WO2012157743A1

WO2012157743A1 - 外来性ｓｄ－ｓａを有するレトロウイルスベクター

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Publication number: WO2012157743A1
Application number: PCT/JP2012/062773
Authority: WO
Inventors: 幸子岡本; 峰野　純一
Original assignee: タカラバイオ株式会社
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2012-11-22

Abstract

　本発明は、細胞に所望の遺伝子を導入してより効率よく発現させるためのレトロウイルスベクターを提供することを目的とし、５'末端から順に、（ａ）レトロウイルス由来の５'ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）配列、（ｂ）レトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列（ψ）、（ｃ）プロモーター配列、（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）配列、（ｅ）スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、（ｆ）所望の遺伝子の配列、（ｇ）Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させたレトロウイルス由来の３'ＬＴＲ配列の各配列の核酸を含み、ここに、（ｄ）のＳＤ配列及び（ｅ）のＳＡ配列のうち少なくとも１つが（ｃ）のプロモーター配列と異なる遺伝子由来であることを特徴とするレトロウイルスベクターを提供する。

Description

外来性ＳＤ－ＳＡを有するレトロウイルスベクター

　本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において、細胞に遺伝子導入して形質転換するために用いるレトロウイルスベクター、前記ベクターが導入された細胞、ならびに前記ベクターを使用する遺伝子導入細胞の製造方法に関する。

　真核生物への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する技術などが知られている。ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適しており、レトロウイルスベクターは、宿主染色体への安定な組み込み機能により長期安定発現が可能であり、遺伝病の遺伝子治療の分野で期待されているベクターであり、また、トランスジェニック動物作成の分野でも期待されている技術である。

　レトロウイルスは、ウイルス粒子の構造タンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどの前駆体タンパク質をコードするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、エンベロープ糖タンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を有する。これらの遺伝子の両端は、ウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わる５’ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）及び３’ＬＴＲで挟まれている。レトロウイルス粒子を使用する遺伝子導入システムは、ウイルス粒子の感染力を保ちつつ自己複製を不可能にするため、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子を発現する１つ又は２つのパッケージングコンストラクトと、レトロウイルスベクターに分割されている。レトロウイルスベクターはトランスファーベクターとも呼ばれ、ＬＴＲ及びウイルス粒子へのパッケージングシグナル配列を有し、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の大部分とｅｎｖ遺伝子が削除され、その代わりに所望の遺伝子が挿入されている。トランスファーベクターの５’ＬＴＲのプロモーター配列によりＲＮＡゲノムが転写され、パッケージングシグナル配列によりウイルス粒子にパッケージングされる。

　レトロウイルスの自己複製の可能性をより低減させるため、標的細胞の染色体上でプロモーターとして機能する３’ＬＴＲのプロモーター配列を欠失させた自己不活性化（ＳＩＮ）型のレトロウイルスベクターが開発されている（非特許文献１、非特許文献２）。ＳＩＮ型ベクターでは、所望の遺伝子の転写調節は、パッケージングシグナル配列の３’末端側に位置する内部プロモーターにより行われる。ＳＩＮ型ベクターは内部プロモーターより５’末端側の配列が転写されないため自己複製能を有するウイルス粒子が生成する可能性は極めて低く安全である。

米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８３巻、第３１９４－３１９８頁（１９８６）ジャーナル　オブ　ヴイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７２巻、第８１５０－８１５７頁（１９９８）

　本発明の目的は、細胞に所望の遺伝子を導入してより効率よく発現させるためのレトロウイルスベクターを提供することにある。

　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、外来性のＳＤ配列及びＳＡ配列を利用することにより、導入された遺伝子を効率よく発現するレトロウイルスベクターを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち本発明を概説すれば、
［１］　５’末端から順に、
（ａ）レトロウイルス由来の５’ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）配列、
（ｂ）レトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列（ψ）、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）配列、
（ｅ）スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、
（ｆ）所望の遺伝子の配列、
（ｇ）Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させたレトロウイルス由来の３’ＬＴＲ配列、
の各配列の核酸を含み、（ｄ）のＳＤ配列及び（ｅ）のＳＡ配列のうち少なくとも１つが（ｃ）のプロモーター配列と異なる遺伝子由来であることを特徴とするレトロウイルスベクター、
［２］　所望の遺伝子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする遺伝子である［１］記載のレトロウイルスベクター、
［３］　所望の遺伝子がポリシストロニックに連結したＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖をコードする遺伝子である［２］記載のレトロウイルスベクター、
［４］　プロモーター配列がレトロウイルスのＬＴＲ　Ｕ３領域由来である［１］記載のレトロウイルスベクター、
［５］　プロモーター配列がマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）のＬＴＲ　Ｕ３領域由来である［４］記載のレトロウイルスベクター、
［６］　ＳＤ配列及びＳＡ配列が哺乳動物遺伝子由来の配列である［１］記載のレトロウイルスベクター、
［７］　レトロウイルスがオンコレトロウイルス又はレンチウイルスである［１］記載のレトロウイルスベクター、
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法。
［９］　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である［８］記載の遺伝子導入細胞の製造方法、
［１０］　請求項［１］～［７］のいずれかに記載のレトロウイルスベクターが導入された遺伝子導入細胞、
［１１］　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である［１０］記載の遺伝子導入細胞、に関する。

　本発明により、効率よく所望の遺伝子が発現するレトロウイルスベクター、当該ベクターを使用する遺伝子導入細胞の製造方法、当該ベクターが導入された細胞が提供される。これらのレトロウイルスベクター、遺伝子導入細胞の製造方法及び遺伝子導入細胞は、タンパク質の製造、細胞医療による疾患の治療及びそのための研究、試験に極めて有用である。

実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。野生型ＴＣＲ遺伝子の発現相対値を示す図である。コドン変換型ＴＣＲ遺伝子の発現相対値を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー陽性細胞率を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー平均蛍光値を示す図である。実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー陽性細胞率及びテトラマー平均蛍光強度を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー陽性細胞率及びテトラマー平均蛍光強度を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー陽性細胞率及びテトラマー平均蛍光強度を示す図である。ウイルスのコピー数に対するテトラマー陽性細胞率及びテトラマー平均蛍光強度を示す図である。

