CN108471731A - 大型基因组dna敲入及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于利用大容量克隆载体(例如，BAC)以携带侧翼为近端和远端区域(10kb)的大型外源基因组DNA(约10‑300kb)以在CRISPR/Cas9刺激的同源重组中有效插入到细胞的基因组中的组合物和方法。还提供了用于向小鼠合子中显微注射大型人类基因以制备基因修饰小鼠的方法和组合物。

Description

大型基因组DNA敲入及其用途
相关申请的引用
本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2015年11月6日提交的美国临时申请号62/252,080的优先权益，该临时申请的整个内容通过引用以其全文并入本文。
政府支持
本发明在美国国立卫生研究院(NIH)的美国国家癌症研究所(NCI)授予的批准号P30CA034196的美国政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
基因组编辑是其中插入、替换或从基因组移除DNA的基因工程类型。近年来，已使用人工工程化的核酸酶(也称为“分子剪刀”)实现基因组编辑。所述核酸酶在基因组中的期望位置处产生双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源性机制以通过同源定向修复(HDR，其一种常见形式是同源重组(HR))和非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复所诱导的断裂。
常使用限制性核酸内切酶(RE)在靶DNA中产生DSB。由于识别序列短(通常为4-8bp)，RE在大的基因组DNA区域中产生太多的DSB。为克服此问题，若干不同类型的核酸酶已被生物工程化以产生更适合大基因组区域的位点特异性DSB；例如，锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统和工程化兆核酸酶。
兆核酸酶通常见于一些微生物物种中。它们具有识别序列非常长(＞14bp)的独特性质，因此使得它们是天然特异性的，并适于在大型基因组中的基因组编辑过程中产生位点特异性DSB。然而，该方法的限制在于已知的兆核酸酶很少，因此严重限制了该方法可覆盖的靶序列。已使用诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列的兆核酸酶变体。已融合各种兆核酸酶来产生具有新的识别序列的杂交酶。其他人已试图通过改变兆核酸酶的DNA-相互作用残基来合理设计兆核酸酶，以设计序列特异性兆核酸酶(参见例如美国专利号8,021,867)。
基因组编辑中的其他传统基因工程化技术包括随机转基因、靶向转基因和重组酶介导的盒式交换(RMCE)。这些方法中的每一种都有其缺点。例如，随机转基因方法偏离同源内源性基因座处的基因组修饰，足以允许转基因随机整合(此时它们发生多样化表达)。在靶向转基因术过程中，转基因可被明确引导至标准化安全港位点以限制这种位置效应多样化，但即便在这里，转基因也与其内源性同源基因没有联系。类似于相关RMCE方法，靶向转基因术可涉及侧翼为重组酶结合位点的抗生素选择盒的使用。除了增加的复杂性外，删除这些选择盒需要繁殖到特定的重组酶表达小鼠，从而延长品系发育。
对于过去三十年来在小鼠中使用的类别的传统基因靶向，基于大量文献的传统范式是创建具有几个至几千个碱基对长度的两个同源臂的质粒载体充当供体分子。这些臂位于质粒内以便侧接研究者改变的序列，其将在向胚胎干细胞(ES细胞)和HDR中导入质粒载体后整合到基因组中。常常采用阳性和阴性选择盒来帮助选择含有适当整合的序列的罕见胚胎干细胞(ES细胞)克隆。该技术足以在从一个核苷酸到数千个碱基对的规模上修改基因组序列。然而，在尝试改变常达到数万或数十万个碱基对的整个小鼠基因时，此方法可能不符合标准。
作为基因组工程化工具，CRISPR-Cas核酸内切酶充当工具以以高频率并在广泛的品系和生物体中产生具有感兴趣的基因座的特异性的DNA双链断裂(DSB)。当面对DSB时，受扰生物体的细胞以NHEJ途径和HDR途径响应以修复DSB。通过更快速且易于出错的NHEJ途径修复的DSB的特征在于删除或插入少量核苷酸(INDELS)，其当它们在感兴趣的蛋白质的开放阅读框内时，可以导致感兴趣的原始基因的亚等位基因突变或无效突变。相比之下，在存在同源模板(例如，姐妹染色单体、供体分子)的情况下，通过HDR修复的DSB提供了在DSB位点处向生物体中导入精确的DNA修饰的机会。
CRISPR技术正在迅速扩张，并应用于多个物种和不同的基因组编辑领域。尽管CRISPR技术正在推进，然而，目前就申请人所知，基于HDR(例如，HR)的重组局限于编辑基因组DNA的相对较小的区域。例如，在旨在解决通过CRISPR/Cas创建DSB后使用HR进行基因编辑时的技术问题的Addgene网站的同源重组(HR)常见问题部分中，提出了关于在尝试使用CRISPR/Cas9系统来通过同源重组(HR)创建特定的突变或插入时每个同源臂应多长的问题。对于导入小突变(例如，＜50bp的那些)或单点突变，推荐的方法是使用单链DNA(ssDNA)寡核苷酸(与质粒相对)作为用于转染到靶细胞中的HR模板。ssDNA寡核苷酸通常具有约100-150bp的总同源性，小突变或点突变位于中间，因此在突变的每一侧上产生约50-75bp的同源臂。对于大的改变(如＞100bp的插入或删除)，通常使用质粒供体，约800bp的两个同源臂在期望插入或突变侧翼的每一侧上。这样的质粒供体的典型尺寸为大约5kb(Yang etal.，Cell 154(6)：1370-1379，2013)。针对关于使用CRISPR/Cas进行同源重组(HR)可插入到基因组中的DNA的最大量，以及用于有效重组的同源臂的长度的问题，Addgene网站指出已试图插入的最长长度为1kb，同源臂长度为800bp。
关于该技术的某些关键方面的不确定性和不可预测性，如由CRISPR/Cas创建的DSB的性质和合适性，以及同源臂长度对CRISPR相关HDR的影响，尤其是当插入尺寸大于几千个碱基时，可能是造成CRISPR相关HDR至今局限于向宿主基因组中插入小DNA片段(例如，从单个核苷酸到最多一千或几千个碱基)的原因。
因此，持续需要开发新的手段来通过同源重组向宿主基因组中导入大型基因组DNA。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种在哺乳动物的细胞的基因组中通过同源重组插入大型外源基因组DNA以替换内源基因组DNA的方法，其包括以下步骤：
(a)提供细菌人工染色体(BAC)；
(b)提供约10-300kb的大型外源基因组DNA；
(c)向所述BAC中插入所述大型外源基因组DNA，
其中所述大型外源基因组DNA的侧翼为约10-30kb的近端区域和约10-30kb的远端区域，和
其中所述近端区域和所述远端区域在所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA的侧翼；
(d)制备第一对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第一对包含第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离近端接合点约250bp内的第一Cas9切割位点和第二Cas9切割位点，其中所述近端区域在所述近端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(e)制备第二对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第二对包含第三gRNA和第四gRNA，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离远端接合点约250bp内的第三Cas9切割位点和第四Cas9切割位点，其中所述远端区域在所述远端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(f)提供Cas9蛋白质或能够产生所述Cas9蛋白质的Cas9编码序列；和
(g)向所述哺乳动物的所述细胞中导入：
(i)步骤(c)中的所述BAC；
(ii)步骤(d)中的所述第一对CRISPR/Cas9指导RNA；
(iii)步骤(e)中的所述第二对CRISPR/Cas9指导RNA；和
(iv)步骤(f)中的所述Cas9蛋白质或Cas9编码序列；
由此，
(i)所述第一对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述近端接合点处的所述第一和所述第二Cas9切割位点以产生第一双链断裂(DSB)；
(ii)所述第二对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述远端接合点处的所述第三和所述第四Cas9切割位点以产生第二DSB；和
(iii)所述大型外源基因组DNA在所述第一DSB和所述第二DSB处通过同源重组整合到所述细胞的所述基因组中以替换所述近端区域和所述远端区域之间的所述内源基因组DNA。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA为约15-200kb；优选约20-100kb；更优选约25kb。
在某些实施方式中，细胞为合子。在某些实施方式中，关于合子，步骤(g)通过显微注射进行。在某些实施方式中，显微注射使用约1-10ng/μL含有大型外源基因组DNA的BAC进行；优选使用约2-8ng/μL；更优选使用约5ng/μL。
在某些实施方式中，细胞为胚胎干细胞(ES细胞)。在某些实施方式中，关于ES细胞，步骤(g)通过电穿孔进行。
在某些实施方式中，BAC不携带选择标志物。
在某些实施方式中，BAC为pBACe3.6、pBACGK1.1、pBACGMR、pBAC-red、pTARBAC1、pTARBAC1.3、pTARBAC2、pTARBAC2.1、pTARBAC3、pTARBAC4或pTARBAC6。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA来自哺乳动物的相同物种的不同品系。在某些实施方式中，大型外源基因组DNA来自哺乳动物的不同物种。
在某些实施方式中，哺乳动物为小鼠。
在某些实施方式中，第一和第二Cas9切割位点独立地在距离近端接合点约100bp、50bp或10bp内。
在某些实施方式中，第一gRNA和第二gRNA结合内源基因组DNA的不同链(即，正链和负链)。
在某些实施方式中，第一和第二Cas9切割位点为最靠近近端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
在某些实施方式中，第三和第四Cas9切割位点独立地在距离远端接合点约100bp、50bp或10bp内。
在某些实施方式中，第三gRNA和第四gRNA结合内源基因组DNA的不同链(即，正链和负链)。
在某些实施方式中，第三和第四Cas9切割位点为最靠近远端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
在某些实施方式中，在步骤(f)中，Cas9蛋白质以包含第一gRNA、第二gRNA、第三gRNA或第四gRNA的复合物提供。
然而，在一个相关的方面，本方法可仅使用第一和第二gRNA之一进行来创建第一DSB。
在另一个相关的方面，本方法可仅使用第三和第四gRNA之一进行来创建第二DSB。
