
レルの中心には、発色団を含むアルファらせんがバレルによりシールドされてい
る。この密な構造は、プロテアーゼ処理などの多様な、および／または苛酷な条
件下でＧＦＰをきわめて安定なものにし、ＧＦＰを全般的にきわめて有用なレポ
ーターにしている。他方、その安定性は、短期事象または反復事象の測定を困難
にしている。
の三次元構造はバレル（ｂａｒｒｅｌ）に似ていることが明らかになった（Ｏｒ
ｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１３９２−１３９５
；Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｏｓｓ，Ｌ．Ｇ．ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｎ．Ｊ
ｒ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４：１２４６−１２５１）
。このバレルは、密な（コンパクトな）逆並行構造のベータシートからなる。バ
レルの中心には、発色団を含むアルファらせんがバレルによりシールドされてい
る。この密な構造は、プロテアーゼ処理などの多様な、および／または苛酷な条
件下でＧＦＰをきわめて安定なものにし、ＧＦＰを全般的にきわめて有用なレポ
ーターにしている。他方、その安定性は、短期事象または反復事象の測定を困難
にしている。
【０００６】 ＧＦＰの性質を改良し、多様な研究目的に有用なＧＦＰ試薬を製造するために
、多数の研究が行われている。変異によって新たな型のＧＦＰが開発された。そ
れには”ヒト化”ＧＦＰ ＤＮＡが含まれ、そのタンパク質産物は哺乳動物細胞
における合成を増加した（Ｃｏｒｍａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ
，１７３，３３−３８；Ｈａａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，３１５−３２４；およびＹａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４５９２−４５９
３参照）。そのようなヒト化タンパク質の１つは”増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）グ
リーン蛍光タンパク質”（ＥＧＦＰ）である。他のＧＦＰ変異により、ブルー、
シアンおよびイエローの蛍光を発するバージョンが得られた。
、多数の研究が行われている。変異によって新たな型のＧＦＰが開発された。そ
れには”ヒト化”ＧＦＰ ＤＮＡが含まれ、そのタンパク質産物は哺乳動物細胞
における合成を増加した（Ｃｏｒｍａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ
，１７３，３３−３８；Ｈａａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，３１５−３２４；およびＹａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４５９２−４５９
３参照）。そのようなヒト化タンパク質の１つは”増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）グ
リーン蛍光タンパク質”（ＥＧＦＰ）である。他のＧＦＰ変異により、ブルー、
シアンおよびイエローの蛍光を発するバージョンが得られた。
【０００７】 オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、ポリアミンの生合成に重要な酵
素である。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼは、哺乳動物細胞における最も
短命なタンパク質の１つであり、約３０分の半減期をもつ（Ｇｈｏｄａ，ｅｔ
ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１４９３−１４９５；およびＧｈ
ｏｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，２１
７８−２１８５）。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼが速やかに分解するの
はそのＣ末端の特異な組成によるものであると判定された。その一部は、ＰＥＳ
Ｔ配列、すなわち短命なタンパク質の特徴であると提唱された配列をもつ。ＰＥ
ＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオ
ニン（Ｔ）に富む領域を含み、これがしばしば塩基性アミノ酸であるリシン、ア
ルギニンまたはヒスチジンでフランキング（隣接）されている（Ｒｏｇｅｒｓ，
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：３６４−６８；Ｒｅｉｃｈ
ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．（１９９０）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，１：４３３−４０）。
素である。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼは、哺乳動物細胞における最も
短命なタンパク質の１つであり、約３０分の半減期をもつ（Ｇｈｏｄａ，ｅｔ
ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１４９３−１４９５；およびＧｈ
ｏｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，２１
７８−２１８５）。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼが速やかに分解するの
はそのＣ末端の特異な組成によるものであると判定された。その一部は、ＰＥＳ
Ｔ配列、すなわち短命なタンパク質の特徴であると提唱された配列をもつ。ＰＥ
ＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオ
ニン（Ｔ）に富む領域を含み、これがしばしば塩基性アミノ酸であるリシン、ア
ルギニンまたはヒスチジンでフランキング（隣接）されている（Ｒｏｇｅｒｓ，
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：３６４−６８；Ｒｅｉｃｈ
ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．（１９９０）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，１：４３３−４０）。
【０００８】 トリパノゾーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）のオル
ニチンデカルボキシラーゼ（ＴｂＯＤＣ）はＰＥＳＴ配列をもたず、哺乳動物細
胞において発現した場合、長命であり、かなり安定である（Ｇｈｏｄａ，ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８２３−１１８２
６）；しかし、ＴｂＯＤＣにネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端を付
加すると、ＴｂＯＤＣは不安定になる。さらに、ネズミオルニチンデカルボキシ
ラーゼからＣ末端のＰＥＳＴ含有領域を欠失させると、その速やかな分解が阻止
される（Ｇｈｏｄａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３
，１４９３−１４９５）。
ニチンデカルボキシラーゼ（ＴｂＯＤＣ）はＰＥＳＴ配列をもたず、哺乳動物細
胞において発現した場合、長命であり、かなり安定である（Ｇｈｏｄａ，ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８２３−１１８２
６）；しかし、ＴｂＯＤＣにネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端を付
加すると、ＴｂＯＤＣは不安定になる。さらに、ネズミオルニチンデカルボキシ
ラーゼからＣ末端のＰＥＳＴ含有領域を欠失させると、その速やかな分解が阻止
される（Ｇｈｏｄａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３
，１４９３−１４９５）。
【０００９】 先行技術には、不安定化した、または短命なＧＦＰが不足する。本発明は、先
行技術におけるこの要望を満たすものである。
行技術におけるこの要望を満たすものである。
【００１０】 発明の概要 迅速代謝回転性 (turnover) または不安定化ＧＦＰは、先行技術のＧＦＰを使
用できなかった研究用途に使用できる。そのような用途には、不安定化ＧＦＰを
転写調節および／またはシス作用性調節要素の分析のための遺伝子レポーターと
して、あるいはタンパク質分解を研究するための道具として使用することが含ま
れる。さらに、迅速代謝回転ＧＦＰにより、ＧＦＰ遺伝子を発現する安定な細胞
系の開発が容易になる。ＧＦＰタンパク質が速やかに分解されるので、有毒なＧ
ＦＰレベルが避けられるからである。
用できなかった研究用途に使用できる。そのような用途には、不安定化ＧＦＰを
転写調節および／またはシス作用性調節要素の分析のための遺伝子レポーターと
して、あるいはタンパク質分解を研究するための道具として使用することが含ま
れる。さらに、迅速代謝回転ＧＦＰにより、ＧＦＰ遺伝子を発現する安定な細胞
系の開発が容易になる。ＧＦＰタンパク質が速やかに分解されるので、有毒なＧ
ＦＰレベルが避けられるからである。
【００１１】 本発明は、野生型ＧＦＰのものより著しく短縮した半減期をもつ融合タンパク
質を提供する。１態様においては、ペプチドに融合したＥＧＦＰを含み、不安定
化したタンパク質を生成した、融合タンパク質が提供される。他の態様において
は、約１０時間以下の半減期、好ましくは約４時間以下の半減期、より好ましく
は約２時間以下の半減期、さらに好ましくは約１時間以下の半減期を有する融合
タンパク質が提供される。この観点の本発明の好ましい態様は、ＥＧＦＰ、およ
び／またはネズミオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳ
Ｔ配列含有部分を含有する。本発明の具体的な好ましい態様は、ＥＧＦＰ−ＭＯ
ＤＣ376-461、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４
２６Ａ／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４
４４Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４Ａおよび
Ｄ４４８Ａを包含する。
質を提供する。１態様においては、ペプチドに融合したＥＧＦＰを含み、不安定
化したタンパク質を生成した、融合タンパク質が提供される。他の態様において
は、約１０時間以下の半減期、好ましくは約４時間以下の半減期、より好ましく
は約２時間以下の半減期、さらに好ましくは約１時間以下の半減期を有する融合
タンパク質が提供される。この観点の本発明の好ましい態様は、ＥＧＦＰ、およ
び／またはネズミオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳ
Ｔ配列含有部分を含有する。本発明の具体的な好ましい態様は、ＥＧＦＰ−ＭＯ
ＤＣ376-461、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４
２６Ａ／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４
４４Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４Ａおよび
Ｄ４４８Ａを包含する。
【００１２】 本発明のさらに他の観点においては、野生型ＧＦＰのものより著しく短縮した
半減期をもつ蛍光性融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子が提供される。
この観点の本発明の１態様においては、約１０時間以下の半減期、好ましくは約
４時間以下の半減期、より好ましくは約２時間以下の半減期、さらに好ましくは
約１時間以下の半減期を有する蛍光性融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分
子が提供される。この観点の本発明の好ましい態様においては、蛍光性融合タン
パク質をコードする単離ＤＮＡ分子は、発現性の高いヒトタンパク質中に多くみ
られるコドンを含有する合成ＧＦＰ遺伝子である。さらに本発明は、半減期の短
縮したＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクター
を提供する。ベクターの１態様において、ベクターは誘導性プロモーターを含有
する。
半減期をもつ蛍光性融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子が提供される。
この観点の本発明の１態様においては、約１０時間以下の半減期、好ましくは約
４時間以下の半減期、より好ましくは約２時間以下の半減期、さらに好ましくは
約１時間以下の半減期を有する蛍光性融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分
子が提供される。この観点の本発明の好ましい態様においては、蛍光性融合タン
パク質をコードする単離ＤＮＡ分子は、発現性の高いヒトタンパク質中に多くみ
られるコドンを含有する合成ＧＦＰ遺伝子である。さらに本発明は、半減期の短
縮したＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクター
を提供する。ベクターの１態様において、ベクターは誘導性プロモーターを含有
する。
【００１３】 本発明の他の態様においては、細胞を一過性ＧＦＰレポーターで標識する方法
が提供される。この方法においては、誘導性プロモーターおよび半減期の短縮し
たＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡを含む、ＤＮＡベクターを使用
