ES2260918T3

ES2260918T3 - Vectores retrovirales de alta eficiencia que no contienen secuencias codificadoras virales.

Info

Publication number: ES2260918T3
Application number: ES99929919T
Authority: ES
Inventors: Sunyoung Kim; Seung Shin Yu; Jong-Mook Kim
Original assignee: Viromedica Pacific Ltd
Current assignee: Helixmith Co Ltd
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: DE69931023T2; JP2002519037A; DK1032697T3; CN1154744C; PT1032697E; US6451595B1; AU4655499A; EP1032697A1; EP1032697B1; RU2203321C2; DE69931023D1; KR20000006334A; CN1277636A; ATE324460T1; WO2000000629A1; ID24192A; JP3864049B2

Abstract

Vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina (MLV), caracterizado porque las regiones de codificación gag, env y pol del MLV se han suprimido completamente.

Description

Vectores retrovirales de alta eficiencia que no contienen secuencias codificadoras virales.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vectores retrovirales mejorados para la terapia genética. En particular, esta invención se refiere a vectores de expresión retrovirales seguros y eficaces en los que se suprimen completamente todos los genes retrovirales, es decir gag, env y pol, donde un intrón heterólogo, un aceptor de extensión y/o una secuencia no codificadora está(n) insertado(s) en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño; donde un promotor interno heterólogo o un sitio de entrada interno ribosómico (en adelante, denominado "IRES") se inserta en posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación; y donde la secuencia de longitud total U3 5' LTR (Repetición Terminal Larga) o un promotor heterólogo fuerte controla la expresión del gen extraño.

Antecedentes

Los vectores retrovirales se han venido utilizando para la terapia genética con más frecuencia que cualquier otro vector, empleándose en más del 50% de los protocolos clínicos aprobados en el mundo (Wiley - Journal de Gene Medicine Website; http://www.wiley.co.uk/genetherapy). Aunque se utilicen predominantemente vectores basados en el Virus de la Leucemia Murina (en adelante, denominado "MLV"), siguen presentándose muchos problemas con los vectores retrovirales en su utilización clínica. El problema más serio es su inocuidad; el vector retroviral pertenece al vector viral y puede convertirse por ello en células de retrovirus de replicación-competente (en adelante denominada "RCR"). Sobre todo, es de gran preocupación la producción de RCR a través de la recombinación homóloga.

Todos los vectores retrovirales disponibles contienen en cantidad significativa largas secuencias de codificación viral. Como estas secuencias están presentes también en el genoma de las células empaquetadoras a partir de las cuales se liberan los vectores empaquetados, se ha sugerido que puede tener lugar una recombinación homóloga entre la misma secuencia de nucleótidos en el genoma empaquetador y el vector, lo que resulta en la producción de RCR, lo que fue investigado por Miller y col. (Miller y col., Human Gene Ther., 1:5, 1990).

En la terapia genética con mucha frencuencia se utilizan dos tipos de vectores retrovirales basados en el MLV, vectores de la serie LN y vector de MFG (Miller and Roseman, Biotechniques, 7:980-990, 1989; Dranoff y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:3539-3543, 1993). Aunque la expresión de un gen extraño en los vectores de la serie LN esté controlada por un promotor interno heterólogo o por LTR, el nivel de transcripción en el vector MFG se encuentra bajo el control de la LTR, y el gen extraño se expresa como una forma de ARN genómico o de ARN subgenómico prolongado. Los vectores de la serie LN, que a menudo son considerados como los vectores retrovirales de cebadora generación, contienen la secuencia de codificación gag de 420 pb. Aunque se pueda pensar que esta región desempeñaba un papel importante en el empaquetamiento viral, se ha descubierto que la región gag puede suprimirse sin ningún efecto significativo de la envoltura viral y concentración bajo ciertas condiciones (Kim y col., J. Virol., 71:994-1004, 1998).

En comparación con los vectores de la serie LN, el vector de MFG es conocido por conducir a niveles más estables y más altos de expresión genética, y produce concentraciones virales más altas en la mayoría de las líneas celulares humanas o derivadas del ratón (Byun y col., Gene Ther., 3:780-788, 1996). Sin embargo, el vector MFG contiene aun más secuencias virales codificantes, 420 pb para gag, 377 pb para pol y 99 pb para env, aumentado la posibilidad de una frecuencia incluso mayor de producción de RCR que los vectores de la serie LN.

Para superar estos inconvenientes asociados a los vectores retrovirales convencionales, nosotros, inventores de esta invención, hemos construido un vector retroviral (SOLICITUD DE PATENTE COREANA NO. 97-48095 publicada como KR246096), que poseía las diversas características siguientes:

\bullet: las transcripciones del gen clonado se prolongaban de forma efectiva, produciendo niveles de expresión del gen mayores,

\bullet: las secuencias gag y env fueron suprimidas completamente sin una pérdida de concentración viral,

\bullet: se utilizó IRES para la expresión simultánea de dos o más genes en un vector,

\bullet: se insertó el sitio de multiclonación en el vector para facilitar la clonación del gen extraño.

Como se suprimieron las secuencias gag y env de los vectores retrovirales, la seguridad de los vectores aumentó en comparación con la de otros vectores retrovirales. Sin embargo, este vector sigue conteniendo la secuencia de codificación de 377 pb pol que aloja la secuencia del aceptor de unión, así como su secuencia "downstream" (aguas abajo) que contiene la secuencia líder de 284 pb para env (transcrita pero no traducida), porque la supresión de la secuencia pol conduciría a una prolongación anormal o ineficaz. Como la secuencia de 377 pb para pol está presente también en el genoma de las líneas empaquetadoras, la posibilidad de recombinación homóloga que resulta en la producción de RCR sigue estando presente en el vector.

De forma similar, la WO 98/12338 también describe un vector retroviral en el cual las secuencias gag y env han sido suprimidas.

Para desarrollar nuevos vectores retrovirales con gran eficacia de expresión genética así como con una mayor seguridad, hemos construido vectores retrovirales que no contienen ninguna secuencia de codificación viral. Esta invención se lleva a cabo mediante la construcción de vectores retrovirales, donde se suprime completamente el gen pol derivado de MLV, excluyendo la posibilidad de producir RCR mediante recombinación homóloga en la línea celular empaquetadora, donde se inserta(n) un intrón heterólogo, un aceptor de unión y/o una secuencia no codificadora en la posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño, lo que maximiza la eficacia de la expresión genética; donde el 5' LTR o el citomegalovirus humano (en adelante denominado "HCMV"), el principal promotor inmediato temprano (MIEP: promotor del gen ie1), se emplea como elemento cis para la regulación de la expresión del gen extraño; y donde se inserta un promotor interno heterólogo o un IRES en la posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación, permitiendo la expresión simultánea de dos o más genes
extraños.

