TWI412589B

TWI412589B - 突變藍色螢光蛋白及其用於螢光共振能量傳遞與藍色螢光魚之方法

Info

Publication number: TWI412589B
Application number: TW098140179A
Authority: TW
Inventors: Ming Chung Chang
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2013-10-21
Also published as: TW201118169A

Description

突變藍色螢光蛋白及其用於螢光共振能量傳遞與藍色螢光魚之方法

本發明是關於分子與細胞生物學領域，特別是有關於一種可存在於好氧或厭氧系統中之突變藍色螢光蛋白，以及其用於螢光共振能量傳遞(FRET)與藍色螢光魚之方法。

螢光蛋白已成為細胞生物學中非常寶貴的工具，例如取自維多利亞水母(Aequorea victoria)之綠色螢光蛋白(GFPs)或類似綠色螢光蛋白。在過去幾年中，已增加具有不同螢光光譜、經改善之褶皺(folding)性質、較大的亮度及經改變之酸鹼值敏感度之綠色螢光蛋白變體(Tsien,1998；Chudakov et al.,2005)，而這些綠色螢光蛋白變體廣泛用於生物化學、分子及細胞生物學、醫學診斷及藥物篩選方法學等領域。

當綠色螢光蛋白系蛋白質用於作為報導分子(reporter molecules)時，則在發射螢光前新合成綠色螢光蛋白系聚胜肽需經適當的成熟(mature)。成熟包括兩步驟：首先，蛋白質褶皺成近似天然構形，然後再藉由氧化而將內三胜肽(internal tripeptide)環化。因此，哺乳細胞內之綠色螢光蛋白系蛋白質的本身亮度係由其在37℃下之表現、有效的褶皺及成熟程度所決定。另一影響生物體內綠色螢光蛋白系蛋白質亮度的因素係為其需要氧氣作為螢光形成的輔助因子(cofactor)。事實上，所有綠色螢光蛋白系在嚴厲的缺氧情況下(<0.75μM O₂)均會失去它們的發光性(Hansen et al.,2001)。然而，如本案發明人之前的報告所述(Chang et al.,2004(vol.322)；Chang et al.,2004(vol.319))，取自創傷弧菌(Vibrio vulnificus)之BfgV野生型藍色螢光蛋白係透過放大與其鍵結之NADPH本身螢光而發螢光。因NADPH為大部分不管好氧或厭氧的生物體內常見的輔助因子，所以BfgV野生型藍色螢光蛋白與其改質變體BFPvv D7理論上可在好氧活細胞或厭氧活細胞(例如癌細胞)中發螢光。因此，具經改善之褶皺性質及較大亮度的BfgV野生型藍色螢光蛋白變體在多色螢光實驗中相當有價值，其可允許於氧氣存在或缺氧下均可進行體內標記或偵測。

一種可於體外或體內測定中監測蛋白質間的交互作用之技術係以螢光共振能量傳遞(FRET)為基礎。此過程中，當施體發射光譜與受體吸收光譜顯著重疊達相當大的百分比(30%)，且二發光團(phuorophore)相當靠近(10 nm以內)時，能量將從一發光團(施體)傳送至另一發光團(受體)。橫跨可見光譜之不同發射波長的螢光蛋白可提供各種用於FRET之適當的施體-受體對。

