KR20000006334A

KR20000006334A - 바이러스코딩염기서열이전혀없는고효율레트로바이러스벡터

Info

Publication number: KR20000006334A
Application number: KR1019990023398A
Authority: KR
Inventors: 김선영; 유승신; 김종묵
Original assignee: 이선경; 주식회사 바이로메드
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2000-01-25
Also published as: JP3864049B2; DE69931023T2; EP1032697B1; CN1277636A; ID24192A; PT1032697E; JP2002519037A; DK1032697T3; WO2000000629A1; AU4655499A; EP1032697A1; US6451595B1; DE69931023D1; CN1154744C; RU2203321C2; ES2260918T3; ATE324460T1

Abstract

본 발명은 유전자치료를 위해 개선된 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서는 MLV (murine leukemia virus)에서 유래하는 레트로바이러스 벡터인 MON 및 MIN을 시발 벡터로 하여 보다 안전하고 우수한 레트로바이러스 벡터를 제조한다. 상기 개선된 레트로바이러스 벡터의 특징은, 스플라이싱 수용체 (splicing acceptor)를 포함하는 MLV의 pol 유전자가 완전히 제거되어 바이러스 코딩 염기서열이 전혀 없고, 종래 레트로바이러스 벡터의 문제점이었던 동종재조합의 위험성이 배제되고; 외래유전자 삽입위치 상류에 이종 (heterologous) 인트론, 스플라이싱 수용체 및/또는 이종 유전자 유래의 비코딩 서열 (non-coding sequence)이 삽입되어, 외래유전자가 스플라이싱된 RNA에서 발현되어 유전자 발현 효율을 극대화하고; 5' LTR (long terminal repeat)의 U3 전장 (full length) 또는 이를 대체하는 강력한 이종 프로모터를 포함하여, 상기 벡터로부터 전체적으로 많은 양의 RNA가 생산될 수 있도록 하며; 외래유전자 삽입 위치의 하류에 IRES (internal ribosomal entry site) 또는 내부 SV40 최소 프로모터가 삽입되어, 두 가지 이상의 외래유전자를 효율적으로 발현할 수 있도록 한다. 본 발명의 개선된 레트로바이러스 벡터는 상기와 같은 특징을 가지고 있어서 안전할 뿐 아니라 유전자 발현 효율도 우수하므로, 유전자치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바이러스 코딩 염기서열이 전혀 없는 고효율 레트로바이러스 벡터{High efficiency retroviral vectors that contain none of viral coding sequences}

본 발명은 유전자치료를 위한 개선된 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 레트로바이러스의 구조유전자인 gag, env 및 pol 코딩 서열이 완전히 제거되고; 외래유전자 삽입위치 상류에 이종 인트론, 스플라이싱 수용체 (heterologous splicing acceptor) 및/또는 이종 유전자 유래의 비코딩 서열 (heterologous non-coding sequences)을 포함하고; 외래유전자 삽입 위치 하류에 이종 내부 프로모터 또는 내부 리보솜 출입 자리 (Internal Ribosomal Entry Site; 이하, "IRES"로 약칭함)를 포함하고; 5' LTR (long terminal repeat)의 U3 전장 또는 이를 대체하는 강력한 이종 프로모터가 외래유전자의 발현을 조절하는; 안전하고 유전자 발현효율이 우수한 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

현재 유전자치료에 사용되는 유전자전달체 중 가장 빈번하게 사용되는 것은 레트로바이러스 벡터로서, 전세계적으로 허가를 받은 유전자 요법의 임상 시험의 50% 이상에서 레트로바이러스 벡터가 사용되고 있다 (Wiley - The Journal of Gene Medicine Website; http://www.wiley.co.uk/genetherapy). 유전자치료에 사용되는 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린류케미아바이러스 (Murine Leukemia Virus; 이하 "MLV"라고 약칭함) 게놈을 기본 게놈으로 사용하고 있는데, 이러한 레트로바이러스 벡터는 현재 높은 빈도로 사용되고 있지만, 아직도 많은 개선의 여지가 있으며, 그 중 가장 중요한 문제는 안전성 문제이다. 즉, 레트로바이러스 벡터는 바이러스성 벡터이므로, 세포에서 복제가능 레트로바이러스 (replication-competent retrovirus; 이하 "RCR"이라 약칭함)로 변할 수 있는 가능성이 항상 제기되어 왔다. 그중에서도 특히 같은 염기서열끼리 유전정보를 교환하는 동종재조합 (homologous recombination)에 의한 RCR의 생산이 가장 우려되어 왔다.

이와 관련하여, 현재 사용되고 있는 모든 레트로바이러스 벡터들은 상당한 길이의 바이러스 코딩 염기서열을 가지고 있는데, 이러한 코딩 염기서열은 벡터가 바이러스로 포장되어 나올 수 있는 패키징 (packaging) 세포의 게놈 상에도 존재하기 때문에, 바이러스 코딩 염기서열과 패키징 세포 게놈 간의 동종재조합 가능성이 높고, 실제로 RCR의 생산이 보고된 바 있다 (Miller et al., Human Gene Ther., 1:5, 1990).

유전자치료에 주로 사용되는 MLV-유래 (based) 레트로바이러스 벡터로는 LN 계열 벡터와 MFG 벡터 (Miller and Roseman, Biotechniques 7:980-990, 1989;Dranoff et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:3539-3543, 1993)를 들 수 있는데, LN 계열 벡터는 외부 유전자가 내부 이종 프로모터나 LTR에 의해서 발현되고, MFG 벡터는 외부 유전자가 LTR에서 전사되어 게노믹(genomic) RNA 또는 스플라이싱된 서브게노믹(subgenomic) RNA로부터 발현된다. 그 중, 레트로바이러스 벡터의 원형이라 볼 수 있는 LN 계열 벡터들은 모두 420 bp의 gag 염기서열을 갖고 있다. gag 염기서열은 바이러스 패키징에 중요한 역할을 하리라 생각되어 왔으나, 최근에 특정 조건 하에서는 gag 부위가 바이러스 패키징과 생산에 크게 영향을 주지 않고도 제거될 수 있음이 보고된 바 있다 (Kim et al., J. Virol., 71: 994-1004, 1998).

한편, MFG 벡터는 대다수 인간과 쥐의 세포주에서 LN 계열 벡터보다 유전자 발현율도 높고, 게노믹 RNA를 대량 생산하기 때문에 더 많은 바이러스를 생산하는 것으로 알려져 있다 (Byun et al., Gene Ther., 3: 780-788, 1996). 그러나, MFG 벡터는 LN 계열 벡터에 비하여 훨씬 더 긴 바이러스 코딩 염기서열을 포함하고 있다는 단점이 있다. 즉, MFG 벡터는 420bp gag, 377bp pol 및 99bp env 유전자를 포함하기 때문에, LN 계열 벡터에 비하여 훨씬 더 높은 확률로 RCR을 생산할 가능성이 있으며, 이는 MFG 벡터의 안전성을 감소시키는 중요 요인으로 작용한다.

