CN114727592A - 高频率靶向动物转基因 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了使用例如Bxb1着陆垫进行高频小鼠转基因的方法和组合物。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2019年10月9日提交的美国临时申请号62/913,092的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
联邦政府赞助的研究
本发明是在美国国立卫生研究院授予的R24 OD016473和R21 OD023800的政府支持下完成的。政府对这项发明有一定的权利。
发明背景
基因组工程革命继续推动小鼠基因组的快速修饰，从而以前所未有的速度创造出更极致复杂的突变小鼠品种。虽然小基因组修饰简单而有效，但依赖同源重组来精确插入大型供体DNA仍然存在问题。生成人源化小鼠需要加入基因的控制区域，以重现预期的表达模式和功能。这是使用随机和固有的混乱转基因(transgenesis)的一个原因，而这种混乱转基因可能存在低效率、部分/不完全整合和多拷贝连环化的问题。这种插入通常沉积到活性基因座中，导致对转基因表达和无意中破坏的内源基因产生有害的位置效应。因此，大型转基因项目往往需要大量的表征时间和额外的繁育轮次。
发明概述
本公开证明使用Bxb1整合酶系统可实现将外源DNA到小鼠基因组中的大的、单拷贝插入。因此，在一些方面，本文提供的是利用基因编辑工具(例如，CRISPR/Cas9)和Bxbl整合酶的组合将大转基因的单拷贝插入到特定基因座中的系统。在存在Bxb1整合酶的情况下，attP位点与attB位点重组以将这些位点转化为attR(“右”)和attL(“左”)位点(图1)。在一些实施方式中，该系统不包含基因组中的质粒/细菌供体DNA载体序列整合，其证明导致转基因沉默。在此，30.6千碱基(kb)的人类DNA以11％的效率(4/35)整合至C57BL/6J小鼠Rosa26基因座中。令人惊讶的是，在显微注射日期起的3-6个月内，所有四个独立的系都证明了转基因等位基因的种系传递，没有脱靶污染。此外，该基因在肝脏中被适当地转录。这些结果证明了该系统能够在短时间内将完整的单拷贝转基因传递到确定的基因座中，从而提供精确的转基因，这是动物模型快速可靠的基因工程的强大工具。
在一些方面，本公开提供了在动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，例如，小鼠)基因组中大转基因(例如，长度至少20k碱基)的靶向插入，而具有基因组的有限脱靶修饰的方法。令人惊讶的是，经过基因工程改造以拥有Bxb1 att(附着位点)着陆垫的小鼠能够以高插入频率插入大型转基因。此外，不知道Bxb1系统在小鼠基因组中表现出假整合位点，特别是(参见，例如，Russell JP等BioTechniques2006；40:460-464)。
在一些实施方式中，本公开的Bxb1着陆垫小鼠品种通过原核显微注射CRISPR/Cas9基因编辑工具在小鼠中直接产生，所述CRISPR/Cas9基因编辑工具包含编码Cas9核酸酶(或其变体或同源物)的多核苷酸、靶向基因组基因座的向导RNA(gRNA)，例如安全港基因座(例如，Rosa26或Hip11基因座)，和(至少一个)单链DNA(ssDNA)，其包含侧翼是安全港基因座的同源臂的Bxb1附着位点。例如，使用这些CRISPR/Cas9基因编辑工具产生一种在基因组中几乎没有至没有脱靶变化(在预期的基因组基因座之外)的小鼠品系/品种。然后可以将已建立的Bxb1着陆垫小鼠品系用作插入和随后分析目的转基因的平台。例如，包含目的转基因和相应(同源)Bxb1附着位点的供体DNA可以与Bxb1整合酶(或编码Bxb1整合酶的多核苷酸)显微注射，以产生携带基因组整合的目的转基因的转基因小鼠。
本公开的一些方面提供在其基因组(例如，基因组基因座)内包含第一Bxb1附着位点(例如，attP或attB)和第二Bxb1附着位点(例如，修饰的attP*或修饰的attB*)的哺乳动物(或其他动物)。在一些实施方式中，哺乳动物进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸。例如，多核苷酸的侧翼可以是第一和第二Bxb1附着位点。因此，Bxb1整合酶可能是基因组编码的。
本公开的其他方面提供了哺乳动物胚胎(或其他动物胚胎)，其在基因组(例如，基因组基因座)内包含第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。在一些实施方式中，哺乳动物胚胎进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸侧翼为第一和第二Bxb1附着位点。
在一些实施方式中，第一Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点。在一些实施方式中，第二Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点。在一些实施方式中，第一和第二Bxb1附着位点相对于彼此是异源的。
在一些实施方式中，attP位点包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方式中，修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方式中，attB位点包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
在一些实施方式中，第一和第二Bxb1附着位点彼此分开50至500个核苷酸碱基。
在一些实施方式中，基因组基因座是安全港基因座，任选地是Rosa26基因座。可以靶向其他基因座。
在一些实施方式中，哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方式中，哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，例如小鼠胚胎或大鼠胚胎。可以使用其他哺乳动物和非哺乳动物。
本文还提供了方法，其包括将(a)包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列的供体多核苷酸，和(b)Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸，引入哺乳动物胚胎中。本文进一步提供了包括将供体多核苷酸引入哺乳动物胚胎中的方法，其中所述供体多核苷酸包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列。
在一些实施方式中，该方法进一步包括将哺乳动物胚胎植入假孕雌性哺乳动物中。在一些实施方式中，该方法进一步包括从雌性哺乳动物收集后代哺乳动物。在一些实施方式中，该方法进一步包括筛选后代哺乳动物是否存在整合到后代哺乳动物基因组中的目的序列。
在一些实施方式中，通过显微注射将供体多核苷酸、Bxb1整合酶和/或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。可以使用其他转染方法。
在一些实施方式中，目的序列包含目的基因。
在一些实施方式中，目的序列具有至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb或至少30kb的大小。
本公开的其他方面提供了用于产生Bxb1着陆垫哺乳动物的方法，该方法包括：(a)将(i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的多核苷酸，(ii)第一向导RNA(gRNA)或编码靶向哺乳动物胚胎中第一基因组位点(例如，基因座)的多核苷酸，(iii)包含侧翼为左同源臂和右同源臂的第一Bxb1附着位点的第一单链DNA(ssDNA)供体；任选地(iv)第二向导RNA(gRNA)或编码靶向哺乳动物胚胎中的第二基因组(例如，基因座)的gRNA的多核苷酸，和(v)包含其侧翼为左同源臂和右同源臂的第二Bxb1附着位点的第二ssDNA，引入哺乳动物胚胎中；和(b)将哺乳动物胚胎细胞植入假孕雌性哺乳动物中，其中假孕雌性哺乳动物能够生育后代哺乳动物。
在一些实施方式中，第一ssDNA进一步包含在第一Bxb1附着位点上游或下游的第二Bxb1附着位点，其中第一和第二Bxb1附着位点的侧翼是左同源臂和右同源臂。
在一些实施方式中，哺乳动物胚胎包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，或该方法进一步包括将编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。
在一些实施方式中，该方法进一步包括收集后代哺乳动物。
