KR20180102116A - 항―ｃ―ＭＥＴ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 c-Met 아고니스트로서 기능하는 항-c-Met 항체에 의해 유도된 세포에서의 c-Met 활성화를 통해, 다양한 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 항-c-Met 항체에 의한 c-Met 활성화를 통해 다양한 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

항―ｃ―ＭＥＴ 항체 및 이의 용도
본 특허출원은 2016년 2월 5일에 미국특허청에 출원된 미국 특허출원 번호 제62/291,988호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 c-MET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 치료방법에 관한 것으로서, 상기 항체의 결합은 c-Met의 인산화 및/또는 MDCK-2 분산(scattering) 활성화와 같은 c-Met 활성을 증가시킨다. 항-c-Met 항체는 다양한 질환 및 질병의 예방 및 치료에 유용하다.
세포 표면에서 발현되는 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)는 Met 원발암유전자(proto-oncogene)에 의해 코딩되는 수용체 티로신 키나아제이다. 구조적으로 c-Met는 세포외 알파 서브유닛(extracellular alpha subunit, 50 kDa)과 막관통 베타 서브유닛(transmembrane beta subunit, 140 kDa)으로 구성된 디설파이드-결합된 이합체이다. c-Met는 리간드 결합을 위한 세포외 도메인, 막관통 부분, 및 세포내 도메인 내의 티로신 잔기의 인산화에 관여하는 티로신 키나아제 촉매 모티프를 포함한다(Dean et al., Nature, 4: 318 (6044): 385, 1985; Park et al., PNAS, 84 (18): 6379, 1976; Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173:183, 1997).
c-Met은 리간드인 HGF (hepatocyte growth factor)가 결합하면, c-Met의 세포질 티로신 잔기가 이량화되고 자가인산화되며(autophosphorylate), 이어 하위 신호전달 경로를 매개하는 다양한 단백질과 상호 작용한다. c-Met 활성화는 세포 성장, 분산(scattering) 및 운동성(motility), 침습(invasion), 세포사멸로부터의 보호, 분지형태 형성(branching morphogenesis) 및 신생혈관 형성(angiogenesis)의 증가를 유도하는 다양한 생물학적 반응을 초래한다. 병리학적 조건 하에서 c-Met의 부적절한 활성화는 암세포에 증식, 생존 및 침습/전이 능력을 부여할 수 있다. c-Met 활성에 의해 영향을 받는 다양한 생물학적, 생리학적 기능을 고려할 때, c-Met 단백질은 다용도의 치료 표적이 되었다. 본 발명에서는 c-Met 단백질에 결합하여 이를 활성화시키고 다양한 장애 또는 질병에서 예방적 및/또는 치료학적으로 유효한 c-Met 면역 글로블린을 제공한다.
상술한 관련 기술의 예시 및 제한사항은 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 관련 기술의 다른 제한은 명세서 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.
하기 설명되고 도시된 발명의 양태 및 실시예는 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명의 일 양태는 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subjects)에 투여하는 단계를 포함하는 치료방법이며, 상기 폴리펩타이드는 서열 번호 5의 CDR1, 서열 번호 6의 CDR2 및 서열 번호 7의 CDR3를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열 번호 9의 CDR2 및 서열 번호 10의 CDR3를 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 양태는, 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에게 투여하여, 뇌졸중의 위험성이 있거나 뇌졸중을 경험한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 양태는, 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에게 투여하여, 신장 손상 또는 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 신장 손상 또는 신장 질환으로 진단받은 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신장 손상 또는 질환은 섬유성 상태(fibrotic condition)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신장 손상 또는 신장 질환은 신장 섬유증(renal fibrosis), 만성 신장 섬유증(chronic kidney fibrosis), 당뇨병과 관련된 만성 신병증(chronic nephropathy associated with diabetes), 루푸스(lupus), 신장 경피증(scleroderma of the kidney), 사구체 신염(glomerular nephritis), 국소 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerular sclerosis), 인간 만성 신장질환 관련 IgA 신병증성 섬유증 (IgA nephropathyrenal fibrosis associated with human chronic kidney disease, CKD), 만성 진행성 신병증 (chronic progressive nephropathy, CPN), 세뇨관간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis), 요관 폐쇄(ureteral obstruction), 만성요독증(chronic uremia), 만성 간질 신장염(chronic interstitial nephritis), 방사선 신병증(radiation nephropathy), 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 진행성 사구체신증(progressive glomerulonephrosis, PGN), 내피/혈전성 미세혈관병증 손상(endothelial/thrombotic microangiopathy injury), HIV - 연관 신증(HIV-associated nephropathy), 및 독소, 자극제(irritant) 및 화학 요법제에 대한 노출과 관련된 섬유증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 양태는, 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 상처치유(wound healing) 증진방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 기계적, 화학적, 세균성 또는 열에 의한 상처이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 절개(incision), 열상(laceration), 찰과상(abrasion), 자창(puncture wound), 관통상(penetration wound) 및 총상(gunshot wound)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 피부 상처이다.
본 발명의 일 양태는, 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에게 투여하여, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder)의 위험이 있거나, 또는 망막 신생혈관 형성 장애로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 망막 신생혈관 형성 장애는 황반변성(macular degeneration), 히스토플라즈마증(histoplasmosis), 병리적 근시(pathological myopia), 망막색소선조(angioid streaks), 전방허혈성시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy), 세균성 심내막염(bacterial endocarditis), 베스트병(Best's disease), 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 혈관종(choroidal hemangioma), 맥락막 모반(choroidal nevi), 맥락막 비관류(choroidal nonperfusion), 맥락막 골종(choroidal osteomas), 맥락막 파열(choroidal rupture), 맥락막 결손(choroideremia), 만성 망막 박리(chronic retinal detachment), 망막 결손 (coloboma of the retina), 드루젠(Drusen), 내인성 칸디다 내안구염(endogenous Candida endophthalmitis), 망막 색소상피의 외유두상 과오종(extrapapillary hamartomas of the retinal pigmented epithelium), 황반안저(fundus flavimaculatus), 특발성 황반원공(idiopathic, macular hole), 악성 흑색종(malignant melanoma), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis, type II), 금속성 안구내 이물(metallic intraocular foreign body), 모닝글로리 디스크 신드롬(morning glory disc syndrome), 다발성 소실성 백반증후군(multiple evanescent white-dot syndrome, MEWDS), 거상연 신혈관형성(neovascularization at ora serrata), 수술현미경 화상(operating microscope burn), 시신경 헤드 피츠(optic nerve head pits), 광응고(photocoagulation), 내 맥락막증(punctuate inner choroidopathy), 풍진(rubella), 유육종증(sarcoidosis), 사행성 또는 지도 맥락막염(serpiginous or geographic choroiditis), 망막하액배출(subretinal fluid drainage), 기울어진 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 탁소플라즈마 망막맥락막염(Taxoplasma retinochoroiditis), 결핵(tuberculosis), 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome), 당뇨성망막병증(diabetic retinopathy), 비-당뇨성망막병증(non-diabetic retinopathy), 분지정맥 폐쇄(branch vein occlusion), 중심성 망막정맥 폐쇄(central retinal vein occlusion), 미숙신생아 망막증(retinopathy in premature infants), 홍채신생혈관(rubeosis iridis), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 중심와부근 모세관확장증(perifoveal telangiectasis), 겸상세포망막증(sickle cell retinopathy), 이일즈병(Eale's disease), 망막혈관염(retinal vasculitis), 본 히펠 린도우병(Von Hippel Linau disease), 방사선 망막증(radiation retinopathy), 망막동결손상(retinal cryoinjury), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 망맥락막결손(retinochoroidal coloboma), 단순포진각막염에 의한 각막혈관신행(corneal neovascularization due to herpes simplex keratitis), 각막궤양(corneal ulcers), 각막이식(keratoplasty), 익상편(pterigyia), 및 트라우마(trauma)로 구성된 군에서 선택되는 원인에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder)는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)이다.
본 발명의 일 양태는, 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을, 신경장애(neurological disorder)또는 신경질환(neurological disease)으로 진단받은 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 치료방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신경장애 또는 신경질환은, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 뇌동맥류(cerebral aneurism), 척수손상(spinal cord injury), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 만성대뇌피질위축증(diffuse cerebral cortical atrophy), 루이소체 치매(Lewy-body dementia), 픽병(Pick disease), 메조림보코르티콜 치매(mesolimbocortical dementia), 시상퇴행(thalamic degeneration), 헌팅턴무도병(Huntington chorea), 피질-선조체-척추 퇴행(cortical-striatal-spinal degeneration), 피질-기저 신경절 퇴행(cortical-basal ganglionic degeneration), 뇌소뇌퇴행(cerebrocerebellar degeneration), 경련성 하반신마비를 동반하는 가족성 치매(familial dementia with spastic paraparesis), 폴리글로코산체병(polyglucosan body disease), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 올리브교소뇌위축증(olivopontocerebellar atrophy), 진행성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy), 변형성근실조증(dystonia musculorum deformans), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 메이지증후군(Meige syndrome), 가족성떨림(familial tremors), 질레 드 라 투렛증후군(Gilles de la Tourette syndrome), 유극적혈구무도증(acanthocytic chorea), 프레드릭실조증(Friedreich ataxia), 홈스 가족성 피질소뇌위축증(Holmes familial cortical cerebellar atrophy), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 진행성 척수성 근육 위축증(progressive spinal muscular atrophy), 진행성연수마비(progressive balbar palsy), 일차성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 유전성 근위축증(hereditary muscular atrophy), 강직성 하반신마비(spastic paraplegia), 비골근위축증(peroneal muscular atrophy), 비대성 간질 다발신경병증(hypertrophic interstitial polyneuropathy), 유전성 다발신경염성 실조증(heredopathia atactica polyneuritiformis), 시신경병증(optic neuropathy), 안근마비(ophthalmoplegia), 및 망막 또는 시신경 손상(retina or optic nerve damage)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 폴리펩타이드를 대상체(subject)에게 방법에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3 을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 척추강내(intrathecal) 투여, 비경구(parenteral) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transdermal) 투여 또는 주입(infusion)에 의한 투여이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상체(subject)는 암이 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 대상체는 암으로 진단된 자가 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편(fragment)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1을 포함하고, 상기 경쇄 가변도메인은 서열번호 2를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 이의 단편(fragment)은 인간(human), 키메라(chimeric) 또는 인간화(humanized) 항체 또는 이의 단편(fragment)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 scFv를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 scFv 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1의 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 scFv는 서열번호 3의 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태는, 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서,
상기 조성물은 유효성분으로서 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)에 결합하는 항체 또는 이의 단편(fragment), 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
상기 항체는: 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2를 포함한다.
본 발명의 일 양태는, 허혈성 장애, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서,
상기 조성물은 유효성분으로서 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)에 결합하는 scFv, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
상기 scFv 는:
서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 scFv 는 서열번호 3의 서열을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물 등의 추가적인 실시 양태는 하기의 설명, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 명백해진다. 전술한 설명 및 후술하는 설명으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 각각의 모든 특징 및 2 이상의 그러한 특징의 모든 조합은 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 임의의 특징 또는 그 특징들의 조합은 본 발명의 임의의 실시예로부터 배제될 수 있다. 본 발명의 추가적인 양태 및 이점은 첨부된 실시예 및 도면과 관련하여, 다음의 설명 및 청구 범위에서 설명된다.