종래의 레트로바이러스 벡터들의 이러한 단점을 개선하기 위하여, 본 발명자들은 다음과 같은 특징을 가지는 레트로바이러스 벡터를 이미 제조한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 97-48095호): 상기 벡터는 클로닝된 유전자의 mRNA가 스플라이싱되어 높은 효율로 발현되고, 바이러스 생산량을 저하시키지 않으면서 gag 및 env 유전자가 완전히 제거되었으며, IRES를 이용하여 두 가지 이상의 유전자를 발현할수 있도록 조작되었고, 다클로닝 부위 (multicloning site)가 삽입되어 외부 유전자의 클로닝이 용이하다. 이렇게 제조된 벡터는 gag와 env 유전자가 완전히 제거되었기 때문에, 다른 레트로바이러스 벡터들보다 안전성이 향상되었다. 그러나, MLV에서는 스플라이싱 수용체가 pol 코딩 영역의 3' 부위와 겹쳐 있기 때문에, 스플라이싱 수용체를 유지하기 위해서는 pol 유전자가 포함될 수밖에 없었다. 상기 377bp pol 유전자는 패키징 세포의 게놈에도 존재하기 때문에 레트로바이러스 벡터의 pol 유전자와 동종재조합이 일어날 가능성이 있었다.

이에, 본 발명자들은 안전성이 개선될 뿐 아니라, 유전자 발현효율이 더욱 향상된 신규한 유전자치료용 레트로바이러스 벡터를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, MLV 유래 pol 유전자를 완전히 제거하여 패키징 세포주에서 동종재조합에 의해 RCR이 생산될 가능성을 완전히 배제하고; 외래유전자 삽입 위치의 상류에 이종 인트론, 스플라이싱 수용체 및/또는 이종 유전자 유래의 비코딩 서열을 삽입하여 유전자 발현효율을 극대화하고; 5' LTR 또는 이를 대체하는 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시초기 1 프로모터 (human cytomegalovirus immediately early 1 promoter; 이하 "HCMV IE1 프로모터"로 약칭함)를 외래유전자의 발현 조절요소로 사용하고; 외래유전자 삽입 위치의 하류에 이종 내부 프로모터 또는 IRES를 삽입하여 최소한 2개의 유전자가 효과적으로 발현될 수 있도록 조작된 레트로바이러스 벡터를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 안전할 뿐 아니라 높은 효율로 유전자발현을 유도하여 유전자치료 등에 효과적으로 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

도 1은 MON 벡터로부터 스플라이싱 수용체 (Splicing Acceptor; SA)를 포함하는 pol 코딩 부위를 제거하여 ΔSA 벡터를 제조한 다음, CAT 유전자를 삽입하여 ΔSA-CAT 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 2는 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 즉시초기 1 유전자의 인트론 및/또는 엑손이 삽입된 레트로바이러스 벡터들의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이고,

도 3a는 MON 벡터의 IRES-네오 카셋트를 SV40 최소프로모터-네오 카셋트로 대체하여 MSN 벡터를 제조한 다음, 상기 MSN 벡터로부터 SV40 최소프로모터-네오 카셋트 및 MLV의 3' LTR을 포함하는 유전자 절편을 제조하고, 이를 pUC18에 삽입하여 SN-3LTR 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 3b는 상기 SN-3LTR 벡터에 HCMV 즉시초기 1 프로모터를 포함하는 키메릭 LTR을 삽입하여 pCM을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 4a는 상기 pCM에 HCMV 즉시초기 1 유전자의 엑손 1과 인트론 A 및 엑손 2의 일부를 삽입하여 DON1.2를 제조하고, 이에 CAT 유전자를 삽입하여 DON1.2-CAT를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 4b는 상기 pCM에 HCMV 즉시초기 1 유전자의 인트론 A 일부 및 엑손 2의 일부를 삽입하여 DON2를 제조하고, 이에 CAT 유전자를 삽입하여 DON2-CAT를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 4c는 상기 pCM에 쥐의 면역글로불린 유전자의 스플라이싱 수용체 및 HCMV 즉시초기 1 유전자의 엑손 1의 일부를 삽입하여 DONSA1을 제조하고, 이에 CAT 유전자를 삽입하여 DONSA1-CAT를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 5는 인간 유전자의 인트론 및 엑손이 삽입된 레트로바이러스 벡터들의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이고,

도 6은 MLV의 5' 및 3' LTR을 포함하는 유전자 절편을 제조하고 이들을 pUC18 벡터에 삽입하여 p53LTR 벡터를 제조한 후, pCBIN 벡터로부터 분리한 IRES-네오 카셋트를 이에 삽입하여 MIN 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 7a는 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 얻은 인간 베타-액틴 유전자 단편 중 첫 번째 인트론의 일부, 스플라이싱 수용체 및 두 번째 엑손의 일부를 상기 MIN 벡터에 삽입하여 MIN-AI 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 7b는 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 얻은 인간 신장인자1α (Elongation Factor 1α; EF1α) 유전자 단편 중 첫 번째 인트론의 일부, 스플라이싱 수용체 및 두 번째 엑손의 일부를 상기 MIN 벡터에 삽입하여 MIN-EI 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 7c는 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 얻은 인간 글리세르알데히드3-인산 탈수소효소 (GAPDH) 유전자 단편 중 첫 번째 인트론의 일부, 스플라이싱 수용체 및 두 번째 엑손의 일부를 상기 MIN 벡터에 삽입하여 MIN-GI 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이고,

도 7d는 상기 DON-2 벡터 중 HCMV 즉시초기 1 유전자 중 첫 번째 인트론의 일부, 스플라이싱 수용체 및 두 번째 엑손의 일부를 상기 MIN 벡터에 삽입하여 MIN-2 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

본 발명은 MLV-유래 레트로바이러스 벡터인 MON 및 MIN을 시발벡터로 하여 제조되는 보다 안전하고 우수한 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 상기 벡터에서는 레트로바이러스 구조유전자인 gag, env 및 pol 코딩서열이 완전히 제거되고, 외래유전자 삽입 위치 상류에 이종 인트론, 스플라이싱 수용체 및/또 이종 유전자 유래의 비코딩 서열을 포함하고, 5' LTR 부위에 강력한 이종 프로모터를 포함하며, 외래유전자 삽입위치 하류에 이종 내부 프로모터 또는 IRES를 포함한다.

보다 구체적으로, MON 벡터로부터 스플라이싱 수용체를 포함하는 pol 유전자를 완전히 제거하여 상기 벡터를 제조함으로써, 종래 레트로바이러스 벡터의 문제점으로 지적되었던 동종재조합의 위험성을 배제하였다.

상기와 같이 pol 유전자가 제거되면, 벡터에 삽입된 외래유전자의 발현 효율이 감소하게 된다. 따라서 pol 유전자 제거에 따라 감소된 발현 효율 및 바이러스 역가 (virus titer)를 증진시키기 위하여 다음과 같이 다양하게 개선된 레트로바이러스 벡터를 제조한다.

먼저, 본 발명은 외래유전자 삽입 위치의 상류에 이종 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 상기 이종 인트론및/또는 스플라이싱 수용체는, pol 유전자와 함께 제거된 스플라이싱 수용체를 보충하기 위해 사용되는 것으로, 공지된 바이러스성 또는 세포성 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체가 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는, 인간 사이토메갈로바이러스 즉시초기 1 유전자 (human cytomegalovirus immediately early 1 gene; 이하 "HCMV IE1 유전자"로 약칭함)의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 신장인자1α (EF1α) 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH) 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 베타-액틴 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 외래유전자 삽입 위치의 상류에 해독 효율 (translational efficiency)을 높여주는 이종 유전자 유래의 비코딩 서열 (non-coding sequence)을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 상기 비코딩 서열은 전사는 되지만 단백질로 번역되지 않는 유전자 부위로 정의되며, 인트론 및 단백질로 해독되지 않는 엑손 부위를 포함한다. 바람직하게는, 상기 이종 유전자 유래의 비코딩 서열은 HCMV IE1 유전자의 비코딩 서열, 신장인자1α (EF1α) 유전자의 비코딩 서열, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH) 유전자의 비코딩 서열, 베타-액틴 유전자의 비코딩 서열 등이 사용될 수 있다. 상기와 같이 이종 유전자 유래의 비코딩 서열이 삽입됨으로써 외래유전자가 스플라이싱된 RNA에서 발현될 수 있음과 동시에 서브게노믹 RNA의 해독 효율이 극대화된다.

