KR20080003780A - 부위-특이적 세린 리콤비나제 및 그의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵생물 세포내에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 제1 재조합 부착 부위 및 제2 재조합 부착 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위를 진핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜 사기 재조합 부착 부위들 사이를 재조합시키는 단계를 포함하고, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위들 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부착 부위는 파지 게놈 재조합 부착 부위(attP) 또는 박테리아 게놈 재조합 부착 부위(attB)이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attP이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attB이다. 또한, 본 발명은 유전자이식 세포, 조직, 식물 및 동물을 생성하기 위한 조성물, 벡터 및 그의 이용 방법을 개시한다. 또한, 본 발명의 상기 조성물, 벡터 및 방법은 유전자 치료에 적용시 유용하다.

Description

부위-특이적 세린 리콤비나제 및 그의 이용 방법{SITE-SPECIFIC SERINE RECOMBINASES AND METHODS OF THERE USE}
본 발명은 고등 기술 프로그램인 국립 표준 기술 연구소에 의해 수여된 수여금 번호 70NANB1H3062의 정부 지원 하에 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 유전 공학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈 내로 부위-특이적으로 삽입(integration), 절단(exision), 역위(inversion), 교환(exchange) 및 전좌(translocation)시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 효소, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 벡터 구조체(construct)에 관한 것이다.
많은 박테이로파지 및 삽입된 플라스미드가 그들의 게놈을 숙주의 게놈 내로 안정적으로 포함시키고, 상기 숙주 게놈으로부터 그 게놈을 절단해 올 수 있는 부위-특이적 재조합 시스템을 코딩하고 있다. 이들 시스템에서, 상기 재조합 반응을 위한 최소 요구사항은 상기 재조합 반응을 촉매하는 리콤비나제(recombinase) 효소 및 두개의 재조합 부위이다(Sadowski (1986) J. Bacteriol. 165: 341-347; Sadowski (1993) FASEB J. 7: 760-767). 파지 삽입 시스템의 경우, 이들은 부착(att) 부위라고 불리며, attP 요소(element)는 파지 DNA 유래이고, attB 요소는 박테리아 게놈 내에 존재한다. 상기 2개의 부착 부위는 수 염기쌍 정도의 낮은 서열 동질성을 공유할 수 있다. 상기 리콤비나제 단백질은 양쪽 att 부위에 결합하고, DNA 사슬의 보존적이고 상호적인 교환을 촉매하여, 결과적으로 원형의 파지 또는 플라스미드 DNA를 숙주 DNA 내로 삽입시키게 된다. DNA 굽힘 단백질 IHF, 삽입 숙주 인자(factor)와 같은 다른 파지 또는 숙주 인자가 효율적인 반응을 위해 요구될 수 있다(Friedman (1988) Cell 55: 545-554; Finkel & Johnson (1992) Mol. Microbiol. 6: 3257-3265). 파지 인테그라제(integrase)는 또한 다른 숙주 및/또는 파지 인자와 연합하여 박테리오파지 성장 사이클의 용해 단계(lytic phase) 과정에서 파지 게놈을 박테리아 게놈으로부터 잘라낸다. 관심있는 특정한 유전자의 관련성 및 기능을 밝히기 위해 포유동물의 게놈을 조작할 수 있도록 하는 몇 가지 방법이 개발되어 있다. 이들 중, 유전자이식(transgenic) 마우스 품종(strain) 및 유전자-표적 기술의 개발은 특히 유용한 것으로 판명되어 있다(Brandon, E.P., Idzerda, R.L. and McKnight, G.S. (1995) Curr Biol, 5, 625-34; Brandon, E.P., Idezerda, RlL. and McKnight, G.S. (1995) Curr Biol, 5, 758-65). 이들 기술은 부위-특이적 리콤비나제의 특성화 및 적용에 따라 새로운 발전을 이루고 있다(Kilby, N.J., Snaith, M.R. and Murray, J.A. (1993) Trends Genet, 9, 413- 21).
부위-특이적 리콤비나제는 2가지 주된 패밀리(family)로 나누어질 수 있다. 첫 번째(Int 패밀리 또는 티로신 리콤비나제 패밀리)는 동일한 DNA 분자(분해, 결실, 또는 역위를 이끄는 분자내 재조합) 또는 별개의 DNA 분자(삽입을 이끄는 분자내 재조합)에 위치하는 부위들 사이의 재조합을 촉매하는 효소들을 포함한다(Sauer, B. (1993) Methods Enzymol, 225, 890-900; Dymecki, S.M. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6191-6; Abremski, K. and Hoess, R. (1984) J Biol Chem, 259, 1509-14; Nash, H.A. (1996) in Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology., ed. F.C. Neidhart, R.I. Curtis, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Rezaikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbager (A.S.M. Press, Washington D.C.), pp.2363-7). 후자의 특성은 특정한 서열을 정확한 위치 내로 표적 삽입시킬 수 있도록 이용되고 있다(Sauer, B. and Henderson, N. (1990) The New Biologist, 2, 441-9; Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7905-9). 포유동물 게놈을 조작하기 위한 리콤비나제는 주로 Cre 및 Flp 단백질이 사용되어 왔으며, 이들은 Int 패밀리에 속한다(Kilby, N.J., Snaith, M.R. and Murray, J.A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21). 이들 효소의 표적 서열은 Cre 효소에 대해서는 loxP 부위, Flp 효소에 대해서는 FRT로 불리며, 상기 단백질이 결합하는 짧은 역위 반복(short inverted repeat)으로 이루어져 있다. 재조합 과정은 게놈 내에서 먼 거리(70 kb까지)에 걸쳐 수행된다. 이들 효소를 이용함으로써, 몇몇 저자들은 설치류 모델에서 부위- 및 조직-특이적 DNA 재조합(DiSanto, J.P., Muller, W., Guy, G.D., Fischer, A. and Rajewsky, K. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92, 377-81; Gu, H., Marth, J.D., Orban, P.C., Mossmann, H. and Rajewsky, K. (1994) Science, 265, 103-6; Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. and Rajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9; Orban, P.C., Chui, D. and Marth, J.D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6861-5), 식물 및 동물에서의 염색체 전좌(Deursen, J.v., Fornerod, M., Rees, B.v. and Grosveld, G. (1995) Nucleic Acids Res, 23, 485-90; Osborne, B.I., Wirtz, U. and Baker, B. (1995) Plant J, 7, 687-701) 및 특정한 유전자의 표적화된 유도(Pichel, J.G., Lakso, M. and Westphal, H. (1993) Oncogene, 8, 3333-42)에 대해 보고하였다. 상기 Cre-loxP 시스템은 또한 간에서는 높은 효율로, 다른 조직에서는 낮은 정도로 유전자 제거를 유발하기 위해 사용된 인터페론 감마 유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터와 조합되어 사용되고 있다(Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. and Rajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9). 그러나, 상기 부위-특이적 재조합 시스템은 동일한 게놈 내에서 감소된 수의 재조합 사건만을 유도한다. 각각의 재조합 반응은 교차 부위에서 게놈 내에서 리콤비나제를 위한 표적 서열을 남기고, 리콤비나제(예를 들면, Cre 및 Flp)는 분자간 재조합을 촉매할 수 있기 때문에, 전체 과정은 원하지 않는 염색체 재배열을 초래할 수 있다.
리콤비나제의 두 번째 패밀리는 집합적으로 레졸바제(resolvase)/인버타제(invertase) 패밀리 또는 세린 패밀리로 불린다(Grindley, N.D.F. (1994) in Nucleic Acids and Molecular Biology, ed. F. Eckstein and D.M.J. Lilley (Springer-Verlag, Berlin), pp. 236-67, (Smith, M.C. and Thorpe, H.M. (2000) Mol. Microbiol., 44, 299-307). 분자내 및 분자간 반응을 촉매하는 효소를 포함하는 이들 표적-특이적 리콤비나제는 Int 패밀리의 리콤비나제에 대해 이점을 가질 수 있다. 파지 삽입을 촉매하는 세린 리콤비나제(인테그라제)는 유전공학 도구로 사용되기 위해 특히 잘 적응되어 있다. 지금까지, φC31, R4 및 TP901-1의 3가지 세린 리콤비나제가 포유동물 세포에서 연구되어 왔다(Groth, A.C. 및 Calos, M.P. (2004) J. Mol. Biol. 335, 667-678). 이들 리콤비나제는 자발적(autonomous)이고, 간단한 att 서열을 가지며, 포유동물 세포에서 기능을 하는 능력을 가진 것으로 관찰되었다. 상기 attP 또는 attB 이외 부위의 임의의 조합 간에는 어떠한 재조합도 관찰되지 않기 때문에, 상기 삽입은 단방향성이고, 삽입 빈도가 높다. 세린 리콤비나제는 Int 패밀리의 리콤비나제 일원(member)의 사용을 도입하는 종래 재조합 시스템에 대해 현저한 이점을 제공한다. 이들 효소는 무수한 적용분야를 갖는다. 한 방법은 att 부위를 생명체의 게놈 내로 위치시키고, 재조합을 위한 표적으로 사용하는 것이다.
본 발명자는 다양한 포유동물 세포 및 식물 세포내에서 강한 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 삽입시키거나 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈으로부터 잘라내는 능력을 갖는 신규한 세린 리콤비나제를 확인하였다.
발명의 요약
본 발명은 진핵생물 세포내에서 안정하고, 부위-특이적인 재조합을 얻기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 부위-특이적 재조합을 위한 종래에 기술된 방법과는 달리, 본 발명의 리콤비나제 및 그 이용 방법은 안정하고, 비가역적이며, 부위-특이적인 재조합을 제공한다.
본 발명의 조성물은 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위 사이의 부위-특이적 재조합을 매개하는 리콤비나제 폴리펩티드를 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 핵산은 상기 리콤비나제 폴리펩티드에 의해 인식되는 재조합 부위를 추가로 포함한다.
상기 방법은 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제2 재조합 부위는 상기 제1 재조합 부위와의 재조합을 위한 기질(substrate)로 작용할 수 있다. 상기 제1 및 제2 재조합 부위는 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉하여, 결과적으로 상기 재조합 부위들 사이가 재조합된다. 상기 재조합 부위 중 하나 또는 양쪽 모두는 상기 진핵생물 세포의 염색체 내에 존재할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 재조합 부위 중 하나는 염색체 내에 존재하고, 다른 하나는 상기 염색체 내로 삽입되는 핵산 내에 포함되어 있다.
또한, 본 발명은 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드 또는 원핵생물 리콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포를 제공한다. 이들 구현예에서, 상기 리콤비나제는 제1 재조합 부위 및 상기 제1 재조합 부위와의 재조합을 위한 기질로 작용할 수 있는 제2 재조합 부위 사이의 부위-특이적 재조합을 매개할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 파지, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 파지, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 파지, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 파지 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 파지로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 안정하게 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 진핵생물 세포를 얻기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 핵산을 제1 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 핵산은 관심있는 이식유전자 및 상기 제1 재조합 부위와의 재조합을 위한 기질로 작용할 수 있는 제2 재조합 부위를 포함한다. 상기 제1 및 제2 재조합 부위는 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉한다. 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 촉매하며, 결과적으로 상기 핵산이 상기 제1 재조합 부위에 삽입된다.
파지 리콤비나제가 살아있는 세포내에서 특이적이고 효율적으로 DNA 서열 사이의 재조합을 유도하는 능력은 이들이 다양한 유전공학 적용 분야에서 잠재적으로 유용성을 갖도록 한다. 이러한 적용 분야로는 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입, 절단, 역위, 전좌 및 카세트 교환을 포함한다.
바람직한 구현예의 개시
정의
본 명세서에서, 다수의 용어 및 약자가 사용된다. 하기 정의가 제공되며, 이들은 본 발명의 범위 및 실행(practice)을 이해하는데 도움이 될 것이다.
특정한 구현예에서, “약” 또는 “대략”이라는 용어는 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내 및 더욱 더 바람직하게는 1% 이내의 주어진 값 또는 범위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “리콤비나제”는 정의된 부위들 간의 부위-특이적 재조합을 촉진시킬 수 있는 효소의 군을 의미하며, 상기 부위는 단일한 DNA 분자 위에서 물리적으로 떨어져 있거나, 또는 상기 부위는 별개의 DNA 분자 위에 위치한다. 상기 정의된 재조합 부위의 DNA 서열은 반드시 필수적으로 동일하지는 않다. 재조합의 개시는 단백질-DNA 상호작용에 의존하며, 상기 군 내에는 파지의 삽입 및 절단(예를 들면, λ 인테그라제, φC31), 원형 플라스미드의 분리(예를 들면, Tn3, 감마 델타, Cre, Flp), 교호(alternate) 유전자의 발현을 위한 DNA 역위(예를 들면, Hin, Gln, Pin), 발달 과정에서의 유전자의 조립(assembly)(예를 들면, 아나배나(Anabaena) 질소 고정 유전자), 및 전위(transposition)(예를 들면, IS607 트랜스포존)를 촉매하는 많은 수의 단백질이 있다. 대부분의 부위-특이적 리콤비나제는 진화적 및 기계적 연관성에 기초하여 상기 두가지 패밀리 중 하나에 속한다. 이들은 λ 인테그라제 패밀리 또는 티로신 리콤비나제(예를 들면, Cre, Flp, Xer D) 및 레졸바제/인테그라제 패밀리 또는 세린 리콤비나제 패밀리(예를 들면, φC31, TP901-1, Tn3, 감마 델타)이다.
“재조합 부착 부위”는 본 명세서에 개시된 상기 리콤비나제에 의해 인식되는 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 두가지 다른 부위가 포함되는데(“상보적 부위”로 명명됨), 하나는 표적 핵산(예를 들면, 진핵생물 또는 원핵생물의 염색체 또는 에피솜(episome)) 내에 존재하고, 다른 하나는 표적 재조합 부위에서 삽입되는 핵산 위에 존재한다. 원래는 각각 박테리아 표적 및 파지 공여자(donor) 유래의 부착(또는 재조합) 부위를 나타내는 “attB” 및“attP”라는 용어가 본 명세서에서 사용된다. 그러나, 특정한 효소에 대한 재조합 부위가 다른 이름을 가질 수도 있다. 상기 재조합 부위는 전형적으로 코어(core) 또는 스페이서(spacer) 영역에 의해 떨어져 있는 왼쪽 및 오른쪽 암(arm)을 포함한다. 따라서, attB 재조합 부위는 BOB'으로 이루어지며, 이때 B 및 B'는 각각 왼쪽 및 오른쪽 암이고, O는 코어 영역이다. 유사하게, attP는 POP'이며, 이때 P 및 P'는 상기 암이고, O는 다시 상기 코어 영역이다. 상기 attB 및 attP 부위 사이의 재조합 및 표적에서의 핵산의 동시(concomitant) 삽입에 있어서, 상기 삽입된 DNA와 인접한 재조합 부위는 “attL” 및 “attR”로 나타낸다. 따라서, 상기 attL 및 attR 부위는, 상기의 용어법을 사용하면 각각 BOP' 및 POB'으로 이루어져 있다. 본 명세서의 어떤 설명에서, 상기 “O”는 생략되고, attB 및 attP는 각각 예를 들면 BB' 및 PP'로 나타낸다.
“실질적으로 없는”이란 용어는 조성물 내의 적어도 약 75 중량%의 단백질, DNA, 벡터(A 및 B가 속하는 종의 카테고리에 의존함)가 “A”일 때, “A”(이때, “A”는 단일한 단백질, DNA 분자, 벡터, 재조합 숙주 세포, 등)를 포함하는 조성물은 “B”(이때, “B”는 하나 이상의 오염 단백질, DNA 분자, 벡터, 등)가 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 바람직하게는, “A”는 상기 조성물 내의 A+B 종의 적어도 약 90 중량%를 포함하며, 가장 바람직하게는 적어도 약 99 중량%를 포함한다. 또한, 오염이 실질적으로 없는 조성물은 원하는 종의 활성 및 특성을 갖는 단일한 분자량의 종만을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적을 위한 “분리된(isolated)”이란 용어는 원래의 환경(자연 상태에서 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 나타낸다. 예를 들면, 식물 또는 동물 내에서 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이 아니지만, 자연 상태로 존재하는 인접한 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 “분리된” 것으로 간주된다. “정제된”이란 용어는 상기 물질이 다른 화합물의 존재를 배재하는 절대적으로 정제된 형태로 존재할 것을 요구하지는 않는다. 이것은 다소 상대적인 정의이다.
폴리뉴클레오티드는 적어도 1 오더(order)의 크기, 바람직하게는 2 또는 3 및 바람직하게는 4 또는 5 오더의 크기로 출발 물질 또는 자연형 물질이 정제된 후에는 “정제된” 상태에 있다.
“핵산”은 뉴클레오티드라고 불리는 공유적으로 결합된 하부단위(subunit)를 포함하는 고분자 화합물이다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 이들은 모두 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반-합성 DNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. DNA는 선형, 원형, 또는 수퍼코일(supercoil)형 일 수 있다.
“핵산 분자”는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 유리딘 또는 시티딘; “RNA 분자”), 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; “DNA 분자”)의 포스페이트 에스테르 고분자 형태이거나, 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 이들의 임의의 포스포에스테르 동족체를 나타내며, 단일 사슬 형태, 또는 이중-사슬 나선일 수 있다. 이중 사슬 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하며, 임의의 특정한 3차 형태로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 그 중에서도 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들면, 제한효소 절편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중-사슬 DNA를 포함한다. 특정한 이중-사슬 DNA 분자의 구조를 논의함에 있어서, 서열은 통상의 관습에 따라 전사되지 않는 DNA의 사슬(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 사슬)을 따라 5´에서 3´ 방향의 서열만으로 나타낼 수 있다. “재조합 DNA 분자”는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다.
“절편”이라는 용어는 참고(reference) 핵산에 비해 줄어든 길이를 가지며, 공통 부분에 걸쳐서 상기 참고 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 절편은 더 큰 폴리뉴클레오티드의 일부로 적절하게 포함될 수 있다. 이러한 절편은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1,000 또는 1,500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 다른 한편으로는 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “분리된 핵산 절편”은 선택적으로는 합성, 비-자연형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 단일- 또는 이중-사슬의 RNA 또는 DNA 고분자이다. DNA 고분자 형태의 분리된 핵산 절편은 하나 이상의 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 세그먼트(segment)를 포함할 수 있다.
“유전자”는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 조립을 의미하며, cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한, “유전자”는 코딩 서열을 선행하거나(5´비-코딩 서열) 뒤따르는(3´ 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함하는 특정한 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 절편을 나타낸다. “자연형 유전자”는 그 자신의 조절 서열을 가지며, 자연 상태에서 발견되는 유전자를 나타낸다. “키메라(chimera) 유전자”는 자연형 유전자가 아닌 임의의 유전자를 나타내며, 함께 자연 상태에서 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 유전자는 다른 공급원(source)으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연 상태에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 다른 공급원으로부터 유래된 코딩 서열 및/또는 다른 공급원으로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. “내인성(endogenous) 유전자”는 생명체의 게놈 내에 자연 상태로 위치하는 자연형 유전자를 나타낸다. “외래” 유전자 또는 “이형(heterologous)” 유전자는 숙주 생명체 내에서 정상적으로는 발견되지 않으며, 유전자 전달에 의해 상기 숙주 생명체 내로 도입된 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비-자연형 생명체 내로 삽입된 자연형 유전자 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. “이식유전자(transgene)”는 형질전환(transformation) 방법에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
“이형” DNA는 세포내, 또는 상기 세포의 염색체 부위에서 정상적으로는 존재하지 않는 DNA를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 이형 DNA는 상기 세포에 대해 외래인 유전자를 포함한다.
“게놈”이라는 용어는 염색체뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는, 상기 핵산 분자의 단일 사슬 형태가 적절한 온도 및 용액의 이온 세기 조건 하에서 다른 핵산 분자와 접합(anneal)할 수 있을 때, cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자와 “교잡가능하다”(Sambrook et al., 1989 infra 참조). 교잡 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며, 샘브룩 등(Sambrook, J., Fitsch, E.F. and Maniatis, T.)의 문헌에 예시되어 있다(Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히 제11장 및 표 11.1 (그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨)). 상기 온도 및 이온 세기 조건은 상기 교잡의 “스트린전시(stringency)”를 결정한다.
스트린전시 조건은 연관성이 먼 생명체 유래의 상동성 서열과 같은 보통의 유사한 절편, 또는 연관성이 밀접한 생명체 유래의 기능성 효소를 복제하는 유전자와 같은 매우 유사한 절편을 스크리닝(screening)하기 위해 조정될 수 있다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝의 경우, 55℃의 Tm에 해당하는 낮은 엄격성 교잡 조건은 예를 들면 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크(milk), 및 포름아미드 부재; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS에서 사용될 수 있다. 보통의 스트린전시 교잡 조건은 더 높은 Tm, 예를 들면 40% 포름아미드 및 5x 또는 6x SCC에 해당한다. 높은 스트린전시 교잡 조건은 가장 높은 Tm, 예를 들면 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 해당한다.
교잡은, 비록 교잡의 스트린전시에 따라 염기 사이의 불일치(mismatch)가 가능하기는 하지만, 상기 2개의 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다. “상보적”이란 용어는 서로 교잡할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들면, DNA에 있어서 아데노신은 티민과 상보적이고 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에서 개시되거나 또는 사용된 완전한 서열뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열에 상보적인 분리된 핵산 절편도 포함한다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 Tm이 55℃인 교잡 단계를 포함하고 전술한 조건을 이용하는 교잡 조건을 도입함으로써 검출된다. 바람직한 구현예에서, 상기 Tm은 60℃이다; 더욱 바람직한 구현예에서 상기 Tm은 63℃이다; 더욱 더 바람직한 구현예에서 상기 Tm은 65℃이다.
