JP4427671B2 - 蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質 - Google Patents
蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4427671B2 JP4427671B2 JP2004558466A JP2004558466A JP4427671B2 JP 4427671 B2 JP4427671 B2 JP 4427671B2 JP 2004558466 A JP2004558466 A JP 2004558466A JP 2004558466 A JP2004558466 A JP 2004558466A JP 4427671 B2 JP4427671 B2 JP 4427671B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- processing
- monitor
- dna
- monitor protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 200
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 183
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 title claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 138
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 69
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 69
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 64
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 64
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 45
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 45
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 29
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 25
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 17
- 102100037732 Neuroendocrine convertase 2 Human genes 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 4
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 claims description 3
- 241000035537 Cypridina noctiluca Species 0.000 claims description 3
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 3
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 claims description 2
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 108090000545 Proprotein Convertase 2 Proteins 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 102000048266 Nociceptin Human genes 0.000 description 3
- 108090000622 Nociceptin Proteins 0.000 description 3
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- PULGYDLMFSFVBL-SMFNREODSA-N nociceptin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 PULGYDLMFSFVBL-SMFNREODSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- 102400001112 Nocistatin Human genes 0.000 description 2
- 101800004812 Nocistatin Proteins 0.000 description 2
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000035538 Cypridina Species 0.000 description 1
- 241000252231 Cyprinus Species 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 241000361919 Metaphire sieboldi Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001077668 Rattus norvegicus Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 241001233061 earthworms Species 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001254 nonsecretory effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000033998 protein modification process Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
プレプロ蛋白質から活性ペプチドが切り出されるプロセッシング過程は、従来、切断後の活性ペプチドに対する特異的な抗体による検出や、電気泳動法やマススペクトル法による直接的な分子量の変化による検出を行ってきた。しかしながら、これらの方法は簡便な方法ではなく、直接的にプロセッシングを観察する手段ではない。
発光酵素類は細胞内の遺伝子転写活性を直接観察する手段として有効であり、遺伝子発現検出モニター蛋白質として利用されている。また、蛍光タンパク質は細胞内で発現とほぼ同時期に、補因子を必要とせず、蛍光活性を持つ。細胞内で蛍光活性を指標として蛋白質の局在等に関するモニター蛋白質として利用されている。
別個の蛋白質である蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間、或いは発光酵素・蛍光蛋白質間のエネルギー移動を指標として分子間或いは分子内相互作用の変化を追跡する手法が開発され、蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間のエネルギー移動を指標に細胞内のカルシウムイオンの変化や、発光酵素・蛍光蛋白質間エネルギー移動を指標に蛋白質のリン酸化を解析するモニター蛋白質が構築されている。しかしながら、これらエネルギー移動を指標としたプロセッシング過程を可視化、定量化するモニター蛋白質はない。