　本明細書において「ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）」とは、レトロウイルス、レトロトランスポゾンなどのプロウイルスＤＮＡの両端に繰り返されている１００～１０００塩基対からなる配列をいう。ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わるＵ３、Ｒ及びＵ５の各領域から構成される。プロウイルス５’末端及び３’末端にあるＩＲ配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ　ｒｅｇｉｏｎ＝逆方向反復）は４～２０塩基対の長さである。Ｕ３には転写のエンハンサー配列及びプロモーター配列が含まれる。

　本明細書において「パッケージングシグナル配列」は、「プサイ（ｐｓｉ）配列」又は「ψ配列」とも表記され、ウイルス粒子の形成においてレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成及びウイルス粒子へのパッケージングに必要な、非コード性のシス作用性の配列を意味する。例えば、主要なスプライスドナー（ＳＤ）部位の３’側からｇａｇ開始コドンまでの領域、又はＳＤ部位の３’側からｇａｇの一部を含む領域である。

　本明細書において「プロモーター配列」とは、直接又はプロモーターが結合しているその他のタンパク質を介してＲＮＡポリメラーゼと結合し、３’末端に接続する配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、他の発現制御配列、例えば、エンハンサーおよびレプレッサー配列を併せ持つ場合がある。

　本明細書において「スプライスアクセプター（ＳＡ）配列」は、ＲＮＡ中に存在するイントロンを除去し、その前後のエキソンを再結合するＲＮＡプロセシング反応において、イントロンとエキソンの境界部位であるスプライス部位のうち、イントロンの３’末端側に存在するスプライス部位を意味する。例えば、核に存在するＲＮＡ前駆体のイントロンの３’末端にはＡＧのコンセンサス配列が存在し、ＡＧ配列の３’末端側がＳＡ配列である。反対に、「スプライスドナー（ＳＤ）配列」は、イントロンの５’末端に存在するスプライス部位を意味する。例えば、核に存在するＲＮＡ前駆体のイントロンの５’末端にＧＵのコンセンサス配列が存在し、ＧＵ配列の５’末端側がＳＤ配列である。真核細胞のｍＲＮＡ前駆体に含まれるイントロンのＳＡ配列及びＳＤ配列のコンセンサス配列の特徴は、ＧＵ－ＡＧ則と呼ばれている。コンセンサス配列に変異を導入したＳＡ配列又はＳＤ配列も、ＲＮＡプロセシング反応において機能すれば本明細書のＳＡ配列又はＳＤ配列に含まれる。

　本明細書において「所望の遺伝子（ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」とは、細胞（例えば、細胞の核ゲノムや細胞質）中に一時的もしくは永続的のいずれかで人工的に（人為的な操作により）挿入されることが望まれる外来性の遺伝子を意味する。このような遺伝子には、導入する細胞に対して完全に異種由来又は部分的に異種由来である遺伝子が含まれ、また、任意の変異を有する遺伝子も含まれる。また、その細胞が天然に有している内在性遺伝子と同一の遺伝子でありうる。ここで「天然に」とは、人為的な操作が加えられていない自然の状態であることを意味する。

　本明細書において「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離されたその遺伝子又は遺伝子産物のうち、集団において最も高頻度で観察されるものを意味する。これは、天然に存在するか、又は組換体として産生させ得る。一方、「変異型」とは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／又は機能的特性が改変された遺伝子又は遺伝子産物を指す。変異型遺伝子は、自然に変異が生じることにより、又は人為的に遺伝子を修飾して配列を変異させることにより産生される。

　本明細書において「Ｔ細胞」とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ＣＴＬ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などを含む細胞集団が例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞は抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）や生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。

　本明細書において「発現の抑制」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子からの転写及び／又は翻訳を妨げることにより、最終的なポリペプチドの生成を抑制すること、すなわち、生成物としてのポリペプチド量が減少することを意味する。従って、ポリペプチドをコードする遺伝子からの転写反応が抑制されない場合でも、転写産物（ｍＲＮＡ）が速やかに分解され、タンパク質の生成が抑制されていれば「発現の抑制」に含まれる。発現が抑制された状態は、抑制しない場合と比較して発現量が２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上又は１００％、すなわち完全に抑制された状態である。

　以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明のレトロウイルスベクター
　本発明のレトロウイルスベクターは、５’末端から順に、
（ａ）レトロウイルス由来の５’ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）配列、
（ｂ）レトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列（ψ）、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）配列、
（ｅ）スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、
（ｆ）所望の遺伝子の配列、
（ｇ）Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させたレトロウイルス由来の３’ＬＴＲ配列、
の各配列の核酸を含み、（ｄ）のＳＤ配列及び（ｅ）のＳＡ配列のうち少なくとも１つが（ｃ）のプロモーター配列と異なる遺伝子由来であることを特徴とする核酸構築物である。本発明のベクターは、導入された細胞内における所望の遺伝子の発現効率が高い。本発明のベクターは、タンパク質の製造、細胞医療による疾患の治療及びそのための研究、試験に使用することができる。

　レトロウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルスゲノムには主要な要素として、その５’末端より５’ＬＴＲ配列、ＳＤ配列、パッケージングシグナル配列、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ＳＡ配列、ｅｎｖ遺伝子、３’ＬＴＲ配列が存在している。後述するレンチウイルスの場合にはこれらの要素に加えて複数のアクセサリー遺伝子が含まれている。このうち、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入システムにおいて、レトロウイルスベクターに必須であるのは５’ＬＴＲ配列、パッケージングシグナル配列、３’ＬＴＲ配列である。その他のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の遺伝子産物は、これらの遺伝子を保持させたパッケージング細胞より供給され得る。

　本発明のベクターに含まれる（ａ）５’ＬＴＲ配列、（ｇ）Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させたレトロウイルス由来の３’ＬＴＲ配列及び（ｂ）パッケージングシグナル配列は、レトロウイルス由来の配列で哺乳動物細胞に遺伝子を導入することが可能な配列であればいずれも使用することができる。レトロウイルスは、オンコレトロウイルスとレンチウイルスのサブクラスを含み、いずれのクラスのウイルス由来の配列も本発明に使用できる。これらの配列は同一のウイルス由来の配列であってもよいが、適切なパッケージング細胞との組み合せによりウイルス粒子の形成や導入細胞ゲノムへの組み込みが可能な範囲で異なるウイルス由来の配列を組み合わせて使用してもよい。