已有各種FRET檢測方法用於顯現蛋白質間的交互作用。近來，已有報導一種3-FRET法，係可測量具有三個施體-受體對(例如藍色螢光蛋白與綠色螢光蛋白耦合、氰色螢光蛋白(CFP)與黃色螢光蛋白(YFP)耦合、及綠色螢光蛋白與紅色螢光蛋白(RFP)耦合)之系統內的 FRET訊號，以及一種多FRET(multiple-FRET)，係使用二可獨立激發FRET對成像。在450nm左右具有螢光且明亮與具相當光穩定之螢光蛋白，其在多色螢光實驗將相當具有價值。目前所報導的螢光蛋白中，藉由取代野生型藍色螢光蛋白之酪氨酸66而發展出分別在380及446nm具有最大激發與最大發射之藍色螢光蛋白(GFP)，因其於多色成像(multicolor imaging)中預期可與最常使用之增強綠色螢光蛋白(enhanced GFPs,EGFPs)適度地配對，而特別受到興趣。然而，藍色螢光蛋白在體外與體內中為發暗螢光的。雖然已有一些增強藍色螢光蛋白(EBFPs)藉由引入數個突變到藍色螢光蛋白中而開發出，但目前增強藍色螢光蛋白仍很少被使用，因其仍具有不良的低螢光量子產率(QY)，因而具有較差的螢光，且維持相當敏感的光褪色(Kremers et al.,2007)。因此，進一步改善增強藍色螢光蛋白的亮度(亦即，具相當高量子產率)及光穩定度為所期望的。近來，已報導一種Sirius群青(ultramarine)螢光蛋白係具有較好的光穩定度與酸鹼值敏感度。因Sirius群青螢光蛋白在424nm具有一發射峰，所以其可與增強藍色螢光蛋白適用於二色成像(Tomosugi et al.,2009)。

此外，大部分新發現的野生型螢光蛋白均具有一主要缺點，即它們均屬於二聚體(dimeric)。蛋白質通常係以同型二聚體(homodimer)存在，然而當一已知螢光蛋白以多於一種型式表現於單一細胞中或體外混合，且如果不同螢光蛋白之二聚體形成界面為互補，則會形成異型二聚體(heterodimer)。當螢光蛋白用於表現以與另一感興趣的蛋白質融合或當其應用於FRET，則異型二聚體形成為非所期望的。然而，很多野生型螢光蛋白可以被改變基因結構而設計成單體或串列二聚體，其接著可進一步經歷最佳化。

至今，仍未揭示在高溫條件(例如37℃)下且在厭氧環境中，仍具有高螢光量子產率(QY)、增強的螢光及緩慢的光褪色之藍色螢光蛋白突變。這些突變可提供顯著且有意義的優點，包括可在原核系統，特別是生理溫度為37℃且有些為厭氧之真核系統中用來作為細胞標記或蛋白質標籤，且亦可適當地應用於FRET。

因此，本發明之一目的就是在提供一種新型突變藍色螢光蛋白(BFP)，其在高溫條件且厭氧環境中，具有包括較高螢光量子產率(QY)、較強螢光強度及不易光褪色等經改善之螢光性質。

本發明所提供之突變藍色螢光蛋白與如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白比較，係顯示具有較大之螢光強度。BFPvv D7藍色螢光蛋白係由取自創傷弧菌且具有如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白衍生出，其中突變藍色螢光蛋白對應於如SEQ ID NO：2所示序列之一組突變位置包括位置176或位置178。在一較佳實施例中，突變藍色螢光蛋白之突變係為S176R或V178I取代，其中其螢光強度係為如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白之螢光強度的1.2-4倍，且具有一激發峰位於352nm及一發射峰位於440nm之發光光譜。本發明之突變藍色螢光蛋白更顯示在好氧或缺氧系統中均具有極度穩定地發光強度，且在例如20℃低溫或例如37℃高溫下均能穩定的發螢光。

此外，本發明亦提供一種核酸，其包括把如上述之突變藍色螢光蛋白編碼之一序列。選擇性地，此核酸可機能性地與如啟動子之表現式連接，及/或整合至一載體。此編碼突變藍色螢光蛋白之核酸可用於轉化或轉染宿主細胞，例如細菌、植物或動物細胞，而此經轉化或轉染之宿主細胞亦為本發明揭示之一。

本發明亦提供將藍色螢光蛋白用於螢光共振能量傳遞(FRET)之方法，包括使用上述所提之突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白作為螢光團。在一較佳實施例中，上述所提之突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白可用於作為施體螢光團，與作為受體螢光團之多個綠色螢光蛋白(GFP)變體之其中之一耦合。

