JP2002519037A

JP2002519037A - ウイルスコード配列を含有していない高い効率を有するレトロウイルスベクター

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Publication number: JP2002519037A
Application number: JP2000557382A
Authority: JP
Inventors: キム，サンヨン; シンユ，セウン; キム，ジョン−ムーク
Original assignee: バイロメドリミテッド
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2002-07-02
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: DE69931023T2; DK1032697T3; CN1154744C; PT1032697E; US6451595B1; AU4655499A; EP1032697A1; EP1032697B1; RU2203321C2; DE69931023D1; ES2260918T3; KR20000006334A; CN1277636A; ATE324460T1; WO2000000629A1; ID24192A; JP3864049B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は遺伝子療法のための改善されたレトロウイルスベクターを提供する。【解決手段】安全性および効率が一層高いレトロウイルスベクターをＭＬＶベースの出発ベクター、ＭＯＮおよびＭＩＮから構築する。【効果】改善されたベクターは次の特徴を有している：１）ＭＬＶ由来ｐｏｌ遺伝子に相当する配列がベクターでは完全に欠失し、通常のレトロウイルスベクターで難問とされていた相同性組換えが避けられ、２）クローニング部位の上流位置に非相同性イントロン、スプライシング受容体および（または）非コード配列が挿入され、効率のよいスプライシングにより外来遺伝子の発現が最大となり、３）ベクターが５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列または代って強い非相同性のプロモーターを含有し、ＲＮＡの豊富な生成が可能となり、４）クローニング部位の下流位置にＩＲＥＳ（内部リポソームエントリー部位（ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍａｌＥｎｔｒｙＳｉｔｅ））または内部ＳＶ４０最小プロモーターが挿入され、二種またはそれ以上の外来遺伝子の同時発現が可能となる。本発明の改善されたレトロウイルスベクターは安全であり、かつ外来遺伝子を効率よく発現することがわかっているので、遺伝子療法等に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は遺伝子治療のための改善されたレトロウイルスベクターに関する。特
に、本発明は安全で、有効なレトロウイルス発現ベクターに関し、このベクター
において、レトロウイルス遺伝子、すなわちｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌの全て
が完全に欠失していて；非相同性イントロン、スプライシング受容体および（ま
たは）非コード配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入さ
れ；非相同性内部プロモーターまたは内部リボソームエントリー部位（以下「Ｉ
ＲＥＳ」と称する）がクローニング部位の下流位置に挿入され；そして５′ＬＴ
Ｒ（ロングタームリピート）または強力な非相同性プロモーターのフルレングス
Ｕ３配列が外来遺伝子の発現を調節している。

【０００２】

【発明の背景・従来の技術】

レトロウイルスベクターはその他のベクターよりもさらに頻繁に遺伝子療法に
使用されていて、世界的に承認された臨床プロトコールの５０％を超えて使用さ
れている（Wiley-Journal of Gene Medicine Website ; http://www.wiley, co.
uk/genetherapy）。マウス白血病ウイルス（以下「ＭＬＶ」と称する）ベースの
ベクターが主に使用されているが、臨床上の使用においてレトロウイルスベクタ
ーにはなお多くの問題がある。最も重大な問題はそれらの安全性であり、レトロ
ウイルスベクターはウイルスベクターの一種であり、そのために細胞中で複製受
容能のあるレトロウイルス（以下「ＲＣＲ」と称する）に変換されることがある
。結局、相同組換えによるＲＣＲ生成は重大な関心事であった。

【０００３】全ての利用可能なレトロウイルスベクターは顕著に長いウイルスコード配列を
含有している。これらの配列はパッケージングされたベクターが放出されるパッ
ケージングされた細胞のゲノム中にも存在しているので、パッケージングされた
ゲノム中の同一ヌクレオチド配列とベクターとの間に相同組換えが生じてＲＣＲ
の生成が結果として生じ得ることが提案されていて、このことはMiller等(Mille
r等、Human Gene Ther., 1:5, 1990)によって報告されている。

【０００４】ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターの二種類のタイプ、すなわちＬＮシリ
ーズベクターおよびＭＦＧベクターが遺伝子療法に最も頻繁に使用されている(M
illerおよびRoseman, Biotechnigues, 7: 980-990,1989 ; Dranoff等、Proc. Na
t’l. Acad. Sci. USA 90 : 3539-3543,1993)。ＬＮシリーズベクター中の外来遺
伝子の発現は非相同性内部プロモーターまたはＬＴＲによって調節されるが、Ｍ
ＦＧベクター中の転写レベルはＬＴＲのコントロール下にあり、そして外来遺伝
子はゲノムＲＮＡまたはスプライシングされたサブゲノムＲＮＡの形態で発現さ
れる。しばしば第一世代レトロウイルスベクターと考えられているＬＮシリーズ
ベクターは４２０−ｂｐｇａｇコード配列を含有している。この領域はウイル
スパッケージングに重要な役割を果しているものと考えられているが、ある条件
下ではｇａｇ領域はウイルスパッケージングおよび力価に対して顕著な効果を示
すことなく欠失できることが開示されている(Kim等，J. Virol., 71 : 994-1004
, 1998)。

【０００５】ＬＮシリーズベクターと比較して、ＭＦＧベクターは遺伝子発現レベルをさら
に安定化し、かつ高め、そしてヒト−またはマウス−由来細胞系の大部分でより
高いウイルス力価を生じることが知られている(Byun等，Gene Ther., 3 : 780-7
88, 1996)。しかしながら、ＭＦＧベクターはさらに多くのウイルス配列、ｇａ
ｇに対する４２０−ｂｐ．ｐｏｌに対する３７７−ｂｐ，およびｅｎｖに対する
９９−ｂｐを含有し、ＬＮシリーズベクターよりも高い頻度でＲＣＲを生成する
可能性が生じる。

【０００６】通常のレトロウイルスベクターに関連するこれらの不利な点を克服するべく、
本発明者等はレトロウイルスベクターを構築した（韓国特許出願第９７−４８０
９５号）。このベクターは以下に述べるいくつかの特徴を有していた：

【０００７】・クローニングされた遺伝子転写産物は有効にスプライシングされ、より高い発
現レベルの遺伝子を生成した。・ｇａｇおよびｅｎｖ配列はウイルス力価を失うことなく完全に欠失していた。・ＩＲＥＳをベクターでの二種またはそれ以上の遺伝子の同時発現のために使用
した。・マルチクローニング部位をベクター中に挿入して外来遺伝子のクローニングを
容易にした。