　本発明で使用するＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列には、例えば、オンコレトロウイルスに属するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）由来の配列が使用できる。オンコレトロウイルス由来のウイルスベクターは、高効率で遺伝子導入可能であるが、ベクターの導入の際に細胞が活発に細胞分裂を行っている必要がある。これらのオンコレトロウイルスベクターは多数の文献で説明されている［例えば米国特許第５，２１９，７４０号公報、米国特許第６，２０７，４５３号公報、米国特許第５，２１９，７４０号公報、バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）第７巻、第９８０－９９０頁（１９８９）、ヒューマン　ジーン　セラピー（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１巻、第５－１４頁（１９９０）、ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１８０巻、第８４９－８５２頁（１９９１）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９０巻、第８０３３－８０３７頁（１９９３）、ならびにカレント　オピニオン　イン　ジェネティックス　アンド　デベロップメント（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．）、第３巻、第１０２－１０９頁（１９９３）］。

　また、本発明で使用するＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列には、例えば、レンチウイルスに属するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）由来の配列が使用できる。レンチウイルスベクターは、遺伝子を導入する細胞の有糸分裂に関係なく核内のゲノムに遺伝子を導入ことができる。レンチウイルスベクターも多数の文献で説明されている［例えば、ジャーナル　オブ　ヴイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７２巻、第８４６３－８４７１頁（１９９８）］。スプマウイルス属（例えば、泡沫状ウイルス）のような他のレトロウイルスのグループも、分裂していない細胞に効率的に形質導入することができる。

　本発明のベクターには、配列を変異させたＬＴＲ配列を使用することもできる。ＬＴＲは機能的に５’末端よりＵ３、Ｒ、Ｕ５の３つの領域に区分される。Ｕ３領域にはエンハンサー／プロモーター活性があり、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、ウイルスゲノムは５’ＬＴＲ配列のＲ領域から３’ＬＴＲ配列のＲ領域までが転写される。本発明のベクターに使用する３’ＬＴＲは、Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させた配列である。３’ＬＴＲ配列のＵ３領域に変異を導入してエンハンサー／プロモーター活性を欠失させることにより、ウイルスゲノムが染色体に組み込まれて形成されたプロウイルスでのＲ領域からの転写が抑制される。このように３’ＬＴＲ配列のＵ３領域を変異させたレトロウイルスベクターを自己不活性（ＳＩＮ）型ベクターと呼ぶ。３’ＬＴＲ配列への変異の導入は、塩基の置換又は欠失により実施される。

　また、５’ＬＴＲ配列のＵ３領域を、そのＬＴＲ配列が由来するウイルス以外に由来する外来性プロモーターに置換したＬＴＲ配列も本発明に使用できる。置換する外来性のプロモーターは、ウイルス又は哺乳動物由来の配列を使用することができ、構成的、誘導性又は組織特異的なプロモーターが使用できる。例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（米国特許第５３８５８３９号公報）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ　Ｕ３領域［セル（Ｃｅｌｌ）、第２２巻、第７８７－７９７頁（１９８０）］、ＳＶ４０初期プロモーター領域［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９０巻、第３０４－３１０頁（１９８１）］、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）等のウイルス由来プロモーターや、ポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ）１α、ホスホグリセレート　キナーゼ（ＰＧＫ）、βアクチン、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン及びインスリン遺伝子の哺乳動物由来プロモーターが使用できる。

　本発明のベクターはプロウイルスでのＬＴＲ　Ｒ領域からの転写が抑制されているため、所望の遺伝子を発現させるためのプロモーター配列をＬＴＲとは別に配置する。このような、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの間に存在するプロモーター配列を内部プロモーター配列と言うことがある。本発明のベクターの（ｃ）のプロモーター配列は、所望の遺伝子配列と作動可能な状態でＳＤ配列及びＳＡ配列と共に連結される。前記プロモーター配列は、ウイルス由来又は哺乳動物遺伝子由来のプロモーター配列が使用できる。ウイルス由来のプロモーター配列を使用する場合は、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ又はパッケージングシグナル配列が由来するウイルスと同一のウイルス由来の配列又は異なるウイルス由来の配列を使用できる。例えば、レトロウイルスのＬＴＲ　Ｕ３領域由来のプロモーター配列、例えば、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）のＬＴＲ　Ｕ３領域由来のプロモーター配列が使用できる。また、プロモーター配列は、前段落の５’ＬＴＲ配列のＵ３領域を置換する外来性プロモーターとして例示する配列が使用できる。例えば、モレキュラーセラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第２巻、第４５８－４６９（２０００）に記載されるプロモーターを使用できる。

　本発明のベクターに含まれる（ｄ）ＳＤ配列及び／又は（ｅ）ＳＡ配列は、（ｃ）のプロモーター配列に対して外来性のＳＤ配列及び／又はＳＡ配列、すなわち使用するプロモーター配列とは異なる遺伝子に由来するＳＤ配列及び／又はＳＡ配列が使用できる。「異なる遺伝子由来する」とは、前記の各エレメントが同種のウイルス又は哺乳動物の異なる遺伝子に由来すること、もしくは異なるウイルス又は哺乳動物に由来することを意味する。更に、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ又はパッケージングシグナル配列が由来するウイルスと同一のウイルス由来、異なるウイルス由来又は哺乳動物遺伝子由来のＳＤ配列及び／又はＳＡ配列が使用できる。また、ＳＤ配列及びＳＡ配列は、互いに異なる遺伝子に由来する配列であってもよい。例えば、ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ（ＳＶ）４０の１６Ｓ　ＲＮＡ、ＨＣＭＶのｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ＲＮＡ、ヒトのｈＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ配列及びＳＡ配列が使用できる［米国科学アカデミー紀要、第９５巻、第１号、第２１９－２２３頁（１９９８）］。また、コンセンサス配列に変異を導入し、スプライシング活性を強化又は抑制されたＳＤ配列又はＳＡ配列も本発明のベクターに使用できる。