이하, 본 발명의 다양한 양태에 관하여 상세히 설명한다. 그러나, 이러한 양태들은 많은 다른 형태로 구체화될 수 있으며, 하기 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되는 것은 아니다. 하기 실시예는 본 발명이 완벽하게 이루어질 수 있도록 당업자에게 그 범위를 전달할 것이다.
I. 정의(DEFINITIONS)
본 명세서에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수(plural) 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 하나 이상의 중합체뿐만 아니라 2 종 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하며, "부형제(excipient)"는 하나 이상의 부형제뿐만 아니라 2 종 이상의 동일하거나 상이한 부형제를 포함한다.
값(value)의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 값(intervening value) 및 언급된 범위 내 임의의 다른 명시된 값 또는 사이의 값 또한 포함된다. 예를 들어, 1 μm 내지 8 μm 의 범위가 언급된 경우, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm 및 7 μm 가 명시적으로 포함되고, 1 μm 이상 및 8 μm 이하의 값 범위도 포함된다.
본 명세서에서 용어 "c-Met"는 당업계에서 간세포 성장 인자 수용체 (hepatocyte growth factor receptor, HGFR)로 알려진 수용체 티로신 키나아제 단백질 산물인, MET 원종양유전자(proto-oncogene)를 지칭한다. 예를들어, c-Met 는 1E4 폴리펩티드가 결합하는, GenBank 수탁 번호 NP_00236 (인간 c-Met 아이소폼 b, 서열번호 13), NP_001120972 (인간 c-Met 아이소폼 a, 서열번호 14) 및 NP_032617 (마우스, 서열번호 15)로 기재된 단백질 생성물, 및 이들의 변이체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중 특이성 항체 (예: 이중 특이성 항체) 및 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
용어 "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "완전한 항체(intact antibody)" 및 "전체 항체(whole antibody)" 는 상호 호환 가능하도록 사용되며, 상기 항체는 본래(native) 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다.
항체의 "종류(class)"는 중쇄가 갖는 불변 도메인(constant domain) 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5 가지 주요 종류가 있으며, 이들 중 몇 개는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위 분류(아이소타입)로 더 나누어질 수 있다. 다른 종류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다.
"항체 단편(antibody fragment)"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 손상되지 않은 항체의 부분을 포함하는, 온전한(intact) 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F(ab')2; 다이어바디(diabodies); 선형(linear) 항체; 단일쇄 항체 분자 (예: scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적(multispecific) 항체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 항체에 파파인(papain) 처리시 각각 하나의 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라 불리는 2 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편을 생성하며, Fc 의 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신(Pepsin) 처리시 2 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변도메인 (first constant domain, CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 경첩(hinge) 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 약간의 잔기가 부가되어 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리(free) 티올 그룹을 갖는 Fab'를 의미한다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍에 의해 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
"프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초 가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 본 발명의 일 구현예에서, 2 쇄(two-chain) Fv 종(species)은 견고하고 비공유 결합된 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 이합체로 이루어진다. 단일 사슬 Fv (single-chain Fv, scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 가요성(flexible) 펩타이드 링커에 의해 공유 결합될 수 있어서, 경쇄 및 중쇄가 "이량체(dimeric)" 구조로 결합할 수 있다. 이는 2쇄 Fv 종과 유사하다. 이러한 구조에서 VHV-VL 이량체 표면 상의 항원 결합 부위를 나타내기 위하여, 각 가변 도메인의 3 개의 HVR이 상호 작용한다. 종합적으로, 6 개의 HVR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 HVR 만 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 사이트보다 낮은 친화도를 나타낼지라도, 항원을 인식하고 결합할 수 있다.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, (Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352 : 624-628 (1991)).
용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 보다 작은 KD는보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나, 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종(species)의 c-Met 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
"친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1 : 1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기위한 구체적인 예시 및 예시적인 실시 양태를 하기에 기재한다.
약학 제형과 같은 약제의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여되는 효과적인 양을 지칭한다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 질환 또는 장애의 예방 및 선재(pre-existing) 또는 진단된 상태의 치료를 지칭하기 위해 사용된다.
II. 아고니스트 c-Met 항체를 이용한 치료방법
A. 치료타겟으로서의 c-Met
간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF) 수용체로도 알려진 c-Met 수용체 단백질은 간, 췌장, 전립선, 신장, 근육 및 골수를 포함하는 많은 기관의 상피 세포 표면에서 발현된다. c-Met에 대한 리간드는 HGF이다. HGF는 신체의 다양한 조직에서 세포 증식, 생존, 운동성, 산란(scattering), 분화 및 형태 형성(morphogenesis)을 촉진시키는 발달 인자(pleiotropic factor) 및 사이토카인으로서 작용한다. 또한 HGF는 간경화, 폐 섬유증 및 진행성 신장병증과 같은 여러 질병에서 보호적인 역할을 하는 것으로 보인다. HGF가 c-Met의 세포외 도메인에 결합하면, c-Met의 세포질 도메인 내의 다중 티로신 잔기가 인산화된다. Y1234 및 Y1235의 인산화는 c-Met 티로신 키나아제 활성 및 이어서 나타나는 Y1349 및 Y1356 잔기의 인산화를 활성화시킨다 (Matsumoto et al., 2014, Biomedicines, 2 : 275-300). 인산화된 티로신 잔기는 다양한 세포 내 신호 분자를 모집하여 세포 분열 및 이동의 촉진, 세포 사멸의 억제, 및 상피 세포의 형태 형성 유도와 같은 생물학적 활성을 나타낸다. HGF-c-Met 상호 작용은 간, 신장, 피부, 췌장, 폐, 신경계, 심장 및 면역 체계 등 다양한 생물학적 시스템에서 나타나며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하고 HGF의 결합에 의한 활성화와 유사한 방식으로 c-Met을 활성화시키는 폴리펩타이드를, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하기 위한 치료 조성물 밀 치료방법을 제공한다. 본원에 개시된 c-Met 활성화 폴리펩타이드가 질병 상태를 나타내는 다양한 증상을 예방 또는 치료하는데 치료학적으로 효과적임을 나타내는 데이터가 하기에 제공된다.
B. c-Met 아고니스트 항체
c-Met 단백질에 결합하는 면역글로불린은 PCT 출원 제 PCT/KR2015/007899 호에 기재되어 있다(그 내용은 전체가 참고 문헌으로 인용된다). 요약하면, 바이오 패닝(biopanning)을 위한 완전 인간화(fully humanized) 단일 사슬 항체(scFv) 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여, 인간 c-Met에 결합하는 scFv 종을 선택하였다. 본원에서 "1E4" scFv로 지칭되는 scFv는 c-Met와 높은 친화도로서 결합함이 입증되었으며, 본원에서 서열 번호 3으로 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 1E4 scFv 또는 이의 변이체는 하기에서보다 상세히 기술되는 바와 같이, 이를 필요로 하는 대상의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 제 PCT/KR2015/007899 호에는 1E4 scFv의 중쇄 가변 도메인 (서열번호 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열번호 2)을 갖고, 인간 IgG 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 전장(full-length) 면역글로불린의 제조방법이 기술되어 있다. 중쇄 가변 도메인은 CDR1 (서열번호 5), CDR2 (서열번호 6) 및 CDR3 (서열번호 7)을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 CDR1 (서열번호 8), CDR2 (서열번호 9) 및 CDR3 (서열번호 10)을 포함한다.
면역글로불린의 항원 결합특이성이 CDR 서열에 의해 크게 결정된다는 것은 당업자에게 자명하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 이용한 치료를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 1을 포함하는 IgG 중쇄 및 서열번호 2를 포함하는 IgG 경쇄를 포함한다. 상기 기술된 1E4 컨스트럭트의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
서열 번호 설명 서열
1 중쇄 가변도메인 QVQLVQSGAEVKKPGESLRISCQGSGYSFPTHWITWVRQMPGKGLEWMGTIDPTDSYNFYGPSFQGHVTISADSSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDGNYYDSRGYYYDTFDMWGQGTLVTVSS
2 경쇄 가변도메인 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGTAPKLLIYSASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQADSFPLTFGGGTKVEIKRGGASLVE
3 1E4 scFv QVQLVQSGAEVKKPGESLRISCQGSGYSFPTHWITWVRQMPGKGLEWMGTIDPTDSYNFYGPSFQGHVTISADSSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDGNYYDSRGYYYDTFDMWGQGTLVTVSSGLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGTAPKLLIYSASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQADSFPLTFGGGTKVEIKRGGASLVE
4 scFv 링커 GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS
5 중쇄 CDR1 THWIT
6 중쇄 CDR2 TIDPTDSYNFYGPSFQG
7 중쇄 CDR3 DGNYYDSRGYYYDTFDM
8 경쇄 CDR1 RASQGISTYLA
9 경쇄 CDR2 SASTLES
10 경쇄 CDR3 QQADSFPLT
1E4 항체가 선택적으로 MDCK-2 (Madin-Darby Canine Kidney epithelial Cells-2)에서의 분산 및 c-Met 인산화를 유도하는 것으로 나타났기 때문에(제 PCT/KR2015/007899 호), 본원에 기술 된 치료방법에 사용하기 위한 1E4 항체는 선택적으로 아고니스트(agonist) 항체로 지칭된다.
1E4 항체는 또한 인간 c-Met 및 마우스 c-Met 모두에 결합하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 인간 및 마우스 c-MET 에 대하여 1E4-IgG 항체의 BIAcore 분석을 수행하였다(제 PCT/KR2015/007899 호). 바인딩 결과는 하기 표 2에 기재하였다.
단백질 Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
마우스 c-Met 2.58 x 106 1.59 x 10-3 6.15 x 10-10
인간 c-Met 2.71 x 106 8.07 x 10-4 2.98 x 10-10
따라서, 일부 구현예에서, 약 3 Х 10-10 M 이하의 KD로 인간 c-Met 단백질에 결합하는 항체, 또는 약 7 x 10-10 M 이하의 KD로 마우스 c-Met 단백질에 결합하는 항체를 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 치료방법이 제공된다. 상기 항체는 c-Met 기능의 아고니스트(작용제)이다.
달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 용어 "항체"는 2 개의 면역글로불린 중쇄 및 2 개의 면역글로불린 경쇄(즉, "완전 항체 분자")뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 분자를 포함한다(예를 들면, 용어 "항체"는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다). 따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 scFv 구조물 또는 다른 면역글로불린 단백질을 포함할 수 있다. 항체의 "항원-결합 부위", 항체의 "항원-결합 단편" 등과 같은 용어는 항원과 결합하여 복합체를 형성하는, 천연 발생, 효소처리로 수득 가능한, 합성된 또는 유전적으로 조작된 임의의 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본 명세서에서 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항체 단편"은 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR을 포함하는 단편 또는 분리된 CDR을 포함할 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들면 단백질 분해효소에 의한 분해, 또는 항체 가변 및 (선택적으로) 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 공학 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 입수 가능하거나 또는 합성될 수 있다. DNA는 시퀀싱되고 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 배치로 배열하거나, 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 만들고, 아미노산을 변형, 추가 또는 삭제할 수 있다.
