JPWO2004052934A1 - 蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロセッシングを受けるアミノ酸残基又はアミノ酸残基配列を含むプロセッシング領域と、プロセッシングを受けることにより生じる少なくとプロセッシング領域を含む蛋白質の立体構造に起因し発光蛍光エネルギー特性変化を示す分泌型キメラタンパク質とを含む、蛋白質のプロセッシングを測定するモニター蛋白質に関する。

Description

本発明は，プロセッシングによりタンパクが切断される領域と切断によってエネルギー移動特性が変化する特性可変領域を含むモニター蛋白質、それをコードする遺伝子，作成された本モニター蛋白質を用いるプロセッシング細胞や蛋白質、或いはプロセッシングを促進または抑制する化合物のスクリーニングする方法に関する。

遺伝子の転写産物である蛋白質が直接機能を持つ事もあるが、多くの場合、翻訳後産物である蛋白質は糖付加、リン酸化、プロセッシング等の修飾過程を経て活性化される。そのうちプロセッシング過程ではプレプロ蛋白質から任意の場所が切断され活性ペプチドが切り出される。
プレプロ蛋白質から活性ペプチドが切り出されるプロセッシング過程は、従来、切断後の活性ペプチドに対する特異的な抗体による検出や、電気泳動法やマススペクトル法による直接的な分子量の変化による検出を行ってきた。しかしながら、これらの方法は簡便な方法ではなく、直接的にプロセッシングを観察する手段ではない。
発光酵素類は細胞内の遺伝子転写活性を直接観察する手段として有効であり、遺伝子発現検出モニター蛋白質として利用されている。また、蛍光タンパク質は細胞内で発現とほぼ同時期に、補因子を必要とせず、蛍光活性を持つ。細胞内で蛍光活性を指標として蛋白質の局在等に関するモニター蛋白質として利用されている。
別個の蛋白質である蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間、或いは発光酵素・蛍光蛋白質間のエネルギー移動を指標として分子間或いは分子内相互作用の変化を追跡する手法が開発され、蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間のエネルギー移動を指標に細胞内のカルシウムイオンの変化や、発光酵素・蛍光蛋白質間エネルギー移動を指標に蛋白質のリン酸化を解析するモニター蛋白質が構築されている。しかしながら、これらエネルギー移動を指標としたプロセッシング過程を可視化、定量化するモニター蛋白質はない。
本発明は，プロセッシング過程を可視化できるモニター蛋白質の作成及び最適化、さらに本モニター蛋白質を用いるプロセッシング酵素に対するスクリーニング法、プロセッシング酵素活性を抑制或いは促進する薬剤に対するスクリーニング法を開発し病態の治療，検査及び新薬開発に利用することを目的とする。

図１は、エネルギー移動可能な分泌型キメラタンパク質にプロセッシング部位（Ａ）、及びその部位を変異（Ｂ）或いは欠損（Ｃ）させた領域を挿入した構築物を示す。
図２は、エネルギー移動可能な分泌型キメラタンパク質にプロセッシング部位（Ａ）、及びその部位を変異（Ｂ）或いは欠損（Ｃ）させた領域のＤＮＡ配列を示す。
図３は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質を導入した細胞内、及び細胞外でのウエスタンブロット解析及びプロセッシング酵素を導入した場合の切断効率の変化の検出結果を示す。
図４は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質を発現する細胞にプロセッシング酵素を導入した場合、エネルギー移動効率、スペクトルが変化することを示す。（ａ）Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｃｏ−ＥＹＦＰ単独、（ｂ）Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｃｏ−ＥＹＦＰにＰＣ１を発現、（ｃ）Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｃｏ−ＥＹＦＰにＰＣ２を発現、（ｄ）Ｖｌｕｃ。
図５は、プロセッシング配列を挿入した分泌型キメラタンパク質のエネルギー移動効率は切断酵素ＰＣ１により大きく減少し、同様に切断効率をウェスタンブロットの結果より定量化した結果を示す。

