KR102353568B1 - 안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 - Google Patents

안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 상기 안정성이 개선된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모항체인 1E4와 비교하여, 생산성과 생물학적 활성이 우수하면서도 안정성은 개선되고 면역원성은 감소되었다. 따라서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항 c-Met 항체 개발에 있어서 생산비용 절감, 효능 감소 억제 및 부작용 감소 등의 우수한 특성을 나타낸다.

Description

안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편{Anti c-Met Antibody or Antigen binding fragment thereof with Improved Stability}
본 발명은 안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포 표면에서 발현되는 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)는 Met 원발암유전자(proto-oncogene)에 의해 코딩되는 수용체 티로신 키나아제이다. 구조적으로 c-Met는 세포외 알파 서브유닛(extracellular alpha subunit, 50 kDa)과 막관통 베타 서브유닛(transmembrane beta subunit, 140 kDa)으로 구성된 디설파이드-결합된 이합체이다. c-Met는 리간드 결합을 위한 세포외 도메인, 막관통 부분, 및 세포내 도메인 내의 티로신 잔기의 인산화에 관여하는 티로신 키나아제 촉매 모티프를 포함한다(Dean et al., Nature, 4: 318 (6044): 385, 1985; Park et al., PNAS, 84 (18): 6379, 1976; Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173:183, 1997).
c-Met가 리간드인 HGF (hepatocyte growth factor)에 결합하면, c-Met의 세포질 티로신 잔기가 이량화되고 자가인산화되며(autophosphorylate), 이어 하위 신호전달 경로를 매개하는 다양한 단백질과 상호 작용한다. c-Met 활성화는 세포 성장, 분산(scattering) 및 운동성(motility), 침습(invasion), 세포사멸로부터의 보호, 분지형태 형성(branching morphogenesis) 및 신생혈관 형성(angiogenesis)의 증가를 유도하는 다양한 생물학적 반응을 초래한다. 병리학적 조건 하에서 c-Met의 부적절한 활성화는 암세포에 증식, 생존 및 침습/전이 능력을 부여할 수 있다. c-Met 활성에 의해 영향을 받는 다양한 생물학적, 생리학적 기능을 고려할 때, c-Met 단백질은 다용도의 치료 표적이 되었다.
본 발명자들은 c-Met 단백질에 결합하여 이를 활성화시키고 다양한 장애 또는 질병에서 예방적 및/또는 치료학적으로 유효한 c-Met 면역 글로불린(WO2016/021864A1; WO2017/135791A1)을 개발한 바 있다. 그러나, 본 발명자들이 기 개발한 IgG1 기반 항 c-Met 항체인 1E4 (WO2016/021864A1; WO2017/135791A1)는 c-Met에 대한 높은 친화력(affinity)을 가짐에도 불구하고, 생산 과정에서 구조적 불안정성을 보인다. 이에 본 발명자들은 기존 항체의 친화력 및 생물학적 활성(biopotency)을 유지하면서도 구조적 안정성을 가진 항체를 개발하기 위해 예의 노력하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌(WO2016/021864A1; WO2017/135791A1)의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Perry, L.C.A., Jones, T.D. & Baker, M.P., 2008. New approaches to prediction of immune responses to therapeutic proteins during preclinical development. Drugs in R&D, 9(6), pp.385-96 Bryson, C.J., Jones, T.D. & Baker, M.P., 2010. Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computation tools. BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy, 24(1), pp.1-8
본 발명자들은 기 개발한 항 c-Met 항체 1E4의 친화력 및 생물학적 활성(biopotency)을 유지하면서도 구조적 안정성이 향상된 항체를 개발하기 위해 예의 노력하였다. 항체의 구조적 안정성은 의약의 상업적 개발 과정에서 중요한 고려 요소이다. 항체의 구조적 안정성이 우수하지 않으면 품질 관리가 불리해지고 효능이 감소되며 부작용이 증가하는 문제점이 있다. 본 발명자들은 기존 항 c-Met 항체 1E4의 c-Met에 대한 친화력을 유지하기 위하여 상보성결정부위(complementarity determining regions, CDRs)를 보다 안정적인 프레임워크 영역에 이식하는 CDR 그래프팅(CDR grafting)을 수행하였다. 그 결과 기존보다 항체의 구조적 안정성이 향상된 항체 또는 항원 결합 단편의 서열을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 개선된 안정성을 나타내는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 개선된 안정성을 나타내는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 기 개발된 항 c-Met 항체인 1E4 (WO2016/021864A1; WO2017/135791A1 참조)의 구조적 안정성을 개선하고자 노력하였다. 본 발명자들은 1E4 항체의 CDR 그래프팅을 통하여 항원에 대한 높은 친화력, 낮은 면역원성, 높은 안정성 및 생물학적 활성을 나타내는 1E4 항체의 변이체를 제작하였다.
본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 c-Met에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG1 형태이다.
본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL(Vk) 및 불변 영역 도메인 CL(Ck)을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나, 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종(species)의 c-Met 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 발명자들은 기존 특허 WO2016/021864A1 및 WO2017/135791A1에서 개시한 IgG1 기반 항 c-Met 항체인 1E4 에 있어서, 항 c-Met 항체의 특성을 보존하면서 구조적 안정성을 향상시키기 위해 기존 항체의 상보성결정부위 (complementarity determining regions, CDRs)를 기존 항체의 프레임워크 영역(framework region)보다 안정적인 프레임워크 영역(framework region)에 이식하는 CDR 그래프팅(CDR grafting) 방법을 이용하였다.
"CDR 그래프팅"이란 마우스 단일클론 항체를 인간 환자에게 사용시 면역반응이 유발되어 중화(neutralization)되어 버리는 문제점을 해결하기 위하여 개발된 방법으로 비-인간 항체(non-human antibody)를 인간화(humanization)하는 가장 대표적인 방법이다. CDR 그래프팅은 동물 항체의 CDR 부위를 인간 항체의 프레임워크(framework)로 이식하는 것이다.
본 발명자들은 최적의 프레임워크 영역을 선별하기 위해, 상기 CDR 그래프팅 방법을 응용하였다. 그 결과, 인간 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 부위의 아미노산 서열을 항 c-Met 항체 1E4의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(Vk)과의 서열 상동성 (sequence homology)을 확인하고, 그 중에서 높은 서열 상동성을 가지는 후보 서열을 스크리닝하고, 이로부터 본 발명의 안정성이 개선된 항 c-Met 항체 또는 항원 결합단편의 변이체를 제작하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4의 구성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인; 및
(b) FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 구성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인:
상기 CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain), CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain), CDRL2, 및 CDRL3는 서열번호 4, 5, 6의 아미노산 서열로 이루어짐.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (a)의 중쇄 가변영역 도메인에서 FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)은 하기 i)의 아미노산 서열로 이루어진, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편이다:
i) X1VQLVQSGAEVKKPGX16SX18X19X20SCX23X24SGX27X28FX30
상기 서열에서 서로 독립적으로,
X1은 Q 또는 E이고;
X16은 E 또는 S이며;
X18은 L 또는 V이고;
X19는 R 또는 K이며;
X20은 I 또는 V이고;
X23은 Q 또는 K이며;
X24는 G 또는 A이고;
X27은 Y 이며;
X28은 S 이고; 및
X30은 P임.
본 명세서에서 사용된 "Xn" 및 "Xm"은 상기 정의된 서열 i) 내지 viii)에서 위치 n 및 m의 아미노산을 표시하기 위해 사용한 것이며, 여기에서 n 및 m은 상기 서열의 N-말단으로부터 계산되는 상기 서열 내의 아미노산 위치를 표시 하는 정수이다. 예를 들어, X3 및 X7은 서열의 N-말단으로부터 각각 3번째 및 7번째 위치의 아미노산을 표시한다.
