KR20240024240A - 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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즈강 텐
구슈아이 카오
웨이후아 지안
루이 선
하오이 선
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허페이 티지 이뮤노파마 컴퍼니 리미티드
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Abstract

항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용이 제공되며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 1~3으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 CDR 서열 및 SEQ ID NO: 4~6으로 표시되는 경쇄 가변 영역의 CDR 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 CDR 서열을 포함한다. 상기 항체는 MICA 또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 치료 또는 에방할 수 있고, NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진한다.

Description

항체 및 이의 응용
우선권정보
본원 발명은 2021년 12월 28일자로 중국 국가지식재산권국에 제출한 특허 출원 번호가 202111629693.7인 특허 출원의 우선권 및 권리를 주장하는 바, 그 전체 내용은 참조로서 여기에 포함된다.
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것으로, 구체적으로 항체 및 이의 응용에 관한 것이고, 보다 구체적으로 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, MICA 및/또는 MICB 검출용 키트, 키트의 제조에 있어서 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 용도, 약물, 약물의 제조에 있어서 상기 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 면역 접합체 및/또는 조성물의 용도, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체에 관한 것이다.
NKG2D는 NK 세포에서 동종이량체를 형성하고 4개의 DAP10 분자와 육량체를 형성한다. MICA, MICB와 같은 리간드를 결합한 후, NKG2D 육량체는 NK 세포 내에 활성화 신호를 전달하고, NK 세포가 IFN-γ와 같은 사이토카인을 분비하도록 촉진하며, 리간드를 발현하는 표적 세포를 살상시킨다. MICA, MICB는 자가 유전자에 의해 코딩되는 단백질로 정상 조직, 세포에서는 발현되지 않으며; 세포가 종양 세포로 악성화된 후, MICA, MICB는 종양 세포 표면에 발현된다. NK 세포는 NKG2D-MICA/B 상호 작용을 통해 종양을 인식하고 살상한다.
종양은 매트릭스 메탈로프로테이나제 매개 MICA/B 탈락을 비롯한 다양한 메커니즘을 통해 세포 표면에서 MICA/B 발현을 하향 조절한다. MICA/B는 I형 막 관통 단백질로, 이의 세포외 도메인은 α1, α2, α3 이 3개 도메인을 포함하며, α1, α2 도메인을 통해 NKG2D에 결합한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 작용 하에, MICA/B의 세포외 도메인의 대부분 아미노산(α1, α2 도메인 및 α3 도메인의 일부 포함)은 종양 세포 표면으로부터 탈락된다. NKG2D는 세포 표면에 남아 있는 α3 도메인의 일부와 결합할 수 없으므로 종양이 NK 세포의 면역 감시를 벗어날 수 있게 된다.
연구에 따르면, α3 도메인에 결합하는 MICA 항체는 MICA가 종양 표면으로부터 탈락되는 것을 억제하여 NKG2D-MICA/B 매개 NK 세포 인식을 촉진하고, 종양 면역 탈출을 억제할 수 있으므로, α3 도메인에 결합할 수 있는 MICA 항체의 개발은 종양 치료에 중요한 가치가 있다.
본원 발명은 아래 사실 및 문제점에 대한 발명자의 발견 및 인식에 기반한 것이다.
MICA, MICB는 종양 세포에서만 발현되므로, MICA, MICB를 표적으로 하는 특이성 항체의 제조는 종양 치료를 위한 잠재적인 수단이다. 발명자는 MICA 세포외 영역 Fc 융합 단백질(MICA-Fc)을 항원으로 사용하여 마우스를 면역시킨 후, 다중 스크리닝을 통해 항-인간 MICA 및 MICB 면역 글로불린을 포함하는 마우스를 얻고, 계속해서 서브 클로닝 스크리닝을 수행하여 타깃 항체를 얻었으며, 검출 결과, 상기 항체는 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB와 NK 세포 활성화 수용체 NKG2D의 결합을 촉진하며, NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 단편을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~3; 경쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 4~6 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
GFSLTTYG(SEQ ID NO: 1).
IWTDGTT(SEQ ID NO: 2).
VRKGHGYYYAMDY(SEQ ID NO: 3).
SSVSSSY(SEQ ID NO: 4).
STS(SEQ ID NO: 5).
HQYHRSPFT(SEQ ID NO: 6).
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 면역 접합체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB 단백질의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 항체 및/또는 제2 양태에 따른 면역 접합체를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체 모두 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 물질을 포함하는 조성물은 동일한 효과를 가지며, 더 나아가, 상기 조성물은 MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 효과적으로 촉진할 수 있고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB 검출용 키트를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트는 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB 검출용 키트의 제조에 사용될 수 있으며, 상기 키트는 MICA 및/또는 MICB를 효과적으로 검출할 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플 내 MICA 및/또는 MICB 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학 연구에 사용할 수 있어, 요구사항을 충족하는 생물학적 샘플을 얻어 다음 단계 연구를 수행하며, 상기 생물학적 샘플은 동물 조직, 혈액, 혈청, 세포 등을 포함한다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 키트의 제조에 있어서 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트는 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB 검출용 키트의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 약물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 제2 양태에 따른 면역 접합체 및/또는 제3 양태에 따른 조성물을 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물에는 모두 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있는 물질이 존재하므로, 상기 물질을 포함하는 약물은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하며, 상기 약물은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료에 현저한 효과가 있다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 제2 양태에 따른 면역 접합체 및/또는 제3 양태에 따른 조성물의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약물은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물에는 모두 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있는 물질이 존재하므로, 상기 물질을 포함하는 약물은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하며, 상기 약물은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료에 현저한 효과가 있다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산은 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산으로 코딩된 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 핵산으로 코딩된 단백질은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 재조합 벡터 또는 형질전환체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제8 양태에 따른 핵산을 포함한다. 상기 발현 벡터는 선택적인 제어 서열을 포함할 수 있고, 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 실시예에서 제안된 재조합 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 고효율적으로 발현할 수 있고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 제8 양태에 따른 핵산, 제9 양태에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체를 운반하거나, 제1 양태에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 발현한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환시켜 얻는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적합한 조건에서 상기 항체를 고효율적으로 발현할 수 있고, 상기 항체 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으며, 나아가, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 제11 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 약물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질은 모두 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 제12 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 면역 접합체; 3) 전술한 조성물; 4) 전술한 약물; 5) 전술한 핵산; 6) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 7) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 물질은 모두 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따른 방법은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 제13 양태에서, 본 발명은 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포 중 적어도 하나를 사용하여 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 단계; 및 상기 MICA 및/또는 MICB의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량을 결정하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, MICA 및/또는 MICB는 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 MICA 및/또는 MICB의 수준에 따라 상기 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 이 밖에, 상기 물질을 이용하여 피험자의 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량을 모니터링할 수도 있는 바, 즉 상기 물질은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는 피험자에 대한 병기 분류에 사용될 수도 있고, MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예후 평가에 사용될 수도 있다.
본 발명의 제14 양태에서, 본 발명은 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, MICA 및/또는 MICB는 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 MICA 및/또는 MICB의 수준에 따라 상기 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 추가 양태 및 이점은 하기 설명에서 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 하기 설명으로부터 자명하거나 본 발명의 실천을 통해 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 및/또는 부가 양태 및 이점은 하기 도면과 함께 실시예의 설명으로부터 명백하고 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 여기서,
도 1은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 인간 MICA에 결합된 ELISA 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICA α3 도메인에 결합된 ELISA 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 CHO-K1-MICA에 결합된 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 CHO-K1-MICB에 결합된 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 CHO-K1-Rhesus MIC1에 결합된 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 CHO-K1-Rhesus MICB에 결합된 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 흑색종 A375 세포에 결합된 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 폐암 NCI-H1299에 결합된 세포 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 K562에 결합된 세포 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 Western blot를 검출하는 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 CHO-K1-MICA 세포에 대한 NKG2D-Fc의 결합을 촉진함을 보여주는 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 NK92 세포에 의한 A375 세포 살상을 촉진함을 보여주는 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICAα3*002 변이체에 결합된 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICAα3*004 변이체에 결합된 결과 그래프이다.