在一个方面，本发明提供了一种产生非人类哺乳动物的方法，所述非人类哺乳动物的细胞具有已通过同源重组替换内源基因组DNA的大型外源基因组，并能够通过种系传递所述大型外源基因组DNA，所述方法包括以下步骤：
(a)提供细菌人工染色体(BAC)；
(b)提供约10-300kb的大型外源基因组DNA；
(c)向所述BAC中插入所述大型外源基因组DNA，
其中所述大型外源基因组DNA的侧翼为约10-30kb的近端区域和约10-30kb的远端区域，和
其中所述近端区域和所述远端区域在所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA的侧翼；
(d)制备第一对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第一对包含第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离近端接合点约250bp内的第一Cas9切割位点和第二Cas9切割位点，其中所述近端区域在所述近端接合点处连接所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(e)制备第二对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第二对包含第三gRNA和第四gRNA，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离远端接合点约250bp内的第三Cas9切割位点和第四Cas9切割位点，其中所述远端区域在所述远端接合点处连接所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(f)提供Cas9蛋白质或能够产生所述Cas9蛋白质的Cas9编码序列；和
(g)向所述哺乳动物的合子中导入：
(i)步骤(c)中的所述BAC；
(ii)步骤(d)中的所述第一对CRISPR/Cas9指导RNA；
(iii)步骤(e)中的所述第二对CRISPR/Cas9指导RNA；和
(iv)步骤(f)中的所述Cas9蛋白质或Cas9编码序列；
(h)制备所述哺乳动物的相同物种的假孕雌性；
(j)向所述假孕雌性中植入步骤(g)中的所述合子以产下所述哺乳动物的后代。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA为约15-200kb；优选约20-100kb；更优选约25kb。
在某些实施方式中，步骤(g)通过显微注射进行。
在某些实施方式中，关于大型外源基因组DNA，哺乳动物为半合子或纯合子。在某些实施方式中，约50％或100％的哺乳动物的后代携带大型外源基因组DNA。
在某些实施方式中，如有必要，本方法还包括产生关于大型外源基因组DNA为半合子或纯合子的哺乳动物的后代。
在某些实施方式中，哺乳动物为缺乏ES细胞技术的物种。
在某些实施方式中，显微注射使用约1-10ng/μL含有大型外源基因组DNA的BAC进行；优选使用约2-8ng/μL；更优选使用约5ng/μL。
在某些实施方式中，第一和第二Cas9切割位点独立地在距离近端接合点约100bp、50bp或10bp内。
在某些实施方式中，第三和第四Cas9切割位点独立地在距离远端接合点约100bp、50bp或10bp内。
在某些实施方式中，第一gRNA和第二gRNA结合内源基因组DNA的不同链(即，正链和负链)。
在某些实施方式中，第三gRNA和第四gRNA结合内源基因组DNA的不同链(即，正链和负链)。
在某些实施方式中，第一和第二Cas9切割位点为最靠近近端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
在某些实施方式中，第三和第四Cas9切割位点为最靠近远端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
在某些实施方式中，在步骤(f)中，Cas9蛋白质以包含第一gRNA、第二gRNA、第三gRNA或第四gRNA的复合物提供。
然而，在一个相关的方面，本方法可仅使用第一和第二gRNA之一进行来创建第一DSB。
在另一个相关的方面，本方法可仅使用第三和第四gRNA之一进行来创建第二DSB。
在另一个方面，本发明提供了一种人工基因组DNA，其包含：来自第一生物体的大型基因组DNA的中心区域、来自第二生物体的基因组DNA的近端区域和来自所述第二生物体的基因组DNA的远端区域，其中所述中心区域的侧翼为所述近端区域和所述远端区域。
中心区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、60kb、80kb、100kb、150kb、200kb、250kb、300kb或350kb。
来自第一生物体的基因组DNA的中心区域替换侧翼为第二生物体中的近端区域和远端区域的第二生物体的同源或相应中心区域。
第二生物体的同源或相应中心区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、60kb、80kb、100kb、150kb、200kb、250kb、300kb或350kb。
在某些实施方式中，近端区域的长度和远端区域的长度两者均足够长以支持同源重组。
近端区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或至少约50kb。远端区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或至少约50kb。
在某些实施方式中，同源或相应中心区域为约20kb，中心区域为约25-30kb，近端区域和远端区域各为约10kb。
在某些实施方式中，第一生物体和第二生物体为相同物种。在某些实施方式中，第一生物体和第二生物体为不同物种。在某些优选的实施方式中，第一生物体为人，第二生物体为小鼠(或大鼠)。
在一个方面，本发明提供了一种载体，其能够携带大型外源DNA并且与根据本发明的同源重组相容。
在某些实施方式中，适合于合子中的(CRISPR-创建的)双链断裂(DSB)-同源重组(HR)-介导的敲入的载体包含本发明的人工基因组DNA中的任一种。在某些实施方式中，DSB通过CRISPR/Cas或CRISPR/cpf1创建。在某些实施方式中，载体不具有可选择标志物。
在某些实施方式中，载体适合于胚胎干细胞(ES细胞)中的同源重组，所述载体包含本发明的人工基因组DNA中的任一种。
在某些实施方式中，载体为质粒、噬菌体λ、粘粒、噬菌体P1载体、P1人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。优选地，载体为BAC。示例性的BAC包括但不限于pBACe3.6、pBACGK1.1、pBACGMR、pBAC-red、pTARBAC1、pTARBAC1.3、pTARBAC2、pTARBAC2.1、pTARBAC3、pTARBAC4、pTARBAC6或其修饰版本。
在某些实施方式中，编码CRISPR/Cas9的载体或编码序列为CRISPR/Cas9 mRNA。
在一个相关的方面，本发明提供了在如本文所述的第二生物体的近端区域和远端区域之间导入第一生物体的中心区域的方法，所述方法包括在允许同源重组的条件下向ES细胞中导入本发明的载体。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括将ES细胞或合子转移到假孕雌性中。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括对产生于显微注射的合子或其后代的哺乳动物进行基因分型。基因分型可用来验证完整(或含小INDEL的)宿主哺乳动物等位基因的Cas9结合位点、内源/外源基因组DNA接合点，和/或携带任何缺失的等位基因的断点。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括对来自基因分型反应的扩增产物进行测序。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括对整合的大型外源基因组DNA进行遗传作图以验证在期望基因座处的整合。
应理解，本文描述的任何一个实施方式，包括仅在实施例或说明书的一个部分中公开的那些，意在能够与任何一个或多个其他实施方式组合，除非被明确放弃。
附图说明
图1示出了用于构建Bcl2l11/BCL2L11靶向载体/供体分子的一般方案。在小鼠同源臂之间放置人BCL2L11基因的25-kbp片段、在所述人片段的每一端处放置可移除的可选择标志物盒，并将loxP位点放置在在12％的东亚人口中缺失的人DNA的2.9-kbp片段周围来构建基因靶向载体/供体分子。
图2示出了用于BCL2L11/Bcl2l11的小鼠(M)、人源化(M/H)和携带缺失(ΔM)的等位基因的基因分型引物的组织。示意图示出了基因分型引物的组织。数字、引物名称如表4中；水平黑线的左段和右段：小鼠Bcl2l11基因的侧翼区域；顶部水平黑线的中心片段：小鼠Bcl2l11基因的中心(待替换)区域；蓝线：人BCL2L11基因的中心片段。
图3A和3B示出了在小鼠合子中，在CRISPR刺激的同源重组后，BCL2L11整合位点的连锁分析的结果。所示为C57BL/6NJ×FVBB6NF1/J-BCL2L11回交的22只F2后代(上图)和FVB/NJ×FVBB6NF1/J-BCL2L11回交的28只F2后代(下图)的连锁分析。连锁和单倍型分析表明BCL2L11载体的整合发生在标志物rs4223406和rs3689600之间，并且其分离与标志物rs13476756和rs3662211完全一致。该结果与如所设计的人BCL2L11片段在内源性小鼠Bcl2l11基因内的整合完全一致。
具体实施方式
定义-本申请中使用的术语应具有以下含义。
如本文所用，术语“大型外源基因组DNA”是指就哺乳动物的基因组而言的异体基因组DNA，所述异体基因组DNA具有至少约10kb的长度，例如约10-300kb、约15-200kb、约20-100kb或约25-50kb。例如，就小鼠基因组而言，50kb人基因组DNA为大型外源基因组DNA。
如本文所用，术语“同源重组”是指其中在称为同源序列或同源臂的两个相似或相同DNA分子之间交换核苷酸序列的基因重组类型。同源重组通常涉及以下基本步骤：在DNA的两条链上发生双链断裂(DSB)后，在称为切除的过程中切去DSB的5′端周围的DNA部分。在随后的链侵入步骤中，断裂的DNA分子的悬挂3′端“侵入”未断裂的类似或相同(或同源)DNA分子，例如同源臂。在链侵入后，进一步的事件顺序可遵循两种主要途径中的任一种：DSBR(双链断裂修复)途径或SDSA(合成依赖性链退火)途径。
如本文所用，术语“内源基因组DNA”是指哺乳动物中待由如本文所定义的大型外源基因组DNA替换的基因组DNA的某个片段。待替换或删除的内源基因组DNA可以与或可以不与大型外源基因组DNA序列同源，只要它们两者侧翼为相同的同源臂即可。内源基因组DNA长至少约10kb。允许同源重组发生(优选在近端和远端接合点处/附近的DSB的存在下)的是在连接到内源基因组DNA的近端区域和连接到大型外源基因组DNA的近端区域之间的序列同源性(例如，同一性)；和在连接到内源基因组DNA的远端区域和连接到大型外源基因组DNA的远端区域之间的序列同源性(例如，同一性)。
如本文所用，“近端区域”是指长至少约10kb的基因组DNA片段，其(1)连接哺乳动物基因组中内源基因组DNA的一端，(2)连接同源重组靶向载体上大型外源基因组DNA的一端，和(3)充当两个侧翼同源臂中的一个，其促进同源重组以在哺乳动物基因组中用大型外源基因组DNA替换内源基因组DNA。
