JP7096790B2 - 発現カセット - Google Patents
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Description
本出願は、その全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる2011年12月7日に出願された米国仮出願第61/567,675号の利益を主張する。
る領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、約100~約15000ヌクレオチドである発現カセットを提供する。
一態様において、本開示は、以下の発明を包含する。
[1] プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および発現増強エレメントを含む発現カセットであって、発現増強エレメントが、真核生物グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1近傍のヌクレオチド位置~+7000近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約100~約15000ヌクレオチドである、発現カセット。
[2] 真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列をさらに含み、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約100~約15000ヌクレオチドである、[1]に記載の発現カセット。
[3] 真核生物GAPDHプロモーターまたはその断片を含まないという条件で、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列を含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが100~約15000ヌクレオチドである、発現カセット。
[4] 真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列をさらに含み、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1近傍のヌクレオチド位置~+7000近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約100~約15000ヌクレオチドである、[3]に記載の発現カセット。
[5] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流および/または上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[6] ポリアデニル化部位をさらに含む、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[7] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約10ヌクレオチドであり、その最長の場合で、IFF01遺伝子の最後から2番目のイントロンまたはその一部まで伸びる、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[8] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記真核生物のGAPDHのポリアデニル化部位の下流で開始され、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、少なくとも約100ヌクレオチドであり、その最長の場合で、IFF01遺伝子の最後から2番目のイントロンまで伸びる、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[9] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、少なくとも約100ヌクレオチドであり、その最長の場合で、NCAPD2遺伝子の開始コドンまで伸びる、[2]に記載の発現カセット。
[10] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、少なくとも約100ヌクレオチドであり、その最長の場合で、NCAPD2遺伝子の最後から3番目のイントロンまで伸びる、[2]に記載の発現カセット。
[11] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、少なくとも100ヌクレオチドであり、その最長の場合で、NCAPD2遺伝子の開始コドンまで伸びる、[3]に記載の発現カセット。
[12] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、少なくとも100ヌクレオチドであり、その最長の場合で、NCAPD2遺伝子の最後から3番目のイントロンまで伸びる、[3]に記載の発現カセット。
[13] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流および/または上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が哺乳動物に由来する、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[14] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流および/または上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が齧歯動物またはヒトに由来する、[13]に記載の発現カセット。
[15] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号8および21またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[16] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号8および21またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[17] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号8および21またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列を含む、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[18] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号7、9、10、11、12、13、14、15、16、20、22、23、24、25、26、27、および28またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、[2]または[3]に記載の発現カセット。
[19] 配列番号7、9、10、11、12、13、14、15、16、20、22、23、24、25、26、27、および28またはその断片からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列が、5カ所以下の核酸修飾を含む、[18]に記載の発現カセット。
[20] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号7、9、10、11、12、13、14、15、16、20、22、23、24、25、26、27、および28またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、[2]または[3]に記載の発現カセット。
[21] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、配列番号7、9、10、11、12、13、14、15、16、20、22、23、24、25、26、27、および28またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列を含む、[2]または[3]に記載の発現カセット。