エネルギー移動可能な発光酵素・蛍光蛋白質間にプロセッシング領域を挿入したモニター蛋白質構築物が作られれば、プロセッシングの前後でエネルギー移動は変化し、それに伴い発光スペクトルは変化する。このスペクトル変化を指標に、プロセッシング後活性ペプチドの定量化、プロセッシング酵素活性の定量化及びプロセッシング場の局在解析、さらにはプロセッシング酵素活性を制御する遺伝子や蛋白質をスクリーニングでき、プロセッシングを指標とした各種病態の治療及び新薬開発（プロセッシングの促進または阻害作用を有する薬物の開発）への利用が可能となる。
本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，プロセッシングによる切断を受けるプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることにより発光蛍光エネルギー特性変化を示す特性可変領域を持つモニター蛋白質を作成した。
本発明は、以下のモニター蛋白質、それをコードする遺伝子，作成された本モニター蛋白質を用いるプロセッシング細胞や蛋白質、或いはプロセッシングを促進または抑制する化合物のスクリーニングする方法に関する。
１．プロセッシングを受けるアミノ酸残基又はアミノ酸残基配列を含む１以上のプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることによりエネルギー移動特性変化を示す１以上の特性可変領域とを含む、蛋白質のプロセッシングを測定可能なモニター蛋白質。
２．特性可変領域が発光蛋白質と蛍光蛋白質を含む、項１に記載のモニター蛋白質。
３．モニター蛋白質が分泌タンパク質である項１に記載のモニター蛋白質。
４．プロセッシング切断領域を切断するプロセッシング酵素が、ＰＣ１、ＰＣ２、フリン、プロテアソーム、カテプシンおよびトロンビンからなる群から選ばれるいずれかである項１に記載のモニター蛋白質。
５．プロセッシング酵素がＰＣ１である項４に記載のモニター蛋白質。
６．プロセッシング切断領域が、特性可変領域を構成する発光蛋白質と蛍光蛋白質の間に位置する、項１に記載のモニター蛋白質。
７．発光蛋白質が、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキなど）、発光性渦鞭毛藻、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケおよびオワンクラゲ（エクオリン）からなる群から選ばれるいずれかに由来のルシフェラーゼである、項１に記載のモニター蛋白質。
８．蛍光蛋白質が、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ），黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ），青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、ＤｓＲＥＤおよび赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）からなる群から選ばれるいずれかに由来の蛋白質である、項１に記載のモニター蛋白質。
９．特性可変領域の発光蛋白質が、分泌型ウミボタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）発光酵素であり、特性可変領域の蛍光蛋白質が、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来変異体の黄色蛍光タンパクとからなることを特徴とする、項２に記載のモニター蛋白質。
１０．プロセッシング切断領域が、プロセッシング酵素による切断点を含む６〜１００個のアミノ酸配列からなる項１に記載のモニター蛋白質。
１１．以下のａ）およびｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有する項１に記載のモニタータンパク質：
ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質；
ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において，１または複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているモニター蛋白質．
１２．プロセッシング切断領域がＳＥＱＫＱＬＱＫＲＦＧＧＦＴＧＧである、項１に記載のモニター蛋白質。
１３．項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質をコードするＤＮＡ。
１４．以下ｃ）−ｄ）のいずれかのＤＮＡ配列を有する項１３に記載のＤＮＡ。
ｃ）配列番号１記載に塩基配列により表わされるＤＮＡ；
ｄ）配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているＤＮＡ。
１５．項１３に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
１６．項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質、項１３〜１４に記載のＤＮＡ、および項１５に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価することを特徴とする、該細胞のプロセッシング能を測定する方法。
１７．前記細胞がヒト由来の細胞である項１６に記載の方法。
１８．被験蛋白質と項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のプロセッシング能を測定する方法。
１９．プロセッシング酵素をスクリーニングする方法であって、被験蛋白質と項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させる工程；被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法。