항원 결합 단편은 다음의 비제한적인 예시를 포함한다: (ⅰ) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(hypervariable region)을 모방한 아미노산 잔기를 포함하는 최소 인식 단위(예를 들어, CDR3 펩타이드와 같은 분리된 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)) 또는 제한(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드. 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-결합(grafted) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies) (예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등)와 같은 다른 조작된 분자, 소형 모듈 면역약제 (small modular immunopharmaceuticals, SMIP) 및 상어 가변 IgNAR 도메인(shark variable IgNAR domains)은 또한 본 명세서에서 사용된 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"이라는 표현 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열(framework sequences)을 가진 프레임(frame) 내에 있거나 인접하여 있는, 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 결합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체 일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 포함할 수 있다. 또는, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
전체 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일 특이적(mono-specific) 또는 다중 특이적(multi-specific) (예를 들어, 이중 특이성)일 수 있다. 항체의 다중 특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2 개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 각 가변 도메인은 별도의 항원 또는 동일한 항원 상의 다른 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중 특이적 항체 포맷을 비롯한 임의의 다중 특이적 항체 포맷은, 당업계에서 이용 가능한 일반적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 단편과 관련하여 사용하기 위해 채택될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 제공된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용되는 항-c-Met 항체는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 서열 상동성(identity)을 갖는 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain, VH)을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호 1에 대하여 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 상동성(identity)을 갖는 VH 서열은 예를 들어, 표준 서열(reference sequence)에 대한 치환(보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-c-Met 항체는 c-Met에 결합하는 능력을 보유한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, 프레임 워크 영역에서) 발생한다. 선택적으로, VH 서열을 포함하는 항-c-Met 항체는 그 서열의 번역 후 변형(post-translational modifications)을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용되는 항-c-Met 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain, VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호 2에 대하여 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 상동성(identity)을 갖는 VL 서열은, 표준 서열(reference sequence)에 대한 치환(보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 삽입 / 삭제), 삽입 / 삭제를 포함하지만, 항-c-Met 항체는 c-Met에 결합하는 능력을 보유한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, 프레임 워크 영역에서) 발생한다. 선택적으로, VL 서열을 포함하는 항-c-Met 항체는 그 서열의 번역 후 변형(post-translational modifications)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용되는 항-c-Met 항체는 서열번호 1 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 %, 98 % 또는 99 %의 상동성을 갖는 VH 서열, 및 서열번호 2 서열과 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 또는 99 % 상동성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 상기 항체는 서열번호 13의 서열을 갖는 c-Met 단백질에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 약 3 x 10-10 M 이하의 KD로 서열번호 13의 서열을 갖는 c-Met 단백질에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 약 7 x 10-10 M 이하의 KD로 서열번호 15의 c-Met 단백질에 결합한다.
결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구조가 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록 만들어질 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 관심 부위는 프레임워크 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 보존적 치환은 표 3 에 기재되어 있다. 보다 바람직한 예는 표 3에서 "바람직한 치환(Preferred substitutions)"의 표제 하에 제공되며, 아미노산 측쇄 등급(side chain classes)과 관련하여 하기에서 더 기술된다. 아미노산 치환은 대상 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
본래의 잔기 보존적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
아미노산은 일반적인 곁사슬(side-chain) 특징에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성(hydrophobic): 노르류신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성(neutral hydrophilic): Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(acidic): Asp, Glu;
(4) 염기성(basic): His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족(aromatic): Trp, Tyr, Phe.
비보존적(Non-conservative) 치환은 이들 종류 중 하나의 구성원을 다른 종류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는(glycosylated) 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 쉽게 수행될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착 된 탄수화물(carbohydrate)은 변경될 수 있다. 올리고당은 예를 들어, 바이안테너리(biantennary) 올리고당 구조의 "모체(stem)"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스뿐만 아니라, 만노오스, N- 아세틸 글루코사민 (G1cNAc), 갈락토오스 및 시알산과 같은 다양한 탄수화물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 제조될 수 있다. 항체 변이체는 이분된(bisected) 올리고사카라이드일 수 있으며, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리(biantennary) 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분된다(bisected). 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화(fucosylation) 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 또한, Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체일 수 있다.
C. 치료용도의 1E4 면역글로불린 제조
scFv 컨스트럭트(서열번호 3)의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로부터의 전장 인간 1E4 IgG 항체의 생성은 일반적인 방법 및 조성물을 사용하여 수행된다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 인간 1E4 항체의 제조방법은 하기 실시예 1 및 제 PCT/KR2015/007899 호에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 1E4 항체의 가변 도메인을 코딩하는 핵산(서열번호 11 및 12, 및 이들의 변이체)은 일반적인 방법을 사용하여 전장 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-c-Met 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산은, 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임(in-frame) 접합된, 본 발명의 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)을 포함할 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 항-c-Met 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는, 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임 접합된, 본 발명의 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인(VL)을 코딩하는 핵산 분자가 전장 항체 유전자로 "전환된다(converted)". 일 구현예에서, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 각각 중쇄 불변 도메인(CH) 또는 경쇄 불변 도메인(CL)을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입됨으로써 전장 항체 유전자로 전환된다. VH 단편(segment)는 벡터 내의 CH 단편에 작동적으로 연결(operatively linked)되며, 및/또는 VL 단편은 벡터 내의 CL 단편에 작동적으로 연결된다. 또 다른 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 연결(linking), 예를 들어 결찰(ligating)시킴으로써 전장 항체 유전자로 전환된다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 불변 도메인 유전자의 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991). 전체 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 세포에 도입하여 세포에서 발현시킨 후, 이어서 항-c-Met 항체를 분리할 수 있다.
핵산 분자는 다량의 항-c-Met 항체를 재조합 발현시키는데 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 상기 기술된 바와 같이, 키메라 항체, 이중 특이성 항체, 단일 쇄 항체, 면역 접합제(immunoadhesins), 디아바디(diabodies), 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생성하는데 사용될 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인 (서열번호 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열번호 2)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 링커(예: 서열번호 4) 코딩 폴리뉴클레오타이드와 접합시켜 발현 벡터에 클로닝하고, 상기 벡터가 도입된 세포로부터 발현시켜, 본 명세서에 기재된 치료방법에 사용하기 위한 scFv 컨스트럭트를 생성한다.
D. 상처 치료
본 발명의 일 양태는, 1E4 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 상처 치유를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 하기 실시예 2 에 기재된 바와 같이, 1E4 항체를 마우스 상처에 투여하면, 1E4 항체를 투여하지 않은 마우스의 상처 치유와 비교하여 상처 치료가 빨라진다. 도 1에 도시된 바와 같이, 3 μg, 6 μg 또는 12 μg의 1E4 항체를 마우스 피부 상처에 국소 투여한 경우, 1E4 면역글로불린을 투여하지 않은 경우와 비교하여 창상 면적을 적어도 20 % 감소 시키는데 효과적이었다. 당업자는 1E4의 c-Met 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자의 투여가 대상체에서 상처 치유를 촉진하는데 효과적일 것이라는 것을 알 수 있다.
상처 치유는 HGF-c-Met 경로를 필요로 하는 것으로 나타났다. 상처는 열상(lacerations), 상처, 긁힘, 물집, 찰과상, 화상, 당뇨병성 궤양, 욕창, 수술 상처 및 기타 상처와 같이 피부 또는 다른 조직 또는 기관의 붕괴를 비롯한 많은 원인에 의해 발생할 수 있다. 모든 상처는 유사한 상처 치료 과정을 거친다. 상처 치유는 4 단계로 구분된다. 첫 번째 단계는 혈소판이 상처 부위에 도달하여 응고를 촉진하는 혈액 응고(지혈) 단계이다. 두 번째 단계인 염증기(inflammatory phase)는 외상 부위의 염증을 특징으로 한다. 이 단계는 치료에 중요하며 광범위한 세포 이동을 수반한다. 상처 치유의 세 번째 단계는 상피화(epithelialization), 혈관 신생, 과립 조직 형성 및 콜라겐 침착으로 특징되는 증식 단계(proliferative phase)이다. 새로운 모세 혈관 형성과 관련된 혈관 신생은 영양분을 공급하고 과립화(granulation)를 유지하는데 사용된다. 상처에 새로운 모세 혈관이 형성되지 않으면 필요한 영양소가 상처에 도달하지 못하여 만성적으로 치유되지 않는 상처가 된다. 상처 치유의 네 번째 및 최종 단계는 섬유아세포가 콜라겐으로 분화하는 성숙 단계(maturational phase)이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 상처 치유의 하나 이상의 단계에서 효과적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 모든 형태의 상처에서 요구되는 적절한 치유 과정을 수반하고 따라서 상처에 의해 전형적으로 초래되는 파괴적인 생화학적 반응을 방지한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 1E4 항체는 화상에 효과적이다. 화상은 열에 의해 유도된 화상, 열에 유도된 조절(controlled) 화상, 화학적 화상, 방사선 화상, 전기 화상, 얼음 화상 또는 번개에 노출에 의해 야기된 화상일 수 있다. 상기 화상은 1도, 2도, 3도 또는 4도 화상 또는 그 조합을 포함하는 다양한 정도의 화상을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원의 조성물 및 방법은 상처 치유를 촉진함으로써 미생물이 상처 부위에 침입하는 것을 직접 또는 간접적으로 방지한다. 따라서 환자는 상처와 연관된 감염이 없기 때문에 고통을 덜 받는다. 따라서 상기 조성물은 상처 손상이 더 심해지는 것을 방지한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 대부분의 상처에서 미생물에 대한 증식 원인인 조직 손상을 예방, 치료 및/또는 개선한다. 감염 순환을 억제하여 질병의 진행을 멈출 수 있다. 감소된 감염률은 상처의 일반적인 결과인 질병, 장애 및 기형의 심각성을 감소시킨다.
본 발명에 따라 성공적으로 치료 또는 예방 될 수 있는 상처 또는 염증과 관련된 다른 상태는 탄저균 상처(anthrax wounds), 파상풍(tetanus), 가스 괴저병(gas gangrene), 스카치나(scalatina), 단독(erysipelas), 모창(sycosis barbae), 모낭염(folliculitis), 전염성 농(impetigo contagiosa), 또는 수포성 농가진(impetigo bullosa) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법을 실시함에 있어서, 치료학적 유효량의 아고니스트 c-Met 면역글로불린이 상처 치유를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여된다. 면역글로불린은 단독으로 또는 다른 공지된 치료법과 조합하여 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료법과 함께 사용되는(co-administered) 경우, 면역글로불린은 다른 치료와 동시에 또는 순차적으로 진행될 수 있다. 순차적으로 진행되는 경우 주치의는 두 번째 치료 전후로 적절한 투여 순서를 결정할 것이다.
E. 신장 조직 손상의 예방 또는 치료
본 발명의 일 양태는, 상술한 1E4 항체의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장 조직에 대한 손상을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 하기 실시예 3에서는 동물에 대한 1E4 항체의 투여가 화학요법 약물인 아드리아마이신 (adriamycin, ADR)의 동물에게 투여함으로써 야기되는 신장 조직 손상을 감소시키는 것을 보여준다. 구체적으로, BALB/c 마우스에 2 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg 1E4 항체를 꼬리 정맥 투여하였다. 다음날, 15 mg/kg ADR의 단일 꼬리 주입에 의해 신장 손상을 유도하였다. 그 후 마우스에게 2 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg 1E4 항체를 ADR 주사 후 2 일 및 5 일째에 정맥 내 주사하였다. 도 2a 및 도 2b 에서 볼 수 있듯이, 1E4 면역글로불린 5 mg/kg 또는 그 이상의 용량은 BUN (혈액 요소 질소) 및 크레아티닌 증가를 줄이는데 효과적이다. 혈액에서의 BUN 및 크레아티닌 수준의 증가는 신장의 기능 상실 및 손상의 지표이다. 신장 기능이 저하됨에 따라 크레아티닌과 요소 (사구체 여과에 크게 의존하는)의 혈장 농도는 비선형 상승을 시작한다. 초기에는 크레아티닌 및 우레아 농도의 변화가 거의 없다. 이후 크레아티닌 및 우레아 농도 수준은 급속히 증가되고 일반적으로 전신 징후(systemic manifestations)과 관련된다.