【０００８】ｇａｇおよびｅｎｖ配列がレトロウイルスベクターから欠失していたため、ベ
クターの安全性がその他のレトロウイルスベクターと比較して増大した。しかし
、このベクターはスプライシング受容体配列を係留する３７７−ｂｐｐｏｌコ
ード配列およびｅｎｖのための２８４−ｂｐリーダー（転写されるが、翻訳され
ない）を含むその下流配列をなお含有している。その理由はｐｏｌ配列の欠失は
異常な、または非能率的なスプライシングをもたらすからである。ｐｏｌ配列の
ための３７７−ｂｐはまたパッケージングラインのゲノム中にも存在しているの
で、ＲＣＲ生成を生じる非相同性組換えの可能性がベクターになお残っている。

【０００９】遺伝子発現の効率が上昇し、かつ安全性が増大した新規なレトロウイルスベク
ターを開発するために、本発明者等はいずれのウイルスコード配列をも含有して
いないレトロウイルスベクターを構築した。本発明は、ＭＬＶ由来ｐｏｌ遺伝子
が完全に欠失し、パッケージング細胞系での非相同性組み換えによるＲＣＲ生成
の可能性を排除し；非相同性イントロン、スプライシング受容体および（または
）非コード領域が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され、
遺伝子発現の効率を最大とし；５′ＬＴＲまたはヒトサイトロメガロウイルス（
以下「ＨＣＭＶ」と称する）主要前初期プロモーター（ｍａｊｏｒｉｍｍｅｄ
ｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＭＩＥＰ：ｉｅｌ遺伝子のプロモ
ーター）を外来遺伝子発現調節のためのシス−エレメントとして使用され；そし
て非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に挿
入され、二種またはそれ以上の外来遺伝子の同時発現が可能となるレトロウイル
スベクターを構築することにより達成される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は、より高いレベルで外来遺伝子が発現され、それ故に遺伝子療
法に有効に使用し得る安全なレトロウイルスベクターを提供するにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】

本発明によれば、上述した目的は容易に達成される。本発明は、ＭＬＶ−コードｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌ配列が完全に欠失して
いるＭＬＶベースのレトロウイルスベクターを提供する。

【００１２】一つの特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外
来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されている非相同性イント
ロンおよび（または）非相同性スプライシング受容体を含有し得る。

【００１３】別の特徴によれば、本発明のＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは、外来
遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同性非コード配列
を含有し得る。さらに他の特徴によれば、ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１
９〜−１ｂｐ）を本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクター中で非相同
性プロモーターで置換することができる。

【００１４】さらにその他の特徴によれば、本発明のＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベク
ターは外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置に非相同性プロモーター
を含有することができる。本発明によればまた本発明のＭＬＶ−ベースレトロウイルスで形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）菌株が提供される。本発明のこれ以上の特徴は以下に明らかとなる。

【００１５】

【発明の実施の態様】本発明はＭＬＶベースのベクター、特にＭＯＮまたはＭＩＮから誘導される安
全でかつ効率のよいレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターにお
いて、レトロウイルス遺伝子（ｇａｇ，ｅｎｖおよびｐｏｌコード配列）は完全
に欠失し；非相同性イントロン、スプライシング受容体および（または）非コー
ド配列が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；強力な非
相同性プロモーターが５′ＬＴＲに含有され；そして非相同性プロモーターまた
はＩＲＥＳがクローニング部位の下流位置に配置されている。

【００１６】特に、本発明のベクターにおいて、スプライシング受容体を含むｐｏｌコード
配列が完全に欠失しているので、通常のレトロウイルスベクターの不利な点とさ
れている相同性組換えの可能性を排除することができる。

【００１７】欠失ｐｏｌ配列は遺伝子発現レベルの低下をもたらす。低下した発現効率およ
びウイルス力価を回復するために、以下の如く様々なレトロウイルスベクターが
本発明で提供される：

【００１８】・本発明は、ｐｏｌコード配列の３′部分とオーバーラップしている欠失スプラ
イシング受容体を補完するために、非相同性イントロンおよび（または）スプラ
イシング受容体が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されて
いるレトロウイルスベクターを提供する。既知のウイルスまたは細胞遺伝子のイ
ントロンおよび（または）スプライシング受容体はいずれもがこの目的に使用す
ることができ、好ましくはＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、延長因子１
α（以下「ＥＦ１α」と称する）遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（以下「ＧＡＰＤＨ」と称する）遺伝子、β−アクチン遺伝子等であ
る。

【００１９】・本発明はまた、非相同性非コード配列がクローニング部位の上流位置に挿入さ
れているレトロウイルスベクターを提供する。非コード配列は、翻訳効率を増進
するのに使用され、そしてイントロンおよび非翻訳エキソンを包含するタンパク
質に翻訳されない転写ＤＮＡ配列と定義される。好ましくは、非コード配列はＨ
ＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子、ＥＦ１α遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子およ
びβ−アクチン遺伝子からなる群から選択される。非相同性非コード配列の挿入
により、外来遺伝子転写のスプライシングの効率化およびサブゲノムＲＮＡの有
効な翻訳が可能となる。

【００２０】・加えて、本発明は非相同性内部プロモーターまたはＩＲＥＳがクローニング部
位の下流位置に係留されているレトロウイルスベクターを提供する。

【００２１】・最後に、本発明は５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列または強力な非相同性プ
ロモーターが含まれているレトロウイルスベクターを提供する。本発明を以下に詳述する。

【００２２】ｐｏｌコード配列の欠失：ΔＳＡ構築安全性が改善されたレトロウイルスベクター、すなわち相同性組換え活性を有
していないレトロウイルスベクターを開発するために、ＭＯＮベクター（韓国特
許出願第９７−４８０９５号）からスプライシング受容体を包含するｐｏｌコー
ド配列を欠失させ、欠失変異体ベクターΔＳＡを構築した。さらに、レポーター
遺伝子として細菌性ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
）の挿入によりΔＳＡ−ＣＡＴベクターを構築した（図１参照）。次に、ΔＳＡ
−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系を調製し、そしてＣ
ＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイにより、欠失変異体のウイルス力価は親
ベクターＭＯＮ−ＣＡＴの力価と匹敵し得るが、遺伝子発現が低下したことが明
らかになった（表１参照）。これらの結果は、スプライシング受容体を含むｐｏ
ｌ遺伝子がベクター中の外来遺伝子発現の調節に関連していることを提示してい
る。

【００２３】これらの結果から予想されるとおり、非相同性スプライシング受容体および（
または）イントロンが外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入し
てｐｏｌ遺伝子に付随して欠失されるスプライシング部位を補完するようにする
と、外来遺伝子の発現レベルが上昇する。しかし、スプライシングが余りに多く
起こると、サブゲノムＲＮＡ対ゲノムＲＮＡの比が増加し、高レベルの遺伝子発
現にもかかわらずウイルス力価の低下をもたらす。