此外，本發明更提供將藍色螢光蛋白用於生產藍色螢光魚之方法，包括藉由基因轉殖技術，使用上述所提之突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白作為螢光團。

簡言之，依本發明之突變藍色螢光蛋白及其用於螢光共振能量傳遞與藍色螢光魚之方法，其可具有一或多個下述優點：

(1)本發明之突變藍色螢光蛋白可有利於各種不同生物學應用，包括螢光活化細胞分類(FACS)篩選法，其可用於研究不同媒介成分，例如促動子、抑制子，且可用於開發經改良之監測方法及/或改善基因表現，以及用於探討特定蛋白質的組織專一性。

(2)本發明之突變藍色螢光蛋白之亮度與光穩定性均有改善，因此可適合應用於FRET，特別是具有單波長激發之多FRET(multiple-FRET)。FRET為一種可偵測蛋白質間交互作用、酵素活性及細胞內環境的小分子之具很大效力的方法，因而可報導活細胞內之生化現象。此外，本發明亦適用於生產藍色螢光魚。

(3)本發明之突變藍色螢光蛋白具有形成單體(monomer)的傾向，因此可顯著的減少與蛋白質的接觸面積，因而可大大提升偵測感興趣的蛋白質之精確度。

(4)本發明之突變藍色螢光蛋白即使在厭氧條件下仍不會失去它的發光性。不同於類似綠色螢光蛋白，與NADPH相關之突變藍色螢光蛋白將透過NADPH作為發色團(chromophore)而發光。更簡單來說，本發明之突變藍色螢光蛋白並不需要經過仰賴氧之成熟過程。此外，藉由紫外光激發(352 nm)可使突變藍色螢光蛋白在無氧之體內發出可見藍光(440 nm)。

(5)已有報導指出利用厭氧菌作為腫瘤標的標記。本發明之突變藍色螢光蛋白在此些腫瘤標的厭氧菌內之表現可顯示腫瘤位置，因此其有相當大潛力貢獻於癌症研究與治療。

(6)本發明之突變藍色螢光蛋白可應用於雙分子螢光互補作用(BiFC)測定。BiFC測定的基本原理為將取自本發明之分裂突變藍色螢光蛋白的二非螢光片段摻混至二交互作用之配偶體。其一旦完成，二蛋白質會相互作用，此交互作用可使二非螢光片段彼此相當靠近，而重組成一完整螢光蛋白分子，而此螢光訊號將可顯示此二感興趣的蛋白質之交互作用。

(7)本發明之突變藍色螢光蛋白可應用於雙分子螢光互補作用-螢光共振能量傳遞(BiFC-FRET)測定。BiFC-FRET測定的基本原理為結合BiFC與FRET二者之測定，以具體化活細胞內之三元錯合物。BiFC-FRET測定中，將二蛋白質(A與B)摻混於取自綠色螢光蛋白之二非螢光片段，而第三蛋白質(C)則與本發明之全長突變藍色螢光蛋白混合。接著，蛋白質A與B間更交互作用重排為完整的綠色螢光蛋白，而可作為FRET受體。當蛋白質C與蛋白質A或B或二者作用，此交互作用可使突變藍色螢光蛋白(FRET施體)靠近重組之綠色螢光蛋白，而使FRET發生。因此，BiFC-FRET測定可提供形成三元錯合物的證據。

本發明之其他方面將部分闡明於其後之詳細說明中，或透過其教示而被部分適當的認定或藉由本發明所揭示之實施例而理解。本發明之各方面可由後附之申請專利範圍中所特別指出之成分或組合而理解與實現。值得注意的是，本發明之上述發明內容與下述詳細說明僅為舉例性，而非用於限制本發明之範疇。

本說明書中所指”突變藍色螢光蛋白(BFP)”一詞，係指其係為由取自創傷弧菌且具有如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白衍生出之如SEQ ID NO：2所示序列之一BFPvv D7的升級。