또한, 교잡 후 세척이 스트린전시 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 6X SSC, 0.5% SDS를 15분간으로 시작하여, 이후 45℃에서 2X SSC, 0.5% SDS를 30분간 반복하고, 이후 50℃에서 0.2X SSC, 0.5% SDS를 30분간 2회 반복하는 일련의 세척을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 스트린전시 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 이때 세척 조건은 0.2X SSC, 0.5% SDS를 30분간 세척하는 최종 2회의 온도가 60℃로 증가되는 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 다른 바람직한 세트의 높은 스트린전시 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS를 2회 최종 세척한다. 교잡은, 비록 교잡의 스트린전시에 따라 염기 사이의 불일치가 가능하기는 하지만, 상기 2개의 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다.
핵산의 교잡을 위한 적합한 스트린전시는 핵산의 길이 및 상보적인 정도에 의존하며, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 다양하다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 및 상동성 정도가 클수록 이들 서열을 갖는 핵산의 교잡을 위한 Tm 값은 커진다. 핵산 교잡의 상대적인 안정성(높은 Tm에 해당함)은 다음의 순서로 떨어진다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 이상인 교잡의 경우, Tm을 계산하기 위한 방정식이 유도되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 이용한 교잡의 경우, 불일치 위치가 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
본 발명의 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 이하의 염 및 적어도 37℃에서의 교잡 단계 및 2X SSPE, 적어도 63℃에서의 세척 단계를 포함하는 교잡 조건을 도입함으로써 검출된다. 바람직한 구현예에서, 상기 교잡 조건은 상기 교잡 단계에서 200 mM 이하의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 교잡 조건은 상기 교잡 및 세척 단계 모두에 대해 2X SSPE 및 63℃를 포함한다.
한 구현예에서, 교잡가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 바람직하게는 교잡가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드이다; 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드이다; 및 가장 바람직하게는 상기 길이는 약 30 뉴클레오티드이다. 아울러, 당업자는 상기 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브(probe)의 길이와 같은 인자에 따라 필요시 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
“프로브”란 용어는 상보적인 단일 사슬 표적 핵산과 염기쌍을 형성하여 이중-사슬 분자를 형성할 수 있는 단일-사슬 핵산 분자를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “올리고뉴클레오티드”라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자와 교잡할 수 있는 일반적으로 적어도 18 뉴클레오티드의 핵산을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 32P-뉴클레오티드 또는 바이오틴과 같은 표지(label)가 공유적으로 결합되어 있는 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(하나 또는 양쪽 모두 표지될 수 있음)는 핵산의 전장(full length) 또는 절편을 클로닝하거나, 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 나선을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 합성된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 본드 등과 같은 비-자연 발생적 포스포에스테르 동족체 결합으로 제조될 수 있다.
“프라이머”는 표적 핵산 서열과 교잡하여 적당한 조건 하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 이중 사슬 핵산 영역을 생성하기 위해 표적 핵산 서열과 교잡하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 프라이머는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에서 사용될 수 있다.
“중합효소 연쇄 반응”은 PCR로 약칭되며, 특정한 핵산 서열을 효소적으로 증폭하기 위한 시험관내 방법을 의미한다. PCR은 반복되는 일련의 온도 사이클을 포함하며, 각 사이클은 3가지 단계를 포함한다: 표적 분자의 사슬을 분리하기 위한 주형 핵산의 변성, 단일 사슬 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 주형 핵산의 어닐링, 및 DNA 중합효소에 의한 상기 어닐링된 프라이머(들)의 연장. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀(pool) 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
“역전사-중합효소 연쇄 반응”은 RT-PCR로 약칭되고, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 생산하기 위한 시험관내 방법을 의미하며, 이후 상기 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특정한 핵산 서열 또는 서열들을 전술한 바와 같이 효소적으로 증폭한다. 또한, RT-PCR은 상기 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
DNA “코딩 서열”은 적절한 조절 서열의 조절 하에 놓여질 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포내에서 전사 및 폴리펩티드로 번역되는 이중-사슬 DNA 서열이다. “적합한 조절 서열”은 코딩 서열의 상류(5´비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3´ 비-코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 상기 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 및 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열의 경계부는 상기 5´(아미노) 말단의 개시 코돈 및 상기 3´(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, mRNA 유래의 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 만일, 상기 코딩 서열을 진핵생물 세포내에서 발현시킬 의도라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 상기 코딩 서열의 3´쪽에 위치할 것이다.
“열린 해독 틀(open reading frame)”은 ORF로 약칭되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 출발 신호 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하고, 잠재적으로 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있는 DNA, cDNA 또는 RNA 핵산 서열의 길이를 의미한다.
본 명세서에서, “머리-대-머리”라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 한 폴리노클레오티드의 코딩 사슬의 5´말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5´ 말단과 인접할 때 머리-대-머리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5´말단으로부터 멀어지게 된다. “머리-대-머리”라는 용어는 (5´)-대-(5´)으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(←→) 또는 (3´←5´5´→3´)으로 표시될 수 있다.
본 명세서에서, “꼬리-대-꼬리”라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 한 폴리노클레오티드의 코딩 사슬의 3´말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3´ 말단과 인접할 때 꼬리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드 방향으로 향하게 된다. “꼬리-대-꼬리”라는 용어는 (3´)-대-(3´)으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→←) 또는 (5´→3´3´←5´)으로 표시될 수 있다.
본 명세서에서, “머리-대-꼬리”라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 한 폴리노클레오티드의 코딩 사슬의 5´말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3´ 말단과 인접할 때 머리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 것과 동일한 방향으로 진행하게 된다. “머리-대-꼬리”라는 용어는 (5´)-대-(3´)으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→→) 또는 (5´→3´5´→3´)으로 표시될 수 있다.
“하류”라는 용어는 참고 뉴클레오티드 서열의 3´에 위치한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 개시점을 뒤따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 개시 부위의 하류에 위치한다.
“상류”라는 용어는 참고 뉴클레오티드 서열의 5´에 위치하는 서열을 나타낸다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열 또는 전사 개시점의 5´측 상에 위치한다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사 개시 부위의 상류에 위치한다.
“제한 엔도뉴클레아제” 및 “제한효소”라는 용어는 이중 사슬 DNA 내의 특정한 뉴클레오티드 서열에 결합하고 그 내부를 절단하는 효소를 나타낸다.
“상동성 재조합”은 외래 DNA 서열의 다른 DNA 분자로의 삽입, 예를 들면 벡터의 염색체로의 삽입을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 벡터는 상동성 재조합을 위해 특정한 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정한 상동성 재조합을 위하여, 상기 벡터는 상보적인 결합 및 상기 벡터의 염색체로의 삽입을 가능하게 하도록 상기 염색체 서열과 상동성인 충분히 긴 영역을 포함할 것이다. 상동성 영역이 더 길고, 서열의 유사성 정도가 커질수록 상동성 재조합 효율은 증가될 것이다.
기술 분야에서 공지된 몇 가지 방법이 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 증식을 위해 사용될 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터는 다량으로 증식 및 제조될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 하기 벡터 및 그 유도체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 몇 가지 언급하지만 너무 적은 수이다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
“벡터”는 핵산을 숙주 세포로 클로닝 및/또는 전달시키기 위한 임의의 수단이다. 벡터는 다른 DNA 세그먼트가 부착되어 상기 부착된 세그먼트의 복제를 일으킬 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. “레플리콘”은 생체내에서 DNA 복제의 자발적 단위로 기능하는, 즉 그 자신의 조절 하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)이다. “벡터”라는 용어는 상기 핵산을 시험관내, 생체외(ex vivo) 또는 생체내에서 세포내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 수단 모두를 포함한다. 기술 분야에 공지되어 있는 많은 수의 벡터가 핵산을 조작하고, 반응 요소(response element) 및 프로모터를 유전자 등 내로 포함시키기 위해 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 예를 들면 플라스미드 또는 예를 들면 람다 유도체와 같은 박테리오파지를 포함하는 변형된 바이러스, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 포함한다. 예를 들면, 반응 요소 및 프로모터에 해당하는 DNA 절편을 적합한 벡터내로 삽입하는 것은 적당한 DNA 절편을 상보적인 점착성(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터내로 접합시킴으로써 달성될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형되거나, 또는 뉴클레오티드 서열(링커)을 상기 DNA 발단 내로 접합시킴으로써 임의의 부위가 생성될 수 있다. 이러한 벡터는 선별 마커(marker) 유전자를 포함하도록 가공되어, 상기 마커가 세포 게놈 내로 삽입된 세포를 선별하도록 할 수 있다. 이러한 마커는 상기 마커에 의해 코딩되는 단백질이 삽입 및 발현되는 숙주 세포의 확인 및/또는 선별을 가능하게 한다.
바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 세포뿐만 아니라 살아있는 동물 대상에서의 다양한 종류의 유전자 전달 적용분야에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스, 배큘로바이러스, 백시니아, 헤르페스 심플렉스, 엡스테인-바, 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 카울리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 전하를 띈 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생고분자(biopolymer)를 포함한다. 핵산에 더하여, 벡터는 또한 핵산 전달 결과(어느 조직으로의 전달, 발현 기간, 등)를 선별, 측정 및 모니터하기에 유용한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
“플라스미드”라는 용어는 염색체 이외의 요소를 나타내며, 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하고, 보통 원형의 이중-사슬 DNA 분자 형태이다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 자발적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 단일- 또는 이중-사슬 DNA 또는 RNA의 선형, 원형 또는 수퍼코일형이며, 다수의 뉴클레오티드 서열이 독특한 구조물로 합류 또는 재결합되어서 프로모터 절편 및 선별된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 적당한 3´비번역 서열과 함께 세포내로 도입할 수 있다.
“클로닝 벡터”는 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 “레플리콘”으로서, 순차적으로 복제하고, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하며, 여기에 다른 핵산 세그먼트가 부착하여 부착된 세그먼트의 복제를 일으킨다. 클로닝 벡터는 한 세포 타입에서는 복제하고, 다른 곳에서는 발현할 수 있다(“셔틀 벡터”).
벡터는 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 전달감염(transfection), 전기천공(electroporation), 미세주입(microinjection), 형질도입(transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 지질감염(lipofection)(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터에 의해 원하는 숙주 세포내로 도입될 수 있다(예를 들면, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; 및 1990년 3월 15일에 출원된 Hartmut 등의 캐나다 특허 출원 제2,012,311호).
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 지질감염에 의해 생체내로 도입될 수 있다. 지난 수십년간, 시험관내에서 핵산을 캡슐화 및 전달감염하기 위한 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀-매개성 전달감염과 관련된 어려움 및 위험성을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온성 지질이, 마커를 코딩하는 유전자의 생체내 전달감염을 위한 리포좀 제조에 사용될 수 있다(Felgner et all, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413; Mackey, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 8027-8031; and Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1748). 양이온성 지질의 사용은 음전하를 갖는 핵산의 캡슐화를 촉진시키고, 또한 음전하를 갖는 세포막과의 융합을 촉진시킬 수 있다(Felgner and Ringold, 1989, Science 337: 387-388). 핵산의 전달을 위해 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물은 국제 특허 공보 WO95/18863 및 WO96/17823 및 미국 특허 제5,459,127호에 개시되어 있다. 외인성(exogenous) 유전자를 생체내에서 특정한 기관 내로 도입하기 위해 지질감염을 사용하는 것은 몇 가지 실질적인 이점을 갖는다. 특정한 세포로 리포좀을 분자 표적화하는 것이 한가지 유익한 측면이다. 특정한 세포 타입으로 전달감염을 유도하는 것은 췌장, 간, 신장, 및 뇌와 같이 세포가 이형성(heterogeneity)을 갖는 조직에 있어서는 특히 바람직하다는 것이 명확하다. 지질은 표적화를 목적으로 다른 분자와 화학적으로 커플링될 수 있다(Mackey, et al., 1988, supra). 표적화된 펩티드, 예를 들면 호르몬 또는 신경전달물질(neurotransmitter) 및 항체와 같은 단백질 또는 비-펩티드 분자는 리포좀과 화학적으로 커플링될 수 있다.
또한, 양이온성 올리고펩티드(예를 들면, WO95/21931), DNA 결합 단백질 유래의 펩티드(예를 들면, WO96/25508), 또는 양이온성 고분자(예를 들면, WO95/21931)와 같은 다른 분자들도 생체내에서의 핵산의 전달감염을 촉진하는데 유용하다.
또한, 네이키드(naked) DNA 플라스미드와 같은 벡터를 생체내로 도입하는 것도 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조). 수용체-매개성 DNA 전달 접근방법 또한 사용될 수 있다(Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147-154; 및 Wu 및 Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432).
“전달감염“이란 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이형 RNA 또는 DNA의 섭취를 의미한다. 세포는 외인성 또는 이형 RNA 또는 DNA가 세포의 내부로 도입될 때 이러한 RNA 또는 DNA에 의해“전달감염“되었다. 세포는 상기 전달감염된 RNA 또는 DNA가 외형적인(phenotypic) 변화를 나타낼 때 외인성 또는 이형 RNA 또는 DNA에 의해“형질전환“되었다. 형질전환된 RNA 또는 DNA는 염색체 DNA 내부로 삽입되어(공유적으로 결합됨) 세포의 게놈을 형성할 수 있다.
“형질전환”은 숙주 생명체 게놈 내로의 핵산 절편의 감염을 나타내며, 결과적으로 유전적으로 안정하게 유전된다. 형질전환된 핵산 절편을 포함하는 숙주 생명체는 “유전자이식된” 또는 “재조합된” 또는 “형질전환된” 생명체로 나타낸다.
“유전자 영역”이란 용어는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열 영역을 나타낼 것이다.
아울러, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 그의 증폭 또는 그의 발현을 원하는 세포성 숙주 내에서의 복제를 위한 하나 이상의 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
“선별 마커”라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전을 추적하거나 및/또는 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 확인하기 위해 사용되는 상기 마커 유전자의 효과, 즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 발색성 마커, 효소, 형광 마커 등에 의해 선별될 수 있는, 통상 항생제 또는 화학 저항성 유전자와 같은 확인 인자(identifying factor)를 의미한다. 기술 분야에서 공지되고 사용되는 선별 마커 유전자의 예로는 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 비알랍포스(bialaphos) 제초제, 술폰아미드 등에 저항성을 나타내는 유전자; 및 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전달 유전자 등과 같은 외형적인 마커로 사용되는 유전자를 포함한다.
“리포터 유전자”라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전을 추적하거나, 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 확인하거나 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용되는 상기 리포터 유전자의 효과에 의해 확인될 수 있는 확인 인자를 코딩하는 핵산을 의미한다. 기술 분야에서 공지되고 사용되는 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제(Luc), 초록 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 또한, 선별 마커 유전자가 리포터 유전자로 간주될 수도 있다.
“프로모터”는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3´에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 자연형 유전자로부터 유래되거나, 또는 자연 상태에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유래된 다른 요소로 이루어지거나, 또는 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 프로모터들은 다른 조직 또는 세포 타입, 또는 다른 발단 단계, 또는 다른 환경적 또는 물리적 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 대부분의 시간에서 대부분의 세포 타입에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 “지속적(constitutive) 프로모터”로 나타낸다. 특정한 세포 타입에서의 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 “세포-특이적 프로모터” 또는 “조직-특이적 프로모터”로 나타낸다. 특정한 발달 또는 세포 분화 단계에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 “발달-특이적 프로모터” 또는 “세포 분화-특이적 프로모터”로 나타낸다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드(ligand), 빛 등에 세포를 노출하거나 처리한 이후 유도되거나 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 “유도가능한 프로모터” 또는 “조절가능한 프로모터”로 나타낸다. 아울러, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계부가 완전하게 정의되어 있지 않기 때문에, 다른 길이의 DNA 절편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 인식되어 있다.
“프로모터 서열”은 세포내에서 RNA 중합효소가 결합하여 하류(3´방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 정의하기 위한 목적에서, 상기 프로모터 서열은 그 3´ 말단에 전사 개시 부위가 결합되어 있고, 상류(5´방향)에는 배경(background) 이상으로 검출될 수 있는 레벨로 전사를 개시하기에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 연장된다. 상기 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑에의해 편리하게 정의됨)뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합에 필요한 단백질 결합 도메인(공통(consensus) 서열)도 발견될 것이다.
코딩 서열은 RNA 중합효소가 상기 코딩서열을 mRNA로 전사할 때 세포내에서 전사 및 번역 조절 서열의 “조절 하에” 있으며, 이후 트랜스-RNA 스플라이싱(상기 코딩 서열이 인트론을 포함하는 경우)되고 상기 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역된다.
“전사 및 번역 조절 서열”은 숙주 세포내에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 신호는 조절 서열이다.
“반응 요소”라는 용어는, 첫 번째 키메라 유전자의 DNA-결합 도메인과의 상호작용을 통해 매개되는 프로모터에 대한 반응성을 부여하는 하나 이상의 시스(cis)-작용성 DNA 요소를 의미한다. 상기 DNA 요소는 그 서열이 (완전하거나 또는 불완전한) 팔린드롬성(palindromic)이거나, 또는 다양한 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 하프 부위로 이루어질 수 있다. 상기 하프 부위는 동일하거나 유사하며, 직접 또는 역상의 반복으로 배열되거나, 또는 단일 하프 부위이거나 또는 인접한 하프 부위가 직렬로 연결된 멀티머(multimer)로 배열될 수 있다. 상기 반응 요소는 상기 반응 요소가 삽입되는 세포 또는 생명체의 본성에 따라 다른 생명체로부터 분리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 첫 번째 교잡 단백질의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재시에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하여 상기 반응 요소의 조절 하에 있는 하류 유전자(들)의 전사를 개시 또는 억제한다. 자연형 엑디손(ecdysone) 수용체의 반응 요소에 대한 DNA 서열의 예로는 RRGG/TTCANTGAC/ACYY (Cherbas L., et. al., (1991), Genes Dev. 5, 120-131 참조); AGGTCAN(n)AGGTCA (상기 N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드일 수 있으며, D'Avino PP., et al., (1995), Mol, Cell, Endocrinol, 113, 1-9 참조); 및 GGGTTGAATGAATTT (Antoniewski C., et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474 참조)를 포함한다.
“기능적으로 연결된(operably linked)”이란 용어는, 핵산 서열이 단일한 핵산 절편과 연관되어서 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때(즉, 상기 코딩 서열이 상기 프로모터의 전사 조절 하에 있을 때) 상기 코딩 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 코딩 서열은 조절 서열과 센스 또는 안티센스 방향으로 기능적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “발현”이란 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 단백질 또는 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 나타낼 수도 있다.
“카세트”, “발현 카세트” 및 “유전자 발현 카세트”라는 용어는 상동성 재조합에 의해 특정한 제한효소 부위에서 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA 세그먼트를 나타낸다. 상기 DNA 세그먼트는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 번역을 위하여 상기 카세트가 올바른 판독 틀 내에 삽입될 수 있도록 디자인된다. “형질전환 카세트”는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 이외에 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 인자를 갖는 특정한 벡터를 나타낸다. 또한, 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포내에서 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되도록 하는 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
“조정” 및 “조정하는”이란 용어는 핵산 또는 유전자의 발현을 유도, 감소 또는 억제하여, 결과적으로 단백질 또는 폴리펩타이드 생산을 각각 유도, 감소 또는 억제하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 플라스미드 또는 벡터는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. “발현 벡터”라는 용어는 숙주 내로 형질전환된 후에 삽입된 핵산 서열이 발현될 수 있도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 운반체(vehicle)를 의미한다. 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 통상 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 조절 하에 놓여있다. 원하는 숙주 세포내에서 핵산을 발현시키기에 유용한 조절 영역 또는 프로모터는 매우 많이 개시되어 있으며, 당업자에게 친숙하다. 이러한 유전자를 발현시킬 수 있는 실질적으로 모든 프로모터가 본 발명에 적합하며, 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 지속적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 발달 특이적 프로모터, 유도가능한 프로모터, 빛 조절성 프로모터; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 알칼린 포스페이트 프로모터(사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOX1 프로모터(피키아(Pichia)에서의 발현에 유용함); β-락타마제, lac, ara, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac 및 trc 프로모터(대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 유용함); 빛 조절성-, 씨앗 특이적-, 화분 특이적-, 난소 특이적-, 병인(pathogenesis) 또는 질환 연관성-, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S, CMV 35S 최소, 카사바 베인(cassava vein) 모자이크 바이러스(CsVMV), 클로로필 a/b 결합 단백질, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제, 줄기(shoot)-특이적, 뿌리 특이적, 키티나제, 스트레스 유도성, 쌀 퉁그로바실리폼(rice tungro bacilliform) 바이러스, 식물 수퍼-프로모터, 감자 루신 아미노펩티다제, 나이트레이트 리덕타제, 만노파인 신타제, 노팔린 신타제, 유비퀴틴, 제인 단백질 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서의 발현에 유용함); SV40 초기(SV40e) 프로모터 영역, 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 3´ 긴 말단 반복(LTR)에 포함되어 있는 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 프로모터 또는 주된 후기 프로모터(MLP), 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티민 키나제(TK) 프로모터, 배큘로바이러스 IE1 프로모터, 연장 인자(elongation factor) 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 저졸 영역, 유비퀴터스 프로모터(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간체 필라멘트(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터, 치료 유전자(MDR, CFTR 또는 인자 Ⅷ 타입 등)의 프로모터, 병인 또는 질환 연관성-프로모터, 췌장 애시나(acinar) 세포에서 활성형인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역과 같이 조직 특이성을 나타내고 이식유전자 동물에서 이용되고 있는 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 기술 분야에서 공지된 동물 및 포유동물 프로모터; 췌장 베타 세포에서 활성형인 인슐린 유전자 조절 영역, 임파구 세포에서 활성형인 이뮤노글로불린 유전자 조절 영역, 고환, 유방, 임파구 및 비만 세포(mast cell)에서 활성형인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역; 알부민 유전자, 간에서 활성형인 Apo AI 및 Apo AII 조절 영역, 간에서 활성형인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역, 간에서 활성형인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역, 마이엘로이드 세포에서 활성형인 β-글로빈 유전자 조절 영역, 뇌의 올리고덴드로사이트 세포에서 활성형인 마이엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역, 골격근에서 활성형인 마이오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 및 시상하부에서 활성형인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역, 피루베이트 키나제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 소장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 인핸서는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 연장 인자(elongation factor)-1(EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 종결 조절 영역, 즉 터미네이터 또는 폴리아데닐화 서열은 바람직한 숙주에게 존재하는 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수도 있지만, 포함되어 있는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 종결 조절 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 바이러스 터미네이터 서열 등을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
“3´비-코딩 서열” 또는 “3´ 비번역 영역(UTR)”이라는 용어는 코딩 서열의 하류(3´)에 위치하는 DNA 서열을 나타내며, 폴리아데닐화(폴리(A)) 인식 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 통상 mRNA 전구체(precursor)의 3´ 말단에 폴리아데닐산 트랙(track)을 첨가하는데 영향을 미치는 것에 의해 특정된다.