如本文所用，术语“近端接合点”是指在那里近端区域连接哺乳动物基因组中的内源基因组DNA的位置。
如本文所用，“远端区域”是指长至少约10kb的基因组DNA片段，其(1)连接哺乳动物基因组中内源基因组DNA的另一端，(2)连接同源重组靶向载体上大型外源基因组DNA的另一端，和(3)充当两个侧接同源臂中的另一个，其促进同源重组以在哺乳动物基因组中用大型外源基因组DNA替换内源基因组DNA。
如本文所用，术语“远端接合点”是指在那里远端区域连接哺乳动物基因组中的内源基因组DNA的位置。
如本文所用，术语“人工基因组DNA”是指通过将来自第一哺乳动物的大型外源基因组DNA的一端连接到来自第二哺乳动物的近端区域和通过将所述大型外源基因组DNA的另一端连接到来自所述第二哺乳动物的远端区域而创建的人工基因组DNA。所述大型外源基因组DNA、所述近端区域和所述远端区域各长至少约10kb。
如本文所用，术语“CRISPR相关蛋白质9”或“Cas9”蛋白质是指与在某些细菌如化脓性链球菌及其他细菌中发现的CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)II型适应性免疫系统相关的RNA指导DNA核酸内切酶。出于本申请的目的，Cas9蛋白质不限于化脓性链球菌中存在的野生型(wt)Cas9。其意在涵盖如图3中所示的(化脓性链球菌的)Cas9/Csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003和WO 2013/176772(通过引用并入本文)的SEQ ID NO：8；WO2013/176772(通过引用并入本文)的氨基酸序列SEQ ID NO：1-256和795-1346中任一者中的相应部分；和来自化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜热链球菌和牙密螺旋体的正交Cas9序列的氨基酸序列中任一者中的相应部分(参见Esvelt et al.，Nature Methods，10(11)：1116-1121，2013，通过引用并入本文)。
如本文所用，术语“Cas9编码序列”是指根据在宿主细胞/宿主哺乳动物中有功能的遗传密码，能够被转录和/或翻译以产生Cas9蛋白质的多核苷酸。Cas9编码序列可以是DNA(如质粒)或RNA(如mRNA)。
如本文所用，术语“Cas9核糖蛋白”是指由Cas9蛋白质和相关的指导RNA组成的蛋白质/RNA复合物。
如本文所用，术语“胚胎干细胞(ES细胞)”是指源自囊胚(哺乳动物的早期植入前胚胎)的内细胞团(ICM)的多能干细胞，其可以在体外的长时间后培养，之后其被插入/注射到正常囊胚的空腔中，并被诱导以恢复正常胚胎发育程序以分化成包括生殖细胞的成年哺乳动物的所有细胞类型。
如本文所用，术语“ES细胞技术”是指为分离、培养和操纵ES细胞而开发的技术，例如，用于基因转移实验。ES细胞技术是复杂但功能强大的种系基因插入方法，但迄今为止仅在有限的哺乳动物物种中建立，包括小鼠，和在更低程度上，大鼠和人类。因此，在可对其使用本CRISPR/Cas9驱动的同源重组以插入大型外源基因组DNA的大多数哺乳动物中，缺乏ES细胞技术。
如本文所用，术语“合子”是指通过两个配子(例如，来自哺乳动物的卵子和精子)之间的受精事件形成的真核细胞。
如本文所用，术语“接合性”是指生物体中的性状的等位基因的相似性程度。
如本文所用，术语“纯合子”针对特定的基因或DNA(例如，插入到宿主基因组中的大型外源基因组DNA)使用，并且是指其中同源染色体两者具有基因/DNA的相同等位基因或拷贝的二倍体细胞或生物体。
如本文所用，术语“杂合子”针对特定的基因或DNA(例如，插入到宿主基因组中的大型外源基因组DNA)使用，并且是指其中两条同源染色体具有基因或DNA的不同等位基因/拷贝/版本的二倍体细胞或生物体。
如本文所用，术语“半合子”针对特定的基因或DNA(例如，插入到宿主基因组中的大型外源基因组DNA)使用，并且是指其中基因或DNA的等位基因/拷贝/版本仅存在于两个同源染色体中的一个中(即，另一同源染色体中不存在该基因或DNA)的二倍体细胞或生物体。当基因的一个拷贝被删除时，或者在异形配子性别中当基因位于性染色体上(例如，位于哺乳动物的X染色体上)时，观察到半合子状态。当向一个染色体上的基因座中导入外源转基因，但在另一个同源染色体的相同基因座中上不存在时，观察到半合子状态。然而，如果期望和适当，可将转基因繁殖成纯合性并保持为近交系。
如本文所述，术语“细菌人工染色体(BAC)”是指基于功能能育质粒(或大肠杆菌的F质粒)和大DNA病毒的基因组(包括杆状病毒和鼠巨细胞病毒的基因组)构建并用于细菌(通常为大肠杆菌)中的转化和克隆的大容量DNA构建体(通常长7kb但能够含有尺寸约150-350kbp的插入片段)。典型的BAC具有以下共同组分：repE(用于质粒复制和拷贝数的调节)；parA和parB(用于在分裂过程中向子细胞中分配F质粒DNA并确保BAC的稳定保持)；用于转录插入基因的T7和Sp6噬菌体启动子；和任选的抗生素抗性可选择标志物(一些BAC在克隆位点处还具有lacZ用于蓝/白选择)。
相应地，通过提供携带大型外源基因组DNA的基于BAC的载体进行同源重组，本发明克服了现有技术的缺点。本发明提供了一种构建基于BAC的载体的方法。当与CRISPR-Cas9组合使用时，本发明的基于BAC的载体促进大型基因组DNA通过同源重组向靶细胞的基因组的有效递送。
本文描述的本发明部分地基于大尺寸(例如，约10、15、20、25、30、35、50、75、100、150、200、250、300或350kb)的外源基因组DNA可被敲入到生物体的基因组中这一发现。本发明的方法采用适合于在靶基因组中的大缺失/缺口(例如，约10、15、20、30、35、50、75、100、150、200、250、300或350kb等)侧翼同源重组的同源臂(例如，10kb-30kb)。本发明的方法采用CRISPR/Cas9组分与同源重组的组合。
如本文所述和示例的本发明具有许多优点，例如：1)将CRISPR驱动的敲入和基因替换的物理尺寸扩大到≥25-kbp；2)使多种品系和物种对长范围DNA修饰开放；3)消除对胚胎干(ES)细胞的抗生素选择的需要；和4)避免选择盒的重组酶介导切除。
在一个方面，本发明提供了一种大型外源基因组DNA。所述大型外源基因组DNA被含在大容量克隆载体内以导入到宿主哺乳动物中来替换内源基因组DNA，可具有约10-300kb、优选约15-200kb、最优选约100-150kb的大DNA尺寸。
大型外源基因组DNA可以是人类或非人类的。例如，非人类基因组DNA可来自动物、哺乳动物(如非人类哺乳动物)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔等)、酵母、细菌等。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA可含有编码蛋白质例如治疗性蛋白质(如补偿遗传或获得性缺陷的蛋白质)的大异体基因。示例性的治疗性蛋白质包括：人生长激素(rHGH)、人胰岛素(BHI)；卵泡刺激激素(FSH)；因子VIII；因子IX；促红细胞生成素(EPO)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；α-半乳糖苷酶A；α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDU；laronidase)；N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB；galsulfase)；阿尔法链道酶(Dornase alfa)；组织纤溶酶原激活剂(TPA)；葡糖脑苷脂酶；干扰素(IF)干扰素-β；胰岛素样生长因子1(IGF-1)；和生长激素等。
由于大型外源基因组DNA的大尺寸，可以编码具有大启动子元件的一系列不同蛋白质。例如，可以编码在细胞特异性或外源调节的基因表达下一起形成蛋白质复合物的许多蛋白质。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA可编码感兴趣的基因(GOI)，如其突变已经和疾病或病况联系在一起的基因。突变基因可编码与疾病(例如癌症、神经退行性疾病、自身免疫疾病、炎性疾病等)相关的突变蛋白。将异体基因整合到宿主基因组中提供了独特的功能基因组动物模型(或试验)，其可用于确定特定基因组插入片段中基因的存在或功能。例如，基因可为人BCL2L11(BCL2-样11凋亡促进剂)，突变是其内含子2的一部分的缺失。其中同源小鼠Bcl2l11已由人类突变体BCL2L11基因替换的小鼠模型提供了研究与人类突变相关的人类疾病的有价值模型。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA可含有调控或控制DNA序列，包括启动子、增强子区域或其他转录调控元件。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA可包含人或哺乳动物着丝粒DNA以产生人或哺乳动物人工染色体。
在另一个方面，本发明采用大容量克隆载体如BAC、YAC等，以向宿主基因组中导入大型外源基因组DNA。
在某些实施方式中，本发明涉及一种携带大型外源基因组DNA的基于BAC的载体，其包含：(a)大容量克隆载体，和(b)大型外源基因组DNA，其中所述基于BAC的载体可向靶细胞中递送所述大型外源基因组DNA。
代表性的BAC包括pBACe3.6、pBACGK1.1、pBACGMR、pBAC-red、pTARBAC1、pTARBAC1.3、pTARBAC2、pTARBAC2.1、pTARBAC3、pTARBAC4、pTARBAC6等。
BAC文库，尤其是含有作为人类基因组计划的结果的人类基因组DNA的那些，对于本领域技术人员来说是易于获得的(参见例如，Simon，Nature Biotechnol.15：839，1997)。
在某些实施方式中，BAC载体不具有选择标志物。这样的BAC载体适合于其中这样的载体被显微注射到动物合子中的本发明方法。
在某些实施方式中，BAC载体携带一个或多个选择标志物基因。这样的BAC载体可用于其中可以需要选择的ES细胞。合适的选择标志物包括但不限于新霉素抗性基因(例如，NeoR)；杀稻瘟菌素S抗性基因(例如，BsdR)；嘌呤霉素抗性基因(puroR)等。
鉴于插入片段和侧翼同源区域的尺寸，BAC是优选的大容量克隆载体。然而，本发明中也可使用本领域技术人员已知的其他大容量克隆载体。这些载体包括例如粘粒(Evanset al.，Gene 79：9-20，1989)；酵母人工染色体(YAC)(Sambrook et al.，A MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989)；哺乳动物人工染色体(MAC)(Vos et al.，Nature Biotechnology 15：1257-1259，1997)；人类人工染色体(Harrington et al.，Nature Genetics 15：345-354，1997)；或基于病毒的载体，如CMV、EBV或基于杆状病毒的载体。
在另一个方面，本发明提供了一种用于将大容量DNA克隆载体如细菌人工染色体(BAC)克隆中的大型外源基因组DNA转变为相对更小容量的克隆载体(如质粒)的改进和简化方法。这允许大容量DNA克隆载体(例如，BAC)内的大型外源基因组DNA更有效或更容易地递送到靶细胞并在体外或体内表达。