[22] 前記プロモーターと、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列とが、作動的に連結されている、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[23] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と同方向に配向している、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[24] 前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している、[1]または[4]に記載の発現カセット。
[25] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と同方向に配向している、[2]または[3]に記載の発現カセット。
[26] 前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している、[2]または[3]に記載の発現カセット。
[27] 前記プロモーターが、SV40プロモーター、MPSVプロモーター、マウスCMV、ヒトtk、ヒトCMV、ラットCMV、ヒトEF1アルファ、チャイニーズハムスターEF1アルファ、ヒトGAPDH、MYCプロモーター、HYKプロモーター、およびCXプロモーターを組み入れたハイブリッドプロモーターからなる群から選択される、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[28] 前記ポリペプチドが、抗体、抗体断片、または抗体誘導体からなる群から選択される、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[29] 前記ポリアデニル化部位が、BGH poly(A)およびSV40 poly(A)からなる群から選択される、[6]に記載の発現カセット。
[30] さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、および選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む、[1]から[4]のいずれかに記載の発現カセット。
[31] 前記遺伝子エレメントが選択マーカーであり、前記選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列中に含有されるCpG部位の含量が45以下である、[30]に記載の発現カセット。
[32] [1]から[29]のいずれかに記載の発現カセットを含む発現ベクター。
[33] a)真核生物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)プロモーター
c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
d)ポリアデニル化部位
e)エンハンサー
f)真核生物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)真核生物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)エンハンサー
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)真核生物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)エンハンサー
b)真核生物GAPDHの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)真核生物GAPDHの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を、a)またはb)が、真核生物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列である場合は、f)が、真核生物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列であり、a)またはb)が、真核生物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列である場合は、f)が、真核生物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列であるという条件で、順に含む発現ベクターであって、前記エンハンサーの組入れが任意選択であり、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1近傍のヌクレオチド位置~+7000近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、約100~約15000ヌクレオチドであり、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約100~約15000ヌクレオチドである、発現ベクター。
[34] 前記発現ベクターが、さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、複製起点、および選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む、[32]または[33]に記載の発現ベクター。
[35] 前記発現ベクターが複製起点および選択マーカーをさらに含み、前記複製起点および前記選択マーカーをコードする前記発現ベクターのポリヌクレオチド配列中に含有されるCpG部位の含量が200以下である、[32]または[33]に記載の発現ベクター。
[36] [1]から[31]のいずれかに記載の発現カセット、または[32]から[35]のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[37] 障害を処置するための医薬として用いられる、[1]から[31]のいずれかに記載の発現カセット、または[32]から[35]のいずれかに記載の発現ベクター。
[38] 遺伝子治療で使用するための、[1]から[31]のいずれかに記載の発現カセット、または[32]から[35]のいずれかに記載の発現ベクター。
[39] ポリペプチドを発現させるためのin vitro法であって、宿主細胞を、[1]から[31]のいずれかに記載の発現カセット、または[32]から[35]のいずれかに記載の発現ベクターでトランスフェクトするステップと、前記ポリペプチドを回収するステップとを含むin vitro法。
[40] 前記発現カセットまたは前記発現ベクターを、安定的にトランスフェクトする、[39]に記載の方法。
[41] 前記発現カセットまたは前記発現ベクターを、一過性にトランスフェクトする、[39]に記載の方法。
[42] 哺乳動物の宿主細胞から異種ポリペプチドを発現させるための、[1]から[31]のいずれか一項に記載の発現カセット、または[32]から[35]のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
は「遺伝子」という用語は、互換的に用いられる。これらの用語は、宿主細胞において、好ましくは、哺乳動物細胞において発現させ、採取することが求められる組換え産物、特に、組換え異種タンパク質産物をコードするDNA配列を指す。遺伝子産物は、ポリペプチドでありうる。異種遺伝子配列は、天然では宿主細胞内に存在せず、同じ種または異なる種の生物に由来し、遺伝子改変されている場合がある。
DH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、例えば、とりわけ、別段に示されない限りにおいて、真核生物のGAPDHの転写開始起点に照らした位置である。
の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合は、シス作用型転写制御エレメントの任意の組合せを含めたプロモーター配列および/またはエンハンサー配列を、コード配列に作動可能に連結する。転写される遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーター調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する。