２０．プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質とを接触させる工程；被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
２１．プロセッシング（酵素活性）を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質、項１３〜１４に記載のＤＮＡ配列、および項１５に記載の発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程；被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
さらに、本願明細書は，以下の発明を開示する．
１．以下の１）−４）に示す蛋白質
１） 配列番号２記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質；
２） 配列番号２記載のアミノ酸配列において，プロセッシングにより切断を受ける領域とそれに伴う特性可変領域（発光蛋白質と蛍光蛋白質）のいずれかの配列または位置が変更されたモニター蛋白質．
３） 配列番号２記載のアミノ酸配列の下線部により図示されるプロセッシング切断領域（プレプロノシスタチン蛋白質の切断点を含む１８残基のアミノ酸配列）が、プロセッシング切断部位を含む前後１０〜１００アミノ酸残基，好ましくは２０−４０アミノ酸残基で置換されてなるモニタータンパク質
４） 特性可変領域が、プロセッシング切断領域の前／後において３次元立体構造が変化することを起因として特性が可変する領域であるモニタータンパク質。プロセッシング領域を挟んで発光蛋白質、蛍光蛋白質を配しプロセッシングの前後で発光蛋白質から蛍光蛋白質にエネルギー移動が成立しなくなり、発光色が変化するモニター蛋白質は好適である。
好ましい実施形態において、モニター蛋白質は特性可変領域の両端にそれぞれ発光蛋白質、蛍光蛋白質を配した。モニター蛋白質において、いずれがＮ末端側にあってもよいが、Ｎ末端側から発光蛋白質−蛍光蛋白質の順序であるのがより好ましい。発光蛋白質と蛍光蛋白質を有するモニター蛋白質において、プロセッシングが起きない状況では、発光蛋白質（分泌型ウミボタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）発光酵素）の発する青色光は蛍光蛋白質変異体（ＥＹＦＰ）にエネルギー移動しモニター蛋白質は黄緑色光を発するが、プロセッシングが起きた場合、エネルギー移動は成立せず、モニター蛋白質より青色光のみを発する。この特性可変領域における発光色変化を指標としてプロセッシングを解析できる。
従来、細胞内のリン酸化やカルシウムの動態を観察できるモニター蛋白質はあるが、プロセッシング過程を可視化、定量化できるモニター蛋白質は本発見者が初めて明らかにした．また，蛍光蛋白質・蛍光蛋白質間の、或いは発光蛋白質・蛍光蛋白質間のエネルギー移動の変化を指標として細胞機能を解析するシステムも考案されているが、プロセッシングを解析するシステムへの利用は，本研究者が初めてである．
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のモニター蛋白質は、プロセッシング切断領域と、特性可変領域とを含む点に特徴を有する。
プロセッシング切断領域とは、プロセッシング酵素により切断を受ける２以上のアミノ酸を含む領域であり、モニター対象となるプロセッシング酵素の種類によりそのアミノ酸配列は変化する。
本発明において、プロセッシング切断領域とは、プロセッシング酵素により認識・切断可能なアミノ酸配列を含む領域であり、１以上のアミノ酸を含み、モニター対象となるプロセッシング酵素の種類によりそのアミノ酸配列は変化する。例えば配列番号２に示されるモニター蛋白質において、プロセッシング酵素であるＰＣ１は切断点「ＫＲ」を認識して切断するが、配列番号２には４個の「ＫＲ」（ルシフェラーゼ部分に２個、プロセッシング切断領域に１個、ＹＦＰに１個）があるにもかかわらず、切断はプロセッシング切断領域のみで起こる。従って、プロセッシング切断領域は、切断点（ＫＲ）のみならず該切断点を酵素が認識し切断可能とするための補助的部分を有し、切断にほとんど或いは全く影響しない追加の配列をさらに含んでいてもよい。プロセッシング切断領域の一例としては、プロセッシング酵素（ＰＣ１）に対する「ＳＥＱＫＱＬＱＫＲＦＧＧＦＴＧＧ」が挙げられる。
プロセッシング切断領域を、プロセッシング酵素としてＰＣ１を例に取り説明する。
ＰＣ１の切断認識配列は、Ｌｙｓ−Ａｒｇであり、プロセッシング切断領域はＬｙｓ−Ａｒｇを含み、さらにそのＣ末端側及びＮ末端側に３〜５０個、好ましくは４〜４０個更に好ましくは５〜２０個のアミノ酸を連結してプロセッシング切断領域とすることができる。プロセッシング切断領域に用いられるアミノ酸は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｃｙｓ（シスチンを含む），Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ａｓｐ，Ｐｒｏなどの蛋白質を構成する通常のアミノ酸が好ましいが、Ｓａｒ、β−アラニン、ノルバリン、オルニチン、システイン酸などの他の天然或いは合成のアミノ酸であってもよい。
上記は、プロセッシング酵素がＰＣ１の場合であり、他のプロセッシング酵素に対するプロセッシング切断領域も同様にしてデザインすることができる。
切断領域の全アミノ酸数は、６〜１００個程度、好ましくは８〜５０個程度、更に好ましくは１０〜４０個程度である。
プロセッシング酵素は、生体内で合成された蛋白質前駆体を限定分解し、成熟体蛋白質に変換する酵素であれば特に限定されず、例えばＰＣ１，ＰＣ２，フリン，プロテアソーム、カテプシン、トロンビンが例示される。
ＰＣ１以外のプロセッシング酵素と切断領域を以下に例示する。