本公开的其他方面提供了包含本文所述哺乳动物胚胎的哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。
本公开的其他方面提供在其基因组(例如，基因组基因座)内包含单个Bxb1附着位点的哺乳动物或哺乳动物胚胎，以及生产和使用该哺乳动物或哺乳动物胚胎的方法。
附图简述
图1A-1C：Bxb1整合酶利用附着位点整合外源DNA(例如，attP与载体中的其交互attB位点一起选择性地置于基因组中)。在第一形式中(图1A)，基因组中的单一Bxb1附着位点用于将整个供体载体整合到基因组中。为了最小化不需要的质粒骨架的插入，首先将载体加工成微环。显示字母(ABC…)以展示序列定向。在第二形式中(图1B)，使用了两个Bxb1附着位点(除了赋予特异性的二核苷酸碱基之外相同)。使用这种策略，没有必要在交付前将供体质粒转化为微环。相反，双异源附着位点之间的重组(工程化/修饰，例如，使用可选的二核苷酸碱基对)起到排除质粒骨架整合到着陆垫中的作用。在第三形式中(图1C)，用转基因Bxb1蛋白“起动”受精卵以促进有效重组。侧翼为两个Bxb1附着位点，该Bxb1整合酶转基因在成功的Bxb1介导的供体序列替换后被消除。
图2A-2B：(图2A)显示为具有经典二核苷酸(GT)3'突出端的Bxb1附着位点序列。从上到下的序列是SEQ ID NO:11-18。(图2B)能够实现更大设计灵活性和序列修饰的可选的二核苷酸选择的非限制性列表。星号表示回文突出端(*)、相同的双碱基突出端(**)和经典突出端(***)。
图3：筛选策略的总结。用于识别和确认重组等位基因的序列的简单的基于PCR的筛选策略，以及着陆垫之外脱靶整合事件的检测的概述。
图4：长片段PCR确认敲入。使用长片段PCR分析来验证重组等位基因正确和完整的实例。与其中侧翼区域未知的随机转基因或其中长同源臂可能使这种类型的分析难以实现的同源重组不同，使用我们的系统生成的候选等位基因允许使用“In/Out”PCR策略进行长片段PCR验证。在该实施例中，几乎整个30.6kb的插入片段通过仅两个PCR捕获，其中每一个都有与转基因中的一个位点的一个引物结合(“In”)和与着陆垫邻近的基因组的另一个结合(“Out”)。
图5：RT-PCR确认转录。转基因按预期表达的证据是使用从肝脏提取的mRNA产生的，在这种情况下，肝脏是用于表达人类转基因，转化为cDNA，扩增和序列验证的预期组织。显示了与跨剪接位点的参考比对的示意图，以及来自三个独立创始品系的扩增子的琼脂糖凝胶电泳，表明人类来源的转录物得到了表达和适当的剪接。
图6：质粒整合到具有一个着陆垫的Bxb1小鼠(Bxb1v1)与具有两个着陆垫的Bxb1小鼠(Bxb1v2)中的效率。迄今为止在多种测试条件下使用Bxb1整合酶mRNA进行的所有实验的总结。对于四种形式1着陆垫品种(单attP位点)中的三种，产生了成功的重组等位基因。两种形式2(双attP位点)着陆垫小鼠品种都成功地产生了重组等位基因。在进行最多实验的背景下(B6)，双位点(形式2)系统的效率似乎比单位点形式(形式1)大约高3-4倍。
发明详述
历史上，已经通过胚胎干细胞操作或更常见的通过直接在受精卵中的随机转基因(并且仅非常少见地通过CRISPR介导的HDR)实现了在小鼠中大(>10kb)转基因的引入。靶向的转基因通常依赖于在供体转基因侧翼使用广泛的同源臂，从而产生甚至更大的载体大小。这种方法的使用在生产和处理方面提出了技术挑战，并且需要大量的下游工作来减轻任何意外后果。使用随机转基因创建的动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠)模型通常会受到位置效应的影响，例如，在整合位点处天然基因的破坏，以及异常的转基因表达水平。多拷贝多联体可导致大量过表达，或利用分散在基因组上的多个插入，导致转基因在育种过程中的分离，随后导致表达变化和所需表型的不稳定性。此外，同时包含来自质粒骨架的元件可能导致转基因沉默，从而使潜在哺乳动物模型的效用无效。
由Bxb1分枝杆菌噬菌体编码的丝氨酸重组酶为传统技术带来的许多挑战提供了解决方案，例如，小鼠基因组的大规模人源化。这种丝氨酸重组酶可用于将任何人类、小鼠(或任何其他物种)或合成的构建体引入哺乳动物基因组。在性质上，Bxb1整合酶的功能是在噬菌体(“attP”)与其细菌宿主(“attB”)的独特附着位点之间在其溶原期中进行DNA链交换。根据attP和attB位点的相对定向，该反应可导致识别位点之间的序列的切除、倒位或整合，并且是不可逆的，除非存在额外的蛋白质，即切除酶。每一个附着位点的长度小于50个核苷酸碱基对(bp)，使其易于用于分子克隆以及使用现在常见的基因编辑技术插入宿主基因组中。Bxb1整合酶在真核细胞中起作用，并且不需要任何额外的宿主因子以发挥作用。此外，它已被证明在细胞中以高效发挥作用，是单向的，并且在小鼠基因组中没有可检测的假位点。该系统导致其自身增强，因为附着位点中的两个中心二核苷酸单独负责重组事件的特异性(参见，例如，图2B)。这些组合属性使该系统可用于直接修饰哺乳动物(例如，小鼠)受精卵。
本公开描述了如何使用Bxb1整合酶系统工程设计在安全港基因座中具有“着陆垫”的小鼠品种。在一些实施方式中，这些品种能够以确定的方向引入单拷贝转基因而不污染重组等位基因中的载体序列。对重组等位基因的精确位置的了解，结合高效率，极大地有助于确定创始品种和随后的转基因验证。应当理解，虽然本公开描述了Bxb1整合酶系统如何用于工程改造小鼠品种，但它也可以用于改造其他动物，例如，具有“着陆垫”的其他哺乳动物(例如，非人类哺乳动物)。
Bxb1着陆垫品种的产生
Bxb1着陆垫动物是在其基因组中包含(至少一个)Bxb1附着位点(例如，attB位点、Bxb1 attP位点和/或其修饰形式)的动物。在一些实施方式中，动物基因组包含Bxb1 attP位点(SEQ ID NO:1)或修饰的Bxb1 attP*位点(SEQ ID NO:7)。在一些实施方式中，动物基因组包含Bxb1 attB位点(SEQ ID NO:2)或修饰的Bxb1 attB*位点(SEQ ID NO:8)。在图2B中提供了其他二核苷酸修饰的Bxb1附着位点的非限制性实例。动物可以是任何动物，例如实验室动物或家畜/农场动物。在一些实施方式中，动物是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是啮齿动物。啮齿动物可以是例如小鼠或大鼠。本文也考虑其他动物，例如家禽(例如，鸡)。
分枝杆菌噬菌体Bxb1编码的整合酶催化attP和attB之间的链交换，分别是噬菌体和细菌宿主的附着位点。尽管DNA位点相对较小(<50bp)，但反应对这些位点具有高度选择性，并且也是强方向性(参见，例如，Singh A等PLoS Genetics 2013；9(5):e1003490)。Bxb1attB位点显示至少7个独特和特定的最佳变异，加上内部二核苷酸识别序列中的另外9个次优变异，从而允许相同的Bxb1重组酶同时使用一系列不同的构建体，其中每一个都有其特定的二核苷酸地址(参见，例如，Ghosh P等J.Mol Biol.2006；349:331-348)。因此，本文考虑使用Bxb1 attP位点和修饰的attP*位点(例如，相对于SEQ ID NO:1的序列修饰的)，以及使用Bxb1 attB位点和修饰的attB*位点(例如，相对于SEQ ID NO:2的序列修饰的)。
应当理解，除非另有说明，否则Bxb1着陆垫动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠)品种可以包含Bxb1 attP位点、修饰的Bxb1 attP位点、Bxb1 attB位点，修饰的Bxb1 attB位点，或其任何组合。待插入Bxb1着陆垫中的相应供体多核苷酸应包含同源Bxb1附着位点。因此，如果Bxb1着陆垫动物品种包含Bxb1 attP位点，则待插入Bxb1着陆垫中的相应多核苷酸(例如，环状供体DNA)应包含Bxb1 attB位点；和如果Bxb1着陆垫动物品种包含Bxb1 attB位点，则待插入Bxb1着陆垫中的相应多核苷酸应包含Bxb1 attP位点。
在一些实施方式中，Bxb1附着位点位于安全港基因座中，该基因座是基因组的开放染色质区域。基因组安全港(GSH)是基因组中的位点，其能够以确保新插入的遗传元件(i)可预测地发挥功能和(ii)不导致宿主基因组的改变而对宿主细胞或生物体产生风险的方式适应新遗传物质的整合(参见，例如，Papapetrou EP和Schambach A Mol Ther 2016；24(4):678–684)。