約2700ヌクレオチド」には、2430~2970ヌクレオチド、好ましくは2600~2800ヌクレオチド、より好ましくは2690~2710ヌクレオチド、最も好ましくは2695~2705ヌクレオチドの値が含まれ、「約3300ヌクレオチド」には、2970~3630ヌクレオチド、好ましくは3100~3500ヌクレオチド、より好ましくは3290~3310ヌクレオチド、最も好ましくは3295~3305ヌクレオチドの値が含まれ、「約3200ヌクレオチド」には、2880~3520ヌクレオチド、好ましくは3000~3400ヌクレオチド、より好ましくは3190~3210ヌクレオチド、最も好ましくは3195~3205ヌクレオチドの値が含まれ、+7000近傍または+7000位近傍には、+6300~+7700位、好ましくは+6700~+7300位、より好ましくは+6990~+7010位、最も好ましくは+6995~+7005位が含まれ、+1近傍または+1位近傍には、-10~+10位、好ましくは-5~+5位、より好ましくは-1~+2位が含まれ、-3500近傍または-3500位近傍には、-3150~-3850位、好ましくは-3300~-3700位、より好ましくは-3490~-5010位、最も好ましくは-3495~-3505位が含まれる。本明細書で言及されるヒト、マウス、およびラット由来のGAPDH遺伝子、IFF01遺伝子、およびNCAPD2遺伝子のDNAに用いられる番号付けに関して本明細書で用いられるか、またはある配列番号の配列内の位置に関して本明細書で用いられる「近傍」という用語は、最大で±500bp、好ましくは±100bp、より好ましくは±10bp、最も好ましくは±5bpの偏差を伴う値を包含する。
及び、最後から2番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列は、配列番号17により示されるヌクレオチド配列のbp 18106近傍まで及ぶ。
F01遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるIFF01遺伝子をコードするbp 3579014(+6883位)近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるIFF01遺伝子の最後から2番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるIFFO1遺伝子をコードするbp 3585061(+12930位)近傍まで及ぶ。NCBIデータバンクでは、染色体の位置がいまだ注記されておらず、最新の配列情報も、多くの未知の塩基を含有する。したがって、境界についての精密な注記は、より正確な配列情報が入手可能となるのに従い変化する可能性がある。
れるbp 8463に対応するGAPDH mRNAの転写開始点に照らして)において開始され、その長さが、配列番号17に示されるbp 8463近傍~11819近傍の配列に対応する3357bp近傍であることが好ましく、GAPDHポリアデニル化部位の下流の非翻訳ゲノムDNA配列が、+4070近傍(配列番号17に示されるbp 8602に対応するGAPDH mRNAの転写開始点に照らして)において開始され、その長さが、配列番号17に示されるbp 8602近傍~11819近傍の配列に対応する3218bp近傍であることがより好ましい。
を含まないという条件で、発現カセットが、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列を含み、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがGAPDHではなく、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列が、真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが100~約15000ヌクレオチドである。
遺伝子の転写開始点に照らした-3673位)近傍まで及ぶ。
288671~161310417位近傍の真核生物DNAに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子をコードする第4染色体の161289191bp近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子の最後から2番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子をコードする第4染色体の161289446bp近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子の最後から3番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるNCAPD2遺伝子をコードする第4染色体の161290508bp近傍まで及ぶ。
クレオチド配列のbp 1449(チャイニーズハムスターGAPDH mRNAの転写開始点に照らした-2752)近傍まで及ぶ。最後から2番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列は、配列番号29により示されるヌクレオチド配列のbp 1200(チャイニーズハムスターGAPDH mRNAの転写開始点に照らした-3001位)近傍まで及ぶ。最後から3番目のイントロンまで伸びる真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列は、配列番号29により示されるヌクレオチド配列のbp 1(チャイニーズハムスターGAPDH
mRNAの転写開始点に照らした-4200位)近傍まで及ぶ。
mRNAの転写開始点に照らして)において開始される。GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列がヒトに由来する場合は、GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列が、-500近傍(配列番号17に示されるbp 4533に対応するGAPDH mRNAの転写開始点に照らして)において開始されることが好ましい。GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列がヒトに由来する場合は、GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列が、-576近傍(配列番号17に示されるbp 4533に対応するGAPDH mRNAの転写開始点に照らして)において開始され、その長さが、配列番号17に示されるbp 800近傍~3957近傍の配列に対応する約3158bpであることがより好ましい。
ヌクレオチド配列と同方向に配向しているヌクレオチド配列またはその断片も同様により好ましい。
GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが約100~約15000ヌクレオチドである場合、発現カセットのプロモーターは、真核生物GAPDHプロモーター、好ましくは、哺乳動物GAPDHプロモーター、より好ましくは、齧歯動物GAPDHプロモーターまたはヒトGAPDHプロモーターでありうる。この実施形態では、真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始される、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列が、真核生物GAPDHプロモーターのすぐ上流に位置することが好ましく、この実施形態では、発現カセットが、真核生物GAPDHプロモーターを含み、-3500近傍のヌクレオチド位置まで伸びる自然発生のゲノムDNA配列を含むことがより好ましく、ヌクレオチド位置は、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置である。
成長因子(FGF)ファミリーの非グリコシル化成長因子;ならびにホルモンおよび成長因子の非グリコシル化受容体である。
a)真核生物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)プロモーター
c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
d)ポリアデニル化部位
e)エンハンサー
f)真核生物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)真核生物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)エンハンサー
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)真核生物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)エンハンサー