する。このベクターを細胞にトランスフェクションし、プロモーターが本発明の
ＧＦＰ融合タンパク質の一過性発現を誘導する条件下で細胞を培養し、これによ
り一過性蛍光レベルが得られる。
が提供される。この方法においては、誘導性プロモーターおよび半減期の短縮し
たＧＦＰ融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡを含む、ＤＮＡベクターを使用
する。このベクターを細胞にトランスフェクションし、プロモーターが本発明の
ＧＦＰ融合タンパク質の一過性発現を誘導する条件下で細胞を培養し、これによ
り一過性蛍光レベルが得られる。
【００１４】 発明の詳細な記述 本発明は、不安定化され、細胞において速やかに代謝回転する、遺伝子工学的
に処理された蛍光タンパク質を記載する。より詳細には、この融合タンパクは約
１０時間を超えない半減期、最も好ましくは約２時間を超えない半減期を有する
蛍光タンパク質を含む。好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよ
びＥＹＦＰよりなる群から選択される。１態様において、工学的に処理されたＧ
ＦＰは、ＥＧＦＰとその含有により不安定化タンパク質を生成するペプチドとの
融合タンパク質である。そのようなペプチドの例は、ネズミオルニチンデカルボ
キシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端領域である。詳細な具体例においては、ネズミ
オルニチンデカルボキシラーゼのアミノ酸４２２〜４６１の分解性ドメインを、
増強型ＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰ）のＣ末端に付加した。トランスフェクションし
た細胞におけるＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461融合タンパク質の蛍光強度はＥＧＦ
Ｐのものと同様であったが、この融合タンパク質はＥＧＦＰと異なり、シクロヘ
キシミド処理した細胞において経時的に消失した。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461
融合タンパク質の蛍光の半減期は約２時間であったのに対し、ＥＧＦＰの半減期
は２４時間を超えた。オルニチンデカルボキシラーゼ分解性ドメインは、ＥＧＦ
Ｐの安定性を著しく低下させる。
に処理された蛍光タンパク質を記載する。より詳細には、この融合タンパクは約
１０時間を超えない半減期、最も好ましくは約２時間を超えない半減期を有する
蛍光タンパク質を含む。好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよ
びＥＹＦＰよりなる群から選択される。１態様において、工学的に処理されたＧ
ＦＰは、ＥＧＦＰとその含有により不安定化タンパク質を生成するペプチドとの
融合タンパク質である。そのようなペプチドの例は、ネズミオルニチンデカルボ
キシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端領域である。詳細な具体例においては、ネズミ
オルニチンデカルボキシラーゼのアミノ酸４２２〜４６１の分解性ドメインを、
増強型ＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰ）のＣ末端に付加した。トランスフェクションし
た細胞におけるＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461融合タンパク質の蛍光強度はＥＧＦ
Ｐのものと同様であったが、この融合タンパク質はＥＧＦＰと異なり、シクロヘ
キシミド処理した細胞において経時的に消失した。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461
融合タンパク質の蛍光の半減期は約２時間であったのに対し、ＥＧＦＰの半減期
は２４時間を超えた。オルニチンデカルボキシラーゼ分解性ドメインは、ＥＧＦ
Ｐの安定性を著しく低下させる。
【００１５】 迅速代謝回転型ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰに勝る利点を少なくとも４つ備えている
。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合体の速やかな代謝回転により、この融合タンパク質を
発現する細胞に対する毒性が少なくなる。したがって１つの利点は、ＥＧＦＰ−
ネズミオルニチンデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを用いて安定な細胞系
を樹立できることである。さらに、不安定化したＥＧＦＰ−ＭＯＤＣは、ＥＧＦ
Ｐの蓄積を減少させる。蛍光タンパク質が蓄積すると、分析の感度を妨害する可
能性がある。したがって、不安定化した迅速代謝回転性融合タンパク質は、より
高感度の結果を与える。さらに、不安定化ＥＧＦＰは、転写調節および／または
シス作用性調節要素の作用を調べるための一過性レポーターとして使用できる。
最後に、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質を用いて、多重遺伝子発現を伴うプ
ロセスを調べることができる。
。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合体の速やかな代謝回転により、この融合タンパク質を
発現する細胞に対する毒性が少なくなる。したがって１つの利点は、ＥＧＦＰ−
ネズミオルニチンデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを用いて安定な細胞系
を樹立できることである。さらに、不安定化したＥＧＦＰ−ＭＯＤＣは、ＥＧＦ
Ｐの蓄積を減少させる。蛍光タンパク質が蓄積すると、分析の感度を妨害する可
能性がある。したがって、不安定化した迅速代謝回転性融合タンパク質は、より
高感度の結果を与える。さらに、不安定化ＥＧＦＰは、転写調節および／または
シス作用性調節要素の作用を調べるための一過性レポーターとして使用できる。
最後に、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質を用いて、多重遺伝子発現を伴うプ
ロセスを調べることができる。
【００１６】 さらに、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質は、ＥＧＦＰの使用に固有の利点
をもつ。たとえば薬物スクリーニングアッセイにおけるＥＧＦＰの使用は特に有
利である。ＧＦＰの蛍光は、経費のかかる付加工程、たとえば細胞溶解、外因性
基質または補因子の添加、細胞調製物の固定などを行うことなく、細胞内検出す
ることができるからである。そのようなアッセイの一例は、ＴＮＦ活性化経路、
すなわち最終的にアポトーシスに影響を及ぼす経路の妨害について被験化合物を
スクリーニングするものである。このアッセイで同定された化合物は、癌および
炎症に関与する細胞プロセスの制御に有用であろう。
をもつ。たとえば薬物スクリーニングアッセイにおけるＥＧＦＰの使用は特に有
利である。ＧＦＰの蛍光は、経費のかかる付加工程、たとえば細胞溶解、外因性
基質または補因子の添加、細胞調製物の固定などを行うことなく、細胞内検出す
ることができるからである。そのようなアッセイの一例は、ＴＮＦ活性化経路、
すなわち最終的にアポトーシスに影響を及ぼす経路の妨害について被験化合物を
スクリーニングするものである。このアッセイで同定された化合物は、癌および
炎症に関与する細胞プロセスの制御に有用であろう。
【００１７】 さらに、本発明のレポーター遺伝子を種々のエンハンサー要素と結合させて、
熱応答、重金属に対する応答、グルココルチコイド活性化、またはｃＡＭＰに対
する応答など、多様な生物学的プロセスを監視することができる。特に、不安定
化ＥＧＦＰは、遺伝子が一過性発現する発生プロセス、動的なタンパク質輸送、
細胞内におけるタンパク質の局在化、ならびにサーカディアンリズムなどの特異
な生物学的現象を制御する遺伝子の周期的および循環性発現を研究するのに有用
である。スクリーニングアッセイにおけるＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質の
他の用途は、実際に当業者に自明であろう。
熱応答、重金属に対する応答、グルココルチコイド活性化、またはｃＡＭＰに対
する応答など、多様な生物学的プロセスを監視することができる。特に、不安定
化ＥＧＦＰは、遺伝子が一過性発現する発生プロセス、動的なタンパク質輸送、
細胞内におけるタンパク質の局在化、ならびにサーカディアンリズムなどの特異
な生物学的現象を制御する遺伝子の周期的および循環性発現を研究するのに有用
である。スクリーニングアッセイにおけるＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質の
他の用途は、実際に当業者に自明であろう。
【００１８】 さらに、誘導性プロモーターの使用により、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク
質の発現を任意に活性化または失活させ、細胞系譜研究に有用なタンパク質を発
現する構築体を作成することができる。先行技術のＧＦＰモデルは、有毒な、細
胞発生を妨害するレベルでＧＦＰを発現し、したがって細胞系譜研究を不可能に
した。さらに、不安定化ＥＧＦＰの蛍光強度はいかなる時点においても遺伝子発
現レベルの直接的尺度であるので、不安定化ＥＧＦＰを調節されたプロモーター
からのｍＲＮＡ転写の反応速度を研究するためのレポーターとして使用できる。
質の発現を任意に活性化または失活させ、細胞系譜研究に有用なタンパク質を発
現する構築体を作成することができる。先行技術のＧＦＰモデルは、有毒な、細
胞発生を妨害するレベルでＧＦＰを発現し、したがって細胞系譜研究を不可能に
した。さらに、不安定化ＥＧＦＰの蛍光強度はいかなる時点においても遺伝子発
現レベルの直接的尺度であるので、不安定化ＥＧＦＰを調節されたプロモーター
からのｍＲＮＡ転写の反応速度を研究するためのレポーターとして使用できる。
【００１９】 本明細書中で用いる”ＧＦＰ”という用語は、エクオリア・ビクトリア由来の
基本的なグリーン蛍光タンパク質を表し、これにはより強い蛍光または異なる色
の蛍光を得るために工学的に処理した先行技術型のＧＦＰも含まれる。エクオリ
ア・ビクトリアＧＦＰの配列は、Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１
９９２）Ｇｅｎｅ，１１１：２２９−３３に記載されている。
基本的なグリーン蛍光タンパク質を表し、これにはより強い蛍光または異なる色
の蛍光を得るために工学的に処理した先行技術型のＧＦＰも含まれる。エクオリ
ア・ビクトリアＧＦＰの配列は、Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１
９９２）Ｇｅｎｅ，１１１：２２９−３３に記載されている。
【００２０】 本明細書中で用いる”ＥＧＦＰ”という用語は、Ｋａｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１
９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９（４）：６５０−５５に報告される
ように”ヒト化された”ＧＦＰを表す。”ヒト化された”とは、コドンをヒト細
胞におけるタンパク質発現に最適化するためにＧＦＰ核酸配列に対しなされた変
更を表す。
９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９（４）：６５０−５５に報告される
ように”ヒト化された”ＧＦＰを表す。”ヒト化された”とは、コドンをヒト細
胞におけるタンパク質発現に最適化するためにＧＦＰ核酸配列に対しなされた変
更を表す。
【００２１】 本明細書中で用いる”不安定化したタンパク質を生成するペプチド”という用
語は、その一部であるタンパク質の不安定化または速やかな代謝回転を促進する
（すなわちタンパク質分解を誘導することにより）アミノ酸またはペプチドの配
列を表す。本明細書に記載するＰＥＳＴ配列はそのような配列の１つである。当
技術分野で既知の他の配列は、リン酸化およびタンパク質−タンパク質相互作用
を促進するペプチドである。
語は、その一部であるタンパク質の不安定化または速やかな代謝回転を促進する
（すなわちタンパク質分解を誘導することにより）アミノ酸またはペプチドの配
列を表す。本明細書に記載するＰＥＳＴ配列はそのような配列の１つである。当
技術分野で既知の他の配列は、リン酸化およびタンパク質−タンパク質相互作用
を促進するペプチドである。
【００２２】 本明細書中で用いる”ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ”という用語は、そのＣ末端でネズ
ミオルニチンデカルボキシラーゼ配列に融合したＥＧＦＰを表す。
ミオルニチンデカルボキシラーゼ配列に融合したＥＧＦＰを表す。
【００２３】 本明細書中で用いる”Ｐ４３８Ａ”という用語は、ネズミオルニチンデカルボ
キシラーゼ配列の位置４３８のプロリン（この配列のＰＥＳＴ部分にあるプロリ
ン）がアラニンで交換されたＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質を表す。同じ命
名法をＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ変異体Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａ；Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３
０Ａ／Ｅ４３１Ａ；Ｅ４４４Ａ；Ｓ４４０Ａ；Ｓ４４５Ａ；Ｔ４３６Ａ；Ｄ４３
３Ａ／Ｄ４３４Ａ；およびＤ４４８Ａについても用いる。詳細な説明を図６に示
す。
キシラーゼ配列の位置４３８のプロリン（この配列のＰＥＳＴ部分にあるプロリ
ン）がアラニンで交換されたＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質を表す。同じ命