因此，在某些实施方式中，载体为能够携带至多约15kb的插入片段的质粒。质粒可含有用于在原核生物(例如，细菌)内独立于宿主染色体进行复制的复制起点。质粒还可以能够在真核细胞中复制。质粒还可携带选择性标志物，如抗生素抗性基因，其允许选择含有该质粒的细胞。质粒还可携带报告基因或标志物基因以标记或识别含有该质粒的细胞克隆。
在某些实施方式中，载体为经修饰的噬菌体λ，其为双链DNA病毒。野生型λ染色体长48.5kb，并可通过用至多约25kb的插入片段替换λ染色体中的非必需病毒序列来修饰，仅留下形成病毒颗粒和感染所需的噬菌体基因。插入DNA可与病毒DNA一起复制并一起包装到病毒颗粒中以在宿主细胞内有效感染和扩增。
在某些实施方式中，载体为含有称为cos序列的噬菌体λDNA的小区域的粘粒载体，其允许粘粒被包装到噬菌体λ颗粒中。粘粒能够携带尺寸为至多45kb的插入片段。可以通过转导将含有线性化粘粒的颗粒导入到宿主细胞中。
在某些实施方式中，载体为噬菌体P1载体，其可携带尺寸介于70-100kb之间的插入片段。这样的载体作为包装在噬菌体P1颗粒中的线性DNA分子开始。然后将这些颗粒注射到表达Cre重组酶的细菌宿主如大肠杆菌菌株中。线性P1载体通过载体中两个loxP位点之间的重组而环化。P1载体可含有抗生素抗性基因。P1载体可含有(阳性)选择标志物以区分含有插入片段的克隆与不含有插入片段的克隆。P1载体可含有P1质粒复制子以确保细胞中仅存在一个拷贝的载体。或者，P1载体可含有由诱导型启动子控制的P1细胞溶素复制子，其允许每个细胞扩增不止一个拷贝的载体。
在某些实施方式中，载体为具有P1载体和细菌人工染色体(BAC)两者的特征的P1人工染色体(PAC)。与P1载体相似，PAC含有如上所述的质粒和细胞溶素复制子。与P1载体不同，它们不需要被包装到噬菌体颗粒中用于转导。相反，它们跟BAC一样通过电穿孔作为环状DNA分子导入到大肠杆菌中。PAC可携带尺寸介于130-150kb之间的插入片段。
在某些实施方式中，载体为酵母人工染色体(YAC)，其为含有真正酵母染色体的必要特征的线性DNA分子，这些必要特征包括端粒、着丝粒和复制起点。大DNA插入片段可被连接到YAC的中间，使得在插入片段的每一侧上有YAC的臂。重组YAC可通过转化导入到酵母中。YAC可包含可选择标志物以允许识别含有YAC的转化子。理论上，YAC可容纳的插入片段的尺寸没有上限。实践中，YAC常常容纳约250-2000kb的插入片段、通常约250-400kb尺寸的插入片段。
本发明还涉及一种通过将大基因组DNA亚克隆到BAC中来构建基于BAC的载体的方法。亚克隆的方法是本领域熟知的。更具体而言，已见描述将大DNA插入片段从一个大容量克隆载体移入到另一个大容量克隆载体中的方法(Wade-Martins et al.，Nucl.A cidsRes.27：1674-1682，1999；Wade-Martins et al.，Nature Biotechnol.18：1311-1314，2000)。
在另一个方面，本发明提供了一种人工基因组DNA构建体，其包含来自第一生物体的大型外源基因组DNA作为中心区域、来自第二生物体的基因组DNA的近端区域，和来自所述第二生物体的所述基因组DNA的远端区域，其中所述大型外源DNA的侧翼为所述近端区域和所述远端区域。
在某些实施方式中，近端区域和远端区域的长度均足够长以支持同源重组。
大型外源基因组DNA/中心区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、60kb、80kb、100kb、150kb、200kb、250kb、300kb或350kb。
来自第一生物体的大型外源基因组DNA/基因组DNA的中心区域替换第二生物体中侧翼为近端和远端区域的第二生物体的同源或相应中心区域。
在某些实施方式中，来自第一生物体的大型外源基因组DNA/中心区域为第二生物体的相应中心区域的同源序列。
在某些实施方式中，由于两者均出于同源重组的目的而侧翼是近端区域和远端区域，来自第一生物体的大型外源基因组DNA/中心区域不与第二生物体的相应中心区域具有显著的序列同源性，并因此仅对应于第二生物体的相应中心区域。
第二生物体的同源或相应中心区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、60kb、80kb、100kb、150kb、200kb、250kb、300kb或350kb。
在某些实施方式中，近端区域的长度和远端区域的长度均足够长以支持同源重组。
近端区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或至少约50kb。远端区域的示例性尺寸为：10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或至少约50kb。
在某些实施方式中，同源或相应中心区域为约25-30kb，优选所述中心区域为约20kb。优选地，近端区域和远端区域各为约10kb。
在某些实施方式中，中心区域、同源中心区域、近端区域和远端区域的尺寸独立地选自一个范围，该范围的低端和高端由上文记载的值中的任一者限定，如中心区域为20-300kb，同源中心区域为15-250kb，近端和远端区域为5-25kb等。
在某些实施方式中，第一生物体和第二生物体为相同物种。第一生物体和第二生物体可以是小鼠或大鼠的不同品系(例如，将来自C57BL/6J小鼠品系的基因插入到FVB/NJ小鼠品系中)。
在某些实施方式中，第一生物体和第二生物体为不同物种。例如，第一生物体可为人，第二生物体可为啮齿动物如小鼠或大鼠。
在某些实施方式中，第一和第二生物体独立地选自：人、灵长类动物、非人灵长类动物、哺乳动物、非人类哺乳动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子)、家畜(如牛、猪、马、羊、山羊、骆驼、美洲驼)、宠物(如猫或狗)、鱼(例如，斑马鱼)、青蛙、昆虫或细菌。
在某些实施方式中，第一生物体为人，第二生物体为小鼠或大鼠。
在某些实施方式中，人工基因组DNA可用于ES细胞中的同源重组，这可能需要使用选择标志物。因此在这样的实施方式中，人工基因组DNA可具有以下特性：(1)中心区域在中心区域的近端处包含第一可选择标志物盒和/或在中心区域的远端处包含第二可选择标志物盒，其中：(a)第一可选择标志物盒包含侧翼为与第一位点特异性重组酶(例如，Flp)相容的第一识别位点对(例如，FRT)的第一可选择标志物(例如，NeoR)，和(b)第二可选择标志物盒包含侧翼为与第二位点特异性重组酶(例如，)相容的第二识别位点对(例如，attB/attP)的第二可选择标志物(例如，BsdR)，和(2)中心区域包含侧翼为与第三位点特异性重组酶(例如，Cre)相容的第三识别位点对(例如，loxP)的可删除区域(例如，片段GH和KL)。
可用作第一、第二和/或第三位点特异性重组酶的合适的位点特异性重组酶包括：Tyr重组酶如Cre、Dre、Flp、KD、B2和B3；Tyr整合酶如λ、HK022和HP1；Ser解离酶/转化酶，如γδ、ParA、Tn3和Gln；和Ser整合酶如Bxb1和R4。
在某些实施方式中，可删除区域与第一可选择标志物盒相邻并在其远端，并且其中第三识别位点对中的一个位于第一可选择标志物盒的近端处。
在某些实施方式中，第一可选择标志物为侧翼为FRT的NeoR。在某些实施方式中，第二可选择标志物为侧翼为attB/attP的BsdR或PuroR。在某些实施方式中，第三识别位点对为loxP。
本发明的一个相关方面提供了与合子中CRISPR/Cas9产生的双链断裂(DSB)-同源重组(HR)介导的敲入相容的载体，所述载体包含本文描述的任何基因组DNA，任选地条件是第一可选择标志物和/或第二可选择标志物(当存在时)分别由第一和第二位点特异性重组酶移除。
本发明的另一个相关方面提供了与胚胎干(ES)细胞中的同源重组相容的载体，所述载体可包含本文描述的任何人工基因组DNA。
根据本发明，通过由核酸内切酶产生的双链断裂(DSB)促进同源重组。在某些实施方式中，核酸内切酶包含CRISPR/Cas9和一种或多种单指导RNA(简称“sgRNA”或“gRNA”)。在某些实施方式中，可通过导入编码CRISPR/Cas9的载体或编码序列和一种或多种sgRNA导入酶。在某些实施方式中，编码CRISPR/Cas9的载体或编码序列为CRISPR/Cas9 mRNA。
在某些实施方式中，可将分离的Cas9蛋白质直接导入到细胞中(例如，合子或ES细胞，通过显微注射或电穿孔)。Cas9蛋白质可呈Cas9核糖蛋白的形式，Cas9核糖蛋白为Cas9蛋白质/gRNA复合物。或者Cas9蛋白质可无任何gRNA，使得将Cas9蛋白质和一种或多种gRNA共同导入到合子或ES细胞中以允许Cas9蛋白质/gRNA复合物在细胞内原位形成。
在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统包含野生型Cas9。出于本申请的目的，Cas9蛋白质不限于化脓性链球菌中存在的野生型(wt)Cas9。其意在涵盖如图3中所示的(化脓性链球菌的)Cas9/Csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003和WO 2013/176772(通过引用并入本文)的SEQ ID NO：8；WO 2013/176772(通过引用并入本文)的氨基酸序列SEQ ID NO：1-256和795-1346中任一者中的相应部分；和来自化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜热链球菌和牙密螺旋体的正交Cas9序列的氨基酸序列中任一者中的相应部分(参见Esvelt et al.，Nature Methods，10(11)：1116-1121，2013，通过引用并入本文)。
可用于本发明中的其他合适的核酸内切酶可以是在特定位点处切割基因组的核酸内切酶，包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/cpf1、或兆核酸酶(如工程化兆核酸酶再工程化归巢核酸内切酶)或其组合。例如，可通过ZFN创建靠近近端区域和同源中心区域的接合点的DSB，并可通过CRISPR/Cas创建靠近远端区域和同源中心区域的接合点的DSB。
优选地，ZFN、TALEN、CRISPR/cpf1或兆核酸酶的切割和/或识别位点在距离近端区域和同源中心区域的接合点或距离远端区域和同源中心区域的接合点的短距离内。例如，所述短距离可在任一接合点的250bp、200bp、150bp、100bp、80bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或5bp内。在某些实施方式中，切割和/或识别位点在待删除的同源中心区域内。
为了用作用于本发明的方法中的核酸内切酶，需要Cas9蛋白质与gRNA形成功能复合物。
根据本发明的一个优选实施方式，在本发明的方法中使用四个特定的gRNA(即，两对)，每一个靶向待由大型外源基因组DNA替换的内源基因组DNA周围的特定Cas9切割位点。即，两个指导RNA(即，一对)靶向待删除的内源基因组DNA序列的近端，两个指导RNA(即，一对)靶向待删除的内源基因组DNA序列的远端。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但四个特定指导RNA的这种冗余对于大型外源基因组DNA的插入是有利的。一种似乎有理的解释是，两对指导RNA的组合活动导致更有效的双链断裂(DSB)产生或更持久的DSB存留。无论是更有效的双链断裂(DSB)产生还是更持久的DSB存留或是二者，都将改善大型外源基因组DNA通过同源重组的插入。