例えば、ＰＣ１，ＰＣ２、フリンは、いずれもＫＲのＣ末端側蛋白質を切断するが、ＫＲの前後の配列或いは全体としての蛋白質の構造を変化させることにより、特定のプロセッシング酵素により切断させることが可能になる。
モニター対象となるプロセッシング酵素が１つの場合、１つの切断認識配列を含めばよいが、複数のプロセッシング酵素を同時にモニターする場合、２種以上のプロセッシング酵素に各々対応する、異なる切断認識配列を切断領域に導入することも可能である。また、特定のプロセッシング酵素の切断認識配列のみを有し、他のプロセッシング酵素の切断認識配列を有しない切断領域を構築することにより、特定のプロセッシング酵素活性のみを調節する化合物をスクリーニングすることができる。また、複数の基質に対して作用する１つのプロセッシング酵素を対象とした場合であっても、切断認識配列及びその前後の配列を例えば特定の基質の配列に合わせて適切に選択することにより、特定の基質のみのプロセッシングを促進または抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
特性可変領域は、プロセッシング酵素により切断された場合に、そのエネルギー移動特性が変化するものであればよく、例えば発光蛋白質と蛍光蛋白質、発光蛋白質と着色蛋白質などの組み合わせを含むことができる。
発光蛋白質と蛍光蛋白質をプロセッシング切断領域を介して連結した場合、プロセッシング切断領域が切断される前では発光蛋白質から蛍光蛋白質へのエネルギー移動が起きるが、切断後にはこのエネルギー移動が起きなくなり、切断の有無をエネルギー移動の測定により容易に定量できる利点がある。発光蛋白質と蛍光蛋白質並びにプロセッシング切断領域は、発光蛋白質−プロセッシング切断領域−蛍光蛋白質の順に連結するのが好ましいが、プロセッシング酵素による切断により発光蛍光特性が変化する限り、蛍光蛋白質−プロセッシング切断領域−発光蛋白質の順序で連結してもよい。
また、発光蛋白質の発光特性に重大な影響を有しない部位にプロセッシング切断領域を導入してもよい。この場合、発光蛋白質は、プロセッシング後に発光特性を失ってもよい。
同様に、蛍光蛋白質の蛍光特性に重大な影響を有しない部位にプロセッシング切断領域を導入してもよい。この場合、蛍光蛋白質は、プロセッシング後に蛍光特性を失ってもよい。
発光蛋白質としては、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキなど）、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケ、オワンクラゲ（エクオリン）などの各種発光生物由来のルシフェラーゼが例示される。例えば、ウミボタル・ルシフェラーゼは分泌型であるので、これを用いるとモニター蛋白質が分泌型となり好ましい。分泌型モニター蛋白質を使用すれば、生きた細胞内で起きているプロセッシングの程度を、細胞を破壊することなく評価できるためである。ウミシイタケ由来のルシフェラーゼのように非分泌型ルシフェラーゼの場合には、Ｎ末端側に分泌タンパク質を導入し、分泌型発光蛋白質として利用することもできる。
蛍光蛋白質としては、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ），黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ），青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ），シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、ＤｓＲＥＤ、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）などが例示される。また、着色蛋白質として青色着色蛋白質（フィコシアニン）、紅色着色蛋白質（フィコエリトリン）が例示される。フィコシアニンとフィコエリトリンは、ホタルルシフェラーゼの光を吸収することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、生物発光タンパク質から放出される光が蛍光蛋白質の励起波長になるように選択される。このような組み合わせとしては、例えば以下のものが挙げられる。

