JP2017209080A - 細胞小器官局在性融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
項2.前記細胞小器官が、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム、液胞、又はリソソームである、項1に記載の融合タンパク質。
項3.前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、項1又は2に記載の融合タンパク質。
項4.項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
項5.項4に記載の核酸を含む発現ベクター。
項6.項4に記載の核酸が導入された細胞。
項7.項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞小器官を可視化する方法。
項8.細胞内局在性が未知のタンパク質と、蛍光タンパク質と、プロテアソーム分解シグナルペプチドとから構成される融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞内におけるタンパク質の局在性を分析する方法。
項9.前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、項8に記載の方法。
以下の試験例の全てにおいて、融合タンパク質(シグナル配列−蛍光タンパク質−デグロン配列)を発現する遺伝子を出芽酵母(S. cerevisiae)のCDC19プロモーターの制御下に配置し、これをプラスミドpTOW40836 (図1、文献1)に組み込んだ。このプラスミドで出芽酵母BY4741株(文献2)をLiOAC法(文献3)により形質転換した。
MTS4-GFPは、S. cerevisiaeのMdh1タンパク質のN末端19アミノ酸(MLSRVAKRAFSSTVANPYA)を人工合成し、yEGFP3 (文献4)のN末端に組み込むことで作製した。MTS4-GFP-degは、さらにcODC1配列(LPMSCAQESITSLYKKAGSENLYFQ(配列番号10))(文献5)を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。
MTSmmf-GFPは、S. cerevisiaeのMmf1タンパク質のN末端21アミノ酸(MFLRNSVLRTAPVLRRGITTL)を人工合成し、yEGFP3のN末端に組み込むことで作製した。MTSmmf1-GFP-degは、さらにcODC1配列(LPMSCAQESITSLYKKAGSENLYFQ)を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。
MTS-GFPは、S. cerevisiaeのMrps12タンパク質のN末端29アミノ酸(MLSRFMSNTWCTPLRQAQRLFSSTTTMQA)を人工合成し、yEGFP3のN末端に組み込むことで作製した。MTS-GFP-degは、さらにcODC1配列(LPMSCAQESITSLYKKAGSENLYFQ)を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。
SS-moxGFP-HDELは、原虫(T. brucei)のEP procyclinのN末端29アミノ酸(MAPRSLYLLAILLFSANLFSGVGFAAAAE)を人工合成しmoxGFP (文献6)のN末端に組み込み、更にC末端にHDEL配列を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。SS-moxGFP-deg-HDELは、HDEL配列を含む改変型cODC1配列(LPMSCAQESITSLYKKAGSHDEL(配列番号11))を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。
GFP-ePTS1は、ePTS1配列(LGRGRRSKL、文献7)を人工合成し、moxGFPのC末端に組み込むことで作製した。GFP-deg-ePTS1は、ePTS1配列を含む改変型cODC1配列(LPMSCAQESITSLYLGRGRRSKL(配列番号12))を人工合成しC末端に組み込むことで作製した。
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Claims (9)
- 細胞小器官への局在化シグナルペプチドと、蛍光タンパク質と、プロテアソーム分解シグナルペプチドとから構成される融合タンパク質。
- 前記細胞小器官が、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム、液胞、又はリソソームである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項4に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項4に記載の核酸が導入された細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞小器官を可視化する方法。
- 細胞内局在性が未知のタンパク質と、蛍光タンパク質と、プロテアソーム分解シグナルペプチドとから構成される融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞内におけるタンパク質の局在性を分析する方法。
- 前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項8に記載の方法。
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