【００２４】従って、理想的なレトロウイルスベクターを構築するには、転写、スプライシ
ングおよび翻訳の率がトランスフェクションまたは形質導入された細胞系で釣合
がとれているようにベクターをデザインしなければならない。換言するに、外来
遺伝子が豊富に転写され、そしてゲノムＲＮＡの量がサブゲノムＲＮＡの量と釣
合がとれ、そのためにゲノムＲＮＡがウイルス粒子中にパッケージされるように
十分に生成され、またサブゲノムＲＮＡが外来遺伝子にコードされている多くの
タンパク質中に翻訳され得るようなベクターが好ましい。本発明では、ウイルス
または細胞遺伝子から由来する様々な非コード配列が欠失変異体ベクターに挿入
されているレトロウイルスベクターが提供され、それでこの挿入がウイルス力価
および遺伝子発現レベルに効果を有するかどうかを検討する。

【００２５】２．スプライシングおよび翻訳効率を増進する非相同性ＤＮＡ配列の挿入：ＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１構築スプライシング率および遺伝子発現率の釣合を保持し、またウイルスＲＮＡの
全収率を上昇させるために、ＭＬＶ５′ＬＴＲのＵ３領域が強力なプロモーター
、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換され、そして非相同性非コード配列が
挿入されたレトロウイルスベクターが構築された。

【００２６】好ましい態様では、ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の非翻訳エキソン
およびイントロンがベクターのクローニング部位の上流位置に挿入された非相同
性非コード配列として使用されていた（図２参照）。ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１
２３）遺伝子のエキソンおよび（または）イントロン配列は発現ベクターに挿入
されると翻訳効率を増進することが知られている。

【００２７】特に、ｐＣＭベクターは以下の如くして調製した：レトロウイルスコード配列
の全てを欠失させ；５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プ
ロモーターで置換し、ＭＬＶ誘導３′ＬＴＲを保持し；そして非相同性内部プロ
モーターとしてＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを用いた。次に、ｐＣＭベ
クターにＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡお
よび（または）エキソン２を挿入することによりＤＯＮ１．２、ＤＯＮ２および
ＤＯＮＳＡ１ベクターを構築した（図３ａ、図３ｂおよび図４ａ〜４ｃを参照）
。次に、ＣＡＴレポーター遺伝子の挿入により、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２
−ＣＡＴおよびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを調製した。これらのベクターで
トランスフェクションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。
ＣＡＴアッセイの結果から、三種のベクターのいずれもがコントロールベクター
Ｌ−ＣＡＴ−ＳＮよりも一層高いスプライシング効率および遺伝子発現を示すこ
とが確認された（表２を参照）。

【００２８】２．スプライシングおよび遺伝子発現を促進し得る細胞ＤＮＡ配列の挿入：ＭＩ
Ｎ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−ＧＩ構築別の好ましい態様において、レトロウイルスベクターをさらに工夫して、スプ
ライシング率と遺伝子発現率との釣合からウイルス力価および遺伝子発現双方の
効率を一層高くするようにした。これらのベクターにおいて、ヒト遺伝子のエキ
ソンおよび（または）イントロン配列をレトロウイルスベクター中の外来遺伝子
のためのクローニング部位の上流位置に挿入した（図５を参照）。

【００２９】これらのベクターを構築するために、ＭＩＮベクターを調製した。このベクタ
ーでは、レトロウイルスコード領域がすべて欠失され；ＭＬＶ−由来５′および
３′ＬＴＲが保持され；そしてＥＭＣＶＩＲＥＳ−ネオカセットを非相同性内
部プロモーターとして使用した。特に、ＭＩＮベクターを次の工程によって調製
した：ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ領域を含むＤＮＡフラグメントを増幅し、こ
のフラグメントをｐＵＣ１８ベクターに挿入し、そして組換えベクターにＩＲＥ
Ｓ−ネオカセットを挿入する（図６を参照）。ヒトβ−アクチン、ＥＦ１αまた
はＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグ
メントをＭＩＮベクターのクローニング部位の上流位置に挿入して、ＭＩＮ−Ａ
Ｉ、ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−ＧＩベクターをそれぞれ構築した。（図７ａ〜
７ｃ参照）。

【００３０】スプライシング受容体として細胞遺伝子（例えば、ＭＩＮ−ＡＩ等）を用いる
ベクターをウイルス遺伝子（例えば、ＤＯＮ１．２等）を用いるベクターと比較
するために、別のＭＬＶ−ベースのベクターＭＩＮ−２を調製した。具体的には
、ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソ
ン２を含むＤＮＡ配列をＭＩＮベクターに挿入する（図７ｄを参照）。この挿入
断片はＤＯＮ２ベクターのそれと同一である。

【００３１】次に、ＭＩＮ−ＣＡＴ、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴ、ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ、ＭＩＮ−
ＧＩＣＡＴおよびＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを相当するベクターにＣＡＴレポー
ター遺伝子を挿入することにより調製した。これらのベクターでトランスフェク
ションまたは形質導入された細胞系をＣＡＴアッセイにかけた。ＣＡＴアッセイ
の結果から、本発明の全てのベクターのウイルス力価はコントロールベクターＬ
ＸＳＮおよびＭＦＧの力価と同じであり、一方ＭＩＮ−２およびＭＩＮ−ＥＩで
トランスフェクションまたは形質導入された細胞系での遺伝子発現はコントロー
ルベクターを含む細胞系よりも一層高いことが明らかとなった（表３を参照）。

【００３２】

【実施例】

本発明の実際の、現在好ましい態様を以下の実施例に示す如く例示する。しかし、当業者は、この記載を考慮して、本発明の精神および範囲内で変形お
よび改良とすることができることが明らかである。

【００３３】実施例１：ＭＯＮベクターからのｐｏｌ遺伝子の欠失（１−１）ΔＳＡ構築ｐｏｌコード配列を欠如している５′ＬＴＲ下流配列を調製するために、ＰＲ
Ｃ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ここでは、ＭＯＮベクター（韓国特許第
９７−４８０９５号）を鋳型として使用し、また配列番号１（ＨＨＩＲプライマ
ー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマー）によって表わされる２種の
一本鎖合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅したＤＮＡフ
ラグメントはＭＬＶ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのヌクレオチド配列に相当した（
図１を参照）。この場合、＋１はＭＬＶゲノムの転写開始部位を表わし、また＋
２１２〜＋５２ｂｐの配列はゲノムＲＮＡをパッケージするのに必要な非コード
領域である。

【００３４】ＰＣＲ生成物をＰＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ＣＡ．ＵＳＡ）にサブクロ
ーニングし、次に得られたベクターからＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメント
を調製した。ＭＯＮベクターの部分ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＰ
ＣＲ生成物のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントで置換してΔＳＡベクター
を構築した。このΔＳＡベクターを、ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲ、およびスプ
ライシング受容体、ＩＲＥＳ−ネオカセットおよびポリプリントラックからなる
非コード配列を含有するレトロウイルスベクターの基本バックボーンとして使用
し、レトロウイルスコード配列は全て欠失している（図１を参照）。

