KR20210036742A - 항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도 - Google Patents

항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 c-Met 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 c-Met 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 이용하는 경우 다양한 c-Met의 발현과 관련된 질환에 대한 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도{Chimeric Antigen Receptor comprising Anti-c-Met Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Uses Thereof}
본 발명은 c-Met 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도에 관한 것이다.
c-Met의 활성화는 세포 성장, 분산(scattering) 및 운동성(motility), 침습(invasion), 세포사멸로부터의 보호, 분지형태 형성(branching morphogenesis) 및 신생혈관 형성(angiogenesis)의 증가를 유도하는 다양한 생물학적 반응을 초래한다. 따라서 병리학적 조건 하에서 c-Met의 부적절한 활성화는 암세포에 증식, 생존 및 침습/전이 능력을 부여할 수 있다. c-Met 활성에 의해 영향을 받는 다양한 생물학적, 생리학적 기능을 고려할 때, c-Met 단백질은 다용도의 치료 표적이 되었다.
최근 면역세포 요법으로 체내의 면역세포를 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 양자적 세포치료(adoptive cell therapy)에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 유전자 재조합 변형을 이용한 인공 수용체인 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 이용한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
c-Met 특이적 인간 항체 및 그 제조방법 (대한민국 등록특허 제10- 1615619호) Anti-c-Met antibodies and uses thereof (PCT 국제특허출원 제PCT/KR2017/001296호)
Tchou J. et al., Safety and Efcacy of Intratumoral Injections of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells in Metastatic Breast Cancer. (2017). Cancer Immunol Res. 5(12):1152-1161 Thayaparan T. et al., CAR T-cell immunotherapy of MET-expressing malignant mesothelioma. (2017). Oncoimmunology 6(12):e1363137
본 발명자들은 c-Met 발현과 관련된 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 키메라 항원 수용체 및 이를 포함하는 효과기 세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 c-Met에 특이적으로 결합하는 항-c-Met CAR 및 이를 발현하는 T 세포를 제작하고, 다양한 c-Met 발현과 관련된 암종에 대한 치료 효과가 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-c-Met 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자에 의해 인코딩 되는 폴리펩티드를 포함하는 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자 및 이를 세포 표면에 발현하는 효과기 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효과기 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항-c-Met 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다:
c-Met 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 c-Met 결합 도메인은 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 그의 항원 결합 단편(antigen binding fragment thereof)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 15, 16, 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(complementarity determining region 1 of heavy chain, CDRH1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDRH2), 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3); 및 서열번호 18, 19, 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(complementarity determining region 1 of light chain, CDRL1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDRL2), 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)를 포함하는 것인, 핵산 분자.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH); 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 것인, 핵산 분자.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH); 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 것인, 핵산 분자.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH); 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 것인, 핵산 분자.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH); 및 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 것인, 핵산 분자.
본 명세서에서, 용어 "항체(antibody 또는 Ab)"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 상기 항체는 천연 항체 또는 재조합 항체 일 수 있다.
상기 용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성된 항체, 예를 들어 동물세포 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또는 항체를 인코딩하는 합성된 DNA 분자의 번역에 의해 생성된 항체를 의미한다.
상기 항체는 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
용어 "중쇄(heavy chain)"는 그의 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하고 항체가 속하는 클래스를 통상 결정하는, 폴리펩티드 쇄의 2개의 종류 중 더 큰 것을 의미한다. 상기 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(variable region of heavy chain) 도메인 VH 및 3개의 중쇄 불변 영역(constant region of heavy chain) 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다.
용어 "경쇄(light chain)"는 그의 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2개의 종류 중 더 작은 것을 의미한다. 상기 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(variable region of light chain) 도메인 VL 및 경쇄 불변 영역(constant region of light chain) 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 경쇄의 불변 영역(constant region of light chain)은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
용어 "항원(antigen 또는 Ag)"은 면역반응을 유발하는 분자를 의미한다. 상기 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역-적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 수반할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산서열을 의미한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 "c-Met(mesenchymal-epithelial transition factor)"은 세포 표면에서 발현되는 Met 원발암유전자(proto-oncogene)에 의해 코딩되는 수용체 티로신 키나아제이다. 구조적으로 c-Met는 세포외 알파 서브유닛(extracellular alpha subunit, 50 kDa)과 막관통 베타 서브유닛(transmembrane beta subunit, 140 kDa)으로 구성된 디설파이드-결합된 이합체이다. c-Met는 리간드 결합을 위한 세포외 도메인, 막관통 부분, 및 세포내 도메인 내의 티로신 잔기의 인산화에 관여하는 티로신 키나아제 촉매 모티프를 포함한다(Dean et al., Nature, 4: 318 (6044): 385, 1985; Park et al., PNAS, 84 (18): 6379, 1976; Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173:183, 1997). c-Met이 리간드인 HGF (hepatocyte growth factor)에 결합하면, c-Met의 세포질 티로신 잔기가 이량화되고 자가 인산화되며(autophosphorylate), 이어 하위 신호전달 경로를 매개하는 다양한 단백질과 상호 작용한다. c-Met 활성화는 세포 성장, 분산(scattering) 및 운동성(motility), 침습(invasion), 세포사멸로부터의 보호, 분지형태 형성(branching morphogenesis) 및 신생혈관 형성(angiogenesis)의 증가를 유도하는 다양한 생물학적 반응을 초래한다. 병리학적 조건 하에서 c-Met의 부적절한 활성화는 암세포에 증식, 생존 및 침습/전이 능력을 부여할 수 있다. c-Met 활성에 의해 영향을 받는 다양한 생물학적, 생리학적 기능을 고려할 때, c-Met 단백질은 다용도의 치료 표적이 되었다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나, 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종(species)의 c-Met 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
본 발명의 항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, c-Met을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 명세서에서, 용어 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)"는 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 분자로부터 유래한 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 상술한 항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포외 항원 결합 도메인으로서 포함한다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항-c-Met 키메라 항원 수용체(anti-c-Met CAR), 항-c-Met CAR 등으로 표현된다.
