TWI816621B - 抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提出了一種抗體及其應用，該抗體或抗原結合片段含有選自下列至少之一的CDR序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~3；輕鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 4~6。本發明所製備的抗體能夠有效與MICA或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，可以有效治療或預防MICA和/或MICB介導的相關疾病，如促進NK細胞殺傷腫瘤。

Description

抗體及其應用
本發明屬於生物醫藥領域，具體地，涉及抗體及其應用，更具體地，涉及抗體或抗原結合片段、免疫綴合物、組合物、用於檢測MICA和/或MICB的試劑盒、所述抗體或抗原結合片段在製備試劑盒中的用途、藥物、所述抗體或抗原結合片段和/或免疫綴合物和/或組合物在製備藥物中的用途、核酸、重組載體或轉化子。
NKG2D在NK細胞形成同源二聚體，並與四個DAP10分子形成六聚體。結合MICA、MICB等配體後，NKG2D六聚體向NK細胞內傳導活化信號，促進NK細胞分泌IFN-γ等細胞因子、殺傷表達配體的靶細胞。MICA、MICB是由自體基因編碼的蛋白，在正常組織、細胞中不表達；當細胞發生惡性轉變成為腫瘤細胞後，MICA、MICB則會表達腫瘤細胞表面。NK細胞通過NKG2D-MICA/B相互作用識別並殺傷腫瘤。
腫瘤則會通過各種機制下調細胞表面MICA/B表達，其中包括基質金屬蛋白酶介導的MICA/B脫落。MICA/B是種I型跨膜蛋白，其胞外段包括α1、α2、α3三個結構域，通過α1、α2結構域與NKG2D結合。在基質金屬蛋白酶的作用下，MICA/B的胞外段大部分氨基酸（包括α1、α2結構域以及α3結構域的一部分）從腫瘤細胞表面脫落。NKG2D無法結合殘留在細胞表面的部分α3結構域，因而腫瘤能夠逃逸NK細胞的免疫監視。
研究表明，結合α3結構域的MICA抗體能夠抑制MICA從腫瘤表面脫落，進而促進NKG2D-MICA/B介導的NK細胞識別，抑制腫瘤免疫逃逸，因此，開發能夠結合α3結構域的MICA抗體對腫瘤的治療具有重要價值。
本申請是基於發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：
由於MICA、MICB僅表達在腫瘤細胞中，因此，製備靶向MICA、MICB的特異性抗體是潛在的治療腫瘤的手段。發明人將MICA胞外區Fc融合蛋白（MICA-Fc）作為抗原，免疫小鼠後，通過多次篩選，獲得含有抗人MICA和MICB免疫球蛋白的小鼠，繼續進行次選殖篩選，以獲得目標抗體，經過檢測，所述抗體能夠與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進MICA和/或MICB與NK細胞活化性受體NKG2D的結合，促進NK細胞殺傷腫瘤。
因此，在本發明的第一方面，本發明提出了一種抗體或抗原結合片段。根據本發明的實施例，含有選自下列至少之一的CDR序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~3；輕鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 4~6。根據本發明實施例的抗體或抗原結合片段，能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。 GFSLTTYG（SEQ ID NO: 1）。 IWTDGTT（SEQ ID NO: 2）。 VRKGHGYYYAMDY（SEQ ID NO: 3）。 SSVSSSY（SEQ ID NO: 4）。 STS（SEQ ID NO: 5）。 HQYHRSPFT（SEQ ID NO: 6）。
在本發明的第二方面，本發明提出了一種免疫綴合物。根據本發明的實施例，包括第一方面所述的抗體或抗原結合片段。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB蛋白的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
在本發明的第三方面，本發明提出了一種組合物。根據本發明的實施例，包括第一方面所述的抗體和/或第二方面所述的免疫綴合物。如前所述，本發明實施例的所述抗體或抗原結合片段、免疫綴合物均能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，包含上述物質的組合物具有相同的效果，更進一步地，所述組合物可以有效促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
在本發明的第四方面，本發明提出了一種用於檢測MICA和/或MICB的試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包括：第一方面所述的抗體或抗原結合片段。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，所述抗體或抗原結合片段可用於檢測MICA和/或MICB，進一步地，可用於製備檢測MICA和/或MICB的試劑盒，所述試劑盒可以有效檢測MICA和/或MICB，所述試劑盒可用科學研究，如定性或定量檢測生物樣本中的MICA和/或MICB蛋白分子。
在本發明的第五方面，本發明提出了第一方面所述的抗體或抗原結合片段在製備試劑盒中的用途。根據本發明的實施例，所述試劑盒用於檢測MICA和/或MICB。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，所述抗體或抗原結合片段可用於檢測MICA和/或MICB，進一步地，可用於製備檢測MICA和/或MICB的試劑盒。
在本發明的第六方面，本發明提出了一種藥物。根據本發明的實施例，包括：第一方面所述的抗體或抗原結合片段和/或第二方面所述的免疫綴合物和/或第三方面所述的組合物。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段、免疫綴合物、組合物均存在能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合的物質，因此，包含上述物質的藥物可以有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，進而促進NK細胞進行作用，如殺傷腫瘤細胞，所述藥物預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果顯著。
在本發明的第七方面，本發明提出了第一方面所述的抗體或抗原結合片段和/或第二方面所述的免疫綴合物和/或第三方面所述的組合物在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段、免疫綴合物、組合物均存在能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合的物質，因此，包含上述物質的藥物可以有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，進而促進NK細胞進行作用，如殺傷腫瘤細胞，所述藥物預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果顯著。
在本發明的第八方面，本發明提出了一種核酸。根據本發明的實施例，所述核酸編碼第一方面所述的抗體或抗原結合片段。根據本發明實施例的核酸編碼的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述核酸編碼的蛋白具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果。
在本發明的第九方面，本發明提出了一種重組載體或轉化子。根據本發明的實施例，含有第八方面所述的核酸。所述表達載體可包括可選的控制序列，所述控制序列與所述核酸分子可操作地連接。其中，所述控制序列為可指導所述核酸分子在宿主中表達的一個或多個控制序列。本發明實施例所提出的重組載體可在適合的宿主細胞中高效表達所述抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
在本發明的第十方面，本發明提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，所述重組細胞攜帶第八方面所述的核酸、第九方面所述的重組載體或轉化子、或第一方面所述的抗體或抗原結合片段。所述重組細胞是通過轉染或者轉化所述表達載體獲得的。根據本發明的實施例，所述重組細胞在合適條件下可高效表達上述抗體，所述抗體能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
此外，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本發明的描述中，「多個」的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
在本文中所披露的範圍的端點和任何值都不限於該精確的範圍或值，這些範圍或值應當理解為包含接近這些範圍或值的值。對於數值範圍來說，各個範圍的端點值之間、各個範圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值範圍，這些數值範圍應被視為在本文中具體公開。
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文中使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
