KR20220097406A - 고빈도 표적화된 동물 유전자도입 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 예를 들어, Bxb1 랜딩 패드를 이용하는 고빈도 마우스 유전자도입을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2019년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/913,092의 이익을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
연방 정부 지원 연구
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 R24 OD016473 및 R21 OD023800하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
게놈 조작 혁명은 계속해서 마우스 게놈의 빠른 수정을 주도하여 과거 어느때보다 더 빠르게 더 정밀하게 복잡한 돌연변이체 마우스 계통을 생성한다. 작은 게놈 변형은 간단하고 효율적이지만, 큰 공여자 DNA의 올바른 삽입을 위해 상동성 재조합에 의존하는 것은 여전히 문제가 된다. 의도된 발현 패턴 및 기능을 재현하기 위해 인간화 마우스를 생성하는 것은 유전자 제어 영역을 도입하는 것을 필요로 한다. 이는 무작위적이고, 본질적으로 매우 난잡한 유전자도입을 사용하는 것의 이유가 되며, 이로 인해 낮은 효율성, 부분적/불완전한 통합 및 다중카피 콘카테머화를 겪게 될 수 있다. 상기 삽입은 종종 활성 유전자좌에 침착되어, 트랜스진 발현 및 의도하지 않게 파괴된 내인성 유전자(들)에 대해 위치상 유해한 영향을 미친다. 결과적으로, 대규모 트랜스제닉 프로젝트는 종종 상당한 특징화 시간 및 추가 브리딩 라운드를 필요로 한다.
본 개시내용은 마우스 게놈으로의 외인성 DNA의 큰 단일 카피 삽입은 Bxb1 인테그라제 시스템을 사용하여 달성될 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 일부 측면에서, 본원에서는 유전자 편집 도구 (예컨대, CRISPR/Cas9) 및 Bxb1 인테그라제의 조합을 사용하여 큰 트랜스진의 단일 카피를 특정 유전자좌에 삽입하는 시스템을 제공한다. Bxb1 인테그라제의 존재하에, attP 부위는 attB 부위와 재조합되어 부위를 attR ("우측") 및 attL ("좌측") 부위로 전환시킨다 (도 1). 일부 실시양태에서, 본 시스템은 게놈으로의 플라스미드/박테리아 공여자 DNA 벡터 서열 통합을 배제하며, 이는 트랜스진 침묵을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서, 30.6 킬로베이스 (kb)의 인간 DNA를 11% 효율 (4/35)로 C57BL/6J 마우스 Rosa26 유전자좌에 통합시켰다. 놀랍게도, 독립적 계통 4마리 모두 미세주입일로부터 3-6개월 이내에 오프-타겟 없는 트랜스제닉 대립유전자의 생식계열 전달을 입증하였다. 추가로, 유전자는 간에서 적절하게 전사된다. 이러한 결과는 이 시스템이 무손상, 단일 카피 트랜스진을 단기간에 정의된 유전자좌에 전달하여, 동물 모델의 빠르고 신뢰할 수 있는 유전자 조작을 위한 강력한 도구인 정밀 유전자도입을 제공하는 능력을 보여준다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 게놈의 제한된 오프-타겟 변형하에, 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스) 게놈에서 큰 트랜스진 (예컨대, 적어도 20 킬로베이스의 길이)의 표적화된 삽입을 위한 방법을 제공한다. 놀랍게도, Bxb1 att (부착 부위) 랜딩 패드(landing pad)를 보유하도록 유전적으로 조작된 마우스는 높은 삽입 빈도로 큰 트랜스진의 삽입을 가능하게 한다. 추가로, Bxb1 시스템은 특히 마우스 게놈에서 슈도 통합 부위를 나타내는 것으로 알려져 있지 않다 (예컨대, 문헌 [Russell JP et al. BioTechniques 2006;40:460-464] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Bxb1 랜딩 패드 마우스 계통은 Cas9 뉴클레아제 (또는 그의 변이체 또는 상동체)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 세이프 하버(safe harbor) 유전자좌 (예컨대, Rosa26 또는 Hip11 유전자좌)와 같은 게놈 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA (gRNA), 및 세이프 하버 유전자좌에 대한 상동성 아암에 의해 플랭킹된 Bxb1 부착 부위(들)를 함유하는 (적어도 하나의) 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 포함하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구의 전핵 미세주입을 통해 마우스에서 직접 생성된다. 예를 들어, 상기 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구를 사용함에 따라 게놈 중 (의도된 게놈 유전자좌 밖의) 오프-타겟 변이가 거의 없거나, 또는 전혀 없는 마우스 계통(line/strain)이 생성된다. 이어서, 확립된 Bxb1 랜딩 패드 마우스 계통을 관심 트랜스진의 삽입 및 후속 분석을 위한 플랫폼으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 관심 트랜스진 및 상응하는 (동족) Bxb1 부착 부위(들)를 포함하는 공여자 DNA를 Bxb1 인테그라제 (또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)와 함께 미세주입하여 게놈적으로 통합된 관심 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면은 그의 게놈 (예컨대, 게놈 유전자좌) 내에 제1 Bxb1 부착 부위 (예컨대, attP 또는 attB) 및 제2 Bxb1 부착 부위 (예컨대, 변형된 attP* 또는 변형된 attB *)를 포함하는 포유동물 (또는 다른 동물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 따라서, Bxb1 인테그라제는 게놈적으로 코딩될 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 그의 게놈 (예컨대, 게놈 유전자좌) 내에 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위를 포함하는 포유동물 배아 (또는 다른 동물 배아)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 배아는, 임의적으로, 폴리뉴클레오티드가 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹되어 있는 것인, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 Bxb1 부착 부위는 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB * 부위로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 Bxb1 부착 부위는 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB * 부위로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위는 서로에 대하여 이종성이다.
일부 실시양태에서, attP 부위는 서열식별번호(SEQ ID NO:) 1의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 attP * 부위는 서열식별번호 7의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, attB 부위는 서열식별번호 2의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 attB* 부위는 서열식별번호 8의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위는 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기에 의해 서로 이격되어 있다.
일부 실시양태에서, 게놈 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌이다. 다른 유전자좌는 표적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 포유동물은 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 배아는 설치류 배아, 예를 들어, 마우스 배아 또는 래트 배아이다. 다른 포유동물, 및 비-포유동물이 사용될 수 있다.
본원에서는 또한 포유동물 배아 내로 (a) 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 및 (b) Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다. 본원에서는 포유동물 배아 내로 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 포유동물 배아를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 암컷 포유동물로부터 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 자손 포유동물의 게놈 내로 통합된 관심 서열의 존재 또는 부재에 대해 자손 포유동물을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드, Bxb1 인테그라제, 및/또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 그/그들을 미세주입을 통해 포유동물 배아 내로 도입한다. 다른 형질감염 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 서열은 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 서열의 크기는 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 또는 적어도 30 kb이다.
본 개시내용의 추가 측면은 (a) 포유동물 배아 내로 (i) Cas9 뉴클레아제, 또는 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 포유동물 배아에서 제1 게놈 부위 (예컨대, 유전자좌)를 표적화하는 제1 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (iii) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제1 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제1 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자; 임의적으로, (iv) 포유동물 배아에서 제2 게놈 (예컨대, 유전자좌)을 표적화하는 제2 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (v) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제2 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제2 ssDNA를 도입하는 단계, 및 (b) 포유동물 배아 세포를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계이며, 여기서 가임신한 암컷 포유동물은 자손 포유동물을 출산할 수 있는 것인 단계를 포함하는, Bxb1 랜딩 패드 포유동물을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 ssDNA는 제1 Bxb1 부착 부위로부터 상류 또는 하류에 제2 Bxb1 부착 부위를 추가로 포함하고, 여기서 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위, 둘 모두가 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있다.
일부 실시양태에서, 포유동물 배아는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 본 방법은 포유동물 배아 내로 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 추가 측면은 본원에 기술된 포유동물 배아를 포함하는 포유동물 (예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트)을 제공한다.
본 개시내용의 다른 측면은 그의 게놈 (예컨대, 게놈 유전자좌) 내에 단일 Bxb1 부착 부위를 포함하는 포유동물 또는 포유동물 배아 뿐만 아니라, 포유동물 또는 포유동물 배아을 생성 및 사용하는 방법을 제공한다.