본 발명의 실시예에서 사용된 "c-Met CAR-001 내지 c-Met CAR-003", "pMT-c-Met-CAR", 또는 "pGemT-c-Met-CAR" 등의 용어 중 "c-Met CAR"는 본 발명자들이 발명한 항-c-Met 키메라 항원 수용체의 코드명칭으로서, 상술한 c-Met 에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "자극 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 몇몇 측면에 대한 자극 방식에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현되는 분자를 나타낸다. 보다 구체적으로 1차 신호는 예를 들어 펩티드로 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 이것은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 (또는 "1차 신호전달 도메인")은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"로도 알려짐) 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저(second messenger)를 생성하거나 또는 상기 메신저에 반응하여 정해진 신호전달 경로를 통한 세포 활성을 조절하기 위해 정보를 세포 내로 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능성 부분을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 선행 서열(leader sequence, LS)을 선택적으로 더 포함한다. 상기 선행 서열은 키메라 항원 수용체를 구성하는 재조합 폴리펩티드의 아미노-말단(N-terminal)에 위치한다. 상기 선행 서열은 키메라 항원 수용체의 세포내 프로세스 및 세포막으로 국재화(localization)되면서 항원 결합 도메인으로부터 임의로 절단된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 선행 서열은 CD8 alpha의 선행 서열, hGM-CSF receptor alpha-chain의 선행 서열, 또는 3E8 항체의 선행 서열일 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 선행 서열은 서열번호 26, 28 또는 30의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 선행 서열이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체의 c-Met 결합 도메인 및 막횡단 도메인은 힌지 영역, 스페이서 영역, 또는 이들의 조합에 의하여 연결된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 힌지 영역, 스페이서 영역, 또는 이들의 조합은 인간 IgG1의 힌지, IgG4의 힌지, IgD의 힌지, CD8 alpha의 힌지, IgG1의 CH3, CD28의 세포외 도메인 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합일 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열번호 32, 34, 36, 38, 40 또는 44의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호 42, 46 또는 47의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 CD3 제타의 신호 전달 도메인은 서열번호 55, 57 또는 59의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 신호전달 도메인을 공동자극 도메인으로 추가적으로 포함한다. 즉, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 자극 분자에서 유래한 세포내 신호전달 도메인 및 공동자극 분자에서 유래한 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 서열번호 49, 51 또는 53의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 키메라 항원 수용체 분자를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는 다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 키메라 항원수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 예컨대 EF-1 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 유전자 전달을 위해 선택된 유전자는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입되고, 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합된 레트로바이러스는 인 비보, 또는 인 비트로에서 목적하는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 벡터가 관련 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 구체적인 구현예에서 상기 레트로바이러스 벡터는 MLV-기반의 레트로바이러스벡터인 pMT 레트로바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자에 의해 인코딩 되는 폴리펩티드를 포함하는 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따른 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자는 상술한 핵산 분자, 또는 이를 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시킴으로써 수득된다. 따라서, 상술한 핵산 분자 및 이를 포함하는 벡터와 중복되는 범위 내에서는 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자를 세포 표면에 발현하는 효과기 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기에서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 상기 효과기 세포는 자가 세포 또는 동종 세포의 집단을 포함한다. 즉, 상기 효과기 세포는 본 항-c-Met CAR 폴리펩티드를 발현하는 자가 세포 또는 동종 세포의 집단을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "자가"는 개체에게 재도입될 예정인, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 나타낸다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 효과기 세포는 항-c-Met CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질 도입된 세포의 집단을 포함한다. 상기 형질 감염 또는 형질 도입은 상술한 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 수단에 의해 제한없이 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면 본 발명의 효과기 세포, 예컨대 T 림프구, 또는 자연살해 세포로 전달되고, 항-c-Met CAR 코딩 핵산 분자는 mRNA로 전사되며, 상기 mRNA로부터 항-c-Met CAR 폴리펩티드가 번역되어 효과기 세포의 표면에 발현된다.
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항-c-Met 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포는 암세포주인 A549, PC-3, MCF-7, SKOV3, 및 SK-HEP-1 세포를 효과적으로 사멸시킨다. 따라서, 본 발명의 항-c-Met 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포는 다양한 암종에 대한 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-c-Met CAR를 발현하는 효과기 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "면역치료(immunotherapy)"란, 면역체계가 암을 제거하도록 돕는 암의 치료방법이다. 면역치료는 능동적 면역치료와 수동적 면역치료로 구분된다. 능동적 면역치료는 i) 암세포 또는 암세포에 의해 생성된 물질을 인체에 주입하여 면역체계를 활성화시키는 암 백신 치료(cancer vaccine therapy), ii) 사이토카인(인터페론, 인터류킨 등), 성장인자 등 면역조절제(immune-modulating agents)를 투여하여 특정 백혈구를 활성화시키는 면역조절 치료를 포함한다. 수동적 면역치료는 특정 암세포에 결합하는 치료적 항체(therapeutic antibody)와 면역세포치료(immune cell therapy)를 포함한다. 면역세포치료는 구체적으로 수지상세포 백신 치료(dendritic cell vaccine therapy)와 CAR-T(chimeric antigen receptor T cell) 치료, NK 세포 치료(natural killer cell therapy), CTL 치료(cytotoxic T lymphocyte therapy), 입양 세포 전이(adoptive cell transfer) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 면역치료는 주로 상술한 면역세포치료를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표적세포의 c-Met 항원에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하므로, c-Met의 발현과 관련된 질환의 진단 또는 치료에 효과적이다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역치료용 약제학적 조성물은 c-Met 발현과 연관된 질환의 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명에서, 상기 c-Met 발현과 연관된 질환은 신경교종, 유방암, 췌장암, 흉막 증피종, 간암, 위암, 폐암, 난소암, 대장암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 CAR-발현 효과기 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 효과기 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 종양 내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 투여될 수 있다.