突變藍色螢光蛋白的構築：本發明所提供之突變藍色螢光蛋白，係使用如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白作為模板(parents)，並藉由易錯聚合酶鏈鎖反應或DNA重組法進行突變所得。其突變方法如下所述：細菌菌株及生長培養基：本發明係以大腸桿菌BL21(DE3)(供應商：Stratagene，加州，美國)作為負責基因表現與篩選工作之宿主，且使用Luria-Bertani(LB)液態培養基或LB瓊脂培養。視需要可添加100μg/ml氨比西林於培養基中。異丙基硫化半乳醣苷(IPTG)可作為誘導劑，且在液態培養基之濃度1mM，而在瓊脂盤中之濃度則為0.1mM。所使用的所有培養基成分均購買自供應商Difco(密西根州，美國)，而使用之化合物則來自供應商Sigma(密蘇里州，美國)。

質體的構築：將包含如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白之完整720個鹼基對之開啟讀碼框(ORF)，以及31個鹼基對之上游非編碼序列嵌入pET21b載體(供應商：Novagen，威斯康辛州，美國)。此重組質體稱為pFP21。此pFP21中之BFPvv D7藍色螢光蛋白經其進化之突變藍色螢光蛋白取代後，係以pmBFP21命名。包含野生型綠色螢光蛋白基因且可於大腸桿菌內表現之質體pGFP(供應商：Clontech，加州，美國)，則用於與pmBFP21比較其螢光形成。p19mBFP質體構造除綠色螢光蛋白已由藍色螢光蛋白取代外，其他部分都與pGFP質體相同。

隨機突變技術：使用易錯聚合酶鏈鎖反應對整個BfgV野生型藍色螢光蛋白基因執行隨機突變。使用之100μl反應混合物包括50mM Tris(pH 8.3)、6.6mM氯化鎂(MgCl₂)、50mM氯化鉀(KCl)、0.5mM氯化錳(MnCl₂)、200μM dNTP混合物、每一寡核苷酸引子濃度為50pmol、20ng DNA模板、及3U Taq DNA聚合酶(供應商：Promega，威斯康辛州，美國)，並設計EP-F1(DNA序列：5’-CTA CGC ATC TAG AAG CCA AAA CGG C-3’)及EP-R1(DNA序列：5’-GTG ATA AGC TCG AGC GGT TAT GG-3’)二引子以用於聚合酵素鏈鎖反應(PCR)。執行熱循環時之條件如下述：於94℃下30秒條件下循環一次，且依序在94℃下30秒、60℃下15秒及72℃下40秒之條件下循環30次，接著在72℃下10分鐘條件下循環一次。藉由瓊脂醣凝膠萃取套組(QIAquick Gel Extraction Kit，供應商：QIAGEN，希爾敦，德國)純化PCR產物，並將此產物遷入pET21b載體。然後將此些重組質體轉化至BL21(DE3)，以變成一突變藍色螢光蛋白資料庫。

DNA重組法：利用標準PCR放大後選質體內全部751個鹼基對插入物，並將每一酵素鏈鎖反應產物等量混合。將約400ng之上述混合物溶於18μl之10mM Tris緩衝液(pH 7.5)中，再加入2μl之10倍去氧核醣核酸酶I(DNase I)分解緩衝液(500mM Tris-鹽酸，pH 7.5，10 mM氯化錳，供應商：Sigma)分解此DNA混合物15-30分鐘。從2%瓊脂醣凝膠純化得約50個鹼基對之DNA片段，再將其加入50μl PCR混合物(10mM Tris-鹽酸(pH 9.0、0.2mM dNTP、1.5mM氯化鎂、50mM氯化鉀、0.1% Triton X-100、及1.5U Taq DNA聚合酶)中。於下述條件下完成無引子之PCR反應：於94℃下40秒條件下循環一次，且依序在94℃下20秒、50℃下10秒及72℃下10秒之條件下循環35次，接著在72℃下5分鐘條件下循環一次。將此PCR產物適當稀釋後，於EP-F1及EP-R1二引子存在下額外進行40次PCR循環。將此些重組片段克隆(clone)回用於篩選之pET21b載體中。