好ましい１つの実施形態において、本発明のモニタータンパクは，以下の１）−３）に示す蛋白質が例示される。
１） 配列番号２記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質。
２） 配列番号２記載のアミノ酸配列において，１若しくは複数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列より表わされ，且つ発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質。
３） 配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパクであって，発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質。
２）のタンパクは，１）のタンパクに発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を失わない程度の変異が導入されたタンパクである．このような変異は，自然界において生じるほかに，人為的な変異も含む．人為的変異を生じさせる手段としては，部位特異的変異誘導法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２）などを挙げることができるが，これに限定されるわけではない．変異したアミノ酸の数は，分泌、発光、蛍光活性及びエネルギー移動特性が失われない限り，その個数は制限されないが，通常は２０アミノ酸以内であり，好ましくは１５アミノ酸以内であり，更に好ましくは１０アミノ酸以内であり，最も好ましくは５アミノ酸以内である．変異を導入したタンパクが発光・蛍光活性を維持しているかは，そのタンパクの発光・蛍光活性を調べることによって判定できる．
３）のタンパクは，ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる分泌型発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有するモニター蛋白質である．３）のタンパクにおける「ストリンジェントな条件」とは，特異的なハイブリダイゼーションのみが起き，非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう．このような条件は，通常，「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度であり，好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度であり，更に好ましくは「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である．ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡと通常高い相同性を有する．高い相同性とは，６０％以上の相同性，好ましくは７５％以上の相同性，更に好ましくは９０％以上の相同性を指す．
本発明のタンパクは，後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み，適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる．発現ベクターとして，例えば，ｐＢＴ−ＶＬ−ｂ−ＹＦＰなどを用いることができ，宿主細胞としては大腸菌ＢＬ２１株などを用いることができる．
本発明の遺伝子は，以下１）−２）に示す遺伝子を包含する。
１） 配列番号１記載に塩基配列により表わされる遺伝子。
２） 配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするＤＮＡ配列。
上記のＤＮＡがコードするタンパクは，ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる分泌型発光酵素活性、蛍光蛋白質活性及びエネルギー移動活性を有する蛋白質である。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは，特異的なハイブリダイゼーションのみが起き，非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は，通常，「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度であり，好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度であり，更に好ましくは「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは配列番号１または２記載の塩基配列により表わされるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは，６０％以上の相同性，好ましくは７５％以上の相同性，更に好ましくは９０％以上の相同性、特に９５％以上の相同性を指す。
本発明のタンパクは，後述する本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み，適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる。発現ベクターとして，例えば，ｐＢＴ−ＶＬ−ｍｐ−ＹＦＰ（ＶＬはウミボタル・ルシフェラーゼ、ｍｐはモニターペプチド、ＹＦＰは黄色蛍光蛋白質をそれぞれ示す）などを用いることができ，宿主細胞としては哺乳動物細胞、酵母などの真核生物細胞、大腸菌、枯草菌、藻類、真菌類などの原核生物細胞が挙げられ、そのいずれを用いてもよい。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物培養細胞ＣＯＳ７細胞株（この系では哺乳類系のタンパク合成、タンパク修飾過程を経ることが重要であり、つまり、この過程をモニタリングする）などを用いることができる。
本発明の好ましいキメラタンパク質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）は，
１） 配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子．
２） 配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する遺伝子
である。
（スクリーニング方法Ｉ）
本発明のモニター蛋白質、ＤＮＡ配列又は発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価する。
該方法により、細胞のプロセッシング能を定量的に評価することが可能になる。
（スクリーニング方法ＩＩ）
被験蛋白質と本発明のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定することで、被験蛋白質のプロセッシング能を定量的に測定する。
該方法において、通常モニター蛋白質は複数用意し、被験蛋白質がどのモニター蛋白質のエネルギー移動特性を変化させるかを測定することにより、被験蛋白質がどのようなプロセッシング酵素であるのか、どのプロセッシング酵素の活性が強いのかなどを定量的に測定することができる。
（スクリーニング方法ＩＩＩ）
被験蛋白質と本発明のモニター蛋白質とを反応させる工程；被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程を行うことにより、新たなプロセッシング酵素をスクリーニングすることができる。
（スクリーニング方法ＩＶ）
細胞フリーの系でプロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに本発明のモニター蛋白質とを接触させる工程；被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む。
該方法により、細胞内への移行性などの要因を考慮することなく、プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
プロセッシング（酵素活性）を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、本発明のモニター蛋白質、該モニター蛋白質をコードするＤＮＡ配列、および該ＤＮＡ配列を含む発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程；被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む。
該方法により、経口投与等により血液中に移行させることにより薬効を発揮する化合物をスクリーニングすることができる。
本発明は，新規のプロセッシングを定量化できるモニター蛋白質及びそれをコードする遺伝子，本酵素の発現を制御する遺伝子を提供する．本モニタータンパク質を使用することで、細胞を破壊することなく細胞内で起きるプロセッシング過程を可視化できる。これらは病態の治療，検査及び新薬開発に利用が可能である．
次に，本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する．