또한, 본 발명은 외래유전자 삽입 위치 하류에 이종 내부 프로모터 또는 IRES를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 5' LTR (long terminal repeat)의 U3 전장 또는 이를 대체하는 강력한 이종 프로모터가 포함된 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. pol 코딩서열의 제거: ΔSA 벡터의 제조

보다 안전한 벡터, 즉 동종재조합 능력이 완전히 상실된 레트로바이러스 벡터를 개발하고자, MON 벡터로부터 스플라이싱 수용체를 포함하는 pol 코딩 부위를 제거하여 결실 돌연변이체 ΔSA 벡터를 제조한 다음, 리포터 유전자로서 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 유전자를 삽입하여 ΔSA-CAT 벡터를 제조하였다 (도 1 참조). 이어서, 상기 ΔSA-CAT 벡터로 트랜스펙션 (transfection)된 세포와 트랜스덕션 (transduction)된 세포 각각에서 CAT 활성을 측정한 결과, 모주인 MON-CAT에 비해 바이러스 역가는 유사하나 유전자 발현량이 감소하는 것이 확인되었으며 (표 1 참조), 이러한 결과는 스플라이싱 수용체를 포함하는 pol 유전자가 벡터에 삽입되는 외래유전자의 발현 조절에 관여함을 제시한다.

상기한 결과로부터 예상할 수 있는 사실은, 레트로바이러스 벡터에서 스플라이싱 수용체를 포함하는 pol 유전자를 제거하는 대신 이종 유전자로부터 유래된 스플라이싱 수용체 및/또는 인트론 서열을 외래 유전자 삽입 위치의 상류에 삽입하면, 유전자 발현 효율이 증가될 것이라는 사실이다. 그러나 만일 스플라이싱이 지나치게 많이 일어나는 경우 게노믹 RNA 보다 서브게노믹 RNA의 양이 상대적으로 높아져서 비록 유전자 발현 효율은 높더라도 바이러스 역가가 떨어질 수 있다.

따라서, 이상적인 레트로바이러스 벡터를 제작하기 위해서는, 세포내에서 벡터에 삽입된 외래유전자의 전사, 스플라이싱 및 해독 절차 간에 적절한 균형이 이루어지도록 벡터를 구성하는 것이 중요하다. 즉, 전체적으로 많은 양의 RNA를 생산할 수 있고 게노믹 RNA의 양과 서브게노믹 RNA 의 양이 적절한 균형을 이루어 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있는 RNA 양이 충분함과 동시에 유전자 발현 효율이 높아 외래유전자가 코딩하는 단백질 생산량이 높은 벡터가 바람직하다. 이러한 관점에서 본 발명에서는, 바이러스성 또는 세포성 유전자에서 유래한 다양한 비코딩 서열을 상기 pol 유전자가 결실된 벡터에 삽입하여 레트로바이러스 벡터의 성능에 미치는 영향을 바이러스 역가와 유전자 발현 효율의 관점에서 비교하였다.

2. 스플라이싱 및 해독 효율성을 높일 수 있는 이종 염기서열의 삽입: DON1.2, DON2 및 DONSA1 벡터의 제조

전체적인 바이러스 RNA의 생산량을 높이는 동시에, 스플라이싱 효율과 유전자 발현 효율 간의 적절한 균형을 이루고자, 인간세포에서 강력한 전사활성을 유도하는 것으로 알려진 HCMV IE1 프로모터로 MLV 5' LTR의 U3 부위를 대체하고, 이종 유전자로부터 유래된 비코딩 서열을 삽입한 레트로바이러스 벡터를 제조하였다.

본 발명의 실시예에서는, 상기 이종 유전자로부터 유래된 비코딩 서열로서, 해독효율을 높여주는 것으로 알려진 HCMV IE1 유전자 유래의 해독되지 않는 엑손 및/또는 인트론을 외래유전자 삽입 위치 상류에 삽입하였다 (도 2 참조). 구체적으로, 레트로바이러스의 모든 코딩 영역이 제거되었고, 3' LTR은 MLV LTR을 그대로 유지하면서 5' LTR의 U3 전장이 HCMV IE1 프로모터로 대체되었으며, 이종 내부 유전자로는 SV40 프로모터-네오 카셋트를 포함하는 pCM 벡터를 제조한 다음, 상기 pCM 벡터에 HCMV IE1 유전자의 엑손 1, 인트론 A 및/또는 엑손 2를 삽입하여 DON1.2, DON2 및 DONSA1 벡터를 제조하였다 (도 3a 내지 도 3b 및 도 4a 내지 도 4c 참조). 이어서, 상기 각 벡터에 리포터 유전자로서 CAT 유전자를 삽입하여 DON1.2-CAT, DON2-CAT 및 DONSA1-CAT 벡터를 제조하고, 상기 벡터들로 트랜스펙션된 세포와 트랜스덕션된 세포 각각에서 CAT 활성을 측정한 결과, 세가지 모든 경우에서 대조군인 L-CAT-SN 벡터에 비해 스플라이싱 및 유전자 발현 효율이 크게 증가함이 확인되었다 (표 2 참조).

3. 스플라이싱 및 해독 효율성을 높일 수 있는 세포성 염기서열의 삽입 : MIN-AI, MIN-EI 및 MIN-GI 벡터의 제조

스플라이싱 효율과 유전자 발현 효율 간의 적절한 균형을 이루어 바이러스의 역가를 높게 유지하면서도 동시에 높은 유전자 발현을 유도할 수 있는 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 다른 예로서, 인간 세포의 유전자로부터 유래된 엑손 및/또는 인트론 서열을 레트로바이러스 벡터의 외래유전자 삽입 위치 상류에 삽입하였다. (도 5 참조).

먼저 앞서 제조한 DON1.2 등의 벡터와 마찬가지로 레트로바이러스의 모든 코딩 영역을 제거하고, 5' LTR 및 3' LTR은 MLV의 것을 그대로 유지하면서 이종내부유전자로는 EMCV IRES-네오 카세트를 포함하는 MIN 벡터를 제조하였다. 구체적으로, MIN 벡터는 MLV의 5' LTR과 3' LTR 부위를 포함하는 DNA 절편을 제조하고 이를 pUC18 벡터에 삽입한 후, IRES-네오 카셋트를 이에 삽입하여 제조하였다. (도 6 참조). 그 다음, 인간 세포의 베타-액틴 (β-actin) 유전자, 신장인자1α (elongation factor 1α; 이하 "EF1α"라 약칭함) 유전자 또는 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; 이하 "GAPDH"라 약칭함) 유전자로부터 유래된 인트론 및 엑손 2의 일부를 각각 상기 MIN 벡터의 외래유전자 삽입 위치 상류에 삽입하여 MIN-AI, MIN-EI 또는 MIN-GI 벡터를 제조하였다. (도 7a 내지 도 7c 참조).

한편, 이종 스플라이싱 수용체로 MIN-AI 등의 벡터처럼 세포성 유전자를 사용한 벡터와, DON1.2 등의 벡터처럼 바이러스 유전자를 사용한 벡터를 비교하기 위해 MIN-2 벡터를 제조하였다. MIN-2 벡터 역시 MIN 벡터로부터 제조되었는데, 보다 상세하게는 DON2 벡터의 제조를 위해 사용된 HCMV IE1 유전자의 인트론 및 엑손 2 일부를 MIN 벡터에 삽입하여 제조하였다 (도 7d 참조).