【００３５】（１−２）ΔＳＡ−ＣＡＴ構築外来遺伝子発現およびレトロウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに対する
上述の遺伝子操作の効果を検討するために、細菌ＣＡＴ遺伝子をレポーター遺伝
子として使用した。

【００３６】ＣＡＴ遺伝子をＰＣＲにより入手し、ここではｐＣＡＴ３−基本ベクター（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を鋳型として使用し、また配列番号３（ＣＡＴＡ
ＴＥＮプライマー）および配列番号４（ＣＡＴＳＴＯＰプライマー）によって表
わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。ＰＣＲ生
成物をｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入し、そしてＣＡ
Ｔ遺伝子を含む得られたベクターのＢａｍＨＩフラグメントをｐＣ３．１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を導入して、ｐＣ３．１−ＣＡＴを調製した
。ΔＳＡ−ＣＡＴベクターをΔＳＡベクターのＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子（Ｃ
３．１−ＣＡＴのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）−処理ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIIIフラ
グメント）を挿入することにより構築した（図１を参照）。

【００３７】（１−３）ＣＡＴアッセイ ΔＳＡ−ＣＡＴおよびコントロールベクター（ＭＯＮ−ＣＡＴ）を、Ｇａｇ−
ＰｏｌおよびＥｎパッケージングベクターと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェク
ションした（ＤｕＢｒｉｄｇｅ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３７９
−３８７，１９８７）。トランスフェクションした細胞を４８時間培養した後、
サイトソルタンパク質を抽出してＣＡＴ活性、すなわち、外来遺伝子発現レベル
の指標を測定した。一方、培地を０．４５−μｍフィルターで濾過して得られた
細胞を含まないウイルス上澄液を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
１６５８）を形質導入した。ＣＡＴ活性のレベルは形質導入後４８時間のタンパ
ク質抽出液を用いて測定した。

【００３８】ＣＡＴアッセイは以下の如くして実施した：まず、細胞を収集し、ＰＢＳ（リ
ン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌで洗い、次に０．２５ＭＴｒｉｓ緩衝剤に再懸濁
した。細胞を凍結（ドライアイス中）−解凍（３７℃水浴中）サイクルを６回く
り返して溶解した。得られた細胞抽出液を７分間６０℃に加熱してデアセチラー
ゼを不活性化した後、抽出液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そし
て上澄液をとり出した。抽出液中のタンパク質レベルをブラッドフォード法によ
って定量した。標準化した抽出液を¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール（６０ｍＣｉ／
ミリモル、０．１ｍＣｉ／ｍｌ）１μｌ、アセチル補酵素Ａ２μｌ（４０ｍＭ）
および０．２５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）の適切な量と混合した。この反応混
合物を適当な反応時間３７℃でインキュベートした。反応後、クロラムフェニコ
ールを酢酸エチルで抽出し、そして減圧濃縮した。ペレットを酢酸エチル１５μ
ｌに再懸濁し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートに充填した。ＴＬＣ
展開溶剤（９５％クロロホルム：５％メタノール）を用いてＴＬＣを実施した後
、ＴＬＣプレートを乾燥し、次にＸ線フィルムに曝すか、またはホスホイメージ
アナライザー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｚｅｒ）にかけ、その結
果としてクロラムフェニコールのアセチル化レベルを測定した。試料中のＣＡＴ
活性は、アセチル化クロラムフェニコール対全クロラムフェニコールの放射能比
から算出することができた。

【００３９】表１は、ΔＳＡ−ＣＡＴ欠如ｐｏｌ遺伝子でトランスフェクションされた２９
３Ｔ細胞系でのＣＡＴ活性はＭＯＮ−ＣＡＴでトランスフェクションされたコン
トロール系よりも低いことを示している。これは、ｐｏｌコード配列が遺伝子発
現の調節に関連していることを示唆している。加えて、形質導入された系でのＣ
ＡＴ活性はトランスフェクションされた系と類似のパターンを示し、パッケージ
ング効率は遺伝子発現効率に関係していることを意味している。

【００４０】

【表１】

【００４１】実施例２：プロモーターおよびＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソ
ンおよび（または）イントロンの挿入スプライシング率と翻訳率との釣合を保ち、またウイルスＲＮＡの全収率を増
進させるために、以下の３種のベクターからなるＭＯＮ由来のレトロウイルスベ
クターを構築した：

【００４２】・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーター
で置換し；そしてＭＬＶスプライシング受容体をＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３
）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２（開始コドンの直前
に末端をもつ）を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮ１．２ベクター
、

【００４３】・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーター
で置換し；そしてＭＬＶスプライシング受容体をＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３
）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントで
置換しているＤＯＮ２ベクター、および

【００４４】・ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列をＨＣＭＶ主要前初期プロモーター
で置換し；そしてＭＬＶスプライシング受容体をマウス免疫グロブリン遺伝子の
スプライシング受容体およびＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン
１を含むＤＮＡフラグメントで置換しているＤＯＮＳＡ１ベクター。これらのベクターを構築する詳しい方法を以下に記載する（図３ａ，図３ｂお
よび図４ａ〜４ｃを参照）。

【００４５】（２−１）ＳＮ−３ＬＴＲの構築３種の変異体ベクターにおいて、ＳＶ４０プロモーターネオカセットを外来遺
伝子のためのクローニング部位の下流位置に挿入する（図２を参照）。これらの
変異体ベクターを構築するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットを含む
ベクターを以下の如くして調製した（図３ａおよび３ｂを参照）。

【００４６】ＳＶ４０プロモーターのコントロール下にネオ遺伝子を発現するベクターを調
製するために、ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをＰＲＣにより生成した。
ＰＣＲにおいて、ｐＣ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を鋳型と
して使用し、また配列番号５（ＳＶ４０−５プライマー）および配列番号６（Ｎ
ｅｏ−３プライマー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＲ
Ｃプライマーとして用いた。

【００４７】ＳＶ４０プロモーター−ネオカセットをｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）でサブクローニングした後、得られたベクターのＢａｍＨＩ−Ｘｈ
ｏＩフラグメントをＭＯＮのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたベ
クターＭＳＮをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、そしてＳＶ４０
プロモーター−ネオカセットおよび３′ＬＴＲを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを３Ｎ−３ＬＴＲベクターを構築するようにｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメントと結合させた（図３ａを参照）。

【００４８】（２−２）ｐＣＭ構築５′ＬＴＲを強力な非相同性プロモーターで置換したレトロウイルスベクター
を調製するためにＰＣＲを実施した。ＰＣＲでの鋳型として、ＭＬＶ５′ＬＴＲ
のフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）をフルレングスＨＣＭＶ主要前
初期プロモーターで置換したキメラＬＴＲを含むレトロウイルスベクターＭＣＣ
−ＣＡＴ（韓国特許願第９７−４８０９５号）を使用した。ＰＣＲプライマーは
配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号２（Ｒ５２３Ｂａｍプライマ
ー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物
はキメラ５′ＬＴＲ〜＋５２３ｂｐのＤＮＡ配列を含有し、そしてｐＣＲII（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングした。サブクローニン
グした配列のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをＳＮ−３ＬＴＲベクター
（実施例２−１で得られたもの）のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐ
ＣＭベクターを調製した（図３ｂを参照）。