본 발명의 일 양태에 따르는 구현예의 경우, 서열 i) 내의 Xn이 각각 정의된 치환가능한 아미노산 잔기들의 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 통상의 기술자라면, Xn이 치환가능한 잔기로서 나열된 아미노산 잔기들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다는 것과, 이러한 선택이 Xm의 아미노산의 선택과는 독립적으로 이루어지며, 여기서 n과 m은 다르다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 Xn 위치에서의 나열된 가능한 잔기들 중 어떤 것이라도 다른 다양한 위치에서의 나열된 가능한 잔기들 중 다른 것과 독립적으로 조합될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 i)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X1은 Q이고; X16은 E 이며; X18은 L이고; X19는 R이며; X20은 I이고; X23은 Q이며; X24는 G이고; X27은 Y이며; X28은 S이고; 및 X30은 P 임.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 i)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X1은 E이고, X19은 K이며, X23은 K이고, 및 X30은 P임;
- X16은 S이고, X18은 V이고, X19는 K이며, X20은 V임; 또는
- X16은 S이고, X18은 V이고, X19는 K이며, X20은 V이고, X23은 K이며, X24는 A임.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (a)의 중쇄 가변영역 도메인에서 FRH2(Framework region 2 of Heavy chain)는 하기 ii)의 아미노산 서열로 이루어진다:
ii) WVRQX40PGX43GLEWMG
상기 서열에서 서로 독립적으로,
X40은 M 또는 A이고; 및
X43은 K 또는 Q임.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 ii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X40은 M 이고; 및 X43은 K 임.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 ii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X40은 A이고, X43은 Q임.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (a)의 중쇄 가변영역 도메인에서 FRH3(Framework region 3 of Heavy chain)는 하기 iii)의 아미노산 서열로 이루어진다:
iii) X67VTIX71ADX74SX76STAYX81X82X83SSLX87X88X89DTAX93YYCAR
상기 서열에서 서로 독립적으로,
X67은 H, Q, 또는 R이고;
X71은 S 또는 T이며;
X74은 S 또는 K이고;
X76는 S, I, 또는 T이며;
X81은 L 또는 M이고;
X82은 Q 또는 E이며;
X83는 W 또는 L이고;
X87은 K 또는 R이며;
X88는, A 또는 S이고;
X89는, S 또는 E이며; 및
X93는 M 또는 V임.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 iii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X67은 H 이고; X71은 S 이며; X74은 S 이고; X76는 S 이며; X81은 L 이고; X82은 Q 이며; X83는 W 이고; X87은 K 이며; X88는, A 이고; X89는, S 이며; 및 X93는 M임.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 iii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X67은 Q이고, X74은 K이며, X76는 I임;
- X67은 R이고, X71은 T이며, X76는 T임;
- X67은 R이고, X71은 T이며, X76는 T이고, X81은 M이고, X82은 E이며, X83는 L이고, X87은 R이고, X88는 S이고, X89는 E임;
- X67은 R이고, X71은 T이며, X76는 T이고, X81은 M이고, X82은 E이며, X83는 L이고, X87은 R이고, X88는 S이고, X89는 E이며, X93는 V임; 또는
- X67은 R이고, X71은 T이며, X74은 K이고, X76는 T이며, X81은 M이고, X82은 E이며, X83는 L이고, X87은 R이고, X88는 S이고, X89는 E이며, X93는 V임.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (a)의 중쇄 가변영역 도메인에서 FRH4(Framework region 4 of Heavy chain)는 하기 iv)의 아미노산 서열로 이루어진다:
iv) WGQGTLVTVSS
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (b)의 경쇄 가변영역 도메인에서, 상기 (b)의 FRL1(Framework region 1 of Light chain)은 하기 v)의 아미노산 서열로 이루어진다:
v) X1IX3X4TQSPX9X10LSX13SX15GX17RX19TX21X22C
상기 서열에서 서로 독립적으로,
X1은 D 또는 E이고;
X3은 Q 또는 V이며;
X4는 M 또는 L이고;
X9는 S 또는 G이며;
X10은 F, S, 또는 T이며;
X13은 A 또는 L이고;
X15는 V 또는 P이며;
X17은 D 또는 E이고;
X19는 V 또는 A이며;
X21은 I 또는 L이고; 및
X22는 T 또는 S임.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 v)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X1은 D 이고; X3은 Q 이며; X4는 M 이고; X9는 S 이며; X10은 F 이며; X13은 A 이고; X15는 V 이며; X17은 D 이고; X19는 V 이며; X21은 I 이고; 및 X22는 T 임.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 v)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X10는 S임;
- X9는 G이고, X13은 L이며, X15는 P이고, X17는 E이며, X19는 A이고, X21은 L이며, X22는 S임;
- X1은 E이고, X9는 G이며, X10은 T이고, X13은 L이며, X15는 P이고, X17는 E이며, X19는 A이고, X21는 L이며, X22는 S임; 또는
- X1은 E이고, X3은 V이며, X4는 L이고, X9는 G이며, X10은 T이고, X13은 L이며, X15는 P이고, X17는 E이며, X19는 A이고, X21은 L이며, X22는 S임.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (b)의 경쇄 가변영역 도메인에서, 상기 (b)의 FRL2(Framework region 2 of Light chain)은 하기 vi)의 아미노산 서열로 이루어진다:
vi) WYQQKPGX42APX45LLIY
X42는 T, K, 또는 Q이고; 및
X45는 K 또는 R임.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 vi)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X42는 T 이고; 및 X45는 K임.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 vi)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X42는 K임; 또는
- X42는 Q이고, X45는 R임.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (b)의 경쇄 가변영역 도메인에서, FRL3(Framework region 3 of Light chain)은 하기 vii)의 아미노산 서열로 이루어진다:
vii) GX58PX60RFSGSGSGTDFTLTISX77LX79PEDX83ATYYC
X58는 V 또는 I이고;
X60은 S 또는 D이며;
X77은 S 또는 R이고;
X79는 Q 또는 E이며; 및
X83은 S 또는 F임.
본 발명의 특정 구현예에 있어서, 상기 vii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X58는 V 이고; X60은 S 이며; X77은 S 이고; X79는 Q 이며; 및 X83은 S임.
본 발명의 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 vii)의 서열은 다음으로부터 선택되는 특정 아미노산 잔기를 포함한다:
- X83는 F임;
- X60은 D이고, X77는 R이며, X79은 E이고, X83은 F임; 또는
- X58은 I이고, X60은 D이며, X77은 R이고, X79는 E이며, X83은 F임
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이루는 상기 (b)의 경쇄 가변영역 도메인에서, FRL4(Framework region 4 of Light chain)은 하기 viii)의 아미노산 서열로 이루어진다:
viii) FGGGTKVEIK
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
- 서열번호 11 내지 16, 및 34 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열; 및
- 서열번호 17 내지 21, 및 41 내지 45 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 서열번호 1의 CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain), 서열번호 2의 CDRH2, 및 서열번호 3의 CDRH3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인;
(b) 서열번호 7의 CH1(constant domain 1 of heavy chain)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변영역 도메인;
(c) 서열번호 4의 CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain), 서열번호 5의 CDRL2, 서열번호 6의 CDRL3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인; 및
(d) 서열번호 8의 Ck(Kappa-constant domain)를 포함하는 면역글로불린 경쇄 불변영역 도메인,
여기에서 상기 서열번호 7의 CH1의 97번째 아미노산 잔기 및 서열번호 8의 Ck의 2번째 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 각각 아르기닌(Arginine), 트레오닌(Threonine)으로 치환 변이된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 서열번호 7의 CH1의 97번째 아미노산 잔기는 아르기닌(Arginine)으로, 상기 서열번호 8의 Ck의 2번째 아미노산 잔기는 트레오닌(Threonine)으로 치환 변이된 것이다.
상기 서열번호 7의 CH1의 97번째 아미노산 잔기가 아르기닌(Arginine)으로 치환 변이된 것은 서열번호 9의 CH1과 같고, 상기 서열번호 8의 Ck의 2번째 아미노산 잔기는 트레오닌(Threonine)으로 치환 변이된 것은 서열번호 10의 Ck와 같다.