“조절 영역”은 2번째 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정한 핵산(상동성 영역)의 발현에 자연적으로 필요한 서열을 포함할 수도 있고, 다른 단백질 또는 심지어 합성 단백질(이형 영역)의 발현에 필요한 다른 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 원핵생물, 진핵생물, 또는 바이러스 유전자의 서열이거나, 또는 특이적인 또는 비-특이적인 방식 및 유도가능한 또는 비-유도가능한 방식으로 유전자의 전사를 촉진 또는 억제하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이싱 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열 및 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 서열을 포함한다.
“이형 공급원” 유래의 조절 영역은 발현된 핵산과 자연적으로는 연관되지 않는 조절 영역이다. 상기 이형 조절 영역에 속하는 것으로는 다른 종 유래의 조절 영역, 다른 유전자 유래의 조절 영역, 교잡 조절 서열 및 자연적으로 존재하지 않지만 당업자에 의해 디자인된 조절 서열을 포함한다.
“RNA 전사체”는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매된 전사체의 결과로 나온 산물을 나타낸다. 상기 RNA 전사체가 DNA 서열과 완전히 상보적인 복사본일 때, 이것은 1차 전사체로 나타내며, 상기 1차 전사체의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 때, 이것은 성숙한 RNA로 나타낸다. “전령 RNA(mRNA)”는 인트론이 없으며, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 나타낸다. “cDNA”는 mRNA와 상보적이고 이로부터 유래된 이중-사슬 DNA를 나타낸다. “센스” RNA는 상기 mRNA를 포함하는 RNA 전사체를 나타내며, 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. “안티센스 RNA”는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부와 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 나타낸다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정한 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5´비-코딩 서열, 3´비-코딩 서열 또는 상기 코딩 서열에 존재할 수 있다. “기능성 RNA”는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 아직 번역되지 않은 것으로서 세포 작용에 영향을 미치는 다른 RNA를 나타낸다.
“폴리펩티드”는 공유적으로 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 고분자 화합물이다. 아미노산은 하기 일반 구조식을 갖는다:
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아미노산은 상기 곁사슬(side chain) R에 기초하여 7가지 군으로 분류된다: (1) 지방족 곁사슬, (2) 히드록시(OH) 기를 포함하는 곁사슬, (3) 황 원자를 포함하는 곁사슬, (4) 산성 또는 아미드 기를 포함하는 곁사슬, (5) 염기성 기를 포함하는 곁사슬, (6) 방향족 고리를 포함하는 곁사슬 및 (7) 상기 곁사슬이 상기 아미노기에 융합된 이미노산인 프롤린. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 약 14가지 아미노산을 포함한다.
“단백질”은 살아있는 세포에서 구조적 또는 기능적 역할을 수행하는 폴리펩티드이다.
“분리된 폴리펩티드” 또는 “분리된 단백질”은 그 자연 상태에서는 정상적으로 연관되어 있는 화합물들(예를 들면, 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 제거된 폴리펩티드 또는 단백질이다. “분리된”은 다른 화합물들과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 불순물의 존재를 배제하는 의미는 아니며, 상기 불순물은 예를 들면 불완전한 정제, 안정제의 첨가, 또는 약학적으로 허용가능한 제제로의 혼합으로 인해 존재할 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 “변이체”는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 유사체, 절편, 유도체, 또는 돌연변이체로서, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 보유한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 변이체는 자연 상태에서 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 상기 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열상의 차이에 의해 특정되는 알릴성(allelic) 변이이거나, 또는 다른 스플라이싱 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 추가, 또는 교체를 갖는 변이체를 제조할 수 있다. 이들 변이체는 특히 (a) 하나 이상의 아미노산이 보존적 또는 비-보존적 아미노산과 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 상기 폴리펩티드 또는 단백질에 추가된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체 및 (d) 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합된 변이체를 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이, 등), 화학적 및 효소적 기술을 포함하는 이들 변이체를 얻기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
“이형 단백질”은 자연적으로는 세포에서 생산되지 않는 단백질을 나타낸다.
“성숙한 단백질”은 번역후 가공된 폴리펩티드, 즉 상기 1차 번역 산물 내에 존재하는 임의의 프리- 또는 프로펩티드가 제거된 것을 나타낸다. “전구체” 단백질은 mRNA 번역의 1차 산물, 즉 프리- 및 프로펩티드가 여전히 존재하는 것을 나타낸다. 프리- 및 프로펩티드는 세포내 위치화(localization) 신호일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
“신호 펩티드”라는 용어는 분비되는 성숙한 단백질 앞에 존재하는 아미노 말단 폴리펩티드를 나타낸다. 상기 신호 펩티드는 잘려지며, 따라서 상기 성숙한 단백질 내에는 존재하지 않는다. 신호 펩티드는 분비된 단백질이 세포막을 가로질러 위치 및 전좌되도록 하는 기능을 갖는다.
“신호 서열”은 세포 표면에 발현되는 단백질의 코딩 서열이 시작되는 곳에 포함되어 있다. 상기 서열은 성숙한 폴리펩티드의 N-말단에 존재하며, 숙주 세포가 상기 폴리펩티드를 전좌시키도록 하는 신호 펩티드를 코딩한다. 본 명세서에 있어서, “전좌 신호 서열”이란 용어는 이러한 종류의 신호 서열을 나타내기 위해 사용된다. 전좌 신호 서열은 진핵생물 및 원핵생물에게 자연형인 다양한 단백질과 연관되어 있는 것으로 나타날 수 있으며, 종종 양쪽 타입의 생명체 모두에서 기능을 한다.
“상동성”이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동질성 퍼센트(%)를 나타낸다. 한 모이어티와 다른 모이어티 유래 서열 사이의 일치 정도는 해당 분야에서 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 배열하고 즉시 사용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 다른 한편으로, 상동성은 상동성 영역 사이에 안정한 이중체(duplex)를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 교잡시킨 후, 단일-사슬-특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고 소화된 절편의 크기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 모든 문법적인 형태 및 철자 변이체에 있어서 “상동성”이란 용어는 수퍼패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼패밀리) 유래의 단백질 및 다른 종 유래의 상동성 단백질을 포함하는 “공통의 진화적인 기원”을 갖고 있는 단백질들 간의 유연관계(relationship)를 나타낸다(Reeck et al., 1987, Cell 50: 667). 이러한 단백질들(및 그의 코딩 유전자들)은 높은 서열 유사성 정도에 의해 반영된 바와 같이 서열 상동성이 있다. 그러나, 통상의 관행 및 본 출원에 있어서, “상동성” 이란 용어는 “매우”와 같은 부사어와 함께 한정될 때는 서열의 유사성을 나타내고 공통의 진화적인 기원을 나타내지 않을 수도 있다.
따라서, 모든 문법적인 형태에서 “서열 유사성”이란 용어는 공통의 진화적인 기원을 갖거나 갖지 않을 수 있는 핵산 또는 단백질의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 일치 정도를 나타낸다(Reeck et al., 1987, Cell 50: 667 참조).
특정한 구현예에서, 2개의 DNA 서열은 적어도 약 50%(바람직하게는 적어도 약 75%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90 또는 95%)의 뉴클레오티드가 정해진 길이의 DNA 서열에 걸쳐서 일치할 때 “실질적으로 상동성”이거나, 또는 “실질적으로 유사하다”. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 또는 예를 들면 특정한 시스템에 대해 정의되어 있는 엄격한 조건 하에 서던 교잡(Southern blot) 실험을 함으로써 확인될 수 있다. 적절한 교잡 조건을 정의하는 것은 해당 분야의 기술 범위 이내이다(예를 들면, Sambrook et al., 1989, supra 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “실질적으로 유사한”은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 하나 이상 아미노산의 치환으로 나타나지만, 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적인 특성에는 영향을 미치지 않는 핵산 절편을 나타낸다. 또한, “실질적으로 유사한”은 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화가 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 절편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 절편을 나타낸다. 또한, “실질적으로 유사한”은 결과물인 전사체의 기능적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 절편의 변형을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 특정한 예시적인 서열 이상을 포괄하는 것으로 이해된다. 제시된 변형 각각은, 코딩된 산물의 생물학적 활성 유지의 결정과 같이, 해당 분야의 일상적인 기술 범위 이내이다.
아울러, 당업자는 본 발명에 의해 포괄되는 실질적으로 유사한 서열은 또한 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS 이후 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척) 하에 본 명세서에서 예시된 서열과 교잡할 수 있는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 절편은 그 DNA 서열이 본 명세서에서 개시된 핵산 절편의 DNA 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 절편이다. 본 발명의 바람직한 실질적인 핵산 절편은 그 DNA 서열이 본 명세서에서 개시된 핵산 절편의 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 절편이다. 보다 바람직한 핵산 절편은 본 명세서에서 개시된 핵산 절편의 DNA 서열과 적어도 90% 동일하다. 보다 더 바람직한 것은 본 명세서에서 개시된 핵산 절편의 DNA 서열과 적어도 95% 동일하다.
2개의 아미노산 서열은 약 40% 이상의 아미노산 서열이 동일하거나, 또는 60% 이상이 유사할 때(기능적으로 동일함) “실질적으로 상동성”이거나, 또는 “실질적으로 유사하다”. 바람직하게는, 상기 유사한 또는 상동성인 서열은 예를 들면 GCG (Genetics Computer Group, Program manual for the GCG package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램을 이용하여 배열함으로써 확인된다.
본 명세서에서, “대응하는”이란 용어는, 그 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 다른, 유사하거나 또는 상동성인 서열을 나타내기 위해 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열의 배열은 스페이스(space)를 포함할 수도 있다. 따라서, “대응하는”이란 용어는 서열의 유사성을 나타내며, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 나타내는 것은 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 “상당 부분(substantial portion)”은, 당업자에 의해 수동으로 서열을 평가하거나, 또는 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 참조)와 같은 알고리즘을 이용한 확인에 의해 상기 폴리펩티드 또는 유전자를 잠재적으로 확인하기 위하여 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 충분히 포함한다. 일반적으로, 공지된 단백질 또는 유전자에 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 잠재적으로 확인하기 위해서는 10개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 또는 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 아울러, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 20-30개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열-의존적 유전자 확인(예를 들면, 서던 교잡법) 및 분리(예를 들면, 박테리아 콜로니(colony) 또는 박테리오파지 플라크(plaque)의 인 시투(in situ) 교잡법)에 사용될 수 있다. 아울러, 12-15개의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정한 핵산 절편을 얻기 위한 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 “상당 부분”은 상기 서열을 포함하는 핵산 절편을 구체적으로 확인 및/또는 분리하기 위한 서열을 충분히 포함한다.
“퍼센트 일치(percent identity)”라는 용어는, 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 그 서열을 비교함으로써 결정되는 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 상관관계이다. 종래 기술에서, “일치”는 또한 경우에 따라서 일련의 서열 사이의 일치에 의해 결정되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 연관성 정도를 의미한다. “일치” 및 “유사성”은 하기에 개시된 공지된 방법에 의해 즉시 계산될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G. eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). 일치를 결정하기 위한 바람직한 방법이 테스트된 서열 사이의 최적의 일치를 제공하기 위해 디자인된다. 일치 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 정리되어 있다. 서열의 배열 및 퍼센트 일치의 계산은 LASERGENE 생명정보학 컴퓨팅 수트(suite)의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 서열의 다중 배열은 디폴트 파리미터(default parameter)(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 가지고 상기 클러스트 배열 방법(Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 클러스트 방법을 이용한 페어와이즈(pairwise) 배열의 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5로 선택될 수 있다.
“서열 분석 소프트웨어”라는 용어는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 나타낸다. “서열 분석 소프트웨어”는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 수트 프로그램(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) 및 DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)를 포함할 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 문맥 내에서, 서열 분석 프로그램이 분석을 위해 사용될 때, 그 분석 결과는 달리 특정하지 않는 한 언급된 프로그램의 “디폴트 값”에 기초한 것임이 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “디폴트 값”은 처음 시작할 때 그 소프트웨어에 원래 부여된 임의의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
“합성 유전자”는 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다. 상기 빌딩 블록은 유전자 세그먼트를 형성하기 위해 접합 및 어닐링되고, 이후 효소적으로 조립되어 전체 유전자를 구축한다. DNA 서열과 관련하여, “화학적으로 합성된”은 구성성분인 뉴클레오티드가 시험관내에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 수동 화학적 합성은 잘-확립된 절차를 이용하여 달성되거나, 또는 자동화된 화학적 합성이 상업적으로 이용가능한 다수의 장치 중 하나를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스(bias)를 반영하기 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 재단될 수 있다. 당업자는 코돈 이용성이 숙주에게 선호되는 코돈으로 바이어스 된다면, 성공적으로 유전자 발현이 이루어진다는 것을 인식한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 이용가능한 숙주 세포로부터 유래된 유전자 조사에 기초할 수 있다.
본 발명
본 발명은 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 2개의 상보적 재조합 부위 사이의 재조합을 촉매할 수는 있지만, 이러한 재조합에 의해 형성된 교잡 부위 사이의 재조합은 촉매할 수 없다는 점에서 단방향성인, 박테리오파지 리콤비나제와 같은 원핵생물 리콤비나제를 도입한다. 본 발명자는 각각 박테리아 부착 부위(attB) 및 파지 부착 부위(attP) 사이의 재조합 만을 일으키는 신규한 리콤비나제를 확인하였다. 상기 리콤비나제는 attB 및 attP 사이의 재조합에 의해 형성된 attL 및 attR 교잡 부위 사이의 재조합은 매개할 수 없다. 이와 같은 리콤비나제는 단독으로는 그 역반응을 촉매할 수 없기 때문에, 상기 attB 및 attP 재조합은 안정한다. 이러한 특성은 본 발명의 조성물 및 방법이, 재조합 반응을 역으로 할 수 있는 Cre-lox 또는 FLP-FRT 시스템과 같은 진핵생물 세포에서 현재 사용되는 다른 재조합 시스템과 구별되는 특성이다. 본 발명의 재조합 시스템을 사용하는 것은 진핵생물 세포에서 안정한 유전자 이식 및 염색체 재배열을 수행하기 위한 새로운 기회를 제공한다.
본 발명의 방법은 진핵세포내에 존재하는 재조합 부착 부위인 attB 및 attP 쌍을 대응하는 리콤비나제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이후, 상기 리콤비나제는 상기 재조합 부착 부위들 사이의 재조합을 매개한다. 상기 재조합 부착 부위의 상대적인 위치에 따라, 다수의 사건들 중 임의의 하나가 재조합의 결과로 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 재조합 부착 부위가 다른 핵산 분자 상에 위치한다면, 상기 재조합은 한 핵산 분자가 2번째 분자 내로 삽입되는 결과가 발생할 수 있다. 따라서, 한 재조합 부위를 포함하는 플라스미드가 대응하는 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포의 염색체 내로 삽입된 것을 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 리콤비나제는 역반응을 촉매할 수 없기 때문에, 상기 삽입은 안정하다. 이러한 방법은 예를 들면 플라스미드 상에 존재하는 이식유전자를 진핵생물 염색체 내로 안정하게 삽입시키는데 유용하다.
상기 재조합 부착 부위는 또한 동일한 핵산 분자 상에 존재할 수 있다. 이러한 경우, 결과 산물은 전형적으로 부착 부위의 상대적인 방향에 의존한다. 예를 들면, 평행 또는 정방향인 부위들 사이의 재조합은 일반적으로 상기 재조합 부착 부위 사이에 있는 임의의 DNA의 절단으로 나타날 것이다. 반대로, 역방향인 부착 부위들 사이의 재조합은 그 사이 DNA의 역위로 나타날 수 있다. 마찬가지로, 결과물인 재배열된 핵산은, 일반적으로 특정한 박테리오파지 및/또는 상기 리콤비나제가 유래된 박테리오파지의 숙주 세포에 의해 코딩되며 진핵생물 세포에서는 보통 발견되지 않는 추가 인자 또는 인자들의 부재시에는 재조합이 비가역적이므로 안정하다. 본 발명의 방법이 유용한 적용 분야의 한 예로는 상기 재조합 부착 부위들 사이에 프로모터를 위치시키는 것을 포함한다. 만일, 상기 프로모터가 최초에 상기 프로모터에 의해 발현되는 코딩 서열에 대해 상대적으로 역방향에 있고, 상기 프로모터에 인접한 재조합 부위가 역방향에 있다면, 상기 재조합 부착 부위를 접촉하는 것은 상기 프로모터의 방향을 반대로 하게 되고, 따라서 상기 프로모터를 올바른 방향으로 놓아서 상기 코딩 서열의 발현을 이끌게 될 것이다. 유사하게, 상기 프로모터가 최초에 발현을 위한 올바른 방향에 있고, 상기 재조합 부착 부위가 동일한 방향에 있다면, 상기 재조합 부착 부위를 리콤비나제와 접촉하는 것은 상기 프로모터 절편을 절단하게 되고, 따라서 상기 코딩 서열의 발현을 중지시키게 할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 염색체의 전좌를 얻기에 유용하다. 예를 들면, 본 구현예에서, 제1 재조합 부착 부위는 제1 염색체 상에 위치하고, 상기 제1 재조합 부착 부위와 재조합하기 위한 기질로 작용하는 제2 재조합 부착 부위는 제2 염색체 상에 위치한다. 상기 재조합 부착 부위들을 리콤비나제와 접촉시키면 재조합이 일어나서, 결과적으로 상기 두 개의 염색체의 암(arm)이 뒤바뀌게 된다. 예를 들면, 한 품종은 상기 제1 재조합 부착 부위를 포함하고, 두 번째 품종은 상기 제2 재조합 부착 부위를 포함하는 두가지 품종의 생명체를 구축할 수 있다. 이후, 상기 두가지 품종은 교차되어서 상기 재조합 부착 부위 모두를 포함하는 자손 품종이 얻어진다.
리콤비나제
본 발명의 실행을 위해 사용되는 리콤비나제는 표적 벡터의 도입 이전, 동시, 또는 이후에 표적 세포내로 도입될 수 있다. 상기 리콤비나제는 예를 들면 리포좀, 코팅된 입자, 또는 미세주입을 이용하여 단백질 형태로 세포내로 직접 도입될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 리콤비나제를 코딩하는 DNA 또는 mRNA의 폴리뉴클레오티드가 적합한 발현 벡터를 이용하여 상기 세포내로 도입될 수 있다. 전술한 표적 벡터 성분은 관심있는 리콤비나제를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트의 구축에 유용하다. 그러나, 상기 리콤비나제의 발현은, 예를 들면 상기 리콤비나제의 발현을 조절가능한 프로모터(즉, 그 발현이 선별적으로 유도 또는 억제될 수 있는 프로모터)의 조절 하에 둠으로써, 다른 방식으로 조절될 수 있다.
본 발명의 실행시에 사용되기 위한 리콤비나제는 재조합적으로 제조되거나 또는 전술한 바와 같이 정제될 수 있다. 원하는 리콤비나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 크기 절편화, 친화 크로마토그래피, HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 아가로스 친화 크로마토그래피(예를 들면, Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 5505-5510, 1998)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 단백질 암모늄 설페이트 침전, 정제 분야에서 공지된 방법에 의해 원하는 정도의 순도로 정제될 수 있다.
본 발명의 리콤비나제 폴리펩티드 및 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 실시예 1에 개시되어 있으며, 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 리콤비나제는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 90% 일치하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열로서, 상기 핵산은 리콤비나제 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 SPβc2 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, Bxb1 리콤비나제, A118 리콤비나제 및 φRv1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이다.
