MXPA01013175A

MXPA01013175A - Composiciones y metodos para incrementar el flujo del colesterol y elevar hdl utilizando un cassette de enlace atp transportador de proteina abc1.

Info

Publication number: MXPA01013175A
Application number: MXPA01013175A
Authority: MX
Inventors: Richard M Lawn
Original assignee: Cv Therapeutics Inc
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2002-06-04
Also published as: ATE422545T1; AU777461B2; NO20016114L; JP2003506097A; TWI259205B; HK1046708A1; NZ531401A; AU2005200171A1; TWI304737B; TR200200440T2; JP2005112859A; AU5746700A; JP4277956B2; KR20020012281A; AU5743400A; EP1218515A2; NO20016114D0; NZ516061A; JP2003508031A; AR024391A1

Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos novedosos ABC1 y moleculas de acidos nucleicos que codifican a los mismos. La invencion tambien se refiere a vectores recombinantes, celulas huesped y composiciones que comprenden polinucleotidos ABC1, asi como a los metodos de produccion de polipeptidos ABC1. La invencion tambien se refiere a anticuerpos que se enlazan especificamente a polipeptidos ABC1. Ademas, la invencion se refiere a metodos para incrementar el eflujo de colesterol, asi como a los metodos para incrementar la actividad y la expresion ABC1. La presente invencion ademas se relaciona con los metodos para identificar compuestos que modulan la expresion de ABC1 y con los metodos para detectar el nivel comparativo de polipeptidos ABC1 y polinucleotidos en un sujeto mamifero. La presente invencion tambien proporciona equipos y composiciones adecuados para el analisis en pantalla de compuestos para determinar la actividad de modulacion de la expresion ABC1 del compuesto, asi como equipos y composiciones adecuados para determinar si un compuesto modula el eflujo de colesterol dependiente de ABC1.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR EL EFLUJO DEL COLESTEROL Y ELEVAR HDL UTILIZANDO UN CASSETTE DE ENLACE ATP TRANSPORTADOR DE PROTEINA ABC1" Esta solicitud reclama la prioridad a la solicitud provisional Norteamericana No. 60/140,264, presentada el 18 de junio de 1999; solicitud provisional norteamericana No. 60/153,872, presentada el 14 de septiembre de 1999; y la solicitud provisional norteamericana No. 60/166,573, presentada el 19 de noviembre de 1999.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a polipéptidos ABC1 novedosos y moléculas de ácido nucleico que codifican los mismos. La invención también se refiere a vectores recombinantes, células huésped y composiciones que comprenden polinucleótidos ABC1, así como también a los métodos para producir polipéptidos ABC1. La invención también se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos ABC1.

Además, la invención se refiere a métodos para incrementar la emanación de colesterol así como también a métodos para incrementar la expresión y actividad de ABC1. La presente invención, además, se refiere a métodos para identificar compuestos que modulan la expresión ABC1 y métodos para detectar el nivel comparativo de polipéptidos ABC1 y polinucleótidos en un sujeto mamífero. La presente invención también proporciona equipos y composiciones adecuados, para compuestos de tamizado para determinar la expresión ABC1 que modula la actividad del compuesto, así como los equipos y composiciones adecuados para determinar si un compuesto modula la emanación de colesterol dependiente de ABC1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los lípidos circulantes en plasma humano o fluido linfático consisten de colesterol, esteres colesterílicos, triglicéridos y fosfolípidos. Estos lípidos se transportan en complejos moleculares grandes llamados lipoproteínas, que consisten de un núcleo de esteres de colesterilo y/o triglicéridos, en envoltura de fosfolípidos y colesterol libre, y apolipoproteínas (Scriver et al., Eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7th Ed., p. 1841-1851 (McGraw-Hill, New York 1995)). Las apolipoproteínas se involucran en el ensamble y secreción de la Mpoproteína, así como la activación de las enzimas que modifica lipoproteína, tales como la lecitin colesterol acil transferasa (LCAT). Además, las apolipoproteínas proporcionan integridad estructural y son ligadas para un amplio espectro de receptores y proteínas de ensamble de membrana. Las lipoproteínas de plasma se clasifican en cinco tipos de acuerdo al tamaño: quilomicrones (más grandes en tamaño y menores en USS. í i . , . densidad), poproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia ( I D L) , lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteína de densidad elevada (HDL). Los quilomicrones, VLDLs, IDLs, y LDLs transportan colesterol exógeno y endógeno y triaci Ig I ice roles a sitios periféricos, en donde los lípidos juegan un papel en varias trayectorias metabólicas y sirve como un constituyente principal de membranas celulares. Los quilomicrones se ensamblan en la mucosa intestinal como un medio para transportar colesterol dietético y triaci Ig I iceroles a varios tejidos. Las VLDL se forman en el hígado para transportar colesterol endógeno y triacilgliceroles sintetizados por el hígado en tejidos extra-hepáticos, tales como músculo y tejido adiposo. En el suero estable, las VLDL contienen 10-15% del colesterol de suero total y más de los triglicéridos. En la circulación, las VLDL se convierten a LDL a través de la acción de la lipoprotein lipasa. Las LDL son portadores de plasma primarios de colesterol para suministrar a todos los tejidos, típicamente conteniendo 60-70% del colesterol de suero estable total. En contraste, las HDL se implican en el "transporte de colesterol inverso", la trayectoria por la cual el colesterol en exceso se transporta desde los sitios periféricos de regreso al hígado, en donde se excretan en la forma de sales de bilis (Glomset, J.A., J. Lipid Res., 9, 155-167 (1968)). Las HDL nacientes se sintetizan de novo en el hígado y el intestino delgado, como depósitos de partículas en forma de disco ricos en proteína de colesterol y esteres de colesterol. De hecho, una función principal de HDL es actuar como almacenes de circulación de apolipoproteinas, principalmente apo C-l, apo C-ll y apoE. El 5 nacimiento de HDL ricas en proteínas se convierte en partículas de lipoproteína esféricas a través de la acumulación de esteres de colesterilo obtenidos a partir de fuentes celulares. La HDL normalmente contiene de 20-30% del colesterol de suero estable total. 10 De acuerdo con las teorías actuales, la emanación inversa del colesterol celular a HDL se media a través de dos mecanismos: una trayectoria de difusión acuosa y una trayectoria mediada por apolipoproteína. La importancia relativa de estos mecanismos distinguibles depende del tipo celular y estado 15 metabólico (Oram et al., J. Lipid Res., 37:2743-2491 (1996); Rothblat et al., J. Lipid Res., 40:781-796 (1999); Stein et al., Atherosclerosis, 144:285-301 (1999)). Para muchas células, la trayectoria de difusión acuosa es la trayectoria principal a través de la cual la emanación de colesterol ocurre (Johnson et al., 20 Biochim Biophys, Acta, 1085:273-298 (1991)). Esta trayectoria implica el intercambio bidireccional de coleslerol entre las membranas celulares y un aceptor de lipoproteína, tal como HDL, en el espacio extracelular a través de un proceso de transporte pasivo (Remaley et al., Arterioscler, Thromb. Vasc. Biol., 17:1813- 25 1821 (1997); Rothblat et al., J. Lip. Res.. 40:781-796 (1999)). El intercambio puece ocurrir principalmente en los mi c rodo minios de superficie conóc elos como caveola (Fielding et al , Biochemistry, 34:14288-14292 91995)). La emanación neta puede conducirse por conversión de colesterol en el compartimento extracelular al éster de colesterilo por la acción de LCAT. Alternativamente, en células de macrófago y fibroblasto, la emanación de colesterol y fosfolípído es principalmente mediada a través de apolipoproteínas tales como apo A-l, apo A-ll, y Apo E (Remaley, supra (1997); Francis, et al., J. Clin. Invest., 96:78-87 (1995); Vega et al., J. Intern. Med., 226:5-15 (1989); Sakar et al., Biochim. Biophys. Acta, 1438:85-98 (1999); Hará et al. J. Biol. Chem., 266:3080-3086 (1991); Fielding et al., J. Lipid Res., 38, 1503-1521 (1997); Oram et al., J. Lipid Res., 37, 2743-2491 (1996)). El proceso de la emanación líquida mediada por apolipoproteínas particularmente domina en macrófagos y otras células eliminadoras cuando son cargadas por colesterol y/o crecimiento interrumpido. La emanación mediada por apolipoproteínas es un proceso de transporte activo que requiere la interacción directa de las apolipoproteínas con la superficie celular, la lipidación de las apolipoproteínas, y la disociación subsecuente de la partícula de apolipoproteínas - lípido a partir de la célula (Oram, supra (1996); Méndez, A.J., J. Lipid Res., 38, 1807-1821 (1997); Remaley, supra (1997); Méndez, A.J., J. Lipid Res., 37,2510-2524 (1996)). Una vez removidas de la célula las partículas de HDL ricas en colesterol se transportan al hígado y remueven a partir del cuerpo como se describe. La función y/o metabolismo de lipoproteína anormal resulta del defecto genético o como un efecto secundario de otro trastorno que puede tener consecuencias biológicas serias. En adición a las influencias dietéticas, los trastornos tales como diabetes, hipotiroidismo, y enfermedad del hígado puede resultar en niveles de plasma elevados de LDL-colesterol y triglicéridos. Los niveles elevados de LDL-colesterol y triglicéridos han sido identificados como factores de riesgos mayores asociados con la incidencia de enfermedades coronarias, la cual es la principal causa de muerte en los Estados Unidos y otras naciones industrializadas (Hokanson et al., J. Cardiovasc. Risk., 3:213-219 (1996); The Expert Panel, JAMA, 269:3015-3023 (1993)). La acumulación de excesos de LDL-colesterol en