本発明は,プロセッシング過程を可視化できるモニター蛋白質の作成及び最適化、さらに本モニター蛋白質を用いるプロセッシング酵素に対するスクリーニング法、プロセッシング酵素活性を抑制或いは促進する薬剤に対するスクリーニング法を開発し病態の治療,検査及び新薬開発に利用することを目的とする。
図2は、エネルギー移動可能な分泌型キメラタンパク質にプロセッシング部位(A)、及びその部位を変異(B)或いは欠損(C)させた領域のDNA配列を示す。
図3は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質を導入した細胞内、及び細胞外でのウエスタンブロット解析及びプロセッシング酵素を導入した場合の切断効率の変化の検出結果を示す。
図4は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質を発現する細胞にプロセッシング酵素を導入した場合、エネルギー移動効率、スペクトルが変化することを示す。(a)Vluc−NST/Nco−EYFP単独、(b)Vluc−NST/Nco−EYFPにPC1を発現、(c)Vluc−NST/Nco−EYFPにPC2を発現、(d)Vluc。
図5は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質のエネルギー移動効率は切断酵素PC1により大きく減少し、同様に切断効率をウェスタンブロットの結果より定量化した結果を示す。
本発明者は,上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果,プロセッシングによる切断を受けるプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることにより発光蛍光エネルギー特性変化を示す特性可変領域を持つモニター蛋白質を作成した。
本発明は、以下のモニター蛋白質、それをコードする遺伝子,作成された本モニター蛋白質を用いるプロセッシング細胞や蛋白質、或いはプロセッシングを促進または抑制する化合物のスクリーニングする方法に関する。
1.プロセッシングを受けるアミノ酸残基又はアミノ酸残基配列を含む1以上のプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることによりエネルギー移動特性変化を示す1以上の特性可変領域とを含む、蛋白質のプロセッシングを測定可能なモニター蛋白質。
2.特性可変領域が発光蛋白質と蛍光蛋白質を含む、項1に記載のモニター蛋白質。
3.モニター蛋白質が分泌タンパク質である項1に記載のモニター蛋白質。
4.プロセッシング切断領域を切断するプロセッシング酵素が、PC1、PC2、フリン、プロテアソーム、カテプシンおよびトロンビンからなる群から選ばれるいずれかである項1に記載のモニター蛋白質。
5.プロセッシング酵素がPC1である項4に記載のモニター蛋白質。
6.プロセッシング切断領域が、特性可変領域を構成する発光蛋白質と蛍光蛋白質の間に位置する、項1に記載のモニター蛋白質。
7.発光蛋白質が、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫(ホタル、ヒカリコメツキなど)、発光性渦鞭毛藻、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケおよびオワンクラゲ(エクオリン)からなる群から選ばれるいずれかに由来のルシフェラーゼである、項1に記載のモニター蛋白質。
8.蛍光蛋白質が、グリーン蛍光蛋白質(GFP),黄色蛍光蛋白質(YFP),青色蛍光蛋白質(BFP)、シアン蛍光蛋白質(CFP)、DsREDおよび赤色蛍光蛋白質(RFP)からなる群から選ばれるいずれかに由来の蛋白質である、項1に記載のモニター蛋白質。
9.特性可変領域の発光蛋白質が、分泌型ウミボタル(Cypridina noctiluca)発光酵素であり、特性可変領域の蛍光蛋白質が、発光オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来変異体の黄色蛍光タンパクとからなることを特徴とする、項2に記載のモニター蛋白質。
10.プロセッシング切断領域が、プロセッシング酵素による切断点を含む6〜100個のアミノ酸配列からなる項1に記載のモニター蛋白質。
11.以下のa)およびb)のいずれかのアミノ酸配列を有する項1に記載のモニタータンパク質:
a)配列番号2記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質;
b)配列番号2記載のアミノ酸配列において,1または複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているモニター蛋白質.
12.プロセッシング切断領域がSEQKQLQKRFGGFTGGである、項1に記載のモニター蛋白質。
13.項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質をコードするDNA。
14.以下c)−d)のいずれかのDNA配列を有する項13に記載のDNA。
c)配列番号1記載に塩基配列により表わされるDNA;
d)配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、該DNAがコードするタンパク質が発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているDNA。
15.項13に記載のDNAを含む発現ベクター。
16.項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質、項13〜14に記載のDNA、および項15に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価することを特徴とする、該細胞のプロセッシング能を測定する方法。
17.前記細胞がヒト由来の細胞である項16に記載の方法。
18.被験蛋白質と項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のプロセッシング能を測定する方法。
19.プロセッシング酵素をスクリーニングする方法であって、被験蛋白質と項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させる工程;被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法。
20.プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質とを接触させる工程;被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
21.プロセッシング(酵素活性)を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、項1〜12のいずれかに記載のモニター蛋白質、項13〜14に記載のDNA配列、および項15に記載の発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程;被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
さらに、本願明細書は,以下の発明を開示する.
1.以下の1)−4)に示す蛋白質
1) 配列番号2記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質;
2) 配列番号2記載のアミノ酸配列において,プロセッシングにより切断を受ける領域とそれに伴う特性可変領域(発光蛋白質と蛍光蛋白質)のいずれかの配列または位置が変更されたモニター蛋白質.