본 발명을 필요로 하는 대상체는 말초 혈액 줄기세포 이식 이후 고용량 화학요법을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명을 필요로 하는 대상체는 상기 말초 혈액 줄기세포 이식 이후에 또는 이식과 동시에, 본 발명의 확장된 CAR T 세포를 투여받을 수 있다. 다른 일 구현예에 있어서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 수술 이후에 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"에 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 결정되며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "항종양"은 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암적 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 몇몇 경우에 105 내지 106 세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수의 횟수로 투여할 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 이용하여 투여할 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 "조합"은 동시 또는 병용투여로 표현될 수 있다. 본원에 기재된 CAR-발현 효과기 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 별개의 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 치료제로는 당업계에 공지된 1 이상의 화학치료제, 1 이상의 표적치료제, PD-1/PD-L1 특이적인 면역관문 억제제가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역치료방법을 제공한다.
본 발명의 면역치료방법의 대상 질병인 c-Met 발현과 관련된 질환은 약제학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 c-Met 발현과 관련된 질환의 치료방법은 유효성분으로서 상술한 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 공통적으로 사용하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 항-c-Met 키메라 항원 수용체와 이를 이용한 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 c-Met 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 이용하는 경우 다양한 c-Met의 발현과 관련된 질환에 대한 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 c-Met-CAR-001 컨스트럭트의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 pBHA-c-Met-CAR-001 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 pMT-CAR-001 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 pMT-CAR-002 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 pMT-CAR-003 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 c-Met-CAR-002 PCR 증폭 과정을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 c-Met-CAR-002 컨스트럭트의 구조를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 c-Met-CAR-003 PCR 증폭 과정을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 c-Met-CAR-003 컨스트럭트의 구조를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 c-Met-CAR-004 PCR 증폭 과정을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 c-Met-CAR-004 컨스트럭트의 구조를 나타낸 도이다.
도 12a 내지 도 12d는 본 발명의 pMT-c-Met-CAR-001, pMT-c-Met-CAR-002, pMT-c-Met-CAR-003, 및 pMT-c-Met-CAR-004 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13c는 본 발명의 항-c-Met-CAR 발현 T 세포에서의 CD3 zeta의 발현을 통해 CAR 발현을 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 항-c-Met-CAR 발현 T 세포 표면에서 CAR의 발현을 확인한 도이다.
도 15a 내지 도 15f는 암세포주인 A549, PC-3, MCF-7, SKOV3, SK-HEP-1 및 Jurkat 세포에서의 c-Met 발현율을 확인한 도이다.
도 16은 A549 암세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 17은 PC-3 암세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 18은 MCF-7 암세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 19는 SKOV3 암세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 20은 SK-HEP-1 암세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 21은 Jurkat 세포주에 대한 본 발명의 항-c-Met CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 목차
실시예 1 내지 4: anti-c-Met-Chimeric Antigen Receptor 유전자 확보
실시예 5. pGemT -c-Met-CAR 벡터의 제조
실시예 6. pMT-c-Met-CAR 레트로바이러스 벡터의 제조
실시예 7. anti-c-Met-CAR 유전자 발현 T 세포의 제조
실시예 8. 생체 외(In vitro)에서의 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포의 항암활성능 확인
실시예 1. c-Met-CAR-001 유전자 확보
실시예 1-1. anti-c-Met scFv 항체 유전자 확보
본 발명의 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 선행된 특허(출원번호 10-2018-0140196)를 통해 확보하였다(표 1).
Nucleotide sequence of finally selected unique anti-c-Met scFv clones
ID Nucleotide sequence SEQ ID NO
1E4-H4k2 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTCTCCTGCCAGGGCTCCGGCTACTCCTTCCCCACCCACTGGATCACCTGGGTGCGACAGGCCCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGGCACCATCGACCCCACCGACTCCTACAACTTCTACGGCCCCAGCTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACTCCTCCACGTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGAGATCTGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGGACGGCAACTACTACGACTCCCGGGGCTACTACTACGATACCTTCGACATGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCTCTGGGGGGGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCTCCCAGGGCATCTCCACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTCCGCCTCCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTTGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCGACTCCTTCCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGT 24
실시예 1-2. c-Met-CAR-001 유전자확보
본 발명의 anti-c-Met scFv 항체 가변 중쇄(variable heavy chain; VH)의 5' 부위에는 BamH I 제한효소 염기서열 및 CD8 alpha의 선행서열(leader sequence; LS)를 포함하고, anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(variable light chain; VL)의 3' 부위에는 hCD8alpha의 Hinge와 TM, 공동 자극 도메인인 4-1BB 및 CD3ζ-iso2M(modified CD3ζ-iso2) 및 Xho I 제한효소 염기서열을 포함하도록 염기서열을 확보하였다. 확보된 염기서열은 BamH I-hCD8αLS-scFv-hCD8α hinge-hCD8αTM-41BB-CD3ζ-iso2M-Xho I의 염기서열(표 2)을 가지게 되며 이를 바탕으로 서열번호 60의 c-Met-CAR-001(도 1)구조를 합성하였다. 합성된 pBHA-c-Met-CAR-001(도 2)은 다른 c-Met-CAR 구조를 확보하는데 사용하였다.