도 1a-1c: Bxb1 인테그라제는 부착 부위를 사용하여 외인성 DNA를 통합시킨다 (예컨대, attP는 벡터에서 상호 attB 부위와 함께 게놈에 선택적으로 배치). 제1 버전에서 (도 1a), 게놈 중의 단일 Bxb1 부착 부위는 전체 공여자 벡터를 게놈 내로 통합시키는 역할을 한다. 원치않는 플라스미드 백본의 삽입을 최소화하기 위해, 벡터를 먼저 미니서클로 프로세싱하였다. 문자 (ABC...)는 시퀀스 방향을 보여주기 위해 제시되어 있다. 두 번째 버전에서 (도 1b), 2개의 Bxb1 부착 부위 (특이성을 부여하는 디뉴클레오티드 염기를 제외하면 동일함)가 이용되었다. 이 전략법을 사용할 경우, 전달 전에 공여자 플라스미드를 미니서클로 전환시켜야 할 필요는 없다. 오히려, (예를 들어, 대체 디뉴클레오티드 염기쌍을 사용하여 조작/변형된) 이중 이종 부착 부위 간의 재조합은 플라스미드 백본이 랜딩 패드로 통합되는 것을 배제하는 기능을 한다. 세 번째 버전에서 (도 1c), 접합자는 효율적인 재조합을 촉진시키기 위해 트랜스제닉 Bxb1 단백질로 "프라이밍"된다. 두 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 상기 Bxb1 인테그라제 트랜스진은 Bxb1이 매개하는 공여자 서열로의 성공적인 대체 후에 제거된다.
도 2a-2b: (도 2a) 정규 디뉴클레오티드 (GT) 3' 오버행과 함께 제시된 Bxb1 부착 부위 서열. 서열은 위에서부터 아래로 서열식별번호 11-18이다 (도 2b). 더 큰 디자인 유연성 및 순차적 변형을 가능하게 하는 대안적 디뉴클레오티드 옵션의 비제한적 목록. 별표 표시는 회문식 오버행 (*), 동일한 이중 염기 오버행 (**) 및 정규 오버행 (***)을 나타낸다.
도 3: 스크리닝 전략법 요약. 재조합 대립유전자 확인 및 그의 서열 확인 뿐만 아니라, 랜딩 패드 밖의 오프-타겟 통합 이벤트 검출을 위한 간단한 PCR 기반 스크리닝 전략법 개요.
도 4: 녹인을 확인하기 위한 장거리 PCR. 재조합 대립유전자가 올바르고, 무손상인지 확인하기 위한 장거리 PCR 검정법의 사용 예. 플랭킹 영역이 알려지지 않은 무작위 유전자도입, 또는 긴 상동성 아암이 상기 유형의 검정법을 불가능하게 어렵게 만들 수 있는 상동성 재조합과 달리, 본 발명자들의 시스템을 사용하여 생성된 후보 대립유전자는 "인/아웃" PCR 전략법을 사용하여 장거리 PCR 확인을 가능하게 한다. 본 예에서, 거의 전체 30.6 kb 인서트는, 각각 한 프라이머는 트랜스진 중의 부위에 결합하고 ("인"), 나머지 다른 하나는 랜딩 패드에 인접한 게놈에 결합하는 것인 ("아웃"), 단 2개의 PCR에 의해 포획된다.
도 5: 전사체를 확인하기 위한 RT-PCR. 트랜스진이 의도된 바와 같이 발현된다는 증거는 간으로부터, 이 경우, 인간 트랜스진을 발현하는 것으로 예상되는 조직으로부터 추출되고, cDNA로 전환되고, 증폭되고, 서열 확인되는 mRNA를 사용하여 생성하였다. 인간 유래 전사체가 발현되고, 적절하게 스플라이싱되었다는 것을 입증하는, 3마리의 독립 파운더(founder) 계통으로부터의 앰플리콘의 아가로스 겔 전기영동과 함께, 스플라이스 부위에 걸쳐 참조와의 정렬을 보여주는 개략도가 제시되어 있다.
도 6: 1개의 랜딩 패드 (Bxb1v1) 대 2개의 랜딩 패드 (Bxb1v2)를 갖는 Bxb1 마우스 내로의 플라스미드 통합률. 다수의 시험 조건하에서 Bxb1 인테그라제 mRNA를 사용한 현재까지의 모든 실험 요약. 버전 1 랜딩 패드 계통 (단일 attP 부위) 4마리 중 3마리는 성공적인 재조합 대립유전자를 생성하였다. 버전 2 (이중 attP 부위) 랜딩 패드 마우스 계통, 둘 모두 성공적으로 재조합 대립유전자를 생성하였다. 가장 많은 실험이 수행된 배경 (B6)에서 이중 부위 (버전 2) 시스템은 단일 부위 버전 (버전 1)보다 대략 3-4배 더 효율적인 것으로 보인다.
도 2a-2b: (도 2a) 정규 디뉴클레오티드 (GT) 3' 오버행과 함께 제시된 Bxb1 부착 부위 서열. 서열은 위에서부터 아래로 서열식별번호 11-18이다 (도 2b). 더 큰 디자인 유연성 및 순차적 변형을 가능하게 하는 대안적 디뉴클레오티드 옵션의 비제한적 목록. 별표 표시는 회문식 오버행 (*), 동일한 이중 염기 오버행 (**) 및 정규 오버행 (***)을 나타낸다.
도 3: 스크리닝 전략법 요약. 재조합 대립유전자 확인 및 그의 서열 확인 뿐만 아니라, 랜딩 패드 밖의 오프-타겟 통합 이벤트 검출을 위한 간단한 PCR 기반 스크리닝 전략법 개요.
도 4: 녹인을 확인하기 위한 장거리 PCR. 재조합 대립유전자가 올바르고, 무손상인지 확인하기 위한 장거리 PCR 검정법의 사용 예. 플랭킹 영역이 알려지지 않은 무작위 유전자도입, 또는 긴 상동성 아암이 상기 유형의 검정법을 불가능하게 어렵게 만들 수 있는 상동성 재조합과 달리, 본 발명자들의 시스템을 사용하여 생성된 후보 대립유전자는 "인/아웃" PCR 전략법을 사용하여 장거리 PCR 확인을 가능하게 한다. 본 예에서, 거의 전체 30.6 kb 인서트는, 각각 한 프라이머는 트랜스진 중의 부위에 결합하고 ("인"), 나머지 다른 하나는 랜딩 패드에 인접한 게놈에 결합하는 것인 ("아웃"), 단 2개의 PCR에 의해 포획된다.
도 5: 전사체를 확인하기 위한 RT-PCR. 트랜스진이 의도된 바와 같이 발현된다는 증거는 간으로부터, 이 경우, 인간 트랜스진을 발현하는 것으로 예상되는 조직으로부터 추출되고, cDNA로 전환되고, 증폭되고, 서열 확인되는 mRNA를 사용하여 생성하였다. 인간 유래 전사체가 발현되고, 적절하게 스플라이싱되었다는 것을 입증하는, 3마리의 독립 파운더(founder) 계통으로부터의 앰플리콘의 아가로스 겔 전기영동과 함께, 스플라이스 부위에 걸쳐 참조와의 정렬을 보여주는 개략도가 제시되어 있다.
도 6: 1개의 랜딩 패드 (Bxb1v1) 대 2개의 랜딩 패드 (Bxb1v2)를 갖는 Bxb1 마우스 내로의 플라스미드 통합률. 다수의 시험 조건하에서 Bxb1 인테그라제 mRNA를 사용한 현재까지의 모든 실험 요약. 버전 1 랜딩 패드 계통 (단일 attP 부위) 4마리 중 3마리는 성공적인 재조합 대립유전자를 생성하였다. 버전 2 (이중 attP 부위) 랜딩 패드 마우스 계통, 둘 모두 성공적으로 재조합 대립유전자를 생성하였다. 가장 많은 실험이 수행된 배경 (B6)에서 이중 부위 (버전 2) 시스템은 단일 부위 버전 (버전 1)보다 대략 3-4배 더 효율적인 것으로 보인다.