　本発明のベクターは、任意の位置にｓｉＲＮＡ生成配列を含むことができる。ｓｉＲＮＡ生成配列は、少なくとも１つのステム－ループ構造を形成し、哺乳動物細胞内でＲＮＡ干渉を誘導し得るＲＮＡが転写される配列である。本発明におけるＲＮＡ干渉は、ベクターを導入する細胞が天然に発現する特定の内在性遺伝子の発現を選択的に抑制することを目的としている。ＲＮＡ干渉は、発現を抑制することが望まれる遺伝子（以下、標的遺伝子と記載する）から転写されるｍＲＮＡの塩基配列に相同的なＲＮＡ分子及び相補的なＲＮＡ分子がアニールしたｓｉＲＮＡにより誘導される。ｓｉＲＮＡ生成配列は、例えば本発明のベクターの（ｂ）と（ｃ）の間、（ｃ）と（ｄ）の間、（ｄ）と（ｅ）の間、（ｅ）と（ｆ）の間又は（ｆ）と（ｇ）の間に配置される。

　本発明に使用されるｓｉＲＮＡ生成配列には、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡのある領域の塩基配列に相同的な配列（センス配列）と相補的な配列（アンチセンス配列）とが直列に並んで配置されている。ｓｉＲＮＡ生成配列から転写された一本のＲＮＡ鎖は、分子内でセンス配列とアンチセンス配列がアニールして二本鎖構造を形成し、形成された二本鎖ＲＮＡ部分をステム領域とし、センス配列とアンチセンス配列の間に配置される任意の配列をループ領域とするステム－ループ構造を形成する。細胞内では、このステム領域からＲＮａｓｅＩＩＩ（ダイサー）の作用によりｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡ生成配列におけるステム領域に相当する部分の鎖長は、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１３～２９塩基、好ましくは１５～２５塩基、更に好ましくは１９～２５塩基が例示される。また、ループ領域は任意の配列でよく、１～３０塩基の鎖長の配列が例示されるが、好ましくは１～２５塩基、更に好ましくは５～２２塩基の配列が使用される。

ここで、本発明により細胞内で生成されるｓｉＲＮＡは標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの特定塩基配列に相同な配列のＲＮＡと相補的な配列のＲＮＡから構成されるが、各ＲＮＡは前記のｍＲＮＡの特定塩基配列と完全に相同もしくは相補的であることを要しない。標的遺伝子の発現抑制という機能が発揮される範囲で実質的に相同なＲＮＡ及び実質的に相補的な配列のＲＮＡからなるｓｉＲＮＡの生成配列を使用してもよい。また、本発明に使用されるｓｉＲＮＡ生成配列は、１種の遺伝子を標的とする１種類のｓｉＲＮＡを転写するものの他、１種の標的遺伝子の異なる領域の塩基配列に対応する複数のｓｉＲＮＡを転写するものや、複数の標的遺伝子に対応する複数のｓｉＲＮＡを転写するものであっても良い。例えば、本発明に使用されるｓｉＲＮＡ生成配列から生成されるｓｉＲＮＡの数は、１～１０個、１～６個、１～４個、複数個又は数個である。

　本発明のベクターに含まれる（ｆ）の所望の遺伝子配列は、ベクターを導入する細胞で発現させたい遺伝子配列である。当該遺伝子配列には、例えばタンパク質をコードする配列、ｔＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の細胞内で機能するＲＮＡをコードする配列が含まれる。本発明のベクターを、配列（ｆ）を連結するための制限酵素認識配列を複数個並べた配列（マルチクローニングサイト）を配列（ｆ）の代わりにベクターに配置したベクターとして製造し、その後マルチクローニングサイトを利用して配列（ｆ）を挿入しても良い。配列（ｆ）の代わりにマルチクローニングサイトを有するベクターも本発明のベクターに含まれる。

　ｓｉＲＮＡ生成配列から生成するｓｉＲＮＡが配列（ｆ）の所望の遺伝子配列を標的として当該配列からの遺伝子発現を抑制することがある。このような現象が予想される場合、これを防ぐために、所望の遺伝子配列に変異を導入し、ｓｉＲＮＡの作用を受けない配列に改変することができる。

　遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１～６種類ずつが存在することが知られている。適切なコドンの選択により、コードされるアミノ酸配列には変化を与えずに、塩基を変換（サイレント変異と呼ばれる）することができる。サイレント変異は、コドンの３番目の塩基を変換する場合が多い。所望の遺伝子がｓｉＲＮＡ生成配列から生成されるｓｉＲＮＡに対応する標的遺伝子上の領域と同じ塩基配列を有するものであった場合、ｓｉＲＮＡはその本来の標的遺伝子、導入された所望の遺伝子の両方の発現を抑制する。所望の遺伝子にこのサイレント変異を導入してｓｉＲＮＡの配列との相同性／相補性を消失させると、ｓｉＲＮＡは所望の遺伝子から転写されるＲＮＡに作用せず、その発現の抑制が低減される。これにより、ｓｉＲＮＡが作用する領域において、所望の遺伝子とｓｉＲＮＡの標的である内在性遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列が同一であるにも関わらず、内在性遺伝子の発現を選択的に抑制することができる。

　更に、所望の遺伝子の塩基配列を変異させる別の態様として、前記ｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡがコードするアミノ酸配列について、所望の遺伝子がコードするポリペプチドの機能を損なわない範囲において、他のアミノ酸の置換、例えば類似するアミノ酸への置換によってアミノ酸配列を変化させても良い。類似するアミノ酸とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４７巻、第１３０６－１３１０頁（１９９０）を参照）。所望の遺伝子にこの保存的アミノ酸置換変異を導入すると、ｓｉＲＮＡ生成配列から生成するｓｉＲＮＡが、所望の遺伝子から転写されるＲＮＡに作用せず、発現の抑制が低減される。これにより、ｓｉＲＮＡが作用する領域において、所望の遺伝子と内在性ポリペプチドのアミノ酸配列が類似するにも関わらず、内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制することができる。

　以下、本明細書において、前記のようにサイレント変異又は保存的アミノ酸置換変異を導入した遺伝子を「コドン変換型」遺伝子と呼ぶことがある。上記の塩基配列の変換に際しては、特に本発明を限定するものではないが、使用される宿主において使用頻度の高いコドンや翻訳効率を上昇させる配列を選択して塩基配列を変換することにより、所望の遺伝子の発現効率の向上が期待される。

　本発明の一態様として、本発明のベクターの所望の遺伝子はオリゴマータンパク質をコードする配列である。オリゴマータンパク質には、構造タンパク質、酵素、転写因子、レセプター、抗体が含まれる。また、本発明において、オリゴマータンパク質は細胞表面タンパク質（膜タンパク質）であってもよく、実施例に例示された抗原認識レセプター、例えばＴ細胞レセプター（Ｔ細胞受容体：ＴＣＲ）をコードする配列が所望の遺伝子として好適である。

