JP2022552283A - 高頻度標的化動物遺伝子導入 - Google Patents
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Abstract
本開示は、例えば、Ｂｘｂ１ランディングパッドを使用する、高頻度マウス遺伝子導入のための方法および組成物を提供する。本開示は、マウスゲノムへの外因性ＤＮＡの大きな単一コピー挿入が、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して達成可能であることを示す。従って、本明細書で提供されるのは、いくつかの局面において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）およびＢｘｂ１インテグラーゼの組み合わせを利用して、特異的遺伝子座への大きな導入遺伝子の単一コピーを挿入するシステムである。
Description
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年１０月９日出願の米国仮特許出願第６２／９１３，０９２号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年１０月９日出願の米国仮特許出願第６２／９１３，０９２号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
政府資金提供の研究
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＲ２４ ＯＤ０１６４７３およびＲ２１ ＯＤ０２３８００の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＲ２４ ＯＤ０１６４７３およびＲ２１ ＯＤ０２３８００の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
ゲノム工学の革命は、マウスゲノムの迅速な改変を推進し続けており、これまでより速く、的確に複雑な変異マウス系統を作り出している。小さなゲノム改変は、単純かつ効率的であるが、大きなドナーＤＮＡの正確な挿入のための相同組換えに対する信頼性は、問題のあるままである。ヒト化マウスの作製は、その意図した発現パターンおよび機能を再現するために、遺伝子の制御領域の組み込みを必要とする。これは、ランダムかつ本質的には無秩序な遺伝子導入の使用に関する１つの理由であり、これにより、低い効率、部分的／不完全な組み込み、およびマルチコピーコンカテマー化に悩まされ得る。このような挿入はしばしば、活性な遺伝子座に置かれ、導入遺伝子発現に対する有害な位置効果および意図せず破壊された内因性遺伝子（複数可）を生じる。結論として、大きなトランスジェニックプロジェクトはしばしば、実質的な特徴付けの時間および余分な回数の繁殖を必要とする。
ゲノム工学の革命は、マウスゲノムの迅速な改変を推進し続けており、これまでより速く、的確に複雑な変異マウス系統を作り出している。小さなゲノム改変は、単純かつ効率的であるが、大きなドナーＤＮＡの正確な挿入のための相同組換えに対する信頼性は、問題のあるままである。ヒト化マウスの作製は、その意図した発現パターンおよび機能を再現するために、遺伝子の制御領域の組み込みを必要とする。これは、ランダムかつ本質的には無秩序な遺伝子導入の使用に関する１つの理由であり、これにより、低い効率、部分的／不完全な組み込み、およびマルチコピーコンカテマー化に悩まされ得る。このような挿入はしばしば、活性な遺伝子座に置かれ、導入遺伝子発現に対する有害な位置効果および意図せず破壊された内因性遺伝子（複数可）を生じる。結論として、大きなトランスジェニックプロジェクトはしばしば、実質的な特徴付けの時間および余分な回数の繁殖を必要とする。
要旨
本開示は、マウスゲノムへの外因性ＤＮＡの大きな単一コピー挿入が、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して達成可能であることを示す。従って、本明細書で提供されるのは、いくつかの局面において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）およびＢｘｂ１インテグラーゼの組み合わせを利用して、特異的遺伝子座への大きな導入遺伝子の単一コピーを挿入するシステムである。Ｂｘｂ１インテグラーゼの存在下では、ａｔｔＰ部位をａｔｔＢ部位で組み換えて、上記部位をａｔｔＲ（「右側」）およびａｔｔＬ（「左型」）部位へと変換する（図１）。このシステムは、いくつかの実施形態において、ゲノムへのプラスミド／細菌ドナーＤＮＡベクター配列組み込み（これは、導入遺伝子サイレンシングを生じることが示されている）を排除する。本明細書において、３０．６キロベース（ｋｂ）のヒトＤＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＲｏｓａ２６遺伝子座へと、１１％ 効率（４／３５）で組み込んだ。驚くべきことに、全４つの独立した系（line）が、マイクロインジェクションの日から３～６ヶ月以内に、オフターゲット汚染（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）のないトランスジェニックアレルの生殖細胞系列伝達を示した。さらに、上記遺伝子は、肝臓において適切に転写される。これらの結果は、このシステムが、無傷の単一コピーの導入遺伝子を、短期間で規定の遺伝子座の中に送達する能力を示し、これは、正確な遺伝子導入、すなわち、動物モデルの迅速かつ信頼性の高い遺伝子工学のための強力なツールを提供する。
本開示は、マウスゲノムへの外因性ＤＮＡの大きな単一コピー挿入が、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して達成可能であることを示す。従って、本明細書で提供されるのは、いくつかの局面において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）およびＢｘｂ１インテグラーゼの組み合わせを利用して、特異的遺伝子座への大きな導入遺伝子の単一コピーを挿入するシステムである。Ｂｘｂ１インテグラーゼの存在下では、ａｔｔＰ部位をａｔｔＢ部位で組み換えて、上記部位をａｔｔＲ（「右側」）およびａｔｔＬ（「左型」）部位へと変換する（図１）。このシステムは、いくつかの実施形態において、ゲノムへのプラスミド／細菌ドナーＤＮＡベクター配列組み込み（これは、導入遺伝子サイレンシングを生じることが示されている）を排除する。本明細書において、３０．６キロベース（ｋｂ）のヒトＤＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＲｏｓａ２６遺伝子座へと、１１％ 効率（４／３５）で組み込んだ。驚くべきことに、全４つの独立した系（line）が、マイクロインジェクションの日から３～６ヶ月以内に、オフターゲット汚染（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）のないトランスジェニックアレルの生殖細胞系列伝達を示した。さらに、上記遺伝子は、肝臓において適切に転写される。これらの結果は、このシステムが、無傷の単一コピーの導入遺伝子を、短期間で規定の遺伝子座の中に送達する能力を示し、これは、正確な遺伝子導入、すなわち、動物モデルの迅速かつ信頼性の高い遺伝子工学のための強力なツールを提供する。
本開示は、いくつかの局面において、ゲノムの制限されたオフターゲット改変を有する、動物（例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス）のゲノムにおいて、大きな導入遺伝子（例えば、少なくとも２０キロベースの長さ）の標的化挿入のための方法を提供する。驚くべきことに、Ｂｘｂ１ ａｔｔ（付着部位）ランディングパッドを有するように遺伝子操作されたマウスは、高い挿入頻度で大きな導入遺伝子の挿入を可能にする。さらに、上記Ｂｘｂ１システムは、特に、マウスゲノムにおいて偽組み込み部位を示すことは知られていない（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＰら． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００６；４０：４６０－４６４を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本開示のＢｘｂ１ランディングパッドマウス系統は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（またはそのバリアントもしくはホモログ）をコードするポリヌクレオチド、ゲノム遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）（例えば、Ｒｏｓａ２６またはＨｉｐ１１遺伝子座）を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびセーフハーバー遺伝子座に対する相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位（複数可）を含む（少なくとも１つの）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ツールの前核マイクロインジェクションを通じて、マウスにおいて直接生成される。例えば、これらのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ツールの使用は、ゲノムにおいて（意図したゲノム遺伝子座を除いて）オフターゲット変化がほとんどないし全くないマウス系／系統を生じる。その樹立されたＢｘｂ１ランディングパッドマウス系は、次いで、目的の導入遺伝子の挿入およびその後の分析のためのプラットフォームとして使用され得る。例えば、目的の導入遺伝子および相当する（同族の）Ｂｘｂ１付着部位（複数可）を含むドナーＤＮＡを、Ｂｘｂ１インテグラーゼ（またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチド）をマイクロインジェクションして、ゲノムに組み込まれた目的の導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを産生することができる。
本開示のいくつかの局面は、そのゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座）内に第１のＢｘｂ１付着部位（例えば、ａｔｔＰまたはａｔｔＢ）および第２のＢｘｂ１付着部位（例えば、改変されたａｔｔＰ＊または改変されたａｔｔＢ＊）を含む哺乳動物（または他の動物）を提供する。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。上記ポリヌクレオチドは、例えば、第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれ得る。従って、上記Ｂｘｂ１インテグラーゼは、ゲノムによってコードされ得る。
本開示の他の局面は、そのゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座）内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む哺乳動物胚（または他の動物胚）を提供する。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで必要に応じて上記ポリヌクレオチドは、上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている。
いくつかの実施形態において、第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択される。いくつかの実施形態において、第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択される。いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種である。
いくつかの実施形態において、ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離されている。
いくつかの実施形態において、上記ゲノム遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座である。他の遺伝子座が標的化されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、齧歯類、例えば、マウスまたはラットである。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物胚は、齧歯類胚、例えば、マウス胚またはラット胚である。他の哺乳動物、および非哺乳動物が使用されてもよい。