b)真核生物GAPDHの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)真核生物GAPDHの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターであって、エンハンサーの組入れが任意選択であり、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、GAPDHではなく、真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列が、+1近傍のヌクレオチド位置~+7000近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、約100~約15000ヌクレオチドであり、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列が、真核生物GAPDHプロモーターの5’端近傍~-3500近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、約100~約15000ヌクレオチドである発現ベクターを提供する。
a)真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)プロモーター
c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
d)ポリアデニル化部位
e)エンハンサー
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
a)真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)エンハンサー
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
a)エンハンサー
b)真核生物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
a)真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)プロモーター
c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
d)ポリアデニル化部位
e)エンハンサー
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
a)真核生物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)エンハンサー
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
a)エンハンサー
b)真核生物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
する。ポリペプチドは、異種ポリペプチド、より好ましくは、ヒトポリペプチドであることが好ましい。
ーターの下流および/または上流の非翻訳ゲノムDNA配列と、宿主細胞とが異なる由来である場合、例えば、真核生物GAPDHプロモーターの下流および/または上流のヒトDNA配列が、CHO細胞において用いられる場合に得られることが見出されている。
I.材料および方法
I.1 プラスミド構築物
I.1.1.LB培養プレート
500mlの水を混合し、16gのLB寒天(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)(1リットルのLBは、10gのトリプトン、5gの酵母抽出物、および10gのNaClを含有する)と共に煮沸した。冷却後、それぞれの抗生剤を溶液へと添加し、次いで、これを播種した(アンピシリンプレートには100μg/mlで播種し、カナマイシンプレートには50μg/mlで播種した)。
全てのPCRは、50μlの最終容量中に1μlのdNTP(各dNTPにつき10mM;Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)、2単位のPhusion(登録商標)DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy、Espoo、Finland)、25ナノモルのプライマーA(Mycrosynth、Balgach、Switzerland)、25ナノモルのプライマーB(Mycrosynth、Balgach、Switzerland)、10μlの5倍濃度のHF緩衝液(7.5mMのMgCl2;Finnzymes、Espoo、Finland)、1.5μlのジメチル
スルホキシド(DMSO、Finnzymes、Espoo、Finland)、および1~3μlの鋳型(1~2μg)を用いて実施した。用いられる全てのプライマーを、表1に列挙する。
全ての制限消化では、約1μgのプラスミドDNA(NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific、Wilmington、DE、USA)で定量化した)を、10~20単位の各酵素、4μlの対応する10倍濃度のNEBuffer(NEB、Ipswich、MA、USA)と混合し、無菌のH2Oで容量を40μlの満量とした。さらに表示しない限り、消化物は
、37℃で1時間にわたりインキュベートした。
Phosphatase(CIP;NEB、Ipswich、MA、USA)を添加し、混合物を37℃で30分間にわたりインキュベートした。NEBuffer3(NEB、Ipswich、MA、USA)中で消化を行った場合は、この酵素が、この緩衝液中で強力な活性を有し、また、ヌクレオチドの一部も末端で消化しうるために、CIPを添加する前に、緩衝液を、NEB緩衝液4へと交換した。
I.1.4.1.PCR産物の清浄化
消化を可能とするために、制限消化の前に、製造元のマニュアルに従い、40μlの溶出緩衝液を用いるMacherey Nagel Extract IIキット(Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて、全てのPCR断片を除去した。このプロトコールはまた、DNA試料の緩衝液を交換するのにも用いた。
ゲル電気泳動のために、UltraPure(商標)Agarose(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)および50倍濃度のTris Acetic
Acid EDTA緩衝液(TAE、pH8.3;Bio RAD、Munich、Germany)を用いて、1%のゲルを調製した。DNAを染色するために、1μlのGel Red Dye(Biotum、Hayward、CA、USA)を、100mlのアガロースゲルへと添加した。サイズマーカーとして、1kbのDNAラダー(NEB、Ipswich、MA、USA)2μgを用いた。電気泳動は、125ボルトで約1時間にわたり行った。対象のバンドをアガロースゲルから切り出し、製造元のマニュアルに従い、40μlの溶出緩衝液を用いるキットであるExtract II(Macherey-Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて精製した。
各ライゲーションのために、4μlの挿入配列を、10μlの容量中に1μlのベクター、400単位のリガーゼ(T4 DNAリガーゼ、NEB、Ipswich、MA、USA)、1μlの10倍濃度のリガーゼ緩衝液(T4 DNAリガーゼ緩衝液;NEB、Ipswich、MA、USA)へと混合した。混合物を、室温で1~2時間にわたりインキュベートした。
pGLEX41-[REP]をクローニングし、基準の複製起点を含有するpCR-Bluntベクターを伴う構築物を作製するために、TOP 10(One Shot(登録商標)TOP 10 Competent E.coli;Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を用いた。
I.1.7.1.ミニプレパレーション
ミニプレパレーションのために、形質転換された細菌のコロニーを、2.5mlのLBおよびアンピシリンまたはカナマイシン中、37℃、200rpmで6~16時間にわたり成長させた。DNAは、提供されるマニュアルに従い、E.coli用のプラスミド精製キット(QuickPure、Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)により抽出した。
ilmington、DE、USA)で、260nmにおける吸光度を測定し、1.8~2の間でなくてはならないOD260nm/OD280nmの比を評価することにより、1回定量化した。対照の消化は、配列を確認するために、試料をFasteris SA(Geneva、Switzerland)へと送付する前に実施した。