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。

ノシスタテンとノシセプチンは同一のプレプロタンパク質よりプロセッシング過程で、切断酵素により切り出されるホルモンペプチドであり、生体内で痛みが伝わった場合、相反する効果を制御することが知られている。発光・蛍光タンパク質間でエネルギー移動可能な分泌型キメラタンパク質の挿入部位にプロセッシングされるノシスタチン（図中でＮＳＴと標記）、ノシセプチン（図中でＮｏｃと標記）ペプチド配列（図１（Ａ））を挿入したモニタータンパク質を、併せて、切断認識に必須、且つ切断されるＬｙｓ−ＡｒｇをＧｌｙ−Ｇｌｙ（図１（Ｂ））に変異させたペプチド配列に、及び欠損させたペプチド配列（図１（Ｃ））にしたモニタータンパク質を作成した。それぞれをＶｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ、ｍｕｔ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ及びｄｅｌ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰとした。作成法として、モニタータンパク質の挿入制限酵素部位であるＢａｍＨＩ部位を切断後、図２に示したＤＮＡ配列を化学合成したものをリガーゼ反応により結合させた。挿入されたことはＤＮＡ配列によって確認した。

神経細胞由来ＮＧ１０８−１５に３つのモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ、ｍｕｔ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ及びｄｅｌ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰを含む遺伝子ベクターを、市販の導入試薬を用いて導入した。培養液中に分泌されたタンパク質をウエスタンブロット法により解析した（図３）。コントロールとして挿入配列を持たないＶｌｕｃ−ＥＹＦＰを用いた。抗ウミボタルルシフェラーゼ抗体（ａｎｔｉ−Ｖｌｕｃ）はモニタータンパク質のＮ末端側の発光酵素を認識できる抗体であり、４つのモニタータンパク質ともに９５ｋＤａの分子量である。また、抗緑色蛍光タンパク質抗体（ａｎｔｉ−ＧＦＰ）はモニタータンパク質のＣ末端側の蛍光タンパク質を認識できる抗体であり、４つのモニタータンパク質ともにメインタンパク質として９５ｋＤａの分子量を示している。しかしながらＶｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰのモニタータンパク質では、９５ｋＤａに比べてわずかではあるが２７ｋＤａにバンドが確認できた。神経細胞由来ＮＧ１０８−１５にはプロセッシング酵素が発現しており、このバンドはモニタータンパク質が切断を受け、切断された後のＣ末端側のＥＹＦＰを認識したものである。また、変異及び欠損を加えた２つのｍｕｔ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ、ｄｅｌ−Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰではこの２７ｋＤａバンドは検出できず、プロセッシング酵素は挿入されたアミノ酸配列を厳密に認識できることが明らかとなった。但し、ａｎｔｉ−ＧＦＰ抗体で認識できる６８ｋＤａのバンドは人為的なものと思われる。