哺乳動物胚に、（ａ）第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する方法がまた、本明細書で提供される。上記哺乳動物胚に、第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチドを導入する工程を包含する方法が、本明細書でさらに提供される。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記哺乳動物胚を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記雌性哺乳動物から、子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記子孫哺乳動物のゲノムに組み込まれた上記目的の配列の存在または非存在に関して、上記子孫哺乳動物をスクリーニングする工程をさらに包含する。
いくつかの実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチド、上記Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および／または上記Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して上記哺乳動物胚に導入される。他のトランスフェクション法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、目的の配列は、目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の配列は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、または少なくとも３０ｋｂのサイズを有する。
本開示のさらなる局面は、Ｂｘｂ１ランディングパッド哺乳動物を生成するための方法であって、上記方法は、（ａ）哺乳動物胚に、（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または上記哺乳動物胚における第１のゲノム部位（例えば、遺伝子座）を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第１のＢｘｂ１付着部位を含む第１の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー；必要に応じて（ｉｖ）第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または上記哺乳動物胚における第２のゲノム部位（a second genomic）（例えば、遺伝子座）を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｖ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第２のＢｘｂ１付着部位を含む第２のｓｓＤＮＡを導入する工程；ならびに（ｂ）上記哺乳動物胚細胞を偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで上記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある方法を提供する。
いくつかの実施形態において、第１のｓｓＤＮＡは、上記第１のＢｘｂ１付着部位から上流または下流に第２のＢｘｂ１付着部位をさらに含み、ここで上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位はともに、上記左側の相同性アームおよび上記右側の相同性アームに挟まれている。
いくつかの実施形態において、哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または上記方法は、上記哺乳動物胚に、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する。
本開示のさらなる局面は、本明細書で記載される哺乳動物胚を含む哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を提供する。
本開示の他の局面は、そのゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座）内に単一のＢｘｂ１付着部位を含む哺乳動物または哺乳動物胚を提供する、ならびに上記哺乳動物または哺乳動物胚を生成および使用する方法を提供する。
詳細な説明
歴史的には、マウスにおける大きな（＞１０キロベース）導入遺伝子の導入は、胚性幹細胞操作またはより一般にはランダム遺伝子導入のいずれかによって（そしてごく稀に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＤＲによって）、接合子において直接達成されてきた。標的化遺伝子導入は、代表的には、上記ドナー導入遺伝子に隣接する広範囲にわたる相同性アームの使用に依拠し、これは、さらにより大きなベクターサイズを生じる。このような方法の使用は、生成および取り扱いにおける技術的困難を表し、任意の意図しない結果を軽減するために高価な下流の作業を必要とする。ランダム遺伝子導入を使用して作り出した動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）モデルは、しばしば、位置的効果、例えば、組み込みの部位における天然の遺伝子の破壊、および異常な導入遺伝子発現レベルを被る。マルチコピーコンカテマーは、多大な過剰発現をもたらし得るか、または多数の挿入がゲノムにわたって点在した状態になる可能性があり、これは、その後の発現の変化および必要とされる表現型の不安定性を伴って、繁殖の間に上記導入遺伝子の分離をもたらし得る。さらに、プラスミド骨格に由来するエレメントを同時に含むことで、導入遺伝子サイレンシングが生じ、潜在的な哺乳動物モデルの有用性を無効にする可能性がある。
歴史的には、マウスにおける大きな（＞１０キロベース）導入遺伝子の導入は、胚性幹細胞操作またはより一般にはランダム遺伝子導入のいずれかによって（そしてごく稀に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＤＲによって）、接合子において直接達成されてきた。標的化遺伝子導入は、代表的には、上記ドナー導入遺伝子に隣接する広範囲にわたる相同性アームの使用に依拠し、これは、さらにより大きなベクターサイズを生じる。このような方法の使用は、生成および取り扱いにおける技術的困難を表し、任意の意図しない結果を軽減するために高価な下流の作業を必要とする。ランダム遺伝子導入を使用して作り出した動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）モデルは、しばしば、位置的効果、例えば、組み込みの部位における天然の遺伝子の破壊、および異常な導入遺伝子発現レベルを被る。マルチコピーコンカテマーは、多大な過剰発現をもたらし得るか、または多数の挿入がゲノムにわたって点在した状態になる可能性があり、これは、その後の発現の変化および必要とされる表現型の不安定性を伴って、繁殖の間に上記導入遺伝子の分離をもたらし得る。さらに、プラスミド骨格に由来するエレメントを同時に含むことで、導入遺伝子サイレンシングが生じ、潜在的な哺乳動物モデルの有用性を無効にする可能性がある。
Ｂｘｂ１マイコバクテリオファージによってコードされるセリンリコンビナーゼは、旧来の技術（例えば、マウスゲノムの大規模なヒト化）によって引きおこされた難題のうちの多くに対する解決策を提供する。このセリンリコンビナーゼは、哺乳動物のゲノムへの任意のヒト、マウス（または任意の他の種）の、または合成構築物の導入のために使用され得る。本質的には、上記Ｂｘｂ１インテグラーゼは、その溶原相の間に、ファージ（「ａｔｔＰ」）およびその細菌宿主（「ａｔｔＢ」）における特有の付着部位間でのＤＮＡ鎖交換を行うように機能する。ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位の相対的配向に依存して、その反応は、その認識部位の間で配列の切除、反転または組み込みを生じ得、さらなるタンパク質、切除酵素（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）が存在しなければ、可逆的ではない。各付着部位は、長さが＜５０ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）であり、分子クローニングにおいて、および現在では一般的な遺伝子編集技術を使用して、宿主ゲノムへの挿入に関して使用しやすくする。上記Ｂｘｂ１インテグラーゼは、真核生物細胞において機能し、機能するためにいかなるさらなる宿主因子をも必要としない。さらに、それは、細胞において高効率で機能することが示されており、一方向性であり、マウスゲノムの中に検出可能な偽部位を有しない。上記システムはまた、増強にふさわしい。なぜなら上記付着部位における２つの中心的なジヌクレオチドは、組換え事象の特異性を担っているに過ぎないからである（例えば、図２Ｂを参照のこと）。これらの併せ持った属性によって、このシステムは、哺乳動物（例えば、マウス）接合子を直接改変するために有用になる。
本開示は、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して、どのようにしてセーフハーバー遺伝子座における「ランディングパッド」でマウス系統を操作するかを記載する。これらの系統は、いくつかの実施形態において、組換えアレルにおけるベクター配列と夾雑することなしに、規定された配向において単一コピーの導入遺伝子の導入を可能にする。上記組換えアレルの正確な位置の知識は、高い効率と合わさって、初代の同定および上記導入遺伝子のその後の検証を大いに補助する。本開示は、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して、マウス系統をどのように操作したかを記載するが、それを使用して、他の動物、例えば、他の哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を「ランディングパッド」でどのように操作し得るかは、理解されるべきである。
Ｂｘｂ１ランディングパッド系統の生成
Ｂｘｂ１ランディングパッド動物は、そのゲノム内に（少なくとも１つの）Ｂｘｂ１付着部位（例えば、ａｔｔＢ部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位、および／またはその改変されたバージョン）を含む動物である。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位（配列番号１）または改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＰ＊部位（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位（配列番号２）または改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ＊部位（配列番号８）を含む。他のジヌクレオチド改変されたＢｘｂ１付着部位の非限定的な例は、図２Ｂの中に提供される。上記動物は、任意の動物（例えば、実験動物または家畜／農場動物）であり得る。いくつかの実施形態において、上記動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、齧歯類である。上記齧歯類は、例えば、マウスまたはラットであり得る。他の動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）はまた、本明細書で企図される。
Ｂｘｂ１ランディングパッド動物は、そのゲノム内に（少なくとも１つの）Ｂｘｂ１付着部位（例えば、ａｔｔＢ部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位、および／またはその改変されたバージョン）を含む動物である。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位（配列番号１）または改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＰ＊部位（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位（配列番号２）または改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ＊部位（配列番号８）を含む。他のジヌクレオチド改変されたＢｘｂ１付着部位の非限定的な例は、図２Ｂの中に提供される。上記動物は、任意の動物（例えば、実験動物または家畜／農場動物）であり得る。いくつかの実施形態において、上記動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、齧歯類である。上記齧歯類は、例えば、マウスまたはラットであり得る。他の動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）はまた、本明細書で企図される。