　ＴＣＲは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー（ヘテロ二量体）、γ鎖とδ鎖からなるヘテロダイマーの２種類が存在する。ＴＣＲの各鎖とも可変（Ｖ）領域、結合（Ｊ）領域、定常（Ｃ）領域からなる。ＴＣＲのＶ領域の多様性は、ＤＮＡの再編成によるＶ領域をコードする遺伝子セグメントの組み合わせと再編成結合部位のずれ、及び結合部位へのＮ配列の挿入によって生じる。α鎖とβ鎖のＶ領域には、アミノ酸配列の変異が特に高い超可変領域（ＣＤＲ）が認められる。本発明のベクターの一態様として、ＴＣＲのヘテロダイマーを構成する２つのポリペプチドをコードする遺伝子をポリシストロニックに連結した配列を所望の遺伝子とすることができる。前記２つの遺伝子は、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ：内部リボソーム進入部位）配列から選択される配列を介して相互に接続させることが可能である。２つの遺伝子の順はどちらでもよく、例えば５’末端からＴＣＲα鎖－ＴＣＲβ鎖の順、又はＴＣＲβ鎖－ＴＣＲα鎖の順のポリシストロニックな配列が使用できる。

　自己切断ペプチドは、ウイルスの２Ａペプチド又はそれと同等の機能を有する２Ａ様ペプチドから得ることが可能である。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）から成る群から選択することができる。例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＴ２Ａを使用することができる。２Ａペプチドは、エキスパート　オピニオン　オン　バイオロジカル　セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ）、第５巻、６２７－６３８頁（２００５）に総説されている。

　ＩＲＥＳ配列は、リボソームがシストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えばＡＵＧへ直接的に進入することを促進し、それによって、遺伝子のキャップ非依存的な翻訳を開始させるエレメントをいう［トレンズ　イン　バイオケミカル　サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ）、第１５巻、第１２号、第４７７－８３頁（１９９０）］。ＩＲＥＳ配列により連結された複数のシストロンを有する単一のｍＲＮＡから、複数のポリペプチドが翻訳される。

　例えば、所望の抗原を認識する外来性のＴＣＲをＴ細胞に導入する場合、Ｔ細胞が天然に発現している内在性ＴＣＲと外来性ＴＣＲが競合し、外来性ＴＣＲの発現が低下する可能性がある。更に、内在性ＴＣＲと外来性ＴＣＲがミスペアリングしたＴＣＲによる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの副作用が発生する可能性がある。従って、内在性ＴＣＲの発現を抑制することが重要である。内在性ＴＣＲのＶ領域は個々のＴＣＲによって異なるのに対し、Ｃ領域は個々のＴＣＲに共通の配列で同じ塩基配列の遺伝子にコードされているため、ｓｉＲＮＡ生成配列が生成するｓｉＲＮＡが標的とする配列に好適である。更に、このｓｉＲＮＡが導入した外来性ＴＣＲ遺伝子の発現を抑制するのを防ぐため、当該遺伝子におけるＣ領域をコードする塩基配列に前記のサイレント変異の導入を実施することができる。こうして、外来性ＴＣＲの発現を効率よく行うことができる。

　例えば、内在性ＴＣＲの発現を抑制する場合、特に限定はされないがＴＣＲをコードする遺伝子のＣ領域のうち、内在性ＴＣＲα鎖の塩基配列ＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴ（配列番号１）を、外来性ＴＣＲα鎖では塩基配列ＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣ（配列番号２）にコドン変換すれば良い。上記２つの塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＳＫＤＳＤＶＹ（配列番号３）で共通であるが、配列番号１３に記載される人工遺伝子が転写されて生成するｓｉＲＮＡにより、内在性ＴＣＲのα鎖が選択的に抑制される。コドン変換を実施例に記載する表１に例示する。

　本発明のベクターは、更に中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）－セントラルターミネーション（ＣＴＳ）配列及び／又はウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含みうる。ｃＰＰＴと称される配列の存在は、非分裂細胞への効率的な遺伝子送達を改善する可能性がある。このｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列は、例えば（ｂ）と（ｃ）の間に配置される。ＷＰＲＥはパッケージング細胞でのパッケージングを促進して高力価に寄与し、宿主細胞中のｍＲＮＡの産生を促して所望の遺伝子の発現を強化する。このＷＰＲＥ配列は、例えば（ｆ）と（ｇ）の間に配置される。

（２）本発明の遺伝子導入細胞の製造方法
　本発明の遺伝子細胞の製造方法は、前記（１）に記載する本発明のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は体外で実施される。

　本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、各種癌細胞株、歯周靭帯線維芽細胞又は神経幹細胞を使用することができる。前記の細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。製造された遺伝子導入細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞より遺伝子導入細胞を製造することが好ましい。

　本発明の方法において、本発明のベクターを細胞に導入する工程は、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（米国特許第５，２７８，０５６号公報）、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０－６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。これらのレトロウイルスベクターから、本発明のベクターの（ａ）～（ｇ）の配列を有するＤＮＡ断片を調製することが可能である。また、これらのパッケージング細胞を本発明の方法に使用することができる。

　本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばＭＭＬＶ、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープやエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したパッケージング細胞を使用し、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスベクター粒子を調製することができる。

　本発明のベクターを細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる（例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット）。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン又はＤＥＡＥ－デキストランを使用することができる。

　本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。

（３）本発明の遺伝子導入細胞
　本発明の遺伝子導入細胞は、前記（２）の製造方法により、前記（１）のレトロウイルスベクターが導入された細胞である。本発明の遺伝子導入細胞は、外来性の所望の遺伝子を高効率で発現している。レトロウイルスベクターがｓｉＲＮＡ生成配列を有する場合は、外来性の所望の遺伝子を強く発現し、特定の内在性遺伝子の発現が抑制されている遺伝子導入細胞が提供される。

　本発明の一態様として、特定の抗原を認識する外来性ＴＣＲを導入した遺伝子導入細胞が挙げられる。外来性ＴＣＲが導入されたＴ細胞が投与される疾患としては、当該Ｔ細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。