상기 리콤비나제는 임의의 적합한 방법에 의해 재조합이 일어나기 원하는 재조합 부착 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 미세주입 또는 다른 방법에 의해 기능성 단백질을 세포내로 도입하는 방법은 기술 분야에서 잘 공지되어 있다. 정제된 리콤비나제 단백질의 도입은 상기 단백질 및 그 기능의 일시적인 존재를 가능하게 하며, 이것은 종종 바람직한 구현예가 된다. 다른 한편으로, 상기 리콤비나제를 코딩하는 유전자는 상기 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 발현 벡터내에 포함될 수 있으며, 이때 상기 리콤비나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터와 기능적으로 연결되어 있다. 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 또한 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA에 의해 진핵생물 세포내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 리콤비나제는 상기 핵산 절편을 변형되는 게놈 내로 삽입하기 위해 필요한 시간 동안만 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 대부분의 발현 벡터와 관련있는 영속성의 부재는 불리한 것으로 예측되지 않는다. 상기 리콤비나제 유전자는 관심있는 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입 이전, 이후, 또는 동시에 세포내로 도입할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 리콤비나제 유전자는 예를 들면 유전자이식 식물, 동물, 균류 등의 유전자이식 진핵생물 생명체 내로 도입되며, 이후 대응하는 재조합 부위를 포함하는 생명체와 교배된다. 리콤비나제를 지속적으로, 또는 세포-특이적, 조직-특이적, 발달-특이적, 소기관(organelle)-특이적, 또는 저분자-유도가능하거나 억제가능한 프로모터 하에서 발현하는 유전자이식 세포 또는 동물이 만들어질 수 있다. 상기 리콤비나제는 또한 다른 펩티드, 단백질, 핵 이동 신호 펩티드, 신호 펩티드, 또는 소기관-특이적 신호 펩티드(예를 들면, 미토콘드리아 또는 엽록체에서의 재조합을 촉진시키기 위한 미토콘드리아 또는 엽록체 운송 펩티드)와의 융합 단백질로 발현될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 재조합 부착 부위는 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 90% 일치하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 부착 부위는 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이다.
벡터/구조체
본 발명에 의해 계획되는 표적 구조체는 후술하는 바와 같은 조절 서열, 마커 서열, 선별 서열 등과 같은 핵산 절편을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 관심있는 폴리펩티드(또는 핵산 서열(들))를 예를 들면 (ⅰ) 제1 재조합 부위와 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 촉진할 수 있는 리콤비나제를 제공하고, (ⅱ) 제1 재조합 서열과 관심있는 폴리뉴클레오티드를 갖는 표적 구조체를 제공하고, (ⅲ) 상기 리콤비나제 및 표적 구조체를 그 핵산 내에 제2 재조합 부위를 포함하는 세포내로 도입함으로써 게놈 내로 표적 삽입시키기 위한 수단을 제공하며, 이때 상기 도입은 상기 리콤비나제가 상기 제1 및 제2 재조합 부위들 사이의 재조합 사건을 촉진하도록 하는 조건 하에서 수행된다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열을 분리된 진핵생물 세포의 게놈 내로 부위-특이적으로 삽입시키기 위한 벡터에 관한 것으로서, 상기 벡터는 관심있는 폴리뉴클레오티드 및 제2 재조합 attB 또는 attP 부위를 포함하며, 상기 제2 재조합 attB 또는 attP 부위는 상기 분리된 진핵생물 세포 게놈 내의 제1 재조합 attP 또는 attB 부위 또는 유사(pseudo) attP 또는 유사 attB 부위와 결합하고, 상기 재조합은 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 부위-특이적 리콤비나제의 존재 하에 일어나며, 상기 제1 재조합 부위가 attB 또는 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP 또는 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB이다. 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
관심있는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 산물을 코딩하는 발현 카세트를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표적 구조체는 원형 또는 선형일 수 있으며, 또한 선별 마커, 복제 기원 및 다른 인자들을 포함할 수 있다.
원핵생물 발현 및 진핵생물 발현 모두의 경우에 다양한 발현 벡터가 본 발명의 실행상 사용을 위해 적합하다. 일반적으로, 상기 표적 구조체는 하기 특징 중 하나 이상을 가질 것이다: 프로모터, 프로모터-인핸서 서열, 선별 마커 서열, 복제 기원, 유도가능한 요소 서열, 에피토프(epitope)-태그 서열 등.
프로모터 및 프로모터-인핸서 서열은 RNA 중합효소가 결합하고 전사를 개시하는 DNA 서열이다. 상기 프로모터는 어떤 사슬이 전사될 것인지를 특정함으로써 전사체의 극성(polarity)을 결정한다. 박테리아 프로모터는 전사 개시점에 대해 상대적으로 -35 내지 -10 뉴클레오티드에 공통 서열로 구성되며, 여기에 특정한 시그마 인자 및 RNA 중합효소가 결합한다. 진핵생물 프로모터는 보다 복잡하다. 발현 벡터에서 이용되는 대부분의 프로모터는 RNA 중합효소 Ⅱ에 의해 전사된다. 일반적으로는 전사 인자(GTFS)가 먼저 상기 개시점 근처의 특정한 서열에 결합하며, 이후 RNA 중합효소 Ⅱ가 결합한다. 상기 최소 프로모터 요소에 더하여, 작은 서열 요소가 상기 프로모터의 활성을 조절하는 모듈 DNA-결합/트랜스-활성 단백질(예를 들면, AP-1, SP-1)에 의해 특이적으로 인식된다. 바이러스 프로모터는 박테리아 또는 진핵생물 프로모터와 동일한 기능을 수행하며, 특정한 RNA 중합효소를 트랜스(trans)로 제공하거나(박테리오파지 T7), 또는 세포성 인자 및 RNA 폴리머라제를 모집한다(SV40, RSV, CMV). 바이러스 프로모터는 일반적으로 특히 강한 프로모터이므로 바람직할 수 있다.
아울러, 프로모터는 지속적이거나 또는 조절가능(즉, 유도가능 또는 억제가능)할 수 있다. 유도가능한 요소는 프로모터와 함께 작용하는 DNA 서열 요소이며, 억제자(repressor)(예를 들면, 대장균에서의 lacO/LAC Iq 억제자 시스템) 또는 유도자(inducer)(예를 들면, 효모에서의 gal1/GAL4 유도자 시스템)와 결합한다. 양쪽 경우에 있어서, 전사는 상기 프로모터가 억제 또는 유도될 때까지 실질적으로 “중지”되며, 이 시점에서 전사가 “개시”된다.
지속적 프로모터의 예로는 박테리오파지 λ의 int 프로모터, pBR322의 β-갈락타마제 유전자 서열의 bla 프로모터, pBR325의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 서열의 CAT 프로모터 등을 포함한다. 유도가능한 진핵생물 프로모터의 예로는 박테리오파지의 주된 오른쪽 및 왼쪽 프로모터(P.sub.L 및 P.sub.R), 대장균의 trp, reca, lacZ, AraC 및 gal 프로모터, α-아밀라제(Ulmanen Ett at., J. Bacteriol. 162: 176-182, 1985) 및 B. 서브틸리스의 시그마-28-특이적 프로모터(Gilman et al., Gene sequence 32: 11-20(1984)), 바실러스의 박테리오파지의 프로모터(Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), 스트렙토마이세스 프로모터(Ward et a., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986) 등을 포함한다. 예시적인 원핵생물 프로모터는 글릭(Glick, J. Ind. Microtiot. 1: 277-282, 1987); 세나티엠포(Cenatiempo, Biochimie 68: 505-516, 1986); 및 고츠만(Gottesman, Ann. Rev. Genet. 18: 415-442, 1984)에 의해 리뷰(review)된다.
바람직한 진핵생물 프로모터는 하기 예들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터(Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31: 355-365, 1982); SV40 초기 프로모터(Benoist et al., Nature (London) 290: 304-310, 1981); 효모 갈(gall) 유전자 서열 프로모터(Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6971-6975, 1982); 실버 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5951-59SS, 1984), CMV 프로모터, EF-1 프로모터, 엑디손-반응성 프로모터(들), 테트라사이클린-반응성 프로모터 등. 본 발명에서 사용되기 위한 예시 프로모터는 이들이 도입되는 세포 타입(및/또는 동물 또는 식물)에서 기능을 나타내는 것들로부터 선택된다.
선별 마커는 벡터를 포함하는 세포에서만 성장하는 것을 선별하기 위한 수단을 제공하기 때문에 발현 벡터에 있어서 중요한 요소이다. 이러한 마커는 약물 저항성 및 독립영양성(autotrophic)의 두가지 타입이 있다. 약물 저항성 마커는 세포를 죽이게 되는 외부에서 첨가된 약물을 세포가 해독할 수 있도록 한다. 독립영양성 마커는 필수 성분이 결여된 배지에서 성장할 때 세포가 상기 필수 성분(대개 아미노산)을 합성할 수 있도록 한다.
보통의 선별 마커 유전자는 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 베오신.TM. 등과 같은 항생제에 대해 저항성인 것들을 포함한다. 선별 독립영양성 유전자는 예를 들면 히스티디놀의 존재 하에 히스티딘이 제거된 배지에서 성장하도록 하는 hisD를 포함한다.
발현 벡터에서 유용한 추가 요소로는 복제 기원이 있다. 복제 기원은 다중결합성(multimeric) 기원-결합 단백질에 의해 인식되고 상기 기원 부위에서 DNA 복제 효소들을 소집하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 다중성 짧은 반복 서열을 포함하는 독특한 DNA 세그먼트이다. 본 발명에서 도입되는 발현 벡터에서 사용되기 위한 적합한 복제 기원은 대장균 oriC, colE1 플라스미드 기원, 2μ 및 ARS(양쪽 모두 효모 시스템에서 유용함), sf1, SV40, EBV oriP(포유동물 시스템에서 유용함) 등을 포함한다.
에피토프 태그는 에피토프 특이적 항체에 의해 인식되는 짧은 펩티드 서열이다. 재조합 단백질과 에피토프 태그를 포함하는 융합 단백질은 크로마토그래피 수지에 결합된 항체를 이용하여 간단하고 용이하게 정제될 수 있다. 아울러, 에피토프 태그의 존재는 재조합 단백질 자체에 특이적인 항체를 생산할 필요없이 웨스턴 블롯(Western blot)과 같은 이후의 분석에서 상기 재조합 단백질을 검출할 수 있도록 한다. 통상 사용되는 에피토프 태그의 예로는 V5, 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 헴아글루티닌(HA), 펩티드 Phe-His-His-Thr-Thr, 키틴 결합 도메인 등을 포함한다.
발현 벡터에 있어서 유용한 추가 요소로는 다중 클로닝 부위 또는 폴리링커가 있다. 일련의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 코딩하는 합성 DNA는 예를 들면 상기 프로모터 인자의 하류에서 플라스미드 벡터내로 삽입된다. 상기 부위는 특정한 위치에서 상기 벡터내로 DNA를 편리하게 클로닝하기 위해 가공된다.
전술한 요소들은 본 발명의 방법에서 사용되기에 적합한 발현 벡터를 제조하기 위해 결합될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 내용의 관점에서 특정한 시스템에서 사용하기에 적합한 요소들을 선별 및 결합할 수 있을 것이다. 적합한 원핵생물 벡터는 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드(예를 들면, pBR322, ColE1, pSC101, PACYC 184, itVX, PRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, Calif) 등)를 포함한다. 이러한 플라스미드는 샘브룩에 의해 개시되어 있다(예컨대, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). 바실러스 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함하며, 그리크잔에 의해 개시되어 있다(Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, 1982, pp.307-329). 적합한 스트렙토마이세스 플라스미드는 pli101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987) 및 φC31과 같은 스트렙토마이세스 박테리오파지(Chater et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary, 1986, pp.45-54)를 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 존 등(John et al., Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986) 및 이자키(Izaki, Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742, 1978)에 의해 리뷰된다.
적합한 진핵생물 플라스미드는 예를 들면 BPV, EBV, 백시니아, SV40, 2-미크론 서클, pcDNA3.1, pcDNA3.1/GS, pDual, pYES2/GS, pMT, pIND, pIND(Spl), pVgRXR(Invitrogen) 등, 또는 그 유도체들이 있다. 이러한 플라스미드는 기술 분야에서 잘 공지되어 있다(Botstein et al., Miami Wntr. SyTnp. 19: 265-274, 1982; Broach, In: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p.445-470, 1981; Broach, Cell 28: 203-204, 1982; Dilon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48, 1980; Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol.3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY. pp.563-608, 1980). 본 명세서에서 개시된 표적 카세트는 본 명세서의 내용을 고려하여 분자 생물학 분야의 공지된 방법론(예를 들면, Ausubel 또는 Maniatis 참조)을 이용함으로써 구축될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 상기 표적 구조체는 재조합 부착 부위, 관심있는 프로모터와 기능적으로 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 및 선택적으로는 양성(positive) 선별 마커를 코딩하는 서열을 적합한 벡터 백본(backbone)에 삽입시킴으로써 조립된다.
적합한 조절 서열(예를 들면, 프로모터)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 얻는 바람직한 방법은 PCR이다. PCR의 일반적인 절차는 맥페르손 등의 문헌에 개시되어 있다(MacPherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press at Oxford University Press, 1991). 각각의 적용 반응에 대한 PCR 조건은 경험적으로 결정될 수 있다. 다수의 파라미터가 반응의 성공에 영향을 미친다. 이들 파라미터 중에는 어닐링 온도 및 시간, 연장 시간, Mg2+ 및 ATP 농도, pH, 및 프라이머, 주형 및 데옥시리보뉴클레오티드의 상대적인 농도가 있다. 증폭 후, 결과물인 절편은 아가로스 젤 전기영동에 의해 검출될 수 있으며, 이후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색 및 자외선 조명으로 시각화된다.
본 발명의 상기 발현 카세트, 표적 구조체, 벡터, 리콤비나제 및 리콤비나제-코딩서열은 키트로 제형화될 수 있다. 이러한 키트의 성분으로는 용기, 사용설명서, 용액, 버퍼, 일회용품 및 하드웨어(hardware)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
방법
본 발명은 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 재조합 부위들 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 부위-특이적 재조합 방법에 관한 것으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부위는 attP 또는 attB 이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 attP 이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 부착 부위가 attP이면 상기 제2 부착 부위는 attB이다.
본 발명의 다른 방법은 부위-특이적 리콤비나제를 그 게놈이 변형될 예정인 세포내로 도입하는 것을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예는 제1 재조합 부착 부위 및 제2 재조합 부착 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드로 접촉시켜서 상기 재조합 부착 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부착 부위는 파지 게놈 재조합 부착 부위(attP) 또는 박테리아 게놈 재조합 부착 부위(attB)이고, 상기 제2 재조합 부착 부위는 attB 또는 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 부착 부위가 attP이면 상기 제2 부착 부위는 attB이다. 바람직한 구현예에서, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 재조합은 결과적으로 삽입된다. 이식유전자를 미리 정의된 유전자 좌(locus) 내로 표적 삽입하는 것은 많은 적용분야에서의 바람직한 목표이다. 먼저, 부위-특이적 리콤비나제를 위한 제1 재조합 부위가 게놈 부위에 무작위 또는 미리 결정된 위치에 삽입된다. 순차적으로, 세포를 관심있는 유전자 또는 DNA와 제2 재조합 부위를 운반하는 플라스미드 및 리콤비나제 공급원(발현 플라스미드, RNA, 단백질, 또는 바이러스-발현 리콤비나제)으로 전달감염시킨다. 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합은 플라스미드 DNA의 삽입을 이끈다.
다른 구현예에서, 상기 부위-특이적 재조합은 결과적으로 결실 또는 절단된다. 포유동물 유전학에 있어서의 가장 흔한 적용은 정의된 발단 단계에서의 불활성화 또는 활성화이다. 염색체 또는 에피솜 DNA로부터 결실 또는 절단되는 DNA 또는 유전자는 제1 재조합 및 제2 재조합 부위의 직렬(직접) 반복에 의해 인접된다. 리콤비나제의 도입에 따른 상기 부위들 사이의 재조합은 DNA의 결실 및 유전자 불활성화를 이끈다. 다른 타입의 적용에서, 리콤비나제는 게놈으로부터 전사 중지 신호(프로모터와 유전자 사이에 위치)를 절단하는 것을 매개하여, 상기 프로모터 요소와 이식유전자의 열린 해독 틀을 연결시키고 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 리콤비나제는 지속적 또는 유도가능한 프로모터를 이용하거나, 또는 리콤비나제-발현 바이러스 벡터를 도입함으로써 발현될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 부위-특이적 재조합은 결과적으로 역위된다. 반대 방향으로 동일한 DNA 분자 내에 삽입된 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합(분자내 재조합)은 그 사이 DNA 세그먼트 또는 절편의 역위를 이끈다.
다른 구현예에서, 상기 부위-특이적 재조합은 결과적으로 DNA 교환된다. 먼저, 카세트 수용체(acceptor)가 염색체 내의 관심있는 위치에 생성된다. 상기 카세트 수용체는 관심있는 DNA 및 제1 재조합 부위(예를 들면, attB)의 어느 한쪽에 인접하는 선별 마커 유전자를 매우 자주 포함한다. 두 번째로, 상기 재조합 부위(예를 들면, attP)의 어느 한쪽에 인접하는 교체 DNA 카세트를 포함하는 교환 벡터가 상기 리콤비나제 발현 플라스미드 또는 리콤비나제 단백질과 함께 세포내로 도입된다. 상기 동일한 성질(cognate)의 재조합 인식 부위 사이의 이중 교차는 상기 제1 재조합 부위와 상기 교환 벡터에 의해 운반되는 부위 사이의 DNA 교체를 이끈다. 다른 경우에 있어서, 상기 제1 재조합 부위는 attP이고, 제2 재조합 부위는 attB이다. 상기 과정은 종종 리콤비나제-매개성 카세트 교환이라고 불린다.
다른 구현예에서, 상기 부위-특이적 재조합은 결과적으로 염색체 전좌된다. 염색체 전좌의 경우, 제1 재조합 부위는 제1 염색체 내에 도입되고, 제2 재조합 부위는 제2 염색체 내에 도입된다. 상기 세포에 리콤비나제를 공급하면, 상기 염색체의 전좌를 이끈다. 전좌는 재조합 부위들이 비-상동성 염색체에 표적화될 때 생성된다. 재조합 부위들의 상대적인 방향에 따라, 재조합은 전좌 또는 두 개의 동심원(dicentric) 및 중심을 벗어난(acentric) 염색체를 이끈다. 상기 재조합 부위들이 그들 각각의 동원체(centromere)에 대한 방향으로 위치한다면 전좌가 일어난다. 상기 재조합 부위가 반대 방향에 있다면, 재조합은 결과적으로 두 개의 동심원 및 중심을 벗어난 염색체가 될 것이다.
또한, 본 발명은 상기 게놈 내에 존재하는 유사 재조합 부착 부위에서의 리콤비나제-매개성 DNA 삽입을 포함한다. 상기 특이적 리콤비나제의 유사 재조합 또는 부착 부위는 상기 부위-특이적 리콤비나제가 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 포함하는 플라스미드 DNA를 삽입하기 위해 인식하고 이용할 수 있는 염색체 상에 존재하는 자연형 서열이다. 유사 재조합 부위에서의 삽입은 종종 무작위 삽입보다 더 자주 일어난다. 이것은 첫 번째 단계로 상기 게놈 내로 재조합 부위를 도입할 필요가 없다는 점에서 한단계 과정이다. 유사-부위에서의 삽입은 유전자 및 세포 치료에서 적용되고 있다. 유사 attB는 attP 부위와 결합하는 게놈 내에 존재하는 자연형 재조합 부위이다. 유사 attP는 attB 부위와 결합하는 게놈 내에 존재하는 자연형 재조합 부위이다. 따라서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 제1 재조합 부착 부위 및 제2 재조합 부착 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드로 접촉시켜서 상기 재조합 부착 부위들 사이를 재조합시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부위는 attP 또는 attB이고, 상기 제2 재조합 부착 부위는 유사 부착 부위이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
아울러, 본 발명은 안정적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 진핵생물 세포를 얻기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 핵산 서열 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제1 재조합 attB 또는 attP 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 안정적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 진핵생물 세포를 얻기 위한 것으로서, 핵산 서열 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제1 재조합 attB 또는 attP 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 발명은 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위에 인접한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 재조합 부위들 사이를 재조합시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제3 재조합 부위 및 상기 제2 및 제4 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 재조합 부위는 attP 또는 attB 이고, 상기 제3 및 제4 재조합 부위는 attB 또는 attP 이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제3 및 제4 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위가 attP이면 상기 제3 및 제4 재조합 부착 부위는 attB이다. 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구현예는 관심있는 폴리뉴클레오티드를 유전자이식 대상의 게놈 내로 부위-특이적으로 삽입하기 위한 방법을 제공하며, 상기 게놈은 제1 재조합 attB 또는 attP 부위 또는 유사 attB 또는 유사 attP 부위를 포함하고, 상기 방법은 관심있는 폴리뉴클레오티드 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 핵산을 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 제1 재조합 부위가 attB 또는 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP 또는 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB이다. 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 방법은 진핵생물 세포에서 다중 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위와 함께 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제3 및 제4 재조합 부위를 제2 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이를 재조합시키고 상기 제3 및 제4 재조합 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하며, 상기 제1 리콤비나제 폴리펩티드 및 상기 제2 리콤비나제 폴리펩티드가 다르다면, 상기 제1 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제2 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제3 및 제4 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 및 두번째 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법은 제5 재조합 부위 및 제6 재조합 부위 및 제3 리콤비나제 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제3 리콤비나제 폴리펩티드가 상기 제1 및 제2 리콤비나제 폴리펩티드와 다르다면, 상기 제3 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제5 및 제6 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있다.
아울러, 본 발명은 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드 또는 원핵생물 리콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포에 관한 것으로서, 상기 리콤비나제는 제1 재조합 부위 및 상기 제1 재조합 부위와의 재조합을 위한 기질로 작용할 수 있는 제2 재조합 부위 사이의 부위-특이적 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부위는 attP, 유사 attP, attB 또는 유사 attB이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB, 유사 attB, attP 또는 유사 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP 또는 유사 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 유사 attB이고, 상기 제1 재조합 부위가 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB이다. 바람직하게는, 상기 리콤비나제는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택된다.
