JP2000514284A

JP2000514284A - Ｓａｒエレメントを有するベクター

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Publication number: JP2000514284A
Application number: JP10500241A
Authority: JP
Inventors: アガールウオル・マニュ; プラヴェック・イヴァン; ベレス・ゲイバー
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト; システミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2000-10-31
Also published as: IL127215A0; CA2256484A1; NZ333188A; AU3256297A; US20020103148A1; AU718551B2; US6194212B1; EP0914444A1; WO1997046687A1

Abstract

(57)【要約】スカフォールド付着領域は、形質導入された細胞における遺伝子発現を増大させること、及び、従ってそれは、例えば、遺伝子治療法において有用であることが示された。

Description

【発明の詳細な説明】ＳＡＲエレメントを有するベクター技術分野本発明は、初代非増殖細胞、即ち、休止細胞（resting cells）における遺伝子発現を増大させる為の、スカフォールド付着領域（ＳＡＲｓ）の使用に関する。背景技術真核細胞の染色体は、別々の複数のクロマチンドメインに組織されており、それら各ドメインはその内の遺伝子の調和した発現に必要な全てのシス調節（cis- regulatory）エレメントを含有する独立した単位を規定するものと考えられている。これらのクロマチンドメインは、核スカフォールド、又は核マトリックスと特異的に結合する配列によって囲まれて（区切られて）おり、これらの配列によってクロマチンドメインの境界が規定されている。このような配列はスカフォールド付着領域（ＳＡＲｓ）又はマトリックス付着領域（ＭＡＲ）と呼ばれている。ＳＡＲエレメントは数百塩基対の長さであり、Ａ／Ｔに富む(≧７０％)。クローンニングされたＳＡＲ及びＭＡＲエレメントは共通の構造的特徴を共有しているが、未だ、いずれの共通（コンセンサス）配列は同定されていない。ＳＡＲｓは、遺伝子（イントロン）の上流若しくは下流、又は遺伝子の内部に位置しており、それらは機能的に別個のクラスを代表しているものと示唆される(Bode J et al.，1995 Academic Press Orlando，スカフォールド／マトリックス付着領域(Ｓ／ＭＡＲ)：転写活性部位を生み出す構造的特徴)。ＳＡＲエレメントは、インビトロ及びトランスジェニックマウスにおけるトランスフェクション実験で異種遺伝子(heterologous gene)の発現を増大させることが出来る。幾つかの場合には、ＳＡＲエレメントは結合した導入遺伝子に対して位置に関係ない(position-independent)発現を付与することが出来る、ことが報告されている。トランスフェクションされたＤＮＡは染色体内にランダムに組み込まれるが、レトロウイルスによる組み込みは完全にはランダムではない、という証拠が得られつつある(Shih，C．C．1988 Cell 53,531-537,Rohdewohld，H et al.,1987 J ．Virol．61,336-343,及びMielke，C et al 1996 Biochemistry 35，2239-2252) 。注目すべきは、プロウイルスは宿主のＳＡＲ配列(Mielke，C．et al．996)及びＤＮａｓｅＩ消化に感受性であることによって特徴づけられる”オープン”なクロマチン(Rohdewohld，H et al．1987)に優先的に組み込まれる。我々の経験によれば、休止細胞での遺伝子発現の調節は増殖細胞のそれとは反対で異なるものである。形質導入された遺伝子の遺伝子発現は休止（すなわち、有糸分裂的に活性（mitotically active）でない）細胞では、活性な細胞に比べて著しく減少している。休止細胞におけるこのような低発現は、インビボでの発現が要求されるようなとき、例えば、遺伝子治療においては問題となる。何故ならば、如何なる任意の時点においても、体内の殆どの細胞は、細胞培養における殆どの細胞とは異なり、休止状態(quiescent state)にあるからである。従って、現在では異種遺伝物質（外来遺伝子）の通常の休止細胞内への組み込みを可能にし増大させる為に利用できる方法はあるが、このような細胞において異種遺伝物質の発現を増大させる為の方法は現時点では未だ確立されていない。発現における差異は、必要な転写因子の量が限られていること、又は特異的プロモーター／エンハンサーエレメントによって制御されていることに因るものと考えることができるかもしれない。しかしながら、本発明研究者によれば、このような休止細胞と増殖細胞における発現の差異は、ＤＮＡＳＡＲｓに媒介されるクロマチン構造における変化に大きく依存していることが示唆された。本明細書において、「ＳＡＲ」という用語は、スカフォールド付着領域及びマトリックス付着領域を包合するものと理解されたい。発明の開示本発明者は、形質導入された、特にレトロウイルスによって形質導入された真核細胞の休止初代(primary)細胞における異種遺伝子の発現を、ＳＡＲｓが増大させることを発見した。ＳＡＲ配列は形質導入されたセルラインにおけるレトロウイルスベクター発現に対しては検出可能な影響は与えない。対照的に、休止初代Ｔ細胞において、ＳＡＲ含有ベクターはコントロールと比較して、極めて高いレベルで発現する。例えば、本発明者はレトロウイルスによって形質導入された休止初代Ｔ細胞において、ＳＡＲは異種遺伝子の発現を、該遺伝子を発現する細胞の割合（パーセンテージ）及び細胞当たりの発現レベルの両方の点で、顕著に増大させることを示した。これは、ＳＡＲ及びシスの異種遺伝子のレトロウイルスが媒介する(mediated)形質導入によって、が該遺伝子の発現が改良されたことの最初の報告であり、ＳＡＲ及び異種遺伝子の共形質導入(co-transduction)によって休止初代細胞において該遺伝子の発現が促進されたことの最初の報告である。本発明で使用するのに適したベクターは、宿主の遺伝物質(genetic material) への組み込みを引き起こせる能力に基づいて選択される。従って、モロニーＣ型のようながんウイルス及びレンチウイルス等のレトロウイルスが本発明の目的に適している。本発明は、相同組み換え又は人工ヒト染色体を用いてＤＮＡを導入することによって行うことも出来る。本発明は従って、第一の態様として、（ｉ）例えば、形質導入された細胞の休止子孫（progeny）を含む休止細胞のような、形質導入された細胞における異種遺伝子の発現を増大させる為のＳＡＲの使用；（ｉｉ）例えば、非不死化（non-immortal）細胞のような細胞に、（ｉ）異種遺伝子及び（ｉｉ）一つ又はそれ以上のＳＡＲｓを形質導入することから成る、休止細胞における異種遺伝子の発現を増大させる方法、を提供する。本発明で使用するＳＡＲはそれ自体は転写され翻訳されて蛋白質を発現するのではなく、又、遺伝子に対するプロモーター又はエンハンサーでもない。その遺伝子発現に対する効果は殆どの場合に位置に無関係(position- independent)である。