JP2018532415A - 大きなゲノムｄｎａノックインおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、大容量クローニングベクター（例えば、ＢＡＣ）を利用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同組換えにおいて細胞のゲノムに効率的に挿入するように近位および遠位領域（１０ｋｂ）によって隣接される大きな外因性ゲノムＤＮＡ（約１０〜３００ｋｂ）を保有するための組成物および方法を提供する。大きなヒト遺伝子をマウス接合体にマイクロインジェクションして遺伝的に改変されたマウスを調製するための方法および組成物も提供する。【選択図】図１

Description

関連出願に関する参照
本出願は、２０１５年１１月６日に出願された米国仮出願番号第６２／２５２，０８０号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下の利益を主張し、その内容全体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の米国国立癌研究所（ＮＣＩ）により授与された助成金番号Ｐ３０ＣＡ０３４１９６の下で、米国政府支援を受けて行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
ゲノム編集は、ＤＮＡが、挿入されるか、置き換えられるか、またはゲノムから除去される遺伝子操作の一種である。近年、ゲノム編集は、人工的に操作されたヌクレアーゼ（ａ／ｋ／ａ「分子ハサミ」）を使用して達成されている。当該ヌクレアーゼは、ゲノムにおける所望の位置で二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出し、細胞の内因性メカニズムを利用して、相同性誘導修復（homology directed repair）（ＨＤＲ、その一般的な形態が、相同組換え（ＨＲ）である）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスによって、誘発された切断を修復する。
制限酵素（ＲＥ）は多くの場合、標的ＤＮＡにおいてＤＳＢを創出するのに使用される。短い認識配列（通常、４〜８ｂｐ）のため、ＲＥは、大きなゲノムＤＮＡ領域では、非常に多くのＤＳＢを創出する。この問題を克服するために、幾つかの別個の種類のヌクレアーゼは、大きなゲノム領域に対してより適した部位特異的ＤＳＢを生成するように生体工学によって操作されており（bioengineered）；例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および操作されたメガヌクレアーゼである。
メガヌクレアーゼは、幾つかの微生物種において一般的に見出される。それらは、非常に長い認識配列（１４ｂｐを超える）を有する特有の特性を保有することから、それらは自然に特異的となり、大きなゲノムにおけるゲノム編集中に部位特異的ＤＳＢを生成するのに適したものとなる。しかしながら、このアプローチの制限は、公知のメガヌクレアーゼが数少ないことであり、したがって、この方法によって網羅され得る標的配列を大幅に制限している。突然変異誘発およびハイスループットスクリーニング法を使用して、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体が創出されてきた。様々なメガヌクレアーゼを融合させて、新たな認識配列を有するハイブリッド酵素が創出されている。配列特異的なメガヌクレアーゼを設計するために、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用残基を変更させることによって、メガヌクレアーゼを合理的に設計しようと試みたものもいる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。
ゲノム編集における他の伝統的な遺伝子操作技術として、ランダム形質転換（transgenesis）、標的形質転換およびリコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）が挙げられる。これらの各々の方法は、欠点を有する。例えば、ランダム形質転換方法は、同族内因性遺伝子座でのゲノム改変から逸脱し、導入遺伝子がランダムに組み込まれるのに十分である（そこで、それらは、多様性発現（variegated expression）を受ける）。標的形質転換中には、導入遺伝子は、標準セーフハーバー部位に特異的に向けられて、この斑入り位置効果（position-effect variegation）を限定し得るが、ここでさえ、導入遺伝子は、それらの内因性同族遺伝子に連結されてない。関連するＲＭＣＥ法のように、標的形質転換は、リコンビナーゼ結合部位によって隣接される抗生物質選択カセットの使用を含み得る。複雑さの付加に加えて、これらの選択カセットを欠失させることは、特異的なリコンビナーゼ発現マウスへの品種改良を要し、それによって系統の開発を長引かせる。
ここ３０年間マウスにおいて使用されているような、伝統的な遺伝子ターゲティングに関して、大部分の文献に基づく伝統的なパラダイムは、ドナー分子として作用するために長さが二、三から数キロ塩基対を有する２つの相同性アームを有するプラスミドベクターを創出することであった。これらのアームは、プラスミドベクターの胚幹（ＥＳ）細胞への導入およびＨＤＲ後にゲノムへ組み込まれる、研究者により変更された配列に隣接するように、プラスミド内で位置する。ポジティブおよびネガティブ選択カセットは、適切に組み込まれた配列を含有する稀な胚幹（ＥＳ）細胞クローンを選択するのを助けるために頻繁に用いられる。この技法は、１つのヌクレオチドから最大数千もの塩基対までの規模で、ゲノム配列を改変するのに十分である。しかしながら、多くの場合に何万または何十万もの塩基対に及ぶマウス遺伝子全体を変更しようと試みる場合、本方法は及ばない場合がある。
ゲノム操作ツールとして、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、高頻度で、かつ多種多様な系統および生物にわたって、目的の遺伝子座に対して特異的にＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成させるための手段として役立つ。ＤＳＢに直面すると、攪乱されている生物の細胞は、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲ経路により応答して、ＤＳＢを修復する。より迅速でかつ誤りがちなＮＨＥＪ経路によって修復されるＤＳＢは、少数のヌクレオチドの欠失または挿入（ＩＮＤＥＬ）を特徴とし、それらが目的のタンパク質のオープンリーディングフレーム内に存在する場合、それらは、目的の元の遺伝子の低形質変異またはヌル変異につながり得る。対比して、相同的な鋳型（例えば、姉妹染色分体、ドナー分子）の存在下でのＨＤＲによって修復されるＤＳＢは、ＤＳＢの部位で、正確なＤＮＡ改変を生物に導入する機会を提供する。
ＣＲＩＳＰＲ技法は、迅速に拡大しており、多数の種および種々のゲノム編集分野にわたって適用される。しかしながら、本出願人の知る限りでは、進行中のＣＲＩＳＰＲ技術にもかかわらず、目下、ＨＤＲ（例えば、ＨＲ）ベースの組換えは、比較的小さな領域のゲノムＤＮＡを編集することに限定される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓによるＤＳＢ創出後に遺伝子編集するのにＨＲを使用する場合の技術的な問題に対処することを目的としたＡｄｄｇｅｎｅウェブサイトのＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＨＲ）ＦＡＱセクションでは、相同組換え（ＨＲ）によって特異的な変異または挿入を創出するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用しようと試みる場合に、各相同性アームがどれくらい長くあるべきであるかに関する疑問が提起された。小さな変異（例えば、５０ｂｐ未満の変異）または単一点変異を導入するための推奨アプローチは、標的細胞へのトランスフェクション用のＨＲ鋳型として単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（プラスミドとは対照的に）を使用することである。ｓｓＤＮＡオリゴは通常、中央に位置する小さな変異または点変異を伴って、およそ１００〜１５０ｂｐの総相同性を有し、したがって、変異の各側に約５０〜７５ｂｐの相同性アームを付与する。大きな変化（１００ｂｐを上回る挿入または欠失など）には、通常、所望の挿入または変異に隣接する各側のおよそ８００ｂｐの２つの相同性アームを有するプラスミドドナーが使用される。かかるプラスミドドナーの典型的なサイズは、およそ５ｋｂである（Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ １５４巻（６）：１３７０〜１３７９頁、２０１３年）。相同組換え（ＨＲ）に関してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用してゲノムに挿入することができるＤＮＡの最大量、および効率的な組換えのための相同性アームの長さに関する疑問に応答して、Ａｄｄｇｅｎｅウェブサイトは、挿入に関して試みた最も長い長さは１ｋｂであり、相同性アームは長さが８００ｂｐであることを示した。
特に挿入片サイズが数キロ塩基よりも大きい場合の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって創出されるＤＳＢの性質および適合性ならびにＣＲＩＳＰＲ関連ＨＤＲに対する相同性アームの長さの影響などの技術のある特定の重要な態様に関する不確実性および予想不可能性は、ＣＲＩＳＰＲ関連ＨＤＲが、これまで小さなＤＮＡ断片（例えば、単一ヌクレオチドから１つまたは多くても数キロ塩基まで）の宿主ゲノムへの挿入に限定されてきたという事実の一因となっている可能性がある。
したがって、相同組換えを介して、大きなゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに導入するための新規手段を開発することは、引き続き必要とされている。
一態様では、本発明は、相同組換えを介して大きな外因性ゲノムＤＮＡを挿入して、哺乳類の細胞のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを置き換える方法であって、
（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
（ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
（ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、前記ＢＡＣに挿入するステップであって、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、前記近位領域および前記遠位領域は、前記細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、前記第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡは、前記近位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、前記第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡは、前記遠位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
（ｇ）前記哺乳類の前記細胞に、
（ｉ）ステップ（ｃ）における前記ＢＡＣ、
（ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第１の対、
（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第２の対、および
（ｉｖ）ステップ（ｆ）における前記Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
を導入するステップと
を含み、それにより、
（ｉ）ｇＲＮＡの前記第１の対が、該近位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第１の二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、
（ｉｉ）ｇＲＮＡの前記第２の対が、該遠位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第２のＤＳＢを生成し、
（ｉｉｉ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、相同組換えを介して前記第１のＤＳＢおよび前記第２のＤＳＢで該細胞の該ゲノムに組み込まれて、該近位領域と該遠位領域との間の前記内因性ゲノムＤＮＡを置き換える、前記方法
を提供する。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１５〜２００ｋｂ、好ましくは約２０〜１００ｋｂ、より好ましくは約２５ｋｂである。
ある特定の実施形態では、細胞は、接合体である。ある特定の実施形態では、接合体に関して、ステップ（ｇ）は、マイクロインジェクションによって実施される。ある特定の実施形態では、マイクロインジェクションは、約１〜１０ｎｇ／μＬの大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣを使用して、好ましくは約２〜８ｎｇ／μＬを使用して、より好ましくは約５ｎｇ／μＬを使用して実施される。
ある特定の実施形態では、細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞である。ある特定の実施形態では、ＥＳ細胞に関して、ステップ（ｇ）は、電気穿孔によって実施される。
ある特定の実施形態では、ＢＡＣは、選択マーカーを保有しない。
ある特定の実施形態では、ＢＡＣは、ｐＢＡＣｅ３．６、ｐＢＡＣＧＫ１．１、ｐＢＡＣＧＭＲ、ｐＢＡＣ−ｒｅｄ、ｐＴＡＲＢＡＣ１、ｐＴＡＲＢＡＣ１．３、ｐＴＡＲＢＡＣ２、ｐＴＡＲＢＡＣ２．１、ｐＴＡＲＢＡＣ３、ｐＴＡＲＢＡＣ４またはｐＴＡＲＢＡＣ６である。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する。ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、哺乳類の異なる種に由来する。
ある特定の実施形態では、哺乳類は、マウスである。
ある特定の実施形態では、第１および第２のＣａｓ９切断部位は、独立して、近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある。
ある特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖（即ち、＋および−鎖）と結合する。
ある特定の実施形態では、第１および第２のＣａｓ９切断部位は、近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である。
ある特定の実施形態では、第３および第４のＣａｓ９切断部位は、独立して、遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある。
ある特定の実施形態では、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖（即ち、＋および−鎖）と結合する。
ある特定の実施形態では、第３および第４のＣａｓ９切断部位は、遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）において、Ｃａｓ９タンパク質は、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、または第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される。
しかしながら、関連態様では、本発明の方法は、第１のＤＳＢを創出するように第１および第２のｇＲＮＡの一方のみを使用して実行することができる。
別の関連態様では、本発明の方法は、第２のＤＳＢを創出するように第３および第４のｇＲＮＡの一方のみを使用して実行することができる。
一態様では、本発明は、細胞が、相同組換えを介して内因性ゲノムＤＮＡを置き換えた大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有し、かつ生殖系列により該大きな外因性ゲノムＤＮＡを伝達することが可能な非ヒト哺乳類を生成する方法であって、
（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
（ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
（ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、該ＢＡＣに挿入するステップであって、該大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、該近位領域および該遠位領域は、該哺乳類の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、該第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、該第１のｇＲＮＡおよび該第２のｇＲＮＡは、該近位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、該第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、該第３のｇＲＮＡおよび該第４のｇＲＮＡは、該遠位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する該遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
（ｇ）該哺乳類の接合体に、
（ｉ）ステップ（ｃ）における該ＢＡＣ、
（ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの該第１の対、
（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの該第２の対、および
（ｉｖ）ステップ（ｆ）における該Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
を導入するステップと、
（ｈ）該哺乳類の同じ種の偽妊娠雌を調製するステップと、
（ｊ）ステップ（ｇ）における該接合体を、該偽妊娠雌に移植して、該哺乳類の子孫を生ませるステップ
とを含む、前記方法を提供する。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１５〜２００ｋｂ、好ましくは約２０〜１００ｋｂ、より好ましくは約２５ｋｂである。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｇ）は、マイクロインジェクションによって実施される。
ある特定の実施形態では、哺乳類は、大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である。ある特定の実施形態では、哺乳類の子孫の約５０％または１００％は、大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有する。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、必要に応じて、大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である哺乳類の子孫を生成するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、哺乳類は、ＥＳ細胞技術が欠如している種である。
ある特定の実施形態では、マイクロインジェクションは、約１〜１０ｎｇ／μＬの大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣを使用して、好ましくは約２〜８ｎｇ／μＬを使用して、より好ましくは約５ｎｇ／μＬを使用して実施される。
ある特定の実施形態では、第１および第２のＣａｓ９切断部位は、独立して、近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある。
ある特定の実施形態では、第３および第４のＣａｓ９切断部位は、独立して、遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある。
ある特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖（即ち、＋および−鎖）に結合する。
ある特定の実施形態では、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖（即ち、＋および−鎖）に結合する。
ある特定の実施形態では、第１および第２のＣａｓ９切断部位は、近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である。
ある特定の実施形態では、第３および第４のＣａｓ９切断部位は、遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）において、Ｃａｓ９タンパク質は、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、または第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される。
しかしながら、関連態様では、本発明の方法は、第１のＤＳＢを創出するように第１および第２のｇＲＮＡの一方のみを使用して実行することができる。
別の関連態様では、本発明の方法は、第２のＤＳＢを創出するように第３および第４のｇＲＮＡの一方のみを使用して実行することができる。
別の態様では、本発明は、第１の生物由来の大きなゲノムＤＮＡの中心領域、第２の生物由来のゲノムＤＮＡの近位領域、および第２の生物由来のゲノムＤＮＡの遠位領域を含む人工ゲノムＤＮＡを提供し、ここで、中心領域は、近位領域および遠位領域によって隣接される。
中心領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂまたは３５０ｋｂである。
第１の生物由来のゲノムＤＮＡの中心領域は、第２の生物における近位領域および遠位領域によって隣接される第２の生物の相同的なまたは相当する中心領域を置き換える。
第２の生物の相同的なまたは相当する中心領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂまたは３５０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、近位領域の長さおよび遠位領域の長さはともに、相同組換えを支持するのに十分長い。
近位領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または少なくとも約５０ｋｂである。遠位領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または少なくとも約５０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、相同的なまたは相当する中心領域は、約２０ｋｂであり、中心領域は、約２５〜３０ｋｂであり、近位領域および遠位領域はそれぞれ、約１０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、第１の生物および第２の生物は、同種である。ある特定の実施形態では、第１の生物および第２の生物は、異なる種である。ある特定の好ましい実施形態では、第１の生物はヒトであり、第２の生物は、マウス（またはラット）である。
一態様では、本発明は、大きな外因性ＤＮＡを保有することが可能であり、かつ本発明による相同組換えに適合性であるベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、接合体における（ＣＲＩＳＰＲ創出）二重鎖切断（ＤＳＢ）相同組換え（ＨＲ）媒介性ノックインに適したベクターは、対象人工ゲノムＤＮＡのいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、ＤＳＢは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃｐｆ１によって創出される。ある特定の実施形態では、ベクターは、選択可能マーカーを有さない。
ある特定の実施形態では、ベクターは、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えに適しており、ベクターは、対象人工ゲノムＤＮＡのいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージλ、コスミド、バクテリオファージＰ１ベクター、Ｐ１人工染色体（ＰＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）である。好ましくは、ベクターはＢＡＣである。例示的なＢＡＣとして、ｐＢＡＣｅ３．６、ｐＢＡＣＧＫ１．１、ｐＢＡＣＧＭＲ、ｐＢＡＣ−ｒｅｄ、ｐＴＡＲＢＡＣ１、ｐＴＡＲＢＡＣ１．３、ｐＴＡＲＢＡＣ２、ｐＴＡＲＢＡＣ２．１、ｐＴＡＲＢＡＣ３、ｐＴＡＲＢＡＣ４、ｐＴＡＲＢＡＣ６またはそれらの改変型が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするベクターまたはコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡである。
関連態様では、本発明は、本明細書中に記載するような第２生物の近位領域と遠位領域の間において、第１の生物の中心領域を導入する方法であって、相同組換えを可能にする条件下で、対象ベクターをＥＳ細胞に導入するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＳ細胞または接合体を、偽妊娠雌に移入するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、マイクロインジェクトされた接合体またはその子孫から生じる哺乳類を遺伝子型同定するステップをさらに含む。遺伝子型同定は、無傷の（または小ＩＮＤＥＬ含有）宿主哺乳類対立遺伝子、内因性／外因性ゲノムＤＮＡ接合部、および／または任意の欠失保有対立遺伝子の分断点のＣａｓ９結合部位を確証するのに使用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、遺伝子型同定反応からの増幅産物を配列決定するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、所望の遺伝子座での組込みを確証するための、組み込まれた大きな外因性ゲノムＤＮＡの遺伝子マッピングをさらに含む。
実施例または明細書の１つのセクションにのみ開示するものを含む本明細書中に記載するいずれか１つの実施形態は、明らかに否認されない限りは、いずれか１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることが可能であると意図されることが理解されよう。
Ｂｃｌ２ｌ１１／ＢＣＬ２Ｌ１１ターゲティングベクター／ドナー分子の構築に関する一般的なスキームを示す図である。マウス相同性アーム間にヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子の２５ｋｂｐセグメントを配置させて、ヒトセグメントの各末端で除去可能な選択可能マーカーカセットを配置させ、かつ東アジア集団の１２％において欠失されるヒトＤＮＡの２．９ｋｂｐのセグメントの周囲にｌｏｘＰ部位を配置させる遺伝子ターゲティングベクター／ドナー分子を構築した。 ＢＣＬ２Ｌ１１／Ｂｃｌ２ｌ１１のマウス（Ｍ）、ヒト化（Ｍ／Ｈ）および欠失保有（ΔＭ）対立遺伝子に関する遺伝子型同定用プライマーの機構を示す図である。遺伝子型同定用プライマーの機構を示す模式図。数字、表４と同様のプライマー名；水平方向の黒線の左および右セグメント、マウスＢｃｌ２ｌ１１領域の隣接領域；上部水平方向の黒線の中心セグメント、マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子の中心（置き換えられるべき）領域；青線、ヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子の中心セグメント。 マウス接合体におけるＣＲＩＳＰＲ刺激相同組換え後のＢＣＬ２Ｌ１１組込み部位の連鎖分析の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２２匹のＦ２子孫（上方パネル）およびＦＶＢ／ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２８匹のＦ２子孫（下方パネル）に関する連鎖分析を示す。連鎖およびハロタイプ分析により、ＢＣＬ２Ｌ１１ベクター組込みが、マーカーｒｓ４２２３４０６とｒｓ３６８９６００との間で起こり、その分域は、マーカーｒｓ１３４７６７５６およびｒｓ３６６２２１１と完全に合致することが示される。この結果は、設計通りに、内因性マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子内でのヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントの組込みと完全に一致する。 マウス接合体におけるＣＲＩＳＰＲ刺激相同組換え後のＢＣＬ２Ｌ１１組込み部位の連鎖分析の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２２匹のＦ２子孫（上方パネル）およびＦＶＢ／ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２８匹のＦ２子孫（下方パネル）に関する連鎖分析を示す。連鎖およびハロタイプ分析により、ＢＣＬ２Ｌ１１ベクター組込みが、マーカーｒｓ４２２３４０６とｒｓ３６８９６００との間で起こり、その分域は、マーカーｒｓ１３４７６７５６およびｒｓ３６６２２１１と完全に合致することが示される。この結果は、設計通りに、内因性マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子内でのヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントの組込みと完全に一致する。 マウス接合体におけるＣＲＩＳＰＲ刺激相同組換え後のＢＣＬ２Ｌ１１組込み部位の連鎖分析の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２２匹のＦ２子孫（上方パネル）およびＦＶＢ／ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２８匹のＦ２子孫（下方パネル）に関する連鎖分析を示す。連鎖およびハロタイプ分析により、ＢＣＬ２Ｌ１１ベクター組込みが、マーカーｒｓ４２２３４０６とｒｓ３６８９６００との間で起こり、その分域は、マーカーｒｓ１３４７６７５６およびｒｓ３６６２２１１と完全に合致することが示される。この結果は、設計通りに、内因性マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子内でのヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントの組込みと完全に一致する。 マウス接合体におけるＣＲＩＳＰＲ刺激相同組換え後のＢＣＬ２Ｌ１１組込み部位の連鎖分析の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２２匹のＦ２子孫（上方パネル）およびＦＶＢ／ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１戻し交配の２８匹のＦ２子孫（下方パネル）に関する連鎖分析を示す。連鎖およびハロタイプ分析により、ＢＣＬ２Ｌ１１ベクター組込みが、マーカーｒｓ４２２３４０６とｒｓ３６８９６００との間で起こり、その分域は、マーカーｒｓ１３４７６７５６およびｒｓ３６６２２１１と完全に合致することが示される。この結果は、設計通りに、内因性マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子内でのヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントの組込みと完全に一致する。
定義−本出願で使用する用語は、下記意味を有する。
本明細書中で使用する場合、「大きな外因性ゲノムＤＮＡ」という用語は、哺乳類のゲノムに関する外来ゲノムＤＮＡを指し、外来ゲノムＤＮＡは、少なくとも約１０ｋｂ、例えば約１０〜３００ｋｂ、約１５〜２００ｋｂ、約２０〜１００ｋｂ、または約２５〜５０ｋｂの長さを有する。例えば、５０ｋｂのヒトゲノムＤＮＡは、マウスゲノムに関して大きな外因性ゲノムＤＮＡである。
本明細書中で使用する場合、「相同組換え」という用語は、ヌクレオチド配列が、相同配列または相同性アームとして知られるＤＮＡの２つの類似または同一分子間で交換される遺伝的組換えの一種を指す。相同組換えは多くの場合、下記の基本ステップを含む：二重鎖切断（ＤＳＢ）がＤＮＡの両方の鎖上で起きた後、ＤＳＢの５’末端周囲のＤＮＡの切片は、切除と呼ばれるプロセスにおいて切り取られる。続く鎖侵入ステップでは、破壊されたＤＮＡ分子のオーバーハンギング３’末端が、破壊されてない類似または同一（または相同）ＤＮＡ分子、例えば相同性アームに「侵入」する。鎖侵入後に、事象のさらなる筋道は、２つの主要経路−ＤＳＢＲ（二重鎖切断修復）経路またはＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーニング）経路の一方に続き得る。
本明細書中で使用する場合、「内因性ゲノムＤＮＡ」という用語は、本明細書中で定義されるような大きな外因性ゲノムＤＮＡによって置き換えられるべきである哺乳類におけるゲノムＤＮＡのある特定のセグメントを指す。置き換えられるか、または欠失されるべき内因性ゲノムＤＮＡは、それらがともに、同じ相同性アームによって隣接される限りは、大きな外因性ゲノムＤＮＡに対して、配列が相同的であってもよく、または相同的でなくてもよい。内因性ゲノムＤＮＡは、長さが少なくとも約１０ｋｂである。それは、好ましくは近位および遠位接合部で／付近でＤＳＢの存在下で相同組換えが起こるのを可能にする、内因性ゲノムＤＮＡに結合される近位領域と、大きな外因性ゲノムＤＮＡに結合される近位領域との間の配列相同性（例えば、同一性）、および内因性ゲノムＤＮＡに結合される遠位領域と、大きな外因性ゲノムＤＮＡに結合される遠位領域との間の配列相同性（例えば、同一性）である。