역사적으로, 마우스에서의 큰 (>10 킬로베이스) 트랜스진의 도입은 배아 줄기 세포 조작에 의해 또는 더 일반적으로는 접합자에서 직접 무작위 유전자도입 (및 아주 가끔씩만 CRISPR 매개 HDR에 의해)에 의해 달성되었다. 표적화된 유전자도입은 전형적으로 공여자 트랜스진에 플랭킹된 광범위한 상동성 아암의 사용에 의존하며, 그 결과로 크기가 훨씬 더 큰 벡터가 생성된다. 이러한 방법을 사용하면 생산 및 취급에 있어 기술상의 문제가 제기되고, 의도하지 않은 결과를 완화시키기 위해 광범위한 하류 작업이 요구된다. 무작위 유전자도입을 사용하여 생성된 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스) 모델은 종종 예를 들어, 통합 부위에 있는 천연 유전자의 파괴, 및 비정상적인 트랜스진 발현 수준과 같은 위치 효과를 겪는다. 다중카피 콘카테머는 방대한 과다발현을 유도할 수 있거나, 또는 게놈 전체에 흩어져 있는 다중 삽입으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 브리딩 동안 트랜스진이 분리됨에 따라, 이어서, 필요한 표현형에 발현 변화가 발생하고, 그는 불안정화될 수 있다. 추가로, 플라스미드 백본으로부터의 요소를 동시에 포함하게 되면, 트랜스진 침묵화가 발생할 수 있고, 이에 의해 잠재적인 포유동물 모델의 유용성이 무효화될 수 있다.
Bxb1 마이코박테리오파지에 의해 코딩된 세린 레콤비나제는 예를 들어, 마우스 게놈의 대규모 인간화와 같은 전통적인 기술에 의해 제기된 많은 문제에 대한 해결안을 제공한다. 상기 세린 레콤비나제는 포유동물 게놈에 임의의 인간, 마우스 (또는 임의의 다른 종) 또는 합성 구축물을 도입하는 데 사용될 수 있다. 자연상에서, Bxb1 인테그라제는 용원기 동안의 파지 중 고유한 부착 부위 ("attP")와 그의 박테리아 숙주 중의 고유한 부착 부위 ("attB") 사이의 DNA 가닥 교환을 수행하는 기능을 한다. attP 및 attB 부위의 상대적인 방향에 따라, 반응은 인식 부위 사이의 서열의 절단, 역전 또는 통합을 초래할 수 있고, 추가 단백질인 엑시지오나제(excisionase)가 존재하지 않는다면, 비가역적이다. 각 부착 부위의 길이는 <50개의 뉴클레오티드 염기쌍 (bp)이며, 이를 통해 분자 클로닝에서의 사용이 용이해질 뿐만 아니라, 현행 일반적인 유전자 편집 기술을 사용하여 숙주 게놈 내로 쉽게 삽입될 수 있다. Bxb1 인테그라제는 진핵 세포에서 작동하며, 작용하기 위해 어떤 추가 숙주 인자도 필요로 하지 않는다. 추가로, 세포에서 고효율로 작용하는 것으로 나타났고, 단방향성이고, 마우스 게놈에 검출가능한 슈도 부위는 없다. 부착 부위에 있는 2개의 중심 디뉴클레오티드는 재조합 이벤트의 특이성을 전적으로 담당하고 있으며, 시스템은 증진에도 또한 적합하다 (예를 들어, 도 2b 참조). 이러한 조합된 속성에 기인하여 상기 시스템은 포유동물 (예컨대, 마우스) 접합자를 직접 변형시키는 데 유용해진다.
본 개시내용은 Bxb1 인테그라제 시스템을 사용하여 세이프 하버 유전자좌에 "랜딩 패드"를 갖는 마우스 계통을 조작하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 이들 계통은 재조합 대립유전자에서 벡터 서열을 오염시키지 않으면서, 정의된 방향으로 단일 카피 트랜스진의 도입을 가능하게 한다. 고효율과 조합된, 재조합 대립유전자의 올바른 위치에 대한 정보는 파운더 확인 및 후속된 트랜스진 확인에 크게 도움을 준다. 본 개시내용은 Bxb1 인테그라제 시스템을 사용하여 마우스 계통을 조작한 방법을 기술하였지만, 이는 "랜딩 패드"를 갖는 다른 동물, 예를 들어, 다른 포유동물 (예컨대, 비-인간 포유동물)을 조작하는 데에도 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
Bxb1
랜딩
패드 계통 생성
Bxb1 랜딩 패드 동물은 그의 게놈 중에 (적어도 하나의) Bxb1 부착 부위 (예컨대, attB 부위, Bxb1 attP 부위, 및/또는 그의 변형된 버전)를 포함하는 동물이다. 일부 실시양태에서, 동물 게놈은 Bxb1 attP 부위 (서열식별번호 1) 또는 변형된 Bxb1 attP * 부위 (서열식별번호 7)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동물 게놈은 Bxb1 attB 부위 (서열식별번호 2) 또는 변형된 Bxb1 attB * 부위 (서열식별번호 8)를 포함한다. 다른 디뉴클레오티드-변형된 Bxb1 부착 부위의 비제한적인 예는 도 2b에 제공되어 있다. 동물은 예컨대, 실험 동물 또는 가축/농장 동물과 같은 임의의 동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 설치류이다. 설치류는 예를 들어 마우스 또는 래트일 수 있다. 예컨대, 가금류 (예컨대, 닭)와 같은 다른 동물도 본원에서 고려된다.
마이코박테리오파지 Bxb1에 의해 코딩된 인테그라제는 각각 파지와 박테리아 숙주의 부착 부위인 attP 및 attB 사이의 가닥 교환을 촉매화시킨다. DNA 부위는 비교적 작지만 (<50 bp), 반응은 이들 부위에 대해 고도로 선택적이고, 또한 강력한 방향성을 나타낸다 (예컨대, 문헌 [Singh A et al. PLoS Genetics 2013; 9(5): e1003490] 참조). Bxb1 attB 부위는 내부 디뉴클레오티드 인식 서열 중 추가 9개의 준최적 변이와 함께 적어도 7개의 고유하고, 특이적인 최적의 변이를 나타내며, 이를 통해 동일한 Bxb1 레콤비나제 효소는 각각 그의 특정 디뉴클레오티드 어드레스를 갖는 일련의 상이한 구축물을 사용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Ghosh P et al. J. Mol Biol . 2006;349:331-348] 참조). 따라서, 본원에서는 Bxb1 attP 부위 및 변형된 attP * 부위 (예컨대, 서열식별번호 1의 서열 대비 변형)의 사용 뿐만 아니라, Bxb1 attB 부위 및 변형된 attB * 부위 (예컨대, 서열식별번호 2의 서열 대비 변형)의 사용이 고려된다.
달리 언급되지 않는 한, Bxb1 랜딩 패드 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스) 계통은 Bxb1 attP 부위, 변형된 Bxb1 attP 부위, Bxb1 attB 부위, 변형된 Bxb1 attB 부위, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. Bxb1 랜딩 패드 내로 삽입시키고자 하는 상응하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 동족 Bxb1 부착 부위(들)를 포함하여야 한다. 따라서, Bxb1 랜딩 패드 동물 계통이 Bxb1 attP 부위를 포함한다면, Bxb1 랜딩 패드 내로 삽입시키고자 하는 상응하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 원형 공여자 DNA)는 Bxb1 attB 부위를 포함하여야 하고; Bxb1 랜딩 패드 동물 계통이 Bxb1 attB 부위를 포함한다면, Bxb1 랜딩 패드 내로 삽입시키고자 하는 상응하는 폴리뉴클레오티드는 Bxb1 attP 부위를 포함하여야 한다.
일부 실시양태에서, Bxb1 부착 부위(들)는 게놈의 개방 염색질 영역인 세이프 하버 유전자좌에 위치한다. 게놈 세이프 하버 (GSH)는 새로 삽입된 유전 요소가 확실히 (i) 예측가능하게 작용하고, (ii) 숙주 세포 또는 유기체에 위험을 초래하는 숙주 게놈의 변경을 일으키지 않게 보장하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있는 게놈 중의 부위이다 (예컨대, 문헌 [Papapetrou EP and Schambach A Mol Ther 2016; 24(4): 678-684] 참조).