las paredes arteriales puede conducir a la formación de placas ateroscleróticas, que juegan un papel principal en el desarrollo de enfermedad cardiaca. Una placa, se cree que se forma cuando los radicales libres se liberan de las paredes arteriales que oxidizan LDL. De acuerdo con la teoría, los accionadores LDL oxidizados forman una respuesta inflamatoria, atrayendo las células circulatorias al sitio el cual contribuye a la formación de placa de lípido. Entre estos están los macrófagos y otros células que contienen receptores de eliminación que acumulan colesterol en una manera no regulada (Brown et al., Ann. Rev. Biochem., 52:223-261 (1986)). Vastos almacenes de colesterol interno resultan en la conversión de un fenotipo de célula esponjosa, la cual se cree es un principal contribuidor al desarrollo de lesiones vasculares. A medida que la placa se intensifica, las paredes arteriales se contraen, reduciendo el flujo sanguíneo al corazón. De manera interesante, sin embargo, un ataque cardiaco se estima ocurre en 60% de personas que no tienen niveles sanguíneos elevados de LDL-colesterol. De estos, un estimado del 45% se asocian con niveles sanguíneos inferiores promedio de HDL-colesterol, indicando que el nivel de HDL-colesterol inferior es un factor de riesgo significante para la enfermedad cardiaca coronaria. De hecho, estudios recientes han indicado que un nivel de HDL-colesterol disminuido es la anormalidad de lipoproteína más común vista en pacientes con enfermedad de arteria coronaria prematura (Genest J., Circulation, 85:2025-2033 (1992); Genest et al., Arterioscler. Thromb., 13:1728-1737 (1993)). Aunque las bases de la asociación inversa entre HDL-colesterol y ei trastorno cardiaco coronario no son bien entendidas, se ha sugerido que el papel cardioprotector de HDL puede provenir de su actividad en relación a la promoción de la emanación de colesterol a partir de las células esponjosas de macrófago en lesiones ateroscleróticas. Un ejemplo de enfermedad cardiovascular asociada con HDL inferior en enfermedad de Tangier (TD), un trastorno genético raro caracterizado por una ausencia próxima o completa de HDL circulante. En adición a los niveles de plasma cerca de cero de HDL. los pacientes con TD tienen una deposición masiva y acumulación de esteres de colesterilo en varios tejidos, incluyendo amígdalas, nudos línfoides, hígado, bazo, timo, intestino, y células Schwann (Fredickson, D.S., J. Clin. Invest., 43, 228-236 (1964); Assmann et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease, (McGraw-Hill, New York, 1995)). Aunque los mecanismos celulares no han sido previamente identificados, estudios recientes han mostrado que las células de sujetos con TD son defectuosas en el proceso de remoción mediada por apolipoproteína de colesterol y fosfolípidos (Remaley et al., Arterioscler: Thromb. Vasc. Biol., 17, 1813-1821 (1997); Francis et al., J. Clin. Invest., 96, 78-87 (1995); Rogler et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 15, 683-690 (1995)). Estos resultados han llevado al propósitos que la deficiencia de HDL severa en pacientes TD proviene de la incapacidad de apo A-l nacientes a lípidos adquiridos. Debido a que no maduran en partículas ricas en lípidos. la HDL naciente en pacientes TD es rápidamente catabolizada y removida a partir del plasma, resultando en los niveles próximos a cero de la HDL circulante (Remaley, supra (1997); Francis, supra (1995); Horowitz et al., J. Clin. Invest., 91, 1743-1752 (1993), Schaefer et al., J. Lip. Res., 22:217-228 (1981)). Otros trastornos asociados con aterosclerosis prematura severa y riesgo elevado para el trastorno cardiaco coronario a resulta a partir de niveles HDL-colesterol disminuidos que son hipoalfalipoproteinemia y síndrome de deficiencia HDL familiar (FHA). Las personas con estos trastornos con frecuencia tienen niveles de LDL-colesterol y triglicéridos normales. Además, los trastornos tales como diabetes, alcoholismo, hipotiroidismo, enfermedad del hígado y presión sanguínea elevada puede resultar en niveles de plasma disminuidos de HDL-colesterol, aunque muchos de estos trastornos también se acompañan por niveles de LDL-colesterol y triglicérido elevados. Los tratamientos actuales para el trastorno cardiaco coronario se han enfocado principalmente en manipulaciones de dieta y/o terapias de fármaco que persiguen una disminución del nivel de LDL en plasma-colesterol por la inhibición de secreción de LDL o promoción de la renovación de LDL. Los derivados de ácido fíbrico, tales como clofibrato, gemfibrozil, y fenofibrato, promueven la renovación de VLDL rápida activando la lipoprotein lipasa. El ácido nicotínico reduce los niveles de plasma de VLDL y LDL inhibiendo la secreción hepática de VLDL. Además, los inhibidores de HMG-CoaA reductasa, tales como mevinolina, mevastatina, pravastatina, simvastatina, fluvastatina y lovastatina reducen los niveles de LDL en plasma inhibiendo la síntesis intracelular de colesterol, que provoca un incremento en la incorporación celular de LDL. Además, las resinas de unión de ácido de bilis, tales como colestirina, colestipol y probucol disminuyen el nivel de LDL-colesterol incrementando el catabolismo de LDL-colesterol en el hígado. >*** Sin embargo, muchas de estas terapias se asocian con baja eficacia y/o efectos secundarios que pueden evitar el uso a largo plazo. Poi ejemplo, el uso de inhibidores de HmG-CoaA reductasa porta un riesgo significante de toxicidad debido a que inhiben la síntesis de mevalonato, que se requiere para la síntesis de otros compuestos de isoprenoide importantes en la adición al colesterol. También, el gemfibrozilo y el ácido nicotínico se asocian con efectos serios adversos, incluyendo el daño renal, miopatía, mioglobinuria y el enrojecimiento y comezón de la piel intolerables. Además, el papel del probucol en tratar pacientes con trastorno cardiaco coronario es incierto debido a que su administración resulta en niveles de HDL-colesterol inferiores como un efecto secundario para reducir LDL-colesterol. Además, los pacientes tratados quienes tienen niveles HDL-colesterol inferiores aislados proporcionan un desafío terapéutico particularmente difícil. Por ejemplo, los pacientes con enfermedad de Tangier muestran un incremento de 4 a 6 veces en enfermedad cardiovascular aún cuando sus niveles de LDL son ya reducidos a aproximadamente 50%. Mientras existe alguna evidencia que el gemfibrozil y el ácido nicotínico pueden elevar simultáneamente los niveles de HDL, en general, en terapias que ayudan a la disminución de los niveles de LDL-colesterol en plasma no son efectivos para pacientes con Tangier que sufren de trastorno cardiaco coronario como un resultado de los niveles de HDL disminuidos. Así mismo, los pacientes con t*t?£.Jt A &*&>.*. *¿.rí*ím ^ • fr *-¿ í hipoalfalipoproteinemía, síndrome de deficiencia de HDL familiar, u otra enfermedad cardiovascular resultante de niveles inferiores de HDL no se beneficiarán de terapias objetivo en la disminución del nivel de LDL plasma. Los p'oblemas asociados con terapias actuales para enfermedad cardiovascular proviene parcialmente del hecho que la biología implicada en el movimiento de colesterol y fuera de las células no es entendida completamente. Además, las proteínas que juegan un papel en el movimiento de colesterol no son completamente conocidas. Por lo tanto, existe una necesidad para un mejor entendimiento de la biología celular de colesterol, así como nuevos métodos para tratar humanos que sufren de enfermedad cardiovascular y otros trastornos asociados con hipercolesterolemía. Adicionalmente, existe una necesidad para nuevos métodos para diagnosticar la enfermedad cardiovascular y nuevos métodos para tamizar pacientes para identificar aquellos de alto riesgo para desarrollar enfermedades cardiovasculares. La identificación de genes y proteínas implicadas en el transporte de colesterol podría utilizarse en el desarrollo de agentes farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades cardiacas y otros trastornos asociados con hipercolesterolemia y aterosclerosis. Además, la identificación de tales genes podría utilizarse en el desarrollo de ensayos de tamizado para tamizar compuestos que regulan la expresión de los genes asociados con el transporte de colesterol. La identificación de tales compuestos regulatorios podria utilizarse en el desarrollo de agentes terapéuticos adicionales. Además, la identificación de genes y proteínas implicados en el transporte de colesterol podría utilizarse como indicadores de diagnóstico de enfermedad cardiovascular y otros trastornos asociados con hipercolesterolemia.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polipéptidos y polinucleótidos novedosos implicados en la emanación de colesterol. Específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos (ABC1) de Cásete de Unión de ATP novedosos y polinucleótidos novedosos que codifican los polipéptidos ABC1. Los términos "ABC1" y "ABCA1" son alternativamente nombrados por la misma proteína y gen de Cásete de Unión de ATP. La invención proporciona polipéptidos ABC1, fragmentos de polipéptido, y variantes de polipéptido. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.. 2. La presente invención también proporciona polipéptidos ABC1 a partir de pacientes con enfermedad de Tangier. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO. 8. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un pol i péptid o aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 10. Además, la presente invención proporciona polinucleótídos ABC1, fragmentos de polinucleótido y vanantes de polinucleótido. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 2. También, en otras modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido ABC1 aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En aún otra modalidad preferida, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad con la SEC. DE IDEMT. NO.: 1. Más preferiblemente, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad con la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En otras modalidades más preferidas, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 1. También, en otras modalidades preferidas, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria al polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un polinucleótido que comprende nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, y un polinucleótido aislado que es complementario a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótído que tiene por lo menos 90% de identidad con la SEC. DE IDENT. NO.: 1. La presente invención también proporciona polinucleótidos ABC1 que corresponden a la región de flanqueo 5' del gen ABC1. En una modalidad preferida, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Preferiblemente, ei polinucleótido aislado comprende nucleótidos 1394-1532 de la SEC. DE IDENT NO . 3. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un polinucleótido aislado que se hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. También, en otras modalidades preferidas, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En aún otra modalidad preferida de la presente invención, un polinucleótido aislado que tiene por lo menos 80% de identidad en un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3 se proporciona. Más preferiblemente, el polinucleótido tiene por lo menos 90% de identidad en un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Aún más preferiblemente, el polinucleótido tiene por lo menos 95% de identidad en un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. También proporcionado en las modalidades preferidas es un polinucleótido aislado que tiene por lo menos 80% de identidad en un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o' 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Más preferiblemente, el polinucleótido tiene por lo menos 90% de identidad, y aún más preferiblemente por lo menos 95% de identidad, a un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, s a .^-•f Wßfím 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Además, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a los polinucleótidos de ABC1 de flanqueo 5' descritos anteriormente. En una modalidad preferida, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. La presente invención también proporciona polinucleótidos ABC1 que corresponden a la región de flanqueo 3' del gen ABC1. En modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5, o SEC. DE IDENT. NO.: 6, y las secuencias complementarias de la misma. En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.:5, o SEC. DE IDENT. NO.: 6, y las secuencias complementarias de la misma. En aún otras modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que tiene al menos 80% de identidad en un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5, o SEC DE IDENT. NO.: 6, y la secuencia complementaria de la misma Más preferiblemente, el polinucleótído tiene por lo menos 90% de identidad en un polínucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5, o SEC. DE IDENT. NO.: 6. Aún más preferible, el polinucleótido tiene por lo menos 95% de identidad en un oolinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5, o SEC. DE IDENT. NO.: 6. Además, la presente invención también proporciona los polinucleótidos ABC1 a partir de pacientes con enfermedad de Tangier. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 8. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 7. En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 10. En aún otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 9. La presente invención además proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a los polinucleótidos descritos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende cualquiera de los polín ucleótidos descritos anteriormente y un portador adecuado. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, un poiinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un poiinucleótido que comprende nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 2, y un portador adecuado. En otra modalidad preferida, la composición comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad con un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1 y un portador adecuado. En otras modalidades preferidas, la composición comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3 o un polinucleótido aislado que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3 y un portador adecuado. En aún otras modalidades preferidas, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3, o un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, así como también una composición que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad en un polin cleótido que comprende la SEC. DE IDENT NO.: 3, o un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3 y un portador adecuado. También proporcionada por la presente invención es una composición que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a cualquiera de los polinucleótidos descritos y un portador adecuado. Además, la presente invención proporciona vectores recombinantes y células huésped que comprenden cualquiera de las secuencias de polinucleótido ABC1 descritas. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, un polinucleótidc aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un polinucleótido aislado que comprende nucle?tidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o un polinucleótído aislado que codifica el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad, y más preferiblemente por lo menos 95% de identidad, JH.Íi.í í con un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.. 1. En aún otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT NO.: 7 o SEC. DE IDENT. NO.: 9. La presente invención proporciona además, un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a cualquiera de los polinucleótidos descritos. En aún otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende cualquiera de los polinucleótidos descritos y comprende, además, un polinucleótido promotor heterólogo. Un promotor heterólogo adecuado es un promotor de citomegalovirus. En una modalidad particularmente preferida, el vector recombinante es pCEPhABCl. La presente invención también proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de flanqueo 5' ABC1. En una modalidad preferida, la invención proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3, o un polinucleótido aislado que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.. 3. En aún otras modalidades preferidas, la invención proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido que hibpdiza bajo condiciones rigurosas al polinucleótido de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, o un polinucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT NO . 3, así como un vector recombinante que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad a estos polinucleótidos. La presente invención, además, proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótído aislado que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a cualquiera de los polinucleótidos descritos. En aún otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende cualquiera de los polinucleótidos deseados y además, comprende por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo. Los polipéptídos heterólogos adecuados incluyen luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa transferasa, y proteínas fluorescentes verdes. Preferiblemente, el polipéptido heterólogo es una proteína de luciferasa. En una modalidad particularmente preferida, el vector recombinante es pAPR1. Además, la presente invención proporciona células huésped que comprende cualquiera de los vectores recombinantes descritos. La presente invención además, proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los vectores recombinantes descritos y un portador adecuado. La presente invención también proporciona métodos para producir la proteína ABC1 en una célula huésped de mamífero así como métodos para expresar la proteína ABC1 en un sujeto mamífero. El método para producir una proteína ABC1 en una célula huésped de mamífero comprende las etapas de: (a) transfectar la célula huésped de mamífero con un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica ABC1 en una cantidad suficiente para producir un nivel detectable de la proteína ABC1, y (b) purificar la proteína ABC1 5 producida. El método para expresar la proteina ABC1 en un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar a un sujeto mamífero un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica ABC1 en una cantidad suficiente para expresar la proteína ABC1 en el sujeto mamífero. 10 Además, la presente invención proporciona composiciones y métodos adecuados para incrementar la emanación de colesterol a partir de las células de un sujeto mamífero. En una modalidad preferida, el método comprende administrar al sujeto mamífero un vector de expresión 15 recombinante que comprende un polinucleótido que codifica ABC1 en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol a partir de las células. Los vectores de expresión recombinantes incluyen vectores que comprenden un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende 20 la SEC. DE IDENT. NO.: 2, un polinucleótido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un polinucleótido aislado que comprende nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, y un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 25 98% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 2. Los vectores de *«?iaifr?ja^ i*,?