本明細書中で使用する場合、「近位領域」は、（１）哺乳類のゲノムにおける内因性ゲノムＤＮＡの一方の末端を結合し、（２）相同組換えターゲティングベクター上の大きな外因性ゲノムＤＮＡの一方の末端を結合し、（３）相同組換えを容易にして、哺乳類のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを、大きな外因性ゲノムＤＮＡで置き換える２つの隣接する相同性アームの一方として機能する、長さが少なくとも約１０ｋｂのゲノムＤＮＡのセグメントを指す。
本明細書中で使用する場合、「近位接合部」という用語は、近位領域が、哺乳類のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡと結合する位置を指す。
本明細書中で使用する場合、「遠位領域」は、（１）哺乳類のゲノムにおける内因性ゲノムＤＮＡの他方の末端を結合し、（２）相同組換えターゲティングベクター上の大きな外因性ゲノムＤＮＡの他方の末端を結合し、（３）相同組換えを容易にして、哺乳類のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを、大きな外因性ゲノムＤＮＡで置き換える２つの隣接する相同性アームの他方として機能する、長さが少なくとも約１０ｋｂのゲノムＤＮＡのセグメントを指す。
本明細書中で使用する場合、「遠位接合部」という用語は、遠位領域が、哺乳類のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡと結合する位置を指す。
本明細書中で使用する場合、「人工ゲノムＤＮＡ」という用語は、第１の哺乳類由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡの一方の末端を、第２の哺乳類由来の近位領域に結合することによって、および大きな外因性ゲノムＤＮＡの他方の末端を、第２の哺乳類由来の遠位領域に結合することによって創出される人工ゲノムＤＮＡを指す。大きな外因性ゲノムＤＮＡ、近位領域、および遠位領域はそれぞれ、長さが少なくとも約１０ｋｂである。
本明細書中で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」または「Ｃａｓ９」タンパク質という用語は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）および他の細菌などのある特定の細菌において見出されるＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）ＩＩ型適応免疫系に関連付けられるＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼを指す。本出願の目的で、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）において見出される野生型（ｗｔ）Ｃａｓ９に限定されない。国際公開第２０１３／１７６７７２号（参照により組み込まれる）の図３および配列番号８に表されるようなＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列（化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）の）のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３、国際公開第２０１３／１７６７７２号（参照により組み込まれる）の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６のアミノ酸配列のいずれか１つにおける相当する部分、ならびに化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、髄膜炎菌（N. meningitidis）、高度好熱菌（S. thermophilus）およびＴ．デンティコラ（T. denticola）由来のオーソゴナル（orthogonal）Ｃａｓ９配列のアミノ酸配列のいずれか１つにおける相当する部分（Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１１）：１１１６〜１１２１頁、２０１３年を参照、参照により組み込まれる）を網羅すると意図される。
本明細書中で使用する場合、「Ｃａｓ９コード配列」という用語は、宿主細胞／宿主哺乳類において機能的な遺伝子コードに従って、転写および／または翻訳されて、Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なポリヌクレオチドを指す。Ｃａｓ９コード配列は、ＤＮＡ（プラスミドなどの）またはＲＮＡ（ｍＲＮＡなどの）であり得る。
本明細書中で使用する場合、「Ｃａｓ９リボタンパク質（riboprotein）」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質および関連ガイドＲＮＡで構成されるタンパク質／ＲＮＡ複合体を指す。
本明細書中で使用する場合、「胚幹（ＥＳ）細胞」という用語は、それが正常な胚盤胞の腔に挿入／注入される前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期間後に培養することができ、また胚発生の正常なプログラムを再開して、生殖細胞を含む成体哺乳類の全ての細胞型に分化するように誘発させることができる、胚盤胞（哺乳類の初期着床前胚）の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する多能性幹細胞を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＥＳ細胞技術」という用語は、例えば、遺伝子移入実験に関して、ＥＳ細胞を単離、培養および操作するために開発された技術を指す。ＥＳ細胞技術は複雑であるが、生殖系列遺伝子挿入にとって強力なアプローチであるが、それらはこれまでのところ、マウスならびにより程度は低いがラットおよびヒトを含む限定された哺乳類種においてのみ確立されている。したがって、無傷のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９駆動相同組換えを使用して、大きな外因性ゲノムＤＮＡを挿入することができるほとんどの哺乳類において、ＥＳ細胞技術は欠如している。
本明細書中で使用する場合、「接合体」という用語は、２つの配偶子、例えば哺乳類由来の卵子および精子との間での受精によって形成される真核細胞を指す。
本明細書中で使用する場合、「接合性」という用語は、生物における形質に関する対立遺伝子の類似性の度合いを指す。
本明細書中で使用する場合、「ホモ接合体」は、特定の遺伝子またはＤＮＡ（例えば、宿主ゲノムへの大きな外因性ゲノムＤＮＡ挿入）に関して使用され、相同染色体がともに、遺伝子／ＤＮＡの同じ対立遺伝子もしくはコピーを有する二倍体細胞または生物を指す。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロ接合体」という用語は、特定の遺伝子またはＤＮＡ（例えば、宿主ゲノムへの大きな外因性ゲノムＤＮＡ挿入）に関して使用され、２つの相同染色体が、遺伝子またはＤＮＡの異なる対立遺伝子／コピー／型を有する二倍体細胞または生物を指す。
本明細書中で使用する場合、「半接合体」という用語は、特定の遺伝子またはＤＮＡ（例えば、宿主ゲノムへの大きな外因性ゲノムＤＮＡ挿入）に関して使用され、遺伝子またはＤＮＡの対立遺伝子／コピー／型が２つの相同染色体の一方のみに存在する（即ち、遺伝子またはＤＮＡは、他方の相同染色体には存在しない）二倍体細胞または生物を指す。半接合性は、遺伝子の一方のコピーが欠失される場合に、または異型配偶子を持つ性において、遺伝子が性染色体上に（例えば、哺乳類のＸ染色体上に）位置する場合に観察される。半接合性は、外因性導入遺伝子が一方の染色体上で遺伝子座に導入されるが、他方の相同染色体上の同じ遺伝子座上に存在しない場合に観察される。しかしながら、導入遺伝子は、望ましくかつ適正である場合に、ホモ接合性に繁殖させて、近交系として維持することができる。
本明細書中で使用する場合、「細菌人工染色体（ＢＡＣ）」という用語は、機能性稔性プラスミド（または大腸菌（E. coli）のＦ−プラスミド）および大きなＤＮＡウイルスのゲノム（バキュロウイルスおよびマウスサイトメガロウイルスのものを含む）に基づいて構築され、細菌、通常大腸菌（E. coli）におけるトランスフォーミングおよびクローニングに使用される大容量ＤＮＡ構築物（通常、長さが７ｋｂであるが、約１５０〜３５０ｋｂｐのサイズを有する挿入片を含有することが可能である）を指す。典型的なＢＡＣは、下記共通構成成分を有する：ｒｅｐＥ（プラスミド複製およびコピー数の調節のため）、ｐａｒＡおよびｐａｒＢ（分裂中にＦプラスミドＤＮＡを娘細胞に分配して、ＢＡＣの安定な維持を保証するため）、挿入された遺伝子の転写のためのＴ７＆Ｓｐ６ファージプロモーター、および抗生物質耐性に関する任意選択の選択可能マーカー（また、幾つかのＢＡＣは、青色／白色選択のためにクローニング部位にｌａｃＺを有する）。
したがって、本発明は、相同組換え用の大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有するＢＡＣベースのベクターを供給することによって、従来技術の欠点を克服する。本発明は、ＢＡＣベースのベクターを構築する方法を提供する。本発明のＢＡＣベースのベクターは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせて使用する場合、相同組換えを介した標的細胞のゲノムへの大きなゲノムＤＮＡの効率的な送達を容易にする。
本明細書中に記載する本発明は、大きなサイズ（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０ｋｂ）の外因性ゲノムＤＮＡが、生物のゲノムへノックインされ得るという発見に部分的に基づく。本発明は、標的ゲノムにおける大きな欠失／ギャップ（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０ｋｂ等）に隣接する相同組換えに適した相同性アーム（例えば、１０ｋｂ〜３０ｋｂ）を利用する。本発明の方法は、相同組換えと組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分を利用する。
本明細書中に記載および例示される本発明は、多くの利点、例えば、１）ＣＲＩＳＰＲ駆動ノックインおよび遺伝子置換の物理的サイズを２５ｋｂｐ以上へ拡大させること、２）多数の系統および種を、長距離にわたるＤＮＡ改変に対して開放すること、３）胚幹（ＥＳ）細胞の抗生物質選択の必要性を省くこと、および４）選択カセットのリコンビナーゼ媒介性切除を回避することを有する。
一態様では、本発明は、大きな外因性ゲノムＤＮＡを提供する。大きな外因性ゲノムＤＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡを置き換えるために、宿主哺乳類への導入用の大容量クローニングベクター内に含有され、約１０〜３００ｋｂ、好ましくは約１５〜２００ｋｂ、最も好ましくは約１００〜１５０ｋｂの大きなＤＮＡサイズであり得る。
大きな外因性ゲノムＤＮＡは、ヒトまたは非ヒトであり得る。例えば、非ヒトゲノムＤＮＡは、動物、哺乳類（非ヒト哺乳類などの）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等）、酵母、細菌等であり得る。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、タンパク質、例えば治療用タンパク質（遺伝的または後天性欠損を補償するものなどの）をコードする大きな外来遺伝子を含有し得る。例示的な治療用タンパク質として、ヒト成長ホルモン（ｒＨＧＨ）、ヒトインスリン（ＢＨＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵ、ラロニダーゼ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ、ガルスルファーゼ）、ドルナーゼアルファ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、グルコセレブロシダーゼ、インターフェロン（ＩＦ）インターフェロン−β、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、およびスマトトロピン等が挙げられる。
大きな外因性ゲノムＤＮＡの大きなサイズに起因して、大きなプロモーター要素を有する一連の種々のタンパク質をコードすることが可能である。例えば、細胞特異的または外因的に調節される遺伝子発現下で、タンパク質複合体を一緒に形成する多くのタンパク質をコードすることができる。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、その突然変異が疾患または状態と関連されている遺伝子などの、目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードし得る。突然変異体遺伝子は、疾患（例えば、がん、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患等）に関連付けられる突然変異体タンパク質をコードし得る。外来遺伝子の、宿主ゲノムへの組込みは、特有の機能性ゲノム動物モデル（またはアッセイ）を提供し、それは、特定のゲノム挿入片における遺伝子の存在または機能を決定するのに有用であり得る。例えば、遺伝子は、ヒトＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＣＬ２様１１アポトーシス促進物質）であってもよく、突然変異は、そのイントロン２の部分の欠失である。相同マウスＢｃｌ２ｌ１１がヒト突然変異体ＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子によって置き換えられたマウスモデルは、ヒト突然変異と関連付けられるヒト疾患を研究するための有用なモデルを提供する。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、プロモーター、エンハンサー領域、または他の転写調節要素を含む調節性または制御用ＤＮＡ配列を含有し得る。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡは、ヒトまたは哺乳類人工染色体の創出用のヒトまたは哺乳類セントロメアＤＮＡを含み得る。
別の態様では、本発明は、ＢＡＣ、ＹＡＣ等などの大容量クローニングベクターを利用して、大きな外因性ゲノムＤＮＡを、宿主ゲノムに導入する。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）大容量クローニングベクターおよび（ｂ）大きな外因性ゲノムＤＮＡを含む、大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有するＢＡＣベースのベクターに関し、ここで、ＢＡＣベースのベクターは、大きな外因性ゲノムＤＮＡを、標的細胞に送達することができる。
代表的なＢＡＣとして、ｐＢＡＣｅ３．６、ｐＢＡＣＧＫ１．１、ｐＢＡＣＧＭＲ、ｐＢＡＣ−ｒｅｄ、ｐＴＡＲＢＡＣ１、ｐＴＡＲＢＡＣ１．３、ｐＴＡＲＢＡＣ２、ｐＴＡＲＢＡＣ２．１、ｐＴＡＲＢＡＣ３、ｐＴＡＲＢＡＣ４、ｐＴＡＲＢＡＣ６等が挙げられる。
ＢＡＣライブラリー、特にヒトゲノムプロジェクトの結果としてヒトゲノムＤＮＡを含有するものは、当業者に容易に利用可能である（例えば、Ｓｉｍｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻：８３９頁、１９９７年を参照）。
ある特定の実施形態では、ＢＡＣベクターは、選択マーカーを有さない。かかるＢＡＣベクターは、かかるベクターが動物接合体へマイクロインジェクトされる本発明の方法に適している。
ある特定の実施形態では、ＢＡＣベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を保有する。かかるＢＡＣベクターは、選択が要され得るＥＳ細胞に使用され得る。適切な選択マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子（例えば、ＮｅｏＲ）、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子（例えば、ＢｓｄＲ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏＲ）等が挙げられるが、限定されない。
挿入片および隣接する相同領域のサイズを考慮すると、ＢＡＣは、好ましい大容量クローニングベクターである。しかしながら、当業者に公知の他の大容量クローニングベクターもまた、本発明で使用することができる。これらとして、例えば、コスミド（Ｅｖａｎｓら、Ｇｅｎｅ ７９巻：９〜２０頁、１９８９年）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．１９８９年）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）（Ｖｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５巻：１２５７〜１２５９頁、１９９７年）、ヒト人工染色体（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５巻：３４５〜３５４頁、１９９７年）、またはＣＭＶ、ＥＢＶもしくはバキュロウイルスベースのベクターなどのウイルスベースのベクターが挙げられる。