本文中，在可變區中某些區域氨基酸組成和排列順序具有更高的變化程度，稱為高變區（Hypervariable region，HVR），高變區為抗原和抗體結合的位置，因此也稱為互補決定區（complementarity-determining region，CDR）。重鏈可變區和輕鏈可變區上均有三個CDR區。
本文中，「抗體」如前所述，本發明的抗體可以是全長的（例如，IgG1或IgG4 抗體）或僅包含抗原結合部分（例如，Fab、F(ab’)2或scFv 片段），或可以被修飾影響功能。本發明包括具有修飾的糖基化模式的抗MICA抗體。在一些應用中，進行修飾以除去不期望的糖基化位點可以是有用的，或在寡糖鏈上不存在岩藻糖部分以例如增強抗體依賴性細胞毒性(ADCC) 功能的抗體。在另一些應用中，可進行半乳糖基化修飾以改變補體依賴性細胞毒性(CDC)。
本文所使用的術語「抗原結合片段」尤其是指抗體的部分片段如Fv、scFv(sc指單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc 片段或者雙抗體(diabody)、或者通過化學修飾或通過摻入脂質體中應能夠增加半衰期的任何片段，所述化學修飾例如添加聚(亞烷基)二醇，如聚乙二醇(「聚乙二醇化，PEG 化」)(被稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG 或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(「PEG」為聚乙二醇)，所述片段具有MICA和/或MICB結合活性。優選地，所述抗原結合片段將由其來源抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的部分序列構成或者包含輕、重鏈可變區的部分序列，所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結合特異性和充分的親和力，對於和/或MICB，優選至少等於其來源抗體親和力的1/100，在更優選方式中至少等於1/10。這種抗原結合片段將包含最少5個氨基酸，優選其來源的抗體序列的10、15、25、50 和100個連續氨基酸。
本文中，為了進一步提高抗體的生物可接受性，還可以對抗體進行人源化，即，所述抗體為嵌合抗體或人源化抗體。術語「嵌合抗體」是指利用重組DNA技術，將來自一個物種（如小鼠）的單株抗體的恒定區氨基酸序列替換為來自另一個物種（如人）的抗體的恒定區而獲得的重組抗體。術語「人源化抗體」是指利用重組DNA技術，將來自一個物種（如小鼠）的單株抗體的恒定區和可變區的非CDR（Fv骨架區（FR））氨基酸序列全部替換為來自另一個物種（如人）的抗體的恒定區和可變區的非CDR氨基酸序列而獲得的重組抗體。也即，一個抗體的恒定區被人源化時稱為嵌合抗體，而恒定區和可變區的非CDR氨基酸序列全部人源化後稱為人源化抗體。人源化的方法可以參照常規的抗體工程技術進行，在此不再贅述。
同源性，本發明，為了比較兩個或更多個核苷酸序列，可以通過將[第一序列中與相應位置的核苷酸相同的核苷酸的數目相除]來計算第一序列和第二序列之間的「序列同源性」的百分比。[第二個序列中的核苷酸]減去[第一個序列中核苷酸的總數]，然後乘以[100％]，其中第二個核苷酸序列中每個核苷酸的缺失、插入、取代或添加，相對於第一核苷酸序列，被認為是單個核苷酸（位置）上的差異。
或者，可以使用標準設置，使用用於序列比對的已知計算機算法，例如NCBI Blast v2.0，計算兩個或多個核苷酸序列之間的序列同一性程度。
用於確定序列同一性程度的一些其他技術，計算機算法和設置例如在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2357768-A。
對於多肽而言，術語「（實質）同源性」表示，兩個多肽或其指定序列在最佳比對及比較(其中適當插入或缺失核苷酸)時有至少約80％的氨基酸、通常至少約90％至95％、且更優選至少約98％至99.5％的氨基酸相同。
兩條序列之間的同源性％在最佳比對序列時隨這些序列所共享的相同位置數而變化(即同源性％＝相同位置數/總位置數×100)，其中最佳比對考慮到為達成兩條序列的最佳比對而需要引入的空位數及每一空位的長度來確定。兩條序列之間的序列比較及同一性百分數測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實施例中所述。
在不實質性影響抗體活性（保留至少95%的活性）的前提下，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以對本發明的序列替換、添加和/或缺失一個或更多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10 個或更多個）氨基酸，以獲得所述抗體或其功能性片段之序列的變體。它們都被視為包括在本發明保護的範圍內。如在可變區將具有類似性質的氨基酸進行替換。本發明所述變體的序列可以與參比序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性（或同源性）。本發明所述的序列一致性可以使用序列分析軟體測量。例如使用缺省參數的計算機程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本發明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
本文中，「保守修飾形式的氨基酸序列」指這樣的氨基酸修飾，所述修飾不顯著影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結合特性，該修飾包括氨基酸置換、增加和缺失。修飾可通過例如定點誘變和PCR介導的誘變等標準技術引入本發明的抗體中。保守氨基酸置換系其中的氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基替換的置換。在本領域中已經確定具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸(如離氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(如天冬氨酸、麩氨酸)，具有不帶電的極性側鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬醯胺、麩氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、白氨酸、異白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-支化側鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異白氨酸)、和具有芳香側鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本發明的抗體的CDR區中的一個或多個氨基酸殘基可以被來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基替代，並且使可用此處說明的功能測定方法對經改變的抗體的保留功能進行測試。優選的是，保守修飾在數目上不超過1個或2個。
本文中「可操作地連接」是指將外源基因連接到載體上，使得載體內的控制元件，例如轉錄控制序列和翻譯控制序列等等，能夠發揮其預期的調節外源基因的轉錄和翻譯的功能。
在本發明的一個方面，本發明提出了一種抗體或抗原結合片段，含有選自下列至少之一的CDR序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~3或其保守修飾形式的氨基酸序列；輕鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 4~6或其保守修飾形式的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1~6所示的任一氨基酸序列進行保守修飾後不顯著影響或改變包含該氨基酸序列的抗體或抗原結合片段的結合特性，因此，根據本發明實施例的包含SEQ ID NO: 1~6中的至少之一和/或SEQ ID NO: 1~6所示的氨基酸序列進行保守修飾後獲得的氨基酸序列的至少之一抗體或抗原結合片段，能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，可以有效治療或預防MICA和/或MICB介導的相關疾病，如促進NK細胞殺傷腫瘤。 GFSLTTYG（SEQ ID NO: 1）。 IWTDGTT（SEQ ID NO: 2）。 VRKGHGYYYAMDY（SEQ ID NO: 3）。 SSVSSSY（SEQ ID NO: 4）。 STS（SEQ ID NO: 5）。 HQYHRSPFT（SEQ ID NO: 6）。
根據本發明一些具體的實施例，上述抗體或抗原結合片段還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的一些具體的實施例，包含：具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的重鏈CDR1，具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的重鏈CDR2，具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的重鏈CDR3，具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的輕鏈CDR1，具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的輕鏈CDR2，具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或其保守修飾形式的氨基酸序列的輕鏈CDR3。