이어서 상기와 같이 제조된 벡터 각각에 리포터 유전자로서 CAT 유전자를 삽입하여 MIN-CAT, MIN-AICAT, MIN-EICAT, MIN-GICAT 및 MIN-2CAT 벡터를 제조하였다. 상기 리포터 유전자를 포함한 벡터로 트랜스펙션된 세포와 트랜스덕션된 세포 각각에서 CAT 활성과 바이러스 역가를 측정하였다. 그 결과, 모든 경우에서 대조군인 LXSN 및 MFG 벡터와 비슷한 바이러스 역가를 유지한 반면, 유전자 발현 효율에 있어서는 MIN-2, MIN-EI의 경우 트랜스팩션과 트랜스덕션된 세포 모두에서 MFG및 LXSN 에 비해 유전자 발현 효율이 크게 증가함이 확인되었다 (표 3 참조).

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 하기 실시예가 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> MON 벡터로부터 pol 유전자의 제거

(1-1) ΔSA 벡터의 제조

pol 유전자 부분이 없는 5' LTR 하류 서열을 제조하기 위해 PCR을 수행하되, PCR의 주형으로는 MON 벡터 (대한민국 특허출원 제 97-48095)를 사용하고 프라이머로는 서열번호 1 (HHIR 프라이머)과 서열번호 2 (R523Bam 프라이머)로 기재되는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 이용하였다. PCR 결과 MLV의 5' LTR로부터 +523까지의 염기서열을 포함하는 유전자절편이 증폭되었다 (도 1 참조). 이때, 상기 MLV 염기서열의 번호는 RNA 전사 개시 부위를 +1로 정한 것이며, +212 부터 +523 까지의 염기서열은 5' 비코딩 영역으로 게노믹 RNA의 패키징에 요구된다.

상기 PCR로부터 수득한 유전자 절편을 pCRⅡ 벡터 (Invitrogen, CA US)에 클로닝한 다음 HindⅢ-BamHI 절편을 수득하고, MON 벡터가 원래 가지고 있던 HindⅢ-BamHI 절편의 일부만을 상기 절편으로 대체하여 레트로바이러스 벡터 ΔSA를 제조하였다. 상기 ΔSA는 레트로바이러스의 모든 코딩 영역이 제거된 가장 기본적인 레트로바이러스 벡터 원형으로서, MLV의 5' 및 3' LTR과 스플라이싱 수용체를 포함한 5' 비코딩 영역, IRES-neo 카셋트 및 폴리퓨린 트랙만을 포함한다 (도 1 참조).

(1-2) ΔSA-CAT 벡터의 제조

상기와 같은 유전자 조작이 외래유전자의 발현 및 레트로바이러스 게노믹 RNA의 패키징에 미치는 영향을 조사하기 위하여, CAT 유전자를 리포터 유전자로 선정하였다.

CAT 유전자는 PCR을 통해 수득하되, 상기 PCR의 주형으로는 pCAT3-basic 벡터 (Promega, WI, USA)를 사용하고 서열번호 3 (CATATGN 프라이머)과 서열번호 4 (CATSTOP 프라이머)로 기재되는 두 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 CAT 유전자를 포함한 절편을 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 pCRII (Invitrogen, CA, USA) 벡터에 삽입하여 pCRII-CAT 벡터를 제조하였다. pCRII-CAT 벡터로부터 CAT 유전자를 포함하는 BamHI 절편을 얻어 pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) 벡터의 BamHI 위치에 삽입하여 pC3.1-CAT 벡터를 제조하였다. 그 다음, pC3.1-CAT 벡터로부터 CAT 유전자를 포함하는 XbaI-HindⅢ 절편을 얻고 이를 클레노우 효소로 처리한 후, 상기 실시예 (1-1)로부터 수득한 ΔSA 벡터의 HpaI 위치에 삽입하여, ΔSA-CAT 벡터를 제조하였다 (도 1 참조).

(1-3) CAT 활성 측정

ΔSA-CAT 벡터와 대조군 MON-CAT 벡터를 각각 패키징 능력을 제공하는 Gag-Pol, Env 발현벡터와 함께 293T 세포 (DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7: 379-387, 1987)에 트랜스펙션시키고, 48시간 동안 배양한 다음, 세포질 단백질을 제조하여 CAT 활성을 측정함으로써 유전자 발현 효율을 조사하고, 세포 배양액은 0.45 ㎛ 필터에 여과시켜 무세포 바이러스를 제조하였다. 이어서, 상기 무세포 바이러스로 NIH3T3 세포 (ATCC CRL 1658)를 트랜스덕션시키고, 48시간 동안 배양한 다음, 세포질 단백질을 제조하여 CAT 활성을 측정함으로써 패키징 효율을 결정하였다.

CAT 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 우선 세포를 수확하여 1 ml의 PBS (; phosphate-buffered saline)로 한 번 씻어 준 뒤 적당한 부피의 0.25 M Tris 완충용액 (pH 7.5)으로 현탁한 후 드라이아이스에서 얼리고 37℃ 수조에서 녹이기를 6회 반복하여 세포를 용해시켰다. 이어서 세포 추출물을 60℃에서 7분간 열처리하여 탈아세틸효소 (deacetylase)를 불활성화시킨 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 취한다. 추출한 용액은 브래드포드의 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 이후 실험군별로 동일한 단백질양이 되도록 추출액을 취한 후 1 ㎕의¹⁴C로 표지된 클로람페니콜 (¹⁴C-chloramphenicol; 60 mCi/mmol, 0.1 mCi/ml), 2 ㎕의 아세틸코엔자임 A (acetyl-coenzyme A, 40 mM), 그리고 적당한 부피의 0.25 M Tris (pH7.5)와 섞어서 37℃에서 적당한 시간 반응시켰다. 반응 후 400 ㎕의 에틸아세테이트를 첨가하여 클로람페니콜을 추출한 후 농축기로 에틸아세테이트를 휘발시키고 클로람페니콜을 농축하였다. 여기에 15 ㎕의 에틸아세테이트를 첨가하여 현탁한 후 박막크로마토그래피 (TLC) 판에 점착시키고 TLC 전개용매 (95% 클로로포름, 5% 메탄올)로 전개시켰다. 전개 후 TLC 판을 말린뒤 X선 필름에 감광하거나 포스포이미지 분석기 (phosphoimage analyzer)로 아세틸화된 정도를 확인한 뒤, 아세틸화된 클로람페니콜의 방사 활성을 전체 클로람페니콜의 방사 활성으로 나눈 값으로 CAT 활성도를 측정하였다.

그 결과 하기 표 1에서 보듯이, pol 유전자가 제거된 ΔSA-CAT 벡터로 293T 세포를 트랜스펙션시킨 경우, CAT 활성이 낮아진 것이 확인되었다. 이는 스플라이싱 수용체를 포함한 pol 부위가 유전자 발현의 조절에 관여함을 시사한다. 또한, 트랜스덕션된 NIH3T3 세포에서의 CAT 활성도 트랜스펙션된 세포에서의 CAT 활성과 일치하는 양상을 보임으로써, 패키징 효율은 유전자 발현효율을 반영함을 알 수 있었다.

pol 유전자의 제거가 유전자 발현에 미치는 영향

벡터	세포주
벡터	293T	NIH3T3
MON-CAT	1.0	1.0
ΔSA-CAT	0.5±0.1	0.4±0.1

<실시예 2> HCMV IE1 프로모터 및 엑손 및/또는 인트론의 삽입

본 발명자들은 전체적인 바이러스 RNA 생산량을 높이는 동시에, 스플라이싱 효율과 해독효율 간의 균형을 이루기 위하여, 상기 MON 벡터를 시발 벡터로 하여 다음과 같은 세가지 변이체 레트로바이러스 벡터를 고안하였다 (도 2 참조).