別の態様では、本発明は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンなどの大容量ＤＮＡクローニングベクターにおける大きな外因性ゲノムＤＮＡを、比較的より小さな容量のクローニングベクター（プラスミドなどの）に変換する改善および簡素化された方法を提供する。これは、大容量ＤＮＡクローニングベクター（例えば、ＢＡＣ）内の大きな外因性ゲノムＤＮＡを、より効率的にまたはより容易に標的細胞へ送達させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現させることが可能である。
したがって、ある特定の実施形態では、ベクターは、最大約１５ｋｂの挿入片を保有することが可能なプラスミドである。プラスミドは、宿主染色体とは無関係に、原核生物（例えば、細菌）内部で複製するための複製起点を含有し得る。プラスミドはまた、真核細胞において複製することが可能であり得る。プラスミドはまた、プラスミドを含有する細胞の選択を可能にする抗生物質耐性に関する遺伝子などの選択性マーカーを保有することができる。プラスミドは、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子をさらに保有して、プラスミドを含有する細胞クローンを標識または同定し得る。
ある特定の実施形態では、ベクターは、二重鎖ＤＮＡウイルスである改変ファージλである。野生型λ染色体は、４８．５ｋｂ長であり、λ染色体における非必須ウイルス配列を、最大約２５ｋｂの挿入片で置き換えること、ウイルス粒子および感染の形成に要されるファージ遺伝子のみを残すことによって改変され得る。挿入片ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡを用いて複製させることができ、宿主細胞の効率的な感染および宿主細胞内での増殖用にウイルス粒子へと一緒にパッケージングされ得る。
ある特定の実施形態では、ベクターは、コスミドをバクテリオファージλ粒子へとパッケージングさせることを可能にするｃｏｓ配列として公知のバクテリオファージλ ＤＮＡの小領域を含有するコスミドベクターである。コスミドは、サイズが最大４５ｋｂの挿入片を保有することが可能である。直鎖状化されたコスミドを含有する粒子は、形質導入によって宿主細胞に導入させることができる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、サイズが７０〜１００ｋｂの挿入片を保有することができるバクテリオファージＰ１ベクターである。かかるベクターは、バクテリオファージＰ１粒子へとパッケージングされる直鎖状ＤＮＡ分子として開始される。次に、これらの粒子を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌（E. coli）株などの細菌宿主に注入する。直鎖状Ｐ１ベクターは、ベクターにおける２つのｌｏｘＰ部位間での組換えによって環状化されるようになる。Ｐ１ベクターは、抗生物質耐性に関する遺伝子を含有し得る。Ｐ１ベクターは、挿入片を含有するクローンを、含有しないものと区別するための（ポジティブ）選択マーカーを含有し得る。Ｐ１ベクターは、Ｐ１プラスミドレプリコンを含有して、ベクターの唯一のコピーが細胞中に存在することを保証し得る。あるいは、Ｐ１ベクターは、誘導性プロモーターによって制御されるＰ１溶解性レプリコンを含有することができ、それは、細胞１つ当たり、ベクターの１つよりも多いコピーの増幅を可能にする。
ある特定の実施形態では、ベクターは、Ｐ１ベクターおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ）の両方の特色を有するＰ１人工染色体（ＰＡＣ）である。Ｐ１ベクターと類似して、ＰＡＣは、上述するようにプラスミドおよび溶解性レプリコンを含有する。Ｐ１ベクターと異なり、それらは、形質導入用のバクテリオファージ粒子へとパッケージングされる必要がない。代わりに、それらは、ＢＡＣのように、電気穿孔により環状ＤＮＡ分子として大腸菌に導入される。ＰＡＣは、サイズが１３０〜１５０ｋｂの挿入片を保有することができる。
ある特定の実施形態では、ベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり、それは、テロメア、セントロメアおよび複製起点を含む真正酵母染色体の必須の特色を含有する直鎖状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡの大きな挿入片は、ＹＡＣの中央へライゲーションさせることができ、その結果、挿入片の片側上にＹＡＣのアームが存在する。組換えＹＡＣは、トランスフォーメーションによって酵母に導入させることができる。ＹＡＣは、ＹＡＣ含有形質転換体の同定を可能にするための選択可能マーカーを含み得る。理論上は、ＹＡＣが保持することができる挿入片のサイズに上限は存在しない。実際には、ＹＡＣは通常、サイズが約２５０〜２０００ｋｂの挿入片、典型的には約２５０〜４００ｋｂの挿入片を保持する。
本発明はさらに、大きなゲノムＤＮＡをＢＡＣにサブクローニングすることによって、ＢＡＣベースのベクターを構築する方法に関する。サブクローニングの方法は、当該技術分野で周知である。より具体的には、ある大容量クローニングベクター由来の大きなＤＮＡ挿入片を、別の大容量クローニングベクターに移動する方法が記載されている（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７巻：１６７４〜１６８２頁、１９９９年；Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：１３１１〜１３１４頁、２０００年）。
別の態様では、本発明は、中心領域としての第１の生物由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡ、第２の生物由来のゲノムＤＮＡの近位領域、および第２の生物由来のゲノムＤＮＡの遠位領域を含む人工ゲノムＤＮＡ構築物を提供し、ここで、大きな外因性ＤＮＡは、近位領域および遠位領域によって隣接される。
ある特定の実施形態では、近位領域および遠位領域の長さはともに、相同組換えを支持するのに十分長い。
大きな外因性ゲノムＤＮＡ／中心領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂまたは３５０ｋｂである。
第１の生物由来のゲノムＤＮＡの大きな外因性ゲノムＤＮＡ／中心領域は、第２の生物における近位および遠位領域によって隣接される第２の生物の相同的なまたは相当する中心領域を置き換える。
ある特定の実施形態では、第１の生物由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡ／中心領域は、第２の生物の相当する中心領域の相同配列である。
ある特定の実施形態では、第１の生物由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡ／中心領域は、第２の生物の相当する中心領域と有意な配列相同性を共有せず、したがって、それらはともに、相同組換えの目的で近位領域および遠位領域によって隣接されるという事実により、第２の生物の相当する中心領域に相当するにすぎない。
第２の生物の相同的なまたは相当する中心領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂまたは３５０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、近位領域の長さおよび遠位領域の長さはともに、相同組換えを支持するのに十分長い。
近位領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または少なくとも約５０ｋｂである。遠位領域の例示的なサイズは、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または少なくとも約５０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、相同的なまたは相当する中心領域は、約２５〜３０ｋｂであり、好ましくは中心領域は、約２０ｋｂである。好ましくは、近位領域および遠位領域はそれぞれ、約１０ｋｂである。
ある特定の実施形態では、中心領域、相同的な中心領域、近位領域、および遠位領域のサイズは独立して、範囲から選択され、範囲の下端および上端は、中心領域に関して２０〜３００ｋｂ、相同的な中心領域に関して１５〜２５０ｋｂ、近位および遠位領域に関して５〜２５ｋｂ等などの上記で列挙した値のいずれかによって規定される。
ある特定の実施形態では、第１の生物および第２の生物は、同じ種である。第１の生物および第２の生物は、マウスまたはラットの異なる系統であり得る（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統由来の遺伝子をＦＶＢ／ＮＪマウス系統に挿入する）。
ある特定の実施形態では、第１の生物および第２の生物は、異なる種である。例えば、第１の生物はヒトであってもよく、第２の生物は、マウスまたはラットなどの齧歯類であってもよい。
ある特定の実施形態では、第１および第２の生物は独立して、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、哺乳類、非ヒト哺乳類、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの）、家畜動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの）、ペット（ネコまたはイヌなどの）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）、カエル、昆虫、または細菌から選択される。
ある特定の実施形態では、第１の生物はヒトであり、第２の生物は、マウスまたはラットである。
ある特定の実施形態では、人工ゲノムＤＮＡは、選択マーカーの使用を要し得るＥＳ細胞における相同組換えに有用である。したがって、かかる実施形態では、人工ゲノムＤＮＡは、下記特徴を有し得る：（１）中心領域は、中心領域の近位末端で第１の選択可能マーカーカセットを、および／または中心領域の遠位末端で第２の選択可能マーカーカセットを含み、ここで、（ａ）第１の選択可能マーカーカセットは、第１の部位特異的なリコンビナーゼ（例えば、Ｆｌｐ）と適合性の第１の認識部位（例えば、ＦＲＴ）の対によって隣接される第１の選択可能マーカー（例えば、ＮｅｏＲ）を含み、（ｂ）第２の選択可能マーカーカセットは、第２の部位特異的なリコンビナーゼ（例えば、φＣ３１）と適合性の第２の認識部位（例えば、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ）の対によって隣接される第２の選択可能マーカー（例えば、ＢｓｄＲ）を含み、（２）中心領域は、第３の部位特異的なリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）と適合性の第３の認識部位（例えば、ｌｏｘＰ）の対によって隣接される検出可能領域（例えば、セグメントＧＨおよびＫＬ）を含む。
第１、第２および／または第３の部位特異的なリコンビナーゼとして使用され得るのに適した部位特異的なリコンビナーゼとして、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ２およびＢ３などのＴｙｒリコンビナーゼ；λ、ＨＫ０２２およびＨＰ１などのＴｙｒインテグラーゼ；γδ、ＰａｒＡ、Ｔｎ３およびＧｉｎなどのＳｅｒリゾルバーゼ／インベルターゼ；ならびにφ３１、Ｂｘｂ１およびＲ４などのＳｅｒインテグラーゼが挙げられる。
ある特定の実施形態では、検出可能領域は、第１の選択可能マーカーカセットに隣接しており、かつ遠位であり、第３の認識部位の対の１つは、第１の選択可能マーカーカセットの近位末端にある。
ある特定の実施形態では、第１の選択可能マーカーは、ＦＲＴによって隣接されるＮｅｏＲである。ある特定の実施形態では、第２の選択可能マーカーは、ａｔｔＢ／ａｔｔＰによって隣接されるＢｓｄＲまたはＰｕｒｏＲである。ある特定の実施形態では、第３の認識部位の対は、ｌｏｘＰである。
本発明の関連態様は、接合体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９生成二重鎖切断（ＤＳＢ）相同組換え（ＨＲ）媒介性ノックインに適合性のベクターであって、本明細書中に記載するゲノムＤＮＡのいずれかを含むベクターを提供するが、但し、任意選択的に、第１の選択可能マーカーおよび／または第２の選択可能マーカーは、存在する場合、それぞれ、第１および第２の部位特異的なリコンビナーゼによって除去される。
本発明の別の関連態様は、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えに適合性のベクターを提供し、ベクターは、本明細書中に記載する人工ゲノムＤＮＡのいずれかを含み得る。
本発明により、相同組換えは、エンドヌクレアーゼによって創出される二重鎖切断（ＤＳＢ）によって促進される。ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および１つまたは複数の単一ガイドＲＮＡ（略して「ｓｇＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」）を含む。ある特定の実施形態では、酵素は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするベクターまたはコード配列、および１つまたは複数のｓｇＲＮＡを導入することによって導入することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするベクターまたはコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、単離Ｃａｓ９タンパク質は、細胞に直接的に（例えば、接合体またはＥＳ細胞、マイクロインジェクションまたは電気穿孔により）導入することができる。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体であるＣａｓ９リボタンパク質の形態で存在し得る。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質および１つまたは複数のｇＲＮＡが、接合体またはＥＳ細胞に同時導入されて、細胞内部でｉｎ ｓｉｔｕでＣａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の形成を可能にするように、Ｃａｓ９タンパク質は、いかなるｇＲＮＡを伴わない場合がある。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、野生型Ｃａｓ９を含む。本出願の目的で、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）で見出される野生型（ｗｔ）Ｃａｓ９に限定されない。国際公開第２０１３／１７６７７２号（参照により組み込まれる）の図３および配列番号８に表されるようなＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列（化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）の）のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３、国際公開第２０１３／１７６７７２号（参照により組み込まれる）の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６のアミノ酸配列のいずれか１つにおける相当する部分、ならびに化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、髄膜炎菌（N. meningitidis）、高度好熱菌（S. thermophilus）およびＴ．デンティコラ由来のオーソゴナルＣａｓ９配列のアミノ酸配列のいずれか１つにおける相当する部分（T. denticola）（Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１１）：１１１６〜１１２１頁、２０１３年を参照、参照により組み込まれる）を網羅すると意図される。
本発明で使用することができる他の適したエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、もしくはメガヌクレアーゼ（操作されたメガヌクレアーゼ、再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼなどの）、またはそれらの組合せを含む、特異的な部位でゲノムを切断するエンドヌクレアーゼであり得る。例えば、近位領域の接合部および相同的な中心領域に近いＤＳＢは、ＺＦＮによって創出することができ、遠位領域の接合部および相同的な中心領域に近いＤＳＢは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって創出することができる。
好ましくは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／ｃｐｆ１、またはメガヌクレアーゼの切断および／または認識部位は、近位領域の接合部および相同的な中心領域から、または遠位領域の接合部および相同的な中心領域から短距離内に存在する。例えば、短距離は、接合部のいずれかの２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、８０ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐまたは５ｂｐ内に存在し得る。ある特定の実施形態では、切断および／または認識部位は、欠失されるべき相同的な中心領域内に存在する。