根據本發明的一些具體實施例，編碼所述重鏈可變區CDR的基因具有SEQ ID NO: 15~17所示的核苷酸序列中的至少之一。 GGGTTTTCACTGACAACTTACGGC（SEQ ID NO: 15）。 ATTTGGACTGATGGGACCACA（SEQ ID NO: 16）。 GTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTAT（SEQ ID NO: 17）。
根據本發明的一些具體實施例，編碼所述輕鏈可變區CDR的基因具有SEQ ID NO: 18~20所示的核苷酸序列中的至少之一。 AGCAGCGTGTCCAGCTCCTAC（SEQ ID NO: 18）。 TCCACCTCC（SEQ ID NO: 19）。 CATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACT（SEQ ID NO: 20）。
根據本發明一些具體的實施例，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，（i）所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列及其保守修飾形式的氨基酸序列至少之一至少80%同源性的氨基酸序列；和/或，(ii)所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列及其保修修飾形式的氨基酸序列至少之一至少80%同源性的氨基酸序列。 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 7）。 QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO: 8）。
根據本發明的一些具體實施例，編碼所述重鏈可變區的基因具有SEQ ID NO: 21所示的核苷酸序列。 CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT（SEQ ID NO: 21）。
根據本發明的一些具體實施例，編碼所述輕鏈可變區的基因具有SEQ ID NO: 22所示的核苷酸序列。 CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA（SEQ ID NO: 22）。
根據本發明一些具體的實施例，所述重鏈可變區包含與選自（i）中的重鏈可變區至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或者100%同源性的氨基酸序列；所述輕鏈可變區包含與選自（ii）中的輕鏈可變區至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或者100%同源性的氨基酸序列。
根據本發明一些具體的實施例，進一步包括Fc區，所述Fc區的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一；
根據本發明一些具體的實施例，所述Fc區的至少一部分來自鼠源、人源、靈長目源IgG抗體或其突變體。
根據本發明一些具體的實施例，所述Fc區的至少一部分來自鼠源IgG2a抗體、人源、靈長目源IgG1抗體或其突變體。
根據本發明一些具體的實施例，所述Fc區的至少一部分來自鼠源IgG2a抗體或其突變體。
根據本發明一些具體的實施例，所述Fc區具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（SEQ ID NO: 14）。
根據本發明一些具體的實施例，所述抗體或抗原結合片段包括：重鏈和輕鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（SEQ ID NO: 9）。 QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID NO: 10）。
根據本發明一些具體的實施例，其中，所述的抗體或抗原結合片段為IgG1、IgG2或IgG4。
根據本發明一些具體的實施例，其中，所述抗體為單株抗體、鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、Fv、單鏈抗體（scFv）、Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2。
根據本發明一些具體的實施例，其中，所述抗體或其抗原結合片段能夠結合SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列。 MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA（SEQ ID NO: 11）。
在本發明的另一方面，本發明提出了一種免疫綴合物，含有治療劑以及上述抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段與所述治療劑偶聯。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB蛋白的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤，所述抗體或抗原結合片段與治療劑進行偶聯後獲得的免疫綴合物同樣具有上述功能。
在本發明的再一方面，本發明提出了一種組合物，該組合物含有前面所述的抗體或其抗原結合片段和/或前面所述的免疫綴合物。如前所述，本發明實施例的所述抗體或抗原結合片段、免疫綴合物均能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，包含上述物質的組合物具有相同的效果，如食品組合物或藥物組合物，更進一步地，所述組合物可以有效促進NKG2D結合MICA和/或MICB，具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
根據本發明的具體實施例，所述組合物進一步包括藥學上可接受的載體。
需要注意的是，所述組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實現本發明的目的。例如，所述組合物中所含的成分可以以整體施用於受試者，或者分開施用於受試者。當所述組合物中所含的成分分開地施用於受試者時，各個成分可以同時或依次施用於受試者。
在本發明的一個方面，本發明提出了一種用於檢測MICA和/或MICB的試劑盒，其中，所述試劑盒含有前面所述的抗體或抗原結合片段。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，所述抗體或抗原結合片段可用於檢測MICA和/或MICB，進一步地，可用於製備檢測MICA和/或MICB的試劑盒，所述試劑盒可以有效檢測MICA和/或MICB，所述試劑盒可用科學研究，如定性或定量檢測生物樣本中的MICA和/或MICB蛋白分子，更具體的，可以用於免疫印跡、免疫沉澱等涉及到利用MICA和/或MICB蛋白與其抗體特異性結合性能，來檢測的試劑盒等。這些試劑盒可包含下列中的任意一種或多種：拮抗劑、MICA和/或MICB抗體或者藥物參照材料；蛋白純化柱；免疫球蛋白親和純化緩衝劑；細胞的測定稀釋劑。MICA和/或MICB抗體可被用於不同類型的診斷測試，例如可以在體外或者體內檢測各種各樣的疾病或者藥物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通過對受試者的血清或者血液進行檢測，用來測試MICA和/或MICB相關疾病。
在本發明的另一方面，本發明提出了前面所述的抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測MICA和/或MICB。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，因此，所述抗體可用於檢測MICA和/或MICB，進一步地，可用於製備檢測MICA和/或MICB的試劑盒，所述試劑盒可以有效檢測MICA和/或MICB，所述試劑盒可用科學研究，如定性或定量檢測生物樣本中的MICA和/或MICB蛋白分子更具體的，可以用於免疫印跡、免疫沉澱等涉及到利用MICA和/或MICB與其抗體或結合片段特異性結合性能，來檢測的試劑盒等。這些試劑盒可包含下列中的任意一種或多種：拮抗劑、MICA和/或MICB抗體或者藥物參照材料；蛋白純化柱；免疫球蛋白親和純化緩衝劑；細胞的測定稀釋劑。MICA和/或MICB抗體或抗原片段可被用於不同類型的診斷測試，例如可以在體外或者體內檢測各種各樣的疾病或者藥物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通過對受試者的血清或者血液進行檢測，用來測試MICA和/或MICB相關疾病。
在本發明的又一個方面，本發明提出了一種藥物，包括：前面所述的抗體或抗原結合片段和/或前面所述的綴合物和/或前面所述的組合物，所述藥物用於預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病。如前所述，本發明實施例的抗體或抗原結合片段、免疫綴合物、組合物均存在能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合的物質，因此，包含上述物質的藥物可以有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述藥物預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果顯著。
根據本發明的一些具體實施例，上述藥物還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的一些具體實施例，所述MICA和/或MICB介導的疾病為癌症或移植排斥、自身免疫病、感染性疾病。
根據本發明的一些具體實施例，所述癌症為肺癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，皮膚癌，膀胱癌，結腸癌，乳腺癌，神經膠質瘤，腎癌，胃癌，食道癌，口腔鱗狀細胞癌和頭頸癌中的至少一種。