도 15는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICAα3*005 변이체에 결합된 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICAα3*008 변이체에 결합된 결과 그래프이다.
도 17은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 MICA 항체가 MICBα3*005 변이체에 결합된 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하며, 상기 실시예의 예시는 도면에 도시된다. 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐, 본 발명에 대한 한정으로 이해해서는 안된다.
이 밖에, 용어 "제 1", "제 2"는 단지 설명의 목적을 위한 것일 뿐, 상대적인 중요성을 시사 또는 암시하거나 또는 시사하는 기술적 특징의 수를 암시적으로 나타내는 것으로 이해해서는 안된다는 점에 유의해야 한다. 따라서, "제 1", "제 2"로 한정된 특징은 명시적 또는 암시적으로 하나 이상의 해당 특징을 포함할 수 있다. 본 발명의 설명에 있어서, 별도의 설명이 없는 한, "복수"는 2개, 3개 등 2 개 이상을 의미한다.
본 명세서에 개시된 범위의 종점과 임의의 값은 상기 정확한 범위 또는 값에 한정되지 않으며, 이러한 범위 또는 값은 이러한 범위 또는 값에 근접한 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 범위의 경우, 각 범위의 종점 값 사이, 각 범위의 종점 값과 개별 포인트 값 사이, 및 개별 포인트 값 사이를 서로 조합하여 하나 이상의 새로운 수치 범위를 얻을 수 있으며, 이러한 수치 범위는 본 명세서에 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 일부 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본 문서의 다른 곳에서 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 아미노산 잔기의 약어는 당업계에서 사용되는 20개의 L-아미노산 중 하나를 지칭하는 표준 3 문자 및/또는 1 문자 코드이다.
본 명세서에서, 가변 영역 중 일부 영역의 아미노산 구성 및 배열 순서는 초가변 영역(Hypervariable region, HVR)이라 불리는 더 높은 변화 정도를 가지는데, 초가변 영역은 항원과 항체가 결합하는 위치이므로, 클러스터 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)으로도 불린다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에는 모두 3개의 CDR 영역이 있다.
본 명세서에서, "항체"는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 항체는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만 포함할 수 있거나, 기능에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-B7H6 항체를 포함한다. 일부 적용에서, 원치 않는 글리코실화 부위 또는 올리고당 사슬 상에 푸코스가 존재하지 않는 부분을 제거하기 위해 항체를 변형시키는 것은 예를 들어 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 기능을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 다른 일부 적용에서, 보체 의존성 세포 독성(CDC)을 변경하기 위해 갈락토실화 변형을 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 특히 Fv, scFv(sc는 단일 사슬을 의미함), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디(diabody)와 같은 항체 단편을 의미하거나, 또는 화학적으로 변형되거나 리포좀에 혼입되어 반감기를 증가시킬 수 있는 임의의 단편을 의미하며, 상기 화학적 변형은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜("페길화, PEG화")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG로 명명된 페길화 단편)("PEG"는 폴리에틸렌 글리콜임)과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 첨가이고, 상기 단편은 B7H6 결합 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 기능성 단편은 이들이 유래된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 부분 서열로 구성되거나 이를 포함하고, 상기 부분 서열은 이들이 유래된 항체와 동일한 결합 특이성 및 충분한 친화력을 유지하기에 충분하며, B7H6의 경우, 바람직하게는 이들이 유래된 항체의 친화력의 1/100, 보다 바람직하게는 1/10과 적어도 동일하다. 이러한 기능 단편은 최소 5개의 아미노산, 바람직하게는 이들이 유래된 항체 서열의 10, 15, 25, 50 및 100개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.
본 명세서에서, 항체의 생물학적 수용성을 더욱 향상시키기 위해, 항체는 인간화될 수도 있는데, 즉, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 한 종(예: 마우스)으로부터의 단일 클론 항체의 불변 영역 아미노산 서열을 다른 종(예: 인간)으로부터의 항체의 불변 영역으로 대체하여 얻은 재조합 항체를 의미한다. 용어 "인간화 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 한 종(예: 마우스)으로부터의 단일 클론 항체의 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR(Fv 프레임워크 영역(FR)) 아미노산 서열을 전부 다른 종(예: 인간)으로부터의 항체의 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR 아미노산 서열로 대체하여 얻은 재조합 항체를 의미한다. 즉, 하나의 항체의 불변 영역이 인간화되면 키메라 항체라 하고, 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR 아미노산 서열을 전부 인간화한 후 인간화 항체라 한다. 인간화 방법은 종래의 항체 공정 기술을 참조하여 수행할 수 있으며, 여기서 더 이상 설명하지 않는다.
상동성의 경우, 본 발명은 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해, [제1 서열에서 상응한 위치의 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드의 수로 나누어] 제1 서열 및 제2 서열 사이의 "서열 상동성"의 백분율을 계산할 수 있다. [두번째 서열 내 뉴클레오티드]에서 [첫번째 서열 내 뉴클레오티드의 총 수]를 –A 후 [100%]를 곱하되, 여기서 제1뉴클레오티드 서열에 대한 두번째 뉴클레오티드 서열 내 각 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환 또는 추가는 단일 뉴클레오티드(위치)의 차이로 간주된다.
또는, 서열 정렬을 위한 공지된 컴퓨터 알고리즘을 사용하는 표준 설정, 예를 들어 NCBI Blast v2.0을 사용하여 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도를 계산할 수 있다.
서열 동일성 정도를 결정하기 위한 일부 다른 기술, 컴퓨터 알고리즘 및 그 설정은 WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 및 GB 2357768-A에 기재된 바와 같다.
폴리펩티드와 관련하여 용어 "(실질적) 상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교될 때(뉴클레오티드가 그 중에 적절히 삽입 또는 결실됨) 적어도 약 80%의 아미노산, 일반적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산이 동일함을 나타낸다.
두 가닥의 서열 사이의 동일성 %는 서열이 최적으로 정렬될 때 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 따라 변하며(즉 상동성 %＝동일한 위치의 수/위치의 총 수×100), 여기서 최적의 정렬은 두 가닥의 서열의 최적 정렬을 달성하기 위해 도입해야 하는 빈자리 수 및 각 빈자리의 길이에 따라 결정된다. 두 가닥의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 측정은 하기 비제한적 실시예에서 설명된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
항체 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 전제 하에(적어도 95% 활성을 유지함), 당업자는 본 발명의 서열에 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 또는 그 이상)의 아미노산을 교체, 추가 및/또는 삭제하여 상기 항체 또는 이의 기능성 단편의 서열 변이체를 얻을 수 있다. 이들은 본 발명의 보호 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어 가변 영역에서 유사한 성질을 갖는 아미노산을 대체한다. 본 발명에 따른 변이체의 서열은 참조 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성(또는 상동성)을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN을 사용할 수 있다. 본 발명에 언급된 아미노산 서열은 모두 N-말단 내지 C-말단 방식으로 표시된다.