名法をＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ変異体Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａ；Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３
０Ａ／Ｅ４３１Ａ；Ｅ４４４Ａ；Ｓ４４０Ａ；Ｓ４４５Ａ；Ｔ４３６Ａ；Ｄ４３
３Ａ／Ｄ４３４Ａ；およびＤ４４８Ａについても用いる。詳細な説明を図６に示
す。
【００２４】 本明細書中で用いる”半減期”という用語は、細胞において発現した蛍光タン
パク質から蛍光シグナルの半量が消失し、半量が残存する時間を表す。本明細書
中で用いる”Ｔｃ”という用語は、テトラサイクリンを表す。本明細書中で用い
る”ＣＨＸ”という用語は、シクロヘキシミドを表す。
パク質から蛍光シグナルの半量が消失し、半量が残存する時間を表す。本明細書
中で用いる”Ｔｃ”という用語は、テトラサイクリンを表す。本明細書中で用い
る”ＣＨＸ”という用語は、シクロヘキシミドを表す。
【００２５】 本発明によれば、一般的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を
当該技術の熟練の範囲内で用いることができる。そのような技術は文献中に十分
に説明されている。たとえばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）；”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，
１９８５）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．
Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８
５））；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（
Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；”Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６
））；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”（Ｉ
ＲＬプレス（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕ
ｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）参照。
当該技術の熟練の範囲内で用いることができる。そのような技術は文献中に十分
に説明されている。たとえばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）；”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，
１９８５）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．
Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８
５））；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（
Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；”Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６
））；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”（Ｉ
ＲＬプレス（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕ
ｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）参照。
【００２６】 ”ベクター”は、それに他のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメ
ントをこれにより複製するレプリコン、たとえばプラスミド、ファージまたはコ
スミドである。
ントをこれにより複製するレプリコン、たとえばプラスミド、ファージまたはコ
スミドである。
【００２７】 ”ＤＮＡ分子”は、一本鎖形または二本鎖らせん状の高分子形デオキシリボヌ
クレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）を表す。この用語は
、一次および二次構造の分子のみを表し、いずれか特定の三次形に限定するもの
ではない。したがってこの用語には、特に直線状ＤＮＡ分子（たとえば制限フラ
グメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中にみられる、二本鎖ＤＮＡが
含まれる。
クレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）を表す。この用語は
、一次および二次構造の分子のみを表し、いずれか特定の三次形に限定するもの
ではない。したがってこの用語には、特に直線状ＤＮＡ分子（たとえば制限フラ
グメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中にみられる、二本鎖ＤＮＡが
含まれる。
【００２８】 ＤＮＡ”コード配列（コーディング配列）”は、インビボで適切な調節配列の
制御下におかれたとき転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。
コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）
末端の翻訳終止コドンにより定められる。コード配列には、原核細胞配列、真核
細胞ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核細胞（たとえば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノ
ムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。ポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止配列がコード配列の３’側に位置してもよ
い。転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化
シグナル、ターミネーターなど、宿主細胞においてコード配列を発現させ、およ
び／または発現を調節するＤＮＡ調節配列である。
制御下におかれたとき転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。
コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）
末端の翻訳終止コドンにより定められる。コード配列には、原核細胞配列、真核
細胞ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核細胞（たとえば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノ
ムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。ポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止配列がコード配列の３’側に位置してもよ
い。転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化
シグナル、ターミネーターなど、宿主細胞においてコード配列を発現させ、およ
び／または発現を調節するＤＮＡ調節配列である。
【００２９】 ”プロモーター配列”は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼが結合して下流（
３’方向）のコード配列の転写を開始しうるＤＮＡ調節領域である。本発明を定
義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位によって境界
をつけられ、上流（５’方向）に伸び、バックグラウンドより高い検出可能なレ
ベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むものである。プ
ロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関与
するタンパク質結合ドメインがある。必ずしも常にではないが、真核細胞プロモ
ーターは”ＴＡＴＡ”ボックスおよび”ＣＡＴ”ボックスを含むことが多い。本
発明の種々のベクターを駆動するために、誘導性プロモーターを含めた種々のプ
ロモーターを使用できる。
３’方向）のコード配列の転写を開始しうるＤＮＡ調節領域である。本発明を定
義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位によって境界
をつけられ、上流（５’方向）に伸び、バックグラウンドより高い検出可能なレ
ベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むものである。プ
ロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関与
するタンパク質結合ドメインがある。必ずしも常にではないが、真核細胞プロモ
ーターは”ＴＡＴＡ”ボックスおよび”ＣＡＴ”ボックスを含むことが多い。本
発明の種々のベクターを駆動するために、誘導性プロモーターを含めた種々のプ
ロモーターを使用できる。
【００３０】 本明細書中で用いる”制限エンドヌクレアーゼ”および”制限酵素”という用
語は、細菌酵素であって、それぞれ二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列また
はその付近で切断するものを表す。外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入され
た場合、細胞はそのようなＤＮＡで”形質転換”または”トランスフェクション
”されたのである。形質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれて（共有結合
して）いてもよく、組み込まれていなくてもよい。たとえば原核細胞、酵母およ
び哺乳動物細胞において、形質転換用ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素
上に保持されることができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は
、形質転換用ＤＮＡが染色体に組み込まれたものであり、したがってそれは染色
体複製により娘細胞に遺伝する。この安定性は、真核細胞が形質転換用ＤＮＡを
含有する娘細胞集団からなる細胞系またはクローンを樹立する能力により証明さ
れる。”クローン”は、単一細胞または共通の祖先から有糸分裂により誘導され
た細胞集団である。”細胞系”は、インビトロで多世代にわたって安定に増殖で
きる一次細胞のクローンである。
語は、細菌酵素であって、それぞれ二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列また
はその付近で切断するものを表す。外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入され
た場合、細胞はそのようなＤＮＡで”形質転換”または”トランスフェクション
”されたのである。形質転換用ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれて（共有結合
して）いてもよく、組み込まれていなくてもよい。たとえば原核細胞、酵母およ
び哺乳動物細胞において、形質転換用ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素
上に保持されることができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は
、形質転換用ＤＮＡが染色体に組み込まれたものであり、したがってそれは染色
体複製により娘細胞に遺伝する。この安定性は、真核細胞が形質転換用ＤＮＡを
含有する娘細胞集団からなる細胞系またはクローンを樹立する能力により証明さ
れる。”クローン”は、単一細胞または共通の祖先から有糸分裂により誘導され
た細胞集団である。”細胞系”は、インビトロで多世代にわたって安定に増殖で
きる一次細胞のクローンである。
【００３１】 ＤＮＡ構築体の”異種”領域は、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡ
セグメントであって、天然ではこの大きな分子に付随してみられないものである
。たとえば異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常は供
給源生物のゲノム内でその哺乳動物ゲノムＤＮＡをフランキングしているもので
はないＤＮＡによりフランキングされるであろう。他の例において異種ＤＮＡは
、２つの異なる供給源（ソース）からの遺伝子部分が一緒になって融合タンパク
質産物を生成する構築体中の、コード配列を含む。対立遺伝子変化または自然変
異事象（イベント）では、本明細書に定義する異種ＤＮＡ領域は生成しない。
セグメントであって、天然ではこの大きな分子に付随してみられないものである
。たとえば異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常は供
給源生物のゲノム内でその哺乳動物ゲノムＤＮＡをフランキングしているもので
はないＤＮＡによりフランキングされるであろう。他の例において異種ＤＮＡは
、２つの異なる供給源（ソース）からの遺伝子部分が一緒になって融合タンパク
質産物を生成する構築体中の、コード配列を含む。対立遺伝子変化または自然変
異事象（イベント）では、本明細書に定義する異種ＤＮＡ領域は生成しない。
【００３２】 本明細書中で用いる”レポーター遺伝子”という用語は、異種プロモーターま
たはエンハンサー要素に結合したコード配列であって、その構築体を組織または