3) 配列番号2記載のアミノ酸配列の下線部により図示されるプロセッシング切断領域(プレプロノシスタチン蛋白質の切断点を含む18残基のアミノ酸配列)が、プロセッシング切断部位を含む前後10〜100アミノ酸残基,好ましくは20−40アミノ酸残基で置換されてなるモニタータンパク質
4) 特性可変領域が、プロセッシング切断領域の前/後において3次元立体構造が変化することを起因として特性が可変する領域であるモニタータンパク質。プロセッシング領域を挟んで発光蛋白質、蛍光蛋白質を配しプロセッシングの前後で発光蛋白質から蛍光蛋白質にエネルギー移動が成立しなくなり、発光色が変化するモニター蛋白質は好適である。
好ましい実施形態において、モニター蛋白質は特性可変領域の両端にそれぞれ発光蛋白質、蛍光蛋白質を配した。モニター蛋白質において、いずれがN末端側にあってもよいが、N末端側から発光蛋白質−蛍光蛋白質の順序であるのがより好ましい。発光蛋白質と蛍光蛋白質を有するモニター蛋白質において、プロセッシングが起きない状況では、発光蛋白質(分泌型ウミボタル(Cypridina noctiluca)発光酵素)の発する青色光は蛍光蛋白質変異体(EYFP)にエネルギー移動しモニター蛋白質は黄緑色光を発するが、プロセッシングが起きた場合、エネルギー移動は成立せず、モニター蛋白質より青色光のみを発する。この特性可変領域における発光色変化を指標としてプロセッシングを解析できる。
従来、細胞内のリン酸化やカルシウムの動態を観察できるモニター蛋白質はあるが、プロセッシング過程を可視化、定量化できるモニター蛋白質は本発見者が初めて明らかにした.また,蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間の、或いは発光蛋白質・蛍光蛋白質間のエネルギー移動の変化を指標として細胞機能を解析するシステムも考案されているが、プロセッシングを解析するシステムへの利用は,本研究者が初めてである.
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のモニター蛋白質は、プロセッシング切断領域と、特性可変領域とを含む点に特徴を有する。
プロセッシング切断領域とは、プロセッシング酵素により切断を受ける2以上のアミノ酸を含む領域であり、モニター対象となるプロセッシング酵素の種類によりそのアミノ酸配列は変化する。
本発明において、プロセッシング切断領域とは、プロセッシング酵素により認識・切断可能なアミノ酸配列を含む領域であり、1以上のアミノ酸を含み、モニター対象となるプロセッシング酵素の種類によりそのアミノ酸配列は変化する。例えば配列番号2に示されるモニター蛋白質において、プロセッシング酵素であるPC1は切断点「KR」を認識して切断するが、配列番号2には4個の「KR」(ルシフェラーゼ部分に2個、プロセッシング切断領域に1個、YFPに1個)があるにもかかわらず、切断はプロセッシング切断領域のみで起こる。従って、プロセッシング切断領域は、切断点(KR)のみならず該切断点を酵素が認識し切断可能とするための補助的部分を有し、切断にほとんど或いは全く影響しない追加の配列をさらに含んでいてもよい。プロセッシング切断領域の一例としては、プロセッシング酵素(PC1)に対する「SEQKQLQKRFGGFTGG」が挙げられる。
プロセッシング切断領域を、プロセッシング酵素としてPC1を例に取り説明する。
PC1の切断認識配列は、Lys−Argであり、プロセッシング切断領域はLys−Argを含み、さらにそのC末端側及びN末端側に3〜50個、好ましくは4〜40個更に好ましくは5〜20個のアミノ酸を連結してプロセッシング切断領域とすることができる。プロセッシング切断領域に用いられるアミノ酸は、Gly,Ala,His,Arg,Lys,Ser,Cys(シスチンを含む),Thr,Met,Phe,Tyr,Trp,Leu,Ile,Val,Glu,Asp,Gln,Asp,Proなどの蛋白質を構成する通常のアミノ酸が好ましいが、Sar、β−アラニン、ノルバリン、オルニチン、システイン酸などの他の天然或いは合成のアミノ酸であってもよい。
上記は、プロセッシング酵素がPC1の場合であり、他のプロセッシング酵素に対するプロセッシング切断領域も同様にしてデザインすることができる。
切断領域の全アミノ酸数は、6〜100個程度、好ましくは8〜50個程度、更に好ましくは10〜40個程度である。
プロセッシング酵素は、生体内で合成された蛋白質前駆体を限定分解し、成熟体蛋白質に変換する酵素であれば特に限定されず、例えばPC1,PC2,フリン,プロテアソーム、カテプシン、トロンビンが例示される。
PC1以外のプロセッシング酵素と切断領域を以下に例示する。
例えば、PC1,PC2、フリンは、いずれもKRのC末端側蛋白質を切断するが、KRの前後の配列或いは全体としての蛋白質の構造を変化させることにより、特定のプロセッシング酵素により切断させることが可能になる。