マイコバクテリオファージＢｘｂ１によってコードされるインテグラーゼは、それぞれ、上記ファージおよび細菌宿主に関する付着部位である、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の鎖交換を触媒する。上記ＤＮＡ部位は、比較的小さい（＜５０ｂｐ）が、上記反応は、これらの部位に関して非常に選択的であり、強く方向性でもある（例えば、Ｓｉｎｇｈ Ａら． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１３； ９（５）： ｅ１００３４９０を参照のこと）。上記Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位は、少なくとも７つの特有かつ特異的な最適バリエーション、加えて、内部のジヌクレオチド認識配列におけるさらなる９つの最適未満のバリエーションを示し、同じＢｘｂ１リコンビナーゼ酵素が、各々、その特異的なジヌクレオチドアドレスを持つ一連の異なる構築物を同時に使用することを可能にする（例えば、Ｇｈｏｓｈ Ｐら． Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００６；３４９：３３１－３４８を参照のこと）。従って、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位および改変されたａｔｔＰ＊部位（例えば、配列番号１の配列に対して改変されている）の使用、ならびにＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位および改変されたａｔｔＢ＊部位（例えば、配列番号２の配列に対して改変されている）の使用が、本明細書で企図される。
別段注記されなければ、Ｂｘｂ１ランディングパッド動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）系統が、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位、改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位、改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位、またはこれらの任意の組み合わせを含み得ることは、理解されるべきである。上記Ｂｘｂ１ランディングパッドへと挿入されるべき相当するドナーポリヌクレオチドは、同族Ｂｘｂ１付着部位（複数可）を含むべきである。従って、上記Ｂｘｂ１ランディングパッド動物系統が、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位を含む場合、上記Ｂｘｂ１ランディングパッドへと挿入されるべき相当するポリヌクレオチド（例えば、環状ドナーＤＮＡ）は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位を含むべきである；そして上記Ｂｘｂ１ランディングパッド動物系統がＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位を含む場合、上記Ｂｘｂ１ランディングパッドへと挿入されるべき相当するポリヌクレオチドは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位を含むべきである。
上記Ｂｘｂ１付着部位（複数可）は、いくつかの実施形態において、セーフハーバー遺伝子座に位置し、この遺伝子座は、ゲノムのオープンクロマチン領域である。ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）は、新たな遺伝物質の組み込みを、その新たに挿入された遺伝的エレメントが、（ｉ）予測されるように機能する、および（ｉｉ）宿主細胞または生物にリスクを課す宿主ゲノムの変化を引きおこさないことを確実にする様式で適応し得るゲノム中の部位である（例えば、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ＥＰ ａｎｄ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ Ａ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１６； ２４（４）： ６７８－６８４を参照のこと）。
本明細書で提供されるように使用され得るセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、Ｈｉｐ１１遺伝子座、Ｈｐｒｔ遺伝子座、およびＴｉｇｒｅ遺伝子座が挙げられる。従って、いくつかの実施形態において、本開示のマウス（または他の哺乳動物）系統のＲｏｓａ２６遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位または改変されたａｔｔＰ＊部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位または改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ＊部位を含む。他の実施形態において、本開示のマウス（または他の哺乳動物）系統のＨｉｐ１１遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位または改変されたａｔｔＰ＊部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｈｉｐ１１遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位または改変されたａｔｔＢ＊部位を含む。なお他の実施形態において、本開示マウス（または他の哺乳動物）系統のＨｐｒｔ遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位または改変されたａｔｔＰ＊部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｈｐｒｔ遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位または改変されたａｔｔＢ＊部位を含む。さらに他の実施形態において、本開示のマウス（または他の哺乳動物）系統のＴｉｇｒｅ遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位または改変されたａｔｔＰ＊部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｔｉｇｒｅ遺伝子座は、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位または改変されたａｔｔＢ＊部位を含む。他のセーフハーバー遺伝子座が、本明細書で提供されるように使用されてもよい。
Ｂｘｂ１付着部位（複数可）は、いくつかの実施形態において、内因性遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）に位置するかまたはその付近に位置する。例えば、内因性遺伝子の通常の転写調節エレメントは、遺伝子の開始コドン付近にＢｘｂ１付着部位を含め、次いで、目的の遺伝子の転写が、内因性遺伝子の転写調節エレメントの制御下にあるように、目的の遺伝子を（Ｂｘｂ１インテグラーゼを介して）組み込むことによって、「遮断され（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｅｄ）」得る。
Ｂｘｂ１ランディングパッド動物を生成するために、１つの（少なくとも１つの）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナーが使用され得る。このｓｓＤＮＡドナーは、相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位（複数可）（例えば、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位またはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｓＤＮＡは、２つのＢｘｂ１付着部位（例えば、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位および改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位、またはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位および改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位）を含む。一方の相同性アームは、Ｂｘｂ１付着部位（複数可）の左側（５’）に位置し（左側の相同性アーム）、もう一方の相同性アームは、Ｂｘｂ１付着部位（複数可）の右側（３’）に位置する（右側の相同性アーム）。相同性アームは、ゲノム（例えば、セーフハーバー）遺伝子座に位置したゲノムＤＮＡの領域に相同なｓｓＤＮＡの領域である。これらの相同性アームは、ｓｓＤＮＡドナーとゲノム遺伝子座との間の相同組換えを可能にし、以下で考察されるように、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して）、ゲノム遺伝子座へのＢｘｂ１付着部位（複数可）の挿入を生じる。
相同性アームは、長さが変動し得る。例えば、各相同性アーム（左側のアームおよび右側の相同性アーム）は、２０ヌクレオチド塩基～１０００ヌクレオチド塩基の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、各相同性アームは、２０～２００個、２０～３００個、２０～４００個、２０～５００個、２０～６００個、２０～７００個、２０～８００個、または２０～９００個のヌクレオチド塩基の長さを有する。いくつかの実施形態において、各相同性アームは、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個、または１０００個のヌクレオチド塩基の長さを有する。いくつかの実施形態において、一方の相同性アームの長さは、他方の相同性アームの長さとは異なる。例えば、一方の相同性アームは、２０個のヌクレオチド塩基の長さを有し得、他方の相同性アームは、５０個のヌクレオチド塩基の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、上記ドナーＤＮＡは、１本鎖である。いくつかの実施形態において、上記ドナーＤＮＡは、２本鎖である。
Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とする左側および右側の相同性アームの例は、それぞれ、配列番号４および配列番号５として提供される。いくつかの実施形態において、上記ｓｓＤＮＡドナーは、配列番号３のヌクレオチド配列（Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とする左側および右側の相同性アームに挟まれたＢｘｂ１ ａｔｔＰ 付着部位）を含む。いくつかの実施形態において、上記ｓｓＤＮＡドナーは、配列番号９のヌクレオチド配列（Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とする左側および右側の相同性アームに挟まれている、改変されたＢｘｂ１ ａｔｔＰ＊付着部位）を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のマウスおよび／またはマウス胚（または他の動物もしくは動物胚）は、上記マウス／マウス胚のゲノム遺伝子座において単一のＢｘｂ１付着部位を含む。例えば、上記Ｂｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ付着部位、改変されたａｔｔＰ＊付着部位、ａｔｔＢ付着部位、および改変されたａｔｔＢ＊付着部位から選択され得る。