본원에서 제공되는 바와 같이 사용될 수 있는 세이프 하버 유전자좌의 비제한적인 예로는 Rosa26 유전자좌, Hip11 유전자좌, Hprt 유전자좌, 및 Tigre 유전자좌를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 (또는 다른 포유동물) 계통의 Rosa26 유전자좌는 Bxb1 attP 부위 또는 변형된 attP * 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Rosa26 유전자좌는 Bxb1 attB 부위 또는 변형된 Bxb1 attB* 부위를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 (또는 다른 포유동물) 계통의 Hip11 유전자좌는 Bxb1 attP 부위 또는 변형된 attP * 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Hip11 유전자좌는 Bxb1 attB 부위 또는 변형된 attB * 부위를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 (또는 다른 포유동물) 계통의 Hprt 유전자좌는 Bxb1 attP 부위 또는 변형된 attP * 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Hprt 유전자좌는 Bxb1 attB 부위 또는 변형된 attB * 부위를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 (또는 다른 포유동물) 계통의 Tigre 유전자좌는 Bxb1 attP 부위 또는 변형된 attP * 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Tigre 유전자좌는 Bxb1 attB 부위 또는 변형된 attB * 부위를 포함한다. 다른 세이프 하버 유전자좌는 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, Bxb1 부착 부위(들)는 내인성 유전자의 개시 코돈 (ATG)에, 또는 그 근처에 위치한다. 예를 들어, 내인성 유전자의 정상적인 전사 조절 요소는 유전자의 개시 코돈 근처에 Bxb1 부착 부위를 포함한 후, 이어서, (Bxb1 인테그라제를 통해) 관심 유전자를 통합함으로써 "인터셉트"될 수 있고, 이에 의해 관심 유전자의 전사는 내인성 유전자의 전사 조절 요소의 제어하에 있게 된다.
Bxb1 랜딩 패드 동물을 생성하기 위해, (적어도 하나의) 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자가 사용될 수 있다. 상기 ssDNA 공여자는 상동성 아암에 의해 플랭킹된 Bxb1 부착 부위(들) (예컨대, Bxb1 attP 부위 또는 Bxb1 attB 부위)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ssDNA는 2개의 Bxb1 부착 부위 (예컨대, Bxb1 attP 부위 및 변형된 Bxb1 attP 부위, 또는 Bxb1 attB 부위 및 변형된 Bxb1 attB 부위)를 포함한다. 한 상동성 아암은 Bxb1 부착 부위(들)의 좌측 (5')에 위치하고 (좌측 상동성 아암), 또 다른 상동성 아암은 Bxb1 부착 부위(들)의 우측 (3')에 위치한다 (우측 상동성 아암). 상동성 아암은 게놈 (예컨대, 세이프 하버) 유전자좌에 위치하는 게놈 DNA 영역과 상동성인 ssDNA 영역이다. 상기 논의되는 바와 같이 (예컨대, CRISPR/Cas9-매개 상동성 지정 수복 (HDR)을 통해) 이들 상동성 아암을 통해 ssDNA 공여자와 게놈 유전자좌 사이의 상동성 재조합이 이루어질 수 있고, 이에 의해 Bxb1 부착 부위(들)가 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다.
상동성 아암의 길이는 다를 수 있다. 예를 들어, 각 상동성 아암 (좌측 아암 및 우측 상동성 아암)은 20개의 뉴클레오티드 염기 내지 1000개의 뉴클레오티드 염기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 상동성 아암은 20 내지 200, 20 내지 300, 20 내지 400, 20 내지 500, 20 내지 600, 20 내지 700, 20 내지 800, 또는 20 내지 900개의 뉴클레오티드 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 각 상동성 아암은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개의 뉴클레오티드 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 한 상동성 아암의 길이는 다른 상동성 아암의 길이와 상이하다. 예를 들어, 한 상동성 아암은 20개의 뉴클레오티드 염기 길이일 수 있고, 다른 상동성 아암은 50개의 뉴클레오티드 염기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 DNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이다.
Rosa26 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암의 예는 각각 서열식별번호 4 및 서열식별번호 5로 제공된다. 일부 실시양태에서, ssDNA 공여자는 서열식별번호 3의 뉴클레오티드 서열 (Rosa26 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 Bxb1 attP 부착 부위)을 포함한다. 일부 실시양태에서, ssDNA 공여자는 서열식별번호 9의 뉴클레오티드 서열 (Rosa26 유전자좌를 표적화하는 좌측 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 변형된 Bxb1 attP* 부착 부위)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 및/또는 마우스 배아 (또는 다른 동물 또는 동물 배아)는 마우스/마우스 배아의 게놈 유전자좌 중에 단일 Bxb1 부착 부위를 포함한다. 예를 들어, Bxb1 부착 부위는 attP 부착 부위, 변형된 attP * 부착 부위, attB 부착 부위, 및 변형된 attB * 부착 부위로부터 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 마우스 및/또는 마우스 배아 (또는 다른 동물 또는 동물 배아)는 마우스/마우스 배아의 게놈 유전자좌 중에 2개의 (적어도 2개의) Bxb1 부착 부위를 포함하며, 이는 본원에서 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위로서 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위는 attP 부착 부위, 변형된 attP * 부착 부위, attB 부착 부위, 및 변형된 attB* 부착 부위로부터 선택된다. 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위는 (개재 뉴클레오티드 서열 없이) 서로 인접해 있을 수 있거나, 또는 특정 개수의 뉴클레오티드에 의해 서로 이격되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 Bxb1 부착 부위가 동일한 세이프 하버 유전자좌 내에 (예컨대, Rosa26 유전자좌 내에) 존재한다면, 두 Bxb1 부착 부위를 이격시키는 뉴클레오티드의 개수는 달라질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 임의의 두 (예컨대, 제1 및 제2) Bxb1 부착 부위는 서로 적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000개의 뉴클레오티드 염기쌍 (bp)만큼 서로 이격되어 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 두 (예컨대, 제1 및 제2) Bxb1 부착 부위는 1 내지 500 bp, 1 내지 1000 bp, 1 내지 1500 bp, 1 내지 2000 bp, 1 내지 2500 bp, 또는 1 내지 3000개의 뉴클레오티드 염기쌍 (bp)만큼 서로 이격되어 있다. 예를 들어, 임의의 두 Bxb1 부착 부위는 1 내지 450 bp, 1 내지 400 bp, 1 내지 350 bp, 1 내지 300 bp, 1 내지 250 bp, 1 내지 200 bp, 1 내지 150 bp, 1 내지 100 bp, 1 내지 50 bp, 5 내지 450 bp, 5 내지 400 bp, 5 내지 350 bp, 5 내지 300 bp, 5 내지 250 bp, 5 내지 200 bp, 5 내지 150 bp, 5 내지 100 bp, 5 내지 50 bp, 10 내지 450 bp, 10 내지 400 bp, 10 내지 350 bp, 10 내지 300 bp, 10 내지 250 bp, 10 내지 200 bp, 10 내지 150 bp, 10 내지 100 bp, 10 내지 50 bp, 50 내지 450 bp, 50 내지 400 bp, 50 내지 350 bp, 50 내지 300 bp, 50 내지 250 bp, 50 내지 200 bp, 50 내지 150 bp, 50 내지 100 bp, 100 내지 450 bp, 100 내지 400 bp, 100 내지 350 bp, 100 내지 300 bp, 100 내지 250 bp, 100 내지 200 bp, 또는 100 내지 150 bp만큼 서로 이격되어 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 동물은 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 게놈 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인테그라제의 발현 및 관심 유전자의 게놈 통합 후에 폴리뉴클레오티드가 제거되도록 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹될 수 있다 (예컨대, 도 1c 참조).
일부 실시양태에서, Bxb1 부착 부위(들)를 포함하는 ssDNA 공여자의 삽입은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/Cas9 유전자 편집에 의해 촉진된다. CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용되는 RNA 가이드된 DNA 표적화 플랫폼으로 용도가 변경된 원핵생물에서 자연적으로 발생된 방어 기전이다. 이는 DNA 절단을 표적화하는 비코딩 가이드 RNA (gRNA) 및 DNA 뉴클레아제 Cas9 (CRISPR 연관 단백질 9)에 의존한다.
일부 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 비록 다른 Cas9 호몰로그, 오솔로그, 및/또는 변이체 (예컨대, Cas9의 진화된 버전)가 사용될 수 있기는 하지만, 본원에 제공된 바와 같이, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (NGG PAM) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (NNGRRT 또는 NNGRR(N) PAM)로부터의 것이다. 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 RNA-가이드된 뉴클레아제의 추가의 비제한적 예로는 Cpf1 (TTN PAM); SpCas9 D1135E 변이체 (NGG (감소된 NAG 결합) PAM); SpCas9 VRER 변이체 (NGCG PAM); SpCas9 EQR 변이체 (NGAG PAM); SpCas9 VQR 변이체 (NGAN 또는 NGNG PAM); 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) (NM) Cas9 (NNNNGATT PAM); 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) (ST) Cas9 (NNAGAAW PAM); 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) (TD) Cas9 (NAAAAC)를 포함한다.