「位置に無関係」とは、ＳＡＲはベクター内に位置し、遺伝子の移入及び発現に必要な機能を破壊するような位置にはない、例えば、ＳＡＲは必須のＬＴＲ機能を妨害（block）するような場所には挿入されない、というものと理解されたい。好ましくは、ＳＡＲは少なくとも４５０塩基対（ｂｐ）の長さ、更に好ましくは６００-１０００ｂｐ，例えば、約８００ｂｐである。ＳＡＲは好ましくはＡＴに富み(即ち、５０％より多く、好ましくは７０％より多い塩基がアデニン及びチミンである)、一般的には、例えば、３−２０ｂｐ，通常は８−１２ｂｐの長さのスペーサー配列によって隔てられた、例えば、ＡＴＴＡ，ＡＴＴＴＡ，ＡＴＴＴＴＡ，ＴＡＡＴ，ＴＡＡＡＴ，ＴＡＡＡＡＴ，ＴＡＡＴＡ，及び／又はＡＴＡＴＴＴのような反復４−６ｂｐモチーフを有するものである。ＳＡＲは、如何なる真核細胞、好ましくは哺乳細胞、最も好ましくはヒトから得られる。適当なＳＡＲは、ヒトインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）遺伝子又はその断片に対するＳＡＲ、例えば、好ましくはヒトＩＦＮ−βの５' ＳＡＲに対応するか又はそれに由来するＳＡＲ(Klehr，Detal.，Biochemistry 1 991，30，1264-1270：ヒトインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）からのスカフォールド付着領域は様々なプロモーターの制御下での遺伝子の安定的発現を増大させる為に使用出来る)、例えば、少なくとも４５０ｂｐの長さの断片、好ましくは６００−１０００ｂｐ、例えば、約８００ｂｐであり、ヒトＩＦＮ−βの５ 'ＳＡＲの対応する部分に実質的に相同であるもの、例えば、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％が該部分と相同であるものである。本発明におけるＳＡＲとして使用するのに特に好適なものは、ＩＦＮ− βの５'ＳＡＲエレメントの８００ｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII（平滑末端）断片である(Mielke，C et al.，Biochemistry 1990 29:7475-7485)。本発明は更に、以下の態様を提供する。 (i)(a)少なくとも一つのＳＡＲ、及び(b)発現調節（制御）配列に機能的に(oper atively)結合した少なくとも一つの異種遺伝子、に対応する遺伝物質を含むレトロウイルスベクターであって、該異種遺伝子（又は、一つ以上の異種遺伝子がある場合には少なくとも一つの異種遺伝子）はｒｅｖ−Ｍ１０であり、ＳＡＲ又は少なくとも一つのＳＡＲがヒトＩＦＮ−β遺伝子の５'ＳＡＲに由来するか、それから得られ得るか、又はそれに対応するもの； (ii)(i)のレトロウイルスベクターで形質導入されたパッケージングセルライン；及び (iii)(i)のレトロウイルスベクターで形質導入された非不死化真核細胞（好ましくは哺乳動物、例えばヒト細胞）を含む細胞組成物。以後、本明細書において、上記(i)，(ii)及び(iii)は、夫々、本発明レトロウイルスベクター、本発明パッケージングセルライン及び本発明細胞組成物と呼ぶことにする。好ましくは、本発明レトロウイルスベクターは両種指向性レトロウイルスベクター、更に好ましくは長い末端反復（long terminal repeat）を有することで特徴づけられるベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭＬＶ)、骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)、マウス胎児幹細胞ウイルス(ＭＥＳＶ)、マウス幹細胞ウイルス(ＭＳＣＶ )、又は脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）である。好ましくは、本発明のベクター(ii)の場合には、レトロウイルスｇａｇ，ｐｏｌ，及び／又はｅｎｖ配列の代わりに発現すべき遺伝子を用いる。適当なコントロール発現配列は、使用する宿主細胞に基づいて、当業者の知識の範囲で選択される。調節エレメントの例として、転写プロモーター又はエンハンサー又はＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写誘導性(transcription inducibli ty)を付与する配列であり、選択マーカーを発現ベクターに組み込むことも出来る。遺伝子の発現を調節するプロモータには、例えば、ウイルスＬＴＲ、例えば、ＭｏＭＬＶＬＴＲ、組織特異的プロモーター又は誘導プロモーターがある。好ましくは、構築物には、レトロウイルスｇａｇ，ｐｏｌ，及び／又はｅｎｖ配列が欠けており、ｇａｇ，ｐｏｌ，及び／又はｅｎｖ機能は、パッケージングセルラインによって、トランスで付与されなければならない。即ち、ベクター構築物がパッケージングセルラインに導入されたときに、該セルラインによって生産されたｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖ蛋白質がベクターＲＮＡと集合して、複製不可能な(replication-defectve)、形質導入ビリオンを生産し、それは培地に分泌される。このようにして生産されたウイルスは標的細胞に感染してそのＤＮＡ内に組み込まれるが、必須のウイルス配列を欠いているために一般的には感染性ウイルス粒子は生じない。特に好適なベクター構造は、以下の一般構造１型、２型又は３型である。１型：５' ＬＴＲ−Ｘ−ＳＡＲ−ｍ−ＬＴＲ３'；２型：５' ＬＴＲ−Ｘ−ｍ−ＳＡＲ−ＬＴＲ３'；３型：５' ＬＴＲ−Ｘ−ｍ−ＬＴＲ／ＳＡＲ３'；ここで、ＬＴＲは長い末端反復(longt erminal repeat)、Ｘは所望の蛋白質に対する遺伝子で好ましくはｒｅｖＭ１０、ｍはマーカー、ＳＡＲはスカフォールド／マトリックス付着領域、好ましくは以下に記載するようなｈＩＦＮβＳＡＲＮ及びＬＴＲ／ＳＡＲはＳＡＲがその中に組み込まれた長い末端反復、例えば、更に本明細書で記載されているＬＭＳＩＬｙ（ＬＭＳｉＬｙ）又はＬＭＩＬｙ２Ｓ（ＬＭｉＬｙ２Ｓ）ベクターである。或いは、ベクターは対象となる遺伝子及び一つ又はそれ以上のＳＡＲエレメントのみを含有する。３型ベクター構造において、ＳＡＲエレメントはベクター３'ＬＴＲに組み込まれ、それによって５'ＬＴＲ内にそれがコピーされるので、その結果、ＳＡＲエレメントのコピーを二つ有するベクターが生じる。或いは、ＳＡＲの二つのコピーをアレンジして（５'）ＬＴＲ−Ｘ−ＳＡＲ−ｍ−ＳＡＲ−ＬＴＲ（３'）構造を有するベクターを作成する。単一ＳＡＲ系におけるＳＡＲは、３'ＬＴＲの上流に置かれる。特に好適な系は、ＳＡＲが３'位置（３'ＬＴＲの上流）にあり逆方向(reverse orientati on)の単一コピーである系である。ＳＡＲの方向、即ち、順方向(forward orient ation)か逆方向かは重要である。異種遺伝子の発現を増大させ為に、ＳＡＲはベクター中で逆方向に置かれるべきである。順方向におかれたＳＡＲは発現を減少調節（down-regulation）してしまう。この減少調節効果は単一ＳＡＲ−二つのプロモーター系、例えば複数遺伝子系の中の一つの遺伝子を発現を低くしたい場合には有効である。パッケージングセルラインは好ましくは、ｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖをコードする別個のプラスミドによってトランスフェクションされているので、複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）が生産されるには複数の組み換え事象が必要である。