BRPI0711207A2

BRPI0711207A2 - vetor alvo para intregação em sìtios-especificos, método de sìtio-especìfico que integra um polinucleotìdeo codificando uma proteina de interesse em um genoma de uma célula eucariótia, célula eucariótica isolada , kit para uso no sìtio-especìfico que integra um polinucleotideo dentro de um genoma de uma celula in vitro e kit para uso em produzir uma proteìna em célula

Info

Publication number: BRPI0711207A2
Application number: BRPI0711207-6A
Authority: BR
Inventors: William J Rutter; Michelle P Calos; Jimmy Z Zhang
Original assignee: Hiprocell Llc
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2007-05-22
Publication date: 2011-03-22
Also published as: EP2019860A2; JP2009538144A; WO2007137267A2; AU2007254508B2; EP2019860A4; US20110177600A1; WO2007137267A3; NZ572884A; CN101511994A; AU2007254508A1; CA2654415A1

Abstract

VETOR ALVO PARA INTEGRAçAO EM SìTIOS-ESPECìFICOS, MéTODO DE SìTIO-ESPECìFICO QUE INTEGRA UM POLINUCLEOTìDEO CODIFICANDO UMA PROTEìNA DE INTERESSE EM UM GENOMA DE UMA CéLULA EUCARIóTICA, CéLULA EUCARIóTICA ISOLADA, KIT PARA USO NO SìTIO-ESPECìFICO QUE INTEGRA UM POLINUCLEOTìDEO DENTRO DE UM GENOMA DE UMA CéLULA IN VITRO E KIT PARA USO EM PRODUZIR UMA PROTEìNA EM UMA CéLULA. Esta invenção fornece um sistema de integração local específico e métodos para a geração de linhagens de células eucarióticas pra produção de proteína. O sistema fornecido inclui um primeiro vetor alvo integrando o local-específico e um segundo vetor doador integrando o local especifico compreendendo o gene de interesse. Também são fornecidos linhagem de células mamíferas produzidas pelos métodos e sistemas revelados, bem como kits que incluem o sistema revelado.

Description

VETOR ALVO PARA INTEGRAÇÃO EM SÍTIOS-ESPECÍFICOS,MÉTODO DE SÍTIO-ESPECÍFICO QUE INTEGRA UM POLINUCLEOTÍDEOCODIFICANDO UMA PROTEÍNA DE INTERESSE EM UM GENOMA DE UMACÉLULA EUCARIÓTICA, CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, KIT PARA USONO SÍTIO-ESPECÍFICO QUE INTEGRA UM POLINUCLEOTÍDEO DENTRO DEUM GENOMA DE UMA CÉLULA IN VITRO E KIT PARA USO EM PRODUZIRUMA PROTEÍNA EM UMA CÉLULA

REFERÊNCIA CRUZADA

Este pedido reivindica o benefício do pedidoprovisional US N0 60/802.719, depositado em 22 de maio de2006, o qual é incorporado aqui por referência em suatotalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Proteínas tais como, anticorpos, estão emergindocomo opções terapêuticas e/ou preventiva para uma grandevariedade de doenças. Por exemplo, a administração deanticorpos terapêuticos fornece uma importante estratégiapara o tratamento e/ou profilaxia dos indivíduos com câncerou indivíduos que foram expostos, ou foram infectados poragentes de doenças virais.

Entretanto, o processo atual de geração de linhagemcelular que produz altos níveis de proteínas de recombinação,tais como anticorpos, requer trabalhos intensivos de etapasde seleção e clonagem. A identificação de uma linhagemcelular que seja capaz de produzir um rendimento elevado dasproteínas é um processo fastidioso e demorado o qual exige aseleção de centenas de linhagens celulares. Esse processo deseleção atrapalha o potencial para selecionar numerosasproteínas terapêuticas ou candidatos profiláticos. Alémdisso, o processo de seleção também retarda a manufatura dasproteínas em uma maneira oportuna efetivamente econômica.

A maioria das linhagens celulares mamíferas atuaisque expressam proteínas terapêuticas, tais como anticorpos,pé desenvolvida pela integração genômica aleatória temsignificantes inconvenientes. Por exemplo, visto que aexpressão do transgene depende do contexto cromossômico nolocal de integração, a integração do transgene em uma posiçãonão desejável resulta em uma expressão relativamente baixa dotransgene. Além disso, a integração é tendente para a excisãodurante a passagem de células transfectadas"permanentemente". Além disso, a expressão do transgenefreqüentemente torna-se "silenciosa" em conseqüência daintegração aleatória do transgene em uma posição indesejávelno cromossomo.

Portanto, um método para rapidamente gerar eidentificar as linhagens celulares estáveis que são capazesde produzir altos níveis de proteínas de recombinação ára ouso como terapêuticos e diagnósticos é necessário. A presenteinvenção é endereçada a esta necessidade.

LITERATURA RELEVANTE

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SUMÁRIO DA INVEÇÃO

O objeto da invenção fornece um sistema deintegração Ioeal-especifico e métodos para gerar linhagens decélulas eucarióticas para a produção de proteína. 0 sistemafornecido inclui um primeiro vetor alvo de integração delocal-específico e um segundo vetor doador de integração delocal-específico compreendendo um gene de interesse também éfornecida linhagem celular eucariótica produzida pelosmétodos e pelos sistemas do objeto do assunto, assim comokits que incluem os sistemas do objeto.

Uma característica da presente invenção forneceum vetor alvo de integração local-específico que inclui umprimeiro local de recombinação do vetor que recombine comum local de recombinação genômica na presença de umprimeiro local-específico unidirecional recombinante; umsegundo local de recombinação do vetor que recombine comum local de recombinação do doador na presença de umsegundo local-específico unidirecional recombinante queseja diferente do primeiro local-específico unidirecionalrecombinante; uma primeira porção de um primeiro marcadorde seleção adjancente a extremidade 3' do segundo local darecombinação do vetor; e um segundo marcador de seleçãoque seja diferente do primeiro marcador de seleçãoadjacente a extremidade 3' do segundo local dorecombinação do vetor; e um segundo marcador de seleçãoque seja diferente do primeiro marcador de seleção.

Em algumas incorporações, o local de recombinaçãogenômica é um local de recombinação genômica eucariótico. Emalgumas incorporações, o primeiro local de recombinação dovetor é um local de recombinação genômica bacteriano (attB)ou um local de recombinação genômica do fago (attP) . Emoutras incorporações, o primeiro local de recombinação dovetor é um local de recombinação genômica bacteriano (attB)e o local de recombinação genômica é um local derecombinação genômica de pseudo-fago (pseudo-attP). Emdeterminadas incorporações, o primeiro local de recombinaçãodo vetor é um local de recombinação genômica do fago (attP)e o local de recombinação genômico é um local derecombinação genômico pseudo-bacteriano (pseudo-attP). Emcertas incorporações, o primeiro local de recombinação dovetor é um local de recombinação genômico pseudo-bacteriano(pseudo-attB) ou um local de recombinação genômico pseudo-fago (pseudo-attP) . Em algumas incorporações, o segundolocal de recombinação do vetor é um local de recombinaçãogenômico bacteriano (attB) ou um local de recombinaçãogenômico fago (attP). Em algumas incorporações, o segundolocal de recombinação do vetor é um local de recombinaçãogenômico pseudo-bacteriano (pseudoattB) ou um local derecombinação genômico do pseudo-fago (pseudo-attl').

Em algumas incorporações, o primeiro local-especifico unidirecional recombinante é um <pC31 fagorecombinante, um TP901-1 fago recombinante, R4 fagorecombinante, cpFCI fago recombinante, cpRvl fago recombinanteou φΒΤΙ fago recombinante. Em determinadas incorporações, oprimeiro local-especifico unidirecional recombinante é umaC31 fago recombinante. Em determinadas incorporações, osegundo local-específico unidirecional recombinante é um R4fago recombinante. Em certas incorporações, um <pC31 fagorecombinante inclui um <pC31 fago recombinante alterado, umTP901-1 fago recombinante inclui um TP901-1 fagorecombinante alterado e um R4 fago recombinante inclui um R4fago recombinante alterado.

Outra característica da presente invenção forneceum método do local que integra especificamente umpolinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse em umgenoma de uma célula eucariótica pela introdução de um vetoralvo dentro de uma célula eucariótica que compreende umprimeiro local-específico unidirecional recombinante emantendo a célula sob condições suficientes para um eventode recombinação mediado pelo primeiro local-específicounidirecional recombinante entre o . primeiro local derecombinação do vetor e o local de recombinação genômicapara integrar o local-específico ao vetor alvo dentro dogenoma da célula; introduzindo um vetor doador dentro dacélula alvo que compreende um segundo local-específicounidirecional recombinante, em que o vetor doador compreendeo polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse eum local de recombinação do doador e mantendo a célula alvosob condições suficientes para um evento de recombinaçãomediado pelo segundo local-específico unidirecionalrecombinante entre o local de recombinação do doador e osegundo local de recombinação do vetor do vetor alvo paraintegrar o local-específico ao polinucleotídeo que codificauma proteína de interesse dentro do genoma da célula; em queo primeiro local-específico unidirecional recombinante édiferente do segundo local-específico unidirecionalrecombinante. Em umas incorporações suplementares, o métodoinclui a seleção de uma célula que expressa à proteína deinteresse.

Em algumas incorporações, o primeiro local derecombinação do vetor é um local de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um local de recombinação genômico fago(attP). Em outras incorporações, o primeiro local derecombinação do vetor é um local de recombinação genômicobacteriano (attB) e o local de recombinação genômico é umlocal de recombinação genômico pseudo-fago (pseudo-attP). Emdeterminadas incorporações, o primeiro local de recombinaçãodo vetor e um local de recombinaçao genômico fago (attP) e olocal de recombinação genômico é um local de recombinaçãogenômico pseudo-bacteriano (pseudo-attB). Em outrasincorporações, o primeiro local de recombinação do vetor éum local de recombinação genômico pseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um local attP de recombinação genômico pseudo-fago(pseudo-attP). Em algumas incorporações, o segundo local derecombinação do vetor é um local de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um local de recombinação genômico fago(attP). Em outras incorporações, o segundo local derecombinação do vetor é um local de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um local attP derecombinação genômico recombinação pseudo-fago (pseudo-attP). Em algumas incorporações, o local doador derecombinação é um local de recombinação genômico bacteriano(attB) ou um local de recombinação genômico fago (attP). Emalgumas incorporações, o local doador de recombinação é umlocal de recombinação genômico pseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um local attP de recombinação genômico pseudo-fago(pseudo-attP).

Em algumas incorporações, o primeiro local-específico unidirecional recombinante é um <pC31 fagorecombinante, um TP901-1 fago recombinante, R4 fagorecombinante, (pFCI fago recombinante, cpRvl fago recombinanteou um φΒΤΙ fago recombinante. Em determinadas incorporações,o primeiro local-especifico unidirecional recombinante é umφC31 fago recombinante. Em determinadas incorporações, osegundo local-especifico unidirecional é um R4 fagorecombinante. Em algumas incorporações a proteína é umaenzima que possa ser usada para a produção de nutrientes ourealizar reações enzimáticas na química, ou umpolinucleotídeo útil e disponível como um nutriente ou parao tratamento de uma doença humana ou animal ou para aprevenção deste, por exemplo, um hormônio, um polipeptídiocom atividade imunomoduladoras, atividade antiviral e/ouantitumoral (por exemplo, maspin), anticorpo, antígenoviral, vacina, fator de coagulação, inibidor de enzima,ingrediente dos gêneros alimentícios e similares. Emdeterminadas incorporações, a proteína é uma proteínasegregada, tal como um anticorpo. Em algumas incorporações,a célula é uma célula mamífera. Em algumas incorporações, acélula mamífera é uma célula de roedor, tal como, uma célulaCRO ou uma linhagem celular CRO-derivada deficiente dedihidrofolato redutase, tal como, DG44. Em outrasincorporações, a célula mamífera é uma célula humana, talcomo, uma célula PER.C6™.

Outra característica da presente invenção forneceuma célula isolada que inclui um cassete polinucleotídeointegrado genomicamente que compreende um primeiro local derecombinação híbrido e um segundo local de recombinaçãohíbrido que flanqueando um local de recombinação do vetorque recombina com um local de recombinação do doador napresença de um local-especifico unidirecional recombinante;uma primeira porção de um primeiro marcador de seleçãoadjacente a extremidade 3' dos locais de recombinação dovetor; e um segundo marcador de seleção que seja diferentedo primeiro marcador de seleção.Em algumas incorporações, o local de recombinaçãodo vetor é um local de recombinação genômico bacteriano(attB) ou um local recombinação genômico fago (attP). Emalgumas incorporações, o local de recombinação do doador éum local de recombinação genômico bacteriano (attB) ou umlocal de recombinação genômico fago (attP). Em algumasincorporações, o local-específico unidirecionalrecombinante é um <pC31 fago recombinante, TP901-1 fagorecombinante ou R4 fago recombinante. Em algumasincorporações, a célula é uma célula mamífera. Em algumasincorporações, a célula mamífera é uma célula de roedor,tal como, uma célula de CRO ou uma linhagem celular CRO-derivada deficiente de dihidrofolato redutase, tal comoDG44. Em outras incorporações, a célula mamífera é umacélula humana, tal como, uma célula de PER.C6™.

Contudo, outra característica da presente invençãofornece um kit para uso no local especificamente integrandoum polinucleotídeo dentro de um genoma de uma célula invitro, incluindo: um vetor alvo; e um vetor doador queinclua dois promotores, duas seqüências de sinal se aproteína de interesse for segregada, 2 genes interruptoresreguladores para controlar a expressão do gene, doisrealçadores translacionais para aumentar a expressão, doislocais múltiplos de clonagem, um local doador derecombinação, e uma segunda porção de um primeiro marcadorselecionável (por exemplo, promotor) adjacente a extremidade5" do local de recombinação do doador. Em algumasincorporações, o kit também inclui um primeiro local-específico unidirecional recombinante ou um ácido nucléicoque codificam os mesmos. Em umas incorporaçõessuplementares, o kit também inclui um segundo local-específico uni direcional recombinante ou um ácido nucléicoque codificam o mesmo que seja diferente do primeiro local-específico unidirecional recombinante.

Em algumas incorporações o primeiro local-específico unidirecional recombinante é um (pC31 fagorecombinante, TP90 I-I fago recombinante, R4 fagorecombinante, cpFCI fago recombinante, cpRvl fago recombinanteou φΒΤΙ fago recombinante. Em algumas incorporações, osegundo local-específico unidirecional recombinante é umcpC31 fago recombinante, TP901-1 fago recombinante, R4 fagorecombinante, cpFCI fago recombinante, cpRvl fago recombinanteou φΒΤΙ fago recombinante.

Contudo, outra característica da presente invençãofornece um kit para uso na produção de uma proteína dentrode uma célula eucariótica, incluindo: uma célula eucarióticaisolada que inclui um cassete de polinucleotídeogenomicamente integrado que compreende um primeiro local derecombinação híbrido e um segundo local de recombinaçãohíbrido flanqueando um local de recombinação do vetor querecombina com o local de recombinação do doador na presençade um local-específico unidirecional recombinante, umaprimeira porção de um primeiro marcador selecionáveladjacente a extremidade 3' do local de recombinação do vetore um segundo marcador selecionável que seja diferente doprimeiro marcador selecionável; e um vetor doador que incluaum múltiplos locais de clonagem, um local de recombinação dodoador, e uma segunda porção de um primeiro marcadorselecionável (por exemplo, promotor) adjacente a extremidade51 do local de recombinação do doador.

Em algumas incorporações, o kit também inclui umlocal-específico unidirecional recombinante ou um ácidonucléico que codificam os mesmos. Em algumas incorporações olocal-específ ico unidirecional recombinante é um cpC31 fagorecombinante, TP90 I-I fago recombinante, R4 fagorecombinante, cpFCI fago recombinante, cpRvl fago recombinanteou um φΒΤΙ fago recombinante.

Estes e outros objetos, vantagens, ecaracterísticas da invenção tornar-se-ão aparentes daquelaspessoas hábeis na técnica sob a leitura dos detalhes dainvenção como descrito mais inteiramente abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DQS DESENHOS

A invenção é mais bem compreendida da seguintedescrição detalhada quando lida conjuntamente com os desenhosem acompanhamento. Enfatiza que, de acordo com a práticacomum, as várias características dos desenhos não são paraparâmetros. Ao contrário, as dimensões das váriascaracterísticas arbitrariamente são expandidas ou reduzidaspara maior clareza. São incluídas nos desenhos as seguintesfiguras:

FIG. 1 é uma representação esquemãtica de um vetoralvo exemplificativo. 0 vetor alvo exemplificativo inclui umprimeiro local de recombinação do vetor (por exemplo, umlocal attB <pC31), um segundo local de recombinação do vetor(por exemplo, local attP R4) , uma primeira porção de umprimeiro marcador selecionável (por exemplo, primeiromarcador selecionável do promotor-menor (por exemplo, o genede resistência à zeocina) ) a jusante do local attP R4, e umsegundo marcador selecionável (por exemplo, um gene deresistência à higromicina).

FIG.2 é uma representação esquemática de um vetordoador exemplificativo. 0 vetor doador exemplificativo incluium local de recombinação do doador (por exemplo, local attBR4) um gene de interesse e um promotor (por exemplo, umpromotor CMV) apenas a jusante ao local attB R4.

FIG.3 é uma representação esquemática de um eventode integração localespecífico inicial exemplificativo entre olocal attB <pC31 presente no vetor alvo e local do pseudo-attP<pC31 presente no genoma da célula alvo. 0 evento de integraçãoé mediado pela <pC31 integrase.

FIG.4 é uma representação esquemática de um eventode integração localespecífico exemplificativo entre o localattB R4 presente no vetor doador e o attP R4 integrado dentrodo genoma da célula como resultado da integração do vetor doalvo. O segundo evento de integração é mediado pela R4integrase.

FIG. 5 é uma representação esquemática de um vetorDHFR-alvo exemplificativo. 0 vetor DHFR-alvo exemplifictivoinclui um local att P R4, um local do attB <pC31, um gene deresistência à higromicina, um gene de DHFR, e uma primeiraporção (por exemplo, promotor-menor) de um gene deresistência à zeocina a jusante ao local attP R4 .

FIG. 6 é uma representação esquemática de um vetorDHFR-doador exemplificativo. O vetor doador exemplificativoinclui um local attB R4, um gene de interesse, um gene deDHFR e um promotor CMV apenas a montante ao local attB R4 .

FIG. 7 é uma representação esquemática de um vetorIRES-doador exemplificativo. O vetor doador exemplificativoinclui um local attB R4, um gene de interesse, um promotorCMV apenas a montante do local attB R4 e um IRES entre olocal do início da transcrição e a região de codificação parao gene do interesse.

FIG. 8 é uma representação esquemática de um vetoralvo pRl. O vetor alvo pRl inclui um primeiro local derecombinação do vetor (por exemplo, um local R4) , um segundolocal de recombinação do vetor attB 295 (por exemplo,um localattP 103 φ C31), uma primeira porção de um primeiro marcadorselecionável (por exemplo, marcador selecionável do promotor-menor (por exemplo, o gene de resistência â puromicina)) amontante ao local φ C31 attP 103 e um segundo marcadorselecionável completo (por exemplo, um cassete de resistênciaã higromicina) . Também contém um origem ColEI de replicaçãodo DNA e um cassete do gene de resistência à ampicilina paraa manutenção e a seleção em E. Coli, respectivamente. Osasteriscos designam únicos locais da enzima de restrição.

FIG.9 é uma representação esquemática de umaespinha dorsal do vetor de expressão doador exemplificativo(PHPC-4). A espinha dorsal do vetor de expressão doadorexemplificativo inclui um local de recombinação do doador(por exemplo, um local AAA cpC31 attB 285) , dois promotoresCMV1 duas seqüências de sinal para o secreção das proteínas,dois poliligantes para a inserção dos genes de interesse edois sinais polis adenilação do hormônio do crescimentobovino. Também inclui um promotor mais fraco (por exemplo, umpromotor SV4 0) apenas a montante do local AAA cpC31 attB 285para selecionar a integração de um vetor de expressão doadordentro do vetor alvo. Além disso, o vetor também inclui umaorigem ColEI de replicação de DNA e um cassete do gene deresistência à ampicilina para a manutenção e a seleção em E.Co li, respectivamente. Os asteriscos designam locais únicosda enzima de restrição.

FIG. 10 é uma representação esquemática de um vetorde expressão doador exemplificativo (pDl- DTX-I). 0 vetor deexpressão doador exemplificativo inclui um local derecombinação do doador (por exemplo, um local AAA cpC31 attB285), dois promotores CMV, duas seqüências de sinal, cadeiaspesadas e leves de um anticorpo da toxina anti-diftérica edois sinais de poliadenilação do hormônio de crescimentobovino. O vetor também inclui um promotor mais fraco (porexemplo, um promotor SV40) apenas a montante do local AAAcpC31 attB 285 para selecionar a integração do vetor deexpressão doador dentro do vetor alvo. Além disso, o vetortambém inclui uma origem ColEI de replicação do DNA e de umcassete do gene de resistência à ampicilina para a manutençãoe a seleção em E. Coli, respectivamente.FIG. 11 é uma representação esquemática doprocedimento de teste rápido usado para verificar a função decada um dos quatro vetores usados para gerar linhagem celularpara a produção de nível elevado de proteína. A primeiraetapa usa R4 integrase codificada por um vetor da expressãoR4 integras e (por exemplo, pCMV sre para mediar a integraçãodo vetor do alvo dentro de locais pseudo attP R4. Quarenta eoito horas são permitidas para a integração ocorrer semseleção (por exemplo, seleção por higromicina).

A segunda etapa usa uma integrase mutante cpC31codificada por um vetor de expressão da integrase mutanteφC31 (por exemplo, pCS-M3J) para mediar a integração do vetordoador dentro do vetor do alvo. Quarenta e oito horas sãopermitidas para a integração ocorrer e uma seleção porpuromicina é então usada para isolar uma associação estáveldas células. Estas células são analisadas para a expressão daproteína. A expressão de nível elevado da proteína depende dafunção apropriada de cada um dos quatro plasmídeo usados.Mesmo se o vetor alvo integrado aleatoriamente ou local-específico em locais pseudo attP R4 na primeira etapa podemser avaliados fazendo a experiência com ou sem o vetor deexpressão R4 integrase. O nível de expressão da proteína serásubstancialmente mais baixo se o vetor de expressão da R4integrase for omitido porque os vetores alvos não-integradosestarão diluídos para fora como células divisoras sobre ocomprimento da experiência 17 dias).

FIG. 12 é uma representação esquemática de umprimeiro evento de integração local-específicoexemplificativo entre o local R4 attB 295 presente no vetoralvo e os locais R4 pseudo-attP presente no genoma da célulaalvo. O evento de integração é mediado o pela R4 integras ecodificado pelo plasmídio pCMV sre. A seleção pelaHigromicina é usada para isolar clones estáveis (por exemplo,linhagem celular attP PER.C6-cpC31 ou attP DG44-cpC31) com ovetor alvo integrado nos locais R4 pseudoattP.

FIG. 13 é uma representação esquemática de umsegundo evento de integração local-específico exemplificativoque ocorre em linhagem celular attP cpC31 entre local AAA cpC31attB 285 presente no vetor doador e local cpC31 attP 103integrado dentro do genoma da célula como um resultado daintegração do vetor alvo. O segundo evento de integração émediado por um mutante cpC31 integras e (por exemplo, ummutante cpC31 integras e codificado pelo plasmídeo pCS-M3J).

Um cassete de expressão reconstitutivo de resistência â drogaé usado para selecionar os integrantes em que o vetor deexpressão doador integrou no vetor alvo, e para selecionarcontra aquelas linhagens celulares em que o vetor doadorintegrou nos locais cpC31 pseudo-attP.

FIG. 14 é um diagrama das seqüências dos locaisattB cpC31, attP e attL 88. As seqüências do tipo selvagem deattB cpC31 e attP cpC31 são dadas na metade superior. Aseqüência sublinhada na metade superior indica as seqüênciasdo attB e do attP as quais poderiam formar um local attL apósa recombinação. Pela convenção attL é nomeado de acordo com olado do recombinação sobre o ponto que foi derivado de attB.

Por exemplo, no attL, seqüências no lado esquerdo dorecombinação sob o ponto são derivadas das seqüências do ladoesquerdo (5') da recombinação sobre o ponto do attB. Asseqüências no attL no lado direito de recombinação sob oponto são derivadas sobre das seqüências do lado direito (3·)de recombinação sobre o ponto do attP.

A metade inferior da figura de diagramas como asseqüências attB e do attP foram modificadas para fazer oslocais AAA cpC31 attP 103 e cpC31 attB 285 que foram usadosnos vetores alvo e doador, respectivamente. Também indica aseqüência do local <pC31 attL 88 que resulta depois que olocal AAA <pC31 attB 285 no vetor doador integra dentro dolocal <-pC31 attP 103 no vetor do alvo.

FIG. 15 é uma representação esquemática de umvetor alvo-DHFR exemplificativo (pRl - DHFR). O vetor alvo-DHFR exemplif icativo inclui um local <pC31 attP 103, um localR4 attB 295, um gene de resistência à higromicina, um geneDHFR e uma primeira porção do gene de resistência àpuromicina (por exemplo, promotor-menor) a montante do localde <pC31 attPI03. O vetor também inclui uma origem dereplicação de DNA ColEI e um cassete do gene de resistênciaã ampicilina para a manutenção e a seleção em E. Co li,respectivamente.

FIG. 16 é uma representação esquemática de umvetor de expressão do doadorDHFR exemplificativo (pDl-DHFR). 0 vetor de expressão do doador-DHFR exemplificativoinclui um local de recombinação do doador (por exemplo, umlocal AAA <pC31 attB 285) , dois promotores CMV, duasseqüências de sinal, cadeias pesadas e leves de um anticorpoda toxina da anti-difteria, dois sinais de poliadenilação dohormônio de crescimento bovino, um cassete de expressão DHFRe um promotor (por exemplo, um promotor SV4 0) apenas amontante do local AAA tpC31 attB 285 para selecionar aintegração do vetor doador dentro do vetor alvo. 0 vetortambém inclui uma origem de replicação do DNA Co 1 EI e umcassete do gene de resistência à ampicilina para amanutenção e a seleção de E. Coli, respectivamente.

FIG. 17 é uma representação esquemática de umvetor de expressão IRES-doador exemplificativo (PDl-IRA). 0vetor de expressão IRES-doador exemplificativo inclui umlocal de recombinação do doador (por exemplo, um local AAA<pC31 attB 285), dois promotores CMV, dois locais internos daentrada da ribossomo (IRES) na região não-traduzida 5', duasseqüências de sinalização, cadeias pesadas e leves de umanticorpo da toxina da anti-difteria, dois sinais depoliadenilação do hormônio de crescimento bovino e umpromotor (por exemplo, um promotor SV40) apenas a montantedo local AAA φC31 attB 285 para selecionar a integração dovetor doador dentro do vetor alvo. O vetor também inclui umaorigem de replicação de DNA ColEI e um cassete do gene deresistência à ampicilina para a manutenção e a seleção em E.Coli, respectivamente.

FIG. 18 é uma representação esquemática de umvetor alvo de regulação exemplificativo (pRlreg). 0 vetoralvo de regulação exemplificativo inclui um primeiro localde recombinação do vetor (por exemplo, um local R4 attB 295) ,um segundo local de recombinação do vetor (por exemplo, umlocal φC31 attP 103) , uma primeira porção de um primeiromarcador selecionável (por exemplo, marcador selecionável dopromotormenor (por exemplo, o gene de resistência àpuromicina) ) ajustante ao local φC31 attP, um segundomarcador selecionável completo (por exemplo, um cassete dogene de resistência à higromicina) e um cassete quecodifique as proteínas (por exemplo Rheoativador eRheoReceptor) capazes de conferir regulação do controlávelum ou mais genes presente em um vetor de expressão deregulação doador (por exemplo pDlreg), que tenha os genesque são configurados em uma maneira, tal que são capazes deregulação. O vetor também inclui uma origem de replicação doDNA Col El e um cassete do gene de resistência à ampicilinapara a manutenção e seleção em E. Coli, respectivamente.

FIG.19 é uma representação esquemática de um vetorDHFR- alvo de regulação exemplificativo (pRlreg-DHFR). Ovetor DHFR -alvo de regulação exemplificativo inclui umprimeiro local de recombinação do vetor (por exemplo, umlocal R4 attB 295) , um segundo local de recombinação dovetor (por exemplo, um local φC31 attB 103) , uma primeiraporção de um primeiro marcador selecionável (por exemplo,marcador selecionável do promotor-menor (por exemplo, o geneda resistência à puromicina) a jusante ao local cpC31 attP103, um segundo marcador selecionável completo (por exemplo,um cassete do gene de resistência à higromicina), um gene deDHFR e um cassete que codifiqueas proteínas (por exemploRheoAtivador e Rheo receptor) capazes de conferir regulaçãoao gene controlável em um ou mais genes presentes em umvetor de expressão de regulação doador (por exemplo pDlreg,o qual tenha os genes que são configurados em uma maneira,tal que são capazes de regulação. 0 vetor também inclui umaorigem de replicação de DNA Col El e um cassete do gene deresistência à ampicilina para a manutenção e a seleção em E.Cole, respectivamente.

FIG. 20 é uma representação esquemática de umaespinha dorsaldo vetor de expressão de regulação doador(pDlreg). A espinha dorsal do vetor doador de expressão deregulação doador inclui um local de recombinação do vetordoador (por exemplo, um local AAA cpC31 att B 285) duasseqüências que mediem a regulação do gene (por exemplo, umaregião de poliadenilação SV4 0), duas seqüências reguladorasdo gene (por exemplo, 5x GAL4 UAS, TATA box, e um 5' UTR) ,duas seqüências de sinalização, um poliligante paraintroduzir genes de interesse, dois sinais de poliadenilaçãodo hormônio de crescimento bovino, e um promotor (porexemplo, um promotor SV4 0) apenas a montante do local AAAcpC31 attB 285 para selecionar a integração do vetor doadordentro do vetor alvo. 0 vetor também inclui uma origem dereplicação de DNA Col El e um cassete do gene de resistênciaà ampicilina para a manutenção e a seleção em E. Coli,respectivamente. Os asteriscos designam locais únicos eenzimas de restrições.

FIG. 21 é uma representação esquemática de umvetor de expressão doador exemplificativo selecionável (pDl-DTXI-G418) a vetor de expressão doador exemplificativoselecionável inclui todos os elementos de um vetor deexpressão doador (FIG. 10), mas também inclui um completogene marcador selecionável (por exemplo, G418).

FIG. 22 demonstra a recombinação local-específicade um vetor alvo com um vetor de expressão doador após otransfecção transiente.

FIG. 23 mostra a seqüência de um local R4 pseudoatt isolado das células em que um vetor alvo foi integradoespecificamente ao local usando a R4 integrase. A seqüênciado núcleo R4 em que a recombinação ocorre é mostrada emletras maiúsculas.