ADR 투여 후, PBS를 투여한 동물 (ADR 및 항체를 투여하지 않은 "naive" 동물과 비교한 "PBS"군, 도 2a 및 2b)에서만 BUN 및 크레아티닌이 모두 증가하였다. 그러나, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg 1E4 항체의 투여는 1E4 항체로 처리하지 않은 동물과 비교하여 BUN 및 크레아티닌 모두의 수준을 감소시켰다. 또한 조직학적 분석을 통해 1E4 면역글로불린 최소 5 mg/kg 존재시, 신장 조직 손상의 유의한 감소가 관찰되었다(실시예 3 참조).
신장 섬유증(Renal fibrosis)은 거의 모든 유형의 만성 신장 질환에서 발생하고 궁극적으로 말기 신부전을 초래하는 세포 외 기질의 과도한 축적에 기인한다. 신장 섬유증 (renal fibrosis)은 만성적이고 지속적인 손상 후 신장 조직의 상처 치유 과정이 실패한 것으로 생각된다. 하기 실시예 4에서는 신장 섬유증에 대한 동물 모델을 설명하고, 1E4 항체의 투여가 신장 조직에서 섬유성 병변의 정도를 감소시키는 것을 보여준다. 따라서, 일부 구현예는 1E4 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하는, 신장 조직에 대한 손상을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물은 1 차 및 2 차의 다양한 신장 질환 및 신부전증의 치료 및 예방에 적용 가능하다. 2 차 신장 질환에는 당뇨병이나 고혈압과 같은 기존(pre-existing) 질환으로 인한 질병이 포함된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 특히 요세관간질성 신장병(tubulointerinterstitial nephropathy) 또는 사구체신장병(glomerulonephropathy)의 병리학적 변화 및 단백뇨에 특징이 있는, 만성 염증 및자가 면역 질환에 응용된다. 질환은 국소 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis), 사구체신염(glomerulonephritis), 당뇨병성 신장질환, 고혈압성 신장질환, 신부전, 말기 신장질환 및 관련 상태를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 만성 신부전은 신장 기능 장애의 주요한 원인으로부터 발생할 수 있다. 말기 신장질환의 가장 흔한 원인은 당뇨병성 신증, 그 다음으로는 고혈압성 신혈관성 경화증(hypertensive nephroangiosclerosis), 및 다양한 1 차 및 2 차 사구체 신염이 있다. 다른 원인으로는 사구체 신염, 예를 들면, IgA 신장병증(IgA nephropathy), 국소 사구체신염(focal glomerulosclerosis), 막성 신장병증(membranous nephropathy), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis), 특발성 반원형 사구체신염(idiopathic crescentic glomerulonephritis), 당뇨병(diabetes mellitus), 감염후 사구체신염(postinfectious glomerulonephritis), 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 베게너 육아종성림프종(Wegener's granulomatosis), 용혈성-요독성 증후군(hemolytic-uremic syndrome), 아밀로이드증(amyloidosis);
만성 요세관간질성 신장병(tubulointerinterstitial nephropathy);
유전성 신증(hereditary nephropathies), 예를 들면, 다발성 신장 질환(polycistic kidney disease), 알포트 증후군(Alport's syndrome), 수질낭성질환(medullary cystic disease), 손톱-무릎뼈 증후군(Nail-patella syndrome);
고혈압(hypertension), 예를 들면 신혈관경화증(nephroangiosclerosis), 악성 사구체경화증(malignant glomerulosclerosis);
신장거대혈관질환(renal macrovascular disease);
및 폐쇄성 요로병증(obstructive uropathy), 예를 들면 요관폐쇄(ureteral obstruction), 방광역류(vesicoureteral reflux), 양성 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia); 등이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법을 실시함에 있어서, 치료학적 유효량의 아고니스트 c-Met 면역글로불린이 신장 기능의 상실과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체(subject)에게 투여된다. 면역글로불린은 단독으로 또는 다른 공지된 치료법과 조합하여 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료법과 함께 사용되는 경우, 면역글로불린은 다른 치료와 동시에 또는 순차적으로 진행될 수 있다. 순차적으로 진행되는 경우 주치의는 두 번째 치료 전후로 적절한 투여 순서를 결정할 것이다.
F. 허혈에 의한 조직 손상의 치료 또는 예방
본 발명의 일 양태는, 상술한 1E4 항체의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직에 대한 허혈성 손상을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 1E4 항체는 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중으로 인한 손상을 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났다 (실시예 5 참조). 1 일전 10 mg/kg의 1E4 항체를 투여한 래트에서 중대뇌동맥을 폐색시킨 동물 모델을 사용하였다. 폐색이후, 3, 10, 17 및 24 일째에 래트에게 10 mg/kg 1E4 항체를 정맥 내 투여하였다. 뇌 조직의 분석은 MRI를 사용하였고 경색의 정도를 측정하였다. 1E4 항체 투여가 폐색 모델에서 경색 크기를 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났다(도 5 참조).
허혈(Ischemia)은 조직으로의 혈액 공급의 감소 또는 폐색을 의미한다. 본 명세서에 기재된 면역글로불린 폴리펩티드 및 방법은 허혈과 관련된 손상 또는 "허혈성 손상"을 치료하는데 사용될 수 있다. 허혈성 손상은 예를 들어 신장, 간, 폐, 췌장, 골격근, 장, 심장 및 뇌에 대한 손상을 포함할 수 있다.
허혈성 손상은 뇌졸중, 급성 심근 경색, 선택적 혈관 성형술, 관상 동맥 우회 이식, 심장 우회술 또는 장기 이식 또는 조직 이식 (예: 심장 이식), 이식 후 조직 거부, 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease), 두개관내 출혈(head trauma), 익사(drowning), 패혈증(sepsis), 심장마비(cardiac arrest), 쇼크(shock), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 코카인-유발성 심장질환(cocaine-induced heart disease), 흡연-유발성 심장질환(smoking-induced heart disease), 심부전(heart failure), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 출혈(hemorrhage), 모세혈관 누출증후군(capillary leak syndrome; 예를 들면 어린이 및 성인 호흡곤란 증후군), 다기관 시스템 부전(multi-organ system failure), 저콜로이드성 삼투압의 상태(a state of low colloid oncotic pressure; 예를 들면, 굶주림, 신경성 식욕 부진, 또는 혈청 단백질 생산 감소로 인한 간부전), 과민증(anaphylaxis), 저체온증(hypothermia), 저온손상(cold injury; 예를 들면 저체온 관류 또는 동상에 의한) 간신증후군(hepatorenal syndrome), 정신 착란 증후군 (delirium tremens), 압착손상(crush injury), 장간막 기능 부전(mesenteric insufficiency), 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease), 파행(claudication), 화상(burn), 감전(electrocution), 과도한 약물-유발성 혈관 확장(excessive drug-induced vasodilation), 과도한 약물-유발성 혈관 수축(excessive drug-induced vasoconstriction), 방사선노출(radiation exposure), 예를 들어, 형광 투시법 또는 방사선 사진촬영, 또는 고에너지 노출(exposure to high energy), 예를 들어 레이저광노출 등과 연관되거나 이에 의해 유발될 수 있다. 과도한 약물-유발성 혈관 확장은 니트로프루시드 (nitroprusside), 하이드 랄라존(hydralazone), 디아조사이드(dyazoxide), 칼슘 채널 차단제 또는 전신 마취 등으로 인해 발생할 수 있다. 과도한 약물-유발성 혈관 수축은 예를 들어 네오시네프린(neosynephrine), 이소프로테레놀(isoproterenol), 도파민(dopamine), 도부타민(dobutamine) 또는 코카인(cocaine)에 의해 유발될 수 있다.
뇌졸중은 혈관 질환 또는 손상으로 인한 급성 뇌 손상의 일반적인 용어이다. 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중 (정상 혈관 밖의 혈액 누출로 인한 뇌졸중)과 허혈성 뇌졸중 (혈액 공급 부족으로 인한 뇌허혈)으로 분류할 수 있다. 허혈성 뇌졸중을 일으킬 수 있는 일부 이벤트에는 혈전증, 색전증 및 전신성 저관류 (결과적으로 허혈 및 저산소증)가 포함된다. 뇌졸중은 일반적으로 산소 결핍 및 2 차 이벤트로 인해 뇌에서 신경 세포의 사멸과 손상을 일으킨다. 혈액 공급 부족이나 다른 손상의 결과로 사멸하는 뇌 영역을 경색(infarct)이라 한다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 치료방법은 경색의 크기를 감소시키거나 최소화 시키는데, 예를 들어, 신경 세포의 사멸 또는 손상을 유발하는 2 차 이벤트를 감소시킬 수 있다.
뇌동맥 벽에 축적 된 혈전에 기인하는 대뇌 동맥의 장애는 일반적으로 뇌 혈전증 (cerebral thrombosis)이라고 불린다. 대뇌 색전증(cerebral embolism)에서, 대뇌 동맥을 차단하는 폐쇄 물질은 순환의 하류에서 발생한다 (예를 들어, 색전은 심장에서 대뇌 동맥으로 운반된다). 뇌졸중이 혈전증 또는 색전증에 의해 발생하는지 여부를 식별하기 어렵기 때문에, 혈전 색전증(thromboembolism)이라는 용어가 두 가지 유형의 뇌졸중을 모두 포괄하는데 사용된다. 전신 저관류(Systemic hypoperfusion)는 혈중 농도의 감소, 적혈구용적률(hematocrit)의 감소, 저혈압 또는 심장에서 혈액을 충분히 펌핑할 수 없어 발생할 수 있다.
본 발명의 치료 방법을 실시함에 있어서, 치료학적 유효량의 아고니스트 c-Met 면역글로불린이 허혈과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체(subject)에게 투여된다. 면역글로불린은 단독으로 또는 다른 공지된 치료법과 조합하여 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료법과 함께 사용되는 경우, 면역글로불린은 다른 치료와 동시에 또는 순차적으로 진행될 수 있다. 순차적으로 진행되는 경우 주치의는 두 번째 치료 전후로 적절한 투여 순서를 결정할 것이다.
G. 병리학적 망막 혈관신생의 치료
본 발명의 일 양태는, 상술한 1E4 항체의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 망막에서 병리학적 혈관 신생(pathologic neovascularization)과 관련된 신생 혈관 망막 질환(neovascular retinal disease)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 하기 실시예 6은 동물 모델에서 병리학적 신생혈관 형성의 성공적인 치료를 보여준다. 특히 시신경 주위에 광응고 반점이 생긴 친칠라(Chinchilla) 토끼에게 레이저 유도 맥락막 신생 혈관 모델 (choroidal neovascularization, CNV)을 적용하였다. 토끼에게 50 μg의 1E4 항체를 유리체액(vitreous humor)에 직접 투여하면, 레이저 유도 성 CNV 형성이 억제되어 (도 6 참조), 치료를 필요로 하는 대상체를 1E4 면역 글로불린 조성물로 망막의 병적 신생 혈관 형성을 예방 또는 치료하는 실시 양태를 뒷받침한다.