他の実施形態において、本開示のマウスおよび／またはマウス胚（または他の動物もしくは動物胚）は、上記マウス／マウス胚のゲノム遺伝子座において２つの（少なくとも２つの）Ｂｘｂ１付着部位を含み、これは、本明細書において第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位といわれ得る。上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、いくつかの実施形態において、ａｔｔＰ付着部位、改変されたａｔｔＰ＊付着部位、ａｔｔＢ付着部位、および改変されたａｔｔＢ＊付着部位から選択される。上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに隣接していてもよいし（介在するヌクレオチド配列がない）、または、それらは、ある特定の数のヌクレオチドだけ、互いから分離されていてもよい。上記２つのＢｘｂ１付着部位を分離するヌクレオチドの数は、いくつかの実施形態において、各Ｂｘｂ１付着部位が同じセーフハーバー遺伝子座内に（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座内に）あることを条件にして、変動してもよい。従って、いくつかの実施形態において、任意の２つの（例えば、第１のおよび第２の）Ｂｘｂ１付着部位は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）だけ、互いから分離される。いくつかの実施形態において、任意の２つ（例えば、第１のおよび第２の）Ｂｘｂ１付着部位は、１～５００ｂｐ、１～１０００ｂｐ、１～１５００ｂｐ、１～２０００ｂｐ、１～２５００ｂｐ、または１～３０００ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）だけ、互いから分離される。例えば、任意の２つのＢｘｂ１付着部位は、１～４５０ｂｐ、１～４００ｂｐ、１～３５０ｂｐ、１～３００ｂｐ、１～２５０ｂｐ、１～２００ｂｐ、１～１５０ｂｐ、１～１００ｂｐ、１～５０ｂｐ、５～４５０ｂｐ、５～４００ｂｐ、５～３５０ｂｐ、５～３００ｂｐ、５～２５０ｂｐ、５～２００ｂｐ、５～１５０ｂｐ、５～１００ｂｐ、５～５０ｂｐ、１０～４５０ｂｐ、１０～４００ｂｐ、１０～３５０ｂｐ、１０～３００ｂｐ、１０～２５０ｂｐ、１０～２００ｂｐ、１０～１５０ｂｐ、１０～１００ｂｐ、１０～５０ｂｐ、５０～４５０ｂｐ、５０～４００ｂｐ、５０～３５０ｂｐ、５０～３００ｂｐ、５０～２５０ｂｐ、５０～２００ｂｐ、５０～１５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、１００～４５０ｂｐ、１００～４００ｂｐ、１００～３５０ｂｐ、１００～３００ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１００～２００ｂｐ、または１００～１５０ｂｐだけ、互いから分離され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される動物は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、ゲノムポリヌクレオチド）を含む。このような実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドが、上記インテグラーゼの発現および目的の遺伝子のゲノム組み込みの後に除去されるように、Ｂｘｂ１付着部位に挟まれてもよい（例えば、図１Ｃを参照のこと）。
いくつかの実施形態において、上記Ｂｘｂ１付着部位（複数可）を含むｓｓＤＮＡドナーの挿入は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９遺伝子編集によって促進される。上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化プラットフォームとして別の目的のために再利用された、原核生物に天然に存在する防御機構である。それは、ＤＮＡの切断を目標とする、ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）および非コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に依拠する。
いくつかの実施形態において、上記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ ＰＡＭ）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ） ＰＡＭ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログ、オルソログ、および／またはバリアント（例えば、Ｃａｓ９の進化バージョン）が、本明細書で提供されるように使用されてもよい。本明細書で提供されるように使用され得るＲＮＡガイドヌクレアーゼのさらなる非限定的な例としては、以下が挙げられる：Ｃｐｆ１（ＴＴＮ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント（ＮＧＧ（低減したＮＡＧ結合）ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント（ＮＧＣＧ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント（ＮＧＡＧ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント（ＮＧＡＮまたはＮＧＮＧ ＰＡＭ）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ） Ｃａｓ９（ＮＮＮＮＧＡＴＴ ＰＡＭ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ） Ｃａｓ９（ＮＮＡＧＡＡＷ ＰＡＭ）；およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ） Ｃａｓ９（ＮＡＡＡＡＣ）。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、会合したＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の活性を、標的化したゲノム内の特異的標的配列に向ける。例えば、Ｊｉｎｅｋら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７， ８１６－８２１（２０１２）およびＤｅｌｔｃｈｅｖａら， Ｎａｔｕｒｅ， ４７１， ６０２－６０７（２０１１）を参照のこと。ｇＲＮＡは、少なくとも、標的配列に（標的部位で）ハイブリダイズするスペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。ＩＩ型システム（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓシステム）では、上記ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＲＮＡ）配列を含む。上記ＩＩ型システムでは、上記ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型システムでは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）配列は、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、上記二重鎖は、上記ｇＲＮＡおよび上記ＲＮＡガイドヌクレアーゼが複合体を形成するように、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に結合する。いくつかの実施形態において、上記ｇＲＮＡは、この上記ＲＮＡガイドヌクレアーゼとの会合によって上記複合体に対する標的特異性を提供する。上記ｇＲＮＡは、上記ＲＮＡガイドヌクレアーゼの活性をそのように方向づける。Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とするｇＲＮＡスペーサー領域の例は、配列番号６および配列番号１０として提供される。
他のゲノム編集技術が使用されてもよい（例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））。例えば、Ｊｏｕｎｇ ＪＫら． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１３；１４（１）：４９－５５； Ｃａｒｒｏｌｌ Ｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２０１１；１８８（４）： ７７３－７８２；およびＧａｊ Ｔら． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３；３１（７）：３９７－４０５を参照のこと。
トランスジェニックマウスは、受精した単一細胞（１細胞）マウス胚の前核へのＤＮＡのマイクロインジェクション（前核注入）によって最も一般的に生成される。ＤＮＡ組み込みが第１の核分裂の前に起こる場合、いくらかのまたは全ての細胞は、導入遺伝子を有する。注入の後、卵子を、雌と精管切除した雄とを交配することによって生成した、適時交配（ｔｉｍｅ－ｍａｔｅｄ）偽妊娠養母の卵管に外科手術により移す。上記導入遺伝子を有する注入した卵子から生じた子孫を、初代と称する。
マイクロインジェクションが例証されるが、他のトランスフェクションシステムが本開示のＢＸｂ１ランディングパッド動物を生成するために使用されてもよい（例えば、エレクトロポレーション（例えば、Ｗａｎｇ Ｗら． Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１６；４３（５）：３１９－２７を参照のこと）、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入（例えば、Ｋｕｍａｒ ＴＲら． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；５９０：３３５－３６２を参照のこと）、ならびにウイルスベースの遺伝子移入など）。
いくつかの実施形態において、遺伝子移入は、胚の単一細胞ステージ（これは、接合子といわれ得る）において行う。他の実施形態において、遺伝子移入は、胚の後の多細胞ステージ（２細胞またはより多くの細胞、卵割球とも称される）において行う。いくつかの実施形態において、前核マイクロインジェクションは、接合子ステージにおいて行い、２細胞ステージ（２倍）での核注入が続く。
いくつかの実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性Ｃａｓ９発現を発現する動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）系統が使用され得る。これらのマウス系統は、Ｃｒｅおよび上記ｇＲＮＡを共発現するウイルスベクターが注入される場合に、インビトロＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を可能にする。上記ウイルスで発現されたＣｒｅは、Ｃａｓ９発現のスイッチを入れて作動させ、これは次に、上記標的化遺伝子（単数または複数）を編集する。さらに、マウスにおけるインビボでの遺伝子編集は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現するレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスの局所または全身注射によって達成され得る。
任意のマウスが、Ｂｘｂ１ランディングパッド系統を生成するために使用され得る。マウス系統の非限定的な例としては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６６４）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ（５３０４）、ＦＶＢ／ＮＪ（１８００）、Ｂ６Ｄ２（Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ ＤＢＡ／２Ｊ）マウス、およびＮＧＳＴＭ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）マウス（５５５７）またはこれらのバリアントが挙げられる。さらなる例としては、Ａ／Ｊ（０００６４６）、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ（００２４４８）、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ（００１９７６）、ＮＺＯ／ＨｉＬｔＪ（００２１０５）、ＣＡＳＴ／ＥｉＪ（０００９２８）、ＰＷＫ／ＰｈＪ（００３７１５）、ＷＳＢ／ＥｉＪ（００１１４５）、ＤＢＡ２（０００６７１）、およびコラボレーティブクロス（ＣＣ）系統が挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｂｘｂ１ランディングパッド動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）を生成する方法は、受精した単一細胞胚を単離する工程、および上記胚の前核または細胞質に、Ｃａｓ９（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）、およびゲノム遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座または他のオープンクロマチン遺伝子座））を標的とするｓｓＤＮＡをマイクロインジェクションする工程を包含し得る。次いで、マイクロインジェクションされた胚は、偽妊娠雌性マウスに移され得、満期まで保持され得る。偽妊娠は、偽の妊娠を説明し、それによって、接合子の存在を除いて、妊娠の全ての徴候および症状が示される。マウスは、雌が不妊の雄によって交尾させられ（bred）、不妊の交配を生じる発情期の後に偽妊娠の状態になる。約２～３週齢において、尾の生検を、子孫から集めてもよく、セーフハーバー遺伝子座への正確な組み込みが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、配列決定、サザンブロット法および／またはロングレンジ配列決定システム（例えば、ＰａｃＢｉｏ）によって検証されてもよい。次いで、所望の組み込みを有する初代マウスは、Ｂｘｂ１ランディングパッドマウス系統を生成するために繁殖させられる。