如本文所提供的可使用的安全港基因座的非限制性实例包括Rosa26基因座、Hip11基因座、Hprt基因座和Tigre基因座。因此，在一些实施方式中，本公开的小鼠(或其他哺乳动物)品种的Rosa26基因座包含Bxb1 attP位点或修饰的attP*位点。在一些实施方式中，Rosa26基因座包含Bxb1 attB位点或修饰的Bxb1 attB*位点。在其他实施方式中，本公开的小鼠(或其他哺乳动物)品种的Hip11基因座包含Bxb1 attP位点或修饰的attP*位点。在一些实施方式中，Hip11基因座包含Bxb1 attB位点或修饰的attB*位点。在其他实施方式中，本公开的小鼠(或其他哺乳动物)品种的Hprt基因座包含Bxb1 attP位点或修饰的attP*位点。在一些实施方式中，Hprt基因座包含Bxb1attB位点或修饰的attB*位点。在其他实施方式中，本公开的小鼠(或其他哺乳动物)品种的Tigre基因座包含Bxb1 attP位点或修饰的attP*位点。在一些实施方式中，Tigre基因座包含Bxb1 attB位点或修饰的attB*位点。如本文所提供的可以使用其他安全港基因座。
在一些实施方式中，Bxb1附着位点位于或靠近内源基因的起始密码子(ATG)。例如，内源基因的正常转录调控元件可以通过在基因的起始密码子附近包含Bxb1附着位点来“拦截”，然后整合目的基因(通过Bxb1整合酶)使得目的基因的转录受内源基因转录调控元件的控制。
为了产生Bxb1着陆垫动物，可以使用(至少一个)单链DNA(ssDNA)供体。此ssDNA供体包含侧翼为同源臂的Bxb1附着位点(例如，Bxb1 attP位点或Bxb1 attB位点)。在一些实施方式中，ssDNA包含两个Bxbl附着位点(例如，Bxbl attP位点和修饰的Bxbl attP位点，或者Bxbl attB位点和修饰的Bxbl attB位点)。一个同源臂位于Bxb1附着位点的左侧(5′)(左同源臂)，另一个同源臂位于Bxb1附着位点的右侧(3′)(右同源臂)。同源臂是与位于基因组(例如，安全港)基因座中的基因组DNA区域同源的ssDNA区域。这些同源臂能够实现ssDNA供体和基因组基因座之间的同源重组，从而导致Bxb1附着位点插入基因组基因座中，如下所述(例如，通过CRISPR/Cas9-介导的同源定向修复(HDR))。
同源臂的长度可以不同。例如，每一个同源臂(左臂和右同源臂)可以具有20个核苷酸碱基至1000个核苷酸碱基的长度。在一些实施方式中，每一个同源臂具有20至200、20至300、20至400、20至500、20至600、20至700、20至800或20至900个核苷酸碱基的长度。在一些实施方式中，每一个同源臂的长度为20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个核苷酸碱基。在一些实施方式中，一个同源臂的长度不同于另一同源臂的长度。例如，一个同源臂可以具有20个核苷酸碱基的长度，而另一个同源臂可以具有50个核苷酸碱基的长度。在一些实施方式中，供体DNA是单链的。在一些实施方式中，供体DNA是双链的。
靶向Rosa26基因座的左和右同源臂的实例分别提供为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，ssDNA供体包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列(Bxb1 attP附着位点，侧翼为靶向Rosa26基因座的左和右同源臂)。在一些实施方式中，ssDNA供体包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列(修饰的Bxb1 attP*附着位点，侧翼为靶向Rosa26基因座的左和右同源臂)。
在一些实施方式中，本公开的小鼠和/或小鼠胚胎(或其他动物或动物胚胎)在小鼠/小鼠胚胎的基因组基因座中包含单个Bxb1附着位点。例如，Bxb1附着位点可以选自attP附着位点、修饰的attP*附着位点、attB附着位点和修饰的attB*附着位点。
在其他实施方式中，本公开的小鼠和/或小鼠胚胎(或其他动物或动物胚胎)在小鼠/小鼠胚胎的基因组基因座中包含两个(至少两个)Bxb1附着位点，其可在本文中称为第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。在一些实施方式中，第一和第二Bxb1附着位点选自attP附着位点、修饰的attP*附着位点、attB附着位点和修饰的attB*附着位点。第一和第二Bxb1附着位点可以彼此相邻(没有插入的核苷酸序列)，或者它们可以彼此隔开一定数量的核苷酸。分隔两个Bxb1附着位点的核苷酸的数量可以变化，条件是在一些实施方式中，每一个Bxb1附着位点在相同的安全港基因座内(例如，在Rosa26基因座内)。因此，在一些实施方式中，任何两个(例如，第一和第二)Bxbl附着位点彼此分开至少1、至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000个核苷酸碱基对(bp)。在一些实施方式中，任何两个(例如，第一和第二)Bxbl附着位点彼此分开1至500bp、1至1000bp、1至1500bp、1至2000bp、1至2500bp或1至3000个核苷酸碱基对(bp)。例如，任何两个Bxb1附着位点可以彼此分开1至450bp、1至400bp、1至350bp、1至300bp、1至250bp、1至200bp、1至150bp、1至100bp、1至50bp、5至450bp、5至400bp、5至350bp、5至300bp、5至250bp、5至200bp、5至150bp、5至100bp、5至50bp、10至450bp、10至400bp、10至350bp、10至300bp、10至250bp、10至200bp、10至150bp、10至100bp、10至50bp、50至450bp、50至400bp、50至350bp、50至300bp、50至250bp、50至200bp、50至150bp、50至100bp、100至450bp、100至400bp、100至350bp、100至300bp、100至250bp、100至200bp或100至150bp。
在一些实施方式中，本文提供的动物包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，例如基因组多核苷酸。在这样的实施方式中，多核苷酸的侧翼可以是Bxb1附着位点，使得多核苷酸在整合酶的表达和目的基因的基因组整合后被去除(参见，例如，图1C)。
在一些实施方式中，包含Bxb1附着位点的ssDNA供体的插入通过成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑来促进。CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA指导的DNA靶向平台。它依靠DNA核酸酶Cas9(CRISPR相关蛋白9)和非编码向导RNA(gRNA)来靶向DNA的切割。
在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(NGG PAM)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(NNGRRT或NNGRR(N)PAM)，尽管可以使用其他Cas9同源物、直向同源物和/或变体(例如，Cas9的进化形式)，如本文所提供。如本文提供的那样可以使用的RNA指导的核酸酶的其他非限制性实例包括Cpf1(TTN PAM)；SpCas9 D1135E变体(NGG(减少的NAG结合)PAM)；SpCas9 VRER变体(NGCG PAM)；SpCas9 EQR变体(NGAG PAM)；SpCas9 VQR变体(NGAN或NGNG PAM)；脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)(NM)Cas9(NNNNGATT PAM)；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(ST)Cas9(NNAGAAW PAM)；和密螺旋体(Treponema denticola)(TD)Cas9(NAAAAC)。
向导RNA(gRNA)将相关的RNA指导的核酸酶(例如Cas9)的活性引导至目标基因组内的特定靶序列。参见，例如，Jinek等，Science,337,816-821(2012)和Deltcheva等，Nature,471,602-607(2011)。gRNA至少包含与靶序列(在靶位点)杂交的间隔序列和CRISPR重复序列。在II型系统(例如，酿脓链球菌系统)中，gRNA包含tracrRNA(反式激活RNA)序列。在Type II系统中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型系统中，crRNA(CRISPR RNA)序列形成双链体。在这两个系统中，双链体结合RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)，从而gRNA和RNA指导的核酸酶形成复合物。在一些实施方式中，gRNA凭借其与RNA指导的核酸酶的相关性为复合物提供靶特异性。因此，gRNA指引RNA指导的核酸酶的活性。以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10提供了靶向Rosa26基因座的gRNA间隔区的实例。