가이드 RNA (gRNA)는 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제 (예컨대, Cas9)의 활성을 표적화된 게놈 내의 특정 표적 서열로 지시한다. 예컨대, 문헌 [Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012)] 및 [Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참조한다. gRNA는 적어도 (표적 부위에서) 표적 서열에 하이브리드화하는 스페이서 서열, 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 타입 II 시스템 (예컨대, 스트렙토코쿠스 피오게네스) 시스템)에서, gRNA는 tracrRNA (트랜스 활성화 RNA) 서열을 포함한다. 타입 II 시스템에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 하이브리드화하여 이중체를 형성한다. 타입 V 시스템에서, crRNA (CRISPR RNA) 서열은 이중체를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 이중체는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (예컨대, Cas9)에 결합하여 gRNA 및 RNA-가이드된 뉴클레아제는 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 RNA-가이드된 뉴클레아제와 그의 회합에 의해 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 따라서, gRNA는 RNA-가이드된 뉴클레아제의 활성을 지시한다. Rosa26 유전자좌를 표적화하는 gRNA 스페이서 영역의 예는 서열식별번호 6 및 서열식별번호 10으로 제공된다.
다른 게놈 편집 기술, 예컨대, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)가 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Joung JK et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14(1):49-55]; [Carroll D Genetics. 2011;188(4): 773-782]; 및 [Gaj T et al. Trends Biotechnol . 2013;31(7):397-405]를 참조한다.
트랜스제닉 마우스는 가장 일반적으로는 수정된 단세포 (1 세포) 마우스 배아의 전핵 내로의 DNA 미세주입 (전핵 주입)에 의해 생성된다. 제1 핵 분열 이전에 DNA 통합이 발생할 경우, 이때 일부 또는 모든 세포는 트랜스진을 보유하게 될 것이다. 주입 후, 난자는 정관 절제된 수컷과 암컷을 교배시켜 생성된 적시 교배 가임신한 수양모의 난관으로 외과적으로 옮겨진다. 트랜스진을 보유하는 주입된 난자로부터 생성된 자손은 파운더로 불린다.
미세주입이 예시되지만, 예컨대, 예를 들어, 전기천공 (예컨대, 문헌 [Wang W et al. J Genet Genomics 2016;43(5):319-27] 참조), 배아 줄기 세포-매개 유전자 전달 및 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예컨대, 문헌 [예컨대, Kumar TR et al. Methods Mol Biol . 2009;590:335-362] 참조), 바이러스 기반 유전자 전달과 같은 다른 형질감염 시스템을 사용하여 본 개시내용의 BXb1 랜딩 패드 동물을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 전달은 접합자로 지칭될 수 있는 배아의 단일 세포 단계에서 발생한다. 다른 실시양태에서, 유전자 전달은 배아의 후기 다세포 단계 (2개 이상의 세포, 할구로도 불림)에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 전핵 미세주입은 접합자 단계에서 이루어지고, 이어서, 2 세포 단계에서 핵 주사가 이루어진다 (2회).
일부 실시양태에서, Cre 레콤비나제-의존성 Cas9 발현을 발현하는 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스) 계통이 사용될 수 있다. Cre 및 gRNA를 공동 발현하는 바이러스 벡터가 주입될 때, 이들 마우스 계통을 통해 생체내 CRISPR 유전자 편집이 이루어질 수 있다. 바이러스에 의해 발현된 Cre는 Cas9 발현을 작동 개시시켜 표적화된 유전자 또는 유전자들을 편집한다. 추가로, 마우스에서의 생체내 유전자 편집은 Cas9 및 gRNA 발현 렌티 또는 아데노 연관 바이러스의 국소 또는 전신 주사에 의해 달성될 수 있다.
Bxb1 랜딩 패드 계통을 생성하는 데 임의의 마우스가 사용될 수 있다. 마우스 계통의 비제한적인 예로는 C57BL/6J 마우스 (664), C57BL/6NJ (5304), FVB/NJ (1800), B6D2 (C57BL/6 x DBA/2J) 마우스, 및 NGS™ (NOD scid 감마) 마우스 (5557) 또는 그의 변이체를 포함한다. 추가로 예로는 A/J (000646), 129S1/SvImJ (002448), NOD/ShiLtJ (001976), NZO/HiLtJ (002105), CAST/EiJ (000928), PWK/PhJ (003715), WSB/EiJ (001145), DBA2 (000671), 및 콜라보레이티브 크로스(Collaborative Cross: CC) 계통을 포함한다.
일부 실시양태에서, Bxb1 랜딩 패드 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스)을 생성하는 방법은 수정된 단일 세포 배아를 단리시키는 단계, 및 배아의 전핵 또는 세포질에 Cas9 (예컨대, Cas9 단백질, 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA), gRNA (또는 gRNA를 코딩하는 DNA), 및 게놈 유전자좌, 예컨대, 세이프 하버 유전자좌 (예컨대, Rosa26 유전자좌 또는 다른 개방 염색질 유전자좌)를 표적화하는 ssDNA를 미세주입하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 미세주입된 배아를 가임신한 암컷 마우스에게 이식하고, 임신시킬 수 있다. 가임신은 접합자의 존재를 제외하고, 임신의 모든 징후와 증상이 나타나는 거짓 임신을 기술한다. 마우스는 암컷이 불임 수컷에 의해 브리딩되어 불임 교배가 이루어진 발정 후에 가임신 상태가 된다. ~2-3주령째, 꼬리 생검을 자손으로부터 수집할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌로의 올바른 통합은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 시퀀싱, 써던 블롯팅 및/또는 장거리 시퀀싱 시스템, 예컨대, PacBio에 의해 검증될 수 있다. 이어서, 원하는 통합을 보유하는 파운더 마우스를 브리딩하여 Bxb1 랜딩 패드 마우스 계통을 생성한다.
표적화된
트랜스진
통합
일부 실시양태에서, Bxb1 랜딩 패드 동물 (예컨대, 포유동물, 예컨대, 설치류, 예를 들어, 마우스)을 사용하여 동물 게놈의 Bxb1 부착 부위에 관심 유전자를 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 벡터 상에 존재한다. 벡터는 간단히 외인성 유전 물질 (예컨대, 공여자 트랜스진)을 숙주 세포 (예컨대, 마우스 배아)로 운반하는 비히클로서 사용되는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 원형 공여자 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 플라스미드 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 그의 게놈에 단 하나의 Bxb1 부착 부위를 포함하는 동물을 사용할 때, 원형 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 미니서클이다. DNA 미니서클은 공여자 DNA가 >100 bp 내지 50 kb로 원형화된 작은 (~4 kb) 원형 벡터 백본이다. 일부 실시양태에서, DNA 미니서클은 모든 원핵성 벡터 부분으로부터 유리된 플라스미드 유도체이다 (예컨대, 항생제 내성 마커 및/또는 박테리아 복제 기점을 포함하는 박테리아 플라스미드 백본을 더 이상 함유하지 않음).
DNA 미니서클을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 박테리아 백본 및 발현시키고자 하는 트랜스진을 포함하는 진핵성 인서트를 포함하는 모체 플라스미드는 부위-특이적 레콤비나제 단백질을 발현하는 특수화된 E. 콜라이(E. coli) 균주에서 제조될 수 있다. 재조합 부위는 모체 플라스미드에서 진핵성 인서트에 플랭킹되어 있고, 이에 의해 레콤비나제 단백질 (비-Bxb1)의 활성이 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 아라비노스 유도, 포도당 유도 등과 같은 방법에 의해 유도될 때, 박테리아 백본은 진핵성 인서트로부터 절제되고, 그 결과로, 진핵성 DNA 미니서클 및 박테리아 플라스미드가 생성된다.
일부 실시양태에서, 관심 서열 (예컨대, 유전자)은 200개의 염기쌍 (bp) 내지 100 킬로베이스 (kb) 길이이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 10 kb 길이이다. 예를 들어, 관심 유전자는 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 적어도 30 kb, 또는 적어도 35 kb 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 10 내지 100 kb, 10 내지 75 kb, 10 내지 50 kb, 10 내지 30 kb, 20 내지 100 kb, 20 내지 75 kb, 20 내지 50 kb, 20 내지 30 kb, 30 내지 100 kb, 30 내지 75 kb, 또는 30 내지 50 kb 길이이다.