標的化導入遺伝子組み込み
上記Ｂｘｂ１ランディングパッド動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）は、いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムのＢｘｂ１付着部位において目的の遺伝子を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ベクター上に存在する。ベクターは、単に、外因性の遺伝物質（例えば、ドナー導入遺伝子）を宿主細胞（例えば、マウス胚）へと運ぶビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、環状ドナーポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）上に存在する。いくつかの実施形態において、例えば、そのゲノム中に１つのみのＢｘｂ１付着部位を含む動物を使用する場合、上記環状ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡミニサークルである。ＤＮＡミニサークルは、ドナーＤＮＡが＞１００ｂｐ～５０ｋｂの環状にされている小さな（約４ｋｂ）環状ベクター骨格である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークルは、全ての原核生物ベクター部分から除かれている（例えば、抗生物質耐性マーカーおよび／または細菌複製起点を含む細菌プラスミド骨格をもはや含まない）プラスミド誘導体である。
上記Ｂｘｂ１ランディングパッド動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス）は、いくつかの実施形態において、上記動物のゲノムのＢｘｂ１付着部位において目的の遺伝子を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ベクター上に存在する。ベクターは、単に、外因性の遺伝物質（例えば、ドナー導入遺伝子）を宿主細胞（例えば、マウス胚）へと運ぶビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、環状ドナーポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）上に存在する。いくつかの実施形態において、例えば、そのゲノム中に１つのみのＢｘｂ１付着部位を含む動物を使用する場合、上記環状ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡミニサークルである。ＤＮＡミニサークルは、ドナーＤＮＡが＞１００ｂｐ～５０ｋｂの環状にされている小さな（約４ｋｂ）環状ベクター骨格である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークルは、全ての原核生物ベクター部分から除かれている（例えば、抗生物質耐性マーカーおよび／または細菌複製起点を含む細菌プラスミド骨格をもはや含まない）プラスミド誘導体である。
ＤＮＡミニサークルを生成する方法は、当該分野で周知である。例えば、細菌骨格および真核生物挿入物（発現されるべき導入遺伝子を含む）を含む親プラスミドは、部位特異的リコンビナーゼタンパク質を発現する特殊なＥ．ｃｏｌｉ株において生成され得る。組換え部位は、親プラスミドにおける真核生物挿入物に隣接し、従って、リコンビナーゼタンパク質（非Ｂｘｂ１）の活性が、アラビノース誘導、グルコース誘導などが挙げられるが、これらに限定されない方法によって誘導される場合、上記細菌骨格は、真核生物挿入物から切り出されて真核生物ＤＮＡミニサークルおよび細菌プラスミドを生じる。
目的の配列（例えば、遺伝子）は、いくつかの実施形態において、２００塩基対（ｂｐ）～１００キロベース（ｋｂ）の長さを有する。目的の遺伝子は、いくつかの実施形態において、少なくとも１０ｋｂの長さを有する。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、または少なくとも３５ｋｂの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、１０～１００ｋｂ、１０～７５ｋｂ、１０～５０ｋｂ、１０～３０ｋｂ、２０～１００ｋｂ、２０～７５ｋｂ、２０～５０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～１００ｋｂ、３０～７５ｋｂ、または３０～５０ｋｂの長さを有する。
上記ドナーポリヌクレオチド（複数可）は、いくつかの実施形態において、２００ｂｐ～５００ｋｂ、２００ｂｐ～２５０ｋｂ、または２００ｂｐ～１００ｋｂの長さを有する。上記ドナーポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、少なくとも１０ｋｂの長さを有する。例えば、上記ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチドは、１０～５００ｋｂ、２０～４００ｋｂ、１０～３００ｋｂ、１０～２００ｋｂ、または１０～１００ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチドは、１０～１００ｋｂ、１０～７５ｋｂ、１０～５０ｋｂ、１０～３０ｋｂ、２０～１００ｋｂ、２０～７５ｋｂ、２０～５０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～１００ｋｂ、３０～７５ｋｂ、または３０～５０ｋｂの長さを有する。ドナーポリヌクレオチドは、環状または直線状であり得る。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子およびその相当する（同族の）Ｂｘｂ１付着部位（複数可）を含むドナーポリヌクレオチド（複数可）は、（例えば、マイクロインジェクションを介して）胚（例えば、単一細胞胚（接合子））へと導入される。後のステージの胚または動物がまた使用されてもよい。本明細書で提供されるとおりの使用のための前核マイクロインジェクションおよび他の遺伝子移入方法は、上記で考察される。
上記ドナーポリヌクレオチド（複数可）は、いくつかの実施形態において、Ｂｘｂ１インテグラーゼタンパク質、Ｂｘｂ１インテグラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはＢｘｂ１インテグラーゼタンパク質およびＢｘｂ１インテグラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドとともに胚または動物に導入される。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。
上記ドナーポリヌクレオチドおよび上記Ｂｘｂ１インテグラーゼを胚に導入した後に、上記胚は、目的の遺伝子を含む遺伝的に改変された子孫動物を生成するために、偽妊娠雌性へと移植され得る（上記で記載される繁殖プロセスに類似）。
いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、または少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの例えば、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、または１０％～２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの５０％超（例えば、５５％、６０％、６５％、または７０％）は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子（または目的の遺伝子を含むドナーポリヌクレオチド）は、少なくとも１０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１０％は、上記 ゲノム遺伝子座に正確に組み込まれた目的の遺伝子を含む。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、または少なくとも５０ｋｂの長さを有し得、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも１５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも２５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３０ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも１５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも２５％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、少なくとも３５ｋｂの長さを有し、上記遺伝的に改変した子孫動物のうちの少なくとも３０％は、上記ゲノム遺伝子座に組み込まれた目的の遺伝子を含む。
さらなる実施形態
さらなる実施形態は、以下に番号付けした段落によって包含される。
１． そのゲノム内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物。
さらなる実施形態は、以下に番号付けした段落によって包含される。
１． そのゲノム内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物。
２． Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで必要に応じて前記ポリヌクレオチドは、前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている、段落１に記載の哺乳動物。
３．
前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種であり、必要に応じて前記ゲノムは、ａｔｔＲおよび／またはａｔｔＬ部位を含まず、例えば、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離される、
段落１または２に記載の哺乳動物。
前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種であり、必要に応じて前記ゲノムは、ａｔｔＲおよび／またはａｔｔＬ部位を含まず、例えば、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離される、
段落１または２に記載の哺乳動物。
４． 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、段落３に記載の哺乳動物。
５． 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離されている、段落１～４のいずれか１つに記載の哺乳動物。
６． 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物。
７． 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物。
８． そのゲノム内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物胚。
９． （ａ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたは（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで必要に応じて前記ポリヌクレオチドは、前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている、段落８に記載の哺乳動物胚。
１０．
前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種であり、必要に応じて前記ゲノムは、ａｔｔＲおよび／またはａｔｔＬ部位を含まず、例えば、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離されている、