FIG. 24 mostra as seqüências dos locais cpC31 atthíbrido isolados das células DG44 em que um vetor deexpressão doador foi integrado especificamente ao local emdentro de um vetor alvo. Painel A mostra o local attLhíbrido e o painel B mostra o local attR híbrido. Aseqüência superior do ácido nucléico mostra a seqüênciaprevista da região do vetor de expressão doador, seguidapelo attL, e então a seqüência de resistência à puromicina,que originou do vetor alvo. A seqüência inferior é aseqüência real da linhagem celular. Como mostrado na figuraa seqüência real do ácido -nucléico corresponde exatamentecom a seqüência prevista.

FIG. 25 mostra seqüências dos locais (pC31 atthíbrido isolado das células PER.C6™ em que um vetor deexpressão doador foi integrado especificamente ao localdentro de um vetor alvo. Painel A mostra o local attLhíbrido e o painel B mostra o local attR híbrido. Aseqüência superior do ácido nucléico mostra a seqüênciaprevista da região do vetor de expressão doador, seguidapelo attL, e então a seqüência de resistência à puromicina,a qual originou do vetor alvo. A seqüência inferior é aseqüência real da linhagem celular. Como mostrado na figura,a seqüência do ácido nucléico real corresponde exatamentecom a seqüência prevista.

FIG. 26 mostra amplificação reação-mediada decadeia de polimerase dos locais attB (Painel A) e attR(painel B) do DNA genômico das células com vetores deexpressão doadores especificamente integrados ao local.

FIG. 27A mostra a expressão de um anticorpo daassociação de CRa DRFR de clones após a integração do vetorda expressão doador especificamente ao local.

FIG. 27B mostra a expressão de um anticorpo daassociação PER.C6™ de clone após a integração do vetor daexpressão doador especificamente ao local.

FIGURAS 28A e 28B mostram a expressão de umanticorpo de clone de célula única da associação CRadhfr#2G7 que contém vetores de expressão doadores integradosespecificamente ao local.

FIG. 29 mostra a expressão de um anticorpo(pg/ceélula/dia) de uma associação das células em que umvetor de expressão doador foi integrado especificamente aolocal dentro de um vetor DHFR-alvo e populações de célulaque foram expostas então às concentrações crescentes demetotrexato.

FIG. 30 é uma representação esquemática de umvetor de expressão doador repórter exemplificativo (pD3-DTXI) . O vetor de expressão doador repórter exemplificativoinclui todos os elementos de um vetor de expressão doador(FIG. 10) , mas também inclui um gene que codifica umamolécula repórter, tal como, proteína fluorescente verde. Apresença do gene repórter permite a fácil identificação dascélulas individuais que expressam uma proteína de interesse.

FIG. 31 mostra a comparação da atividade deligação específica do anticorpo da toxina anti-difteriaexpressado nas células DG44 e nas células de PERC6™.

FIG. 32 mostra biologicamente, a atividade deneutralização in vitro do anticorpo da toxina da anti-difteria expressado das células DG44 ou das células PERC6™comparadas àquela da linhagem humana da célula-B (D2.2), deque os genes do anticorpo foram clonados.

FIGURAS 33A-33B mostram a seqüência do ácidonucléico para o vetor pRl. [0058] FIGURAS 34A-34C mostram aseqüência do ácido nucléico para o vetor pDl-DTX-1.

FIGURAS 3 5A-3 5C mostram a seqüência do ácidonucléico para o vetor pRl-DHFR

FIGURAS 36A-36D mostram a seqüência do ácidonucléico para o vetor pD 1-DTXI-G418.

FIGURAS 37A-37D mostram a seqüência do ácidonucléico para o vetor pD3-DTXl.

DEFINIÇÕES

"Recombinases" é uma família das enzimas que mediaa recombinação local-específico entre seqüências específicasde DNA reconhecidas pela recombinase (Esposito, D., andScocca, J. J., Nucleic Acids Research 25,3605-3614 (1997);Nunes-Duby, S. E., et al, Nucleic Acids Research 26,391-406(1998); Stark, W. M., et al. , Trends in Genetics 8, 432-439(1992). Dentro deste grupo estão diversas subfamílias queincluem a "Integrase" ou tirosina recombinase (incluindo,por exemplo, integras e Cre e lambda) e"Resolvase/Invertase" ou serina recombinase (incluindo, porexemplo, cpC31 integras e, R4 integras, e TP-901 integrase).

0 termo também inclui as recombinases que são alteradas emcomparação ao tipo-selvagem, por exemplo, como descritos napublicação de patente US 20020094516, a divulgação de que éincorporada aqui por este meio por referência em suatotalidade.Uma "recombinase local-específica unidirecional" éuma recombinase natural, tal como, cpC31 integras e, umarecombinase transformada ou alterada, tal como, uma cpC31integrase transformada ou alterada que retenha atividade derecombinação local-específica uni direcional ou umarecombinase bidirecional modificado para ser uni direcional,tal como, uma cre recombinase que foi modificada para setomar unidirecional.

"Recombinases alteradas" e "recombinasesmutantes"; são usadas permutavelmente aqui para referir-seàs enzimas recombinas, e em que o gene recombinase nativo,tipo selvagem encontrado no organismo de origem tenha sidotransformado em uma ou mais posições relativas a umarecombinase original (por exemplo, em um ou maisnucleotídeos que podem resultar nas alterações de um ou maisaminoácidos na recombinase alterada relativa a umarecombinase precursora) . "Recombinase precursora" é usadapara referir-se à seqüência do nucleotídeo e/ou deaminadoãcido da recombinase de qual a recombinase alterada égerada. A recombinase precursora pode ser uma enzima natural(isto é, uma enzima tipo selvagem ou nativa) ou uma enzimade ocorrência não natural (por exemplo, uma enzimageneticamente projetada). As recombinases alteradas deinteresse na invenção exibem uma especificidade de DNA e/ouum nível de ligação de atividade que difere daquela daenzima do tipo-selvagem ou outra enzima precursora. Talespecificidade de ligação alterada permite a recombinasereagir com uma dada seqüência de DNA diferentemente do quepoderia a enzima precursora, enquanto um nível alterado deatividade permite a recombinase realizar a reação em maiorou menor eficiência. Uma reação de recombinase tipicamenteinclui ligação a uma seqüência de reconhecimento e aexecução do corte e da ligação ajustados, tendo porresultado nas trocas de fileiras entre dois locais dereconhecimento de recombinação.

"Integração local-específica" ou "integrandoespecificamente ao local", como usada aqui refere-se àrecombinação e integração da seqüência específica de umprimeiro ácido nucléico com um segundo ácido nucléico,tipicamente mediado por uma recombinase. Geralmente,recombinação ou integração local-específica ocorre nasseqüências definidas particulares reconhecidas pelarecombinase. Em contraste com a integração aleatória, aintegração local-específica ocorre em uma seqüênciaparticular (por exemplo, um local acessório da recombinase)em uma eficiência mais elevada.

Os locais de reconhecimento nativos attB e attP dofago cpC31 (isto é, bacteriófago cpC31) são geralmenteaproximadamente 34 a 40 nucleotídeos do comprimento (Grothet »n, Proc Natl de Acad Sci USA -97:5995-6000 (2000)).

Estes locais são arranjados tipicamente como segue: AttBcompreende uma primeira seqüência de DNA afctBS1, uma regiãodo núcleo, e uma segunda seqüência de DNA attB3', na ordemrelativa de 5' a 31 attB5' - região do núcleo-attB3' . AttPcompreende uma primeira seqüência de DNA attP5', região donúcleo e uma segunda seqüência de DNA attP3', na ordemrelativa de 5' a 3' afcfcP5' - região do núcleo-attP31 . Aregião do núcleo de attP e attB de cpC31 têm a seqüência 5'-TTG-3'. Outras integrases do fago (tais como, integras e dofago R4) e suas seqüências de reconhecimento podem seradaptadas para o uso na invenção.

A ação da integrase em cima destes locais dereconhecimentos é unidirecional em que a reação enzimáticaproduz os produtos de recombinação do ácido nucléico que nãosão substratos efetivos da integrase. Isto resulta naintegração estável com pouca ou quase nenhuma excisãomediada-recombinase detectável, isto é, recombinação que é"unidirecional". 0 produto da recombinação da ação dointegrase em cima dos pares do local de reconhecimentocompreende, por exemplo, na ordem de 5' a 3' : attJ35'seqüência do local do produto de reconhecimento-attP31, eattP5' - seqüência do local do produto de reconhecimento-attB3'. Assim, onde o vetor alvo compreende um local attB eo genoma alvo compreende uma seqüência attP, um produtotípico do recombinação compreende a seqüência (den5! a 3'):attP51-TTG-attB31 {seqüência do vetor alvejado} attB5'

TTG-attP3'. Como os locais attB e do attP são seqüênciasdiferentes, a recombinação resulta em um local derecombinação de local-específico híbrido (designado attL ouattR para esquerdo e direito) que é nem uma seqüência doattB ou nem uma seqüência do attP, e é funcionalmente não-reconhecida como um local de recombinação de local-específico (por exemplo, attB ou attP) para a "recombinaselocal-específico uni direcional relevante, assim removendo apossibilidade que ao recombinase local-específicounidirecional catalisará uma segunda reação de recombinaçãoentre o attL e o attR que inverteria a primeira reação derecombinação.

Um "local de reconhecimento nativo", como usadoaqui, significa um local de reconhecimento que ocorranaturalmente no genoma de uma célula (isto é, os locais nãosão introduzidos no genoma, por exemplo, por meios derecombinação).

Um "local de recombinação tipo-selvagem", comousado aquio significa um local de recombinação usadonormalmente por uma integrase ou por uma recombinase. Porexemplo, o lambda ê um bacteriófago temperado que infecta E.Co li. 0 fago tem um local acessório para a recombinação(attP) e o genoma bacteriano de E. Coli tem um localacessório para recombinação (attB). Ambos desses locais sãolocais de recombinação tipo-selvagem para a integraselambda. No contexto da presente invenção, locais drecombinação tipo selvagem ocorre no sistema homólogo dofago/bactérias. Conformemente, locais de recombinação tipo-selvagem pode ser derivado do sistema homólogo e associadocom as seqüências heteróloga, por exemplo, local attB podeser colocado em outros sistemas para atuar como um substratopara a integrase.

Um "pseudo-local" ou um "local de pseudo-recombinação, como usado aqui, significa a seqüência do DNAque compreende um local de reconhecimento que seja limitadopor uma enzima recombinase onde o local de reconhecimentodifere-se em um ou mais nucleotideos de uma seqüência dereconhecimento de recombinase tipo selvagem e/ou estejapresente como uma seqüência endógena em um genoma quedifere-se da seqüência de um genoma onde a seqüência dereconhecimento tipo selvagem para resíduos da recombinase.

Para uma dada recombinase, uma seqüência de pseudo-recombinação é funcionalmente equivalente a uma seqüência doreconhecimento tipo-selvagem ocorre em um organismo àexceção daquela em que a recombinase é encontrada nanatureza, e pode ter a variação da seqüência relativaseqüência de recombinação do tipo selvagem. Em algumasincorporações um "pseudo-local attP" ou " pseudo local attB"refere-se aos pseudo locais que são similares ao local dereconhecimentos para o fago tipo selvagem (attP) ouseqüências de locais acessórios bacterianos {attB),respectivamente, para enzimas integrase do fago, tais como,o fago φC31 . Em muitas incorporações da invenção, o pseudolocal attP está presente no genoma de uma célula hospedeira,enquanto o local ttB tipo selvagem esta presente em um vetoralvo no sistema da invenção. "Pseudo local att" é um termomais geral que possa referir a um pseudo local afctP ou umpseudo local attB. Compreende-se que os locais att ou ospseudo locais att podem estar presentes em moléculaslineares ou circulares do ácido nucléico. Em determinadasincorporações, a presença de" pseudo-locais de recombinação"no genoma da célula alvo evita a necessidade para introduçãode um local de recombinação dentro do genoma.

Um "local de recombinação-híbrido", como usadoaqui, refere-se a um local de recombinação construído dasporções do tipo-selvagem e/ou locais de pseudo-recombinação.

Como um exemplo, um local de recombinação do tipo-selvagempode ter uma pequena, região de núcleo flanqueada porpalindrômeros. Em uma incorporação de um "local derecombinação-híbrido" a seqüência 5' da seqüência de regiãodo núcleo do local de recombinação híbrida combina um localde pseudo-recombinação e a seqüência 3' do local derecombinação- híbrida do núcleo combina o local derecombinação tipo selvagem. Em uma incorporação alternativa,o local de recombinação híbrido pode ser compreendido daregião 5' do núcleo de um local attB tipo selvagem e daregião 3' do núcleo de um local attP de recombinação tipo-selvagem ou vive-versa. Outras combinações de tais locais derecombinação híbrida serão evidentes àqueles que têm ahabilidade ordinária na técnica, em virtude dos ensinamentosdo presente relatório.

Pelo "fragmento do ácido nucléico de interesse"significa qualquer fragmento do ácido nucléico adaptado paraa inserção dentro de um genoma. Os exemplos apropriados defragmentos do ácido nucléico de interesse incluem elementosdo promotor, genes terapêuticos, genes do marcador, regiõesde controle, fragmentos de traços-produzidos, elementos doácido nucléico para realizar o rompimento do gene, esimilares.Os métodos de transfecção de células sãoconhecidos na técnica. Por "transfectada" significa umaalteração em uma célula resultando da absorção do ácidonucléico estrangeiros, geralmente DNA. Uso do termo"transfecção" não é pretendido limitar a introdução do ácidonucléico estrangeiros a nenhum método particular. Os métodosapropriados incluem a infecção viral, conjugação,eletroporação, tecnologia de injeção de partícula,precipitação do fosfato de cálcio, microinjeção direta esimilar. A escolha do método é geralmente dependente do tipode célula transfectada e das condições sob a qual atransfecção está ocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo ou invivo). Um exame geral destes métodos pode ser encontradoAusubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rded., Wiley & Sons, 1995.

Os termos "molécula de ácido nucléico","polinucleotídeo" são usados permutavelmente e referem-se auma forma polimérica dos nucleotídeos de qualquercomprimento, tanto deoxiribonucleotídeos ouribonucleotídeos, ou análogos destes. Os polinucleotídeospodem ter qualquer estrutura tridimensional e podem executarqualquer função, conhecida ou desconhecida. Os exemplos dospolinucleotídeos não limitantes incluem um gene, umfragmento do gene, éxons, íntrons, um RNA mensageiro (mRNA),um RNA transferente, RNA ribosomal, ribozimas, cDNA,polinucleotídeo de recombinação, polinucleotídeoramificados, plasmídeo, vetores, DNA isolado de qualquerseqüência, regiões de controle, RNA isolado de qualquerseqüência, sondas de ácido nucléico e iniciadores. Amolécula do ácido nucléico pode ser linear ou circular.

Um polinucleotídeo é tipicamente composto de umaseqüência específica de quatro bases dos nucleotídeos:adenina (a) ; cito sina (c) ; guanina (g) ; e timina (T)(uracil (U) para a timina (T) quando o polinucleotídeo forRNA). Assim, o termo a seqüência do polinucleotídeo é arepresentação alfabética de uma molécula do polinucleotídeo.Esta representação alfabética pode ser entrada em bases dedados em um computador que tem uma unidade do processadorcentral e ser usada para aplicações de bioinformãtica, taiscomo, a pesquisa funcional genômica e de homologia.

Uma "seqüência de codificação" ou uma seqüênciaque "codifica" um polinucleotídeo selecionado é uma moléculade ácido nucléico que é transcrita (no caso de DNA) etraduzida (no caso de mRNA) em um polinucleotídeo, porexemplo, in vivo quando colocado sob o controle deseqüências reguladoras apropriadas (ou de "elementos decontrole"). Os limites da seqüência de codificação sãodeterminados tipicamente por um códon inicial no 5' (amino)terminal e um códon de parada da tradução na 3' (carbóxi)terminal. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas nãosendo limitada a, cDNA de mRNA viral, procariótico oueucariõtico, seqüências de DNA genômico de DNA viral ouprocariótico e mesmo seqüências sintéticas de DNA. Umaseqüência da terminação da transcrição pode ser localizada3' para a seqüência de codificação. Outros "elementos decontrole" podem também ser associados com uma seqüência decodificação. Uma seqüência do DNA que codifica umpolipeptídio pode ser aperfeiçoada para a expressão em umacélula selecionada usando os códons preferidos pela célulaselecionada para representar a cópia do DNA da seqüência decodificação do polipeptídio desejado.

"Codificado pelo" refere-se a uma seqüência doácido nucléico a qual códons para uma seqüência dopolipeptídio, onde a seqüência do polipeptídio ou uma porçãodo mesmo contêm uma seqüência do aminoácido de pelo menos 3a 5 aminoácidos, melhor pelo menos 8 a 10 aminoácidos, emais preferivelmente pelo menos 15 a 20 aminoácidos de umpolipeptídio codificado pela seqüência do ácido nucléico.Também são abrangidas as seqüências do polipeptídio que sãoimunologicamente identificáveis com um polipeptídiocodificado pela seqüência.

"Operativamente ligados" refere-se a um arranjodos elementos onde os componentes assim que descrito sãoconfigurados para executar sua função usual. Assim, um dadopromotor que seja operativamente ligado a uma seqüência decodificação (por exemplo, um cassete de expressão dorepórter) é capaz de efetuar a expressão da seqüência decodificação quando as enzimas apropriadas estão presentes. 0promotor ou outros elementos de controle não precisam sercontínuos com a seqüência de codificação, contanto quefuncione para dirigir a expressão do mesmo. Por exemplo,intervindo nas seqüências não-translatadas já transcritaspodem estar presentes entre a seqüência do promotor e aseqüência de codificação e a seqüência do promotor podeainda ser considerada "operativamente ligada" à seqüência decodificação.

Pelo "domínio genômico" é significado uma regiãogenômica que inclua um ou mais, tipicamente uma pluralidadede, éxons, onde os éxons são tipicamente agrupados juntodurante a transcrição para produzir um mRNA, onde o mRNAcodifique freqüentemente um produto de proteína, porexemplo, uma proteína terapêutica, etc. Em muitasincorporações, o domínio genômico inclui os éxons de um dadogene, e pode também ser referido aqui como um "gene." Amodulação da transcrição do domínio genômico conforme aosresultados dos métodos sujeitados a pelo menos modulação deaproximadamente 2 dobras, às vezes pelo menosaproximadamente 5 dobras e às vezes pelo menos cerca de 10dobras, por exemplo, aumento ou diminuição, da transcriçãodo domínio genômico alvejado em comparação a um controle,para aqueles exemplos onde pelo menos alguma transcrição dodomínio genômico alvejado ocorre no controle. Por exemplo,nas situações onde um dado domínio genômico é expresso asomente baixos níveis em uma célula alvo não-modifiçada(usada como um controle) , os métodos sujeitos podem serempregados para obter pelo menos um aumento de 2 dobras natranscrição em comparação a um controle. Os níveis datranscrição podem ser determinados usando qualquer protocoloconveniente, onde os protocolos representativos paradeterminar níveis da transcrição incluem, mas não sãolimitados: Hibridação de blot de RNA, PCR-RT, proteção doRNAse e similares.

Pelo "constructo de ácido nucléico" significa umaseqüência do ácido nucléico que seja construída paracompreender uma ou mais unidades funcionais não encontradasjunto na natureza. Os exemplos incluem filamentoscirculares, lineares, duplos, moléculas de DNAextracromosômico (plasmídeo), cosmídios (plasmídeos quecontêm seqüências COS do fago lambda), genomas virais quecompreendem seqüências inativas do ácido nucléico, esimilares.

Um "vetor" é capaz de transferir seqüências dogene às células alvo. Tipicamente, "constructo de vetor","vetor de expressão" e " vetor de transferência do gene"significam qualquer constructo de ácido nucléico capaz dedirigir a expressão de um gene de interesse e que podetransferir seqüências do gene às células alvo. Assim sendo,o termo inclui veículos de clonagem e de expressão, assimcomo vetores de integração.

Um "cassete de expressão" compreende qualquerconstructo de ácido nucléico capaz de dirigir a expressão deuma seqüência do gene/codificação de interesse. Taiscassetes podem ser construídos em um "constructo de vetor","vetor de expressão" ou "vetor de transferência de gene" afim de transferir a expressão do cassete dentro de célulasalvo. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e deexpressão, assim como vetores virais.

Na presente invenção, quando uma recombinase for"derivada de um fago", a recombinase não precisa serproduzida explicitamente pelo próprio fago, o fago éconsiderado simplesmente sendo a fonte original dasseqüências da recombinase e da codificação do mesmo.

Recombinases podem, por exemplo, ser produzidasrecombinantemente ou sinteticamente, pelos métodosconhecidos na técnica, ou alternativamente, as recombinasespodem ser purificadas do fago infectadas das culturasbacterianas.

"Substancialmente purificada" refere-se geralmenteao isolamento de uma substância (composto, polinucleotídeo,proteína, polipeptídio, composição de polipeptídio) tal quea substância compreende a maioria do percentual da amostraas quais resíduos.

Tipicamente em uma amostra um componentesubstancialmente purificado compreende 50%, preferivelmente80%-85%, melhor 90-95% da amostra. As técnicas parapurificação de polinucleotídeo e polipeptídios de interessesão conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, acromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade esedimentação de acordo com a densidade.

A termo "exógeno" é definido aqui como o DNA que éintroduzido em uma célula pelo método da presente invenção,tal como com os constructos de DNA definidos aqui. a DNAexógeno pode possuir seqüências idênticas ou diferentes doDNA endógeno presente na célula antes da transfecção.

Por "transgene" ou "elemento transgênico" ésignificado uma seqüência artificial introduzida,cromossomicamente integrada do ácido nucléico presente nogenoma de um organismo hospedeiro.

0 termo "animal transgênico" significa um animalnão-humano que tem um elemento transgênico integrado nogenoma de uma ou mais células do animal. "Animaistransgênicos" como usados aqui abrangem assim os animais quetêm toda ou quase todas as células que contêm umamodificação genética (por exemplo, animais inteiramentetransgênicos, animais particularmente transgênicos que têmum transgene hereditário) assim como os animaistransgênicos, quiméricos, em que um subconjunto das célulasdo animal é modificado para conter o transgene genomicamenteintegrado.

"Célula alvo" como usada aqui se refere a umacélula na qual uma modificação genética é desejada. Ascélulas alvo podem ser isoladas (por exemplo, em cultura) ouem um organismo multicelular (por exemplo, em umblastocisto, em um feto, em um animal pós-natal, e similar).

As células alvo de interesse particular na presenteaplicação incluem, mas não são limitadas a, célulasmamíferas cultivadas, incluindo células CRa, e célulastronco (por exemplo, células tronco embrionárias (porexemplo, células que têm um fenõtipo embrionário da célulatronco), células tronco adultas, células troncopluripotente, células tronco hematopoiético, células troncomesenquimal e similares).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O objeto da invenção fornece um sistema deintegração local-específico e métodos gerando linhagemeucariótica das células para a produção de proteína, asistema fornecido inclui um primeiro vetor alvo que integraespecificamente o local e um segundo vetor doador queintegra especificamente o local compreendendo um gene deinteresse.

Também é fornecida linhagem celular eucarióticaproduzida pelos métodos e pelos sistemas sujeitos, assimcomo kits que incluem os sistemas revelados.

Antes que a presente invenção seja descrita, deveser compreendida que esta invenção não é limitada àsincorporações particulares descritas, porque tais podem,naturalmente, variar. Deve também ser compreendido que aterminologia usada aqui é com a finalidade de descrever asincorporações particulares somente, e não é pretendida paralimitar, visto que o escopo da presente invenção serálimitado somente pelas reivindicações adicionadas.

Onde uma escala dos valores é fornecida,compreende-se que cada valor de intervenção, ao décimo daunidade do menor limite a menos que o contexto ditarclaramente de outra maneira, entre os limites superiores einferiores dessa escala é também especificamente divulgado.Cada escala menor entre qualquer valor indicado ou valor deintervenção em uma escala indicada e em um valor indico oude intervenção qualquer outro valor de intervenção ouindício na escala indicada é englobado dentro da invenção.Os limites superiores e inferiores destas escalas menorespodem independente ser incluídos ou excluídos na escala ecada escala onde, nem ou ambos os limites são incluídos nasescalas menores é também abrangida dentro da invenção,revelado alguns limite especificamente excluído na escalaindicada. Onde a escala indicada inclui um ou ambos doslimites, as escalas com exclusão tanto uma ou ambas daqueleslimites incluídos são também incluídas na invenção.

A menos que definidos de outra maneira, todos ostermos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmosignificado como geralmente compreendido por uma pessoa comhabilidade ordinária na técnica a qual esta invençãopertence. Embora todos os métodos e materiais similares ouequivalentes a aqueles descritos aqui possam ser usados naprática ou teste da presente invenção, alguns métodos emateriais potenciais e preferidos são agora descrito. Todasas publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui pelareferência para divulgar e descrever os métodos e/ou osmateriais em relação da qual as publicações são mencionadas.

Compreende-se que a presente descrição substitui qualquerdivulgação de uma publicação incorporada à medida que existeuma contradição. [00 93] Deve-se notar que como usado aqui enas reivindicações adicionadas, a forma singular "um", "uma"e "o" inclui referentes plurais a menos que o contexto ditaclaramente de outra maneira. Assim, por exemplo, referênciaa "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e areferência para "o vetor" inclui a referência a um ou maisvetores e equivalentes conhecidos deste para àqueles hábeisna técnica, e assim por diante.

As publicações discutidas aqui são fornecidasunicamente para sua divulgação antes da data de depósito dapresente aplicação. Nada aqui deve ser interpretado como umaadmissão que a presente invenção não está intitulada paraantedata da tal publicação em virtude da invenção prévia.Mais, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentesdas datas de publicação reais a qual podem precisar serindependentemente confirmada.

VISTA GERAL

Em geral, a presente invenção fornece um primeirovetor alvo integrando especificamente ao local e um segundovetor doador integrando especificamente ao local quecompreendem um gene de interesse para o uso em gerar aslinhagens de células mamíferas capazes da produção daproteína. Os elementos do vetor alvo são selecionados demodo que uma primeira integrase local-específico unidirecional reconheça um primeiro local de recombinaçãolocal-específico presente no vetor alvo e um local derecombinação local-específico genômico no genoma da célulaalvo, resultando na integração do vetor alvo tendo um local-específico de recombinação alvo para uma segunda integraselocal-específico unidirecional dentro do genoma da célulaalvo.

A linhagem celular resultante que tem um local derecombinação local-específico alvo para a segunda integraselocal-específico unidirecional pode então ser usadaeficientemente para gerar uma linhagem celular capaz deproduzir uma proteína desejada. Um vetor doador que tem umpolinucleotídeo codificando uma proteína de interesse e umlocal de recombinação local-específico do doador para asegunda integrase local-específico unidirecional pode serintroduzido na linhagem celular, resultando na integração dovetor doador no genoma da célula alvo. Visto que aintegração do transgene pode ser dirigida em uma maneiralocal-específica, a presente invenção é útil para fornecer aintegração de um transgene em uma posição desejável e evitara baixa expressão do transgene devido à integração em umaposição indesejável.

A invenção será descrita agora em maior detalhe.

VETORES

Como observado acima, o sistema inclui um vetoralvo para integrar um local de recombinação local-específicodentro do genoma de uma célula alvo e um vetor doador paraintegrar um polinucleotídeo que codifica uma proteína deinteresse dentro do local de recombinação local-específicointroduzido. Os vetores são tipicamente circulares e podemtambém conter marcadores selecionáveis, uma origem dereplicação e outros elementos, tais como, um promotor,seqüências do promotor-realçador, uma seqüência marcadora deseleção, uma origem de replicação, uma seqüência de elementoindutível, um epitopo de seqüência Tag e similares. Veja,por exemplo, a patente US N0 6.632.672, a divulgação de queé incorporada pela referência aqui em sua totalidade.

A presente invenção fornece um vetor alvo quecompreende (a) um primeiro local de recombinação local-específico do vetor capaz de recombinação com um local derecombinação genômico no genoma de uma célula eucariótica napresença de uma primeira recombinase local-específicounidirecional; (b) um segundo local de recombinação local-específico do vetor capaz de recombinação com um local derecombinação local-especifico em um vetor doador na presençade uma segunda recombinase local-específico unidirecional;(c) uma primeira porção de um primeiro marcador selecionável(por exemplo, um primeiro marcador selecionável do promotor-menor) adjcente a um lado 3' do local derecombinação local-específ ico; e (d) um segundo marcador selecionável que sejadiferente do primeiro marcador selecionável, e a primeirarecombinase local-específico unidirecional seja diferentedoa segunda recombinase local-específico unidirecional. Umvetor alvo exemplificativo é fornecido na FIG. 1.

A presente invenção também fornece um vetor doadorque compreende (a) um local múltiplo de clonagem; (b) umlocal de recombinação local-específico do doador que sejacapaz de recombinação com o local de recombinação local-específico do segundo vetor do vetor alvo na presença de umasegunda recombinase local-específico unidirecional; e (c)uma segunda porção de um primeiro marcador selecionável (porexemplo, promotor) adjacente ao lado 5' do local derecombinação local-específico do doador. Em determinadasincorporações, o vetor doador também compreende umpolinucleotiídeo que codifica uma proteína de interessepresente no local múltiplo de clonagem. Um vetor doadorexemplificativo é fornecido na FIG. 2.

Duas famílias principais de recombinases local-específicos unidirecionais das bactérias e dos fermentosunicelular foram descritas: a família da recombinase deintegrase ou de tirosine inclui aCre, Flp, Rea integraselambda (Argos, et al, EMBO 1. 5:433-440, (1986)) e a famíliada recombinase resolvase/invertase ou serina incluindoalgumas integrases do fago, tais como, aqueles dos fagocpC31, R4, e TP901-1 (Hallet e Sherratt, Microbiol de FEMS.Rev. 21: 157-178 (1997)). Para uma descrição suplementar derecombinases local-específicos apropriados, veja a patenteU.S. N0 6,632,672 e publicação de patente U.S. N020030050258, as divulgações de que são incorporados aquipela referência em suas totalidades.