可以使用其他基因组编辑技术，例如，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或锌指核酸酶(ZFN)。参见，例如，Joung JK等Nat Rev Mol Cell Biol.2013；14(1):49–55；Carroll D Genetics.2011；188(4):773–782；和Gaj T等Trends Biotechnol.2013；31(7):397–405。
转基因小鼠最通常通过将DNA显微注射(原核注射)到受精单细胞(1细胞)小鼠胚胎的原核中产生。如果DNA整合发生在第一次核分裂之前，那么一些或所有细胞将携带转基因。注射后，通过手术将卵子转移到同时-交配的假孕保姆雌畜的输卵管中，这些假孕保姆雌畜通过雌性与输精管切除的雄性交配产生。由携带转基因的注射卵子产生的后代称为创始者。
虽然以显微注射举例说明，但可以使用其他转染系统来产生本公开的BXb1着陆垫动物，例如，电穿孔(参见，例如，Wang W等J Genet Genomics 2016；43(5):319-27)、胚胎干细胞介导的基因转移和逆转录病毒介导的基因转移(参见，例如，Kumar TR等，Methods MolBiol.2009；590:335–362)，以及基于病毒的基因转移。
在一些实施方式中，基因转移发生在胚胎的单细胞阶段，其可以被称为受精卵。在其他实施方式中，基因转移发生在胚胎的后期多细胞阶段(两个或更多个细胞，也称为卵裂球)。在一些实施方式中，原核显微注射发生在合子阶段，随后是双细胞阶段的核注射(两次)。
在一些实施方式中，可以使用表达Cre重组酶依赖性Cas9表达的动物(例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠)品种。当注射共表达Cre和gRNA的病毒载体时，这些小鼠品种允许体内CRISPR基因编辑。病毒表达的Cre开启Cas9表达，这进而编辑一个或多个靶向的基因。此外，可以通过局部或全身注射Cas9和表达慢病毒或腺相关病毒的gRNA来完成小鼠体内基因编辑。
任何小鼠都可用于生成Bxb1着陆垫品种。小鼠品种的非限制性实例包括C57BL/6J小鼠(664)、C57BL/6NJ(5304)、FVB/NJ(1800)、B6D2(C57BL/6x DBA/2J)小鼠和NGSTM(NODscid gamma)小鼠(5557)或其变体。其他实例包括A/J(000646)、129S1/SvImJ(002448)、NOD/ShiLtJ(001976)、NZO/HiLtJ(002105)、CAST/EiJ(000928)、PWK/PhJ(003715)、WSB/EiJ(001145)、DBA2(000671)和协同杂交(CC)品种。
在一些实施方式中，产生Bxb1着陆垫动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，例如，小鼠)的方法可以包括分离受精的单细胞胚胎，并且用Cas9(例如，Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的DNA或mRNA)、gRNA(或编码gRNA的DNA)和靶向基因组基因座的，例如安全港基因座(例如，Rosa26基因座或其他开放染色质基因座)的ssDNA显微注射胚胎的原核或细胞质。然后可以将显微注射的胚胎转移至假孕雌性小鼠并直足月。假孕描述了一种假怀孕，其中除了受精卵的存在外，表现出所有怀孕的迹象和症状。小鼠在发情期(其中雌性用不育的雄性交配，导致不育交配)后变成假孕。在约2-3周龄时，可以从后代收集尾部活检，并通过聚合酶链式反应(PCR)、测序、Southern印迹和/或长片段测序系统(例如，PacBio)验证正确整合到安全港基因座中。然后携带所需整合的创始者小鼠繁殖以产生Bxb1着陆垫小鼠品种。
靶向的转基因整合
在一些实施方式中，Bxb1着陆垫动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠)可用于在动物基因组的Bxb1附着位点th引入目的基因。在一些实施方式中，目的基因存在于载体上。载体只是一种用作将外源遗传物质(例如，供体转基因)携带到宿主细胞(例如小鼠胚胎)中的媒介的DNA分子。在一些实施方式中，目的基因存在于环状供体多核苷酸上，例如质粒。在一些实施方式中，例如，当使用在其基因组中仅包含一个Bxb1附着位点的动物时，环状供体多核苷酸是DNA微环。DNA微环是小的(～4kb)环状载体骨架，具有>100bp至50kb的被环化的供体DNA。在一些实施方式中，DNA微环是已从所有原核载体部分释放的质粒衍生物(例如，不再包含含有抗生素抗性标记和/或细菌复制起点的细菌质粒骨架)。
产生DNA微环的方法是本领域众所周知的。例如，可以在表达位点特异性重组酶蛋白的专有大肠杆菌菌株中产生包含细菌骨架和真核插入物(包括待表达的转基因)的亲本质粒。重组位点位于亲本质粒中的真核插入物的侧翼，使得当通过例如但不限于阿拉伯糖诱导、葡萄糖诱导等的方法诱导重组酶蛋白(非Bxb1)的活性时，从真核插入物切除细菌骨架，从而产生真核DNA微环和细菌质粒。
在一些实施方式中，目的序列(例如基因)具有200碱基对(bp)至100千碱基(kb)的长度。在一些实施方式中，目的基因具有至少10kb的长度。例如，目的基因可以具有至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb或至少35kb的长度。在一些实施方式中，目的基因的长度为10至100kb、10至75kb、10至50kb、10至30kb、20至100kb、20至75kb、20至50kb、20至30kb、30至100kb、30至75kb或30至50kb。
在一些实施方式中，供体多核苷酸具有200bp至500kb、200bp至250kb或200bp至100kb的长度。在一些实施方式中，供体多核苷酸具有至少10kb的长度。例如，供体多核苷酸可以具有至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少50kb、至少100kb、至少200kb、至少300kb、至少400kb或至少500kb的长度。在一些实施方式中，供体多核苷酸具有10至500kb、20至400kb、10至300kb、10至200kb或10至100kb的长度。在一些实施方式中，供体多核苷酸具有10至100kb、10至75kb、10至50kb、10至30kb、20至100kb、20至75kb、20至50kb、20至30kb、30至100kb、30至75kb或30至50kb的长度。供体多核苷酸可以是环状的或线性的。
在一些实施方式中，将包含目的基因和相应的(同源的)Bxbl附着位点的供体多核苷酸引入(例如，通过显微注射)胚胎，例如单细胞胚胎(受精卵)中。也可以使用后期胚胎或动物。上文讨论了如本文所述使用的原核显微注射和其他基因转移方法。
在一些实施方式中，将供体多核苷酸与Bxb1整合酶蛋白、编码Bxb1整合酶蛋白的多核苷酸或者Bxb1整合酶蛋白和编码Bxb1整合酶蛋白的多核苷酸一起引入胚胎或动物中。多核苷酸可以是DNA或RNA(例如，mRNA)。
在将供体多核苷酸和Bxb1整合酶引入胚胎中后，可以将胚胎植入假孕雌性体内以产生包含目的基因的遗传修饰的后代动物，类似于上述育种过程。
在一些实施方式中，至少10％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，至少11％、至少12％、至少13％、至少14％或至少15％的遗传修饰后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，至少15％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的遗传修饰后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。例如，10％至50％、10％至40％、10％至30％或10％至20％的遗传修饰后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，大于50％(例如，55％、60％、65％或70％)的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因(或其中包含目的基因的供体多核苷酸)具有至少10kb的长度，并且至少10％的遗传修饰的后代动物包含正确整合到基因组基因座中的目的基因。