段落８または９に記載の哺乳動物胚。
前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種であり、必要に応じて前記ゲノムは、ａｔｔＲおよび／またはａｔｔＬ部位を含まず、例えば、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離されている、
段落８または９に記載の哺乳動物胚。
１１． 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、段落１０に記載の哺乳動物胚。
１２． 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、５０～５００ヌクレオチド塩基対だけ、互いから分離されている、段落８～１１のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
１３． 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
１４．前記哺乳動物胚は、単一細胞胚または多細胞胚である、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
１５． 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
１６． 前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚に、（ａ）第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する方法。
１７． 前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚に、第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチドを導入する工程を包含する方法。
１８． 前記哺乳動物胚を偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、段落１６または１７に記載の方法。
１９． 前記雌性哺乳動物から、子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、段落１８に記載の方法。
２０． 前記子孫哺乳動物のゲノムに組み込まれた前記目的の配列の存在または非存在に関して、前記子孫哺乳動物をスクリーニングする工程をさらに包含する、段落１９に記載の方法。
２１． 前記ドナーポリヌクレオチド、前記Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および／またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードする前記ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して前記哺乳動物胚に導入される、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
２２． 前記目的の配列は、目的の遺伝子を含む、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
２３． 前記目的の配列は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、または少なくとも３０ｋｂのサイズを有する、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
２４． Ｂｘｂ１ランディングパッド哺乳動物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）哺乳動物胚に、（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第１のゲノム部位を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第１のＢｘｂ１付着部位を含む第１の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー；必要に応じて（ｉｖ）第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第２のゲノム部位（a second genomic）を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｖ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第２のＢｘｂ１付着部位を含む第２のｓｓＤＮＡを導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、を包含する方法。
（ａ）哺乳動物胚に、（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第１のゲノム部位を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第１のＢｘｂ１付着部位を含む第１の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー；必要に応じて（ｉｖ）第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第２のゲノム部位（a second genomic）を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｖ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第２のＢｘｂ１付着部位を含む第２のｓｓＤＮＡを導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、を包含する方法。
２５． 前記第１のｓｓＤＮＡは、前記第１のＢｘｂ１付着部位から上流または下流に第２のＢｘｂ１付着部位をさらに含み、ここで前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位はともに、前記左側の相同性アームおよび前記右側の相同性アームに挟まれている、段落２４に記載の方法。
２６． 前記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または工程（ａ）は、前記哺乳動物胚に、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含する、段落２４または２５に記載の方法。
２７． 前記子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、段落２４～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８． 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、段落２４～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９． 段落８～１４に記載の哺乳動物胚を含む、哺乳動物。
３０． 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、段落２９に記載の哺乳動物。
３１． そのゲノム内にＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物。
３２． Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、段落３１に記載の哺乳動物。
３３． 前記Ｂｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、または改変されたａｔｔＢ＊部位である、段落３１または３２に記載の哺乳動物。
３４． 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、段落３３に記載の哺乳動物。
３５． 前記Ｂｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物。
３６． 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物。
３７． そのゲノム内にＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物胚。
３８． Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、段落３７に記載の哺乳動物胚。
３９． 前記Ｂｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、または改変されたａｔｔＢ＊部位である、段落３７または３８に記載の哺乳動物胚。
４０． 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、段落３９に記載の哺乳動物胚。
４１． 前記Ｂｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
４２． 前記哺乳動物胚は、単一細胞胚または多細胞胚である、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
４３． 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、前記段落のいずれか１つに記載の哺乳動物胚。
４４． 段落３７～４３のいずれか１つに記載の哺乳動物胚に、（ａ）目的の配列および同族Ｂｘｂ１付着部位を含むドナーポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、方法。
４５． 段落３７～４３のいずれか１つに記載の哺乳動物胚に、目的の配列および同族Ｂｘｂ１付着部位を含むドナーポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、方法。
４６． 前記哺乳動物胚を偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、段落４４または４５に記載の方法。
４７． 前記雌性哺乳動物から、子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、段落４６に記載の方法。
４８． 前記子孫哺乳動物のゲノムに組み込まれた前記目的の配列の存在または非存在に関して、前記子孫哺乳動物をスクリーニングする工程をさらに包含する、段落４７に記載の方法。
４９． 前記ドナーポリヌクレオチド、前記Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および／またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードする前記ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して前記哺乳動物胚に導入される、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
５０． 前記ドナーポリヌクレオチドは、ミニサークルである、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
５１． 前記目的の配列は、目的の遺伝子を含む、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
５２． 前記目的の配列は、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂのサイズを有する、前記段落のいずれか１つに記載の方法。
５３． Ｂｘｂ１ランディングパッド哺乳動物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）哺乳動物胚に、
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド，
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚におけるゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位を含む１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー、
を導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、
を包含する方法。
（ａ）哺乳動物胚に、
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド，