Em determinadas incorporações, a recombinaselocal-específico unidirecional é uma serina integrase. Asserina integrases que podem ser úteis para recombinação invitro e in vivo inclui, mas não são limitados a, integrasesdos fagos cpC31, R4, TP901-1, phiBTI, Bxbl, RV-1, AI 18,Ul53, e phiFCI, assim como outro na grande família de serinaintegras e (Gregory, Till and Smith, J. BacterioL, 185:5320-5323 (2003); Groth and Calos, 1. MoI. Biol. 335:667-678(2004); Groth et al. PNAS 97:5995-6000 (2000); Olivares,Hollis and Calos, Gene 278:167-176 (2001); Smith and Thorpe,Molec. Microbiol, 4:122-129 (2002); Stoll, Ginsberg andCalos, 1. BacterioL, 184:3657-3663 (2002)). Além do queestas integrases do tipo selvagem, integrases alteradas quecarregam mutações foi produzido (Sclimenti, Thyagarajan eCalos, NAR, 29:5044 - 5051 (2001)). Estas integrases podemter alterado a atividade ou a especificidade comparada aotipo-selvagem e são também úteis para reação de recombinaçãoin vitro e a reação de integração no genoma eucariótico.Era incorporações representativas, a primeirarecorabinase local-específico unidirecional e a segundarecombinase local-específico uni direcional são diferentes.Cada recorabinase local-específico unidirecional tem oslocais de recombinação local-específicos distintos (ATT oulocais acessório) que não recombine com os locais doacessório de outras recombinases local-específicosunidirecionais. Usando duas recombinases local-específicounidirecionais diferentes em ordem, um para a integração dovetor alvo e então a outra para a integração do vetordoador, não há nenhuma possibilidade para uma recombinaçãointraraolecular não desejada dentro do vetor alvo inicialentre o local do acessório para a integração genômica dovetor alvo e o local do acessório para o uso na integraçãodo vetor doador. É desejável evitar tais eventosintramoleculares de recombinação porque não somente criariamos locais híbridos que não podem integrar-se no genoraa dacélula alvo, mas também podem conduzir a deleção deelementos importantes da seqüência no vetor alvo.

Conformemente7 as primeira e segunda recombinaseslocal-específico unidirecionais devem ser derivados de fagodiferentes, por exemplo, <pC31, R4, TP90 1-1, phiBTI, Bxbl,RV-1, Al18, U153, e phiFCI, ou podem ser derivados do mesmofago, mas pelo menos uma da primeira e segunda recombinaselocal-específico unidirecional é uma recombinase local-específico uni direcional alterada como que reconhece umdiferente local de recombinação local-específico do que olocal de recombinação local-específico reconhecido pelorecombinase local-específico uni direcional tipo-selvagemcorrespondente.

Em geral, os locais de recombinação local-específ icos reconhecidos por uma recombinase local-específico em um genoma bacteriano são designados locais deacessório bacterianos ("attB") e os locais de recombinaçãode locais- específicos correspondentes presentes nobacteriófago são designados locais acessório do fago("attP"). Estes locais têm um comprimento mínimo deaproximadamente 34-40 pares de bases (bp) Groth, C.A., eoutros, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 97, 5995-6000 (2000)).Estes locais são arranjados tipicamente como segue: AttBcompreende uma primeira seqüência de DNA attB5', região dodo núcleo, e uma segunda seqüência de DNA attB3 ' de ordemrelativa attB5' - região do núcleo-attB31; o attP compreendeuma primeira seqüência de

DNA (attP5'), uma região de núcleo, e uma segundaseqüência de DNA (attP3') na ordem relativa attP5' - regiãodo nücleo-attP31.

Por exemplo, para o attP do fago cpC31 (o localacessório do fago), a região de núcleo é 5'-TTG-3'seqüências flanqueada de cada lado são representadas aquicomo attP5' e attP3' , a estrutura do local do recombinaçãodo attP é, conformemente, attP5'-TTG-attP31.

Correspondentemente, para o local alvo {attB) genômicobacteriano nativo a região do núcleo é 5'-TTG-3' , e asseqüências flanqueadas de cada lado são representadas aquicomo attB5' e attB3', a estrutura do local de recombinaçãodo attB é, conformemente, attB5' - TTG-attB3'.

Como os locais attB e attP são seqüênciasdiferentes, a recombinação conduz a um local de recombinaçãolocal-específico híbrido (designado attL ou attR paraesquerdo e direito) que nem é uma seqüência attB ou nem umaseqüência attP, e é funcionalmente não-reconhecida como umlocal de recombinação local-específico (por exemplo, attB ouattP) para a recombinase local-específico unidirecionalrelevante, assim removendo a possibilidade que a recombinaselocal-específico unidirecional catalisará uma segunda reaçãode recombinação entre o attL e o attR que inverteriam aprimeira reação de recombinação. Por exemplo, após um único-local, mediado por cpC31 integrase, evento de recombinaçãoocorre no resultado de que é o seguinte produto derecombinação: attJ351 -TTG-attP31 {seqüências do vetor cpC3l}attPS 1-TTG-atfcB3'. Tipicamente, depois da recombinação oslocais de recombinação pós-recombinação já podem não atuarcomo um substrato para a cpC31 recombinase. Isto resulta naintegração estável com pouca ou nenhuma excisão mediada porrecombinase.

O local de recombinação nativo tem sido encontradopara existir nos genomas de uma variedade de organismos,onde o local de recombinação nativo não tem necessariamenteuma seqüência de nucleotídeos idêntica a seqüências derecombinação do tipo-selvagem (para uma dada recombinase);mas tais locais de recombinação nativos são, todaviasuficientes para promover a recombinação mediada pelarecombinase. Tais seqüências do local de recombinação sãoreferidas aqui como "seqüências de pseudo-recombinação" Parauma dada recombinase, uma seqüência de pseudo-recombinação éfuncional equivalente a uma seqüência de recombinação dotipo selvagem, ocorre em um organismo à exceção daquele emque a recombinase é encontrada na natureza, e pode ter avariação da seqüência relativa a seqüência de recombinaçãodo tipo selvagem.

A identificação de seqüências de pseudo-recombinação pode ser realizada, por exemplo, usando oalinhamento da seqüência e a análise, onde a seqüência emquestão é o local de recombinação de interesse (por exemplo,attP e/ou attB).

O genoma de uma célula alvo pode ser procurado porseqüências tendo identidade de seqüência ao local derecombinação selecionado para uma dada recombinase, porexemplo, attP e/ou attB de cpC31 ou R4. As bases de dados daseqüência do ácido nucléico, por exemplo, podem serprocuradas pelo computador. O algoritmo dos moldes-fornecidos do Wisconsin software Packge Version 9.0desenvolvida pelo Genetics computer Group (GCG; Madison,Wis.), é um exemplo do programa usado para selecionar todasas seqüências na base de dados do GenBank (Benson et al,1998, Nucleic Acids Res. 26, 1-7). Neste aspecto, aoselecionar locais de pseudo-recombinação em uma célula alvo,as seqüências genômicas da célula alvo podem ser procuradaspor locais de pseudo-recombinação apropriados usando asseqüências attP ou attB associadas com uma recombinaseparticular ou recombinase alterada. Os tamanhos funcionais ea quantidade de heterogeneidade que pode ser tolerada nestasseqüências de recombinação podem empiricamente seravaliados, por exemplo, próximo ã eficiência de avaliação daintegração de uma construção de escolha de objetivos usandouma recombinase alterada da presente invenção (para métodosexemplificativos de avaliar eventos de integração, veja, WO00/11155, publicado em 02 de março de 2000) .

Os pseudo-locais funcionais podem também serencontrados empiricamente. Por exemplo, as experiênciasexecutadas na sustentação da presente invenção mostraram queapós a co-transfecção em células humanas de um plasmídeo quecarrega o attB (pC31 e o gene de resistência à neomicina,junto com um plasmídeo expressando a (pC31 integrase, umnúmero elevado de colônias resistentes a neomicina é obtido,comparado aos co-transf ecções em que o attB ou o gene deintegrase foram omitidos. A maioria destas colôniasrefletiram a integração em locais attP pseudo nativos. Taislocais são recuperados, por exemplo, pelo resgate doplasmídeo e analisados a nível da seqüência de DNA,produzindo, por exemplo, a seqüência de DNA de um localpseudo attP do genoma hutna.no. Este método empírico para aidentificação dos pseudos-locais pode ser usado, mesmo se umconhecimento detalhado dos locais de reconhecimento dorecombinase e a natureza do recombinase que liga a eles sãodesconhecidos.

Em algumas incorporações, o primeiro local derecombinação do vetor do vetor alvo é um local derecombinação genômico bacteriano (attB) ou um local derecombinação genômico do fago (attP) reconhecido por umaprimeira recombinase local-específico. Em taisincorporações, o local de recombinação genômico presente nogenoma da célula alvo é um local correspondente a pseudo-recombinação. Por exemplo, onde o primeiro local derecombinação do vetor do vetor alvo é um local derecombinação genômico bacteriano (attB), o local pseudo-recombinação genômico presente no genoma da célula alvo é umlocal de recombinação genômico do pseudo-fago (pseudo-attP).Do mesmo modo, onde o primeiro local de recombinação dovetor do vetor alvo é um local de recombinação genômica dofago (attP) , o local de pseudo-recombinação genômicapresente no genoma da célula alvo é um local de recombinaçãogenômico pseudo-bacteriano (pseudo- attB) .

Algumas recombinases local-específicosunidirecionais integram preferencial dentro de locais derecombinação pseudo-bacterianos (por exemplo, pseudo-attS),um pouco do que locais de recombinação do pseudo-fago (porexemplo, pseudo-attP). Nestes casos, o vetor alvo carrega umlocal de recombinação do fago (attP) e integrá-lo-á dentrodo local pseudo-attB. Os exemplos das enzimas com estapreferência são phiBTI integras e A118 integrase. Em taisincorporações, o primeiro local de recombinação do vetor dovetor alvo é um local attP e o local de recombinaçãogenômico no genoma da célula alvo é um local pseudo-attB.Outras recombinases unidirecionais, local-específicos, taiscomo (pC31 e R4, preferem integrar em locais acessório dopseudo-fago (locais pscudo-attP) preferencialmente do quelocais de recombinação pseudo-bacterianos (locais pseudo-attB), então o vetor alvo carrega um local attB e integrá-lo-á em um local pseudo-attP (Groth et al. , 2000; Olivares,Hollis e Calos 2001). Em tais incorporações, o primeirolocal de recombinação do vetor do vetor alvo é um local attBe o local de recombinação genômico no genoma da célula alvoé um local pseudo-attP.

Além disso, em determinadas incorporações, oprimeiro local de recombinação do vetor do vetor alvo é umlocal de pseudo-recombinação e o local de recombinação atualno genoma da célula de alvo é um local correspondente dopseudo-recombinação reconhecido por uma primeira recombinaselocal-específico. Por exemplo, onde o local de recombinaçãodo vetor do vetor alvo é um local de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB), o local de pseudo-recombinação presente no genoma da célula alvo é um local derecombinação genômico pseudo-fago (pseudo-attP). Do mesmomodo, onde o primeiro local de recombinação do vetor dovetor alvo é um local de recombinação genômico do pseudo-fago (pseudo-attP), o local de pseudo-recombinação presenteno genoma da célula alvo é um local de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-att-B).

Em algumas incorporações, o segundo local derecombinação do vetor do vetor alvo é um local derecombinação genômico bacteriano (attB) ou um local derecombinação genômico do fago (attP) reconhecido por umasegunda recombinase local-específico. Em tais incorporações,o local de recombinação do doador no vetor doador é um localde recombinação correspondente. Por exemplo, nasincorporações onde o segundo local de recombinação do vetordo vetor alvo é um local de recombinação genômico bacteriano{attB), o local de recombinação do doador presente no vetordoador é um local de recombinação genômico do fago (attP).Do mesmo modo, onde o segundo local de recombinação do vetordo vetor alvo é um local de recombinação genômico do fago(attP), o local de recombinação do doador presente no vetordoador é um local de recombinação genômico bacteriano(attB).

Como observado acima, o vetor alvo inclui umaprimeira porção de um primeiro marcador selecionáveladjacente a um lado 3' do segundo local de recombinação dovetor e o vetor doador inclui uma segunda porção do primeiromarcador selecionável adjacente a um lado 5' do local derecombinação do doador. Na presença de uma segundarecombinase local-específico unidirecional o segundo localde recombinação do vetor no vetor alvo recombina com o localde recombinação do doador presente no vetor doador paragerar um local de recombinação híbrido. Como um resultado darecombinação, a primeira porção do marcador selecionável novetor alvo e a segunda porção do marcador selecionável novetor doador são levadas dentro de grande proximidade parafornecer um primeiro marcador selecionável funcionalreconstituído. Portanto, a seleção que usa o primeiromarcador de seleção pode ser usada para selecionar eventosbem sucedidos de recombinação entre um vetor alvo presenteno genoma de uma célula alvo e o vetor doador que tem umpolinucleotídeo codificando uma proteína de interesse.

Em uma incorporação do primeiro gene marcadorselecionável reconstituído do promotor ê fornecido pelovetor doador e uma região de codificação para um sinalselecionável do gene e de poliadenilação do marcador éfornecida pelo vetor alvo. Em outra incorporação do genemarcador selecionável reconstituído o vetor doador podeconter um promotor, uma parte N-terminal da região decodificação, e metade 5' de um íntron, enquanto o vetor alvopuder conter a metade 31 de um íntron, a parte C-terminal daregião de codificação e um sinal de poliadenilação. Em umaincorporação suplementar do gene marcador selecionávelreconstituído o vetor doador pode conter um promotor e parteN-terminal da região de codificação enquanto o vetor alvopuder conter a parte C-terminal da região de codificação eum sinal de poliadenilação. Ainda em outra incorporação, ovetor doador inclui um promotor e o vetor alvo inclui ummarcador selecionável do promotor-menor. Em todas estasincorporações do gene marcador selecionável reconstituído, acaracterística chave é que os elementos genéticos presenteno alvo separado e os vetores doadores são incapazes deconferenciar resistência à droga independente de outro.

Entretanto quando o vetor doador é integrado no vetor alvoum cassete de expressão funcional completo do gene é montadanas células as quais contêm tal configuração serãoresistentes à droga que é usada para selecionar para apresença do gene marcador selecionável reconstituído.

As seqüências do promotor e do promotor-realçadorsão as seqüências do DNA a qual a RNA polimerase liga-se einicia a transcrição. 0 promotor determina a polaridade dotranscrito pela especificidade a qual o filamento serátranscrito. Os promotores bacterianos consistem nasseqüências consenso, -35 e-10 nucleotídeos, relativo aocomeço transcricional, que são limitados por um fator sigmae por uma RNA polimerase específica.

Promotores eucarióticos são mais complexos. Amaioria dos promotores eucarióticos utilizados em vetores deexpressão é transcrita pela RNA polimerase II. Fatores detranscrição gerais (GTFS) primeiro ligam seqüênciasespecíficas perto do local do início da transcrição erecrutam então o emperramento da RNA polimerase II. Alémdisso, estes mínimos elementos de promotor, pequenaseqüência de elementos são reconhecidos especificamente pelaligação modular de DNA, proteínas de ativação-trans (porexemplo, AP-1, SP-1) que regulam a atividade de um dadopromotor. Os promotores virais servem para a mesma funçãoque os promotores bacterianos ou eucarióticos e requerem umaRNA polimerase promotor-específico no transporte (porexemplo, RNA polimerase do bacteriófago T7 nas bactérias) ourecrutam os fatores celulares e RNA polimerase II (emcélulas eucarióticas). Os promotores virais (por exemplo,promotores SV4 0, RSV e CMV) podem ser preferidos porque sãogeralmente particularmente promotores fortes.

Os promotores podem ser, além disso, constitutivosou reguláveis. Os promotores constitutivos expressamconstantemente o gene de interesse. Ao contrário, genesexpressos dos promotores reguláveis (isto é, de repressão ouindução) de interesse somente sob determinadas condições quepodem ser controladas. Os elementos de repressão são oselementos da seqüência de DNA que atuam conjuntamente compromotores e ligam os repressores (por exemplo, sistema dorepressor de lacO/laclq em E. Co li) . Os elementosinduzíveis são os elementos da seqüência de DNA que atuamconjuntamente com promotores e ligam os indutores (porexemplo, sistema indutor gall/gal4 da levedura). Em um ououtro caso, a transcrição é virtualmente "desligada" até opromotor seja reprimido ou induzido pela alteração de umacondição no ambiente (por exemplo, adição de IPTG ao sistemalacO/lacIq ou adição de galactose ao sistema gall/gaI4), emque o ponto de transcrição é "ligado".

Outro tipo de promotor regulado é uma "repressão"em que um gene é expresso inicialmente e pode então serdesligado alternando uma condição ambiental. Em sistemas derepressão a transcrição é constitutivaraente ligada até que orepressor ligue-se a uma pequena molécula reguladora em queo ponto de trnscrição seja "desligado". Um exemplo destetipo de promotor é o istema de tetraciclina/repressor detetraciclina. Neste sistema quando a tetraciclina liga-se aorepressor de tetraciclina, o repressor liga-se a um elementodo DNA no promotor e desliga a expressão de gene.

Os exemplos de promotores procarióticosconstitutivos incluem o promotor λ do bacteriófago, promotorbla da seqüência do gene β-lactamase de pBR322, promotor CATda seqüência do gene do cloranfenicol cetil transferase depPR325, e similares.

Os exemplos de promotores procarióticos induziveisincluem os principais promotores direito e esquerdo dobacterióf ago (PL e PR) , promotores trp, recA, IacZ, AraC egal de E. Coli, a a-amilase (Ulmanen Ett at. , J. Bacteriol.162: 176-182, 1985) e promotores específicos sigma-28 de B.subtilis (Gilman et al. , Gene sequence 32:11-20 (1984)), ospromotores dos bacteriófagos do Bacillus (Gryczan, In: TheMolecular Biology ofthe Bacilli, Academic Press, Inc., NY(1982)), Promotores de Streptomyces (Ward et at. , MoI. Gen.Genet. 203:468-478, 1986), e similares. Os promotoresprocarióticos exemplares são revistos por Glick (1. Ind.Microtiot. 1 :277 -282, 1987); Cenatiempo (Biochimie 68:505-516,1986); e Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18:415 - 442,1984).

Os promotores eucarióticos constitutivosexemplificativos incluem, mas não são limitados aosseguintes: o promotor da seqüência do gene de metalotioneinaI de rato (Hamer et al. , 1. MoI. Appl. Gen. 1 :273-288,1982); o promotor TK do vírus da herpes (McKnight,Cell31:355-365, 1982); promotor SV40 adiantado (Benoist etal, Nature (London) 290:304- 310, 1981); promotor daseqüência do gene gall da levedura (Johnston e outros, Proc.Natl. Acad. Sei, (USA) 79:6971 - 6975, 1982); Silver Et al. ,Proc, Natl. Acad. Sei. (USA) 81:5951 -59SS, 1984), promotorCMV, promotor EF-I.

Os exemplos de promotores eucarióticos induzíveisincluem, mas não são limitados aos seguintes: promotoresresponsáveis-eedisona, promotor tetraciclina-responsável,promotores regulados pelo "dimerizeres" que traz duasporções de um fator de transcrição junto, promotoreshormonas-responsáveis, promotores progesterona-responsáveis,promotores riboswitch-reguláveis, promotores antibiótico-regulados, promotores acetaldeido-regulados e similares.

Alguns promotores regulados podem mediar arepressão e a ativação. Por exemplo, no sistema RheoSwitchuma proteína (o RheoReceptor) liga-se a um elemento do DNA(UAS, seqüência de ativação a montante) no promotor e mediaa repressão. Entretanto na presença de certo indutores comoeedisona uma outra proteína (RheoAtivador) ligará aoindutor. O indutor-liga o Rheoativador que é capaz de ligar-se ao RheoReceptor ligdo ao DNA. O RheoReceptor/indutorRheoActivator é então capazes de ativar a expressão de gene.

Os genes marcadores selecionáveis comuns incluemaqueles para a resistência aos antibióticos, tais como,ampicilina, tetraciclina, canamicina, bleomicina,estreptomicina, higromicina, neomicina, puromicina, G418,bleomicina, blasticidina, Zeocina" e similares. Os genesauxotróficos selecionáveis incluem, por exemplo, hisD, quepermite o crescimento em meios livres de histidine napresença do histidinol.

Um elemento suplementar útil em um vetor deexpressão é uma origem de replicação. As origens dereplicação são os segmentos originais do DNA que contêmmúltiplas seqüências repetidas curtas que são reconhecidaspor proteínas de ligação de origem multiméricas e quepossuem um papel chave na montagem nas enzimas de replicaçãodo DNA no local de origem. As origens de replicaçãoapropriadas para o uso nos vetores de expressão empregadosaqui incluem a origem oriC de E. Coli, CoIEI de plasmídio,2/-1 e o ARS (ambos útil em sistemas da levedura) , sfl,SV40, oriP de EBV (útil em sistemas eucarióticos, tais como,um sistema mamífero), e similares.

Como observado acima, o vetor doador incluimúltiplos locais de clonagem ou um poliligante. Um múltiplolocal de clonagem ou um poliligante é um DNA sintético quecodifica uma série de locais de reconhecimento daendonuclease de restrição introduzidos em um vetor doador epermitem a clonagem conveniente dos polinucleotídeos quecodificam a proteína de interesse no vetor doador em umaposição específica.

Proteínas úteis que podem ser produzidas pelascomposições e os métodos da invenção são, por exemplo, asenzimas que podem ser usadas para a produção de nutrientes eexecutando reações enzimáticas na química, ou polipeptídiosque são úteis e disponíveis como nutrientes ou para otratamento de doenças humanas ou animais ou para a prevençãodestes, por exemplo, hormônios, polipeptídios com atividadeimunomodulatõrias, propriedades antiviral e/ou antitumoral(por exemplo, maspin) , anticorpos, antígenos virais,vacinas, fatores de coagulação, inibidores de enzima,gêneros alimentícios, e similares. Outros polipeptídiosúteis que podem ser produzidos pelos métodos da invençãosão, por exemplo, aqueles codificando hormônios, tais como,secretina, timosina, relaxina, hormônio luteinizante,hormônio da paratireóide, adrenocorticotropina, hormônio deestimulação, β-lipotropina, urogastrona ou insulina, fatoresde crescimento, tais como, fator de crescimento epidérmico,fator de crescimento semelhante-insulina (IGF), por exemplo,IGF- I e IGF-II, fator de crescimento da célula mastro,fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico derivadada linhagem da célula glial (GDNF) ou fator de crescimentode transformação (TGF), como TGF-a ou TGF-β (por exemplo,TGF-βΐ, β2 ou β3) , hormônio de crescimento, tal como,hormônios de crescimento humanos ou bovinos, interleucinas,tais como, interleucina-1 ou -2, fator inibitório damigração humana do macrófago (FIM), interferons, tais como,u-interferon humano, por exemplo, interferon-uA, aB, aD ounF, n-interferon, y-interferon ou um interferon híbrido, uminterferon, por exemplo, aA-aD- ou aB-aD-híbrido, interferonhíbrido BDBB especial, inibidores de protease, tais como, oal-antitripsina, SLPI, al-antiquimotripsina, inibidor Cl,antígenos do vírus de hepatite, tais como, o antígeno dasuperfície ou do núcleo do vírus da hepatite B ou o antígenodo vírus da hepatite A, ou da hepatite não-A e não-B (istoé, antígeno do vírus da hepatite C), ativadoresplasminogênicos, tais como, o ativador plasminogênico detecido ou uroquinase, fatores de necrose tumoral (porexemplo, TNF-a ou TNF- β) , somatostatina, renina, β-endorfina, imunoglobulina, tais como as cadeias leves e/oupesadas da imunoglobulina A, D, E, G ou M ou imunoglobulinahíbridas de humano-rato, fatores de ligação daimunoglobulina, tais como, fator de ligação daimunoglobulina E, por exemplo sCD23 e similares,calcitonina, peptídeo relacionado a calcitonina humano,fatores de coagulação do sangue, tais como, o fator IX ouVIIIc, eritropoietina, eglina, tal como, eglin C,desulfatohirudina, tal como, variação HVl, HV2 ou PA dodesulfatohirudina, dismutase humano do superoxide, quinasetimidina viral, β-lactamase, glicose isomerase, proteínas detransporte, tais como, proteínas do plasma humano, porexemplo, albumina de soro e transf errina. As proteínas defusão acima podem também ser produzidas pelos métodos dainvenção.

Além disso, os níveis de uma proteína de interesseexpressada podem ser aumentados pela amplificação do vetor(veja Bebbington and Hentschel, "The use of vetors based ongene amplification for the expression of cloned genes inmammalian cells in "DNA cloning", Vol. 3, Academic Press,New York, 1987). Quando um marcador no sistema do vetor queexpressa uma proteína é amplificável, um aumento no nível deum inibidor desse marcador, quando presente na cultura decélula hospedeiro, aumentará o número de cópias do gene domarcador. Desde que a região amplificada esteja associadacom o gene da proteína-codificação, a produção da proteínade interesse aumentará concomitante (Crouse et al. , 1983,MoI. Cell. Biol, 3:257). Um sistema exemplificativo daamplificação inclui, mas não é limitado a, dihidrofolatoreductase (DHFR), que conferencia resistência a seu inibidorde metotrexato. Outros sistemas apropriados da amplificaçãoincluem, mas não são limitados a, glutamina sintetase (e seuinibidor metionina sulfoximina), timidina sintase (e seuinibidor 5-fluoruridina) , carbamil-P-sintetase/aspartatotranscarbamilase/dihidro-orotase (e seu inibidorN(fosfonacetil) - L-aspartato) , ribonucleosídeo reductase (eseu inibidor hidroxiurea) , ornitina decarboxilase (e seuinibidor ornitina diflurometil) , adenosina deaminase (e seuinibidor deoxicoformicina), e similar.

Cada um destes sistemas exige o uso de umalinhagem celular que seja deficiente no gene do marcador queé amplificado. Por exemplo, o uso do gene DHFR como um geneamplificável usa uma linhagem celular DHFR-deficiente, talcomo, uma célula DHFR-deficiente de CHO (por exemplo, DG44).Métodos são disponíveis para isolar tais linhagens celularesgene-deficientes do marcador. Um sistema de amplificação degene que não use linhagem celular gene-deficientes domarcador é um sistema que use a proteína rep (AAV-2) vírustipo 2 adeno-associado e o local de ligação da proteína rep.[00133] A maioria de genes amplificáveis do marcador podetambém ser usada como genes marcadores selecionáveis. Porexemplo, a presença do gene DHFR pode ser selecionada emcélulas deficientes de DHFR usando meios de crescimento dacélula que falta a glicina, a timidina e a hipoxantina. Apresença do gene da glutamina sintetase pode ser selecionadaem células glutamina sintetase-deficientes usando meios quefalta a glutamina, e assim por diante. Desse modo um podeassegurar-se de que o gene amplificável do marcador estejapresente a fim de mediar a amplificação do gene,especialmente antes de todos os procedimentos deamplificação do gene.

Conformemente, em determinadas incorporações, ovetor alvo também inclui um polinucleotídeo que codifica ogene marcador selecionável e amplificável DHFR. Um vetoralvo exemplificativo que inclui DHFR é fornecido na FIG. 5.Em tais incorporações, o vetor alvo que é integrado nogenoma da célula alvo é amplificado usando concentraçõescrescentes de metotrexato. Desde que o vetor alvo compreendaum segundo local de recombinase local-específico para aintegração do vetor doador, a amplificação da seqüência dovetor alvo no genoma da célula alvo conduzirá à amplificaçãodo número de segundos locais da recombinase local-específicos presentes no genoma da célula alvo. Isto forneceuma pluralidade de posições em que o vetor doador podeintegrar-se.

Em outras incorporações, o vetor de expressãodoador é integrado opcionalmente no vetor alvo-DHFR antes daexposição às concentrações crescentes de metotrexato. Emtais incorporações, o gene que codifica a proteína deinteresse situada no vetor de expressão doador tornar-se-áligada próxima (dentro de -4.000 pares de bases) ao gene deDHFR situado no vetor alvo-DHFR. Em conseqüência daexposição do metotrexato, o número de cópia do gene quecodifica a proteína de interesse será amplificado pelaseleção das células em concentrações crescentes demetotrexato.

Em um método tradicional de amplificação do gene,o gene de DHFR é co-transfectado com um vetor de expressãoda proteína em tal excesso (geralmente 100-dobras) que toma-se geralmente ligado ao vetor da expressão da proteína, massomente depois da fragmentação e da ligação de ambos osvetores por mecanismos celulares. Ao contrário de um métodotradicional de amplificação do gene, este método opcionalfornece a vantagem de poder controlar o arranjo, acomposição e a posição do gene DHFR relativo ao gene deexpressão da proteína antes da exposição ao metotrexato. Emconseqüência, isto fornecerá uma freqüência mais elevada daamplificação e do resultado bem sucedidos do gene em poucaslinhagens celulares instáveis que não expressam o gene deinteresse ou perda da expressão do gene de interesse sobre otempo.

Alternativamente, em outras incorporações, o vetordoador que tem o polinucleotídeo codificando a proteína deinteresse inclui mais um polinucleotídeo que codifica o genemarcador selecionável e amplificável DHFR. Um vetor doadorexemplif icativo que inclui DHFR é fornecido na FIG. 6. Emtais incorporações, a seqüência inteira que é integrada nogenoma, incluindo o polinucleotídeo que codifica a proteínade interesse é amplificada usando concentrações crescentesde metotrexato.

Em determinadas incorporações, o vetor doadortambém inclui um local interno da entrada de ribossomo(IRES) posicionado entre o local do início da transcrição eo cõdon da iniciação da tradução da proteína de interesse.Um vetor doador exemplificativo incluindo IRES é fornecidona FIG. 7. Tais vetores podem permitir a expressão de geneaumentada se eles são realçadores translacionais ou podemtambém permitir a produção de múltiplas proteínas deinteresse em um único transcrito, contanto que os IRESestejam localizados em 5' a cada região de codificação deinteresse.

Os vetores descritos aqui podem ser construídosutilizando as metodologias conhecidas na técnica da biologiamolecular (veja, por exemplo, Ausubel ou Maniatis) emvirtude dos ensinamentos do relatório. Um métodoexemplificativo de obter polinucleotídeo, incluindoseqüências reguladoras apropriadas (por exemplo, promotores)é PCR. Os procedimentos gerais para o PCR são ensinados emMacPherson e outros, PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Pressat Oxford University Press, (1991)). As condições do PCRpara cada reação da aplicação podem ser empiricamentedeterminadas. Um número de parâmetros influencia o sucessode uma reação. Entre estes parâmetros estão a temperatura eo tempo de anelamento, tempo de extensão, concentração deMg2 e de ATP, pH, e a concentração relativa dos iniciadores,moldes e de deoxiribonucleotídeos. Após a amplificação, osfragmentos resultantes podem ser detectados pelaeletroforese em gel de agarose seguida pela visualização comuma coloração de brometo de etídio e a iluminaçãoultravioleta.

MÉTODOS

A presente invenção também fornece métodos degerar uma linhagem celular que produz uma proteína deinteresse pelo local que integra especificamente umpolinucleotídeo que codifica a proteína de interesse nogenoma de uma célula eucariótica, tal como, uma célulamamífera. Geralmente o método envolve primeiramenteintroduzir um vetor alvo como descrito aqui em uma célulaeucariótica utilizando uma primeira recombinase local-específico uni direcional e mantendo a célula sob condiçõessuficientes para um evento de recombinação mediado pelaprimeira recombinase local-específico unidirecional entre oprimeiro local de recombinação do vetor e o local derecombinação genômico local-específico a fim de integrar olocal-especifico ao vetor alvo dentro do genoma da célula.Os eventos bem sucedidos de integração do vetor alvo mediadopela primeira recombinase local-específico uni direcionalpodem ser selecionados usando o gene marcador selecionávelpresente no vetor alvo.