突變篩選法：將經轉化之BL21(DE3)細胞培養於 37℃下之LBAI瓊脂(包含50 μg/ml氨比西林及0.1mM IPTG之LB瓊脂)上16小時，之候再使用ImageMaster VDS系統(供應商：Amersham-Pharmacia，NT，香港)之長波長紫外光照射。將具有比上一輪具有更亮螢光之菌落挑選出以做進一步的確認。將所有挑選得之候選者置於液體培養基以進行螢光指數(FI)測定。簡言之，每一轉殖株係先接種(inoculate)於20ml LBA液態培養基，並於37℃下以200rpm振盪培養16小時。然後，將此培養隔夜培養物取0.5ml接種於50ml LB液態培養基中培養1.5小時。加入IPTG以誘導蛋白質合成，將此培養液再培養1.5小時。最後，收集細胞並使用冰冷的50nM磷酸鹽緩衝液(pH 7.5)清洗三次。每一經稀釋之細胞懸浮液取2毫升，以利用Perkin-Elmer LS50B螢光光譜儀於激發波長352nm且放射波長440nm下進行螢光測定。以每一樣品之吸收值600(O.D.₆₀₀)正規化之螢光強度係標明為螢光指數(FI)。

螢光光譜之測定：經轉化之大腸桿菌之培養與收集方法，除了在開始即於50ml培養液中加入IPTG外，其他均與上述突變篩選法一樣。測定大腸桿菌轉殖株之螢光光譜的方法係與本案發明人之前的文獻(Chang et al.，2004(vol.319))一樣。

請參閱第1圖，其係為先前技術之BfgV野生型藍色螢光蛋白與BFPvv D7藍色螢光蛋白和本發明之一較佳實施例之突變藍色螢光蛋白之相對螢光強度之直方圖。圖中，本發明之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之突變藍色螢光蛋白之螢光強度，係大於如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白之螢光強度，此BFPvv D7藍色螢光蛋白係由取自創傷弧菌且具有如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白衍生出。

突變藍色螢光蛋白之蛋白質合成及螢光形成：綠色螢光蛋白的螢光性係依賴一特定的發光團，且此結構的形成需仰賴氧的存在。然而，本發明之突變藍色螢光蛋白的螢光性則來自於與NADPH鍵結。為釐清體內之蛋白質合成及螢光形成之間是否有任何差異性，因此培養BL21(DE3)/pmBFP21及BL21(DE3)/pFFP21轉殖株以作為分析用。BL21(DE3)/pmBFP21及BL21(DE3)/pFFP21轉殖株係培養於LBA液態培養基，並於37℃下以200rpm振盪，並於特定時間點收集樣品。於每一樣品中取等量細胞進行SDS-PAGE電泳以分析蛋白質，亦測定每一樣品之相對螢光指數(FI)。突變藍色螢光蛋白所使用之激發與發射波長分別為352nm及440nm，而綠色螢光蛋白則分別為395nm及509nm。如第2圖所示，時間變化分析清楚顯示野生型綠色螢光蛋白的螢光性明顯落於綠色螢光蛋白合成之後，但本發明之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列且包括S176R與V178I突變之突變藍色螢光蛋白之蛋白質合成及螢光性顯露看來則是同步的。此突變藍色螢光蛋白的”同步”特性可能係因此蛋白質於細胞內一合成出，NADPH即與其鍵結。