本発明の方法における使用のためのエンドヌクレアーゼとして機能するために、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡと機能性複合体を形成しなくてはならない。
本発明の好ましい実施形態によれば、４つの特異的なｇＲＮＡ（即ち、２つの対）が、本発明の方法で使用され、各々が、大きな外因性ゲノムＤＮＡによって置き換えられるべき内因性ゲノムＤＮＡ周囲の特異的なＣａｓ９切断部位を標的とする。即ち、２つのガイドＲＮＡ（即ち、１つの対）は、欠失されるべき内因性ゲノムＤＮＡ配列の近位末端を標的とし、２つのガイドＲＮＡ（即ち、１つの対）は、欠失されるべき内因性ゲノムＤＮＡ配列の遠位末端を標的とする。
いかなる特定の理論により拘束されることを望まないが、４つの特異的なガイドＲＮＡのかかる冗長性は、大きな外因性ゲノムＤＮＡの挿入に好適である。真実味のある説明の１つは、ガイドＲＮＡの２つの対の複合活性が、より効率的な二重鎖切断（ＤＳＢ）創出またはより耐久性のあるＤＳＢ持続性をもたらすことである。より効率的な二重鎖切断（ＤＳＢ）創出、もしくはより耐久性のあるＤＳＢ持続性のいずれか、または両方が、相同組換えによる大きな外因性ゲノムＤＮＡの挿入を改善する。
したがって、本発明の例示的な実施形態では、（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を誘導して、内因性ゲノムＤＮＡの近位末端で、またはその付近で第１の二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出するｓｇＲＮＡの第１の対（即ち、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡ）、および（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を誘導して、内因性ゲノムＤＮＡの遠位末端で、またはその付近で第２の二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出するｓｇＲＮＡの第２の対（即ち、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡ）を含むｇＲＮＡの２つの対が提供される。
しかしながら、他の実施形態では、ｇＲＮＡの第１の対の一方のみ、例えば、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を誘導し、内因性ゲノムＤＮＡの近位末端で、またはその付近で第１の二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出する。
関連実施形態では、ｇＲＮＡの第２の対の一方のみ、例えば、第３のｇＲＮＡまたは第４のｇＲＮＡを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を誘導し、内因性ゲノムＤＮＡの遠位末端で、またはその付近で第２の二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出する。
即ち、ある特定の実施形態では、１つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの近位末端で、またはその付近で第１のＤＳＢを創出する一方で、２つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの遠位末端で、またはその付近で第２のＤＳＢを創出する。ある特定の他の実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの近位末端で、またはその付近で第１のＤＳＢを創出する一方で、１つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの遠位末端で、またはその付近で第２のＤＳＢを創出する。さらに他の実施形態では、１つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの近位末端で、またはその付近で第１のＤＳＢを創出する一方で、１つのｇＲＮＡを使用して、内因性ゲノムＤＮＡの遠位末端で、またはその付近で第２のＤＳＢを創出する。
好ましくは、ＤＳＢを創出するのに使用するｇＲＮＡの数とは無関係に、ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡの各々は独立して、近位接合部または遠位接合部に対するそれらの近接に基づいて選択される。即ち、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡはともに、近位接合部に対するそれらの近接に基づいて選択することができ、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡはともに、遠位接合部に対するそれらの近接に基づいて選択される。結果として、Ｃａｓ９／第１のｇＲＮＡおよびＣａｓ９／第２のｇＲＮＡによって生成される第１のＤＳＢは、近位接合部に最も近く、Ｃａｓ９／第３のｇＲＮＡ／第４のｇＲＮＡによって生成される第２のＤＳＢは、遠位接合部に最も近い。
ＤＳＢを創出するのに使用するｇＲＮＡの数とは無関係に、ある特定の他の実施形態では、ｇＲＮＡは独立して、近位または遠位接合部に対するそれらの近接に基づいて選択されず、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ．で利用可能な標準的なアルゴリズムなどのｇＲＮＡ設計アルゴリズムによって発生されるスコアによって測定される場合のそれらの予想品質に基づいて選択される。
ｇＲＮＡの選択および設計は、標的ゲノムおよび配列型などのユーザー入力に基づいて、周知の原理またはオンラインツールを使用して実施することができる。概して、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な「スカフォールド」配列およびターゲティング配列によって結合または改変されるようにゲノム標的を規定するユーザー定義のおよそ２０個のヌクレオチドの「スペーサー」または「ターゲティング」配列で構成される短い合成ＲＮＡである。簡素化すると、「ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９切断部位を標的する」は、ｇＲＮＡのスペーサーまたはターゲティング配列が、ゲノム標的配列に結合して、切断部位でそれを切断するように設計されるという事実を指す。
好ましくは、ターゲティング配列は、理論的に特有の（ゲノムの残部と比較して）ゲノム標的配列にそれが結合するのに十分特有である。標的は、プロトスペーサー隣接モチーフ（または「ＰＡＭ」配列）のすぐ上流（または５’）に存在すべきである。ＰＡＭ配列は、標的結合に絶対的に必要であり、正確な配列は、Ｃａｓ９の種に依存する。最も広く使用される化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９において、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＣ−３’である（「Ｎ」は、４つの鎖のヌクレオチドのいずれかを表す）。種々の種におけるさらなるＣａｓ９に関する他のＰＡＭ配列が、当該技術分野で公知である。以下に列挙する例示的なＰＡＭ配列を参照されたい。
Ｃａｓ９の種／変異体 ＰＡＭ配列
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（ＳＰ）；ＳＰＣａｓ９ ＮＧＧ
ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅ変異体 ＮＧＧ（ＮＡＧ結合の低減）
ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体 ＮＧＣＧ
ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ変異体 ＮＧＡＧ
ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体 ＮＧＡＮまたはＮＧＮＧ
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＳＡ）；ＳａＣａｓ９ ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ）
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（ＮＭ） ＮＮＮＮＧＡＴＴ
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（ＳＴ） ＮＮＡＧＡＡＷ
トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola） ＮＡＡＡＡＣ
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭを有する任意の標的ゲノム配列と結合するが、ｇＲＮＡスペーサーと標的ゲノム配列との間に、十分な相同性が存在する場合、Ｃａｓ９のみが、標的ゲノム配列を切断する。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の最終結果は、ＰＡＭ配列の約３〜４個のヌクレオチドの上流である切断部位での標的ゲノム配列内での二重鎖切断（ＤＳＢ）である。
ある特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する。
ある特定の実施形態では、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する。
ある特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの同じ鎖に結合する。
ある特定の実施形態では、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡは、内因性ゲノムＤＮＡの同じ鎖に結合する。
ある特定の実施形態では、任意の選択ｇＲＮＡの切断部位は、近位接合部（第１および第２のｇＲＮＡに関して）または遠位接合部（第３および第４のｇＲＮＡに関して）から約２５０ｂｐ以内にある。好ましくは、切断部位は、第１および第２のｇＲＮＡに関して近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内に、または第３および第４のｇＲＮＡに関して遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある。
送達されるべき大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有するＢＡＣベクターの、標的細胞への導入は、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質またはコード配列、および１つまたは複数のｓｇＲＮＡを保有するベクターは、マイクロインジェクションまたは電気穿孔により接合体に導入される。
ある特定の実施形態では、大きな外因性ゲノムＤＮＡ上の外来遺伝子は、トランスフェクションまたは電気穿孔によってＥＳ細胞に送達させることができ、続いて選択マーカーを使用した選択を行う。
マイクロインジェクションは、外来物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）をある特定の細胞（接合体などの）または初期段階の胚に導入するのに使用される周知の技法である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはコード配列および１つまたは複数のｓｇＲＮＡと一緒に大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有する十分量のＢＡＣベクターは、接合体にマイクロインジェクトされる。
ＢＡＣベクターおよび大きな外因性ＤＮＡを含有する注入溶液の粘度は、首尾よい相同組換えが進行するのに必須であることがわかっている。注入溶液の粘度は、大きな外因性ＤＮＡを含有するドナーＢＡＣベクターの量に関する。好ましくは、マイクロインジェクションは、約１〜１０ｎｇ／μＬ、より好ましくは２〜８ｎｇ／μＬ、最も好ましくは約５ｎｇ／μＬの大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣの最適粘度を使用して実施される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分（Ｃａｓ９コード配列およびｇＲＮＡ）およびドナーＤＮＡ（大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有するＢＡＣ）の電気穿孔は、国際公開第２０１６／０５４０３２号（参照により組み込まれる）に記載する方法に従って実行され得る。
ある特定の実施形態では、本方法は、ＥＳ細胞または接合体を偽妊娠雌に移入するステップをさらに含む。
マウスにおいて、偽妊娠雌は、自然発情期の６〜８週齢の雌マウスを、精管切除した雄と交配させることによって準備する。
偽妊娠雌への同日移入用に加工処理した接合体を、培養液から取り出して、予め加温し、た適した培地（Ｍ２培地などの）に配置させて、卵管を介して性交の０．５日後の偽妊娠雌（９〜１１週齢）に移入させることができる。
本発明の方法を使用して、大きな外因性ゲノムＤＮＡがひとたび宿主哺乳類に挿入されると、正確なゲノム挿入を、得られたトランスジェニック動物（例えば、マウス）またはその子孫において検証することができる。
かかる検証は通常、導入遺伝子を潜在的に保有する動物の遺伝子型同定、接合部配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅、ある特定の一続きのゲノムＤＮＡ（導入遺伝子が宿主ゲノムに挿入されるＤＮＡ接合部配列などの）の直接的な配列決定、および宿主ゲノムにおける公知の遺伝子マーカーに関する挿入位置を決定するための遺伝子マッピングの１つまたは複数を含む。かかる技法は、当該技術分野で周知である。
本発明は、下記実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、本発明の理解を助長するために提供され、それらの限定と解釈されるべきではない。
実施例１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同組換えによる２５キロ塩基対のＢＡＣ由来のゲノムＤＮＡのノックイン
この実施例は、１０個〜１００個程度のキロ塩基対（ｋｂ）を有するヒトゲノムＤＮＡセグメント由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡを使用して、マウスゲノムの特異的な領域をヒト化する際における本明細書中に記載する本発明の使用について記載する。より具体的には、この実施例は、マウス腫瘍抑制因子遺伝子Ｂｃｌ２ｌ１１のおよそ１７キロ塩基対（ｋｂ）セグメントの、相当するヒト遺伝子ＢＣＬ２Ｌ１１のオーソロガスな疾患関連の２５ｋｂセグメントによるＣＲＩＳＰＲ駆動置換（例えば、ヒト化）を提供する。
ａ）ヒト由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡ
ＢＡＣ ＤＮＡは、目的の遺伝子、例えば、この場合はヒトＢＣＬ２Ｌ１１（ヒト：ライブラリーＲＰ１１、クローン６９５−Ｂ−２３）を含有するＢＡＣクローンから精製した。続いて、精製ＤＮＡを、組換え誘導（recombinogenic）大腸菌（E. coli）株であるＳＷ１０２に電気穿孔した。図１のヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子を含有するヒトＢＡＣを示す最上部から３番目のラインを参照されたい。
ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用したターゲティングベクターの調製
ＢＡＣ ＤＮＡを、標的ゲノム遺伝子座、例えば、この場合は相当するマウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子（マウス：ライブラリーＲＰ２３、クローン３３１−Ｋ−２２）を含有するＢＡＣクローンから精製した。続いて、精製ＤＮＡを、組換え誘導大腸菌（E. coli）株であるＳＷ１０２に電気穿孔した。
マウスおよびヒトＢＡＣ由来のセグメントを、以下の表１に記載するオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。
次に、マウスおよびヒトＢＡＣ由来の増幅したゲノムＤＮＡセグメントを、オリゴヌクレオチドに組み込まれた部位で制限消化して（表１を参照）、ゲル精製して、下記のように小さなプラスミドベクターへと構築した：
セグメントＫＬおよびＭＮを、ＰＬ４５２のネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）含有ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片と一緒に、Ｒ６Ｋγ複製起点を含有するように改変されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。このプラスミドをｐＴＬＤ０１と称する。