モニター対象となるプロセッシング酵素が1つの場合、1つの切断認識配列を含めばよいが、複数のプロセッシング酵素を同時にモニターする場合、2種以上のプロセッシング酵素に各々対応する、異なる切断認識配列を切断領域に導入することも可能である。また、特定のプロセッシング酵素の切断認識配列のみを有し、他のプロセッシング酵素の切断認識配列を有しない切断領域を構築することにより、特定のプロセッシング酵素活性のみを調節する化合物をスクリーニングすることができる。また、複数の基質に対して作用する1つのプロセッシング酵素を対象とした場合であっても、切断認識配列及びその前後の配列を例えば特定の基質の配列に合わせて適切に選択することにより、特定の基質のみのプロセッシングを促進または抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
特性可変領域は、プロセッシング酵素により切断された場合に、そのエネルギー移動特性が変化するものであればよく、例えば発光蛋白質と蛍光蛋白質、発光蛋白質と着色蛋白質などの組み合わせを含むことができる。
発光蛋白質と蛍光蛋白質をプロセッシング切断領域を介して連結した場合、プロセッシング切断領域が切断される前では発光蛋白質から蛍光蛋白質へのエネルギー移動が起きるが、切断後にはこのエネルギー移動が起きなくなり、切断の有無をエネルギー移動の測定により容易に定量できる利点がある。発光蛋白質と蛍光蛋白質並びにプロセッシング切断領域は、発光蛋白質−プロセッシング切断領域−蛍光蛋白質の順に連結するのが好ましいが、プロセッシング酵素による切断により発光蛍光特性が変化する限り、蛍光蛋白質−プロセッシング切断領域−発光蛋白質の順序で連結してもよい。
また、発光蛋白質の発光特性に重大な影響を有しない部位にプロセッシング切断領域を導入してもよい。この場合、発光蛋白質は、プロセッシング後に発光特性を失ってもよい。
同様に、蛍光蛋白質の蛍光特性に重大な影響を有しない部位にプロセッシング切断領域を導入してもよい。この場合、蛍光蛋白質は、プロセッシング後に蛍光特性を失ってもよい。
発光蛋白質としては、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫(ホタル、ヒカリコメツキなど)、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケ、オワンクラゲ(エクオリン)などの各種発光生物由来のルシフェラーゼが例示される。例えば、ウミボタル・ルシフェラーゼは分泌型であるので、これを用いるとモニター蛋白質が分泌型となり好ましい。分泌型モニター蛋白質を使用すれば、生きた細胞内で起きているプロセッシングの程度を、細胞を破壊することなく評価できるためである。ウミシイタケ由来のルシフェラーゼのように非分泌型ルシフェラーゼの場合には、N末端側に分泌タンパク質を導入し、分泌型発光蛋白質として利用することもできる。
蛍光蛋白質としては、グリーン蛍光蛋白質(GFP),黄色蛍光蛋白質(YFP),青色蛍光蛋白質(BFP),シアン蛍光蛋白質(CFP)、DsRED、赤色蛍光蛋白質(RFP)などが例示される。また、着色蛋白質として青色着色蛋白質(フィコシアニン)、紅色着色蛋白質(フィコエリトリン)が例示される。フィコシアニンとフィコエリトリンは、ホタルルシフェラーゼの光を吸収することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、生物発光タンパク質から放出される光が蛍光蛋白質の励起波長になるように選択される。このような組み合わせとしては、例えば以下のものが挙げられる。
好ましい1つの実施形態において、本発明のモニタータンパクは,以下の1)−3)に示す蛋白質が例示される。
1) 配列番号2記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質。
2) 配列番号2記載のアミノ酸配列において,1若しくは複数個のアミノ酸が欠失,置換若しくは付加されたアミノ酸配列より表わされ,且つ発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質。
3) 配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパクであって,発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質。
2)のタンパクは,1)のタンパクに発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を失わない程度の変異が導入されたタンパクである.このような変異は,自然界において生じるほかに,人為的な変異も含む.人為的変異を生じさせる手段としては,部位特異的変異誘導法(Nucleic Acids Res.10,6487−6500,1982)などを挙げることができるが,これに限定されるわけではない.変異したアミノ酸の数は,分泌、発光、蛍光活性及びエネルギー移動特性が失われない限り,その個数は制限されないが,通常は20アミノ酸以内であり,好ましくは15アミノ酸以内であり,更に好ましくは10アミノ酸以内であり,最も好ましくは5アミノ酸以内である.変異を導入したタンパクが発光・蛍光活性を維持しているかは,そのタンパクの発光・蛍光活性を調べることによって判定できる.