LS, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
BamH I-start codon-hCD8a LS GGATCC ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
ScFv (표 1)
hCD8a hinge ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
hCD8a TM ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
4-1BB AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
CD3ζ-iso2M-stop codon-Xho I CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAA CTCGAG
실시예 2. c-Met-CAR-002 유전자 확보
실시예 2-1. anti-c-Met scFv 항체 유전자 확보
유전자 합성을 통해 확보된 pBHA-c-Met-CAR-001(도 2)를 주형으로 프라이머 서열번호 1(표 3)과 서열번호 2(표 3)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, anti-c-Met scFv 항체 가변 중쇄(VH)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 hGM-CSF rec.α(Human GM-CSF receptor alpha-chain)의 12개 염기서열을 가지고, anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hinge의 9개 염기서열과 hCD28 pECD의 3개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 hGM-CSF rec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD의 염기서열을 가지게 된다(표 4). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
프라이머의 염기서열 정보
SEQ ID NO Primer Nucleotide sequence
1 GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv (F) CTCCTGATCCCACAGGTGCAGCTGGTG
2 1E4-H4k2 scFv +hinge+hCD28 pECD (R) AATTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCAC
3 AS+BamHI+GMCSF rec.a LS(F) CGGGATCCATGCTTCTCCTGGTGACAA
4 GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv(R) CAGCTGCACCTGTGGGATCAGGAGGAA
5 1E4-H4k2 scFv+hinge+CD28 pECD(F) GAAATCAAACGTGCGGCCGCAATTGAA
6 AS+Xho1+CD3-ζ (R) CCGCTCGAGTTATTAGCGAGGGGGCAGG
7 3E8 LS+1E4-H4k2 scFv(F) GGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
8 1E4-H4k2 scFv+hIgD hinge(R) ACCTGGCCAGCGACGTTTGATTTCCAC
9 BamHI+3E8 VH(F) GGATCCATGGAATGGAGCTGGGTC
10 1E4-H4k2 scFv+3E8 LS(R) CAGCTGCACCTGGGAGTGGACACCTGT
11 1E4-H4k2 scFv+hIgD hinge(F) GAAATCAAACGTCGCTGGCCAGGTTCT
12 XhoI+CD3zeta(R) CCGCTCGAGTTAGCGAGGGGGCAGGGC
13 T7(F) TATACGACTCACTATAGGG
14 SP6(R) ATTTAGGTGACACTATAG
실시예 2-2. hGM - CSF receptor alpha-chain의 신호 서열 유전자 확보
hGM-CSF rec.α의 신호 서열을 포함하는 pMT-CAR-001 플라스미드(도 3)를 주형으로 프라이머 서열번호 3(표 3)과 서열번호 4(표 3)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때 hGM-CSF rec.α의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 BamH I 제한효소 염기서열을 가지고, hGM-CSF rec.α의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met 항체의 가변 중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 BamHI-hGM-CSF rec.α-scFv의 염기서열을 가지게 된다(표 4). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
LS, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
BamH I-start codon-hGM-CSF rec.a LS GGATCC ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA
ScFv (표 1)
hinge GCGGCCGCA
hCD28 pECD ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC
hCD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
hCD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
CD3ζ-iso2-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAA CTCGAG
실시예 2-3. Hinge, TM , ICD공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Hinge, hCD28의 pECD와 TM, ICD 및 hCD3ζ-iso2를 포함하는 pMT-CAR-001 플라스미드(도 3)를 주형으로 프라이머 서열번호 5(표 3)와 서열번호 6(표 3)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때 Hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met 항체의 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso2의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-XhoI 염기서열을 가지게 된다(표 4). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
실시예 3. c-Met-CAR-003 유전자 확보
실시예 3-1. anti-c-Met scFv 항체 유전자 확보
유전자합성을 통해 확보된 pBHA-cMet-CAR-001(도 2)를 주형으로 프라이머 서열번호 7(표 3)과 서열번호 8(표 3)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, anti-c-Met scFv 항체 가변 중쇄(VH)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 3E8 선행서열(LS)의 12개 염기서열을 가지고, anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgD hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 3E8 LS-scFv-hIgD hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 5). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
LS, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
BamH I-start codon-3E8 LS GGATCC ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
ScFv (표 1)
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
IgG1 hinge GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
IgG1 CH3 GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
CD3ζ-iso1-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
실시예 3-2. 3E8 항체의 선행 서열( LS ) 유전자 확보
3E8 항체의 선행 서열(LS)을 포함하는 pMT-CAR-002플라스미드(도 4)를 주형으로 프라이머 서열번호 9(표 3)와 서열번호 10(표 3)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 BamH I 제한효소 염기서열을 가지고, 3E8 선행 서열(LS)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met scFv 항체 가변중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 BamH I-3E8 LS-scFv의 염기서열을 가지게 된다(표 5). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
실시예 3-3. Hinge, TM , ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human IgD의 Hinge와 IgG1의 hinge, CH3, CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-002플라스미드(도 4)를 주형으로 프라이머 서열번호 11(표 3)과 서열번호12(표 3)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgD hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 5). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
실시예 4. c-Met-CAR- 004유전자확보
실시예 4-1. anti-c-Met scFv 항체 유전자 확보
유전자합성을 통해 확보된 pBHA-cMet-CAR-001(도 2)를 주형으로 프라이머 서열번호 7(표 3)과 서열번호 8(표 3)를 이용하여 PCR 방법을 증폭하여 사용하였다. 이 때, anti-c-Met scFv 항체 가변 중쇄(VH)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 3E8 선행서열(LS)의 12개 염기서열을 가지고, anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgD hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 3E8 LS-scFv-hinge-hIgD hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 6). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
LS, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
BamH I-start codon-3E8 LS GGATCC ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
ScFv (표 1)
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
CD3ζ-iso1-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
실시예 4-2. 3E8 항체의 선행 서열( LS ) 유전자 확보
3E8 항체의 선행 서열(LS)을 포함하는 pMT-CAR-003플라스미드(도 5)를 주형으로 프라이머 서열번호 9(표 3)와 서열번호 10(표 3)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 BamH I 제한효소 염기서열을 가지고, 3E8 선행 서열(LS)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met scFv 항체 가변중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 BamH I-3E8 LS-scFv의 염기서열을 가지게 된다(표 6). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
실시예 4-3. Hinge, TM , ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human IgD의 Hinge와 CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-003 플라스미드(도 5)를 주형으로 프라이머 서열번호 11(표 3)과 서열번호 12(표 3)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgD hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 anti-c-Met scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 된다(표 6). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
실시예 5. pGemT -c-Met-CAR 벡터의 제조
실시예 5-1. pGemT -c-Met-CAR-002 벡터의 제조
증폭한 PCR 생성물인 BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv와 hGM-CSF rec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD를 주형으로 프라이머 서열번호 3(표 3)과 서열번호 2(표 3)를 이용하여 OE-PCR (overlap extension PCR)방법으로 증폭하였다. 증폭한 PCR 생성물인 BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD와 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 3(표 3)과 서열번호 6(표 3)을 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 6). 증폭된 PCR 생성물은 BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I 염기서열을 가지게 되며, 서열번호 61의 c-Met-CAR-002의 구조를 가지게 된다(도 7). 증폭한 PCR 생성물은 직선형 DNA의 양 끝에 다중 T 서열을 가지는 pGemT EASY 벡터 (Promega, WI, USA)에 결찰하여 구조물 pGemT-c-Met-CAR-002를 획득하였고, 서열분석을 통해 원본서열과 같음을 확인하였다. 서열 분석을 위해 프라이머 서열번호 13과 14(표 3)를 사용하였다.