상기 아미노산 잔기의 치환 변이는 종래의 항 c-Met 항체 1E4의 불변 부위(constant region)를 인간 생식세포계열의 서열과 동일한 서열로 제작하기 위함이다. 종래의 항 c-Met 항체 1E4가 포함하는 불변 부위 서열인 서열번호 7의 CH1 및 서열번호 8의 Ck는 일반적인 human population에서는 발견되지 않는 서열을 포함하고 있었다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (a)의 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인은 서열번호 11 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 서열번호 11의 아미노산 서열은 종래의 항 c-Met 항체 1E4의 중쇄 가변영역(VH or VH0)이고, 서열번호 12의 아미노산 서열은 본 발명의 항 c-Met 항체의 CDR 그래프팅을 위해 스크리닝 한 인간 중쇄 가변영역의 후보서열인 IGHV5-51*01에서 파생한 후보서열(VH2)이고, 서열번호 13 내지 16의 아미노산 서열은 인간 중쇄 가변영역의 후보서열인 IGHV1-69*02에서 파생한 후보서열(VH3, VH4, VH5, VH6)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (a)의 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인은 서열번호 11, 및 14 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 구체적으로는 서열번호 14 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (c)의 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인은 서열번호 17 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 서열번호 17의 아미노산 서열은 종래의 항 c-Met 항체 1E4의 경쇄 가변영역(Vk or Vk0)이고, 서열번호 18의 아미노산 서열은 본 발명의 항 c-Met 항체의 CDR 그래프팅을 위해 스크리닝 한 인간 경쇄 가변영역의 후보서열인 IGKV1-39*01에서 파생한 후보서열(Vk2)이며, 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열은 인간 경쇄 가변영역의 후보서열인 IGKV3-20*01에서 파생한 후보서열(Vk3, Vk4, Vk5)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (c)의 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인은 서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (a)의 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인은 서열번호 14 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 (c)의 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인은 서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 (a)의 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 (c)의 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항 c-Met 항체는 바람직하게는완전한 항체 형태이다. 완전한 항체 형태는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역과, 카파 또는 람다 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함하며, 바람직하게는 감마1(γ1) 중쇄 불변영역과 카파(κ) 경쇄 불변영역를 포함하는 IgG1 형태이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 다르면, 본 발명의 항 c-Met 항체의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 또는 화학적으로 연결된 F(ab')2 이고 바람직하게는 scFv 형태이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 22 내지 32, 또는 46 내지 58의 염기서열, 그의 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신장 손상 또는 질환은 섬유성 상태(fibrotic condition)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신장 손상 또는 신장 질환은 신장 섬유증(renal fibrosis), 만성 신장 섬유증(chronic kidney fibrosis), 당뇨병과 관련된 만성 신병증(chronic nephropathy associated with diabetes), 루푸스(lupus), 신장 경피증(scleroderma of the kidney), 사구체 신염(glomerular nephritis), 국소 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerular sclerosis), 인간 만성 신장질환 관련 IgA 신병증성 섬유증 (IgA nephropathyrenal fibrosis associated with human chronic kidney disease, CKD), 만성 진행성 신병증 (chronic progressive nephropathy, CPN), 세뇨관간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis), 요관 폐쇄(ureteral obstruction), 만성요독증(chronic uremia), 만성 간질 신장염(chronic interstitial nephritis), 방사선 신병증(radiation nephropathy), 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 진행성 사구체신증(progressive glomerulonephrosis, PGN), 내피/혈전성 미세혈관병증 손상(endothelial/thrombotic microangiopathy injury), HIV - 연관 신증(HIV-associated nephropathy), 및 독소, 자극제(irritant) 및 화학 요법제에 대한 노출과 관련된 섬유증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 망막 신생혈관 형성 장애는 황반변성(macular degeneration), 히스토플라즈마증(histoplasmosis), 병리적 근시(pathological myopia), 망막색소선조(angioid streaks), 전방허혈성시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy), 세균성 심내막염(bacterial endocarditis), 베스트병(Best's disease), 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 혈관종(choroidal hemangioma), 맥락막 모반(choroidal nevi), 맥락막 비관류(choroidal nonperfusion), 맥락막 골종(choroidal osteomas), 맥락막 파열(choroidal rupture), 맥락막 결손(choroideremia), 만성 망막 박리(chronic retinal detachment), 망막 결손 (coloboma of the retina), 드루젠(Drusen), 내인성 칸디다 내안구염(endogenous Candida endophthalmitis), 망막 색소상피의 외유두상 과오종(extrapapillary hamartomas of the retinal pigmented epithelium), 황반안저(fundus flavimaculatus), 특발성 황반원공(idiopathic, macular hole), 악성 흑색종(malignant melanoma), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis, type II), 금속성 안구내 이물(metallic intraocular foreign body), 모닝글로리 디스크 신드롬(morning glory disc syndrome), 다발성 소실성 백반증후군(multiple evanescent white-dot syndrome, MEWDS), 거상연 신혈관형성(neovascularization at ora serrata), 수술현미경 화상(operating microscope burn), 시신경 헤드 피츠(optic nerve head pits), 광응고(photocoagulation), 내 맥락막증(punctuate inner choroidopathy), 풍진(rubella), 유육종증(sarcoidosis), 사행성 또는 지도 맥락막염(serpiginous or geographic choroiditis), 망막하액배출(subretinal fluid drainage), 기울어진 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 탁소플라즈마 망막맥락막염(Taxoplasma retinochoroiditis), 결핵(tuberculosis), 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome), 당뇨성망막병증(diabetic retinopathy), 비-당뇨성망막병증(non-diabetic retinopathy), 분지정맥 폐쇄(branch vein occlusion), 중심성 망막정맥 폐쇄(central retinal vein occlusion), 미숙신생아 망막증(retinopathy in premature infants), 홍채신생혈관(rubeosis iridis), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 중심와부근 모세관확장증(perifoveal telangiectasis), 겸상세포망막증(sickle cell retinopathy), 이일즈병(Eale's disease), 망막혈관염(retinal vasculitis), 본 히펠 린도우병(Von Hippel Linau disease), 방사선 망막증(radiation retinopathy), 망막동결손상(retinal cryoinjury), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 망맥락막결손(retinochoroidal coloboma), 단순포진각막염에 의한 각막혈관신행(corneal neovascularization due to herpes simplex keratitis), 각막궤양(corneal ulcers), 각막이식(keratoplasty), 익상편(pterigyia), 및 트라우마(trauma)로 구성된 군에서 선택되는 원인에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder)는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신경장애 또는 신경질환은, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 뇌동맥류(cerebral aneurism), 척수손상(spinal cord injury), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 만성대뇌피질위축증(diffuse cerebral cortical atrophy), 루이소체 치매(Lewy-body dementia), 픽병(Pick disease), 메조림보코르티콜 치매(mesolimbocortical dementia), 시상퇴행(thalamic degeneration), 헌팅턴무도병(Huntington chorea), 피질-선조체-척추 퇴행(cortical-striatal-spinal degeneration), 피질-기저 신경절 퇴행(cortical-basal ganglionic degeneration), 뇌소뇌퇴행(cerebrocerebellar degeneration), 경련성 하반신마비를 동반하는 가족성 치매(familial dementia with spastic paraparesis), 폴리글로코산체병(polyglucosan body disease), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 올리브교소뇌위축증(olivopontocerebellar atrophy), 진행성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy), 변형성근실조증(dystonia musculorum deformans), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 메이지증후군(Meige syndrome), 가족성떨림(familial tremors), 질레 드 라 투렛증후군(Gilles de la Tourette syndrome), 유극적혈구무도증(acanthocytic chorea), 프레드릭실조증(Friedreich ataxia), 홈스 가족성 피질소뇌위축증(Holmes familial cortical cerebellar atrophy), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 진행성 척수성 근육 위축증(progressive spinal muscular atrophy), 진행성연수마비(progressive balbar palsy), 일차성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 유전성 근위축증(hereditary muscular atrophy), 강직성 하반신마비(spastic paraplegia), 비골근위축증(peroneal muscular atrophy), 비대성 간질 다발신경병증(hypertrophic interstitial polyneuropathy), 유전성 다발신경염성 실조증(heredopathia atactica polyneuritiformis), 시신경병증(optic neuropathy), 안근마비(ophthalmoplegia), 및 망막 또는 시신경 손상(retina or optic nerve damage)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 기계적, 화학적, 세균성 또는 열에 의한 상처이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 절개(incision), 열상(laceration), 찰과상(abrasion), 자창(puncture wound), 관통상(penetration wound) 및 총상(gunshot wound)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상처는 피부 상처이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 척추강내(intrathecal) 투여, 비경구(parenteral) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transdermal) 투여 또는 주입(infusion)에 의한 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처를 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복적 기재에 의한 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 모 항체의 특정 부위의 아미노산 잔기를 치환하고, CDR 그래프팅을 수행함으로써, 안정성을 개선시킨 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 재조합 벡터, 숙주 세포 등을 제공한다.
(b) 본 발명의 상기 안정성이 개선된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모항체인 1E4와 비교하여, 생산성과 생물학적 활성이 우수하면서도 안정성은 개선되고 면역원성은 감소되었다.
(c) 따라서, 본 발명의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항 c-Met 항체 개발에 있어서 생산비용 절감, 효능 감소 억제 및 부작용 감소 등의 우수한 특성을 나타낸다.
도 1a 및 1b는 항 c-Met 항체의 CDR 그래프팅을 위한 후보 서열을 선별하기 위하여, 개별적인 인간 생식세포 계열 서열(individual germline sequence)들의 발생 빈도에 대해 가변영역 도메인(variable domain)의 안정성에 대한 대리 변수 (surrogate) 분석을 나타낸 도이다.
도 2a 내지 2f는 항 c-Met 항체의 CDR 그래프팅을 위한 후보 서열을 선별하기 위하여, 중쇄 가변영역(2a 내지 2c) 및 경쇄 가변영역(2d 내지 2f) 후보 서열들의 in silico 면역원성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 3b은 기존의 항 c-Met 항체와, CDR 그래프팅을 위한 중쇄 가변영역 후보 서열(3a)과 경쇄 가변영역 후보 서열(3b)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 도이다. 항체의 아미노산 서열의 넘버링은 카바트(Kabat) 시스템을 기준으로 하였으며, 차이가 있는 아미노산 잔기는 붉은색 바탕으로 표시하였다.
도 4는 본 발명에서 선별한 21종의 후보 항체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명에서 선별한 21종의 후보 항체들의 항원(c-Met)과의 결합력을 확인하기 위한 single cycle kinetics 센서그램이다.
도 6은 본 발명에서 선별한 21종의 후보 항체들의 생물학적 활성(biopotency)을 비교하기 위하여 HUVEC에 대한 이동(migration) 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 7c는 1E4의 중쇄불변영역 서열(7a 및 7b) 및 경쇄 불변영역 서열(7c)을 in silico 수준에서 인간 생식세포 계열 서열(human germline sequence)과 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 1E4 항체의 불변영역 치환 및 생물학적 활성 확인
본 발명자들은 기존 특허 WO2016/021864A1 및 WO2017/135791A1에서 개시한 IgG1 기반 항 c-Met 항체인 1E4 에 있어서, 항 c-Met 항체의 특성을 보존하면서 구조적 안정성을 향상시키기 위해 기존 항체의 상보성결정부위 (complementarity determining regions, CDRs)를 기존 항체의 프레임워크 영역(framework region)보다 안정적인 프레임워크 영역(framework region)에 이식하는 CDR 그래프팅(CDR grafting) 방법을 이용하였다. 이를 수행하기에 앞서 1E4의 중쇄 및 경쇄 불변영역서열을 영국 엡제나 (ABZENA)사에 의뢰하여 in silico 수준에서 인간 생식세포 계열 서열(human germline sequence)과 비교하였다.
분석결과, 중쇄불변영역은 CH1 도메인의 라이신 잔기 (K)를 제외하고 G1m(3) allotype과 일치하는 것을 확인하였다(도7a, 도7b). 본 라이신 (K) 잔기는 인간 집단(human population)에서는 일반적으로 흔하지 않게 발현하는 G1m(17,1) allotype에 존재하는 잔기이고, 잠재적인 면역원성의 가능성을 내포한다(Lefranc and Lefranc, 2012). 따라서 생체 내 안정성을 고려하여 해당 잔기를 아르기닌 (R) 잔기로 치환함으로써 G1m(3) allotype과 완벽히 일치하도록 변환하였다. 경쇄불변영역의 경우에도, 잠재적인 면역원성을 최소화하기 위해, 본 데이터의 1번 세린 (S) 잔기를 트레오닌 (T) 잔기로 치환하여 인간 생식세포 계열 서열(human germline sequence)인 Km3 allotype과 일치하도록 변환하였다(도7c).
상기 잔기들의 치환된 불변영역을 포함하는 변형된 1E4 항체를 VH0/Vk0 라고 명명하였다. 또한 VH0/Vk0의 생물학적 활성을 in vitro 수준에서 확인하기 위해 HUVEC migration assay를 수행하였다. 실험결과, 양성대조군인 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)와 마찬가지로 1E4 와 VH0/Vk0 모두 90 ng/ml의 농도에서 HUVEC의 이동을 촉진하는 효과를 나타냈다. 정량적으로는 1E4와 VHO/Vk0은 각각 음성대조군 대비 158%와 161%의 매우 유사한 수준으로 세포의 이동을 촉진시켰다. 상기 결과로부터 해당 불변영역의 변경에도 불구하고 기존 생물학적 활성은 유지됨을 확인하였다. 또한, 인간 생식세포 계열 서열과 일치하도록 불변영역을 변경함으로써 면역원성 및 중화현상 감소를 통한 생체 내 안정성 (면역원성 등)과 안전성(반감기 등) 개선에 효과가 있을 것으로 예상된다.(Reference: Lefranc, M.-P., and Lefranc, G. (2012). Human Gm, Km and Am allotypes and their molecular characterization: a remarkable demonstration of polymorphism. In immunogenetics (F. Christiansen and B. Tait, Eds.), Chap. 34. Humana Press, Springer, New York. Methods Mol Biol . 882, 635-680.)
실시예 2. CDR 그래프팅(grafting)을 위한 최적의 프레임워크 (framework) 탐색
본 발명자들은 기존 특허 WO2016/021864A1 및 WO2017/135791A1에서 개시한 IgG1 기반 항 c-Met 항체인 1E4와 관련하여, 항 c-Met 항체의 특성을 보존하면서 구조적 안정성을 향상시키고자 하였다. 본 발명자들은 이를 위해 기존 항체의 상보성결정부위 (complementarity determining regions, CDRs)를 기존 항체의 프레임워크 영역(framework regions, FRs)보다 안정적인 프레임워크 영역에 이식하는 CDR 그래프팅(CDR grafting) 방법을 이용하였다.
먼저 최적의 프레임워크 영역을 선별하기 위해, 중쇄 가변영역(heavy chain variable domain, 이하 "VH"라고 칭함) 및 경쇄 가변영역(light chain variable domain, 이하 "Vk"라고 칭함) 부위의 아미노산 서열을 human germline variable (V) 및 junction (J) 세그먼트 서열의 데이터베이스와 비교하여, 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 서열에 대한 항 c-Met 항체 1E4의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(Vk)과의 서열 상동성 (sequence homology)을 확인하였다.
그 결과 중쇄 가변영역(VH)의 프레임워크 영역인 IGHV5-51*01과 IGHV1-69*02과, 경쇄 가변영역(Vk)의 프레임워크 영역인 IGKV1-39*01과 IGKV3-20*01이 1E4 항체가 기반으로 하는 human germline sequence IGHV5-10-1*01과 IGKV1-9*01과 각각 비교했을 때, 60% 이상의 서열 상동성 (sequence homology)을 가짐을 확인하였다(표 1).
인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열에 대한 항 c-Met 항체(1E4)의 VH 및 Vk의 서열 상동성 비교
- 중쇄(Heavy chain) 경쇄(Kappa chain)
Human V region germline segment Human J region germline segment Human V region germline segment Human J region germline segment
Homology to closest matching human germline IGHV5-10-1*01
(86.7%)		 IGHJ4*01
(92.9%)		 IGKV1-9*01
(89.5%)		 IGKJ4*01
(100%)
Homology to germlines selected for humanisation IGHV5-51*01
(82.7%)		 IGHJ4*01
(92.9%)		 IGKV1-39*01
(87.4%)		 IGKJ4*01
(100%)
IGHV1-69*02
(62.2%)		 IGHJ4*01
(92.9%)		 IGKV3-20*01
(67.7%)		 IGKJ4*01
(100%)
* IGHV5-51*01 :
IGHV: heavy chain variable
1) IGHV 5: Gene group
2) 51: Gene localization (Gene locus)
3) *01: Reference sequence
* IGHV1-69*02
IGHV: heavy chain variable
1) IGHV 1: Gene group
2) 69: Gene localization (Gene locus)
3) *02: Sequence variant
* IGKV1-39*01
IGKV: kappa light chain variable
1) IGHV 1 : Gene group
2) 39: Gene localization
3) *01: Reference sequence
* IGKV3-20*01
IGKV: kappa light chain variable
1) IGHV 3 : Gene group
2) 20: Gene localization
3) *01: Reference sequence
다음으로 상기 서열 상동성을 기준으로 일차적으로 채택된 프레임워크 들을 기존에 알려진 인간 생식세포 계열 서열(human germline sequence)의 안정성에 근거하여 후보군을 더욱 세분화하는 작업을 진행하였다. 이 과정에서 개별적인 생식세포 계열 서열(individual germline sequence)들의 발생 빈도에 대해 가변영역 도메인(variable domain)의 안정성에 대한 대리 변수 (surrogate)를 참고하여 분석을 실시하였다. 그 결과 중쇄 가변영역 IGHV5-51*01과 IGHV1-69*02, 경쇄 가변영역 IGKV1-39*01과 IGKV3-20*01이 1E4 항체 대비 높은 발생 빈도를 가짐을 확인하였다(도1).
상기 표 1 및 도 1의 결과를 바탕으로, 최종적으로 60% 이상의 서열 상동성을 보이며, 1E4 항체의 가변영역보다 안정성이 높은 중쇄 가변영역 IGHV5-51*01과 IGHV1-69*02, 경쇄 가변영역 IGKV1-39*01과 IGKV3-20*01을 항 c-Met 항체의 CDR 그래프팅을 위한 프레임워크의 최종후보 인간 생식세포계열 서열(human germline sequence)로 선정하여 다음의 연구를 진행하였다.
실시예 3. In silico 면역원성 평가를 통한 최종 후보 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열 확립
1E4 항체의 상보성결정부위(complementarity-determining regions, CDRs)를 실시예2에서 선별된 프레임워크들에 접목시키고 항원-항체 결합력 보존에 중요하다고 확인된 아미노산 잔기를 역 변형(back-mutation)시킨 후, 영국 엡제나 (ABZENA) 사의 iTopeTM 과 TCEDTM (Perry et al. 2008; Bryson et al. 2010) 분석 기술을 사용하여 in silico 면역원성을 평가하였다.
구체적으로 실시예2에서 선별된 프레임워크 후보서열의 펩타이드(peptide)들을 9개의 펩타이드씩 1 아미노산 단위로 증가시켜 스캐닝 분석을 실시하였다. 이 분석 기술에 따라 항체 가변부위서열의 아미노산 잔기들은 Kabat 번호 시스템을 사용하여 번호를 매기었으며, 잠재적으로 면역원성을 지닌 펩타이드를 포함하는 지역을 "iTopeTM"열에 표시하였다. 적색은 promiscuous high affinity MHC class II binding peptides를, 노란색은 promiscuous moderate MHC class II binding peptides를 나타낸다. "TCEDTM (T Cell Epitope Database)"열에는 T 세포 에피토프 데이터베이스와 비교하여 음성 펩타이드 (negative peptide)라고 분석된 아미노산 영역을 녹색으로 표시하였고, VH0/Vk0의 가변영역 서열을 기준으로 후보 가변영역 서열에 존재하는 다른 아미노산 잔기를 빨간색으로 강조하였다(도2).
분석결과, 본 발명자들이 개발한 항 c-Met 항체 1E4의 원형 가변영역을 공유한 불변영역 변형 항체(VH0/Vk0)와 더불어 다른 변형 서열에서도 다양한 promiscuous high/moderate affinity의 MHC class II 리간드로 예상되는 펩타이드 서열들이 발견되었다. 하지만 이 펩타이드 서열(에피토프, epitope)들은 인간 생식세포계열 서열(human germline sequence)에 본래 포함되어 있다고 알려져 있는 서열이기 때문에 T 세포 관용(T cell tolerance)에 의해 면역반응을 잘 유발시키지 못할 것이라고 본 발명자들은 예상하였다. 이와 유사하게 TCEDTM 분석에 따라 T cell negative peptides로 밝혀진 promiscuous moderate/high epitopes도 면역원성의 위험도가 낮다고 본 발명자들은 판단하였다. Human germline sequence에 포함되지 않은 non-germline promiscuous high and moderate affinity MHC class II binding ligands로 예상되는 펩타이드 서열이 후보 서열들에서 일부 발견되었으나 인간화 디자인 절차(humanization design process)를 통해 대부분 제거되었고, 면역원성 유발의 가능성이 다소 존재하나 CDR과 연관되어 있는 (예: Vk CDR2) 아미노산 잔기의 경우, 항체의 결합력 보존을 위해 추가적인 변경 없이 CDR 그래프팅(CDR grafting)을 진행하였다. 이를 통해 CDR 서열을 유지하면서 면역원성(immunogenicity)의 잠재적 위험성이 최소화된 최종 후보 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 in silico 수준에서 확보하였다.
중쇄 가변영역의 경우, IGHV5-51*01을 기반으로 한 후보서열 1종 (코드명: VH2)과 IGHV1-69*02에서 파생한 4종의 후보서열 (코드명: VH3, VH4, VH5, VH6)을 설계하였고, 경쇄 가변영역의 경우, IGKV1-39*01을 기반으로 한 1종의 후보서열 (코드명: Vk2)과 IGKV3-20*01을 바탕으로 한 3종의 후보서열 (코드명: Vk3, Vk4, Vk5)을 설계하였다. 이들 서열은 표2 및 도3에 나타내었다. 각 아미노산 잔기는 카바트 시스템(Kabat system)으로 순서가 매겨졌으며, CDR을 파란색으로 강조하여 표시하였고, 기존 항체 서열과 비교하여 달라진 아미노산 잔기를 각 후보 가변영역 서열 내 빨간색으로 강조하여 표시하였다(도 3).
CDR 그래프팅을 위한 중쇄 및 경쇄 가변영역의 후보서열
중쇄 가변영역 후보서열 경쇄 가변영역 후보서열
생식세포계열(Germline) 코드명(Code name) 서열번호 생식세포계열(Germline) 코드명(Code name) 서열번호
IGHV5-10-01 VH0 (1E4) 11 IGKV1-9 Vk0 (1E4) 17
IGHV5-51*01 VH2 12 IGKV1-39*01 Vk2 18
IGHV1-69*02 VH3 13 IGKV3-20*01 Vk3 19
VH4 14 Vk4 20
VH5 15 Vk5 21
VH6 16
실시예 4. 후보 항 c-Met 항체 variants의 IgG 발현 및 정제
실시예3로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산 서열 및 1E4 항체의 중쇄 및 가변영역 아미노산 서열(VH0 및Vk0)을 포함하여, 총 30개 조합의 후보 항 c-Met항체 변이체(anti c-Met antibody variants)들을 설계하였다.
항 c-Met 항체 변이체를 전체 항체(full antibody) 형태의 IgG 구조로 발현시키기 위해, 실시예 1에서 선별된 중쇄 및 경쇄 불변영역 (constant domain)을 후보 가변영역들과 각각 결합시킨 중쇄 및 경쇄 발현 재조합 벡터를 ABZENA 사의 pANTTM 벡터 시스템을 통해 제작하였다. HEK 293 EBNA 부착성 세포 (LGC Standards, Teddington, UK)에 폴리에틸렌이민 트랜스펙션법(polyethylenimine transfection method)을 사용하여 항체 발현 재조합 벡터들을 트랙스펙션 시키고 9 일 동안 배양한 후, 세포상층액 (배지)을 수집하였다. 상기 수집한 세포상층액을 IgG1 Quantitation ELISA 방법으로 분석하여 세포상층액 내의 항체 농도를 정량하였다. c-Met 항체 변이체(variants)들의 조합 및 발현량 결과는 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 발현이 전혀 일어나지 않은 4종의 후보 항체 (VH0/Vk3, VH0/Vk4, VH0/Vk5 및 VH3/Vk0)와 발현량이 1.5 μg/ml이하로 매우 낮은 5종의 후보 항체 (VH2/Vk3, VH2/Vk4, VH3/Vk3, VH3/Vk4 및 VH3/Vk5)들을 후보 항체로부터 제외하였다(표3).
후보 항 c-Met 항체 variant의 조합 및 발현량(μg/ml)
- VH0 VH2 VH3 VH4 VH5 VH6
Vk0 37.1 31.9 Not Expressed 22.4 21.6 30.2
Vk2 32.4 21.1 17.2 49.7 46.4 40.5
Vk3 Not Expressed 0.9 0.3 5.3 5.8 7.4
Vk4 Not Expressed 1.3 0.5 6.7 3.4 7.9
Vk5 Not Expressed 3.1 1.4 16.5 10.3 14.7
또한, 추가적인 분석을 위해 제조사에 의해 기술된 프로토콜에 따라 단백질 A 세파로스 칼럼(Protein A sepharose columns) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)을 사용하여 세포상층액으로부터 항체를 분리하였고, 1X PBS pH 7.2 버퍼로 투석하여 최종적으로 총 21종의 후보 항체들을 정제하였다. 정제된 항체들의 일부 (1 μg)를 환원시켜 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔 (ThermoFisher, Loughborough, UK)에서 전기영동한 후, InstantBlue (Expedeon, Swavesey, UK)로 염색하여 분자량을 분석하였고 실험결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 위에서 선별한 21 종의 후보 항체들은 인간 유래 세포에서의 발현량이 양호한 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 후보 항체들의 항원(c-Met)에 대한 결합력 측정
Biacore를 사용하여 실시예 4에서 선별한 후보 항체들의 항원(c-Met)에 대한 결합력을 측정하였다. Biacore T200 (serial no. 1909913) 기기 및 Biacore T200 Control Software V2.0.1과 Biacore T200 Evaluation Software V3.0 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 분석프로그램을 사용하여 항원 c-Met에 대한 후보 항체 21종의 결합력을 이온화상수 (dissociation constant, KD value)로 측정하였다. Protein A CM5 칩 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 위에 분석할 항 c-Met 항체를 고정한 후, 0.25 ~ 2 nM의 범위 내에서 다양한 농도의 인간 c-Met 항원 (Sino Biological, Beijing, China)을 흘려줌으로써 센서그램을 확보하였다. 확보된 센서그램을 바탕으로 속도상수 kon 및 koff를 측정하고 속도상수의 비 koff/kon으로부터 KD value를 계산하였다. 결과는 도 5 및 표 4에 나타내었다. 도 5는 본 발명의 21종의 후보 항체들의 single cycle kinetics 센서그램을 나타낸 것이며, 하기 표 4는 21종의 분석항체들을 결합력이 높은 순서에서 낮은 순서로 나열한 것이다.
표 4 및 도 5의 결과로부터, 기존 항체 1E4와 동일한 가변부위를 공유하는 변형항체(VH0/Vk0) 대비 2 배수 이내의 범위에서 본 발명의 20종의 후보 항체들의 결합력이 변동하는 것을 확인하였다. 또한, 21종의 후보 항체 모두 picomolar (pM, KD value: 10-10~10-12) 수준의 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였다.
후보 항체들의 결합력
No. Ligand KD (M) Relative KD to VMDO2 VH0/Vk0 Rmax Chi2 (RU2)
1 VH5/Vk4 3.49 X 10-10 0.67 62.4 0.141
2 VH5/Vk0 3.52 X 10-10 0.68 102.8 0.515
3 VH4/Vk4 3.72 X 10-10 0.72 59.2 0.100
4 VH6/Vk4 3.91 X 10-10 0.75 49.4 0.0612
5 VH4/Vk0 3.95 X 10-10 0.76 70.5 0.354
6 VH5/Vk3 4.02 X 10-10 0.77 68.8 0.117
7 VH6/Vk0 4.14 X 10-10 0.80 89.0 0.249
8 VH5/Vk2 4.20 X 10-10 0.81 65.9 0.152
9 VH4/Vk3 4.22 X 10-10 0.81 68.9 0.119
10 VH4/Vk2 4.23 X 10-10 0.81 68.1 0.177
11 VH6/Vk3 4.31 X 10-10 0.83 58.0 0.0775
12 VH6/Vk2 4.40 X 10-10 0.85 69.6 0.133
13 VH3/Vk2 4.77 X 10-10 0.92 71.2 0.120
14 VH2/Vk2 5.02 X 10-10 0.97 73.9 0.156
15 VH5/Vk5 5.06 X 10-10 0.97 57.8 0.122
16 VH0/Vk2 5.12 X 10-10 0.98 57.1 0.115
17 VH0/Vk0 5.20 X 10-10 1.00 64.7 0.262
18 VH4/Vk5 5.26 X 10-10 1.01 76.1 0.158
19 VH2/Vk0 5.34 X 10-10 1.03 57.5 0.128
20 VH6/Vk5 5.57 X 10-10 1.07 68.3 0.105
21 VH2/Vk5 6.85 X 10-10 1.32 52.8 0.076
실시예6 . 후보항체들의 열역학적 안정성 (Thermal stability) 분석
다음으로 후보 항체들의 열역학적 안정성을 평가하기 위해 SYPRO® Orange (ThermoFisher, Loughborough, UK)를 사용하였다. StepOnePlus real-time PCR system (ThermoFisher, Loughborough, UK)을 사용하여 56분에 걸쳐 온도를 25 ℃에서 99 ℃까지 증가시켜 항체가 중첩풀림이 되는 녹는점을 분석하였다. 용융 곡선(melting curves)은 Protein Thermal Shift Software version 1.2 (ThermoFisher, Loughborough, UK)를 사용하여 분석하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 항체의 안정성은 주로 중쇄 영역에 의해 영향을 받았고, VH6> VH4> VH5> VH0 >> VH2> VH3 순서로 안정성이 감소함을 확인하였다. 또한 항체의 Fab (fragment antigen binding) 구조가 풀릴 때의 녹는점(melting temperature, Tm1)을 기준으로 VH6를 포함한 5종의 후보항체 및 후보항체 VH4/Vk0과 VH5/Vk0이 기준 항체 VH0/Vk0보다 열역학적 안정성이 증가함을 확인하였다.
후보 항체들의 열역학적 안정성 분석 결과
No. Antibody Average Tm1(℃) Average Tm2(℃)
1 VH6/Vk0 65.4 *
2 VH6/Vk5 63.5 *
3 VH6/Vk2 63.2 *
4 VH6/Vk3 63.0 *
5 VH5/Vk0 62.6 ~68
6 VH4/Vk0 62.6 ~68
7 VH6/Vk4 62.4 *
8 VH0/Vk0 60.0 67.7
9 VH5/Vk2 59.7 67.3
10 VH4/Vk2 59.6 67.3
11 VH5/Vk5 59.3 67.5
12 VH2/Vk0 59.1 68.1
13 VH4/Vk5 58.7 67.5
14 VH5/Vk3 58.4 67.3
15 VH4/Vk3 58.0 67.3
16 VH5/Vk4 58.0 66.2
17 VH0/Vk2 58.0 67.5
18 VH2/Vk5 57.6 67.3
19 VH2/Vk2 57.6 67.5
20 VH4/Vk4 57.5 67.2
21 VH3/Vk2 48.9 67.9
실시예7 . 후보항체들의 생물학적 활성 ( Biopotency ) 분석
후보 항체들의 생물학적 활성을 유추하기 위해 HUVEC 이동 분석(HUVEC migration assay)을 수행하였다. HUVEC 이동 분석은 세포의 c-Met 단백질 수용체가 HGF와 같은 리간드에 의해 활성화될 때, HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell)이 이동한다는 원리를 바탕으로 구축된 간단한 실험법으로, 분석값인 % migration이 높을수록 HUVEC의 이동이 더욱 촉진된다고 이해할 수 있다. 항 c-Met 항체는 HGF와 유사하게 항원인 c-Met을 인산화 (phosphorylation)하여 활성화시킬 수 있기 때문에, 세포이동을 유발할 가능성을 기대할 수 있다. 1% 젤라틴 (Sigma Aldrich, USA)으로 코팅된 transwell (Corning inc., USA)에 HUVEC (Lonza, USA)을 2 x 104 세포/웰의 비율로, transwell의 상부 챔버에는 10% 소태아혈청 (Gibco, New Zealand)이, 하부 챔버에는 1% 소태아혈정이 첨가된 Medium 199 (Gibco, USA) 배지로 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 50분간 배양한 후에 재조합 인간 HGF (recombinant human hepatocyte growth factor, rhHGF) (R&D systems, USA)와 후보 항체를 각각 50 ng/ml과 90 ng/ml로 하부 챔버에 처리하였다. 37 ℃, 5% CO2 조건에서 2시간 배양한 뒤, 3.7% 포름알데히드 (VWR Life Science, USA)로 세포를 고정하였고, 크리스탈 바이올렛(VWR Life Science, USA)으로 염색한 후, 현미경으로 관찰 및 사진을 촬영하여 transwell 안쪽으로부터 바깥쪽으로 HUVEC이 얼마나 이동하는지 정량하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
실험 결과, 음성대조군 대비 약 120 ~ 179% 정도로, 21종의 후보 항체들이 양성대조군인 recombinant human HGF(rhHFG)와 마찬가지로 세포의 이동을 촉진시키는 것을 확인하였다(도면6). 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 후보 항체들은 생물학적 활성이 우수함을 알 수 있었다.
실시예8 . 최종 후보 항체 선정을 위한 데이터 비교 분석
실시예 4에서 선별한 21종의 후보 항체들 중에서 최종 후보군을 선별하기 위해 항체 발현량 (expression level), 항원과의 결합력 (affinity), 열역학적 안정성 (thermal stability), 그리고 생물학적 활성(biopotency)으로 세분화하여 기준을 설정하여 비교하였다. 일반적으로 항체 발현량이 생산관점에서 시간과 비용을 고려했을 때, 가장 중요한 지표가 될 수 있다고 판단되었다. 따라서 본 발명자들은 원활한 항체생산을 최우선으로 고려하여 항체 발현량 15 μg/ml 미만인 후보항체들을 배제하였다. 그 후 각 후보항체들의 기준 항체(VH0/Vk0) 대비 개선된 정도를 각각의 선정지표로부터 수치화하여, 각 선정지표에서 측정된 후보 항체들의 분석값을 평균분석값으로 나눠 구한 비(index 1)를 VH0/VkO의 비를 기준으로 다시 나누어(index 2) 정규화하였다(표 6 내지 표 9). 또한, 4가지 각 지표에서 분석된 이 수치를 곱연산하여 후보 항체들을 4가지 선정지표에서 종합적으로 비교하여, 최종 결과값 (index 3)이 높은 순서대로 나열하였다. 그 결과, 기존 프로토타입 (VH0/Vk0))보다 개선된 4종의 후보항체 VH4/Vk2, VH5/Vk2, VH6/Vk2, VH6/Vk0를 선별하였다(표 10).
항체발현량
항체명 발현량 (μg/ml) Index 1 Index 2
VH0/ Vk0 37.1 1.213 1.000
VH0/Vk2 32.4 1.059 0.873
VH2/Vk0 31.9 1.043 0.860
VH2/Vk2 21.2 0.693 0.571
VH3/Vk2 17.2 0.562 0.464
VH4/Vk0 22.4 0.732 0.604
VH4/Vk2 49.7 1.625 1.340
VH4/Vk5 16.5 0.539 0.445
VH5/Vk0 21.6 0.706 0.582
VH5/Vk2 46.4 1.517 1.251
VH6/Vk0 30.2 0.987 0.814
VH6/Vk2 40.5 1.324 1.092
평균 30.6 - -
항원과의 결합력
항체명 KD (10-10M) Index 1 Index 2
VH0/ Vk0 5.20 0.677 1.000
VH0/Vk2 5.12 0.688 1.016
VH2/Vk0 5.34 0.659 0.974
VH2/Vk2 5.02 0.701 1.036
VH3/Vk2 4.77 0.738 1.090
VH4/Vk0 3.95 0.891 1.316
VH4/Vk2 4.23 0.832 1.229
VH4/Vk5 5.26 0.669 0.989
VH5/Vk0 3.52 1.000 1.477
VH5/Vk2 4.20 0.838 1.238
VH6/Vk0 4.14 0.850 1.256
VH6/Vk2 4.40 0.800 1.182
평균 3.52 - -
*: KD값이 낮을수록 높은 결합력을 의미하므로 역수로 계산하였음.
열역학적 안전성
항체명 Tm1 (℃) Index 1 Index 2
VH0/ Vk0 60 1.006 1.000
VH0/Vk2 58 0.973 0.967
VH2/Vk0 59.1 0.991 0.985
VH2/Vk2 57.6 0.966 0.960
VH3/Vk2 48.9 0.820 0.815
VH4/Vk0 62.6 1.050 1.043
VH4/Vk2 59.6 1.000 0.993
VH4/Vk5 58.7 0.985 0.978
VH5/Vk0 62.6 1.050 1.043
VH5/Vk2 59.7 1.001 0.995
VH6/Vk0 65.4 1.097 1.090
VH6/Vk2 63.2 1.060 1.053
평균 59.6 - -
생물학적 활성
항체명 Relative Migration (%) Index 1 Index 2
VH0/ Vk0 149.8 0.951 1.000
VH0/Vk2 162.8 1.034 1.087
VH2/Vk0 156.4 0.993 1.044
VH2/Vk2 176.1 1.118 1.176
VH3/Vk2 163.9 1.041 1.095
VH4/Vk0 121.7 0.773 0.812
VH4/Vk2 177.4 1.127 1.185
VH4/Vk5 171.0 1.086 1.142
VH5/Vk0 128.1 0.813 0.855
VH5/Vk2 176.5 1.121 1.179
VH6/Vk0 151.5 0.962 1.012
VH6/Vk2 154.2 0.979 1.030
평균 157.5 - -
4가지 선정기준에 따른 후보 항체들의 최종 결과값 (index 3)
항체명 Index 3
VH4/Vk2 1.938
VH5/Vk2 1.816
VH6/Vk2 1.399
VH6/Vk0 1.128
VH0/Vk0 1.000
VH0/Vk2 0.932
VH2/Vk0 0.861
VH5/Vk0 0.767
VH4/Vk0 0.674
VH2/Vk2 0.668
VH4/Vk5 0.491
VH3/Vk2 0.451
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
<110> VIROMED CO., LTD. <120> Anti c-Met Antibody or Antigen binding fragment thereof with Improved Stability <130> PN180202 <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 1 Thr His Trp Ile Thr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 2 Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 3 Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr Phe Asp 1 5 10 15 Met <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 5 Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of anti c-Met Antibody 1E4 <400> 6 Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant domain 1 of heavy chain (CH1) of anti c-Met Antibody 1E4(VH) <400> 7 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa-constant domain (Ck) of anti c-Met Antibody 1E4(Ck) <400> 8 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 9 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant CH1 of anti c-Met Antibody 1E4(VH0) <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Kappa constant domain of anti c-Met Antibody 1E4(Ck0) <400> 10 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable of 1E4 (VH or VH0) <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 12 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Heavy chain variable of 1E4 (VH2) <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Heavy chain variable of 1E4 (VH3) <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Heavy chain variable of 1E4 (VH4) <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn 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Heavy chain variable of 1E4 (VH3) <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240 ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctca 378 <210> 25 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Heavy chain variable of 1E4 (VH4) <400> 25 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgag atctgaggac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg 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chain of 1E4 variant (VH0) <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr 100 105 110 Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 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ccggcgtgca caccttccct 540 gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc ctgtcctccg tggtgaccgt gccctccagc 600 tctctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg 660 gacaagaagg tggaacccaa gtcctgcgac aagacccaca cctgtccccc ctgccctgcc 720 cctgaactgc tgggcggacc ctccgtgttc ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg 780 atgatctccc ggacccccga agtgacctgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccct 840 gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 900 agagaggaac agtacaactc cacctaccgg gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag 960 gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtctcca acaaggccct gcctgccccc 1020 atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc cagccccgcg agccccaggt gtacacactg 1080 ccccctagcc gggaagagat gaccaagaac caggtgtccc tgacctgtct ggtgaaaggc 1140 ttctacccct ccgacattgc cgtggaatgg gagtccaacg gccagcccga gaacaactac 1200 aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac ggctcattct tcctgtactc caagctgacc 1260 gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc 1320 ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg tccctgagcc ccggcaagtg a 1371 <210> 47 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH0) <400> 47 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgaatc cctgcggatc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacagatg 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcca cgtgaccatc tccgccgact cctccagctc caccgcctac 240 ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 48 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH2) <400> 48 gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgaatc cctgaagatc 60 tcctgcaagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacagatg 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcca agtgaccatc tccgccgaca agtccatctc caccgcctac 240 ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 49 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH3) <400> 49 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240 ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 50 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH4) <400> 50 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgag atctgaggac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 51 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH5) <400> 51 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgag atctgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 52 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 1E4 variant (VH6) <400> 52 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180 ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgaca agtccacgtc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgag atctgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacggc 300 aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 53 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 (Vk) <400> 53 gacatccaga tgacccagtc ccccagcttc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaccgccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggactccg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gagatccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtccag caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ctgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gctga 645 <210> 54 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 variant (Vk0) <400> 54 gacatccaga tgacccagtc ccccagcttc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaccgccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggactccg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 55 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 variant (Vk2) <400> 55 gacatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaagccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 56 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 variant (Vk3) <400> 56 gacatccaga tgacccagtc ccccggcttc ctgtccttgt ccccaggcga aagagccacc 60 ctctcctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccaggctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgcccgac 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag actggagccc 240 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 57 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 variant (Vk4) <400> 57 gaaatccaga tgacccagtc ccccggcacc ctgtccttgt ccccaggcga aagagccacc 60 ctctcctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccaggctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgcccgac 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag actggagccc 240 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 58 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 1E4 variant (Vk5) <400> 58 gaaatcgtgt tgacccagtc ccccggcacc ctgtccttgt ccccaggcga aagagccacc 60 ctctcctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccaggctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg catccccgac 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag actggagccc 240 gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

Claims (36)

  1. 다음을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편:
    (a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4의 구성을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인; 및
    (b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 구성을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인:
    상기 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3는 서열번호 4, 5, 6의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 (a)는 서열번호 11 내지 16 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 (b)는 서열번호 17 내지 21 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하나, 다음 i) 내지 x)의 경우의 항체 또는 항원 결합 단편은 제외함:
    i) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함,
    ii) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    iii) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함,
    iv) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함,
    v) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함,
    vi) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 12의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    vii) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 12의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함,
    viii) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    ix) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함, 또는
    x) 상기 (a) 및 상기 (b)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄는 서열번호 34 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 41 내지 45 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 단, 다음 i) 내지 x)의 경우는 제외하는, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편:
    i) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함,
    ii) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함,
    iii) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함,
    iv) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함,
    v) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함,
    vi) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함,
    vii) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함,
    viii) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함,
    ix) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함, 또는
    x) 상기 항체의 중쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 또는 화학적으로 연결된 F(ab')2 인, 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
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  24. 다음을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 1의 CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain), 서열번호 2의 CDRH2, 및 서열번호 3의 CDRH3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변영역 도메인;
    (b) 서열번호 7의 CH1(constant domain 1 of heavy chain)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변영역 도메인;
    (c) 서열번호 4의 CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain), 서열번호 5의 CDRL2, 서열번호 6의 CDRL3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변영역 도메인; 및
    (d) 서열번호 8의 Ck(Kappa-constant domain)를 포함하는 면역글로불린 경쇄 불변영역 도메인,
    여기에서 상기 서열번호 7의 CH1의 97번째 아미노산 잔기 및 서열번호 8의 Ck의 2번째 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 각각 아르기닌(Arginine), 트레오닌(Threonine)으로 치환 변이되고,
    상기 (a)는 서열번호 11 내지 16 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 (c)는 서열번호 17 내지 21 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하나, 다음 i) 내지 x)의 경우의 항체 또는 항원 결합 단편은 제외함:
    i) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함,
    ii) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    iii) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함,
    iv) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 11의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함,
    v) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함,
    vi) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 12의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    vii) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 12의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함,
    viii) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함,
    ix) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함, 또는
    x) 상기 (a) 및 상기 (c)가 각각 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함.
  25. 제24항에 있어서, 상기 서열번호 7의 CH1의 97번째 아미노산 잔기는 아르기닌(Arginine)으로, 상기 서열번호 8의 Ck의 2번째 아미노산 잔기는 트레오닌(Threonine)으로 치환 변이된, 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 제1항의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 (a)를 코딩하는 서열번호 22 내지 27 중 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열, 및 상기 (b)를 코딩하는 서열번호 28 내지 32 중 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자:
    단, 다음 i) 내지 x)의 경우의 핵산 분자는 제외함:
    i) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    ii) 상기 (a) 를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    iii) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    iv) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    v) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    vi) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    vii) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    viii) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    ix) 상기 (a) 를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함, 또는
    x) 상기 (a)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 (b)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함.
  28. 제27항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 중쇄를 코딩하는 서열번호 47 내지 52 중 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열, 및 상기 경쇄를 코딩하는 서열번호 54 내지 58 중 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자:
    단, 다음 i) 내지 x)의 경우의 핵산 분자는 제외함:
    i) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    ii) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    iii) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 57의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    iv) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    v) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    vi) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    vii) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 57의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    viii) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함,
    ix) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 57의 뉴클레오타이드 서열을 포함, 또는
    x) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  35. 제34항의 재조합 벡터로 형질전환 된 분리된 숙주세포.
  36. (a) 제1항 내지 제3항, 제24항, 및 제25항 중 어느 한 항의 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 허혈성 질환, 뇌졸중, 신장 손상 또는 질환, 망막 신생혈관 형성 장애(retinal neovascularization disorder), 신경장애 또는 질환, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물.
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