^--J-'*'*1"- i á gi^a-,^4 expresión preferidos ¡ncluyen vectores virales, especialmente vectores adenovirales y vectores lentivírales. En otras modalidades, la invención proporciona sistemas de suministro no virales, incluyendo complejos de ligando de ADN, complejos de adenovírus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación CaP04, técnicas de disparo de gen, electroporación, liposomas y lipofección. En otra modalidad preferida, el método para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero comprende administrar al sujeto mamífero una cantidad terapéutica de un compuesto que incrementa la expresión de ABC1 en las células. Un método adecuado que comprende administrar al sujeto mamífero un análogo cAMP. Los análogos cAMP incluyen 8-bromo, cAMP, N6-benzoilo cAMP, y 8-tiometilo cAMP. Otro método adecuado comprende administrar al sujeto mamífero un compuesto que incrementa la síntesis de cAMP, por ejemplo, forskolina. Aún otro método adecuado comprende administrar al sujeto mamífero un compuesto que inhibe la degradación de cAMP, tal como un inhibidor de fosfodiesterasa. Los inhibidores de fosfodiesterasa adecuados ¡ncluyen rolipram, teofilina, 3-¡sob uti I- 1 -metilxantina, R020-1724, vinpocetina, zaprinast, dipiridamol, milrinona, amrinona, pimobendan, cilostamida, enoximona, peroximona, y vesnarinona. Además, otro método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero >% %<# &. comprende administrar al sujeto mamífero por lo menos un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol Los ligandos adecuados incluyen ligandos, LXR, RXR, FXR, SXR y PPAR. En otra modalidad preferida, el método comprende administrar a un sujeto mamífero un ligado para un receptor nuclear LXR. Los ligandos LXR adecuados incluyen 20(S) hidroxicolesterol, 22(R) hidroxícolesterol 24(S) hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, y 24(S), 25 epoxicolesterol. Preferiblemente, el ligando LXR es 20(S) hidroxicolesterol. En otra modalidad preferida, el método comprende administrar a un sujeto mamífero un ligando para un receptor nuclear RXR. Los ligandos RXR ¡ncluyen ácido retinoico 9-c/s, retinol, retinal, ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 13-c/s, acitretina, fenretinida, etretinato, CD 495, CD564, TTNN, TTNNPB, TTAB, y LGD 1069. Preferiblemente, el ligando RXR es ácido retinoico 9-c/s. En otra modalidad preferida, el método comprende administrar a un sujeto mamífero un ligando para un receptor nuclear PPAR. Un ligando adecuado es un ligando seleccionado de la clase de tiazolidíndionas. En aún otra modalidad preferida, el método comprende administrar por lo menos dos ligandos para un receptor nuclear. En una modalidad particularmente preferida, los ligandos son 20(S) hidroxicolesterol y ácido retinoíco 9-c/s. Además, otro método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero comprende administrar al sujeto mamífero un eicosanoide en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol. Los eicosanoides adecuados incluyen prostaglandina E2, prostaglandina J2, y prostaciclina (prostaglandina 12). En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto mamífero un compuesto que incrementa la actividad de ABC1 en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol a partir de las células. La presente invención también proporciona métodos adecuados para incrementar la expresión del gen de ABC1 en un sujeto mamífero. En una modalidad preferida, el método comprende administrar al sujeto mamífero por lo menos un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la expresión del gen de ABC1. Los ligandos adecuados incluyen ligandos para receptores nucleares LXR, RXR, FXR, SXR y PPAR. En otra modalidad, el método comprende administrar al sujeto mamífero un análogo cAMP en una cantidad sufíciente para incrementar la expresión del gen de ABC1. En aún otra modalidad preferida, el método comprende administrar al sujeto mamífero un compuesto que incrementa la síntesis de cAMP en una cantidad suficiente para incrementar la expresión del gen de ABC1.

. Además, la presente invención proporciona un método para tamizar un compuesto de prueba para la expresión de ABC1 modulando la actividad que comprende las etapas de (a) enlazar operativamente un ADNc reportero con una expresión que modula 5 la porción del gen ABC1 de mamífero para producir un constructor reportero recombinante; (b) transfectar el constructor reportero recombinante en una población de células huésped; (c) ensayar el nivel de gen de ia expresión del gen reportero en una muestra de las células huésped; (d) poner en contacto las células huésped 10 con el compuesto de prueba siendo tamizado; (e) ensayar el nivel de la expresión del gen reportero en una muestra de las células huésped después del contacto con el compuesto de prueba; y (f) comparar el cambio relativo en el nivel de la expresión del gen reportero provocado por la exposición al compuesto de prueba, por 15 lo que determina la expresión de ABC1 que modula la actividad. El constructor reportero recombinante comprende un gen reportero operativamente enlazado a una expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero, tal como cualquiera de las secuencias de región de flanqueo 5' ABC1 proporcionadas por la presente 20 invención. En una modalidad preferida, la porción que modula la expresión del gen ABC1 comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En otra modalidad preferida la porción que modula la expresión del gen ABC1 comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. 25 Los ADNcs reporteros adecuados ¡ncluyen luciferasa, ß- inMigtfi » , I . galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa y ADNc de proteína fluorescente verde. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero. En una modalidad particularmente preferida del método, el constructor reportero recombinante es pAPR1. 5 También proporcionado por la presente invención es un método para tamizar un compuesto de prueba para determinar si el compuesto de prueba promueve la emanación de colesterol mediada por ABC1 a partir de células en cultivo que comprenden las etapas de: (a) ensayar el nivel de emanación de colesterol en 10 una muestra de células de mamífero mantenidas en cultivo para determinar un nivel de control de emanación de colesterol; (b) poner en contacto las células con el compuesto de prueba siendo tamizado; (c) ensayar el nivel de emanación de colesterol en una muestra de células después del contacto con el compuesto de 15 prueba; (d) ensayar el nivel de emanación de colesterol mediada por ABC1 en una muestra de células después del contacto con el compuesto de prueba, por lo que determina si el compuesto de prueba promueve la emanación de colesterol mediada por ABC1 a partir de las células en cultivo. Las células pueden derivarse de 20 cultivos primarios o en línea celular. Las células adecuadas para tamizar el compuesto de prueba incluyen fibroblasto, macrófago, líneas celulares hepáticas e intestinales. Preferiblemente, la línea celular es RAW 264.7. En una modalidad preferida, la emanación de colesterol mediada por ABC1 se mide utilizando un anticuerpo 25 anti-ABC1 que inhibe la actividad de ABC1 hasta la unión. En otra S*S .~&??Z*?Í. modalidad preferida, la emanación de colesterol mediada por ABC1 se mide utilizando un polinucleótido ABC1 antísentido. En una modalidad particularmente preferida, el polinucleótido antisentido comprende la SEC. DE IDENT NO.: 57. Además, la presente invención proporciona métodos para detectar el nivel comparativo de la expresión de ABC1 en células de un sujeto mamífero. Tales métodos pueden usarse para determinar la susceptibilidad de un sujeto para enfermedad cardiaca coronaria. Se proporciona un método para detectar el nivel comparativo de expresión de ABC1 en células de un sujeto mamífero el cual comprende (a) obtener una muestra celular de un sujeto mamífero, (b) ensayar el nivel de expresión de ARNm ABC1 en la muestra celular; y (c) comparar el nivel de expresión de ARNm ABC1 en la muestra celular con un nivel estándar predeterminado de la expresión de ARNm ABC1, por lo detecta el nivel comparativo de la expresión del gen ABC1 en las células de un sujeto mamífero. Los métodos adecuados para medir el nivel de expresión ARNm ABC1 incluyen, por ejemplo, RT-PCR, tinción northern, y ensayo de protección ARNs. La presente invención también proporciona métodos para detectar el nivel comparativo de proteína ABCl en células de un sujeto mamífero. Tales métodos pueden usarse para determinar la susceptibilidad de un sujeto para enfermedad cardiaca coronaria. Se proporciona un método para detectar la cantidad comparativa de proteína ABC1 en las células de un sujeto mamífero el cual comprende (a) obtener una muestra celular a partir del sujeto mamífero, (b) ensayar la cantidad de proteína ABC1 en la muestra celular, y (c) comparar la cantidad de proteína ABC1 en la muestra celular con una cantidad estándar predeterminada de proteína ABC1, por lo que se detecta el nivel comparativo de proteína ABC1 en las células del sujeto mamífero. La cantidad de proteína ABC1 puede determinarse utilizando varios inmunoensayos disponibles en la técnica. Por ejemplo, la cantidad de la proteína ABC1 puede determinarse por (a) poner en contacto la muestra celular con una población de anticuerpos anti-ABC1 y (b) detectar los anticuerpos ABC1 de unión específicos asociados con la muestra. Los métodos adecuados para detectar los anticuerpos ABC1 incluyen tinción wester, ¡nmunoprecipitación y FACS. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos ABC1 descritos. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 98% de identidad con la SEC. DE IDENT. NO.: 2. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. En aún otra modalidad, el & % \z anticuerpo, en la unión con un polipéptído ABC1, inhibe la actividad d transporte de colesterol del polipéptido ABC1. Ad emás, la presente invención proporciona equipos adecuados para tamizar un compuesto para determinar la expresión i e ABC1 modulando la actividad del compuesto que comprende un ADNc reportero operativamente enlazado a una expresión c ue modula la porción del gen ABC1 de mamífero en una cantid d suficiente por lo menos un ensayo e instrucciones para uso. En una modalidad preferida, el equipo, además, comprende medios para detectar el gen reportero. En otra modalidad ireferida, la porción que modula la expresión del gen ABC1 de m amífero comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En aún otra modali dad preferida, la porción que modula la expresión del gen ABC1 d e mamífero comprende nucleótídos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. N O 3. Los ADNc reporteros adecuados incluyen luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, y ADNc de p roteína fluorescente verde. Preferiblemente, el ADNc reportero es luciferasa. En una modalidad particularmente preferida d el método, el constructor reportero recombinante es pAPRL L a presente invención también proporciona equipos adecuados para tamizar un compuesto para determinar si el compuesto modula la emanación de colesterol dependiente de ABC1. En una modalidad preferida, el equipo comprende un anticuerpo ant?-ABC1 inactivado en una cantidad suficiente para al menos un ensayo e instrucciones para uso En otra modalidad preferida, el equipo comprende un oligonucleótido ABC1 antisentído en una cantidad suficiente para al menos un ensayo e instrucciones para uso. En una modalidad particularmente preferida el oligonucleótido ABC1 antisentido comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 53.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 10 La Figura 1A-D es una representación gráfica que muestra los resultados de la emanación de colesterol de control y emanación de colesterol en la presencia de HDL y apo A-l a partir de células de fibroblastos normales (IA, C) y células de fibroblastos a partir de pacientes con enfermedad de Tangier (IB, 15 D). Los círculos abiertos representan la emanación de colesterol a partir de células que no se exponen a HDL o apo A-l, los círculos cerrados representan la emanación de colesterol a partir de células expuestas a HDL, y los diamantes cerrados representan la emanación de colesterol a partir de células expuestas a apo A-l; 20 A- 3H-colesterol de % total; B-control, HDL, apo A-l; C-horas. La Figura 2 es una representación gráfica de un análisis de microdisposición que muestra una comparación de la expresión del gen encontrado en células a partir de pacientes de Tangier (TD1) y que se encuentra en células normales, por lo que un total 25 de ADNcs de 58,800 humanos se hibridizaron con ADNs preparada J. á^^^^m.¿^¿ü^: a partir de ARNm de células TD1 tratadas con cAMP (marcadas con tinte Cy3) y con ADNc preparado a partir de ARNm de células normales tratados con cAMP (marcadas con tinte C5); A-Valor de Señal CyS-normal, B-Valor de Señal CyS-Tangier. La Figura 3 es un diagrama esquemático que muestra un mapa de restricción del vector de expresión recombinante pCEPhABCI, el cual contiene el marco de lectura abierto del gen ABC1 humano. La Figura 4 es un diagrama esquemático de la estructura de gen del ABC1 humano, mostrando una comparación entre la secuencia de aminoácido ABC1 humana publicada, mostrando una comparación entre la secuencia de aminoácido ABC1 humana publicada (GenBank, Acceso # AJ012376) y actualmente secuencia de aminoácido ABC1 humana ("CVT") descrita y reclamada la cual tiene sesenta aminoácidos adicionales en el extremo terminal N; A-Estructura de Gen CVT ABCA1; B-sítios Iniciales de Transcripción aproximada; C-marco de lectura abierto ATG, CVT; D-60 aminoácidos; E-marco de lectura abierto ATG GENBANK; F- 49, G-clon pAPRI. La Figura 5 es una representación gráfica que muestra el efecto inhibidor que el transportador ABC1 inhibe el ácido 4,4-diísotiocianotilben-2,2'-disulfónico (DIDS) y sulfobromoftaleína (BSP) tienen una emanación de colesterol mediada por apo A-l, en donde los círculos abiertos indican el colesterol mediado por apo A-l en la presencia de BSP y los círculos cerrados indican el colesterol mediado por apo A-l en la presencia de DIDS A-emanación de colesterol específico apo A-l, B-fármaco mM La Figura 6 es una representación gráf;ca que muestra el efecto inhibidor de un oligonucleótido ABC1 antisentido en emanación de colesterol mediada por A-i, mostrando la emanación de colesterol mediada por apo A-l, mostrando la emanación de colesterol mediada por apo A-l en células incubadas sin oligonucleótído antisentido, la emanación de colesterol mediada por apo A-l en células expuestas a oligonucléotido antisentido ß-globina 30 µM, y la emanación de colesterol mediada por apo A-l en células expuestas a 30 µM de oligonucleótido antisentido ABC1; A-emanación de colesterol específico apo A-l; B-sin oligo; C-oligo control; D-oigo antisentido. La Figura 7 es una representación gráfica que demuestra la estimulación de la emanación de colesterol mediada por apo A-l provocada por la sobreexpresión del gen ABC1 utilizando células de macrófago de ratón RAW 264 7 establemente transfectadas con un plásmido de expresión para ABC1 humana (pCEPhABCI), mostrando la emanación de colesterol mediada por apo A-l en células paternas control (sin pCEPhABCI) y la emanación de colesterol mediada por apo A-l en células clónales transfectadas cpm pCEPhABCI (L3, L5, L6); A-emanación de colesterol específico apo A-l. La Figura 8 es una representación gráfica de análisis de reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT- PCR) mostrando el nivel de expresión del gen ABC1 en células normales y células a partir de pacientes con enfermedad de Tangier (TD1 y TD2) que han sido ya sea expuestos a albúmina (barras cerradas), expuestas a 8-Br-cAMP (barras abiertas), 5 cargadas de colesterol (barras sombreadas), o colesterol cargado y subsecuentemente expuesto a apo A-1 (barras tramadas); A- ARNm ABC1 (abundancia relativa), B-normal. La Figura 9 es una representación gráfica de los resultados del análisis RT-PCR que muestra el nivel de la 10 expresión del gen ABC1 en células RAW 264.7 expuestas en ya sea etanol (0.1% v/v), ácido retinoico 9-cis (RA 9-c/s RA; 10 µM) 20(S) hidroxicolesterol (20(S)-OH; 10 µM), o 9-c/s RA y 20(S)-OH (10 µM cada uno); A-abundancia ARNm ABC1 A-l (unidades arbitrarias); B-etanol. 15 La Figura 10 muestra los resultados de análisis de inmunoprecipitación indicando el nivel de superficie celular de la proteína ABC1 encontrada en fibroblastos normales (NL1, 10A) y fibroblastos de un paciente con enfermedad Tangier (TD1, 10B) en la presencia de ya sea ningún aditivo (control), 8-Br-cAMP (1 mM), 20 colesterol (30 µg/ml), colesterol y 8-Br-cAMP (30 µg/ml y 1 mM, respectivamente). La Figura 11 es un diagrama esquemático que muestra un mapa de restricción del vector de expresión recombinante pAPR1, que contiene la región de flanqueo 5' del gen ABC1 ddM fflItjÜU colocado corriente arriba del marco de lectura abierto del gen evaluados de luciferasa. La Figura 12 es una representación gráfica que muestra en el nivel de la expresión del gen reportero de luciferasa inducido en células RAW 264.7 transfectadas con pAPR1 en la presencia de ya sea EtOH (control, 20(S)-OH (10 µM), RA 9-c/s (10 µM o ambos 20(S)-OH y RA 9-c/s (10 µM cada una); A-actividad luciferasa (unidades de luz relacionadas); B-etanol La Figura 13 es un diagrama esquemático de la región de flanqueo 5' del gen ABC1; A-región de flanqueo 5' del gen ABC1; B-sitio inicial de transcripción; C-caja TATA, D-medio sitio del receptor de hormona nuclear; E-elemento de respuesta LXR; F-sitio SP1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De acuerdo con la presente invención se proporcionan, los polipéptidos novedosos que incrementan la emanación de colesterol a partir de células. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos (ABC1) de Cásete 1 de Unión de ATP que han sido mostrados para incrementar la emanación de colesterol. La ABC1 es un miembro de la familia de proteínas de cásete de unión de ATP que reside en membranas celulares y utiliza hidrólisis ATP para transportar una amplia variedad de sustratos a través de la membrana de plasma. Se deberá notar que los términos "ABC1" y "ABCA1" se refiere a la misma proteína de cásete que se me a ATP. El término "ABCA1" se introduce en 1999 por un comité de nomenclatura y ha recibido aceptación limitada en el campo. A la fecha, más de 30 miembros de esta familia han sido identificados en el genoma humano. Estas proteínas homologas contienen estructuras similares a canal a través de las cuales las moléculas se transportan a través de la membrana celular y uno o dos dominios que se une a ATP para acoplar energía generando la hidrólisis de ATP para transportarla. Los miembros de la familia incluyen los factores de resistencia multifármaco (MDR/P-glícoproteínas; Chen et al., Cell, 47:381-389 (1986); Stride et al., Mol. Pharmacol.. 