適当なレトロウイルスベクターパッケージングセルラインには、マウスＮＩＨ／３Ｔ３セルラインに基づくもの及びＰＡ３１７(Miller et al ．1986 Mol．Cell Biol．6:2895;Miller et al．1989 Biotechniques 7:980) 、ＣＲＩＰ（Danos et al．1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460)、及びｇｐ＋ａｍ１２(Markowitz et al．1988 Virology 167:400)、更には、ヒト２９３細胞又はサルＣＯＳ細胞に基づくセルライン、例えば、ＰｒｏＰａｋＡパッケージングセルで、例えば、Pear et al．1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8392-8396 ;Rigg et al．1996 Virology 218;Fineer et al．1994 Blood 83:43-50;Landau ，et al．1992 J．Virol.66:5110-5113)がある。レトロウイルスベクターＤＮＡはパッケージングセルに、安定的又は過渡的トランスフェクションによって導入され、レトロウイルスベクター粒子を生産する。レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによって感染される宿主細胞の範囲は、一般的にウイルスのｅｎｖ蛋白質によって決定される。パッケージング細胞（セル）から生産された組換えウイルスは、該パッケージング細胞によって提供されるｅｎｖ蛋白質が認識する事実上如何なる型の細胞をも感染させる為に使用することが出来る。感染によって、ウイルスゲノムが形質導入された細胞内に組み込まれ、その結果、外来性遺伝子産物の安定的な発現が行われる。感染効率は、標的細胞上での受容体の発現レベルにも関連する。一般的には、ＭｏＭＬＶのマウス同種指向性ｅｎｖは齧歯類細胞に感染出来る一方で、両指向性ｅｎｖは、齧歯類、鳥類、ヒトを含む幾つかの霊長類の細胞に感染する。異種指向性ベクター系はマウス異種指向性ｅｎｖを利用し、これも同様にヒトへの感染が可能である。レトロウイルスベクターの宿主範囲は、基本となるウイルスのｅｎｖ蛋白質を二番目のウイルスのそれと置換することによって変化させることが可能である。この結果得られる偽型ウイルスは、エンベロープ蛋白質を支配し、パッケージング細胞によって発現されるウイルスの宿主範囲を有する。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）由来のＧ−糖蛋白質でＭＭＬＶｅｎｖ蛋白質を置換することによって、宿主範囲を拡大することが出来る。好ましくは、本発明のベクター及びパッケージング細胞（セルライン）はヒト細胞の形質導入に適するように採用される。「異種遺伝子」とは、天然のレトロウイルス遺伝子ではないが、プロモーターの調節（制御）下で適当に該ベクター内に挿入されて、形質導入されるべき細胞内で発現されるものを意味する。異種遺伝子は発現が望まれる遺伝子であれば如何なるでもかまわない。例えば、ウイルス又はレトロウイルス（例えばＨＩＶ）複製に干渉（妨害）する蛋白質をコードする遺伝子、例えば、Ｒｅｖ−Ｍ１０遺伝子（例えば、ＷＯ９０／１４４２７、及びEscaich et al．Hum.Gene Ther．19 95，6:625-634に記載されたもの）である。本発明方法で使用する真核細胞は、非不死化ヒト細胞である。「非不死化(non -immortal)ヒト細胞」とは、細胞培養において僅かの分裂回数しか増殖できないヒト細胞、又はインビボにおいて成熟(maturation)若しくは分化(differentiati on)を経たヒト細胞、例えば、非癌性初代細胞を意味する。適当な細胞の型としては、分化又は活性化を経て、インビボで停止状態になるもの、例えば、造血細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチン細胞等である。従って、本発明は、休止（非増殖）真核初代細胞中での遺伝子発現を増大させる目的でＳＡＲを使用することを包含するものであり、ここで、「休止細胞」とは以前には活性であったが現在は休止している細胞を含むものである。上記細胞は好ましくは、非癌性造血細胞、例えば、ＣＤ３４＋／Ｔｈｙ−１＋細胞のような造血幹細胞、又はＣＤ４＋等の末梢血リンパ球若しくは胸腺細胞のような成熟造血細胞である。遺伝子治療とは、インビボで異種の遺伝物質を発現する細胞を使用することから成る治療方法である。必須の蛋白質の発現に欠陥によって特徴付けられる先天性遺伝疾患（例えば、ＡＤＡ−疾患(ＳＣＩＤ)、血友病Ａ又はＢ、ゴーシュ病等）を治療する場合には、遺伝物質は正常蛋白質の遺伝子である。或いは、遺伝子は、防御蛋白質(protective protein)の遺伝子、例えば、高用量化学療法に対して防御する蛋白質の遺伝子(例えば、ＭＤＲ−１)、又は、ウイルス若しくはレトロウイルス感染に対して防御する蛋白質の遺伝子(例えば、ｒｅｖ−Ｍ１０)，又は、防御ＲＮＡ、例えば、ウイルス若しくはレトロウイルス感染に対して防御することの出来るリボザイム若しくはアンチセンス配列をコードする。遺伝子療法は、インビボ(in vivo)、例えば、ベクターを患者に投与して、標的細胞にその場で形質導入するか、又は、エキソビボ(ex vivo)、例えば、インビトロで所望の細胞に形質導入し、該形質導入された細胞を患者に戻す(例えば、個人から治療すべき細胞を除去し(取り出し)、分離し、所望遺伝子を形質導入し、その後に患者に戻す操作)。末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）は、ＳＣＩＤ−ＡＤＡ疾患及びＨＩＶ病のような免疫疾患に対する遺伝子治療法における標的細胞として用いられてきた。現在では、レトロウイルスベクターが遺伝子移入方式（手段）として選ばれているが、それは主に、標的細胞の染色体内にレトロウイルスによって組み込まれた遺伝子は、継続的に導入遺伝子を発現するからである。ＰＢＬｓに対する効率的な遺伝子マーキングのプロトコールが開発されてきたが、初代Ｔ細胞内での導入遺伝子の発現調節に関しては未だ殆ど解明されていない。インビボにおいて、循環するＰＢＬｓの多くは休止状態にあり、モロニーマウス白血病ウイルス又はマウス胎児性幹細胞ウイルスに基づいた標準的なレトロウイルスベクターにコードされている遺伝子はこれらの細胞中では効率的に発現されない。初代Ｔ細胞中での導入遺伝子の発現を調節する因子は知られていないので、ＨＩＶ病等の或る種の疾患に対して、レトロウイルスを利用する遺伝子治療手段を非効率的なものにしている。更に本発明の態様として、 (i) 遺伝子治療を必要としている患者に対する遺伝子治療方法であって、該患者に、a）本発明の細胞組成物、又はb）本発明のレトロウイルスベクターを導入すること、から成る該方法； (ii) 治療又は予防用の用途、例えば、上記遺伝子治療方法における使用の為の細胞組成物； (iii) ＳＡＲ又は上記ベクターを上記細胞組成物の製造の為、又は上記遺伝子治療の為に使用すること。本発明の好適態様は、ＨＩＶ感染、例えば、ＨＩＶ−１感染で苦しむ患者の治療方法であって、患者から造血細胞（例えば、造血幹細胞、末梢血リンパ球、造血幹細胞由来のＣＤ４＋細胞又はＴ細胞）を除去し(取り出し)、分離し；該細胞に抗レトロウイルス蛋白質の遺伝子（例えば、ｒｅｖ−Ｍ１０）及びＳＡＲ（例えば、ヒトＩＦＮ−βの５'ＳＡＲに由来するか又はそれから得られ得るＳＡＲ）を形質導入し、そして該細胞を患者に戻す、ことから成る該方法、である。