본 명세서에서, "보존적 변형 형태의 아미노산 서열"은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하며, 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 그 중 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기 패밀리가 당업계에서 확인되었다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄가 있는 아미노산(예: 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있고, 여기에 설명된 기능 측정 방법을 사용하여 변경된 항체의 유지 기능을 테스트할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형의 수는 1개 또는 2개를 초과하지 않는다.
본 명세서에서 "작동 가능하게 연결"은 외인성 유전자를 벡터에 연결하여 전사 제어 서열 및 번역 제어 서열 등과 같은 벡터의 제어 소자가 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 데 의도된 역할을 할 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 단편을 제안하며, 이는 중쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~3 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열; 경쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 4~6 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열; 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 1~6으로 표시되는 임의의 아미노산 서열은 보존적 변형 후 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 특성에 현저한 영향을 미치거나 변화시키지 않으므로, 본 발명의 실시예에 따른 SEQ ID NO: 1~6 중 적어도 하나 및/또는 SEQ ID NO: 1~6으로 표시되는 아미노산 서열은 보존적 변형 후 얻은 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 관련 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
GFSLTTYG(SEQ ID NO: 1).
IWTDGTT(SEQ ID NO: 2).
VRKGHGYYYAMDY(SEQ ID NO: 3).
SSVSSSY(SEQ ID NO: 4).
STS(SEQ ID NO: 5).
HQYHRSPFT(SEQ ID NO: 6).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역 CDR을 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 15~17로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 갖는다.
GGGTTTTCACTGACAACTTACGGC(SEQ ID NO: 15).
ATTTGGACTGATGGGACCACA(SEQ ID NO: 16).
GTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTAT(SEQ ID NO: 17).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 경쇄 가변 영역 CDR을 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 18~20으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 갖는다.
AGCAGCGTGTCCAGCTCCTAC(SEQ ID NO: 18).
TCCACCTCC(SEQ ID NO: 19).
CATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACT(SEQ ID NO: 20).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, (i) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 및/또는, (ii) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 7).
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO: 8).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 21로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT(SEQ ID NO: 21).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO: 22).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역은 (i)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 (ii)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, Fc 영역을 추가로 포함하고, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린 항체, 인간 항체, 영장류 항체 또는 이의 돌연변이체 중 적어도 하나로부터 유래되며;
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린, 인간, 영장류 IgG항체 또는 이들의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린 IgG2A 항체, 인간, 영장류 IgG1항체 또는 이들의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린 IgG2A 항체 또는 이의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO:14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO: 14).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO: 9).
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO: 10).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 여기서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 여기서, 상기 항체는 단일 클론 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2이다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA(SEQ ID NO: 11).
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 면역 접합체를 제안하며, 이는 치료제 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 치료제에 커플링된다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB 단백질의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 치료제와 커플링시킨 후 얻어진 면역 접합체는 마찬가지로 상기 기능을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 전술한 면역 접합체를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체 모두 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 물질을 포함하는 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물과 같은 동일한 효과를 가지며, 더 나아가, 상기 조성물은 MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 효과적으로 촉진할 수 있고, NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 벡터를 추가로 포함한다.
상기 조성물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 함께 작용할 수 있는 한, 시간적 및/또는 공간적으로 분리된 조합을 포함함에 유의해야 한다. 예를 들어, 상기 조성물에 함유된 성분은 피험자에게 전체적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 상기 조성물에 함유된 성분이 피험자에게 개별적으로 투여되는 경우, 각 성분은 동시에 또는 순차적으로 피험자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB 검출용 키트를 제공하며, 여기서, 상기 키트는 전술한 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB 검출용 키트의 제조에 사용될 수 있으며, 상기 키트는 MICA 및/또는 MICB를 효과적으로 검출할 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플 내 MICA 및/또는 MICB 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학 연구에 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로, MICA 및/또는 MICB 단백질과 그 항체 특이성 결합 성능을 이용하는 면역 블롯팅, 면역 침전 등으로 검출하는 키트에 사용할 수 있다. 이러한 키트는 길항제, MICA 및/또는 MICB항체 또는 약물 기준 물질; 단백질 정제 컬럼; 면역 글로불린 친화 정제 완충액; 세포 측정 희석제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. MICA 및/또는 MICB항체는 상이한 유형의 진단 테스트에 사용될 수 있는데, 예를 들어 생체 외 또는 생체 내에서 다양한 질환 또는 약물, 독소 또는 다른 단백질 등의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어 피험자의 혈청 또는 혈액을 검출하여 MICA 및/또는 MICB 관련 질환을 테스트할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 키트의 제조에 있어서 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제안하며, 상기 키트는 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체는 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB 검출용 키트의 제조에 사용될 수 있으며, 상기 키트는 MICA 및/또는 MICB를 효과적으로 검출할 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플 내 MICA 및/또는 MICB 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학 연구에 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로, MICA 및/또는 MICB와 그 항체 특이성 결합 성능을 이용하는 면역 블롯팅, 면역 침전 등으로 검출하는 키트에 사용할 수 있다. 이러한 키트는 길항제, MICA 및/또는 MICB항체 또는 약물 기준 물질; 단백질 정제 컬럼; 면역 글로불린 친화 정제 완충액; 세포 측정 희석제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. MICA 및/또는 MICB항체 또는 항원 단편은 상이한 유형의 진단 테스트에 사용될 수 있는데, 예를 들어 생체 외 또는 생체 내에서 다양한 질환 또는 약물, 독소 또는 다른 단백질 등의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어 피험자의 혈청 또는 혈액을 검출하여 MICA 및/또는 MICB 관련 질환을 테스트할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 약물을 제안하며, 이는 전술한 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 전술한 접합체 및/또는 전술한 조성물을 포함하고, 상기 약물은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물에는 모두 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있는 물질이 존재하므로, 상기 물질을 포함하는 약물은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 약물은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료에 현저한 효과가 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 약물은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 유효량의 상기 항체 활성 성분을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 인간 및/또는 동물에서 기능 또는 활성을 나타낼 수 있는 양으로서 인간 및/또는 동물이 수용할 수 있는 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한" 성분은 과도한 부작용(예: 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이, 즉 합리적인 이익/위험 비율로 인간 및/또는 포유동물에 사용하기에 적합한 성분이다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 벡터"는 다양한 부형제 및 희석제를 포함하는 치료제의 투여를 위한 벡터를 의미한다.
본 발명의 약물은 안전하고 유효한 양의 본 발명의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 약물 제제는 투여 방식과 매칭되어야 하며, 본 발명의 약물 제형은 주사제, 경구제제(정제, 캡슐제, 내용액제), 경피제, 서방제이다. 예를 들어 생리 식염수 또는 포도당 및 기타 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 상기 약물은 바람직하게는 무균 조건에서 제조된다.