【００４９】ｐＣＭにおいて、レトロウイルスコード配列の全部が実施例１−１のΔＳＡベ
クターのとおりに欠失され、一方ΔＳＡベクターの５′ＬＴＲおよびＩＲＥＳ−
ネオカセットはキメラＬＴＲおよびＳＶ４０プロモーター−ネオカセットでそれ
ぞれ置換されていた。ｐＣＭベクターを実施例２−３〜２−５に示すようにＤＯ
Ｎ１．２、ＤＯＮ２およびＤＯＮＳＡ１ベクターのための出発物質として使用し
た。

【００５０】（２−３）ＤＯＮ１．２およびＤＯＮ１．２−ＣＡＴ構築ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよびエ
キソン２（コドン開始まで）を含むＤＮＡフラグメントを得るために、ＰＣＲを
実施した。ＰＣＲでの鋳型は、ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターからエキソン５
までのＤＮＡ配列を含有するｐＥＱ２７６ベクター（Biegalbe等，Virology, 18
3 : 381-385, 1991）であった。２種のＰＣＲプライマーが配列番号７（ＲＩ５
プライマー、エキソン１でハイブリッド形成された）および配列番号８（ＣＭＶ
ｅｘｏｎ２．３プライマー、エキソン２でハイブリッド形成された）にそれぞれ
記載されていた。１−ｋｂＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、そしてＨＣ
ＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）のエキソン１、イントロンＡおよび部分エキソン２
（開始コドン直前に末端を有する）を含有していた。

【００５１】ＰＣＲ生成物をｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）に挿入してｐＺｅｒｏ１．２ベクターを調製した。次に、ｐＺｅｒｏ１．
２のＥｃｏＲＩフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。実施例
２−２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵
素で処理した。平滑末端を有する２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯＮ
１．２ベクターを構築した。さらに、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２のクレノウ処
理ＨｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴベク
ターを構築した。

【００５２】（２−４）ＤＯＮ２およびＤＯＮ２−ＣＡＴ構築実施例２−３のｐＺｅｒｏ１．２のＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを調製
した。このものはイントロンＡの１１２−ｂｐ３′領域およびエキソン２の５′
領域（＋８３７〜＋９６４，開始コドン直前）を含有していた。次に、このＤＮ
Ａフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。一方で、実施例２−
２で得られたｐＣＭベクターをＢａｍＨＩ酵素で消化し、そしてクレノウ酵素で
処置した。平滑末端を有する上述の２種のＤＮＡフラグメントを結合させてＤＯ
Ｎ２ベクターを構築した。さらには、ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２のクレノウ処理Ｈ
ｉｎｄIIIフラグメントに挿入することにより、ＤＯＮ２−ＣＡＴベクターを構
築した（図４ｂを参照）。

【００５３】（２−５）ＤＯＮＳＡ１およびＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴ構築マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライシング受容体を調製するために、一本
鎖オリゴヌクレオチドを合成した。これらはそれぞれ配列番号９（ＳＡトップオ
リゴマー）および配列番号１０（ＳＡボトムオリゴマー）によって表わされた。
２種のオリゴマーのアニーリング反応により付着末端を有するスプライシング受
容体が生成した。ｐＧＥＭ４−ＳＡベクターはフラグメントをｐＧＥＭ４ベクタ
ー（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ部位に挿入することによって
調製した（図４ｃを参照）。

【００５４】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１を増幅するために、ＰＣ
Ｒを実施した。ここでは、実施例２−３のｐＥＱ２７６ベクターを鋳型として使
用し、またそれぞれ配列番号７（ＲＩ５プライマー）および配列番号１１（エキ
ソン１３プライマー）により表わされた２種の合成オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして使用した。

【００５５】増幅したエキソン１フラグメントをｐＺｅｒｏ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ；ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＺｅｒｏ
−エキソン１ベクターを生成させた。次に、ｐＺｅｒｏ−エキソン１のＥｃｏＲ
ＩフラグメントをｐＧＥＭ４−ＳＡのＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングしてｐ
ＧＥＭ−ＳＡ−エキソン１ベクターを調製した。

【００５６】ｐＧＥＭ４−ＳＡ−エキソン１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクレノ
ウで処理して平滑末端とし、次にｐＣＭのクレノウ処理ＢａｍＨＩフラグメント
（実施例２−２で得られたもの）と結合させて、ＤＯＮＳＡ１ベクターを構築し
た。

【００５７】さらには、ＤＯＮＳＡ１のＨｐａＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより
、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴベクターを構築した（図４ｃを参照）。

【００５８】（２−６）ＣＡＴアッセイＤＯＮ１．２−ＣＡＴ、ＤＯＮ２−ＣＡＴ、ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴおよびＬ−
ＣＡＴ−ＳＮベクターをパッケージング系ＦｌｙＡ１３（Cosset等，J. Virol.,
69 : 7430-7436, 1995）にトランスフェクションした。トランスフェクション
した系を４８時間培養した後、細胞を含まないウイルス上澄液を調製してＮＩＨ
３Ｔ３細胞を形質導入した。形質導入した系を４８時間培養した。トランスフェ
クションまたは形質導入した系でのＣＡＴ活性を実施例１−３の方法に従って測
定し、これにより相対遺伝子発現レベルを分析した。

【００５９】表２に示すように、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴでトランス
フェクションされたＦｌｙＡ１３系でコントロール系（Ｌ−ＣＡＴ−ＳＮでトラ
ンスフェクションされた）より著しくより高いレベルのＣＡＴ活性が観察された
。さらに、ＤＯＮ１．２−ＣＡＴまたはＤＯＮ２−ＣＡＴベクターで安定に形質
導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞はコントロール系よりも５−乃至１０−倍高いＣＡ
Ｔ活性を示した。ＤＯＮＳＡ１−ＣＡＴでトランスフェクションまたは形質導入
された細胞系の場合、コントロールよりも少し高いＣＡＴ活性が観察された。こ
れらの結果は、スプライシングに関連する非相同性非コード領域を発現ベクター
中の外来遺伝子の上流位置に挿入すると、スプライシング効率および遺伝子発現
効率が上昇し得ることを示唆していた。

【００６０】ＤＯＮおよびＤＯＮＳＡ１ベクターで形質転換された大腸菌菌株をそれぞれＴ
ＯＰ１０−ＤＯＮ２およびＴＯＰ１０−ＤＯＮＳＡ１と称した。これらは１９９
８年６月５日付けで韓国微生物カルチャーセンター（ＫｏｒｅａｎＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｅｎｔｅｒｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に寄託されていた（
それぞれ受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２８およびＫＣＣＭ−１０１２７）。