49:962-971 (1996)), transportadores asociados con presentación de antígeno (Neefjes et al., Science, 261:769-771 (1993); Shepherd et al., Cell, 74:577-584 (1993)), y el regulador de conductancia de la transmembrana de fibrosís cístíca (Chang et al., J. Biol. Chem., 269:18572-18575 (1994); Rommens et al., Science, 245: 1059-1065 (1989)). Los miembros de la familia de transportador ABC se componen generalmente de 4 dominios encontrados dentro de dos mitades simétricos que se enlazan por una región cargada larga y un segmento altamente hidrofóbico. Cada mitad contiene un dominio hidrofóbico, que contiene 6 segmentos de transmembrana y un nucleótido hidrofírico que se une al dominio conteniendo conversión elevada de secuencia Waiker A y B motivo típico de muchas ATPases (Hyde et al., Nature, 346:362-365 (1990); Luciani et al., Genomics, 21: 150-159 (1994)) La actividad transportadora es dependiente de la interacción con ATP en el nucle?tido que une los dominios y por la regulación a través de la fosforilación de residuos en la región que se une a las dos mitades simétricas 5 (Becq et al., J. Biol. Chem., 272:2695-2699 (1997)). Varias líneas de evidencia descritas en la presente identifican ABC1 como una proteína pivotal en la movilización mediada por alipoproteína de almacenes de colesteroi intracelulares. Primero, los estudios presentados en la presente 10 muestran que la ABC1 es defectuosa en enfermedad de Tangier, un trastorno genético caracterizado por el metabolismo de HDL- colesterol anormal. Como se muestra previamente, y en la presente en el Ejemplo 1, el efecto genético en enfermedad Tangíer provoca un defecto en la trayectoria de emanación 15 mediada por apolipoproteína de colesterol a partir de las células, resultando en actividad de emanación de colesterol significativamente disminuida y niveles de HDL-colesterol bajos (Oram et al., J. Lipid Res, 37:2743-2491 (1996); Francis et al., J. Clin. Invest., 96: 78-87 (1995)). Los análisis de conexión 0 genéticos de las familias con enfermedad de Tangier asignadas al gen defectuoso a un intervalo en el cromosoma 9q31 (Rust et al., Nature Genetics, 20:96-98 (1998)). Una búsqueda de bases de datos públicos reveló que el gen ABC1 se localizó en el cromosoma 9q22-9q31, el cual es tan amplio que, pero incluye el 5 intervalo revelado en Rust et al. (Luciani et al., supra 81994)). í?l?tri-|i? Ti ?í " ¡aSife Basado en aquellos datos, el mapeo híbrido de radiación del gen ABC1 humano se realizó, el cual se colocó en el gen entre dos marcadores cuadrados con la región 7-cM de cromosoma 9q31 humano reportado por Rust et al. En adición, como se muestra en el Ejemplo 2, el análisis de microdisposición revela que el gen ABC1 es no expresado de 2.5 veces en células de pacientes Tangier como se comparó con las células normales. Estos estudios identifican el gen de defectuoso en la enfermedad de Tangier como ABC1. Además, estudios adicionales muestran que los inhibidores de la actividad de transporte ABC1, tal como ácido 4,4-diisotiocianostilben-2,2'-disulfónico (DIDS) y sulfobromoftaieina (BSP), también inhiben la emanación de colesterol mediada por apoAl, a partir de células de fibroblastos (ver Ejemplo 6). También la inhibición de la expresión del gen ABC1, utilizando un oligonucleótido ABC1 antisentido se muestra para inhibir la emanación de colesterol mediada por apoAl a partir de células de fibroblastos (Ejemplo 7). En contraste, los estudios de transfección, en los cuales el gen ABC1 se transfectan dentro de las células de monocito de ratón, mostraron que la sobreexpresíón de ABC1 resulta en un incremento en emanación mediada por apoAl (Ejemplo 8). Finalmente, la RT-PCR realizado utilizando ARNM de pacientes Tangier y del tipo silvestre reveló que ARNm que la expresión de ARNm ABC1 se regula por las condiciones celulares relacionadas a la emanación de colesterol en células de fibroblastos de piel normal, pero no en fibroblastos de pacientes & &.ii Á J Á con Tangier (Ejemplo 9). Basado en estos descubrimientos, se determinó que ABC1 juega un papel principal en la emanación de colesteroi. Se postula que ABC1 juega un papel en la translocación de colesterol intracelular en la hoja exterior de la membrana de plasma. El transporte deficiente de colesterol intracelular debido a la pérdida de ABC1 o ABC1 defectuosa resulta en una pérdida de colesterol en dominios de membrana específicos con cuyo apoAl y otras alopoprotei ñas específicas interactúa (Stangl et al., J. Biol. Chem., 273: 31002-31008 (1998); Babitt et ai., J. Biol. Chem., 272:13242-13249 (1997)). El suministro fallido del colesterol a apoAl conduce a la formación de partícula de HDL deficientes de colesterol que son rápidamente removidas a partir del plasma (Bojanovski et al., J. Clin. Invest., 80: 1742-1747 (1987)).

Definiciones Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de ciertos términos usados a través de esta especificación. En la presente invención, "aislado" se refiere al material removido a partir de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está ocurriendo naturalmente), y así se altera "por la mano del hombre" a partir de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado podría ser parte de un vector o una composición de materia, o podría contenerse dentro de una célula, y aún ser "aislado" debido al vector, composición de materia, o la célula particular no está en el ambiente original del polín ucleótido. Como se usa en la presente, el término "polinucleótido(s)" se define para abarcar ADN y ARN de origen sintético y natural. El polinucleótido puede existir como ADN, o ARN de trenzado sencillo o doble, o un heteroduplex ARN/ADN. De esta manera el polinucleótido de la presente invención puede comprenderse de cualquier polinucleótido o polidesoxribonucleótido, que puede ser ARN o ADN modificado o ARN o ADN sin modificar. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden componerse de ADN de trenzado sencillo y doble, el ADN es una mezcla de regiones de trenzado sencillo o doble que es una mezcla de regiones trenzadas sencillas y dobles, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser sencilla o doble o, más típicamente, de doble trenzado o triple trenzado, o una mezcla de regiones de trenzado sencillo y doble. En adición, el polinucleótido puede componerse de regiones de triple trenzado que comprende ARN o ADN o ambos ARN y ADN. Un polinucleótido puede también contener una o más bases modificadas o columna de base de ADN o ARN modificadas por ia estabilidad o para otras razones. Bases "modificadas" ¡ncluyen, por ejemplo, bases tritíladas y bases inusuales tales como inosina. Una variedad de modificaciones puede estar hechas para ADN y ARN; así, el "polinucleótido" abarca química, enzimática o metabólicamente formas modificadas de polinucleótidos. El término "polinucleótido(s)" también abarca polinucleótidos cortos con frecuencia referidos como oligonucleótido(s). El término "polipéptido(s)" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces de péptido o por enlaces de péptido modificados. "Polipéptido" se refiere a ambas secuencias de aminoácido cortas, comúnmente mencionadas como péptidos, así como secuencias de aminoácido largo, generalmente mencionadas como proteínas. El polipéptido puede contener aminoácidos diferentes del gen 20 que codifica aminoácidos. Además, el polipéptido puede modificarse ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones post-traslacionales, o por técnicas de modificación química, que son bien conocidos en la técnica. Un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. También, el mismo de tipo modificación puede estar presente en el mismo o variar el grado de uno o más sitios en el polipéptido. Las modificaciones pueden ocurrir donde quiera en el polipéptido, incluyendo la columna base de péptido, las cadenas laterales de aminoácido, y el amino o carboxilo terminal. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ÁDP-ribosilación, amidación, formilación, gama-carboxilación, glicosilación, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, fosforilación, fenilación, sulfación, y selenoxilación, así como la unión covalente de un nucleótido o derivado nucleótido, un lípido o derivado lípido, o fosfotidilinositol. Otras modificaciones incluyen reticulamíento, ciclización, formación de piroglutamato, formación de ancla GPl, procesamiento proteolítico, racemización, y adición mediada por t-ARN de aminoácidos, tales como arginilación y ubiquinación. Ver, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd, Ed., T.E. Creighton, W. H. Freedman and Co., New York (1993); Wold. F., Posttranslational Protein Modification; Perspectives and Prospects, ¡n Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson. Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol., 182:626-626 (1990) y rattan et al., Proteíns Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci., 663: 48-62 (1992)). Los polipéptidos de la invención pueden prepararse en cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipeptidos naturalmente aislados, polípéptídos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Medios para preparar tales polipéptidos son bien entendidos en la técnica. Un "polinucleótido" de la presente invención también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibridizar, bajo condiciones de hibridización rigurosas, a la SEC. DE IDENT. NO.: 3 o nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643 o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, o los complementos de los mismos. Un polinucleótido de la presente invención también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibpdizar, bajo condiciones de hibridización rigurosas, a la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5 o SEC. DE IDENT. NO.: 6, o los complementos de las mismas. 5 Las "condiciones de hibridización rigurosas" se refieren a una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, 5x SSC (750 mM de NaCI, 75 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6) 5x de solución Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 µg/ml de ADN 10 de esperma de salmón despojado, desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 0.1 x SSC a aproximadamente 65°C. Como se usa en la presente, el término "complementario" se refiere a la hibridización o pares de base entre nucleótidos, tales como, por ejemplo, entre las dos hebras 15 de un polinucleótido de doble hebras o entre un oligonucleótido cebador y un sitio de unión cebador en un polinucleótido de una sola hebra para ser amplificado o secuenciado. Dos moléculas de nucleótido de una hebra están para ser complementarias cuando los nucleótidos de una hebra, óptimamente alineada con las 20 inserciones de nucleótido apropiadas, supresiones o sustituciones, pares con al menos aproximadamente 80% de los nucleótidos de la otra hebra. "Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más 25 secuencias de polinucleótido, como se determinó comparar las a?