例如，目的基因可以具有至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb或至少50kb的长度，和至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少10kb的长度，并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少10kb的长度并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少10kb的长度并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少10kb的长度并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少15kb的长度，并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少15kb的长度，并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少15kb的长度，并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少15kb的长度并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少20kb的长度并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少20kb的长度，并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少20kb的长度，并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少20kb的长度并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少25kb的长度，并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少25kb的长度，并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少25kb的长度并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少25kb的长度并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少30kb的长度并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少30kb的长度并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少30kb的长度并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少30kb的长度并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
在一些实施方式中，目的基因具有至少35kb的长度并且至少15％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少35kb的长度，并且至少20％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少35kb的长度，并且至少25％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。在一些实施方式中，目的基因具有至少35kb的长度，并且至少30％的遗传修饰的后代动物包含整合到基因组基因座中的目的基因。
另外的实施方式
在以下编号的段落中包含了另外的实施方式。
1.一种哺乳动物，在其基因组内包含第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。
2.如段落1的哺乳动物，其进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸侧翼为第一和第二Bxb1附着位点。
3.如段落1或2的哺乳动物，其中
第一Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；
第二Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；和
任选地，第一和第二Bxb1附着位点相对于彼此是异源的，并且任选地该基因组不包含attR和/或attL位点，例如，彼此相隔50至500个核苷酸碱基。
4.如段落3的哺乳动物，其中attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
5.如段落1-4中任一项所述的哺乳动物，其中所述第一和第二Bxb1附着位点彼此隔开50至500个核苷酸碱基。
6.如前述段落中任一项所述的哺乳动物，其中第一和第二Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
7.如前述段落中任一项所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
8.一种哺乳动物胚胎，在其基因组内包含第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。
9.如段落8的哺乳动物胚胎，进一步包含(a)Bxb1整合酶或(b)编码Bxb1整合酶的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸侧翼是第一和第二Bxb1附着位点。
10.如段落8或9的哺乳动物胚胎，其中
第一Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；
第二Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；和
任选地，第一和第二Bxbl附着位点相对于彼此是异源的，并且任选地基因组不包含attR和/或attL位点，例如，彼此相隔50至500个核苷酸碱基。
11.如段落10的哺乳动物胚胎，其中attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
12.如段落8-11中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述第一和第二Bxb1附着位点彼此隔开50至500个核苷酸碱基对。
13.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述第一和第二Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
14.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是单细胞胚胎或多细胞胚胎。
15.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
16.一种方法，包括
将(a)包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列的供体多核苷酸，和(b)Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入到前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎中。
17.一种方法，包括
将包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列的供体多核苷酸引入前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎中。
18.如段落16或17的方法，还包括将哺乳动物胚胎植入假孕雌性哺乳动物中。
19.如段落18的方法，进一步包括从雌性哺乳动物收集后代哺乳动物。
20.如段落19的方法，进一步包括筛选后代哺乳动物是否存在整合到后代哺乳动物基因组中的目的序列。
21.如前述段落中任一项所述的方法，其中通过显微注射将供体多核苷酸、Bxb1整合酶和/或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。
22.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述目的序列包含目的基因。
23.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述目的序列具有至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb或至少30kb的大小。
24.一种产生Bxb1着陆垫哺乳动物的方法，该方法包括：