　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
　また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー　クローニング：ア　ラボラトリー　マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　ｅｄ．）に記載の方法によった。

実施例１　コドン変換型ヒトＴ細胞受容体α及びβ遺伝子の作製
　Ａｎ　Ｊら、インターナショナル　ジャーナル　オブ　ヘマトロジー（Ｉｎｔ．Ｊ　Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第９３巻、第１７６－１８５頁（２０１１）（出典明示により本明細書の一部とする）の記載に従い、腫瘍抗原ＷＴ１の２３５－２４３のペプチドを認識するＴＣＲのα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子を含む核酸断片をそれぞれ調製した。次に、こうして得られたＴＣＲα鎖遺伝子の、配列番号３、６で示されるＣ領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列（それぞれ配列番号１、４）を、コドン変換型の塩基配列である配列番号２、５の塩基配列にそれぞれ変換した。同様に、ＴＣＲβ鎖遺伝子の、配列番号９、１２で示されるＣ領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列（それぞれ配列番号７、１０）を、コドン変換型の塩基配列である配列番号８、１１の塩基配列にそれぞれ変換した。以上の塩基配列変換の詳細を表１に示す。また、配列番号１３に示す人工遺伝子を合成した。この人工遺伝子は、ステム－ループ構造を形成する４種類の一本鎖ＲＮＡを転写する。これらの一本鎖ＲＮＡは細胞内でそれぞれ配列番号１、４、７、１０の塩基配列を標的とする、野生型ＴＣＲα鎖及び野生型ＴＣＲβ鎖遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを生成する。野生型とコドン変換型の塩基配列がコードするアミノ酸配列は共通であるが、コドン変換型ＴＣＲの塩基配列には変異が導入されているので、配列番号１３記載のＤＮＡより転写される二本鎖ｓｉＲＮＡによりコドン変換型ＴＣＲの発現は抑制されない。

実施例２　コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製
　まず、ｐＭＳＣＶｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型にＰＣＲを行い、配列番号１４に示すＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位を増幅した。また、インフォームドコンセントの得られたヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）よりＦａｓｔＰｕｒｅ　ＤＮＡ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、そのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び配列番号１６に示すプライマーにてＰＣＲを行い、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含む領域を増幅した。更に、配列番号１７に示すＴ２Ａペプチド配列を含む人工合成遺伝子を作製した。図１に示すようにＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含む領域、及び実施例１にて作製したコドン変換型のヒト抗ＷＴ１　ＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子を含む核酸断片とＴ２Ａペプチド配列をコードする人工遺伝子をレンチウイルスベクターｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α　Ｎｅｏ（タカラバイオ社製）のＣｌａＩ－ＮｏｔＩ消化産物に挿入した。すなわち、ベクターのｃＰＰＴ配列とＷＰＲＥ配列の間に、２Ａペプチドによりポリシストロニックに連結したコドン変換型ＷＴ１特異的ＴＣＲα鎖とβ鎖遺伝子がＭＳＣＶ　ＬＴＲ　Ｕ３プロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡ断片を挿入したｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＡ）を作製した。また、ＭＳＣＶ　ＬＴＲ　Ｕ３プロモーターとコドン変換型ＷＴ１特異的ＴＣＲ遺伝子の間に、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含む領域を挿入したｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＢ）を作製した。

実施例３　コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
　実施例１で合成した４種類のｓｉＲＮＡを生成する人工遺伝子を、図１に示すように、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＢ）のコドン変換型ＷＴ１特異的ＴＣＲα及びβ鎖遺伝子と３’ＬＴＲの間に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ（ベクターＣ）を作製した。

実施例４　レトロウイルス溶液の作製
　プラスミドベクターｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＡ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＢ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ（ベクターＣ）により大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持するプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてそれぞれ精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして以下の操作に供した。
　調製したｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＡ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＢ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＷＴ１－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ（ベクターＣ）プラスミドのそれぞれと、Ｌｅｎｔｉ－ＸＨＴＸ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）及びＬｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ＶＳＶＧエンベロープを持つレンチウイルスを含有する３種の上清液を獲得した。上清液を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ　ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ウイルス溶液を調製した。

実施例５　ヒトＰＢＭＣへのコドン変換型ＴＣＲ及びコドン変換型ＴＣＲ－ｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染１
　インフォームドコンセントの得られたヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例４で作製したウイルス溶液を、プロタミンを用いた標準的な方法で２回感染させた。２回目のウイルス感染８日後に細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩ処理を行った。得られた全ＲＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いたｃＤＮＡ合成を行った。更に、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラバイオ社製）及び配列番号１８、１９の野生型ＴＣＲα鎖遺伝子増幅用プライマー、配列番号２０、２１の野生型ＴＣＲβ鎖遺伝子増幅用プライマー、配列番号２２、２３のコドン変換型ＴＣＲα鎖遺伝子増幅用プライマー、配列番号２４、２５のコドン変換型ＴＣＲβ鎖遺伝子増幅用プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを行い、各遺伝子発現量を測定してその相対値を算出した。全ＲＮＡ量の補正は配列番号２６、２７のＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーを用いたＧＡＰＤＨ遺伝子の測定値に基づいて行った。

　ネガティブコントロールとしてベクターを導入しなかったＰＢＭＣを用意して前記同様に遺伝子発現量を測定した。そして、当該細胞の野生型ＴＣＲα鎖、野生型ＴＣＲβ鎖の遺伝子発現の相対値に基づき、各実験群での遺伝子発現の相対値の割合を算出することによって、野生型ＴＣＲ遺伝子の抑制効果を評価した。図２に結果を示す。図中、縦軸はベクターを導入しなかったネガティブコントロールを１００とした時の遺伝子の発現量の相対値を示す。横軸は、導入したレトロウイルスベクターを示す。図２に示されるように、コドン変換型ＴＣＲを導入したＰＢＭＣ（ベクターＡ及びベクターＢ）は、野生型ＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子の発現は抑制されないが、コドン変換型ＴＣＲ遺伝子及びｓｉＲＮＡを共発現するＰＢＭＣ（ベクターＣ）は、野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現は抑制された。
　また、ベクターＡを導入した細胞のコドン変換型ＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子発現の相対値に基づき、各実験群での遺伝子発現の相対値の割合を算出することによって、導入したコドン変換型ＴＣＲ遺伝子の発現量を比較した。図３に結果を示す。図中、縦軸はベクターＡを導入したＰＢＭＣにおける発現量を１００とした時の遺伝子の発現量の相対値を示す。横軸は、導入したレトロウイルスベクターを示す。図３に示されるように、導入したコドン変換型ＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子の発現量は、外来の、すなわちＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含むベクターＢは、ＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含まないベクターＡと比較して、１．５倍から２倍高かった。