ミディプレパレーションのために、形質転換された細菌を、200~400mlのLBおよびアンピシリン(またはカナマイシン)中、37℃で一晩にわたり成長させた。次いで、培養物を、725gで20分間にわたり遠心分離し、製造元のマニュアルにおいて提示される低量プラスミドプロトコールに従い、市販のキット(NucleoBond Xtra Midi;Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて、プラスミドを精製した。
II.1.GAPDH発現カセットの上流および下流(GAPDHの5’側および3’側)におけるDNA領域のクローニング
BACクローンであるRPCIB753F11841Qを、Imagene(Berlin、Germany)で注文した。このクローンは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するpBACe3.6ベクター骨格内に、ヒトGAPDH配列を含有する。ミニプレパレーションによるDNAの抽出後、ベクター濃度を、Nanodropにより、27ng/μlと決定した。
Bluntクローニングキット、Invitrogen)内でクローニングした。ライゲーション産物は、TOP10コンピテント細菌へと形質転換し、カナマイシンLB寒天プレート上に播種した。コロニーを増幅し、プラスミドを、ミニプレップにより単離した。対照の消化を実施して、pCR-Blunt-5’GAPDH構築物およびpCR-Blunt-3’GAPDH構築物をもたらす陽性クローンを同定した。
本研究において用いられるレポーター構築物(REP):IgG1モノクローナル抗体の軽鎖(LC)-IRES-IgG1モノクローナル抗体の重鎖(HC)-IRES-緑色蛍光タンパク質(GFP)は、ポリシストロニック遺伝子内に存在させた。脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位(IRES)の存在(Gurtuら、Biochem Biophys Res Commun.、229(1):295~298、1996))は、3つのペプチドであるIgG1モノクローナル抗体の軽鎖(LC)、IgG1モノクローナル抗体の重鎖(HC)、およびGFPの翻訳を可能とする(図1)。したがって、トランスフェクトされた細胞は、IgG1モノクローナル抗体を分泌し、細胞内GFPを依存的な形で蓄積することになる。しかし、真核細胞では、ポリシストロニックのmRNAが一般的でなく、それらの翻訳は、それほど効率的でなく、比較的低力価のIgG1およびGFPの発現をもたらす。
pcDNA3.1(+)に由来する発現ベクターであるpGLEX41ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)を、安定的な細胞系を作製するために用いた。pGLEX41ベクターは、GAPDH配列を伴う第2世代のベクターAおよびGAPDH配列を伴わない第2世代のベクターBを創出するように改変された初期骨格として用いた。全てのベクターに、同じプロモーター-イントロンの組合せ(mCMVおよび1番目のイントロンをコードするドナー-アクセプター断片(IgDA))を用いた(Gormanら(1990)、Proc Natl Acad Sci USA、87:5459~5463)。
pGLEX41から、新たなベクター世代の開発を開始した。アンピシリン耐性カセットを放出するために、このベクターを、制限酵素であるNruIおよびBspHIを用いて切断した。骨格断片は、CIP処理して、ゲル電気泳動により精製した。アンピシリン耐性遺伝子(blaプロモーターを含めた)のコドン最適化(E.coliにおける発現について)形をコードするDNA断片は、GeneArtから注文した。制限酵素であるNruIおよびBspHI(骨格のために用いた酵素と同じ酵素)を用いて、挿入配列を、GeneArtクローニングベクターである#1013237から切り出し、精製し、骨格へとクローニングした。制限消化により、ミニプレップを解析した。クローンであるpGLEX41-HM-MCS-ampiA#2は、予測される制限プロファイルを有し、適正な断片の組込みは、配列決定により確認した。
ベクターであるpGLEX41-HM-MCS-ampiA#2の複製起点であるpUCを交換するために、ベクターを、PvuIおよびBspHIを用いて消化した。骨格断片は、CIP処理して、精製した。新たな挿入配列断片は、R6K複製起点と、発現カセットの部分としての、改変SV40 poly(A)配列とを含有する。SV40 poly(A)近傍の不要な細菌性骨格配列またはウイルス性骨格配列は取り除いた(下記の表2を参照されたい)。挿入配列断片は、GeneArtから注文し、酵素であるPvuIおよびBspHI(骨格のために用いた酵素と同じ酵素)を用いて、GeneArtクローニングベクターである#1013238から切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、配列解析により確認した。クローンであるpGLEX41-MCS-R6K-ampiA#1は、適正な配列を有した。
ベクターであるpGLEX41-MCS-R6K-ampiA#1を、制限酵素であるBspHIを用いて切断し、アンピシリン耐性カセットを放出するためにCIP処理した。新たな挿入配列断片は、E.coliにおける発現について最適化されたアンピシリン耐性コドンは含有するが、代替的なコドン使用により取り除くことのできた全てのCpG配列は置きかえられていた(上記の表2を参照されたい)。この断片は、GeneArtで注文した。挿入配列断片を放出するために、GeneArtクローニングベクターである#1016138を、BspHIを用いて消化した。挿入配列および骨格断片のいずれも、ゲル電気泳動により精製した後でライゲーションし、PIR1細菌へと形質転換した。ミニプレップは、配列決定のために直接送付した。pGLEX41-R6K-MCS-ampiB#1は、適正な配列を有し、さらなるクローニングステップのために用いられた。
レポーター構築物であるREPを、発現ベクターであるpGLEX41-MCS-R6K-ampiAおよびpGLEX41-MCS-R6K-ampiBにおいてクローニングするために、制限酵素であるNheIおよびClaIを用いて、ベクターを切断した。発現ベクターであるpGLEX41-HM-MCSを、制限酵素であるNheIおよびB
stBIを用いて切断した(65℃で)。消化後、全てのベクター骨格を、CIPで処理し、骨格を、ゲル電気泳動により精製した。骨格を、レポーター構築物であるREPをコードするNheI/BstBI(BstBIは、ClaIと適合性である)断片とライゲーションした。ライゲーション産物は、PIR1コンピテント細菌またはTOP 10コンピテント細菌へと形質転換し、アンピシリンLB寒天プレート上に播種した。コロニーを増幅し、プラスミドを、ミニプレップにより単離した。陽性クローンは、ミニプレップの制限消化およびFasteris SAによるその後の配列確認を介して同定することができた。
本段落の全ての制限消化は、80μlの最終容量中で実施し、37℃で一晩にわたりインキュベートした。
耐性ベクターをクローニングするための出発点は、ベクターpGLEX-MCS-R6K-ampiA#1であった。耐性遺伝子の発現については、弱いプロモーターで十分であり、mCMVプロモーターを、SV40プロモーターで置きかえた。耐性遺伝子をコードする遺伝子は、GeneArt SA(Regensburg、Germany)から注文し、チャイニーズハムスターにおける発現について最適化(ピューロマイシン:puroAおよびネオマイシン:neoA)するか、または選択的コドン使用によりCpG含量を低減(ピューロマイシン:puroBおよびネオマイシン:neoB)した。
発現カセットにおいてピューロマイシン耐性をクローニングするために、制限酵素であるNruIおよびXbaIを用いて、ベクターであるpGLEX41-MCS-R6K-ampiA#1を切断した後、CIPで処理した。挿入配列断片をGeneArtから注文し、GeneArtクローニングベクターである#1013239における挿入配列として用意した。挿入配列は、ピューロマイシン耐性のためのSV40プロモーターおよびコドン最適化遺伝子(CHO細胞によるコドン使用について)を含有する。挿入配列を、酵素であるNruIおよびXbaI(骨格のために用いた酵素と同じ酵素)を用いて、G
eneArtクローニングベクターから切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、制限消化により解析した。クローンであるpGLEX-MCS-R6K-ampiA-puroA#1は、適正なプロファイルを示し、これは、配列決定により確認することができた。