細胞に導入した場合にその産物を容易にアッセイおよび定量できる配列を表す。
転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグ
ナル、ターミネーターなど、宿主細胞においてコード配列を発現させるＤＮＡ調
節配列である。
たはエンハンサー要素に結合したコード配列であって、その構築体を組織または
細胞に導入した場合にその産物を容易にアッセイおよび定量できる配列を表す。
転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグ
ナル、ターミネーターなど、宿主細胞においてコード配列を発現させるＤＮＡ調
節配列である。
【００３３】 本明細書に記載するアミノ酸は、”Ｌ”異性体形であることが好ましい。しか
し目的とする免疫グロブリン結合の機能特性をそのポリペプチドが保持する限り
、Ｌ−アミノ酸残基の代わりに”Ｄ”異性体形を使用できる。ＮＨ2は、ポリペ
プチドのアミノ末端にある遊離アミノ基を表す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカ
ルボキシ末端にある遊離カルボキシ基を表す。
し目的とする免疫グロブリン結合の機能特性をそのポリペプチドが保持する限り
、Ｌ−アミノ酸残基の代わりに”Ｄ”異性体形を使用できる。ＮＨ2は、ポリペ
プチドのアミノ末端にある遊離アミノ基を表す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカ
ルボキシ末端にある遊離カルボキシ基を表す。
【００３４】 したがって本発明は、得られる融合タンパク質が約１０時間を超えず、１時間
未満程度の短い半減期を有するような、ＧＦＰを含む融合タンパク質に関する。
好ましい形態において、ＧＦＰはＥＧＦＰである。好ましくは、融合タンパク質
はネズミオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳＴ配列含
有部分に融合したＥＧＦＰを含む。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末
端のＰＥＳＴ配列含有部分の代表例には、ＭＯＤＣ376-461、ＭＯＤＣ376-456、
ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３
０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４４４Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３
３Ａ／Ｄ４３４ＡおよびＤ４４８Ａが含まれる。本発明のＧＦＰ融合タンパク質
の一例は、配列番号：１に示す配列をもつ。
未満程度の短い半減期を有するような、ＧＦＰを含む融合タンパク質に関する。
好ましい形態において、ＧＦＰはＥＧＦＰである。好ましくは、融合タンパク質
はネズミオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳＴ配列含
有部分に融合したＥＧＦＰを含む。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末
端のＰＥＳＴ配列含有部分の代表例には、ＭＯＤＣ376-461、ＭＯＤＣ376-456、
ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３
０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４４４Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３
３Ａ／Ｄ４３４ＡおよびＤ４４８Ａが含まれる。本発明のＧＦＰ融合タンパク質
の一例は、配列番号：１に示す配列をもつ。
【００３５】 本発明はまた、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰよりなる群から選択される
蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子に関する。本
発明の単離ＤＮＡの一例は、配列番号：２に示す配列をもつ。本発明はまた、こ
の単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクターに関する。１形態においてベクターは誘
導性プロモーターを含み、テトラサイクリン調節発現ベクターである。
蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子に関する。本
発明の単離ＤＮＡの一例は、配列番号：２に示す配列をもつ。本発明はまた、こ
の単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクターに関する。１形態においてベクターは誘
導性プロモーターを含み、テトラサイクリン調節発現ベクターである。
【００３６】 本発明はまた、蛍光タンパク質、たとえばＧＦＰを発現する安定な細胞系の製
造方法であって、細胞を本明細書に開示するベクターでトランスフェクションす
る工程を含む方法に関する。さらに本発明は、一過性蛍光レポータータンパク質
によりプロモーターまたは他の転写もしくは翻訳要素の活性化または失活をアッ
セイする方法であって、約１０時間を超えない、好ましくは４時間未満、最も好
ましくは１時間未満の半減期を有する融合タンパク質を含む発現ベクターで細胞
をトランスフェクションし、その際、融合タンパク質はそれらのプロモーター、
転写または翻訳要素の影響下にあり；そしてそれらの細胞における蛍光の存在、
不存在または量を検出する工程を含む方法に関する。この方法においては、細胞
に存在する蛍光の量が発現する蛍光タンパク質の尺度である。目的とする種々の
転写または翻訳要素下で蛍光タンパク質を発現する細胞間の蛍光強度の差を検出
するのは、これらの転写または翻訳要素の効果を測定するための迅速かつ直接的
方法である。さらに、トランスフェクションした細胞を目的化合物で処理して、
目的化合物がそれらの転写または翻訳要素に及ぼす影響を測定する、追加工程を
実施することができる。目的化合物により細胞を処理した際の蛍光の変化を検出
するのは、発現する融合タンパク質の転写または翻訳に目的化合物が及ぼす効果
を測定するための迅速かつ直接的方法である。
造方法であって、細胞を本明細書に開示するベクターでトランスフェクションす
る工程を含む方法に関する。さらに本発明は、一過性蛍光レポータータンパク質
によりプロモーターまたは他の転写もしくは翻訳要素の活性化または失活をアッ
セイする方法であって、約１０時間を超えない、好ましくは４時間未満、最も好
ましくは１時間未満の半減期を有する融合タンパク質を含む発現ベクターで細胞
をトランスフェクションし、その際、融合タンパク質はそれらのプロモーター、
転写または翻訳要素の影響下にあり；そしてそれらの細胞における蛍光の存在、
不存在または量を検出する工程を含む方法に関する。この方法においては、細胞
に存在する蛍光の量が発現する蛍光タンパク質の尺度である。目的とする種々の
転写または翻訳要素下で蛍光タンパク質を発現する細胞間の蛍光強度の差を検出
するのは、これらの転写または翻訳要素の効果を測定するための迅速かつ直接的
方法である。さらに、トランスフェクションした細胞を目的化合物で処理して、
目的化合物がそれらの転写または翻訳要素に及ぼす影響を測定する、追加工程を
実施することができる。目的化合物により細胞を処理した際の蛍光の変化を検出
するのは、発現する融合タンパク質の転写または翻訳に目的化合物が及ぼす効果
を測定するための迅速かつ直接的方法である。
【００３７】 さらに本発明は、細胞系譜を調べる方法であって、本発明の不安定化した蛍光
性融合タンパク質を発現することができるベクターで未分化細胞をトランスフェ
クションし、これらの未分化細胞を、未分化細胞が分化細胞になる条件下で増殖
させ、そして分化細胞における蛍光の不存在または存在を検出する工程を含む方
法に関する。さらに本発明は、本明細書に記載する融合タンパク質を細胞局在化
試験に使用する方法であって、約１０時間を超えない、好ましくは４時間未満の
半減期を有する蛍光性融合タンパク質を含む発現ベクターで細胞をトランスフェ
クションし、その際、融合タンパク質は推定による細胞局在化要素に結合してお
り；これらの細胞を増殖させ；そして細胞における蛍光の位置を検出する工程を
含む方法を提供する。
性融合タンパク質を発現することができるベクターで未分化細胞をトランスフェ
クションし、これらの未分化細胞を、未分化細胞が分化細胞になる条件下で増殖
させ、そして分化細胞における蛍光の不存在または存在を検出する工程を含む方
法に関する。さらに本発明は、本明細書に記載する融合タンパク質を細胞局在化
試験に使用する方法であって、約１０時間を超えない、好ましくは４時間未満の
半減期を有する蛍光性融合タンパク質を含む発現ベクターで細胞をトランスフェ
クションし、その際、融合タンパク質は推定による細胞局在化要素に結合してお
り；これらの細胞を増殖させ；そして細胞における蛍光の位置を検出する工程を
含む方法を提供する。
【００３８】 実施例１ ＤＮＡ発現ベクターの構築 ＥＧＦＰおよびネズミＯＤＣ（ＭＯＤＣ）のＣ末端をコードするｃＤＮＡを、
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ
）で増幅させた。ＥＧＦＰを一対のプライマーで増幅させた：ＳａｃＩＩ認識配
列を含む５’側、およびＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む３’側。ネズミＯＤＣのＣ末
端を含むオープンリーディングフレームを形成するために、ＥＧＦＰの終止コド
ンをそのＣ末端から欠失させた。ネズミＯＤＣのＣ末端も一対のプライマーで増
幅させた：ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含む５’側、およびＥｃｏＲＩ配列を含む
３’側。２つの増幅したＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ部位でライゲートさせ、
この融合体をｐＴＲＥ発現ベクター、Ｔｃ調節発現系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ． ａ
ｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，８９：５５４７−５５５１）中へクローニングした。
ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ
）で増幅させた。ＥＧＦＰを一対のプライマーで増幅させた：ＳａｃＩＩ認識配
列を含む５’側、およびＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む３’側。ネズミＯＤＣのＣ末
端を含むオープンリーディングフレームを形成するために、ＥＧＦＰの終止コド
ンをそのＣ末端から欠失させた。ネズミＯＤＣのＣ末端も一対のプライマーで増
幅させた：ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含む５’側、およびＥｃｏＲＩ配列を含む
３’側。２つの増幅したＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ部位でライゲートさせ、
この融合体をｐＴＲＥ発現ベクター、Ｔｃ調節発現系（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ． ａ
ｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，８９：５５４７−５５５１）中へクローニングした。
【００３９】 これらの方法を用いて、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質を構築した。この
ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質は、ネズミオルニチンデカルボキシ
ラーゼの完全Ｃ末端を含有していた。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456およびＥＧＦ
Ｐ−ＭＯＤＣ422-461は、ネズミオルニチンデカルボキシラーゼ分解性ドメイン
の一部のみを含有していたが、ただし両方ともＰＥＳＴ配列を含有していた。さ
らに、融合タンパク質中のＰＥＳＴ配列の鍵アミノ酸を、次いで相同延長法によ
りアラニンに変異させた（Ｒｏｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３４：３６４−３６８）。ＰＥＳＴ変異体には、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７
Ａ；Ｐ４３８Ａ；Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ；Ｅ４４４Ａ；Ｓ４４０
Ａ；Ｓ４４５Ａ；Ｔ４３６Ａ；Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４Ａ；およびＤ４４８Ａが含
まれていた。
ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質は、ネズミオルニチンデカルボキシ
ラーゼの完全Ｃ末端を含有していた。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456およびＥＧＦ
Ｐ−ＭＯＤＣ422-461は、ネズミオルニチンデカルボキシラーゼ分解性ドメイン
の一部のみを含有していたが、ただし両方ともＰＥＳＴ配列を含有していた。さ
らに、融合タンパク質中のＰＥＳＴ配列の鍵アミノ酸を、次いで相同延長法によ
りアラニンに変異させた（Ｒｏｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３４：３６４−３６８）。ＰＥＳＴ変異体には、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７
Ａ；Ｐ４３８Ａ；Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ；Ｅ４４４Ａ；Ｓ４４０