3)のタンパクは,DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる分泌型発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質である.3)のタンパクにおける「ストリンジェントな条件」とは,特異的なハイブリダイゼーションのみが起き,非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう.このような条件は,通常,「1xSSC,0.1%SDS,37℃」程度であり,好ましくは「0.5xSSC,0.1%SDS,42℃」程度であり,更に好ましくは「0.2xSSC,0.1%SDS,65℃」程度である.ハイブリダイゼーションによって得られるDNAは配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNAと通常高い相同性を有する.高い相同性とは,60%以上の相同性,好ましくは75%以上の相同性,更に好ましくは90%以上の相同性を指す.
本発明のタンパクは,後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み,適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる.発現ベクターとして,例えば,pBT−VL−b−YFPなどを用いることができ,宿主細胞としては大腸菌BL21株などを用いることができる.
本発明の遺伝子は,以下1)−2)に示す遺伝子を包含する。
1) 配列番号1記載に塩基配列により表わされる遺伝子。
2) 配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするDNA配列。
上記のDNAがコードするタンパクは,DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる分泌型発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有する蛋白質である。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは,特異的なハイブリダイゼーションのみが起き,非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は,通常,「1xSSC,0.1%SDS,37℃」程度であり,好ましくは「0.5xSSC,0.1%SDS,42℃」程度であり,更に好ましくは「0.2xSSC,0.1%SDS,65℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるDNAは配列番号1または2記載の塩基配列により表わされるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは,60%以上の相同性,好ましくは75%以上の相同性,更に好ましくは90%以上の相同性、特に95%以上の相同性を指す。
本発明のタンパクは,後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み,適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる。発現ベクターとして,例えば,pBT−VL−mp−YFP(VLはウミボタル・ルシフェラーゼ、mpはモニターペプチド、YFPは黄色蛍光蛋白質をそれぞれ示す)などを用いることができ,宿主細胞としては哺乳動物細胞、酵母などの真核生物細胞、大腸菌、枯草菌、藻類、真菌類などの原核生物細胞が挙げられ、そのいずれを用いてもよい。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物培養細胞COS7細胞株(この系では哺乳類系のタンパク合成、タンパク修飾過程を経ることが重要であり、つまり、この過程をモニタリングする)などを用いることができる。
本発明の好ましいキメラタンパク質をコードする遺伝子(ポリヌクレオチド)は,
1) 配列番号1記載の塩基配列を有する遺伝子.
2) 配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを有する遺伝子
である。
(スクリーニング方法I)
本発明のモニター蛋白質、DNA配列又は発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価する。
該方法により、細胞のプロセッシング能を定量的に評価することが可能になる。
(スクリーニング方法II)
被験蛋白質と本発明のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定することで、被験蛋白質のプロセッシング能を定量的に測定する。
該方法において、通常モニター蛋白質は複数用意し、被験蛋白質がどのモニター蛋白質のエネルギー移動特性を変化させるかを測定することにより、被験蛋白質がどのようなプロセッシング酵素であるのか、どのプロセッシング酵素の活性が強いのかなどを定量的に測定することができる。
(スクリーニング方法III)
被験蛋白質と本発明のモニター蛋白質とを反応させる工程;被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程を行うことにより、新たなプロセッシング酵素をスクリーニングすることができる。
(スクリーニング方法IV)
細胞フリーの系でプロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに本発明のモニター蛋白質とを接触させる工程;被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む。
該方法により、細胞内への移行性などの要因を考慮することなく、プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
プロセッシング(酵素活性)を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、本発明のモニター蛋白質、該モニター蛋白質をコードするDNA配列、および該DNA配列を含む発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程;被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む。
該方法により、経口投与等により血液中に移行させることにより薬効を発揮する化合物をスクリーニングすることができる。
本発明は,新規のプロセッシングを定量化できるモニター蛋白質及びそれをコードする遺伝子,本酵素の発現を制御する遺伝子を提供する.本モニタータンパク質を使用することで、細胞を破壊することなく細胞内で起きるプロセッシング過程を可視化できる。これらは病態の治療,検査及び新薬開発に利用が可能である.
次に,本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する.