첫째, MLV 5' LTR의 U3 전장이 HCMV의 IE1 프로모터로 대체되고, MLV의 스플라이싱 수용체 (splicing acceptor; SA)가 HCMV IE1 유전자의 엑손 1과 인트론 A와 엑손 2의 일부 (해독개시코돈 직전까지)를 포함하는 절편으로 대체된 DON1.2;

둘째, MLV 5' LTR의 U3 전장이 HCMV IE1 프로모터로 대체되고, MLV의 스플라이싱 수용체가 HCMV IE1 유전자의 인트론 A의 일부와 엑손 2의 일부 (해독개시코돈 직전까지)를 포함하는 절편으로 대체된 DON2; 및,

셋째, MLV 5' LTR의 U3 전장이 HCMV IE1 프로모터로 대체되고, MLV의 스플라이싱 수용체가 쥐의 면역글로불린 유전자의 스플라이싱 수용체 및 HCMV IE1 유전자의 엑손 1을 포함하는 절편으로 대체된 DONSA1.

상기 세가지 변이체 레트로바이러스 벡터들의 구체적인 제조방법은 다음과 같다 (도 3a와 3b, 도 4a 내지 4c 참조).

(2-1) SN-3LTR 벡터의 제조

상기 세가지 변이체 레트로바이러스 벡터 속에는 SV40 프로모터-네오 카셋트가 외래 유전자의 삽입 위치 하류에 삽입되어 있다 (도 2 참조). 상기 벡터들을 제조하기 위해, 우선 SV40 프로모터-네오 카셋트를 포함하는 벡터를 다음과 같이 제조하였다 (도 3a 및 3b 참조).

SV40 최소 프로모터에 의하여 네오 유전자가 발현되는 벡터를 제조하기 위하여, 먼저 PCR을 수행하여 SV40 프로모터-네오 카셋트를 제조하였다. 이때 상기 PCR의 주형으로는 pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) 플라스미드를 이용하였고, 프라이머로는 서열번호 5 (SV40-5 프라이머) 및 서열번호 6 (Neo-3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.

상기 SV40 프로모터-네오 카셋트를 pCRⅡ (Invitrogen, CA, USA)에 클로닝한 다음, 다시 BamHI-XhoI 절편을 제조하여, MON의 BamHI-XhoI 부위에 삽입되어 있는 IRES-네오 카셋트와 대체함으로써 MSN 벡터를 제조하였다. 이어서, 상기 MSN으로부터 SV40 프로모터-네오 카셋트 및 3' LTR을 포함하는 BamHI-EcoRI 절편을 제조하고, 이를 pUC18의 BamHI-EcoRI 부위에 삽입하여 SN-3LTR 벡터를 제조하였다 (도 3a 참조).

(2-2) pCM 벡터의 제조

5' LTR을 강력한 이종 프로모터로 대체한 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위하여, PCR을 수행하였다. 상기 PCR에서는, MLV 5' LTR의 U3 전장 (-419에서 -1까지)이 HCMV IE1 프로모터의 전장으로 대체된 키메릭 LTR을 포함하고 있는 레트로바이러스 벡터 MCC-CAT (대한민국 특허출원 제 97-48095호)을 주형으로 사용하고, 서열번호 1 (HHIR 프라이머)와 서열번호 2 (R523Bam 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머를 사용하였다. 그 결과 키메릭 5' LTR로부터 MLV 유전자의 +523 까지의 염기서열을 포함하는 유전자 절편이 증폭되었으며, 이를 pCRⅡ (Invitrogen, CA, USA)에 클로닝한 후 이로부터 HindⅢ-BamHI 절편을 제조하여 상기 실시예 2-1로부터 수득한 SN-3LTR 벡터의 HindⅢ-BamHI 위치에 삽입함으로써 레트로바이러스 벡터 pCM을 제조하였다 (도 3b 참조). 상기 pCM 벡터에서는, 상기실시예 1-1로부터 수득한 ΔSA 벡터와 마찬가지로 레트로바이러스의 모든 코딩 영역이 제거되어 있을 뿐만 아니라, ΔSA의 5' LTR이 키메릭 LTR로, ΔSA의 IRES-NEO 카셋트는 SV40 프로모터-NEO 카셋트로 각각 치환되었다. 상기 pCM 벡터는 하기 실시예 2-3 내지 2-5에서와 같이 DON1.2, DON2 및 DONSA1 벡터의 출발 벡터로 사용하였다.

(2-3) DON1.2 및 DON1.2-CAT 벡터의 제조

HCMV IE1 유전자의 엑손 1과 인트론 A와 엑손 2 (해독개시코돈 직전까지)를 포함하는 유전자 단편을 제조하기 위하여 PCR을 수행하되, 그 주형으로는 HCMV IE1프로모터부터 엑손 5 까지를 포함하는 pEQ276 벡터 (Biegalke et al., Virology, 183: 381-385, 1991)을 사용하고, 프라이머로는 서열번호 7 (RI5 프라이머; 엑손 1에 결합)과 서열번호 8 (CMVexon2.3 프라이머; 엑손 2에 결합)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하였다. PCR 결과 증폭된 약 1 kb 의 DNA 절편은 HCMV IE1 유전자의 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 개시코돈 직전까지의 염기서열을 포함한다.

상기 PCR 산물을 pZero-blunt 벡터 (Invitrogen, USA)에 삽입하여 pZero1.2 벡터를 제조하고, 전기 pZero1.2로부터 EcoRI 절편을 제조하여 클레노우로 처리하여 둔단으로 만들었다. 상기 실시예 2-2로부터 수득한 pCM를 BamHI으로 절단하고 클레노우 처리한 다음, 이에 상기 pZero1.2의 둔단화된 EcoRI 단편을 삽입하여 DON1.2 벡터를 제조하였다. 또한, DON1.2 벡터의 HindⅢ 단편을 클레노우 처리 후CAT 유전자를 삽입하여 DON1.2-CAT 벡터를 제조하였다 (도 4a 참조).

(2-4) DON2 및 DON2-CAT 벡터의 제조

상기 실시예 2-3으로부터 수득한 pZero1.2를 HpaI-EcoRI 으로 절단하여, 인트론 A의 3' 부분의 112 bp 및 엑손 2의 해독개시코돈 직전까지의 5' 부분 (+837 ~ +964)을 포함하는 유전자 절편을 제조하고, 클레노우를 처리하여 둔단으로 만들었다. 상기 실시예 2-2로부터 수득한 pCM를 BamHI으로 절단하고 클레노우 처리한 다음, 이에 상기 pZero1.2의 둔단화된 HpaI/EcoRI 단편을 삽입하여 DON2 벡터를 제조하였다. 이어서, 상기 DON2 벡터의 HindⅢ 절편에 클레노우 처리 후 CAT 유전자를 삽입하여 DON2-CAT 벡터를 제조하였다 (도 4b 참조).

(2-5) DONSA1 및 DONSA1-CAT 벡터의 제조

쥐의 면역글로불린 유전자의 스플라이싱 수용체 (Immunoglobulin splicing acceptor; IgSA)를 제조하기 위해, 서열번호 9 (SA Top oligomer)와 서열번호 10 (SA bottom oligomer)으로 기재되는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 이를 서냉복원 (annealing)하여 점착성 말단을 갖는 스플라이싱 수용체 절편을 제조하였다. 상기 절편을 pGEM4 벡터 (Promega, WI, USA)의 BamHI 위치에 삽입하여 pGEM4-SA 벡터를 제조하였다 (도 4c 참조).