【００６１】

【表２】

【００６２】実施例３：ヒト遺伝子のイントロンおよび（または）エキソンの挿入この実施例では、ＭＩＮ−由来レトロウイルスベクター、ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩ
Ｎ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭＩＮ−２を構築し、その結果外来遺伝子の転写
、スプライシングおよび翻訳の率が真核細胞で釣合がとれるようになった。ウイ
ルス配列はＭＩＮベクターおよびΔＳＡベクターに全く含まれていないが、ＭＩ
ＮはＳＶプロモーター−ネオカセットの代わりにＩＲＥＳ−ネオカセットを含有
している（図５参照）。上述した４種のベクターの特徴は以下に述べるとおりで
ある：

【００６３】・ヒトβ−アクチン遺伝子のイントロン、スプライシング受容体および部分エキ
ソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＡＩベクター中外来遺伝子の上流位
置に挿入した。

【００６４】・ヒトＥＦ１α遺伝子のイントロン、スプライシング受容体および部分エキソン
２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＥＩベクター中外来遺伝子の上流位置に
挿入した。

【００６５】・ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のイントロン、スプライシング受容体および部分エキソ
ン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮ−ＧＩベクター中外来遺伝子の上流位置
に挿入した。

【００６６】これらの構築体以外に、非相同性ウイルス配列を挿入したベクターを調製した
。特に、ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）のイントロン、スプライシング受容体
および部分エキソン２を含むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターのクローニン
グ部位の上流位置に挿入したＭＩＮ−２ベクターを調製した。

【００６７】ＭＩＮおよびＭＩＮ由来ＭＩＮ−ＡＩ、ＭＩＮ−ＥＩ、ＭＩＮ−ＧＩおよびＭ
ＩＮ−２ベクターを以下の如くして構築した。（３−１）ＭＩＮの構築ＭＬＶ３′ＬＴＲ領域を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶ（Sh
inneck等、Nature，293 : 543-548, 1981）を鋳型として使用し、また配列番号
１２（３ＬＴＲ５プライマー）および配列番号１３（３ＬＴＲ３プライマー）で
表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。増幅し
たＰＲＣ生成物は３′非翻訳領域、ポリプリントラックおよびＭＬＶゲノムの３
′ＬＴＲを含有していた。ｐＣＲIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）にサブクローニングしたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ酵素
で消化し、そして得られたフラグメントをｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ
部位に挿入した（図６を参照）。

【００６８】一方、レトロウイルス５′ＬＴＲおよびスプライシングドナーを含む非コード
配列を得るために、ＰＣＲを実施し、ここではｐＭＬＶを鋳型として使用し、そ
して配列番号１（ＨＨＩＲプライマー）および配列番号１４（５ＬＴＲ３プライ
マー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使
用した。増幅したＰＣＲ生成物はＭＬＶゲノムの５′ＬＴＲから＋６２３ｂｐま
で（ｇａｇコード配列の直前）のヌクレオチドを含有していた。ＰＣＲ生成物を
ｐＣＲIIベクターにサブクローニングした後、ベクターのＨｉｎｄIII−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントをｐ３ＬＴＲのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐ５
３ＬＴＲベクターを調製した（図６を参照）。

【００６９】最後に、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化によりｐＣＢＩＮ（韓国特許願第９７−４
８０９５号）からＩＲＥＳ／ネオカセットを単離し、次にｐ５３ＬＴＲベクター
のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入してＭＩＮベクターを構築した（図６を参照
）。ＭＩＮ−ＣＡＴベクターを、ＭＩＮベクターの発現効率を分析するために、Ｍ
ＩＮベクターのＢａｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することによっても構築し
た。

【００７０】（３−２）ＭＩＮ−ＡＩの構築ＭＩＮベクターに挿入されるヒトヌクレオチド配列を調製するために、ゲノム
ＤＮＡをヒトの細胞から抽出した。まず、フィコール−パキュー勾配遠心分離に
より、ヒトの血液から末梢血液単核細胞を分離した。一度または二度洗浄し、再
び採集した後、細胞をＴＥＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．０），１０
ｍＭＥＤＴＡ，０．７％ＳＤＳ）で溶解した。細胞溶解物にプロティナーゼＫ
（４００μｇ／ｍｌ）を加え、そして溶解物を５０−５５℃で１−２時間インキ
ュベートし、次にフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した
。

【００７１】単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、ここでヒトβ−アクチン
遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロンおよび部分エキソン２を含むＤ
ＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲプライマーは配列番号１５（β−アクチン
５プライマー）および配列番号１６（β−アクチン３プライマー）によって表わ
される２種の合成オリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクタ
ーにサブクローニングし、そして次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメン
トをｐＣ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−
ＮｈｅＩ部位に挿入してｐβアクチンを調製した。

【００７２】ｐβアクチンのクレノウ処理ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトβ−ア
クチン遺伝子の＋７１７〜＋８４９に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラ
ーゼ処理ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ａを参照）。得られたベク
ターをＭＩＮ−ＡＩと称した。さらに、ＭＩＮ−ＡＩの発現効率を分析するためにＭＩ−ＡＩベクターのＢａ
ｍＨＩ部位にＣＡＴ遺伝子を挿入することにより、ＭＩＮ−ＡＩＣＡＴベクター
を構築した。

【００７３】（３−３）ＭＩＮ−ＥＩの構築ヒトＥＦ１α遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した。
実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲで鋳型として使用し、また配列番
号１７（ＥＦ１α５プライマー）および配列番号１８（ＥＦ１α３プライマー）
で表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した
。ＰＣＲ生成物はヒトＥＦ１α遺伝子のプロモーター、エキソン１、イントロン
および部分エキソン２を含有していた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブ
クローニングし、次にベクターのＭｌｕＩ−ＮｈｅＩフラグメントをｐＣ３．１
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に
挿入してｐＥＦ１αを調製した。

【００７４】ｐＥＦ１αのクレノウ処理ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヒトＥＦ１α
遺伝子の＋７７２〜＋１００８に相当）をＭＩＮベクターのＴ４−ポリメラーゼ
処理ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した（図７ｂを参照）。得られたベクター
をＭＩＮ−ＥＩと称した。

【００７５】さらに、ＭＩＮ−ＥＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴカセット
をＭＩＮ−ＥＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＥＩ
ＣＡＴベクターを構築した。ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株
Ｔｏｐ１０に導入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ形質転換細胞をＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ（
Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月２日付けで韓国微生物カルチャーセ
ンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６３）。