実施例６　ヒトＰＢＭＣへのコドン変換型ＴＣＲ及びコドン変換型ＴＣＲ－ｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染２
　実施例５と同様に、２回目のウイルス感染８日後に細胞を回収した。ＨＬＡ－Ａ２４０２　ＷＴ１　テトラマー－ＰＥ（ＭＢＬ社製）及びＦＩＴＣ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８　抗体（べクトンディッキンソン社製）により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合及びＰＥの平均蛍光強度を測定した。また、２回目のウイルス感染３日後に細胞を回収し、ＦａｓｔＰｕｒｅ　ＤＮＡ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ，Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）とＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）及びＬｅｎｔｉ－Ｘ　Ｐｒｏｖｉｒｕｓ　Ｑｕａｑｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定を行った。図４及び図５にこれらの結果を示す。図中、横軸はウイルスコピー数を示し、縦軸は、ＷＴ１テトラマー陽性細胞率（図４）及びＷＴ１テトラマー陽性細胞の平均蛍光強度（図５）を示す。なお、図５の平均蛍光強度はＷＴ１テトラマー陽性細胞における、抗ＷＴ１　ＴＣＲの発現量を反映している。図４及び図５に示すように、ＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含むベクターＢは、ＳＤ及びＳＡ配列が挿入されていないベクターＡと比べて、低いウイルスコピー数でより高いＷＴ１テトラマー陽性細胞率が得られ、また、前記テトラマー陽性細胞由来の蛍光の平均強度も高かった。更に、ＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及び野生型ＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子に対するｓｉＲＮＡ生成配列を含むベクターＣは、実施例５の図３に示すように、導入したコドン変換型ＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子の発現がベクターＡ及びベクターＢと比べて低いにもかかわらず、より低いウイルスコピー数でより高いＷＴ１テトラマー陽性細胞率が得られ、また、前記テトラマー陽性細胞由来の蛍光の平均強度も高かった。すなわち、ｓｉＲＮＡを生成する配列をコードする核酸を導入した細胞においてコドン変換型ＴＣＲのα／β複合タンパク質の発現率及び発現強度の増強が見られた。

実施例７　コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製（ＷＴ１）
　実施例２と同様に、ＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位及びＴ２Ａペプチド配列をコードする人工合成遺伝子を調製し、ＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位、及び実施例１にて作製したコドン変換型のヒト抗ＷＴ１　ＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子を含む核酸断片とＴ２Ａペプチド配列をコードする人工合成遺伝子をレンチウイルスベクターｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α　Ｎｅｏ（タカラバイオ社製）のＣｌａＩ－ＮｏｔＩ消化産物に挿入した。すなわち、ベクターのｃＰＰＴ配列とＷＰＲＥ配列の間に、２Ａペプチドによりポリシストロニックに連結したコドン変換型ＷＴ１特異的ＴＣＲβ鎖とα鎖遺伝子がＭＳＣＶ　ＬＴＲ　Ｕ３プロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡ断片を挿入したｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクターＤ）を作製した（図６）。

実施例８　コドン変換型ヒトＴ細胞受容体α及びβ遺伝子の作製（ＭＡＧＥ－Ａ４）
　国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレット（出典明示により本明細書の一部とする）に記載の方法に従い、コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４　ＴＣＲα鎖遺伝子を、野生型の遺伝子を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の制限酵素ＫｐｎＩ－ＸｈｏＩサイトにクローニングした。
　同様に、コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４　ＴＣＲβ鎖遺伝子を、野生型の遺伝子を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔの制限酵素ＫｐｎＩ－ＸｈｏＩサイトにクローニングした。

実施例９　コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製（ＭＡＧＥ－Ａ４）
　実施例２と同様に、ＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位及びＴ２Ａペプチド配列をコードする人工合成遺伝子を調製し、ＭＳＣＶ　Ｕ３プロモーター部位、及び実施例８にて作製したコドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４　ＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子を含む核酸断片とＴ２Ａペプチド配列をコードする人工合成遺伝子をレンチウイルスベクターｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α　Ｎｅｏ（タカラバイオ社製）のＣｌａＩ－ＮｏｔＩ消化産物に挿入した。すなわち、ベクターのｃＰＰＴ配列とＷＰＲＥ配列の間に、２Ａペプチドによりポリシストロニックに連結したコドン変換型ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲβ鎖とα鎖遺伝子がＭＳＣＶ　ＬＴＲ　Ｕ３プロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡ断片を挿入したｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター１Ａ）を作製し、それらのＴＣＲα鎖とβ鎖遺伝子を入れ替えたｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター１Ｂ）を作製した（図７）。また、それぞれのベクターのＭＳＣＶ　ＬＴＲ　Ｕ３プロモーターとＴＣＲ遺伝子の間に、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ及びＳＡ配列を含む領域を挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター２Ａ）及びｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター２Ｂ）を作製した（図７）。

実施例１０　コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
　実施例１で合成した４種類のｓｉＲＮＡを生成する人工遺伝子を、ベクター２Ａおよび２Ｂのコドン変換型ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子と３’ＬＴＲの間に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター３Ａ）およびｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター３Ｂ）を作製した（図７）。

実施例１１　レトロウイルス溶液の作製
　実施例２および実施例７にて作製したプラスミドベクターｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ（ベクターＡ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＷＴ１－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクターＤ）、および実施例９、１０により作製したプラスミドベクターｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター１Ａ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター１Ｂ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター２Ａ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター２Ｂ）およびｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ－ａ２Ａｂ（ベクター３Ａ）、ｐＬＶＳＩＮ－ＭＳＣＶＵ３―ＥＦ１－ＭＡＧＥ－Ａ４－ＴＣＲ－ｌｏｏｐ―ｓｉＴＣＲ－ｂ２Ａａ（ベクター３Ｂ）を用いて、実施例４と同様の方法でウイルス溶液を調製した。