Sumario de la invención

Un objeto de esta invención consiste en proporcionar vectores retrovirales seguros en los cuales el(los) gen(es) extraño(s) es(son) expresado(s) a niveles más altos y, por tanto, puede(n) ser utilizado(s) eficazmente para la terapia genética.

De acuerdo con la presente invención, el objeto anteriormente mencionado se consigue fácilmente.

Esta invención proporciona un vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina (MLV), en el cual se suprimen completamente las regiones de codificación gag, env y pol del MLV.

En un aspecto, los vectores retrovirales basados en el MLV de esta invención pueden contener un intrón heterólogo y/o un aceptor de unión heterólogo que se inserta(n) en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño.

En otro aspecto, los vectores retrovirales basados en el MLV de esta invención pueden contener una secuencia heteróloga no codificadora insertada en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen
extraño.

En otro aspecto, la secuencia de longitud total U3 (-419 a -1 pb) de 5'LTR de MLV puede sustituirse por un promotor heterólogo en los vectores retrovirales basados en el MLV de esta invención.

En todavía otro aspecto, los vectores retrovirales basados en el MLV de esta invención pueden contener un promotor heterólogo en posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación para un gen extraño.

Esta invención proporciona también las cepas de E. coli transformadas con los vectores retrovirales basados en el MLV de esta invención.

Otras características de la presente invención se describen a continuación.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 representa el procedimiento por el cual se suprime la región de codificación pol del vector MON para construir el vector \DeltaSA, y luego se inserta el gen CAT en el vector \DeltaSA para producir el vector \DeltaSA-CAT

Fig. 2 representa esquemáticamente las estructuras de los vectores retrovirales que contienen el intrón y/o exón del gen ie1 (UL123) HCMV

Fig. 3a representa el procedimiento por el cual un neo-cassette promotor mínimo de SV40 es sustituido por un neo-cassette IRES para obtener el vector MSN, y luego el vector SN-3LTR se construye mediante la inserción del fragmento que contiene el promotor mínimo SV40 y 3' LTR MLV en pUC18

Fig. 3b representa el procedimiento por el cual se inserta en el vector SN-3LTR una LTR quimérica que contiene el principal promotor inmediato temprano de HCMV

Fig. 4a representa el procedimiento por el cual un fragmento de ADN que contiene el exón 1, el intrón A y el exón 2 parcial del gen ie1 (UL123) HCMV se inserta en el vector pCM para construir el vector DON1.2, y luego el gen bacteriano CAT se inserta en DON1.2 para producir DON1.2-CAT

Fig. 4b representa el procedimiento por el cual un fragmento de ADN que contiene el intrón A parcial y el exón 2 parcial del gen ie1 (UL123) HCMV se inserta en el vector pCM para construir el vector DON2, y luego el gen bacteriano CAT se inserta en DON2 para producir DON2-CAT

Fig. 4c representa el procedimiento por el cual un aceptor de unión del gen de inmunoglobulina de ratón y el exón 1 del gen ie1 (UL123) HCMV se insertan en el vector pCM para construir el vector DONSA1, y luego el gen bacteriano CAT se inserta en DONSA1 para producir DONSA1-CAT

Fig. 5 representa esquemáticamente las estructuras de los vectores retrovirales que contienen intrones y exones de genes humanos

Fig. 6 representa el procedimiento por el cual un fragmento de ADN que contiene MLV 5' y 3' LTR es preparado e insertado en pUC18 para producir el vector p53LTR, y luego se construye el vector MIN mediante la inserción del neo-cassette IRES aislado de pCBIN en p53LTR

Fig. 7a representa el procedimiento de construcción de MIN-AI, donde se obtiene el producto genómico de PCR que contiene el gen humano de la \beta-actina, y luego un fragmento de ADN que contiene el intrón parcial 1, el aceptor de propolngación y el exón parcial 2 del gen de \beta-actina humano se inserta en el vector MIN

Fig. 7b representa el procedimiento de construcción de MIN-EI, donde se obtiene un producto genómico de PCR que contiene el gen humano EF1\alpha, y luego un fragmento de ADN que contiene el intrón parcial 1, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen humano EF1\alpha se inserta en el vector MIN

Fig. 7c representa el procedimiento de construcción de MIN-GI, donde se obtiene un fragmento de ADN que contiene el intrón parcial 1, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen humano GAPDH mediante PCR genómica y luego se inserta en el vector MIN

Fig. 7d representa el procedimiento de construcción de MIN-2, donde se obtiene un fragmento de ADN que contiene el intrón parcial A, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen ie1 (UL123) HCMV se inserta en el vector MIN

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

La presente invención proporciona vectores retrovirales tanto seguros como eficaces que derivan de los vectores basados en MLV, específicamente de MON o MIN. En los vectores de esta invención se suprimen completamente los genes retrovirales (secuencias de codificación gag, env y pol); un intrón heterólogo, un aceptor de unión y/o una secuencia no codificadora se inserta(n) en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño; un promotor heterólogo fuerte está contenido en 5' LTR; y un promotor heterólogo o un IRES está colocado en posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación.

En particular, en los vectores de esta invención, como se suprime completamente la secuencia de codificación pol que contiene un aceptor de unión, se puede excluir la posibilidad de recombinación homóloga, que ha sido un inconveniente de los vectores retrovirales convencionales.

La supresión de la secuencia pol conduce a la reducción del nivel de expresión del gen. Para restablecer la eficacia de la expresión reducida y la concentración de virus, se proporcionan en esta invención varios vectores retrovirales de la forma siguiente:

\bullet: Esta invención proporciona vectores retrovirales en los cuales se inserta(n) un intrón heterólogo y/o un aceptor de unión en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño con el fin de complementar el aceptor de unión suprimido que se superpone a la parte 3' de la secuencia de codificación pol. Todos los intrones y/o aceptores de prolongación de los genes virales o celulares conocidos pueden utilizarse con este propósito, preferentemente se utilizan los intrones y/o aceptores de prolongación del gen ie1 (UL123) HCMV, el gen 1\alpha (en adelante denominado "EF1\alpha") factor de elongación, el gen gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (en adelante denominado "GAPDH"), el gen de \beta-actina, etc.

\bullet: Esta invención proporciona también vectores retrovirales en los cuales se inserta una secuencia heteróloga no codificadora en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación. Se utiliza la secuencia no codificadora para promover la eficacia de traducción, y se define como una secuencia de ADN transcrita que no se traduce a una proteína, incluidos el intrón y el exón no traducidos. Preferentemente, la secuencia no codificadora se selecciona de entre el grupo que comprende las secuencias no codificadoras del gen ie1 (UL123) HCMV, gen EF1\alpha, gen GAPDH y el gen de \beta-actina. La inserción de la secuencia heteróloga no codificadora permite tanto la unión eficaz del gen extraño transcrito como la traducción efectiva del ARN subgenómico.