適宜、患者はＩＬ−２等のサイトカイン又は増殖因子との共治療、及び／又はＡＺＴ、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤等の抗ＨＩＶ薬剤との共治療を受けることも可能である。ＰＢＬ又は胸腺から分離された成熟Ｔ細胞は通常は休止状態（即ち、有糸分裂的に不活性）にある。フィトメガグルチニン（ＰＨＡ）及び同種支持細胞のような種々の刺激剤、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体にインビトロで暴露されると、これらの細胞は活性化され、増殖を開始する。Ｔ細胞の活性化状態はＣＤ２５抗原（ＩＬ−２受容体α鎖）の発現を測定することで決めることが出来る。ＣＤ２５発現は休止細胞では低く、活性化細胞では高い状態に調節される。最初の活性化後に、Ｔ細胞は数回の分裂を経て非活性化状態に戻り、それと同時にＣＤ２５抗原の発現は低い状態に調節される。図面の簡単な説明図１は、実施例における具体的なレトロウイルスベクターの模式的例を示す。レトロウイルスベクターの名前は左側に示されている。ベクターは正確な尺度で表されてはいない。ＬＴＲはマウス白血病ウイルスの長い末端反復（long terminal repeat）;ＭＰＳＶは骨髄増殖性肉腫ウイルスＬＴＲ；ＭＥＳＶはマウス胎児幹細胞ウイルスＬＴＲ；ＳＡＲはスカフォールド又はマトリックス付着領域；ＩＲＥＳは内部リボソームエントリー（entry）部位；ＮＧＦｒは神経増殖因子受容体、を表す。図２は、刺激後１１日目のＣＤ２５^-細胞集団におけるレトロウイルスベクター発現を示す。図３Ａは、組み込まれたＬＭＩＬｙ２ＳプロウイルスＤＮＡ、及び５'及び３' ＬＴＲに存在するＳＡＲ配列を増幅させる為に使用したプライマーの位置を模式的に示す。図３Ｂは、休止状態のＬＭｉＬｙ２Ｓで形質導入されたＴ細胞である、Ｌｙｔ −２⁺及びＬｙｔ−２^-細胞の２種類にソートされた亜集団のＰＣＲ分析である。これらの二つの集団はＦＡＣＳを用いて分離され、半定量的ＰＣＲによってプロウイルスＤＮＡ中のＳＡＲ配列の存在について分析された。図４は、ＨＩＶ−１感染試験を示す。（Ａ）ＰＨＡ，ＩＬ−２及び支持細胞による刺激後５日目に初代Ｔ細胞を回収し、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦウイルスを接種した。細胞上清中のｐ２４抗原濃度を測定することによって、ウイルス複製を９日間にわたって監視した。（Ｂ）「５日目再刺激」試料を、新鮮なＰＨＡ，ＩＬ−２及び支持細胞でＨＩＶ−１接種後３日目に再刺激した。全ての値は三重(t riplicate)の試料の平均値であり、バーは標準誤差を示している。これが示されていない場合は、誤差はグラフプログラムの解像度以下である。図５は、初代休止Ｔ細胞定及び培養細胞におけるレトロウイルスＲＮＡの定常状態レベルに対するＳＡＲ形質導入の効果の比較を示す。図６は、ＬＭｉＬｙ形質導入ＣＥＭＳＳ細胞におけるＲｅｖＭ１０及びＬｙｔ −２蛋白質の発現を示している。（Ａ）ＲｅｖＭ１０及びＬｙｔ−２蛋白質の発現は相関している。形質導入ＣＥＭＳＳ細胞のノーザンブロット分析。形質導入された、Ｌｙｔ−２に富むＣＥＭＳＳ細胞集団からのＲＮＡをＲｅｖ特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して分析した(Plavec，I.，et al．1997 Gene Th erapy 7，128-139)。形質導入ベクターは上部に示されている。ＬΔＭｉＬｙはコントロールベクターであり、これはＲｅｖＭ１０蛋白質をコードしていない(P lavec，I.，et al．1997 Gene Therapy 7，128-139)。ゲノム転写物のサイズは矢印で示されている。（Ｂ）示されているベクターで形質導入されたＣＥＭＳＳ細胞及びモック（ｍｏｃｋ）形質導入されたコントロール細胞は抗Ｌｙｔ−２− ＰＥ抗体で染色され、４％パラホルムアレデヒドで固定され、そして抗Ｒｅｖ− ＦＩＴＣ抗体で染色された(Rigg，R.J.，etal.,1995 J.Immunol．Methods 188， 187-195)。この分析に使用した細胞は予めＬｙｔ−２発現に関して富むようにはされていなかった。Ｌｙｔ−２発現で測定されたこれら集団内の形質導入された細胞の画分は、ＬＭｉＬｙ及びＬΔＭｉＬｙベクターについて、それぞれ３０％及び２６％であった。図７は、形質導入セルライン内のＬＭｉＬｙ及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクター発現の間の比較を示している。ＣＥＭＳＳ（ヒトＣＤ４＋Ｔセルライン）及びＰＡ３１７（マウス繊維芽ライン）細胞は、ＬＭｉＬｙ及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクターによって形質導入され、免疫磁気ビーズを用いてＬｙｔ−２に富むようにした。細胞を抗Ｌｙｔ−２−ＰＥ抗体で染色し、ＦＡＣＳｓｃａｎで分析した。括弧内の数字はＬｙｔ−２陽性細胞のパーセンテージを示している。図８は、休止Ｔ細胞でＬＭｉＬｙ２Ｓベクターが効率良く発現されていることを示している。Ｌｙｔ−２に富み、ＬＭｉＬｙ及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクターによって形質導入されたＣＤ４＋初代Ｔ細胞はＰＨＡ，ＩＬ−２及び放射化同種支持細胞で活性化された。刺激後３日目及び１０日目に、細胞アリコートを抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ及び抗Ｌｙｔ−２−ＰＥ抗体で染色し、ＦＡＣＳｓｃａｎで分析した。数字はそれぞれのクアドラントにおけるＬｙｔ−２陽性細胞のパーセンテージを示している。バックグランド蛍光に対するゲート（基底）はコントロールイソタイプ抗体に基づいて定めた。Ｍｏｃｋはコントロール細胞と理解されたい。図９は、ＳＡＲ効果は方向に依存していることを示している。（Ａ）ＭＥＳＶ −ＭｉＬｙ，ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ，ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆ，ＬＭｉＬｙ及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクターで形質導入された、Ｌｙｔ−２に富むＣＤ４＋初代Ｔ細胞をＰＨＡ，ＩＬ−２及び放射化同種支持細胞で刺激した。導入遺伝子発現は刺激後、３，５，７，１０及び１２日目に図２の脚注に示されているように分析した。１２日目に、細胞を再刺激し(矢印で示す)、３日後に分析した(グラフ上の１５日目)。（Ｂ）休止Ｔ細胞のＣＤ２５⁺及びＣＤ２５^-画分におけるＬｙｔ−２⁺細胞のパーセンテージを刺激後１０日目で測定した。実施例１：ベクター構築物及びレトロウイルス生産細胞実施例１Ａ組み換えレトロウイルスベクターの構造を図１に示す。ＬＭＩＬｙ，ＭＥＳＶ −ＭＩＬｙ，ＭＰＳＶ−ＭＩＬｙ，Ｌ５８７−ＭＩＬｙ及びＬＭＳＩＬｙは、それらのＭｏＭＬＶ，ＭＥＳＶ，ＭＰＳＶ，ＭｏＭＬＶ／５８７及びＭｏＭＬＶ／ＳＡＲの一方の対応物から得られた。ｔｋＮｅｏ薬剤選択マーカーにわたるＸｈｏＩ（平滑末端）−ＣｌａＩ断片をＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＣｌａＩＩＲＥＳ−Ｌｙｔ−２断片と交換した。ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ−２は、Ｌｙｔ−２α'表面マーカー遺伝子(Tagawa，M．et al.，1986 Proc.Natl.Ac ad.Sci．USA 83:3422-3426)に結合した、ヒト脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）(Jang，S.K．et al.，J．Virol．63 :1651-1660)から成る。ＬＭＩＬｙ−２Ｓは８００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄI II（平滑末端）ＩＦＮ−βＳＡＲ断片（Klehr，D．et al.，1991 Biochemistry 30:1264-1210)をＬＸＳＮベクターの３'ＬＴＲにおけるＮｈｅＩ部位に挿入して、その後にＬＭＩＬｙの３'ＬＴＲをＬＸＳＮからのＳＡＲを含有する３'ＬＴＲに代えた。ＬΔＭＩＬＹ及びＬΔＭＩＬＹ−２Ｓは、メチオニン開始コドンを欠〈突然変異ＲｅｖＭ１０遺伝子（ΔＭ１０）を含有する(Escaich，S．et al．19 95 Hum．Gene Ther．6:625-634)。更に、５０ｂｐリンカー５'− （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）をΔＭ１０遺伝子（図１中の陰影を付したボックス）のＢｇｌII部位に挿入した。ＬＬｙＣＤ４Ｎベクターは、ＨｉｎｄIII−ＣｌａＩＬｙｔ−２遺伝子断片をＬＸＳＮのＥｃｏＲＩ部位(Miller，A.D．et al．1 989 BioTechniques 7:980-990)に挿入することで作成し、ＬＸＳＮのＳＶ４０− Ｎｅｏ断片を、ヒトＣＤ４プロモーター（１．１ｋｂ断片、Salmon，P．et al. ，1993 Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90:7739-7743）制御下のヒト神経増殖因子受容体（ＮＧＦｒ）ｃＤＮＡ(１．５ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片，Johnson， D．et al.，1986 Cell47:545-554)に代えた。レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡｓはＢＯＳＣ−２３細胞内にトランスフェクションさせた(Pear，W.S．et al.，1993 Proc.Natl:.Acad.Sci．USA 90:8392-8396)。トランスフェクションの４８時間後に、同種指向性レトロウイルスを含むＢＯＳＣ−２３上清を使用してＰＡ３１７細胞(Miller，A.D．et al.，1986 Molecular and Cellular Biology 6:2895-2 902)に接種した。形質導入に続いて、Ｌｙｔ−２を発現するＰＡ３１７細胞を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により濃縮し、プロデューサー細胞のプールを作成した。レトロウイルスベクター上清をForestell，S.P．et al.,1995 Gene Therapy 2:723-730に記載の方法で調製した。レトロウイルスベクター上清の形質導入効率はＮＩＨ３Ｔ３細胞に基づいて測定した。全てのプロデューサー細胞に関して、ＰＧ４細胞に対するＳ＋Ｌアッセイ(Haapala，D.K．et al.，1985 J. Virol．53:827-833)によって複製可能レトロウイルスの存在について検査した。実施例１ＢＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターＬＭｉＬｙ（図１）は一つのバイシストロン（bicistronic）ｍＲＮＡ転写物（図６Ａ）からのＲｅｖＭ１０及びＬｙｔ−２表面マーカー（マウスＣＤ８α鎖）という二つの遺伝子をコードしている。Ｌｙｔ−２蛋白質の翻訳はヒトＥＭＣＶのＩＲＥＳを介して行われ、従って、ＲｅｖＭ１０蛋白質の発現と結びついている。形質導入されたＣＥＭＳＳ細胞をＲｅｖＭ１０及びＬｙｔ−２に関して二重染色すると、これら二つの蛋白質は共直線性であった(図６Ｂ)。その後は、より容易に染色されるＬｙｔ−２表面マーカーのフローサイトメトリー分析を行い、全導入遺伝子を評価した、８００ｂｐＩＦＮβ−ＳＡＲ断片（上記）をＬＭｉＬｙの３'ＬＴＲのＮｈｅＩ部位に挿入し、ＬＭｉＬｙ２Ｓベクターを作成した。又、我々はＭＥＳＶに基づくベクターも作成した。何故ならば、それらは造血細胞における発現に関してＭｏＭＬＶよりも有利であるからである。ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ及びＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆベクターは、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ構築物から得られた(P lavec I．Et al.，1997 Gene Therapy 7，128-139;図１)。図１で矢印で示されているように、ＬＭｉＬｙ２Ｓ及びＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓにおいては、ＳＡＲ配列は逆方向であり、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆでは順方向である。順方向又は逆方向とは、天然ヒトＩＦＮβ遺伝子座位（locus）におけるＳＡＲエレメントの方向に対して呼んでいる(Junker，U．et al.，1995 Gen Therapy 2，639-64 6)。形質導入に続いて、３'ＬＴＲＳＡＲ配列は５'ＬＴＲ内で複製され(dupli cate)、二重コピー型ベクターを生成した(Hantzopoulos，P.A．et al.，1989 Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3519-3523)。このような二重コピー型ベクターは不安定である場合がある(Junker，U．et al.，1995 Gene Therapy 2，639-646)。ＬＭｉＬｙ２Ｓで形質導入されたＣＥＭＳＳ細胞のクローン分析によると該ベクターが不安定であることが判明した。プロウイルスが組み込まれたＣＥＭＳＳセルラインの個々のクローンの約３０％はＳＡＲ配列を有していなかった(データは示さず)。両指向性プロデューサーセルラインはＰｒｏＰａｋ−Ａパッケージング細胞(Rigg，J.R．et al.，1996 Virology 218，290-295)を使用して作成された。該ベクターは薬剤耐性遺伝子をコードしていない為に、ウイルスエンドポイント力価を決定することは不可能であった。その代わりに、ウイルス上清のＮＩＨ−３Ｔ３細胞への遺伝子移入能力を測定した。使用したウイルスストックの形質導入効率(Forestell，S.P.，et al.，1995 Gene Therapy 2，723-130)は、以下の通りであった。ＬＭｉＬｙ，５３％；ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ，８１％；ＬＭｉＬｙ２Ｓ，２１％；ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ，１４％；及びＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆ，７％。