因此，在本发明的一个示例性实施方式中，提供了两对gRNA，包括：(1)引导CRISPR/Cas9以在内源基因组DNA的近端处或附近产生第一双链断裂(DSB)的第一对sgRNA(即，第一gRNA和第二gRNA)；和(2)引导CRISPR/Cas9以在内源基因组DNA的远端处或附近产生第二双链断裂(DSB)的第二对sgRNA(即，第三gRNA和第四gRNA)。
然而，在其他实施方式中，仅使用第一对gRNA之一，例如第一gRNA或第二gRNA，来引导CRISPR/Cas9以在内源基因组DNA的近端处或附近产生第一双链断裂(DSB)。
在相关的实施方式中，仅使用第二对gRNA之一，例如第三gRNA或第四gRNA，来引导CRISPR/Cas9以在内源基因组DNA的远端处或附近产生第二双链断裂(DSB)。
即，在某些实施方式中，使用一个gRNA以在内源基因组DNA的近端处或附近产生第一DSB，而使用两个gRNA以在内源基因组DNA的远端处或附近产生第二DSB。在某些其他实施方式中，使用两个gRNA以在内源基因组DNA的近端处或附近产生第一DSB，而使用一个gRNA以在内源基因组DNA的远端处或附近产生第二DSB。在又一些实施方式中，使用一个gRNA以在内源基因组DNA的近端处或附近产生第一DSB，并使用一个gRNA以在内源基因组DNA的远端处或附近产生第二DSB。
优选地，独立于用来产生DSB的gRNA的数量，在某些实施方式中，每一个gRNA基于它们与近端接合点或远端接合点的接近度独立地选择。即，第一gRNA和第二gRNA都可基于它们与近端接合点的接近度选择，而第三gRNA和第四gRNA都可基于它们与远端接合点的接近度选择。结果，由Cas9/第一gRNA和Cas9/第二gRNA产生的第一DSB最靠近近端接合点，而由Cas9/第三gRNA和Cas9/第四gRNA产生的第二DSB最靠近远端接合点。
独立于用来产生DSB的gRNA的数量，在某些其他实施方式中，gRNA不基于它们与近端或远端接合点的接近度独立地选择，而是基于它们的预测质量来选择，如由通过gRNA设计算法如可在http：//crispr.mit.edu获得的标准算法产生的得分所度量的。
gRNA的选择和设计可使用熟知的原理或在线工具基于用户输入如靶基因组和序列类型来进行。通常，gRNA是由Cas9-结合所必需的“支架”序列和限定待由靶向序列结合或修饰的基因组靶的用户定义的约20个核苷酸“间隔子”或“靶向”序列组成的短合成RNA。为简单起见，“gRNA靶向Cas9切割位点”是指gRNA的间隔子或靶向序列被设计为与基因组靶序列结合并在切割位点切割其。
优选地，靶向序列是足够独特的，使得理论上它与独特的(与基因组的其余部分相比)基因组靶序列结合。靶应当靠近地存在于原型间隔子邻近基序(或“PAM”序列)的上游(或5′)。PAM序列对于靶结合是绝对必需的，并且确切的序列取决于Cas9的物种。在最广泛使用的化脓性链球菌Cas9中，PAM序列为5′-NGG-3′(“N”表示4种标准核苷酸中的任何一种)。本领域已知用于不同物种中的另外的Cas9的其他PAM序列。参见下面列出的示例性PAM序列。
Cas9-gRNA复合物将结合具有PAM的任何靶基因组序列，但如果在gRNA间隔子和靶基因组序列之间存在足够的同源性，则Cas9将仅切割靶基因组序列。Cas9-介导的DNA切割的最终结果是靶基因组序列内在PAM序列上游约3-4个核苷酸的切割位点处的双链断裂(DSB)。
在某些实施方式中，第一gRNA和第二gRNA结合内源基因组DNA的不同链。
在某些实施方式中，第三gRNA和第四gRNA结合内源基因组DNA的不同链。
在某些实施方式中，第一gRNA和第二gRNA结合内源基因组DNA的相同链。
在某些实施方式中，第三gRNA和第四gRNA结合内源基因组DNA的相同链。
在某些实施方式中，任何选定的gRNA的切割位点在距离近端接合点(对于第一和第二gRNA)或远端接合点(对于第三和第四gRNA)约250bp内。优选地，切割位点对于第一和第二gRNA在距离近端接合点约100bp、50bp或10bp内并对于第三和第四gRNA在距离远端接合点约100bp、50bp或10bp内。
携带待递送至靶细胞的大型外源基因组DNA的BAC载体的导入可通过本领域技术人员已知的任何方法实现。
在某些实施方式中，携带大型外源基因组DNA的载体、Cas9蛋白质或编码序列和一种或多种sgRNA通过显微注射或电穿孔导入到合子中。
在某些实施方式中，大型外源基因组DNA上的异体基因可通过转染或电穿孔递送到ES细胞中，然后使用选择标志物筛选。
显微注射是用来向某些细胞(如合子)或早期胚胎中导入异体物质(例如，DNA、RNA和/或蛋白质)的熟知技术。在某些实施方式中，与Cas9蛋白质或编码序列和一种或多种sgRNA一道向合子中显微注射足够量的携带大型外源基因组DNA的BAC载体。
发现含BAC-载体和大型外源DNA的注射溶液的粘度对于进行成功的同源重组是必要的。注射溶液的粘度与含大型外源DNA的供体BAC-载体的量有关。优选地，使用约1-10ng/μL的最佳粘度的含大型外源基因组DNA的BAC进行显微注射，更优选2-8ng/μL，最优选约5ng/μL。
CRISPR/Cas9组分(Cas9编码序列和gRNA)和供体DNA(携带大型外源基因组DNA的BAC)的电穿孔可根据WO 2016/054032(通过引用并入本文)中描述的方法进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将ES细胞或合子转移到假孕雌性中。
在小鼠中，通过在自然发情期使6-8周龄雌性小鼠与输精管切除的雄性交配来制备假孕雌性。
用于同日转移至假孕雌性的处理的合子可以从培养物中移出，置于预加温的合适培养基(如M2培养基)中并经由输卵管转移到交配后0.5天的假孕雌性(9-11周龄)中。
一旦使用本发明的方法将大型外源基因组DNA插入到宿主哺乳动物中，就可在得到的转基因动物(例如，小鼠)或其后代中验证正确的基因组插入。
这样的验证通常包括以下中的一种或多种：对可能携带转基因的动物进行基因分型；接合序列的聚合酶链式反应扩增；基因组DNA的某些区段(如，在那里转基因插入到宿主基因组中的DNA接合序列)的直接测序，以及遗传作图以确定有关宿主基因组中的已知遗传标志物的插入位置。这样的技术是本领域熟知的。
实施例
本发明还通过以下实施例进一步说明。提供这些实施例是为了帮助理解本发明，并不构成对其的限制。
实施例1：通过CRISPR/Cas9-刺激的同源重组敲入25000个碱基对的BAC衍生基因组DNA
本实施例描述本文所述的本发明在使用来自人类基因组DNA片段的大型外源基因组DNA在10000至100000个碱基对(10至100kb)的程度上对小鼠基因组的特定区域进行人源化中的用途。更具体而言，本实施例提供了CRISPR-驱动的用相应的人类基因BCL2L11的直系同源、疾病相关25-kb片段替换(例如，人源化)小鼠肿瘤抑制基因Bcl2l11的大约17000个碱基对(17kb)片段。
a)来自人的大型外源基因组DNA
在这个案例中，从含有感兴趣的基因例如人BCL2L11基因的BAC克隆(人：文库RP11，克隆695-B-23)纯化BAC DNA。然后将经纯化的DNA电穿孔到重组基因大肠杆菌菌株SW102中。参见图1从顶部开始第三行，其显示了含有人类BCL2L11基因的人BAC。
b)使用细菌人工染色体(BAC)制备靶向载体
在这个案例中，从含有靶基因组基因座例如相应的小鼠Bcl2l11基因的BAC克隆(小鼠：文库RP23，克隆331-K-22)纯化BAC DNA。然后将经纯化的DNA电穿孔到重组基因大肠杆菌菌株SW102中。
使用下表1中描述的寡核苷酸扩增来自小鼠和人BAC的片段。
然后在引入到寡核苷酸(参见表1)中的位点处限制性消化来自小鼠和人BAC的扩增的基因组DNA片段，进行凝胶纯化，并如下装配成小质粒载体：
将片段KL和MN与PL452的含有新霉素抗性基因(NeoR)的EcoRI/BamHI片段一起克隆到经修饰以含有R6Kγ复制起点的pBluescript II载体(Agilent Technologies，SantaClara，CA USA)中。该质粒命名为pTLD01。
将片段CD、EF、GH和IJ与PL451的含有新霉素抗性基因(NeoR)的EcoRI/BamHI片段一起克隆到经修饰以含有R6Kγ复制起点的pBluescript II载体(Agilent Technologies，Santa Clara，CA USA)中。该质粒命名为pTLD02。
将片段OP、QR和ST与pTLD08(携带attB、attP和BsdR的PL452衍生物)的含有杀稻瘟菌素抗性基因(BsdR)的EcoRI/BamHI片段一起克隆到经修饰以含有R6Kγ复制起点的pBluescript II载体(Agilent Technologies，Santa Clara，CA USA)中。该质粒命名为pTLD03。
对于更大的插入基因组DNA，BAC可直接用于本文描述的方法。然而，在这种情况下，由于不需要BAC载体的全部容量，我们使用具有替代性载体(即，pBR322)骨架的载体的尺寸减小(从225kbp到70kbp)的版本。
具体而言，为减小构建体的尺寸，将片段AB和YZ与阴性可选择胸苷激酶(tk)基因一起克隆到基于pBR322的载体中。该质粒命名为pTLD11。
然后按以下步骤使用该pTLD11载体：
首先，用标准重组工程方法使用pTLD01质粒以正好在含有人BCL2L11的BAC中的2,903-bp缺失区域的远端放置侧翼为loxP的新霉素抗性盒(NeoR)。在将含有经修饰的人BCL2L11基因的BAC转移至表达Cre的大肠杆菌菌株SW106后，通过将细胞暴露于阿拉伯糖而除去Neo盒，剩下单个loxP位点。参见图1从顶部开始第三行和pTLD01质粒的结构，其示出了使用人KL和MN同源臂的同源重组方案。也参见图1第二行到最后一行，其示出了剩下的单个loxP位点。
接下来，用标准重组工程技术使用质粒pTLD02以正好在含有小鼠BCl2l11的BAC中的小鼠外显子2的远端放置人DNA的EF片段、loxP位点、侧翼为FRT的Neo盒和人DNA的GH片段。参见图1第四行左侧和pTLD02质粒的结构，其示出了使用小鼠CD和IJ同源臂的同源重组方案。
接下来，用标准重组工程技术使用质粒pTLD03以在上述含有pTLD02修饰小鼠Bcl2l11基因组DNA的BAC中的小鼠外显子4的稍远端放置人DNA的QR片段和侧翼为attB/attP的杀稻瘟菌素抗性(BsdR)盒。参见图1第四行右侧和pTLD03质粒的结构，其示出了使用小鼠OP和ST同源臂的同源重组方案。
接下来，用HindIII将质粒pTLD11线性化并用标准重组工程程序使用其以从上述含有pTLD02/pTLD03修饰小鼠Bcl2l11基因组DNA的BAC重新得到小鼠Bcl2l11基因的AB至YZ(AZ)片段，变成pTLD14。参见图1第四和第六行(即，pTLD11质粒的结构)，其示出了使用小鼠AB和YZ同源臂的同源重组方案。
所得载体pTLD14(参见图1第6行)含有整个小鼠Bcl2l11基因，以及pTLD02插入片段(即，人DNA的EF片段、loxP位点、侧翼为FRT的Neo盒和人DNA的GH片段)和pTLD03插入片段(人DNA的QR片段和侧翼为attB/attP的杀稻瘟菌素抗性(BsdR)盒)。
c)向靶向载体中插入大型外源基因组DNA