Ａ；Ｓ４４５Ａ；Ｔ４３６Ａ；Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４Ａ；およびＤ４４８Ａが含
まれていた。
【００４０】 実施例２ 細胞トランスフェクション 構築体ＤＮＡを精製し、タンパク質分解の測定のためにＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ
細胞中へトランスフェクションした。ＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ細胞は、ＣＨＯ細胞
をｔｅｔ−リプレッサーと単純ヘルペスウイルスＶＰ１６遺伝子の融合タンパク
質（ｔＴＡ）で予備トランスフェクション(pre-transfected)したものである。
この予備トランスフェクションにより、ｐＴＲＥベクター（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎ
ｄ Ｂｕｊａｒｄ、前掲）上の融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させる
ことができ、次いでこれがｔｅｔ−リプレッサー結合要素を含む修飾ＣＭＶプロ
モーターに結合することにより転写を開始させる。この結合はテトラサイクリン
により遮断することができ、したがってテトラサイクリンにより発現を制御でき
る。ＤＮＡをクローンフェクチン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）（クローンテック・
ラボラトリーズ社、パロ・アルト）によりこれらの細胞に導入した。２４時間後
、トランスフェクションした細胞を機能分析した。
細胞中へトランスフェクションした。ＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ細胞は、ＣＨＯ細胞
をｔｅｔ−リプレッサーと単純ヘルペスウイルスＶＰ１６遺伝子の融合タンパク
質（ｔＴＡ）で予備トランスフェクション(pre-transfected)したものである。
この予備トランスフェクションにより、ｐＴＲＥベクター（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎ
ｄ Ｂｕｊａｒｄ、前掲）上の融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させる
ことができ、次いでこれがｔｅｔ−リプレッサー結合要素を含む修飾ＣＭＶプロ
モーターに結合することにより転写を開始させる。この結合はテトラサイクリン
により遮断することができ、したがってテトラサイクリンにより発現を制御でき
る。ＤＮＡをクローンフェクチン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）（クローンテック・
ラボラトリーズ社、パロ・アルト）によりこれらの細胞に導入した。２４時間後
、トランスフェクションした細胞を機能分析した。
【００４１】 実施例３ 蛍光分析 蛍光顕微鏡下での観察ができるように、細胞をカバーガラス上で培養した。ト
ランスフェクション後、細胞をカバーガラス上で３７℃において２４時間インキ
ュベートし、次いで４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。ツァイス、
アキシオスコープ（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ）モデル５０蛍光顕微鏡で蛍
光検査するために、カバーガラスをスライドガラスに乗せた。タンパク質の代謝
回転を測定するために、パラホルムアルデヒド固定の前に、細胞を最終濃度１０
０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで種々の時間処理した。
ランスフェクション後、細胞をカバーガラス上で３７℃において２４時間インキ
ュベートし、次いで４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。ツァイス、
アキシオスコープ（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ）モデル５０蛍光顕微鏡で蛍
光検査するために、カバーガラスをスライドガラスに乗せた。タンパク質の代謝
回転を測定するために、パラホルムアルデヒド固定の前に、細胞を最終濃度１０
０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで種々の時間処理した。
【００４２】 ＦＡＣＳ分析のために、トランスフェクションした細胞およびシクロヘキシミ
ド処理した細胞をＥＤＴＡ処理により採集し、細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢ
Ｓに再懸濁した。次いで細胞懸濁液をＦＡＣＳカリバー（Ｃａｌｉｂｕｒ）（ベ
クトン・ディックソン社、カリフォルニア州サンホゼ）により蛍光強度分析した
。ＥＧＦＰを４８８ｎｍで励起し、５１０／２０帯域通過フィルターを用いて発
光を検出した。
ド処理した細胞をＥＤＴＡ処理により採集し、細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢ
Ｓに再懸濁した。次いで細胞懸濁液をＦＡＣＳカリバー（Ｃａｌｉｂｕｒ）（ベ
クトン・ディックソン社、カリフォルニア州サンホゼ）により蛍光強度分析した
。ＥＧＦＰを４８８ｎｍで励起し、５１０／２０帯域通過フィルターを用いて発
光を検出した。
【００４３】 実施例４ ウェスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析のために、トランスフェクションした対照細胞および
シクロヘキシミド処理した細胞をＰＢＳ中に採集し、超音波処理して細胞溶解物
を調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質を膜に
移しとった後、ＥＧＦＰとＭＯＤＣの融合タンパク質をＧＦＰに対するモノクロ
ーナル抗体により検出した。検出を化学発光検出キット（クローンテック）によ
り視覚化した。
シクロヘキシミド処理した細胞をＰＢＳ中に採集し、超音波処理して細胞溶解物
を調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質を膜に
移しとった後、ＥＧＦＰとＭＯＤＣの融合タンパク質をＧＦＰに対するモノクロ
ーナル抗体により検出した。検出を化学発光検出キット（クローンテック）によ
り視覚化した。
【００４４】 実施例５ ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣタンパク質の安定性の測定 ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端のアミノ酸３７６〜４６１は哺
乳動物細胞においてＴｂＯＤＣの分解を誘導することが示されている。この分解
ドメインがＥＧＦＰの分解をも誘導できることを証明するために、ネズミＯＤＣ
配列をＥＧＦＰのＣ末端に付加して、第１融合ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ構築体を作成
した（図１）。このＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合構築体をＴｃ調節発現ベク
ター（ｐＴＲＥ）により発現させた。ＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ細胞において一過性
発現させた後、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質の蛍光強度を蛍光顕
微鏡下で検査した。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質の蛍光強度はき
わめて低かった（図１）。このタンパク質の蛍光が比較的低いのは速やかな分解
によると思われたが、そのような低いシグナル強度をもつＥＧＦＰ融合タンパク
質は大部分の研究用途に役立たないであろう。
乳動物細胞においてＴｂＯＤＣの分解を誘導することが示されている。この分解
ドメインがＥＧＦＰの分解をも誘導できることを証明するために、ネズミＯＤＣ
配列をＥＧＦＰのＣ末端に付加して、第１融合ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ構築体を作成
した（図１）。このＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合構築体をＴｃ調節発現ベク
ター（ｐＴＲＥ）により発現させた。ＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ細胞において一過性
発現させた後、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質の蛍光強度を蛍光顕
微鏡下で検査した。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461融合タンパク質の蛍光強度はき
わめて低かった（図１）。このタンパク質の蛍光が比較的低いのは速やかな分解
によると思われたが、そのような低いシグナル強度をもつＥＧＦＰ融合タンパク
質は大部分の研究用途に役立たないであろう。
【００４５】 速やかな分解が実際にＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461の蛍光の低さに関与するの
であれば、その分解速度を低下させることにより融合タンパク質の蛍光強度を高
めることができるであろう。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端延長
配列のサイズが分解速度を決定することができる。分解ドメインの両端からの欠
失によって分解速度がより低いトランケートしたタンパク質が得られ、ネズミオ
ルニチンデカルボキシラーゼから最後の５アミノ酸を除去するとネズミオルニチ
ンデカルボキシラーゼの分解が著しく低下する（Ｇｈｏｄａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，２１７８−２１８５）。
ＴｂＯＤＣ融合体を、アミノ酸４２２から始まるより小さな延長配列と融合させ
ると、アミノ酸３７６から始まるより長い延長配列より分解が遅かった（Ｌｉ，
Ｘ． ａｎｄ Ｃｏｆｆｉｎｏ，Ｐ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．，１３，２３７７−２３８３）。したがって、より小さな２つの延長配列、す
なわち一方はアミノ酸３７６〜４５６、他方は４２２〜４６１をＥＧＦＰのＣ末
端に付加して、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456およびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461を
作成した（図１）。これらの融合タンパク質は両方ともＰＥＳＴ配列を含有する
。トランスフェクション後、両融合タンパク質の蛍光強度を蛍光顕微鏡検査によ
り測定した。結果は、両方とも（特に融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-46 1 ）がＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461より高い相対蛍光強度をもつことを示した。図
１から分かるように、この後者の融合タンパク質の蛍光はＥＧＦＰのものに類似
する。
であれば、その分解速度を低下させることにより融合タンパク質の蛍光強度を高
めることができるであろう。ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端延長
配列のサイズが分解速度を決定することができる。分解ドメインの両端からの欠
失によって分解速度がより低いトランケートしたタンパク質が得られ、ネズミオ
ルニチンデカルボキシラーゼから最後の５アミノ酸を除去するとネズミオルニチ
ンデカルボキシラーゼの分解が著しく低下する（Ｇｈｏｄａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，２１７８−２１８５）。
ＴｂＯＤＣ融合体を、アミノ酸４２２から始まるより小さな延長配列と融合させ
ると、アミノ酸３７６から始まるより長い延長配列より分解が遅かった（Ｌｉ，
Ｘ． ａｎｄ Ｃｏｆｆｉｎｏ，Ｐ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．，１３，２３７７−２３８３）。したがって、より小さな２つの延長配列、す
なわち一方はアミノ酸３７６〜４５６、他方は４２２〜４６１をＥＧＦＰのＣ末
端に付加して、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-456およびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461を
作成した（図１）。これらの融合タンパク質は両方ともＰＥＳＴ配列を含有する
。トランスフェクション後、両融合タンパク質の蛍光強度を蛍光顕微鏡検査によ
り測定した。結果は、両方とも（特に融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-46 1 ）がＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ376-461より高い相対蛍光強度をもつことを示した。図
１から分かるように、この後者の融合タンパク質の蛍光はＥＧＦＰのものに類似
する。
【００４６】 実施例６ ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461タンパク質の安定性の詳細な解明 次いで、アミノ酸４２２〜４６１のＣ末端延長配列がインビボでＥＧＦＰ分解
を誘導しうるか否かを調べた。このために、構築体をまずＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ
細胞中へ一過性トランスフェクションし、シクロヘキシミド（ＣＴＸ）でタンパ
ク質合成を遮断することにより、融合タンパク質の半減期を測定した。トランス