さらに、Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰのモニタータンパク質で起きる切断が、インシュリンやエンケファリンなどを切断、産生する代表的なプロセッシング酵素であるＰＣ１やＰＣ２のどちらの作用によるのかを明らかにするため、ＰＣ１とＰＣ２をモニタータンパク質に導入した細胞に強制発現させた。その結果、ＰＣ１では２７ｋＤａバンドが９５ｋＤａバンドに比べて著しく増加するが、ＰＣ２ではほとんど変化しないことが明らかとなった。この結果、ノシスタチン・ノシセプチン（ＮＳＴ／Ｎｏｃ）間で起きるプロセッシングがＰＣ１によることを世界で始めて明らかにした。

神経細胞由来ＮＧ１０８−１５にモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ及びＶｌｕｃを含む遺伝子ベクターを、市販の導入試薬を用いて導入した。併せてモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰを発現する細胞にプロセッシング酵素ＰＣ１或いはＰＣ２を強制発現させた。この４種類の細胞より分泌された培養液の発光スペクトルを測定した（図４）。モニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰではＶｌｕｃ単独の発光スペクトルと一致する４６０ｎｍの他にモニタータンパク質内で起きるエネルギー移動に起因した５２５ｎｍのピークが観測できる。このモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰにプロセッシング酵素ＰＣ１或いはＰＣ２を発現させた細胞の培養液ではＰＣ２を加えた場合は変化しないが、ＰＣ１を発現させた場合、５２５ｎｍのピークが減少する。これはウエスタンブロット法の結果から明らかなようにプロセッシング酵素ＰＣ１がモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰを切断し、モニタータンパク質内のエネルギー移動が起きなくなったことを表わしている。つまり培養液の発光スペクトルを測定することで、生きた細胞内で起きているプロセッシングの程度を、細胞を破壊することなく評価できる。

神経細胞由来ＮＧ１０８−１５に導入したモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰの切断効率を、ウエスタンブロット法により検出し画像解析より非切断タンパク質量を定量化した（図５Ｂ）。また、モニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰとＶｌｕ単独の発光スペクトルを比較した差スペクトルを求め（図４のスペクトルの内図）、スペクトルの面積をエネルギー移動効果（ＢＲＥＴシグナル）として評価した（図５Ａ）。モニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰ及びモニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰにＰＣ２を導入した場合、非切断タンパク質量とＢＲＥＴシグナル共に切断が起きていないことを、一方、モニタータンパク質Ｖｌｕｃ−ＮＳＴ／Ｎｏｃ−ＥＹＦＰにＰＣ１を導入した場合、モニタータンパク質がおよそ６０％切断されていることを、非切断タンパク質量とＢＲＥＴシグナル共に示している。これは、細胞内で起きているプロセッシングの効率を直接電気泳動のような方法で定量しなくても、培養液の発光スペクトルを測定することで、瞬時に評価できることが明らかとなった。