突變藍色螢光蛋白於厭氧系統中之螢光性：請參閱第3圖，其係本發明之嵌有缺氧反應元件(6HRE)-hCMV基因片段之pGL3基本載體之示意圖。因此，嵌入pGL3基本載體之本發明之突變藍色螢光蛋白可於缺氧下表現於HeLa細胞中。如第4圖所示，其中第4A-1圖及第4A-2圖係為具有本發明之突變藍色螢光蛋白之HeLa細胞分別培養於常氧環境與缺氧環境下，而第4B-1圖及第4B-2圖則係為具有先前技術之野生型綠色螢光蛋白之HeLa細胞分別培養於常氧環境與缺氧環境下。由第4圖中可發現本發明之蛋白質在常氧環境(第4A-1圖)與缺氧環境(第4A-2圖)下均可發藍色螢光。然而，先前技術之野生型綠色螢光蛋白僅有在常氧環境(第4B-1圖)下有發綠色螢光，但在缺氧環境(第4B-2圖)下則不發螢光。

突變藍色螢光蛋白在原核細胞及真核細胞之螢光表現：本發明之突變藍色螢光蛋白可藉由該領域具有通常知識者所知之多種重組技術中之任一方法來編碼、表現及純化出，因此此處即不再詳細描述。較佳之生產方法將受到許多因素及考量而改變，針對已知情況之最理想生產程序對於該領域具有通常知識者來說，僅須透過最少量的實驗即可明顯得知。可將包括一編碼本發明之突變藍色螢光蛋白之序列的核酸引入包括原核細胞及真核細胞之各種宿主細胞中，例如細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或動物細胞，而將外來基因材料引入此宿主細胞的方法係為該領域具有通常知識者所通曉。提供編碼為本發明之突變藍色螢光蛋白之序列，且此些序列可包括所選宿主品種表現之密碼子”優先的(preferred)”之併入、限制性內切酶之切位點的提供、及/或另外的初始化DNA序列、末端DNA序列或中間DNA序列之提供，以促進快速表現載體之建構。如第5圖及第6圖所示，可發現本發明之突變藍色螢光蛋白無論在包括大腸桿菌(第5A-1圖，無紫外光激發；第5A-2圖，有紫外光激發)及創傷弧菌細胞(第5B-1圖，無紫外光激發；第5B-2圖，有紫外光激發)之原核細胞，或是在包括HEK293T細胞(第6A圖，無紫外光激發；第6B圖，有紫外光激發)之真核細胞中均可發螢光。

用於螢光共振能量傳遞(FRET)之藍色螢光蛋白：此外，可發現包括本發明之突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白之藍色螢光蛋白對於各種生物技術及生物醫學應用具有很大的潛力，例如螢光共振能量傳遞(FRET)。可表現FRET之螢光蛋白，對於其可測量螢光改變之分子級距離已經造成巨大的影響。事實上，應用FRET的方法已可測量很難取得之分子濃度，且其將結合交互作用與催化活性。藉由進一步觀察，可證實取自創傷弧菌之藍色螢光蛋白可十分成功地作為具有綠色螢光蛋白之FRET的施體，如第7圖所示之FRET方法之示意圖，其中與蛋白質Y鍵結之取自創傷弧菌之藍色螢光蛋白之一係作為施體螢光團，且耦合於與蛋白質X鍵結以作為施體螢光團之數個綠色螢光蛋白(GFP)變體之一。

本發明之一較佳實施例中，將藍色螢光蛋白用於FRET之方法包括使用如SEQ ID NO：3所示序列之突變藍色螢光蛋白作為施體螢光團，而一增強綠色螢光蛋白則作為受體螢光團。FRET法係為該領域具有通常知識者所熟知，因此在此僅作簡單描述。在此實施例中，係以pBAD/HisB載體作為表現載體。首先，利用XhoI/BglII限制性內切酶將突變藍色螢光蛋白克隆入pBAD/HisB載體中，再使用EcoRI/HindIII限制性內切酶將增強綠色螢光蛋白克隆入上述pBAD/HisB載體中，因而形成pBAD/HisB-突變藍色螢光蛋白-增強綠色螢光蛋白(pBAD/HisB-BFPvv-EGFP)表現載體。將此構築好之表現載體送入大腸桿菌中表現隔夜，然後抽取表現後菌液於突變藍色螢光蛋白之激發波長352nm下激發。