«¡¡É¡Aa8?^iiaMÉm.afe«rat«» secuencias. "Identidad" o "similaridad" también tiene un significado de técnica reconocido que se refiere al grado de secuencia relacionada entre las secuencias de polipéptido o pohnucleótido, como se determinó por la oposición entre las cuerdas de tales secuencias. "Identidad" y "similapdad" pueden calcularse utilizando un número de métodos bien conocidos, incluyendo aquellos publicados en Computational Molecular Bíology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); Biocomputíng; Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M , y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, (1987); y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, (1991); y Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)) Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similapdad entre dos secuencias incluyen, pero no se imitan a, aquellos descritos en "Guide to Huge Computers", Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, (1994), y Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar identidad se designan para dar emparejamiento largo entre las secuencias probadas. Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas de computadora, incluyendo el paquete de programa GCG (Devereux, Í?.t i.¿ ri J , et al , Nucleic Acids Research (1984) 12(1) 387 (1984)), BLASTP, BLASTN. FASTA (Atschul, S.F et al., J Molec. Biol. 215.403 (1990), programa Bestfit (Wísconsin Sequence Anaiysís Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison Wl 53711 (utilizando el lgoritmo de homología local de Smíth and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). Cuando se usa cualquiera de los programas de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 90% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen así como el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total del polipéptido o se permite polinucleótido de referencia y que abre en identidad hasta el 10% del número total de nucleótidos en el polínucleótido de referencia. Un método preferido para determinar el mejor emparejamiento total entre una secuencia dudosa (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también se refiere a un alineamiento de secuencia global, puede determinarse utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App.Bioscí. 6:237-235 (1990)) El término "secuencia" incluye secuencias de nucleótido y aminoácido. En un alineamiento de secuencia las secuencias dudosas y sujeto son ya sea secuencias de nucleótido o secuencias aminoácido. El resultado de tal alineamiento de secuencia global es en identidad en por ciento. Los parámetros preferidos usados en una búsqueda FASTDB de una secuencia de ADN para calcular la identidad por ciento son Matriz = Unitaria, k-tuple = 4, Mismatch Penal ty=1, Joíning Penal ty=30, Grupo de Aleatorización de Longitud = 0, y Clasificación Cutoff=1, Penalty Abierto = 5, Penalty de Tamaño Abierto 0.05, y Tamaño de Ventana = 500 o secuencia de longitud dudosa en bases de nucleótido, cualquiera es más corta. Los parámetros preferidos empleados para calcular el por ciento de identidad y similaridad de un alineamiento de aminoácido son: Matriz = PAM 150, k-tuple = 2, Mismath Penalty=1, Joining Penalty = 20, Grupo de Aleatorización de Longitud = 0, Clasificación Cutoff=1, Penalty abierto = 5, Penalty de tamaño Abierto =0.05, y Tamaño de Ventana = 500 o secuencia de longitud dudosa en residuos aminoácidos cualquiera es más corto. Como una ilustración, un polinucleótído que tiene una secuencia de nucleótido de por lo menos 90% de "identidad" en una secuencia contenida en la SEC. DE IDENT. NO.: 1 significa que la secuencia de nucleótido del polinucleótido es idéntica a una secuencia contenida en la SEC. DE IDENT. NO.: 1, excepto que la secuencia de polinucleótido puede incluir hasta diez mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de la longitud total de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad a la SEC. DE IDENT. NO.: 1, hasta 10% de los nucleótidos en la secuencia contenida en la SEC. DE IDENT NO.: 1 puede eliminarse, insertarse, o sustituirse con otros nucleótidos. Estos cambios pueden ocurrir en donde sea a través del polinucleótido, y pueden esparcirse ya sea individualmente entre los nucleótidos o en uno o más grupos contiguos dentro de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Similarmente, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de por lo menos 98% de "identidad" a una secuencia contenida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 significa que la secuencia de aminoácido del polipéptido es idéntica a una secuencia contenida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 excepto que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta 2 alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la longitud total de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido en por lo menos 98% idéntica a la SEC. DE IDEMT. NO.: 2, hasta 2% de los residuos aminoácidos en la secuencia contenida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 pueden eliminarse, insertarse, o sustituirse con oíros residuos aminoácidos. Estos cambios pueden ocurrir donde sea a través del polipéptido, y pueden esparcirse ya sea individualmente entre los residuos o en uno o más grupos contiguos dentro de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. "Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a un polipéptído que muestra actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo actividad que transporta colesterol), como se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de dosis. En el caso donde la dependencia de dosis existe, no es necesario ser idéntica a aquella del polipéptído, pero más bien sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada como la comparada al polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato mostrara mayor actividad o no más que aproximadamente 25 veces menor y, preferiblemente, no más que aproximadamente diez veces menor actividad, y más preferiblemente, no más que aproximadamente tres veces menos actividad relativa al polipéptido de la presente invención). La "variante de polipéptido" se refiere a un polipéptido que se difiere a partir del polipéptido ABC1 de la presente invención, pero retiene propiedades esenciales del mismo. Generalmente, las variantes son de manera total intimamente similares y, en muchas regiones, idénticas al polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. Preferiblemente, la variante de polipéptido retiene su actividad biológica, es decir, actividad de transporte de colesterol. Las variantes incluyen, pero no se limitan a, variantes de empalme y variantes alélicas, así como las variantes de adición, eliminación y sustitución. Así mismo, "variante de poiinucleótido" se refiere a un polinucleótido que se difiere del polinucleótido de la presente invención, pero retiene propiedades esenciales del mismo. Las vanantes pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones sin codificación, o ambas. Así, por ejemplo, una variante de polinucleótido ABC1 tiene una secuencia de nucleótido que se difiere a partir de la SEC. DE IDENT. NO.. 1, pero codifica un polípéptido que tiene la actividad que transporta el colesterol. También, por ejemplo, una variante de polinucleótido tiene una secuencia de nucleótido que difiere de aquella de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, pero retiene la actividad promotora. Especialmente preferidas son las variantes de polinucleótido que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o eliminaciones silenciosas pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Las variantes de nucleótido producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético son preferidas. Además, las variantes en las cuales 10-20, 5-10, 1-5, o 1-2 aminoácidos son sustituidas, eliminadas, o agregadas en cualquier combinación son también preferidas. Las variantes de polinucleótido pueden producirse por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codón para un huésped particular (por ejemplo, cambiando codones en el ARNm humano a aquellos preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli). Las "variantes alélicas" son variantes naturales que se refieren a una ae las varias formas alternativas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar en ya sea el nivel de polinucleótido y/o polipéptido. Alternativamente, ninguna variantes que ocurren no naturalmente pueden producirse por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. El terruño "sustitución de aminoácido conservadora" se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo tal como el que existe poco o sin efecto en la polaridad o carga del residuo aminoácido en aquella posición. Por ejemplo, una sustitución conservadora resulte a partir del reemplazo de un residuo no polar en un polipéptido con cualquier otro residuo no polar. Otro ejemplo de una sustitución conservadora es el reemplazo de un residuo acídico con otro residuo acídico. Las sustituciones conservadoras se esperan para producir polipéptidos ABC1 que tienen características funcionales y químicas similares a aquellas del polipéptido ABC1 que ocurre naturalmente. El término "ortólogo" se refiere a un polipéptido que corresponde a un polipéptido identificado a partir de especies diferentes. Por ejemplo, polipéptidos ABC1 de ratón y humano se consideran ortólogos. El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo ácido nucleico, plásmido, o virus) usada para transferir la información de codificación en una célula huésped .