\bullet: Además, esta invención proporciona vectores retrovirales en los cuales se aloja un promotor interno heterólogo o IRES en posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación.

\bullet: Finalmente, esta invención proporciona vectores retrovirales que contienn una secuencia de longitud total U3 de 5' LTR o un promotor heterólogo fuerte.

A continuación se describe en detalle la presente invención.

1. Supresión de la secuencia codificadora pol: construcción de \DeltaSA

Para desarrollar los vectores retrovirales de mayor seguridad, es decir, los vectores retrovirales sin actividad de recombinación homóloga, la secuencia de codificación pol que incluye un aceptor de unión se suprimió del vector MON (SOLICITUD DE PATENTE COREANA NO. 97-48095), construyéndose un vector de deleción mutante \DeltaSA. Además, se construyó el vector \DeltaSA-CAT mediante la inserción de un CAT bacteriano (cloranfenicol acetiltransferasa) como gen reporter (véase Fig. 1). Posteriormente, se prepararon las líneas celulares transfectadas o transducidas con \DeltaSA-CAT y se llevaron al ensayo CAT. El ensayo CAT reveló que la concentración viral del mutante de deleción era comparable con la del vector parental MON-CAT pero con la expresión génica reducida (véase la Tabla 1). Estos resultados planteaban que el gen pol que contenía el aceptor de unión estaba involucrado en la regulación de la expresión del gen extraño en un vector.

Tal como se esperaba de los resultados, el nivel de expresión de un gen extraño aumentaría al insertar un aceptor de unión heterólogo y/o un intrón en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño para así complementar el sitio de unión suprimido de forma concomitante con el gen pol. Sin embargo, si la unión es demasiado alta, la relación entre el ARN subgenómico y el ARN genómico aumentará, conduciendo a una disminución de las concentraciones virales a pesar de los altos niveles de expresión del gen.

Por tanto, para construir los vectores retrovirales ideales, los vectores tendrían que ser diseñados para que las velocidades de transcripción, unión y traducción puedan compensarse en la línea transfectada o transducida. En otras palabras, son preferibles los vectores en los cuales un gen extraño se transcribe ampliamente y la cantidad de ARN genómico está equilibrada con la cantidad de ARN subgenómico, de forma que se pueda producir suficiente ARN genómico como para ser empaquetado en partículas virales y que el ARN subgenómico pueda ser suficientemente traducido en la proteína codificada por el gen extraño. En esta invención, se proporcionan vectores retrovirales donde se insertan en el vestor de deleción mutante varias secuencias no codificadoras a partir de genes virales o celulares, y luego se investiga si esta inserción tiene un efecto sobre las concentraciones virales y los niveles de expresión génica.

2. Inserción de una secuencia de ADN heterólogo que aumenta la eficacia de unión y de traducción: construcción de DON1.2, DON2 y DONSA1

Con el fin de mantener el equilibrio entre la velocidad de unión y la velocidad de expresión genética, así como para elevar el la producción general de ARN viral, se construyeron aquellos vectores retrovirales donde la región U3 de MLV 5' LTR fue sustituida por un promotor fuerte, un promotor inmediato temprano principal de HCMV, y donde se insertó una secuencia heteróloga no codificadora.

En una realización preferente, el intrón y/o exón no traducido del gen ie1 (UL123) de HCMV se empleó(aron) como secuencia heteróloga no codificadora insertada en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación del vector (véase Fig. 2). Es sabido que las secuencias de exón y/o intrón del gen ie1 (UL123) de HCMV mejoran la eficacia de traducción cuando están insertadas en un vector de expresión.

En particular, se preparó el vector pCM como sigue: todas las secuencias codificantes retrovirales se suprimieron; la secuencia de longitud total U3 de 5' LTR se sustituyó por el promotor inmediato temprano principal de HCMV, manteniéndose el 3' LTR derivado de MLV; y el neo-cassette del promotor SV40 se empleó como promotor heterólogo interno. Posteriormente, se construyeron los vectores DON1.2, DON2 y DONSA1 mediante inserción del exón 1, el intrón A y/o el exón 2 del gen ie1 (UL123) de HCMV en el vector pCM (véase Fig. 3a, Fig. 3b y Fig. 4a a 4c). Luego, se prepararon los vectores DON1.2-CAT, DON2-CAT y DONSA1-CAT mediante inserción del gen reporter CAT. Las líneas celulares transfectadas o transducidas con estos vectores fueron llevadas al ensayo CAT. A partir del resultado del ensayo CAT, se confirmó que los tres vectores mostraban mayor eficacia en cuanto a la unión y la expresión genética que el vector control L-CAT-SN (véase Tabla 2).

3. Inserción de las secuencias celulares de ADN que pueden promover la unión y expresión genética: construcción de MIN-AI, MIN-EI y MIN-GI

En otra realización preferente, se concibieron además vectores retrovirales para que el equilibrio entre la velocidad de unión y la velocidad de expresión genética pudieran conducir a eficacias más altas tanto de las concentraciones virales como de la expresión genética. En estos vectores, se insertaron secuencias de exón y/o intrón de genes humanos en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para el gen extraño en los vectores retrovirales (véase
Fig. 5).

Para construir estos vectores, se preparó el vector MIN donde toda la región codificadora retroviral se había suprimido; se mantuvieron 5' y 3' LTR derivados de MLV; y se empleó el neo-cassette IRES de EMCV como promotor heterólogo interno. En especial, se preparó el vector MIN según los siguientes pasos: amplificación de un fragmento de ADN que contenía la región MLV 5' y 3' LTR, inserción de este fragmento en el vector pUC18, e inserción del neo-cassette IRES en el vector recombinante (véase Fig. 6). Se insertó un fragmento de ADN que contenía el intrón parcial y el exón parcial 2 del gen de \beta-actina humana, EF1\alpha o el gen GAPDH en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación del vector MIN, construyéndose el vector MIN-AI, MIN-EI, o MIN-GI, respectivamente (ver Fig. 7a a 7c).

Para comparar el vector utilizando el gen celular como aceptor de unión (por ejemplo, MIN-AI, etc.) con uno que utilizara un gen viral (por ejemplo, DON1.2, etc.), se preparó otro vector MIN-2 basado en MLV. De forma más específica, la secuencia de ADN que contiene el intrón parcial A y el exón parcial 2 del gen ie1 (UL123) HCMV se insertó en el vector MIN (véase Fig. 7d). Este inserto es idéntico al del vector DON2.

Entonces se prepararon los vectores MIN-CAT, MIN-AICAT, MIN-EICAT, MIN-GICAT y MIN-2CAT mediante la inserción del gen reporter CAT en el vector correspondiente. Las líneas celulares transfectadas o transducidas con estos vectores se llevaron al ensayo CAT. El resultado del ensayo CAT reveló que las concentraciones virales de todos los vectores de esta invención eran similares a las de los vectores control LXSN y MFG, mientras que los niveles de expresión genética en las líneas celulares transfectadas o transducidas con MIN-2 y MIN-EI eran mucho más altos que los de las líneas celulares que contenían los vectores control (véase Tabla 3).