일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 200 bp 내지 500 kb, 200 bp 내지 250 kb, 또는 200 bp 내지 100 kb 길이이다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 적어도 10 kb 길이이다. 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드는 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 적어도 30 kb, 적어도 35 kb, 적어도 50 kb, 적어도 100 kb, 적어도 200 kb, 적어도 300 kb, 적어도 400 kb, 또는 적어도 500 kb 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 10 내지 500 kb, 20 내지 400 kb, 10 내지 300 kb, 10 내지 200 kb, 또는 10 내지 100 kb 길이이다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 10 내지 100 kb, 10 내지 75 kb, 10 내지 50 kb, 10 내지 30 kb, 20 내지 100 kb, 20 내지 75 kb, 20 내지 50 kb, 20 내지 30 kb, 30 내지 100 kb, 30 내지 75 kb, 또는 30 내지 50 kb 길이이다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 원형 또는 선형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자 및 상응하는 (동족) Bxb1 부착 부위(들)를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 (예컨대, 미세주입을 통해) 배아, 예컨대, 단일 세포 배아 (접합자) 내로 도입된다. 그 이후의 후기 배아 또는 동물이 또한 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같이 사용하기 위한 전핵 미세주입 및 다른 유전자 전달 방법은 상기에서 논의되었다.
일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 Bxb1 인테그라제 단백질, Bxb1 인테그라제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 Bxb1 인테그라제 단백질 및 Bxb1 인테그라제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 배아 또는 동물 내로 도입된다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA (예컨대, mRNA)일 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드 및 Bxb1 인테그라제의 배아 내로의 도입 후, 상기 기술된 브리딩 프로세스와 유사하게, 배아를 가임신한 암컷에 이식하여 관심 유전자를 포함하는 유전자 변형된 자손 동물을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 10%가 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 또는 적어도 15%가 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%가 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 예를 들어, 유전자 변형된 자손 동물 중 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 10% 내지 20%가 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 자손 동물 중 50% 초과 (예컨대, 55%, 60%, 65%, 또는 70%)는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자 (또는 관심 유전자를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드)는 적어도 10 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 10%가 게놈 유전자좌 내로 올바르게 통합된 관심 유전자를 포함한다. 예를 들어, 관심 유전자는 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 적어도 30 kb, 적어도 35 kb, 적어도 40 kb, 적어도 45 kb, 또는 적어도 50 kb 길이일 수 있고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 10 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 10 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 10 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 10 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 15 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 15 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 15 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 15 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 20 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 20 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 20 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 20 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 25 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15% 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 25 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 25 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 25 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 30 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 30 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 30 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 30 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 35 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 15%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 35 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 20%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 35 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 25%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 적어도 35 kb 길이이고, 유전자 변형된 자손 동물 중 적어도 30%는 게놈 유전자좌 내로 통합된 관심 유전자를 포함한다.
추가 실시양태
추가 실시양태는 하기 넘버링된 단락에 포함된다.
1. 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물.
2. 단락 1에 있어서, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의적으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 것인 포유동물.
3. 단락 1 또는 2에 있어서,
제1 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
제2 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
임의적으로, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 서로에 대하여 이종성이고, 임의적으로, 게놈이 attR 및/또는 attL 부위를 포함하지 않고, 예를 들어, 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물.
4. 단락 3에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP* 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB* 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물.
5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물.
7. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
8. 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물 배아.
9. 단락 8에 있어서, (a) Bxb1 인테그라제 또는 (b) Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의적으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 것인 포유동물 배아.
10. 단락 8 또는 9에 있어서,
제1 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
제2 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
임의적으로, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 서로에 대하여 이종성이고, 임의적으로, 게놈이 attR 및/또는 attL 부위를 포함하지 않고, 예를 들어, 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물 배아.
11. 단락 10에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP* 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB* 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물 배아.
12. 단락 8 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기쌍에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물 배아.
13. 단락 8 내지 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물 배아.
14. 단락 8 내지 단락 13 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 배아가 단일 세포 배아 또는 다세포 배아인 포유동물 배아.
15. 단락 8 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 포유동물 배아.
16. 단락 8 내지 단락 15 중 어느 한 단락의 포유동물 배아 내로 (a) 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 및 (b) Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
17. 단락 8 내지 단락 15 중 어느 한 단락의 포유동물 배아 내로 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
18. 단락 16 또는 17에 있어서, 포유동물 배아를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 단락 18에 있어서, 암컷 포유동물로부터 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
20. 단락 19에 있어서, 자손 포유동물의 게놈 내로 통합된 관심 서열의 존재 또는 부재에 대해 자손 포유동물을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
21. 단락 16 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드, Bxb1 인테그라제, 및/또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 미세주입을 통해 포유동물 배아 내로 도입하는 것인 방법.
22. 단락 16 내지 단락 21 중 어느 한 단락에 있어서, 관심 서열이 관심 유전자를 포함하는 것인 방법.
23. 단락 16 내지 단락 22 중 어느 한 단락에 있어서, 관심 서열의 크기가 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 또는 적어도 30 kb인 방법.
24. (a) 포유동물 배아 내로 (i) Cas9 뉴클레아제, 또는 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 포유동물 배아에서 제1 게놈 부위를 표적화하는 제1 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (iii) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제1 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제1 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자; 임의적으로, (iv) 포유동물 배아에서 제2 게놈을 표적화하는 제2 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (v) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제2 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제2 ssDNA를 도입하는 단계; 및
(b) 포유동물 배아 세포를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계이며, 여기서 가임신한 암컷 포유동물은 자손 포유동물을 출산할 수 있는 것인 단계
를 포함하는, Bxb1 랜딩 패드 포유동물을 생성하는 방법.
25. 단락 24에 있어서, 제1 ssDNA가 제1 Bxb1 부착 부위로부터 상류 또는 하류에 제2 Bxb1 부착 부위를 추가로 포함하고, 여기서 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위, 둘 모두가 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있는 것인 방법.
26. 단락 24 또는 25에 있어서, 포유동물 배아가 Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 단계 (a)가 포유동물 배아 내로 Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 단락 24 내지 단락 26 중 어느 한 단락에 있어서, 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 단락 24 내지 단락 27 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 방법.
29. 단락 8 내지 단락 14 중 어느 한 단락의 포유동물 배아를 포함하는 포유동물.
30. 단락 29에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
31. Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물.
32. 단락 31에 있어서, Bxb1 인테그라제 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 포유동물.
33. 단락 31 또는 32에 있어서, Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 또는 변형된 attB * 부위인 포유동물.
34. 단락 33에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP * 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB * 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물.
35. 단락 29 내지 단락 34 중 어느 한 단락에 있어서, Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물.
36. 단락 29 내지 단락 35 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
37. Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물 배아.
38. 단락 37에 있어서, Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 포유동물 배아.
39. 단락 37 또는 38에 있어서, Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 또는 변형된 attB* 부위인 포유동물 배아.
40. 단락 39에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP* 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB* 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물 배아.
41. 단락 37 내지 단락 40 중 어느 한 단락에 있어서, Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물 배아.
42. 단락 37 내지 단락 41 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 배아가 단일 세포 배아 또는 다세포 배아인 포유동물 배아.
43. 단락 37 내지 단락 42 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 포유동물 배아.
44. 단락 37 내지 단락 43 중 어느 한 단락의 포유동물 배아 내로 (a) 관심 서열 및 동족 Bxb1 부착 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 및 (b) Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
45. 단락 37 내지 단락 43 중 어느 한 단락의 포유동물 배아 내로 관심 서열 및 동족 Bxb1 부착 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
46. 단락 44 또는 45에 있어서, 포유동물 배아를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
47. 단락 46에 있어서, 암컷 포유동물로부터 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 단락 47에 있어서, 자손 포유동물의 게놈 내로 통합된 관심 서열의 존재 또는 부재에 대해 자손 포유동물을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
49. 단락 44 내지 단락 48 중 어느 한 단락에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드, Bxb1 인테그라제, 및/또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 미세주입을 통해 포유동물 배아 내로 도입하는 것인 방법.
50. 단락 44 내지 단락 49 중 어느 한 단락에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드가 미니서클인 방법.
51. 단락 44 내지 단락 50 중 어느 한 단락에 있어서, 관심 서열이 관심 유전자를 포함하는 것인 방법.
52. 단락 44 내지 단락 51 중 어느 한 단락에 있어서, 관심 서열의 크기가 적어도 3 kb, 적어도 4 kb, 적어도 5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 7 kb, 적어도 8 kb, 적어도 9 kb, 또는 적어도 10 kb인 방법.