한편, HCMV IE1 유전자의 엑손 1 부위를 증폭하기 위해 PCR을 수행하되, 그 주형으로는 상기 실시예 2-3의 pEQ276 벡터를 사용하고, 프라이머로는 서열번호 7(RI5 프라이머)과 서열번호 11 (exon 13 프라이머)로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.

상기 증폭된 엑손 1 절편을 pZero-blunt 벡터의 EcoRI 위치에 클로닝하여 pZero-exon1을 제조한 다음, 상기 pZero-exon1을 EcoRI 효소로 처리하여 엑손 1을 포함하는 EcoRI 절편을 제조하고 이를 상기 pGEM4-SA의 EcoRI 위치에 삽입하여 pGEM-SA-exon 1을 제조하였다.

상기 pGEM4-SA-exon1으로부터 IgSA 및 엑손 1을 포함하는 XbaI-BamHI 절편을 제조하여 클레노우로 처리하여 둔단으로 만들었다. 상기 실시예 2-2로부터 수득한 pCM를 BamHI으로 절단하고 클레노우 처리한 다음, 이에 상기 pGEM4-SA-exon1의 둔단화된 XbaI/BamHI 절편을 삽입하여 DONSA1 벡터를 제조하였다. 이어서, 전기 DONSA1 벡터의 HpaI 위치에 CAT 유전자를 삽입하여 DONSA1-CAT 벡터를 제조하였다 (도 4c 참조).

(2-6) CAT 활성 측정

상기 DON1.2-CAT, DON2-CAT, DONSA1-CAT 및 L-CAT-SN 벡터를 각각 패키징 세포주인 FlyA13 (Cosset et al., Journal of Virology, 69:7430-7436, 1995)에 트랜스펙션시키고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 세포배양액으로부터 무세포 바이러스 상층액을 제조하여 NIH3T3 세포를 트랜스덕션시키고, 48시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션된 세포와 안정하게 트랜스덕션된 세포 각각의 세포질 단백질 중의 CAT 활성을 실시예 1-3의 방법대로 측정하여, 상기 레트로바이러스 벡터들의 유전자 발현량을 비교 분석하였다.

그 결과 하기 표 2에서 보듯이, 트랜스펙션된 FlyA13 세포에서 DON1.2-CAT과 DON2-CAT의 경우, 대조군인 L-CAT-SN에 비하여 월등히 높은 CAT 활성이 관찰되었으며, 안정하게 트랜스덕션된 NIH3T3 세포에서도 대조군에 비하여 5~10배 가량 높은 CAT 활성이 관찰되었다. DONSA1-CAT의 경우에는 FlyA13과 NIH3T3 세포 모두에서 대조군보다 약간 높은 CAT 활성이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해, 스플라이싱에 관여하는 이종 비코딩 서열 (heterologous non-coding sequence)을, 발현코자 하는 외래 유전자의 상류에 삽입함으로써 스플라이싱 및 유전자 발현의 효율을 높일 수 있다는 사실이 확인되었다.

상기 DON2 벡터로 형질전환된 대장균을 Top10-DON2로, DONSA1 벡터로 형질전환된 대장균을 Top10-DONSA1으로 각각 명명하고, 이들을 1998년 6월 5일자로 한국종균협회 부설 한국미생물보존센타 (KCCM)에 각각 수탁번호 KCCM-10128과 KCCM-10127로 기탁하였다.

이종 염기서열의 삽입이 유전자 발현에 미치는 영향

벡터	세포주
벡터	FlyA13	NIH3T3
L CAT SN	1.0	1.0
DON1.2-CAT	10.1±1.5	7.7±1.6
DON2-CAT	12.5±2.1	8.0±2.0
DONSA1-CAT	5.0±2.0	1.8±1.2

<실시예 3> 인간 세포 유전자의 인트론 및/또는 엑손의 삽입

본 실시예에서는 MIN 벡터로부터 유래하는 레트로바이러스 벡터 MIN-AI, MIN-EI 및 MIN-GI를 제조하여, 진핵세포 내에서 발현하고자 하는 외래 유전자의 전사, 스플라이싱 및 해독 효율 간의 최적의 균형을 이루고자 하였다. 상기 MIN 벡터는 ΔSA 벡터와 같이 바이러스 코딩 영역을 전혀 포함하지 않으나, ΔSA 벡터에 존재하는 SV 프로모터-네오 카세트 대신 IRES-네오 카세트를 포함한다 (도 5 참조). 상기 세 가지 레트로바이러스 벡터의 특징은 다음과 같다.

벡터 MIN-AI에서는 인간 베타-액틴 (β-actin) 유전자에서 유래한 인트론, 스플라이싱 수용체 및 엑손 2 일부가 외래 유전자 상류에 삽입되었고;

벡터 MIN-EI에서는 인간 신장 인자 1α(elongation factor 1α; EF1α) 유전자에서 유래한 인트론, 스플라이싱 수용체 및 엑손 2 일부가 외래 유전자 상류에 삽입되었고;

벡터 MIN-GI에서는 인간 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde 3-phsphate dehydrogenase; GAPDH) 유전자에서 유래한 인트론, 스플라이싱 수용체 및 엑손 2 일부가 외래 유전자 상류에 삽입되었다.

본 실시예에서는 상기 제작된 벡터 이외에도 바이러스 유전자에서 유래한 이종 유전자를 삽입한 벡터를 제조하여, 상기 세가지 세포성 유전자 절편을 삽입한 벡터와 비교하였다. 즉, HCMV IE1 유전자의 인트론, 스플라이싱 수용체 및 엑손 2 일부를 MIN 유전자의 외래 유전자 상류에 삽입시켜 벡터 MIN-2를 제조하였다.

MIN 벡터 및 이로부터 유래하는 MIN-AI, MIN-EI, MIN-GI 및 MIN-2의 구체적인 제조는 하기 실시예와 같이 수행하였다.

(3-1) MIN 벡터의 제조

먼저 MLV 3' LTR 부위를 제조하기 위해 PCR을 수행하되, 그 주형으로는 pMLV (Shinnick et al., Nature 293:543-548, 1981)를 이용하고, 프라이머로는 서열번호 12 (3LTR5 프라이머)와 서열번호 13 (3LTR3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하였다. 증폭된 PCR 산물은 MLV 게놈의 3' 비해독영역, 폴리퓨린 트랙 및 3' LTR을 포함한 것으로, 이를 pCRⅡ (Invitrogen, CA, USA)에 클로닝한 다음 BamHI-EcoRI 절편을 제조하여 pUC18의 BamHI-EcoRI 부위에 삽입하여 p3LTR을 제조하였다 (도 6 참조).

한편, 레트로바이러스의 5' LTR과 스플라이싱 공여체 (splicing donor; SD)를 포함한 비코딩 영역을 제조하기 위해 PCR을 수행하되, 그 주형으로는 pMLV를 이용하고, 프라이머로는 서열번호 1 (HHIR 프라이머) 및 서열번호 14 (5LTR3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하였다. 상기 PCR 결과 증폭된 유전자 절편은 MLV의 5' LTR로부터 +620 까지의 염기서열을 포함하며 gag의 코딩 영역 직전까지를 포함한다. 이를 PCRⅡ 벡터에 클로닝한 다음 HindⅢ/BamHI 으로 절단하여 상기 PCR 산물의 HindⅢ/BamHI 절편을 얻었다. 이 절편을 상기 p3LTR 벡터의 HindⅢ/BamHI 부위에 삽입하여 p53LTR 벡터를 제조하였다 (도 6 참조).