안구 조직 내 및 주위의 새로운 혈관의 병리학적 성장(신혈관 형성)은 다양한 안질환 (ancular diseases)과 관련되어있다. 특히 저산소증(hypoxia)은 맥락막과 Bruch 막의 병리학적 혈관 신생에 대한 주요 자극으로 알려져 있어, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 및 AMD의 습윤 형태(wet form)와 관련된 치명적인 시력 상실을 초래한다.
눈의 질환 또는 상태, 특히 망막병증, 눈의 부종 및 안신생 혈관의 치료 방법이 개시된다. 이들 질병 또는 상태의 비제한적 예시로서, 당뇨병성 황반부종, 연령-관련 황반변성(age-related macular degeneration; 습윤 형태), 맥락막 신생혈관증(choroidal neovascularization), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 안구 허혈(ocular ischemia), 포도막염(uveitis), 망막 정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion; 중심성 또는 분지성), 안 외상(ocular trauma), 수술 유도된 부종(surgery induced edema), 수술 유발 신생 혈관증(surgery induced neovascularization), 낭포성 황반 부종(cystoid macular edema), 안 허혈(ocular ischemia), 포도막염(uveitis) 등이 있다. 이러한 질병 또는 상태는 급성 질환 또는 상태의 결과인지, 또는 만성 질환 또는 상태인지, 진행성 또는 비-진행성인지 여부에 따른 안구 혈관계의 변화를 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 환자는 허혈-유발성 신혈관 형성증을 앓고 있다. 허혈-유발성 신생 혈관증(Ischemia-induced neovascularization)은 반드시 질병에 의해 야기되지는 않는다. 예를 들어, 안구 조직의 손상은 안구 조직의 저산소 상태를 유발할 수 있으며, 이로 인해 허혈-유발성 신생 혈관 형성을 유발하여 시력 손실을 초래할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema) 및 당뇨병 성 망막증(diabetic retinopathy)을 비롯한 당뇨병의 직접적 또는 간접적인 결과에 의한 질병과 관련된 방법에 관한 것이다. 발생할 수 있는 또 다른 증상은 미세 동맥류(microaneurysms)와 같은 비증식성 망막병증으로서, 혈관 변화가 눈의 황반부 바깥에서 발생할 수 있다. 이러한 상태는 신생 혈관이 특징인 당뇨병성 증식성 망막병증(diabetic proliferative retinopathy)으로 진행될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 전형적으로, 당뇨병성 황반부종을 갖는 대상체(subject)는 당뇨병성 망막증의 비-증식성 단계를 겪고 있다; 그러나 증식 단계가 시작될 때 황반부종 증상이 나타나기 시작하는 것이 드문 일은 아니다.
본 발명의 치료 방법을 실시함에 있어서, 치료학적 유효량의 아고니스트 c-Met 면역글로불린이 병리학적 망막 신생 혈관과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체(subject)에게 투여된다. 면역글로불린은 단독으로 또는 다른 공지된 치료법과 조합하여 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료법과 함께 사용되는 경우, 면역글로불린은 다른 치료와 동시에 또는 순차적으로 진행될 수 있다. 순차적으로 진행되는 경우 주치의는 두 번째 치료 전후로 적절한 투여 순서를 결정할 것이다.
H. 신경질환의 치료
본 발명의 일 양태는, 상술한 1E4 항체의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. HGF의 결합에 의한 c-Met의 활성화는 신경계의 발달 및 유지에 중요한 역할을 한다. c-Met는 반응성 성상 세포(reactive astrocytes), 희소돌기 아교세포 전구세포(oligodendrocyte progenitors), 희소 돌기 아교 세포(oligodendrocytes) 및 미세아교세포(microglia )와 같은 비-신경 세포 뿐만 아니라, 대뇌 피질(cerebral cortex), 해마(hippocampus), 소뇌(cerebellum), 뇌사 운동 신경핵(brainstem motor nucleus), 망막 및 감각 신경절(retina and sensory ganglia) 및 척수(spinal cord) 포함한 성숙한 뇌 및 발달하는 뇌에서 발현된다(Funakoshi and Nakamura, 2011, Current Signal Transduc Ther, 6: 156-167).
슈반(Schwann) 세포 이동에 대한 1E4 아고니스트 항체 투여의 효과를 연구하기 위해 실시예 7의 실험을 수행하였다. 슈반 세포는 신경계의 발달, 기능 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 손상된 신경의 미엘린초 재생(re-myelination)은 슈반 세포의 손상된 신경으로의 이동을 필요로 한다. 실시 예 7에 기재되고, 도 7a 및 도 7b 에 도시된 바와 같이, 1E4 항체를 배양 중인 래트 슈반 세포에 투여한 경우, 완충액만으로 처리된 세포에 비해 이들 세포의 이동성이 유의하게 증가하였다.
추가적으로 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 동물 모델을 이용하여 본 발명의 아고니스트 c-Met 항체 효과를 연구하였다. 인간 돌연변이 SOD1을 발현하는 B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 마우스는 ALS 및 다른 신경근 질환에 대한 약제의 치료 효과를 연구하기 위한 동물 모델이다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, 1E4 항체를 척수강 내(intrathecally) 및 복강 내(intraperitoneally)로 투여한 마우스는 완충액만을 투여한 마우스와 비교하여 개선된 운동 기능을 갖는 것으로 나타났다 (도 8a 및 8b). 1E4 항체 치료는 생존율 또한 향상시켰다 (도 8d).
실시예 7 및 실시예 8의 실험 데이터는 본 발명의 아고니스트 c-Met 항체를 포함하는 조성물이 신경계 세포와 관련된 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
신경계에서의 HGF 및 c-Met의 잠재적인 역할은 Funakoshi and Nakamura, 2011, Current Signal Transduc Ther, 6: 156-167에 요약되어 있다. 예를 들어 연구 결과는 다음과 같다. HGF 및 c-Met 유전자의 돌연변이는 자폐증(autism), 조현병(schizophrenia) 및 비증후성 청력 상실(nonsyndromic hearing loss)과 관련 있다. 증가된 혈청 HGF 수치는 공황 장애 환자에서 항우울제 치료의 효능과 관련 있다. HGF는 허혈성 뇌 손상 후 기능 회복을 위한 강력한 뇌 보호제로서 작용하는 것으로 나타났다. HGF는 세포 사멸을 억제함으로써 신경 세포의 사멸을 방지하는 것으로 나타났다. HGF는 인비트로 및 인비보에서 운동 뉴런에 유익한 효과를 나타내며, 이러한 효과는 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)의 치료에서 잠재적인 치료적 가치를 나타내는 것으로 간주되어왔다. 알츠하이머병의 치료에서 c-Met 아고니스트에 대한 치료적 역할을 제안하는, 동물의 해마에서 HGF 수준을 증가시키는 다양한 연구에서 유익한 효과가 보고되었다. 또한, 일차 중뇌 도파민성 신경 세포(primary midbrain dopaminergic neurons)에서의 HGF의 신경영양적 효과(neurotrophic effects) 및 파킨슨 병에 대한 c-Met 아고니스트의 유익한 효과가 보고되었다. 손상된 척수에 외인성 HGF 유전자를 적용하여 운동 신경 세포의 생존을 촉진시켰고 손상 부위를 감소시켰으며, 이는 c-Met 아고니스트 항체가 척수 손상의 치료용도로 사용될 수 있음을 뒷받침한다.
c-Met의 활성화가 신경 질환 또는 손상에 대한 다양한 유익한 효과와 관련되어 있으므로, 본 발명의 치료 또는 사용 방법을 실시함에 있어서, 치료학적 유효량의 아고니스트 c-Met 면역글로불린은 신경 질환, 장애 또는 손상인 징후(indications)를 가진 대상체(subject)에게 투여될 수 있다. 이러한 징후로는 허혈성 뇌손상, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 척수 손상, 다발성 경화증, 발작, 수두증, 망막 손상, 청력 손상, 말초 신경 손상 및 신경병증 및 신경 병성 통증이 포함 되au, 이에 한정되는 것은 아니다.
I. 약제학적 조성물
본 발명의 다른 양태는, 항체 또는 이의 콘쥬게이트(conjugate) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생 혈관 형성 장애, 신경 장애 또는 질환, 또는 상처를 치료하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 약제학적 조성물은 유효성분으로서 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)에 결합하는 항체 또는 그의 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 상기 항체는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1을 포함하고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2를 포함한다.
일부 구현예에서, 허혈성 장애, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생 혈관 형성 장애, 신경 장애 또는 질환, 또는 상처를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 유효성분으로서 c-Met에 결합하는 scFv 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 상기 scFv는 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 scFv는 서열번호 3을 포함한다.
약제학적 조성물은 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 동맥 내 투여, 골수 내 투여, 뇌척수 내 투여, 심장 내 투여, 유리체 내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복강 내 투여, 설하 투여, 피하, 경피 및 국소 투여 등의 다양한 투여 경로를 통해 신체와 접촉시킬 수 있다.
이러한 임상 투여를 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 기술을 사용하여 적절한 산물로 제조될 수 있다.
본 발명의 항-c-Met 항체의 약제학적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 이에 한정되는 것은 아니지만 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 시클로 헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온(counter-ions); 금속착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체는, 가용성 중성 활성 히알루로니다아제 글리코단백질 (as soluble neutral-active hyaluronidase glycoproteins, sHASEGP)과 같은 간질성 약물 분산제(insterstitial drug dispersion agents), 예를 들어 rHuPH2O (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)와 같은 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 글리코단백질을 추가로 포함한다. 특정 예시로서 sHASEGP 및 rHuPH2O를 포함하는 사용 방법은 미국 공개특허 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기재되어 있다. 본 발명의 일 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나아제(chondroitinases)와 같은 하나 이상의 추가 글리코아미노글리카나아제 (glycosaminoglycanases)과 결합된다.
활성 성분은 코아 세르 베이션 기술(coacervation techniques) 또는 계면중합기술(interfacial polymerization)에 의해 마이크로캡슐 내에 존재하는 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-파티클 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼(macroemulsions) 하에서, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐(gelatin-microcapsules) 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐로 제조될 수 있다. 이러한 기술은 Remington 's Pharmaceutical Sciences 제 16 판, Osol, A. Ed. (1980) 에 개시되어 있다.
서방성 제제(Sustained-release preparations)로 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성(semipermeable) 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로 캡슐 등 성형된 제품의 형태로 존재한다.
생체 내(in vivo) 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
보다 양호한 투여를 위해, 상기 조성물은 전술한 활성 성분 이외에 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 생리식염수, 멸균수, 링거 용액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린(수성) 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 필요하다면, 산화 방지제, 완충액, 정균제(bacteriostatic agent) 등과 같은 전형적인 첨가제를 첨가 할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등의 첨가제를 첨가함으로써, 수용액, 현탁액, 에멀젼 등의 형태로 약제학적으로 제조할 수 있다.
J. 투약
1E4 c-Met 항체를 투여하기위한 효과적인 투여량 및 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 당해 기술 분야의 숙련된 기술자는 투여될 약제의 투여량이 약제를 투여할 대상, 투여 경로, 사용된 특정 유형의 약물 및 대상에게 투여될 다른 약제에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 예를 들면,
예를 들어, 항체의 적절한 투여량을 선정하는 지침은 "Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389"의 항체의 치료 용도에 관한 문헌에 기재되어 있다. 단독으로 사용되는 약제의 전형적인 투여량은 상술한 요인에 따라, 체중에 대해 또는 하루 당 약 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg 체중이거나, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.2 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 일 수 있다.