実施例１２　ヒトＰＢＭＣへのコドン変換型ＴＣＲレトロウイルスベクターの感染（ＷＴ１）
　インフォームドコンセントの得られたヒト末梢血より分離したＰＢＭＣに、実施例１１で作製したＷＴ１特異的ＴＣＲ発現ウイルス溶液（ベクターＡ又はベクターＤ）を、プロタミンを用いた標準的な方法で１回感染させた。ウイルス感染８日後に細胞を回収した。実施例６と同様の方法により、ＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合、ＰＥの平均蛍光強度及びゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定を行った。図８にこれらの結果を示す。図中、横軸はウイルスコピー数を示し、縦軸は、ＷＴ１テトラマー陽性細胞率（図８左）及びＷＴ１テトラマー陽性細胞の平均蛍光強度（図８右）を示す。なお、図８の平均蛍光強度はＷＴ１テトラマー陽性細胞における、抗ＷＴ１　ＴＣＲの発現量を反映している。図８に示すように、ＷＴ１特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクターＤは、α鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクターＡと比べて、より低いウイルスコピー数で同程度のＷＴ１テトラマー陽性細胞率及び前記テトラマー陽性細胞由来の蛍光の平均強度が得られた。すなわち、ＴＣＲβ鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクターＤにより遺伝子導入した細胞は、α鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクターＡにより遺伝子導入した細胞と比べて、ＴＣＲのα／β複合タンパク質の発現率及び発現強度の増強が見られた。

実施例１３　ヒトＰＢＭＣへのコドン変換型ＴＣＲ及びコドン変換型ＴＣＲ－ｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染（ＭＡＧＥ－Ａ４）
　インフォームドコンセントの得られたヒト末梢血より分離したＰＢＭＣに、実施例１１で作製したＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ発現ウイルス溶液（ベクター１Ａ～ベクター３Ｂ）を、プロタミンを用いた標準的な方法で１回感染させた。ウイルス感染６日後に細胞を回収し、実施例６と同様にゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定を行った。また、２回目の感染後８日後に細胞を回収し、実施例６と同様の方法により、ＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合及びＰＥの平均蛍光強度を測定した。図９にベクター１の結果、図１０にベクター２の結果、図１１にベクター３の結果を示す。図中、横軸はウイルスコピー数を示し、縦軸は、テトラマー陽性細胞率（図９左、図１０左、図１１左）及びＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー陽性細胞の平均蛍光強度（図９右、図１０右、図１１右）を示す。なお、図９、１０、１１の平均蛍光強度はＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー陽性細胞における、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲの発現量を反映している。図９、１０、１１に示すように、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクター１Ｂ、２Ｂ、３Ｂは、α鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクター１Ａ、２Ａ、３Ａと比べて、より低いウイルスコピー数でより高いＭＡＧＥ－Ａ４テトラマー陽性細胞率が得られ、また、前記テトラマー陽性細胞由来の蛍光の平均強度も高かった。すなわち、ＴＣＲβ鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクター１Ｂ、２Ｂ、３Ｂにより遺伝子導入した細胞は、α鎖遺伝子が２Ａペプチドの上流に挿入されたベクター１Ａ、２Ａ、３Ａにより遺伝子導入した細胞と比べて、コドン変換型ＴＣＲのα／β複合タンパク質の発現率及び発現強度の増強が見られた。

SEQ ID NO:1: A part of wild type TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:2: A part of codon modified TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:3: A part of TCR alpha chain amino acid sequence
SEQ ID NO:4: A part of wild type TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:5: A part of codon modified TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:6: A part of TCR alpha chain amino acid sequence
SEQ ID NO:7: A part of wild type TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:8: A part of codon modified TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:9: A part of TCR beta chain amino acid sequence
SEQ ID NO:10: A part of wild type TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:11: A part of codon modified TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:12: A part of TCR beta chain amino acid sequence
SEQ ID NO:13: siRNA generating sequence for wild type TCR genes
SEQ ID NO:14: MSCV U3 promoter region.
SEQ ID NO:15: EF1 alpha SD/SA amplification primer
SEQ ID NO:16: EF1 alpha SD/SA amplification primer
SEQ ID NO:17: T2A peptide coding sequence
SEQ ID NO:18: wild type TCR alpha chain amplification primer F
SEQ ID NO:19: wild type TCR alpha chain amplification primer R
SEQ ID NO:20: wild type TCR beta chain amplification primer F
SEQ ID NO:21: wild type TCR beta chain amplification primer R
SEQ ID NO:22: codon modified TCR alpha chain amplification primer F
SEQ ID NO:23: codon modified TCR alpha chain amplification primer R
SEQ ID NO:24: codon modified TCR beta chain amplification primer F
SEQ ID NO:25: codon modified TCR beta chain amplification primer R
SEQ ID NO:26: GAPDH amplification primer F
SEQ ID NO:27: GAPDH amplification primer R

Claims

　５’末端から順に、
（ａ）レトロウイルス由来の５’ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）配列、
（ｂ）レトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列（ψ）、
（ｃ）プロモーター配列、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）配列、
（ｅ）スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、
（ｆ）所望の遺伝子の配列、
（ｇ）Ｕ３領域に変異を導入してプロモーター活性を欠失させたレトロウイルス由来の３’ＬＴＲ配列、
の各配列の核酸を含み、（ｄ）のＳＤ配列及び（ｅ）のＳＡ配列のうち少なくとも１つが（ｃ）のプロモーター配列と異なる遺伝子由来であることを特徴とするレトロウイルスベクター。
　所望の遺伝子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする遺伝子である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
　所望の遺伝子がポリシストロニックに連結したＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖をコードする遺伝子である請求項２記載のレトロウイルスベクター。
　プロモーター配列がレトロウイルスのＬＴＲ　Ｕ３領域由来である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
　プロモーター配列がマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）のＬＴＲ　Ｕ３領域由来である請求項４記載のレトロウイルスベクター。
　ＳＤ配列及びＳＡ配列が哺乳動物遺伝子由来の配列である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
　レトロウイルスがオンコレトロウイルス又はレンチウイルスである請求項１記載のレトロウイルスベクター。
　請求項１～７のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法。
　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である請求項８記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
　請求項１～７のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターが導入された遺伝子導入細胞。
　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である請求項１０記載の遺伝子導入細胞。