Um vetor doador que compreende o polinucleotídeoque codifica uma proteína de interesse e de um local derecombinação do doador ê introduzido então na célula alvoutilizando uma segunda recombinase local-específico unidirecional. A célula alvo é mantida então sob as condiçõessuficientes para permitir um evento de recombinação mediadopela segunda recombinase local-específico unidirecional aocorrer. Como resultado, um evento de recombinação entre olocal de recombinação do doador e o segundo local derecombinação do vetor do vetor alvo permite a integraçãolocal-específica do polinucleotídeo que codifica umaproteína de interesse dentro do genoma da célula. Os eventosbem sucedidos da integração do vetor doador mediado pelasegunda recombinase local-específico unidirecional podem serselecionados usando um primeiro gene marcador selecionávelreconstituído. Em uma incorporação do primeiro gene marcadorselecionável reconstituído o promotor é fornecido pelo vetordoador e uma região de codificação para um gene marcadorselecionável e um sinal de poliadenilação é fornecida pelovetor alvo. Em outra incorporação do gene marcadorselecionável reconstituído o vetor doador pode conter umpromotor, uma parte N-terminal da região de codificação, e ametade 5' de um íntron, quando o vetor alvo puder conter ametade 3' de um íntron, a parte C-terminal da região decodificação e um sinal de poliadenilação. Em umaincorporação suplementar do gene marcador selecionávelreconstituído o vetor doador pode conter um promotor e parteN-terminal da região de codificação quando o vetor alvopuder conter a parte C-terminal da região da codificação eum sinal de poliadenilação. Em outra incorporação, o vetordoador inclui um promotor e o vetor alvo inclui um marcadorselecionável do promotor-menor. Em todas estas incorporaçõesde gene marcador selecionável reconstituído, acaracterística chave é que os elementos genéticos presentesno alvo separado e os vetores doadores são incapazes deconferenciar resistência às drogas independentes um dooutro. Entretanto quando o vetor doador é integrado no vetoralvo um cassete de expressão funcional completo do gene émontada nas células que contêm tal configuração a qual seráresistente à droga que é usada para selecionar para apresença do gene marcador selecionável reconstituído.

Em geral, a interação da integrase local-específica unidirecional com os locais de recombinaçãolocal-específico local produz um produto de recombinação quenão contém uma seqüência que atue como um substrato eficazpara a integrase local-específico unidirecional. Assim, oevento de integração empregado nos métodos sujeitos éunidirecional, com quase nenhuma excisão detectável do ácidonucléico introduzido mediado pela integras e local-específ ico unidirecional. Esta característica assegura amaior estabilidade da expressão das proteínas de interessecomparadas a outros sistemas da integração do que possa serfornecido por uma recombinase local-especifico bidirecional(por exemplo, sistema de integração lox/cre) ou que contémas seqüências diretamente repetidas (por exemplo, repetiçõesterminais longas) o qual pode resultar na deleção dos genesque codificam proteínas de interesse (por exemplo, sistemasde integração do retro vírus ou lentivírus).

Os vetores podem ser introduzidos na célulahospedeira por qualquer dos meios padrões praticados por umapessoa com habilidade na técnica para produzir uma linhagemcelular da invenção. Os vetores do ácido nucléico podem serobtidos, por exemplo, com lipídios catiônicos (Goddard, etal, Gene Therapy, 4:1231-1236,1997; Gorman, et al, GeneTherapy 4:983-992, 1997; Chadwick, et al, Gene Therapy4:937-942, 1997; Gokhale, et al, Gene Therapy4:1289-1299,1997; Gao, and Huang, Gene Therapy2:710-722, 1995, que sãoincorporados pela referência aqui), usando vetores virais(Monahan, et al, Gene Therapy 4:40-49, 1997; ano dera, etal, Blood 91 :30-36, 1998" que são incorporadas pelareferência aqui), pela tomada do "DNA despido", meiosquímico (por exemplo, fosfato de cálcio), meioseletroforéticos, e similares.

As primeira e segunda recombinases local-específico unidirecionais usadas na prática da presenteinvenção podem ser introduzidas na célula alvo antes,simultaneamente com, ou após a introdução de um vetor alvoou de um vetor doador. As primeira e segunda recombinaseslocal-específico unidirecionais podem ser introduzidas sob aforma de DNA codificando a recombinase local-específicounidirecional (Olivares, Hollis and Calos, Gene, 278:167-176(2001); Thyagarajan et al. MCB 21 :3926- 3934 (2001)), oumRNA que codifica a recombinase local-específicounidirecional (Groth et al. JMB 335:667-678 (2004); Holliset al. Repr. BioI. Endocrin. 1 :79 (2003)) ou como aproteína recombinase local-específica unidirecional.

A expressão das primeira e segunda recombinaseslocal-específico unidirecionais é tipicamente desejada paraser transiente. Isto é porque a expressão a longo prazo dasrecombinases pode promover a recombinação entre os locaispseudo att presente em várias localizações no genoma. Istopoderia conduzir aos rearranjos cromossômicos eeventualmente à morte de célula. Conformem ente, os vetorese os métodos que fornecem a expressão transiente darecombinase são preferidos na prática da presente invenção.Entretanto, a expressão estável das primeira e segundarecombinases local-específico unidirecionais pode seraceitável se for regulada, por exemplo, pela colocação daexpressão da recombinase sob o controle de um promotorregulável (isto é, um promotor cuja expressão possaseletivamente ser induzida ou reprimida).

A introdução das primeira e segunda recombinaseslocal-específico unidirecionais como proteínas tem diversasvantagens. A proteína tem uma meia-vida curta, assim que aexposição das células a recombinase local-específico unidirecional é limitada pelo tempo. Além disso, não há nenhumapossibilidade da integração do gene da recombinase local-específ ico unidirecional no genoma. As limitações comtranscrição ou tradução de recombinase local-específicounidirecional são evitadas e a cinética de reação pode sermais rápida. A introdução de proteína em células égeralmente menos tóxica do que a introdução do DNA.Conseqüentemente, a introdução de uma recombinase local-específico unidirecional do fago nas células eucarióticacomo uma proteína pode ser preferível.

As proteínas, tais como, a recombinase local-específico uni direcional do fago podem ser introduzidas emcélulas por muitos meios, incluindo a eletroporação,transportadores de peptídeo (Siprashvili, Reuter e Khavari,MoI. Ther., 9:721 - 728 (2004)), ou o acessório de domíniosdo transducção de proteína, tais como, aqueles derivados daproteína VP22 do Vírus Simples da Herpes, pepetídeosderivados-antenapedia, vários peptídeos ricos em arginina,ou proteína tat do Vírus da Imunodeficiência Humana. 0 DNAou o RNA que codificam um recombinase local-específicounidirecional podem também ser introduzidos em células pormuitos meios, incluindo eletroporação, complexação comagentes químicos, tais como, interação eletrostática commoléculas de transportador ou endocitoses.

As células apropriadas para o uso com os métodossujeitos da presente invenção são geralmente qualquer célulaeucariótica superiora, tal como, células mamíferas e célulasde levedura. Em algumas incorporações, as células são umalinhagem celular mamífera facilmente manipulada, facilmentecultivada. Em outras incorporações, as células são umalinhagem celular facilmente manipulada, facilmente cultivadade levedura. As células apropriadas que são capazes deexpressar moléculas de DNA de recombinação, incluem, mas nãosão limitadas a, células mamíferas, tais como, uma célula deroedor, tal como, células (CHO) do ovário de hamster (CHO),células BHK, células de rato que incluem células das célulasSP210 e do mieloma de NS-0, células de primata, tais como,COS e células Vera, células MDCK, células BRL 3A,hibridomas, células tumorais, células preliminares nãoimortalizadas, células humanas, tais como, W13 8, HepG2,HeLa, REK293, HT1080, ou PER.C6™, e similares.

Em algumas incorporações, a célula é uma célulaPER.C6™. Em outras incorporações, a célula é uma célula CROou uma célula dihidrofolato deficiente de reductase, talcomo, as células DG44. As células CRO transformaram-se numarotina e um sistema de produção conveniente para a geraçãode proteínas biofarmacêuticas e proteínas para finalidadesdiagnosticas. Um número de características faz dessascélulas CRO apropriada como uma célula hospedeira. Os níveisda produção que podem ser alcançados em células CRO sãoextremamente elevados. A linhagem celular fornece um sistemade produção seguro, que possa estar livre de agentesinfecciosos e de partículas virais infecciosas. As célulasCRO extensivamente foram caracterizadas sendo capazes docrescimento na suspensão até altas densidades de alcance nosbioreatores, usando meios de cultura do soro livre e ummutante deficiente de DRFR de células de CRO (DG-44 clone.Urlaub et al. , Cell. 33(2):405-12 (1983)) foi tomado paraobter um sistema fácil de seleção e de amplificaçãointroduzindo um gene exógeno de DRFR, selecionando para suapresença, e depois disso executando uma amplificação bem-controlada, por etapas do gene de DRFR e todos os genes deinteresse ligados usando concentrações crescentes demetotrexato.

LINHAGEM CELULAR

A presente invenção também fornece linhagenscelulares geradas integrando o vetor alvo descrito acima nolocal de recombinação genômico da célula alvo.Conformemente, as células sujeitas têm um cassete depolinucleotídeo integrado genomicamente compreendendo umprimeiro local de recombinação híbrido e um segundo local derecombinação híbrido que flanqueiam um local de recombinaçãodo vetor que recombina com um local de recombinação dodoador na presença de uma recombinase local-específicounidirecional; um primeiro marcador selecionável dopromotor-menor adjacente ao local de recombinação do vetorna extremidade 31 e um segundo marcador selecionável queseja diferente do primeiro marcador selecionável.Em algumas incorporações, o local de recombinaçãodo vetor é um local de recombinação genômico bacteriano(attB) ou um local de recombinação genômico do fago (attP).Em algumas incorporações, o local de recombinação do doadoré um local de recombinação genômico bacteriano (attB) ou umlocal de recombinação genômico do fago (attP). Em algumasincorporações, a recombinase local-específico unidirecionalé uma recombinase do fago cpC31, um recombinase do fagoTP901-1 ou um recombinase do fago R4. Em algumasincorporações, a célula mamífera é uma célula de roedor. Emoutras incorporações, a célula mamífera é uma célula CRO. Emoutras incorporações, a célula mamífera é uma célulaPER.C6™.

KITS

Também são fornecidos pelo objeto da invenção oskits para praticar os métodos sujeitos, como descritosacima. Em determinadas incorporações, os kits reveladosincluem pelo menos um ou mais de, e geralmente todo o vetoralvo e vetor doador como descrito acima. Em algumasincorporações, os kits também incluem uma primeira e segundacomponente recombinase local-específico unidirecional, ondeo componente recombinase possa ser fornecido em qualquerforma apropriada (por exemplo, como uma proteína formuladapara a introdução em uma célula alvo ou em um vetorrecombinase que forneça para a expressão da recombinasedesejado depois da introdução dentro da célula alvo).[0 0153] Em outras incorporações, os kits revelados incluempelo menos um ou mais de, e geralmente qualquer linhagemcelular isolada que tem um vetor alvo integrado e um vetordoador como descrito acima. Em algumas incorporações, oskits também incluem uma primeira e segunda componenterecombinase local-específico unidirecional, onde ocomponente recombinase possa ser fornecido em qualquer formaapropriada (por exemplo, como uma proteína formulada para aintrodução em uma célula alvo ou em um vetor recombinase queforneça a expressão da recombinase desejado depois daintrodução dentro da célula de alvo).

Outros componentes opcionais do kit incluemenzimas de restrição, plasmídeo de controle, tampões,materiais para a introdução de vetores em células, etc. Osvários componentes do kit podem estar presentes emrecipientes separados ou determinados componentescompatíveis podem ser pré-combinados em um único recipiente,como desejado.

Além disso, para os componentes acima mencionados,os kits revelados tipicamente também incluem instruções parauso dos componentes do kit para praticar os métodosrevelados. As instruções para praticar os métodos reveladossão geralmente gravadas em um meio apropriado de gravação.Por exemplo, as instruções podem ser impressas em umaestrutura, tal como, papel ou plástico, etc. como tal, asinstruções podem estar presentes nos kits como uma inserçãono pacote, no rótulo do recipiente do kit ou dos componentesdo mesmo (isto é, associado com o empacotamento ou sub-empacotamento) etc. Em outras incorporações, as instruçõesestão presentes como um arquivo de armazenamento de dadoseletrônico atual em um suporte de memória legível porcomputador apropriado, por exemplo, CD-ROM, disquete, etc.

Em outras incorporações, as instruções reais não estãopresentes no kit, mas em meios para obter as instruções deuma fonte remota, por exemplo, através da Internet, sãofornecidas. Um exemplo desta incorporação é um kit queinclua um endereço da web de onde as instruções possam servistas e/ou de quais as instruções possam ser transferidas.Como com as instruções, estes meios para obter as instruçõessão gravados em uma estrutura apropriada.EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são colocados assim pordiante para fornecer aqueles com habilidade ordinária natécnica uma divulgação e uma descrição completas de comofazer e usar a presente invenção, e não pretendidos paralimitar o escopo do que os inventores consideram como suainvenção nem são pretendidos para representar que asexperiências abaixo são tudo ou as únicas experiênciasexecutadas. Os esforços foram feitos para assegurar aexatidão no que diz respeito aos números usados (porexemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros edesvios experimentais devem ser esclarecidos. Salvoindicação contrária, as partes são partes por peso, o pesomolecular é peso molecular de média do peso, a temperaturaestá em graus centígrado e a pressão está ou próxima daatmosférica.

EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DO VETOR ALVO E DOADOR

A expressão de nível elevado dos transgenes foidifícil de conseguir consistentemente em células CRO e emoutras linhagens NS celulares de mamíferos por causa danatureza aleatória da integração e dos efeitos cromossomáticos associados do contexto em cima do transgeneintegrado. Usando integrases local-específicos dos fagos(pC31 e R4, vetores de integração local-específ ico podem sergerados a fim de prever a integração local-específica doscassetes de expressão que codificam um gene de interesse nogenoma de uma célula mamífera.

Os sistemas da integração cpC31 e R4 removem muitasdas limitações da integração aleatória fornecendo aintegração em um número relativamente pequeno delocalizações no genoma que são também caracterizadas pelaexpressão robusta do gene. A integração dos transgenes com aintegrase cpC31 ou R4 proporciona um método fácil para geraras linhagens celulares mamíferas que indicam a expressãoestável, de nível elevado do gene introduzido. 0 uso deintegrases do fago para gerar produção de linhagem celularreduz assim o tempo e o esforço exigido no isolamento declones apropriados para a produção da proteína.Conseqüentemente, visto que a integração é pensada para maisfavoravelmente ocorrer nos lugares nos cromossomas comcromatina aberta ou metilação reduzido, tais localizaçõestambém serão mais favoráveis para um nível mais elevado daexpressão de gene sustentada.

Vetor Alvo

Um mapa esquemático de um vetor alvoexemplif icativo para o uso na introdução a um localacessório de integras e local específico no genoma dalinhagem celular é fornecido na FIG. 1 e na FIG. 8. Em geralo vetor alvo irá incluir um primeiro local acessório parauma primeira integrase local-específico e um segundo localacessório para uma segunda integras e local-específico (porexemplo, integras e local-específica, alterada, com umaeficiência mais elevada de integração), onde a primeiro e asegunda integras e local-específica são diferentes. Osvetores alvo podem também incluir elementos suplementares,tais como um marcador selecionável bacteriano (por exemplo,β-lactamase codificando resistência à ampicilina) quefornece a seleção das células procarióticas que contêm osvetores. Além disso, o vetor pode também incluir um marcadorselecionável específico da célula mamífera (por exemplo,gene codificando higromicina B fosfotransferase codificandoresistência à droga higromicina) para selecionar as célulasmamíferas que têm o vetor alvo integrado com sucesso nogenoma e uma origem para a replicação do vetor (por exemplo,origem ColEl da replicação do DNA) em células bacterianas,tais como Ε. Coli.

Como mostrado na FIG. 12 e na FIG. 13, o vetoralvo irá ser usado para introdução de uma seqüência de ácidonucléico codificando o local 103 attP cpC31 dentro do genomadas células, tais como, células mamíferas. Uma vez queintegrado, este local 103 attP cpC31 será usado para o localque integra especificamente um plasmídeo doador que incluium cassete de expressão para um gene de interesse e de umaseqüência de ácido nucléico que codifica o local AAA 285attB cpC31. O vetor alvo inicial inclui as seqüências doácido nucléico para dois diferentes locais att para duasdiferentes integrases locais-específicas. Em particular, ovetor alvo incluirá uma seqüência de ácido nucléico quecodifica o local R4 attB 295. O local R4 attB 295 media aintegração do vetor alvo em locais R4 pseudo attP (R4 ΨattP) no genoma da célula mamífera. Estima-se a cerca de 100locais R4 Ψ attP em um genoma mamífero típico. O vetor alvotambém incluirá uma seqüência de ácido nucléico que codificaum local 103 attP cpC31. 0 local 103 attP <pC31 serve como umlocal alvo para a integração do vetor doador que inclui umacassete de expressão projetado para dirigir a expressão dosgenes de interesse.

A ordem de integração escolhida aqui, ou seja,integração R4 integrase-mediada seguida pela integração tpC31integrase-mediada mutante, é escolhida para duas razões. Aintegração integrase-mediada R4 foi escolhida como aprimeira etapa, em vez da integração cpC31 integrase-mediada,porque há poucos locais R4 Ψ attP comparados aos locais docpC31 Ψ attP em genomas mamíferos. Conseqüentemente o númerode locais em que a integração ocorrerá é menor e poucosclones irão ser selecionados para identificar aqueles com osníveis mais elevados de expressão da proteína. A integraçãocpC31 integrase-mediada mutante é escolhida como a segundaetapa porque uma vez que os primeiros locais de integraçãosão identificados uma vez que resulta em altos níveis deexpressão de proteína após a integração do vetor doador, édesejável ter integração do vetor doador sendo tão eficientecomo possível. Portanto, uma integrase cpC31 mutante seráusada. As integrase cpC31 mutantes foram identificadas queresultam a até 75% dos eventos de integração ocorrendo nolocal attP tipo selvagem contido em um vetor integrado (talcomo que contido no vetor alvo), enquanto os 25% restanteocorrerem em uma variedade de locais cpC31 Ψ attP. Estima-sea ser aproximadamente 370 (média=202-764 com um intervalo deconfiança de 95%) locais cpC31 Ψ attP em células humanas,tais como, células 293, D407, e HepG2 (Chalberg, et al. ,2006) . O local em que a integração mais freqüentementeocorre pode variar entre diferentes células, mas étipicamente < 5-10% do número total de locais que podeservir como locais de integração. Se uma integrase menoseficiente é usada que conduz a um menor grau de seletividadepara locais attP tipo selvagem sobre locais pseudo attP,então mais integração poderia ocorrer em locais cpC31 Ψ attPpreferencialmente do que local attP tipo selvagem desejadoem um vetor alvo integrado.

Além disso, o vetor alvo também inclui umaseqüência de ácido nucléico que codifica marcadorselecionável de o higromicina, que é usado para selecionaros clones resistentes à higromicina que têm um vetor alvogenomicamente integrado. O vetor alvo tem uma primeiraporção de região de codificação do puromicina (por exemplo,promotor-menor) e um sinal poli A SV4 0 a jusante daseqüência do ácido nucléico que codifica o local 103 attPcpC31. Sobre a integração do vetor doador, um promotor SV4 0 éintroduzido a montante do gene de puromicina, desse modoreconstituindo um cassete de expressão completo do genecapaz de fornecer a expressão do marcador selecionável.Conseqüentemente, o marcador selecionável reconstituído depuromicina pode ser usado para selecionar eficientementeeventos bem sucedidos de recombinação entre um local attBcpC31 (por exemplo, um local AAA 285 attB cpC31) no vetordoador e um local attP cpC31 (por exemplo, local 103 attPcpC31) presente no vetor do alvo.

Um promotor mais fraco (por exemplo, SV4 0) e umadroga mais tóxica para a seleção (por exemplo, puromicina)são escolhidos ao contrário de promotores mais fortes (porexemplo, CMV) e de drogas mais fracas para a seleção (porexemplo, G418) a fim de fornecer uma seleção mais forte parao evento de integração do vetor doador desejado.

Esta etapa, a integração do vetor doador no vetoralvo integrado, é a etapa chave da invenção que permite umaintegração local específica no vetor doador, que contémcassetes de expressão para genes de interesse. Entretanto, épossível que uma grande variedade de promotores (sem regiõesde codificação) no vetor doador possa trabalhar comoeficiência. Além disso, uma grande variedade de regiões decodificação para genes de resistência à droga (sempromotores) presente no vetor alvo pode também trabalharcomo eficiência. Os exemplos dados aqui, usando um promotorSV40 e uma região de codificação da puromicina, não sãosignificados a ser exclusivos.

Em uma maneira similar um promotor relativamentefraco (timidina quinase do vírus simples do herpes) é usadopara conduzir à expressão do marcador a resistência à droga(higromicina) no vetor alvo. Foi reportado por alguns queuma expressão mais fraca de um marcador co-selecionado podeconduzir a uma expressão mais elevada de genes de interesseligados.

CONSTRUÇÃO DO VETOR DO ALVOPara construir o vetor alvo (pRl; FIG. 8) asseguintes etapas foram executadas. A seqüência do vetor pRlé fornecida nas FIGS. 33A-33B. Um fragmento de 295 bp quecontém o local attB R4 (attB 295 R4) foi amplificado peloPCR de células rehidratadas de Streptomyces parvulus (ATCC12434) usando iniciadores

5f-CGTGGGGACGCCGTACAG-3' (SEQID N0:01)

e

5'- CCCGGTCAACATCCAGTACACCT-3' (SEQ ID N0:02)

como descritos por Olivares e outros, 2001 e clonados empCR2.1-T0P0 (Invitrogen) para fazer PTA-R4attB. 0 attB 295R4 foi isolado de pTA-R4attB pela digestão com EcoRI. Estefragmento foi terminado pelo preenchimento das extremidadescom DNA polimerase de Klenow e ligado então no pTK-Hyg(TaKaRa Clontech) no local Hind III, no qual tinham sidoterminados também preenchendo nas extremidades com a DNApolimerase de Klenow para fazer o vetor pTK-R4B.Seqüenciamento de DNA foi usado para confirmar se pTK-R4Bteve a seqüência correta e também se o local do attB 295 R4estava na orientação mostrada na FIG. 8, ou seja, que o ladodireito do local de recombinação do núcleo attB R4 (indicadopelo ponto estreito do triângulo) era o mais próximo aocassete de resistência à higromicina.

Duas reações em cadeia de polimerase foram feitaspara amplificar o attP 103 <pC31 e a região de codificação deresistência à puromicina separadamente. Então foram fundidasjunto precisamente usando um terceiro PCR. As condições doPCR foram de 95°C para 1 minuto de desnaturação, 60°C para15 segundos a anelamento e 72°C para 4 5 segundos parapolimerização. As reações foram feitas com uma enzima decorreção (Pfu Ultra) que gera produtos PCR terminados semcorte.Uma região de 103 bp do local attP cpC31 (attP 103<pC31) que contém as seqüências conhecidas para codificar umlocal attP funcional foi amplificado de Pta-attP (descritapor Olivares et al., 2001) usando iniciadores C31-attP-l

5'- AAAAAAGAATTCGTACTGACGGACAC ACCGAAGCCCC-3'

(SEQ ID No: 03) e C31-attP-2

^'-AAAAAACCTTTCGTCTTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTrGG-S')(SEQ ID No: 04) tendo por resultado um produto de 18 6 bp. Aextremidade 5' do primeiro iniciador C31-attP- 2 tinha 24bases de extremidade 5' da ORF de resistência à puromicina.[00168] A região de codificação de resistência à puromicinajunto com um sinal de poliadenilação SV40 foi amplificadapelo PCR de pPUR (TaKaRa Clontech) usando iniciadores Puro 15'- CAGTTGGGGGCGTAGGGTCGCCACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG -3'',(SEQ ID No: 05) e SV4OpoliA

5'- AAAAAACCTTTCGTCTTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGG-3'(SEQ ID No: 06) tendo por resultado um produto 1001 bp. Aextremidade 5' do iniciador Purol teve 24 bases deextremidade 3' do attP cpC31 e a extremidade 31 de SV40poliAtinha um local de reconhecimento da enzima de restrição BBSL As condições do PCR para os primeiros 10 ciclos foram950°C por 1 minuto de desnaturação, 47°C por 30 segundos deanelamento e 72°C por 75 segundos de polimerização. Ascondições do PCR para os 15 ciclos seguintes foram 950C por1 minuto para desnaturação, 60°C por 30 segundos paraanelamento e 72°C por 75 segundos para polimerização. Asreações foram feitas com uma enzima de correção (Pfu ultra)que gerasse produtos sem corte-terminados do PCR.

Para fundir o DNA contendo attP 103 cpC31 ao DNAcontendo a região de codificação resistente a puromicina esinal de poliadenilação SV4 0 os produtos daqueles PCRsseparado foram misturados em uma relação equimolar eamplificados pelo PCR com iniciadores C31-attP-l e poliASV4 0 para produzir um produto de 113 8 bp. As condições doPCR foram a 95°C por 30 segundos para desnaturação, 60°C por20 segundos para anelamento e 72 0C por 90 segundos parapolimerização. As reações foram feitas com uma enzima decorreção (Pfu Ultra) que gera produtos de PCR terminados-semcorte.

O produto de PCR de 113 8 bp contendo attP 103cpC31, estrutura de leitura aberta de resistência àpuromicina e o sinal de poliadenilação SV4 0 foi digerido comBBS I e clonado em pTK-R4B que foi digerido com Swa I e BBSL Isto produziu o pRl do vetor alvo. As seqüências e aorientação apropriada de attP 103 (pC31; a estrutura deleituraaberta da resistência à puromicina e o sinal depoliadenilação SV4 0 no pRl foram confirmados porseqüenciamento do DNA.

Uma característica chave do projeto da fusão daregião de codificação attP 103 cpC31-puromicina é diagramadona FIG. 14. As 221 pares de bases ao longo do local attPcpC31 221 que está presente em Pta-attP tem um ATG quepoderia terminar acima a montante da região de codificaçãoda puromicina uma vez o vetor doador é integrado no vetoralvo, para criar um local attL cpC31. Geralmente asseqüências A TG (locais potenciais de iniciação da tradução)que estão a montante de legítimas regiões de codificação sãoprejudiciais à expressão de gene. Conseqüentemente, noproduto do PCR que funde attP 103 cpC31 à região decodificação da puromicina, esse A TG foi feito ao cõdoninicial da região de codificação da puromicina. Além disso,2 bases antes daquela ATG foram trocadas para criar umamelhor seqüência (GCCACC) consenso de início da tradução(Kozak). Como mostrado na FIG. 14 estas mudanças são pelomenos dezoito bases na 31 ao mínimo, mas inteiramentefuncional, local attP (pC31 identificado por Groth et al. ,2000. Conseqüentemente não devem afetar a habilidade o localAAA 285 attB cpC31 no vetor doador para integrar dentro dolocal attP 103 cpC31 no vetor alvo. Após a integração dovetor doador dentro do vetor alvo o 88 bases ao longo dolocal attL cpC31 (attL 88 (pC31) é localizado na região não-traduzida 5' , imediatamente antes da região de codificaçãoda puromicina. Precedendo o attL 8 8 cpC31 pode ser 57, 62 ou74 bases derivadas da região não traduzida 51 do promotoradiantado SV4 0 (transcrição dirigida pelo promotor adiantadoSV4 0 sendo em 3 locais diferentes).

VETOR DOADOR

Um diagrama esquemático de um vetor de expressãodoador exemplificativo é fornecido nas FIGURAS 2 e 10. 0vetor de expressão doador exemplificativo contém umaseqüência de ácido nucléico codificando o local AAA attB 285cpC31 e cassete de expressão de ácido nucléico codificandogenes de interesse, tais como, um cassete que codifica ascadeias pesadas e leves de um anticorpo humano. 0 vetordoador também contém um promotor SV4 0 a montante daseqüência do ácido nucléico que codifica o local AAA attB285 cpC31. Sob a integração do vetor doador dentro do vetoralvo previamente integrado, o qual é mediado pelarecombinação local-específica entre local AAA attB 285 cpC31presente no vetor doador e attP 103 <pC31 presente no vetoralvo, o promotor SV4 0 conduzirá a expressão do gene depuromicina (FIG. 13) . Conseqüentemente, o gene deresistência reconstituído da puromicina pode ser usado paraselecionar os clones celulares que integraram os genes novetor doador para expressar proteínas de interesse.

Esta etapa da seleção é crítica para conseguir ummétodo de eficiência elevada porque o local AAA attB 285cpC31 no vetor doador pode também integrar dentro de locaisattP Ψ cpC31 encontrados em 370 posições cromossôraicasestimadas (Chalberg, et al. , 2006). Entretanto todos osvetores de expressão doadores exemplificativos que integramem locais do attP Ψ cpC31 conterão somente o promotor SV4 0 enão irão reconstituir um gene funcional de resistência àpuromicina. Algumas células resistentes a puromicina tambémresultam quando apenas a integrase é expressa em um clone dovetor alvo attP (isto é, na ausência de um vetor deexpressão doador) . Sem se prender à teoria, o mecanismo porqual este ocorre pode envolver a recombinação dos locais ΨattB que estão perto de um promotor celular com o local attP103 no vetor alvo. Transfecção da linhagem celular attP comum vetor de expressão doador selecionável e uma segundaintegrase de vetor de expressão endereça este interesseporque as células sem nenhum vetor de expressão não serãoresistentes a completa seleção do gene de resistência àdroga no vetor de expressão doador selecionável. Em adição,caso necessário, a integração desejável dos vetores doadoresdentro de vetores alvos cromossomáticos pode facilmente serdistinta da integração aleatória indesejável ou daintegração dos vetores doadores em locais attP Ψ cpC31 comodescrita abaixo na seção "Métodos para a caracterização dalinhagem celular".

CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR

O vetor de expressão doador (pDl-DTX-1) é baseadoem pcDNA3002neo descrito por Jones et al., 2003.pcDNA3002neo é baseado no pcDNA3 (Invitrogen, Inc.).pcDNA3002neo contém dois promotores CMV seguidos por doissinais de poliadenilação do hormônio de crescimento bovinopara a expressão das proteínas em células mamíferas.pcDNA3 002neo também inclui uma origem ColEl e um gene deresistência à ampicilina para a manutenção e a seleção em E.Coli. Finalmente, o vetor pcDNA3002neo tem um gene deresistência G418 expressado usando um promotor SV40 e umsinal de poliadenilação SV40. A seqüência do vetor pDl-DTX-1é fornecido nas FIGS. 34A-34C.