마지막으로 pCBIN (대한민국 특허출원 제 97-48095호) 벡터에 BamHI/XhoI 효소를 처리하여 IRES-네오 카셋트를 분리한 후, 이 카셋트를 상기 p53LTR의BamHI/XhoI 부위에 삽입하여 MIN 벡터를 제작하였다 (도 6 참조).

한편, 상기 MIN 벡터의 발현 효율을 분석하기 위해, MIN 벡터의 BamHI 위치에 CAT 유전자를 삽입하여 MIN-CAT 벡터를 제작하였다.

(3-2) MIN-AI 벡터의 제조

MIN 벡터에 삽입되는 인간 유전자의 염기서열을 얻기 위하여 다음과 같은 방법으로 인간 게노믹 DNA를 추출하였다. 우선 혈액을 채취한 후 즉시 피콜-팩 구배 원심분리법 (Ficoll-paque gradient centrifugation)을 사용하여 말초혈관 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells; PBMC)를 분리하고, 이를 1-2번 세척하여 세포를 수집한 다음, TES (10 mM Tris-CI, pH 7.0 : 10 mM EDTA : 0.7% SDS)로 세포를 용해시킨다. 이를 다시 프로테아제 K (proteinase K; 400 ㎍/ml)를 가한 후 50℃ 내지 55℃에서 한 시간 내지 두 시간 배양하였고 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전을 거쳐 인간 게노믹 DNA를 분리하였다.

상기한 바와 같이 사람세포로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 이 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 프라이머로는 서열번호 15 (beta-actin 5 프라이머) 및 서열번호 16 (beta-actin 3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하였고, 증폭된 PCR 산물은 베타-액틴 유전자의 프로모터와 엑손 1, 인트론 및 엑손 2 일부 를 포함하였다. 상기 PCR 산물을 pCRⅡ 벡터에 클로닝한 후 이로부터 MluI-NheI 절편을 제조하고, 이를 pC3.1 벡터 (Invitrogen, USA)의 MluI/NheI 위치에 삽입하여 pβactin을 제조하였다.

실시예 3-1에서 제조된 MIN 벡터의 ApaI-BamHI 절편을 T4 중합효소로 처리하는 한편, 상기 pβactin의 BglⅡ-BamHI 절편(βactin 유전자의 +717 ~ +849 염기서열 포함)을 클레노우 처리한 후 상기 MIN 벡터의 ApaI-BamHI 자리에 삽입한다 (도 7a 참조). 이와 같이 제조된 벡터는 MIN-AI로 명명되었다.

한편, 상기 MIN-AI 벡터의 발현 효율을 분석하기 위해, MIN-AI 벡터의 BamHI 위치에 CAT 유전자를 삽입하여 MIN-AICAT 벡터를 제작하였다.

(3-3) MIN-EI 벡터의 제조

인간 EF-1α 유전자의 비전사영역의 염기서열을 얻기 위해, 상기 실시예 3-2에서 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 프라이머로는 서열번호 17 (EF1α5 프라이머) 및 서열번호 18 (EF1α3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하였고, 증폭된 PCR 산물은 EF1α 유전자의 프로모터와 엑손 1, 인트론 및 엑손 2 일부를 포함한다. 상기 PCR 산물을 PCRⅡ 벡터에 클로닝한 후 이로부터 MluI-NheI 절편을 제조하고, 이를 pC3.1 벡터 (Invitrogen, USA)의 MluI/NheI 위치에 삽입하여 pEF1α을 제조하였다.

실시예 3-1에서 제조된 MIN 벡터의 ApaI-BamHI 절편을 T4 중합효소로 처리하는 한편, 상기 pEF1α의 XhoI-BamHI 절편 (EF1α유전자의 +772 ~ +1008 염기서열 포함)을 클레노우 처리한 후 상기 MIN 벡터의 ApaI/BamHI 자리에 삽입한다 (도 7b 참조). 이와 같이 제조된 벡터는 MIN-EI로 명명되었다.

한편, 상기 MIN-EI 벡터의 발현 효율을 분석하기 위해, MIN-EI 벡터의 BamHI위치에 CAT 카셋트를 삽입하여 MIN-EICAT 벡터를 제작하였다. 이어서, 상기 MIN-EICAT 벡터를 대장균 Top10 균주에 도입한 형질전환체를 제조하여 MIN-EICAT(TOP10) 이라 명명하였으며, 이를 1999년 6월 2일 한국 미생물 배양 센터에 기탁하였다 (수탁번호: KCCM-10163).

(3-4) MIN-GI 벡터의 제조

인간 GAPDH 유전자의 비전사영역의 염기서열을 얻기 위해, 상기 실시예 3-2에서 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 프라이머로는 서열번호 19 (Gint5 프라이머) 및 서열번호 20 (Gint3 프라이머)로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하였고, 증폭된 PCR 산물은 GAPDH 유전자의 인트론 일부 및 엑손 2 일부 (+185 ~ +317)를 포함하였다. 상기 PCR 산물을 PCRⅡ 벡터에 클로닝한 후 이로부터 MluI/BamI 절편을 제조하고, 이를 MIN 벡터의 MluI/BamI 위치에 삽입하여 MIN-GI 벡터를 제조하였다 (도 7c 참조).

한편, 상기 MIN-GI 벡터의 발현 효율을 분석하기 위해, MIN-GI 벡터의 BamHI 위치에 CAT 유전자를 삽입하여 MIN-GICAT 벡터를 제작하였다.

(3-5) MIN-2 벡터의 제조

DON2 벡터로부터 HCMV IE1 유전자의 인트론, 스플라이싱 수용체 및 엑손 2 일부 (HCMV IE1 유전자의 +837에서 +964에 해당하는 염기서열)를 포함하는 MluI/BamHI 절편을 제조하여 MIN 벡터의 MluI/BamHI 자리에 삽입하였다 (도 7d 참조). 이와 같이 제조된 벡터는 MIN-2로 명명되었다.

한편, 상기 MIN-2 벡터의 발현 효율을 분석하기 위해, MIN-2 벡터의 BamHI 위치에 CAT 유전자를 삽입하여 MIN-2CAT 벡터를 제작하였다. 이어서, 상기 MIN-2CAT 벡터를 대장균 Top10 균주에 도입한 형질전환체를 제조하여 MIN-2CAT(TOP10) 이라 명명하였으며, 이를 1999년 6월 2일 한국 미생물 배양 센터에 기탁하였다 (수탁번호: KCCM-10164).

(3-6) CAT 활성 측정

상기 실시예에서 제조한 MIN-AI, MIN-EI, MIN-GI 및 MIN-2 의 외부 유전자 발현 효율 및 패키징 능력을 조사하기 위해, MIN-CAT, MIN-AICAT, MIN-EICAT, MIN-GICAT 및 MIN-2CAT 뿐만 아니라 잘 알려진 레트로바이러스 벡터인 MFG 및 LXSN (Miller et al., Biotechniques, 7: 980-990, 1989; Ohashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11332-11336, 1992) 벡터의 CAT 삽입형을 CAT 활성에 측정하는데 이용하였다. 상기 벡터들을 각각 패키징 세포주인 피닉스 (Kinsella and Nolan, Hum. Gene Ther. 7: 1405-1413)에 트랜스펙션시키고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 세포배양액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 무세포 바이러스 상층액을 제조하여 NIH3T3 세포를 트랜스덕션시키고, 48시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션된 세포와 트랜스덕션된 세포 각각의 세포질 단백질 중의 CAT 활성을 측정하였으며 (표 3의 "일시적 트랜스펙션" 및 "일시적 트랜스덕션" 칸 참조), 항생제 저항성을 가진 안정된 세포 군집의 CAT 활성도 측정하였다 (표 3의 "안정적 트랜스덕션" 칸참조). 또, 상기한 안정된 세포군집을 4주간 항생제를 포함한 배지에서 계대배양한 뒤 CAT 활성을 측정하였다 (표 3의 "안정적(4주) 트랜스덕션" 칸 참조). 상기 결과로부터 레트로바이러스 벡터들의 유전자 발현량 및 트랜스펙션된 세포주에서의 바이러스 생산량을 비교 분석하였다.