Claims (16)
- プロセッシングを受けるアミノ酸残基又はアミノ酸残基配列を含む1以上のプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることによりエネルギー移動特性変化を示す1以上の特性可変領域とを含み、該特性可変領域が発光蛋白質と蛍光蛋白質を含み、該発光蛋白質が分泌型ルシフェラーゼ又はN末端側に分泌蛋白質が導入された非分泌型ルシフェラーゼであり、プロセッシング切断領域が特定可変領域を構成する発光蛋白質を蛍光蛋白質の間に位置する、蛋白質のプロセッシングを測定可能なモニター蛋白質。
- プロセッシング切断領域を切断するプロセッシング酵素が、PC1、PC2、フリン、カテプシンおよびトロンビンからなる群から選ばれるいずれかである請求項1に記載のモニター蛋白質。
- プロセッシング酵素がPC1である請求項2に記載のモニター蛋白質。
- 蛍光蛋白質が、グリーン蛍光蛋白質(GFP),黄色蛍光蛋白質(YFP),青色蛍光蛋白質(BFP)、シアン蛍光蛋白質(CFP)、DsREDおよび赤色蛍光蛋白質(RFP)からなる群から選ばれるいずれかに由来の蛋白質である、請求項1に記載のモニター蛋白質。
- 特性可変領域の発光蛋白質が、分泌型ウミボタル(Cypridina noctiluca)発光酵素であり、特性可変領域の蛍光蛋白質が、発光オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来変異体の黄色蛍光タンパクとからなることを特徴とする、請求項1に記載のモニター蛋白質。
- 以下のa)およびb)のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項1に記載のモニタータンパク質:
a)配列番号2記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質;
b)配列番号2記載のアミノ酸配列において,1または複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているモニター蛋白質。 - プロセッシング切断領域がSEQKQLQKRFGGFTGGである、請求項1に記載のモニター蛋白質。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質をコードするDNA。
- 以下c)−d)のいずれかのDNA配列を有する請求項8に記載のDNA。
c)配列番号1記載に塩基配列により表わされるDNA;
d)配列番号1記載の塩基配列により表わされるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、該DNAがコードするタンパク質が発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているDNA。 - 請求項8に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質、請求項8〜9に記載のDNA、および請求項10に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価することを特徴とする、該細胞のプロセッシング能を測定する方法。
- 前記細胞がヒト由来の細胞である請求項11に記載の方法。
- 被験蛋白質と請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のプロセッシング能を測定する方法。
- プロセッシング酵素をスクリーニングする方法であって、被験蛋白質と請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させる工程;被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法。
- プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質とを接触させる工程;被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
- プロセッシング(酵素活性)を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1〜7のいずれかに記載のモニター蛋白質、請求項8〜9に記載のDNA配列、および請求項10に記載の発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程;被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002360744 | 2002-12-12 | ||
JP2002360744 | 2002-12-12 | ||
PCT/JP2003/015828 WO2004052934A1 (ja) | 2002-12-12 | 2003-12-11 | 蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2004052934A1 JPWO2004052934A1 (ja) | 2006-04-13 |
JP4427671B2 true JP4427671B2 (ja) | 2010-03-10 |
Family
ID=32501001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004558466A Expired - Lifetime JP4427671B2 (ja) | 2002-12-12 | 2003-12-11 | 蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070224647A2 (ja) |
EP (1) | EP1580196B1 (ja) |
JP (1) | JP4427671B2 (ja) |
CN (1) | CN1726228B (ja) |
AU (1) | AU2003289316A1 (ja) |
DE (1) | DE60333673D1 (ja) |
WO (1) | WO2004052934A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8487035B2 (en) | 2006-03-30 | 2013-07-16 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Resin composition and molded product thereof |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7989621B2 (en) | 2005-09-26 | 2011-08-02 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for producing substituted imidazo[1,2-A]pyrazines of (s)-1-(3-(2-sec-butyl-6-(1h-indol-3-yl)-3-oxo-3,7-dihydroimadazo[1,2-a]pyrazin-8-yl)propyl)guanidine |
WO2007144990A1 (ja) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 変異型ルシフェラーゼ |
WO2012124799A1 (en) | 2011-03-15 | 2012-09-20 | Olympus Corporation | Star-worm luciferase |
CN103562719B (zh) | 2011-03-16 | 2016-01-13 | 国立大学法人东北大学 | 生物体组织分析用探针及其使用方法 |
WO2016152882A1 (ja) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | 国立大学法人東京工業大学 | コラーゲン融合タンパク質、及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法 |
CN115011621A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-06 | 齐鲁工业大学 | 一种重组蛋白及荧光检测底物的方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6228604B1 (en) * | 1996-04-10 | 2001-05-08 | Loma Linda University | Secreted renilla luciferase |
EP1088233B9 (en) * | 1998-06-16 | 2006-05-17 | PerkinElmer BioSignal Inc. | A bioluminescence resonance energy transfer (bret) system and its use |
EP1265990B1 (en) * | 2000-03-15 | 2006-03-08 | Prolume, Ltd. | Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items |
US6762280B2 (en) * | 2000-09-25 | 2004-07-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | High throughput assays for the proteotytic activities of clostridial neurotoxins |