Para construir pDl-DTX-1, seis inserções foramclonadas no pcDNA3002neo que contêm 1) um poliligante com oslocais de reconhecimento para três enzimas de restrição quecortam dentro de oito pares ao longo da seqüência dereconhecimento, 2) a região AAA attB 2 85 (pC31, 3) umaprimeira seqüência do sinal que media a secreção dasproteínas, tais como, a cadeia pesada de um anticorpo humanoe contém um único local de restrição, 4) uma segundaseqüência do sinal que media o secreção das proteínas, taiscomo, a cadeia leve de um anticorpo humano e contenha umoutro local único de restrição, 5) uma região de codificaçãopara uma primeira proteína, tal como, a cadeia pesada de umanticorpo específico humano para a toxina da difteria, e 6)uma região de codificação para uma segunda proteína, talcomo, a cadeia leve de um anticorpo específico humano para atoxina da difteria.

pcDNA3002neo perde o uso de poliligantes após umde seus promotores CMV. Conseqüentemente, em uma primeiraetapa para criar o vetor doador pDI, um poliligante com ostrês locais de restrição de ocorrência rara foi inserido.Dois oligonucleotídeos sintéticos (BamBst-A e BamBst-B)foram anelados. A seqüência de BamBst-A é:

5' - GATCCAAAAAATTAATTAAAAAAAACACCGGCGAAAAAAGCGATCGCA AAAAACCAGTGTG - 3'(SEQ ID No: 07). A seqüência BamBst-B é

5' -CTGGTTTTTTGCGATCGCTTTTTTCGCCGGTGTTTTTTTTAATTAATTTTTTG - 3'(SEQ ID No: 08) . Quando BamBst-A e BamBst-B são aneladosconterá seqüências complementares do Bam HI e do Bst XI emsuas extremidades 51 e 3', respectivamente, para permitir aligação a Bam HI/Bst XI-digerir pcDNA3002neo. As seqüênciastambém incluirão (na ordem 5' a 3') locais de reconhecimentoda enzima de restrição para Pac I, SgrA I e AsiS I Asseqüências do espaçador de 6 adenosines separa cada local derestrição para permitir a digestão eficiente em dois locaisadjacentes, se necessários. Os dois oligonucleotídeossintéticos foram anelados (isto é, não-fosforilatados).pcDNA3 002neo foi digerido com Bam HI a 37°C e então com BstXI a 55°C. O vetor digerido foi ligado ao poliliganteanelado e a ligação foi transformada dentro de células de E.Coli XL-IO GOLD (Stratagene). 0 vetor resultante foi chamadopHPC-1.

Um elemento crítico da seqüência no vetor doadorpDl é o local AAA attB 285 <pC31. 0 local AAA attB 285 cpC31foi amplificado pelo PCR do vetor Pta-attB descrita porOlivares, et al, 2001. 0 iniciador 5' foi chamado C31attB5'e tem uma seqüência de

5' - GTCGACGAAATAGGTCACGGTCTC-S'

(SeQ ID No: 09). 0 iniciador 31 foi chamado CilattB-V e temuma seqüência de

5' - TACGTCGACATGCCCGCCGTGACC -3'(SEQ ID No: 10) . As condições do PCR foram desnaturação a95 0C por 1 minuto, ane lamento em 60 0C por 15 segundos eextensão a 720C por 3 0 segundos usando a polimerase PfuUltra (Stratagene). A concentração de outros componentes dareação foi a mesma que aquela de um PCR padrão (por exemplo,200 μΜ de dNTPs, 1 μΜ cada iniciador, 1,5 mm de MgCl2) .

O iniciador 5' mudou uma seqüência ATG naextremidade 5' do local do attB cpC31 em Pta-attB a umaseqüência AAA. A razão para esta é similar àquela descritaacima para o local attP 103 cpC31 e diagramado na FIG. 14. Aextremidade 5' do local attB 285 cpC31 que está presente emPta-attP tem um ATG que poderia terminar sendo a montante daregião de codificação da puromicina uma vez que o vetordoador é integrada dentro do vetor alvo, para criar um localattL 88 cpC31. Geralmente as seqüências A TG (locaispotenciais de iniciação da tradução) que está a montante delegítimas regiões de codificação são prejudiciais àexpressão de gene. Conseqüentemente, o ATG na extremidade 5'do attB cpC31 foi mudada para AAA. Todas as variações de umabase de AUG foram encontradas para funcionar como códonsalternativos de iniciação da tradução. Entretanto nenhumavariação de duas bases foi mostrada para função como códonsalternativos de iniciação da tradução. Conseqüentemente afim de impedir a 5' ATG no attB cpC31 sendo utilizado como umcódon de iniciação da tradução, mas ao mesmo tempo introduzum número mínimo de mudanças à seqüência attB cpC31, o A TGfoi mudado para AAA. Visto que este ATG está próximo daextremidade 5' da região attB (pC31 contida em PT A -attB foimais conveniente incorporar a mudança A TG para AAA dentrodo iniciador usado para PCR a seqüência de attB (pC31 de Pta-attB.

Amplificação de Pta-attB pelo PCR com iniciadoresC31attB-5' e C3 lattB-3 1 conduzido a um produto ao longo de285 pares de bases chamado AAA attB 285 <pC31. pHPC-1 foidigerido com Sma I e Bst Z 17 I para produzir fragmentos de1130 bp e 5718 bp. O produto do PCR AAA attB 286 cpC31 foiligado ao fragmento de 5718 bp. Isto produziu um plasmídeochamado pHPC-2. O plasmídeo com a seqüência AAA attB 286cpC31 em uma orientação, tal que o lado esquerdo do attBestava ao lado do promotor SV40 foi chamado de pHPC-2 ( + )enquanto o plasmídeo com a seqüência AAA attB 286 cpC31 naorientação oposta foi chamado pHPC-2(-).

pHPC2 (+) e pHPC-2 (-) são úteis como vetores paraintegrar e expressar os genes que codificam as proteínas quenão são segregadas. Entretanto, para segregar as proteínastais como, anticorpos, fatores hemofílicos, fatores decrescimento, fatores do soro ou receptores solúveis, umvetor doador que contivesse uma seqüência do sinal para asecreção seriam desejável. Conseqüentemente uma seqüência dosinal (HAVT20; Boel et al, J Immunol Methods. 2000 May26; 239 (1-2) : 153-66) de uma cadeia do receptor alfa decélula T humano foi modificado para ter locais de restriçãoúnicos. Uma versão com um único Pml I foi inserido em um dosdois poliligantes no pHPC2 ( + ) e uma outra versão com umúnico PspX 1 foi inserido no outro poliligante no pHPC2 (+).Nenhuma versão mudou a seqüência de aminoácido da seqüênciado sinal HA VT2 0 e as mudanças também utilizaram códonshumanos freqüentemente usados. Tanto os locais Pml IeoPspX I ocorre imediatamente antes do local de clivagem daseqüência do sinal. Conseqüentemente, uma fusão precisaentre o local de clivagem na seqüência do sinal HA VT2 0 e aregião da codificação de uma proteína de interesse éfacilmente alcançada projetando os iniciadores de PCRapropriadas para amplificar as regiões de codificação dosgenes de interesse. Alternativamente, é possível extirpar aseqüência do sinal HAVT20 (por exemplo, usando BamH IlPac Iem um local de clonagem e Asc I/Not I em outro local declonagem) e introduzir outras seqüências do sinal. Aquelasseqüências poderiam ser heteróloga (por exemplo, a seqüênciado sinal IL-2) ou homóloga (por exemplo, uma seqüênciahumana do sinal de IgGl).

Para introduzir uma seqüência do sinal HA VT2 0 empHPC-2 ( + ) um DNA duplex codificando um local Bam HI naextremidade 5», uma melhor seqüência consenso Kozak,seqüência do sinal HAVT2 0 com um local Pml I e naextremidade 3' foi gerada por anelamento de 2oligonucleotiídeos: HAVT20-L-top(5CGCGCCACCATGGCATGCCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGCCTCGAGTTTTCCATGGCTCG-3') (SEQID NO:l 1)e HAVT2 0-L-bot

(3' - GGTGGT A CCGT ACGGG ACCG AAGG AC AC CC GTG AAC ACT AGÀGGTGGACGGAGCTCAAAAGGTACCGAGC-5') (SEQ ID NO: 12).

Este cassete anelado foi ligado a pHPC2 (+) que foi digeridocom Bam HI e Pac I. 0 plasmídeo resultante foi chamado pHPC-3.

Para introduzir um segundo seqüência de sinalHAVT20 dentro do pHPC-3 um DNA duplex que codifica um local

Asc I na extremidade 5', uma melhor seqüência consensoKozak, seqüência do sinal HA VT2 0 com um local PspX I e umaextremidade 31 sem corte foi gerada pelo anelamento de 2oligonucleotídeos: HAVT20-H-top

5' GATCCGCCACCATGGCATGCCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACGTGTCTTGAATTTTCCATGGCTTTAAT -3'

(SEQ ID NO: 13) e HA VT20-H-bot

(3' - GCGGTGGTACCGTACGGGACCGAAGGACACCCGTGAACACTAGAGGTGCACAGAACTTAAAAGGTACCGAAAT -5')

(SEQ ID No: 14). Este cassete anelado foi ligado a pHPC3 quefoi digerido com Asc I e Eco rv. 0 plasmídeo resultante éuma espinha dorsal do vetor de expressão doador que possaser usada, entre outras coisas, prontamente trocando várioselementos de expressão de gene, tais como, promotores. Estaespinha dorsal do vetor de expressão doador foi chamadapHPC-4

5' -AAAAAACACGTGTCTTGAATTTTCCATGGCTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTG<Kj-3'

Para isolar genes IgG humanos, as linhagenshumanas EBV-transformadas de célula-B que segregam osanticorpos que ligam a toxina da difteria foram derivadascomo descritas por Traggiai, et ai., 2004. Um anticorpo comafinidade elevada foi subtipado e conduzido para ter umacadeia pesada IgGl humano e uma cadeia leve kappa. 0 RNA foipreparado das células produzindo este anticorpo e usado emreações de RT-PCR para gerar os cDNAs que codificam os genesdo anticorpo de cadeia pesada e leve. Os iniciadores usadospara a amplificação foram similares àqueles descritas porMarca, et al (Transplantation, 1991 August; 52 (2) : 340-5) ,Sblattero, et al (Immunotechnology, 1998 Jan; 3 (4) :271-8), eYamanaka, et al (J Biochem (Tokyo), 1995 jun; 117(6): 1218-27) exceto que as extremidades tenham os locais apropriadosde restrição para permitir a subclonagem. O cDNA da cadeialeve foi clonado dentro do local Not I/Xba do pBK-CMV(Stratagene) para criar pBK-CMV-DTX-L. O cDNA de cadeiapesada foi clonado dentro do local Hind Ill/Sal I do pBK-CMV-DTX-L para criar pABMCI03 . Os cDNAs foram seqüênciados esua identidade como um IgGlK humano foi confirmado.

Para subclonar genes do anticorpo da toxina anti-difteria dentro de pHPC-4 o gene inteiro de cadeia pesadafoi amplificado pelo PCR com iniciadores IMAGEM 6 (SEQ IDNo: 15) e

5' - AA AAAATTAATTAATTATTTACCCGGAG ACAGGG AGAG-S'(SEQ ID No: 16) que usam pABMCI03 como um molde. O produtoresultante do PCR de cadeia pesada foi digerido com BbrP I(isoschizomer de PmI I) e de Pac I e clonado dentro de pHPC-4 que foi digerido com BbrP I e Pac I para criar pHPC4-DTX-H. O gene inteiro de cadeia leve foi amplificado cominiciadores

5' - AAAACCTCGAGTTTTCCATGGCTGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGS'(SEQ ID No: 17) e

5' - AAAAAAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTG-3'(SEQ ID No: 18) que usam o ρ ABMC 103 como um molde. Oproduto resultante do PCR da cadeia leve foi digerido comPspX I e Not I e clonado dentro de pHPC4-DTX-H que foidigerido com PspX I e Not I para criar pDl-DTX-1. Asseqüências de ambos os genes da cadeia do anticorpo foramconfirmadas para ambos os filemantos.

pHPC-2, pHPC-4, e pDl-DTX-I pode ser vetores desubclonagem e vetores de expressão. Embora as seqüências decada um dos dois promotores as CMV, seqüência do sinalHAVT20, e sinais de poliadenilação do hormônio decrescimento bovino sejam quase idênticas, elas são separadaspelos poliligantes que são diferentes na seqüência.

Conseqüentemente iniciadores de seqüenciamento específicosforam projetadas que são capazes de seqüenciamento de genesinseridos em cada cassete de expressão. Por exemplo, oiniciador

5' - GCTTGGTACCGAGCTCGGATCC-31

(SEQ ID No: 19) pode ser usado para seqüenciar as regiõesvariáveis do anticorpo inseridas após o local Pml I de umaseqüência de sinal e o iniciador

5* - GAAGCTTGGT ACCGGTGAATTCGG-3'

(SEQ ID No: 20) pode ser usado para seqüenciamento dasregiões variáveis do anticorpo inseridas após o local PspX Ida outra seqüência do sinal. Conseqüentemente, não hánenhuma necessidade de clonar genes de interesse dentro deoutros vetores para seqüenciamento antes da clonagem delesno pHPC-2, em pHPC-4 ou em pDl-DTX-I para a expressão.

Além disso, cada elemento no pHPC-4 ou no pDl-DTX-1 é flanqueado por locais únicos de restrição, tais que,todo o elemento (por exemplo, promotor, seqüência de sinal,cadeia variável do anticorpo, cadeia constante do anticorpo,região de codificação, local de poliadenilação, local attB<pC31) pode facilmente ser extirpado e substituído com outroselementos similares.

Por exemplo, a região variável da cadeia pesadapode ser trocada digerindo pDl -DTX-I com Pml I/Xho I esubstituindo a região variável da cadeia pesada do anticorpoda toxina da anti-difteria com outras regiões variável decadeia pesada. A região variável de cadeia leve pode sertrocada digerindo pDl-DTX-I com PspX 1/BsiW I e substituindoa região variável de cadeia leve do anticorpo da toxina daanti-difteria com outras regiões variável de cadeia leve.

Similarmente a região constante da cadeia pesadade IgGl pode ser trocada por aquelas de outros subtipos deanticorpo (por exemplo, IgG2, IgG3, IgG4) ou da outra classede imunoglobulina (por exemplo, IgAl, IgA2, IgD, IgE ou IgM)trocando um fragmento de restrição Apa I/Pac I. A regiãoconstante de cadeia leve kappa no pDl-DTXl pode ser trocadapor uma região constante da cadeia leve kappa lambdatrocando um fragmento de restrição BsiW I/Not I.

Um promotor CMV pode ser substituído com um outropromotor trocando um fragmento de restrição Mfe 1/BamH Ieooutro promotor CMV posso ser substituído trocando umfragmento de restrição BstZ 17 I/Asc I Uma seqüência dosinal HA VT20 pode ser substituída trocando um fragmento derestrição BamH I/Pml I e outro pode ser substituída trocandoum fragmento de restrição Asc I/PspX I. Um sinal depoliadenilação do hormônio de crescimento bovino pode sersubstituído trocando um fragmento de restrição AsiS I/NgoMIV e outro pode ser substituído trocando um fragmento derestrição CIA IlPci L 0 local attB cpC31 pode ser substituídocom um local attB reconhecido por uma outra integras eserina local-específico trocando um fragmento de restriçãoStu I/BstZ17 I.

CONSTRUÇÃO DO VETOR ALVO-DHFR

0 vetor alvo-DHFR (pRl - DHFR) foi construído pelaclonagem de um cassete de expressão DHFR de rato consistindodo promotor SV4 0, uma região de codificação DHFR de rato, o3' UTR do DHFR cDNA de rato e o sinal de poliadenilatação dovírus da leucemia murina Moloney (MLV) dentro do vetor alvopRl. A seqüência do vetor do pRl-DHFR é fornecida nas FIGS.35A-35C.

Um fragmento de DNA de 1.074 pares de base depSV2dhfr (Americam Type Cultere Collection) contendo opromotor SV4 0, uma região de codificação DHFR de rato eparte 31 UTR do cDNA do rato DHFR foi amplificado pelo PCRusando os iniciadores 51

5' - CGAATCAGCACGGGGTGGCGCGCCCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGO -3 '(SEQ ID No: 21) e

5' - CGAATCAGCACGAAGTGCACCGGTGTTTAAACTTAATTAAAGATCTAAAGCCAGC AAAAGTCCCATGGT -3'

(SEQ ID No: 22) . As circunstâncias usadas para o PCR foram a95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 90segundos para 10 ciclos, então 95°C por 30 segundos e 72°Cpor 90 segundos para 15 ciclos usando a polimerase Pfu. Oproduto de PCR foi clonado então dentro PCR-BluntII-TOPO(Invitrogen) , a seguir digerido com DraIII, e um fragmentode 1050 pares de bases foi isolado e o gel purificado. 0 pRlfoi digerido com Van91 I (isoschizomer de PflM I) epurificado usando um kit de purificação Qiagen PCR. 0fragmento de Dra III foi ligado a Van91 I cortado o pRl paragerar o pRl-dHFR (noltr).

As 594 pb ao longo da repetição terminal ML V, asquais contêm um sinal de poliadenilação foram amplificadaspelo PCR do pLNXH (TaKaRa Clontech) usando os iniciadores

5' - AAAAAATTAATTAAAATGAAAGACCCC ACCTGTAGGTTTGO- S'(SEQ ID No: 23) e

5' - AAAAAACACCGGTGAAAGTTTAAACAAACCTGCAGGAATGAAAGACCCCCGCTGACGGGTAG -3'

(SEQ ID No: 24) . As condições usadas incluíram 95°C por 30segundos, 56°C por 30 segundos e 72°C por 45 segundos para15 ciclos usando a polimerase de Pfu. O produto de PCRterminado-sem corte foi clonado então dentro de PCR-BluntII-TOPO para criar o pCR-pLTR. 0 MLV LTR foi cortado do pCR-pLTR usando EcoRI, terminado-sem corte com Klenow e gelpurificado. 0 pRl-dHFR (noltr) foi digerido com PmeI etratado com CIP. 0 fragmento MLV LTR contendo o sinal poli AMLV foi ligado ao vetor Pme I-digerido para criar o pRl-DHFR. As orientações e as seqüências corretas da inserçãower confirmado pelas digestões de enzimas de restrições eseqüenciamento de DNA.

CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR-DHFR

O vetor de expressão doador-DHFR (pDl-DHFR) podeser construído clonando um cassete de expressão DHFR de ratoconsistindo de um promotor SV4 0, uma região de codificaçãoDHFR de rato, um 31 UTR do cDNA DHFR de rato e o sinal depoliadenilação do vírus da leucemia murina Moloney (MLV) novetor de expressão doador pDl- DTX -1. Este cassete deexpressão de 1626 pares de base é amplificada pelo PCRusando a polimerase Pfu do pRl-DHFR do vetor alvo-DHFRusando iniciadores DHFR-I

5' -TTTTTTGAAGACGAAAGGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGA- 3'(SEQ ID No: 25) e LTR-2

5' -AAAAAACCTGCAGGAATGAAAGACCCCCGCTGACGGGTAG-S'

(SEQ ID No: 26) , e clonado como um fragmento terminado-semcorte no local BstZ17 I de pDl-DTX-I na orientação mostradana FIG. 16.

CONSTRUÇÃO DO VETOR DOADOR-IRES

O vetor doador-IRES (pDl-IRES, FIG. 17) pode serconstruído clonando duas cópias dos mesmos IRES (tambémconhecido como elemento realçador translacional (TEEs)dentro de tanto o local único BamHI ou tanto no local Asc Ide pDl-DTX-1. Diversos IRES podem ser escolhidos, tais comoos Gtx IRES de ocorrência natural do gene do homeodomínioGtx do rato (Chappell, et al., 2000), IRES de ocorrêncianatural no Rbm3 mRNA de rato (Chappell, et al., 2003), ouIRES sintéticos, tais como, ICSl-23b ou ICS2-17. 2 foramselecionados em um esquema enriquecido baseado em FACS(Owens, et al., 2001). Versões Multiméricas de alguns IRESfreqüentemente realçam várias traduções no melhor dobramentodo que as versões monoméricas. As seqüências dos IRES, todasmultiméricas, são pequenas e são facilmente introduzidasdentro de pDl-como vetores pela construção deoligonucleotideos sintéticos que os codificam.

Um ICSl-23b IRES multimérico é montado peloanelamento de 2 oligonucleotideos sintéticos. Um par,consistindo das seqüências

5' - GATCCAGCGGAAACGAGCGAAAAAAAAACAGCGGAAACGAGCGAAAAAAAAACAGCG GAAACGAGCGAAAAAAAAACAGCGGAAACGAGCGAAAAAAAAACAGCGGAA ACGAGC GGACTCACAACCCC AG AAACAG ACATG- 3'(SEQ IDNo: 27)

5' - GATCCATGTCTGTTTCTGGGGTTGTGAGTCCGCTCGTTTCCGCTGITTTTTTTTCGCT CGTrrCCGCTGTTTTTTTTTCGCTCGTTTCOGCTGITTTTITITCGCTCOTTTCCG

(SEQ ID No: 28), a qual têm as extremidades complementares aum local de restrição BamH I e uns outros pares, consistindonas seqüências

CGCGCCAGCGGAAACGAGCGAAAAAAAAACAGCGGAAACGAGCGAAAAAAA

AACAGCGG AAACGAGCGAAAAAAAAACAGCGGAAAC GAGCGAAAAAAAAACAG CGGAAA CGAGCGGA CTCACAACCCCAGAAACAGACATGG-3'(SEQ IDNo: 29) e

5' - CGCGCCATGTCTGirrCTGGGGTTGTGAGTCCGCTCGTTrCCGCTGTTTTTTTTT(SEQ ID No: 30), que têm as extremidades complementares a umlocal de restrição Asc I. Estas seqüências contêm 5 cópiasde 15 bases ao longo de ICSl-23b. Cada um é separado porquatro cópias de um espaçador de 9 bases ao longo doespaçador Poli A. Finalmente, a extremidade 3 1 contém uma25 seqüência de base que precede imediatamente a região decodificação β-globina do rato (por exemplo, número deascensão J00413 do GenBank). Estes oligonucleotideosanelados são clonados nos locais BamH I e Asc I do pDl-DTX-1para criar o pDl-IRES do vetor doador-IRES. Os clones sãoseqüenciados para identificar aqueles com a orientação e aseqüência corretas.

CONSTRUÇÃO DO VETOR ALVO DE REGULAÇÃO

Quando algumas proteínas são expressas a níveisnecessários para tomar-se comercialmente úteis, elas podemser tóxicas e conduzir para retardar o crescimento da célulaou mesmo a morte celular. Conseqüentemente, pode ser útilreprimir sua expressão até que seja necessário produzirgrandes quantidades. Diversos métodos para regulação degenes estão disponíveis. Em algumas incorporações, édesejável introduzir o sistema que regule os genes emcélulas primeiramente antes que o cassete de expressão daproteína seja introduzido nas células. Desse modo, o sistemaregulador do gene é estabelecido e reprimido a expressão degene antes que um vetor de expressão seja introduzido.

Conseqüentemente, pode ser desejável ter um sistemaregulador do gene pRl do vetor alvo e não no vetor doador.

0 sistema RheoSwitch (New England Biolabs) fornecea regulação do gene sobre uma ampla escala de expressão. Aregulação do gene pelo sistema de RheoSwitch é mediado porduas proteínas. 0 RheoReceptor consiste na proteína GAL4 delevedura fundida ao domínio de ligação do ligante de umreceptor nuclear do hormônio estrogênico do inseto. ORheoReceptor liga-se às seqüências (DAS) de ativação amontante (DAS) derivadas do gene GAL4 de levedura que écolocado a montante de um TATA-box. 0 RheoActivator consisteem um receptor de ligação ao ligante RXR mamífero/insetohíbrido fundidos ao domínio de ativação transcrictional VP16 do vírus simples da herpes. Os análogos de ecdisona podemdimerizar o RheoReceptor e o RheoActivator e quando istoocorre os genes que estão corretamente ligados aos elementosde ligação GAL4 DAS DNA serão ativados. Além disso, naausência do dimerizador o RheoReceptor liga-se às seqüênciasDAS e media a repressão da expressão de gene. A rede deresultado é que os níveis basais de expressão usando estesistema estão muito baixos e os níveis de indução que podemser conseguidos são elevados.

Cassetes do gene codificando os dois componentesda proteína do sistema RheoSwitch (RheoReceptor eRheoAtivator) podem ser amplificados pelo PCR do pNEBR-Rl(New England Biolabs). Eles são clonados em uma orientação,como mostrado na FIG. 18, tais que, as regiões decodificação para o RheoReceptor e o RheoAtivator estão emuma orientação que seja a mesma que aquela da região decodificação da puromicina. Esta configuração é diferente daconfiguração no pNEBR-Rl (onde estão em orientações opostas)e esta é como os cassetes do gene RheoReceptor eRheoAtivator são clonados dentro do pRl separadamente.

Mais especificamente, iniciadores do PCRconsistindo nas seqüências

5' -AAAAAAACCCTGCAGGGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCT -3'(SEQ ID No: 31) e

5' - AAAAAAAACACCGGTGCTTATCGGATTTTACCACATTTG-3'(SEQ ID No: 32) são usados para amplificar o cassete deexpressão do gene RheoActivator (que consiste um promotor deubiquitina C (UbC), região de codificação de RheoAtivator, ena seqüência do sinal de poliadenilação da região atrasadaSV4 0) . As 24 81 pares de base ao longo o produto é digeridocom Sbf I e SgrA I e clonado dentro dos locais únicosSbfI/SgrA I do pRl-PU para criar o pRl-RA.

Iniciadores do PCR que consistem nas seqüências

5' -aaaaaaaacaccggtgccgatatcgggtgccacgccgtcccg-3 '(SEQ ID No: 33) e

5'-Aaaaaaaagcccgggcggcggcccgccagaaatcc-S (SEQ ID No: 34) são usados para amplificar o cassete deexpressãode do gene RheoReceptor (que consiste em umpromotor de ubiquitina B (UbB), da região de codificaçãoRheoReceptor e na seqüência de sinal de poliadenilação TK).

As 3 68 0 pares de base ao longo do produto é digerido comSgrA I e SrfI e clonado em únicos locais SgrA I/Srfl do pRl-RA para criar o pRlreg.

CONSTRUÇÃO DO VETOR ALVO-DHFR DE REGULAÇÃO

A fim de construir um vetor alvo que possa regulargenes no vetor doador e ser sujeitado à amplificação dogene, um vetor alvo-DHFR de regulação (FIG. 19) éconstruído. O cassete de regulação do gene pRlreg,consistindo nos genes RheoAtivator e de RheoReceptor, éamplificado pelo PCR do pRlreg usando os iniciadores

5'-aaaaaaaccctgcaggggcctccgcgccgggttttggcgcct-3'(SEQ ID NO: 35) e

5' - aaaaaaaagcccgggcggcggcccgccagaaatcc-3'(SEQ ID No: 36), digerido com SbfI e Sfr I e clonado noslocais SbfI e Sfr I do pRl-DHFR para construir o pRlreg-DHFRde vetor do alvo-DHFR de regulação.

CONSTRUÇÃO DA ESPINHA DORSAL DO VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR DEREGULAÇÃO

A espinha dorsal do vetor de expressão doador deregulação (FIG. 20) tem as seqüências do DNA reconhecidaspelo componente de proteína (por exemplo, RheoReceptor) dosistema regulador do gene codificado pelo pRlreg clonado amontante das regiões da codificação para proteínas deinteresse. No caso do sistema RheoSwitch os elementos doDNAa em que o RheoReceptor liga-se são as seqüências (UAS) ade ativação a montante GAL4 (UAS) . 722 pares de bases aolongo da seqüência de DNA, em ordem, locais de restrição(metade 3' de BstZ17 I, EcoR I), a região de sinal depoliadenilação SV4 0 (para impedir a transcrição oculta naregião reguladora), cinco elementos de GAL4 DAS e uma TATA-box podem ser amplificados pelo PCR do pNEBR-XIHygro (NewEngland Biolabs) que usa iniciadores

TACGAATTCATCAGCCATATCACATTTGTAGAG-3'(SEQ ID No: 37) e

TTATAT ACCCTCTAGAGTCTCCGCTCGGA -3'(SEQ ID No: 38).

Duas seqüências de DNA longas de pares de base 17 3ou 17 8 codificando duas versões da região não-traduzida(5'DTR) do promotor 5' adiantado 5 CMV com locais diferentesde enzima de restrição na extremidade 31 são geradas peloanelamento de dois conjuntos de sobreposiçãooligonucleotídeos e preenchendo em suas extremidades 31usando a DNA polimerase de Klenow. A base 173 ao longo daversão é gerada pelo anelamento

CCGAGCGGAGACTCT AGAGGGT ATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCA GATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGAC -3'(SEQ ID No: 39) e

AAAAAAGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGG CTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAA-3'(SEQ Id No: 4 0) e preenchendo com a polimerase de Klenow. Abase 178 ao longo da versão é gerada pelo anelamentoccgagcggagactctagagggtatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagac-3'(SEQ ID No: 41) e

aaaaaaggcgcgccgaattcaccggtaccaagcttccaatgcac cgttcccggccgcggaggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaa-s'(SEQ ID No: 42) e preenchendo com a polimerase de Klenow.

Então elas são misturadas separadamente com o par de base722 de produto de PCR (que contém o sinal poli SV4 0 A, cincoGAL4 DAS, e uma TATA-box) , e o PCR amplificou com doisconjuntos de iniciadores do PCR: tanto

5' - tacgaattcatcagccatatcacatttgtagag-s(SEQ ID No: 43) e

5'-aaaaaaggatccgagctcggtaccaagcttccaatgcaccgttcccggccgcggaggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaa-s'(SEQ ID No: 44) OU

5' - tacgaattcatcagccatatcacatttgtagag-s 1(SEQ ID NO: 45) e

aaaaaaggcgcgccgaattcaccggtaccaagcttccaatgcaccgttcccggccgcggaggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaa -3'(SEQ ID No: 46).

Desse modo, dois cassetes contendo uma região dosinal de poliadenilação SV4 0 (para impedir a transcriçãooculta na região reguladora), cinco elementos GAL4 UAS, umTATA-box, e um promotor CMV adiantado 5' são montados. Um édigerido com EcoR I e BamH I e clonado dentro do local MfeI/BamH I do pHPC-4 para criar pHPC-4reg. O outro é digeridocom Asc I e clonado dentro do local BstZ 17 II Asc I depHPC-4reg para criar o pDlreg. Ambas as etapas de clonagemremovem os dois promotores CMV constitutivos em pHPC-4 quepoderia interferir com a expressão regulada. Como descritoacima, os vários genes de interesse podem ser introduzidosnas regiões de poliligante pDlreg, tais que podem serintegrados em um vetor alvo e sua expressão pode serregulada.