본 발명에 따른 활성 성분의 유효량은 투여 패턴 및 치료할 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 당업자가 다양한 요인(예를 들어, 임상 시험을 통해)에 따라 결정할 수 있다. 상기 요인에는 생체이용률, 대사, 반감기 등과 같은 활성 성분의 약동학 파라미터; 환자가 치료해야 하는 질환의 중증도, 환자의 무게, 환자의 면역 상황, 투여 경로 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황의 긴박성 요구에 따라 매일 여러 회 분할 투여하거나 용량을 비례적으로 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 벡터는 물, 식염수, 리포좀, 지질, 단백질, 단백질-항체 접합체, 펩티드계 물질, 셀룰로오스, 나노겔, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 벡터의 선택은 당업자에게 잘 알려진 투여 방식과 매칭되어야 한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안하며, 이는 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산으로 코딩된 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하며, 상기 핵산으로 코딩된 단백질은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 12, 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄를 코딩하는 유전자는 하기와 같이 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCTGCCAAAACAACTGCACCATCTGTTTATCCACTGGCCCCCGTTTGCGGGGATACCACTGGTAGCTCTGTCACCCTCGGCTGTCTGGTCAAAGGATATTTCCCCGAGCCTGTGACACTTACCTGGAATTCAGGCAGCTTGTCCTCCGGCGTGCATACTTTCCCTGCAGTCCTGCAGTCAGATCTGTACACCCTCAGCTCATCTGTGACTGTCACAAGTTCTACCTGGCCATCCCAGAGTATTACATGCAACGTGGCCCACCCAGCAAGTTCAACAAAAGTTGACAAGAAGATTGAGCCAAGAGGCCCTACTATCAAGCCCTGTCCCCCCTGTAAGTGTCCTGCACCCAATCTGCTGGGGGGCCCATCTGTGTTTATTTTCCCCCCAAAGATTAAGGACGTCCTCATGATTAGCCTGTCCCCAATCGTGACATGTGTGGTGGTGGATGTTTCTGAGGACGACCCAGACGTACAGATCTCTTGGTTCGTGAACAATGTCGAGGTGCATACAGCCCAGACCCAGACCCATCGGGAAGACTACAACTCTACATTGAGAGTGGTGTCCGCTTTGCCCATCCAGCATCAGGACTGGATGTCCGGCAAGGAGTTTAAATGTAAGGTCAACAACAAGGACCTGCCCGCTCCAATAGAGAGAACTATCTCAAAGCCTAAAGGTAGTGTTCGAGCCCCCCAGGTATACGTACTGCCACCCCCTGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACACTGACCTGCATGGTGACAGACTTCATGCCAGAAGACATTTATGTCGAATGGACTAATAATGGCAAGACCGAACTGAATTATAAAAATACCGAACCAGTGCTGGACTCCGACGGGTCCTATTTCATGTACTCTAAGCTCCGTGTCGAAAAGAAGAACTGGGTGGAACGAAACTCTTACTCCTGCAGTGTTGTGCACGAGGGGCTTCACAACCATCATACAACCAAGTCCTTCTCCAGGACACCTGGGAAG(SEQ ID NO: 12).
상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄를 코딩하는 유전자는 하기와 같이 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGAGCTGATGCTGCCCCCACTGTCTCTATTTTTCCTCCTAGTAGTGAGCAGCTGACATCTGGAGGCGCCTCCGTGGTGTGCTTCCTGAATAACTTTTACCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGGAGTGAGAGGCAGAATGGCGTACTGAATTCCTGGACTGATCAGGACTCTAAAGATAGCACCTATAGCATGTCCTCCACCCTCACACTGACAAAGGACGAATACGAACGGCATAACTCCTATACATGTGAGGCTACCCACAAGACATCCACCTCACCAATCGTCAAGAGCTTCAACCGGAATGAGTGT　(SEQ ID NO: 13).
본 발명의 명세서 및 특허청구범위에 언급된 핵산에 대해 당업자는 실제로 상보적인 이중 가닥 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것으로 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 편의상, 본 명세서 및 특허청구범위에서는 대부분의 경우 하나의 사슬만 제시하지만, 이와 상보적인 다른 사슬도 사실상 개시하고 있다. 이 밖에, 본원 발명에서 핵산 서열은 DNA 형태 또는 RNA 형태를 포함하며, 이들 중 하나를 개시한다는 것은 다른 하나도 개시함을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 벡터 또는 형질전환체를 제안하며, 이는 전술한 핵산을 포함한다. 상기 재조합 벡터는 선택적인 제어 서열을 포함할 수 있고, 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 실시예에서 제안된 재조합 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 고효율적으로 발현할 수 있고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 의미할 수 있고, 이는 상기 핵산과 시판되는 벡터(예: 플라스미드 또는 바이러스 벡터)를 작동 가능하게 연결하여 얻을 수 있으며, 일반적으로 사용되는 플라스미드는 pSeTag2, PEE14, pMH3 등을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안하며, 상기 재조합 세포는 전술한 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체를 운반하거나 전술한 항체 또는 항원 결합 단편을 발현한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환시켜 얻는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적합한 조건에서 상기 항체를 고효율적으로 발현할 수 있고, 상기 항체 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으며, 나아가, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진하는 것과 같이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 예방 및/또는 치료하는 양호한 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 재조합 세포는 특별히 한정되지 않으며, 원핵 세포, 진핵 세포 또는 파지일 수 있음에 유의해야 한다. 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균, 스트렙토마이세스 또는 프로테우스 미라빌리스 등일 수 있다. 상기 진핵 세포는 피키아 파스토리스, 양조 효모, 분열 효모, 자일로마이신 등 진균, 군대벌레 등 곤충 세포, 담배 등 식물 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 등 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 세포는 바람직하게는 BHK 세포, CHO 세포, NSO 세포 또는 COS 세포를 포함하는 포유동물 세포이고, 동물 생식 세포, 수정란 또는 배아 줄기 세포는 포함하지 않는다.
본원 발명의 명세서에서 언급된 "적합한 조건"은 본원 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건을 의미함에 유의해야 한다. 당업자는 항체 또는 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건이 적절한 형질전환 또는 형질감염 방식, 적절한 형질전환 또는 형질감염 조건, 건강한 숙주 세포 상태, 적절한 숙주 세포 밀도, 적합한 세포 배양 환경, 적합한 세포 배양 시간을 포함하나 이에 한정되지 않음을 용이하게 이해할 수 있다. "적합한 조건"은 특별히 한정되지 않으며, 당업자는 실험실의 구체적 환경에 따라 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 최적 발현 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 약물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질은 모두 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방 용도는 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 면역 접합체; 3) 전술한 조성물; 4) 전술한 약물; 5) 전술한 핵산; 6) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 7) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있고, 나아가, MICA 및/또는 MICB에 대한 NKG2D의 결합을 촉진하여 종양 세포를 살상하는 것과 같이 NK 세포가 작용하도록 촉진하므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 물질은 모두 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따른 방법은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법을 제안한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포 중 적어도 하나를 사용하여 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 단계; 및 상기 MICA 및/또는 MICB의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량을 결정하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, MICA 및/또는 MICB는 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 MICA 및/또는 MICB의 수준에 따라 상기 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 이 밖에, 상기 물질을 이용하여 피험자의 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량을 모니터링할 수도 있는 바, 즉 상기 물질은 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는 피험자에 대한 병기 분류에 사용될 수도 있고, MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예후 평가에 사용될 수도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량이 질환에 대한 최저 기준보다 낮지 않다는 것은 테스트 샘플이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는 환자로부터 유래된 것임을 시사한다. 상기 최저 기준값은 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는 많은 개체와 많은 건강한 개체의 테스트할 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량 차이를 비교 분석하고 검증하여 결정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 테스트 샘플은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 땀, 대변 및 소변 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서 용도: 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB의 α3 도메인에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 데 사용될 수 있고, MICA 및/또는 MICB는 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 MICA 및/또는 MICB의 수준에 따라 상기 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 용도는 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
이하, 실시예를 구체적으로 소개한다. 실시예에서 구체적인 기술이나 조건이 명시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 기재된 기술 또는 조건 또는 제품 사양에 따라 수행된다. 사용되는 시약 또는 기기는 제조업체가 명시되지 않은 경우, 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예 1: 항체의 제조
본 실시예는 주로 다음과 같은 내용을 포함한다.