세포
본 발명의 방법을 도입하여 변형하기에 적합한 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포 모두를 포함한다. 원핵생물 세포는 정의된 핵이 결여된 세포이다. 적합한 원핵생물 세포의 예로는 박테리아 세포, 마이코플라즈마 세포 및 아키박테리아(archaebacteria) 세포를 포함한다. 특히 바람직한 원핵생물 세포는 다양한 타입의 테스트 시스템에서 유용한 것(이하에서 보다 상세하게 설명함) 또는 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)(에탄올 제조), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)(부탄올 제조) 등과 같은 몇 가지 산업적인 유용성을 갖는 것(Green and Bennet, Biotech & Bioengineering 58: 215-221, 1998; Ingram, et al., Biotech & Bioengineering 58: 204-206, 1998)을 포함한다. 적합한 진핵생물 세포는 동물 세포(곤충, 설치류, 소, 염소, 토끼, 양, 비-인간 영장류, 인간 등으로부터 유래) 및 식물 세포(쌀, 옥수수, 목화, 담배, 토마토, 감자 등으로부터 유래) 모두를 포함한다. 특정한 목적에 적용될 수 있는 세포 타입은 이하에서 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 유전공학적으로 가공된 분리된 세포를 포함한다. 적합한 세포는 전술한 바와 같이 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포는 단세포 생명체이거나, 다세포 생명체로부터 유래된 것일 수 있다. 다세포 생명체로부터 유래된 유전공학적으로 가공된 세포에 대한 참고로서, “분리된”은 식물 또는 동물이든 세포가 살아있는 개체 외부에서 인공 환경 내에 있다는 것을 의미한다. “분리된”이란 용어를 사용하는 것은 유전공학적으로 가공된 세포가 유일하게 존재하는 세포인 것을 의미하는 것은 아니다.
한 구현예에서, 본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포는 본 발명의 핵산 구조체 중 하나를 임의로 포함한다. 두 번째 구현예에서, 관심있는 핵산 서열(들)이 그 게놈 내로 삽입될 수 있는 조건 하에서, 재조합 서열을 특이적으로 인식하는 리콤비나제가 본 발명의 핵산 구조체 중 하나를 포함하는 유전공학적으로 가공된 세포내로 도입된다. 따라서, 상기 유전공학적으로 가공된 세포는 변형된 게놈을 갖고 있다. 이러한 리콤비나제를 도입하는 방법은 기술 분야에서 잘 공지되어 있으며, 상기에서 논의되었다.
본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포는 다양한 방식으로 도입될 수 있다. 단세포 생명체는 재조합 단백질, 산업적 용매, 산업적으로 유용한 효소 등과 같은 상업적으로 유용한 물질들을 생산하기 위해 변형될 수 있다. 바람직한 단세포 생명체로는 효모(예를 들면, S. pombe, Pichia pastoris, (INVSc1과 같은) S. cerevisiae 등), 아스페르질리스(Aspergillis) 등과 같은 균류 및 클레브시엘라(Klebsiella), 스트렙토마이세스 등과 같은 박테리아를 포함한다.
다세포 생명체로부터 분리된 세포는 이와 유사하게 유용하며, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 식물 세포를 포함한다. 유용할 수 있는 포유동물 세포는 설치류, 영장류 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 이들은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 마우스 신경 줄기 세포, 래트 골수 스트로마(stroma) 세포, VERO, 3T3 또는 CHOK1과 같은 섬유아세포 기원의 세포, HEK 293 세포 또는 (32D 세포와 같은) 임파구 기원의 세포 및 이들의 유도체를 포함한다.
아울러, 담배 BY2 세포와 같은 식물 세포도 또한 숙주로 이용가능하며, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 및 19S, 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열 등과 같은 식물 세포와 양립가능한 조절 서열이 이용가능하다. 적합한 유전자이식 식물 세포는 유전자이식 식물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
다른 바람직한 숙주는 예를 들면 드로소필라 라르배(Drosophila larvae)로부터 유래된 곤충 세포이다. 곤충 세포를 숙주로 사용함으로써, 상기 드로소필라 알코올 디하이드로게나제(dehydrogenase) 프로모터가 사용될 수 있다(Rubin, Science 240: 1453-1459, 1988). 다른 한편으로, 배큘로바이러스 벡터는 곤충 세포에서 원하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 많은 양의 펩타이드를 발현하도록 가공될 수 있다(Jasny, Science 238: 1653, 1987); Miller et al., In: Genetic Engineering, 1986, Setlow, J.K., et al., eds., Plenum, Vol.8, pp.277-297).
본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포는 관심있는 핵산 절편에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하기 위한 도구로 또한 유용하다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포를 테스트 물질과 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 상기 테스트 물질과 접촉하지 않은 테스트 세포와 비교할 때 세포 형태, 세포 성장, 세포 분화, 단백질의 효소 활성 또는 단백질 및 상기 단백질의 자연형 결합 파트너(partner) 사이의 상호작용에 있어서의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는 스크리닝하는 방법을 포함한다.
펩티드, 단백질, 항체, 저분자량의 유기 화합물, 예를 들면 진균류 또는 식물 세포 등으로부터 유래된 자연형 산물을 포함하는 다양한 테스트 물질들이 본 발명의 유전공학적으로 가공된 세포를 이용하여 평가될 수 있다. “저분자량의 유기 화합물”은 일반적으로 500-1,000 이하의 분자량을 갖는 화학 종을 의미한다. 테스트 물질의 공급원은 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다.
또한, 세포를 도입하는 다양한 분석 방법은 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이들은 예를 들면 효소 활성 분석(Hirth, et al, 미국 특허 제5,763,198호, 1998년 6월 9일 등록), 유전공학적으로 가공된 세포에 의해 발현되는 단백질과 테스트 물질의 결합 분석, 리포터 유전자의 전사 활성 분석 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 변형된 세포는, 예를 들면 (ⅰ) 살아있지만 성장을 촉진하지 않는 상태로 유지, (ⅱ) 세포의 성장을 촉진, 및/또는 (ⅲ) 세포의 분화 또는 탈분화를 초래하는 조건 하에서 유지될 수 있다. 세포 배양 조건은, 비록 리콤비나제 활성의 조절이 배양 조건(예를 들면, 세포가 배양되는 온도를 높이거나 낮춤)에 의해 변형될 수도 있지만, 전형적으로는 세포내에서의 상기 리콤비나제 작용에 대해 허용성이다. 주어진 세포, 세포-타입, 조직, 또는 생명체에 대하여, 배양 조건은 기술 분야에 공지되어 있다.
유전자이식 식물 및 비-인간 물
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물을 도입함으로써 그 게놈이 변형된 유전자이식 식물 및 비인간 유전자이식 동물을 포함한다. 유전자이식 동물은 본 발명의 방법을 도입함으로써 제조될 수 있으며, 다양한 질환의 연구 및 이러한 질환을 조절하는 약물을 스크리닝하기 위한 모델 시스템으로 사용된다.
“유전자이식” 식물 또는 동물은 유전공학적으로 가공된 식물 또는 동물, 또는 유전공학적으로 가공된 식물 또는 동물의 자손을 나타낸다. 유전자이식 식물 또는 동물은 통상 바이러스와 같이 연관되지 않은 생명체 유래의 물질을 적어도 하나 포함한다. 유전자이식 생명체라는 문맥에서 사용되는 “동물”이란 용어는 인간을 제외한 모든 종을 의미한다. 또한, 배아 및 태아기를 포함하는 모든 발달 단계의 개별 동물을 포함한다. 농장의 동물(예를 들면, 닭, 돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), (마우스와 같은) 설치류 및 길들인 애완동물(예를 들면, 고양이 및 개)이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 상기 동물은 마우스 또는 래트이다.
“키메라” 식물 또는 동물이란 용어는 이형 유전자가 발견되거나, 또는 이형 유전자가 상기 식물 또는 동물 세포의 전부가 아닌 일부에서만 발현되는 식물 또는 동물을 나타내기 위해 사용된다.
또한, 유전자이식 동물이란 용어는 생식 세포주(germ cell line) 유전자이식 동물을 포함한다. “생식 세포주 유전자이식 동물”은 본 발명의 방법에 의해 제공되는 유전 정보가 받아들여져서 생식 세포주 내로 포함되고, 따라서 상기 정보를 자손에게 전달할 수 있는 능력을 갖는 유전자이식 동물이다. 사실, 이러한 자손이 상기 정보의 일부 또는 전부를 갖고 있다면, 이들 또한 유전자이식 동물이다.
유전자이식 식물 및 동물을 생성하는 방법은 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에서 개시된 내용과 조합하여 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 유전자이식 동물은 단일 세포 배아 내로 상기 세포가 유래되는 생명체의 게놈 내에서 발견되는 제2 재조합 부위와 결합할 수 있는 제1 재조합 부위 및 관심있는 핵산 절편을 포함하는 핵산 구조체를 상기 관심있는 핵산 절편이 성숙한 동물의 생식 세포주 DNA 내로 안정하게 삽입되어서 보통의 멘델 방식으로 유전되는 방식으로 도입함으로써 제조된다. 본 구현예에서, 상기 관심있는 핵산 절편은 전술한 절편 중 임의의 하나가 될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 관심있는 핵산 서열은 내인성으로 생성된 관심있는 단백질의 발현을 방해 또는 간섭해서, 관심있는 단백질의 발현이 감소된 유전자이식 동물을 생성하는 외인성 산물을 코딩할 수 있다.
유전자이식 동물을 제조하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 본 발명의 핵산 구조체는 암컷 및 수컷의 전핵(pronuclei)이 융합되기 전에 수정된 난자의 전핵 또는 세포질 내로 주입되거나, 또는 배아 세포의 핵(예를 들면, 2 세포 배아의 핵) 내로 주입될 수 있으며, 이후 세포 분열이 시작된다(Brinster, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 4438, 1985). 배아는 attD 재조합 부위 및 관심있는 핵산 서열로 변형된 바이러스, 특히 레트로바이러스로 감염될 수 있다. 상기 세포는 상기 관심있는 핵산 서열의 게놈 내 삽입을 촉진하기 위하여 전술한 부위-특이적 리콤비나제로 추가로 처리될 수 있다.
실시예 만을 위하여, 유전자이식 마우스를 제조하기 위하여 암컷 마우스는 과잉배란이 유도된다. 교미시킨 후, 상기 암컷을 CO2 질식 또는 경추 탈골에 의해 희생시키고, 절단된 난관으로부터 배아를 회수한다. 주위의 난구 세포(cumulus cell)는 제거한다. 이후, 전핵성 배아를 세척하고 주입시까지 보관한다. 무작위로 순환하는 성체 암컷 마우스를 정관을 제거한 수컷과 짝지운다. 수용자(recipient) 암컷은 공여자 암컷과 동일한 시점에 교미한다. 이후, 배아를 수술적으로 전달한다. 유전자이식 래트의 생성 절차는 마우스의 것과 유사하다(Hammer, et al., Cell 63: 1099-1112, 1990 참조). 유전자이식 실험에 적합한 설치류는 찰스 리버(Charles River, Wilmington, Mass), 타코닉(Taconic, Germantown, Y.Y.), 할란 스프래그 돌리(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Ind.) 등과 같은 상업적인 공급원으로부터 얻을 수 있다.
설치류 배아의 조작 및 DNA를 접합체(zygote)의 전핵 내로 미세주입하는 방법은 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다(Hogan, et al., supra). 물고기, 양서류 알, 및 새에 대한 미세주입 방법은 호우데빈 및 코우로우트의 문헌(Houdebine and Chourrout, Experientia 47: 897-905, 1991)에 상세히 기재되어 있다. 동물 조직 내로 DNA를 도입하기 위한 다른 방법은 미국 특허 제4,945,050(Sanford et al., 1990년 7월 30일)에 개시되어 있다.
상기 배아의 내부 세포괴(inner cell mass)로부터 유래되고 배지에서 안정화된 전능성(totipotent) 또는 다능성(pluripotent) 줄기 세포는 본 발명의 방법을 도입하는 핵산 서열을 삽입시키기 위해 배지에서 조작될 수 있다. 유전자이식 동물은 배반포(blastocyst) 내로 주입한 후, 대리모에 이식하여 시간을 보냄으로써 이러한 세포로부터 제조될 수 있다.
줄기 세포의 배양 및 전기천공, 칼슘 포스페이트/DNA 침전, 미세주입, 리포좀 융합, 레트로바이러스 감염 등과 같은 방법을 이용하여 줄기 세포내로 DNA를 도입함으로써 유전자이식 동물을 순차적으로 생성하는 방법 또한 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, 1987 참조). 이형 DNA를 포유동물(마우스, 돼지, 토끼, 양, 염소, 소)의 수정된 난자 내로 미세주입하기 위한 표준 실험 방법에 대한 리뷰는 다음의 문헌들을 포함하며, 해당 내용은 참조로서 포함되어 있다: Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort et al., 1991, Bio/Technology 9: 86; Palmiter et al., 1985, Cell 41: 343; Kraemer et al., Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1985); Hammer et al., 1985, Nature, 315: 680; Purcel et al., 1986, Science, 244: 1281; Wagner et al., 미국 특허 제5,175,385; Krimpenfort et al., 미국 특허 제5,175,384.
상기 방법의 마지막 단계는 표적화된 ES 세포를 배반포 내로 주입하고, 상기 배반포를 가임신 암컷에 전달하는 것이다. 결과물인 키메라 동물을 키우고, 그 자손을 서던 블롯으로 분석하여 상기 이식유전자를 운반하는 개체를 확인한다. 비-설치류 포유동물 및 다른 동물의 생산 방법은 다른 문헌에서 논의되어 있다(Houdebine and Chourrout, supra; Pursel, et al., Science 244: 1281-1288, 1989; 및 Simms, et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988). 상기 이식유전자를 운반하는 동물은 예를 들면 점 블롯 또는 서던 블롯과 같이 기술 분야에서 잘 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자 이식이란 용어는 초기 배아 또는 수정된 난자를 시험관내에서 조작하거나, 특정한 유전자의 녹아웃(knockout)을 유도하기 위한 임의의 유전자이식 기술에 의해 그 게놈이 변형된 임의의 생명체를 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “유전자 녹아웃”이란 용어는 본 발명의 벡터를 이용함으로써 달성된 기능이 상실된 생체내 유전자의 표적화된 파괴를 나타낸다. 한 구현예에서, 유전자 녹아웃을 갖는 유전자이식 동물은 상기 유전자 서열 내에 위치한 유사-재조합 부위의 표적화에 의해 상기 유전자의 기능을 상실하게 하도록 표적화된 삽입에 의해 상기 표적 유전자의 기능이 상실된 것이다.
유전자 치료 및 질환
본 발명의 다른 구현예는 치료를 필요로 하는 대상에서의 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 한 구현예에서, 상기 대상의 적어도 하나의 세포 또는 세포 형태(또는 조직, 등)는 재조합 부위를 갖는다. 이러한 세포(들)는 제2 재조합 서열 및 하나 이상의 관심있는 폴리뉴클레오티드(전형적으로는 치료 유전자)를 포함하는 핵산 구조체(“표적 구조체”)로 형질전환된다. 동일한 세포내로, 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합 사건을 통해 상기 관심있는 핵산 서열이 그 게놈 내에 삽입되는 조건 하에서 상기 재조합 서열을 특이적으로 인식하는 리콤비나제가 도입된다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 대상은 인간 및 비-인간 동물 모두를 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 표적 구조체 및 리콤비나제를 이용한다.
단일 유전자(monogenic) 질환, 감염성 질환, 획득한 질환, 암 등을 포함하는 다양한 질환이 본 발명의 방법을 도입함으로써 치료될 수 있다. 단일 유전자 질환의 예시로는 ADA 결핍증, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 가족성 고콜레스테롤혈증(familial-hypercholesterolemia), 혈우병, 만성 가눌로마터스(ganulomatous) 질환, 뒤시엔느 근위 영양증(Duchenne muscular dystrophy), 판코니 빈혈(Fancony anemia), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle-cell anemia), 고셔병(Gaucher's disease), 헌터 증후군(Hunter syndrome), X-연관된 SCID 등을 포함한다.
본 발명의 방법을 도입함으로써 치료될 수 있는 감염성 질환은 인간 T-세포 림포트로픽 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파필로마 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 면역결핍 바이러스(HIV 등), 사이토메갈로바이러스 등을 포함하는 다양한 타입의 바이러스 감염을 포함한다. 또한, 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium Tuberculosis), 마이코플라즈마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae) 등과 같은 다른 병원성 생명체 또는 플라스마디움 팔시파룸(Plasmadium falciparum) 등과 같은 기생충 감염을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “획득한 질환“이란 용어는 비선천성 질환을 나타낸다. 이러한 질환은 일반적으로 단일 유전자 질환보다 더 복잡한 것으로 간주되며, 하나 이상의 유전자의 부적절한 또는 불필요한 활동의 결과일 수 있다. 이러한 질환의 예로는 말초 동맥 질환(peripheral artery disease), 류마티스 관절염, 관상 동맥 질환 등을 포함한다.
본 발명의 방법을 도입함으로써 치료될 수 있는 특정한 획득 질환 군은 고형 종양 및 백혈병 및 림프종과 같은 혈액암 모두를 포함하는 다양한 암을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 고형 종양은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 골종(osteoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma) 등을 포함한다. 특정한 암으로는 유방암, 뇌암, 폐암(비-소세포 및 소세포), 대장암, 췌장암, 전립선암, 위암, 방광암, 신장암, 두경부암 등을 포함한다.
게놈 내의 특정한 위치의 적합성은 부분적으로는 치료되는 특정한 질환에 의존한다. 예를 들면, 상기 질환이 단일 유전자 질환이고, 원하는 치료가 상기 질환의 원인으로 작용한다고 생각되는 핵산의 비-돌연변이 형태를 코딩하는 치료 핵산의 추가라면, 적합한 위치는 어떠한 단백질도 코딩하지 않고 상기 추가된 핵산을 적당한 수준으로 발현하도록 하는 게놈 영역일 수 있다. 상기 게놈 내에서 적합한 위치를 확인하는 방법은 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 하기 실시예에서 추가로 개시하고 있다.
본 구현예에서 유용한 핵산 구조체는 관심있는 핵산 절편을 하나 이상 추가로 포함한다. 본 구현예에서 사용되기 위한 바람직한 관심있는 핵산 절편은 앞서 정의된 바와 같은 치료 유전자 및/또는 조절 영역이다. 핵산 서열의 선택은 치료되는 질환의 본성에 의존할 것이다. 예를 들면, 응고 인자 Ⅸ의 결핍에 의해 유발되는 혈우병 B를 치료할 목적인 핵산 구조체는 기능성 인자 Ⅸ를 코딩하는 핵산 절편을 포함할 수 있다. 폐색성(obstructive) 말초 동맥 질환을 치료할 목적인 핵산 구조체는 예를 들면 혈관 내피세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor), 혈소판-유래 성장 인자 등과 같은 신생 혈관의 성장을 촉진하는 단백질을 코딩하는 핵산 절편을 포함할 수 있다. 당업자는 어떤 관심있는 핵산 절편이 특정한 질환의 치료에 유용할 것인지를 용이하게 인식할 것이다.
상기 핵산 구조체는 다양한 방법을 이용하여 치료되는 대상에게 투여될 수 있다. 투여는 생체내 또는 생체외에서 일어날 수 있다. “생체내”는 동물의 살아있는 신체를 의미한다. “생체외”는 세포 또는 기관이 신체 밖에서 변형되고, 이러한 세포 또는 기관이 전형적으로 살아있는 신체로 되돌아오는 것을 의미한다.
핵산 구조체를 치료학적으로 투여하기 위한 방법은 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 핵산 구조체는 양이온성 지질(Goddard, et al., Gene Therapy, 4: 1231-1236, 1997; Gorman, et al., Gene Therapy 4: 1289-1299, 1997; Gao, and Huang, Gene Therapy 2: 710-722, 1995, 이들 모두는 본 명세서 내에 참조로 포함됨)과 함께 운반되거나, 바이러스 벡터를 이용하여 운반되거나(Monahan, et al., Gene Therapy 4: 40-49, 1997; Onodera, et al., Blood 91: 30-36, 1998, 이들 모두는 본 명세서 내에 참조로 포함됨), “네이키드 DNA”의 섭취 등에 의해 운반될 수 있다. 세포의 전달감염 분야에서 잘 공지된 기술(전술한 내용 참조)이 핵산 구조체의 생체외 투여에 사용될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태에 따라 개별 내과의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl).
상기 간호하는 내과의사는 독성, 기관의 기능장애 등으로 인해 어떻게 그리고 언제 투여를 중지, 일시적 중지(interrupt), 또는 조절해야 하는지를 알 것이다. 반대로, 상기 간호하는 내과의사는 또한 임상적인 반응이 적절하지 않을 때(독성은 배재함) 더 높은 레벨로 치료를 조절하는 방법을 알 것이다. 치료되는 질환을 다룸에 있어서의 투여량의 정도는 치료되는 질환의 심각성, 투여 경로 등에 따라 다양할 것이다. 상기 질환의 심각성은 예를 들면 부분적으로는 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 아울러, 상기 투여량 및 어쩌면 투여 빈도는 또한 나이, 체중, 및 개별 환자의 반응에 따라 다양할 것이다.
일반적으로, 게놈의 변형을 위해 표적화된 세포의 적어도 1-10%가 질환의 치료시에 변형될 것이다. 따라서, 투여 방법 및 경로는 선택적으로 투여 당 적어도 0.1-1%의 표적 세포를 변형하도록 선택될 것이다. 이러한 방식에 있어서, 투여 횟수는 치료 효능 및 편리성을 증가시키기 위해 최소로 유지될 수 있다.