【配列表】

Claims (21)

1. プロセッシングを受けるアミノ酸残基又はアミノ酸残基配列を含む１以上のプロセッシング切断領域と、プロセッシングを受けることによりエネルギー移動特性変化を示す１以上の特性可変領域とを含む、蛋白質のプロセッシングを測定可能なモニター蛋白質。
2. 特性可変領域が発光蛋白質と蛍光蛋白質を含む、請求項１に記載のモニター蛋白質。
3. モニター蛋白質が分泌タンパク質である請求項１に記載のモニター蛋白質。
4. プロセッシング切断領域を切断するプロセッシング酵素が、ＰＣ１、ＰＣ２、フリン、プロテアソーム、カテプシンおよびトロンビンからなる群から選ばれるいずれかである請求項１に記載のモニター蛋白質。
5. プロセッシング酵素がＰＣ１である請求項４に記載のモニター蛋白質。
6. プロセッシング切断領域が、特性可変領域を構成する発光蛋白質と蛍光蛋白質の間に位置する、請求項１に記載のモニター蛋白質。
7. 発光蛋白質が、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキ）、発光性渦鞭毛藻、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケおよびオワンクラゲ（エクオリン）からなる群から選ばれるいずれかに由来のルシフェラーゼである、請求項１に記載のモニター蛋白質。
8. 蛍光蛋白質が、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ），黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ），青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、ＤｓＲＥＤおよび赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）からなる群から選ばれるいずれかに由来の蛋白質である、請求項１に記載のモニター蛋白質。
9. 特性可変領域の発光蛋白質が、分泌型ウミボタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）発光酵素であり、特性可変領域の蛍光蛋白質が、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来変異体の黄色蛍光タンパクとからなることを特徴とする、請求項２に記載のモニター蛋白質。
10. プロセッシング切断領域が、プロセッシング酵素による切断点を含む６〜１００個のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のモニター蛋白質。
11. 以下のａ）およびｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項１に記載のモニタータンパク質：
    ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列によって表わされるモニタータンパク質；
    ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において，１または複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているモニター蛋白質．
12. プロセッシング切断領域がＳＥＱＫＱＬＱＫＲＦＧＧＦＴＧＧである、請求項１に記載のモニター蛋白質。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質をコードするＤＮＡ。
14. 以下ｃ）−ｄ）のいずれかのＤＮＡ配列を有する請求項１３に記載のＤＮＡ。
    ｃ）配列番号１記載に塩基配列により表わされるＤＮＡ；
    ｄ）配列番号１記載の塩基配列により表わされるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発光蛋白質と蛍光蛋白質の間のエネルギー移動特性と、プロセッシング切断領域におけるプロセッシング酵素による切断活性が保持されているＤＮＡ。
15. 請求項１３に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
16. 請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質、請求項１３〜１４に記載のＤＮＡ、および請求項１５に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入し、モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を定量的に評価することを特徴とする、該細胞のプロセッシング能を測定する方法。
17. 前記細胞がヒト由来の細胞である請求項１６に記載の方法。
18. 被験蛋白質と請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質と反応させ、該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のプロセッシング能を測定する方法。
19. プロセッシング酵素をスクリーニングする方法であって、被験蛋白質と請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させる工程；被験蛋白質との反応の前後における該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法。
20. プロセッシングを促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、被験試料とプロセッシング酵素並びに請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質とを接触させる工程；被験試料の接触の前後での該モニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。
21. プロセッシング（酵素活性）を促進或いは抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１〜１２のいずれかに記載のモニター蛋白質、請求項１３〜１４に記載のＤＮＡ配列、および請求項１５に記載の発現ベクターのいずれかが導入された細胞を調製する工程；被験試料の存在下及び非存在下で、該細胞で発現されたモニター蛋白質のエネルギー移動特性変化を測定して、該特性変化を促進または抑制する試料を選択する工程、を含む方法。

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