(a)将(i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的多核苷酸，(ii)第一向导RNA(gRNA)或编码靶向哺乳动物胚胎中第一基因组位点的gRNA的多核苷酸，(iii)包含侧翼为左同源臂和右同源臂的第一Bxb1附着位点的第一单链DNA(ssDNA)供体；任选地(iv)第二向导RNA(gRNA)或编码靶向哺乳动物胚胎中的第二基因组的gRNA的多核苷酸，和(v)包含其侧翼为左同源臂和右同源臂的第二Bxb1附着位点的第二ssDNA，引入哺乳动物胚胎中；和
(b)将哺乳动物胚胎细胞植入假孕雌性哺乳动物中，其中假孕雌性哺乳动物能够生育后代哺乳动物。
25.如段落24的方法，其中所述第一ssDNA进一步包含位于所述第一Bxb1附着位点上游或下游的第二Bxb1附着位点，其中所述第一和第二Bxb1附着位点两者的侧翼为左同源臂和右同源臂。
26.如段落24或25的方法，其中哺乳动物胚胎包含Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸，或步骤(a)进一步包括将Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。
27.如段落24-26中任一项所述的方法，进一步包括收集后代哺乳动物。
28.如段落24-27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
29.一种哺乳动物，包含如段落8-14所述的哺乳动物胚胎。
30.如段落29的哺乳动物，其中哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
31.在其基因组内包含Bxb1附着位点的哺乳动物。
32.如段落31的哺乳动物，进一步包含Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸。
33.如段落31或32的哺乳动物，其中Bxb1附着位点是attP位点、修饰的attP*位点、attB位点或修饰的attB*位点。
34.如段落33的哺乳动物，其中attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
35.如前述段落中任一项所述的哺乳动物，其中所述Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
36.如前述段落中任一项所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地小鼠。
37.一种哺乳动物胚胎，在其基因组内包含Bxb1附着位点。
38.如段落37的哺乳动物胚胎，进一步包含Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸。
39.如段落37或38所述的哺乳动物胚胎，其中Bxb1附着位点是attP位点、修饰的attP*位点、attB位点或修饰的attB*位点。
40.如段落39的哺乳动物胚胎，其中attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，attB位点包含SEQ ID NO:2的序列和/或修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
41.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
42.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是单细胞胚胎或多细胞胚胎。
43.如前述段落中任一项所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
44.一种方法，包括
向如段落37-43中任一项所述的哺乳动物胚胎中引入(a)包含目的序列和同源Bxb1附着位点的供体多核苷酸，和(b)Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸。
45.一种方法，包括
向如段落37-43中任一项所述的哺乳动物胚胎中引入包含目的序列和同源Bxb1附着位点的供体多核苷酸。
46.如段落44或45所述的方法，进一步包括将哺乳动物胚胎植入假孕雌性哺乳动物中。
47.如段落46所述的方法，进一步包括从雌性哺乳动物收集后代哺乳动物。
48.如段落47所述的方法，进一步包括筛选后代哺乳动物是否存在整合到后代哺乳动物基因组中的目的序列。
49.如前述段落中任一项所述的方法，其中通过显微注射将供体多核苷酸、Bxb1整合酶和/或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。
50.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述供体多核苷酸是微环。
51.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述目的序列包含目的基因。
52.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述目的序列具有至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb或至少10kb的大小。
53.一种用于产生Bxb1着陆垫哺乳动物的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物胚胎中引入：
(i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的多核苷酸，
(ii)向导RNA(gRNA)或编码gRNA的多核苷酸，其靶向哺乳动物胚胎中的基因组位点，和
(iii)单链DNA(ssDNA)供体，其包含侧翼是左同源臂和右同源臂的Bxb1附着位点；和
(b)将哺乳动物胚胎细胞植入假孕雌性哺乳动物中，其中假孕雌性哺乳动物能够生育后代哺乳动物。
54.如段落53所述的方法，其中哺乳动物胚胎包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，或步骤(a)进一步包括将编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入哺乳动物胚胎中。
55.如段落54所述的方法，进一步包括收集后代哺乳动物。
56.如段落55所述的方法，其中哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
57.一种哺乳动物，其包含段落37-43所述的哺乳动物胚胎。
58.如段落57所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
实施例
实施例1.Bxb1小鼠–一个(attP)着陆垫
使用CRISPR/Cas9和寡核苷酸供体，我们将单个attP位点插入小鼠基因组(C57BL/6J、NSGTM、PWK/PhJ、DBA/2J、A/J、129S1/SvImJ或FVB/NJ小鼠品系)的Rosa26基因座中。
从C57BL/6J小鼠分离受精卵。向这些受精卵的原核显微注射(1)作为mRNA或蛋白质或者mRNA和蛋白质两者的Cas9(mRNA浓度范围为60-100ng/μL，蛋白质浓度范围为30-60ng/μL)，(2)gRNA(浓度范围为30-50ng/μL)，和(3)约200bp的ssDNA寡核苷酸，其靶向Rosa26基因座(SEQ ID NO:3)。该ssDNA寡核苷酸具有152个同源碱基(SEQ ID NO:4和5)，其侧翼为48个碱基对的Bxb1 attP位点(SEQ ID NO:2)。将显微注射的受精卵转移到假孕小鼠并进行至足月。在约2-3周龄时，从后代收集尾部活组织检查，并通过PCR和测序测试attP位点的正确整合。繁育携带Bxb1 attP位点的小鼠以产生Bxb1 attP小鼠品种。
然后将这些小鼠用作用于整合酶介导的与包含匹配同源attB位点的供体重组的接受体(图2A-2B)。为了避免从载体骨架插入DNA，在显微注射之前将质粒转化为微环(System Biosciences，LLC)。
从Bxb1 attP C57BL/6J小鼠品种分离受精卵。用100ng/μL的编码Bxb1整合酶的mRNA和1-10ng/μL的供体DNA显微注射这些受精卵的原核。供体DNA带有与宿主胚胎Bxb1attP位点匹配的Bxb1attB位点。供体DNA是使用本领域众所周知和已建立的技术的无细菌载体微环。将显微注射的受精卵转移到假孕小鼠并进行至足月。在>2-3周龄时，从后代收集尾部活检，并通过PCR和测序测试DNA的正确整合。
表1列出了此版本的结果。
表1.结果的总结
TG＝转基因阳性
实施例2.Bxb1小鼠–两个(attP)着陆垫
我们通过对版本1品系的序列修饰生成了版本2受体小鼠。同样，我们使用CRISPR/Cas9和寡核苷酸供体在距原始attP位点约240bp处插入第二attP*(修饰)位点。在修饰位点中，二核苷酸配对从GT变为GA。添加第二个位点允许排除载体骨架，而无需首先将供体构建体转化为微环(图1B)。应注意，虽然在该实施例中两个附着位点是顺序插入的，但可以使用例如单个供体多核苷酸同时插入它们。版本2小鼠还使得可能插入甚至更大片段的DNA，因为必需的attB位点可以简单地侧邻待整合的所需区域而放置到任何载体(包括BAC)中。