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚におけるゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位を含む１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー、
を導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、
を包含する方法。
５４． 前記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または工程（ａ）は、前記哺乳動物胚に、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含する、段落５３に記載の方法。
５５． 前記子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、段落５４に記載の方法。
５６． 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、段落５５に記載の方法。
５７． 段落３７～４３に記載の哺乳動物胚を含む、哺乳動物。
５８． 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、段落５７に記載の哺乳動物。
実施例
実施例１．Ｂｘｂ１マウス－１つの（ａｔｔＰ）ランディングパッド
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびオリゴヌクレオチドドナーを使用して、本発明者らは、単一のａｔｔＰ部位を、上記マウスのゲノム（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＮＳＧＴＭ、ＰＷＫ／ＰｈＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、Ａ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、またはＦＶＢ／ＮＪマウス系）のＲｏｓａ２６遺伝子座へと挿入した。
実施例１．Ｂｘｂ１マウス－１つの（ａｔｔＰ）ランディングパッド
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびオリゴヌクレオチドドナーを使用して、本発明者らは、単一のａｔｔＰ部位を、上記マウスのゲノム（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＮＳＧＴＭ、ＰＷＫ／ＰｈＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、Ａ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、またはＦＶＢ／ＮＪマウス系）のＲｏｓａ２６遺伝子座へと挿入した。
受精接合子を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離した。これらの接合子の前核に、（１）ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質、またはｍＲＮＡおよびタンパク質の両方としてのＣａｓ９（濃度は、ｍＲＮＡに関しては６０～１００ｎｇ／μＬおよびタンパク質に関しては３０～６０ｎｇ／μＬの範囲に及んだ）、（２）ｇＲＮＡ（濃度は、３０～５０ｎｇ／μＬの範囲に及んだ）、および（３）Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とするおよそ２００ｂｐのｓｓＤＮＡオリゴ（配列番号３）を、マイクロインジェクションした。このｓｓＤＮＡオリゴは、４８塩基対のＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位（配列番号２）に隣接する相同性の１５２塩基（配列番号４および５）を有する。マイクロインジェクションした接合子を、偽妊娠マウスに移し、満期まで保持させた。約２～３週齢において、尾の生検を子孫から集め、上記ａｔｔＰ部位の正確な組み込みに関して、ＰＣＲおよび配列決定によって試験した。上記Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位を有するマウスを、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰマウス系統を交尾させて作り出した。
次いで、これらのマウスを、適合している同族ａｔｔＢ部位を含むドナーとのインテグラーゼ媒介性組換えのためのレシピエントとして使用した（図２Ａ～２Ｂ）。上記ベクター骨格に由来するＤＮＡの挿入を回避するために、プラスミドを、マイクロインジェクションの前に、ミニサークルへと変換した（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＬＬＣ）。
受精した接合子を、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統から単離した。これらの接合子の前核に、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードする１００ｎｇ／μＬのｍＲＮＡおよび１～１０ｎｇ／μＬのドナーＤＮＡをマイクロインジェクションした。上記ドナーＤＮＡは、宿主胚Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ部位と適合するＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位を有する。上記ドナーＤＮＡは、当該分野で周知でありかつ確立された技術を使用する、細菌ベクターがないミニサークルであった。そのマイクロインジェクションした接合子を、偽妊娠マウスに移し、満期まで保持させた。＞２～３週齢において、尾の生検を子孫から集め、ＰＣＲおよび配列決定によって上記ＤＮＡの正確な組み込みに関して試験した。
このバージョンでの結果を、表１に概説する。
実施例２．Ｂｘｂ１マウス－２つの（ａｔｔＰ）ランディングパッド
本発明者らは、本発明者らのバージョン２ レシピエントマウスを、バージョン１系の逐次的改変を経て生成した。繰り返すと、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびオリゴヌクレオチドドナーを使用して、第２のａｔｔＰ＊（改変）部位を、元のａｔｔＰ部位から約２４０ｂｐ離して挿入した。その改変された部位では、ジヌクレオチド対形成を、ＧＴからＧＡに変えた。上記第２の部位の付加は、先ずドナー構築物をミニサークルへと変換させる必要なしに、ベクター骨格の排除を可能にする（図１Ｂ）。この例では、２つの付着部位が逐次的に挿入されたが、それらを、例えば、単一のドナーポリヌクレオチドを使用して同時に挿入できたことに注意のこと。上記バージョン２のマウスはまた、ＤＮＡのさらにより大きなトラクトを挿入することを可能にする。なぜなら必須のａｔｔＢ部位は、組み込まれるべき所望の領域に単に隣接させることによって、任意のベクター（ＢＡＣを含む）へと配置されうるからである。
本発明者らは、本発明者らのバージョン２ レシピエントマウスを、バージョン１系の逐次的改変を経て生成した。繰り返すと、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびオリゴヌクレオチドドナーを使用して、第２のａｔｔＰ＊（改変）部位を、元のａｔｔＰ部位から約２４０ｂｐ離して挿入した。その改変された部位では、ジヌクレオチド対形成を、ＧＴからＧＡに変えた。上記第２の部位の付加は、先ずドナー構築物をミニサークルへと変換させる必要なしに、ベクター骨格の排除を可能にする（図１Ｂ）。この例では、２つの付着部位が逐次的に挿入されたが、それらを、例えば、単一のドナーポリヌクレオチドを使用して同時に挿入できたことに注意のこと。上記バージョン２のマウスはまた、ＤＮＡのさらにより大きなトラクトを挿入することを可能にする。なぜなら必須のａｔｔＢ部位は、組み込まれるべき所望の領域に単に隣接させることによって、任意のベクター（ＢＡＣを含む）へと配置されうるからである。
スクリーニングおよび検証は、大きなノックインを有するマウスを作り出す場合に、最も大きな困難のうちの１つである。しかし、導入遺伝子の正確な位置および配向を知ることで、ＰＣＲによる迅速かつ簡単な同定が可能になる。スクリーニングに関する一般的ストラテジーは、図３に概説される。
本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡの３０，５７０ｂｐトラクトを挿入するために、組み換えた（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｅｄ）ＢＡＣ（合計サイズ３３，９３９ｂｐ）を使用して、バージョン２のマウスを試験した。その結果を表２にまとめる。
本発明者らは、種々の長さ（１．５ｋｂ～３０．６ｋｂの範囲）を有する核酸を挿入してバージョン２のマウスを試験した。その結果を表３にまとめる。
４つの初代候補を、野生型マウスへと戻し交配し、そのＮ１子孫を、両方の所望の組換えアレル（ＲＥＣ）および任意のオフターゲット挿入（ＯＴＩ）事象の生殖細胞系列伝達に関して評価した。上記４つの初代系のうちの２つからの子孫はまた、望ましくないランダムトランスジェニックアレルを有した。上記ＯＴＩおよびＲＥＣアレルを分離した。これは、上記挿入事象が関連していないことを示す。ロングレンジＰＣＲを行って、その組み込まれたアレルが無傷であることを確認した（図４）。
上記導入遺伝子は、ヒト肝臓において高発現を有することが公知であることから、ＲＮＡを、４つのコロニーのうちの３つからのマウスの肝臓から単離した（第４の初代からのコロニーは、未だ十分なサイズに達していなかったので、これらの試験には含めなかった）。ｃＤＮＡを、全ＲＮＡから調製し、１，２７０ｂｐ ＰＣＲ生成物を、各系から生成した（図５）。次いで、この生成物のＳａｎｇｅｒシーケンシングを使用して、転写物が実際にヒト化アレルであることを確認した。
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それら各々が引用され、いくらかの場合には、その文書の全体を包含し得る主題に関して参考として援用される。
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、ここ本明細書中でおよび特許請求の範囲において使用される場合、反対のことが明示的に示されなければ、少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味することが理解されるべきである。
反対のことが明示的に示されなければ、１より多くの工程または行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、本方法の工程または行為の順序が、本方法の工程または行為が記載されている順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである。
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する、挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、保持する「ｈｏｌｄｉｎｇ」」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などのような全ての移行句は、制限がない、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されないこと（including but not limited to）を意味すると理解されるべきである。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のみが、米国特許庁特許審査便覧第２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、閉鎖または半閉鎖の移行句であるものとする。
数値の前にある用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」とは、その記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供される場合、上記範囲の上端と下端との間の各値は、具体的に企図されかつ本明細書に記載されている。
Claims (58)
- そのゲノム内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物。
- Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、必要に応じてここで前記ポリヌクレオチドは、前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている、請求項１に記載の哺乳動物。
- 前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種である、