セグメントＣＤ、ＥＦ、ＧＨおよびＩＪを、ＰＬ４５１のネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）含有ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片と一緒に、Ｒ６Ｋγ複製起点を含有するように改変したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。このプラスミドをｐＴＬＤ０２と称する。
セグメントＯＰ、ＱＲおよびＳＴを、ｐＴＬＤ０８（ａｔｔＢ、ａｔｔＰおよびＢｓｄＲを保有するＰＬ４５２誘導体）のブラストサイジン耐性遺伝子（ＢｓｄＲ）含有ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片と一緒に、Ｒ６Ｋγ複製起点を含有するように改変したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。このプラスミドをｐＴＬＤ０３と称する。
より大きな挿入片ゲノムＤＮＡに関して、ＢＡＣは、本明細書中に記載する方法に直接使用することができる。しかしながら、この場合、ＢＡＣベクターの完全容量が必要とされなかったため、本発明者らは、代替的なベクター（即ち、ｐＢＲ３２２）バックボーンを有するベクターの低減サイズ（２２５ｋｂｐから７０ｋｂｐへ）型を使用した。
具体的には、構築物のサイズを低減するために、セグメントＡＢおよびＹＺを、ネガティブ選択可能チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子と一緒に、ｐＢＲ３２２ベースのベクターにクローニングした。このプラスミドをｐＴＬＤ１１と称する。
続いて、ｐＴＬＤ１１ベクターを、下記ステップに従って使用した。
まず、ｐＴＬＤ０１プラスミドを、標準的な組換え（recombineering）アプローチを用いて使用して、ヒトＢＣＬ２Ｌ１１含有ＢＡＣにおいて２，９０３ｂｐ欠失領域にまさに遠位に、ｌｏｘＰ隣接ネオマイシン耐性カセット（ＮｅＯＲ）を配置させた。改変ヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子を含有するＢＡＣを、Ｃｒｅ発現大腸菌（E. coli）株であるＳＷ１０６に移入した後、細胞をアラビノースに曝露させることによってＮｅｏカセットを除去して、単一のｌｏｘＰ部位を残存させた。ヒトＫＬおよびＭＮ相同性アームを使用した相同組換えスキームを示す図１の最上部から３番目のライン、およびｐＴＬＤ０１プラスミドの構造を参照されたい。同様に、残存する単一のｌｏｘＰ部位を示す図１の最後から２番目のラインも参照されたい。
次に、プラスミドｐＴＬＤ０２を、標準的な組換え技法を用いて使用して、マウスＢｃｌ２ｌ１１含有ＢＡＣにおいてマウスエクソン２にまさに遠位に、ヒトＤＮＡのＥＦセグメント、ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ隣接Ｎｅｏカセット、およびヒトＤＮＡのＧＨセグメントを配置させた。マウスＣＤおよびＩＪ相同性アームを使用した相同組換えスキームを示す図１の４番目のラインの左側、およびｐＴＬＤ０２プラスミドの構造を参照されたい。
次に、プラスミドｐＴＬＤ０３を、標準的な組換え技法を用いて使用して、上述するｐＴＬＤ０２改変マウスＢｃｌ２ｌ１１ゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣにおいてマウスエクソン４にわずかに遠位に、ヒトＤＮＡのＱＲセグメントおよびａｔｔＢ／ａｔｔＰ隣接ブラストサイジン耐性（ＢｓｄＲ）カセットを配置させた。マウスＱＲおよびＳＴ相同性アームを使用した相同組換えスキームを示す図１の４番目のラインの右側、およびｐＴＬＤ０３プラスミドの構造を参照されたい。
次に、プラスミドｐＴＬＤ１１を、ＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状化して、標準的な組換え手順を用いて使用して、上述するｐＴＬＤ０２／ｐＴＬＤ０３改変マウスＢｃｌ２ｌ１１ゲノムＤＮＡを含有するＢＡＣから、マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子のＡＢ〜ＹＺ（ＡＺ）セグメントを回収し、ｐＴＬＤ１４となった。マウスＡＢおよびＹＺ相同性アームを使用した相同組換えスキームを示す図１の４番目および６番目のライン（即ち、ｐＴＬＤ１１プラスミドの構造）を参照されたい。
得られたベクターであるｐＴＬＤ１４（図１の６番目のラインを参照）は、完全マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子、ならびにｐＴＬＤ０２挿入断片（即ち、ヒトＤＮＡのＥＦセグメント、ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ隣接Ｎｅｏカセット、およびヒトＤＮＡのＧＨセグメント）、およびｐＴＬＤ０３挿入断片（ヒトＤＮＡのＱＲセグメント、およびａｔｔＢ／ａｔｔＰ隣接ブラストサイジン耐性（ＢｓｄＲ）カセット）を含有する。
ｃ）大きな外因性ゲノムＤＮＡの、ターゲティングベクターへの挿入
ヒト化ドナーベクターの構築を開始するために、プラスミドｐＴＬＤ１４を精製して、ＡｓｃＩで消化して、その２つの主要な断片を、アガロースゲル電気泳動で分離させた。ＡｃＩ切断部位ならびにマウスＩＬおよびＯＰゲノムＤＮＡによって規定される２つの直鎖状断片の小さい方を廃棄した。
２つの直鎖状断片の大きい方をゲル精製して、上述するｌｏｘＰ改変ヒトＢＡＣクローンを含有する組換え誘導大腸菌（E. coli）細胞に電気穿孔して、隣接するマウス相同性アーム間で２７，２８２ｂｐヒトセグメントを捕捉し、プラスミドｐＴＬＤとなった（図１のライン３およびライン４を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの接合体マイクロインジェクションの目的で、最終的なＮｅｏＲ／ＢｓｄＲ含有ベクター（プラスミドｐＴＬＤ１５）を、まずＮｅｏＲを除去する（プラスミドｐＴＬＤ６６を作製する）ためにＦＬＰ発現大腸菌（E. coli）株ＳＷ１０５に、次にＢｓｄＲを除去するためにΦＣ３１リコンビナーゼ発現大腸菌（E. coli）株（ＳＷ１０５誘導体）に電気穿孔した。最終的なベクターをｐＴＬＤ６７と称し、それは、２つのマウス相同性アームによって隣接される２７ｋｂ外因性ヒトゲノムＤＮＡを含有する。図１における最後の２つのラインを参照されたい。
得られたターゲティングベクター（ｐＴＬＤ６７）／ドナー分子は、それぞれ、マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子の近位および遠位領域で構成される１２，７７３ｂｐおよび２６，６３２ｂｐ相同性アームによって隣接されるヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子の２７，２８２ｂｐ中心セグメントを含有した。
得られたターゲティングベクター（ｐＴＬＤ６７）／ドナー分子において、少なくとも３つの特色が存在する：１）相同ヒト遺伝子ＢＬＣ２Ｌ１１由来の大きな外因性ゲノムＤＮＡによって置き換えられた／ヒト化されたマウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子の１８ｋｂ中心セグメント、２）選択可能マーカーは、最初にヒト化セグメントのすぐ５’および３’に配置されたが、かかる選択可能マーカーは、本発明者らのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの実験用の最終的なｐＴＬＤ６７ベクターにおいて除去されたこと（対比して、かかる選択マーカーは、ＥＳ細胞ベースの伝統的なアプローチに関しては保持された、以下の比較例を参照）、および３）東アジアの人口の１２％で観察される疾患関連欠失をモデル化するために、ヒト化イントロンの１つ内の２，９０３ｂｐ領域が、ｌｏｘＰ部位で隣接されたこと。
しかしながら、一般的なアプローチとして、第１の特色は、内因性ゲノムＤＮＡを、配列相同性を共有する外因性ゲノムＤＮＡで置き換えることに限定されない。それと同時に、第３の特色は、一般的に必要とされず、ある特定の特異的な使用に有用であり得る。
ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の調製
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）全てが、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ．で利用可能なアルゴリズムなどの標準的なアプローチを使用して設計された。表２に示すこれらのｓｇＲＮＡは、２つの概念に沿って設計した。
最初に、２５０ｂｐ領域内の２つの最も高いスコアリングｓｇＲＮＡ（各配向性で１つ）を、置き換えられるマウスＢｃｌ２ｌ１１セグメントの１７ｋｂｐセグメントの５’および３’末端の両方から選択した。第２に、置き換えられるセグメントの各末端に最も近い２つの内部ｓｇＲＮＡ（各配向性で１つ）を、それらの全体的なスコアにかかわらず選択した。ガイドは、Ｂｒｉｎｅｒらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ．５６巻（２）：３３３〜３３９頁、２０１４年、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５３７３５４０、参照により本明細書に組み込まれる）に従って産生された。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９ ｍＲＮＡ、５−メチルシチジン、プソイドウリジン）は、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。
全体として、最大設計スコアを有する２つ（各配向性で１つ）および最外末端に最も近くに位置する２つ（各配向性で１つ）を含む４つのガイドＲＮＡが、置き換えられるべきマウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子セグメントの各末端で設計された。
ｅ）Ｃａｓ９コード配列
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（株ＳＦ３７０）由来のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９ ｍＲＮＡ／５−メチルシチジン／プソイドウリジン（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／５ＭｅＣ／Ψ）は、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から入手して、約１００ｎｇ／μＬの最終濃度で、本発明者らのマイクロインジェクション混合物において使用した。
ｆ）ターゲティングベクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９コード配列のマイクロインジェクション
電気穿孔などの他の手段も使用され得るが、本発明者らは、大きな外因性ヒトゲノムＤＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｇＲＮＡを含有するターゲティングベクターを、マウス接合体に導入するのにマイクロインジェクションを使用した。
マイクロインジェクション用のマウス接合体を調製するために、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊドナー雌マウス（３週齢）を過排卵させて、胚の収量を最大限にした。各ドナー雌に、妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（Ｐｒｏｓｐｅｃｔ ＨＯＲ−２７２）の５国際単位（ＩＵ）を腹腔内に（ＩＰ）、続いて４７時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｐｒｏｓｐｅｃｔ ＨＯＲ−２７２）の５ＩＵ（ＩＰ）を付与した。ｈＣＧの投与の直後に、雌を、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ繁殖用雄と１：１で交配させて、２２時間後に、交尾プラグの存在に関して調べた。交尾プラグを示す雌を安楽死させて、卵管を切除して、Ｍ２培地中に配置した。
腹卵収集前に、卵管を、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｈ３５０６）（０．３ｍｇ／ｍＬ）を含有するＭ２培地中に配置させた。卵母細胞腹卵は、膨大部を機械的に溶解させることによって取り出され、卵丘塊が、卵母細胞／予定接合体を露出させるのに十分に破壊されるまで、ヒアルロニダーゼを含有するＭ２培地中で、腹卵をインキュベートさせた。卵母細胞／予定接合体を、新鮮なＭ２の数回の洗浄により移入させ、続いて（視覚的な段階分けのプロセスにより）個々の同定接合体を分離して、ＣＯＯＫ ＭＩＮＣベンチトップインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２／５％Ｏ２／窒素）において２４時間、鉱油（Ｓｉｇｍａ Ｍ８４１０）下で平衡化したＫ−ＲＣＶＬ（ＣＯＯＫ Ｋ−ＲＶＣＬ）培地の微小滴に移入させた。
マイクロインジェクション混合物を表３に示すように調製した。およそ８０個のＣ５７ＢＬ／６ＮＪ接合体にマイクロインジェクトした（上述の各マイクロインジェクション混合物を用いて１〜２回の技術的反復で）。マイクロインジェクション混合物は、４つのガイド（置き換えられるべきマウスＢｃｌ２ｌ１１セグメント内の最高のスコアを有するもの、または最も末端の位置を有するもののいずれか）および様々な濃度のドナーＤＮＡ（１、５または１０μｇ／μＬ）を含有した。
具体的には、接合体を培養液から取り出して、新鮮なＭ２培地１５０μＬを含有するスライド上に配置させた。マイクロインジェクションは、Ｎａｒａｓｈｉｇｅ ＩＭ−５Ａインジェクターと併せてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＮＫ２マイクロマニピュレーターを使用してＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１上で行った。標準的な接合体マイクロインジェクション手順は、材料を対象接合体の前核および細胞質の両方へ堆積させるように特別に配慮して行われた。マイクロインジェクション用の針は、ＷＰＩ ＴＷ１００Ｆ−４キャピラリーガラスおよびＳｕｔｔｅｒ Ｐ９７水平プラーを使用して、毎日新たに引いた（pulled）。注入した接合体を、スライドから取り出して、平衡化したＫ−ＲＣＶＬの３０μＬ液滴３回によりすすいだ後、平衡化したＫ−ＲＣＶＬの別個の３０μＬ微小滴へ配置させ、そこで、続いてそれらを、注入当日の胚移入（卵管を介した）用に加工処理した。
ｇ）動物飼育
マウスは全て、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、ＭＥ）から入手し、白松の削りくずの寝床上に収容して、適宜、ＮＩＨ−３１ ５Ｋ５２（脂肪６％）食餌および酸性水（ｐＨ２．５〜３．０）を給餌した。実験は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認とともに、またｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（第８版）および全ての適用法令を遵守して実施した。
ｈ）偽妊娠雌の調製
偽妊娠雌は、自然発情期の６〜８週齢の雌マウスを、精管切除した雄と交配させることによって準備した。
偽妊娠雌への同日移入用に加工処理した接合体を、培養液から取り出して、外科ステーションへの輸送用の予め加温したＭ２培地９００μＬを含有する１．８ｍＬのスクリュートップチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３６３４０１）に配置させた。接合体を、チューブから取り出して、培養液（油−ＣＯＯＫ ＭＩＮＣベンチトップインキュベーター３７℃、５％ＣＯ２／５％Ｏ２／窒素下のＫ−ＲＣＶＬ）へと配置させた。移入の時点で、接合体を培養液から取り出して、予め加温したＭ２培地に配置し、卵管を介して性交の０．５日後の偽妊娠ＣＢＹＢ６Ｆ１／Ｊ雌（９〜１１週齢）に移入させた。
妊娠を予定日へと進ませて、仔を自然分娩させた。
ｉ）マイクロインジェクトした接合体の、偽妊娠雌への移植
上記のマイクロインジェクトしたマウス接合体を、標準的な技法によって偽妊娠雌へ移入させ、予定日まで進ませて、そこで、４週齢で離乳するまで、それらを雌親が育てた。
ｊ）正確なゲノム挿入の検証−遺伝子型同定
１細胞性接合体のマイクロインジェクション（ＣＲＩＳＰＲアプローチ）から生じる潜在的にキメラのマウスおよびそれらの子孫を、表４に記載するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、設計したＣａｓ９結合部位で遺伝子型同定した。図２に示すように、これらのプライマーは、１）無傷の（または小ＩＮＤＥＬ含有）マウス対立遺伝子のＣａｓ９結合部位、２）ヒト化対立遺伝子（またはランダムに組み込まれる導入遺伝子）のマウス／ヒト接合部、および３）任意の欠失保有対立遺伝子の分断点にわたってＤＮＡを増幅するように設計された別個のＰＣＲ反応で、対で使用された。
ｋ）正確なゲノム挿入の検証−Ｓａｎｇｅｒ配列決定
特異的な対立遺伝子のより詳細な分析のために、遺伝子型同定反応からのＰＣＲ産物を精製して、Ｓａｎｇｅｒによって開発された方法に従って、ＪＡＸ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって配列決定した。ＰＣＲ産物を、ＨｉｇｈＰｒｅｐ ＰＣＲ磁気ビーズ（ＭａｇＢｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ゲイザースバーク、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して精製した。サイクル配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクル配列決定キット バーション３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。