ネオマイシン耐性を、発現カセットにおいてクローニングするために、制限酵素であるXbaIおよびNotIを用いて、ベクターであるpGLEX-R6K-puroA#1を切断した後、CIPで処理した。挿入配列断片は、GeneArtから注文し、GeneArtクローニングベクターである#1013242(neoA)および#1026894(neoB)における挿入配列として用意した。挿入配列断片はそれぞれ、ネオマイシン耐性のための、CHO細胞によるコドン使用についてのコドン最適化遺伝子およびネオマイシン耐性のCpG低減形を含有する。挿入配列を、酵素であるXbaIおよびNotI(骨格のために用いた酵素と同じ酵素)を用いて、GeneArtクローニングベクターから切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、クローンを配列決定により確認した。
ベクターであるpGLEX41-R6K-puroB#1を、制限酵素であるBspHIを用いて切断し、その後、CIP処理した。挿入配列断片は、E.coliにおける発現についてコドン最適化されたアンピシリン耐性遺伝子を含有する一方で、代替的なコドン使用のために取り除くことのできた全てのCpG配列が置きかえられていた。この断片は、GeneArtに注文され、クローニングベクターである#1016138により着荷した。挿入配列断片を放出するために、GeneArtクローニングベクターを、BspHIを用いて消化した。挿入配列および骨格断片のいずれも、ゲル電気泳動により精製した後でライゲーションし、PIR1細菌へと形質転換した。ミニプレップは、配列決定のために直接送付し、確認することができた(pGLEX41-ampiB-R6K-puroB#1)。
5’側GAPDH挿入配列(3164bp)を得るために、ベクターであるpCR-blunt-5’GAPDHを、NruIで消化した。耐性遺伝子をコードするベクターをNruIで消化し、その後、骨格断片を調製するために、CIP(Calf Intestinal Phosphatase;NEB、Ipswich、MA)で処理した。4つの異なる骨格断片(pGLEX-R6K-neoA-ampiA、pGLEX-R6K-neoB-ampiB、pGLEX-R6K-puroA-ampiA、およびpGLEX-puroB-ampiB)を、3164bpの5’側GAPDH挿入配列とライゲーションし、PIR1コンピテント細菌へと形質転換した。ApalIを用いるミニプレップの制限消化は、クローンであるpGLEX-R6K-neoB-ampiB-5’GAPDH#5、pGLEX-R6K-neoA-ampiA-5’GAPDH#6、pGLEX-R6K-puroA-ampiA-5’GAPDH#16、およびpGLEX-puroB-ampiB-5’GAPDH#5の同定を可能とした。
十分量のプラスミドをもたらすために、Macherey Nagelキット(NucleoBond Xtra Midi;Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて、ミディプレップを調製した。制限消化および配列決定による確認後、プラスミドを直鎖化し、CHO-S細胞におけるトランスフェクションのために用いた。表3は、ミディプレパレーションにおいて得られるプラスミドDNAバッチの濃度、トランスフェクション用に調製された直鎖化DNAプレップ、直鎖化のために用いた酵素、およびFasteris SAによる、それぞれのプラスミドの同一性および配列情報を確認する配列ファイルについてまとめる。全てのミディプレップは、配列決定により確認してから、トランスフェクション用に用いた。
1.材料および方法
CHO-S細胞およびHEK293細胞
哺乳動物細胞は、組換えタンパク質の適正なフォールディング、アセンブリー、および
転写後修飾が可能であるために、タンパク質を発現させるのに好ましい宿主である。十分に特徴付けられており、大半のヒト病原性ウイルスの宿主として用いられないことから、安定的な治療用タンパク質の産生のための比較的安全な宿主となっているために、CHO細胞系を用いた。チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-S、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)は、4mMのL-グルタミン(Applichem、Germany)を補充したPowerCHO-2 CD培地(Lonza、Verviers、Belgium)中に懸濁させて培養し、37℃、5%のCO2、および湿度
80%の振とう(2.5cmの環状ストロークを伴う200rpm)インキュベーター内でインキュベートした。HEK293細胞は、トランスフェクトするのが容易であり、組換えタンパク質の低グラム量までの迅速な産生を可能とするために用いる。用いられる細胞は、HEK293-EBNA細胞(ATCC、Manassas、VA)であり、Ex-cell 293培地(Sigma-Aldrich、St.Louis、MI)中に懸濁させて日常的に培養される。
した。細胞は、ガス交換を可能とする透過性フィルターを含有する50mlのバイオリアクターチューブ(TubeSpin Bioreactor 50;TPP、Trasadingen、Switzerland)内で10mlの培地を用いて培養した。細胞の生存可能性および細胞濃度は、トリパンブルー細胞除外法を用いて、Countess自動式細胞カウンター(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)により決定した。細胞濃度は、CHO-S細胞用のPCVチューブ(TPP、Trasadingen、Switzerland)を用いて、ヘマトクリット値(PCV)を決定することにより確認した。
PCV法は、ミニPCVチューブ(PCV Packed Cell Volume Tube;TPP、Trasadingen、Switzerland)内で、5000rpmで1分間にわたる、特定容量の培養液の遠心分離に基づく。遠心分離時において、細胞は、チューブ底部の目盛り付き毛細管内でペレット化する。次いで、ペレットの容量を、遠心分離された細胞培養物流体の量との関係で評価することにより、ヘマトクリット値の百分率を決定する。例えば、1%のPCVは、10μlの細胞ペレットが1mlの培養物流体中に存在することを示した。
試料を同じ量のトリパンブルーと混合して、細胞濃度および細胞の生存可能性を、Countess(登録商標)自動式細胞カウンター(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)により決定した。次いで、溶液を、Countess(登録商標)のチャンバースライドへとピペティングしてから、測定器に読み取らせた。この測定器は、較正後に細胞の生存可能性ならびに死細胞および生細胞の濃度を決定するNeubauerチャンバーの自動式読取りを可能とする。
フローサイトメトリーとは、個別の細胞の複数のパラメータを解析するための技法である。この技法は、互いと表現型的に異なる細胞、例えば、生細胞と異なる死細胞(細胞のサイズおよび粒度に従う)の定量的解析および定性的解析を可能とする。フローサイトメトリーはまた、GFPなど、対象のタンパク質を発現させる細胞の定量化も可能とする。細胞は、300μlの試料の無菌のピペティングにより培養物から回収し、488nmで発光する空冷式アルゴンレーザーを装備した蛍光活性化細胞分取(FACS)Caliburフローサイトメーター(Becton、Dickinson and Company、Franklin Lakes、NJ、USA)により解析した。解析は、CellQuestソフトウェアにより行った。GFPによる発光は、530/30nmのバンドパスフィルターを用いるFL-1により検出した。
Octet QKシステム(ForteBio、Menlo Park、CA、USA)は、抗体、タンパク質、ペプチド、DNA、および他の生体分子に対する無標識の定量化を実行し、生体分子の結合相互作用についての速度論的特徴付けをもたらす。試料の結合率(nm)と蓄積されたIgG1濃度(μg/ml)との間の相関は、検量線によるIgG力価の定量化を可能とする。
ポリエチレンイミン(PEI;JetPEI、Polyplus-transfection、Illkirch、France)を用いて、CHO-S細胞およびHEK293 EBNA細胞の一過性トランスフェクションおよび安定的トランスフェクションを実施した。PEIとは、DNAなど、負に帯電した分子と複合体化しうるカチオン性ポリマーである。正に帯電したDNA-PEI複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスにより内部化される。DNA-PEI複合体は、リソソームコンパートメントに到達し、そこから溶解により核へと放出される。DNA-PEI複合体による高いトランスフェクション効率は、DNAをリソソーム分解から保護するPEIの能力に起因する。細胞は、製造元により提供されるマニュアルに従ってトランスフェクトした。