全てのウイルスストックはＰＣＲを含んではいなかった。実施例２：ＰＣＲ分析ＰＣＲ分析の為に、100,000個の生存する未分画又はソートされた細胞から細胞溶解（溶菌）物（ライセート）を調製した。５０mM ＫＣｌ,１０mM ＴｒｉｓｐＨ：８．３，２．５ＭｇＣｌ₂，１％Ｔｗｅｅｎ２０，１％ＮＰ４０及び１００mg/mlプロテアーゼＫを含有する２００μｌの緩衝液中、５６℃で２時間細胞を溶解した。溶解後に、試料を９５℃で３０分間保持し、プロテアーゼＫを失活させた。増幅に使用したプライマーは以下の通りである。５'ＬＴＲ特異的プライマー：Ｓａｒｕｐ２＋：及びＳＤｄｎ−：３'ＬＴＲ特異的プライマー：Ｌｙｔｕｐ＋：及びＬＴＲｄｎ１−：及び内因性βグロビン遺伝子に特異的なプライマー：細胞溶解物をＰＣＲ緩衝液(Perkin Elmer)、ｄＮＴＰｓ（Pharmacia）２００ μＭ，１００pmolの各プライマー、及び単位Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer ）と混合した。変性（３０分、９５℃）後に、試料を４０サイクルの増幅に供した。即ち、サーモサイクラー（Perkin Elmer 4800）中での、１分間９５℃、２分間５９℃、２分間７２℃、及び１０分間７２℃における伸長反応。ＰＣＲ産物は１．４％アガロースゲルにおけるエチジウムブロマイド染色で分析した。実施例３：初代Ｔ細胞の形質導入初代Ｔ細胞を、健常者ドナー末梢血(ＰＢＬ)又は、ＳＣＩＤ−ｈｕｔｈｙｍｕｓ／ｌｉｖｅｒマウスの胸腺移植皮片（胸腺細胞）から分離し(Plavec，Ｉ．e t al.，1996 Gene Therapy 3，717-724)、抗ＣＤ８ビオチン化Ａｂ（Beckton Di ckinson）及びストレプトアビジン磁気ダイナビーズ（dynabeads）（Dynal）を使用してＣＤ８＋細胞を除去することによってＣＤ４＋細胞を濃縮した。この操作により、９０−９５％純粋なＣＤ４＋細胞集団が得られた。細胞を、ＴＯＣ培地（１ｘＭＥＭビタミン溶液(GIBCO-BRL)，インシュリン−トランスフェリン− 亜セレン酸ナトリウム添加物（SIGNA）及び１０％牛胎児血清（Hyclone）が添加されたＲＰＭＩ）中で、ＰＨＡ(２μｇ/ml)，ＩＬ−２（４０U/ml）及び同種ＪＹ支持細胞で刺激し、３ないし４日間分裂させた(James，S.P．1994 InCurrent Protocols in Immunology，Vol.1，R．Coico，editor．John Wiley & Sons，Inc .，New York及びPlavec，1.，1997 Gene Therapy 7，128-139)。レトロウイルスによる形質導入の為に、５ｘ１０⁵の細胞をポリブレン（８μｇ/ml）添加のレトロウイルスプロデューサー細胞からの上清（１ml）と共に２０００ｘｇ、３４℃で遠心した。この操作は連続２日間行った。抗Ｌｙｔ−２ビオチン化Ａｂ（PharMingen）及びストレプトアビジン磁気ダイナビーズ（dynabeads）（Dynal）又は蛍光活性化セルソーター（FACS）を使用して２回の陽性選択を実施することにより、形質導入細胞は全般的に濃縮された。レトロウイルスベクター遺伝子発現を分析する為に、上記のように細胞をＰＨＡ及び支持細胞で刺激し、刺激後の様々な時点で、細胞のアリコートを抗Ｌｙｔ−２Ｒ−ＰＥ（PharMingen）抗体及び抗ＣＤ２５ＦＩＴＣ（Beckton Dickinso n）抗体で二重染色してFACS（Beckton Dickinson）で分析した。ＮＧＦｒの発現はＦＩＴＣ結合抗ＮＧＦｒ抗体（ＭｏＡｂ２０．４，ＡＴＣＣ＃ＨＢ８７３７）を用いて分析した。実施例３ＡＳＡＲ配列の導入遺伝子発現に対する効果は、休止Ｔ細胞のＤ２５^-区画において最も顕著である。ＬＭｉＬｙ−及びＬＭｉＬｙ−２Ｓで形質導入された集団の細胞Ｌｙｔ−２発現レベル（平均蛍光強度）を分析した(表２)。ＣＤ２５^-しきい（gate）をコントロールイソタイプ抗体を用いて規定した(データは示さず)。平均で、ＬＭｉＬｙ形質導入集団のＣＤ２５^-画分に比べて、ＬＭｉＬｙ２ＳのＣＤ２５^-画分には５．７±３．４倍のＬｙｔ−２⁺細胞が存在した(表２)。対照的に、ＬＭｉＬｙ２ＳのＣＤ２５⁺画分には，ＬＭｉＬｙ形質導入集団のそれと比べて、たった１．７±０．５倍のＬｙｔ−２⁺しか存在しなかった(表２)。導入遺伝子発現レベルの間接的な測定として考えられる、Ｌｙｔ−２染色の平均蛍光強度は、ＬＭｉＬｙ形質導入集団と比較して、ＬＭｉＬｙ２Ｓにおいて僅かに（１．６倍）増加しただけであり、ＣＤ２５^-細胞集団とＣＤ２５⁺細胞集団の間で検出可能な差異はなかった(表２)。休止ＬＭｉＬｙ２Ｓ形質導入Ｔ細胞の二つの集団が観察された。細胞の３０− ４０％はＬｙｔ−２⁺であり、残りはＬｙｔ−２^-であった(図８Ｆ)。これらの集団を更にキャラクターライゼーションする為に、Ｌｙｔ−２⁺及びＬｙｔ−２^-細胞をＦＡＣＳを用いて分離して、半定量的ＰＣＲでプロウイルスＤＮＡ中のＳＡＲ配列の存在に関して分析した(図３Ｂ)。Ｌｙｔ−２⁺細胞は強力なＳＡＲ特異的ＰＣＲシグナルを発し、５'及び３'ＬＴＲの両方にＳＡＲ配列のコピーが存在することを示した。対照的に、Ｌｙｔ−２^-細胞は微かなＳＡＲ特異的ＰＣＲシグナルを発し、このことは組み込まれたレトロウイルスのプロウイルスのかなりの部分がＳＡＲ配列を喪失していることを意昧している。これは、ＬＭｉｌｙ２Ｓベクターが不安定であるという我々の知見と一致している。しかしながら、これらの細胞を再刺激することによってＬｙｔ−２マーカーが発現することに示されるように、Ｌｙｔ−２^-細胞は転写可能なプロウイルスを有している(データは示さず)。試料は、ＰＨＡ，ＩＬ−２及び同種支持細胞による刺激１０−１２日後に分析した。ＣＤ２５^-しきい（gate）をコントロールイソタイプ抗体を用いて規定した。Ｌｙｔ−２染色の定量的分析は全細胞の約５０％がＣＤ２５^-しきい内に落ちた時点で行った(図８、パネルＤ参照)。組織１及び４は胸腺細胞であり組織２及び３はＰＢＬｓである。実施例３ＢＳＡＲ配列は導入遺伝子発現を方向（orientation）依存様式で増大させる。ＳＡＲ配列は休止初代Ｔ細胞の中では低調節されている(Rlgg，J.R．1996 Vir ology 218，290-295)、ＭＥＳＶに基づくレトロウイルスベクターＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ（図１）の発現を回復する（rescue）ことが出来る。形質導入されたＴ細胞におけるＬｙｔ−２発現の反応速度論的分析によれば、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２ＳベクターはＬＭｉＬｙ２Ｓベクターに類似した挙動を示した(図９Ａ)。ＭＥＳＶ−ＬＭｉＬｙと比較して、Ｌｙｔ−２導入遺伝子は、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓが形質導入されたＣＤ２５^-休止Ｔ細胞画分において良く発現された。更に、Ｌｙｔ−２⁺ＣＤ２５^-画分における細胞数はＬＭｉＬｙ２Ｓベクターの場合に匹敵した(図９Ｂ)。陽性効果は、ＳＡＲ配列が逆方向で存在するときにのみ観察された(ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２ＳベクターとＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆベクターとの比較：図９)。