フェクションの２４時間後、細胞を１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで０、
１、２、３および４時間処理した。トランスフェクションした細胞の蛍光強度の
変化を蛍光顕微鏡検査により調べ、結果を図２に示す。細胞における融合タンパ
ク質の蛍光強度は、シクロヘキシミド処理が長くなるのに伴って徐々に低下した
。これはＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461融合タンパク質が不安定であることを示す
。シクロヘキシミドで４時間処理した後、時間ゼロの細胞の蛍光強度と比較して
存在する蛍光強度は半分未満であった。これらの結果は、この融合タンパク質の
蛍光強度が４時間未満であることを示す。
を誘導しうるか否かを調べた。このために、構築体をまずＣＨＯ Ｋ１−ｏｆｆ
細胞中へ一過性トランスフェクションし、シクロヘキシミド（ＣＴＸ）でタンパ
ク質合成を遮断することにより、融合タンパク質の半減期を測定した。トランス
フェクションの２４時間後、細胞を１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで０、
１、２、３および４時間処理した。トランスフェクションした細胞の蛍光強度の
変化を蛍光顕微鏡検査により調べ、結果を図２に示す。細胞における融合タンパ
ク質の蛍光強度は、シクロヘキシミド処理が長くなるのに伴って徐々に低下した
。これはＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461融合タンパク質が不安定であることを示す
。シクロヘキシミドで４時間処理した後、時間ゼロの細胞の蛍光強度と比較して
存在する蛍光強度は半分未満であった。これらの結果は、この融合タンパク質の
蛍光強度が４時間未満であることを示す。
【００４７】 次いでＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461を同じアッセイにおいてＥＧＦＰと比較し
た。ＥＧＦＰトランスフェクションした細胞のＥＧＦＰ蛍光強度には、タンパク
質合成停止の４時間後に有意な変化がなかった（図２）。これは、ＥＧＦＰの半
減期が４時間より長いことを示す。これは、哺乳動物細胞において発現した場合
、ＥＧＦＰは安定なタンパク質であり、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461構築体のタ
ンパク質産物は不安定であるという結論を支持する、ＧＦＰに関する他の報告と
一致する。
た。ＥＧＦＰトランスフェクションした細胞のＥＧＦＰ蛍光強度には、タンパク
質合成停止の４時間後に有意な変化がなかった（図２）。これは、ＥＧＦＰの半
減期が４時間より長いことを示す。これは、哺乳動物細胞において発現した場合
、ＥＧＦＰは安定なタンパク質であり、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461構築体のタ
ンパク質産物は不安定であるという結論を支持する、ＧＦＰに関する他の報告と
一致する。
【００４８】 ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質およびＥＧＦＰの半減期をより精確に測定
するために、これら２タンパク質の蛍光の変化をフローサイトメトリーにより定
量した。トランスフェクションした細胞をシクロヘキシミドで０、１、２および
３時間処理した後、ＥＤＴＡで採集し、１０，０００個の細胞をＦＡＣＳ分析に
用いた。結果は蛍光顕微鏡観察と一致した；すなわち融合タンパク質の蛍光はシ
クロヘキシミド処理が長くなるのに伴って次第に減少した（図３）。
するために、これら２タンパク質の蛍光の変化をフローサイトメトリーにより定
量した。トランスフェクションした細胞をシクロヘキシミドで０、１、２および
３時間処理した後、ＥＤＴＡで採集し、１０，０００個の細胞をＦＡＣＳ分析に
用いた。結果は蛍光顕微鏡観察と一致した；すなわち融合タンパク質の蛍光はシ
クロヘキシミド処理が長くなるのに伴って次第に減少した（図３）。
【００４９】 図４のグラフはＦＡＣＳデータをまとめたものであり、未処理細胞の約５０％
がシクロヘキシミド処理の２時間後に蛍光を維持したことを示す。これは、この
融合タンパク質の半減期が約２時間であることを示す。ＥＧＦＰトランスフェク
ションした細胞を同様に分析し、結果はＥＧＦＰの蛍光がシクロヘキシミド処理
に際して有意には変化しなかったことを示した。実際に、４時間のシクロヘキシ
ミド処理後、ＥＧＦＰ細胞はなお未処理ＥＧＦＰ細胞と比較して８０％より多い
蛍光を維持していた。すなわち、ＥＧＦＰ融合体の半減期は適切に短縮され、Ｅ
ＧＦＰの半減期は４時間より有意に長い。
がシクロヘキシミド処理の２時間後に蛍光を維持したことを示す。これは、この
融合タンパク質の半減期が約２時間であることを示す。ＥＧＦＰトランスフェク
ションした細胞を同様に分析し、結果はＥＧＦＰの蛍光がシクロヘキシミド処理
に際して有意には変化しなかったことを示した。実際に、４時間のシクロヘキシ
ミド処理後、ＥＧＦＰ細胞はなお未処理ＥＧＦＰ細胞と比較して８０％より多い
蛍光を維持していた。すなわち、ＥＧＦＰ融合体の半減期は適切に短縮され、Ｅ
ＧＦＰの半減期は４時間より有意に長い。
【００５０】 シクロヘキシミド処理は細胞にとって有毒であり、アポトーシスを起こすので
、４時間より延長できない。しかしこれらの試験に用いる誘導性発現系はテトラ
サイクリンにより調節されるので（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ． ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ
，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．．Ｓｃｉ．，８９：５５４
７−５５５１）、ＥＧＦＰ合成はテトラサイクリンを添加するだけで停止できる
。ＥＧＦＰの半減期をより精確に測定するために、ＥＧＦＰトランスフェクショ
ンした細胞の蛍光強度を、２４時間後にテトラサイクリンの存在下および不存在
下の両方で監視した。まずトランスフェクション後２４時間、ＥＧＦＰを発現さ
せた。次いで、トランスフェクションした細胞をテトラサイクリンの存在下また
は不存在下でさらに２４時間培養し、フローサイトメトリーによる分析用に採集
した。これら２タイプの細胞（−ＴＣおよび＋ＴＣ、図３の下側パネル）間に蛍
光強度の差は検出されなかった。これは、ＥＧＦＰタンパク質合成遮断後２４時
間に蛍光が変化しなかったことを示す。これらの結果は、ＥＧＦＰの半減期が２
４時間より長いことを示す。
、４時間より延長できない。しかしこれらの試験に用いる誘導性発現系はテトラ
サイクリンにより調節されるので（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ． ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ
，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．．Ｓｃｉ．，８９：５５４
７−５５５１）、ＥＧＦＰ合成はテトラサイクリンを添加するだけで停止できる
。ＥＧＦＰの半減期をより精確に測定するために、ＥＧＦＰトランスフェクショ
ンした細胞の蛍光強度を、２４時間後にテトラサイクリンの存在下および不存在
下の両方で監視した。まずトランスフェクション後２４時間、ＥＧＦＰを発現さ
せた。次いで、トランスフェクションした細胞をテトラサイクリンの存在下また
は不存在下でさらに２４時間培養し、フローサイトメトリーによる分析用に採集
した。これら２タイプの細胞（−ＴＣおよび＋ＴＣ、図３の下側パネル）間に蛍
光強度の差は検出されなかった。これは、ＥＧＦＰタンパク質合成遮断後２４時
間に蛍光が変化しなかったことを示す。これらの結果は、ＥＧＦＰの半減期が２
４時間より長いことを示す。
【００５１】 ＥＧＦＰおよび本発明のＥＧＦＰ融合タンパク質の半減期が蛍光量と相関する
か否かを調べるために、ウェスタンブロット分析により融合タンパク質の分解を
監視した。図３のフローサイトメトリーに用いた、ＥＧＦＰトランスフェクショ
ン細胞およびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461トランスフェクション細胞の両方を、
ＧＦＰに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロット分析にも用いた。
図５に示すように、シクロヘキシミドで０〜３時間処理した細胞間のＥＧＦＰタ
ンパク質レベルに、検出できる変化はみられなかった。これは、ＥＧＦＰが３時
間のシクロヘキシミド処理中、安定であることを示す。
か否かを調べるために、ウェスタンブロット分析により融合タンパク質の分解を
監視した。図３のフローサイトメトリーに用いた、ＥＧＦＰトランスフェクショ
ン細胞およびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461トランスフェクション細胞の両方を、
ＧＦＰに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロット分析にも用いた。
図５に示すように、シクロヘキシミドで０〜３時間処理した細胞間のＥＧＦＰタ
ンパク質レベルに、検出できる変化はみられなかった。これは、ＥＧＦＰが３時
間のシクロヘキシミド処理中、安定であることを示す。
【００５２】 ＭＯＤＣ修飾した本発明のＥＧＦＰ融合タンパク質を、同様にＧＦＰモノクロ
ーナル抗体により検出した。融合タンパク質のサイズは約３１ｋＤａであった。
しかし、ＥＧＦＰと異なり、ＥＧＦＰ融合タンパク質は不安定であった。融合タ
ンパク質のレベルは、３時間のシクロヘキシミド処理終了時までに著しく低下し
た；事実、１時間で残存するＥＧＦＰ融合タンパク質は対照の半分未満であり、
この融合タンパク質の半減期が１時間未満でありうることを示す。フローサイト
メトリーとウェスタンブロット分析を用いて測定した半減期の差は、ウェスタン
分析では未熟（すなわち非蛍光性）ＧＦＰと成熟ＧＦＰの両方が検出されるとい
う事実による。しかしＥＧＦＰ発色団の形成は転写後であり、約２５分の半活性
期（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）で進行する（Ｃｏｒｍａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｇｅｎｅ，１７３，３３−３８）。本発明に関してＧＦＰ含量は、タンパク
質レベルではなくレポーターとして、その蛍光レベルにおいて重要である−−Ｅ
ＧＦＰ蛍光の半減期の方が重要である。インビボでのＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-46 1 の蛍光半減期は約２時間である。
ーナル抗体により検出した。融合タンパク質のサイズは約３１ｋＤａであった。
しかし、ＥＧＦＰと異なり、ＥＧＦＰ融合タンパク質は不安定であった。融合タ
ンパク質のレベルは、３時間のシクロヘキシミド処理終了時までに著しく低下し
た；事実、１時間で残存するＥＧＦＰ融合タンパク質は対照の半分未満であり、
この融合タンパク質の半減期が１時間未満でありうることを示す。フローサイト
メトリーとウェスタンブロット分析を用いて測定した半減期の差は、ウェスタン
分析では未熟（すなわち非蛍光性）ＧＦＰと成熟ＧＦＰの両方が検出されるとい
う事実による。しかしＥＧＦＰ発色団の形成は転写後であり、約２５分の半活性
期（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）で進行する（Ｃｏｒｍａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｇｅｎｅ，１７３，３３−３８）。本発明に関してＧＦＰ含量は、タンパク
質レベルではなくレポーターとして、その蛍光レベルにおいて重要である−−Ｅ
ＧＦＰ蛍光の半減期の方が重要である。インビボでのＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-46 1 の蛍光半減期は約２時間である。
【００５３】 ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461タンパク質のアミノ酸配列は下記のとおりである
：
：
【化１】
【００５４】 ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461タンパク質をコードするＤＮＡ配列は下記のとお
りである：
りである：
【化２】
【００５５】 実施例７ ＰＥＳＴ配列の分析 マウスオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端は、アミノ酸４２３〜４４９の
ＰＥＳＴ配列を含む。３個のプロリン残基、４個のグルタミン酸残基、２個のセ
リン残基、および１個のトレオニン残基がある（図６）。タンパク質分解速度に
対するＰＥＳＴモチーフ中の各アミノ酸の関与を評価するために、ＥＧＦＰ−Ｍ
ＯＤＣ融合タンパク質のＰＥＳＴ領域の各Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒ
残基をＡｌａに変異させた。蛍光の変化により分解を監視した。各構築体をＣＨ
Ｏ Ｋ１−ｏｆｆ細胞中へ一過性トランスフェクションさせた。シクロヘキシミ
ドの存在下で０、２および４時間処理した後、細胞をサイトメトリー分析により
採集した。データを図７に示す。
ＰＥＳＴ配列を含む。３個のプロリン残基、４個のグルタミン酸残基、２個のセ
リン残基、および１個のトレオニン残基がある（図６）。タンパク質分解速度に
対するＰＥＳＴモチーフ中の各アミノ酸の関与を評価するために、ＥＧＦＰ−Ｍ
ＯＤＣ融合タンパク質のＰＥＳＴ領域の各Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒ
残基をＡｌａに変異させた。蛍光の変化により分解を監視した。各構築体をＣＨ
Ｏ Ｋ１−ｏｆｆ細胞中へ一過性トランスフェクションさせた。シクロヘキシミ
ドの存在下で０、２および４時間処理した後、細胞をサイトメトリー分析により
採集した。データを図７に示す。
【００５６】 アミノ酸４３８のプロリン残基の変異はタンパク質を安定化した。４時間のシ