【００７６】（３−４）ＭＩＮ−ＧＩの構築ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の非コード配列を得るために、ゲノムＰＣＲを実施した
。実施例３−２で単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲでの鋳型として使用し、また配
列番号１９（Ｇｉｎｔ５プライマー）および配列番号２０（Ｇｉｎｔ３プライマ
ー）によって表わされる２種の合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし
て使用した。ＰＣＲ生成物は、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の＋１８５〜＋３１７に相
当するヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン２を含有して
いた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲIIベクターにサブクローニングし、次にベクターの
ＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ部
位に挿入した。得られたベクターをＭＩＮ−ＧＩと称した（図７ｃを参照）。

【００７７】さらに、ＭＩＮ−ＧＩベクターの発現効率を分析するために、（ＡＴ遺伝子と
ＭＩＮ−ＧＩベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−ＧＩＣ
ＡＴベクターを構築した。

【００７８】（３−５）ＭＩＮ−２の構築ＤＯＮ２のＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ＨＣＭＶｉｅｌ遺伝子の＋
８３７〜＋９６４に相当）を調製し、これはＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺
伝子のイントロン、スプライシング受容体および部分エキソン２を含有していた
。このＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭＩＮベクターのＭｌｕＩ−Ｂａｍ
ＨＩ部位に挿入した（図７ｄを参照）。得られたベクターをＭＩＮ−２と称した
。

【００７９】さらに、ＭＩＮ−２ベクターの発現効率を分析するために、ＣＡＴ遺伝子をＭ
ＩＮ−２のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、ＭＩＮ−２ＣＡＴベクターを
構築した。ＭＩＮ−２ＣＡＴを大腸菌菌株Ｔｏｐ１０に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉ
形質転換細胞をＭＩＮ−２ＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）と称し、そして１９９９年６月
２日付けで韓国微生物カルチャーセンターに寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ−１
０１６４）。

【００８０】（３−６）ＣＡＴアッセイ上述の４種のベクターの外来遺伝子発現効率およびパッケージング能力を検討
するために、ベクターをＣＡＴアッセイに付し、ここではＣＡＴ挿入形態の周知
のレトロウイルスベクター、ＭＦＧおよびＬＸＳＮ、をコントロールベクターと
して使用した（Miller等、Biotechniques, 7 : 980-990, 1981 ; Ohashi等、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 11332-11336, 1992）。パッケージング系Phoen
ix(KinsellaおよびNolan, Hum. Gene. Ther. 7 : 1405-1413）をこれらのベクタ
ーでトランスフェクションし、次に４８時間培養した。一方、培養した培地を０
．４５μｍフィルターで濾過することによって得られた細胞を含まないウイルス
上澄液をＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）を形質導入するのに用
いた。ＣＡＴ活性のレベルを形質導入後２日にタンパク質抽出液を用いて測定し
た。ＣＡＴ活性を各ベクターでトランスフェクションまたは形質導入した細胞系
（表３での「一過性トランスフェクション」および「形質導入、一過性」の欄を
参照）、および抗生物質耐性細胞集団（表３での「形質導入、安定」の欄を参照
）で測定した。さらに、ＣＡＴ活性を４週間継代培養した安定な細胞集団で測定
した（表３での「形質導入安定（４週間）」の欄を参照）。トランスフェクショ
ンした細胞系での遺伝子発現レベルおよびウイルス力価を各ベクターでトランス
フェクションまたは形質導入した系で測定したＣＡＴ活性から測定した。

【００８１】表３に示すように、全てのレトロウイルスベクターは、ＬＸＳＮベクターを除
いて、ＭＩＮベクターよりも高いＣＡＴ活性を示した。しかし、ＣＡＴ活性は挿
入された非相同性配列に基づいて変化した。特に、ＭＩＮ−ＥＩおよびＭＩＮ−
２は著しく高いレベルの遺伝子発現を生じた。ＭＩＮ−ＥＩまたはＭＩＮ−２で
安定に形質導入された細胞は４週間継代培養した後でも一層高い遺伝子発現レベ
ルを生じたことは極めて注目すべきことであった。

【００８２】

【表３】

【００８３】

【発明の効果】

前文に開示し、実証した如く、本発明は遺伝子療法等に多くの利点を有するレ
トロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは以下のような効果を有し
ている：

【００８４】１．レトロウイルスコード配列（ｇａｇ．ｅｎｖおよびｐｏｌ配列）が全て欠失
しているので、相同性組換えにより複製能力をもつレトロウイルスが生じる可能
性を完全に排除することができる。

【００８５】２．非相同性イントロン、スプライシング受容体および（または）非コード領域
が外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているので、ベク
ター中の外来遺伝子を安定して、効率よく発現させることができる。

【００８６】３．５′ＬＴＲ中のＵ３領域が特にヒト細胞で転写を強く誘起する非相同性プロ
モーターで置換されているので、ベクターでトランスフェクションされたヒト細
胞由来のパッケージング系は一層高いレベルのＲＮＡを生成し、それでウイルス
力価の増大を示している。

【００８７】４．ＩＲＥＳまたは非相同性プロモーターを用いてベクター中で２種またはそれ
以上の外来遺伝子を同時に発現させる。この場合、最小プロモーターを、非相同
性内部プロモーターの干渉を減少させ、そして外来遺伝子を一層大きなサイズで
クローニングするために、挿入非相同性プロモーターとして使用することができ
る。

【００８８】上記の記載で開示した概念および特定の態様を本発明の同一の目的を実施する
ためのその他の態様を変形または設計するための基礎として容易に利用し得るこ
とは当業者に明白である。このような均等の態様は付属の請求の範囲に記載の発
明の精神および範囲を逸脱するものではないことも当業者に明白である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐｏｌコード領域をＭＯＮベクターから欠失させてΔＳＡベクターを構築し、
次にＣＡＴ遺伝子をΔＳＡベクターに挿入してΔＳＡ−ＣＡＴベクターを生成す
る手順を示す図。

【図２】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のイントロンおよび（または）エキソ
ンを含有するレトロウイルスベクターの構造を図式で示す図。

【図３ａ】ＳＶ４０最小プロモーター−ネオカセットでＩＲＥＳ−ネオカセットを置換し
てＭＳＮベクターを得て、次にＳＮ−３ＬＴＲベクターがＳＶ４０最小プロモー
ターおよびＭＬＶ３′ＬＴＲを含むフラグメントをｐＵＣ１８に挿入することに
より構築される手順を示す図。

【図３ｂ】ＨＣＭＶ主要前初期プロモーターを含有するキメラＬＴＲをＳＮ−３ＬＴＲベ
クターに挿入する手順を示す図。

【図４ａ】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１、イントロンＡおよび部
分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ
１．２ベクターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ１．２に挿入してＤ
ＯＮ１．２−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。

【図４ｂ】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡおよび部分エキソ
ン２を含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮ２ベクタ
ーを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮ２に挿入してＤＯＮ２−ＣＡＴを
生成させる手順を示す図。