興味深いことには、ＳＡＲエレメントが順方向（ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆベクター）にあるときには、導入遺伝子の発現は親ベクターであるＭＥＳＶ−ＭｉＬｙの場合よりっ低かった。同様に、ＳＡＲエレメントを順方向で含むＬＭｉＬｙ２Ｓ−Ｆベクターを使用したときも、導入遺伝子の発現は低かった(データは示さず)。実施例４：初代Ｔ細胞のＨＩＶ感染刺激後第４−５日目に、細胞を洗浄し、ＩＬ−２のみを含有するＴＯＣ培地に再度懸濁した。２−３ｘ１０⁴個の細胞（７５μｌ）を未希釈ＪＲ−ＣＳＦＨＩＶ −１ウイルスストック（１０⁴−１０⁵ＴＣＩＤ₅₀/ml）７５μｌと混合し、９６穴丸底のウェルに三重で播いた。細胞は一晩培養し、翌日に培地１２５μｌを除去し、新たなＩＬ−２＋ＴＯＣ培地１３５μｌと交換した。このような方法で、接種後第３，５，７及び９日目に細胞上清を回収した。示されている場合には、第３日目に２．５ｘ１０⁵個/mlの支持細胞を含有するＩＬ−２＋ＴＯＣ培地１３５μｌを該細胞に添加した。培養上清中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の濃度をＥＬＩＳＡキット（Dupont-NEN）を使用して測定した。実施例５：非刺激Ｔ細胞中での標準レトロウイルスベクターの発現我々は以前に、ＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターの発現が非刺激初代ヒトＴ細胞中では低い状態に調節されていることを観察している。そこで、我々は、非刺激細胞中での発現を可能にするレトロウイルスベクターを同定することに興味があった。我々は、ＭＰＳＶに基づくベクター，ＭＥＳＶに基づくベクター、及びｄＩ５８７−ｒｅｖウイルスからのプライマー結合部位を有するＭｏＭＬＶに基づくベクターを試験した(図１、ベクターＭＥＳＶ−ＭＩＬｙ，ＭＰＳＶ−ＭＩＬｙ及びＬ／５８７−ＭｌＬｙ)。これら全てのベクターは、Ｌｙｔ −２表面マーカーをコードしているので、その発現は容易に且つ定量的に分析することが出来る(図１)。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞はＰＨＡ，ＩＬ−２及び同種支持細胞によってインビトロで３−４日間刺激され、その後に遠心によってレトロウイルスベクターで形質導入された(Bahnson，A.B.，et al．1995，J．Vi rol．Methods 54:131-143)。これらのプロトコール後に、４−８％のＬｙｔ−２陽性細胞を検出した。インビトロで増殖した後に、免疫磁気ビーズを使用してＬｙｔ−２陽性細胞の純度を更に８０−９０％に高めた。これらの細胞をＰＨＡ及び支持細胞を含有する培地中で刺激した。ＣＤ２５表面蛋白質（低親和性のＩＬ２受容体）をＴ細胞活性化のマーカーとして使用した。刺激の３乃至５日後に、ＣＤ２５発現は最大となり、９５％ＣＤ２５⁺細胞を超えた(図８Ａ)。11乃至１４日目までに、細胞の増殖は止まり、ＣＤ２５発現は低いレベルに調節されており(〉５０％ＣＤ２５^-細胞)、これは初代Ｔ細胞が有糸分裂的に休止状態にあることを反映したものであった(図８Ｄ)。刺激又は非刺激培養におけるレトロウイルスベクターの発現は、抗Ｌｙｔ２抗体を使用してＬｙｔ２発現に関して細胞を染色することによって測定した。結果は表１Ａに示す。ＬＭＩＬｙ，ＭＥＳＶ− ＭＩＬｙ，ＭＰＳＶ−ＭＩＬｙ及びＬ／５８７−ＭＩＬｙで形質導入された細胞におけるＬｙｔ２の発現は、細胞が非刺激状態になったときには、低いレベルに調節されていた。刺激後１１日目では、細胞の約５０％がＣＤ２５^-であり、約５０％がＣＤ２５⁺であった。Ｌｙｔ−２⁺細胞の主な部分はＣＤ２５⁺集団に存在し、ＣＤ２５^-集団に存在したのは僅かであった。これは、ＣＤ２５^-細胞はレトロウイルスベクターＬＴＲの発現に必要な転写因子を欠いている為であると考えた。この仮説を証明する為に、マーカー遺伝子（この場合には、上記のヒトＮＧＦ受容体）の発現が１．１ｋｂヒトＣＤ４プロモーターによって行われているベクターを調製した（図１：ＬＬｙＣＤ４Ｎベクター）。ＣＤ４分子は非刺激Ｔ細胞中でも通常高いレベルで発現されている。しかしながら、レトロウイルスによって形質導入された細胞中でのＣＤ４プロモーターからのＮＧＦｒの発現は、ＣＤ２５^- 細胞において低いレベルに調節されていた。この低いレベルの調節はＭｏＭＬＶＬＴＲプロモーターの発現に匹敵するものであり、従って、低いレベルの調節はレトロウイルスベクターに固有の特徴であって、使用する特定のプロモーターに固有のものではない。試料は、ＰＡ，ＩＬ−２及び同種支持細胞による刺激後３日目（活性化）及び第１０−１２目（休止）に分析した。Ｌｙｔ−２⁺細胞に対するしきいは、非形質導入Ｔ細胞をコントロールとして使用して決めた(図８、パネルＡ及びＤ)。組織１及び４は胸腺であり、組織２及び３はＰＢＬｓである。実施例６：スカフォールド付着領域（ＳＡＲ）を含有するベクターは非刺激Ｔ細胞中でも発現を維持する。我々は、活性化（刺激後第３日目）及び休止細胞（刺激後第１１日目）におけるＬｙｔ−２導入遺伝子発現を分析した。代表的な一つの組織に関して得られた結果を図８に示した。活性化Ｔ細胞中のＬＭｉＬｙ（９１％）及びＬＭｉＬｙ２Ｓ（９６％）ベクターの間でＬｙｔ−２⁺ 細胞のパーセンテージに顕著な差異は見られなかった(図８、パネルＢ及びＣ) 。休止細胞においては、全Ｌｙｔ−２発現は低く(図８、パネルＢ及びＣとＥ及びＦとの比較)、導入遺伝子発現の減少はＣＤ２５マーカーの減少と相関していた。しかしながら、ＬＭｉＬｙベクター及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクターの間でＬｙｔ−２発現に関しては顕著な差異が見られた。ＬＭｉＬｙ形質導入細胞の１５％がＬｙｔ−２陽性であったのに対して、ＬＭｉＬｙ２Ｓ形質導入細胞では39％がＬｙｔ−２陽性であった(図８、パネルＥ及びＦ)。再刺激によって、ＬＭｉＬｙ形質導入細胞及びＬＭｉＬｙ２Ｓ形質導入細胞の両者共に相当な高いレベルでＬｙｔ−２マーカーを発現し(８７％及び９５％）、従って、観察された発現の喪失（減少）は組み込まれたベクターが失われたことに因るものではなかった(データ示さず、及び図９Ａ)。同様な発現パターンが初代Ｔ細胞の起源に拘わらず観察された。四つの独立した組織（二つのＰＢＬｓ及び二つの胸腺細胞）に関して得られたデータを表１Ｂにまとめた。Ｌｙｔ−２⁺休止Ｔ細胞の絶対的なパーセンテージは組織毎にかなり変化するが、ＬＭｉＬｙ２ＳベクターはＬＭｉＬｙベクターよりも常に高い値（平均２．４±０．９倍多いＬｙｔ−２⁺細胞）である(表１Ｂ)。実施例７：ＨＩＶ複製の阻害改良された発現によって、ＲｅｖＭ１０媒介によるＨＩＶ−１複製の阻害をより効果的に行えるか否かについて試験する為に、ＬＭｉＬｙベクター、ＬＭＳｉＬｙベクター及びＬＭｉＬｙ２Ｓベクターで形質導入された初代Ｔ細胞にＨＩＶ −１ＪＲ−ＣＳＦ株を感染させて、ウイルス複製を９日間に亘って監視した( 図４)。ＲｅｖＭ１０蛋白質（上記）を生産しないＬΔＭＩＬｙベクターを陰性コントロールとして使用した。ＰＨＡ，ＩＬ−２及び支持細胞で刺激した５日後に(第５日目試料)、細胞にＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦを感染させた。刺激（活性化）細胞と非刺激（非活性化）細胞とを比較する為に、ＨＩＶ感染後３日目に培養物の半分に新鮮なＰＨＡ及び支持細胞を添加し、Ｔ細胞の刺激表現型を維持した。