根據本發明的一些具體實施例，包括藥學上可接受的載體和有效量的所述抗體活性成分。
如本文所用，術語「有效量」或「有效劑量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應) 的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
本發明的藥物含有安全有效量的本發明的活性成分以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物的劑型為注射劑、口服製劑(片劑、膠囊、口服液)、透皮劑、緩釋劑。例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物宜在無菌條件下製造。
本發明所述的活性成分的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本發明所屬技術領域具有通常知識者根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於：所述的活性成分的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
本發明所述的藥學上可接受的載體包括(但不限於)：水、鹽水、脂質體、脂質、蛋白、蛋白-抗體綴合物、肽類物質、纖維素、奈米凝膠、或其組合。載體的選擇應與給藥方式相匹配，這些都是本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。
在本發明的一個方面，本發明提出了一種核酸，包含編碼前面所述的抗體或其抗原結合片段的序列。根據本發明實施例的核酸編碼的抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，促進NKG2D結合MICA和/或MICB，所述核酸編碼的蛋白具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果。
根據本發明的具體實施例，所述核酸具有SEQ ID NO: 12、13所示的核苷酸序列。
編碼所述抗體或抗原結合片段的重鏈的基因具有如下所示的核苷酸序列： CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCTGCCAAAACAACTGCACCATCTGTTTATCCACTGGCCCCCGTTTGCGGGGATACCACTGGTAGCTCTGTCACCCTCGGCTGTCTGGTCAAAGGATATTTCCCCGAGCCTGTGACACTTACCTGGAATTCAGGCAGCTTGTCCTCCGGCGTGCATACTTTCCCTGCAGTCCTGCAGTCAGATCTGTACACCCTCAGCTCATCTGTGACTGTCACAAGTTCTACCTGGCCATCCCAGAGTATTACATGCAACGTGGCCCACCCAGCAAGTTCAACAAAAGTTGACAAGAAGATTGAGCCAAGAGGCCCTACTATCAAGCCCTGTCCCCCCTGTAAGTGTCCTGCACCCAATCTGCTGGGGGGCCCATCTGTGTTTATTTTCCCCCCAAAGATTAAGGACGTCCTCATGATTAGCCTGTCCCCAATCGTGACATGTGTGGTGGTGGATGTTTCTGAGGACGACCCAGACGTACAGATCTCTTGGTTCGTGAACAATGTCGAGGTGCATACAGCCCAGACCCAGACCCATCGGGAAGACTACAACTCTACATTGAGAGTGGTGTCCGCTTTGCCCATCCAGCATCAGGACTGGATGTCCGGCAAGGAGTTTAAATGTAAGGTCAACAACAAGGACCTGCCCGCTCCAATAGAGAGAACTATCTCAAAGCCTAAAGGTAGTGTTCGAGCCCCCCAGGTATACGTACTGCCACCCCCTGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACACTGACCTGCATGGTGACAGACTTCATGCCAGAAGACATTTATGTCGAATGGACTAATAATGGCAAGACCGAACTGAATTATAAAAATACCGAACCAGTGCTGGACTCCGACGGGTCCTATTTCATGTACTCTAAGCTCCGTGTCGAAAAGAAGAACTGGGTGGAACGAAACTCTTACTCCTGCAGTGTTGTGCACGAGGGGCTTCACAACCATCATACAACCAAGTCCTTCTCCAGGACACCTGGGAAG（SEQ ID NO: 12）。
編碼所述抗體或抗原結合片段的輕鏈的基因具有如下所示的核苷酸序列： CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGAGCTGATGCTGCCCCCACTGTCTCTATTTTTCCTCCTAGTAGTGAGCAGCTGACATCTGGAGGCGCCTCCGTGGTGTGCTTCCTGAATAACTTTTACCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGGAGTGAGAGGCAGAATGGCGTACTGAATTCCTGGACTGATCAGGACTCTAAAGATAGCACCTATAGCATGTCCTCCACCCTCACACTGACAAAGGACGAATACGAACGGCATAACTCCTATACATGTGAGGCTACCCACAAGACATCCACCTCACCAATCGTCAAGAGCTTCAACCGGAATGAGTGT （SEQ ID NO: 13）。
需要說明的是，對於本發明說明書和發明申請專利範圍中所提及的核酸，本發明所屬技術領域具有通常知識者應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和發明申請專利範圍中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。另外，本申請中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種，意味著另一種也被公開。
在本發明的另一方面，本發明提出了一種重組載體或轉化子，含有前面所述的核酸。所述重組載體可包括可選的控制序列，所述控制序列與所述核酸分子可操作地連接。其中，所述控制序列為可指導所述核酸分子在宿主中表達的一個或多個控制序列。本發明實施例所提出的重組載體可在適合的宿主細胞中高效表達所述抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
重組載體可以指克隆載體，也可以指表達載體，可以通過將所述核酸與商購的載體（如質粒或病毒載體）可操作地連接而獲得，本發明中的重組載體不受特別限制，常用的質粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本發明的又一方面，本發明提出了一種重組細胞，所述重組細胞攜帶前面所述的核酸、重組載體或轉化子、或抗體或抗原結合片段。所述重組細胞是通過轉染或者轉化所述表達載體獲得的。根據本發明的實施例，所述重組細胞在合適條件下可高效表達上述抗體，所述抗體能夠有效與MICA和/或MICB的α3結構域進行結合，進一步地，所述抗體或抗原結合片段具有良好的預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病的效果，如促進NK細胞殺傷腫瘤。
需要注意的是，本發明所述重組細胞不受特別限制，可以為原核細胞、真核細胞或噬菌體。所述原核細胞可以為大腸桿菌、枯草桿菌、鏈黴菌或奇異變形菌等。所述真核細胞可以為包括巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母、木黴等真菌，草地粘蟲等昆蟲細胞，煙草等植物細胞，BHK細胞、CHO 細胞、COS 細胞、骨髓瘤細胞等哺乳動物細胞。在一些實施例中，本發明所述重組細胞優選為哺乳動物細胞，包括BHK細胞、CHO細胞、NSO細胞或COS細胞，且不包括動物生殖細胞、受精卵或胚胎幹細胞。
需要說明的是，本申請說明書中所述的「適合條件」，是指適合本申請所述重組抗體表達的條件。本發明所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，適合重組抗體表達的條件包括但不限於合適的轉化或轉染方式、合適的轉化或轉條件、健康的宿主細胞狀態、合適的宿主細胞密度、適宜的細胞培養環境、適宜的細胞培養時間。「適合條件」不受特別限制，本發明所屬技術領域具有通常知識者可根據實驗室的具體環境，優化最適的所述重組抗體表達的條件。
下面將對實施例作具體介紹。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 抗體的製備
本實施例主要包括以下內容： 通過生成針對人MICA的鼠源單株抗體，然後，用純化的重組MICA胞外區Fc融合蛋白（MICA-Fc）（重組MICA胞外區Fc融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示）作為抗原，免疫Balb/c小鼠（9周齡，購自上海萊斯克，體重20g左右）。免疫小鼠使用純化抗原和完全弗氏佐劑進行3次免疫，將免疫後的小鼠進行尾靜脈放血後，通過ELISA、流式細胞術進行檢測，以獲得有抗人MICA免疫球蛋白的小鼠。 EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 23）。
從獲得的含有抗人MICA免疫球蛋白的小鼠中選取抗MICA免疫球蛋白含量最高的小鼠，取出其脾細胞與鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞（ATCC編號CRL-1581）進行融合，製備雜交瘤的具體實驗操作為本領域的常規操作。利用融合後的雜交瘤細胞進行抗體篩選，從而得到鼠單抗。