치료되는 특정한 조건에 따라, 상기 제제는 전신 또는 국소 투여 및 제형화될 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Renington's Pharmaceutical Sciences", 1990, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa 에서 발견될 수 있다. 적합한 경로를 단지 몇 가지 언급하자면, 경구, 직장, 경피, 질내, 점막, 또는 장내 투여; 비경구 운반, 근육내, 피하, 수질내(intramedullary) 주사 뿐만 아니라 건초내(intrathecal), 직접 뇌실내(intraventricular), 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안구내 주사를 포함할 수 있다.
치료되는 대상은 사용시 선택되는 상기 제1 및 제2 재조합 서열을 특이적으로 인식하는 리콤비나제가 추가로 투여될 수 있다. 상기 특정한 리콤비나제는 핵산 구조체의 일부로서 이를 코딩하는 핵산을 포함하거나, 또는 그 게놈이 변형되는 세포에 의해 섭취되는 단백질로서 투여될 수 있다. 투여 방법 및 경로는 재조합 서열 및 관심있는 핵산 서열을 포함하는 표적 구조체의 투여에 대해 상기에서 기술한 것과 유사할 것이다. 상기 리콤비나제 단백질은 관심있는 핵산 서열을 삽입하기 위한 제한된 기간동안만 요구될 것이다. 따라서, 리콤비나제 유전자로 도입된다면, 상기 리콤비나제 유전자를 운반하는 벡터는 연장된 체류(retention)를 매개하는 서열이 없을 것이다. 예를 들면, 전통적인 플라스미드 DNA는 대부분의 포유동물 세포에서 즉시 없어진다. 상기 리콤비나제 유전자는 또한 그 발현을 제한하는 유전자 발현 서열을 구비할 수 있다. 예를 들면, 유도가능한 프로모터를 사용함으로써, 리콤비나제의 발현은 상기 유도 제제에 제한적으로 노출됨으로써 시간적으로 조절될 수 있다. 이러한 프로모터의 한 예시 군으로는 엑디손-반응성 프로모터가 있으며, 그 발현은 엑디스테로이드 또는 다른 비-스테로이드 작용약(agonist)을 이용함으로써 조절될 수 있다. 다른 프로모터 군은 테트라사이클린-반응성 프로모터가 있으며, 그 발현은 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 이용함으로써 조절될 수 있다.
도 1은 표적 상의 attP 및 attB 부위 사이의 재조합을 검출하기 위한 리콤비나제의 능력을 평가하거나, 또는 실시예에서 개시된 플라스미드를 평가하기 위해 사용되는 일시적 분자내 재조합 분석(transient intramolecular recombination assay, TIRA)을 보여주는 개략도이다.
도 2는 인간 배아 신장(HEK293) 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 3은 마우스 NIH3T3 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 4는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 5는 인간 HeLa 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 6은 래트 골수 스트로마 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 7은 마우스 신경 줄기 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 8은 담배 BY2 세포내에서 수행된 다양한 리콤비나제에 대한 TIRA 결과를 보여준다.
도 9는 attP 또는 attB 서열을 포함하는 플라스미드 DNA가 상기 attB 또는 attP 부위를 포함하는 HEK293 염색체 내로 안정하게 삽입된 것을 보여주는 개략도이다.
도 10은 attP 또는 attB 서열을 포함하는 플라스미드 DNA가 상기 attB 또는 attP 부위를 포함하는 HEK293 세포 염색체 내로 안정하게 삽입된 후에 attL 및 attR을 PCR 증폭한 결과를 보여준다.
도 11은 안정적으로 삽입된 STOP 서열의 절단 및 리콤비나제에 의한 루시퍼라제 활성의 활성화를 보여주는 개략도이다.
도 12는 안정적으로 삽입된 STOP 서열의 절단 및 리콤비나제에 의한 루시퍼라제 활성의 활성화 결과를 보여준다.
도 13은 HEK293 세포내에 존재하는 자연형의 유사 attB 또는 유사 attP 부위에 attP 또는 attB 재조합 부위를 포함하는 플라스미드가 삽입된 것을 보여주는 개략도이다.
도 14는 SF370.1에 대한 자연형의 유사 attB 부위 및 HEK293 세포에서 확인된 SPβc2 리콤비나제의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
일반적인 방법
본 명세서에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 해당 분야에서 잘 공지되어 있으며, 샘브룩, J. 등(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. 1989), T.J. 실하비 등(T.J. Silhavy, M.L. Bennan, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1984) 및 오스벨, F.M. 등(Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New Youk, NY, 1987)에 의해 개시되어 있다. 박테리아 배양의 유지 및 성장을 위해 적합한 물질 및 방법은 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 하기 실시예에서 사용되기에 적합한 기술은 하기 문헌에 제시된 내용에서 발견될 수 있다: Philipp, G. et al., Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1994; 또는 Brock, T.D. Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, 1989. 숙주 세포의 성장 및 유지에 사용되는 모든 시약, 제한 효소 및 물질들은, 달리 언급하지 않는 한, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(Beverly, MA), 인비트로젠(Carlsbad, CA), 스트라타진(La Jolla, CA), 프로메가(Madison, WI), DIFCO 래브러토리스(Detroit, MI), 또는 시그마/알드리치 화학(St. Louis, MO)으로부터 구입하였다.
유전자 서열의 조작 및 폴리뉴클레오티드 및 펩티드 서열의 배열 및 비교는 인비트로젠(Carlsbad, CA)(Vector NTI 소프트웨어 버전 8.0), DNASTAR (Madison,WI)(DNASTAR 소프트웨어 버전 6.0), 또는 지네틱스 컴퓨터 그룹(Madison, WI)(위스콘신 페키지 버전 9.0)으로부터 구입가능한 프로그램 수트를 이용하여 달성될 수 있다.
약자의 의미는 다음과 같다: “h”는 시간(들)을 의미하고,“㎕ ”는 마이크로리터(들)를 의미하며,“㎖ ”는 밀리리터(들)를 의미하고,“ℓ ”는 리터(들)를 의미하며,“μM”은 마이크로몰라(micromolar)를 의미하고, “mM”은 밀리몰라를 의미하며, “ng”은 나노그램(들)을 의미하고,“㎍ ”은 마이크로그램(들)을 의미하며,“㎎ ”은 밀리그램(들)을 의미하고,“A”는 아데닌 또는 아데노신을 의미하며, “T”는 티민 또는 티미딘을 의미하고,“G”는 구아닌 또는 구아노신을 의미하며, “C”는 시티딘 또는 시토신을 의미하고,“nt”는 뉴클레오티드(들)를 의미하며, “aa”는 아미노산(들)을 의미하고,“bp”는 염기쌍(들)을 의미하며, “kb”는 킬로염기(들)를 의미하고,“k”는 킬로를 의미하며, “μ”는 마이크로를 의미하고, “φ”는 파이를 의미하며, “β”는 베타를 의미하고, “SE”는 표준 오차(standard error)를 의미하며,“Luc”는 반딧불이 루시퍼라제(luciferase)를 의미하고, “RLuc”는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제를 의미하며,“℃ ”는 섭씨를 의미한다.
하기 실시예는 진핵생물 세포에서 기능을 하는 바실러스 서브틸리스 박테리오파지 SPβc2, 스트렙토코커스 피오게네스 박테리오파지 SF370.1, 마이코박테리움 스메그마티스 박테리오파지 Bxb1, 리스테리아 모노사이토게네스 박테리오파지 A118, 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리오파지 φRv1로부터 유래된 부위-특이적 리콤비나제 시스템을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 리콤비나제 유전자 및 분자내 재조합 분석 플라스미드의 디자인, 합성 및 클로닝
공개된 문헌 및 진뱅크에서 입수가능한 서열을 분석한 후, 포유동물 및 식물 세포에서의 DNA 삽입, 절단, 역위 및 교체를 위한 무수한 부위-특이적 리콤비나제를 선별 및 분석하였다. 세린 패밀리에 속하는 큰 부위-특이적 리콤비나제(Smith, M.C. and H.M. Thorpe 2000 Diversity in the serine recombinases, Mol. Microbiol., 44: 299-307)에 대한 아미노산 서열은 진뱅크로부터 입수하였으며, DNA로 역번역하였다. 상기 리콤비나제의 공급원이 박테리아 또는 박테리아 바이러스 유래였기 때문에, 본 발명자는 코딩되는 아미노산 서열의 변경없이 포유동물 세포에서의 리콤비나제 발현을 위해 DNA 서열을 최적화하였다. 상기 유전자들은 고등한 인간 및 마우스에서의 발현을 위한 코돈(codon)을 이용하여 클로닝을 위한 편리한 제한효소 부위와 함께 전체적으로 합성하였다. 아울러, 매우 높은(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량을 갖는 영역은 가능한 피하였다. 아울러, 최적화하는 동안에는 RNA의 안정성 및 번역을 최적화하기 위하여 다음의 시스-작용성 서열 모티프는 피하였다:
- 내부(internal) TATA-박스, 카이(chi)-부위 및 리보좀 진입(entry) 부위
- AT-풍부(rich) 또는 GC-풍부 서열 스트레치(stretch)
- 반복 서열 및 RNA 2차 구조
- (모호한(cryptic)) 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 분지점
- 폴리(A) 부위
상기 코돈 및 RNA 최적화 결과, 자연형(즉, 진뱅크에서 입수가능한 DNA 서열) 및 합성 유전자 사이에 20-30%의 서열이 차이가 났다. 상기 리콤비나제를 코딩하는 합성 유전자는 스트라타진(La Jolla, CA, 카탈로그 번호 214501)으로부터 구입한 포유동물 및 대장균 발현 플라스미드 pDual 내로 클로닝하였다. pDual 발현 벡터는 포유동물 및 원핵생물 세포 양쪽 모두에서 이형 유전자의 발현을 이끈다. 포유동물 세포에서의 지속적인 발현을 위하여, 상기 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자(immediate early gene)의 프로모터/인핸서를 포함한다. 상기 리콤비나제 유전자는 상기 CMV 프로모터 및 SV40 터미네이터 서열 사이에 존재하는 유일한(unique) Eam 1104 I 제한 효소 부위에 클로닝한다. 상기 유전자 서열을 합성하는 과정에서, 본 발명자는 Eam 1104 I 효소를 이용한 소화 및 상기 pDual 플라스미드와 동일한 부위에서의 클로닝을 촉진하기 위하여 상기 유전자의 시작(개시 코돈인 ATG 이전) 및 끝(중지 코돈인 TAG 이후)에 Eam 1104 I 제한 효소 인식 부위를 첨가하였다. 합성 유전자의 클로닝, pDual 벡터내로의 클로닝 이후 상기 유전자 서열을 확인하기 위한 클론의 시퀀싱은 표준 DNA 클로닝 방법(Sambrook, J.E.F. Fritsch, et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)을 이용하여 수행하였다. 발현 플라스미드에 대한 설명은 아래와 같다.
1.1 Spbc2 리콤비나제 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 바실러스 서브틸리스 파지 SPβc2의 부위-특이적 DNA 리콤비나제 yokA(서열번호 2, 진뱅크 기탁 번호 T12765, Lazarevic, V., A. Dusterhoft, et al., 1999, Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis template bacteriophage SPβc2. Microbiology 145: 1055-67)를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 1) 코돈을 스트라타진(La Jolla, CA)에 의해 제시된 방법에 따라 Eam 1104 I 제한효소 부위에서 pDual 박현 벡터내로 클로닝하였다.
1.2 SF370 .1 리콤비나제 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 스트렙토코커스 피오게네스 박테리오파지 SF370.1의 유사 리콤비나제(서열번호 4, 진뱅크 기탁 번호 T12765, Canchaya, C., F. Desiere, et al., 2002, Genome analysis of an inducible prophage and prophage remnants integrated in the Streptococcus pyogenes strain SF370. Virology 302: 245-58)를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 3) 코돈을 스트라타진(La Jolla, CA)에 의해 제시된 방법에 따라 Eam 1104 I 제한효소 부위에서 pDual 박현 벡터내로 클로닝하였다.
1.3 Bxb1 리콤비나제 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 마이코박테리움 스메그마티스 박테리오파지 Bxb1의 유사 리콤비나제(서열번호 6, 진뱅크 기탁 번호 AAG59740, Mediavilla, J., S. Jain, et al., 2000, Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxb1. Mol. Microbiol. 38: 955-70)를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 5) 코돈을 스트라타진(La Jolla, CA)에 의해 제시된 방법에 따라 Eam 1104 I 제한효소 부위에서 pDual 박현 벡터내로 클로닝하였다.
1.4 A118 리콤비나제 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 리스테리아 모노사이토게네스 박테리오파지 A118의 유사 리콤비나제(서열번 호 8, 진뱅크 기탁 번호 CAB53817, Loessner, M.J., R.B. Inman, et al., 2000, Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes: implications for phage evolution, Mol. Microbiol. 35: 324-40)를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 7) 코돈을 스트라타진(La Jolla, CA)에 의해 제시된 방법에 따라 Eam 1104 I 제한효소 부위에서 pDual 박현 벡터내로 클로닝하였다.
1.5 φ Rv1 리콤비나제 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리오파지 φRv1의 유사 리콤비나제(서열번호 10, 진뱅크 기탁 번호 CAB09083, Bibb, L.A. and G.F. Hatfull 2002, Integration and excision of the Mycobacterium tuberculosis prophage-like element, phiRv1. Mol. Microbiol. 45: 1515-26)를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 9) 코돈을 스트라타진(La Jolla, CA)에 의해 제시된 방법에 따라 Eam 1104 I 제한효소 부위에서 pDual 박현 벡터내로 클로닝하였다.
1.6 A118 리콤비나제 식물 발현 플라스미드: 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 리스테리아 모노사이토게네스 박테리오파지 A118의 유사 리콤비나제를 코딩하는 합성 DNA 서열(서열번호 5) 코돈을 카사바 베인 모자이크 프로모터 NOS 터미네이터 서열(Verdaguer, B., A. Kochko et al., 1998, Functional Organization of the cassava vein mosaic virus(CsVMV) promoter. Plant Mol. Biol. 37: 1055-67) 사이의 식물 발현 플라스미드 pILTAB358 내로 클로닝하였다. pILTAB 플라스미드 DNA는 Donald Danforth Center for Plant Research (St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 상기 구조체는 CMV 프로모터 및 SV40 터미네이터가 각각 카사바 베인 모자이크 프로모터 및 35S 터미네이터로 교체된 것을 제외하고는 동물 세포에서 사용된 것과 유사하다.
분자내 재조합 분석 플라스미드의 디자인 및 구축
플라스미드 gWizTM Luc (Gene Therapy Systems, San Die해, CA)을 이용하여 분자내 재조합 분석 플라스미드를 구축하였다. 상기 플라스미드는 대장균에서 카나마이신 저항성을 부여하며, 포유동물 세포내로 도입될 때 상기 CMV 프로모터로부터 지속적으로 루시퍼라제 유전자를 발현한다. 또한, 상기 벡터는 상기 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자의 개시 코돈 사이의 유일한 Sal I 및 Not I 제한효소 부위를 포함한다. 제한효소 Apa I 및 Nhe I에 대한 인식 부위는 상기 Sal I 및 Not I 부위 사이에 올리고뉴클레오티드를 삽입함으로써 생성하였다. 유사하게, 상기 attB 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 상기 Nhe I 및 Not I 부위 사이에 삽입하였다. 1,296 bp의 전사 종결 또는 STOP 서열을 플라스미드 pBS302 (Genbank 기탁번호 U51223, 뉴클레오티드 193-1488)로부터 PCR 증폭하였으며, attP 및 attB 부위 사이의 Apa I 및 Nhe I 부위에 클로닝하였다. 최종 구조체는 도 1에 나타난 바와 같이 상기 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 위치한 attP, STOP, 및 attB 서열을 갖고 있다. 상기 플라스미드는 attP 및 attB 부위 사이의 재조합에 따라 STOP 서열이 결실된 후에만 루시퍼라제 유전자를 발현할 것이다. 상기 분자내 재조합 분석 플라스미드에 대한 설명은 아래에 나타나 있다.
1.7 SP β c2 분자내 재조합 분석 플라스미드: SPβc2 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 99 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 11), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12) 및 SPβc2 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 96 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 13)을 상기 순서대로 gWizTM Luc 플라스미드의 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 클로닝하였다.
1.8 SF370 .1 분자내 재조합 분석 플라스미드: SF370.1 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 99 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 14), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12) 및 SF370.1 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 96 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 15)을 상기 순서대로 gWizTM Luc 플라스미드의 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 클로닝하였다.
1.9 Bxb1 분자내 재조합 분석 플라스미드: Bxb1 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 52 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 16), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12) 및 Bxb1 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 46 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 17)을 상기 순서대로 gWizTM Luc 플라스미드의 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 클로닝하였다.
1.10 A118 분자내 재조합 분석 플라스미드: A118 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 99 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 18), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12) 및 A118 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 96 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 19)을 상기 순서대로 gWizTM Luc 플라스미드의 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 클로닝하였다.
1.11 φ Rv1 분자내 재조합 분석 플라스미드: φRv1 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 99 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 20), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12) 및 φRv1 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 96 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 21)을 상기 순서대로 gWizTM Luc 플라스미드의 CMV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자 사이에 클로닝하였다.
1.12 A118 분자내 재조합 분석 플라스미드: A118 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 99 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 18), 1,296 bp의 STOP 서열(서열번호 12), A118 리콤비나제의 attB 부위를 포함하는 96 bp 합성 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 19) 및 루시퍼라제 유전자를 상기 순서대로 pILTAB358의 카사바 베인 모자이크 프로모터 및 NOS 서열 사이에 클로닝하였다.
실시예 2. 일시적 분자내 재조합 분석
포유동물 및 식물 세포에서 상기 리콤비나제의 활성을 결정하기 위하여, 일시적 분석(transient assay)을 개발하였다. 간략히 설명하면, 상기 분석은 상기 리콤비나제 유전자를 발현 플라스미드 내로 클로닝하는 단계, 대응하는 분자내 재조합 분석 플라스미드를 제조하는 단계, 상기 플라스미드 DNA들을 전달감염으로 세포내로 도입하는 단계, 및 루시퍼라제 효소 활성을 분석하는 단계로 구성되어 있다. 상기 리콤비나제 분석 플라스미드는 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 리포터 유전자 - 터미네이터 서열을 포함하였다. 상기 STOP 서열은 전사 종결 신호 서열이다. 재조합이 없으면, 상기 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현은 상 기 프로모터 및 리포터 유전자 사이에 존재하는 STOP 서열에 의해 방지된다. 리콤비나제의 도입으로 인해 상기 attP 및 attB 사이가 재조합되면 결과적으로 상기 STOP 서열이 결실되고 리포터 유전자가 활성화된다. 상기 분석은, 꺼짐(OFF)과 켜짐(ON) 포맷(format)이고, 루시퍼라제 리포터의 양은 루미노미터(luminometer)를 이용하여 루시퍼라제에 의해 방출된 빛을 검출함으로써 용이하게 분석될 수 있기 때문에, 민감하고 확실하다. 상기 분석 포맷은 도 1에 그래프로 나타나 있다.
일시적 전달감염 및 루시퍼라제 분석
세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA로부터 구입)을 포함하는 DMEM 또는 지시된 다른 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 전달감염시킨 날, 사용되는 세포 타입에 따라 다른 밀도로 플레이트에 세포를 분주하였다. 상기 세포를 분자내 재조합 분석 플라스미드 단독 또는 다양한 양의 리콤비나제 발현 플라스미드 DNA와 함께 리포펙타민(Lipofectamine) 2000TM을 이용하여 제조사(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 지침에 따라 전달감염시켰다. 지속적으로 발현되는 Renilla 루시퍼라제 리포터 플라스미드(프로메가사의 pRL-CMV, Madison, WI)를 함께 전달감염시켰고(2 ng/웰), 데이터를 정상화시키기 위한 내부 대조군으로 사용하였다. (세포주에 따라) 전달감염 24 또는 48시간 후, 배지를 버리고 세포를 수동 용해 버퍼(passive lysis buffer, Promega, Madison, WI)를 이용하여 용해시켰다. 이후, 추출물을 이중 루시퍼라제 분석 키트(Promega, Madison, WI)를 이용하여 주사기(injector)가 장착된 플레이트 판독기(Dynex Technologies, Chantilly, VA) 상에서 분석하였다. 나타난 데이터는 달리 언급하지 않는 한 루시퍼라제(Luc) 및 Renilla 루시퍼라제(RLuc) 활성의 비이다. Luc 활성(상대 빛 단위)이 비교될 때에도 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 미도시). 복제물(replicate) 및 실험의 수가 다른 구조체 및 세포주에 따라 다양하였으므로, 실험상의 편차를 나타내기 위해 표준 오차를 사용하였다.
2.1 인간 HEK293 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
세포(96-웰 플레이트에서 20,000 세포/웰)를 25 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 0, 10, 25, 또는 75 ng의 대응하는 리콤비나제 플라스미드로 전달감염시켰고, 24시간동안 배양하였다. 세포를 50 ㎕의 수동 용해 버퍼로 용해시켰고, 25 ㎕의 추출물을 분석하였다. 6 내지 20개의 복제물 분석을 수행하였고, Luc/RLuc (평균값)±SE의 비를 그래프로 나타내었다(plotted). 도 2에서 바(bar)보다 높은 값은 배수 유도(fold induction)(리콤비나제 플라스미드 존재시의 루시퍼라제 활성과 리콤비나제 플라스미드 부재시의 활성의 비)를 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 분자내 재조합 분석 플라스미드만을 전달감염시키면 매우 적은 루시퍼라제 활성을 나타내었다(Luc/RLuc의 비로 주어짐). A118 분자내 재조합 분석 플라스미드와 함께 증가되는 양의 A118 리콤비나제 발현 플라스미드(10, 25 또는 75 ng)를 전달감염시키면 상기 루시퍼라제 활성이 증가하였다. 또한, 유사한 결과가 SF370.1, SPβc2, φRV1 및 Bxb1에 대해서도 관찰되었다. 상기 결과는 상기 리콤비나제가 HEK293 세포에서 기능을 나타낸다는 것을 명확하게 나타낸다. 상기 리콤비나제는 attP 및 attB 사이의 재조합을 매개하였고, 상기 분자내 재조합 분석 플라스미드 상의 STOP 서열을 결실시켰으며, 상기 루시퍼라제 유전자의 발현을 활성화시켰다.