실시예 5-2. pGemT -c-Met-CAR-003 벡터의 제조
증폭한 PCR 생성물인 BamH I-3E8 LS-scFv와 3E8 LS-scFv-hIgD hinge를 주형으로 프라이머 서열번호 9(표 3)와 서열번호 8(표 3)을 이용하여 OE-PCR방법으로 증폭하였다. 증폭한 PCR 생성물인 BamH I-3E8 LS-scFv-hIgD hinge와 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호9(표 3)과 서열번호 12(표 3)을 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 8). 증폭된 PCR 생성물은 BamH I-3E8 LS-scFv-hIgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, 서열번호 62의 c-Met-CAR-003의 구조를 가지게 된다(도 9). 증폭한 PCR 생성물은 직선형 DNA의 양 끝에 다중 T 서열을 가지는 pGemT EASY 벡터에 결찰하여 구조물 pGemT-c-Met-CAR-003을 획득하였고, 서열분석을 통해 원본서열과 같음을 확인하였다. 서열 분석을 위해 프라이머 서열번호 13과 14(표 3)을 사용하였다.
실시예 5-3. pGemT -c-Met-CAR-004 벡터의 제조
증폭한 PCR 생성물인 BamH I-3E8 LS-scFv와 3E8 LS-scFv-hIgD hinge를 주형으로 프라이머 서열번호 9(표 3)와 서열번호 8(표 3)을 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다. 증폭한 PCR 생성물인 BamH I-3E8 LS-scFv-hIgD hinge와 scFv-IgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 9(표 3)과 서열번호 12(표 3)을 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 10). 증폭된 PCR 생성물은 BamH I-3E8 LS-scFv-IgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, 서열번호 63의 c-Met-CAR-004의 구조를 가지게 된다(도 11). 증폭한 PCR 생성물은 직선형 DNA의 양 끝에 다중 T 서열을 가지는 pGemT EASY 벡터에 결찰하여 구조물 pGemT-c-Met-CAR-004를 획득하였고, 서열분석을 통해 원본서열과 같음을 확인하였다. 서열 분석을 위해 프라이머 서열번호 13과 14(표 3)을 사용하였다.
실시예 6. pMT-c-Met-CAR 레트로바이러스 벡터의 제조
1종의 pBHA-c-Met-CAR-001과 3종의 pGemT-c-Met-CAR 벡터(pGemT-c-Met-CAR-002, pGemT-c-Met-CAR-003, pGemT-c-Met-CAR-004)에 BamH I과 Xho I 제한효소 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 획득한 DNA 절편을 미리 BamH I과 Xho I 제한효소로 처리된 pMT 레트로바이러스 벡터(미국 등록특허 제 US6,451,595호)에 결찰하여 4 종의 pMT-c-Met-CAR 레트로바이러스 벡터(pMT-c-Met-CAR-001, -002, -003, -004)를 제작하였다(도 12a 내지 도 12d). 이렇게 제조된 pMT-c-Met-CAR 레트로바이러스 벡터는 MLV LTR 프로모터의 조절 하에서 c-Met-CAR를 코딩하는 서열을 포함한다.
실시예 7. Anti-c-Met-CAR 유전자 발현 T 세포의 제조
실시예 7-1. Anti-c-Met-CAR 유전자 발현 레트로바이러스의 제조
Anti-c-Met-CAR 유전자의 전달을 위한 레트로바이러스는 플라스미드 DNA 형질전환법을 이용하여 제작하였다(Soneoka Y et al., 1995). TransIT 293 형질전환시스템(Mirus Bio LLC, WI, USA)을 이용하였고, 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 전날 60 mm 접시에 1×106개로 파종한 293T 세포주에 4종의 pMT-c-Met-CAR 레트로바이러스 벡터, gag- pol 발현 벡터 및 RD114 env 발현 벡터를 형질전환 후 세포를 약 48시간 배양하였다. 배양완료 후 세포배양액을 모두 수확하여 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 사용 전까지 -80℃에 냉동 보관하였다. 생산된 4종의 anti-c-Met-CAR 레트로바이러스는 retrovirus titer set kit (TaKaRa, JAPAN)을 이용하여 real-time PCR로 역가 측정 후 사용하였다.
실시예 7-2. Anti-c-Met-CAR 유전자 발현 T 세포의 제조
공여받은 사람 혈액을 SepMate??-50 (STEMCELL)과 Ficoll-Paque PLUS (GE healthcare, Sweden)를 이용하여 단핵세포를 획득하였다. 단핵세포는 5% 사람 혈청이 포함된 AIMV 배지(Invitrogen)를 배양액으로 사용하고 100 mm 접시에 1Х107개로 분주한 후, 항-CD3 (OKT3, eBioscience) 항체를 mL당 50 ng 첨가하여 T 세포를 활성화하였다. T 세포의 성장을 위해 배양액에 사람 IL-2 (R&D)를 mL당 300 U 첨가하여 배양하였다. 48시간 배양 후 활성화된 T 세포를 수확하여 4종의 anti-c-Met-CAR 레트로바이러스 전달에 사용하였다.