將候選雜交瘤細胞總數量培養到10 6個，於800rpm條件下離心10分鐘收集細胞，並以Trizol試劑盒（Invitrogen）提取雜交瘤細胞的總RNA；以總RNA為模板，逆轉錄合成cDNA文庫（Invitrogen），又以cDNA為模板PCR擴增雜交瘤細胞中所含抗體所對應的可變區核酸序列。PCR擴增反應中所使用的引物序列與抗體可變區第一框架區或信號肽區和恒定區互補(Larrick，J.W.，et al.，(1990) Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991) BioTechniques，11，152-156)。在50μL反應體系中，分別加入cDNA 2μL，10×PCR緩衝液5μL，上游及下游引物2μL（5μmol），dNTP 2μL，Taq酶 1μL (Takara，Ex Taq)，H 2O 38μL；95℃預變性5min，進入溫度循環，進行PCR擴增。反應條件為：94℃變性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32個循環，然後72℃延長7 min。將擴增產物測序後，得到鼠單抗的重鏈可變區（SEQ ID NO:21）和輕鏈可變區（SEQ ID NO:22）核苷酸序列。鼠單抗的重鏈可變區（SEQ ID NO:7）和輕鏈可變區（SEQ ID NO:8）氨基酸序列。 CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT（SEQ ID NO: 21）。 CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA（SEQ ID NO: 22）。 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 7）。 QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO: 8）。
實施例2 MICA抗體ELISA結合實驗
ELISA實驗被用於檢測實施例1獲得的MICA抗體的結合特性。將上述MICA胞外區Fc融合蛋白（MICA-Fc）包被到96孔板中，抗體加入後信號的強弱用於判斷抗體和MICA的結合特性。
用PBS緩衝液將MICA-Fc融合蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示）稀釋為1μg/mL，以100μL/孔的體積加於96孔板中，於4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩衝液吸掉，用PBST（pH7.2 PBS含0.1% Tween 20）緩衝液洗板6次後，加入200μL/孔PBS/10% BSA，37℃孵育2h進行封閉。移去封閉液，用PBST洗板6次後，採用100μL/孔的PBST/0.05% BSA將待測MICA抗體稀釋至合適濃度，然後，於37℃孵育1h。移去反應體系，用PBST洗板6次後，以100μL/孔用PBST/0.05% BSA稀釋HRP（辣根過氧化物酶）標記的抗鼠抗體二抗（博士德，BA1050），於37℃條件下孵育1h。孵育結束後用PBST洗板6次後，加入80μL/孔TMB（四甲基聯苯胺），於室溫孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸終止反應。用酶標儀在450mm處讀取吸光值。具體的實驗結果如圖1所示，表明本發明的抗體能夠結合MICA。 EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:23）。
實施例3  MICA抗體ELISA結合實驗
ELISA實驗被用於檢測MICA抗體的結合特性。MICA胞外區α3結構域Fc融合蛋白（MICAα3-Fc）包被到96孔板中，抗體加入後信號的強弱用於判斷抗體和MICA的結合特性。
用PBS緩衝液將MICAα3-Fc融合蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示）稀釋為1μg/mL，以100μL/孔的體積加於96孔板中，於4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩衝液吸掉，用PBST（pH7.2 PBS含0.1% Tween 20）緩衝液洗板6次後，加入200μL/孔PBS/10% BSA，37℃孵育2h進行封閉。移去封閉液，用PBST洗板6次後，加入100μL/孔用PBST/0.05% BSA稀釋至合適濃度的待測MICA抗體，37℃孵育1h。移去反應體系，用PBST洗板6次後，以100μL/孔用PBST/0.05% BSA稀釋HRP（辣根過氧化物酶）標記的抗鼠抗體二抗（博士德，BA1050），37℃孵育1h。用PBST洗板6次後，加入80μL/孔TMB（四甲基聯苯胺），於室溫孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸終止反應。用酶標儀在450mm處讀取吸光值。結果（圖2）表明本發明的抗體能夠結合MICAα3結構域。 VLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:24）。
實施例4 CHO-K1過表達細胞構建
HEK293T細胞按照5×10 5細胞/孔鋪六孔板，用不含雙抗的DMEM培養基培養過夜。轉染前棄去培養基，加入1mL新鮮的不含雙抗的DMEM培養基。將含有目的基因的pLVX-EF1a-IRES-puro載體（pLVX-EF1a-IRES-pruo載體的酶切位點EcoRI與BamHI之間分別插入編碼MICA（SEQ ID NO: 25）、MICB（SEQ ID NO: 26）、Rhesus MIC1（SEQ ID NO:27）、Rhesus MICB（SEQ ID NO: 28）的核苷酸序列（蘇州金唯智合成）、pMD2G、psPAX2載體（共3μg）按照2:1:1的比例加入200μL 無血清DMEM培養基中，加入12μg聚醚醯亞胺（PEI，Polysciences有限公司）。混勻後靜置16min，然後將全部液體加入鋪有HEK293T細胞的六孔板中。培養6h後，棄去培養基，加入新鮮的完全DMEM培養基培養。轉染48h後，收細胞培養上清，過0.45μm濾器（Millipore），即為病毒上清。將病毒上清全部加入含有1×10 4CHO-K1細胞的6孔板中，加入終濃度4μg/mL的聚凝胺（Sigma），培養12h。隨後棄盡上清，加入新鮮的完全DMEM培養基。所得細胞即為CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB細胞，分別可以表達MICA（SEQ ID NO: 11）、MICB（SEQ ID NO: 29）、Rhesus MIC1（SEQ ID NO:30）、Rhesus MICB（SEQ ID NO: 31）蛋白。 ATGGGCCTTGGCCCTGTGTTTCTGTTGCTTGCTGGGATTTTTCCATTCGCACCTCCCGGTGCCGCCGCAGAGCCCCACAGCTTGCGGTACAATTTGACCGTGCTGTCCTGGGATGGCAGTGTACAAAGCGGCTTTCTGACCGAGGTTCATCTGGATGGACAACCATTCCTGCGCTGCGACAGACAGAAGTGTCGAGCAAAACCCCAGGGTCAGTGGGCAGAAGATGTACTCGGCAATAAGACATGGGATCGAGAAACAAGAGACCTCACAGGAAATGGTAAAGATCTCCGCATGACCCTTGCACACATTAAGGATCAGAAAGAAGGACTGCACTCCCTCCAGGAGATTCGAGTGTGTGAGATTCACGAGGATAACAGCACAAGAAGCTCACAGCATTTTTATTACGATGGAGAACTGTTTCTCAGCCAAAACCTGGAGACCAAAGAGTGGACTATGCCACAGTCCTCCAGAGCTCAGACCCTGGCTATGAATGTCCGTAATTTTTTGAAAGAGGACGCAATGAAGACCAAGACTCACTACCATGCCATGCACGCCGACTGCCTGCAGGAGTTGAGACGATACCTCAAATCCGGGGTTGTGCTCAGGCGGACAGTGCCCCCAATGGTAAACGTGACTCGGTCTGAAGCTTCTGAAGGAAACATCACAGTCACCTGCAGAGCTAGCGGTTTTTACCCCTGGAACATCACTCTCTCCTGGAGACAGGACGGTGTGTCCCTCAGCCATGATACCCAGCAGTGGGGAGACGTGCTGCCCGATGGCAACGGCACTTATCAGACTTGGGTGGCTACTCGAATTTGTCAAGGAGAGGAGCAGCGATTCACATGTTACATGGAGCACTCCGGGAATCATTCAACTCACCCAGTACCCAGCGGAAAGGTCCTTGTGCTGCAGAGTCATTGGCAGACATTTCACGTATCCGCTGTGGCAGCCGCCGCAATTTTCGTCATCATCATTTTCTATGTTCGCTGTTGTAAAAAAAAGACAAGCGCTGCCGAGGGGCCCGAACTGGTGAGCCTCCAGGTGCTGGACCAACATCCCGTGGGCACCAGCGACCATCGCGATGCCACCCAGCTTGGCTTCCAGCCATTGATGTCAGACCTCGGCAGCACAGGCAGCACTGAGGGCGCT（SEQ ID NO: 25）。 