53. (a) 포유동물 배아 내로
(i) Cas9 뉴클레아제, 또는 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 포유동물 배아에서 게놈 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(iii) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 Bxb1 부착 부위를 포함하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자를 도입하는 단계; 및
(b) 포유동물 배아 세포를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계이며, 여기서 가임신한 암컷 포유동물은 자손 포유동물을 출산할 수 있는 것인 단계
를 포함하는, Bxb1 랜딩 패드 포유동물을 생성하는 방법.
54. 단락 53에 있어서, 포유동물 배아가 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 단계 (a)가 포유동물 배아 내로 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
55. 단락 54에 있어서, 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
56. 단락 55에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 방법.
57. 단락 37 내지 단락 43 중 어느 한 단락의 포유동물 배아를 포함하는 포유동물.
58. 단락 57에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
실시예
실시예
1.
Bxb1
마우스 - 1개의 (
attP
)
랜딩
패드
본 발명자들은 CRISPR/Cas9 및 올리고뉴클레오티드 공여자를 사용하여 단일 attP 부위를 마우스 게놈 (C57BL/6J, NSG™, PWK/PhJ, DBA/2J, A/J, 129S1/SvImJ, 또는 FVB/NJ 마우스 계통)의 Rosa26 유전자좌 내로 삽입하였다.
수정된 접합자를 C57BL/6J 마우스로부터 단리시켰다. 이들 접합자의 전핵에 (1) mRNA, 또는 단백질, 또는 mRNA 및 단백질 둘 모두로서 Cas9 (농도 범위, mRNA의 경우, 60-100 ng/㎕, 및 단백질의 경우, 30-60 ng/㎕), (2) gRNA (농도 범위 30-50 ng/㎕), 및 (3) Rosa26 유전자좌를 표적화하는 대략 200 bp의 ssDNA 올리고 (서열식별번호 3)를 미세주입하였다. 상기 ssDNA 올리고는 48-염기쌍의 Bxb1 attP 부위 (서열식별번호 2)에 플랭킹하는, 상동성인 152개의 염기 (서열식별번호 4 및 5)를 갖는다. 미세주입된 접합자를 가임신한 마우스에 이식하고, 임신시켰다. ~2-3주령째, 꼬리 생검을 자손으로부터 수집하고, PCR에 의해 시험하고, attP 부위의 올바른 통합에 대해 시퀀싱하였다. Bxb1 attP 부위를 보유하는 마우스를 브리딩하여 Bxb1 attP 마우스 계통을 생성하였다.
이어서, 상기 마우스를 매칭 동족 attB 부위를 함유한 공여자와의 인테그라제-매개 재조합을 위한 수용자로서 사용하였다 (도 2a- 2b). 벡터 백본으로부터의 DNA 삽입을 막기 위해, 미세주입 이전에 플라스미드를 미니서클 (시스템 바이오사이언시스, LLC(System Biosciences, LLC))로 전환시켰다.
수정된 접합자를 Bxb1 attP C57BL/6J 마우스 계통으로부터 단리시켰다. 이들 접합자의 전핵에 100 ng/㎕의 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 mRNA 및 1-10 ng/㎕의 공여자 DNA를 미세주입하였다. 공여자 DNA는 숙주 배아 Bxb1 attP 부위와 매칭되는 Bxb1 attB 부위를 보유한다. 공여자 DNA는 본 기술분야에 널리 공지되고, 확립된 기술을 사용하는 박테리아 벡터 무함유 미니서클이었다. 미세주입된 접합자를 가임신한 마우스에 이식하고, 임신시켰다. > 2-3주령째, 꼬리 생검을 자손으로부터 수집하고, PCR 및 시퀀싱에 의해 DNA의 올바른 통합에 대해 시험하였다.
상기 버전의 결과는 표 1에 개략적으로 제시되어 있다.
표 1. 결과 요약
TG=트랜스진 양성
실시예
2.
Bxb1
마우스 - 2개의 (
attP
)
랜딩
패드
본 발명자들은 버전 1 계통을 순차적으로 변형시켜 본 발명자들의 버전 2 수용자 마우스를 생성하였다. 추가로, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 및 올리고뉴클레오티드 공여자를 사용하여 원래의 attP 부위로부터 ~240 bp만큼 떨어진 위치에 제2 attP* (변형된) 부위를 삽입하였다. 변형된 부위에서, 디뉴클레오티드 쌍형성은 GT에서 GA로 변이되었다. 제2 부위를 부가함으로써, 먼저 공여자 구축물을 미니서클로 전환시킬 필요 없이, 벡터 백본을 절제할 수 있다 (도 1b). 본 실시예에서 2개의 부착 부위를 순차적으로 삽입하였지만, 이는 예를 들어, 단일 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용하여 동시에 삽입될 수 있다는 점에 주의한다. 통합시키고자 하는 원하는 영역을 간단히 플랭킹함으로써 (BAC를 포함하는) 임의의 벡터 내로 필수 attB 부위를 배치시킬 수 있으며, 버전 2 마우스를 통해서도 또한 훨씬 더 큰 DNA 트랙을 삽입할 수 있다.
큰 녹-인이 이루어진 마우스를 생성할 때, 스크리닝 및 확인은 가장 도전과제들 중 하나가 될 수 있다. 그러나, 트랜스진의 정확한 위치 및 방향을 앎으로써 PCR에 의해 빠르고, 간단하게 확인할 수 있다. 스크리닝을 위한 일반 전략법은 도 3에 개략적으로 제시되어 있다.
본 발명자들은 30,570 bp의 인간 게놈 DNA 트랙을 삽입하기 위해 재조합된 BAC (전체 크기 33,939 bp)를 사용하여 버전 2 마우스를 시험하였다. 결과는 표 2에 요약되어 있다
표 2. 결과 요약
본 발명자들은 1.5 kb 내지 30.6 kb 범위의 다양한 길이를 갖는 핵산을 삽입한 버전 2 마우스를 시험하였다. 결과는 표 3에 요약되어 있다.
표 3. 결과 요약
TG=트랜스진 양성
4마리의 파운더 후보를 야생형 마우스와 역교배시키고, 원하는 재조합 대립유전자 (REC) 뿐만 아니라, 임의의 오프-타겟 삽입 (OTI) 이벤트, 둘 모두의 생식계열 전달에 대해 N1 자손을 평가하였다. 4마리의 파운더 계통 중 둘로부터의 자손은 또한 원치않는 무작위 트랜스제닉 대립유전자를 보유하였다. OTI 및 REC 대립유전자가 분리되어 있었고, 이는 삽입 이벤트가 연결되어 있지 않다는 것을 시사하는 것이다. 장거리 PCR을 수행하여 통합된 대립유전자가 무손상임을 확인하였다 (도 4).
트랜스진은 인간의 간에서 높은 발현을 보이는 것으로 알려져 있으며, 4개 콜로니 중 3개로부터의 마우스의 간으로부터 RNA를 단리시켰다 (네 번째 파운더로부터의 콜로니는 아직 충분한 크기에 도달하지 못하여 본 시험에 포함시키지 않았다). 전체 RNA로부터 cDNA를 준비하고, 각 계통으로부터 1,270 bp PCR 생성물을 생성하였다 (도 5). 이어서, 상기 생성물의 생어(Sanger) 시퀀싱을 사용하여 전사체가 사실상 인간화 대립유전자라는 것을 확인하였다.
서열
Bxb1 attP 부위
Bxb1 attP * 부위
Bxb1 attB 부위
Bxb1 attB * 부위
Rosa26 유전자좌 - Bxb1 attP 부위를 표적화하는 ssDNA
Rosa26 유전자좌 - Bxb1 attP * 부위를 표적화하는 ssDNA
C57BL6/J Rosa26 유전자좌, Bxb1 attP 부위의 삽입을 위한 5' 좌측 상동성 아암
C57BL6/J Rosa26 유전자좌, Bxb1 attP 부위의 삽입을 위한 3' 우측 상동성 아암
C57BL/6J 마우스 접합자에서 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 gRNA
C57BL/6J 마우스 접합자에서 Rosa26 유전자좌를 표적화하는 gRNA
참고문헌
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문헌 전문을 포함할 수 있다.