인간 MICA에 대한 뮤린 단일 클론 항체를 생성한 후, 정제된 재조합 MICA 세포외 영역 Fc 융합 단백질(MICA-Fc)(재조합MICA 세포외 영역 Fc 융합 단백질, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23으로 표시됨)을 항원으로 사용하여 Balb/c 마우스(9주령, 상하이 레스크에서 구입, 무게 약 20g)를 면역시켰다. 면역 마우스에 대해 정제 항원 및 완전 프로인트 아쥬반트를 사용하여 3회 면역화를 수행하고, 면역된 마우스를 꼬리 정맥을 통해 방혈한 후, ELISA, 유세포 분석을 통해 검출하여 항-인간 MICA 면역 글로불린을 갖는 마우스를 얻었다.
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 23).
얻어진 항-인간 MICA 면역 글로불린을 갖는 마우스에서 항-MICA 면역 글로불린 함량이 가장 높은 마우스를 선택하여 비장 세포를 꺼내 마우스 골수종 세포인 SP2/0 세포(ATCC 번호 CRL-1581)와 융합하였다, 하이브리도마를 제조하는 구체적인 실험 작업은 당업계의 통상적인 작업이다. 융합된 하이브리도마 세포를 이용하여 항체 스크리닝을 수행하여 마우스 단일클론 항체를 얻었다.
후보 하이브리도마 세포의 총 수를 106개로 배양하고, 800rpm 조건에서 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였으며, Trizol 키트(Invitrogen)로 하이브리도마 세포의 총 RNA를 추출하고; 총 RNA를 주형으로 하여 cDNA 라이브러리(Invitrogen)로 역전사 및 합성하였으며, 또한 cDNA를 주형으로 하여 하이브리도마 세포에 포함된 항체에 대응되는 가변 영역 핵산 서열을 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 반응에 사용되는 프라이머 서열과 항체 가변 영역의 제1 프레임 워크 영역 또는 신호 펩티드 영역 및 불변 영역은 상보적이다(Larrick, J.W., et al., (1990) Scand.J.Immunol., 32, 121-128 및 Coloma, J.J.et al., (1991) BioTechniques, 11, 152-156). 50μL 반응 시스템에 cDNA 2μL, 10×PCR 완충액 5μL, 상류 및 하류 프라이머 2μL(5μmol), dNTP 2μL, Taq 효소 1μL(Takara, Ex Taq), H2O 38μL를 각각 첨가하고; 95℃에서 5min 동안 사전 변성하였으며, 온도 사이클에 진입하여 PCR 증폭을 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 30S 동안 변성하고, 58℃에서 45S 동안 어닐링하며, 72℃에서 50S 동안 연장시키고, 총 32 사이클 후, 72℃에서 7 min 동안 연장시켰다. 증폭 생성물을 시퀀싱한 후, 마우스 단일클론 항체의 중쇄가변 영역(SEQ ID NO:21) 및 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO:22)의 뉴클레오티드 서열, 마우스 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역(SEQ ID NO:7) 및 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO:8)의 아미노산 서열을 얻었다.
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT(SEQ ID NO: 21).
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO: 22).
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 7).
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO: 8).
실시예 2: MICA 항체 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 실시예 1에서 얻은 MICA 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 사용되었다. 상기 MICA 세포외 영역 Fc 융합 단백질(MICA-Fc)을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 MICA에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS 완충액으로 MICA-Fc 융합 단백질(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23으로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 100μL/웰의 PBST/0.05% BSA로 테스트할 MICA 항체를 적절한 농도로 희석하고, 그 후, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체(Boster, BA1050)를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃ 조건에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후 PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL/웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 구체적인 실험 결과는 도 1에 나타내었으며, 이는 본 발명의 항체가 MICA에 결합할 수 있음을 나타낸다.
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:23).
실시예 3: MICA 항체 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 MICA 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 사용되었다. MICA 세포외 영역 α3 도메인Fc 융합 단백질(MICAα3-Fc)을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 MICA에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS 완충액으로 MICAα3-Fc 융합 단백질(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, PBST/0.05% BSA로 적절한 농도로 희석된 테스트할 MICA 항체 100μL/웰을 첨가하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체(Boster, BA1050)를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL/웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 결과(도 2)는 본 발명의 항체가 MICAα3 도메인에 결합할 수 있음을 나타낸다.
VLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24).
실시예 4: CHO-K1 과발현 세포 구축
HEK293T 세포를 5×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 이중 항체가 없는 DMEM 배지를 사용하여 밤새 배양하였다. 형질감염 전에 배지를 버리고, 이중 항체가 없는 신선한 DMEM 배지 1mL를 첨가하였다. 목적 유전자를 포함하는 pLVX-EF1a-IRES-puro 벡터(pLVX-EF1a-IRES-pruo 벡터의 효소 절단 부위 EcoRI와 BamHI 사이에 각각 삽입된) 코딩 MICA(SEQ ID NO: 25), MICB(SEQ ID NO: 26), Rhesus MIC1(SEQ ID NO:27), Rhesus MICB(SEQ ID NO: 28)의 뉴클레오티드 서열(Suzhou Jinweizhi에서 합성), pMD2G, psPAX2 벡터(총 3μg)를 2:1:1의 비율로 무혈청 DMEM 배지 200μl에 첨가하고, 12μg 폴리에테르이미드(PEI, Polysciences사)를 첨가하였다. 균일하게 혼합한 후 16min 동안 방치한 다음 모든 액체를 HEK293T 세포가 플레이팅된 6-웰 플레이트에 첨가하였다. 6h 동안 배양한 후, 배지를 버리고, 신선한 완전 DMEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 형질감염 48h 후, 세포 배양 상층액을 수집하여 0.45μm 필터(Millipore)를 통과시켜 바이러스 상층액을 얻었다. 바이러스 상층액을 모두 1×104 CHO-K1 세포를 포함하는 6-웰 플레이트에 첨가하고, 최종 농도가 4μg/mL인 폴리아미드(Sigma)를 첨가하여 12h 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 버리고, 신선한 완전 DMEM 배지를 첨가하였다. 얻어진 세포는 CHO-K1-MICA, CHO-K1-MICB, CHO-K1-Rhesus MIC1, CHO-K1-Rhesus MICB 세포이며, 각각 MICA(SEQ ID NO: 11), MICB(SEQ ID NO: 29), Rhesus MIC1(SEQ ID NO:30), Rhesus MICB(SEQ ID NO: 31) 단백질을 발현할 수 있었다.