Ejemplos

Las realizaciones prácticas y actualmente preferentes de la presente invención son ilustrativas tal como se muestra en los siguientes Ejemplos.

Sin embargo, se apreciará que los especialistas en la técnica, considerando esta descripción, pueden realizar modificaciones y mejoras dentro del espíritu y el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Supresión del gen pol del vector MON (1-1) Construcción de \DeltaSA

Para preparar la secuencia "downstream" (aguas abajo) 5' LTR que carece de la secuencia de codificación pol, se realizó una PCR (Reacción Cascada de la Polimerasa), donde se emplearon el vector MON (SOLICITUD DE PATENTE COREANA NO. 97-48095) como molde y dos oligonucleótidos sintéticos de una hebra descritos por la SEQ ID NO: 1 (cebador HHIR) y NO: 2 (cebador R523Bam) como cebadores. Los fragmentos amplificados de ADN correspondían a la secuencia de nucleótidos procedentes de MLV 5' LTR a +523 ob (véase Fig. 1). En este caso, +1 representa el sitio de inicio de la transcripción del genoma de MLV, y la secuencia de +212 a +523 pb es una secuencia no codificadora necesaria para envolver el ARN genómico.

El producto PCR fue subclonado en pCRII (Invitrogen, CA, USA) y luego se preparó el fragmento HindIII-BamHI a partir del vector resultante. Se sustituyó un fragmento parcial de HindIII-BamHI del vector MON por el fragmento HindIII-BamHI del producto PCR, construyéndose el vector \DeltaSA. Este vector \DeltaSA se utiliza como esqueleto elemental de los vectores retrovirales que contienen MLV 5' y 3' LTR, y la secuencia no codificadora 5' que comprende un aceptor de unión, el neo-cassette IRES y trazas de polipurina, con todas las secuencias retrovirales de codificación suprimidas (véase Fig. 1).

(1-2) Construcción de \DeltaSA-CAT

Para investigar el efecto de la manipulación genética anterior sobre la expresión del gen extraño y sobre la envoltura del ARN genómico retroviral, se empleó un gen bacteriano CAT como gen reporter.

Se obtuvo el gen CAT mediante PCR utilizándose el vector básico pCAT3 (Promega, WI, USA) como molde y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por la SEQ ID NO:3 (cebador CATATGN) y NO: 4 (cebador CATSTOP) como cebadores. Se insertó el producto PCR en pCRII (Invitrogen, CA, USA) y el fragmento BamHI del vector resultante, que contiene el gen CAT, se introdujo en pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) para preparar pC3.1-CAT. El vector \DeltaSA-CAT se construyó mediante la inserción del gen CAT (fragmento de pC3.1-CAT XbaI-HindIII tratado con Klenow) en el sitio HpaI del vector \DeltaSA (véase Fig. 1).

(1-3) Ensayo CAT

Se transfectaron \DeltaSA-CAT y el vector control (MON-CAT), junto con los vectores empaquetadores Gag-Pol y Env, a células 293T (DuBridge y col., Mol. Cell. Biol., 7: 379-387, 1987). Después cultivar células transfectadas durante 48 horas, se extrajeron las proteínas citosólicas para medir la actividad CAT, indicadora del nivel de expresión del gen extraño. Mientras tanto, los sobrenadantes virales libres de células, obtenidos mediante filtración del medio de cultivo en un filtro de 0,45 \mum, se utilizaron para transducir células NIH3T3 (ATCC CRL 1658). Se determinó el nivel de actividad CAT utilizando el extracto de proteína 48 horas después de la transducción.

Se llevó a cabo el ensayo CAT como sigue: primero, se recogieron las células y se lavaron con 1 ml de PBS (solución salina tampón de fosfato), y se resuspendieron en tampón Tris (pH 7,5) 0,25M. Se lisaron las células repitiendo 6 veces un ciclo de congelación (en hielo seco) - descongelación (en baño de agua a 37ºC). Después de calentar el extracto celular resultante a 60ºC durante 7 minutos para inactivar la desacetilasa, se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos y se rescató el sobrenadante. Se cuantificó el nivel de proteínas en el extracto según el método de Bradford. Se mezcló el extracto normalizado con 1 \mul de ^{14}C-cloranfenicol (60 mCi/mmol, 0,1 mCi/ml), 2 \mul de acetilcoenzima A (40mM) y un volumen apropiado de Tris (pH de 7,50) 0,25M. Se incubó esta mezcla de reacción a 37ºC durante el tiempo de reacción adecuado. Después de la reacción, se extrajo el cloranfenicol con acetato de etilo y se concentró a presión reducida. Se resuspendió el granulado en 15 \mul de acetato de etilo y se cargó en una placa de cromatografía en capa fina (TLC). Después de realizar la TLC utilizando el disolvente de desarrollo de TLC (95% de cloroformo, 5% de metanol), se secó la placa de TLC y luego se expuso a una película de rayos X o se llevó a un analizador fosfoimagen, para que poder medir el nivel de acetilación del cloranfenicol. Se pudo calcular la actividad CAT en una muestra a partir del coeficiente de radioactividad del cloranfenicol acetilado con respecto al cloranfenicol total.

La Tabla 1 muestra que la actividad CAT en la línea celular 293T transfectada con \DeltaSA-CAT que carece del gen pol era inferior a la de la línea control transfectada con MON-CAT. Esto sugiere que la secuencia de codificación pol está implicada en la regulación de la expresión génica. Además, la actividad CAT en la línea transducida siguió un patrón similar al de la línea transfectada, lo que implica que la eficacia de empaquetamiento tiene relación con la eficacia de expresión génica.

TABLA 1 Efecto de la supresión de pol sobre el nivel de expresión génica

Vector	Línea celular
	Células 293T	Células NIH3T3
MON-CAT	1,0	1,0
\DeltaSA-CAT	0,5 \pm 0,1	0,4 \pm 0,1

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Ejemplo 2 Inserción del promotor y del exón y/o intrón del gen ie1 (UL123) HCMV

Con el fin de mantener el equilibrio entre la velocidad de unión y la velocidad de traducción, así como para mejorar la producción general de ARN viral, se construyeron los vectores retrovirales derivados de MON que comprenden los siguientes tres vectores:

\bullet: El vector DON1.2 donde la secuencia de longitud total U3 5' LTR de MLV se ha sustituido por el promotor inmediato temprano principal de HCMV; y el aceptor de unión de MLV se ha sustituido por un fragmento de ADN que contiene el exón 1, el intrón A y el exón parcial 2 (que termina justo antes del codón de inicio) del gen ie1 (UL123) HCMV,

\bullet: el vector DON2 donde la secuencia de longitud total U3 5' LTR de MLV se ha sustituido por el promotor inmediato temprano prinicpal de HCMV; y el aceptor de unión de MLV se ha sustituido por el fragmento de ADN que contiene el intrón parcial A y el exón parcial 2 del gen ie1 (UL123) HCM, y

\bullet: el vector DONSA1 donde la secuencia de longitud total U3 5' LTR de MLV se ha sustituido por el promotor inmediato temprano prinicpal de HCMV; y el aceptor de unión de MLV se ha sustituido por un fragmento de ADN que contiene el aceptor de unión del gen de inmunoglobulina de ratón y el exón 1 del gen ie1 (UL123) HCMV.