2.2 마우스 NIH3T3 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
세포(96-웰 플레이트에서 5,000 세포/웰)를 25 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 0, 10, 25, 또는 75 ng의 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드로 전달감염시켰고, 24시간동안 배양하였다. 세포를 50 ㎕의 수동 용해 버퍼로 용해시켰고, 25 ㎕의 추출물을 분석하였다. 2 내지 14개의 복제물 분석을 수행하였고, Luc/RLuc (평균값)±SE의 비를 그래프로 나타내었다. 도 3에서 바(bar)보다 높은 값은 배수 유도를 나타낸다.
도 3은 분자내 재조합 분석 플라스미드 단독 또는 증가되는 양의 리콤비나제 발현 플라스미드(10, 25 또는 75 ng)와 함께 NIH3T3를 전달감염시킨 것으로부터 얻은 데이터를 나타낸다. 리콤비나제 플라스미드 및 분자내 재조합 분석 플라스미드의 동시 전달감염은 루시퍼라제 활성을 몇 배 증가시켰다. 예를 들면, 25 ng의 Bxb1 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 75 ng의 Bxb1 리콤비나제 발현 플라스미드로 세포를 전달감염시키면 25 ng의 Bxb1 분자내 재조합 분석 플라스미드만을 전달감염시킨 것과 비교할 때 루시퍼라제 활성이 66배 증가하였다. Bxb1과 유사하게, A118, SF370.1, SPβc2 및 φRV1 또한 루시퍼라제 활성을 증가시켰으며(도 3), 이것은 상기 리콤비나제가 마우스 NIH3T3 세포에서 기능을 나타내고, attP 및 attB 부위를 결합시키는데 있어서 효과적이라는 것을 보여준다.
2.3 중국 햄스터 난소( CHO ) 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
세포(96-웰 플레이트에서 15,000 세포/웰)를 25 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 0, 10, 25, 또는 75 ng의 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드로 전달감염시켰고, 24시간동안 배양하였다. 세포를 50 ㎕의 수동 용해 버퍼로 용해시켰고, 25 ㎕의 추출물을 분석하였다. 2 내지 8개의 복제물 분석을 수행하였고, Luc/RLuc (평균값)±SE의 비를 그래프로 나타내었다. 도 4에서 바(bar)보다 높은 값은 배수 유도를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 분자내 재조합 분석 플라스미드 A118, SF370.1 또는 φRV1만을 전달감염시키면 루시퍼라제 활성이 없거나 매우 적은 활성을 나타내었다. 증가되는 양의 대응하는 A118, SF370.1 또는 φRV1 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 전달감염시키면 상기 루시퍼라제 활성이 증가하였다. 상기 결과는 상기 리콤비나제가 CHO 세포에서 기능을 나타낸다는 것을 명확하게 나타낸다. 상기 리콤비나제는 attP 및 attB 사이의 재조합을 매개하였고, 상기 분자내 재조합 분석 플라스미드 상의 STOP 서열을 결실시켰으며, 상기 루시퍼라제 유전자의 발현을 활성화시켰다.
2.4 인간 HeLa 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
세포(96-웰 플레이트에서 15,000 세포/웰)를 25 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 0, 10, 25, 또는 75 ng의 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드로 전달감염시켰고, 24시간동안 배양하였다. 2 내지 8개의 복제물 분석을 수행하였고, Luc/RLuc (평균값)±SE의 비를 그래프로 나타내었다. 도 5에서 바(bar)보다 높은 값은 배수 유도를 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 분자내 재조합 분석 플라스미드 A118, SF370.1 또는 φRV1만을 전달감염시키면 루시퍼라제 활성이 없거나 매우 적은 활성을 나타내었다. 증가되는 양의 대응하는 A118, SF370.1 또는 φRV1 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 전달감염시키면 상기 루시퍼라제 활성이 증가하였다. 상기 결과는 상기 리콤비나제가 CHO 세포에서 기능을 나타낸다는 것을 보여준다.
2.5 래트 골수 스트로마 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
래트의 1차 골수 스트로마 세포를 4,000 세포/㎠의 밀도로 전달감염 전에 하루동안 미리 플레이트에 분주하였고, 50% 최소 필수 배지 알파 배지(αMEM), 50% F12 hams, 10% FBS, 1% Pen/Strep (100 U/㎖ 페니실린 G 및 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 설페이트)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 세포를 25 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 0, 50, 100, 또는 200 ng의 대응하는 리콤비나제 플라스미드로 전달감염시켰고, 48시간동안 배양하였다. 세포를 50 ㎕의 수동 용해 버퍼로 용해시켰고, 25 ㎕의 추출물을 분석하였다. 8개의 복제물 분석을 수행하였고, Luc/RLuc (평균값)±SE의 비를 그래프로 나타내었다. 도 6에서 바(bar)보다 높은 값은 배수 유도를 나타낸다.
도 6은 분자내 재조합 분석 플라스미드 단독 또는 증가되는 양의 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드(50, 100 또는 200 ng)와 함께 래트 골수 스트로마 세포를 전달감염시킨 것으로부터 얻은 데이터를 나타낸다. 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 리콤비나제 발현 플라스미드의 동시 전달감염은 루시퍼라제 활성을 몇 배 증가시켰다. 예를 들면, 25 ng의 Bxb1 분자내 재조합 분석 플라스미드 및 200 ng의 Bxb1 리콤비나제 발현 플라스미드로 세포를 전달감염시키면 25 ng의 Bxb1 분자내 재조합 분석 플라스미드만을 전달감염시킨 것과 비교할 때 루시퍼라제 활성이 501배 증가하였다. Bxb1과 유사하게, A118, SF370.1, SPβc2 및 φRV1 또한 루시퍼라제 활성을 증가시켰으며(도 6), 이것은 상기 리콤비나제가 래트 골수 스트로마 세포에서 기능을 나타내고, attP 및 attB 부위를 결합시키는데 있어서 효과적이라는 것을 보여준다.
2.6 마우스 신경 중기 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
마우스 신경 줄기 C17.2 세포(mNSC)는 번햄 연구소(Burnham Research Institute, La Jolla, CA)의 에반 스니더(Evan Snyder) 박사로부터 입수하였으며, 제시된 프로토콜(Ryder, E.F., E.Y. Snyder, et al. 1990,Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. J. Neurobiol., 21: 356-75)을 이용하여 유지하였다. 세포를 전달감염 하루 전에 나누고, 48-웰 플레이트에 웰 당 120,000 세포로 분주하였다. 밤새 배양한 후, 상기 배양 배지를 혈청이 제거된 배지로 교체하였다. 상기 세포를 50 ng의 분자내 재조합 분석 플라스미드 단독 또는 0, 25, 50, 100 또는 200 ng의 리콤비나제 플라스미드 DNA와 함께 전달감염 시약 리페펙타민 2000TM을 이용하여 제조사(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 지침에 따라 전달감염시켰다. 지속적으로 발현되는 Renilla 루시퍼라제 리포터 플라스미드(pRL-CMV, Promega, Madison, WI)를 데이터를 정상화시키기 위한 내부 대조군으로 함께 전달감염시켰다(4 ng/웰). 전달감염 2일 후, 상기 배지를 버렸고, 세포를 75 ㎕의 수동 용해 버퍼(Promega, Madison, WI)로 용해시켰다. 추출물(50 ㎕)을 이중 루시퍼라제 분석 키트(Promega, Madison, WI)를 이용하여 주사기(injector)가 장착된 플레이트 판독기(Dynex Technologies, Chantilly, VA) 상에서 분석하였다. 도 7에 나타난 데이터는 루시퍼라제(Luc) 및 Renilla 루시퍼라제(RLuc) 활성의 비이며, 처치 당 평균 4 전달감염이다. 오차 바(bar)는 표준 오차를 나타낸다.
HEK293, NIH3T3, CHO, HeLa 및 래트 골수 스트로마 세포에서 관찰된 결과와 유사하게, 리콤비나제 A118, SF370.1, SPβc2, φRV1 및 Bxb1은 mNSC에서 기능을 나타내었고, 상기 루시퍼라제 활성을 증가시켰다(도 7). 증가되는 양의 리콤비나제 발현 플라스미드(25, 50, 100 또는 200 ng)와 함께 대응하는 분자내 재조합 분석 플라스미드(50 ng)를 동시 전달감염시키면, 결과적으로 루시퍼라제 활성이 더 증가하였고, 배수 유도는 72-5,349 범위였다.
2.7 담배 BY2 세포에서의 일시적 분자내 재조합 분석
니코티아나 토바쿰(Nicotiana tobacum) BY2의 세포 현탁 배양액을 암소에서 MS 배지에서 유지하였고, 매주 계대배양하였다(Nagata, T., T. Nemoto, and S. Hasezawa. 1992. Tobacco BY-2 cell line as the Hela cell in the cell biology of higher plants. Intl. Rev. Cytol., 132: 1-30). 3일된 배양액으로부터 준비한 원형질체(protoplast)를 0.4 M 만니톨에서 재부유시켰고, 35 ㎜ 페트리 디쉬(petri dish)에 1 ㎖ 당량(∼5×105 세포)씩 분배하였다. 원형질체를 플라스미드 DNA와 혼합하였고, 페트리펄서 전극(Petripulser electrode)을 갖는 직사각형파 전기천공 시스템(BTX, San Diego, CA, USA)을 이용하여 0.56 K 볼트에서 80 μ초 동안 전기 천공하였다. 상기 세포를 10 ㎍의 새포내 재조합 테스트 플라스미드 및 0 또는 10 ㎍의 재조합 발현 플라스미드로 전달감염시켰다. 상기 전기천공 후, 원형질체를 1 ㎖의 2x 원형질체 배양 배지(Watanabe, Y., T. Meshi, and Y. Okada. 1987. Infection of tobacco protoplasts with in vitro transcribed tobacco mosaic virus RNA using an improved electroporation method. Virology, 192: 264-272)로 희석하였고, 2개의 1 ㎖ 배양액으로 당량화한 후, 27℃에서 17시간동안 배양하였다. 원형질체를 동결-해동 및 250 ㎕의 5x 수동 용해 버퍼(Promega, Madison, WI, USA)의 첨가에 의해 용해시켰다. 20 ㎕의 세포 추출물을 이중 루시퍼라제 분석 키트를 이용하여 주사기가 장착된 플레이트 판독기 상에서 분석하였다. 도 8에 나타난 데이터는 루시퍼라제 활성에 따른 상대 빛 단위이다. 수치는 22개의 복제물의 평균이고, 오차 바(bar)는 표준 오차이다.
도 8에 나타난 바와 같이, BY2 세포를 A118 세포내 재조합 식물 분석 플라스미드만으로 전달감염시키면 매우 약한 루시퍼라제 활성을 나타내었다. A118 리콤비나제 식물 발현 플라스미드와 함께 전달감염시키면, 결과적으로 루시퍼라제 활성이 364배 증가하였다. 상기 데이터는 상기 리콤비나제가 식물 세포에서 attP 및 attB 부위를 재조합시킨다는 것을 명확하게 나타낸다.
실시예 3. attP 또는 attB 서열을 포함하는 플라스미드 DNA 를 상기 attB 또는 attP 부위를 포함하는 HEK293 염색체로 안정적으로 삽입
상기 염색체 상의 attP 또는 attB 부위에서의 플라스미드 DNA의 삽입에 대한 분석은 2단계 과정으로 수행되었다. 첫 번째 단계에서, 각 효소의 attP 또는 attB 부위의 한 카피를 포함하는 안정한 세포주를 생성하고 특성을 분석하였다. 두 번째 단계에서, 상기 attP 또는 attB 부위를 포함하는 플라스미드를 상기 리콤비나제 발현 플라스미드의 존재 하에 각각 염색체 attB 또는 attP에 삽입시켰다.
염색체 내에 attP 또는 attB 서열을 갖는 안정한 HEK293 클론의 생성
각 리콤비나제의 attP 또는 attB 서열(서열번호 11, 11 내지 21)의 한 카피를 인비트로젠(Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 R750-07)에서 구입한 Flp-InTM-293 세포의 FRT 좌(locus)에 도입하였다. 상기 Flp-InTM-293 세포의 FRT 좌는 CMV 프로모터, Flp 리콤비나제에 대한 FRT 삽입 부위 및 제오신(zeocin) 저항성 및 β-갈락토시다제 융합 유전자를 갖고 있다. 상기 세포를 제오신 항생제의 존재 하에 키우고, β-갈락토시다제 마커 유전자를 발현시켰다. 각 효소의 attP 또는 attB 서열을 상기 CMV 프로모터 및 BGH 터미네이터 서열 사이에 존재하는 다중 클로닝 부위 영역에서 pCDNA/FRT 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 V6010-20) 내로 클로닝하였다. 상기 pcDNA/FRT 클로닝 플라스미드는 상기 히그로마이신(hygromycin) 유전자 앞에 FRT 부위를 갖고 있다. 상기 히그로마이신 유전자는 프로모터 및 ATG 개시 코돈이 결여되어 있다. 따라서, 상기 attP 또는 attB 부위를 포함하는 pcDNA/FRT 플라스미드를 포유동물 세포내로 전달감염시키면 히그로마이신 저항성이 부여되지 않을 것이다. pcDNA/FRT 플라스미드의 삽입은 상기 Flp 리콤비나제 발현 플라스미드(pCG44, Invitrogen, Carlsbad, CA)가 동시 전달감염된 후에만 Flp-InTM-293 세포내의 FRT 좌에서 일어난다. 삽입 결과 히그로 마이신 저항성이 획득되고, 제오신 저항성 및 β-갈락토시다제 발현이 상실된다. 상기 과정은 도 9에 개략적으로 나타나 있다.
상기 attP 또는 attB를 포함하는 pcDNA/FRT 플라스미드 DNA를 Flp-InTM-293 세포내로 삽입시켰고, 각 attP 또는 attB 부위에 대한 클론 주(line)를 히그로마이신을 포함하는 배지 상에서 선별하였다. 예상한 바와 같이, 이들 세포는 β-갈락토시다제 활성을 잃어버렸고, 제오신에 민감하였다. 또한, 상기 FRT 좌에서의 attP 또는 attB 서열을 갖는 pcDNA/FRT 플라스미드의 존재는 PCR에 의해 확인되었다(도 10). PCR 분석에서, 본 발명자는 attP 또는 attB에 결합하는 프라이머 또는 인접한 FRT 좌 서열에 결합하는 다른 프라이머를 이용하여 상기 게놈 내의 FRT 좌에서의 attP 또는 attB 서열의 삽입을 검출하였다. 따라서, 상기 클론은 attP 또는 attB 부위가 상기 염색체 내에 삽입된 경우에만 PCR 양성일 것이다. 예상한 바와 같이, 상기 선별된 주(line)는 attP 또는 attB에 대해 양성이다. PCR은 양친(parental) Flp-InTM-293 세포로부터 분리된 게놈 DNA(도 10의 레인 P, 패널 C)로부터는 특이적인 밴드를 증폭하지 못했지만, 테스트된 각 리콤비나제에 대하여 attP 또는 attB를 포함하는 pcDNA/FRT 플라스미드(도 10의 레인 I, 패널 C)로 삽입된 세포로부터 분리된 DNA로부터는 밴드를 증폭하였다. attP 또는 attB 부위를 갖는 안정적인 293 세포를 각각 상기 attB 또는 attP 부위를 포함하는 삽입 플라스미드로 사용하였다.
염색체 attP 또는 attB 부위에서의 플라스미드 DNA 의 삽입
상기 삽입 분석 플라스미드는 상기 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자 바 로 앞에 각 리콤비나제의 attP 또는 attB 서열을 위치시킴으로써 제조되었다. 상기 플라스미드에서, 퓨로마이신 유전자는 그 자체의 프로모터를 갖고 있지 않다. 그러나, 염색체 상의 attP 및 삽입 분석 플라스미드 내의 attB (또는 염색체 상의 attB 및 상기 분석 플라스미드 상의 attP) 사이의 재조합은 상기 퓨로마이신 유전자를 상기에서 생성된 Flp-InTM-293 세포(도 9) 내의 attP 또는 attB 부위 바로 앞에 존재하는 CMV 프로모터 다음에 삽입시킬 것이다. 상기 삽입은 결과적으로 퓨로마이신 유전자를 발현시키고, 퓨로마이신 항생제의 존재 하에 이러한 세포를 성장시킬 것이다. 상기 attP 서열을 포함하는 상기 Flp-InTM-293 안정한 세포주는 표준 프로토콜을 이용하여 상기 attB 부위를 포함하는 삽입 분석 플라스미드 단독 또는 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 전달감염되었다. 다른 경우에는, 안정적으로 삽입된 attB 서열을 갖는 Flp-InTM-293 안정한 세포주를 생성하였고, 상기 attP를 포함하는 삽입 분석 플라스미드를 삽입시키기 위해 사용하였다. 염색체 attP 또는 attB 부위를 포함하는 Flp-InTM-293 세포(150,000 내지 300,000 세포)를 100 ng의 삽입 분석 플라스미드 및 400 ng의 리콤비나제 발현 플라스미드로 전달감염시켰다. 이후, 세포를 퓨로마이신 항생제를 포함하는 배지 상에서 선별하였다. 상기 리콤비나제가 기능을 나타낸다면, 상기 attB 서열을 포함하는 플라스미드는 상기 염색체 상의 attP 부위에 삽입되거나 또는 그 반대일 것으로 기대된다.
세 번의 독립적인 실험에서, attP 또는 attB를 포함하는 삽입 분석 플라스미드 및 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드를 동시 전달감염시킨 후, attB 또는 attP 부위를 포함하는 Flp-InTM-293 세포로부터 얻은 퓨로마이신 저항성 콜로니의 수를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 리콤비나제 플라스미드 부재시에는 퓨로마이신 저항성 콜로니가 전혀 관찰되지 않았다. 상기 결과는 상기 리콤비나제가 염색체 attP 또는 attB 부위와 플라스미드 attB 또는 attP 부위 사이의 재조합을 촉진시켜, 결과적으로 플라스미드 DNA를 염색체 내로 삽입시킨다는 것을 명확하게 보여주었다. 또한, 본 발명자는 퓨로마이신 저항성 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하고, 상기 염색체 상의 attL 및 attR 부위의 존재를 검출함으로써 상기 플라스미드의 삽입을 확인하였다. attB 및 attP 사이의 재조합은 결과적으로 attB 및 attP 사이의 교잡 부위인 attL 및 attR 부위를 생성한다. 상기 attL 또는 attR 특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭은, 분석 플라스미드의 삽입 후에 퓨로마이신 저항성 클론(도 10의 레인 I, 패널 A 및 B)에서만 예상되는 특이적인 밴드를 증폭하였고, 삽입을 위해 사용된 attP 또는 attB를 포함하는 양친 세포(도 10의 레인 P, 패널 A 및 B)에서는 증폭하지 않았다.
Figure 112007063669911-PCT00002
Figure 112007063669911-PCT00003
실시예 4. attP 및 attB 부위에 인접한 염색체 DNA 의 결실
상기 염색체 상에 위치한 attP:STOP:attB 서열의 결실에 대한 분석을 2단계 과정으로 수행하였다. 첫 번째 단계에서, 한 카피의 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 - 터미네이터 구조체를 포함하는 안정한 세포주를 각 리콤비나제에 대해 생성하고 특성을 분석하였다. 두 번째 단계에서, 리콤비나제 발현 플라스미드를 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 - 터미네이터를 갖는 안정한 세포내로 일시적으로 전달감염시켰고, 상기 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 상기 리콤비나제가 포유동물 세포에서 활성이 있다면, 염색체 attP 및 attB 부위 사이의 재조합은 결과적으로 STOP 서열의 결실과 루시퍼라제 발현의 활성으로 나타날 것이다. 상기 분석 포맷은 도 11에 그래프로 나타나 있다.
염색체 내에 CMV 프로모터- attP - STOP - attB - 루시퍼라제 유전자 구조체를 갖는 안정한 HEK293 클론의 생성
한 카피의 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 - 터미네이터 구조체를 전술한 바와 같이 인비트로젠(Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 R750-07)으로부터 구입한 Flp-InTM-293 세포의 FRT 좌에 도입하였다. 일시적 분자내 재조합 분석 플라스미드(분자내 재조합 분석 플라스미드의 디자인 및 구축 및 도 1 참조) 내에 존재하는 각 리콤비나제의 attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 서열을 상기 CMV 프로모터 및 BGH 터미네이터 서열 사이에 존재하는 다중 클로닝 부위 영역에서 pcDNA/FRT 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 V6010-20) 내로 클로닝하였다. CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 -터미네이터를 갖는 구축된 pcDNA/FRT 플라스미드를 Flp 리콤비나제를 이용하여 Flp-InTM-293 세포의 FRT 좌에 삽입시켰다. 상기 플라스미드의 삽입 결과 히그로마이신 저항성이 획득되고, 제오신 저항성 및 β-갈락토시다제 발현이 상실된다.