ATGGGCCTTGGCCCTGTGTTTCTGTTGCTTGCTGGGATTTTTCCATTCGCACCTCCCGGTGCCGCCGCAGAGCCCCACAGCTTGCGGTACAATTTGACCGTGCTGTCCTGGGATGGCAGTGTACAAAGCGGCTTTCTGACCGAGGTTCATCTGGATGGACAACCATTCCTGCGCTGCGACAGACAGAAGTGTCGAGCAAAACCCCAGGGTCAGTGGGCAGAAGATGTACTCGGCAATAAGACATGGGATCGAGAAACAAGAGACCTCACAGGAAATGGTAAAGATCTCCGCATGACCCTTGCACACATTAAGGATCAGAAAGAAGGACTGCACTCCCTCCAGGAGATTCGAGTGTGTGAGATTCACGAGGATAACAGCACAAGAAGCTCACAGCATTTTTATTACGATGGAGAACTGTTTCTCAGCCAAAACCTGGAGACCAAAGAGTGGACTATGCCACAGTCCTCCAGAGCTCAGACCCTGGCTATGAATGTCCGTAATTTTTTGAAAGAGGACGCAATGAAGACCAAGACTCACTACCATGCCATGCACGCCGACTGCCTGCAGGAGTTGAGACGATACCTCAAATCCGGGGTTGTGCTCAGGCGGACAGTGCCCCCAATGGTAAACGTGACTCGGTCTGAAGCTTCTGAAGGAAACATCACAGTCACCTGCAGAGCTAGCGGTTTTTACCCCTGGAACATCACTCTCTCCTGGAGACAGGACGGTGTGTCCCTCAGCCATGATACCCAGCAGTGGGGAGACGTGCTGCCCGATGGCAACGGCACTTATCAGACTTGGGTGGCTACTCGAATTTGTCAAGGAGAGGAGCAGCGATTCACATGTTACATGGAGCACTCCGGGAATCATTCAACTCACCCAGTACCCAGCGGAAAGGTCCTTGTGCTGCAGAGTCATTGGCAGACATTTCACGTATCCGCTGTGGCAGCCGCCGCAATTTTCGTCATCATCATTTTCTATGTTCGCTGTTGTAAAAAAAAGACAAGCGCTGCCGAGGGGCCCGAACTGGTGAGCCTCCAGGTGCTGGACCAACATCCCGTGGGCACCAGCGACCATCGCGATGCCACCCAGCTTGGCTTCCAGCCATTGATGTCAGACCTCGGCAGCACAGGCAGCACTGAGGGCGCT(SEQ ID NO: 25).
ATGGGATTGGGTAGGGTTTTGCTTTTTCTCGCTGTGGCTTTCCCCTTTGCACCTCCTGCTGCAGCCGCAGAACCCCATAGCCTTAGGTATAACCTGATGGTGCTCAGTCAAGATGAATCCGTGCAGTCCGGATTTCTTGCCGAGGGCCATCTGGATGGACAACCTTTCTTGCGTTACGATAGGCAGAAACGACGAGCTAAACCACAGGGTCAGTGGGCAGAGGACGTGCTGGGAGCTAAGACTTGGGACACCGAGACCGAGGATCTGACTGAGAACGGGCAGGACCTGAGAAGGACTCTGACACACATCAAGGACCAGAAGGGAGGGTTGCACTCCCTGCAGGAAATCCGCGTGTGTGAGATTCACGAGGACTCATCAACCCGAGGCAGTAGGCACTTTTACTACGATGGAGAGCTGTTTCTGAGTCAGAATCTGGAGACACAAGAGAGCACTGTGCCACAGTCATCTCGGGCTCAGACTCTGGCTATGAACGTTACCAATTTCTGGAAAGAAGATGCTATGAAAACAAAGACCCATTATAGAGCTATGCAGGCCGATTGCCTGCAGAAGTTGCAGCGTTATTTGAAGTCTGGTGTTGCTATCAGGCGGACCGTTCCCCCCATGGTGAATGTGACTTGCTCCGAGGTTTCCGAAGGTAACATTACTGTTACCTGTCGAGCTAGCTCCTTCTACCCACGGAACATTACATTGACATGGAGGCAGGATGGCGTTAGTCTGAGCCATAATACTCAGCAGTGGGGAGACGTTCTGCCTGACGGAAATGGCACATACCAGACCTGGGTTGCCACCAGAATCCGACAGGGCGAAGAGCAGAGGTTTACCTGTTATATGGAGCACAGCGGAAATCATGGGACTCATCCCGTGCCTAGTGGGAAGGTGCTCGTTCTCCAGTCTCAGCGCACTGACTTTCCTTACGTGTCTGCCGCTATGCCATGCTTCGTCATCATTATCATCCTCTGTGTGCCATGCTGCAAGAAGAAAACATCTGCAGCCGAGGGGCCTGAACTTGTGTCCCTGCAGGTTCTGGACCAGCACCCTGTTGGCACCGGAGATCACCGAGACGCAGCCCAACTGGGCTTCCAACCTCTGATGAGCGCCACTGGATCTACTGGTTCTACCGAGGGAGCC(SEQ ID NO: 26).
ATGGGCCCTGGGAGGGTTTTGCTCTTTCTGACCTCTATTTTTCCCTTCGCTAGACCAGGCGCTCCAACAGAGCTCCACAGCTTGCGCTACAACGTGACAGTTCTCAGCAGGGATGGGTCCGTGCAGTCCGATTTCCTCGCTGAGGGCCATCTTGATAGCCAACTCTTCGTCCGCTACGACCGCGAGACACGGCGGGCAAGGCCACAAGGACAGTGGGCCGAGGCTGTGCTGGGCGCAAAAACATGGGACACTGAAACTGGCGATCTCACAGAGAATGGGAAGGACCTGCGGCGTACCCTGACTCACATTGAGGGACAAAAGGGTGGCCTCCACAGCTTGCAGGATATACAGAATTGTGAGATTTACGAGGACGGCTCTACTGGAGGTTCCAGGCATTTTTACTATGATGGGGAGAGATTTCTGTCCCTTAATCTGGCCACTCAGGAGTGGACAGTAGCACAGTCTAGCCGAGCACAGACTCTGGCCATGAACTTCTGGAAGGAAGATACTATGAAAACAAATACACACTACCACGCAATGCAGGCCGATTGCCTGAAAAAGCTGAGACGCTACCAAAAGTCCAGAGTGGCTGTACGACGCACCGCCCCTCCTATGGTGAATGTGACACATTCCGAGGCTAGTGAGGGTAATATTACAGTGACCTGCCGCGCTTCTGGTTTCTACCCCAGAAATATAGCCTTGACCTGGCGACAGGACGGTGTTTCATTGAACCACGACGCCCAGCAGTGGGGCGGCATACTGCCAGACCAGAATGGCACTTACCAGACTTGGGTGGCCACCAGGATTCGGCAGGGCGAGGAACAGCGTTTCGCCTGCTATATGGAGCATAGCGGTAATCACTCTACCCATCCCGTGCCTAGCGGAAAGGTCCTGGTCTTTCAATCTCAGTGGCTGGATATTCCATACGTGCTGGGTGTAGCCGCTGCCGCCGTGGCCGCCGCTGCCGCAATTTTCGTTATTATCCTGTACGTTCTGTGTTGCAAGAAAAAGACTTCAGCCGCCGAAGGCCCCGAGCTCGTGAGTCTGCGCACCCTGGATCAGCACCCCGTTGGTACTGGAGATCACCGTGACGCAACC(SEQ ID NO: 27).