フローサイトメトリー(BD FACS Caliburサイトメーター、#1293)を介して細胞内GFPの発現を解析することにより、トランスフェクションの24時間後におけるトランスフェクション効率を決定した。GPF陽性細胞の百分率が、20%より高い場合は、トランスフェクトされた細胞を、選択培地で希釈し、96ウェルプレート(単離安定ミニプールを創出する限界希釈のために)、またはT型フラスコ(安定プールを創出するために)へと分配した。用いられた選択培地は、異なる濃度のジェネティシンおよびピューロマイシンを補充した、PowerCHO-2、4mMのグルタミンであった。
ー(200rpm)内でインキュベートする)の10mlの培地中に、1ml当たりの細胞0.5×106個の密度で細胞を播種することにより、全てのプールについてシードト
レインを開始した。各シードトレインは、成長培地中に1ml当たりの細胞0.5×106個(PCV解析により細胞濃度を決定した)で細胞を播種することにより、毎週2回継
代培養した。シードトレインは、全ての生産実施(バッチ)の接種のために用いた。
バッチ実施の細胞プールを、接種のために、シードトレインを用いて、1ml当たりの細胞0.5×106個の濃度で播種し、次いで、Feed培地中で7日間にわたり細胞を
培養した。4および8日目において、200μlの細胞を、300gで5分間にわたり遠心分離し、Octetを用いて、上清を、蓄積されたIgGについて解析した。加えて、各バッチのGFP発現を、FACSにより解析した。
2.1 CHO細胞における一過性発現:
本研究で比較されるベクターは、主にそれらの骨格において異なる。発現カセットの全体(プロモーター、1番目のイントロン、発現構築物、poly(A))は、全てのベクターについて全く同じである。ベクターは、実施例1で記載される通り、ベクターであるpGLEX41から導出する。1つのベクターでは、アンピシリン耐性遺伝子を、E.coliにおける発現についてコドン最適化し、細菌骨格を最小限まで低減した:pGLEX41-R6K-AmpiA-[REP](Aと略称する)。第2のベクターでは、アンピシリン耐性遺伝子を、E.coliにおける発現についてコドン最適化したが、代替的コドンを用いる(可能な場合)ことにより、全てのCpG配列を回避した:このベクターを、pGLEX41-R6K-AmpiB-[REP]と呼ぶ(Bと略称する)。第3の改変には、ベクターであるpGLEX41-R6K-AmpiA-[REP]-GAPDH(GAPDH_Aと略称する)、およびpGLEX41-R6K-AmpiB-[REP]-GAPDH(GAPDH_Bと略称する)をもたらすベクターAおよびBの発現カセットの上流および下流においてクローニングされた、GAPDHフランキング配列の使
用を組み入れた。
発現したレポータータンパク質の発現レベルを、異なるプラスミド骨格の文脈で比較するために、HEK293 EBNA細胞の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクション(2連の)は、50mlのバイオリアクターチューブ(TPP、Trasadingen、Switzerland)内で、10mlの最終培地容量を用いて実施し、トランスフェクションの10日後に、Octetにより解析した(図3)。
安定的にトランスフェクトされた細胞の確立
安定集団は、発現ベクターと耐性遺伝子をコードするベクターとを共トランスフェクトした後で、抗生剤により媒介される選択圧にかけることにより創出した。選択圧は、トランスフェクションの14日後に除去した。これらのステップにより、異なる構築物のレポータータンパク質(IgG1抗体、およびGFP)の発現レベルおよび発現の安定性を比較するための、生産実施において定期的な間隔で培養される安定ミニプールおよび安定プールの作製が可能となった。
安定的トランスフェクションによりプールを創出した。選択手順時(トランスフェクション後の最初の14日間)に、FACSによりプールを解析した。GFP陽性細胞画分の増大を、培養物の生存可能性と併せて、時間経過にわたり観察することができた。抗生剤
により媒介される選択圧は、14日後にプールから除去した。この手法を用いても、「B」プラスミドをトランスフェクトされた細胞プールを得ることはできなかった。創出したプールの発現レベルは、50mlのバイオリアクターチューブ内で細胞を培養できたらすぐにアッセイした。バッチは、2連で行った。FACSにより、GFPの発現について細胞を解析し、発現の8日後に、Octetにより、上清中のIgGの蓄積についてアッセイした。
クローン集団またはオリゴクローン集団を得るために、細胞にトランスフェクトし、96ウェルプレート内の選択培地中に分配した。7日後に、選択培地を細胞へと添加することにより、選択圧を更新した。GFPの発現は、トランスフェクションの14日後に、ELISA-プレートリーダーを用いることにより、評価した。結果を図5に示す。
文献では、GAPDHプロモーターの5’側領域が、潜在的なインスリン応答エレメントのほか、フォルボールエステル応答エレメントを保有することが記載されている(Alexander-Bridgesら(1992)、Advan Enzyme Regul、32:149~159)。フォルボールエステル応答エレメント(-1040~-1
010bp)は、通例GAPDHプロモーター(-488~+20)と称する配列の上流に位置する。安定H35肝がん細胞系において実施された欠失研究において、著者らは、塩基対-1200~-488(転写開始点に照らした)の欠失の有意な効果を実証することができなかった。したがって、フォルボールエステル応答エレメントは、GAPDHプロモーターにより駆動される発現へと機能的に連結されていない可能性があろう。にもかかわらず、GAPDHフランキングエレメントを含有するプラスミドを用いて観察された一過性発現および安定的発現の増大における、インスリンおよびPMA(最も一般的なフォルボールエステルである、フォルボール-12-ミリステート-13-アセテート)の寄与を評価するために、一過性トランスフェクション実験を実施した。
ヒトGAPDH遺伝子座は、ヒトゲノムの第12染色体上に位置する。GAPDHは、グルコースの代謝において鍵となる役割を果たすので、哺乳動物に由来する全ての細胞において構成的に活性であることが記載されている。プロモーターの上流において、GAPDH遺伝子は、30000bp超にわたり及ぶ遺伝子であるNCAPD2と隣接する。ポリアデニル化部位の下流において、GAPDH遺伝子は、IFFO1と隣接する(詳細については、図7を参照されたい)。
2×3(合計で6)のヌクレオチドであって、そのうちの3つが、その5’端において、ゲノムDNAへと連結され、3つが、その3’端において、ゲノムDNAへと連結されるヌクレオチドを含有する。用いられる下流のGAPDHフランキング領域(配列番号8)は、ScaI制限部位の2×3(合計で6)のヌクレオチドであって、そのうちの3つが、その5’端において、ゲノムDNAへと連結され、3つが、その3’端において、ゲノムDNAへと連結されるヌクレオチドを含有する。それぞれの制限部位のヌクレオチドを伴わない、上流のGAPDHフランキング領域および下流のGAPDHフランキング領域を、配列番号20(制限部位を伴わない上流のGAPDHフランキング領域)、および配列番号21(制限部位を伴わない下流のGAPDHフランキング領域)に示す。用いられる上流のGAPDHフランキング領域の断片の各々は、その5’端および/またはその3’端において、ゲノムDNAへと連結された、それぞれの制限部位の3つずつのヌクレオチドを含有する(断片1は、その5’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片2は、その3’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片3は、その5’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片4は、その3’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片8は、その3’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片9は、その5’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し、その3’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有し;断片11は、その3’端において、NruI制限部位の3つのヌクレオチドを含有する)。断片17は、制限部位のヌクレオチドを含有しない。それぞれの制限部位のヌクレオチドを伴わない、上流のGAPDHフランキング領域の断片を、配列番号22(制限部位を伴わない断片1)、配列番号23(制限部位を伴わない断片2)、配列番号24(制限部位を伴わない断片3)、配列番号25(制限部位を伴わない断片4)、配列番号26(制限部位を伴わない断片8)、配列番号27(制限部位を伴わない断片9)、配列番号28(制限部位を伴わない断片11)に示す。