請求項１に記載の哺乳動物。 - 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、請求項３に記載の哺乳動物。
- 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、５０～５００ヌクレオチド塩基だけ、互いから分離されている、請求項１に記載の哺乳動物。
- 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、請求項１に記載の哺乳動物。
- 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、請求項１に記載の哺乳動物。
- そのゲノム内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物胚。
- Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで必要に応じて前記ポリヌクレオチドは、前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている、請求項８に記載の哺乳動物胚。
- 前記第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
前記第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ＊部位から選択され；
必要に応じて前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種である、
請求項８に記載の哺乳動物胚。 - 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、請求項１０に記載の哺乳動物胚。
- 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、５０～５００ヌクレオチド塩基対だけ、互いから分離されている、請求項８に記載の哺乳動物胚。
- 前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、請求項８に記載の哺乳動物胚。
- 前記哺乳動物胚は、単一細胞胚または多細胞胚である、請求項８に記載の哺乳動物胚。
- 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、請求項８に記載の哺乳動物胚。
- 前記請求項のいずれか１項に記載の哺乳動物胚に、（ａ）第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、方法。
- 前記請求項のいずれか１項に記載の哺乳動物胚に、第１の同族Ｂｘｂ１付着部位および第２の同族Ｂｘｂ１付着部位に挟まれている目的の配列を含むドナーポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、方法。
- 前記哺乳動物胚を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
- 前記雌性哺乳動物から、子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
- 前記子孫哺乳動物のゲノムに組み込まれた前記目的の配列の存在または非存在に関して、前記子孫哺乳動物をスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
- 前記ドナーポリヌクレオチド、前記Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および／またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードする前記ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して前記哺乳動物胚に導入される、請求項１６に記載の方法。
- 前記目的の配列は、目的の遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記目的の配列は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、または少なくとも３０ｋｂのサイズを有する、請求項１６に記載の方法。
- Ｂｘｂ１ランディングパッド哺乳動物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）哺乳動物胚に、（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第１のゲノム部位を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第１のＢｘｂ１付着部位を含む第１の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー；必要に応じて（ｉｖ）第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚における第２のゲノム部位を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに（ｖ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれている第２のＢｘｂ１付着部位を含む第２のｓｓＤＮＡを導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を、偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、
を包含する方法。 - 前記第１のｓｓＤＮＡは、前記第１のＢｘｂ１付着部位から上流または下流に第２のＢｘｂ１付着部位をさらに含み、ここで前記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位はともに、前記左側の相同性アームおよび前記右側の相同性アームに挟まれている、請求項２４に記載の方法。
- 前記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または工程（ａ）は、前記哺乳動物胚に、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
- 前記子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
- 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、請求項２４に記載の方法。
- 請求項８に記載の哺乳動物胚を含む、哺乳動物。
- 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、請求項２９に記載の哺乳動物。
- そのゲノム内にＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物。
- Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３１に記載の哺乳動物。
- 前記Ｂｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、または改変されたａｔｔＢ＊部位である、請求項３１に記載の哺乳動物。
- 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、請求項３３に記載の哺乳動物。
- 前記Ｂｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、請求項３１に記載の哺乳動物。
- 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、請求項３１に記載の哺乳動物。
- そのゲノム内にＢｘｂ１付着部位を含む、哺乳動物胚。
- Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３７に記載の哺乳動物胚。
- 前記Ｂｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ＊部位、ａｔｔＢ部位、または改変されたａｔｔＢ＊部位である、請求項３７に記載の哺乳動物胚。
- 前記ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含み、前記改変されたａｔｔＰ＊部位は、配列番号７の配列を含み、前記ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含み、および／または前記改変されたａｔｔＢ＊部位は、配列番号８の配列を含む、請求項３９に記載の哺乳動物胚。
- 前記Ｂｘｂ１付着部位は、セーフハーバー遺伝子座、必要に応じてＲｏｓａ２６遺伝子座内にある、請求項３７に記載の哺乳動物胚。
- 前記哺乳動物胚は、単一細胞胚または多細胞胚である、請求項３７に記載の哺乳動物胚。
- 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、請求項３７に記載の哺乳動物胚。
- 請求項３７～４３のいずれか１項に記載の哺乳動物胚に、（ａ）目的の配列および同族Ｂｘｂ１付着部位を含むドナーポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する方法。
- 請求項３７～４３のいずれか１項に記載の哺乳動物胚に、目的の配列および同族Ｂｘｂ１付着部位を含むドナーポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、方法。
- 前記哺乳動物胚を偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
- 前記雌性哺乳動物から子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
- 前記子孫哺乳動物のゲノムに組み込まれた前記目的の配列の存在または非存在に関して、前記子孫哺乳動物をスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
- 前記ドナーポリヌクレオチド、前記Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および／またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードする前記ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して前記哺乳動物胚に導入される、請求項４４に記載の方法。
- 前記ドナーポリヌクレオチドは、ミニサークルである、請求項４４に記載の方法。
- 前記目的の配列は、目的の遺伝子を含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記目的の配列は、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂのサイズを有する、請求項４４に記載の方法。
- Ｂｘｂ１ランディングパッド哺乳動物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）哺乳動物胚に、
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記哺乳動物胚におけるゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）左側の相同性アームおよび右側の相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位を含む１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナー、
を導入する工程；ならびに
（ｂ）前記哺乳動物胚細胞を偽妊娠雌性哺乳動物に移植する工程であって、ここで前記偽妊娠雌性哺乳動物は、子孫哺乳動物を産む能力がある、移植する工程、
を包含する方法。 - 前記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または工程（ａ）は、前記哺乳動物胚に、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を包含する、請求項５３に記載の方法。
- 前記子孫哺乳動物を集める工程をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。
- 前記哺乳動物胚は、齧歯類胚、必要に応じてマウス胚である、請求項５５に記載の方法。
- 請求項３７に記載の哺乳動物胚を含む、哺乳動物。
- 前記哺乳動物は、齧歯類、必要に応じてマウスである、請求項５７に記載の哺乳動物。
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