1E4 항체의 투여를 위한 투약 스케쥴은 1 일 1 회, 매주 3 회, 매주 2 회, 1 주일 1회, 3 회, 1 달 2 회, 1 달 1 회 및 매달 1 회 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1a-1b 는 아고니스트 항-c-Met 항체의 상처 치유 촉진 효과를 나타낸다. 도 1a는 마우스에 상처를 일으킨 뒤 10일 째의 표피 병변의 사진이다. 도 1b는 아고니스크 항-c-Met 항체를 처리한 마우스에서 14일 동안 상처 봉합의 속도를 나타내는 그래프이다.
도 2a-2b는 아드리아마이신 (adriamycin, ADR)-유도 신장병증 모델에서, 아고니스트 항-c-Met 항체의 보호 효과를 나타낸다. 도 2a는 아고니스트 항-c-Met 항체를 투여한 신장 손상을 가진 마우스에서의 혈중 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN) 농도의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 아고니스트 항-c-Met 항체를 투여한 신장 손상을 가진 마우스에서의 혈중 크레아티닌 (Crea) 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. Naive는 ADR과 항체를 투여하지 않은 동물을 의미한다. PBS는 ADR을 처리한 다음 인산염 완충 식염수 (항체 투여하지 않음)를 투여한 동물을 의미한다.
도 3a 및 3b는 아고니스트 항-c-Met 항체를 투여한 마우스에서 신장 손상 정도를 나타내는 조직 절편의 이미지 (도 3a) 및 이에 대응하는 그래프 (도 3b)를 나타낸다.
도 4a-4b는 일측성 요관 폐쇄 (unilateral ureteral obstruction, UUO)에 의해 유도된 래트 신장 병증 모델에서, 항-c-Met 아고니스트 항체의 신장 보호 효과를 나타낸다. 도 4a는 UUO에 의해 유도된 손상된 신장 조직의 Masson 3색-염색 절편의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 4b는 도 4a의 이미지에서 측정된 섬유화 스코어를 나타내는 그래프이다.
도 5는 허혈성 뇌졸중 래트 모델에서 아고니스트 항-c-Met 항체로 치료시 경색 크기의 변화를 나타낸다.
도 6은 레이저-유도된 맥락막 혈관 신생 (choroidal neovascularization, CNV)의 토끼 모델을 아고니스트 항-c-Met 항체로 치료한 경우, 맥락막 혈관 신생을 나타내는 형광의 측정치를 도시하는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 트랜스웰 분석(Transwell assay)에서 아고니스트 항-c-Met 항체에 의한 슈반 세포 (Schwann cells, iSc)에 이동 촉진 효과를 나타낸다. 도 7a는 염색된 세포의 이미지를 나타낸다. 도 7b는 도 7a 이미지들의 정량적 표현이다.
도 8a-8d는 B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 마우스의 운동 기능 및 생존에 대한 아고니스트 항-c-Met 항체의 효과를 나타낸다. 결과는 Rotarod (도 8a), 그립 강도 (도 8b), 체중 (도 8c) 및 생존 (도 8d)의 주간 평가(weekly assessment)로서 나타내었다.
서열번호 1은 1E4 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 1E4 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 1E4 scFv 컨스트럭트(construct)의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 1E4 scFv 컨스트럭트 내의 링커 도메인 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 1E4 중쇄 가변 도메인 CDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 1E4 중쇄 가변 도메인 CDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 7는 1E4 중쇄 가변 도메인 CDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 1E4 경쇄 가변 도메인 CDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 1E4 경쇄 가변 도메인 CDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 1E4 경쇄 가변 도메인 CDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 1E4 중쇄 가변 도메인의 핵산 서열이다.
서열번호 12는 1E4 경쇄 가변 도메인의 핵산 서열이다.
서열번호 13은 GenBank Acc. No. NP_000236 으로 표시되는 인간 c-Met 단백질 아이소폼 b의 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 GenBank Acc. No. NP_001120972 로 표시되는 인간 c-Met 단백질 아이소폼 a의 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 GenBank Acc. No. NP_032617 로 표시되는 마우스 c-Met 단백질의 아미노산 서열이다.
하기 실시예는 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
c-Met 항체의 제조
하기 실시 예에서 사용된 1E4 IgG1 항체는 HEK-293T 세포에서 재조합 발현에 의해 생성되었다. 전장 1E4 항체 중쇄를 코딩하는 핵산을 포함하도록 pIgGHD 벡터 (Aprogen, South Korea)를 제조하였다. 전장 1E4 항체 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하도록 pIgGLD 벡터 (Aproge, South Korea)를 제조하였다. 1E4 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 파지 디스플레이 라이브러리의 바이오 패닝 (biopanning)에 의해 생성된 ScFv 폴리펩타이드로부터 얻었다. 이러한 1E4 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 생성은 PCT 출원 번호 PCT/KR2015/007899에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 출원의 참고로 인용되었다. 1E4 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 1E4 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 1E4 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 SfiI 엔도뉴클레아제로 처리한 pIgGLD 벡터에 삽입하고, 1E4 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 SfiI 엔도뉴클레아제로 처리한 pIgGHD 벡터에 삽입하였다. 하기 실시예에 사용된 전장 1E4 항체를 재조합 발현시키고, pIgGHD 벡터를 SfiI 엔도뉴클레아제로 처리하고 pIgGLD 벡터를 BstXI 엔도뉴클레아제로 처리하였다. 1E4 IgG 항체를 생산하기 위하여, HEK-293T 세포를 동량의 경쇄 및 중쇄 발현 벡터로 형질 감염시켰다.
동시-형질감염된(co-transfected) 세포를 무혈청 배지 293 배지 (37℃, 5 % CO2)에서 배양한 다음 배지를 수거하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 단백질 A 친화성 크로마토 그래피 (GE healthcare, US)를 이용하여, 배지상등액으로부터 1E4 IgG 항체를 정제하였다: 상등액을 20 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 및 100 mM NaCl로 평형화시키고, 단백질 A 칼럼 칼럼에 주입하였다. 상기 컬럼을 20 mM 인산나트륨 (pH 7.0), 1 mM EDTA, 및 500 mM NaCl로 세척한 후, 100 mM NaCl을 함유하는 0.1 M 글리신 -HCl (pH 3.3)으로 항체를 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출된 단백질을 1M 트리스 용액으로 중화시켰다. 중화된 단백질과 5 mM 인산 나트륨 (pH 6.0)을 1 : 1의 비율로 혼합한 후, 50 mM NaCl을 함유하는 5 mM 인산 나트륨 (pH 6.0)으로 평형화 된 충전된 SP-세파로스 컬럼(GE 헬스 케어)에 주입하였다. 컬럼-결합된 단백질을 50 mM NaCl을 함유하는 인산 나트륨 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 용출시켰다. 미결합 단백질은 방출 완충액(release buffer)으로 평형화된 충전된 Q-세파로스 컬럼 (GE 헬스 케어)으로부터 수득 하였다. 단백질 용출액을 30 kDa vivaspin20 (Sartorius)으로 농축하고 PBS로 투석 하였다.
실시예 2
상처 치유에 대한 항 c-Met 아고니스트 항체의 효과
동물에서 1E4 항체의 상처 치유 촉진효과를 실험하였다. 무균 상태에서 마우스 (Balb/C, 8주령 자성)를 마취시켰다. 등의 털을 제거한 후, 6 mm 생검 펀치 (Integra Miltex, cat # 11L48)를 사용하여 마우스의 등쪽 피부의 양쪽에 6 mm 원형 상처를 만들었다. 상처의 원래 형태를 보존하고 시험 물질의 상처 치유 효과를 보다 정확하게 측정하기 위해, 창상 부목(내경 7 mm, Grace Bio-Labs, Cat # 1213138)으로 상처 부위를 접착 및 밀봉하였다(Galiano et al., Wound Repair Regen Jul-Aug, 12(4):485-92, 2004; Li et al., J Diabetes Res 2015:512959, 2015). 마이크로파이펫을 사용하여 PBS (대조군) 또는 1E4 20 μl를 상처 부위에 각기 다른 용량 (상처 당 1일 3 μg, 6 μg, 또는 12 μg)으로 골고루 도포하였다. 상처 부위를 보호하기 위해 상처 부위를 TegaDerm (3M, Cat # 2016-07PK)로 덮었다. PBS 또는 1E4를 14 일 동안 매일 투여하였다. 상처 봉합의 경과를 분석하기 위해 2 - 3 일마다 이미지를 촬영하였다.
도 1a는 치료 전 및 치료 중 상처의 사진이다. 상처의 봉합 정도의 측정은 도 1b에 그래프로 나타내었다. 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 항체의 모든 투여군에서 항 c-Met 항체는 PBS 투여군보다 적어도 20 % 이상의 상처 면적을 감소시켰다. 따라서, 항 c-Met 항체는 창상 치유를 향상시키는데 효과적이다.
실시예 3
항 c-Met 아고니스트 항체의 신경보호효과
많은 연구에서 알 수 있듯이, 항암치료제 아드리아마이신 (adriamycin, ADR)은 신장 독성이 있고, 마우스에 투여했을 때 신장 내 손상으로 인해 혈중 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌 모두가 증가하는 것으로 보고되었다(Rossmann et al. J Pathol. 169 (1):99-108, 1993; Wang et al.; Kidney Int. 58(4):1797-1804, 2000; Okuda et al Kidney Int 29, 502-510, 1986.). 화학요법에 의해 발생하는 손상으로부터 신장을 보호하는 아고니스트 항 c-Met 항체의 능력을 실험하였다.
1E4 항체의 투여에 앞서, BALB/c 마우스 (6 주, 웅성)는 1 주간의 순응 기간을 거쳤다. 그 후, PBS (대조군) 또는 1E4 (2 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg)를 꼬리 정맥 주사(-1 일)를 통해 투여하였다. 다음날 (0 일), 15 mg/kg ADR를 꼬리 주입하여, 모든 동물에서 신장 손상을 유도하였다. ADR 주사 후 2 일 및 5 일째에(각각 2 일 및 5 일), PBS 또는 1E4를 마우스에 각각 정맥 내 투여하였다. ADR 주사 후 7 일째, 모든 동물을 희생시키고, 혈액 중의 BUN 및 크레아티닌 수준을 평가하기 위해 혈액 샘플을 수집하였다. 다음으로 마우스 복부를 개복하여 신장을 절제하고 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 광학 현미경을 사용하여 일반적인 조직검사를 위해 각 신장에서 여러 슬라이드를 준비하고 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다.
ADR-유도된 신장 손상의 동물 모델에서 1E4 항체 5mg/kg 또는 그 이상의 양을 투여한 경우, 증가된 BUN (도 2a) 및 크레아티닌 (도 2b)을 효과적으로 감소시켰다. 또한, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여군에서 1E4 투여가 신장에서 조직 손상을 유의하게 개선시키는 것으로 관찰되었다. 비투여군(naive), PBS 투여군 및 10 mg/kg 1E4 항체 투여군의 조직에 대한, H&E-염색된 신장 조직절편의 이미지를 표시하였다(도 3a). 조직학 분석은 도 3에 나타낸 바와 같이 영상화된 조직에 점수를 부여하는 것을 포함한다. 1 점은 손상 부위가 전체 신장 조직의 10 % 이하임을 의미한다. 2 점은 손상 부위가 전체 신장 조직의 10-40 % 사이임을 의미한다. 3 점은 손상 부위가 전체 신장 조직의 40-70 % 사이임을 의미한다. 4 점은 손상 부위가 전체 신장 조직의 70 % 이상임을 의미한다. 별표는 PBS (항체 투여하지 않음)투여한 경우와 비교하여 p> 0.05에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다. 5 ㎎/㎏의 1E4 항체를 투여 한 군의 조직에 대한 이미지는 나타내지 않았지만, 이들 동물의 조직학적 분석은 5 ㎎/㎏의 1E4 항체를 투여한 군의 조직이 p < 0.05의 유의적인 차이를 나타내는 2.44의 점수를 나타냈으며, 이는 5 mg/kg과 10 mg/kg의 1E4가 모두 ADR 유발성 신장 손상을 감소시키는데 효과적임을 나타낸다.