クロヘキシミド処理後、蛍光性細胞の割合はなお６０％より高かった。したがっ
てＰ４３８Ａ変異体の半減期はＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461の半減期の２倍より
多い。これは、４３８にプロリンが存在すると融合タンパク質の不安定化に寄与
することを示す。アミノ酸位置４２６および４２７のプロリンの変異は半減期を
延長しなかった。実際に、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａの半減期はＥＧＦＰ−ＭＯＤ
Ｃ422-461のものよりさらに短い。これは、これらのプロリン残基がタンパク質
を安定化する可能性があることを示す。同様な結果が、融合構築体中のグルタミ
ンおよびセリンに対する変異によっても得られた。変異体Ｅ４４４ＡおよびＳ４
４０Ａの半減期は、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461のものより長い；しかしＥ４２
８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１ＡおよびＳ４４５Ａはより不安定になり、２時間の
処理後に蛍光を維持していた細胞はわずか２０％または２９％であった。
クロヘキシミド処理後、蛍光性細胞の割合はなお６０％より高かった。したがっ
てＰ４３８Ａ変異体の半減期はＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461の半減期の２倍より
多い。これは、４３８にプロリンが存在すると融合タンパク質の不安定化に寄与
することを示す。アミノ酸位置４２６および４２７のプロリンの変異は半減期を
延長しなかった。実際に、Ｐ４２６Ａ／Ｐ４２７Ａの半減期はＥＧＦＰ−ＭＯＤ
Ｃ422-461のものよりさらに短い。これは、これらのプロリン残基がタンパク質
を安定化する可能性があることを示す。同様な結果が、融合構築体中のグルタミ
ンおよびセリンに対する変異によっても得られた。変異体Ｅ４４４ＡおよびＳ４
４０Ａの半減期は、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461のものより長い；しかしＥ４２
８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１ＡおよびＳ４４５Ａはより不安定になり、２時間の
処理後に蛍光を維持していた細胞はわずか２０％または２９％であった。
【００５７】 ＰＥＳＴ配列はしばしば塩基性アミノ酸でフランキングされている（Ｒｏｇｅ
ｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：３６４−３６８）。
これらのフランキングアミノ酸残基がタンパク質の不安定性に関与していること
を示すために、ヒスチジン４２３、アルギニン４４９およびヒスチジン４５０を
アラニンに変異させた。４４９および４５０のアルギニンおよびヒスチジンをア
ラニンで置換すると、タンパク質の安定性が著しく高まった。これは、これら２
アミノ酸が効率的なタンパク質分解に必要であることを示唆する。アミノ酸４２
３のＨｉｓを変異させてもタンパク質の安定性は変化しなかった。
ｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：３６４−３６８）。
これらのフランキングアミノ酸残基がタンパク質の不安定性に関与していること
を示すために、ヒスチジン４２３、アルギニン４４９およびヒスチジン４５０を
アラニンに変異させた。４４９および４５０のアルギニンおよびヒスチジンをア
ラニンで置換すると、タンパク質の安定性が著しく高まった。これは、これら２
アミノ酸が効率的なタンパク質分解に必要であることを示唆する。アミノ酸４２
３のＨｉｓを変異させてもタンパク質の安定性は変化しなかった。
【００５８】 実施例８ Ｔｅｔ発現系によりｄＥＧＦＰを発現する細胞系 ＣＨＯ Ｋ１−ｔｅｔ ｏｆｆ細胞を、ｐＴＲＥ−ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-46 1 およびｐＴＫ−ハイグロマイシンでトランスフェクションした。トランスフェ
クションはクローンフェクチン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）キット（クローンテッ
ク）により行われた。トランスフェクションした細胞を２００μｇ／ｍｌのハイ
グロマイシンの存在下で選択し、耐性コロニーを蛍光顕微鏡下で蛍光につきスク
リーニングした。蛍光性細胞の単一コロニーをそれぞれ新たなプレートに移した
。一過性トランスフェクションした細胞の場合と同様に、安定にトランスフェク
ションされた細胞における不安定化ＥＧＦＰをテトラサイクリンで調節し、シク
ロヘキシミドを添加してタンパク質合成を遮断することにより分解を検出するこ
とができた。得られた安定にトランスフェクションされた細胞系を、薬物スクリ
ーニングを含めた多数の分析に使用できる。たとえばそれを用いて、テトラサイ
クリン存在からテトラサイクリン不存在への移行中に不安定化ＥＧＦＰの転写誘
導を遮断する薬物、またはシクロヘキシミド添加後にタンパク質分解を阻害する
薬物をスクリーニングすることができる。
クションはクローンフェクチン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）キット（クローンテッ
ク）により行われた。トランスフェクションした細胞を２００μｇ／ｍｌのハイ
グロマイシンの存在下で選択し、耐性コロニーを蛍光顕微鏡下で蛍光につきスク
リーニングした。蛍光性細胞の単一コロニーをそれぞれ新たなプレートに移した
。一過性トランスフェクションした細胞の場合と同様に、安定にトランスフェク
ションされた細胞における不安定化ＥＧＦＰをテトラサイクリンで調節し、シク
ロヘキシミドを添加してタンパク質合成を遮断することにより分解を検出するこ
とができた。得られた安定にトランスフェクションされた細胞系を、薬物スクリ
ーニングを含めた多数の分析に使用できる。たとえばそれを用いて、テトラサイ
クリン存在からテトラサイクリン不存在への移行中に不安定化ＥＧＦＰの転写誘
導を遮断する薬物、またはシクロヘキシミド添加後にタンパク質分解を阻害する
薬物をスクリーニングすることができる。
【００５９】 実施例９ 不安定化ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰ ＣＦＰ（シアン）およびＹＦＰ（イエロー）はＧＦＰの色の変異体である。Ｃ
ＦＰおよびＹＦＰには、それぞれ６および４種類の変異体が含まれる。それらは
、ＣＦＰの場合はＴｙｒ６６Ｔｒｙ、Ｐｈｅ６６Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６５Ｔｈｒ、Ａ
ｓｎ１４５Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１５３ＴｈｒおよびＶａｌ１６３Ａｌａ、ならびにＳ
ｅｒ６５Ｇｌｙ、Ｖａｌ１６８Ｌｅｕ、Ｓｅｒ７２ＡｌａおよびＴｈｒ２０３Ｔ
ｙｒである。増強されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）およびＹＦＰ（ＥＹＦＰ）は、ヒト
最適化コドンを含む遺伝子によりコードされる。ＥＣＦＰは４３３ｎｍで励起さ
れ、４７５ｎｍで発光する。ＥＹＦＰは５２３または４８８ｎｍで励起され、５
２７ｎｍで発光する。
ＦＰおよびＹＦＰには、それぞれ６および４種類の変異体が含まれる。それらは
、ＣＦＰの場合はＴｙｒ６６Ｔｒｙ、Ｐｈｅ６６Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６５Ｔｈｒ、Ａ
ｓｎ１４５Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１５３ＴｈｒおよびＶａｌ１６３Ａｌａ、ならびにＳ
ｅｒ６５Ｇｌｙ、Ｖａｌ１６８Ｌｅｕ、Ｓｅｒ７２ＡｌａおよびＴｈｒ２０３Ｔ
ｙｒである。増強されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）およびＹＦＰ（ＥＹＦＰ）は、ヒト
最適化コドンを含む遺伝子によりコードされる。ＥＣＦＰは４３３ｎｍで励起さ
れ、４７５ｎｍで発光する。ＥＹＦＰは５２３または４８８ｎｍで励起され、５
２７ｎｍで発光する。
【００６０】 ｄＥＧＦＰを作成するための前記と同じ方式で、これら２タンパク質それぞれ
のＣ末端にマウスオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端を付加することにより
、ｄＥＣＦＰおよびｄＥＹＦＰを作成した（図８）。ｐＴＲＥ−ｄＥＣＦＰおよ
びｐＴＲＥ−ｄＥＹＦＰをＣＨＯ／ｔＴＡ細胞中へトランスフェクションし、Ｃ
ＨＸの添加によりタンパク質合成を停止し、そして蛍光顕微鏡検査することによ
り、ｄＥＣＦＰおよびｄＥＹＦＰの半減期を測定した。両タンパク質ともＣＨＸ
の存在下で不安定であった。ＣＨＸによる処理の２時間後、これら２タンパク質
の蛍光の半分が消失した。これは、これらのタンパク質の半減期が野生型と比較
して実質的に短縮したことを示す。
のＣ末端にマウスオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端を付加することにより
、ｄＥＣＦＰおよびｄＥＹＦＰを作成した（図８）。ｐＴＲＥ−ｄＥＣＦＰおよ
びｐＴＲＥ−ｄＥＹＦＰをＣＨＯ／ｔＴＡ細胞中へトランスフェクションし、Ｃ
ＨＸの添加によりタンパク質合成を停止し、そして蛍光顕微鏡検査することによ
り、ｄＥＣＦＰおよびｄＥＹＦＰの半減期を測定した。両タンパク質ともＣＨＸ
の存在下で不安定であった。ＣＨＸによる処理の２時間後、これら２タンパク質
の蛍光の半分が消失した。これは、これらのタンパク質の半減期が野生型と比較
して実質的に短縮したことを示す。
【００６１】 これら２種類の不安定化タンパク質の色変異体を、２色検出のために一緒に使
用できる。たとえばｄＥＣＦＰ遺伝子をＮＦｋＢ結合配列に、ｄＥＹＦＰ遺伝子
をＮＦＡＴ結合配列に結合させることができる。これら２つのレポーター融合体
を単一細胞に導入すると、これら２色の相対蛍光を監視するだけで、２つの転写
因子または２つのシグナリング経路を同時に検出できる。
用できる。たとえばｄＥＣＦＰ遺伝子をＮＦｋＢ結合配列に、ｄＥＹＦＰ遺伝子
をＮＦＡＴ結合配列に結合させることができる。これら２つのレポーター融合体
を単一細胞に導入すると、これら２色の相対蛍光を監視するだけで、２つの転写
因子または２つのシグナリング経路を同時に検出できる。
【００６２】 実施例１０ ｄＥＧＦＰの分解速度および誘導倍率 ｄＥＧＦＰのＰＥＳＴ配列の鍵アミノ酸を変異させることにより、異なる半減
期をもつ多数の変異体を作成した。それらは、それらの半減期を反映してｄ１Ｅ
ＧＦＰおよびｄ４ＥＧＦＰと表示された（図９）。ｄ１ＥＧＦＰ変異体は１時間
未満の半減期をもち、ｄ４ＥＧＦＰ変異体は約４時間の半減期をもつ（図１０）
。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461は約２時間の半減期をもつので、ｄ２ＥＧＦＰと
表示された。
期をもつ多数の変異体を作成した。それらは、それらの半減期を反映してｄ１Ｅ
ＧＦＰおよびｄ４ＥＧＦＰと表示された（図９）。ｄ１ＥＧＦＰ変異体は１時間
未満の半減期をもち、ｄ４ＥＧＦＰ変異体は約４時間の半減期をもつ（図１０）
。ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461は約２時間の半減期をもつので、ｄ２ＥＧＦＰと
表示された。
【００６３】 ＥＧＦＰと比較して卓越したｄＥＧＦＰタンパク質の特性は、それらが速やか
な代謝回転を示し、その結果、元のレベルの活性でありながら不安定化タンパク
質の蓄積がより少ないことである。したがって、ＴＮＦ仲介ＮＦｋＢ活性系によ
り証明されるように、ｄ２ＥＧＦＰはＥＧＦＰよりはるかに高感度の転写レポー
ターである。ｄ１ＥＧＦＰはｄ２ＥＧＦＰより短い半減期をもつので、ｄ１ＥＧ
ＦＰは転写レポーターとして用いた場合にｄ２ＥＧＦＰより高感度である。これ
を説明するために、ｄ１ＥＧＦＰおよびｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をｃＡＭＰ調節要素
（ＣＲＥ）に結合させ、各融合構築体についてフォルスコリンに対するそれらの
応答を試験した。ｄ２ＥＧＦＰをレポーターとして用いた場合には４倍の誘導が
得られたが、ｄ１ＥＧＦＰを用いた場合には１２倍より高い誘導が達成された（
図１１）。これらの結果は、ＧＦＰ分子の代謝回転速度が高いほど、高い誘導お
よび向上した感度が達成されることを示す。
な代謝回転を示し、その結果、元のレベルの活性でありながら不安定化タンパク
質の蓄積がより少ないことである。したがって、ＴＮＦ仲介ＮＦｋＢ活性系によ
り証明されるように、ｄ２ＥＧＦＰはＥＧＦＰよりはるかに高感度の転写レポー
ターである。ｄ１ＥＧＦＰはｄ２ＥＧＦＰより短い半減期をもつので、ｄ１ＥＧ
ＦＰは転写レポーターとして用いた場合にｄ２ＥＧＦＰより高感度である。これ
を説明するために、ｄ１ＥＧＦＰおよびｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をｃＡＭＰ調節要素
（ＣＲＥ）に結合させ、各融合構築体についてフォルスコリンに対するそれらの
応答を試験した。ｄ２ＥＧＦＰをレポーターとして用いた場合には４倍の誘導が
得られたが、ｄ１ＥＧＦＰを用いた場合には１２倍より高い誘導が達成された（
図１１）。これらの結果は、ＧＦＰ分子の代謝回転速度が高いほど、高い誘導お
よび向上した感度が達成されることを示す。
【００６４】 本明細書に述べた特許または刊行物は本発明に関連する技術分野の水準を示す
ものであり、各刊行物を個々に援用したと同程度に参考として援用する。
ものであり、各刊行物を個々に援用したと同程度に参考として援用する。
【００６５】 本発明が、前記およびそれらに伴う目的を実施し、それらの目標および利点を
達成するのに好適であることは、当業者に容易に理解されるであろう。本明細書
に記載するこれらの実施例、ならびに方法、操作、処理、分子および具体的化合
物は現時点で好ましい態様の代表例であり、本発明の範囲を限定するためのもの
ではない。特許請求の範囲により定める本発明の精神に包含されるそれらの変更
および他の用途は、当業者に自明であろう。