Seguidamente se describe el método detallado de construcción de estos vectores (ver Fig. 3a, Fig. 3b y Fig. 4a a 4c).

(2-1) Construcción de SN-3LTR

En tres variantes de vectores se inserta el neo-cassette del promotor SV40 en posición "downstream" (aguas abajo) del sitio de clonación para un gen extraño (véase Fig. 2). Para construir estas variantes de vectores se preparó un vector que contenía el neo-cassette del promotor SV40 como sigue (ver Fig. 3a y 3b).

Para preparar un vector en el cual se expresa el neo-gen bajo el control del promotor de SV40, se produjo el neo-cassette del promotor SV40 mediante PCR. En la PCR se empleo como molde pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por la SEQ ID NO: 5 (cebador SV40-5) y la NO:6 (cebador neo-3) como cebadores de PCR.

Después de haber subclonado el neo-cassette del promotor SV40 en pCRII (Invitrogen, CA, USA), se insertó el fragmento BamHI-XhoI del vector resultante en el sitio BamHI/XhoI de MON. El vector resultante MSN fue digerido con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y el fragmento BamHI-EcoRI que contiene el neo-cassette del promotor SV40 y 3' LTR fue ligado con el fragmento BamHI-EcoRI de pUC18 para construir el vector SN-3LTR (véase Fig. 3a).

(2-2) Construcción de pCM

Se realizó la PCR con el fin de preparar el vector retroviral donde 5' LTR estaba sustituido por un promotor heterólogo fuerte. Se empleó como molde de PCR un vector retroviral MCC-CAT (SOLICITUD DE PATENTE COREANA NO. 97-48095) que contenía el LTR quimérico donde la secuencia de longitud total U3 (-419 a -1 pb) de 5' LTR MLV se había sustituido por el promotor inmediato temprano principal de longitud total de HCMV. Los cebadores de PCR eran dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ. ID NO: 1 (cebador HHIR) y NO: 2 (cebador R523Bam). Los productos de PCR contenían la secuencia de ADN desde 5' LTR quimérico hasta +523 pb y subclonada en pCRII (Invitrogen, CA, USA). El fragmento HindIII-BamHI de la secuencia subclonada se insertó en el sitio HindIII-BamHI del vector SN-3LTR (obtenido en el Ejemplo 2-1) para preparar el vector pCM (véase Fig. 3b). En el pCM, se suprimieron todas las secuencias retrovirales codificadoras tal como el vector \DeltaSA del Ejemplo 1-1, mientras que 5' LTR y el neo-cassette IRES del vector \DeltaSA se sustituyeron por LTR quimérico y el neo-cassette del promotor SV40, respectivamente. Se empleó como materia prima el vector pCM para el vector DON1.2, DON2 y DONSA1 como se muestra en los Ejemplos 2-3 a 2-5.

(2-3) Construcción de DON1.2 y DON1.2-CAT

Para obtener el fragmento de ADN que contenía el exón 1, el intrón A y el exón 2 (para codón de inicio) del gen ie1 (UL123) de HCMV, se realizó una PCR. El molde PCR fue el vector pEQ276 (Biegalke y col., Virology, 183: 381-385, 1991) que contenía la secuencia de ADN desde el promotor inmediato temprano principal de HCMV hasta el exón 5. Los cebadores PCR estaban descritos por SEQ ID NO: 7 (cebador RI5, hibridizado con el exón 1) y NO: 8 (cebador CMVexon2.3, hibridizado con el exón 2), respectivamente. El fragmento de ADN de 1-kb fue amplificado en la PCR y contenía el exón 1, el intrón A y el exón parcial 2 (que termina justo antes del codón de inicio) del gen ie1 (UL123) de HCMV.

Se insertó el producto PCR en el vector pZero-truncado (Invitrogen, CA, USA) para preparar el vector pZero1.2. Luego, el fragmento EcoRI de pZero1.2 se trató con enzima Klenow para obtener extremos truncados. El vector pCM obtenido en el Ejemplo 2-2 fue digerido con la enzima BamHI y tratado con enzima Klenow. Dos fragmentos de ADN con extremos truncados fueron ligados para construir el vector DON1.2. Además, el vector DON1.2-CAT se construyó mediante la inserción de un gen CAT en el fragmento HindIII tratado con Klenow de DON1.2 (véase Fig. 4a).

(2-4) Construcción de DON2 y DON2-CAT

Se preparó el fragmento HpaI-EcoRI de pZero1.2 del Ejemplo 2-3, que contenía la región 112 pb 3' del intrón A y la región 5' del exón 2 (desde +837 a +964, justo antes del codón de inicio). Luego, este fragmento de ADN fue tratado con enzima Klenow para obtener extremos truncados. Por otro lado, el vector pCM obtenido en el Ejemplo 2-2 fue digerido con la enzima BamHI y tratado con enzima Klenow. Ambos fragmentos de ADN anteriores con extremos truncados fueron ligados para construir el vector DON2. Además, el vector DON2-CAT fue construido mediante la inserción de un gen CAT en el fragmento HindIII tratado con Klenow de DON2 (véase Fig. 4b).

(2-5) Construcción de DONSA1 y DONSA1-CAT

Para preparar el aceptor de unión del gen de inmunoglobulina de ratón, se sintetizaron oligonucleótidos monohebra, descritos por SEQ ID NO. 9 (SA Top oligomer) y NO: 10 (SA bottom oligomer), respectivamente. La reacción de hidridación de los dos oligómeros produjo los fragmentos del aceptor de unión con extremos cohesivos. Se preparó el vector pGEM4-SA mediante la inserción del fragmento en el sitio BamHI del vector pGEM4 (Promega, WI, USA) (véase Fig. 4c).

Para amplificar el exón 1 del gen ie1 (UL123) HCMV, se realizó una PCR, donde como colde se empleó el vector pEQ276 del Ejemplo 2-3 y como cebadores dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ ID NO: 7 (cebador RI5) y NO: 11 (cebador exón 13), respectivamente.

El fragmento amplificado de exón 1 fue subclonado en el sitio EcoRI del vector pZero-truncado (Invitrogen, CA, USA), que produce el vector pZero-exón1. Luego, el fragmento EcoRi de pZero-exón1 fue subclonado en el sitio de EcoRI del pGEM4-SA para preparar el vector pGEM-SA-exón1.