Hã duas características sobre a construção dopDlreg que pode ser importante para manter os altos níveisdas versões de utilização possíveis da expressão de gene dovetor doador que não contêm componentes de um sistemaregulador do gene (por exemplo, pDl, pDl-DHFR, pDl-IRA).Primeiro, o TATA-box do sistema regulador de gene foiprecisamente fundido aos TATA-boxes dos promotores CMV dopDl. Segundo, 05' UTRs dos promotores CMV foramreconstituídos. A rede de resultado é que as seqüênciasentre o TATA-box e o códon do início da tradução (isto é, olocal do início da transcrição e o 5' UTR) do pDlreg são osmesmos como são no pDl. Entretanto as seqüências antes doTATA-box no pDlreg consiste naquelas seqüências de DNAexigidas para obter a regulação do gene mediado peloscomponentes de proteína do sistema regulador do gene queestão codificados pelo pRlreg.

CONSTRUÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR SELECIONÁVEL

0 vetor de expressão selecionável (FIG. 21) ésimilar ao vetor de expressão doador exceto que tambémincluem um gene completo de resistência à droga, que sejadiferente tanto do primeiro gene marcador selecionável dopromotor menor e quanto do segundo gene marcadorselecionável funcional no vetor do alvo. A construção de umvetor de expressão doador selecionável com um gene completode resistência G418 (pDl-DTXI-G418, FIG. 21) é descrito comoexemplo. A seqüência do vetor do pDl-DTXI-G418 é fornecidanas FIGURAS 3 6A-36D.

O vetor de expressão doador selecionável pDl-DTXI-G418 foi construído amplificando um completo, cassetefuncional de resistência de droga G418 de pcDNA3002neo(Crucell) que usa a reação em cadeia de polimerase e osiniciadores

GAGAGAGGATCCACG€GTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG-3,(SEQ ID No: 47) e

GAGAGAGAATTCTCTAGACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTG-3,(SEQ ID No: 48) . 0 produto resultante do PCR contém umpromotor SV4 0, o gene de resistência G418 e o sinal depoliadenilação SV40. 0 produto do PCR foi digerido com asenzimas de restrição BamH I e EcoR I e ligado dentro dovetor de expressão pDl-DTX-I, que tinha sido digerido comBgI II e Mfe I. A ligação foi digerida com BgI II e Mfe I(as quais são destruídas pela ligação da inserção) parareduzir a ligação da espinha dorsal do vetor sozinho etransformada dentro de células ultracompetentes de E. ColiGold XL-IO (Stratagene). Os clones com as inserções naoritentação desejado foram identificados pelo PCR e peladigestão da enzima de restrição. A seqüência de DNA corretado gene de resistência G418 inteiro foi confirmada peloseqüenciamento.

CONSTRUÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR DO REPÓRTER

0 vetor de expressão doador repórter (FIG. 30) ésimilar ao vetor de expressão doador exceto que tambéminclui um gene repórter, que possa ser detectado em célulasindividuais tanto, por exemplo, microscopia de fluorescênciaou um classificador celular ativado por fluorescência.Geralmente, o nível da expressão do gene repórter em umvetor de expressão doador repórter correlacionará ao nívelda expressão de proteínas de interesse no mesmo vetor deexpressão doador repórter. Conseqüentemente, depois que atransfecção do clone do vetor alvo com um vetor de expressãodoador repórter, os clone do vetor alvo podem opcionalmenteser identificados que resultem em altos níveis da expressãode uma proteína de interesse identificando os clones queexpressam o gene repórter em altos níveis. Usando uminstrumento elevado de produção, tal como, um classificadorcelular ativado por fluorescência um número muito maior declone do vetor alvo (isto é, locais de integração) podem serselecionados para a expressão do que pode ser selecionadopor métodos manuais de colheita de clone.

Em um esquema opcional um grande número decombinações de clone do vetor alvo será gerado. Por exemplo,as células transfectadas com um vetor alvo e um primeirovetor de expressão integram-se. As colônias estáveis serãoselecionadas (por exemplo, pela resistência à higromicina).Por exemplo, tanto como 100 placas com 100 colônias porplaca (isto é, 10.000 clones do vetor alvo) podem sergeradas. Cada combinação de clone do vetor alvo é entãotransfectada separadamente com um vetor de expressão doadorrepórter e um segundo vetor de expressão integrase. Aintegração estável dos vetores de expressão doador repórterem vetores alvo é selecionada (por exemplo, pela resistênciaà puromicina). Cada associação individual dos clones dovetor doador repórter é classificada usando um classificadorcelular ativado por fluorescência e as únicas células decada combinação com a expressão de gene repórter maiselevada são coletadas. A expressão de nível elevado daproteína do interesse é confirmada então. O local daintegração do vetor alvo nas células com a expressão de generepórter mais elevada é determinado então usando o resgatedo plasmídeo ou as técnicas de PCR. Os iniciadores de PCRvetor alvo específico são projetados para serem específicospara os locais da integração do vetor alvo. Então, ascombinações dos clones do vetor alvo que fornecem níveismais elevados de expressão são única célula clonada e oiniciador PCR vetor alvo-específico é usado para identificarque clone individual do vetor alvo causa os níveis maiselevados de expressão após a transfecção com um vetorexpressão doador repórter e um segundo vetor de expressãointegrase. Isolando um pequeno número de clone do vetor alvoque conduz aos níveis mais elevados de expressão daproteína, outros vetores de expressão doadores podem sertransfectados nos clone identificados para expressar umavariedade de outras proteínas, ao invez de fazer a seleçãoda expressão da grande escala de cada vez.

Além disso, para um uso opcional descrito acimapara a seleção elevada da produção de locais de integração,um simples, rápido método de monitoração do curso do tempo,freqüência e uma estabilidade do vetor de expressão doadorrepórter em tempo real pela examinação de célulastransfectadas usando um microscópio de fluorescência. Comoexemplo de construção de um vetor de expressão doadorreportes com um gene protéico fluorescente verde (pD3-DTXl,FIG. 30) é descrito. 0 vetor de expressão doador repórterpD3-DTXl foi construído primeiramente amplificando umpromotor do vírus de Sarcoma de Rous (pRSV) do ρ LXRN doplasmídeo (Clontech) usando a reação em cadeia de polimerasee os iniciadores

ttttcactgcattcgacaattgtcatcccctcaggatatagtagtttc -3'(SEQ ID No: 49) e

Gaccagcacgttgcccaggagttggaggtgcacaccaatgtggtg-S'SEQ ID No: 50). Um DNA que contém a região de codificação(hrGFP) da proteína fluorescente verde Renilla reniformshumanizada e um sinal de poliadenilação do gene do hormôniodo crescimento humano (hGH) foi amplificado pelo PCR do PAAVhrGFP (Stratagene) usando os iniciadores

caccacattggtgtgcacctccaactcctgggcaacgtgctggtc -3'(SEQ ID No: 51) e5'-GAGAGAGTCAGCATTTAAATAAGGACAGGGAAGGGAGCAGTGG-3'(SEQ ID No: 52) . Os 2 produtos do PCR foram misturados eamplificados com os iniciadores 5' -

TTTTCACTGCATTCGACAATTGTCATCCCCTCAGGATATAGTAGTTTC -3'(SEQ ID No: 53) e

GAGAGAGCTAGCATTTAAATAAGGACAGGGAAGGGAGCAGTGG-s'(SEQ ID No: 54) a fim de fundir o promotor do vírus deSarcoma de Rous à região da codificação do hrGFP e ao sinalde poliadenilação do gene do hGH. O produto terminado-semcorte resultante do PCR foi ligado a um local blunt Psi I dovetor de expressão doador pDl-DTXl. Os clone com inserçõesforam identificados pelo PCR usando os iniciadores

TTTTCACTGCATTCGACAATTGTCATCCCCTTCAGGATATAGTAGTTTC -3'(SEQ ID No: 53) e

GAGAGAGCTAGCATTTAAATAAGGACAGGGAAGGGAGCAGTGG-s'(SEQ ID No: 54) e a orientação da inserção foi determinadospela digestão da enzima de restrição. A correta seqüência deDNA da poli A pRSV-hrGFP-hGH inteiro inserida foiconfirmada. A seqüência do vetor pD3-DTXI é fornecida nasFIGURAS 37A-3 7D.

TESTAGEM DOS VETORES

As funções do vetor alvo individual, do vetor deexpressão doador e dos vetores de expressão integrase foramtestadas. Por exemplo, a transfecção do transporte do vetoralvo nas células DG44 ou nas células PER.C6™ podeconferenciar resistência à higromicina. Quando tanto o vetorexpressando a integrase R4 ou o vetor expressando (pC31integrase é transfectado com o vetor alvo aproximadamente 5vezes tanto podem colônias resistentes a higromicinaresultaram comparado a transfecção do vetor alvo sozinhomostrando que a expressão de um ou outra integrase podeconduzir a um número aumentado de clone estáveis. Atransfecção transiente do vetor de expressão doador sozinhoconduziu a uma produção de anticorpo de 3 00 ng/ml nascélulas DG44 e de 1 ug/ml em PER.C6™ (FIG. 31).

Outra função importante a demonstrar é ahabilidade do local attP <pC31 em um vetor alvo pararecombinar com o local attB <pC31 em um vetor de expressãodoador. Isto é particularmente verdadeiro visto que oslocais att tanto no vetor alvo e no vetor doador foram tantotransformados ou truncados para encontrar as demandas dosistema de expressão descrito aqui. As células DG44 (3e6) emplacas de 10 em foram transfectadas com 500 ng de um vetoralvo (PRI) e 500 ng de um vetor de expressão doador (pDl-DTX-I) na presença ou na ausência de 4000 ng de umaintegrase tpC31 que expressa o vetor (pCS-M3J) usando oLipofectamine DC 2000. Quarenta e oito horas depois datransfecção, as células foram tripsinizadas e o DNA doplasmídeo foi isolado usando um kit Miniprep Spin QIAprep(QIAGEN). O DNA foi amplificado com iniciadores PCR

TGCCCCGGGGCTTCACGTTTTCC- S'(SEQ ID No: 55) (de att P <pC31) e

GCCCGCCGTGACCGTCGAGAAC-31SEQ ID No: 56) (de att B <pC31), então com iniciadores

5' - CAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-S'(SEQ ID No: 57) (de att P <pC31) e

5'- CCGCTGACGCTGCCCCGCGTATC- 3'

(SEQ ID No: 58) (de att B cpC31), todos dos quais foramprojetados para especificamente amplificar o produto attRque poderia resultar somente da recombinação mediada porcpC31 integras e- de um local attP cpC31 em um vetor alvo comum local attB <pC31 em um vetor de expressão doador. Como umcontrole positivo 500 ng cada dos plasmídeo PTa-attB e PTa-attP o qual continha seqüências dos locais att (pC31 tiposelvagem, mais longas foram transfectadas na presença ou naausência de 4000 ng de um vetor cpC31 integras e (pCS-M3J) .PTa-attB e PTa-attP têm 285 e 221 regiões longas dos paresde bases dos locais attB cpC31 e dos locais attP <pC31,respectivamente. Enquanto um controle negativo não-transfectado das células foi usadas. Como pode ser visto naFIG. 22 pRl e pDl-DTX-I pode recombinar para gerar um localattR somente na presença da (pC31 integrase.

As funções do vetor alvo, do vetor doador e deambos os vetores de expressão integras e foram testados deuma vez por transfecção e pela seleção das células PERC6™ ouDG44 como diagramada na FIG. 11, antes que um grande númerode linhagem celular estáveis individuais fossem geradas.

Esta experiência foi feita somente uma vez no curso dodesenvolvimento da metodologia ou como necessário, porexemplo, se as variações do alvo, do doador ou dos plasmideointegrase são construídas. Subseqüentemente somente osvetores de expressão doadores, os quais codificam outrasproteínas de interesse transfectada transiente para testar aexpressão da proteína de interesse e para confirmar se ovetor doador é capaz de expressão.

O pRl do vetor alvo foi co-transf ectado com umplasmídeo expressando R4 integras e (pCMV-sre) dentro decélulas PERC6™ ou DG44 por lipofecção usando LipofectamineCD 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções dovendedor. As células foram incubadas então por quarenta eoito horas para permitir a expressão da proteína R4integrase, a qual media a integração local-específica entreR4 o local attB 295 presente no vetor alvo e os locaispseudo attP R4 presentes no cromos soma (FIGS. 3 e 11). Ascolônias que contêm um vetor alvo integrado foramselecionadas então em higromicina contendo meios (porexemplo, DMEM, 10% de soro bovino fetal, 10 mM de MgC12 paraPERC6™ e o F-12, 5 % de soro bovino fetal, 3 0 /-IM detimidina para DG44). As colônias resistentes a higromicina,únicas, foram isoladas e selecionadas para a sensibilidade apuromicma.

A higromicina resistente, clones sensíveis dovetor alvo à puromicina foram co-transfectados outra vez comum vetor doador (por exemplo, pDl-DTX-1) contendo o localAAA attB 285 cpC31 e um cassete de expressão codificandogenes de interesse, tais como, as cadeias pesadas e leves deum anticorpo específico humano para a toxina da difteria eda expressão que codifica uma (pC31 integrase alterada (porexemplo, pCS-M3J). A proteína da integrase (pC31 alteradamedia a integração local-específica entre o local AAA attB285 <pC31 presente no vetor doador e o local attP 103 cpC31projetado no cromossoma da linhagem celular usando o vetoralvo (FIGOS. 4 e 11).

Uma combinação estável de células puromicina-resistentes é isolada como segue. Quarenta e oito horas apósa segunda transfecção os meios regulares de crescimento dacélula foram substituídos com os meios de crescimento dacélula que contêm a puromicina (1 ug/ml para PER.C6™, 10/-lg/ml para DG44). Os meios de contenção foram trocado a cada2-3 dias por 7 dias (células DG44) ou 14-21 dias (células dePER.C6™), ou até o número de colônias crescentes tomar-seestáveis.

Neste ponto, todas as colônias foram tripsinizadase foram combinadas. As células foram recolocadas epermitidas a serem unidas por 24 horas. A seleção para aresistência à puromicina foi continuada por um total de pelomenos 21 dias a permitir os vetores de expressão não-integrados serem diluídos. 0 nível de expressão da proteínade interesse (por exemplo, codificando um anticorpo) foianalisado então para confirmar a função dos vetores deexpressão integras e do vetor alvo e dos vetores doadores.Para a expressão de medição do anticorpo, um ensaioespecífico para IgG humano (por exemplo, o Easy Titer IgGAssay, Pierce, Inc.) foi usado.

0 vetor alvo não pode integrar ou pode integraraleatoriamente em diferentes posições dos locais pseudo attPR4. Mesmo nestes casos o vetor doador pode ainda integrar-seno vetor alvo para reconstituir um gene de resistênciacompleto à puromicina. 0 número de colônias de puromicinaque seria esperado que resultasse destes eventos é muitomais baixo do que aqueles que ocorrem em conseqüência daintegração de um vetor doador em um vetor alvo que seja, porsua vez, local-específico integrado usando a integrase R4.Isto é porque os vetores não-integrados seriam perdidos aolongo do processo de seleção. A integração aleatória de umvetor alvo ocorrerá em uma freqüência muito mais baixa doque a integração local-específica mediada pela integras eR4. Para também documentar que os níveis de expressão daproteína medidos nesta experiência são primeiramente umresultado da integração local-específica inicial do vetoralvo, uma experiência de controle é feita em que o vetor deexpressão integras e R4 é omitido.

É desejável executar a etapa da seleção daresistência à puromicina para assegurar-se de que o trabalhocomo essa etapa é o local-específico da chave que integra ovetor de expressão doador. A integração do local attB cpC31dentro do vetor doador no local attP <pC31 no vetor do alvoconduz à criação de um local attL q>C31, em que este exemploespecífico é 88 bases ao longo. Esta seqüência adicionalestará presente na região 5' não-traduzida do mRNAcodificando a resistência à puromicina. Visto que o efeitodesta seqüência adicional na transcrição, na estabilidade domRNA, na tradução e daqui finalmente no nível de resistênciaà puromicina que pode ser alcançado não podem ser previstosunicamente das seqüências do ácido nucléico, os vetoresdevem ser testados como descrito acima para assegurar asfunções reconstitutivas do cassete de resistência àpuromicina a um grau que permita a seleção eficiente dascélulas em que o vetor doador tenha integrado dentro dovetor destinatário.

EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DA LINHAGEM CELULAR EXPRESSANDO PROTEÍNA

A seguinte protocolo foi seguido para a construçãode linhagem celular expressando proteína. As células deCHa/dhfir (por exemplo, células DG44 e células dePER.C6™)foram transfectadas usando Lipofectamine CD 2000 emplacas de 10 em como segue:

1. A primeira transfecção foi feita com 500 ng dopRl-DHFR do vetor alvo e 5000 ng do pCMV-sre do plasmídeointegras e R4 (FIG. 11) por placa de 10 cm.

2. As células foram crescidas por 48 horas nomeio regular (Ham's F-12, S% de soro bovino fetal, 3 0 /-IMde timidina).

3. As células foram então tripsinizadas eplaqueadas em placas de 96 poços em meio seletivo, que foium meio regular que contém 4 00 pg/ml de higromicina B. Sobestas circunstâncias, aproximadamente 3 0 únicos clone dacélula cresceram em cada um de cinco placas de poços.

4. Aproximadamente 7-8 dias após a transf ecção,quando as colônias são primeiramente visíveis pelo olho, osclones individuais foram trisinizados e transferidos a umnúmero mínimo para a placa de 96 poços. Um total de 165clones foi selecionado e consolidado em duas placas de 96poços.

5. As colônias selecionadas foram expandidas emum conjunto de triplicata da placa de 96 poços. Um conjuntofoi resfriado e estocado na fase de vapor de nitrogênioliquido. 0 terceiro conjunto foi para a segunda transfecção.

6. Um conjunto de colônias CHO foi expandido a 24placas poços e co-transfectada cora 15 ng de pDl-DTXl-G4l8,vetor de expressão doador selecionável, e 150 ng de pCS-M3J,o plasmideo integrase cpC31 mutante (FIG. 11) .

7. As células foram crescidas por 48 horas nomeio regular que contém 4 00 ug/ml de higromicina B.

8. As células foram crescidas então em meioseletivo que contém 10 ug/ml depuromicina. Após 7-21 dias de números variáveis daseleção de colônias crescidas, dependendo de que linhagemcelular parental attP foi transfectada.

9. As colônias foram tripsinizadas e entãocombinadas. A metade foi plaqueada em meio contendo 10 ug/mlde puromicina e metade foi plaqueada em meio contendolOpg/ml de puromicina e 400 ug/ml de G418.

10. Os meios seletivos foram trocados a cada 2-3dias até que os poços estivessem confluentes. As combinaçõesdos clones que cresceram em puromicina e em G418 foramexpandidas a 6 placas de poços e testadas para aprodutividade de IgG (pg IgG produzido/célula/dia).

11. Dos 165 clones parentais do vetor alvo-DHFR,132 foram sensíveis à puromicina e foram usados para asegunda transfecção. Destes 96 clones restantesproduzidos depuromicina e foram testados para a produção de IgG. Dos 96clones, 14 produziram IgG a níveis detectáveis.

12. A combinação (2G7-G) com o nível mais elevadode expressão ((3-8 pg/célula/dia) foi crescida em meiosseletivos para tanto o gene DHFR e quanto para o vetor deexpressão doador selecionável (MEMa-a, soro fetal bovinodilizado a 7%, 400 ug/ml de G418) por 6 dias e entãoplaqueados em 1 célula por poço em duas placas de 96 a fimde isolar o clone.

13. Um total de 56 clones foi obtido e aprodutividade de IgG foi medida. Os resultados são mostradosnas FIGURAS 28A e 28B. Três clones foram identificados comotendo os níveis de produtividade médios que são consideradosde extremidade alta (isto é, > 30 pg/célula/dia).

14. Outra combinação (2H9-G) , em que o gene DHFRfoi mostrado para ser ligado aos genes do anticorpo pormétodos de resgate do plasmídeo, foi sujeita à amplificaçãodo gene DHFR. As células crescidas em meios seletivos para ogene DHFR e o vetor de expressão doador selecionável (MEMa-,7% dialisado do soro bovino fetal, 400 ug/ml de G418). Ogene DHFR foi amplificado então adicionando quantidadescrescentes de metotrexato ao meio. A concentração inicialfoi de 2 uM e a concentração foi tipicamente aumentada 2 a 3dobras sobre cada 10-14 dias.

15. As produtividades de IgG da combinação 2H9-Gselecionada em várias concentrações de metotrexato forammedidas e os resultados são mostrados na FIG. 29. Em 200 nMde metotrexato um aumento acentuado na produtividade foiobservado a um nível igual àquele dos clones 2G7-Gexpressando os mais elevados. Entretanto enquanto poderiatomar aproximadamente 1 mês para se isolar a maior expressãode clones 2G7-G usando a integração local- específica, eletomaria aproximadamente 4 meses para isolar uma combinação2H9-G de expressão elevada usando a amplificação do gene.

PRIMEIRA INTEGRAÇÃO

A fim de criar um local único específico para aintegração de um vetor de expressão da proteína eidentificar locais attP W R4 nos genomas da linhagem celularque são apropriadas para a produção de nível elevado,reprodutível de proteínas o pRl do vetor alvo ou o pRl-DHFRdo vetor alvo- DHFR foram integrados em um grande número dediferentes locais attP W R4 nas células PERC6™ e DG44. Ovetor alvo ou o vetor alvo-DHFR foram misturados com o pCMV-sre do vetor de expressão integrase R4 e transfectados nascélulas PERC 6™ e DG44 por lipofecção de acordo com o asinstruções de vendedor. Os reagentes Lipossômicosapropriados para a lipofecção incluem Fugene 6 (RoucheApplied Science), Lipofectamine CD 2000 (Invitrogen) esimilares. As células foram incubadas por quarenta e oitohoras para permitir a expressão da integrase e da integraçãodo pRl ou do pRl-DHFR nos locais attP 1P R4 a ocorrer. 0 meiode crescimento regular da célula é substituído então com omeio de crescimento seletivo contendo 100 ug/ml (paracélulas de PERC6™) de higromicina B de 400 ug/ml (para ascélulas DG44) (Calbiochem). 0 meio do crescimento da célulafoi substituído a cada 2-3 dias por 7-14 dias ou até umnúmero máximo as colônias são visíveis. Um total de 100colônias, que fosse estimado para representaraproximadamente 50 locais diferentes do attP Y R4 foiescolhido e expandido para a segunda integração. Cada cloneda célula isolado nesta etapa é referido como uma linhagemcelular attP de PERC6™ ou uma linhagem celular do attP de DG44.

As seqüências adjacentes aos vetores alvointegrados foram determinadas para mostrar que estiveramintegradas por um mecanismo R4 mediada-integrase. Para fazeristo um método de "plasmídeo resgatado" foi usado queenvolve as seguintes etapas. 0 DNA genômico foi preparadodos clones do vetor alvo e digerido com Afl III ou Nsi I(New England Biolabs). Estas enzimas cortam o vetor alvoperto da origem de replicação, mas não cortam em nenhumoutro local entre a origem de replicação e um local attL 1PR4 (veja FIG. 12). Mais importante ainda eles também nãocortam dentro da origem de replicação e do gene deresistência à ampicilina, que são exigidos para o resgatebem sucedido do plasmídeo em E. Coli. 0 DNA digerido foiligado em baixa concentração ((3-1 0 ng/ml) e eletroporatadoentão em células TOPlO (Invitrogen). 0 DNA de Miniprep foiisolado das colônias resultantes e seqüenciado com uminiciador que corresponde ao filamento de anti-sentido daregião de codificação da puromicina, tal que a seqüênciaobtida estenderia da região de codificação da puromicinaatravés do local attP pC31 e então no local attL Y R4. Comomostrado na FIG. 23, o plasmídeo resgatado de dois clones dovetor alvo conteve seqüências até a seqüência do núcleo dolocal att R4 e estendeu-as então no DNA cromossomático. Aseqüência do núcleo do local att R4 foi suprimida em cadacaso, como ocorre freqüentemente quando integrases de serinerecombinam um local att tipo selvagem com um local W att.

Os métodos de PCR semi-aleatórios podem também serusados para determinar seqüências nas junções entre vetoresalvo e o DNA cromossomático. Por exemplo, o DNA WalkingSpeedUp Kit (Seegene) pode ser usado com esta finalidade. 0"iniciadores alvos-específicos" poderiam estar localizadosno gene de resistência à puromicina para isolar umaseqüência que contém o local attL W R4 ou na área poli A HSKTK para isolar uma seqüência que contém o local attR'P R4.

Alternativamente, métodos de "PCR inverso" podemser usados. Nestes métodos o DNA genômico é digerido com umaenzima de restrição que não corta dentro da região deinteresse. 0 DNA é ligado para formar um DNA circular. 0 DNAligado é amplificado então pela reação em cadeia depolimerase usando iniciadores alojados em seqüênciasconhecidas. A orientação dos iniciadores é invertidarelativa ao que poderia ser em um PCR normal, tais que, asseqüências através do ponto de ligação são amplificadas.

Antes da segunda integração, as linhagem celularesdo attP são selecionadas para a sensibilidade a puromicina.

Uma seleção de resistência à puromicina é usada paraselecionar a segunda etapa de integração e assim é útil paraassegurar-se de que os clones do vetor alvo ou do vetoralvo-DHFR sejam obtidos na primeira integração sejamsensíveis à puromicina. Nós encontramos que cerca de 10% dovetor alvo ou do vetor alvo-DHFR os clone podem serpuromicina sensível, dependendo da linhagem celular. Vistoque a eficiência da integração é aproximadamente 0, I-I % seum clone de resistência à puromicina foi tranfectada poderiaser prevista que somente 0, I-I % das células expressariamas proteínas de interesse e visto que as células já foramresistentes à puromicina poderia não ser possíveis aenriquecer para as células expressando as proteínas. Outraaproximação para contornar este problema, além da seleçãodos clones do vetor alvo para a sensibilidade a puromicinaapós a primeira transfecção, seria usar um vetor deexpressão doador selecionável na segunda transfecção.

SEGUNDA INTEGRAÇÃO

A fim de testar a habilidade de cada local attP 1PR4 que o vetor alvo integrou dentro de uma primeiraintegração para permitir a expressão de nível elevado daproteína, uma segunda integração de um vetor de expressãodoador é feita. Um vetor doador que codifica um anticorpo datoxina da anti-difteria (pDl- DTX-I) foi misturado com ovetor da expressão integrase <pC31 mutante (pCS-M3J) etransfectado em cada attP de PER.C6™ ou linhagem celularattP DG44 gerado na primeira transfecção por lipofecção deacordo com o instruções do vendedor. Os reagentesLipossômicos apropriados para a lipofecção incluem Fugene 6(Rouche Applied Science), Lipofectamine CD 2000(Invitrogen), e similarese. As células foram incubadas porquarenta e oito horas para permitir a expressão da integrase <pC31 mutante e a integração de pDl-DTX-I no vetor alvo aocorrer. O meio de crescimento regular foi substituído entãocom o meio de crescimento seletivo contendo 1 ug/ml depuromicina (para PER.C6™) ou 10 pg/ml (para DG44)(Calbiochem). As células de meio de crescimento contendopuromicina foram substituídas a cada 2-3 dias por 7 -14 diasou até um número máximo das colônias ficarem visíveis. Ascolônias levantadas de cada transfecção foi tripsinizada,expandida, congelada para o armazenamento da fase de vaporde nitrogênio líquido.

As seqüências ao redor da junção dos vetores deexpressão alvo e doador foram determinadas para mostrar queeles foram recombinados por um mecanismo mediado por cpC3lintegrase. Para fazer isto um método de "resgate deplasmídeo" foi usado envolvendo as seguintes etapas. 0 DNAgenômico foi preparado das combinações transfectadas com osvetores de expressão integrase <pC31 mutante e doador. 0 DNAfoi digerido com Tfi I (New England Biolabs) . Esta enzimacorta o vetor de expressão dentro do gene do anticorpo dacadeia pesada e o vetor alvo perto da origem de replicação,mas não corta em nenhum outro local entre estas áreas (vejaFIG. 13). Mais importante ainda Tfi I não corta dentro daorigem de replicação ou o gene de resistência à ampicilina,que são exigidos para o resgate bem sucedido do plasmídeo emE. Coli. 0 DNA digerido foi ligado em baixa concentração (p-10 ng/ml) e eletroporatado então em células TOPlO(Invitrogen). 0 DNA minipreparado foi isolado das colôniasresultantes e seqüenciado com um iniciador que correspondeao filamento de anti-sentido da região de codificação depuromicina, tais que, a seqüência obtida estenderia daregião da codificação de puromicina (do vetor alvo) atravésdo local attL88 cpC3l (junção entre os vetores alvo e doadorrecombinado), e então no sinal de poliadenilação do hormôniodo crescimento bovino (vetor doador). Como mostrado na FIG.24A e FIG. 25A a seqüência dos plasmídeos resgatados dascélulas DG44 e PER.C6™ foram como previsto se a integrase(pC31 integrou corretamente o vetor de expressão doadordentro do vetor alvo. As seqüências que cercam os locaisattR cpC3l foram determinadas em uma maneira similar e tambémencontradas para ser exatamente como previsto (FIG. 24B eFIG. 25B).

Os métodos PCR-baseados foram desenvolvidos tambémpara permitir a determinação rápida dos tipos de integraçõesque possam estar presentes nos clones ou nas combinações dosclones. No que diz respeito a três tipos de integração vetorde expressão doador são possíveis: aleatório, vetor alvo oulocal W att. Para detectar a integração aleatória, osiniciadores do PCR específicos para o local attB cpC31 novetor de expressão doador foram projetados. Na maioria doscasos de integração aleatória, o pequeno local att B (285pares de bases) seria intacto, visto que se a integração dovetor doador dentro do vetor alvo ou um local ¥ att tenhaocorrido, o local attB seria interrompido. 0 DNA genômico de6 combinações de clone em que o vetor doador tinha sidointegrado foi preparado. Um micrograma de DNA foi sujeitadoà reação em cadeia de polimerase usando iniciadores

5' - CATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTC-3'(SEQ ID No: 59) e

5' - AAGCTCTAGCTAGAGGTCGACGGTA-3'(SEQ ID No: 60) para 30 ciclos e 1 % desse DNA da reaçãoforam sujeitados então à reação em cadeia de polimeraseusando iniciadores

5' - GTCGACGAAATAGGTCACGGTCTC-S'(SEQ ID No: 61) eTACGTCGACATGCCCGCCGTGACC-3'(SEQ ID No: 62) para 30 mais ciclos. Os produtos do PCRforam separados em um gel do agarose a 4% e os resultadossão mostrados na FIG. 26A. A evidência para a integraçãoaleatória do vetor de expressão doador foi ausente de duascombinações (2G7, 2HI0), mas presente em quatro combinações(2B11, 2G11, 2H9G, 2H9P).