为开始组装我们的人源化供体载体，将质粒pTLD14纯化，用AscI消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分解其两个主要片段。弃去由AscI切割位点限定的两个线性片段中的较小者，及小鼠IL和OP基因组DNA片段。
将两个线性片段中的较大者进行凝胶纯化并电穿孔到上述含有loxP修饰人BAC克隆的重组大肠杆菌细胞中，从而捕获侧翼小鼠同源臂之间的27,282-bp人片段，变成质粒pTLD15(参见图1第3行和第4行)。
出于基于CRISPR/Cas9的合子的显微注射的目的，将最终的含有NeoR/BsdR的载体(质粒pTLD15)电穿孔；首先，电穿孔到表达FLP的大肠杆菌菌株SW105中以去除NeoR(制备质粒pTLD66)，接下来电穿孔到表达ΦC31重组酶的大肠杆菌菌株(SW105衍生物)中以去除BsdR。最终的载体命名为pTLD67，其含有侧翼为两个小鼠同源臂的27-kb外源人基因组DNA。参见图1中最后两行。
所得靶向载体(pTLD67)/供体分子含有侧翼为12,773-和26,632-bp同源臂的人BCL2L11基因的27,282-bp中心片段，所述同源臂分别由小鼠Bcl2l11基因的近端和远端区域组成。
所得靶向载体(pTLD67)/供体分子中至少有三个特征：1)被来自同源人基因BCL2L11的大型外源基因组DNA替换/人源化的小鼠Bcl2l11基因的18kb中心片段；2)可选择标志物最初被靠近地放置在人源化片段的5′和3′，但这样的可选择标志物在用于我们的基于CRISPR/Cas9的实验的最终pTLD67载体中被去除(相比之下，对于基于ES-细胞的传统方法，这样的选择标志物被保留，参见下面的对比实施例)；和3)人源化内含子之一内的2,903-bp区域侧翼为loxP位点，以建模在12％的东亚人群中观察到的与疾病相关的缺失。
然而，作为一般的方法，第一个特征不限于用共享序列同源性的外源基因组DNA替换内源基因组DNA。同时，第三个特征通常不需要，但对某些特定用途可以有用。
d)制备CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)
所有单指导RNA(sgRNA或gRNA)均采用标准方法设计，如在http：//crispr.mit.edu可得的算法。示于表2中的这些sgRNA是按照两个概念设计的。
第一，250-bp区域内两个得分最高的sgRNA(每个方向一个)是从被替换的小鼠Bcl2l11片段的17-kbp片段的5′和3′端两者选择。第二，最靠近被替换的片段的每个末端的两个内部sgRNA(每个方向一个)是不考虑其总体得分而选择。指导是根据Briner，et al.(Molecular cell.56(2)：333-339，2014，PubMed PMID：25373540，通过引用并入本文)的方法产生。Cas9 mRNA(CRISPR相关蛋白质9 mRNA、5-甲基胞苷、假尿苷)购自TriLinkBiotechnologies(San Diego，CA)。
总体而言，在待替换的小鼠Bcl2l11基因片段的每一端处设计了四个指导RNA，包括具有最高设计得分的两个(每个方向一个)和位于最靠近最外端处的两个(每个方向一个)。
e)Cas9编码序列
来自化脓性链球菌(SF370菌株)的CRISPR相关蛋白质9 mRNA/5-甲基胞苷/假尿苷(Cas9 mRNA/5meC/Ψ)得自TriLink Biotechnologies(San Diego，CA)并以约100ng/μL的最终浓度用于我们的显微注射混合物中。
f)靶向载体、CRISPR/Cas9gRNA和Cas9编码序列的显微注射虽然也可使用其他措施如电穿孔，但我们使用显微注射来向小鼠合子中导入含有大型外源人类基因组DNA的靶向载体和CRISPR/Cas9-gRNA。
为制备用于显微注射的小鼠合子，使C57BL6/J供体雌性小鼠(3周龄)超数排卵以使胚胎产量最大化。每一供体雌性腹膜内(IP)接受5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)(Prospect HOR-272)，47小时后接受5IU(IP)的人绒毛膜促性腺激素(hCG)(ProspecHOR-272)。在施用hCG后立即使雌性与C57BL6/J配种用雄性1∶1交配并在22小时后检查交配栓的存在。将显示交配栓的雌性处死，切除输卵管并置于M2培养基中。
在收集窝卵(clutch)之前，将输卵管置于含有透明质酸酶(Sigma H3506)(0.3mg/mL)的M2培养基中。通过以机械方式溶解壶腹来去除卵母细胞窝卵，并让窝卵在含有透明质酸酶的M2中孵育直至卵丘细胞团块已分解到足以暴露卵母细胞/未来的合子。通过用新鲜的M2洗涤数次来转移卵母细胞/未来的合子，然后(通过视觉分级过程)分离个体的识别的合子，并转移到已在COOK MINC台式孵育器(37℃，5％CO2/5％O2/氮气)中在矿物油(SigmaM8410)下平衡24小时的K-RCVL(COOK K-RVCL)培养基的微滴中。
如表3中所示制备显微注射混合物。对大约80个C57BL/6NJ合子进行显微注射(用每种上述显微注射混合物在一至两个技术重复中)。显微注射混合物含有四个指导(具有最高得分的那些或具有在待替换的小鼠Bcl2l11片段内的最末端位置的那些)以及不同浓度的供体DNA(1、5或10ng/μL)。
具体而言，从培养物中取出合子并将其置于含有150μL新鲜M2培养基的载玻片上。使用Eppendorf NK2显微操作器结合Narashige IM-5A注射器在Zeiss AxioObserver.D1上进行显微注射。遵循标准的合子显微注射程序，特别注意将材料沉积到受试合子的原核和细胞质两者中。使用WPI TW100F-4毛细玻璃和Sutter P97水平拉拔器每天另行拉动用于显微注射的针。从载玻片移出经注射的合子并通过三个30μL滴的经平衡的K-RCVL冲洗，然后将其置于单独的30μL微滴的经平衡的K-RCVL中，在那里它们随后被处理以于注射当天进行胚胎移植(经由输卵管)。
g)动物养殖
所有小鼠均得自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，在白松木刨花的床垫上居住，随意进食NIH-31 5K52(6％脂肪)饮食和酸化水(pH2.5至3.0)。所有实验均经杰克逊实验室机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准并遵守“实验动物护理和使用指南”(第8版)及所有适用法律法规进行。
h)制备假孕雌性
通过在自然发情期使6-8周龄雌性小鼠与输精管切除的雄性交配而准备假孕雌性。
将用于同日转移至假孕雌性的处理的合子从培养物中移出，置于含有900μL预加温的M2培养基的1.8mL顶部螺旋管(Thermo Scientific 363401)中以运送到手术站。从管移出合子并置于培养物(K-RCVL，在油下，-COOK MINC台式孵育器37℃，5％CO2/5％O2/氮气)中。转移时，将合子从培养物中移出，置于预加温的M2培养基中并经由输卵管转移到交配后0.5天的假孕CBYB6F1/J雌性(9-11周龄)中。
妊娠进行至正常分娩期并自然分娩幼仔。
i)向假孕雌性中植入显微注射的额合子
通过标准技术将上述显微注射的小鼠合子转移到假孕雌性，并使达到正常分娩期，那时它们由母鼠抚育直至在4周龄时断奶。
j)验证正确基因组插入-基因分型
使用表4中所述的寡核苷酸引物在设计的Cas9结合位点处对从1-细胞合子的显微注射(CRISPR方法)产生的潜在嵌合小鼠及其后代进行基因分型。如图2中所示，这些引物在设计成扩增横过以下位置的DNA的单独PCR反应中成对使用：1)完整(或含小INDEL的)小鼠等位基因的Cas9结合位点，2)人源化等位基因(或随机整合转基因)的小鼠/人接合点，和3)任何携带缺失的等位基因的断点。
k)验证正确基因组插入-Sanger测序
对于特定等位基因的更详细分析，对来自基因分型反应的PCR产物进行纯化并由JAX Scientific Services根据Sanger开发的方法测序。使用HighPrep PCR磁珠(MagBioGenomics，Gaithersburg，MD USA)纯化PCR产物。使用BigDye终止子循环测序试剂盒3.1版(Applied Biosystems，Foster City，CA USA)进行循环测序。
测序反应包含5μL经纯化的PCR产物(3-20ng)和1μL浓度为5pmol/μL的引物。使用HighPrep DTR(MagBio Genomics，Gaithersburg，MD USA)纯化测序反应产物。纯化反应在Applied Biosystems 3730xlDNA分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA USA)上进行。
序列数据使用测序分析软件5.2版(Applied Biosystems，Foster City，CA USA)进行分析。将所得序列(.abi)文件导入Sequencher 5.0.1版(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI USA)中以供进一步分析。
1)验证正确插入基因座-遗传作图
为了显示人BCL2L11片段确实已在直系同源Bcl2l11基因座中替换了其小鼠对应物，我们使用遗传作图来定位BCL2L11/Bcl2l11基因的人源化片段(图3A和3B)。
使用以下方法建立两个回交。首先，使FVB/NJ雌性与携带人源化片段的C57BL/6NJ雄性杂交以获得F1杂种(FVBB6NF1/J)后代。然后对这些后代进行基因分型以确定人源化片段的存在。使携带人序列的雄性(FVBB6NF1/J-BCL2L11)与FVB/NJ雌性或C57BL/6NJ雌性回交以产生N2后代。
这些回交方案可注释如下：
C57BL/6NJ×FVBB6NF1/J-BCL2L11
FVB/NJ×FVBB6NF1/J-BCL2L11
对来自每个回交的N2后代(以及适宜的对照)使用KASP-化学(LGC Limited，Teddington，UK)对在小鼠基因组上大致相等地分布的一组大约150个单核苷酸多态性(SNP)标志物进行基因分型。通过卡方(2)分析计算该组中每个标志物与人源化片段之间的一致性。
结果
1)成功的基因靶向
在正常分娩期时，共有94只幼仔出生；6只死产，6只未能生存到四周龄。对82只小鼠断奶并如表4中所示分配到实验中。
表3中所示实验3(最高得分指导，5ng/μL供体DNA)和实验5(最靠近端部的指导，10ng/μL供体DNA)两者导致在断奶年龄时没有剩余的存活幼仔。虽然有这些结果，但实验7(用与实验5相等的供体DNA浓度进行，即10ng/μL，参见表3)和实验8(实验3的重复，表3)分别产生7只和21只幼仔，这表明实验3和5中缺乏幼仔是由于技术失败而不是实验设计的任何系统性错误。
为了对这82个后代进行基因分型，设计PCR测定法以跨越每一个近端和远端小鼠/人接合点及跨越待替换的17-kbp小鼠区域。这些实验的结果示于表5中。如上所述，设计为跨越每一个近端和远端小鼠/人接合点的PCR测定法识别出对二者均为阳性的三只首建鼠(founder)(实验2，最靠近末端的指导，1ng/μL供体DNA；实验6，最靠近末端的指导，5ng/μL供体DNA；实验7，最高得分指导，10ng/μL供体DNA，参见表3)。设计为跨越待替换的17-kbp小鼠区域的PCR测定法识别出上述三只首建鼠中的两只(实验6，最靠近末端的指导，5ng/μL供体DNA；实验7，最高得分指导，10ng/μL供体DNA，表3)。
2)成功的种系传递