El fragmento XbaI-BamHI de pGEM4-SA-exón1 fue tratado con Klenow para obtener extremos truncados y luego fue ligado con el fragmento BamHI tratado con Klenow de pCM (obtenido en el Ejemplo 2-2), construyéndose el vector DONSA1.

Además, se construyó el vector DONSA1-CAT mediante la inserción del gen CAT en el sitio HpaI de DONSA1 (véase Fig. 4c).

(2-6) Ensayo CAT

Los vectores DON1.2-CAT, DON2-CAT, DONSA1-CAT y L-CAT-SN fueron transfectados a la línea empaquetadora FlyA13 (Cosset y col., J. Virol., 69: 7430-7436, 1995). Después de cultivar las líneas transfectadas durante 48 horas, se prepararon sobrenadantes virales libres de células para transducir las células NIH3T3. Se cultivaron las líneas transducidas durante 48 horas. Se midió la actividad CAT en las líneas transfectadas o transducidas según el método del Ejemplo 1-3, analizándose así los niveles relativos de expresión génica.

Tal como se muestra en la Tabla 2, se observó un nivel notablemente más alto de actividad CAT en la línea F1yA13 transfectada con DON1.2-CAT o DON2-CAT que en una línea control (transfectada con L-CAT-SN). Además, las células NIH3T3 transducidas establemente con el vector DON1.2-CAT o DON2-CAT mostraron una actividad CAT 5 a 10 veces más alta que la de las células control. En el caso de la línea celular transfectada o transducida con DONSA1-CAT, se observó un actividad CAT ligeramente más alta que en el control. Estos resultados sugieren que la eficacia de unión y la eficacia de expresión del gen pueden aumentar cuando una secuencia heteróloga no codificadora implicada en la unión se inserta en posición "upstream" (aguas arriba) del gen extraño en un vector de expresión.

Las cepas de E. coli transformadas con el vector DON2 y DONSA1 fueron designadas TOP10-DON2 y Top10-DONSA1, respectivamente. Se depositaron en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos el 5 de junio de 1998 (número de referencia: KCCM-10128, KCCM-10127, respectivamente).

TABLA 2 Efecto de la inserción de la secuencia heteróloga en el nivel de expresión génica

Vector	Línea celular
	FlyA13	NIH3T3
L-CAT-SN	1,0	1,0
DON1.2-CAT	10,1 \pm 1,5	7,7 \pm 1,6
DON2-CAT	12,5 \pm 2,1	8,0 \pm 2,0
DONSA1-CAT	5,0 \pm 2,0	1,8 \pm 1,2

Ejemplo 3 Inserción del intrón y/o exón de un gen humano

En este ejemplo, se construyeron los vectores retrovirales derivados de MIN, MIN-AI, MIN-EI, MIN-GI y MIN-2 para que las velocidades de transcripción, unión y traducción del gen extraño pudieran ser compensadas en las células eucarióticas. Ninguna de las secuencias virales está incluida en el vector MIN ni tampoco en el vector \DeltaSA, pero MIN contiene el neo-cassette IRES en lugar del neo-cassette del promotor SV (véase Fig. 5). Las características de los cuatro vectores anteriores son las siguientes:

\bullet: Un fragmento de ADN que contiene el intrón, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen de \beta-actina humano se insertó en posición "upstream" (aguas arriba) del gen extraño en el vector MIN-AI.

\bullet: Un fragmento de ADN que contiene el intrón, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen EF1\alpha humano se insertó en posición "upstream" (aguas arriba) del gen extraño en el vector MIN-EI.

\bullet: Un fragmento de ADN que contiene el intrón, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen GAPDH humano se insertó en posición "upstream" (aguas arriba) del gen extraño en el vector MIN-GI.

Aparte de estas constructos, se preparó un vector donde se insertó una secuencia heteróloga viral. En especial, se preparó el vector MIN-2 donde se insertó un fragmento de ADN que contenía el intrón, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen ie1 (UL123) HCMV en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación del vector MIN.

Se construyeron los vectores MIN y MIN-AI, MIN-EI, MIN-GI y MIN-2 derivados de MIN, como sigue.

(3-1) Construcción de MIN

Para obtener la región 3' LTR MLV, se realizó una PCR donde se empleó pMLV (Shinnick y col., Nature, 293: 543-548, 1981) como molde y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ ID NO: 12 (cebador 3LTR5) y NO: 13 (cebador 3LTR3) como cebadores. El producto amplificado de PCR contenía la región 3' no traducida, trazas de polipurina y la 3' LTR del genoma de MLV. El producto de PCR subclonado en el vector pCRII (Invitrogen, CA, USA) se digirió con las enzimas BamHI y EcoRI, y el fragmento resultante se insertó en el sitio BamHI-EcoRI de pUC18 para preparar el vector p3LTR (véase Fig. 6).

Por otro lado, para obtener la secuencia no codificadora que contiene 5' LTR retroviral y el donador de unión, se realizó una PCR donde se empleó pMLV como molde y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ ID NO: 1 (cebador HHIR) y NO: 14 (cebador 5LTR3) como cebadores. El producto amplificado de PCR contenía la secuencia de nucleótidos desde 5' LTR hasta +623 pb (justo antes de la secuencia de codificación gag) del genoma de MLV. Después de haber subclonado el producto de PCR en el vector pCRII, se insertó el fragmento HindIII-BamHI del vector en el sitio HindIII-BamHI de p3LTR para preparar el vector p53LTR (véase Fig. 6).

Finalmente, se aisló el neo-cassette IRES de pCBIN (SOLICITUD DE PATENTE COREANA NO: 97-48095) mediante la digestión de BamHI-XhoI, y luego se insertó en el sitio BamHI-XhoI del vector p53LTR para construir el vector MIN (véase Fig. 6).

El vector MIN-CAT se construyó también mediante la inserción de un gen CAT en el sitio BamHI del vector MIN para analizar la eficacia de expresión del vector MIN.

(3-2) Construcción de MIN-AI

Para preparar las secuencias de nucleótidos humanos que se insertarían en el vector MIN, se extrajo ADN genómico de células humanas. Primero, se separaron células mononucleares de la sangre periférica humana por centrifugación a gradiente Ficoll-Paque. Después de lavarlas una o dos veces y reunirlas de nuevo, se lisaron las células con TES (Tris-Cl 10mM (pH 7,0), EDTA 10mM, SDS al 0,7%). Se añadió proteínasa K (400 \mug/ml) al lisado celular y se incubó esta lisado a 50-55ºC durante 1-2 horas, seguido de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.

Se empleó el ADN genómico aislado como molde para la PCR, cuyo fragmento amplificado de ADN contenía el promotor, el exón 1, el intrón y el exón parcial 2 del gen de \beta-actina humano. Los cebadores de PCR fueron dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ. ID. NO: 15 (cebador 5 beta-actina) y NO: 6 (cebador 3 beta-actina). El producto de PCR fue subclonado en el vector de pCRII, y luego el fragmento MluI-NheI del vector se insertó en el sitio MluI-NheI del vector pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) para preparar p\betaactina.