【図４ｃ】マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライシング受容体およびＨＣＭＶｉｅｌ
（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１をｐＣＭベクターに挿入してＤＯＮＳＡ１ベ
クターを構築し、次に細菌性ＣＡＴ遺伝子をＤＯＮＳＡ１に挿入してＤＯＮＳＡ
１−ＣＡＴを生成させる手順を示す図。

【図５】ヒト遺伝子のイントロンおよびエキソンを含有するレトロウイルスベクターの
構造を図式で示す図。

【図６】ＭＬＶ５′および３′ＬＴＲを含有するＤＮＡフラグメントを調製し、そして
ｐＵＣ１８に挿入してｐ５３ＬＴＲベクターとし、次にｐＣＢＩＮから単離した
ＩＲＥＳ−ネオカセットをｐ５３ＬＴＲに挿入することによりＭＩＮベクターを
構築する手順を示す図。

【図７ａ】ヒトβ−アクチン遺伝子含有ゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１α
遺伝子の部分イントロン１、スプライシング受容体および部分エキソン２を含有
するＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入する手順を示す図。

【図７ｂ】ヒトＥＦ１α遺伝子を含有するゲノムＰＣＲ生成物が得られ、次にヒトＥＦ１
α遺伝子の部分イントロン１、スプライシング受容体および部分エキソン２を含
むＤＮＡフラグメントをＭＩＮベクターに挿入するＭＩＮ−ＥＩ構築の手順を示
す図。

【図７ｃ】ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の部分イントロン１、スプライシング受容体および部分
エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがゲノムＰＣＲによって得られ、次に
ＭＩＮベクターに挿入されるＭＩＮ−ＧＩ構築の手順を示す図。

【図７ｄ】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロンＡ、スプライシング
受容体および部分エキソン２を含有するＤＮＡフラグメントがＭＩＮベクターに
挿入されるＭＩＮ−２構築の手順を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユ，セウンシン大韓民国 138−050 ソウルソンパ−クパンギー−ドンオリンピックアプト＃123−103 (72)発明者キム，ジョン−ムーク大韓民国 151−057 ソウルクワナク− クポンチョン−ドン 296 ヒュンダイアプト＃202−1603 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA04 DA02 DA03 EA02 FA02 GA11 HA01 HA17 4B065 AA97X AB01 BA02 CA24 CA44 【要約の続き】同時発現が可能となる。本発明の改善されたレトロウイルスベクターは安全であり、かつ外来遺伝子を効率よく発現することがわかっているので、遺伝子療法等に有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）−コードｇａｇ，ｅｎｖお
よびｐｏｌ配列を完全に欠失しているＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項２】外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され
ている非相同性イントロンおよび（または）非相同性スプライシング受容体を含
有する請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項３】非相同性イントロンおよび（または）非相同性スプライシン
グ受容体が、ＨＣＭＶ（ヒトサイロメガロウイルス）ｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝
子、ＥＦ１α（延長因子１α）遺伝子、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子、β−アクチン遺伝子およびマウス免疫グロブリ
ン遺伝子のイントロンおよび（または）スプライシングからなる群から選択され
る請求項２記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項４】外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され
た非相同性非コード配列を含有する請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイル
スベクター。
【請求項５】非相同性非コード配列がＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺
伝子、ＥＦ１α遺伝子、ＧＡＰＤＥ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の非コード
配列からなる群から選択される請求項４記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベ
クター。
【請求項６】ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配列（−４１９〜−１
ｂｐ）が非相同性プロモーターで置換されている請求項１記載のＭＬＶベースの
レトロウイルスベクター。
【請求項７】非相同性プロモーターがＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで
ある請求項６記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項８】外来遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され
た非相同性プロモーターを含有する請求項１記載のＭＬＶベースのレトロウイル
スベクター。
【請求項９】非相同性プロモーターがＳＶ４０最小プロモーターである請
求項８記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項１０】マウス免疫グロブリン遺伝子のスプライシング受容体およ
びＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子のエキソン１が外来遺伝子のためのク
ローニング部位の上流位置に挿入され；ＭＬＶ５′ＬＴＲのフルレングスＵ３配
列（−４１９〜−１ｂｐ）がＨＣＭＶ主要前初期プロモーターで置換され；そし
てＳＶ４０最小プロモーターが外来遺伝子のためのクローニング部位の下流位置
に挿入されているＤＯＮＳＡ１ベクターである請求項８記載のＭＬＶベースのレ
トロウイルスベクター。
【請求項１１】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）遺伝子の部分イントロン
Ａ（１１２−ｂｐ３′フラグメント）および部分エキソン２（エキソン２の５′
末端から開始コドン直前の配列までをカバーしている５′フラグメント）が外来
遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入され；ＭＬＶ５′ＬＴＲのフ
ルレングスＵ３配列（−４１９〜−１ｂｐ）がＨＣＭＶ主要前初期プロモーター
で置換され；そしてＳＶ４０最小プロモーターが外来遺伝子のためのクローニン
グ部位の下流位置に挿入されているＤＯＮ２ベクターである請求項２記載のＭＬ
Ｖベースのレトロウイルスベクター。
【請求項１２】ヒトＥＦ１α遺伝子の部分イントロンおよび部分エキソン
２（＋７７２〜＋１００８ｂｐ）を含むＤＮＡフラグメントが外来遺伝子のため
のクローニング部位の上流位置に挿入されているＭＩＮ−ＥＩベクターである請
求項４記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項１３】ＨＣＭＶｉｅｌ（ＵＬ１２３）の部分イントロンＡおよ
び部分エキソン２（＋８３７〜＋９６４ｂｐ）を含むＤＮＡフラグメントが外来
遺伝子のためのクローニング部位の上流位置に挿入されているＭＩＮ−２ベクタ
ーである請求項４記載のＭＬＶベースのレトロウイルスベクター。
【請求項１４】請求項１０記載のＤＯＮＳＡ１ベクターで形質転換された
大腸菌菌株Ｔｏｐ１０−ＤＯＮ２（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２７）。
【請求項１５】請求項１１記載のＤＯＮ２ベクターで形質転換された大腸
菌菌株Ｔｏｐ１０−ＤＯＮ２（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１２８）。
【請求項１６】請求項１２記載のベクターのクローニング部位に細菌ＣＡ
Ｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含むＭＩＮ−
ＥＩＣＡＴベクターで形質転換された大腸菌菌株ＭＩＮ−ＥＩＣＡＴ（Ｔｏｐ１
０）（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１６３）。
【請求項１７】請求項１３記載のベクターのクローニング部位に細菌ＣＡ
Ｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含むＭＩＮ
−２ＣＡＴで形質転換された大腸菌菌株ＭＩＮ−２ＣＡＴ（Ｔｏｐ１０）（受託
番号：ＫＣＣＭ−１０１６４）。