配列決定反応は、精製ＰＣＲ産物（３〜２０ｎｇ）５μＬおよび５ｐｍｏｌ／μＬの濃度のプライマー１μＬを含有した。配列決定反応産物は、ＨｉｇｈＰｒｅｐ ＤＴＲ（ＭａｇＢｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ゲイザースバーク、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して精製した。精製した反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行した。
配列データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析ソフトウェア バージョン５．０．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。得られた配列（．ａｂｉ）ファイルを、さらなる分析用にＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ バージョン５．０．１（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アナーバー、ＭＩ、ＵＳＡ）に取り込ませた。
ｌ）正確な挿入遺伝子座の検証−遺伝子マッピング
ＢＣＬ２Ｌ１１のヒトセグメントが、実際にオーソロガスなＢｃｌ２ｌ１１遺伝子座においてそのマウス対応物を置き換えたかどうかを示すために、本発明者らは、遺伝子マッピングを使用して、ＢＣＬ２Ｌ１１／Ｂｃｌ２ｌ１１遺伝子のヒト化セグメントを位置決めした（図３Ａおよび図３Ｂ）。
２つの戻し交配を、下記アプローチを使用して樹立させた。まず、ＦＶＢ／ＮＪ雌に、ヒト化セグメントを保有するＣ５７ＢＬ／６ＮＪ雄を交配させて、Ｆ１ハイブリッド（ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ）子孫を得た。次に、これらの子孫を、ヒト化セグメントの存在に関して遺伝子同定した。ヒト配列を保有する雄（ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１）を、ＦＶＢ／ＮＪ雌またはＣ５７ＢＬ／６ＮＪ雌のいずれかに戻し交配させて、Ｎ２子孫を生成した。
これらの戻し交配スキームは下記のようにアノテートすることができる：
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１
ＦＶＢ／ＮＪ×ＦＶＢＢ６ＮＦ１／Ｊ−ＢＣＬ２Ｌ１１
各戻し交配由来のＮ２子孫（適切な対照と一緒に）を、マウスゲノムにわたってほぼ等しく分配されるおよそ１５０個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーの組にわたってＫＡＳＰ化学（ＬＧＣ Ｌｉｍｉｔｅｄ、テディントン、ＵＫ）を使用して遺伝子型同定した。組における各マーカーと、ヒト化セグメントの間での合致（concordance）は、カイ二乗（χ２）分析によって算出した。
結果
１）首尾よい遺伝子ターゲティング
満期時に、総計９４匹の仔が産まれ、６匹が死産であり、６匹が、４週齢まで生存しなかった。８２匹のマウスを離乳させて、表４に示すように実験間で分配した。
表３に示す実験３（最も高いスコアリングガイド、５ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ）および実験５（末端に最も近いガイド、１０ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ）はともに、離乳期に残存する生存可能な仔を生じなかった。これらの結果にもかかわらず、実験７（実験５の濃度に等しいドナーＤＮＡ濃度を用いて実施、即ち、１０ｎｇ／μＬ、表３を参照）および実験８（実験３の反復、表３）は、それぞれ、７匹および２１匹の仔をもたらし、実験３および実験５における仔の欠如は、実験設計にとって体系的に欠点となる何かではなく、技術的な失敗に起因することを示唆した。
これらの８２匹の子孫を遺伝子型同定するために、近位および遠位のマウス／ヒト接合部の各々に及ぶように、および置き換えられるべき１７ｋｂｐマウス領域に及ぶように、ＰＣＲアッセイを設計した。これらの実験の結果を表５に示す。上述するように、近位および遠位のマウス／ヒト接合部の各々に及ぶように設計したＰＣＲアッセイは、両方に関して陽性である３つの樹立体（founders）を同定した（実験２、末端に最も近いガイド、１ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ；実験６、末端に最も近いガイド、５ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ；および実験７、最も高いスコアリングガイド、１０ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ、表３を参照）。置き換えられるべき１７ｋｂｐマウス領域に及ぶように設計したＰＣＲアッセイは、上述する３つの樹立体のうちの２つを同定した（実験６、末端に最も近いガイド、５ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ；および実験７、最も高いスコアリングガイド、１０ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ、表３）。
２）首尾よい生殖細胞系列伝達
これらの遺伝子変化の遺伝をさらに探究するために。本発明者らは、実験２、実験６および実験７由来のヒト挿入／欠失陽性Ｐ０を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに交配させて、それらの子孫を遺伝子型同定した。これらの分析の結果を表５に示す。
示したように、実験２（末端に最も近いガイド、１ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ）由来のヒト挿入陽性Ｐ０マウス（雄）は、そのＮ１子孫の２９匹のいずれにも、ヒト化対立遺伝子を伝達することができず、Ｐ０マウスが、主に未改変野生型細胞で構成される生殖系列を用いた場合にモザイク現象を起こしていることを示唆した。
対比して、実験７（最も高いスコアリングガイド、１０ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ）由来のヒト挿入および欠失陽性Ｐ０マウス（雄）は、その２１匹のＮ１子孫のうちの４匹に、その欠失保有対立遺伝子を伝達した。しかしながら、このＰ０マウスは、再度これらの２１匹のマウスのいずれにもヒト挿入保有対立遺伝子を伝達せず、このことは、そのＰ０マウスが、比較的少ないヒト挿入保有細胞で構成される生殖系列を用いた場合にモザイク現象を起こしていることを示唆した。
興味深いことに、実験６（末端に最も近いガイド、５ｎｇ／μＬ ドナーＤＮＡ）由来のヒト挿入および欠失陽性Ｐ０マウス（雌）は、その１３匹のＮ１子孫の全てに、ヒト挿入保有対立遺伝子または欠失保有対立遺伝子のいずれかを伝達したが、両方には伝達せず、この動物が、Ｂｃｌ２ｌ１１遺伝子座でヒト挿入および欠失保有遺伝子座の両方の遺伝子型を有する真のヘテロ接合体として繁殖していることを含蓄する。
３匹の選り抜きＮ１マウス（２匹がヒト挿入を保有し、１匹が欠失を保有する）の続く繁殖は、メンデル予想と一致した結果をもたらした。雄を、Ｂ６Ｎ．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｓｏｘ−２Ｃｒｅ）１ Ａｍｃ／Ｊ雌マウスと交配させることにより、設計通りにｌｏｘＰ隣接２．９ｋｂｐヒトイントロンセグメントが欠失された子孫を生じた。
３）ドナーＤＮＡ（ターゲティングベクターにおける外因性ＤＮＡ）の濃度およびガイドＲＮＡ位置が、効率に影響を及ぼす
ドナーＤＮＡがＰ０マウスにおいて検出された実験（表３の実験２、実験６および実験７）の中で、１、５および１０ｎｇ／μＬのＤＮＡドナー濃度が表されたが、得られたマウスは、様々な度合いのモザイク現象を示す。ドナーＤＮＡ濃度が、その最も低い状態であった実験２（１ｎｇ／μＬ）では、ドナーＤＮＡは、Ｎ１子孫間で検出されず（０／５０）、ドナーＤＮＡの組込みが、胚の発生の多細胞段階で起こること、およびドナーＤＮＡを獲得した細胞が、認識可能なレベルで生殖系列に寄与しないことを示唆した。
ドナーＤＮＡ濃度が、中間レベルであった表３の実験６（５ｎｇ／μＬ）では、ドナーＤＮＡが、全てのＮ１子孫のほぼ半分で検出され（１４／３１）、ドナーＤＮＡの組込みが、胚の発生の一細胞（接合体）段階で起こること、その細胞が、生殖系列の全ての細胞を生じさせること、およびドナーＤＮＡが、減数分裂中に、成熟精子の集団の半分に継代することを示唆した。この結果は、置き換えられるべき１７ｋｂｐマウスセグメントの欠失が、接合体において相同染色体におけるＢｃｌ２ｌ１１遺伝子座で起き、ＤＮＡ挿入に相反して、全ての残存子孫に伝達された（１７／１７）という本発明者らの仮説と一致する。この結果は、最適な所望の結末と完全に合致し、即ち、ここで、Ｐ０接合体は、二対立遺伝子改変を受け、モザイク現象を有さないマウスへと発生し、一方または他方の変異体対立遺伝子を、同数で（５０％：５０％）成熟精子の集団に伝達する。
ドナーＤＮＡ濃度が、試験した最高レベルであった表３の実験７（１０ｎｇ／μＬ）では、１７ｋｂｐ欠失が、全てのＮ１子孫のほんの２５％で検出され（１４／５６）、Ｐ０マウス中に存在するドナーＤＮＡが、Ｎ１世代に全く伝達されなかった（０／５６）。これらの結果は、欠失が、１つのＢｃｌ２ｌ１１対立遺伝子において、単一卵割球で２細胞段階でまたはその付近で起き、この欠失保有細胞が、発生中の減数分裂前生殖系列のおよそ半分および全ての成熟（減数分裂後）生殖細胞の４分の１に生じさせた状況を仮定して説明することができる。胚発生における幾らか後の時点で、ドナーＤＮＡの挿入が起きたが、生殖系列に寄与しないような細胞ではほとんど、認識可能な方法では起きなかったと仮定することができる。
任意の特定の理論に拘束されるのを望まないが、表３の実験７における多数の態様が、その最適に満たない結果に寄与した可能性がある。
第一に、その粘度に起因して、高すぎるＤＮＡ濃度を有するドナーＤＮＡ調製物は、マイクロインジェクション針により接合体へ効率的に送達され得ないか、またはＣａｓ９活性および／またはＨＤＲを促進するようあまり促さない形態で送達され得る。
第二に、この実験用に設計したガイドは、最適なスコアを有するように設計されたが、本発明者らが、置き換えられるべきマウスＤＮＡセグメントの末端付近で、最適な位置であると推測したものは有さなかった。このタイプの実験では、ガイド位置は、ガイドスコア単独よりも有意な設計パラメーターを表し得る。高いスコア最適化用に設計したガイドを使用した全ての実験の中で、ドナーＤＮＡ濃度が、試験した最高レベルであった実験７（１０ｎｇ／μＬ）においてのみ、ドナーＤＮＡ組込みの任意の兆候が見られ、ここでさえ、それは、改変対立遺伝子をＮ１マウスに伝達しないほど、Ｐ０樹立体マウスにおいて一見非常に低いレベルであったことに留意することは興味深い。最適な結果が達成された上述する実験６において、ドナーＤＮＡ濃度が、ほんの５ｎｇ／μＬであったことを想起する。その状況で見られる首尾よい結果は、最適以下のドナーＤＮＡ濃度であると証明することができるものでさえ、優れて機能し／配置された（末端に最も近い）ガイドによって駆動されたことは、専ら可能である。実験６を実験７と比較して、より高いドナーＤＮＡ濃度を用いた実験（実験７、１０ｎｇ／μＬ）が、より高い割合の組込みを達成した（生産マウスのパーセントとして、１４．３％対５．６％）が、回収した単一樹立体では対立遺伝子改変のより低い品質（非モザイク現象／最大頻度で両方の改変対立遺伝子の伝達と比較して、モザイク現象／低頻度でたった１つの改変対立遺伝子の伝達）を達成したことを留意することは興味深い。
ＤＮＡ濃度が、個々の接合体へのＤＮＡの導入に関連した最も重要なパラメーターであり得るのに対して、ガイド設計は、ドナーＤＮＡがひとたび細胞に進入すると、より頻度の高い欠失形成およびより効率的なＨＤＲを促進するのに最も重要な因子であることが判明し得ると推測し得る。
４）外因性ＤＮＡの組込みが、設計遺伝子座で起きた
本発明者らは、ＢＡＣ由来のヒトＢＣＬ２Ｌ１１配列の挿入部位を位置付けすることの手段として、外交配−戻し交配遺伝子マッピング戦略を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ×（ＦＶＢ／ＮＪ×Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ）戻し交配由来の２２匹のＮ２子孫およびＦＶＢ／ＮＪ×（ＦＶＢ／ＮＪ×Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ）戻し交配由来の２８匹の子孫を分析した。データの分析により、ヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントとマウス２番染色体上の幾つかの遺伝子マーカーとの間の強力な関連性が実証される（図３Ａおよび図３Ｂを参照）。
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪに対する戻し交配において、最も強力な関連性を有するマーカーであるマーカーｒｓ１３４７６７５６は、６．５８のログオッズ比（ＬＯＤ）を有した（ｐ＜０．００４）。ＦＶＢ／ＮＪに対する戻し交配において、マーカーｒｓ１３４７６７５６は、７．６４のＬＯＤスコアを有した（ｐ＜０．０００４）。
個々のハプロタイプ（具体的には、試料２６１、２６３、２６６、３０３および３１９における組換えのポイント）の分析は、挿入臨界領域を、マウス２番染色体上のマーカーｒｓ４２２３４０６（ヌクレオチド１１３、８２７、３５２）からマーカーｒｓ３６８９６００（ヌクレオチド１５９、０１４、２５３）の４５．２Ｍｂｐ領域へとさらに狭め（ＧＲＣ３８／ｍｍ１０）、それは、ヌクレオチド１２８、１２６、０３８からヌクレオチド１２８、１６２、５４７に及ぶ３６，５１０ｂｐマウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子への組込みと一致している。
換言すると、この分析は、マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子および操作したヒト配列の両方が、マウスゲノムの２％未満を含む領域内で共存させなくてはならないことを示す。本発明者らは、ヒト配列の組込みが、ランダムには起きず、実際には設計通りに相同組換えによって起きたと結論付ける。
まとめると、上記実施例は、記載するＣＲＩＳＰＲ／ＢＡＣ技術を使用して、大きな外因性ＤＮＡ（そのマウス対応物に相同的な２５ｋｂヒト遺伝子などの）を、定方向様式で接合体ゲノムに導入することができること、および本発明者らがＰＣＲ、配列決定および連鎖分析によって実証したように、得られたトランスジェニック動物が、特異的に標的とされるＤＮＡを、生殖系列伝達によりその子孫へと継代する能力を有することを示す。
実施例２ 伝統的なＥＳ細胞ベースの相同組換えによる２５キロ塩基対ＢＡＣ由来ドナー分子のノックイン
実施例１に記載するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９駆動アプローチと対比して、本発明者らはまた、古典的なＥＳ細胞ターゲティング、二重選択およびリコンビナーゼ駆動カセット除去を含む伝統的なアプローチを使用した。
この伝統的なアプローチにおける一般的なステップは、下記の特異的なステップを除いて、実施例１における一般的なステップと実質的に同じであった。
ｂ’）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用したターゲティングベクターの調製
ｐＴＬＤ１４プラスミドがひとたび得られたら（実施例１を参照）、本発明者らは、ブラストサイジンベースの胚幹（ＥＳ）細胞選択を用いた場合に幾らか困難を被った。したがって、本発明者らは、ＢｓｄＲのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ネガティブ選択可能ｒｐｓＬ中間体によりＰｕｒｏＲのオープンリーディングフレームで置き換えた。
得られたベクターであるｐＴＬＤ３９は、それぞれ、マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子の近位および遠位領域を構成する１２，７７３および２６，６３２ｂｐ相同性アームによって隣接されるヒトＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子の２７，２８２ｂｐ中心セグメントを含有した。ＦＲＴ部位によって隣接されるＮｅｏＲカセットは、大きな外因性ヒトゲノムＤＮＡの５’末端に近い。ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位によって隣接されるＰｕｒｏＲカセットは、大きな外因性ヒトゲノムＤＮＡの３’末端に近い。ベクターｐＴＬＤ３９は、連続的なネオマイシン／ピューロマイシン選択に付された胚幹細胞において良好に機能した。
ｆ’）ＥＳ細胞ターゲティングベクターｐＴＬＤ３９の電気穿孔