在创建具有大的敲入的小鼠时，筛选和验证可能是最大的挑战之一。然而，知道转基因的精确位置和方向允许通过PCR快速和直接地鉴定。图3概述了用于筛选的一般策略。
我们使用重组BAC(总大小33,939bp)插入30,570bp片段的人类基因组DNA测试了版本2小鼠。结果总结在表2中。
表2.结果的总结
我们测试了插入范围从1.5kb至30.6kb的各种长度的核酸的版本2的小鼠。结果总结在表3中。
表3.结果的总结
TG＝转基因阳性
将四个创始候选者与野生型小鼠回交，并评估N1后代的所需重组等位基因(REC)以及任何脱靶插入(OTI)事件的种系传递。四个创始者品系中的两个的后代也携带不希望的随机转基因等位基因。OTI和REC等位基因分离，表明插入事件没有关联。进行长片段PCR以确认整合的等位基因是完整的(图4)。
由于已知转基因在人类肝脏中具有高表达，因此来自四个种群中的三个的小鼠肝脏分离出RNA(来自第四个创始者的种群尚未达到足够的大小，因此不包含在这些测试中)。从总RNA制备cDNA，并从每一个品系产生1,270bp PCR产物(图5)。然后使用该产物的Sanger测序来确认转录本实际上是人源化等位基因。
序列
Bxb1 attP位点
GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACC(SEQ ID NO:1)
Bxb1 attP*位点
GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGACTCAGTGGTGTACGGTACAAACC(SEQ ID NO:7)
Bxb1 attB位点
GGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCAT(SEQ ID NO:2)
Bxb1 attB*位点
GGCTTGTCGACGACGGCGGACTCCGTCGTCAGGATCAT(SEQ ID NO:8)。
靶向Rosa26基因座的ssDNA–Bxb1 attP位点GAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTG(SEQ ID NO:3)
靶向Rosa26基因座的ssDNA–Bxb1 attP*位点GCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCTCGGAGTATTTTCCATCGGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGACTCAGTGGTGTACGGTACAAACCAGGTAGATTAAAGACATGCTCACCCGAGTT(SEQ ID NO:9)
C57BL6/J Rosa26基因座，5'左同源臂，用于插入Bxb1 attP位点GAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGAT(SEQ ID NO:4)
C57BL6/J Rosa26基因座，3'右同源臂，用于插入Bxb1 attP位点GGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTG(SEQ ID NO:5)
靶向C57BL/6J小鼠受精卵中Rosa26基因座的gRNA GUCUUUCUAGAAGAUGGG(SEQ IDNO:6)
靶向C57BL/6J小鼠受精卵中Rosa26基因座的gRNA GUCUUUAAUCUACCUCGA(SEQ IDNO:10)
参考引用
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本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用的方式并入每一个所引用的对象，在某些情况下，其可涵盖整个文件。
在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”，除非明确指出相反，应理解为“至少一个”。
还应该理解的是，除非有明确的相反指示，在本文要求保护的任何包含一个以上步骤或动作的方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语，例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”，等应被理解为是开放式的，即意味着包含但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures)第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭或半封闭过渡短语。
在数值之前的术语“大约”和“基本上”是指所列举数值的±10％。
在提供数值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的每一个值在本文中被具体考虑和描述。
Claims (58)
1.一种哺乳动物，在其基因组内包含第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。
2.如权利要求1所述的哺乳动物，进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸的侧翼为所述第一和第二Bxb1附着位点。
3.如权利要求1所述的哺乳动物，其中
所述第一Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；
所述第二Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；和
任选地，所述第一和第二Bxb1附着位点相对于彼此是异源的。
4.如权利要求3所述的哺乳动物，其中所述attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，所述修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，所述attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或所述修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
5.如权利要求1所述的哺乳动物，其中所述第一和第二Bxb1附着位点彼此分开50至500个核苷酸碱基。
6.如权利要求1所述的哺乳动物，其中所述第一和第二Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
7.如权利要求1所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
8.一种哺乳动物胚胎，在其基因组内包含第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。
9.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸的侧翼为所述第一和第二Bxb1附着位点。
10.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，其中
所述第一Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；
所述第二Bxb1附着位点选自attP位点、修饰的attP*位点、attB位点和修饰的attB*位点；和
任选地，所述第一和第二Bxb1附着位点相对于彼此是异源的。
11.如权利要求10所述的哺乳动物胚胎，其中所述attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，所述修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，所述attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或所述修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
12.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，其中所述第一和第二Bxb1附着位点彼此分开50至500个核苷酸碱基对。
13.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，其中所述第一和第二Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