본원 명세서에서 및 청구범위에서 사용되며, 단수 형태 "하나"는 명백하게 달리 명시되지 않는 한, "적어도 하나"라는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 1 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급된 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
청구범위에서 뿐만 아니라, 상기 명세서에서, 예컨대, "포함하는," "포함하는(including)," "보유하는(carrying)," "가지는," "함유하는," "포함하는(involving)," "보유하는(holding)," "구성된" 등과 같은 모든 연결 어구는 개방형인 것으로, 즉, ~을 포함하나, 이에 제한되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03)에 명시된 바와 같이 "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 연결 어구만이 각각 폐쇄형 또는 연결 어구여야 한다.
수치 앞의 "약" 및 "실질적으로"라는 용어는 인용된 수치의 ±10%를 의미한다.
값이 범위로 제공되는 경우, 범위의 상단과 하단 사이의 각 값이 본원에서 구체적으로 고려되고, 기술된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Jackson Laboratory
<120> HIGH FREQUENCY TARGETED ANIMAL TRANSGENESIS
<130> J0227.70078WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/913,092
<151> 2019-10-09
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
ggtttgtctg gtcaaccacc gcggtctcag tggtgtacgg tacaaacc 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
gaggaccgcc ctgggcctgg gagaatccct tccccctctt ccctcgtgat ctgcaactcc 60
agtctttcta gaagatggtt tgtctggtca accaccgcgg tctcagtggt gtacggtaca 120
aaccgggcgg gagtcttctg ggcaggctta aaggctaacc tggtgtgtgg gcgttgtcct 180
gcaggggaat tgaacaggtg 200
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
gaggaccgcc ctgggcctgg gagaatccct tccccctctt ccctcgtgat ctgcaactcc 60
agtctttcta gaagat 76
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
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gggaattgaa caggtg 76
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
<400> 6
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<212> DNA
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<223> Synthetic
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
<400> 9
gcaaaactac aggttattat tgcttgtgat ccgcctcgga gtattttcca tcgggtttgt 60
ctggtcaacc accgcggact cagtggtgta cggtacaaac caggtagatt aaagacatgc 120
tcacccgagt t 131
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<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
<400> 10
gucuuuaauc uaccucga 18
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ccaaacagac cagttggtgg cgccagagtc accacatgcc atgtttgg 48
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ggcttgtcga cgacggcggt ctccgtcgtc aggatcat 38
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ggtttgtctg gtcaaccacc gcggtctccg tcgtcaggat cat 43
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<223> Synthetic
<400> 16
ccaaacagac cagttggtgg cgccagaggc agcagtccta gta 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
<400> 17
ggcttgtcga cgacggcggt ctcagtggtg tacggtacaa acc 43
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 18
ccgaacagct gctgccgcca gagtcaccac atgccatgtt tgg 43
Claims (58)
- 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물.
- 제1항에 있어서, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의적으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 것인 포유동물.
- 제1항에 있어서,
제1 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
제2 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
임의적으로, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 서로에 대하여 이종성인 포유동물. - 제3항에 있어서, attP 부위가 서열식별번호(SEQ ID NO:) 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP * 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB * 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물.
- 제1항에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물.
- 제1항에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물.
- 제1항에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
- 제1 Bxb1 부착 부위 및 제2 Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의적으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 것인 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서,
제1 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP* 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
제2 Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP* 부위, attB 부위, 및 변형된 attB* 부위로부터 선택되고;
임의적으로, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 서로에 대하여 이종성인 포유동물 배아. - 제10항에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP * 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB * 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 50 내지 500개의 뉴클레오티드 염기쌍에 의해 서로 이격되어 있는 것인 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서, 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서, 포유동물 배아가 단일 세포 배아 또는 다세포 배아인 포유동물 배아.
- 제8항에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 포유동물 배아.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 포유동물 배아 내로 (a) 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 및 (b) Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 포유동물 배아 내로 제1 동족 Bxb1 부착 부위 및 제2 동족 Bxb1 부착 부위에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 포유동물 배아를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 암컷 포유동물로부터 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 자손 포유동물의 게놈 내로 통합된 관심 서열의 존재 또는 부재에 대해 자손 포유동물을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드, Bxb1 인테그라제, 및/또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 미세주입을 통해 포유동물 배아 내로 도입하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 관심 서열이 관심 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 관심 서열의 크기가 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 또는 적어도 30 kb인 방법.
- (a) 포유동물 배아 내로 (i) Cas9 뉴클레아제, 또는 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 포유동물 배아에서 제1 게놈 부위를 표적화하는 제1 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (iii) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제1 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제1 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자; 임의적으로, (iv) 포유동물 배아에서 제2 게놈을 표적화하는 제2 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (v) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 제2 Bxb1 부착 부위를 포함하는 제2 ssDNA를 도입하는 단계; 및
(b) 포유동물 배아 세포를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계이며, 여기서 가임신한 암컷 포유동물은 자손 포유동물을 출산할 수 있는 것인 단계
를 포함하는, Bxb1 랜딩 패드 포유동물을 생성하는 방법. - 제24항에 있어서, 제1 ssDNA가 제1 Bxb1 부착 부위로부터 상류 또는 하류에 제2 Bxb1 부착 부위를 추가로 포함하고, 여기서 제1 및 제2 Bxb1 부착 부위, 둘 모두가 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 포유동물 배아가 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 단계 (a)가 포유동물 배아 내로 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 방법.
- 제8항의 포유동물 배아를 포함하는 포유동물.
- 제29항에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
- Bxb1 부착 부위를 포함하는 그의 게놈 내에 포유동물.
- 제31항에 있어서, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 포유동물.
- 제31항에 있어서, Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 또는 변형된 attB * 부위인 포유동물.
- 제33항에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP * 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB * 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물.
- 제31항에 있어서, Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물.
- 제31항에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
- Bxb1 부착 부위를 그의 게놈 내에 포함하는 포유동물 배아.
- 제37항에 있어서, Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 포유동물 배아.
- 제37항에 있어서, Bxb1 부착 부위가 attP 부위, 변형된 attP * 부위, attB 부위, 또는 변형된 attB* 부위인 포유동물 배아.
- 제39항에 있어서, attP 부위가 서열식별번호 1의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attP * 부위가 서열식별번호 7의 서열을 포함하고/거나, attB 부위가 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 변형된 attB * 부위가 서열식별번호 8의 서열을 포함하는 것인 포유동물 배아.
- 제37항에 있어서, Bxb1 부착 부위가 세이프 하버 유전자좌, 임의적으로, Rosa26 유전자좌 내에 있는 것인 포유동물 배아.
- 제37항에 있어서, 포유동물 배아가 단일 세포 배아 또는 다세포 배아인 포유동물 배아.
- 제37항에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 포유동물 배아.
- 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항의 포유동물 배아 내로 (a) 관심 서열 및 동족 Bxb1 부착 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드, 및 (b) Bxb1 인테그라제, 또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항의 포유동물 배아 내로 관심 서열 및 동족 Bxb1 부착 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, 포유동물 배아를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제46항에 있어서, 암컷 포유동물로부터 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제47항에 있어서, 자손 포유동물의 게놈 내로 통합된 관심 서열의 존재 또는 부재에 대해 자손 포유동물을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드, Bxb1 인테그라제, 및/또는 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 미세주입을 통해 포유동물 배아 내로 도입하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드가 미니서클인 방법.
- 제44항에 있어서, 관심 서열이 관심 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 관심 서열의 크기가 적어도 3 kb, 적어도 4 kb, 적어도 5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 7 kb, 적어도 8 kb, 적어도 9 kb, 또는 적어도 10 kb인 방법.
- (a) 포유동물 배아 내로
(i) Cas9 뉴클레아제, 또는 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 포유동물 배아에서 게놈 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA (gRNA), 또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(iii) 좌측 상동성 아암 및 우측 상동성 아암에 의해 플랭킹된 Bxb1 부착 부위를 포함하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자를 도입하는 단계; 및
(b) 포유동물 배아 세포를 가임신한 암컷 포유동물 내로 이식하는 단계이며, 여기서 가임신한 암컷 포유동물은 자손 포유동물을 출산할 수 있는 것인 단계
를 포함하는, Bxb1 랜딩 패드 포유동물을 생성하는 방법. - 제53항에 있어서, 포유동물 배아가 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 단계 (a)가 포유동물 배아 내로 Bxb1 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제54항에 있어서, 자손 포유동물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제55항에 있어서, 포유동물 배아가 설치류 배아, 임의적으로, 마우스 배아인 방법.
- 제37항의 포유동물 배아를 포함하는 포유동물.
- 제57항에 있어서, 포유동물이 설치류, 임의적으로, 마우스인 포유동물.
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