本発明者らは、直鎖状ｐＴＬＤ３９ＤＮＡ ２５μｇを、マウス胚幹細胞のＪＭ８−Ａ３（系統：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）系統の１．５×１０７個の細胞に電気穿孔した。次に、ＥＳ細胞を、連続的なゲンタマイシン（Ｇ４１８、２００μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）およびピューロマイシン（０．７５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）選択を有するＥＳ＋２ｉ培地に蒔いた。
生存ＥＳ細胞クローンを、ＥＳ＋２ｉ培地上に播種して、核型分析して、ＰＣＲによってピューロマイシン耐性カセットの存在に関してさらに試験し、定量的ＰＣＲによって相同性アーム、挿入片およびネオマイシン耐性カセット計数に関して評価した。適切にターゲティングされたクローンを、性交の３．５日後の（ｄｐｃ）胚盤胞にマイクロインジェクトした（以下を参照）。
ｈ’）偽妊娠雌への移植前の胚盤胞への、電気穿孔したＥＳ細胞の注入
適切にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、３．５ｄｐｃ胚盤胞へマイクロインジェクトし、次に、標準的な技法によって胚盤胞を偽妊娠宿主雌親に移入させた。
得られた胚を予定日まで進ませて、仔を自然分娩させて、４週齢離乳するまで、雌親によって育てられた。続いて、実施例１と同様に、仔を、遺伝子型同定、サンガー配列決定、および遺伝子マッピングに付した。
結果
ＥＳ細胞のＪＭ８−Ａ３系統へのｐＴＬＤ３９ベクターの電気穿孔およびＧ４１８上での選択後に、本発明者らは、ＰＣＲによってピューロマイシン耐性カセットの存在に関して、８９個の生存クローンをアッセイした。これらのうち、２７個（２７）が、ピューロマイシンカセットを含有し、ピューロマイシン選択に付した。これらのうち、４個（４）のクローンが生存し、定量的ＰＣＲによって相同性アーム、挿入片およびネオマイシン耐性カセット計数に関して評価した。１個（１）のクローンが、中心ヒトＢＣＬ２Ｌ１１セグメントの、内因性マウスＢｃｌ２ｌ１１遺伝子への適切なターゲティングに関してこれらの試験全てをパスした。
このクローン由来のＥＳ細胞を胚盤胞へマイクロインジェクトして、９個（９）の高品質キメラを生じた。４個の最高品質雄キメラを、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ雌に交配させて、ヒト化対立遺伝子の生殖系列伝達の２つの独立した事例を生じた。おそらく同一であるが、独立した系統（遺伝的背景：Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮ）を各事例から発生させた。雄を、Ｂ６Ｎ．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｓｏｘ２−Ｃｒｅ）１Ａｍｃ／Ｊ雌マウスと交配させることにより、設計通りにｌｏｘＰ隣接２．９ｋｂｐヒトイントロンセグメントが欠失された子孫を生じた。
上述の本発明は、理解の明瞭性の目的で、実例および実施例として幾らか詳細に記載したが、本発明は、開示する特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神および範囲内に存在する全ての変更および改変を網羅すると意図される。
本明細書中に記載する刊行物および特許は全て、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示す。刊行物および特許は全て、各個々の刊行物または特許出願が、参照に組み込まれるようにまるで具体的かつ個々に示されたのと同程度にまで、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (45)

  1. 相同組換えを介して大きな外因性ゲノムＤＮＡを挿入して、哺乳類の細胞のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを置き換える方法であって、
    （ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
    （ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
    （ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、前記ＢＡＣに挿入するステップであって、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、前記近位領域および前記遠位領域は、前記細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
    （ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、前記第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡは、前記近位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
    （ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、前記第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡは、前記遠位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する該遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、調製するステップと、
    （ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
    （ｇ）前記哺乳類の前記細胞に、
    （ｉ）ステップ（ｃ）における前記ＢＡＣ、
    （ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第１の対、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第２の対、および
    （ｉｖ）ステップ（ｆ）における前記Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
    を導入するステップと
    を含み、それにより、
    （ｉ）ｇＲＮＡの前記第１の対は、該近位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第１の二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、
    （ｉｉ）ｇＲＮＡの前記第２の対は、該遠位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第２のＤＳＢを生成し、
    （ｉｉｉ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、相同組換えを介して前記第１のＤＳＢおよび前記第２のＤＳＢで該細胞の該ゲノムに組み込まれて、該近位領域と該遠位領域との間の前記内因性ゲノムＤＮＡを置き換える、前記方法。
  2. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約１５〜２００ｋｂである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２０〜１００ｋｂである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２５ｋｂである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞が、接合体である、請求項１に記載の方法。
  6. ステップ（ｇ）が、マイクロインジェクションによって実施される、請求項５に記載の方法。
  7. マイクロインジェクションが、約１〜１０ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項６に記載の方法。
  8. マイクロインジェクションが、約２〜８ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項６に記載の方法。
  9. マイクロインジェクションが、約５ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項６に記載の方法。
  10. 前記細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
  11. ステップ（ｇ）が、電気穿孔によって実施される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＢＡＣが、選択マーカーを保有しない、請求項１に記載の方法。
  13. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の異なる種に由来する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記哺乳類が、マウスである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、請求項１に記載の方法。
  17. 前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、請求項１に記載の方法。
  18. 前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡが、前記内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、請求項１に記載の方法。
  19. 前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡが、前記内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、前記近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、前記遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、請求項１に記載の方法。
  22. ステップ（ｆ）において、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、または前記第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される、請求項１に記載の方法。
  23. 細胞が、相同組換えを介して内因性ゲノムＤＮＡを置き換えた大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有し、かつ生殖系列を介して該大きな外因性ゲノムＤＮＡを伝達することが可能である、非ヒト哺乳類を生成する方法であって、
    （ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
    （ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
    （ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、前記ＢＡＣに挿入するステップであって、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、前記近位領域および前記遠位領域は、前記哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
    （ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、前記第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡは、前記近位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
    （ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、前記第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡは、前記遠位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
    （ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
    （ｇ）前記哺乳類の接合体に、
    （ｉ）ステップ（ｃ）における前記ＢＡＣ、
    （ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第１の対、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第２の対、および
    （ｉｖ）ステップ（ｆ）における前記Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
    を導入するステップと、
    （ｈ）前記哺乳類の同じ種の偽妊娠雌を調製するステップと、
    （ｊ）前記接合体を、前記偽妊娠雌に移植して、該哺乳類の子孫を生ませるステップ
    とを含む、前記方法。
  24. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約１５〜２００ｋｂである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２０〜１００ｋｂである、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２５ｋｂである、請求項２３に記載の方法。
  27. ステップ（ｇ）が、マイクロインジェクションによって実施される、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記哺乳類が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である、請求項２３に記載の方法。
  29. 該哺乳類の子孫の約５０％または１００％が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有する、請求項２３に記載の方法。
  30. 必要に応じて、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である該哺乳類の子孫を生成するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  31. 前記ＢＡＣが、選択マーカーを保有しない、請求項２３に記載の方法。
  32. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する、請求項２３に記載の方法。
  33. 前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の異なる種に由来する、請求項２３に記載の方法。
  34. 前記哺乳類が、マウスである、請求項２３に記載の方法。
  35. 前記哺乳類が、ＥＳ細胞技術が欠如している種である、請求項２３に記載の方法。
  36. マイクロインジェクションが、約１〜１０ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項２７に記載の方法。
  37. マイクロインジェクションが、約２〜８ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項２７に記載の方法。
  38. マイクロインジェクションが、約５ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項２７に記載の方法。
  39. 前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、請求項２３に記載の方法。
  40. 前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、請求項２３に記載の方法。
  41. 前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、請求項２３に記載の方法。
  42. 前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、請求項２３に記載の方法。
  43. 前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、該近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、請求項２３に記載の方法。
  44. 前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、該遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、請求項２３に記載の方法。
  45. ステップ（ｆ）において、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、または前記第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される、請求項２３に記載の方法。
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