断片9およびプロモーター近位の断片8は、pGLEX41-ampiAと比較した発現の差違を示さない。断片1、11、および17は、発現の増大を示す。最高の増大は、断片4について観察された。プロモーター近位の断片8が、効果を示していないことを強調すべきである。したがって、発現の増大を、既に公表されている(Alexander-Bridgesら(1992)、Advan Enzyme Regul、32:149~159);Gravenら(1999)、Biochimica et Biophysics Acta、147:203~218)配列によって説明することはできない。
1.1 チャイニーズハムスターGAPDH遺伝子の上流の非翻訳ゲノムDNA配列の、発現ベクターへのクローニング
チャイニーズハムスターGAPDH遺伝子の上流の非翻訳ゲノムDNA配列を、CHO-S細胞(Life Technologies)のゲノムDNAから、PCRにより増幅した。ゲノムDNAは、実施例1で記載した通りに抽出した。構築物は、実施例1において記載したレポーター遺伝子構築物[REP]を発現させるための、マウスCMVプロモーターまたはチャイニーズハムスターGAPDHプロモーターを用いて調製した。
Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて精製した。精製された断片は、Zero Blunt PCRクローニングキット(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を用いて、プラスミドであるpCR_Bluntへとクローニングした。ライゲーション産物は、コンピテントE.coli TOP10(One Shot(登録商標)TOP 10 Competent E.coli;Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)へと形質転換し、ミニプレップを制限解析することにより解析した。これにより、チャイニーズハムスターGAPDH遺伝子の上流のゲノムDNA配列を含有するプラスミドであるpCR_blunt[CHO
-upstreamGAPDH]、チャイニーズハムスターGAPDH遺伝子の上流のゲノムDNA配列と、GAPDHプロモーターと、ベクター「A」に由来するイントロンとを含有するpCR_Blunt[CHO-upstreamGAPDH_GAPDHプロモーター]、ならびにGAPDHプロモーター、およびベクター「A」に由来するイントロンを含有するpCR_Blunt[CHO-GAPDHプロモーター]がもたらされた。
CHO-S細胞を、TubeSpinバイオリアクター内で、10mlの培地容量を用いてトランスフェクトした(実施例2で記載される通り)。トランスフェクトされた細胞は、37℃で、5%のCO2、および湿度80%の、200rpmの撹拌を伴う振とうインキュベーター内でインキュベートした。プロテインAバイオセンサー(Fortebio、Menlo Park、CA、USA)を伴うOctet QKシステムを用いて、細胞の上清を、IgG1の発現について解析した。結果を図10に示す。
Claims (3)
- プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および発現増強エレメントを含む発現カセットであって、発現増強エレメントが、哺乳動物グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1のヌクレオチド位置~+7000のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが200~2800ヌクレオチドであり、
哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列をさらに含み、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの5’端~-3500のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが200~2800ヌクレオチドである、発現カセット。 - 哺乳動物GAPDHプロモーターまたはその断片を含まないという条件で、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の非翻訳ゲノムDNA配列を含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの5’端~-3500のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが200~2800ヌクレオチドであり、
哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の非翻訳ゲノムDNA配列をさらに含み、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1のヌクレオチド位置~+7000のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが200~2800ヌクレオチドである、発現カセット。 - a)哺乳動物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)プロモーター
c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
d)ポリアデニル化部位
e)エンハンサー
f)哺乳動物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)哺乳動物GAPDHプロモーターの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
b)エンハンサー
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)哺乳動物GAPDHプロモーターの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列、または
a)エンハンサー
b)哺乳動物GAPDHの上流および/もしくは下流の非翻訳ゲノムDNA配列
c)プロモーター
d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
e)ポリアデニル化部位
f)哺乳動物GAPDHの下流および/もしくは上流の非翻訳ゲノムDNA配列
を、
a)またはb)が、哺乳動物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列である場合は、f)が、哺乳動物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列であり、a)またはb)が、哺乳動物GAPDHの下流の非翻訳ゲノムDNA配列である場合は、f)が、哺乳動物GAPDHの上流の非翻訳ゲノムDNA配列であるという条件で、順に含む発現ベクターであって、
前記エンハンサーの組入れが任意選択であり、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがGAPDHではなく、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、+1のヌクレオチド位置~+7000のヌクレオチド位置にわたる領域内の配列であり、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが、200~2800ヌクレオチドであり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列が、哺乳動物GAPDHプロモーターの5’端~-3500のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、GAPDH mRNAの転写開始点に照らした位置であり、前記哺乳動物GAPDHプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムDNA配列の長さが200~2800ヌクレオチドである、発現ベクター。
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