請參考第8圖及第9圖，其係分別為好氧FRET(突變藍色螢光蛋白與增強綠色螢光蛋白耦合)及厭氧FRET(突變藍色螢光蛋白與增強綠色螢光蛋白耦合)於352nm激發下之相對螢光強度對波長之曲線圖。此些圖中，均可發現當使用突變藍色螢光蛋白作為施體，則無論系統係為好氧或厭氧，於位於增強綠色螢光蛋白之發射波長509nm處均具有一峰(peak)。亦即，取自創傷弧菌之藍色螢光蛋白的確可成功地應用於FRET。如第10圖所示，可發現當使用紫外光激發，與增強綠色螢光蛋白耦合之突變藍色螢光蛋白均可放出綠光。然而，如果作為FRET之施體，此刻藍色螢光蛋白應為所有螢光蛋白中顯示最短的激發及發射波長。此外，本發明之將藍色螢光蛋白用於螢光共振能量傳遞之方法亦可適用於偵測凋亡細胞中之鈣離子濃度或硫胱氨酸蛋白脢-3(caspase)活性化。

用於藍色螢光魚之藍色螢光蛋白：目前，市面上已經存在綠色螢光魚及紅色螢光魚，但仍然沒有藍色螢光魚，因藍色螢光魚具有不合人意之低螢光量子產率(QY)且易於光褪色。然而，本發明取自創傷弧菌之藍色螢光蛋白係具有高量子產率且不易光褪色，可成供應用於生產藍色螢光魚。生產藍色螢光魚的方法係為該領域具有通常知識者所知，因此在此僅作簡單說明。本發明之此實施例中，係將包括突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之BfgV野生型藍色螢光蛋白之線性藍色螢光蛋白DNA注入斑馬魚(Danio rerio)受精卵的細胞質內，並藉由β肌動蛋白活化線性藍色螢光蛋白DNA，所獲得之藍色螢光魚如第11圖所示。

因此，突變藍色螢光蛋白系列將可提供研究者探討生命科學研究更強而有效的工具。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

參考文獻：

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Tomosugi et al., “An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity,” 6: 351-353 (2009).

Tsien, “The green fluorescent protein,” Annu. Rev. Biochem. 67:509-544 (1998).

藉由下述詳細說明，以及本發明不同實施例所附相關圖式，而使本發明之示範實施例能更完整易懂：第1圖係為先前技術之BfgV野生型藍色螢光蛋白與BFPvv D7藍色螢光蛋白和本發明之一較佳實施例之突變藍色螢光蛋白之相對螢光強度之直方圖；第2圖係為本發明之一較佳實施例之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之突變藍色螢光蛋白與先前技術之野生型綠色螢光蛋白，其體外蛋白質合成與螢光形成之動力曲線圖；第3圖係為本發明之一較佳實施例之嵌有缺氧反應元件(6HRE)-hCMV基因片段之pGL3基本載體之示意圖；第4圖係為本發明之一較佳實施例之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之突變藍色螢光蛋白及先前技術之野生型綠色螢光蛋白之螢光表現影像，其中第4A-1圖及第4A-2圖係為具有本發明之突變藍色螢光蛋白之HeLa細胞分別培養於常氧環境與缺氧環境下，而第4B-1圖及第4B-2圖則係為具有先前技術之野生型綠色螢光蛋白之HeLa細胞分別培養於常氧環境與缺氧環境下；第5圖係為本發明之一較佳實施例之大腸桿菌細胞及創傷弧菌細胞內之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之突變藍色螢光蛋白之螢光表現影像，其中第5A-1圖及第5A-2圖係為大腸桿菌分別在無紫外光下激發及有紫外光下激發，而第5B-1圖及第5B-2圖係為創傷弧菌細胞分別在無紫外光下激發及有紫外光下激發；第6圖係為本發明之一較佳實施例之HEK239T細胞內之具有如SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之突變藍色螢光蛋白之螢光表現影像；第7圖係為一FRET方法之示意圖，其中取自創傷弧菌之多種藍色螢光蛋白之一係作為施體螢光團，且與作為受體螢光團之多個綠色螢光蛋白(GFP)變體之一耦合；第8圖係為本發明之一較佳實施例之一好氧FRET(突變藍色螢光蛋白與增強綠色螢光蛋白耦合)於352nm激發下之相對螢光強度對波長之曲線圖；第9圖係為本發明之一較佳實施例之一厭氧FRET(突變藍色螢光蛋白與增強綠色螢光蛋白耦合)於352nm激發下之相對螢光強度對波長之曲線圖；第10圖係為本發明之一較佳實施例之與增強綠色螢光蛋白耦合的藍色螢光蛋白於紫外光激發下之螢光表現影像；以及第11圖係為本發明之一較佳實施例之Danio rerio藍色螢光魚之螢光表現影像。