ATGGGATTGGGTAGGGTTTTGCTTTTTCTCGCTGTGGCTTTCCCCTTTGCACCTCCTGCTGCAGCCGCAGAACCCCATAGCCTTAGGTATAACCTGATGGTGCTCAGTCAAGATGAATCCGTGCAGTCCGGATTTCTTGCCGAGGGCCATCTGGATGGACAACCTTTCTTGCGTTACGATAGGCAGAAACGACGAGCTAAACCACAGGGTCAGTGGGCAGAGGACGTGCTGGGAGCTAAGACTTGGGACACCGAGACCGAGGATCTGACTGAGAACGGGCAGGACCTGAGAAGGACTCTGACACACATCAAGGACCAGAAGGGAGGGTTGCACTCCCTGCAGGAAATCCGCGTGTGTGAGATTCACGAGGACTCATCAACCCGAGGCAGTAGGCACTTTTACTACGATGGAGAGCTGTTTCTGAGTCAGAATCTGGAGACACAAGAGAGCACTGTGCCACAGTCATCTCGGGCTCAGACTCTGGCTATGAACGTTACCAATTTCTGGAAAGAAGATGCTATGAAAACAAAGACCCATTATAGAGCTATGCAGGCCGATTGCCTGCAGAAGTTGCAGCGTTATTTGAAGTCTGGTGTTGCTATCAGGCGGACCGTTCCCCCCATGGTGAATGTGACTTGCTCCGAGGTTTCCGAAGGTAACATTACTGTTACCTGTCGAGCTAGCTCCTTCTACCCACGGAACATTACATTGACATGGAGGCAGGATGGCGTTAGTCTGAGCCATAATACTCAGCAGTGGGGAGACGTTCTGCCTGACGGAAATGGCACATACCAGACCTGGGTTGCCACCAGAATCCGACAGGGCGAAGAGCAGAGGTTTACCTGTTATATGGAGCACAGCGGAAATCATGGGACTCATCCCGTGCCTAGTGGGAAGGTGCTCGTTCTCCAGTCTCAGCGCACTGACTTTCCTTACGTGTCTGCCGCTATGCCATGCTTCGTCATCATTATCATCCTCTGTGTGCCATGCTGCAAGAAGAAAACATCTGCAGCCGAGGGGCCTGAACTTGTGTCCCTGCAGGTTCTGGACCAGCACCCTGTTGGCACCGGAGATCACCGAGACGCAGCCCAACTGGGCTTCCAACCTCTGATGAGCGCCACTGGATCTACTGGTTCTACCGAGGGAGCC（SEQ ID NO: 26）。 ATGGGCCCTGGGAGGGTTTTGCTCTTTCTGACCTCTATTTTTCCCTTCGCTAGACCAGGCGCTCCAACAGAGCTCCACAGCTTGCGCTACAACGTGACAGTTCTCAGCAGGGATGGGTCCGTGCAGTCCGATTTCCTCGCTGAGGGCCATCTTGATAGCCAACTCTTCGTCCGCTACGACCGCGAGACACGGCGGGCAAGGCCACAAGGACAGTGGGCCGAGGCTGTGCTGGGCGCAAAAACATGGGACACTGAAACTGGCGATCTCACAGAGAATGGGAAGGACCTGCGGCGTACCCTGACTCACATTGAGGGACAAAAGGGTGGCCTCCACAGCTTGCAGGATATACAGAATTGTGAGATTTACGAGGACGGCTCTACTGGAGGTTCCAGGCATTTTTACTATGATGGGGAGAGATTTCTGTCCCTTAATCTGGCCACTCAGGAGTGGACAGTAGCACAGTCTAGCCGAGCACAGACTCTGGCCATGAACTTCTGGAAGGAAGATACTATGAAAACAAATACACACTACCACGCAATGCAGGCCGATTGCCTGAAAAAGCTGAGACGCTACCAAAAGTCCAGAGTGGCTGTACGACGCACCGCCCCTCCTATGGTGAATGTGACACATTCCGAGGCTAGTGAGGGTAATATTACAGTGACCTGCCGCGCTTCTGGTTTCTACCCCAGAAATATAGCCTTGACCTGGCGACAGGACGGTGTTTCATTGAACCACGACGCCCAGCAGTGGGGCGGCATACTGCCAGACCAGAATGGCACTTACCAGACTTGGGTGGCCACCAGGATTCGGCAGGGCGAGGAACAGCGTTTCGCCTGCTATATGGAGCATAGCGGTAATCACTCTACCCATCCCGTGCCTAGCGGAAAGGTCCTGGTCTTTCAATCTCAGTGGCTGGATATTCCATACGTGCTGGGTGTAGCCGCTGCCGCCGTGGCCGCCGCTGCCGCAATTTTCGTTATTATCCTGTACGTTCTGTGTTGCAAGAAAAAGACTTCAGCCGCCGAAGGCCCCGAGCTCGTGAGTCTGCGCACCCTGGATCAGCACCCCGTTGGTACTGGAGATCACCGTGACGCAACC（SEQ ID NO: 27）。 ATGGGTCTGGGAAGAGTATTGCTGTTTCTGGGTCGAGTCCTGCTGTTTCTCGCCTCCATTTTCTCTTTTACTCGACCTCGAGCCGCTGCTGAGCTGCACTCACTCAGATACAACGTGACCGTCTTGTCTAGAGATGGGTCAGTGCAGAGCGAGTTTTTGGCAGAGGGCCATTTGGATGGTCAGCTCTTTGTGAGGTACGATAGGGAAACACGACGTGCTAGACCTCAGGGACAGTGGGCAGAGGCAGTGTTGGGGGACCAGGAGACAGAGGACTTGACCGAGAACGCACAGGACCTGCGCAGAACACTGACCCACATTGAAGGCCAGAAGGGCGGCCTGCATAGTCTGCAGAAGATAAAAATCTGCGAAATTTATGAGGATGGCTCTACTGGCGGATTTTGGCATTTTTATTACGACGGGGAGCTGTTTCTGTCCCTTAATCTGGAGACACAGAAGTGGACAGTAGCTCAGTCATCCCGCGCTCAAACCCTGGCAATGAATTTCTGGAAGGAGGACACTATGAAAACTAATACACACTATAGAGCCATGAGGGCCGATTGCTTGAAAAAACTGTGGAGATACCAGAAGTCTCGGGTTGCTGTGAGAAGGACAGTTCCCCCTATGGTGAATGTCACTCATGGGGAGGCCTCTGAGGGCAACATAACAGTCACATGCAGGGCTTCAGGCTTTTACCCTGGAAACATCACTCTGACTTGGAGACAAGATGGCGTGTCCCTGAGTCACGACGCACAACAGTGGGGCGACGTCCTGCCTGATTGGAATGGCACCTATCAGACATGGGTCGCCACAAGAATCCGACAGGGAGAGGAACAGCGTTTTGCCTGTTACATGGAGCATAGCGGCAATCATTCCACACATCCTGTGCCTTCTGGCAAGCCACCAGTGCTCCAGTCCGAACGGTTGAATCTGCTGTATGTCCCCGTAGCAGTGGCTGTTGCTGTTGTCACTGCCTTTATCATTATCTGCGTTCACCGATGTAAAAAGAAAAAAACATCAGCTGCCGAGGGCCCAGAGTTGGTATCCCTCAGAACTCTTGACCAACACCCTGTCGGAACTGGGGATCATAGAGATGCTACCCAGCTGGGATTCCAGCCTCTCATGAGCGCTCCAGGGTCCACCGGATCAACTGAAGGGGCC（SEQ ID NO: 28）。 MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA（SEQ ID NO: 11）。 MGLGRVLLFLAVAFPFAPPAAAAEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTDFPYVSAAMPCFVIIIILCVPCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTGDHRDAAQLGFQPLMSATGSTGSTEGA（SEQ ID NO: 29）。 MGPGRVLLFLTSIFPFARPGAPTELHSLRYNVTVLSRDGSVQSDFLAEGHLDSQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGAKTWDTETGDLTENGKDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQDIQNCEIYEDGSTGGSRHFYYDGERFLSLNLATQEWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYHAMQADCLKKLRRYQKSRVAVRRTAPPMVNVTHSEASEGNITVTCRASGFYPRNIALTWRQDGVSLNHDAQQWGGILPDQNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVFQSQWLDIPYVLGVAAAAVAAAAAIFVIILYVLCCKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDAT（SEQ ID NO: 30）。 MGLGRVLLFLGRVLLFLASIFSFTRPRAAAELHSLRYNVTVLSRDGSVQSEFLAEGHLDGQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGDQETEDLTENAQDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQKIKICEIYEDGSTGGFWHFYYDGELFLSLNLETQKWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYRAMRADCLKKLWRYQKSRVAVRRTVPPMVNVTHGEASEGNITVTCRASGFYPGNITLTWRQDGVSLSHDAQQWGDVLPDWNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKPPVLQSERLNLLYVPVAVAVAVVTAFIIICVHRCKKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDATQLGFQPLMSAPGSTGSTEGA（SEQ ID NO: 31）。