Para detectar a presença de integração em um vetoralvo, uma região que contém o local attR cpC31 híbrido foiamplificado por PCR diretamente nas células. Os váriosnúmeros de células tripsinizadas da combinação 2H9G foramusados. A combinação 2H9G das células foi derivada datransfecção de um clone do vetor alvo DG44 (pRl -DHFR) (2H9)com um vetor de expressão doador (pDl-DTXI-G418) e um vetorintegrase cpC31 mutante (pCS-M3J) . As células foramselecionadas em puromicina para um mês e então em G418 porum mês. As células tripsinizadas foram sujeitadas àamplificação do PCR usando iniciadores

5' - TGCCCCGGGGCTTCACGTTTTCC-S'(SEQ Id NO: 64) eGCCCGCCGTGACCGTCGAGAAC-3'

(SEQ Id No: 65) para 30 ciclos e 1 % desse DNA da reaçãoforam sujeitados então a um círculo subseqüente deamplificação de PCR usando iniciadores5' - CAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-S'(SEQ Id No: 63) eCCGCTGACGCTGCCCCGCGTATC-S,

(SEQ ID No: 66) para mais 30 ciclos. Os produtos do PCRforam separados em um gel do agarose a 4% e os resultadossão mostrados na FIG. 26B. Um sinal específico do tamanhocorreto foi amplificado quando células 102, 103, ou 104foram usadas.

Os métodos semi-aleatórios do PCR podem ser usadospara determinar se um vetor doador integrou em um local att¥ cp C31. Por exemplo, o DNA Walking SppedUp Kit(Seegene)pode ser usado com esta finalidade. Alternativamente ométodo inverso do PCR pode ser usado.

Os níveis da produção do anticorpo foram testadoscomo segue. Um número conhecido de células foi plaqueado emuma placa de 6 poços em meios de MEMu-(Invitrogen) com 7% desoro fetal bovino dializado (Invitrogen) para células de CHODHFR- OU DMEM (Invitrogen), soro fetal bovino a 10% (JRH),10 mM de MgCl2 para células de PER.C6™. As células foramcolocadas para crescer por 1-4 dias. Os meios foram colhidose ao mesmo tempo o número final de células foi determinado.

0 número da célula foi determinado usando umhemocitômetro. Alternativamente, kit de ensaio MTT-baseado(Cell Titer 96 kit, Promega) ou kits similares podem serusados para determinar o número de células na placa.Instrumentos, tais como, o ViaCount Assay (goiaba) que podemedir o número de células aderentes em uma placa também estádisponível.

A concentração de IgG nos meios foi determinadausando o kit de ensaio (Pierce) Easy- Titer Human Ig (H+L)que mede especificamente todas as classes de IgG humano. Aprodutividade específica (anticorpo/célula/dia de picograms)foi calculada da seguinte equação:

Anticorpo pg/ml X ml do meio colhidos (número de célulafinal + número inicial de célula)/2número de dias de anticorpo que foi produzido

Os resultados de linhagem celular do attP daseleção 100 PER.C6™ e de 100 linhagem celular do attP DG44são mostrados na FIG. 27 A e FIG. 27B, respectivamente.Dezesseis linhagens celulares de att P DG44 causaramcombinações de clone resistentes a puromicina com expressãodetectável e da melhor combinação produzida aproximadamente8 pg anticorpo/célula/dia (FIG. 27 A). Dezessete linhagenscelulares attP de PER.C6™ causaram combinações de cloneresistentes a puromicina com expressão detectável e damelhor associação produzida de aproximadamente 4 pganticorpo/célula/dia (FIGO. 27B).

Freqüentemente, as combinações dos clones irãoconter as células que variam extremamente nos termos deexpressão da proteína. Conseqüentemente, nós subclonamoscombinações de produção elevadas a fim de identificarlinhagem celular específica dentro das combinações quefornecem um nível elevado da expressão da proteína. Acombinação derivada da transfecção de linhagem celular doattP DG44 com o vetor de expressão doador exibiu o nívelmais elevado da expressão (2G7) subseqüentemente foi clonadalimitando a diluição em 96 placas de poços e analisada paraa produtividade do anticorpo como descrita acima. Osresultados são mostrados na FIG. 28. Dentro da combinação,que produziu 7.6 pg/célula/dia, são os clones que variam naprodutividade de 0,2 a 38 pg/célula/dia. Três clonesproduziram mais de 30 pg/células/dias.

As células que expressam altos níveis dasproteínas são freqüentemente uma desvantagem de crescimentoe podem conseqüentemente ser perdidos ou sub-representadosquando expandidos como descritas acima como parte de umacombinação. Um método para contornar este problema é comosegue. Após a transfecção com o vetor de expressão doador eo vetor integrase <pC31, as células são incubadas por 4 8horas para permitir que a integração ocorra. As célulastransfectadas são tripsinizadas e plaqueadas então em placasde 96 poços, tais que, as únicas colônias crescerão emaproximadamente 30% dos poços. O número de célulastransfectadas que são plaqueadas por poço depende daeficiência de plaqueamento e da eficiência da integração dovetor doador. Geralmente para obter o número máximo declones únicos da célula em uma placa de 96 poçosaproximadamente 0,3 células com viabilidade 100% sãoplaqueadas por poço. Assim, por exemplo, se a eficiência dep laqueament o de uma célula é 50% e 0,1 % das célulassubmetem-se a um evento de integração em que os resultadosem uma célula resistente a puromicina plaqueariam as células0,3/0,5/0,001 = 6000 por poço depois da transfecção a fim deobter clone. Se a eficiência de integração é muito alta podeser preciso transfectar poucas células.

As linhagens celulares attP PER.C6™ parental ouattP DG44 que resulta ao número mais elevado de clone com osníveis mais elevados da expressão da proteína são escolhidospara ser usados como as linhagens celulares attP integrandooutros vetores de expressão doadores e produzindo outrasproteínas em altos níveis. Aquelas linhagens celulares sãousadas repetidamente e somente um pequeno número «50) dosclones são gerados e selecionados para identificar aquelescom os níveis mais elevados de expressão. Este esquematrabalhará para a expressão de uma variedade de proteínas,mostrando que a habilidade de conseguir níveis elevados deexpressão pela integração em um local não é específica àexpressão do anticorpo. Este método conserva uma quantidadede tempo substancial comparada aos métodos que são usadosatualmente que pode exigir centenas ou milhares de clone detodo tempo na proteína diferente são produzidos. Além disso,integrando cassetes de expressão nos mesmos locus cada vezque a estabilidade dos genes e da expressão das proteínascodificados por aqueles genes é mais previsível comparadaaos métodos que são usados atualmente em que a estabilidadeda expressão do gene e da proteína é freqüentementealtamente variável, e em conseqüência pode exigir a seleçãode clones adicionais e de ensaios demorados para identificaraquelas linhagens celulares que são bastante estáveis paraser úteis. Este método também elimina os métodos deamplificação do gene que são freqüentemente usados paraimpulsionar a expressão se uma linhagem celular que tem umnível elevado da expressão da proteína não é obtida. Taismétodos de amplificação do gene, tais como, aqueles queutilizam o gene dihidrofolato reductase ou o gene daglutamina sintetase, tomam freqüentemente 3-6 meses paraconseguir níveis elevados de expressão e em muitos casos aexpressão não pode ser estável.

Diversas características da configuraçãocromossomática que resulta quando o vetor doador é integradono vetor alvo valem a pena observar (FIGS. 11-13) .Primeiramente, todos os promotores estão no mesmo ou nasorientações de oposição para evitar gerar os transcritos e osiRNA antisentido que possa reduzir a expressão de gene. Emsegundo, uma configuração dupla do promotor CMV iguala aexpressão das cadeias pesadas e leves de um anticorpo. Istoé importante porque freqüentemente quando há umdesequilíbrio na expressão da cadeia pesado ou o conjuntoapropriado da cadeia leve não ocorre ou são degradadas. Emterceiro lugar, os locais AAA attB 285 cpC31 e attP 103 (pC31foram projetados de modo que quando recombinam-se umapequena base 88 ao do local attL cpC31, não contendo nenhumcódons de início a montante da tradução, resultasse. Ocomprimento curto attL 88 cpC31, que está presente no 5' UTRda resistência à puromicina da codificação do mRNA, minimizaa interferência com expressão da resistência à puromicina.

Outra configuração exemplificativa inclui um emque o local attL cpC31 termina acima de um íntron. Para geraresta configuração o vetor doador é construído para conter(em ordem) um promotor, metade do N-terminal da região dacodificação de um gene de resistência da droga e 5* metadede um íntron que precede um local attB cpC31. O vetor alvo éconstruído então para conter (em ordem) o 3' metade de umíntron, a metade C-terminal da região de codificação de umgene de resistência à droga, e um sinal poli A seguido de umlocal attP cpC31. Após a integração do tal vetor doadordentro do tal vetor alvo inteiramente - um cassete funcionalde expressão de resistência à droga é reconstituído em queconsiste em um promotor, na região completa de codificaçãode um gene de resistência à droga e em um sinal poli A. Olocal attL cpC31 estará presente no íntron.

A informação extensiva está disponível sobre asseqüências de nucleotídeo em um íntron são exigidas para quea emenda apropriada ocorra. Por exemplo, as seqüênciasaproximam as junções 5' e 3' do éxonlíntron e um intervalode polipirimidina que seja localizado tipicamente a cerca de3 0 bases da extremidade 5' a 3' do íntron é exigida para quea emenda eficiente ocorra. Conseqüentemente, nasconfigurações descritas acima o attB no vetor doador e attPno vetor alvo são colocados no meio de um íntron pelo menos100 bases de uma ou outra extremidade do íntron de modo queo local resultante attL seja no meio do íntron longe detodas as seqüências e nucleotídeos que forem críticas paraque a emenda apropriada ocorra. Isto assegurar-se-á de que olocal resultante attL seja muito pouco susceptível deinterferir com a emenda. Além disso, o íntron pode ser longo(> IKBP) para minimizar mais o potencial que o local attLinterferirá com a emenda.

Métodos para a caracterização da linhagem celular.

Diversos procedimentos podem ser executados paracaracterizar o cassete do gene que está presente dentro e asproteínas que são produzidas pelas linhagens celularesderivadas usando os métodos descritos acima. O cassete doqene é caracterizado para determinar onde o casseteintegrado e para assegurar a estrutura prevista é atual eestável sobre o tempo. A proteína que estão sendo produzidaspela linhagem celular é caracterizada também para assegurar-se de que seja atual, ativa, e que a produção de nívelelevado seja estável sobre o tempo.

Para caracterizar o número de locais de integraçãoe de sua posição um número de métodos está disponível. Emalgumas incorporações, a hibridação de fluorescência in situ(FISH) é usada para determinar o número de locais daintegração no genoma inteiro. A posição de locais deintegração é determinada isolando e seqüenciando o DNAcromossomático que flanqueia o cassete integrado e comparadoà seqüência do genoma humano inteiro (veja, por exemplo,Chalberg, et al, 2006).

O cassete integrado inteira é isolado em doisfragmentos por um método "resgate de plasmídeo" cada mês demodo que o cassete seja arquivado caso seja desejável fazeruma análise retrospectiva. Em breve, o resgate do plasmídeoenvolve preparar o DNA genômico das linhagens celulares,digerindo-o com as enzimas de restrição que cortam uma veznocassete integrado e uma vez no DNA genômico, tais que, ofragmento de DNA terá uma origem de replicação e um marcadorselecionável apropriado para a manutenção e a seleção em E.Co li. 0 DNA digerido é ligado e usado para transformar E.Coli. Todo o DNA que contiver uma origem de replicação em E.Coli (por exemplo, CoIEI) e de réplicas selecionáveis de ummarcador (por exemplo, resistência à ampicilina) é então"resgatado". 0 cassete de DNA que resulta da integração dovetor alvo em um local attP W R4 e então subseqüentemente emuma integração do pDI do vetor doador dentro do vetor alvointegrado terá duas origens de replicação de E. Coli e doismarcadores selecionáveis. Diversas enzimas de restriçãocortam entre estas seqüências uma vez e permitem assim oresgate de DNAs que conteém os vetores alvo e doadorseparadamente. Usando este método a integridade e aestabilidade do cassete de expressão sobre o tempo pode serdeterminada. Por exemplo, o cassete inteiro (kbp (3-14) podeser seqüenciado para confirmá-lo se tem a seqüência e oarranjo pretendidos de elementos de DNA.

Se o local de restrição no DNA cromossomático édemasiadamente longe do cassete integrada para gerar um DNApequeno o bastante para ser replicado em E. Coli, o resgatedo plasmideo pode ser mal sucedido. Em tais incorporações, areação em cadeia de polimerase é usada para analisar ocassete integrado. Diversas enzimas e circunstâncias estãodisponíveis, tais que, o cassete inteiro integrado (3- 14 kbppode ser amplificado e armazenado sem uma clonagemsuplementar. Se for desejável obter as seqüências deflanqueamento, o DNA cromossomático tem um número de métodosdisponíveis, como o PCR ou as aproximações inversas que usaminiciadores aleatórios para amplificar as seqüênciascromossomáticas flanqueadas.

Além disso, para a determinação de quais genesestão presente é também desejável assegurar-se de que osvetores integrase não integrem-se no genoma. Isto é porque aexpressão persistente da integrase poderia conduzir ãinstabilidade dos cassetes integrados do vetor alvo e doadorou à instabilidade do DNA cromossomático pela recombinaçãoda mediação entre os locais att W presentes no genoma. Osvetores integrase estáveis foram observados após umatransfecção transiente, mas são raros. Entretanto, emalgumas incorporações pode ser desejável comandar a presençade vetores integrase nas linhagens celulares. Todos osmétodos apropriados para detectar a presença ou a ausênciade ácidos nucleicos específicos, tais como, Southernblotting ou a reação em cadeia de polimerase, podem serusados para determinar se os vetores integrase estãopresentes. Alternativamente os métodos, tais como, Westernblotting ou ELISA, os quais detectam a presença de umaproteína integrase, podem ser usados.

CARACTERIZAÇÃO DE PRODUÇÃO DA PROTEÍNA

Além disso, para a caracterização dos cassetes dogene integrado, a qualidade, a estabilidade e o nível daprodução da proteína (por exemplo, produção do anticorpo)são também caracterizados. Inicialmente, um grande número decombinação de linhagem celular (> 100) da segunda integraçãofoi selecionado para a produção da proteína em uma placa de96 poços. Uma variedade de métodos apropriados para aseleção do anticorpo pode ser usada. Por exemplo, ELISA éusado para medir a quantidade total presente do anticorpo.

Se o nível de anticorpo que está sendo feito é produzido anível apropriado, o gel de SDS-poliacrilamida pode tambémser usado para selecionar níveis de produção. Se as célulassão crescidas em meios de soro livre, é possível carregar ossobrenadantes da cultura de célula diretamente em um gel deSDS-PAGE. Se as células são crescidas em meios de contençãoo anticorpo pode ser detectado especificamente e dosadoperto, por exemplo, Western blotting ou ELISA.

ATIVIDADE DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA DO ANTICORPOPRODUZIDO POR CÉLULAS

DG44 ou PER.C6™ foi transfectado com pDl - DTXI(usando Lipofectamine CD 2 000 como descritos em outraparte). Vinte quatro horas após a transfecção os meios foramcolhidos. IgG total foi determinado usando um kit de ensaioEasy- Titer (H+L) IgG (como descrito em outros lugares napatente). A toxina IgG da Anti-difteria foi determinadausando um kit ELISA IgG Diphtheria (IBL Hamburgo) exatamentede acordo com o as instruções do vendedor.

A FIG. 31 mostra a atividade de ligação específicado anticorpo da toxina anti-difteria expressada nas célulasDG44 ou nas células PER.C6™. O anticorpo produzido de cadacélula tem a mesma atividade de ligação especifica. Alémdisso, os resultados mostram que o anticorpo de ambas aslinhagens celulares tem a especificidade correta do antígenoe que p-250mg deste anticorpo seria necessário para uma dosetípica de 10.000 1U.

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO ANTICORPO PRODUZIDO POR CÉLULAS

Um ensaio de neutralização pode também ser usadopara medir a atividade funcional de um anticorpo. Porexemplo, a toxina do antraz e outras toxinas, tais como, acélulas de culturas mortas da toxina da difteria.

Conseqüentemente, a atividade de um anticorpo da toxinaanti-difteria pode ser determinada medindo sua habilidade deneutralizar as propriedades de extermínio celular da toxinada difteria purificada. A relação da atividade funcionalpara a proteína total (atividade específica) é uma medidaútil ao nível de anticorpo ativo ou de outra proteína quesegrega uma linhagem celular particular produzida.

A atividade de neutralização do anticorpo datoxina anti-difteria produzido de DG44 ou de PERC6™ foideterminada e comparada ao anticorpo da linhagem celularD2.2, de qual os genes do anticorpo da toxina anti-difteriaforam clonados. 0 anticorpo de DG44 ou de PERC6™ foi geradopelo transfecção transiente de células usando oLipofectamine CD 2000 como descrito em outra parte. Aquantidade de anticorpo presente nos sobrenadantes dascélulas D2.2 ou de DG44 e as PERC6™ transf ectados foramdeterminadas por ELISA usando a toxina da difteria pura comoo anitgen. As várias quantidades de anticorpos foramadicionadas então à lOng/ml de toxina da difteria. Após umaincubação de 15 minutos em 37°C. As misturas doanticorpo/toxina foram adicionadas às células de Jurkat, quesão sensíveis a morte pela toxina da difteria. A divisão decélula foi medida pela incorporação 3H-timidina. Osresultados são mostrados na FIG. 32. Controle das célulasque foi tratado com somente toxina e nenhum anticorpo mortocomo indicado pela falta da incorporação significante de 3H-timidina. As células tratadas com as quantidades crescentesde anticorpo da toxina anti-difteria produzidos por célulasD2.2, DG44 ou de PERC6™ sobreviveram. O EC50 para protegercélulas de Jurkat da matança pela toxina da difteria foi5,8, e 11 ng/ml para os anticorpos da toxina anti-difteriaproduzidos por células de D2.2, DG44 ou de PERC6™,respectivamente.

Aproximadamente dez linhagens celulares queproduzem níveis mais elevados de anticorpo em uma pequenaescala são adaptadas à cultura em suspensão de soro-livre emuma escala maior (por exemplo, 100 ml - 1 litro) . Diversosclones são adaptados, visto que alguns não podem se adaptar,crescer rapidamente, ou reter níveis da expressão doanticorpo em níveis mais elevados. Após a adaptação daslinhagens celular à produção do anticorpo da cultura emsuspensão os níveis são testados outra vez. A produção doanticorpo exemplificativa em uma escala de laboratório éaproximadamente 10-100 mg/L dos meios por dia ouaproximadamente 10-100 pg/célula/dia que suporta umadensidade de célula máxima de 1 x 109 células por litro.

Uma variedade de métodos foi descrita para apurificação do anticorpo de IgG humano em grande escala.

Tipicamente, pelo menos três resinas de cromatografia sãousadas. Uma coluna de proteína A é usada como uma primeiraetapa da afinidade para capturar o IgG pela ligação da suaregião de Fe. A segunda coluna é projetada para remover aendotoxina, as proteínas celulares permanecendo, e todaproteína A que lixivie da primeira coluna. As resinasexemplificativas incluem hidroxiapatita, interaçãohidrofóbica ou resinas de troca catiônica o qual o Ca éusado para a segunda etapa da cromatografia. Uma coluna datroca aniônica é usada como a terceira etapa para remover o DNA.

Aproximadamente 100 mg do anticorpo sãopurificados e testados em um ensaio de atividade apropriado.Para anticorpos da toxina anti-difteria in vivo um ensaioapropriado é um teste de pele feito nas cobaias. O anticorpoé misturado com a toxina da difteria purificada e injetadona pele. Toxina que não é neutralizada resulta em umaresposta inflamatória. Para anticorpos da toxina anti-difteria in vitro um ensaio apropriado é utilização decélulas Vera. Tão pouco quanto uma molécula da toxinadifteria (Sigma) é provavelmente capaz de matar célulasatravés de um ADP-ribosilação covalente da proteínaacessória ribosomal do fator de alongamentoz (EF -2) . Emconseqüência toda a síntese da proteína na célula é inibidae as células morrem. Assim, todo o ensaio que mede aviabilidade da célula ou o metabolismo da célula, tal comoum ensaio MTT-baseado é usado para determinar o título doanticorpo de encontro a uma dada quantidade de toxina dadif teria purificada. Tais ensaios são feitos a cada mês por12 meses para estabelecer uma vida útil e para estudar aestabilidade do anticorpo purificado.

Um gel de SDS-poliacrilamida é usado para avaliaralgumas características básicas do anticorpo. Por exemplo, aeletroforese do gel SDS de uma amostra reduzida do anticorpopode ser usada para confirmar a quantidade, pureza e paracorrigir o peso molecular das cadeias pesadas ((5-50 kDal) eleves ((3-25 kDal), mas o mais importante confirmar que arelação da aceia pesada a leve é aproximadamente 1:1. Aeletroforese do gel de SDS de uma amostra desnaturada, masnão-reduzida é usada para determinar se o anticorpo éprimeiramente monomérico ou multimérico. Isto é importanteporque a presença de anticorpo agregado pode indicarproblemas de produção ou de purificação. Os anticorposagregados podem ter efeitos indesejáveis, tais como, atoxicidade do rim, quando usados como terapêutico humano.Finalmente, os anticorpos agregados são tambémfreqüentemente inativos no que diz respeito a sua atividadebiológica desejada. Outros métodos bioanalíticos podemtambém ser usados para avaliar o estado da agregação de umanticorpo que inclui a dispersão de luz ou a filtragem de gel.

EXEMPLO 3

LINHAGEM CELULAR CHO PARA A PRODUÇÃO DA PROTEÍNA USANDOUM VETOR DE EXPRESSÃO DOADOR SELECIONÁVEL

Nós encontramos que transfecção de clonescelulares DG44 pRl-DHFR com o vetor de expressão pCS-M3 Jintegras e <pC31 mutante sozinho poderia conduzir às célulasresistentes a puromicina sem transfecção do vetor deexpressão doador. Este parece ser o resultado de rearranjosintegrase-mediado cpC31 do DNA cromos somático no plasmídeointegrado pRl-DHFR nas áreas 5' ao gene de resistência depuromicina. Tais DNAs cromos somáticos translocados podemconter os promotores que conduzem a expressão da resistênciaà puromicina. Em algumas experiências o número desteseventos foi até 3 0% do número de eventos desejados daintegração em que o vetor de expressa doador integrou dentrodo vetor alvo.

Um método para contornar este problema era ter umgene de resistência funcional completo da droga, tal como,uma codificação de resistência G418, no vetor de expressãodoador. Depois que a transfecção do clone do vetor alvo comum gene G418 que contém o vetor de expressão doador e ovetor integrase cpC31, seguido pela seleção para a puromicinahaverá duas classes de integrantes. Em uma classe derecombinação do vetor de expressão doador dentro de locaisatt P tipo selvagem no vetor alvo terá ocorrido e em umaoutra classe os rearranjos do DNA cromossomático no vetoralvo terão ocorrido. Entretanto se uma seleção G418 éaplicada depois que a seleção a puromicina somente osrecombinantes com um vetor de expressão doador completopermanecerá. Células em que rearranjos cromossomático de DNAdentro do vetor alvo tenham ocorrido não conterão o vetorexpressão doador-G418 e será eliminado.

Observe que a ordem das seleções da resistência àdroga é importante. Se a seleção G418 foi feitaprimeiramente, a seguir as células com o vetor da expressãoG418-doador integrado aleatoriamente, no vetor alvo, e emlocais att W podem ser obtidas. Então, se uma seleção apuromicina foi feita subseqüentemente, as células comintegrações do local att Y ou aleatório seriam eliminadas,mas rearranjos cromossomáticos no vetor alvo podem aindaocorrer como nas células em que a integração do vetor deexpressão doador dentro do vetor alvo não tenha ocorrido.Por razões similares é indesejável fazer simultaneamenteseleções de puromicina e G418.

Para determinar se faz uma seleção G418 depois quea seleção de puromicina foi benéfica, pDl-DTXI-G418 foitransfectado dentro de clones IAI de DG44 RI-DHFR, 2B1 1,2E8, 2G7, 2HI, 2H9 como descrito no exemplo 2. Dois diasapós a transfecção as células foram selecionadas em 10 ug/mlde puromicina por 7 dias. Então as colônias foram separadasem meios de crescimento contendo 10 ug/ml de puromicinasomente ou 10 ug/ml de puromicina e 400 ug/ml de G418. Aseleção sob estas circunstâncias continuou por 21 dias. Osmeios foram analisados então para a produção do anticorpo.Os resultados destes ensaios são mostrados na tabela 1. Aseleção G418 aumentou a produtividade específica pela dobra30 a 73 em 4 casos e não teve nenhum efeito em dois casos.

Mesmo se a seleção G418 tivesse um efeito pode depender daeficiência da integração do vetor de expressão doador emcada clone do vetor alvo, e também da freqüência dos eventosvetor de expressão-independentes que conduzem à resistênciaà puromicina.

Tabela 1: Efeito do uso de um vetor de expressãodoador selecionável na produção da proteína

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Genes de resistência à droga completos, à exceçãode um codificação de resistência G418, podem opcionalmenteser incorporados em um vetor de expressão doadorselecionável. A única limitação é que deve ser diferentedessa usada para selecionar a integração do vetor alvo (porexemplo, resistência à higromicina), para selecionar aintegração do vetor doador (por exemplo, resistência àpuromicina) ou para amplificar o número de cópia do vetoralvo (por exemplo, dihidrofolato reductase). Assim sendo,por exemplo, os genes que codificam a resistência à zeocinaou a blasticidina podem ser utilizados.

Um outro benefício de usar um vetor de expressãodoador selecionável é aquele após a integração <pC31 -mediadade um vetor de expressão doador selecionável dentro de umvetor alvo, tal como, o pRl-DHFR, o gene selecionável estarálocalizado entre as regiões de codificação das cadeiaspesadas e leves do anticorpo. Daqui a seleção continuaimpedirá a recombinação homóloga entre elementos repetidosdo vetor de expressão (por exemplo, promotor, seqüência dosinal, sinal poliadenilação) que poderia conduzir a deleçãodas regiões de codificação da cadeia pesada ou leve.

EXEMPLO 4

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR CHO PARA A PRODUÇÃO DEPROTEÍNA DE ELEVADO RENDIMENTO

0 método de cultivar e de transfeção das célulasCHa seguirá o procedimento como descrito em Thyagarajan etal, Methods MoI. Bio., 308:99 - 106 (2005). Resumidamente,células "CHa/dhfr-" (por exemplo, células DG44) irão sertransfectadas usando Fugene 6 em placas de 24 poços, aseguinte protocolo é seguido:

1. A primeira transfecção é feita com o vetor alvoe o plasmídeo integras e cpC31 (FIG. 3).

2. 24 horas após a transfecção, as células sãotransferidas a placa de 100 mm.

3. 48 horas após a transfecção, as células sãoselecionadas para clone resistentes a higromicina.

4. Aproximadamente 12-14 dias após a transfecçãoquando as colônias formadas aparecem nos poços, os clonesindividuais são escolhidos e transferidos a uma placa de 24poços. Da experiência precedente com utilização da integrasecpC31, somente 30-50 clone precisam ser selecionados paraobter clone da elevado-expressão.

5. As colônias selecionadas serão mantidas em doisconjuntos de 24 placas poços. Um cnjunto é para amanutenção, a outro conjunto é para a seleção.

6. a conjunto da seleção de colônias CHa nasplacas de 24poços é co-transfectado com o vetor doadorexpressando um gene repórter (por exemplo, CIP, GFP ouluciferase), e o plasmídeo integrase R4 (FIG. 4).

7.48 horas após a segunda transfecção, o meio não-seletivo é removido das placas e meio contendo zeocina éaplicado diversas vezes por aproximadamente 2 semanas.

8. As células são colhidas então para ensaiosapropriados do gene repórter.

9.3-5 clones são selecionados que expressam osníveis mais elevados de gene repórter, e os clonescorrespondentes são expandidos do conjunto da manutenção.

10. As linhagens celulares resultantes, contendoum local acessório do fago integras e R4 (attP) , sãoreferidas como células CHO-R4attP.

TESTANDO A LINHAGEM CELULAR CHO-R4ATTP

Um anticorpo SARS ou antraz é usado para testar alinhagem celular CH0-R4attP. A maioria dos anticorpos SARS eantraz são IgGI. As regiões variáveis de VH e de VL dosanticorpos são clonadas e montadas então em um vetor quecontenha regiões constantes IgGl para produzir anticorposcompletos. Os cDNAs para a cadeia pesada e a cadeia levepodem qualquer um ser clonados em dois plasmídeo doadoresseparados ou em um único plasmídeo doador no que tandem serconduzido por dois promotores idênticos ou dois diferentes.Uma vantagem de usar uma integras e de fago é que não hánenhuma limitação do tamanho no gene de interesse. Umsistema de dois plasmídeo e um sistema do um plasmídeo serãousados para expressar os anticorpos de comprimento completo.

A expressão de anticorpos monoclonais na escala dapesquisa foi descrita extensivamente (Wurm et al. , NatBiotechnol22, 1393-8 (2004); Andersen et al, CUIT OpinBiotechnoll3, 117-23 (2002); Wirth et al., Gene 73, 419-26(1988); Kim et al. , Biotechnol Bioeng 58, 73-84 (1998);Gandor et al., FEBS Lett 377,290-4 (1995); and Kito et al.,Appl Microbiol Biotechnol60, 442-8 (2002)). Estesprocedimentos comuns são seguidos no que diz respeito àlinhagem celular CH0-K4attP. 0 meio de soro-livre e oprocesso de cultura celular são desenvolvidos paraaperfeiçoar a produção do anticorpo para a fermentação emgrande escala.

A linhagem celular parental, um subclone de"CHO/dhfr-", é selecionado para produzir proteína com umrendimento elevado de 30-50 pg/célula/dia no meio de soro-livre. A taxa de produção prevista usando a linhagem celularprojetada attP CH0-R4 será aproximadamente pelo menos 30pg/célula/dia no meio do soro-livre. Uma vez que a linhagemcelular e o vetor doador são desenvolvidos, todo o gene doanticorpo de interesse pode convenientemente ser clonado nocassete de expressão do vetor doador (FIG. 2) . Visto que aseleção para clone de expressão de alto rendimento requersomente a seleção de 30-50 colônias, uma linhagem celularestável que expresse altos níveis de um anticorpo possarapidamente ser gerada em uma maneira de baixo-custo.

CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM CELULAR CHO-R4ATTP

0 memorando "Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals(1993)" publicado pelo Center for Biologies Evaluation andResearch (CBER) do FDA é seguido para caracterizar alinhagem celular CHO- RAattP.