为进一步探索这些基因变化的遗传，我们将来自实验2、6和7的人插入/删除-阳性P0与C57BL/6J小鼠交配并对它们的后代进行基因分型。这些分析的结果示于表5中。
如所示，来自实验2(最靠近末端的指导，1ng/μL供体DNA)的人插入-阳性P0小鼠(雄性)未能将人源化等位基因传递给其29只N1后代中的任一只，表明P0小鼠是镶嵌的，具有主要由未经修饰的野生型细胞组成的种系。
相比之下，来自实验7(最高得分的指导，10ng/μL供体DNA)的人插入-和删除-阳性P0小鼠(雄性)将其携带缺失的等位基因传递给了其21只N1后代中的四只。然而，再次地，该P0小鼠也未将携带人插入片段的等位基因传递给这21只小鼠中的任一只，表明该P0小鼠是镶嵌的，具有由携带相对少的人插入片段的细胞组成的种系。
有趣的是，来自实验6(最靠近端部的指导，5ng/μL供体DNA)的人插入-和删除-阳性P0小鼠(雌性)将携带人插入片段的等位基因或携带缺失的等位基因传递给了其全部13只N1后代，但从未传递两者，意味着该动物作为在Bcl2l11基因座处具有携带人插入片段的等位基因和携带缺失的等位基因二者的基因型的真正杂合子繁殖。
三只选择的N1小鼠(两只携带人插入片段，一只携带缺失)的后续繁殖给出了与孟德尔法则预期一致的结果。使雄性与B6N.Cg-Tg(Sox2-Cre)1Amc/J雌性小鼠交配产生了如所设计的其中侧翼为loxP的2.9-kbp人内含子片段被删除的后代。
3)供体DNA(靶向载体中的外源DNA)的浓度和指导RNA位置影响效率
在其中在P0小鼠中检测到供体DNA的实验(表3的实验2、6和7)中，以1、5和10ng/μL的DNA供体浓度作为代表，但所得小鼠显示出不同程度的镶嵌性。在其中供体DNA浓度是在其最低处(1ng/μL)的实验2中，在N1后代中未检测到供体DNA(0/50)，表明供体DNA的整合发生在胚胎发育的多细胞阶段，并且确实获得供体DNA的那些细胞未在可察觉的水平上对种系作出贡献。
在其中供体DNA浓度是在中等水平处(5ng/μL)的表3实验6中，在全部N1后代中的几乎一半(14/31)中检测到供体DNA，表明供体DNA的整合发生在胚胎发育的单细胞(合子)阶段，该细胞产生种系的所有细胞，并且供体DNA在减数分裂过程中进入到成熟精子群体的一半中。这一结果与我们的假设一致：待替换的17-kbp小鼠片段的删除发生在合子中同源染色体中的Bcl2l11基因座处，并排斥DNA插入地传递给所有剩余的后代(17/17)。该结果与最佳期望结果完全一致，即其中P0合子发生双等位基因修饰，发育成无镶嵌性的小鼠，并将一个或另一个变体等位基因以相等数量(50％∶50％)传递给成熟精子群体。
在其中供体DNA浓度是在测试的最高水平处(10ng/μL)的表3实验7中，仅在全部N1后代中的25％中(14/56)检测到17-kbp缺失，并且P0小鼠中存在的供体DNA根本没有传递给N1代(0/56)。假设由此在单卵裂球中，在两细胞阶段时或附近，删除在一个Bcl2l11等位基因中发生，并且携带这种缺失的细胞产生大约一半的发育中的减数分裂前种系和四分之一的全部成熟(减数分裂后)生殖细胞的情况，这些结果可以得到解释。在胚细胞样转变中的某个后期时间点，可以假定供体DNA的插入发生，但在如此少的细胞中发生以致于不以可察觉的方式对种系作出贡献。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但表3的实验7中的许多方面可能对其不如最理想的结果作出贡献。
首先，由于其粘度，DNA浓度过高的供体DNA制剂可能不通过显微注射针有效地递送至合子，或以较不有利于促进Cas9活性和/或HDR的形式递送。
其次，为本实验设计的指导，尽管被设计为具有最佳得分，但不具有我们猜测的最佳位置，靠近待替换的小鼠DNA片段的末端。可能的是，在这种类型的实验中，指导位置代表比单独的指导得分更重要的设计参数。有趣的是，注意到在使用为高得分优化设计的指导的所有实验中，仅在其中供体DNA浓度处于测试的最高水平(10ng/μL)的实验7中才看到供体DNA导入的任何证据，并且甚至在此，其在P0首建鼠中明显处于如此低的水平，以致于不将经修饰的等位基因传递给N1小鼠。回想到，在前面提到的其中取得最佳结果的实验6中，供体DNA浓度仅为5ng/μL。在那种情况下看到的成功结果完全有可能是由优越地表现/定位(最接近末端)的指导驱动的，甚至在可证明是次优的供体DNA浓度下。比较实验6与实验7，有趣的是，注意到具有更高供体DNA浓度的实验(实验7，10ng/μL)确实取得了更高的导入率(作为活产小鼠的百分数，14.3％对5.6％)，但在重新得到的单只首建鼠中更低质量的等位基因修饰(与最大频率的经修饰等位基因两者的非镶嵌性/传递相比，低频率的仅一个经修饰等位基因的镶嵌性/传递)。
可以推测DNA浓度可能是与向个体合子中导入DNA有关的最重要的参数；然而，一旦供体DNA已进入细胞，指导设计可能被证明是促进更频繁的缺失形成和更有效的HDR的最重要因素。
4)外源DNA的整合发生在设计的基因座处
我们使用异型杂交-回交遗传作图策略作为定位BAC衍生人BCL2L11序列的插入位点的措施。分析来自C57BL/6NJ×(FVB/NJ×C57BL/6NJ)回交的22只N2后代和来自FVB/NJ×(FVB/NJ×C57BL/6NJ)回交的28只后代。数据分析证实了人BCL2L11片段与小鼠染色体2上的多个基因标志物之间的强连锁(参见图3A和3B)。
在与C57BL/6NJ的回交中，具有最强连锁的标志物：标志物rs13476756，具有6.58的对数让步比(log-odds ratio，LOD)(p＜0.004)。在与FVB/NJ的回交中，标志物rs13476756具有7.64的LOD得分(p＜0.0004)。
对个体单倍型(具体而言，样品261、263、266、303和319中的重组点)的分析进一步使小鼠染色体2(GRC38/mm10)上从标志物rs4223406(核苷酸113，827，352)到标志物rs3689600(核苷酸159，014，253)的45.2-Mbp区域的插入临界区域变窄，这与向从核苷酸128，126，038跨越到核苷酸128，162，547的36，510-bp小鼠Bcl2l11基因中的整合一致。
换句话说，该分析显示，小鼠Bcl2l11基因和工程化人序列两者必须共同定位于包含小于小鼠基因组的2％的区域内。我们得出结论：人序列的整合不是随机发生，而确实是如所设计的通过同源重组发生。
总之，上述实施例显示，可使用所描述的CRISPR/BAC技术来以定向方式向合子基因组中导入大型外源DNA(如与其小鼠对应物同源的25kb人基因)，并且如我们已通过PCR、序列和连锁分析所证实的，得到的转基因动物能够将该特定靶向的DNA通过种系传递传递给其后代。
实施例2：通过传统的基于ES细胞的同源重组敲入25000个碱基对的BAC衍生供体分子
与实施例1中描述的CRISPR/Cas9驱动方法相比，我们还使用了涉及经典ES细胞靶向、双重选择和重组酶驱动盒去除的传统方法。
除了以下具体步骤之外，该传统方法中的一般步骤基本上与实施例1中的那些相同。
b′)使用细菌人工染色体(BAC)制备靶向载体
在获得pTLD14质粒(参见实施例1)时，我们在基于杀稻瘟菌素的胚胎干(ES)细胞选择方面遇到了一些困难。因此，我们通过阴性可选择rpsL中间体用PuroR的开放阅读框(ORF)替换了BsdR的开放阅读框。
所得载体pTLD39含有侧翼为12,773-和26,632-bp同源臂的人BCL2L11基因的27,282-bp中心片段，所述同源臂分别由小鼠Bcl2l11基因的近端和远端区域组成。靠近该大型外源人基因组DNA的5′-端的是侧翼为FRT位点的NeoR盒。靠近该大型外源人基因组DNA的3′-端的是侧翼为attB和attP位点的PuroR盒。载体pTLD39在进行连续新霉素/嘌呤霉素选择的胚胎干细胞中表现良好。
f′)ES细胞靶向载体pTLD39的电穿孔
我们将25μg线性pTLD39 DNA电穿孔到小鼠胚胎干细胞的JM8-A3(品系：C57BL/6N)系的1.5×107个细胞中。然后将ES细胞接种在ES+2i培养基中，用庆大霉素(G418，200μg/mL，Gibco，Fisher Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)和嘌呤霉素(0.75μg/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)连续选择。
将存活的ES细胞克隆在ES+2i培养基上繁殖，进行核型分析，通过PCR进一步测试嘌呤霉素抗性盒的存在，并通过定量PCR评估同源臂、插入片段和新霉素抗性盒计数。将正确靶向的克隆显微注射到交配后3.5天(dpc)的囊胚中(参见下文)。
h′)向囊胚中注射电穿孔ES细胞，然后植入到假孕雌性中
将正确靶向的ES克隆显微注射到3.5-dpc囊胚中，然后通过标准技术将囊胚转移到假孕宿主母鼠。
使所得胚胎达到正常分娩期，幼仔自然分娩，并由母鼠抚育直至在4周龄时断奶。然后如实施例1中所述对幼仔进行基因分型、Sanger测序和遗传作图。
结果
在将pTLD39载体电穿孔到ES细胞的JM8-A3系中并在G418上选择后，我们通过PCR测定了89个存活克隆中嘌呤霉素抗性盒的存在。其中，二十七(27)个含有嘌呤霉素盒，并进行嘌呤霉素选择。其中，四(4)个克隆存活并通过定量PCR评估同源臂、插入片段和新霉素抗性盒计数。一(1)个克隆通过用于中心人BCL2L11片段正确靶向到内源小鼠Bcl2l11基因的所有这些测试。
将来自该克隆的ES细胞显微注射到囊胚中，产生九(9)只高质量嵌合体。使四只最高质量的雄性嵌合体与C57BL/6NJ雌性交配，产生人源化等位基因的种系传递的两个独立情况。虽然推测起来是相同的，但独立的系(遗传背景：C57BL/6JN)是从每一情况发展而来。使雄性与B6N.Cg-Tg(Sox2-Cre)1Amc/J雌性小鼠交配产生了如所设计的其中侧翼为loxP的2.9-kbp人内含子片段被删除的后代。
虽然出于理解的清楚的目的，已通过示意和实施例详细描述了前述发明，但本发明不限于所公开的特定实施方式，而是意在涵盖在如由附随的权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所有改变和修改。
本说明书中提及的所有出版物和专利都是本发明所属领域的技术人员的技术水平的指示。所有出版物和专利通过引用并入本文，其程度如同每个个体出版物或专利申请被具体且单独地指出通过引用并入一样。
表5：CRISPR-刺激的25000个碱基对的人BCL2l11对17000个碱基对的小鼠Bcl2l11的替换的总结
示出了从每一只首建鼠开始的种系传递以及人源化和携带缺失的等位基因的后续孟德尔法则遗传。

Claims (45)

1.一种在哺乳动物的细胞的基因组中通过同源重组插入大型外源基因组DNA以替换内源基因组DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供细菌人工染色体(BAC)；
(b)提供约10-300kb的大型外源基因组DNA；
(c)向所述BAC中插入所述大型外源基因组DNA，
其中所述大型外源基因组DNA的侧翼为约10-30kb的近端区域和约10-30kb的远端区域，和
其中所述近端区域和所述远端区域在所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA的侧翼；