ATGGGTCTGGGAAGAGTATTGCTGTTTCTGGGTCGAGTCCTGCTGTTTCTCGCCTCCATTTTCTCTTTTACTCGACCTCGAGCCGCTGCTGAGCTGCACTCACTCAGATACAACGTGACCGTCTTGTCTAGAGATGGGTCAGTGCAGAGCGAGTTTTTGGCAGAGGGCCATTTGGATGGTCAGCTCTTTGTGAGGTACGATAGGGAAACACGACGTGCTAGACCTCAGGGACAGTGGGCAGAGGCAGTGTTGGGGGACCAGGAGACAGAGGACTTGACCGAGAACGCACAGGACCTGCGCAGAACACTGACCCACATTGAAGGCCAGAAGGGCGGCCTGCATAGTCTGCAGAAGATAAAAATCTGCGAAATTTATGAGGATGGCTCTACTGGCGGATTTTGGCATTTTTATTACGACGGGGAGCTGTTTCTGTCCCTTAATCTGGAGACACAGAAGTGGACAGTAGCTCAGTCATCCCGCGCTCAAACCCTGGCAATGAATTTCTGGAAGGAGGACACTATGAAAACTAATACACACTATAGAGCCATGAGGGCCGATTGCTTGAAAAAACTGTGGAGATACCAGAAGTCTCGGGTTGCTGTGAGAAGGACAGTTCCCCCTATGGTGAATGTCACTCATGGGGAGGCCTCTGAGGGCAACATAACAGTCACATGCAGGGCTTCAGGCTTTTACCCTGGAAACATCACTCTGACTTGGAGACAAGATGGCGTGTCCCTGAGTCACGACGCACAACAGTGGGGCGACGTCCTGCCTGATTGGAATGGCACCTATCAGACATGGGTCGCCACAAGAATCCGACAGGGAGAGGAACAGCGTTTTGCCTGTTACATGGAGCATAGCGGCAATCATTCCACACATCCTGTGCCTTCTGGCAAGCCACCAGTGCTCCAGTCCGAACGGTTGAATCTGCTGTATGTCCCCGTAGCAGTGGCTGTTGCTGTTGTCACTGCCTTTATCATTATCTGCGTTCACCGATGTAAAAAGAAAAAAACATCAGCTGCCGAGGGCCCAGAGTTGGTATCCCTCAGAACTCTTGACCAACACCCTGTCGGAACTGGGGATCATAGAGATGCTACCCAGCTGGGATTCCAGCCTCTCATGAGCGCTCCAGGGTCCACCGGATCAACTGAAGGGGCC(SEQ ID NO: 28).
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA(SEQ ID NO: 11).
MGLGRVLLFLAVAFPFAPPAAAAEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTDFPYVSAAMPCFVIIIILCVPCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTGDHRDAAQLGFQPLMSATGSTGSTEGA(SEQ ID NO: 29).
MGPGRVLLFLTSIFPFARPGAPTELHSLRYNVTVLSRDGSVQSDFLAEGHLDSQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGAKTWDTETGDLTENGKDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQDIQNCEIYEDGSTGGSRHFYYDGERFLSLNLATQEWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYHAMQADCLKKLRRYQKSRVAVRRTAPPMVNVTHSEASEGNITVTCRASGFYPRNIALTWRQDGVSLNHDAQQWGGILPDQNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVFQSQWLDIPYVLGVAAAAVAAAAAIFVIILYVLCCKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDAT(SEQ ID NO: 30).
MGLGRVLLFLGRVLLFLASIFSFTRPRAAAELHSLRYNVTVLSRDGSVQSEFLAEGHLDGQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGDQETEDLTENAQDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQKIKICEIYEDGSTGGFWHFYYDGELFLSLNLETQKWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYRAMRADCLKKLWRYQKSRVAVRRTVPPMVNVTHGEASEGNITVTCRASGFYPGNITLTWRQDGVSLSHDAQQWGDVLPDWNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKPPVLQSERLNLLYVPVAVAVAVVTAFIIICVHRCKKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDATQLGFQPLMSAPGSTGSTEGA(SEQ ID NO: 31).
실시예 5: MICA 유세포 분석에 의한 결합 실험
유세포 분석 실험은 MICA 항체의 결합 특성을 검출하기 위한 것으로, 실시예 4에서 얻은 CHO-K1-MICA, CHO-K1-MICB, CHO-K1-Rhesus MIC1, CHO-K1-Rhesus MICB 세포에 각각 실시예 1에서 제조된 MICA 항체(번호 5A1) 및 대조군 항체 마우스 IgG1(Biolegend, MG1-45)를 첨가하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 MICA, MICB, Rhesus MIC1, Rhesus MICB 단백질에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS로 CHO-K1-MICA, CHO-K1-MICB, CHO-K1-Rhesus MIC1, CHO-K1-Rhesus MICB 세포를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 염소 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 상이한 농도(10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100, 101μg/mL)의 MICA 항체를 첨가하고 4℃에서 조건에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여, 4℃, 3500rpm 조건에서 5min 동안 원심분리하였으며, 상층액을 버리고, 침전물을 재차 PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μL/튜브의 PBS로 세포를 포함하는 침전물을 재현탁하였으며, 여기에 0.1μL/튜브 Alexa-647로 표지된 염소 항-뮤린 항체 2차 항체(Biolegend, 405322)를 첨가하여 4℃, 어두운 조건에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 포함하는 침전물을 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과를 도 3, 4, 5, 6에 나타내었으며, 이는 본 발명의 상기 항체가 MICA, MICB, Rhesus MIC1 및 Rhesus MICB 단백질에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 6: MICA 유세포 분석에 의한 결합종양 세포 실험
유세포 분석 실험은 MICA 항체가 종양 세포에 결합하는 특성을 검출하기 위한 것으로, 폐암 NCI-H1299 세포에 각각 MICA 항체(번호 5A1) 및 대조군 뮤린 항체 IgG1(Biolegend, MG1-45)를 첨가하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 종양 세포에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS로 NCI-H1299 세포를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 염소 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 상이한 농도(10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100, 101, 102μg/mL)의 MICA 항체, 대조군 항체IgG1를 첨가하여 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃, 3500rpm 조건에서 5min 동안 원심분리하였으며, 상층액을 버리고, 얻은 침전물을 재차 PBS로 1회 세척하였으며, 재차 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μL/튜브의 PBS로 세포를 포함하는 침전물을 재현탁하였으며, 여기에 0.1μL/튜브의 Alexa-647로 표지된 염소 항-뮤린 항체 2차 항체(Biolegend, 405322)를 첨가하여 4℃, 어두운 조건에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과를 도 7, 8, 9에 나타내었으며, 이는 본 발명의 상기 항체가 흑색종 A375 세포, 폐암 NCI-H1299 세포, 인간 적색 백혈병 K562 세포에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 7: MICA 항체의 항원 에피토프 특성 판단
Western blot 실험은 MICA 항체의 항원 에피토프 특성을 판단하기 위해 사용되었다.
실시예 4에서 구축한 CHO-K1-MICA, CHO-K1 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 RIPA 용해액을 첨가하여 얼음에서 15min 동안 용해하고, 4℃, 15000g 조건에서 5min 동안 원심분리하여 상층액을 수집하였다. BCA 키트를 이용하여 용해된 상층액에 대해 단백질 정량을 수행하였다. 그 후 SDS-PAGE loading buffer로 샘플을 조제하되, 로딩량은 50ug/웰이다. 전기영동 후 멤브레인을 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮기고, 5% 탈지분유를 이용하여 실온에서 1h 동안 블로킹하였다. 그 후 1:2000(w/v)로 희석된 MICA 항체를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1‰ PBST로 멤브레인을 5min×6회 세척한 후, 1:5000(v/v)로 희석된 HRP-염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 실온에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 1‰ PBST로 멤브레인을 5min×6회 세척하였다. ECL 기질로 현상하고 화학 발광을 검출하였다. 결과는 도 8에 나타내었으며, 이는 본 발명의 상기 항체가 MICA 단백질 선형 에피토프에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 8: NKG2D에 대한 MICA의 결합 결합 능력을 촉진하는 항체 스크리닝
MICA 항체는 MICA 세포외 영역에 결합함으로써 MICA와 이의 수용체 NKG2D 사이의 신호 통로를 촉진하는 것으로, 본실시예에서는 유세포 분석 실험을 통해 MICA와 MICA 및 이의 수용체 NKG2D의 결합에 대한 항체의 영향을 검출하였다.