Além disso, o local de integração do attP R4 écaracterizado inteiramente, por exemplo, no que diz respeitoao número de cópias e ao locus da integração, por métodosconvencionais, por exemplo, FISH, Southern blots,seqüenciamento de DNA e PCR. Visto que a integração futurade um gene de interesse será alvejada especificamente aolocal que tenha sido projetado previamente no cromossoma, acaracterização do local de integração de cada geneindividual de interesse é trivial. Conseqüentemente, acaracterização futura das linhagens celulares estáveis queexpressam o gene de interesse é significativamentesimplificada, tempo de regate e custo.

EXEMPLO 5

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR CHO DHRF -AMPLIFICÁVELPARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA DE ELEVADO RENDIMENTO

O sistema da DHFR-amplificação é amplamenteutilizado em sistemas de expressão CHa a fim de aumentar onúmero de cópia de um DHFR associado a um cassete deexpressão. a sistema de expressão utiliza célulashospedeiras CHa deficiente de dihidrofolato reductase (DHFR)conjuntamente com um gene transfectado DHFR como um marcadorselecionável. a sistema amplifica os genes e as seqüênciasligadas ao DHFR, o qual conduz ao melhorado nível deexpressão da proteína (Wurm e outros, Nat. Biotechnol22,1393-8 (2004)). As células transfectadas desenvolvem aresistência ao metotrexato (MTX) , a um inibidor DHFR com aamplif icação do gene DHFR de até 100-10.000 kilobases daregião circunvizinha (Coquelle et al., CelI89, 215-25(1997); e Stark et al., CelI57, 901-8 (1989)). Após 2-3semanas da exposição à MTX, a maioria das células morre.Entretanto, as células de sobrevivência contêmfreqüentemente várias centenas a algumas mil cópias doplasmídeo integrado (Wurm et al. , Ann N Y Acad Sei 782, 70-8(1996); e Wurm et al., Biologicals 22,95-102 (1994)). Amaioria das células "amplificadas" produzem até 10 - 20dobras a mais de proteínas recombinantes (Wirth et al., Gene73,419 - 26 (1988)). Diversos ciclos de amplificação do genesão executados freqüentemente e tipicamente a concentraçãode metotrexato é aumentada 3-5 dobras após cada ciclo daamplificação do gene. Três opções alternativas são testadaspara a melhor amplificação DHFR.

Para testar se a amplificação DHFR do gene deinteresse permitiria a expressão aumentada da proteína, ogene DHFR foi colocado no vetor alvo. Um diagramaesquemático de um vetor alvo que inclui um gene DHFR éfornecido na FIG. 15. A seqüência do vetor resultante éfornecida nas FIGURAS 35A-35C. A FIG. 2 9 mostra que aexpressão de um anticorpo (pg/célula/dia) de uma associaçãodas células em que um vetor de expressão doador foi local-específico integrado dentro de um vetor alvo-DHFR epopulações da célula foram então expostas às concentrações

crescentes de metotrexato.

Há pelo menos três vantagens da ligação do geneDHFR com o local attP R4 no vetor alvo. Primeiramente, apósa amplificação do DHFR, o cromossoma também terá múltiplascópias do local attP R4. Depois que o vetor doador étransfectado dentro da linhagem celular CH0-R4attP (DHFR), ogene de interesse pode ser integrado dentro de múltiplolocais recebimento attP R4, mediado pela integrase R4. Emsegundo, se a linhagem celular previamente amplificada CHO-RAattP (DHFR) já tem a capacidade de expressar um nívelsuficientemente elevado do gene de interesse, uma segundaamplificação DHFR não pode ser exigida depois que o gene deinteresse é transfectado, assim tendo tempo e esforçosignificativos de economia. Em terceiro lugar, visto que alinhagem celular CH0-R4attP (DHFR) terá sido bemcaracterizada, após a integração do gene de interesse dovetor doador, a linhagem celular de expressão que produz ogene de interesse não pode precisar de outra amplificaçãolonga DHFR e caracterização adicional, ganhando umaquantidade significativa de tempo e de custo.

Em um segundo exemplo, o gene DHFR está presenteno vetor doador. Um diagrama esquemático do vetor doadorincluindo um gene DHFR é fornecido na FIG. 6. Em um terceiroexemplo, o gene DHFR está presente no vetor alvo (FIG. 5) eno vetor doador (FIG. 6) . Após a amplificação de DHFR, alinhagem celular projetada CH0-R4attP (DHFR) é esperada paraproduzir um rendimento bem acima de 3 0 pg/célula/dia no meiolivre de soro.

EXEMPLO 6

LINHAGEM CELULAR PROJETADA DE CHO PARA A PRODUÇÃO ELEVADA DAPROTEÍNA DO RENDIMENTO COM A UTILIZAÇÃOREALÇADA DA TRADUÇÃO IRES

A possibilidade e a necessidade de usar umelemento otimizado IRES junto com a integras e cpC31 paratambém aumentar o nível da expressão são também testadas. OIRES-elemento aperfeiçoado é clonado no vetor doador, amontante da região de codificação para a proteína deinteresse e a jusante do local do começo da transcrição(FIG. 7). Este IRES-elemento aumentará significativamente aprodução da proteína realçando a eficiência da tradução domRNA alvo (Chappell et al., J Biol Chem 278,33793-800(2003); Owens et al., Proc Natl Acad Sei USA 98, 1471-6(2001); and Chappell et al., (2000) Proc. NatI. Acad. Sei.U.S.A., 97, 1536-1541).

Para obter grandes quantidades de proteínas e deanticorpos terapêuticos, as linhagens celularessuperexpressantes são desenvolvidas que usam novastecnologias baseadas em translação que são capazes de níveismuito mais elevados de produção da proteína do quepossível usando transcrição tradicional dos métodos baseadosque aumentam a quantidade do gene mRNA do alvo, por exemplo,com o uso de promotores fortes, duplicação cromossomática eda seleção da elevação expressando linhagem celular.

Os realçadores translacionais foram desenvolvidosrecentemente usando as seqüências curtas do RNA quefuncionam enquanto locais internos da entrada do ribossomo(IRESes) esses recrutam a maquinaria da tradução e facilitama iniciação da tradução. Embora a atividade do IRES-elementoindividual fosse relativamente fraca, mostrou-se que aatividade dos IRES poderia ser aumentada sinergisticamentequando os elementos particulares IRES fossem ligados junto(Owens et al., Proc Natl Acad Sei USA 98, 1471-6 (2001); eChappell et al., (2000) Proc. NatI. Acad. Sei. U.S.A., 97,1536-1541). Nestes estudos, IRESes sintético foram testadosna região intercistrônica de mRNAs dicistrônicos para a suahabilidade de melhorar a tradução do segundo cístron.Entretanto, mostrou-se recentemente que um destes IRESespoderia também funcionar como um realçador translationalpoderoso quando colocado no 5' líder de um mRNAmonocistrônico. Este IRES sintéticos contiveram múltiplascópias ligadas de um 9-nt IRES-módulo de líder 5' de umhomeodomínio Gtx mRNA.

O objetivo é para identificar os elementos IRESque funcionam eficientemente em células CRO e usam esteselementos individuais para gerar os realçadorestranslacionais sintéticos que funcionam eficientemente emcélulas CRO. Os realçadores translacionais são tambémdesenvolvidos funcionando eficientemente no humano-híbrido enas linhagens celulares humanas que são usadas para aprodução em grande escala.

Os elementos individuais IRES que funcionameficientemente nestas linhagens celulares são obtidos usandouma metodologia da seleção em que um cassete que contém 18nucleotídeos aleatórios é clonado em um vetor de seleção etransfectado na linhagem celular de interesse (Owens eoutros, Proc Acad Nat Sei USA 98, 1471-6 (2001)). Asexperiências de seleção são executadas usando um vetorretroviral dicistrÔnico GFP/CFP. As células que contêmelementos ativos IRES são selecionadas por F ACS. Asseqüências selecionadas são recuperadas e reexaminadas em umvetor duplo luciferase RenillalPhotinus (RPh) para mostraras funções IRES em um outro contexto e não é dependente ouinfluenciado pelas seqüências presentes nos vetores GFP/CFPusados para selecioná-los. Os vários elementos IRES sãotestados para que sua atividade sinergética pela ligaçãojunt de múltiplas cópias do mesmo ou de elementos-IRESdiferentes. As combinações de elementos que mostram IRESrealçados a atividade são testadas para que sua habilidadefuncione como realçadores translacional na 5' líder de umRNA monocistrônico repórter.

Os realçadores translacionais sintéticos que sãogerados são testados então no 5' líderes dos mRNAs quecodificam proteínas ou anticorpos terapêuticos paradeterminar que combinações do realçador/gene funcionam maiseficientemente. Uma vez que combinações particulareseficientes são identificadas, os constructos são testados emcondições de cultura escalonadas e também otimizados casonecessário para maximizar a produção do anticorpo.

EXEMPLO 7

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR CHO PARA A PRODUÇÃO DAPROTEÍNA INDUTíVEL DE RENDIMENTO ELEVADO

As linhagens celulares apropriadas para a escalaacima e a fabricação deve ter a capacidade combinada para ocrescimento rápido e a produtividade-específica elevada.Devido ao nível elevado da expressão do vetor de expressão,as células da produção podem ter dificuldades para crescerao expressar altos níveis de proteínas estrangeiras ou asproteínas estrangeiras podem agregar durante uma fase decrescimento prolongada. Se esta dificuldade é encontrada, uminterruptor ligado-desligado está adicionado ao vetor doadorpara prever a expressão induzível do gene de interesse. Comotal, o elemento funcionaria para desligar a expressão dotransgene durante o crescimento da célula e giraria somentesobre a expressão quando as células vissem uma quantidadecritica e estão prontas para a produção da proteína. Estesinterruptores são atuados pelos ligantes que interage com umsistema receptor apropriado que condicionalmente interferecom ou ativa a transcrição. Diversos interruptoresproprietariamente foram desenvolvidos para estudos daterapia de gene e podem ser usados no sistema de produçãoprevisto, incluindo, mas não limitado a, o sistema ARGENT, osistema GENE SWITCH, riboswitches, proteínas do dedo dezinco, sistemas baseados receptor de ecdisone, e similares.Além disso, os sistemas tetraciclina-inditíveis e gás-inditíveis podem também ser utilizados (Weber et al., NatBiotechnol22, 1440-4 (2004); e Weber et al. , Metab Eng 7,174-81 de Metab (2005)).

EXEMPLO 8

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR PER.C6™ PARA A PRODUÇÃO DEPROTEÍNA DE RENDIMENTO ELEVADO0 método de cultura e transfecção de célulasPER.C6™ seguirá o procedimento como descrito em Thyagarajanet al, Methods MoI. Bio., 308:99 - 106 (2005).Resumidamente, as células PER.C6™ serão transfectadas usandoFugene 6 em placas de 24 poços. 0 seguinte protocolo éseguido:

1. A primeira transfecção é feita com o vetor alvoe o plasmídeo integrase cpC3l (FIG.3) .

2. 24 horas após a transfecção, as célulassãotransferidas a placas de 100 mm.

4. Aproximadamente 21 dias após a transfecçãoquando as colônias aparecem bem-formadas, os clonesindividuais são escolhidos e transferidos a uma placa de 24poços.

Da experiência precedente usando a integrase cpC31,somente 30-50 clones precisam ser selecionados para obterclone de elevada-expressão.

5. As colônias selecionadas são mantidas então emdois conjuntos de placas de 24 poços. Um conjunto é para amanutenção. 0 outro conjunto é para a seleção.

6. 0 conjunto da seleção de colônias PERC6™ naplaca de 24 poços é o plasmídeo co- transfectado com o vetordoador expressando um gene repórter (por exemplo, SEAP, CIP,GFP ou luciferase), e integrase R4 (FIG. 4)

7.48 horas após a segunda transfecção, o meio não-seletivo é removido das placas e o meio contendo zeocina éaplicado diversas vezes por aproximadamente 3 semanas.

8. As células são colhidas então para ensaiosapropriados do gene repórter.

9.3-5 clones que expressam os níveis mais elevadosdo gene repórter é selecionado e os clones correspondentesdo conjunto de manutenção são expandidos.

10. As linhagens celulares resultantes, contendoum local acessório do fago da integrase R4 (attP) , sãoreferidas como células PERC6™ - MattP.

TESTANDO A LINHAGEM CELULAR PER.C6™-R4ATTP

Um anticorpo SARS ou antraz é usado para testar ecaracterizar a linhagem celular PERC6™- RAattP. A maioriados anticorpos SARS e antraz são IgGI. As regiões variáveisde VH e de VL dos anticorpos são clonadas e montadas entãoem um vetor que contenha regiões constantes IgGI paraproduzir anticorpos completos. Os cDNAs para a cadeia pesadae a cadeia clara podem qualquer um ser clonado em doisplasmídeos doadores separados ou em um único plasmídeodoador no que tende ser conduzido por dois promotoresidênticos ou dois diferentes. Uma vantagem de usar umaintegras e do fago é que não há nenhuma limitação do tamanhono gene de interesse. Um sistema do dois-plasmídeo e umsistema de um plasmídeo será usado para expressar osanticorpos de comprimento total.

A expressão de anticorpos monoclonais na escala dapesquisa foi descrita extensivamente (Wurm et al., NatBiotechnol22, 1393-8 (2004); Andersen et al, Curr OpinBiotechnoll3, 117-23 (2002); Wirth et al., Gene 73, 419-26(1988); Kim et al., Biotechnol Bioeng 58, 73-84 (1998);Gandor et al. , FEBS Lett 311,290-4 (1995); and Kito et al. ,Appl Microbiol Biotechnol6 0, 442-8 (2002)), e também emcélulas de PERC6™ (Urlaub et al, Proc Natl Acad Sci USA 77,4216-20 (1980)). Estes procedimentos comuns são seguidos noque diz respeito à linhagem celular CH0-R4attP. 0 meio livrede soro e o processo celular é desenvolvido para aperfeiçoara produção do anticorpo para a fermentação em grande escala.

A taxa de produção prevista usando a linhagemcelular projetada de PERC6™-R4u#P será aproximadamente depelo menos 3 0 pg/célula/dia no meio livre de soro. Uma vezque a linhagem celular e o vetor doador são desenvolvidos,todo o gene do anticorpo de interesse pode convenientementeser clonado no cassete de expressão do vetor doador (FIG.2) . Visto que a seleção para clone de nível elevado deexpressão requer somente a seleção de 3 0-50 colônias, umalinhagem celular estável que expresse altos níveis de umanticorpo possa rapidamente ser gerada em uma maneira decustos-efetivos.

CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM CELULAR PER.C6™-R4ATTP

O memorando "Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals(1993)" publicado pelo Center for Biologies Evaluation andResearch (CBER) do FDA é seguido para caracterizar alinhagem celular PERC6™-R4uffP. [00284] Além disso, o localda integração attP R4 é caracterizado inteiramente, porexemplo, no que diz respeito ao número de cópias e ao locusda integração, por métodos convencionais, por exemplo, FISH,Southern bloots, seqüenciamento de DNA e PCR Visto que aintegração futura de um gene de interesse será alvejadaespecificamente ao local que tem sido projetado previamenteno cromossoma, a caracterização attP R4 do local deintegração de cada gene individual de interesse é trivial.Conseqüentemente, a caracterização futura das linhagenscelulares estáveis que expressam o gene de interesse ésignificativamente simplificada na economia de tempo ecusto.

EXEMPLO 9

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR PER.C6™ PARA A PRODUÇÃO DEPROTEÍNA DE RENDIMENTO ELEVADO COM A UTILIZAÇÃO ATRADUÇÃO MELHORADA USANDO UM IRES

A possibilidade e a necessidade de usar umelemento-IRES junto com uma integrase <pC31 para tambémaumentar o nível da expressão são também testados. Oelemento-IRES aperfeiçoado é clonado no vetor doador, ajusante do promotor e a montante da região de codificaçãopara o gene de interesse (FIG. 7) . Este elemento-IRESaumentará significativamente a produção da proteínarealçando a eficiência da tradução do mRNA alvo (Chappell etal, J Biol Chem 278,33793- 800 (2003); Owens et al. , ProcNatl Acad Sci USA 98, 1471-6 (2001); and Chappell et al. ,(2000) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 97, 1536-1541).

Para obter grandes quantidades de proteínas e deanticorpos terapêuticos, as linhagens celularessuperexpressantes são desenvolvidas usando novas tecnologiasbaseadas na tradução em que são capazes de níveis muito maiselevados de produção da proteína do que é possível usandotranscrição tradicional dos métodos baseados que aumentam aquantidade do gene mRNA alvo, por exemplo, com o uso depromotores fortes, duplicação cromossomática e da seleção dalinhagem celular de alta expressão. [00287] Os realçadorestranslacionais foram desenvolvidos recentemente usando asseqüências curtas do RNA que funcionam enquanto locaisinternos da entrada do ribossomo (IRESes) que recrutam amaquinaria da tradução e facilitam a iniciação da tradução.Embora a atividade de elemento-IRES individual fosserelativamente fraca, mostrou-se que a atividade dos IRESpoderia ser aumentada sinergisticamente quando os elementosIRES particulares fossem ligados juntos (Owens et al., ProcNatl Acad Sei USA 98, 1471-6 (2001); and Chappell et al. ,(2000) Proc. NatI. Acad. Sei. U.S.A., 97, 1536-1541). Nestesestudos, IRESes sintéticos foram testados na regiãointercistrônica de mRNAs dicistrônico para que suahabilidade para realçar a tradução do segundo cístron.Entretanto, mostrou-se recentemente que um dos IRESespoderia também funcionar como um realçador translacionalpoderoso quando colocado no 5' líder de um mRNAmonocistrônico. Este IRES sintéticos contiveram múltiplascópias ligadas de um NT-9 IRES-módulo do 5' líder dohomeodomínio Gtx do mRNA.

Um objetivo é para identificar os elementos IRESque funcionam eficientemente em células PER.C6™ e usam esteselementos individuais para gerar os realçadorestranslacionais sintéticos que funcionam eficientemente emcélulas PER.C6™. Os realçadores translacionais sãodesenvolvidos também funcionando eficientemente no humano-híbrido e nas linhagens celulares humanas que são usadaspara a produção em grande escala.

Os elementos individuais IRES que funcionameficientemente nestas linhagens celulares são obtidos usandouma metodologia da seleção em que um cassete contendo 18nucleotídeos aleatórios é clonado em um vetor de seleção etransfectado na linhagem celular de interesse (Owens et al. ,Proc Acad Natl Sei USA 98, 1471-6 (2001)). Seleções dasexperiências são executadas usando um vetor retroviraldicistrônico de GFP/CFP. As células que contêm elementosativos IRES são selecionadas por F ACS. As seqüênciasselecionadas são recuperadas e reexaminadas em um vetorduplo do luciferase RenillalPhotinus (RPh) para mostrar asfunções IRES em um outro contexto e não são dependentes ouinfluenciadas pelas seqüências presentes nos vetores GFP/CFPusados para selecioná-los. Os vários elementos IRES sãotestados para que sua habilidade a atividade sinergéticaligada junto a múltiplas cópias do mesmo ou de elementos-IRES diferentes. As combinações de elementos que mostram aatividade IRES realçada são testadas para que sua habilidadefuncione como realçadores translacionais no 5' líder de umRNA monocistrônico repórter.

Os realçadores translacionais sintéticos que sãogerados são testados então no 5' líderes dos mRNAs quecodificam proteínas ou anticorpos terapêuticos paradeterminar que combinações do realçador/gene funcionam maiseficientemente. Uma vez que as combinações eficientesparticulares são identificadas, os constructos são testadosna escala acima das condições de cultura e também otimizadoscaso necessário para maximizar a produção do anticorpo.

EXEMPLO 10

ENGENHARIA DA LINHAGEM CELULAR PER.C6™ PARA A PRODUÇÃO DEPROTEÍNA INDUTÍVEL DE RENDIMENTO ELEVADO

As linhagens celulares apropriadas para a escalaacima e a fabricação deve ter a capacidade combinada para ocrescimento rápido e a produtividade-específica elevada.Devido ao nível elevado da expressão do vetor de expressão,as células da produção podem ter dificuldades de crescimentoao expressar altos níveis de proteínas estrangeiras ou asproteínas estrangeiras podem agregar durante uma fase decrescimento prolongado. Se esta dificuldade é encontrada, uminterruptor ligado-desligado é adicionado ao vetor doadorpara prever a expressão induzível do gene de interesse nalinhagem celular PER.C6™. Como tal, o elemento funcionariapara desligar a expressão do transgene durante o crescimentoda célula e giraria somente sobre a expressão quando ascélulas vissem uma quantidade crítica e estão prontas para aprodução da proteína. Estes interruptores são atuados pelosligantes que interagem com um sistema receptor apropriadoque condicionalmente interfere com ou ativa a transcrição.Diversos interruptores proprietariamente foram desenvolvidospara estudos da terapia de gene e podem ser usados nosistema de produção previsto, incluindo, mas não limitado a,o sistema ARGENT, o sistema GENE SWITCH, riboswitches,proteínas do dedo de zinco, sistemas receptor-baseados emecdisone, e similares. Além disso, sistema tetracycline-induzível e gás-induzível podem também ser utilizados (Weberet al., Nat Biotechnol22, 1440-4 (2004); and Weber et al,Metab Eng 7, 174-81 (2005)).

A precedência ilustra meramente os princípios dainvenção. Apreciar-se-á que aqueles hábeis na técnicapoderão planejar os vários arranjos que, embora descritosnão explicitamente ou mostrados aqui, personificam osprincípios da invenção e são incluídos dentro de seusespírito e escopo. Além disso, todos os exemplos e linguagemcondicional relatados aqui são pretendidos principalmentepara ajudar ao leitor na compreensão dos princípios dainvenção e dos conceitos contribuídos pelos inventores apromover a arte, e devem ser interpretados como sendo semlimitação a tais exemplos e circunstâncias especificamenterelatados. Além disso, todas as indicações relatadas aquidos princípios, aspectos e incorporações da invenção assimcomo exemplos específicos dos mesmos, são pretendidas paraabranger equivalentes estruturais e funcionais dos mesmos.

Adicionalmente, pretende-se que tais equivalentes incluemambos equivalentes atualmente conhecidos e equivalentesdesenvolvidos no futuro, isto é, todos os elementosdesenvolvidos que executarem a mesma função, não obstante aestrutura. 0 escopo da presente invenção, conseqüentemente,não é pretendido ser limitado às incorporaçõesexemplificativas mostradas e descritas aqui.

Particularmente, o escopo e o espírito da presente invençãosão personificados pelas reivindicações adicionadas.

Claims

1. VETOR ALVO PARA INTEGRAÇÃO EM SÍTIOS-ESPECÍFICOS, caracterizado por compreender:(a) um primeiro sítio de recombinação do vetor querecombina com um sítio de recombinação genômica na presençade uma primeira recombinase de sítio-específicounidirecional ;(b) um segundo sítio de recombinação do vetor querecombina com um sítio de recombinação doador na presença deuma segunda recombinase de sítio-específico unidirecional queé diferente da primeira recombinase de sítio-específicounidirecional ;(c) uma primeira porção de um primeiro marcadorselecionável adjacente ao segundo sítio de recombinação dovetor na extremidade 31; e(d) um segundo marcador selecionável que édiferente do primeiro marcador selecionável.

2. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o sítio de recombinaçãogenômica é um sítio de recombinação genômica de mamífero.

3. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio recombinação genômico de fago(attP).

4. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) e o sítio de recombinação genômico é umsítio de recombinação genômico de pseudo-fago (pseudo-attP).

5. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômico defago (attP) e o sítio de recombinação genômico é um sítio derecombinação pseudo-bacteriano (pseudo-attB).

6. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um sítio de recombinaçãogenômico de pseudo-fago (pseudo-attP).

7. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o segundo sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio de recombinação genômico defago (attP).

8. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o segundo sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um sítio attP derecombinação genômica pseudo-fago (pseudo-attP).

9. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a primeira recombinase desítio-específico unidirecional é uma fago recombinase cpC31,uma fago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, umafago recombinase cpFCl, uma fago recombinase cpRvl ou uma fagorecombinase cpBTl.

10. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a primeira recombinase desítio-específico unidirecional é uma fago recombinase cpC31.

11. VETOR ALVO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a segunda recombinase desítio-específico unidirecional é uma fago recombinase R4.

12. MÉTODO DE SÍTIO-ESPECÍFICO QUE INTEGRA UMPOLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO UMA PROTEÍNA DE INTERESSE EM UMGENOMA DE UMA CÉLULA EUCARIÓTICA, caracterizado por:(a) introduzir o vetor alvo de acordo com areivindicação 1 em uma célula de mamífero compreendendo umaprimeira recombinase de sítio-específico unidirecional emantendo a célula de mamífero sob condições suficientes paraum evento de recombinação mediado pela primeira recombinasede sítio-específico unidirecional entre o primeiro sítio derecombinação do vetor e o sítio de recombinação genômico parao sítio-específico integrar o vetor alvo dentro do genoma dacélula de mamífero;(b) introduzir um vetor doador na célula alvo quecompreende uma segunda recombinase de sítio-específicounidirecional, em que o vetor doador compreende opolinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse e umsítio de recombinação doador e mantendo a célula alvo sobcondições suficientes para um evento de recombinação mediadopela segunda recombinase de sítio-específico unidirecionalentre o sítio de recombinação doador e o segundo sítio derecombinação do vetor do vetor alvo ao sítio-específico paraintegrar o polinucleotídeo que codifica uma proteína deinteresse no genoma da célula de mamífero;onde a primeira recombinase de sítio-específicounidirecional é diferente da segunda recombinase de sítio-específ ico unidirecional.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado por também compreender a seleção de uma célulaque expresse a proteína de interesse.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio de recombinação genômico defago (attP).

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) e o sítio de recombinação genôraico é umsítio de recombinação genômico de pseudo-fago (pseudo-attP).

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicofago (attP) e o sítio de recombinação genômico é um sítio derecombinação genômico pseudo-bacteriano (pseudo-attB).

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um sítio attP derecombinação genômico de pseudo-fago (pseudo-attP) .

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o segundo sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio de recombinação genômico defago (attP).

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o segundo sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicopseudo-bacteriano (pseudo-attB) ou um sítio attP derecombinação genômico de pseudo-fago (pseudo-attP) .

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o sítio de recombinação doadoré um sítio de recombinação genômico bacteriano (attB) ou umsítio de recombinação genômico de fago (attP).

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o sítio de recombinação doadoré um sítio de recombinação genômico pseudo-bacteriano(pseudo-attB) ou sítio attP de recombinação genômico depseudo-fago (pseudo-attP).

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a primeira recombinase desítio-específico unidirecional é uma fago recombinase <pC31,uma fago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, umafago recombinase o cpFCl, uma fago recombinase cpRvl ou umafago recombinase <pBTl.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a segunda recombinase desítio-específ ico unidirecional é uma fago recombinase cpC31,uma fago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, umafago recombinase cpFCl, uma fago recombinase cpRvl ou uma fagorecombinase pBTl.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a primeira recombinase desítio-específ ico unidirecional é uma fago recombinase <pC31.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a segunda recombinase desítio-específico unidirecional é uma fago recombinase R4.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteínasegregada.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a proteína segregada é umanticorpo.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula demamífero.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é umacélula de roedor.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que a célula do roedor é umacélula CHO.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é umacélula humana.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a célula humana é uma célulaPER.C6™.

33. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, caracterizada porcompreender um polinucleotídeo cassete integradogeneticamente compreendendo,um primeiro sítio híbrido de recombinação e umsegundo sítio híbrido de recombinação flanqueado:(a) um sítio de recombinação do vetor querecombina com um sítio de recombinação doador na presença deuma recombinase de sítio-específico unidirecional;(b) uma primeira parcela de um primeiromarcador selecionável adjacente aos locais de recombinação dovetor na extremidade 3'; e(c) um segundo marcador selecionável que sejadiferente do primeiro marcador selecionável.

34. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o sítio derecombinação do vetor é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio de recombinação genômico defago (attP).

35. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o sítio derecombinação do doador é um sítio de recombinação genômicobacteriano (attB) ou um sítio de recombinação genômico defago (attP).

36. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que arecombinase de sítio-específico unidirecional é uma fagorecombinase cpC31, uma fago recombinase TP901-1, uma fagorecombinase R4, uma fago recombinase cpFCl, uma fagorecombinase cpRvl ou uma fago recombinase cpBTl.

37. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a célula éuma célula de mamífero.

38. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a célula demamífero é uma célula de roedor.

39. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a célula deroedor é uma célula CHO.

40. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a célula demamífero é uma célula humana.

41. CÉLULA EUCARIÓTICA ISOLADA, de acordo com areivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a célulahumana é uma célula PER.C6™.

42. KIT PARA USO NO SÍTIO-ESPECÍFICO QUE INTEGRAUM POLINUCLEOTÍDEO DENTRO DE UM GENOMA DE UMA CÉLULA INVITRO, caracterizado por compreender:(a) um vetor de acordo com a reivindicação 1; e(b) um vetor doador compreendendo:(i) um múltiplg sítio de clonagem;(ii) um sítio de recombinação doador; e(iii) uma segunda parcela de um primeiromarcador selecionável adjacente aos locais de recombinaçãodoador de extremidade 5' .

43. KIT, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado por também compreender uma primeira recombinasede sítio-específico unidirecional ou um ácido nucléicocodificando a mesma.

44. KIT, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado por também compreender uma segunda recombinasede sítio-específico unidirecional ou um ácido nucléicocodificando a mesma que seja diferente da primeirarecombinase de sítio-específico unidirecional.

45. KIT, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a primeira recombinase desítio-específ ico unidirecional é uma fago recombinase (pC31,uma fago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, umafago recombinase cpFCl, uma fago recombinase cpRvl ou uma fagorecombinase cpBTl.

46. KIT, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que a segunda recombinase desítio-específ ico unidirecional é uma fago recombinase cpC31,uma fago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, umafago recombinase cpFCl, uma fago recombinase cpRvl ou uma fagorecombinase cpBTl.

47. KIT PARA USO EM PRODUZIR UMA PROTEÍNA EM UMACÉLULA, caracterizado por compreender:(a) uma célula eucariótica isolada de acordo com areivindicação 43; e(b) um vetor doador compreendendo:(i) um múltiplo sítio de clonagem;(ii) um sítio de recombinação do doador; e(iii) uma segunda parcela de um primeiromarcador selecionável adjacente aos locais de recombinação dodoador de extremidade 5' .

48. KIT, de acordo com a reivindicação 47,caracterizado por também compreender de um sítio-específicode recombinação unidirecional ou de um ácido nucléico quecodifica o mesmo.

49. KIT, de acordo com a reivindicação 48,caracterizado pelo fato de que a recombinase de sítio-específ ico unidirecional é uma fago recombinase cpC31, umafago recombinase TP901-1, uma fago recombinase R4, uma fagorecombinase cpFCl, uma fago recombinase (pRvl ou uma fagorecombinase cpBTl.