실시예 4
항 c-Met 아고니스트 항체의 항-섬유화 효과
일측성 요관 폐쇄 (Unilateral ureteral obstruction, UUO)는 신장 섬유증으로 잘 알려져 있으며, 만성 신장 질환의 병리학적 특징을 나타낸다(Klahr et al., Am Physiological Soc, Vol.283, No.5, F861-F875, 2002; Klahr et. al Nephrology Forum, Kidney Int 54: 286-300, 1998). 따라서, 이 동물 모델을 사용하여 신장의 섬유성 병변에 아고니스트 효과를 나타내는 항 c-Met 항체의 효과를 연구하였다.
UUO 수술 하루 전, 10 mg/kg의 1E4를 BALB/c 마우스 꼬리에 정맥 내 주사하였다. 다음 날, UUO 수술을 무균 상태에서 수행하였다. 복부 가운데를 절개하고 왼쪽 요관(ureter)를 두 지점에서 결찰하였다(ligated). 그 후, 두 개의 연결 지점 사이의 근위 부분을 절제하였다. 절제 후 복부를 닫았다. 그 후 매주 1E4를 꼬리 정맥 투여하였다. 수술 3 주 후 왼쪽 신장을 적출하여 4 % 포름 알데히드로 고정시켰다. 다음으로, Masson trichrome 염색 및 신장 절편 이미징으로 조직 샘플의 섬유성 병변 면적을 평가하였다.
Masson의 삼색 염색의 이미지를 도 4a에 나타내었고. 도 4a에 대응하는 정량 분석결과를 도 4b에 도시하였다. 도 4a 및 도 4b 에 도시된 바와 같이, 1E4의 투여는 신장 섬유증으로부터 신장을 보호하는데 효과적인 치료효과를 나타내었다.
실시예 5
항 c-Met 아고니스트 항체를 이용한 뇌졸중 치료
중간 대뇌 동맥 폐색 모델 (middle cerebral artery occlusion model, MCAO)은 뇌졸중 연구 분야에서 널리 이용되는 모델이다. 이 모델은 허혈성 뇌졸중의 근본적인 기전과 질병을 치료하기 위한 시험물질 또는 약물의 치료 효과를 조사하기위한 훌륭한 도구로 사용된다(Badr et al., Am Physiological Soc, Vol.280 no.3 : R766-R770, 2001; Zhao et al., Blood, 114 (15) : 3329-3334, 2009). 허혈성 뇌졸중 또는 다른 허혈 관련 질환으로 인한 조직 손상을 최소화하기 위한, 항 c-Met 아고니스트 항체 1E4의 효과를 시험하였다.
실험은 Wistar 래트(7 주령)에서 수행하였다. MCAO의 유도 전날에 10 mg/kg 1E4를 꼬리 정맥을 통해 래트에 투여하였다. 다음날, 동물을 마취시키고 경복부(ventral neck) 부위의 털을 제거하였다. 제모 후 각 래트를 앙와위(supine position)로 두었다. 오른쪽 쇄골 위로 정중앙선 절개하였다. 우측 총경동맥 (common carotid artery, CCA)은 인접한 미주 신경에서 확인하여 분리하였다. 심장에서 상행(ascending) CCA의 원위부 가지를 느슨하게 2-0 실크로 묶었다. 일반적으로 총 경동맥은 외경동맥 (external carotid artery, ECA)과 내경동맥 (internal carotid artery, ICA)의 두 가지로 나뉜다. ECA는 실크를 사용하여 두 지점에서 단단히 결찰되었고, ICA는 느슨하게 매듭지었다. 이어서 ECA는 매듭 사이를 절단하였다. 실리콘으로 앞부분이 코팅된 4-0 나일론 프로브를 절단된 혈관 내로 30 분간 삽입하였다. 프로브를 제거한 후 삽입 부위를 완전히 봉합하였다. MCAO 유도 1 시간 후, 1E4 10 mg/kg을 주입 펌프를 사용하여 정맥 내 주사하였다. MCAO 유도 3 일 후에 동일한 용량의 1E4를 다시 정맥 내 투여하였다. 그 후 동일한 용량의 1E4를 10 일, 17 일 및 24 일째에 7 일 간격으로 주입하였다. 수술 후 3 일, 7 일, 14 일, 21 일 및 28 일째 째에 MRI (MAGNETOM ESSENZA 1.5 Tesla, SIEMENS Co., Germany)를 사용하여 경색의 범위를 정량화하였다.
MRI에 의해 측정된 효과는 미처치(untreated)되거나, PBS 또는 1E4로 처치 된 동물에서 경색 크기의 측정치로서 나타난다 (도 5). 이 데이터는 1E4가 MCAO 모델에서 허혈로 인한 뇌 손상을 효과적으로 감소시킨다는 것을 보여준다.
실시예 6
항 c-Met 아고니스트 항체를 이용한 신생혈관 망막 질환의 치료
레이저-유도된 맥락막 신생 혈관 (choroidal neovascularization, CNV) 모델은 망막에서의 병원성 혈관 신생에 대한 약물의 치료 효과를 조사할 수 있는 우수한 플랫폼을 제공한다. (Marano et al. Gene Therapy, 12, 1544-1550, 2005; Zhan et al. Arch Ophthalmol, Oct; 127 (10): 1329-35, 2009). CNV 모델은 망막 혈관 신생에 대한 항 c-Met 아고니스트 항체의 효과를 연구하는데 사용되었다.
Mydriacyl Eye Drops 1 %를 국소 도포하여 유두 확장술(papillary dilation)을 한 후, 친칠라 토끼(웅성, 2-2.5kg, 유색)를 마취시켰다. 레이저 시스템 (Elite, Lumenis, USA)을 사용하여 눈에 광응고(photocoagulation) (532 nm 파장, 150 mW 출력, 0.1 초 지속 시간)를 유도하였다. 결과적으로 시신경 주변의 6시 위치에 총 6 개의 광응고 점이 생성되었다. CNV 유도 당일에 1E4 50 μg을 유리체액(vitreous humor)에 직접 투여하였다. 0 일, 3 일, 7 일, 10 일 및 14 일에 토끼의 오른쪽 눈에 1 %의 Mydriacyl Eye Drops를 점안한 후 마취하였다. 꼬리 정맥 주사를 통해 2 % 플루오레세인 소듐염 용액 1 ml를 투여하였다. 안저(fundus) 검사는 안구 검안경 (TRC-50IX, TOPCON, Japan)을 사용하여 시각화하였고, 투여 후 2 분 이내에 영상을 촬영 하였다. 약물의 CNV 형성 및 효능은 안저 촬영에서 형광을 확산시키는 정도를 측정함으로써 결정되었다. 안저 이미지는 ImageJ 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 영역 내 형광 강도를 정량화하여 CNV로 평가 하였다. 모든 이미지에서 정상 혈관이나 혈관이 없는 영역의 형광 강도는 동일한 값으로 변환되었다. 최종 CNV 값의 변환은 각 값을 naive 대조군의 값과 비교함으로써 얻었다.
데이터 분석결과는 도 6에 나타내었다. 도 6은 1E4 항체가 레이저-유도된 CNV 형성에 억제 효과가 있음을 보여준다.
실시예 7
항 c-Met 아고니스트 항체를 이용한 신경 질환의 치료
슈반 세포(Schwann cells)는 신경 발달, 전도 (수초 형성을 통한) 및 재생과 같은 신경계의 다양한 측면에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 병리학적 조건 하에서, 슈반 세포는 손상된 신경을 재미엘린화(re-myelinate) 시키기 위해 이동한다 (Whalley Katherine, 2014, Nat Rev Neurosci., 15 (11) : 698-99, 2014; Jessen KR et al., 2015, Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (7): a020487, 2015). 슈반 세포 이동에 대한 항-c-Met 항체 1E4의 영향을 조사하기 위해, 10 % 소태아 혈청(FBS), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 HEPES 을 첨가한 Dulbecco's modified eagle's medium 을 함유하는 완전 배지에서 래트 슈반 세포(Rat Schwann cells, iSC)를 배양하였다. 이동 분석을 위해, Transwell (Corning, 3422) 삽입물을 세포배양기 (37℃ 및 5% CO2)에서 45분 동안 0.1% 젤라틴(Sigma, G1393)으로 코팅하였다. 래트 슈반 세포를 0.25 % 트립신-EDTA으로 처리 후, Transwell 시스템의 상부 구획에 100 μl의 완전 배지로 세포를 분주하였다. 하부챔버는 2 % FBS가 함유된 600 μl의 완전 성장 배지로 채워졌다. Transwell 시스템을 37℃, 5 % CO2에서 50분 동안 배양하여 세포가 진정되도록 하였다. 결과적으로 하부챔버의 성장 배지에는 다음과 같이 50 ng/ml 재조합 인간 HGF (R&D systems, 294-HGF-025/CF) 또는 다양한 농도의 1E4 가 보충되었다: 900 ng/ml, 450 ng/ml, 90 ng/ml 및 18 ng/ml.
Transwell 필터를 통한 세포 이동을 4 시간 동안 진행시켰다. Transwell 삽입물(inserts)에 있는 세포를 4 % 포름알데히드로 하루동안 4℃에서 고정시켰다. 고정 후, 세포를 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 필터 상단의 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하였다. Olympus 현미경을 사용하여 5 개의 이미지를 촬영하고, 필터를 이동한 세포의 수를 계산하고 평균을 구하였다.
도 7a 및 도 7b에 도시 된 바와 같이, 모든 농도에서 1E4는 PBS (1E4를 투여하지 않음)로 처리된 세포와 비교하여 슈반 세포의 이동을 현저히 증가시켰다.
실시예 8
항 c-Met 아고니스트 항체를 이용한 근위축성 측삭 경화증의 치료
인간 돌연변이 SOD1을 발현하는 B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 마우스는 ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) 및 다른 신경 근육 장애 치료제의 치료 효능을 평가하기 위한 형질전환 동물모델이다 (Ji-Seon Seo et al., Exp Neurobiol., Dec; 24 (4) : 341-350, 2015; Gurney ME et al., Science., 264 : 1772-1775, 1994) 및 다른 신경 근육 장애. 따라서, 이 모델 동물에서 ALS 증상의 발병에 대한 1E4 항체 투여의 효과를 시험하였다. Rotarod의 행동 평가방법을 기준으로, 마우스를 그룹별로 나누었다.
그룹 분류 후, 마우스 당 20 μg의 1E4를 척추강내(intra-thecally) 투여하였다. 일주일 후, 각 마우스에 1E4 10 mg/kg을 복강내 투여하였다. 이러한 1E4의 척추강 내 및 복강내 교차 투여(alternate treatment)는 2 주 동안 계속되었다. 2 주 후, 1E4 10 mg/kg을 실험 종료시까지 마우스에게 복막(peritoneally) 투여하였다. Rotarod와 그립 강도 테스트로 일주일에 한 번 운동 기능을 측정하였으며, 일주일에 세 번씩 생존율을 모니터링하였다.
4 주 후, ALS-관련 증상의 발현이 나타날 것으로 예상되는 시기에, 마우스는 PBS만 처리한 경우와 비교하여, 1E4 투여 (도 8A 및 8B)에 반응하여 개선된 운동 기능을 나타내기 시작하였다. 또한, 1E4 처리는 마우스의 생존을 증가시켰다 (도 8d).
다수의 예시적인 양태 및 실시예들이 상술되었으며, 당업자는 이들의 특정 수정, 치환, 부가 및 서브 조합을 인식할 수 있을 것이다. 그러므로, 이하의 특허청구범위는 이들의 기술적 사상 및 범위 내에 있는 그러한 모든 수정, 치환, 부가 및 서브 조합을 포함하는 것으로 해석된다.
<110> Viromed Co., Ltd. <120> ANTI-c-MET ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> PI180005KR <150> US 62/291,988 <151> 2016-02-05 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCVR <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCVR <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 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caatttctat 180 ggaccgtcgt tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca gctccagcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagatggc 300 aactactatg atagtcgcgg ttattactac gatacttttg atatgtgggg ccaagggaca 360 ctggtcaccg tctcctca 378 <210> 12 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCV <400> 12 tccgacatcc agatgaccca gtctccatcc ttcctctctg catctgtcgg agacagagtc 60 accatcactt gccgggccag tcagggcatc agtacttatt tagcctggta tcaacaaaaa 120 ccagggacag cccctaaact cctgatctat tctgcatcca ctttggaaag tggggtccca 180 tcgcgattca gcggaagtgg atccgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatt ctgcaactta ctattgtcaa caggctgaca gtttcccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacgtgga ggagccagcc tcgtggaa 348 <210> 13 <211> 1390 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys 20 25 30 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr 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Leu Trp Met Arg Lys Arg Lys His Lys 945 950 955 960 Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro 965 970 975 His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu 980 985 990 Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp 995 1000 1005 Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ala Cys Arg Gln Val Gln Tyr 1010 1015 1020 Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu 1045 1050 1055 Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser 1060 1065 1070 Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly 1075 1080 1085 Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His 1090 1095 1100 Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Glu Glu Val Ser 1105 1110 1115 1120 Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn 1125 1130 1135 Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu 1140 1145 1150 Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg 1155 1160 1165 Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu 1170 1175 1180 Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His 1185 1190 1195 1200 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val 1205 1210 1215 Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr 1220 1225 1230 Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met 1235 1240 1245 Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val 1250 1255 1260 Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro 1265 1270 1275 1280 Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Ile Tyr Leu Leu Gln 1285 1290 1295 Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Ala Leu Tyr Glu 1300 1305 1310 Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe 1315 1320 1325 Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ser Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly 1330 1335 1340 Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val 1345 1350 1355 1360 Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Pro Ser Gln Asp Asn Ile Asp Gly Glu 1365 1370 1375 Gly Asn Thr

Claims (29)

  1. 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 치료방법으로서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3 을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3 을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체는 허혈성 장애의 위험성이 있거나 허혈성 장애를 가진 것인, 치료방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 허혈성 장애는 뇌 조직 허혈, 심장 조직 허혈, 신장조직 허혈 및 장 조직의 허혈로 구성된 군에서 선택되는 것인, 치료방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체는 뇌졸중의 위험성이 있거나 뇌졸중을 경험한 자인 것인, 치료방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 뇌졸중은 색전성 뇌졸중(embolic stroke) 또는 혈전성 뇌졸중(thrombotic stroke)인 것인, 치료방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체는 신장 손상 또는 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 신장 손상 또는 신장 질환으로 진단받은 자인 것인, 치료방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 신장 손상 또는 신장 질환은 섬유성 상태(fibrotic condition)인 것인, 치료방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 신장 손상 또는 신장 질환은 신장 섬유증(renal fibrosis), 만성 신장 섬유증(chronic kidney fibrosis), 당뇨병과 관련된 만성 신병증(chronic nephropathy associated with diabetes), 루푸스(lupus), 신장 경피증(scleroderma of the kidney), 사구체 신염(glomerular nephritis), 국소 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerular sclerosis), 인간 만성 신장질환 관련 IgA 신병증성 섬유증 (IgA nephropathyrenal fibrosis associated with human chronic kidney disease, CKD), 만성 진행성 신병증 (chronic progressive nephropathy, CPN), 세뇨관간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis), 요관 폐쇄(ureteral obstruction), 만성요독증(chronic uremia), 만성 간질 신장염(chronic interstitial nephritis), 방사선 신병증(radiation nephropathy), 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 진행성 사구체신증(progressive glomerulonephrosis, PGN), 내피/혈전성 미세혈관병증 손상(endothelial/thrombotic microangiopathy injury), HIV - 연관 신증(HIV-associated nephropathy), 및 독소, 자극제(irritant) 및 화학 요법제에 대한 노출과 관련된 섬유증으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 치료방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체는 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder)의 위험이 있거나, 또는 망막 신생혈관 형성 장애로 진단된 자인 것인, 치료방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 망막 신생혈관 형성 장애는 황반변성(macular degeneration), 히스토플라즈마증(histoplasmosis), 병리적 근시(pathological myopia), 망막색소선조(angioid streaks), 전방허혈성시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy), 세균성 심내막염(bacterial endocarditis), 베스트병(Best's disease), 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 혈관종(choroidal hemangioma), 맥락막 모반(choroidal nevi), 맥락막 비관류(choroidal nonperfusion), 맥락막 골종(choroidal osteomas), 맥락막 파열(choroidal rupture), 맥락막 결손(choroideremia), 만성 망막 박리(chronic retinal detachment), 망막 결손 (coloboma of the retina), 드루젠(Drusen), 내인성 칸디다 내안구염(endogenous Candida endophthalmitis), 망막 색소상피의 외유두상 과오종(extrapapillary hamartomas of the retinal pigmented epithelium), 황반안저(fundus flavimaculatus), 특발성 황반원공(idiopathic, macular hole), 악성 흑색종(malignant melanoma), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis, type II), 금속성 안구내 이물(metallic intraocular foreign body), 모닝글로리 디스크 신드롬(morning glory disc syndrome), 다발성 소실성 백반증후군(multiple evanescent white-dot syndrome, MEWDS), 거상연 신혈관형성(neovascularization at ora serrata), 수술현미경 화상(operating microscope burn), 시신경 헤드 피츠(optic nerve head pits), 광응고(photocoagulation), 내 맥락막증(punctuate inner choroidopathy), 풍진(rubella), 유육종증(sarcoidosis), 사행성 또는 지도 맥락막염(serpiginous or geographic choroiditis), 망막하액배출(subretinal fluid drainage), 기울어진 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 탁소플라즈마 망막맥락막염(Taxoplasma retinochoroiditis), 결핵(tuberculosis), 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome), 당뇨성망막병증(diabetic retinopathy), 비-당뇨성망막병증(non-diabetic retinopathy), 분지정맥 폐쇄(branch vein occlusion), 중심성 망막정맥 폐쇄(central retinal vein occlusion), 미숙신생아 망막증(retinopathy in premature infants), 홍채신생혈관(rubeosis iridis), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 중심와부근 모세관확장증(perifoveal telangiectasis), 겸상세포망막증(sickle cell retinopathy), 이일즈병(Eale's disease), 망막혈관염(retinal vasculitis), 본 히펠 린도우병(Von Hippel Linau disease), 방사선 망막증(radiation retinopathy), 망막동결손상(retinal cryoinjury), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 망맥락막결손(retinochoroidal coloboma), 단순포진각막염에 의한 각막혈관신행(corneal neovascularization due to herpes simplex keratitis), 각막궤양(corneal ulcers), 각막이식(keratoplasty), 익상편(pterigyia), 및 트라우마(trauma)로 구성된 군에서 선택되는 원인에 의한 것인, 치료방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder)는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)인 것인, 치료방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체(subject)는 신경장애(neurological disorder)또는 신경질환(neurological disease)으로 진단받은 자인 것인, 치료방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 신경장애 또는 신경질환은, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 뇌동맥류(cerebral aneurism), 척수손상(spinal cord injury), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 만성대뇌피질위축증(diffuse cerebral cortical atrophy), 루이소체 치매(Lewy-body dementia), 픽병(Pick disease), 메조림보코르티콜 치매(mesolimbocortical dementia), 시상퇴행(thalamic degeneration), 헌팅턴무도병(Huntington chorea), 피질-선조체-척추 퇴행(cortical-striatal-spinal degeneration), 피질-기저 신경절 퇴행(cortical-basal ganglionic degeneration), 뇌소뇌퇴행(cerebrocerebellar degeneration), 경련성 하반신마비를 동반하는 가족성 치매(familial dementia with spastic paraparesis), 폴리글로코산체병(polyglucosan body disease), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 올리브교소뇌위축증(olivopontocerebellar atrophy), 진행성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy), 변형성근실조증(dystonia musculorum deformans), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 메이지증후군(Meige syndrome), 가족성떨림(familial tremors), 질레 드 라 투렛증후군(Gilles de la Tourette syndrome), 유극적혈구무도증(acanthocytic chorea), 프레드릭실조증(Friedreich ataxia), 홈스 가족성 피질소뇌위축증(Holmes familial cortical cerebellar atrophy), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 진행성 척수성 근육 위축증(progressive spinal muscular atrophy), 진행성연수마비(progressive balbar palsy), 일차성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 유전성 근위축증(hereditary muscular atrophy), 강직성 하반신마비(spastic paraplegia), 비골근위축증(peroneal muscular atrophy), 비대성 간질 다발신경병증(hypertrophic interstitial polyneuropathy), 유전성 다발신경염성 실조증(heredopathia atactica polyneuritiformis), 시신경병증(optic neuropathy), 안근마비(ophthalmoplegia), 및 망막 또는 시신경 손상(retina or optic nerve damage)으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 치료방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체(subject)는 상처치유(wound healing)를 필요로 하거나 또는 상처치유를 필요로 할 자인 것인, 치료방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 상처(wound)는 기계적, 화학적, 세균성 또는 열에 의한 상처인 것인, 치료방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 상처는 절개(incision), 열상(laceration), 찰과상(abrasion), 자창(puncture wound), 관통상(penetration wound) 및 총상(gunshot wound)으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 치료방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상처는 피부 상처인 것인, 치료방법.
  18. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 서열을 포함하는 것인, 치료방법.
  19. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편(fragment)인 것인, 치료방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 인간화 항체(humanized antibody)인 것인, 치료방법.
  21. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 scFv를 포함하는 것인, 치료방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 scFv 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1의 서열을 포함하고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 서열을 포함하는 것인, 치료방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것인, 치료방법.
  24. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 척추강내(intrathecal) 투여, 비경구(parenteral) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transdermal) 투여 또는 주입(infusion)에 의한 투여인 것인, 치료방법.
  25. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체(subject)는 암이 아닌 것인, 치료방법.
  26. 허혈성 장애, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 조성물은 유효성분으로서 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)에 결합하는 항체 또는 이의 단편(fragment), 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
    상기 항체는:
    서열번호 5의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
    서열 번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1을 포함하고, 경쇄가변도메인은 서열번호 2를 포함하는 것인, 조성물.
  28. 허혈성 장애, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 조성물은 유효성분으로서 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)에 결합하는 scFv, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
    상기 scFv 는:
    서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
    서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 scFv 는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
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