PBS로 실시예 4에서 얻은 CHO-K1-MICA 세포를 2×106개/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 마우스 혈청을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 일련의 희석 구배(10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100, 101μg/mL)를 갖는 MICA 항체(번호 5A1) 및 대조군 항체 IgG1(Biolegend, MG1-45)을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. 2μg/튜브의 NKG2D 세포외 영역 Fc 융합 단백질(NKG2D-Fc, SEQ ID NO:32, 본 실험실에서 발현됨)을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃, 3500rpm 조건에서 5min 동안 원심분리하고, 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μl/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하였으며, 여기에 1μL/튜브의 647로 표지된 마우스 항-인간 항체 2차 항체(Biolegend, HP6017)를 첨가하여 4℃, 어두운 조건에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유동형 세포 분석기로 검출한 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 MICA와 수용체 NKG2D의 결합을 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:32).
실시예 9: MICA 항체의 NK92 세포 항종양 촉진
본 실시예는 생체 외 살상 실험으로, 검출NK92 세포(ATCC 번호 CRL-2407)에 의한 종양 세포 살상에 대한 MICA 항체의 영향을 검출하기 위해 사용되었다. 총 두 그룹을 설정하되, 여기에 사용된 종양 세포는 흑색종 A375 세포(ATCC 번호 CRL-1619)이고, 구체적인 실험 작업은 다음과 같다.
(1) A375종양 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세척하고, 4℃, 200g 조건에서 5min 동안 원심분리하여 상층액을 버리고; 1mL무혈청 DMEM 배지로 얻어진 침전물을 재현탁하였으며, 최종 농도 5μM CTV로 첨가하여 37℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다.
(2) 인큐베이션 종료 후, 배양 시스템에 사전 냉각된 200μL의 소 태아 혈청을 첨가하여 마커를 중지하고, 4℃, 200g 조건에서 5min 동안 원심분리하여 상층액을 버리고; 10% 소 태아 혈청을 함유한 완전 RPMI-1640 배지로 세포 침전물을 2회 세척하였으며, 상층액을 버리고; 완전 RPMI-1640 배지로 침전물을 재현탁하였으며, 세포를 계수하고, 완전 RPMI-1640 배지로 1.25×105개/mL로 희석하였다.
(3) 10% 소 태아 혈청이 함유된 완전 RPMI-1640 배지로 NK92 세포를 일련의 농도(2×105개/mL, 4×105개/mL, 8×105개/mL, 1.6×106개/mL)로 희석하였다.
(4) 희석된 PBMC(NK92)를 100μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다.
(5) 완전 RPMI-1640 배지로 MICA 항체(5A1) 또는 대조군 마우스 IgG를 50μg/mL로 희석하고, 20μL/웰의 부피로 희석된 MICA 항체 또는 마우스 IgG를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다.
(6) 희석된 종양 세포를 80μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다.
(7) 단계 (6)에서 얻은 96웰 둥근 바닥 플레이트를 4℃, 1500rpm 조건에서 1min 동안 원심분리하고, 원심분리된 96-웰 플레이트를 37℃에서 4h 동안 인큐베이션하였다.
(8) 1μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 7-AAD(BD, 559925)를 첨가하여 균일하게 혼합. 웰 내의 모든 액체를 유동형 튜브로 옮겨 유세포 분석기로 검출하고, 구체적인 실험 결과를 도 12에 나타내었으며, 이로부터 본 발명의 항체는 NK92 세포의 종양 살상을 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실시예 10: MICA 항체 ELISA 결합 실험
본 실시예는 ELISA를 통해 MICA 항체 및 MICA, MICB의 α3 도메인의 결합 특성을 검출하였다. 발명자는 얻어진 다양한 MICA, MICB 변이체 세포외 영역 α3 도메인(MICAα3*-002, 004, 005, 008, MICBα3*-005) Fc 융합 단백질(MICAα3-Fc, MICBα3-Fc), 및 대조군 항체 IgG를 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 MICA, MICB에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS 완충액으로 융합 단백질(MICA*002α3-Fc아미노산 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시되고; MICA*004α3-Fc아미노산 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되며; MICA*005α3-Fc아미노산 서열은 SEQ ID NO:35로 표시되고; MICA*008α3-Fc아미노산 서열은 SEQ ID NO:36로 표시되며; MICB*005α3-Fc아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, PBST/0.05% BSA로 적절한 농도(10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100, 101, 102μg/mL)로 희석된 테스트할 MICA 항체 100μL/웰을 첨가하여 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL/웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 결과를 도 13, 14, 15, 16, 17에 나타내었으며, 이는 본 발명의 항체가 MICA*002, MICA*004, MICA*005, MICA*008, MICB*005에 결합할 수 있음을 보여준다.
RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33).
RRVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:34).
RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35).
RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNIILTWRQDGVSLSHDTQQWGGVLPDGNGTYQTWVATRICRGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:36).
RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLALQSQWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37).
본 명세서의 설명에 있어서, 용어 "일 실시예", "일부 실시예", "예시", "구체적인 예시" 또는 "일부 예시" 등을 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예시를 결부하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예시에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어의 예시적인 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예시를 가리키는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성은 임의의 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 상충되지 않는 범위에서 본 명세서에 설명된 상이한 실시예 또는 예시 및 상이한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였지만, 상기 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안 된다는 것을 이해할 수 있을 것이며, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예에 대한 변경, 수정, 대체 및 변형을 수행할 수 있다.

Claims (26)

  1. 항체 또는 항원 결합 단편으로서,
    중쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~3; 및
    경쇄 가변 영역의 CDR 서열: SEQ ID NO: 4~6; 중 적어도 하나로부터 선택되는 CDR 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
    SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
    SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되,
    (i) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 및/또는, (ii) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 (i)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 (ii)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 단일 클론 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 일부에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 면역 접합체로서,
    치료제 및 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 치료제에 커플링되는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  10. 조성물로서,
    상기 조성물은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 제9항에 따른 면역 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. MICA 및/또는 MICB 검출용 키트로서,
    상기 키트는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  12. MICA 및/또는 MICB 검출용 키트의 제조에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  13. 약물로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 제9항에 따른 면역 접합체 및/또는 제10항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  14. MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 제9항에 따른 면역 접합체 및/또는 제10항에 따른 조성물의 용도로서,
    선택적으로, 상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 용도.
  15. 핵산으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하고;
    선택적으로, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 12, 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 재조합 벡터 또는 형질전환체로서,
    제15항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 또는 형질전환체.
  17. 재조합 세포로서,
    상기 재조합 세포는 제15항에 따른 핵산, 제16항에 따른 발현 벡터 또는 형질전환체를 운반하거나, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  18. MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제9항에 따른 면역 접합체, 제10항에 따른 조성물, 제13항에 따른 약물, 제15항에 따른 핵산, 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 제17항에 따른 재조합 세포의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 용도.
  20. MICA 및/또는 MICB-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제9항에 따른 면역 접합체;
    3) 제10항에 따른 조성물;
    4) 제13항에 따른 약물;
    5) 제15항에 따른 핵산;
    6) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    7) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제15항에 따른 핵산;
    3) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    4) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나를 사용하여 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB를 검출하는 단계; 및
    상기 MICA 및/또는 MICB의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 테스트 샘플 내 MICA 및/또는 MICB의 함량이 질환에 대한 최저 기준보다 낮지 않다는 것은 테스트 샘플이 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는 환자로부터 유래된 것임을 시사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 피험자가 MICA 및/또는 MICB-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서,
    1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제15항에 따른 핵산;
    3) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    4) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 MICA 및/또는 MICB-매개 질환은 암 또는 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 용도.
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