達成するのに好適であることは、当業者に容易に理解されるであろう。本明細書
に記載するこれらの実施例、ならびに方法、操作、処理、分子および具体的化合
物は現時点で好ましい態様の代表例であり、本発明の範囲を限定するためのもの
ではない。特許請求の範囲により定める本発明の精神に包含されるそれらの変更
および他の用途は、当業者に自明であろう。
【図１】 ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ融合タンパク質の模式的地図である。ＥＧ
ＦＰをＭＯＤＣのＣ末端領域（３７６〜４６１、３７６〜４５６または４２２〜
４６１のアミノ酸を含む）と融合させる。これらの融合タンパク質をＣＨＯ Ｋ
１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞において発現させ、蛍光顕微鏡下でそれらの蛍光強度を
比較した。
ＦＰをＭＯＤＣのＣ末端領域（３７６〜４６１、３７６〜４５６または４２２〜
４６１のアミノ酸を含む）と融合させる。これらの融合タンパク質をＣＨＯ Ｋ
１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞において発現させ、蛍光顕微鏡下でそれらの蛍光強度を
比較した。
【図２】 細胞中でシクロヘキシミドの存在下に蛍光顕微鏡により検査したＥＧＦＰおよ
びＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461の蛍光安定性を示す。これら２タンパク質を発現
するベクターでＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞をトランスフェクションした
。２４時間後、トランスフェクションした細胞を１００ｍｇ／ｍｌのシクロヘキ
シミドで０、１、２、３および４時間処理した。
びＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461の蛍光安定性を示す。これら２タンパク質を発現
するベクターでＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞をトランスフェクションした
。２４時間後、トランスフェクションした細胞を１００ｍｇ／ｍｌのシクロヘキ
シミドで０、１、２、３および４時間処理した。
【図３】 フローサイトメトリーによるＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461の蛍
光安定性分析を示す。ＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞をＥＧＦＰおよびＥＧ
ＦＰ−ＭＯＤＣ422-461でトランスフェクションした。２４時間後、トランスフ
ェクションした細胞を１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで０、１、２および
３時間処理した。処理した細胞をＥＤＴＡで採集し、１０，０００個の細胞をＦ
ＡＣＳ分析に用いた。
光安定性分析を示す。ＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞をＥＧＦＰおよびＥＧ
ＦＰ−ＭＯＤＣ422-461でトランスフェクションした。２４時間後、トランスフ
ェクションした細胞を１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで０、１、２および
３時間処理した。処理した細胞をＥＤＴＡで採集し、１０，０００個の細胞をＦ
ＡＣＳ分析に用いた。
【図４】 図３からのフローサイトメトリーデータをまとめたグラフである。これはＥＧ
ＦＰ−ＭＯＤＣ422-461トランスフェクションした細胞がシクロヘキシミド処理
後に速やかに蛍光を失うのに対し、ＥＧＦＰ細胞は蛍光を維持することを証明す
る。
ＦＰ−ＭＯＤＣ422-461トランスフェクションした細胞がシクロヘキシミド処理
後に速やかに蛍光を失うのに対し、ＥＧＦＰ細胞は蛍光を維持することを証明す
る。
【図５】 ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461のタンパク質安定性のウェスタン
ブロット分析の写真である。フローサイトメトリー中に採集した細胞を細胞溶解
物の調製に用いた。細胞溶解物をＳＤＳゲル電気泳動し、膜に移し取った。ＥＧ
ＦＰおよびＥＧＦＰ融合タンパク質を、ＧＦＰに対するモノクローナル抗体によ
り検出した。
ブロット分析の写真である。フローサイトメトリー中に採集した細胞を細胞溶解
物の調製に用いた。細胞溶解物をＳＤＳゲル電気泳動し、膜に移し取った。ＥＧ
ＦＰおよびＥＧＦＰ融合タンパク質を、ＧＦＰに対するモノクローナル抗体によ
り検出した。
【図６】 変異の位置を示した融合ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461のＰＥＳＴ配列の模式的
地図である。
地図である。
【図７】 ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−ＭＯＤＣ422-461およびＰＥＳＴ変異体を発現するトラ
ンスフェクションしたＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞において、蛍光シグナ
ルの持続を測定して得た結果をまとめた表である。トランスフェクションはＣＨ
Ｏ／ｔＴＡ細胞において、実施例２に挙げた方法で行われた。２４時間後、細胞
をシクロヘキシミドで０、２および４時間処理し、ＦＡＣＳカリバー（Ｃａｌｉ
ｂｅｒ）により蛍光を分析した。
ンスフェクションしたＣＨＯ Ｋ１ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞において、蛍光シグナ
ルの持続を測定して得た結果をまとめた表である。トランスフェクションはＣＨ
Ｏ／ｔＴＡ細胞において、実施例２に挙げた方法で行われた。２４時間後、細胞
をシクロヘキシミドで０、２および４時間処理し、ＦＡＣＳカリバー（Ｃａｌｉ
ｂｅｒ）により蛍光を分析した。
【図８】 ｄ２ＥＧＦＰ、ｄＥＣＦＰおよびｄＥＹＦＰの模式図を示す。
【図９】 不安定化ＥＧＦＰ変異体の構築を示す。
【図１０】 ＥＧＦＰおよびｄＥＧＦＰ変異体の蛍光安定性を示す。
【図１１】 ＣＲＥ−ｄ１ＥＧＦＰおよびＣＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰによる誘導増大を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０５７ 1/21 9/88 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/88 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/543 ５７５ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/543 ５７５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA07 FA02 HA11 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ79 QR18 QR58 QS28 QX02 4B064 AG01 CA19 CC24 DA13 4B065 AA87Y AA91Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA27 CA46 4C057 BB05 DD01 MM04 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 CA50 DA89 EA50 FA74
Claims (22)
- 【請求項１】 蛍光タンパク質を含む融合タンパク質であって、約１０時間を
超えない半減期を有する融合タンパク質。 - 【請求項２】 蛍光タンパク質がＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰよりなる
群から選択される、請求項１記載の融合タンパク質。 - 【請求項３】 融合タンパク質が、蛍光タンパク質に融合した、ネズミオルニ
チンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳＴ配列含有部分を含む、
請求項２記載の融合タンパク質。 - 【請求項４】 ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端のＰＥＳＴ配列
含有部分が、ＭＯＤＣ376-461、ＭＯＤＣ376-456、ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４２６
Ａ／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４４４
Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４ＡおよびＤ４
４８Ａよりなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項３記載の融合タンパク
質。 - 【請求項５】 タンパク質が配列番号：１に示す配列を有する、請求項３記載
の融合タンパク質。 - 【請求項６】 請求項１記載の融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
- 【請求項７】 請求項６記載のＤＮＡであって、蛍光タンパク質がＥＧＦＰ、
ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰよりなる群から選択されるものである融合タンパク質を
コードするＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項７記載のＤＮＡであって、蛍光タンパク質に融合した、
ネズミオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）のＣ末端のＰＥＳＴ配列含有
部分を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項９】 ネズミオルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端のＰＥＳＴ配列
含有部分がＭＯＤＣ376-461、ＭＯＤＣ376-456、ＭＯＤＣ422-461、Ｐ４２６Ａ
／Ｐ４２７Ａ、Ｐ４３８Ａ、Ｅ４２８Ａ／Ｅ４３０Ａ／Ｅ４３１Ａ、Ｅ４４４Ａ
、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｔ４３６Ａ、Ｄ４３３Ａ／Ｄ４３４ＡおよびＤ４４
８Ａよりなる群から選択される、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項１０】 配列番号：２に示す配列を有する、請求項８記載の単離ＤＮ
Ａ。 - 【請求項１１】 請求項６記載の単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクター。
- 【請求項１２】 ベクターが誘導性プロモーターを含む、請求項１１記載のベ
クター。 - 【請求項１３】 請求項１０記載の単離ＤＮＡ分子を発現しうるベクター。
- 【請求項１４】 ベクターが誘導性プロモーターを含む、請求項１３記載のベ
クター。 - 【請求項１５】 プロモーターがテトラサイクリン誘導性である、請求項１４
記載のベクター。 - 【請求項１６】 蛍光タンパク質を発現する安定な細胞系の製造方法であって
、細胞を請求項１１記載のベクターでトランスフェクションする工程を含む方法
。 - 【請求項１７】 請求項１６記載の方法で製造された安定な細胞系。
- 【請求項１８】 一過性蛍光レポータータンパク質により転写または翻訳要素
の活性化または失活をアッセイする方法であって、 約１０時間を超えない半減期を有する蛍光タンパク質融合タンパク質を含む発
現ベクターで細胞をトランスフェクションし、その際、融合タンパク質はそれら
のプロモーター、転写または翻訳要素の影響下にあり；そして それらの細胞における蛍光の存在、不存在または量を検出する 工程を含む方法。 - 【請求項１９】 細胞に存在する蛍光の量が、発現する蛍光タンパク質の尺度
である、請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 一過性蛍光タンパク質レポータータンパク質によりプロモー
ターまたは他の転写もしくは翻訳要素の活性化または失活をアッセイする方法で
あって、 約１０時間を超えない半減期を有する蛍光性融合タンパク質を含む発現ベクタ
ーで細胞をトランスフェクションし、その際、蛍光性融合タンパク質はそれらの
プロモーター、転写または翻訳要素の影響下にあり； トランスフェクションした細胞を目的化合物で処理し；そして 細胞をその目的化合物で処理した際の蛍光の変化を検出し、これにより目的化
合物がそれらの転写または翻訳要素の活性化または失活に及ぼす影響をアッセイ
する 工程を含む方法。 - 【請求項２１】 細胞系譜を調べる方法であって、 請求項１記載の不安定化した融合タンパク質を発現するベクターで未分化細胞
をトランスフェクションし； これらの未分化細胞を、未分化細胞が分化細胞になる条件下で増殖させ；そし
て 分化細胞における蛍光の不存在、存在または位置を検出する 工程を含む方法。 - 【請求項２２】 請求項１記載の融合タンパク質を細胞局在化試験に使用する
方法であって、 約１０時間を超えない半減期を有するＧＦＰ融合タンパク質を含む発現ベクタ
ーで細胞をトランスフェクションし、その際、融合タンパク質は推定による細胞
局在化要素に結合しており； これらの細胞を増殖させ；そして 細胞における蛍光の位置を検出する 工程を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/062,102 US6130313A (en) | 1997-10-02 | 1998-04-17 | Rapidly degrading GFP-fusion proteins |
| US09/062,102 | 1998-04-17 | ||
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