그 결과 하기 표 3 에서 보듯이, LXSN을 제외한 모든 레트로바이러스 벡터에서 MIN에 비하여 더 높은 CAT 활성을 보여주었다. 그러나, 도입된 이종 유전자 유래의 인트론 및 엑손 유전자에 따라 각 벡터의 CAT 활성은 큰 차이를 나타내었다. 특히, MIN-EI 및 MIN-2는 다른 벡터보다 외래 유전자 발현 효율 및 바이러스 생산효율 면에서 월등히 높음을 확인할 수 있었으며, 특히 안정된 트랜스덕션 세포주에서 보다 높았으며 4주간 배양된 안정된 트랜스덕션 세포주에서도 다른 벡터들에 비해 높은 유전자 발현을 보였다.

레트로바이러스 벡터의 성능에 대한 이종 인트론 및 엑손 서열의 효과

벡터	상대적 CAT 활성	바이러스 역가
	일시적 트랜스펙션		트랜스덕션
	일시적 트랜스펙션		일시적	안정적	안정적(4주)
MIN-CAT	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
MIN-2CAT	3.8±0.5	3.7±0.5	4.5±0.5	2.3±0.5	0.9±0.3
MIN-AICAT	0.9±0.2	1.1±0.2	1.1±0.2	0.9±0.2	0.8±0.2
MIN-EICAT	3.5±0.4	3.3±0.4	3.5±0.4	2.7±0.4	1.1±0.2
MIN-GICAT	2.0±0.5	2.4±0.3	2.2±0.4	1.5±0.3	1.3±0.2
MFG-CAT	1.0±0.2	1.1±0.3	0.8±0.2	0.3±0.1	1.0±0.3
LXSN-CAT	0.2±0.1	0.2±0.1	0.2±0.1	0.1±0.0	0.5±0.2

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 다음과 같은 특징을 가지는 유전자 요법 등에 유용하게 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

첫째, 유전자 치료요법에 불필요한 레트로바이러스의 gag, env 및 pol 코딩 서열을 완전히 제거하여, 패키징 세포주에서 동종재조합에 의하여 복제가능 레트로바이러스가 생산될 가능성을 완전히 배제하였다.

둘째, 외래유전자 삽입 위치의 상류에 이종 인트론, 스플라이싱 수용체 및/또는 이종 유전자의 비코딩 염기서열을 삽입하여, 안정되게 고효율로 유전자를 발현한다.

셋째, 5' LTR의 U3 부위를 특히 인간세포에서 강력한 전사 활성을 유도하는 이종 프로모터로 대체함으로써 인간세포유래 패키징 세포주에서 많은 양의 RNA를 생산하여 바이러스의 역가가 향상된다.

넷째, IRES 또는 이종 프로모터를 사용하여 두 가지 이상의 외래유전자를 발현할 수 있도록 하였다. 이때 이종 프로모터는 최소프로모터를 이용하여, 이종 내부 프로모터에 의한 간섭을 최소화하고 보다 큰 외래유전자를 클로닝할 수 있도록 하였다.

Claims

MLV (Murine Leukemia Virus)의 gag, env, pol 서열이 완전히 제거된 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 외래유전자 삽입 위치의 상류에 이종 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체 (splicing acceptor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 2항에 있어서, 이종 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체는 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시초기 1 유전자 (HCMV IE1 유전자)의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 신장인자1α (EF1α) 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH) 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체, 베타-액틴 유전자의 인트론 및/또는 스플라이싱 수용체 및 쥐의 면역 글로불린 유전자의 스플라이싱 수용체로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 스플라이싱 수용체인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 외래유전자 삽입 위치의 상류에 이종 유전자 유래의 비코딩 서열 (heterologous non-coding sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 4항에 있어서, 상기 이종 유전자 유래의 비코딩 서열은 HCMV IE1 유전자의 비코딩 서열, 신장인자1α (EF1α) 유전자의 비코딩 서열, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH) 유전자의 비코딩 서열 및 베타-액틴 유전자의 비코딩 서열로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 비코딩 서열인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, MLV의 5' LTR (long terminal repeat)의 U3 전장 (-419 ~ -1)이 이종 프로모터로 대체된 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 6항에 있어서, 상기 이종 프로모터는 HCMV IE1 프로모터인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 외래유전자 삽입 위치의 하류에 이종 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 8항에 있어서, 상기 이종 프로모터는 SV40 최소 프로모터인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 벡터는 외래유전자 삽입 위치의 상류에 쥐의 면역글로불린 유전자의 스플라이싱 수용체 및 HCMV IE1 유전자의 엑손 1을 포함하고; MLV의 5' LTR의 U3 전장 (-419 ~ -1)이 HCMV IE1 프로모터로 대체되고; 외래유전자 삽입 위치의 하류에 SV40 최소 프로모터를 포함한 레트로바이러스 벡터 DONSA1인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 벡터는 외래유전자 삽입 위치의 상류에 HCMV IE1 유전자의 인트론 A 영역의 3' 말단 방향 112bp와 엑손 2의 해독개시코돈 직전까지의 염기서열을 포함하고; MLV의 5' LTR의 U3 전장 (-419 ~ -1)이 HCMV IE1 프로모터로 대체되고; 외래유전자 삽입 위치의 하류에 SV40 최소 프로모터를 포함한 레트로바이러스 벡터 DON2인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 4항에 있어서, 상기 벡터는 외래유전자 삽입 위치의 상류에 인간 신장인자1α (EF1α) 유전자의 인트론 영역의 3' 말단 부위부터 엑손 2의 해독개시코돈 직전까지의 염기서열 (+772 ~ +1008)을 포함한 레트로바이러스 벡터 MIN-EI인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 4항에 있어서, 상기 벡터는 외래유전자 삽입 위치의 상류에 HCMV IE1 유전자의 인트론 A 영역의 3' 말단 방향 112bp와 엑손 2의 해독개시코돈 직전까지의 염기서열 (+837 ~ +964)을 포함한 레트로바이러스 벡터 MIN-2인 것을 특징으로 하는 MLV-유래 레트로바이러스 벡터.
제 10항의 레트로바이러스 벡터 DONSA1으로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주 Top10-DONSA1 (수탁번호 : KCCM-10127).
제 11항의 레트로바이러스 벡터 DON2으로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주 Top10-DON2 (수탁번호 : KCCM-10128).
제 12항의 레트로바이러스 벡터 MIN-EI의 외래유전자 삽입 위치에 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 유전자가 삽입된 MIN-EICAT으로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주 MIN-EICAT(TOP10) (수탁번호: KCCM-10163).
제 13항의 레트로바이러스 벡터 MIN-2의 외래유전자 삽입 위치에 CAT 유전자가 삽입된 MIN-2CAT으로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주 MIN-2CAT(TOP10) (수탁번호 : KCCM-10164).