<110> 國立成功大學

<120> 突變藍色螢光蛋白及其用於螢光共振能量傳遞與藍色螢光魚之方法

<140> 098140179

<141> 2009-11-16

<160> 3

<210> 1

<211> 239

<212> 蛋白質

<213> Vibrio vulnificus

<400> 1

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自Vibrio vulnificus衍生出之變體

<400> 2

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自Vibrio vulnificus衍生出之變體

<400> 3

Claims

一種突變藍色螢光蛋白(BFP)，該突變藍色螢光蛋白之一胺基酸序列係如SEQ ID NO：3所示之序列。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其在37℃下之螢光強度係為穩定的。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其具有形成一單體(monomer)的傾向。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其係透過與NADPH鍵結而發螢光，且放射螢光前無需經過一成熟(maturation)步驟。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其具有一激發峰位於352 nm且一發射峰位於440 nm之一發光光譜。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其螢光強度係至少為如SEQ ID NO：2所示序列之一BFPvv D7藍色螢光蛋白之螢光強度的1.5倍。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其係使用如SEQ ID NO：2所示序列之一BFPvv D7藍色螢光蛋白作為模板(parents)，並藉由一易錯聚合酶鏈鎖反應或一DNA重組法進行突變所得。
如申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白，其包括用於作為一原核細胞或一真核細胞中之一細胞標記或一蛋白質標籤。
一種核酸，其係由編碼申請專利範圍第1項所述之突變藍色螢光蛋白之一核苷酸序列所組成。
一宿主細胞，係經由如申請專利範圍第9項所述之核酸穩定轉化(transform)或轉染(transfect)。
如申請專利範圍第10項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞係表現該核酸所編碼之該突變藍色螢光蛋白。
如申請專利範圍第10項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞包括一原核細胞或一真核細胞。
一種將藍色螢光蛋白用於螢光共振能量傳遞(FRET)之方法，其包括使用如申請專利範圍第1項所述之該突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之一BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之一BfgV野生型藍色螢光蛋白作為一施體螢光團，一綠色螢光蛋白作為一受體螢光團，其中該突變藍色螢光蛋白之一激發峰為352 nm，且該突變藍色螢光蛋白之一發射峰為440 nm，進而於如申請專利範圍第1項所述之該突變藍色螢光蛋白、如SEQ ID NO：2所示序列之該BFPvv D7藍色螢光蛋白、或如SEQ ID NO：1所示序列之該BfgV野生型藍色螢光蛋白與該綠色螢光蛋白耦合時，激發該綠色螢光蛋白，並使該綠色螢光蛋白具有一發射峰為509 nm之一發光光譜。
如申請專利範圍第13項所述之將藍色螢光蛋白用於螢光共振能量傳遞之方法，其適用於偵測一凋亡細胞中之一鈣離子濃度或一硫胱氨酸蛋白脢-3活性化。
一種將藍色螢光蛋白用於生產藍色螢光魚之方法，其包括藉由一基因轉殖技術，將申請專利範圍第9項所述之核酸轉殖入一魚中，使該魚產生該藍色螢光魚。