US7544484B2 (en) * | 2002-09-06 | 2009-06-09 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acids encoding membrane-binding proteins and methods of using same |
-
2003
- 2003-12-11 JP JP2004558466A patent/JP4427671B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-11 WO PCT/JP2003/015828 patent/WO2004052934A1/ja active Application Filing
- 2003-12-11 AU AU2003289316A patent/AU2003289316A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-11 CN CN2003801060052A patent/CN1726228B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-11 EP EP03780713A patent/EP1580196B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-11 DE DE60333673T patent/DE60333673D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-06-09 US US10/537,971 patent/US20070224647A2/en not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8487035B2 (en) | 2006-03-30 | 2013-07-16 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Resin composition and molded product thereof |
US8658731B2 (en) | 2006-03-30 | 2014-02-25 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Resin composition and molded product thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1726228A (zh) | 2006-01-25 |
EP1580196A1 (en) | 2005-09-28 |
AU2003289316A1 (en) | 2004-06-30 |
WO2004052934A1 (ja) | 2004-06-24 |
EP1580196A4 (en) | 2006-06-21 |
JPWO2004052934A1 (ja) | 2006-04-13 |
US20070224647A2 (en) | 2007-09-27 |
AU2003289316A8 (en) | 2004-06-30 |
EP1580196B1 (en) | 2010-08-04 |
CN1726228B (zh) | 2010-05-26 |
DE60333673D1 (de) | 2010-09-16 |
US20060035286A1 (en) | 2006-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6566083B1 (en) | Method of detecting biologically active substances | |
KR101834574B1 (ko) | G 단백질 커플링 수용체 활성화 측정 | |
EP0815257B1 (en) | A method of detecting biologically active substances | |
US8101364B2 (en) | Fragments of fluorescent proteins for protein fragment complementation assays | |
EP1088233B9 (en) | A bioluminescence resonance energy transfer (bret) system and its use | |
US20090068164A1 (en) | Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences | |
US7056683B2 (en) | Genetically encoded fluorescent reporters of kinase, methyltransferase, and acetyl-transferase activities | |
US7060793B2 (en) | Circularly permuted fluorescent protein indicators | |
US6670144B1 (en) | Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners | |
US20070224647A2 (en) | Monitor protein for measuring processing of protein | |
EP2695893A1 (en) | Novel far red fluorescent protein | |
JP2009153399A (ja) | 一分子型リアルタイム生物発光イメージングプローブ | |
Kim et al. | Resource for FRET-based biosensor optimization | |
JP6153140B2 (ja) | 人工生物発光酵素に用いるための発光基質 | |
US6656696B2 (en) | Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners | |
US8921045B2 (en) | Fluorescent color markers | |
US7544484B2 (en) | Nucleic acids encoding membrane-binding proteins and methods of using same | |
CN106632689B (zh) | 多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用 | |
US7351537B2 (en) | Variants of cyan fluorescent protein with improved fluorescent properties | |
JP3760222B2 (ja) | トビイカ発光蛋白質、トビイカ発光蛋白質をコードする遺伝子 | |
Nakamura et al. | Current techniques for studying oligomer formations of G-protein-coupled receptors using mammalian and yeast cells | |
WO2017057752A1 (ja) | 新規人工生物発光酵素群 | |
CN112194729B (zh) | 一种用于检测泛素-蛋白酶体系统降解活性的生物探针 | |
KR20130103560A (ko) | 개변 형광 단백질 | |
EP1143011B1 (en) | A method of detecting biologically active substances |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20051005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051028 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060117 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090422 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090715 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090914 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091104 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091124 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121225 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4427671 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121225 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |