KR20120134938A

KR20120134938A - ＨＧＦ 활성을 가지는 ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120134938A
Application number: KR1020110054177A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 조기원; 박찬웅; 유석호; 장명희; 김혜난; 윤선하; 조규원; 박미라
Original assignee: 한국생명공학연구원; 주식회사에이앤알쎄라퓨틱스
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2012-12-12
Also published as: WO2012165925A2; KR101444837B1; US20140193431A1; US9631020B2; WO2012165925A3

Abstract

본 발명은 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)과 프레임 워크 영역(FR)으로 구성된 인간항체, 상기 인간항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 인간항체 B7을 제조하는 방법, 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 조성물, 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 세포재생용 조성물 및 상기 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체에 관한 것이다. 본 발명의 c-Met에 특이적인 인간항체는 HGF의 mimic으로 작용하여 상처치료용 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 HGF나 c-Met의 활성화로 치유되는 다양한 질환(Neuronal Infarction, progressive nephropathy, liver cirrhosis, lung fibrosis, Kidney, Liver, Lung injury, Ulcerative wound)에 대한 치료 및 예후 판정 등에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＨＧＦ 활성을 가지는 ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체 및 이의 용도{c-Met-targeting full agonist human antibody with HGF activity and usage thereof}

본 발명은 HGF 활성을 가지는 c-Met에 대한 인간항체에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)과 프레임 워크 영역(FR)으로 구성된 인간항체, 상기 인간항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 인간항체 B7을 제조하는 방법, 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 조성물, 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 세포재생용 조성물 및 상기 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체에 관한 것이다.

간세포 성장인자/산란 인자(Hepatocyte Growth factor/scatterring factor, HGF/SF)는 다면발현성 사이토카인(pleiotropic cytokine)으로서 발생과정에서 다양한 기능을 한다. HGF/SF는 수용체인 Met 티로신 키나제에 결합하여 표적세포의 이동성, 침입, 증식, 생존, 형태변화 등 다양한 생체반응을 유도한다(Jiang et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology. 53:35-69, 2005). HGF/SF는 중간엽 기원의 사이토카인으로 간세포는 물론 다른 상피성 세포인 내피세포, 색소세포, 조혈세포, 골세포 등에 작용하여 수용체인 Met을 통하여 상기 반응을 활성화시킨다고 보고되었다(Tamagnone and Comoglio, Cytokine & Growth factor Rev. 8:129-142, 1997).

본 발명자들은 "HGF/SF-Met signaling의 장애가 간세포의 일상적 기능에는 영향을 미치지 않지만, 간세포가 손상된 경우의 재생과정에 부정적 영향을 미친다"는 결과를 발표한 바 있으며 그 이후 간뿐만이 아니라 피부가 손상될 경우에도 HGF/SF와 c-Met가 분비되는 것을 확인하였다. 즉 과다증식성 피부조직에서 HGF/SF와 c-Met가 대량으로 분비되기 때문에 피부조직의 증식이 촉진되는 것이다. 그러나 c-Met는 피부와 모낭에서 발견되는 데 반하여, HGF/SF는 평소에는 모낭에서만 발현되며 피부가 손상을 입은 후에야 피부에서 발견되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 HGF/SF는 피부가 손상을 입을 때까지는 활동을 개시하지 않다가, 피부가 손상을 입은 후에 상처 주변부에서 특히 활발하게 활동한다(Journal of Cell Biology 177(1):151-162, 2007). 따라서 HGF/c-Met은 피부재생과 회복을 직접적으로 조절한다고 알려져 있다(Nakamura et al., Nature. 342:440-443, 1993; Huh et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:4477-4482, 2004).

생체 및 실험실적 환경에서의 연구를 통하여 HGF/SF는 또한 신경계에도 작용을 하며 특히 운동신경세포 보호 기능에 대한 많은 연구들이 보고되어 있다(Novak et al., Journal of Neuroscience. 20:326-337, 2000). 또한 심장 손상 회복(Nakamura et al., J Clin Invest. 106:1511-1519, 2000)등의 일반적인 장기 손상이후의 방어적 생리학적 기작에도 중요한 기능을 담당하고 있음이 제안되었고 실제로 HGF/MET 경로가 신경 경색, 진행성 신장염, 간경화와 폐섬유증의 과정에 관계하며 HGF가 이러한 퇴행성 질병의 병변에 과발현되어 조직손상의 생리학적 방어기전으로 보호활성을 나타냄이 입증되었다(Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008).

그러므로 HGF/SF는 중추신경계 신경세포의 사멸을 막고 더 나아가 신경퇴행성질환 즉 파킨슨씨 질환과 신경경색으로 유도되는 허혈증 및 알츠하이머 질환의 치료제로서, 그리고 다양한 원인에 의한 심장, 신장, 간 및 폐의 손상 및 궤양성 상처가 발생한 이후의 재생성 치료 개념의 제제로서 개발될 가능성이 제시되고 있다.

반면에 HGF/c-Met 신호전달의 과다활성이 내피계열의 다양한 세포의 악성종양화와 혈관형성에 관련되고, 이러한 관점에서 c-Met을 표적으로하는 길항성 c-Met 항체가 항암제로서의 사용될 수 있을 것이라는 가능성이 제시되었다( Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 예를 들어, 하나의 가지를 갖는 c-Met 항체가 HGF의 c-Met 이량체화에 의한 활성화를 음성적으로 조절하여 이식 마우스 모델에서 효율적으로 종양성장을 억제함이 보고된 바 있다(Jin et al, Cancer Research 68(11): 4360-4368, 2008; Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 또한 T-세포 치료법에서 암세포 표면항원을 선택적으로 인식하는 T-세포 유전자조작에도 암세포에 과발현되는 항원에 대한 항체가 T 세포의 연결을 위한 종양 표적화에 활용되고 있다(Sadelain, The Cancer Journal 15(6):451-455, 2009).

이에, 본 발명자들은 c-Met을 표적으로 하면서도 다양한 생리활성을 나타내는 항체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, c-Met을 표적으로 하도록, c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)과 프레임 워크 영역(FR)으로 구성된 인간항체 B7이 HGF와 유사한 활성을 나타내며, 세포표면 분자인 c-Met과 결합하여 신호전달을 유도하는 아고니스트 항체로서의 기능을 수행할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR) 및 프레임 워크 영역(FR)을 포함하는 인간항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 상기 인간항체 B7을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 세포재생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 장기의 궤양성 손상 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)과 프레임 워크 영역(FR)을 포함하는 인간항체를 제공한다.

본 발명에서 용어 “c-Met"이란 HGF(hepatocyte growth factor)의 수용체로서, 본 발명에서 Met 또는 Met 수용체와 혼용되어 사용된다. 본 발명의 목적상 본 발명의 인간항체는 HGF/c-Met 신호전달을 유도할 뿐만 아니라, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하여 HGF의 모방체(mimic)로서 작용하여서 아고니스트 항체로서의 기능을 수행할 수 있다.

본 발명에서 항체(antibody)는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 본 발명의 목적상 상기 인간항체는 단일클론항체일 수 있다. 본 발명의 인간항체는 모든 구조가 인간으로부터 유래되었기 때문에 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있다. 따라서 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 단일클론항체란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 상기 단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

본 발명에서 용어 “가변영역”이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 부위를 의미하고, 가변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.

본 발명에서 용어 “상보성 결정영역(CDR)"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 파지 디스플레이 방법으로 천연 인간 단쇄 Fv 라이브러리(naive human single chain Fv library)를 바이오 패닝하여 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간항체 B7을 제조하였다.

본 발명에서 용어 “바이오 패닝(biopanning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)과 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.

바람직하게, 상기 인간항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간항체는 서열번호 7로 기재된 중쇄가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 8로 기재된 경쇄가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 중쇄가변영역 아미노산 서열은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열로 코딩될 수 있고, 상기 경쇄가변영역 아미노산 서열은 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열로 코딩될 수 있다.

아울러, 상기 인간항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 투여된 생체내에서의 체류시간을 증진시키기 위하여, 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)될 수 있다.

본 발명의 용어 "당화(glycosylation)"는 글리코실기를 단백질에 전위시키는 가공방법을 의미한다. 상기 당화는 글리코실 전달효소에 의해 글리코실기가 표적 단백질의 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 히드록실리신 잔기에 결합되어 수행되는데, 상기 당화된 단백질은 생체조직의 구성물질로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포표면에서 세포인식에도 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명에서는 인간항체의 당화 또는 상기 당화의 패턴을 변화시켜서 인간항체의 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 용어 "페길화(PEGlation)"는 상기 인간항체에 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써, 상기 인간항체의 혈중 체류시간을 향상시키는 가공방법을 의미한다(Anna M. Wu, et al., Nature Biotechnology, 23(9): 1137-1146, 2005; David Schrama, et al., Drug Discovery, 5:147-159, 2006; Alain Beck, et al., Immunology, 10:345-352, 2010). 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜로 고분자 나노 입자를 페길화하는 것에 의해, 나노 입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 탐식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서, 상기 페길화에 의하여 인간항체의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 페길화는 히알루론산의 카르복실 그룹과 폴리에틸렌 글리콜의 아민 그룹의 결합에 의해 아미드 그룹을 형성하는 방법으로 형성될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 아니하며 다양한 방법으로 페길화를 수행할 수 있다. 이때, 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 100 내지 1,000사이의 분자량을 갖고, 선형 또는 가지형의 구조를 가지는 것을 사용함이 바람직하다.

상기 당화 및/또는 페길화는 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 한 당업계의 공지된 방법에 의해 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형될 수 있고, 본 발명의 인간항체는 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 변이 인간항체를 모두 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 개발한 인간항체 B7이 Met 수용체가 잘 발현되지 않는 것으로 알려진 MCF7 세포 및 Met 수용체를 발현하지만 종의 차이로 인하여 인간항체가 결합하지 않는 개 신장 MDCK세포에서는, 상기 B7 항체가 결합하지 않는 것을 FACS를 통해 확인하여, 본 발명의 항체가 c-Met 특이적인 것을 확인하였다(도 6). 이때, 개 신장 MDCK세포에서는 Met 수용체가 발현되기는 하지만, 종이 상이하기 때문에 인간의 cMet 항원과 반응하는 본 발명의 인간항체 B7과는 결합되지 않았다. MTT 세포 성장 분석을 통해, HGF와 동일하게 B7 항체를 처리한 Hep3B 세포가 성장하는 것을 확인하여 B7 항체가 HGF와 동일하게 세포 성장을 촉진하는 것을 확인하였다(도 7). 실제로, 간세포, 피부세포 및 뇌세포를 대상으로 하여 상처치료활성을 나타내는 HGF와 본 발명의 B7 항체를 처리한 결과, HGF보다는 낮은 수준이지만 B7항체가 상처치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 8a 내지 8c).

또한, 세포 분산이동을 관찰한 결과, HGF의 일반적인 성질인 세포 분산 이동을 일으키는 것을 확인하였다(도 9). 또한 단백질 발현 분석을 통해, HGF를 처리한 Cos7세포와 동일하게 B7항체를 처리한 세포군에서도 Met 수용체의 인산화 증가를 확인하였으며(도 10), HGF를 통한 대표적인 특징인 세포 내 이입 현상이 B7 항체에 의해서도 일어난 것을 면역형광 염색법을 통해 확인하였다(도 11). 이와 같은 결과들은 본 발명의 인간항체가 c-Met에 특이적으로 결합하며, HGF의 mimic으로 작용할 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 이러한 결과는 기존의 HGF 단백질의 문제점인 혈중 안전성(plasma stability)를 극복하는 새로운 HGF/c-Met 신호전달의 활성화 개념의 치료제로 작용할 수 있는 가능성을 시사하는 것이다.

아울러, 상기 도 8a 내지 8c에서 보듯이, 본 발명의 B7항체는 상처치료효과의 측면에서는 HGF보다 낮은 수준을 나타내었지만, 혈장에 대한 안정성의 측면에서는 HGF보다도 현저하게 높은 수준을 나타내었으므로(도 13), 실제적인 상처치료효과면에서는 본 발명의 B7항체가 HGF보다도 오히려 높은 효율을 나타낼 것으로 예상할 수 있었다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 인간항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 항체의 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 삽입되어 발현된다. 바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열이고, 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 염기서열일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, 본 발명에서, "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV)프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다.

또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 폴리뉴클레오티드인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로 바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용 가능하다. 전체 항체 또는 항체 단편을 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(cotransfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입하고, 경쇄(또는 중쇄)를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별한다.

Fab 형태의 항체를 제작하기 위해서, 인간 경쇄의 가변영역(V_L)과 불변영역(C_L) 및 인간 중쇄의 가변영역(V_H)과 첫 번째 불변 영역 도메인(C_H1)의 아미노산을 코딩하는 유전자를 삽입한 벡터를 이용한다.

본 발명의 인간항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 인간항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 벡터의 적합한 숙주세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary)세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 CHO 세포이다.

본 발명에서 "숙주세포로의 형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄)) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 상기 인간항체를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, (i) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양액으로부터 상기 인간항체를 정제하는 단계를 포함하는, c-Met에 특이적으로 결합하는 인간항체를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 항체 제조에서 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

형질전환체를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 이들을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피가 가장 많이 사용되며, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등이 있다.

상기 방법으로 제작된 항체는 항원에 대한 친화도(affinity)가 증가된 항체이다. 용어 친화도는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로 이런 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 본 발명에서는 중쇄 가변영역을 무작위로 돌연변이시켜 인간화 중쇄 라이브러리 세포를 제작하고 이 라이브러리 세포를 대상으로 콜로니 리프트 어세이를 실시하여 항원 결합능이 높은 변이체 클론을 먼저 선별하였고 선별된 클론들을 대상으로 경쟁적 ELISA를 실시하여 각 클론의 친화도를 조사하였다. 그 외에도 항원에 대한 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 표면 플라즈몬 공명 기술(surface plasmon resonance technology:SRP)가 그 예다.

본원에 사용되는 용어 K_D는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 칭하며 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하는 척도로 사용되었다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 조성물 또는 세포성장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “상처치료”란 물리적인 요인에 의해서 손상된 피부 세포를 회복시키기 위한 약물 처치 및 손상된 피부 세포를 보호하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 “세포성장 촉진”이란, 일반적으로 질병 또는 외상 등에 의하여 피부조직의 일부가 탈락 또는 결손되면, 탈락조직 주위에 생존하고 있는 피부 세포가 분열 증식하여 결손부에 이동하여 가는 현상을 세포 재생이 빠르게 일어나도록 하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 간, 피부 또는 뇌세포에 yellow tip으로 상처를 준 후, 본 발명의 B7 항체를 처리하자 24시간 후, 손상된 부분의 세포가 회복된 것을 확인하였으며(도 8a 내지 8c), 이와 같은 결과는 본 발명의 인간항체가 상처치료 또는 세포성장을 촉진할 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

이와 같은 효과를 이용하여 본 발명의 피부 세포 재생용 화장품으로도 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 각 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 양제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 반산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

본 발명의 상기 각 조성물은 바람직하게는 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있는데, 상기 경구 투여용 제형은, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화 할수 있다. 정제 및 캡슐등의 제형으로 제제화 하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 마니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활류를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 세포재생용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 간세포, 신경세포, 근육세포, 피부세포 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 뇌세포, 심장근세포 등이 될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 간, 피부 또는 뇌세포에 yellow tip으로 상처를 준 후, 본 발명의 B7 항체를 처리하자 24시간 후, 손상된 부분의 세포가 회복된 것을 확인하였으며(도 8a 내지 8c), 이와 같은 결과는 본 발명의 인간항체가 간세포, 피부세포, 근육세포, 신경세포 등의 재생을 촉진할 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 퇴행성 신경질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 파킨슨씨병, 신경경색이 유도되는 허혈성 질환, 알쯔하이머 질환 등이 될 수 있다.

지금까지의 in vitro와 in vivo의 연구를 통하여 HGF/SF(Hepatocyte Growth factor/scatterring factor)는 또한 신경계에도 작용을 하며 특히 운동신경세포 보호 기능에 대한 많은 연구들이 보고되어 있다 (Novak et al., Journal of Neuroscience. 20:326-337, 2000). 또한 HGF/MET 경로가 신경경색(neuronal Infarction)의 과정에 관계하며 HGF가 이러한 퇴행성 질환의 병변에 과발현되어 보호활성을 나타냄이 입증되었다(Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008).

그러므로 HGF/SF는 중추신경계 신경세포의 사멸을 막고 더 나아가 파킨슨씨병, 신경경색이 유도되는 허혈성 질환, 알쯔하이머 질환 등의 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)의 치료제로서 활용될 수 있다. 이와 같은 결과는, HGF/SF 신호전달을 유도하는 본 발명의 c-Met 특이적 인간항체가 퇴행성 신경질환의 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 인간항체를 유효성분으로 포함하는 장기의 궤양성 손상 치료용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 장기는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 심장, 신장, 간, 폐 등이 될 수 있다.

본 발명자들은 "HGF/SF-Met 신호전달의 장애가 간세포의 일상적 기능에는 영향을 미치지 않지만, 간세포가 손상된 경우의 재생과정에 부정적 영향을 미친다"는 결과를 발표한 바 있으며 그 이후 간뿐만이 아니라 피부가 손상될 경우에도 HGF/SF와 c-Met가 분비되는 것을 확인하였다. 즉 과다증식성 피부조직에서 HGF/SF와 c-Met가 대량으로 분비되기 때문에 피부조직의 증식이 촉진되는 것이다. 그러나 c-Met는 피부와 모낭에서 발견되는 데 반하여, HGF/SF는 평소에는 모낭에서만 발현되며 피부가 손상을 입은 후에야 피부에서 발견되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 HGF/SF는 피부가 손상을 입을 때까지는 활동을 개시하지 않다가, 피부가 손상을 입은 후에 상처 주변부에서 특히 활발하게 활동한다(Journal of Cell Biology 177(1):151-162, 2007). 따라서 HGF/c-Met은 간의 재생과 회복를 직접적으로 조절함이 입증되어 있다(Nakamura et al., Nature. 342:440-443, 1993; Huh et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:4477-4482, 2004).

뿐만 아니라 심근손상의 회복(Nakamura et al., J Clin Invest. 106:1511-1519, 2000)등의 손상된 장기의 방어적 생리과정에도 중요한 기능을 담당하고 있음이 공지되어 있으므로, HGF/SF는 다양한 원인에 의한 심장, 신장, 간, 폐 등의 궤양성 손상을 치료할 수 있는 치료제로서 활용될 수 있다. 이와 같은 결과는, HGF/SF 신호전달을 유도하는 본 발명의 c-Met 특이적 인간항체가 장기의 궤양성 손상 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처 치료, 퇴행성 신경질환 치료 또는 장기의 궤양성 손상 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 “치료”란 조성물의 투여로 상기 상처나 피부 재생, 퇴행성 신경질환 치료 또는 장기의 궤양성 손상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 인간항체를 이용한 치료 방법은 상기 항체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업작에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비융, 치료기간, 구체적 조성물과 함계 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함하나, 그 예로 소, 돼지, 말, 토끼, 쥐, 인간일 수 있다.

본 발명의 용어, “투여”는 어떠한 적절하 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "약물"이란 본 발명의 c-Met에 특이적인 인간항체에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 인간항체와 분리될 수 있으며, 표적세포에 대한 치료효과를 나타내는 화합물을 의미하는데, 상기 약물을 특별히 이에 제한되지 않으나, 독소루비신, 나이트로젠 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파마이드, 싸이오테파, 부설판, DTIC(다카바진), 프로카바진, BCNU, CCNU, 메틸-CCNU, 메소트렉세이트(MTX), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 6-싸이오구아닌, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 아드리아마이신, 다우노루비신, 블레오마이신, 미토마이신-C, 악티노마이신-D, 빈크리스틴, 빈블라스틴, VP-16-213, VM-26, 타목시펜, 시스플라틴, L-아스파라지네이스, o,p-DDD, IFN, IL-2, 티모신 α-1, 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin) C, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아클라루비신(aclarubicin), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜 등이 될 수 있다.

본 발명의 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체는 수용체 매개 엔도사이토시스에 의하여 세포내로 유입될 수 있고, 세포내 산성환경에 의하여 약물이 분리되어 원래의 기능을 발휘할 수 있으므로, 상기 약물 결합체는 표적세포 치료용 항체로서 이용될 수 있다.

본 발명의 c-Met에 특이적인 인간항체는 HGF의 mimic으로 작용하여 상처치료용 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 HGF나 c-Met의 활성화로 치유되는 다양한 질환(Neuronal Infarction, progressive nephropathy, liver cirrhosis, lung fibrosis, Kidney, Liver, Lung injury, Ulcerative wound)에 대한 치료 및 예후 판정 등에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 cMet 다클론 파지 항체에 대한 ELISA를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 cMet 단클론 파지에 대한 핑거 프린팅을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3a는 중쇄 발현 벡터 pNATABH_B7를 나타내는 벡터맵이다.
도 3b는 경쇄 발현 벡터 pNATABL_B7를 나타내는 벡터맵이다.
도 4는 항체의 발현여부를 확인하기 위한 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 정제된 항체를 전기영동한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 6은 Hep3B, HeLa, A549, HepG2, MCF7 및 Dog kidney MDCK 세포와 B7 항체의 결합여부를 FACS 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 HGF 또는 B7 항체를 처리한 Hep3B 세포를 MTT 세포 성장 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 간세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다.
도 8b는 피부세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다.
도 8c는 뇌세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다.
도 9는 HGF 또는 B7 항체에 의한 HepG2, A549 및 MDCK 세포의 분산 이동 여부를 나타내는 사진이다.
도 10은 인간 Met 수용체가 과다발현된 Cos7 세포에서 B7 항체에 의한 Met 수용체의 인산화 증가를 확인하는 사진이다.
도 11은 HeLa 세포에서 B7 항체에 의한 Met 수용체의 세포 내 이입 (internalization)의 증가를 확인할 수 있는 형광현미경 사진이다.
도 12는 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon resonance, SPR) 분석을 통해 B7 항체의 해리상수를 산출하는 과정을 나타내는 그래프이다.
도 13은 마우스의 혈장에서 HGF와 B7 항체의 안정성의 차이를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항체의 제조

B7 항체를 제조하기 위하여 공지된 파지 디스플레이 스크리닝방법을 통해 Met 수용체에 결합하는 것으로 보이는 B7 파지의 가변부위를 pNATAB 벡터에 클로닝한 중쇄 및 경쇄 DNA와 PEI 시약을 혈청이 없는 DMEM 배지에 혼합하여 293E 세포에 처리하여 배지로 분비되게한 다음, 이를 정제하여 B7 항체를 제조하였다.

실시예 1-1: 라이브러리 파지의 제조

다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7×10¹⁰를 2×YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3 L)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파지(helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YT CM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 용해시키고, 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)하고, 펠렛을 PBS에 현탁시킨 다음, 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 제조하였다.

실시예 1-2: 패닝 ( Panning ) 과정

정제된 cMet(Extracellular Domain)-Fc 30㎍을 4㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]에 가하여 용해시키고, 이를 면역흡착튜브(Immunosorb tube, Nunc 470319)에 넣은 다음, 회전기(rotator)에 4℃에서 16시간동안 적용하여 cMet을 상기 튜브의 벽면에 코팅하였으며, PBS에 4%로 용해된 탈지분유(skim milk, BD,232100)를 사용하여 블로킹하였다.

상기 코팅된 면역튜브에 상기 실시예 1-1에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고 PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균(XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서(2차: 13번, 3차: 23번) 동일한 방법으로 2차, 3차 패닝을 수행하였다(표 1).

패닝에 따른 항체의 역가비교

패닝횟수	파지의 유입수	파지의 결합수	세척횟수	항원의 양
1회	4.0X10¹³	4.5X10⁷/2.7X10⁷/3.9X10⁷	5회	30㎍
2회	6.0X10¹³	7.5X10⁶	13회	30㎍
3회	6.0X10¹³	6.0X10⁹	23회	30㎍

상기 표 1에서 보듯이, 패닝의 횟수가 증가할수록 항체의 역가가 상승함을 알 수 있었다.

실시예 1-3: 파아지 ELISA에 의한 파아지 항체 스크리닝

1차부터 3차까지 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물(stock)을 5 ㎖의 1차 배지(2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl₂)에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2차 배지(2×YTCMK, 5 mM MgCl₂, 1 mM IPTG)에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 세포를 원심분리한 후(4500 rpm, 15 분, 4℃) 상등액(패닝된 poly scFv-파아지)을 새 튜브로 옮겼다. 96웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 용해된 탈지분유(4 %)를 사용하여 각 웰을 블로킹하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2㎖으로 세척하고, 패닝된 poly scFV-파아지를 원액 및 5, 25, 125, 625, 3125배 희석한 용액을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-M13-HRP(Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD 정제(Sigmap 8787-TAB)를 PC 완충용액[C₆H₈O₇?H₂O(Sigma, C0706) 5.1 g, Na₂HPO₄(Sigma, S7907) 7.3 g)에 용해시킨 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(도 1). 도 1은 cMet 다클론 파지 항체에 대한 ELISA를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 항원에 대한 결합능이 각각 2차 다클론 scFv-파아지 풀(pools)부터 증강하기 시작하여 3차에 결합능이 포화상태에 이르렀음을 확인할 수 있었다.

실시예 1-4: 단일 클론 항체 선별

상기 결합능이 큰 다클론 파아지 항체군에서 얻은 콜로니를 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl₂ 배지 1 ㎖이 포함된 96-웰 플레이트(바이오니아 90030)에서, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 OD600 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 1 ㎖의 1차 배지에 희석한 다음, 96-deep 웰 플레이트에서 37℃에서 OD600 값이 0.5~0.7 되도록 2~3시간 배양하였다. M1 헬퍼 파아지를 MOI값이 1:20이 되도록 감염시킨 후, 2차 배지에서 30℃의 조건하에 16시간동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15 분, 4℃)한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10분, 4℃)하여 상등액을 취해 새 튜브에 옮겨 4℃에서 보관하였다. 이후, 96웰 면역 플레이트에 항원을 웰당 100 ng씩을 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 용해시킨 탈지분유(4%)를 사용하여 각 웰을 블로킹하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 세척한 다음 상기 방법으로 수득한 단일클론 scFv-파아지(each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온 에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 씻어준 후 2차 항체 인 anti-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 세척한 후에 발색하여 흡광도 490 ㎚에서 측정하였다(표 2).

상기 표 2에서 보듯이, 항원에 대한 결합능이 1 이상인 23개의 단일 파아지 클론들을 선별할 수 있었다.

실시예 1-5: 핑거 프린팅에 의한 단일 클론 파지의 확인

1차 선별된 cMet-Fc에 대한 16개 단일 클론 세포 1 ㎕와 Taq.DNA polymerase(젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머(pYG100-F) 및 역방향 프라이머(pYG100-R) 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 이때, PCR 프로그램의 조건은, 95℃-5min x 1 cycle, (95℃-20sec, 48℃-40sec, 72℃-1min) x 34 cycle, 72℃-5min x 1cycle 이다.

pYG100-F: 5'-cagctatgaccatgattacg-3'(서열번호 11)

pYG100-R: 5'-cttattagcgtttgccatct-3'(서열번호 12)

상기 콜로니 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(Seakem LE, CAMERES 50004)에서 확인하였고, BstNI(Roche11288075001, 10 U/㎕) 0.2 ㎕를 가하여 37℃에서 2~3시간 반응하였다. 반응 조건은 10X 완충용액 3 ㎕, PCR 산물 10 ㎕, BstNI(10 U/㎕) 0.2 ㎕ 및 증류수 16.8 ㎕이다.

상기 절단된 산물을 DNA 폴리아크릴 아마이드 겔(30% acrylamide (Bio-RAD,161-0156) 2.66 ㎖, 10 XTBE 1 ㎖, dH₂O 6.27 ㎖, 10% APS(sigma,A3678) 70 ㎕, TEMED(Bio-RAD,161-0801) 7 ㎕)에서 BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 의해 그 다양성을 확인하였다 (도 2). 도 2는 cMet 단클론 파지에 대한 핑거 프린팅을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 2에서 보듯이, BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 대해 다양성이 확인되었고, 15종의 서로 다른 항체가 선별되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 1-6: 염기서열 분석에 의한 단일 클론 파지의 확인

cMET-Fc에 대해 15 종류의 단일 파아지 클론을 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지(5 ㎖)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA 정제 키트(Nuclogen 5112)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 서열번호 125의 pelB5 프라이머를 이용한 서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트, 한국)(표 3).

상기 표 3에서 보듯이, 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역을 확인하였고 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 아미노산 서열을 분석하였으며, 서로 다른 서열을 갖는다는 점을 확인할 수 있었다.

실시예 1-7: 전체 IgG 변환분석

cMet에 대한 단일 클론 파아지 항체들을 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕ 와 10 pM/㎕ 하기의 중쇄 정방향 프라이머(NATVH4-2)와 중쇄 역방향 프라이머(NATJH-ALL Nhe I), 10X 완충액 5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행 하였다. 이때, PCR 프로그램의 조건은, 95℃-2min x 1 cycle, (95℃-20sec, 55℃-40sec, 72℃-1min) x 30 cycle, 72℃-5min x 1cycle 이다.

NATVH4-2: 5'-TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTACAGCAGTG-3'(서열번호 13)

NATJH-ALL Nhe I: 5'-GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA-3'(서열번호 14)

또한, 경쇄도 하기의 경쇄 정방향(NATVL4) 및 역방향 프라이머(NATJL2-R)를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행 하였다.

NATVL4: 5'-TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC-3'(서열번호 15)

NATJL2-R: 5'-GAGGAGAGATCTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'(서열번호 16)

PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트(Qiagen)로 정제한 후, pNATABH 벡터 1 ㎕(10 ng), 중쇄(100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, Ligase (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치 하여 상기 벡터와 연결함으로써, 중쇄를 발현하는 벡터인 pNATABH_B7을 제작하였다(도 3a). 도 3a는 중쇄 발현 벡터 pNATABH_B7를 나타내는 벡터맵이다. 상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃ 에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Amp 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 중쇄 DNA를 추출하였다.

한편, 경쇄는 pNATABL 벡터를 사용하여 상기와 같은 방법으로 경쇄를 발현하는 벡터인 pNATABL_B7을 제작하고(도 3b), 이로부터 경쇄 DNA를 추출하였다. 도 3b는 경쇄 발현 벡터 pNATABL_B7를 나타내는 벡터맵이다. 상기 수득한 DNA의 CMV-proF 프라이머(서열번호 9: AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰 하였다(솔젠트). 그 결과, 전체 IgG로 전환한 cMet-Fc에 대한 15개의 클론 파아지의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.

실시예 1-8: 항체 발현 및 정제

B7 파지의 가변부위를 pNATAB 벡터에 클로닝한 중쇄 및 경쇄 DNA와 PEI 시약을 혈청이 없는 DMEM 배지에 혼합하여 293E 세포에 처리하고, 이를 배양하였다. 상기 293E 세포가 100 mm 플레이트 70% 정도 자랐을 때 중쇄 및 경쇄 DNA 각 6㎍, PEI(#23966, Polysciences, USA) 20㎍을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 세포에 처리해 주었다. 24시간 후에 혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아 준 후, 이틀에 한번씩 배지를 회수 하고 새로운 배지로 갈아 주었다. 회수한 배지는 2차 항체 (Goat Anti-human IgG, (Fc), Thermo, #31413)를 이용한 웨스턴 블럿 방법으로 항체 발현을 확인 하였다(도 4). 도 4는 항체의 발현여부를 확인하기 위한 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진으로서, Non-reducing은 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하지 않는 비환원 조건에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타내고, reducing은 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 환원 조건에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타내며, 1 내지 4차는 48시간 마다 배지를 교체하면서 얻어진 각 시료의 순서를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 비환원 조건에서는 약240kDa의 분자량을 나타내고, 환원조건에서는 항체의 중쇄와 경쇄가 분리되어 상기 2차 항체에 의하여 검출될 수 있는 약 55kDa의 중쇄부분을 확인하였으므로, 상기 제조방법에 의하여 항체가 적절하게 제조되었음을 알 수 있었다.

발현이 확인된 배지는 원심 분리 후, 0.22 ㎛ 필터(#PR02890 Millipore, USA)를 이용하여 여과하였다. 10 ㎖ column에 400 ㎕의 Protein A Bead (#17-1279-03 GE, Sweden)를 충진하고 PBS로 씻어 준 후(약 50㎖) C-Met B7 항체가 발현된 배지를 흘려 주었다. Peri-start 펌프(Bio-rad, EP-1 Econo-pump)를 사용하여 1분에 0.8 ㎖씩 흘러 들어 가게 해 주었다. 배지가 모두 컬럼을 통과 한 후 PBS로 씻어 준 후(약100㎖) 0.1 M glycine-HCl (#G7126, Sigma, USA)로 정제된 C-Met B7 항체를 회수하였다. 회수된 단백질은 1M Tris pH 9.0 (#T-1503, Sigma, USA)를 이용하여 pH를 중화 시켜 준 후 PBS를 이용하여 투석을 실시 하였다. 정제된 항체는 BCA (Thermo, #23228, #1859078) 용액을 가지고 정량을 수행하였고 SDS-PAGG를 통해 정제가 잘 되었는지, 항체 구조를 잘 이루고 있는지, 정량은 잘 되었는지 확인하였다 (도 5). 도 5는 정제된 항체를 전기영동한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, Non은 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하지 않는 비환원 조건에서 전기영동을 수행한 결과를 나타내고, Reducing은 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 환원조건에서 전기영동을 수행한 결과를 나타내며, #1과 #2는 2회의 정제실험의 결과로서 얻어진 각각의 항체를 의미한다. 도 5에서 보듯이, 상기 정제된 항체는 비환원 조건에서는 약240kDa의 분자량을 나타내고, 환원조건에서는 항체의 중쇄와 경쇄가 분리되어 약 55kDa의 중쇄부분과 약 26kDa의 경쇄부분으로 분리됨을 확인하였으므로, 상기 정제방법에 의하여 항체가 적절하게 정제되었음을 알 수 있었다.

실시예 2: FACS 분석

Met 수용체가 잘 발현되는 것으로 알려진 Hep3B, HeLa, A549, HepG2세포와 잘 발현되지 않는 것으로 알려진 MCF7 세포, 그리고 Dog kidney MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 각각 준비하여 PBS로 2번 씻어준 뒤 트립신 처리하여 세포를 떨어뜨려 PBS로 씻어준 뒤 1% BSA 단백질을 넣은 PBS (PBA buffer) 에 각 세포를 풀어주었다. 그 다음 정제된 B7 항체를 4도에서 1:100 의 비율로 1시간 동안 처리해 준 후 PBA buffer로 씻어준 뒤 1200rpm 에서 3분간 윈심분리기를 통해 세포를 침전시키는 방법으로 동일하게 3번 B7 항체를 씻어낸 뒤 인간항체를 탐지하는 2차 형광 항체 (invitrogen, Alexa Fluor 488 goat anti-human IgG, #A11013)를 1:200로 희석하여 40분간 처리해주었다. 앞에서와 동일하게 세포를 세척한 후 FACS 분석기기(BD CantoII Flow Cytometer) 를 사용하여 결과를 얻었다(도 6). 이때, 내부대조군으로서 인간의 면역글로불린(human IgG, hIgG)을 사용하였다.

도 6은 Hep3B, HeLa, A549, HepG2, MCF7 및 Dog kidney MDCK 세포와 B7 항체의 결합여부를 FACS 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, Met 수용체가 잘 발현되지 않는 것으로 알려진 MCF7 세포와 개(dog)인 MDCK 세포에는 상기 B7 항체가 결합하지 않음을 확인하였다. 이로부터 상기 B7 항체가 Met 수용체 특이적인 인간화 항체임을 확인 할 수 있었다.

실시예 3: MTT 세포 성장 분석(Cell proliferation assay)

100mm 플레이트에서 키우던 Hep3B 세포를 트립신 처리하여 떼어낸 다음 96well plate에 5000개씩 깔고 하루 뒤 원래 있던 배지를 제거하고 PBS로 각 well을 씻어낸 뒤 1% 혈청이 함유된 MEM 배지에 40ng/㎖ 농도의 HGF(R&D, 294-HG-005) 와 0.5㎍/㎖ 의 B7 항체를 각 조건 별로 well에 처리하고 2일 후 MTT(Sigma, #M2003) 용액(5mg/㎖)을 20㎕씩 2시간 동안 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 처리해 준 다음 배지를 제거하고 DMSO(AMRESCO, 0231-500ML) 를 100㎕씩 처리 해주었다. 5분 뒤 NanoQuant (Tecan, infinite200)으로 560nm에서 O.D 값을 측정하였다(도 7). 이때, 음성대조군으로 hIgG를 사용하였다.

도 7은 HGF 또는 B7 항체를 처리한 Hep3B 세포를 MTT 세포 성장 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, Day 0은 세포를 깔고난 다음날 아무것도 처리하지 않은 상태를 의미하고, Day 2는 각 항체를 처리하고 2일이 경과한 시점을 의미한다. 도 7에서 보듯이, B7 항체를 처리하고 2일 후에 확인한 결과 Met 수용체의 유일한 ligand로 알려진 간세포 성장인자 (HGF)를 처리했을 때와 같이 세포가 성장한 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는, B7 항체가 Met 수용체에 결합하여 간세포 성장인자와 같이 세포성장을 촉진하는 역할을 하는 것을 시사한다.

실시예 4: 상처 재생 분석 (Wound healing assay)

간세포 성장인자와 Met 수용체의 상호작용을 통한 신호전달 경로는 세포 이동에도 영향을 주는 것이 알려져 있는데 상처 재생 분석을 통해 세포의 이동성에도 B7 항체가 영향을 주는지 알아보았다.

실시예 4-1: 간세포에 대한 상처 재생 분석

Hep3B 세포가 6웰 플레이트의 각 웰에 90% 이상 자라도록 하루 전 날 세포를 깔아두고, 다음날 배지를 제거하였으며, PBS로 세척하고, 혈청이 없는 MEM 배지를 처리하여 24시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양한 다음, 200㎕ yellow tip 으로 표면을 그어서 최대한 균등하게 손상시켰다. 이어, 상처재생효과를 나타내는 것으로 알려진 HGF(0.5nM), B7항체(0.5nM) 또는 B7항체(5nM)을 포함하는 MEM 무혈청 배지를 가하고, 18시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 처리한 다음, 현미경 사진을 촬영하였다(도 8a). 도 8a는 간세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다. 도 8a에서 보듯이, 상기 손상된 부위는 B7 항체를 24시간 처리했을 때 처리하지 않은 경우 보다 월등히 회복되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.

다만, HGF 0.5nM 과 B7 항체 0.5nM을 처리하여 상처 재생 효과를 비교하였을 때 B7 0.5nM 처리했을시 보다 상처치료효과가 우수하였고, HGF 0.5nM의 상처치료효과는 B7 5nM의 상처치료효과와 유사함을 확인하였으므로, HGF가 B7 항체에 비하여 10배 정도 높은 상처치료효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4-2: 피부세포에 대한 상처 재생 분석

간세포인 Hep3B 세포 대신에 피부세포인 SK-MEL-28 세포를 사용하고, B7항체를 가한 후 17시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 현미경 사진을 촬영하였다(도 8b). 도 8b는 피부세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다. 도 8b에서 보듯이, 상기 손상된 부위는 B7 항체를 24시간 처리했을 때 처리하지 않은 경우 보다 월등히 회복되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 4-3: 뇌세포에 대한 상처 재생 분석

간세포인 Hep3B 세포 대신에 뇌세포인 C6 세포를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 현미경 사진을 촬영하였다(도 8c). 도 8c는 뇌세포의 손상된 부위의 회복에 B7 항체가 미치는 영향을 나타내는 사진이다. 도 8b에서 보듯이, 상기 손상된 부위는 B7 항체를 24시간 처리했을 때 처리하지 않은 경우 보다 월등히 회복되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 실시예 4-1 내지 4-3의 결과를 종합하면, 본 발명의 B7 항체가 상처 재생용으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 세포 분산 이동 분석 (Cell scattering assay )

Met 수용체의 ligand인 간세포 성장인자 (HGF)는 분산인자 (Scattering Factor) 라고도 불리는데 Met 수용체에 결합하여 신호전달 과정을 통해 세포의 분산 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이를 이용하여 B7 항체가 HGF와 유사한 활성을 나타내는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, HGF와 B7 항체를 처리하기 하루 전날 HepG2(10000개), A549(10000개), MDCK(5000개) 세포를 24well 플레이트에 깔고 처리하는 당일 원래 배지를 제거하고 PBS로 씻어낸 다음 혈청이 없는 배지에 HGF(20ng/㎖) 또는 B7 항체(1㎍/㎖) 을 처리하고 24시간 뒤에 확인하여 image를 얻었다(Canon, Powershot 650IS)(도 9).

도 9는 HGF 또는 B7 항체에 의한 HepG2, A549 및 MDCK 세포의 분산 이동 여부를 나타내는 사진이다. 도 9에서 보듯이, B7 항체를 세포에 처리하여 확인한 결과 간세포 성장인자를 처리했을 때 와 같이 A549, HepG2 세포에서 분산 이동이 일어난 것을 확인할 수 있었고 FACS 분석법에 확인했듯이 B7 항체가 결합하지 않는 MDCK 세포에서는 변화를 관찰 할 수 없었다. 이러한 결과를 통해 B7 항체가 간세포 성장인자의 대표적 성질인 세포 분산 이동을 일으킴을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 B7 항체가 HGF의 모방체로 작용할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 6: 단백질 발현 분석(Western blotting)

간세포 성장인자가 Met 수용체에 결합하여 세포 내로 신호전달을 일으킬 때 에 Met 수용체의 자가 인산화로부터 신호전달이 시작되게 된다. B7도 이 같은 능력을 가지고 있는 지 알기 위해 웨스턴 블럿방법을 통해 Met의 타이로신 인산화 정도를 확인하였다.

구체적으로, Met 수용체가 과 발현된 Cos7 세포를 6well에 깔아준 뒤 70~80% 정도 자랐을 때 PBS로 씻어낸 후 혈청이 없는 DMEM 배지를 처리하였다. 18시간 뒤에 각 조건별로 HGF(20ng/㎖)와 B7 항체(10㎍/㎖) 또는 다른 종류의 항체(hIgG, C2, F6 또는 B3)를 처리 해주고 15분 뒤 즉시 배지를 제거하고 차가운 PBS로 씻어서 얼음 위로 옮겨주고 5분 후 RIPA lysis buffer를 처리하여 세포 파쇄물을 각각 수득하였다. BCA kit을 통해 정량 한 후 5X 샘플 buffer를 넣고 5분간 끓여주었다. 각 샘플을 40㎍ 양으로 동일하게 SDS-PAGE gel에 로딩하였고 전기영동 후 Nitrocellulose 멤브레인으로 옮겼다. 4% Milk가 포함된 TBST buffer로 1시간 동안 blocking 한 후 Met 탐지 항체 (R&D, AF276)와 인산화된 Met 탐지 항체(R&D, #3129) 으로 각각 1:200, 1:500으로 4도에서 18시간 동안 방치하였다. 2차 항체를 처리하기 위해 5분간 TBST로 세척한 다음 1:5000의 비율로 1시간 동안 2차 항체를 처리하였고 7분씩 3번 씻어낸 뒤 ECL 용액(Intron, West-one, #16033) 처리해주고 5분 뒤 암실에서 인화하였다(도 10).

도 10은 인간 Met 수용체가 과다발현된 Cos7 세포에서 B7 항체에 의한 Met 수용체의 인산화 증가를 확인하는 사진이다. 도 10에서 보듯이, HGF만을 처리한 경우처럼 B7 항체만을 처리하였을 때 Met의 인산화가 상당히 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 실험을 통해 보다 확실히 B7 항체가 자체적으로 Met을 통한 여러 세포 내 작용을 유도한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7: 면역형광 염색법 (Immunofluorescence staining)

간세포 성장인자를 통한 대표적인 특징 중에 Met 수용체가 세포 내 이입(endocytosis)되는 현상이 있다. B7 항체가 Met 수용체의 세포 내 이입을 유도하는지 알아보고자 면역 염색 및 형광현미경 관찰을 진행하였다.

HeLa 세포를 트립신 처리 후 떼어 낸 다음 8well slide glass (Thermo, #154534) 에서 자라게 하고 하루 뒤에 HGF(100ng/㎖)와 B7 항체(1㎍/㎖)를 처리한 후 15분이 지나면 배지를 제거하고 차가운 PBS로 씻어내었다. 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하고 0.5% PBST(PBS+Triton-100 0.5% 첨가)로 5분씩 세 번 씻어주었다. 5% goat 혈청이 포함된 PBST로 1시간 동안 blocking 해 준 후 Met 수용체를 탐지하는 시판되는 항체(R&D, AF276)를 1:50의 비율로 1시간 동안 처리한 뒤 0.5% PBST 로 5분씩 3번 씻어주고 형광이 달린 2차 항체(invitrogen, Alexa Fluor 488 goat anti-human IgG, #A11013)를 1:200의 비율로 희석하여 1시간 동안 처리해주었다. 마지막 5분간 핵 염색을 위해 DAPI 용액을 1:1000으로 처리한 후 앞에서와 동일하게 PBST로 3번 씻어준 후 고정 용액(Dako, S3023)을 처리하고 커버 글라스로 덮은 뒤 빛이 들어오지 않는 곳에서 굳을 때까지 두었다. 다 굳은 후 샘플을 형광현미경(Olympus IX2-UCB)으로 찍어 이미지를 얻었다(도 11).

도 11은 HeLa 세포에서 B7 항체에 의한 Met 수용체의 세포 내 이입 (internalization)의 증가를 확인할 수 있는 형광현미경 사진이다. 도 11에서 보듯이, B7 항체를 처리하고 세포를 염색하여 형광 현미경을 통해 염색된 Met 수용체를 관찰하였을 때 간세포 성장인자를 처리했을 경우와 같이 Met 수용체가 세포 내 핵 주변으로 모여 있는 것을 관찰할 수 있었다. 결과적으로 Met 수용체를 타겟으로 하는 B7 항체는 Met 수용체에 결합하여 Met 수용체의 자가 인산화를 유도하고 이로 인한 신호전달을 통해 세포 성장과 이동을 촉진하며 Met 단백질의 세포 내 이입(endocytosis)을 증가시키는 것으로 여겨진다.

실시예 8: 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon resonance, SPR) 분석

HGF에 대한 B7 항체의 직접적인 결합 친화도를 측정하기 위하여, 단백질 반응 분석 시스템(ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System, BioRad, CA, USA)을 이용하여 SPR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 다양한 농도(2.5, 5, 10, 20, 40 및 80nM)의 정제된 B7 항체를 각각 0.005% Tween20을 포함하는 PBS에서 분당 30㎕의 속도로 흐르는 세포에 120초동안 가하고, 240초 동안 분리시켰으며, 얻어진 결과값을 프로그램(Proteon ManagerTM software, ver 2.1)에 적용하여 결합상수를 산출하였다. 상기 산출된 결합상수를 모델(Langmuir 1:1 binding model)로서 평가하여 해리상수를 산출하였다(도 12).

도 12는 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon resonance, SPR) 분석을 통해 B7 항체의 해리상수를 산출하는 과정을 나타내는 그래프이다. 상기 산출된 B7 항체의 해리상수는 약 3.3nM인 것으로 확인되었다.

실시예 9: 마우스의 혈장에서 HGF와 B7 항체의 안정성 비교

HGF(100ng)를 Sema-Fc (C-Met extracelluar domain Fc fusion 단백질) 0.5ug 과 4도에서 3시간 동안 반응시킨 후, B7 항체(100ng)와 HGF에 각각 protein A 비드(15ul)를 가하여 16시간 동안 반응시키고, 침전시킨 다음, 상층액을 제거하고, 7,000rpm 및 3분의 조건하에 침전물을 3회 세척하였다. 이어, 이들 각각에 마우스 혈장 10㎕를 가하고 4 또는 24시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 앞서와 동일한 방법으로 침전, 상층액 제거 및 세척을 수행하였다.

세척된 각 시료에 샘플링 완충액(5x protein sample buffer)을 가하고 가열하여 각 시료를 불활성화시킨 다음, 이로부터 비드를 제거한 나머지를 SDS-PAGE에 적용한 후, Goat Anti-human IgG (Fc)항체와 Anti-human HGF 항체(R&D, AF-294-NA)를 이용한 웨스턴 블럿을 수행하였다(도 13). 도 13은 마우스의 혈장에서 HGF와 B7 항체의 안정성의 차이를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다. 도 13에서 보듯이, HGF는 혈장을 처리하고 4시간이 경과하면, 혈장을 처리하지 않을 경우에 비하여 HGF의 양이 1/1000 수준으로 상당히 감소되었으나, B7 항체는 혈장을 처리하고 24시간이 경과한 후에도, 혈장을 처리하지 않을 경우에 비하여 큰 변화가 없었다.

상기 도 8a의 분석결과를 통하여 B7항체는 HGF에 비하여 상처 재생 효과는 10배정도 낮은 수준을 나타내었지만, 혈장에 의한 영향을 거의 받지 않기 때문에 실제적으로 생체 내에서의 상처 재생효과는 HGF보다도 훨씬 월등할 것으로 예상되었다.

상기와 같은 결과들은 본 발명의 B7 인간항체가 HGF mimic으로 작용하여 c-Met에 특이적으로 결합하여 작용할 수 있고, HGF 보다도 혈장에서의 안정성이 현저히 우수하므로, B7 인간항체는 우수한 상처치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology A&R therapeutics co., ltd. <120> c-Met-targeting full agonist human antibody with HGF activity and usage thereof <130> PA100841/KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Gly His Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Glu Ile Ser His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Thr Gly Thr Ile Ser Asp Ile Gly Thr Tyr Asp Phe Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu 35 40 45 Ser Gly His Tyr Trp Ser Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Ala Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Glu 85 90 95 Tyr Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 8 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ile Ser Asp Ile 35 40 45 Gly Thr Tyr Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Phe Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ile 85 90 95 Ser Gly Phe Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr 100 105 110 Thr Asp Asn Arg Gly Leu Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 115 120 125 Val Leu Arg Ser 130 <210> 9 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 9 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgcag 60 gtacagctac aggagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcgctgtca gtggtgggtc cctcagtggt cactattgga gctgggtccg tctgccccca 180 gggaaggggc tggagtggat tggagaaatc agtcatagtg gtaataccaa ttacaactcg 240 tccctcaaga gtcgagcctc catatccata gacacgtcca agaatgagta ctccttgaac 300 ctgaagtctg tgaccgccgt ggacacggcc gtgtattact gtgcgagatt ctacggtgac 360 tacccctctt cttacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 420 <210> 10 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 10 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtggccacag cggccgatgt ccactcgcag 60 tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gccagtcgat caccatctcc 120 tgcactggaa ccatcagtga cattggcact tatgattttg tctcctggta ccaacataag 180 cccggcaagg cccccaaact cctgattttt gatgtcaata atcggccctc aggggtttct 240 agtcgcttct ctggctccaa gtctgacaat acggcctccc taagcatctc tggattccag 300 gctgaagacg aggctgatta ctactgcagc tcatatacag acaacagagg ccttgtcctt 360 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta agatct 396 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYG100-F <400> 11 cagctatgac catgattacg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYG100-R <400> 12 cttattagcg tttgccatct 20 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH4-2 <400> 13 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tacagcagtg 50 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJH-ALL Nhe I <400> 14 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL4 <400> 15 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagtctgccc tgactcagcc 50 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL2-R <400> 16 gaggagagat cttaggacgg tcagcttggt ccc 33

Claims

c-Met에 특이적으로 결합하는, 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)및 프레임 워크 영역(FR)을 포함하는 인간항체.
제1항에 있어서,
상기 인간항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영을 포함하는 것인 인간항체.
제1항에 있어서,
상기 인간항체는 서열번호 7로 기재된 중쇄가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 8로 기재된 경쇄가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간항체.
제1항에 있어서,
상기 인간항체는 HGF/c-Met 신호전달을 유도하는 것인 인간항체.
제1항에 있어서,
상기 인간항체는 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)된 것인 인간항체.
제5항에 있어서,
항체의 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 것인 인간항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9로 기재된 염기서열로 구성되고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10으로 기재된 염기서열로 구성된 것인 폴리뉴클레오티드.
제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제9항의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
(ⅰ) 제10항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
(ⅱ) 상기 배양액으로부터 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체를 정제하는 단계를 포함하는, c-Met에 특이적으로 결합하는 인간항체를 제조하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처치료용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세포재생용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 세포는 간세포, 신경세포, 근육세포 또는 피부세포인 것인 조성물.
제14항에 있어서,
상기 신경세포는 뇌세포인 것인 조성물.
제14항에 있어서,
상기 근육세포는 심장근세포인 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료용 조성물.
제17항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 파킨슨씨병, 신경경색이 유도되는 허혈성 질환 또는 알쯔하이머 질환인 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 장기의 궤양성 손상 치료용 조성물.
제19항에 있어서,
상기 장기는 심장, 신장, 간 또는 폐인 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인간항체에 약물이 결합된 약물 결합체.