6 well 플레이트에 10 ug/mL 농도로 준비된 레트로넥틴(retronectin, TaKaRa, Japan)을 well당 2 mL 첨가한 후 상온에서 2시간 반응하여 플레이트에 코팅하였다. 반응 후 레트로넥틴은 제거하고 2.5% 사람 알부민이 포함된 PBS(phosphate-buffered saline)를 well당 2 mL 첨가하여 상온에서 30분 반응하여 blocking 하였다. 반응 후 blocking에 사용한 용액을 제거하고, 1M HEPES가 2.5% 포함된 HBSS을 well당 3 mL 첨가하여 세척하였다. Anti-c-Met-CAR 레트로바이러스를 well당 3Х1010 copies로 5% 사람혈청이 포함된 AIMV 배지로 희석하여 4 mL 첨가 후 2000xg, 32
Figure pat00001
조건으로 2시간 동안 원심분리하여 레트로바이러스를 레트로넥틴에 고정하였다. 대조군으로 사용할 well에는 레트로바이러스 희석에 사용한 배지를 동량 첨가하였다. 반응 후 레트로바이러스를 제거하고 활성화된 T 세포를 well당 2Х106개로 첨가 후 1000xg로 15분간 원심분리하여 T 세포에anti-c-Met-CAR 레트로바이러스를 전달하였다. 전달효율을 높이고자 다음날 전달과정을 1회 더 반복하여 총 2회 진행하였다. 전달 24시간 후, T 세포를 모두 수확하여 5% 사람 혈청과 300 U/mL의 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지로 mL당 5Х105개로 T 플라스크에 계대 배양하였다. 3~4일 간격으로 mL당 5Х105개로 계대 배양하고, mL당 2x106개를 넘지 않도록 유지하였다.
다음으로 anti-c-Met-CAR 레트로바이러스를 전달한 활성화 T 세포(anti-c-Met-CAR 발현 T)에서 anti-c-Met-CAR가 발현하는지 확인하고자 하였다. 2Х106개의 세포를 수확하여 단백질을 추출하였고, 추출된 단백질은 Bradford 분석법으로 정량 후, 4x sample buffer (Invitrogen)와 Dithiothreitol을 섞어 95
Figure pat00002
에서 5분간 끓여 환원 처리하였다. 웨스턴 블랏 방법으로 anti-c-Met-CAR 발현을 확인하였다. 발현확인에 사용한 1차 항체는 마우스 항-인간 CD247 (BD, CA, USA)로 CD3ζ에 부착하고, 2차 항체는 염소 항-마우스 IgG(H+L)-HRP (Thermo, USA)를 사용하였다. 4종의 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포에서 웨스턴 블랏 결과, 50-80 KDa 위치에서 각각 밴드가 확인되어, anti-c-Met-CAR가 잘 발현되고 있음을 확인하였다(도 13a 내지 도 13c).
Anti-c-Met-CAR 발현 T에서 세포 표면에 anti-c-Met-CAR가 발현하는지 확인하고자 하였다. 5x105개의 세포를 수확하여 PBS (Phosphate buffered saline)로 2회 세척 후 CAR의 단쇄가변분절 (Single-chain variable Fragment)에 특이적으로 결합하는 FITC 융합된 Protein L (AcroBiosystem, RPL-PF141)을 2.5 ug 첨가하여 4
Figure pat00003
에서 30 분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척하여 유동세포분석법을 이용하여 anti-c-Met-CAR 발현을 확인하였다. 그 결과, MT-c-Met-CAR-004 레트로바이러스를 전달한 T 세포의 표면에서 anti-c-Met-CAR가 약 57.7% 발현되고 있음을 확인하였다. (도 14)
실시예 8. 생체 외( In vitro )에서의 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포의 항암활성능 확인
실시예 8-1. 타겟 세포에서의 c-Met 발현율 확인
사람 폐암 세포주인 A549는 c-Met을 높게 발현하는 것으로 알려져 있어 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기에 적합한 세포주이다. 이를 확인하기 위해 A549 세포주를 PBS 100 uL에 5x105개로 준비하여 1E4-H4k2 항체를 1 ug 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 염소 항 인간 IgG-PE(Southern Biotech)를 2 uL첨가하여 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후 유동세포 분석법을 이용하여 c-Met 발현을 확인하였다. 그 결과, A549 암세포에서 약 83.9%의 c-Met 발현율을 확인하였다. 동일한 방법을 이용하여 사람 전립선암 세포주인 PC-3와 사람 유방암 세포주인 MCF-7, 난소암 세포주인 SKOV3, 사람 급성 T세포백혈병 세포주인 Jurkat, 사람 간암 세포주인 SK-HEP-1에서 c-Met의 발현을 확인한 결과 PC-3에서는 약 48.5%, MCF-7에서는 약 66.0%, SKOV3에서는 약 58.0%, SK-HEP-1에서는 약 99.9%, Jurkat에서는 약 2.37%의 발현율을 확인하였다.
실시예 8-2. CellTox?? Green dye를 이용한 항암활성능 확인
타겟세포(target 세포, T)에 대한 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포(effector 세포, E)의 항암활성능을 확인하기 위해 CellTox™ Green dye를 사용하였다. CellTox™ Green dye는 죽은 세포에서 방출되는 DNA에 부착하여 형광을 나타내는 염료로 항암활성능(cytotoxicity)을 확인하는데 사용된다. 타겟 세포를 배양배지 50 uL에 1x104개로 준비하고, CellTox™ Green dye를 0.2 uL 첨가하여 검은색 96 well 플레이트에 첨가하였다. Anti-c-Met-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 5x103개, 1x104개, 5x104개(E:T 비율=0.5, 1, 5)로 준비하여 타겟세포를 포함한 well에 첨가하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 반응하였다. CellTox™ Green dye와 타켓세포의 배양배지를 포함한 well에 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포만 첨가한 군을 준비하여 반응시간 동안 죽는 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포에서 방출되는 DNA에 부착하여 발생하는 염료의 반응 값을 제외시켜주었다. 또한 타겟세포만 포함한 well을 준비하여 low control (spontaneous DNA release) 값을 보정하였고, 타겟세포만 포함한 well에 lysis solution을 첨가하여 high control (maximum DNA release) 값을 보정하였다. 타겟 세포에 대한 살상능은 아래의 식으로 계산하였다.
식
Cytotoxicity(%)={(Target세포와 Effector세포의 반응값)-(Effector세포의 반응값)}-(Low control)/(High control - Low control) X 100
그 결과, 4종의 c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포의 A549 암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도16).
그 결과, 4종의 c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포의 A549 암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도16).