Flp-InTM-293 세포를 상기 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 - 터미네이터를 포함하는 pcDNA/FRT 플라스미드와 함께 Flp 발현 플라스미드(pCG44, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 전달감염시켰다. 히그로마이신 저항성을 갖는 클론을 선별 및 확장하였다(도 11). 또한, pCDNA/FRT 플라스미드의 삽입은 선별된 클론의 β-갈락토시다제 활성을 분석함으로써 확인하였다. 상기 선별된 클론은 β-갈락토시다제 발현이 상실되었다. 상기 분리된 클론을 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 전달감염에 사용하였다.
안정한 세포주에서 염색체로부터 STOP 서열의 결실 및 루시퍼라제의 활성
두 번째 단계에서, 각 리콤비나제에 대해 상기 CMV 프로모터 - attP:STOP:attB - 루시퍼라제 유전자 - 터미네이터 구조체를 포함하는 히그로마이신 저항성 세포를 대응하는 리콤비나제 발현 플라스미드로 일시적으로 전달감염시켰다. 세포(15,000 세포/웰, 96-웰 포맷)를 0, 25, 50, 100 또는 200 ng의 리콤비나제 발현 플라스미드로 전달감염시켰고, 24시간동안 배양하였다. 세포를 50 ㎕의 수동 용해 버퍼로 용해시켰고, 25 ㎕의 추출물을 분석하였다. 16개의 복제물 분석을 수행하였고, 루시퍼라제 활성(상대 빛 단위의 평균)±SE를 그래프로 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 각각의 리콤비나제 발현 플라스미드를 증가되는 양(0, 25, 50, 100 또는 200 ng)으로 대응하는 attP:STOP:attB를 포함하는 Flp-InTM-293 세포내로 전달감염시키면 루시퍼라제 활성을 증가시켰다. 상기 결과는 상기 리콤비나제가 염색체에 위치하는 attP 및 attB 서열을 재조합할 수 있다는 것을 보여주었다. 상기 재조합 결과 attP 및 attB 부위에 인접한 서열이 결실되었고, 루시퍼라제 유전자가 활성화되었다.
실시예 5. HEK293 세포에서 염색체 유사 부착 부위에서의 DNA 의 삽입
상기 HEK293 세포내에 존재하는 자연형의 유사 attB 또는 유사 attP 부위에서 attP 또는 attB 재조합 부위를 포함하는 플라스미드의 삽입을 위한 분석은, 세포를 상기 리콤비나제 발현 플라스미드 및 상기 attP 또는 attB 부위 및 히그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 대응하는 표적 플라스미드로 동시 전달감염시키고, 히그로마이신 항생제를 포함하는 배지 상에서 안정한 세포를 선별함으로써 수행하였다. 상기 과정은 도 13에 개략적으로 나타나 있다. HEK293 세포는 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA로부터 구입)을 포함하는 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 전달감염을 수행한 날, 세포를 35 ㎜의 페트리 디쉬 당 750,000 세포의 밀도로 분배하였다. 상기 세포를 attP 또는 attB 부위 및 유비퀴틴(Ubiquitin) C 프로모터-유도된(driven) 히그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 50 ng의 표적플라스미드(도 13) 단독, 또는 4 ㎍의 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 리포펩타민 2000TM을 이용하여 제조사(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 지침에 따라 전달감염시켰다. 플라스미드의 염색체 삽입 결과 히그로마이신 유전자의 발현 및 히그로마이신 항생제의 존재 하에서 이러한 세포가 성장할 것이다. 표적 플라스미드의 무작위 삽입(즉, 비-유사 부위) 또한 히그로마이신 저항성 클론을 생성시킬 것임을 주목해야 한다. 그러나, 만일 상기 게놈이 유사 부착 부위를 포함한다면, 상기 표적 플라스미드가 상기 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 세포내로 도입될 때, 히그로마이신 저항성 HEK293 클론의 수가 더 많을 것으로 예측된다. 또한, 예를 들면, 상기 삽입이 상기 게놈 상의 유사 attB 부위 및 상기 표적 플라스미드 상의 attP 부위 사이의 재조합 때문이라면, 상기 표적 플라스미드 상의 attP 부위는 정확하게 절단되고 플라스미드는 상기 게놈의 유사 attB 부위에 삽입되어, 구해지는(rescued) 플라스미드의 DNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있는 유사 attL 및 유사 attR 부위를 생성할 것이다. 반대로, 무작위 삽입은 일반적으로 삽입 후에도 온전한 attP 부위를 보존한다.
본 기술 분야에서 일반적인 절차(Thyagarajan, B. et al. 2001, Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage φC31 integrase. Mol. Cell. Biol. 21: 3926-3934)에 따라, 리콤비나제 발현 플라스미드의 존재 하에 얻어진 히그로마이신 저항성 HEK293 클론을 모았고, 게놈 DNA를 분리한 후 삽입된 플라스미드 바깥(즉, pUC ori 및 박테리아 선별 마커 유전자 영역의 바깥)을 절단하는 제한효소로 소화시켰으며, 상기 소화된 DNA을 자가-접합시켰고, 및 상기 접합된 DNA를 대장균 내로 형질전환시켜 상기 인접한 게놈 DNA를 포함하는 삽입된 플라스미드를 구하였다. 히그로마이신 저항성 클론으로부터 준비한 게놈 DNA (10 ㎍)를 총 40 ㎕ 부피에서 37℃에서 3시간동안 제한효소 Bgl Ⅱ, Xba I, Eco 0109I, Ban Ⅱ, Sty I, Bso BI, 또는 Btg I로 소화시켰다. 20 ㎕의 각 소화물을 총 200 ㎕ 부피에서 4℃에서 밤새 접합시켰고, 이후 정제하였다. 상기 접합된 DNA를 전기천공에 의해 대장균 내로 도입하였고, 이후 암피실린-저항성 대장균 콜로니를 상기 항생제를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 상기 박테리아 콜로니로부터 준비하였고, 이후 구조된 플라스미드 DNA를 시퀀싱하였다. 상기 회수된 게놈 DNA 서열은 BLAST 프로그램을 이용하여 상기 회수된 게놈 서열과 인간 게놈 서열(진뱅크, NIH 의학 도서관, http://www.ncbi.nlm.nbih.gov/ BLAST)을 배열함으로써 그 염색체 위치를 확인하기 위해 사용하였다.
SF370.1 또는 SPβc2 리콤비나제의 attP 부위를 포함하는 상기 유사 부위 표적 플라스미드가 HEK293 세포내로 도입되었을 때, 각각 9 및 0 히그로마이신 저항성 클론이 얻어졌다(표 3). 반면, 사기 표적 플라스미드 DNA가 해당 SF370.1 또는 SPβc2 리콤비나제 발현 플라스미드와 함께 HEK293 세포내로 전달감염되었을 때에는 각 경우에 있어서 100개 이상의 히그로마이신 저항성 클론이 회수되었다(표 3). 상기 결과는 염색체의 유사 attB 부위에서의 리콤비나제-매개성 삽입이 매우 효과적이었고, 유사 부위에서의 삽입이 표적 플라스미드의 무작위 삽입(즉, 리콤비나제 부재시의 삽입)보다 몇 배 더 높다는 것을 명확하게 보여주었다. 게놈 DNA를 SF370.1 리콤비나제를 갖고 있는 수집된 히그로마이신 저항성 HEK293 클론으로부터 분리하였고, 플라스미드를 상기 게놈으로부터 구조하였으며, 유사 attB 서열을 전술한 바와 같이 100개의 플라스미드 DNA를 시퀀싱함으로써 확인하였다. 100개의 구조된 플라스미드 서열 중에서, 41개의 다른 유사 attB 부위가 존재하였으며, 몇몇 유사 부위에서는 다른 유사 부위 보다 더 많은 삽입이 수행되었다. 예를 들면, 100개의 회수된 삽입물 중에서 35개는 단일한 부위였다. 상기 유사 attB 부위의 뉴클레오티드 서열은 도 14에 나타나 있다. 상기 결과는 상기 SF370.1 리콤비나제가 다른 부위에 비해 상기 부위에서 우세하게 플라스미드 DNA를 삽입시켰다는 것을 제시한다.
Figure 112007063669911-PCT00004
유사한 분석을 SPβc2 attP를 포함하는 플라스미드를 상기 SPβc2 리콤비나제를 이용하여 표적화한 후 얻은 히그로마이신 저항성 HEK293 클론을 이용하여 수행하였으며, 109개의 구조된 플라스미드 DNA를 시퀀싱하였다. 서열 분석은 10개의 삽입물 중 105개가 유사 attB 부위에 있고, 2개의 삽입물은 무작위 위치에 있음을 보여주었다. 상기 105개의 회수된 삽입물 부위 중에서 54개의 다른 유사 attB 삽입 부위가 존재하였다. 15개의 삽입은 도 14에 나타난 하나의 유사 부위 서열에서 일어났다. 상기 결과는 인간 및 진핵생물 염색체가 본 발명자가 발견한 효소를 이용하여 유사 att 부위에서 정확한 부위-특이적 삽입을 위한 효과적인 표적으로 작용한다는 것을 보여준다. 상기 부위는 많은 생명공학 및 의학 분야에서 사용될 수 있는 삽입을 위한 자연 발생형 표적을 형성한다.
<110> INTREXON CORPORATION <120> Site-specific serine recombinases and methods of their use <150> US11/049,552 <151> 2005-02-02 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic gene <400> 1 atggaactga agaacatcgt gaacagctac aacatcacca acatcctggg ctacctgcgg 60 agaagcaggc aggacatgga gagagagaag cggaccggcg aggacaccct caccgagcag 120 aaggaactca tgaacaagat cctcaccgcc atcgagatcc cctacgagct gaagatggag 180 atcggcagcg gcgagagcat cgacggcaga cccgtgttca aggagtgcct gaaggatctg 240 gaggagggca agtaccaggc catcgccgtg aaggagatca ccaggctgag cagaggcagc 300 tacagcgacg ccggccagat cgtgaacctg ctgcagagca agcggctcat catcatcacc 360 ccctacaagg tgtacgaccc cagaaacccc gtcgacatgc ggcagatccg gttcgagctg 420 ttcatggcca gggaggagtt cgagatgacc cgggagagaa tgaccggcgc caagtacacc 480 tacgccgccc agggcaagtg gatcagcggc ctggccccct acggctacca gctgaacaag 540 aaaaccagca agctggaccc cgtggaggac gaggccaagg tggtgcagct catcttcaac 600 atcttcctga acgggctgaa cggcaaggac tacagctaca 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195 200 205 Ile Thr Gly Arg Pro Trp Thr Thr Thr Thr Leu Ser Lys Phe Leu Arg 210 215 220 Lys Pro Arg Asn Ala Gly Leu Arg Ala Tyr Lys Gly Ala Arg Tyr Gly 225 230 235 240 Pro Val Asp Arg Asp Ala Ile Val Gly Lys Ala Gln Trp Ser Pro Leu 245 250 255 Val Asp Glu Ala Thr Phe Trp Ala Ala Gln Ala Val Leu Asp Ala Pro 260 265 270 Gly Arg Ala Pro Gly Arg Lys Ser Val Arg Arg His Leu Leu Thr Gly 275 280 285 Leu Ala Gly Cys Gly Lys Cys Gly Asn His Leu Ala Gly Ser Tyr Arg 290 295 300 Thr Asp Gly Gln Val Val Tyr Val Cys Lys Ala Cys His Gly Val Ala 305 310 315 320 Ile Leu Ala Asp Asn Ile Glu Pro Ile Leu Tyr His Ile Val Ala Glu 325 330 335 Arg Leu Ala Met Pro Asp Ala Val Asp Leu Leu Arg Arg Glu Ile His 340 345 350 Asp Ala Ala Glu Ala Glu Thr Ile Arg Leu Glu Leu Glu Thr Leu Tyr 355 360 365 Gly Glu Leu Asp Arg Leu Ala Val Glu Arg Ala Glu Gly Leu Leu Thr 370 375 380 Ala Arg Gln Val Lys Ile Ser Thr Asp Ile Val Asn Ala Lys Ile Thr 385 390 395 400 Lys Leu Gln Ala Arg Gln Gln Asp Gln Glu Arg Leu Arg Val Phe Asp 405 410 415 Gly Ile Pro Leu Gly Thr Pro Gln Val Ala Gly Met Ile Ala Glu Leu 420 425 430 Ser Pro Asp Arg Phe Arg Ala Val Leu Asp Val Leu Ala Glu Val Val 435 440 445 Val Gln Pro Val Gly Lys Ser Gly Arg Ile Phe Asn Pro Glu Arg Val 450 455 460 Gln Val Asn Trp Arg 465 <210> 11 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPBc2 attP site <400> 11 acggcagagt aagcttcttt ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa tatacagctt 60 tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtgga 99 <210> 12 <211> 1315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STOP sequence <400> 12 aagcttactt accatgtcag atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 60 cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 120 atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 180 gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 240 tggtatggct gattatgatc tctagtcaag gcactataca tcaaatattc cttattaacc 300 cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac aatttttgag catagttatt aatagcagac 360 actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac agtatgttat gattataact gttatgccta 420 cttataaagg ttacagaata tttttccata attttcttgt atagcagtgc agctttttcc 480 tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga gttctattac taaacacagc atgactcaaa 540 aaacttagca attctgaagg aaagtccttg gggtcttcta cctttctctt cttttttgga 600 ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag 660 caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc caccactgct cccattcatc agttccatag 720 gttggaatct aaaatacaca aacaattaga atcagtagtt taacacatta tacacttaaa 780 aattttatat ttaccttaga gctttaaatc tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca 840 ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc cctcgagaaa aaaaatataa aagagatgga 900 ggaacgggaa aaagttagtt gtggtgatag gtggcaagtg gtattccgta agaacaacaa 960 gaaaagcatt tcatattatg gctgaactga gcgaacaagt gcaaaattta agcatcaacg 1020 acaacaacga gaatggttat gttcctcctc acttaagagg aaaaccaaga agtgccagaa 1080 ataacatgag caactacaat aacaacaacg gcggctacaa cggtggccgt ggcggtggca 1140 gcttctttag caacaaccgt cgtggtggtt acggcaacgg tggtttcttc ggtggaaaca 1200 acggtggcag cagatctaac ggccgttctg gtggtagatg gatcgatggc aaacatgtcc 1260 cagctccaag aaacgaaaag gccgagatcg ccatatttgg tgtccccgag gatcc 1315 <210> 13 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPBc2 attB site <400> 13 tcagataaca gcttggtggc acccattgtg ttcacaggag atacagcttt atctgtactg 60 atattaatga catgctgcac tcggtgtgaa agggca 96 <210> 14 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF370.1 attP site <400> 14 acgaaaggag gtcgtgaaat ggataaaaaa atacagcgtt tttcatgtac aactatacta 60 gttgtagtgc ctaaataatg cttttaaaac ttaaaaata 99 <210> 15 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF370.1 attB site <400> 15 taaaagggat aataacgttt gtaaaggaga ctgataatgg catgtacaac tatactcgtc 60 ggtaaaaagg catcttatga tggctcaacc atggtt 96 <210> 16 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bxb1 attP site <400> 16 gtggtttgtc tggtcaacca ccgcggtctc agtggtgtac ggtacaaacc ca 52 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bxb1 attB site <400> 17 ggccggcttg tcgacgacgg cggtctccgt cgtcaggatc atccgg 46 <210> 18 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A118 attP site <400> 18 acgctagtag cttgtttatt tagattgttt agttcctcgt tttctctcgt tggaagaaga 60 agaaacgaga aactaaaatt ataaataaaa agtaaccta 99 <210> 19 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A118 attB site <400> 19 ttgagctaat taaaaccagc tgtaactttt tcggatcaag ctatgaagga cgcaaagagg 60 gaactaaaca cttaattggt gttacccata agccac 96 <210> 20 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PhiRv1 attP site <400> 20 acgagacagc agcacgcaca ggtgtagtgt atctcacagg tccacggttg gccgtggact 60 gctgaagaac attccacgcc aggagatcaa ccatgacca 99 <210> 21 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PhiRv1 attB site <400> 21 tggcgtagca gcttctcgtg gtggtggaag gtgttggtgc ggggttggcc gtggtcgagg 60 tggggtggtg gtagccattc ggtgtggccg tgggtg 96

Claims (35)

  1. 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드로 접촉시켜서 상기 재조합 부착 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제1 재조합 부위는 파지 게놈 재조합 부착 부위(attP) 또는 박테리아 게놈 재조합 부착 부위(attB)이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 부착 부위가 attP이면 상기 제2 부착 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드로 접촉시켜서 상기 재조합 부착 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 진핵생물 세 포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제1 재조합 부위는 attP 또는 attB이고, 상기 제2 재조합 부위는 유사 부착 부위이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리콤비나제 코딩 폴리뉴클레오티드는 상기 진핵생물 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 폴리펩티드로 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 전령 RNA에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합은 결과적으로 DNA의 삽입, 결실, 역위, 전좌 또는 교환이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 핵산 서열 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제1 재조합 attB 또는 attP 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 안정적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 진핵생물 세포를 얻기 위한 방법으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attP이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 핵산 서열 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제1 재조합 유사 부착 부위를 포함하는 진핵생물 세포내로 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 안정적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 진핵생물 세포를 얻기 위한 방법으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리콤비나제 코딩 폴리뉴클레오티드는 상기 진핵생물 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터와 기 능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 폴리펩티드로 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 발현에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위에 인접한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 재조합 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 진핵생물 세포에서 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제3 재조합 부위 및 상기 제2 및 제4 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제1 및 제2 재조합 부위는 attP 또는 attB이고, 상기 제3 및 제4 재조합 부위는 attB 또는 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제3 및 제4 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 및 제2 재조합 부착 부위가 attP이면 상기 제3 및 제4 재조합 부착 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 폴리펩티드로 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 리콤비나제 폴리펩티 드를 코딩하는 전령 RNA에 의해 상기 진핵생물 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위와 함께 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위를 포함하는 진핵생물 세포를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 제1 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키고 상기 제3 및 제4 재조합 부위를 제2 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이를 재조합시키고 상기 제3 및 제4 재조합 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 진핵생물 세포에서 다중 부위-특이적 재조합을 얻기 위한 방법으로서, 상기 제1 리콤비나제 폴리펩티드 및 상기 제2 리콤비나제 폴리펩티드가 다르다면, 상기 제1 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제2 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제3 및 제4 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제5 재조합 부위 및 제6 재조합 부위 및 제3 리콤비나제 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 상기 제3 리콤비나제 폴리펩티드가 상기 제1 및 제 2 리콤비나제 폴리펩티드와 다르다면, 상기 제3 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제5 및 제6 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 제공하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시켜서 상기 재조합 부위 사이를 재조합시키는 단계를 포함하는 부위-특이적 재조합 방법에 관한 것으로서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부위는 attP 또는 attB이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부착 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 상기 제1 부착 부위가 attP이면 상기 제2 부착 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 폴리뉴클레오티드 서열을 분리된 진핵생물 세포의 게놈 내로 부위-특이적으로 삽입시키기 위한 벡터로서, 상기 벡터는 관심있는 폴리뉴클레오티드 및 제2 재조합 attB 또는 attP 부위를 포함하며, 상기 제2 재조합 attB 또는 attP 부위는 상기 분리된 진핵생물 세포 게놈 내의 제1 재조합 attP 또는 attB 부위 또는 유사 attP 또는 유사 attB 부위를 재조합시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상 기 재조합은 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 부위-특이적 리콤비나제의 존재 하에 일어나며, 상기 제1 재조합 부위가 attB 또는 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP 또는 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 상기 관심있는 폴리뉴클레오티드는 상기 진핵생물 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드 또는 원핵생물 리콤비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포로서, 상기 리콤비나제는 제1 재조합 부위 및 상기 제1 재조합 부위와의 재조합을 위한 기질로 작용할 수 있는 제2 재조합 부위 사이의 부위-특이적 재조합을 매개할 수 있으며, 상기 제1 재조합 부위는 attP, 유사 attP, attB 또는 유사 attB이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB, 유사 attB, attP 또는 유사 attP이며, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제1 재조합 부위가 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP 또는 유사 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 유사 attB이고, 상기 제1 재조합 부위가 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 진핵생물 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진핵생물 세포.
  29. 관심있는 폴리뉴클레오티드를 유전자이식 대상의 게놈 내로 부위-특이적으로 삽입하기 위한 방법으로서, 상기 게놈은 제1 재조합 attB 또는 attP 부위 또는 유사 attB 또는 유사 attP 부위를 포함하고, 상기 방법은 관심있는 폴리뉴클레오티드 및 제2 재조합 attP 또는 attB 부위를 포함하는 핵산을 도입하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵생물 리콤비나제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조 합을 매개할 수 있고, 상기 리콤비나제는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 리콤비나제, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 리콤비나제, 바실러스 서브틸리스 파지 리콤비나제, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 리콤비나제 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 제1 재조합 부위가 attB 또는 유사 attB이면 상기 제2 재조합 부위는 attP이고, 상기 제1 재조합 부위가 attP 또는 유사 attP이면 상기 제2 재조합 부위는 attB인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 리콤비나제 폴리펩티드는 A118 리콤비나제, SF370.1 리콤비나제, SPβc2 리콤비나제, φRv1 리콤비나제 및 Bxb1 리콤비나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 리콤비나제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  32. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  33. 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번 호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  34. 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  35. a) SPβc2 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열;
    b) SF370.1 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열;
    c) Bxb1 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열;
    d) A118 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열; 및
    e) φRv1 리콤비나제를 코딩하는 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
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