(d)制备第一对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第一对包含第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离近端接合点约250bp内的第一Cas9切割位点和第二Cas9切割位点，其中所述近端区域在所述近端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(e)制备第二对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第二对包含第三gRNA和第四gRNA，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离远端接合点约250bp内的第三Cas9切割位点和第四Cas9切割位点，其中所述远端区域在所述远端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(f)提供Cas9蛋白质或能够产生所述Cas9蛋白质的Cas9编码序列；和
(g)向所述哺乳动物的所述细胞中导入：
(i)步骤(c)中的所述BAC；
(ii)步骤(d)中的所述第一对CRISPR/Cas9指导RNA；
(iii)步骤(e)中的所述第二对CRISPR/Cas9指导RNA；和
(iv)步骤(f)中的所述Cas9蛋白质或Cas9编码序列；
由此：
(i)所述第一对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述近端接合点处的所述第一和所述第二Cas9切割位点以产生第一双链断裂(DSB)；
(ii)所述第二对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述远端接合点处的所述第三和所述第四Cas9切割位点以产生第二DSB；和
(iii)所述大型外源基因组DNA在所述第一DSB和所述第二DSB处通过同源重组整合到所述细胞的所述基因组中以替换所述近端区域和所述远端区域之间的所述内源基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约15-200kb。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约20-100kb。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约25kb。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为合子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(g)通过显微注射进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约1-10ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约2-8ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约5ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为胚胎干细胞(ES细胞)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(g)通过电穿孔进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述BAC不携带选择标志物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA来自所述哺乳动物的相同物种的不同品系。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA来自所述哺乳动物的不同物种。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为小鼠。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二Cas9切割位点独立地在距离所述近端接合点约100bp、50bp或10bp内。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三和所述第四Cas9切割位点独立地在距离所述远端接合点约100bp、50bp或10bp内。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA结合所述内源基因组DNA的不同链。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA结合所述内源基因组DNA的不同链。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二Cas9切割位点为最靠近所述近端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三和所述第四Cas9切割位点为最靠近所述远端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
22.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中，所述Cas9蛋白质以包含所述第一gRNA、所述第二gRNA、所述第三gRNA或所述第四gRNA的复合物提供。
23.一种产生非人类哺乳动物的方法，所述非人类哺乳动物的细胞具有已通过同源重组替换内源基因组DNA的大型外源基因组，并能够通过种系传递所述大型外源基因组DNA，所述方法包括以下步骤：
(a)提供细菌人工染色体(BAC)；
(b)提供约10-300kb的大型外源基因组DNA；
(c)向所述BAC中插入所述大型外源基因组DNA，
其中所述大型外源基因组DNA的侧翼为约10-30kb的近端区域和约10-30kb的远端区域，和
其中所述近端区域和所述远端区域在所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA的侧翼；
(d)制备第一对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第一对包含第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离近端接合点约250bp内的第一Cas9切割位点和第二Cas9切割位点，其中所述近端区域在所述近端接合点处连接所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(e)制备第二对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第二对包含第三gRNA和第四gRNA，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离远端接合点约250bp内的第三Cas9切割位点和第四Cas9切割位点，其中所述远端区域在所述远端接合点处连接所述哺乳动物的所述基因组中的所述内源基因组DNA；
(f)提供Cas9蛋白质或能够产生所述Cas9蛋白质的Cas9编码序列；和
(g)向所述哺乳动物的合子中导入：
(i)步骤(c)中的所述BAC；
(ii)步骤(d)中的所述第一对CRISPR/Cas9指导RNA；
(iii)步骤(e)中的所述第二对CRISPR/Cas9指导RNA；和
(iv)步骤(f)中的所述Cas9蛋白质或Cas9编码序列；
(h)制备所述哺乳动物的相同物种的假孕雌性；
(j)向所述假孕雌性中植入所述合子以产下所述哺乳动物的后代。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约15-200kb。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约20-100kb。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约25kb。
27.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(g)用显微注射进行。
28.根据权利要求23所述的方法，其中关于所述大型外源基因组DNA，所述哺乳动物为半合子或纯合子。
29.根据权利要求23所述的方法，其中约50％或100％的所述哺乳动物的所述后代携带所述大型外源基因组DNA。
30.根据权利要求23所述的方法，如有必要，所述方法还包括产生关于所述大型外源基因组DNA为半合子或纯合子的所述哺乳动物的后代。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述BAC不携带选择标志物。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA来自所述哺乳动物的相同物种的不同品系。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA来自所述哺乳动物的不同物种。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物为小鼠。
35.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物为缺乏ES细胞技术的物种。
36.根据权利要求27所述的方法，其中所述显微注射使用约1-10ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述显微注射使用约2-8ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述显微注射使用约5ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。
39.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一和所述第二Cas9切割位点独立地在距离所述近端接合点约100bp、50bp或10bp内。
40.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三和所述第四Cas9切割位点独立地在距离所述远端接合点约100bp、50bp或10bp内。
41.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA结合所述内源基因组DNA的不同链。
42.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA结合所述内源基因组DNA的不同链。
43.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一和所述第二Cas9切割位点为最靠近所述近端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
44.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三和所述第四Cas9切割位点为最靠近所述远端接合点的两个潜在Cas9切割位点。
45.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(f)中，所述Cas9蛋白质以包含所述第一gRNA、所述第二gRNA、所述第三gRNA或所述第四gRNA的复合物提供。
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