實施例5 MICA抗體流式細胞術結合實驗
流式細胞術實驗被用於檢測MICA抗體的結合特性，於實施例4中獲得的CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB細胞中分別加入實施例1製備的MICA抗體（編號為5A1）以及對照組抗體小鼠IgG1（Biolegend，MG1-45），抗體加入後信號的強弱用於判斷抗體和MICA、MICB、Rhesus MIC1、Rhesus MICB蛋白的結合特性。
用PBS將CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB細胞稀釋為2×10 6/mL，以100μL/管的體積加於1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，於4℃封閉30min。加入不同濃度（10 -4、10 -3、10 -2、10 -1、10 0、10 1μg/mL）的MICA抗體，於4℃條件下孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，於4℃、3500rpm條件下離心5min，棄盡上清，將沉澱再用PBS洗一遍。離心後棄盡上清，用100μL/管PBS重懸含有細胞的沉澱，向其中加入0.1μL/管Alexa-647標記的山羊抗小鼠抗體二抗（Biolegend，405322），於4℃、避光條件下孵育30min。用PBS洗兩遍，離心後棄盡上清。用200μL/管PBS重懸含有細胞的沉澱，用流式細胞儀進行檢測，結果如圖3、4、5、6所示，進一步顯示本發明的該抗體能夠結合MICA、MICB、Rhesus MIC1和Rhesus MICB蛋白。
實施例6 MICA抗體流式細胞術結合腫瘤細胞實驗
流式細胞術實驗被用於檢測MICA抗體結合腫瘤細胞的特性，於肺癌NCI-H1299細胞中分別加入MICA抗體（編號為5A1）以及對照組小鼠抗體IgG1（Biolegend，MG1-45），抗體加入後信號的強弱用於判斷抗體和腫瘤細胞的結合特性。
用PBS將NCI-H1299細胞稀釋為2×10 6/mL，以100μL/管的體積加於1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，於4℃封閉30min。加入不同濃度（10 -7、10 -6、10 -5、10 -4、10 -3、10 -2、10 -1、10 0、10 1、10 2μg/mL）的MICA抗體、對照組抗體IgG1，於4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，於4℃、3500rpm條件下離心5min，棄盡上清，所得沉澱再用PBS洗一遍，再次離心後棄盡上清，用100μL/管PBS重懸含有細胞的沉澱，向其中加入0.1μL/管Alexa-647標記的山羊抗小鼠抗體二抗（Biolegend，405322），於4℃、避光條件下孵育30min。用PBS洗兩遍，離心後棄盡上清。用200μL/管PBS重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測，結果如圖7、8、9所示，進一步顯示本發明的該抗體能夠結合黑色素瘤A375細胞、肺癌NCI-H1299細胞、人紅白血病K562細胞。
實施例7 MICA抗體的抗原表位特性判斷
Western blot實驗被用於判斷MICA抗體的抗原表位特性。
將實施例4中構建的CHO-K1-MICA、CHO-K1細胞，用PBS洗兩遍。然後加入RIPA裂解液，於冰上裂解15min，4℃、15000g條件下離心5min，收集上清。利用BCA試劑盒對裂解上清進行蛋白定量。然後用SDS-PAGE loading buffer配製樣品，加樣量為50ug/孔。電泳後轉膜到硝酸纖維素膜，利用5%脫脂奶粉室溫封閉1h。然後加入1:2000（w/v）稀釋的MICA抗體，4℃孵育過夜。利用1‰PBST洗膜5min×6次，然後加入1:5000（v/v）稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h。利用1‰PBST洗膜5min×6次。利用ECL底物顯影，檢測化學發光。結果如圖8所示，進一步顯示本發明的該抗體能夠結合MICA蛋白線性表位。
實施例8 抗體促進MICA結合NKG2D能力的篩選
MICA抗體是通過和MICA胞外區的結合，從而促進MICA和其受體NKG2D的信號通路，本實施例通過流式細胞術實驗檢測MICA抗體對MICA與其受體NKG2D結合的影響。
用PBS將實施例4獲得的CHO-K1-MICA細胞稀釋為2×10 6個/mL，以100μL/管的體積加於1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管小鼠血清，於4℃封閉30min。加入一系列稀釋梯度（10 -4、10 -3、10 -2、10 -1、10 0、10 1μg/mL）的MICA抗體（編號為5A1）以及對照組抗體IgG1（Biolegend，MG1-45），於4℃孵育30min。加入2μg/管NKG2D胞外區Fc融合蛋白（NKG2D-Fc，SEQ ID NO:32，本實驗室表達獲得），4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，於4℃、3500rpm條件下離心5min，棄盡上清，再用PBS洗一遍。離心後棄盡上清，用100μL/管PBS重懸細胞，向其中加入1μL/管647標記的小鼠抗人抗體二抗（Biolegend，HP6017），4℃、避光條件下孵育30min。用PBS洗兩遍，離心後棄盡上清。用200μL/管PBS重懸細胞，用流式細胞 儀進行檢測，結果如11所示，可以看出，本發明的抗體能夠促進MICA與受體NKG2D的結合。 IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:32）。
實施例9 MICA抗體促進NK92細胞抗腫瘤
本實施例為體外殺傷實驗，用於檢測MICA抗體對NK92細胞（ATCC編號CRL-2407）殺傷腫瘤細胞的影響。共設置2組，其中，使用的腫瘤細胞為黑色素瘤A375細胞（ATCC編號CRL-1619），具體實驗操作如下： （1）A375腫瘤細胞用無血清DMEM培養基洗兩遍，於4℃、200g條件下離心5min，棄盡上清；用1mL無血清DMEM培養基重懸獲得的沉澱，加入終濃度5μM CTV，於37℃孵育30min。 （2）孵育結束後，向培養體系中加入200μL預冷的胎牛血清終止標記，4℃、200g條件下離心5min，棄盡上清；用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養基洗細胞沉澱兩遍，棄盡上清；用完全RPMI-1640培養基重懸沉澱，進行細胞計數，並用完全RPMI-1640培養基稀釋為1.25×10 5個/mL。 （3）用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養基將NK92細胞稀釋為一系列濃度（2×10 5個/mL、4×10 5個/mL、8×10 5個/mL、1.6×10 6個/mL）。 （4）將稀釋後的PBMC（NK92）以100μL/孔的體積加入96孔圓底板中。 （5）用完全RPMI-1640培養基稀釋MICA抗體(5A1)或對照鼠IgG為50μg/mL，以20μL/孔的體積將稀釋後的MICA抗體或鼠IgG加入96孔圓底板中。 （6）將稀釋後的腫瘤細胞以80μL/孔的體積加入96孔圓底板中。 （7）將步驟（6）獲得的96孔圓底板於4℃、1500rpm條件下離心1min，離心後的96孔板於37℃孵育4h。 （8）以1μL/孔的體積向96孔圓底板中加入7-AAD（BD，559925），混勻。將孔中所有液體轉入流式管，利用流式細胞儀進行檢測，具體實驗結果如圖12所示，可以看出，本發明的抗體能夠促進NK92細胞殺傷腫瘤。
實施例10：MICA抗體ELISA結合實驗
本實施例通過ELISA檢測MICA抗體和MICA、MICB的α3結構域的結合特性。發明人將獲得的多種MICA、MICB變體胞外區α3結構域（MICAα3*-002、004、005、008，MICBα3*-005）Fc融合蛋白（MICAα3-Fc、MICBα3-Fc），以及對照組抗體IgG包被到96孔板中，抗體加入後信號的強弱用於判斷抗體和MICA、MICB的結合特性。