14.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是单细胞胚胎或多细胞胚胎。
15.如权利要求8所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
16.一种方法，包括
将(a)包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列的供体多核苷酸，和(b)Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸，引入前述权利要求中任一项所述的哺乳动物胚胎中。
17.一种方法，包括
将包含侧翼为第一同源Bxb1附着位点和第二同源Bxb1附着位点的目的序列的供体多核苷酸引入前述权利要求中任一项所述的哺乳动物胚胎中。
18.如权利要求16所述的方法，还包括将所述哺乳动物胚胎植入假孕雌性哺乳动物中。
19.如权利要求18所述的方法，进一步包括从所述雌性哺乳动物收集后代哺乳动物。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包括筛选所述后代哺乳动物是否存在整合到所述后代哺乳动物的基因组中的所述目的序列。
21.如权利要求16所述的方法，其中通过显微注射将所述供体多核苷酸、所述Bxb1整合酶和/或所述编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入所述哺乳动物胚胎中。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述目的序列包含目的基因。
23.如权利要求16所述的方法，其中所述目的序列具有至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb或至少30kb的大小。
24.一种用于生产Bxb1着陆垫哺乳动物的方法，该方法包括：
(a)将(i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的多核苷酸，(ii)第一向导RNA(gRNA)或编码gRNA的多核苷酸，其靶向所述哺乳动物胚胎中的第一基因组位点，(iii)包含侧翼为左同源臂和右同源臂的第一Bxb1附着位点的第一单链DNA(ssDNA)供体；任选地(iv)第二向导RNA(gRNA)或编码gRNA的多核苷酸，其靶向所述哺乳动物胚胎中的第二基因组，和(v)包含侧翼为左同源臂和右同源臂的第二Bxb1附着位点的第二ssDNA，引入所述哺乳动物胚胎中；和
(b)将所述哺乳动物胚胎细胞植入假孕雌性哺乳动物中，其中所述假孕雌性哺乳动物能够生育后代哺乳动物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一ssDNA还包含位于所述第一Bxb1附着位点上游或下游的第二Bxb1附着位点，其中所述第一和第二Bxb1附着位点的侧翼是左同源臂和右同源臂。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，或步骤(a)还包括将编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入所述哺乳动物胚胎中。
27.如权利要求24所述的方法，进一步包括收集所述后代哺乳动物。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
29.一种哺乳动物，其包含如权利要求8所述的哺乳动物胚胎。
30.如权利要求29所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
31.一种哺乳动物，在其基因组内包含Bxb1附着位点。
32.如权利要求31所述的哺乳动物，进一步包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸。
33.如权利要求31所述的哺乳动物，其中所述Bxb1附着位点是attP位点、修饰的attP*位点、attB位点或修饰的attB*位点。
34.如权利要求33所述的哺乳动物，其中所述attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，所述修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，所述attB位点包含SEQ ID NO:2的序列，和/或所述修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
35.如权利要求31所述的哺乳动物，其中所述Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
36.如权利要求31所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
37.一种哺乳动物胚胎，在其基因组内包含Bxb1附着位点。
38.如权利要求37所述的哺乳动物胚胎，还包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸。
39.如权利要求37所述的哺乳动物胚胎，其中所述Bxb1附着位点是attP位点、修饰的attP*位点、attB位点或修饰的attB*位点。
40.如权利要求39所述的哺乳动物胚胎，其中所述attP位点包含SEQ ID NO:1的序列，所述修饰的attP*位点包含SEQ ID NO:7的序列，所述attB位点包含SEQ ID NO:2的序列和/或所述修饰的attB*位点包含SEQ ID NO:8的序列。
41.如权利要求37所述的哺乳动物胚胎，其中所述Bxb1附着位点在安全港基因座内，任选地在Rosa26基因座内。
42.如权利要求37所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是单细胞胚胎或多细胞胚胎。
43.如权利要求37所述的哺乳动物胚胎，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
44.一种方法，包括
将(a)包含目的序列和同源Bxb1附着位点的供体多核苷酸，和(b)Bxb1整合酶或编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入到如权利要求37-43中任一项所述的哺乳动物胚胎中。
45.一种方法，包括
向权利要求37-43中任一项所述的哺乳动物胚胎中引入包含目的序列和同源Bxb1附着位点的供体多核苷酸。
46.如权利要求44所述的方法，进一步包括将所述哺乳动物胚胎植入假孕雌性哺乳动物中。
47.如权利要求46所述的方法，进一步包括从所述雌性哺乳动物收集后代哺乳动物。
48.如权利要求47所述的方法，进一步包括筛选所述后代哺乳动物是否存在整合到所述后代哺乳动物基因组中的所述目的序列。
49.如权利要求44所述的方法，其中通过显微注射将所述供体多核苷酸、所述Bxb1整合酶和/或所述编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入所述哺乳动物胚胎中。
50.如权利要求44所述的方法，其中所述供体多核苷酸是微环。
51.如权利要求44所述的方法，其中所述目的序列包含目的基因。
52.如权利要求44所述的方法，其中所述目的序列具有至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb或至少10kb的大小。
53.一种用于产生Bxb1着陆垫哺乳动物的方法，该方法包括：
(a)向哺乳动物胚胎中引入：
(i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的多核苷酸，
(ii)向导RNA(gRNA)或编码gRNA的多核苷酸，其靶向哺乳动物胚胎中的基因组位点，和
(iii)单链DNA(ssDNA)供体，其包含侧翼是左同源臂和右同源臂的Bxb1附着位点；和
(b)将所述哺乳动物胚胎细胞植入假孕雌性哺乳动物中，其中所述假孕雌性哺乳动物能够生育后代哺乳动物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎包含编码Bxb1整合酶的多核苷酸，或步骤(a)进一步包括将编码Bxb1整合酶的多核苷酸引入所述哺乳动物胚胎中。
55.如权利要求54所述的方法，进一步包括收集所述后代哺乳动物。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎是啮齿动物胚胎，任选地是小鼠胚胎。
57.一种哺乳动物，包含如权利要求37所述的哺乳动物胚胎。
58.如权利要求57所述的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。
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