El fragmento BglI-BamHI tratado con Klenow de p\betaactina (correspondiente a +717 \sim +849 del gen de \beta-actina humano) se insertó en el sitio ApaI/BamHI tratado con polimerasa T4 del vector MIN (véase Fig. 7a). El vector resultante se designó MIN-AI.

Además, se construyó el vector MIN-AICAT mediante la inserción de un gen CAT en el sitio BamHI del vector MIN-AI para analizar la eficacia de expresión de MIN-AI.

(3-3) Construcción de MIN-EI

Para obtener la secuencia no codificadora del gen EF1\alpha humano, se realizó una PCR genómica. Se empleó el ADN genómico aislado en el Ejemplo 3-2 como molde para la PCR y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ. ID NO. 17 (cebador EF1\alpha5) y NO: 18 (cebador EF1\alpha3) como cebadores para la PCR. El producto de la PCR contenía el promotor, el exón 1, el intrón y el exón parcial 2 del gen EF1\alpha humano. El producto de PCR fue subclonado en el vector pCRII, y luego se insertó el fragmento MluI-NheI del vector en el sitio MluI-NheI del vector pC3.1 (Invitrogen, CA, USA) para preparar pEF1\alpha.

Se insertó el fragmento XhoI-BamHI de pEF1\alpha tratado con Klenow (correspondiente a +772 - +1.008 del gen EF1\alpha humano) en el sitio ApaI-BamHI del vector MIN tratado con polimerasa T4 (véase Fig. 7b). El vector resultante fue designado MIN-EI.

Además, se construyó el vector MIN-EICAT mediante la inserción del cassette de CAT en el sitio BamHI del vector MIN-EI con el fin de analizar la eficacia de expresión del vector MIN-EI. Se introdujo el MIN-EICAT en la cepa Top 10 de E. coli, y el transformante de E. coli fue designado MIN-EICAT (Top 10) y se depositó en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos el 2 de Junio de 1999 (No. de referencia: KCCM-10163).

(3-4) Construcción de MIN-GI

Para obtener la secuencia no codificadora del gen GAPDH humano, se realizó una PCR genómica. Se empleó el ADN genómico aislado en el Ejemplo 3-2 como molde para la PCR y dos oligonucleótidos sintéticos descritos por SEQ. ID. NO: 19 (cebador Gint5) y NO: 20 (cebador Gint3) como cebadores para la PCR. El producto PCR contenía el intrón parcial y el exón parcial del gen GAPDH humano, correspondiente a +185 \sim +317 del gen GAPDH humano. El producto de PCR fue subclonado en el vector pCRII, y luego se insertó el fragmento MluI-BamHI del vector en el sitio MluI-BamHI del vector MIN. El vector resultante fue designado MIN-GI (véase Fig. 7c).

Además, se construyó el vector MIN-GICAT mediante la inserción de un gen CAT en el sitio BamHI del vector MIN-GI con el fin de analizar la eficacia de expresión del vector MIN-GI.

(3-5) Construcción de MIN-2

Se preparó el fragmento de MluI-BamHI de DON2 (correspondiente a +837 \sim +964 del gen ie1 de HCMV), el cual contenía el intrón, el aceptor de unión y el exón parcial 2 del gen ie1 (UL123) HCMV. Este fragmento MluI-BamHI se insertó en el sitio MluI-BamHI del vector MIN (véase Fig. 7d). El vector resultante fue designado
MIN-2.

Además, se construyó el vector MIN-2CAT mediante la inserción del gen CAT en el sitio BamHI de MIN-2 para analizar la eficacia de expresión del vector MIN-2. Se introdujo el MIN-2CAT en la cepa Top10 de E. coli. El transformante de E. coli fue designado MIN-2CAT(Top 10) y depositado en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos el 2 de Junio de 1999 (No. de referencia: KCCM-10164).

(3-6) Ensayo CAT

Para investigar la eficacia de expresión del gen extraño y la capacidad de envoltura de los cuatro vectores anteriores, se llevó a cabo el ensayo CAT de los vectores, en el cual se emplearon formas CAT insertadas de los vectores retrovirales bien conocidas, MFG y LXSN, como vectores control (Miller y col., Biotechniques, 7: 980-990, 1989; Ohashi y col., Proc. Natl. Acal. Sci. USA, 89: 11332-11336, 1992). Se transfectó la línea empaquetadora Phoenix (Kinsella and Nolan, Hum. Gene. Ther. 7: 1405-1413) con estos vectores y luego se cultivó durante 48 horas. Mientras tanto, los sobrenadantes virales libres de células, obtenidos mediante filtración del medio de cultivo con un filtro de 0,45 \mum, se utilizaron para transducir células NIH3T3 (ATCC CRL 1658). El nivel de actividad CAT se determinó utilizando el extracto proteico 2 días después de la transducción. Se midió la actividad CAT en la línea celular transfectada o transducida con cada vector (véase las columnas "transfectado transitoro" y "transducido, transitorio" en la Tabla 3), así como en la población celular resistente a los antibióticos (véase la columna "transducido, estable" en la Tabla 3). Además, se midió la actividad CAT en la población celular estable subcultivada durante 4 semanas (véase la columna "transducido, estable (4 semanas)" en la Tabla 3). Los niveles de expresión del gen y las concentraciones virales en las líneas transfectadas se determinaron a partir de las actividades CAT medidas en la línea transfectada o transducida con cada vector.

Tal como se muestra en la Tabla 3, todos los vectores retrovirales mostraron actividades CAT más altas que el vector MIN, excepto el vector LXSN. Sin embargo, las actividades CAT variaban según la secuencia heteróloga insertada. En especial, MIN-EI y MIN-2 produjeron notablemente altos niveles de expresión genética. Era bastante notable que las células transducidas establemente con MIN-EI o MIN-2 produjeran niveles de expresión genética mucho más altos, aun después de subcultivo durante 4 semanas.