동일한 실험 방법을 이용하여 PC-3 암세포에 대한 살상능을 확인하였다. c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T세포의 PC-3 암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도 17). 특히 c-Met-CAR-001에 비해 다른 구조의 CAR가 더 우수한 효과를 보였다.
동일한 실험 방법을 이용하여 MCF-7 암세포에 대한 살상능을 확인하였다. c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T세포의 MCF-7암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도 18).
동일한 실험 방법을 이용하여 SKOV3 암세포에 대한 살상능을 확인하였다. c-Met-CAR-001, 002, -003, -004 발현 T세포의 SKOV3암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도 19).
동일한 실험 방법을 이용하여 SK-HEP-1에 대한 살상능을 확인하였다. c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현T 세포의 SK-HEP-1 암세포에 대한 항암활성능은 anti-c-Met-CAR를 발현하지 않는 T 세포인 대조군에 비해 높음을 확인하였다(도20).
동일한 실험 방법을 이용하여 Jurkat에 대한 살상능을 확인하였다. c-Met을 낮게 발현하는 Jurkat을 이용하여 c-Met-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포의 살상능을 확인한 결과, Jurkat에 대한 살상능은 거의 관찰되지 않았다. 이를 통해 anti-c-Met-CAR 발현 T 세포가 c-Met을 높게 발현하는 세포에 대해서만 특이적으로 살상능을 가짐을 확인하였다(도 21).
<110> Helixmith Co., Ltd <120> Chimeric Antigen Receptor comprising Anti-c-Met Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Uses Thereof <130> PN190289 <160> 66 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv (F) <400> 1 ctcctgatcc cacaggtgca gctggtg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 1E4-H4k2 scFv +hCD28 pECD+hinge(R) <400> 2 aattgcggcc gcacgtttga tttccac 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: AS+BamHI+GMCSF rec.a LS(F) <400> 3 cgggatccat gcttctcctg gtgacaa 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv(R) <400> 4 cagctgcacc tgtgggatca ggaggaa 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 1E4-H4k2 scFv+hinge+CD28 pECD(F) <400> 5 gaaatcaaac gtgcggccgc aattgaa 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: AS+Xho1+CD3-zeta (R) <400> 6 ccgctcgagt tattagcgag ggggcagg 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 3E8 LS+1E4-H4k2 scFv(F) <400> 7 ggtgtccact cccaggtgca gctggtg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 1E4-H4k2 scFv+hIgD hinge(R) <400> 8 acctggccag cgacgtttga tttccac 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: BamHI+3E8 VH(F) <400> 9 ggatccatgg aatggagctg ggtc 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 1E4-H4k2 scFv+3E8 LS(R) <400> 10 cagctgcacc tgggagtgga cacctgt 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: 1E4-H4k2 scFv+hIgD hinge(F) <400> 11 gaaatcaaac gtcgctggcc aggttct 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: XhoI+CD3zeta(R) <400> 12 ccgctcgagt tagcgagggg gcagggc 27 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: T7(F) <400> 13 tatacgactc actataggg 19 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1E4-H4k2 heavy chain variable region (AA) <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E4-H4k2 light chain variable region (AA) <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Thr Leu 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gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gccca 45 <210> 35 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgD hinge (AA) <400> 35 Arg Trp Pro Gly Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Gly Cys Pro 50 55 60 <210> 36 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgD hinge (NA) <400> 36 cgctggccag gttctccaaa ggcacaggcc tcctccgtgc ccactgcaca accccaagca 60 gagggcagcc tcgccaaggc aaccacagcc ccagccacca cccgtaacac aggtagagga 120 ggagaagaga agaagaagga gaaggagaaa gaggaacaag aagagagaga gacaaagaca 180 ccaggttgtc cg 192 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG1 CH3 (AA) <400> 37 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr 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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 57 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD3z iso2 (NA) <400> 57 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 58 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD3z iso1 (AA) <400> 58 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 59 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD3z iso1 (NA) <400> 59 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 60 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CAR-001 (NA) <400> 60 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaggtgc agctggtgca gtctggcgcc gaagtgaaga agcccggctc ctccgtgaag 120 gtctcctgcc agggctccgg ctactccttc cccacccact ggatcacctg ggtgcgacag 180 gcccccggcc aaggcctgga atggatgggc accatcgacc ccaccgactc ctacaacttc 240 tacggcccca gcttccaggg cagagtgacc atcaccgccg actcctccac gtccaccgcc 300 tacatggagc tgtcctccct gagatctgag gacaccgcca tgtactactg cgccagggac 360 ggcaactact acgactcccg gggctactac tacgatacct tcgacatgtg gggccagggc 420 accctggtca ccgtctcctc aggcggtgga ggatctggag gaggcggctc tggggggggc 480 ggctctgaca tccagatgac ccagtccccc agctccctgt ccgcctccgt gggcgacaga 540 gtgaccatca cctgtcgggc ctcccagggc atctccacct acctggcctg gtatcagcag 600 aagcccggca aagcccccaa gctgctgatc tactccgcct ccaccctgga atccggcgtg 660 ccctccagat tctccggctc cggctctggc accgacttca ccctgaccat ctccagcctg 720 cagcccgagg actttgccac ctactactgc cagcaggccg actccttccc cctgaccttc 780 ggcggaggca ccaaggtgga aatcaaacgt accactaccc cagcaccgag gccacccacc 840 ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 900 gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 960 cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 1020 cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1080 actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1140 ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200 ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260 ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320 aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380 cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440 acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1479 <210> 61 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CAR-002 (NA) <400> 61 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacagg tgcagctggt gcagtctggc gccgaagtga agaagcccgg ctcctccgtg 120 aaggtctcct gccagggctc cggctactcc ttccccaccc actggatcac ctgggtgcga 180 caggcccccg gccaaggcct ggaatggatg ggcaccatcg accccaccga ctcctacaac 240 ttctacggcc ccagcttcca gggcagagtg accatcaccg ccgactcctc cacgtccacc 300 gcctacatgg agctgtcctc cctgagatct gaggacaccg ccatgtacta ctgcgccagg 360 gacggcaact actacgactc ccggggctac tactacgata ccttcgacat gtggggccag 420 ggcaccctgg tcaccgtctc ctcaggcggt ggaggatctg gaggaggcgg ctctgggggg 480 ggcggctctg acatccagat gacccagtcc cccagctccc tgtccgcctc cgtgggcgac 540 agagtgacca tcacctgtcg ggcctcccag ggcatctcca cctacctggc ctggtatcag 600 cagaagcccg gcaaagcccc caagctgctg atctactccg cctccaccct ggaatccggc 660 gtgccctcca gattctccgg ctccggctct ggcaccgact tcaccctgac catctccagc 720 ctgcagcccg aggactttgc cacctactac tgccagcagg ccgactcctt ccccctgacc 780 ttcggcggag gcaccaaggt ggaaatcaaa cgtgcggccg caattgaagt tatgtatcct 840 cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac 900 ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt 960 gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1020 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1080 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1140 tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1479 <210> 62 <211> 2031 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CAR-003 (NA) <400> 62 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtctcc 120 tgccagggct ccggctactc cttccccacc cactggatca cctgggtgcg acaggccccc 180 ggccaaggcc tggaatggat gggcaccatc gaccccaccg actcctacaa cttctacggc 240 cccagcttcc agggcagagt gaccatcacc gccgactcct ccacgtccac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgagatc tgaggacacc gccatgtact actgcgccag ggacggcaac 360 tactacgact cccggggcta ctactacgat accttcgaca tgtggggcca gggcaccctg 420 gtcaccgtct cctcaggcgg tggaggatct ggaggaggcg gctctggggg gggcggctct 480 gacatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 540 atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 600 ggcaaagccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 660 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 720 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 780 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtcgctgg ccaggttctc caaaggcaca ggcctcctcc 840 gtgcccactg cacaacccca agcagagggc agcctcgcca aggcaaccac agccccagcc 900 accacccgta acacaggtag aggaggagaa gagaagaaga aggagaagga gaaagaggaa 960 caagaagaga gagagacaaa gacaccaggt tgtccggagc ccaaatcttg tgacaaaact 1020 cacacatgcc caccgtgccc agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080 tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1260 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aattttgggt gctggtggtg 1380 gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1440 gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1500 cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1560 cgctccgccc tgtacctgct ccggagggac cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc 1620 cctgggggag gcagtttccg gacccccatc caagaggagc aggccgacgc ccactccacc 1680 ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1740 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1800 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag 1860 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1920 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1980 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 2031 <210> 63 <211> 1665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CAR-004 (NA) <400> 63 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtctcc 120 tgccagggct ccggctactc cttccccacc cactggatca cctgggtgcg acaggccccc 180 ggccaaggcc tggaatggat gggcaccatc gaccccaccg actcctacaa cttctacggc 240 cccagcttcc agggcagagt gaccatcacc gccgactcct ccacgtccac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgagatc tgaggacacc gccatgtact actgcgccag ggacggcaac 360 tactacgact cccggggcta ctactacgat accttcgaca tgtggggcca gggcaccctg 420 gtcaccgtct cctcaggcgg tggaggatct ggaggaggcg gctctggggg gggcggctct 480 gacatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 540 atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 600 ggcaaagccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 660 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 720 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 780 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtcgctgg ccaggttctc caaaggcaca ggcctcctcc 840 gtgcccactg cacaacccca agcagagggc agcctcgcca aggcaaccac agccccagcc 900 accacccgta acacaggtag aggaggagaa gagaagaaga aggagaagga gaaagaggaa 960 caagaagaga gagagacaaa gacaccaggt tgtccgtttt gggtgctggt ggtggttggt 1020 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1080 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1140 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1200 gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 1260 ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 1320 aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1380 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1440 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1500 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1560 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1620 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1665 <210> 64 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E4-H5k2 heavy chain variable region (AA) <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E4-H6k2 heavy chain variable region (AA) <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E4-H6k0 light chain variable region (AA) <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (23)

  1. 다음을 포함하는 항-c-Met 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자:
    c-Met 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 c-Met 결합 도메인은 항-c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 15내지 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정영역 1(complementarity determining region 1 of heavy chain, CDRH1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDRH2), 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3); 및 서열번호 18내지 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정영역 1(complementarity determining region 1 of light chain, CDRL1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDRL2), 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)를 포함하는 것인, 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH); 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 선행 서열(leader sequence, LS)을 추가적으로 포함하는 것인, 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 선행 서열은 CD8 alpha의 선행 서열, hGM-CSF receptor alpha-chain의 선행 서열, 또는 3E8 항체의 선행 서열인, 핵산 분자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 선행 서열은 서열번호 26, 28 또는 30의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 선행 서열인, 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 c-Met 결합 도메인 및 막횡단 도메인은 힌지 영역, 스페이서 영역, 또는 이들의 조합에 의하여 연결되는 것인, 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 힌지 영역 또는 스페이서 영역은 IgG1의 힌지, IgG4의 힌지, IgD의 힌지, CD8 alpha의 힌지, IgG1 CH3, CD28의 세포외 도메인 또는 이들의 조합인, 핵산 분자.
  10. 제8항에 있어서, 상기 힌지 영역 또는 스페이스 영역은 서열번호 32, 34, 36, 38, 40 또는 44의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 선행 서열인, 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호 42, 46 또는 47의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  13. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CD3 제타의 신호 전달 도메인은 서열번호 55, 57 또는 59의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  15. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 신호전달 도메인을 공동자극 도메인으로 추가적으로 포함하는 것인, 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 서열번호 49, 51 또는 53의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 공동자극 도메인인, 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 인코딩 되는 폴리펩티드를 포함하는 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자.
  19. 제18항의 항-c-Met 키메라 항원 수용체 분자를 세포 표면에 발현하는 효과기 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효과기 세포.
  21. 제19항의 효과기 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 c-Met 면역치료용 약제학적 조성물.
  22. 제19항의 효과기 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 c-Met 발현과 연관된 질환의 치료용 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 c-Met 발현과 연관된 질환은 신경교종, 유방암, 췌장암, 흉막 증피종, 간암, 위암, 폐암, 난소암, 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병인, 약제학적 조성물.
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