図４Ｂに示された通り、ＬＭｉＬｙ２Ｓベクターは、活性化細胞におけるＨＩＶ複製阻害により強力なだけではなく、休止細胞においてもその効果を維持した。これに対して、ＬＭｉＬｙベクターはその抗ウイルス効果を失った(図４Ａ) 。ＲｅｖＭ１０蛋白質をコードしていないコントロールＳＡＲベクター（ＬΔＭｉＬｙ２Ｓ）はＨＩＶ−１複製に対して効果を及ぼさなかった（データ示さず）ので、ＬＭｉＬｙ２Ｓベクターの抗ウイルス効果はＲｅｖＭ１０蛋白質の発現にのみ因るものである。予想していたように、ＨＩＶ−１ＨＸＢ−３感染ＣＥＭＳＳ細胞集団における二つのベクターの間に抗ウイルス効果の差異は見られなかった(データ示さず)。実施例８：ＳＡＲ形質導入初代及び培養細胞における示差発現ＲＮＡ分析：ＣＥＭＳＳ細胞（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞）及び胸腺細胞から、ＲｎａｚｏｌＢ(Ambion,Austin TX)を使用して全細胞ＲＮＡを抽出し、Ambion ＲＰＡ IIキットを使用してＲＮａｓｅ保護により分析した。ＲＮＡプローブは、Bluesc ript Instruction Manualに従って、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（Stratagen e）由来のプラスミドを使用して、³²Ｐ−ＵＴＰを用いて、Ｔ３又はＴ７ポリメラーゼによるインビトロ転写によって合成した。Ｒｅｖ遺伝子内部の１８８ｂｐＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片、及び１４５０から１５５０の位置にあるヒトβ アクチン遺伝子の第三エクソン（GenBank file HUMACTB-CYT-A）にまたがる１００ｂｐＰｓｔＩ−ＳａｌＩＰＣＲ断片。分析は、約１μｇの全細胞ＲＮＡ及び９ μｇの酵母キャリアーＲＮＡを各プローブ１−２ｘ１０⁵cpmとハイブリダイズさせた。保護された断片を５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素変性ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。Phosphorimager（Molecular Dynamics ）を使用して、保護断片の放射活性を測定した。アクチン特異的シグナルを内部標準として使用してそれぞれのレーンに載せたＲＮＡ量の差を補正し、ＲｅｖＭ１０蛋白質の相対的発現を評価した。我々は、ＳＡＲは初代Ｔ細胞におけるレトロウイルスベクターの発現を増大させるが、培養細胞、特に、ＣＥＭＳＳＴセルライン又はＰＡ３１７マウス繊維芽セルラインにおいてはそれを増大させない、ことを見出した。ＬＭＩＬｙ，ＬＭＳＩＬｙ及びＬＭＩＬｙ２Ｓベクターにより形質導入されたＣＥＭＳＳ細胞は刺激された又は活性化された胸腺細胞において観察されたものと同様のＬｙｔ−２染色パターンを示した(データ示さず)。図６にしめされるように、ＳＡＲエレメントの存在は、樹立ヒトＴセルライン又はマウス細胞においては、導入遺伝子発現レベルに何らの影響を及ぼさなかった。ＳＡＲ含有ベクターの発現を分子レベルにおいて更に分析する為に、我々は、形質導入ＣＥＭＳＳ細胞、並びに刺激及び非刺激胸腺細胞から全細胞ＲＮＡを分離した。ベクター特異的ＲＮＡの定常状態レベルを半定量的ＲＮａｓｅ保護アッセイで求めた。該アッセイで求められた様々な値を図５に示した。ＣＥＭＳＳ細胞及び胸腺細胞で得られた値を適当なＬＭＩＬｙベクターＲＮＡに対して個別に標準化した。ＲＮＡ分析を、初代胸腺細胞においてＬｙｔ−２染色で得られた結果とあわせた。ＳＡＲは刺激及び非刺激胸腺細胞の双方において、レトロウイルスベクターの発現を三倍にまで増大させ、二重ＳＡＲ形態はＳＡＲが一つのものに比べてより効果的であった。興味深いことには、ＳＡＲは形質導入ＣＥＭＳＳ細胞におけるベクターＲＮＡ発現に対しては影響を及ぼさなかったことであり( 図５)、これは初代細胞と不死化Ｔ細胞との間の差異を強調するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者プラヴェック・イヴァンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94205，メンロパーク，メレー・コート３，1025番 (72)発明者ベレス・ゲイバーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94031，パロアルト，ハーカー・アヴェニュ 1350番

Claims

【特許請求の範囲】１．レトロウイルスによって形質導入された、真核非不死化休止細胞における遺伝子発現を増大させる為の、ＤＮＡスカフォールド又はマトリックス付着領域（ＳＡＲ）の使用。２．非不死化細胞を、（ｉ）発現調節配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子及び（ｉｉ）少なくとも一つのＳＡＲを含むレトロウイルスで形質導入することから成る、レトロウイルスで形質導入された真核細胞における異種遺伝子の発現を変化させる方法。３．非不死化真核休止細胞を、（ｉ）発現調節配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子及び（ｉｉ）少なくとも一つの逆方向のＳＡＲを含むレトロウイルスで形質導入することから成る、レトロウイルスで形質導入された真核休止細胞における異種遺伝子の発現を増大させる方法。４．非不死化細胞を、（ｉ）発現調節配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子及び（ｉｉ）少なくとも一つの順方向のＳＡＲを含むレトロウイルスで形質導入することから成る、レトロウイルスで形質導入された真核休止細胞における異種遺伝子の発現を低いレベルに調節する方法。５．（ａ）少なくとも一つのＳＡＲ及び（ｂ）発現調節配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子を含むレトロウイルスベクターであって、該異種遺伝子（又は、一つ以上の異種遺伝子がある場合には少なくとも一つの異種遺伝子）がｒｅｖ−Ｍ１０であり、ＳＡＲ又は少なくとも一つのＳＡＲがヒトインターフェロンβ遺伝子の５’ＳＡＲに由来するか、それから得られるか、又はそれに対応するような、前記レトロウイルスベクター。６．請求項５のレトロウイルベクターによって形質導入された非不死化ヒト細胞を含む細胞組成物。７．細胞が造血細胞である、請求項６記載の細胞組成物。８．細胞がＴ細胞である、請求項７記載の細胞組成物。９．遺伝子治療を必要としている患者に対する遺伝子治療方法であって、該患者に、請求項６，７又は８に記載の細胞組成物を導入すること、から成る該方法。１０．造血細胞を該患者から取り出し、該細胞を請求項５に記載のベクターで形質導入し、該形質導入した細胞を患者に戻す、ことから成る請求項９に記載の方法。１１．ＨＩＶ感染、例えば、ＨＩＶ−１感染で苦しむ患者の治療方法であって、患者から造血細胞（例えば、造血幹細胞、末梢血リンパ球、造血幹細胞由来のＣＤ４＋細胞又はＴ細胞）を除去し（取り出し）て分離し、該細胞に抗レトロウイルス蛋白質の遺伝子（例えば、ｒｅｖ−Ｍ１０）及びＳＡＲ（例えば、ヒトＩＦＮ−βの５'ＳＡＲに由来するか又はそれから得られ得るＳＡＲ）を形質導入し、そして該細胞を患者に戻す、ことから成る該方法。１２．本明細書、特に実施例に記載されている、全ての新規な物、方法及び用途。