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TABLA 3 Efecto de las secuencias heterólogas en la eficacia de los vectores retrovirales

	Actividad relativa CAT
Vector	Transfectado	Transducido	Concentración
	transitorio		viral relativa
		Transitorio	Estable	Estable
				(4 sem.)
MIN-CAT	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
MIN-2CAT	3,8 \pm 0,5	3,7 \pm 0,5	4,5 \pm 0,5	2,3 \pm 0,5	0,9 \pm 0,3
MIN-AICAT	0,9 \pm 0,2	1,1 \pm 0,2	1,1 \pm 0,2	0,9 \pm 0,2	0,8 \pm 0,2
MIN-EICAT	3,5 \pm 0,4	3,3 \pm 0,4	3,5 \pm 0,4	2,7 \pm 0,4	1,1 \pm 0,2
MIN-GICAT	2,0 \pm 0,5	2,4 \pm 0,3	2,2 \pm 0,4	1,5 \pm 0,3	1,3 \pm 0,2
MFG-CAT	1,0 \pm 0,2	1,1 \pm 0,3	0,8 \pm 0,2	0,3 \pm 0,1	1,0 \pm 0,3
LXSN-CAT	0,2 \pm 0,1	0,2 \pm 0,1	0,2 \pm 0,1	0,1 \pm 0,0	0,5 \pm 0,2

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Aplicabilidad industrial

Tal como se ha revelado y comprobado anteriormente, esta invención proporciona vectores retrovirales que posee muchas ventajas para la terapia genética y demás. Los vectores de esta invención tienen las siguientes características:

1.: Como se suprimen todas las secuencias codificadoras retrovirales (secuencias gag, env, y pol), se puede excluir absolutamente la posibilidad de producir retrovirus de replicación competente a través de recombinación homóloga.

2.: Como se inserta(n) un intrón heterólogo, un aceptor de unión y/o una secuencia no codificadora en posición "upstream" (aguas arriba) del sitio de clonación para un gen extraño, el gen extraño en los vectores puede expresarse tanto de forma estable como eficaz.

3.: Como la región U3 en 5' LTR está sustituida por un promotor heterólogo que induce intensivamente a la transcripción especialmente en células humanas, las líneas empaquetadoras derivadas de las células humanas transfectadas con los vectores pueden producir niveles más altos de ARN y por lo tanto muestran concentraciones virales aumentadas.

4.: Se utiliza simultáneamente un IRES o un promotor heterólogo para expresar dos o más genes extraños en los vectores. En este caso, se puede emplear un promotor mínimo como promotor heterólogo insertado con el fin de disminuir una interferencia del promotor heterólogo interno y clonar un gen extraño de mayor tamaño.

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(Formulario pasa a página siguiente)

1

2

3

4

5

6

<110> ViroMed Limited

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<120> High efficiency retroviral vectors that contain none of viral coding sequences

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<130> 9fpo-05-10

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<150> KR 98-24478

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<151> 1998-06-26

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<150> KR 99-23398

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<151> 1999-06-22

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<160> 20

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<170> KOPATIN 1,0

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<210> 1

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> HHIR primer

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<400> 1

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aagcttatct gaaagacccc

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20

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<210> 2

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> R523Bam primer

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<400> 2

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ggatcccaaa aattcagacg ga

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22

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<210> 3

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> CATATGN primer

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<400> 3

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ccatggagaa aaaaatcact

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20

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<210> 4

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> CATSTOP primer

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<400> 4

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ggatccttac gccccgccct gcca

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24

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<210> 5

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<211> 39

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> SV40-5 primer

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<400> 5

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cggatccgtc gacgttaact catgcatctc aattagtca

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39

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<210> 6

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Neo-3 primer

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<400> 6

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ctcgagtcag aagaactc

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18

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<210> 7

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> R15 primer

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattctc agatcgcctg gagacgcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CMVexon2.3 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttcgtg tcaaggacgg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SA Top oligomer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatctctcca cagga

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> SA bottom oligomer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggtgtcc tctag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exon 13 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccgt cactcttggc acgggg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3LTR5 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcctcga ggataaaata aaagatttta tttagtctcc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3LTR3 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaattcaatg aaagaccccc gctgac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 5LTR3 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccgcgg gcccacgcgt attttcagac aaatacagaa acacagtcag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta actin 5 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtgccc agcaccccaa ggcggccaac gccaaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> beta-actin 3 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagcggtg agctgcgaga atagccgggc gcgctgt

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EF1 alpha 5 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtggca attgaaccgg tgcctagaga aggtgg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> EF1 alpha 3 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagctttg gcttttaggg gtagttttca cgacac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glnt5 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtatcg atagatctgt cgacgtgatg cggcgcgggc t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glnt primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggccgcgt taacggatcc atggtgtctg agcgatgtg

\hfill

39

Claims

1. Vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina (MLV), caracterizado porque las regiones de codificación gag, env y pol del MLV se han suprimido completamente.

2. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 1, que comprende un intrón, un aceptor de unión o ambos insertados "upstream" (aguas arriba) de un sitio de clonación para un gen extraño, siendo heterólogos el intrón y el aceptor de unión con respecto al MLV.

3. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 2, caracterizado porque el intrón se selecciona de entre el grupo compuesto por intrones de un gen ie1 (UL123) de citomegalovirus humano (HCMV), un gen 1\alpha (EF1\alpha) factor de elongación, un gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), un gen de \beta-actina y un gen de inmunoglobulina de ratón; y el aceptor de unión se seleccionado de entre el grupo compuesto por aceptores de unión de un gen ie1 (UL123) de HCMV, un gen EF1\alpha, un gen de GAPDH, un gen de \beta-actina y un gen de inmunoglobulina de ratón.

4. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 1, que comprende una secuencia no codificadora insertada "upstream" (aguas arriba) de un sitio de clonación para un gen extraño, siendo la secuencia no codificadora heteróloga con respecto al MLV.

5. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia no codificadora se selecciona de entre el grupo de las secuencias no codificadoras de un gen ie1 (UL123) de HCMV, un gen EF\alpha, un gen de GAPDH y un gen de \beta-actina.

6. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de longitud total U3 (-419 a -1 pb) de repetición terminal larga (LTR) 5' de MLV está sustituida por un promotor heterólogo con respecto al MLV.

7. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 6, caracterizado porque el promotor es un promotor inmediato temprano principal de HCMV.

8. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 1, que comprende un promotor insertado "downstream" (aguas abajo) de un sitio de clonación para un gen extraño, siendo el promotor heterólogo con respecto al MLV.

9. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor es un promotor mínimo de SV40.

10. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 2, que es un vector DONSA1 que tiene la estructura descrita en la Fig. 4c disponible con el No. de Referencia: KCCM-10127.

11. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 2, que es un vector DON2 que tiene la estructura descrita en la Fig. 4b disponible con el No. de Referencia: KCCM-10128.

12. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 4, que es un vector MIN-EI que tiene la estructura descrita en la Fig. 7b disponible con el No. de Referencia: KCCM-10163.

13. Vector retroviral basado en el MLV según la reivindicación 4, que es un vector MIN-2 que tiene la estructura tal como se describe en la Fig. 7d disponible con el No. de Referencia: KCCM-10164.

14. DONSA1-Top10 de la cepa E. coli que tiene el No. de referencia: KCCM-10127.

15. DON2-Top10 de la cepa E. coli que tiene el No. de referencia: KCCM-10128.

16. MIN-EICAT(Top10) de la cepa E. coli que tiene el No. de referencia: KCCM-10163.

17. MIN-2CAT(Top10) de la cepa E. coli que tiene el No. de referencia: KCCM-10164.