用PBS緩衝液將融合蛋白（MICA*002α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；MICA*004α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示；MICA*005α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；MICA*008α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；MICB*005α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示）稀釋為1μg/ml，以100μL/孔的體積加於96孔板中，於4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩衝液吸掉，用PBST（pH7.2 PBS含0.1% Tween 20）緩衝液洗板6次後，加入200μL/孔PBS/10% BSA，37℃孵育2h進行封閉。移去封閉液，用PBST洗板6次後，加入100μL/孔用PBST/0.05% BSA稀釋至合適濃度（10 -7、10 -6、10 -5、10 -4、10 -3、10 -2、10 -1、10 0、10 1、10 2μg/mL）的待測MICA抗體，37℃孵育1h。移去反應體系，用PBST洗板6次後，以100μL/孔用PBST/0.05% BSA稀釋HRP（辣根過氧化物酶）標記的抗鼠抗體二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板6次後，加入80μL/孔TMB（四甲基聯苯胺），於室溫孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸終止反應。用酶標儀在450mm處讀取吸光值。結果如圖13、14、15、16、17，表明本發明的抗體能夠結合MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*008、MICB*005。 RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:33）。 RRVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:34）。 RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:35）。 RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNIILTWRQDGVSLSHDTQQWGGVLPDGNGTYQTWVATRICRGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:36）。 RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLALQSQWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:37）。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、 「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本發明所屬技術領域具有通常知識者在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
無
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中： 圖1為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合人MICA的ELISA結果圖； 圖2為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICA α3結構域的ELISA結果圖； 圖3為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合CHO-K1-MICA結果圖； 圖4為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合CHO-K1-MICB結果圖； 圖5為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合CHO-K1-Rhesus MIC1結果圖； 圖6為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合CHO-K1-Rhesus MICB結果圖； 圖7為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合黑色素瘤A375細胞結果圖； 圖8為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合肺癌NCI-H1299細胞結果圖； 圖9為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合K562細胞結果圖； 圖10為根據本發明具體實施方式的MICA抗體用於Western blot檢測的結果圖； 圖11為根據本發明具體實施方式的MICA抗體促進NKG2D-Fc結合CHO-K1-MICA細胞的結果圖； 圖12為根據本發明具體實施方式的MICA抗體促進NK92細胞殺傷A375細胞的結果圖； 圖13為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICAα3*002變體的結果圖； 圖14為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICAα3*004變體的結果圖； 圖15為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICAα3*005變體的結果圖； 圖16為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICAα3*008變體的結果圖；以及 圖17為根據本發明具體實施方式的MICA抗體結合MICBα3*005變體的結果圖。
Figure 111148246-A0305-02-0044-1
Figure 111148246-A0305-02-0045-2
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Claims (14)

  1. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段與MICA和/或MICB結合，其中含有如下序列所示的CDR序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO：1~3；和輕鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO：4~6。
  2. 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段，包括：重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；和所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
  3. 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段，包括：重鏈和輕鏈，所述重鏈的胺基酸序列如包含SEQ ID NO：9所示，所述輕鏈的胺基酸序列如包含SEQ ID NO：10所示。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體為單株抗體、鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人源抗體、Fv、單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab’，Fab’-SH或F(ab’)2。
  5. 如請求項1-3任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段能夠結合SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列中的至少一部分。
  6. 一種免疫綴合物，包括治療劑以及請求項1-5中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中，所述抗體或抗原結合片段與治療劑偶聯。
  7. 一種組合物，其中該組合物含有請求項1-5中任一項所述的抗體或抗原結合片段和/或請求項6所述的免疫綴合物。
  8. 一種用於檢測MICA和/或MICB的試劑盒，其中所述試劑盒含有請求項1-5中任意一項所述的抗體或抗原結合片段。
  9. 請求項1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒的中的用途，所述試劑盒用於檢測MICA和/或MICB。
  10. 一種藥物，包括：請求項1-5中任一項所述的抗體或抗原結合片段和/或請求項6所述的免疫綴合物和/或請求項7所述的組合物。
  11. 請求項1-5中任一項所述的抗體或抗原結合片段和/或請求項6所述的免疫綴合物和/或請求項7所述的組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防和/或治療MICA和/或MICB介導的疾病；任選地，所述MICA和/或MICB介導的疾病為癌症或移植排斥、自身免疫病、感染性疾病；任選地，所述癌症為肺癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，皮膚癌，膀胱癌，結腸癌，乳腺癌，神經膠質瘤，腎癌，胃癌，食道癌，口腔鱗狀細胞癌和頭頸癌中的至少一種。
  12. 一種核酸，包含編碼請求項1-5中任一項所述的抗體或抗原結合片段的序列；任選地，所述核酸的胺基酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示。
  13. 一種重組載體或轉化子，其中含有請求項12所述的核酸。
  14. 一種重組細胞，其中所述重組細胞攜帶請求項12所述的核酸、請求項13所述的表達載體或轉化子、或請求項1-5任一項所述的抗體或抗原結合片段。
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