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirige y/o controla la expresión de las secuencias de ácido nucleico heterólogas 5 insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción, y empalme de ARN, si los intrones están presentes. Como se usa en la presente, el término "región reguladora transcripcional" o "expresión que modula la porción" se 10 refiere a cualquier región del gen, incluyendo, pero no limitándose a, promotores, mejoradores, y represores. Como se usa en la presente, el término "promotor" se refiere a una secuencia no transcrita ubicada corriente arriba (es decir, 5') al codón de inicio de un gen estructural (generalmente 15 dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controla la transcripción del gen estructural. Como se usa en la presente, el término "mejoradores" se refiere a elementos que actúan cis de ADN, usualmente de aproximadamente 10-300 bp en longitud, que actúa en el promotor 20 para incrementar la transcripción. Los mejoradores son relativamente independientes de orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' a la unidad de transcripción. "Célula huésped" es una célula que ha sido transformada o transfectada, o es capaz de transformación o 25 transfección por una secuencia de polinucleótido exógena. El término incluye la progenie de la célula paterna, si o no la progenia es idéntica en morfología o en realización genética al patrón original, tan larga como el gen seleccionado se presenta El término "enlazado operativamente" se usa en la presente para referirse a una disposición de secuencias de flanqueo en donde las secuencias de flanqueo así descritas se configuran o ensamblan para realizar su función usual. Así, una secuencia de flanqueo operablemente enlazada a una secuencia de codificación puede ser capaz de efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación. Por ejemplo, una secuencia de codificación es enlazada operablemente a un promotor cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de aquella secuencia de codificación. Una secuencia de flanqueo no necesita ser contigua con la secuencia de codificación, tan larga como funciona correctamente. Así, por ejemplo, las secuencias que intervienen no trasladadas, aún transcritas pueden presentarse entre una secuencia promotora y la secuencia de codificación y la secuencia promotora pueden todavía considerarse "enlazadas operablemente" a la secuencia de codificación. El término "transfección" se usa para referirse a la incorporación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el ADN exógeno ha sido introducido en lugar de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica y se describen en la presente. Ver, por ejemplo , Graham er al , 1973, Virology 52:456, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989), Davis eí al., Basic Methods m Molecular Biology (Elsevier, 1986) y Chu eí al., 1981, Gene 13 197 Tales técnicas pueden usarse para introducir una o más porciones de ADN exógenas dentro de las células huésped adecuadas.

Polipéptidos ABC1 La presente invención se refiere a polípéptidos ABC1 humanos novedosos. En una modalidad, el polípéptido ABC1 comprende la secuencia de aminoácido mostrado en la SEC DE IDENT NO.: 2. En contraste a la proteína ABC1 humana reportada por otros, el polipéptido ABC1 mostrado en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 tiene 60 aminoácidos adicionales en el término amino, revelando una proteína ABC1 de 2261 aminoácidos en lugar de 2201 aminoácidos (ver Langmann et al. in Biochem. Biophys, Res. Comm., 257, 29-33 (1999)). Además, el polípéptido ABC1 mostrado en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 difiere de oirás secuencias reportadas a vanos residuos aminoácidos. Específicamente, el presente polípéptido ABC1 mostrado en la SEC. DE IDENT. NO.: 2 tiene una K para R al residuo 159, I para V a 765, M para I a 823, I para T a 1495, L para P a 1588, K para R a 1914, y L para P a 2108 Para permanecer consistente con la anotación publicada, los números de aminoácido anteriores son aquellos de Lawn et al., J. d*?fl**BE?***** Clin Invest., 104 R25-31 (1999) en lugar de aquellos de la SEC. DE IDENT. NO 2. Como se discutió en detalle adicional posteriormente, la diferencia de secuencia probablemente surge del hecho que el primer ADNc ABC1 se clonó a partir de un ratón 5 utilizando una estrategia basada en PCR y las secuencias de ADNc ABC1 humanas subsecuentemente reportadas donde se predicen a partir de la secuencia de la proteína de ratón. La proteina ABC1 tiene un peso molecular aproximado de 240 kD como se determinó por SDS-PAGE. 10 La presente invención también se refiere a los polipéptidos ABC1 que comprende secuencias de aminoácido que preferiblemente tienen por lo menos 98% de identidad sobre su longitud total a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. Más preferiblemente, el polipéptido tiene por lo menos 15 99% de identidad sobre su longitud completa a ia secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 Más preferiblemente, el polípéptido tiene 100% de identidad sobre su longitud completa a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO : 2. Como se definió previamente, el término "identidad" se refiere al grado 20 de secuencia relacionada entre las secuencias de poli péptido , la cual se define además posteriormente. Tales polipéptidos ABC1 relacionados incluyen variantes de sustitución, eliminación e inserción, así como variantes alélicas, variantes de empalme, fragmentos, derivados y ortólogos. 25 Los polípéptidos preferidos y fragmentos de polipéptidos incluyen a^tMh*.» aquellos polipéptidos y fragmentos que poseen la actividad biológica de ABC1. En particular, aquellos polipéptidos y fragmentos que median el transporte de colesterol inverso se prefieren. También preferidos son los polipéptidos y fragmentos que tienen actividad de transporte de colesterol inverso mejorado. Las variantes de sustitución, eliminación e inserción se refieren a polipéptidos ABC1 que comprenden secuencias de aminoácido que contienen una o más sustituciones, eliminaciones, y/o adiciones de secuencia de aminoácido, como se comparó a la secuencia de aminoácido ABC1 establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2. En las modalidades preferidas, las variantes tienen de aproximadamente 1 a 5, o de aproximadamente 1 a 10, o de aproximadamente 1 a 20, o de aproximadamente 1 a 40, o de aproximadamente 1 a 65 sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácido. Por ejemplo, las variantes pueden tener una adición de uno o más residuos de aminoácido donde sea en el polipéptído así como también en el término carboxilo y/o el término amino, tan largo como la variante que retiene la función biológica. También, por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden eliminarse a partir de cualquier región del polipéptido, incluyendo el término carboxilo y/o término amino, sin pérdida sustancial de la función biológica (Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993); Dobeli et al., J. Biotechnology, 7: 199-216 (1988)). Las sustituciones de aminoácido pueden ser conservadoras o no conservadoras, o cualquier combinación de éstas, tan largas como la variante ABC1 que retiene su actividad biológica. Además, las sustituciones pueden estar con residuos aminoácidos no conservados, donde los residuos sustituidos pueden o no pueden ser codificados por el código genético, y con residuos aminoácidos que tienen un grupo sustituyente. Las vanantes adecuadas de los polipéptidos ABC1 pueden determinarse utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las variantes ABC1 adecuadas pueden determinarse por regiones de identificación de la molécula ABC1 que puede cambiarse sin destruir la actividad biológica. También, como se realizó en la técnica, aún las regiones que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden sujetarse a las sustituciones de aminoácido conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura polipéptida. Los residuos de aminoácidos que pueden cambiarse sin destruir actividad biológica pueden determinarse por regiones de identificación del polipéptido ABC1 que no son importantes para la actividad (Bowie et al., Science et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)). Por ejemplo, los polipéptidos ABC1 de varias especies pueden compararse para determinar los residuos y regiones de aminoácido de moléculas ABC1 que se conservan a través de especies. Los residuos de aminoácido conservados son probablemente importantes para la función y/o estructura biológica. En contraste, los cambios en las regiones de la molécula ABC1 que no se conservan a través de las especies y son así tolerados por la selección natural podrían ser menos probables para la actividad y/o estructura biológica adversamente afectada. Por consiguiente, los polipéptidos ABC1 con adiciones, eliminaciones o sustituciones en las regiones no conservadas son variantes probablemente adecuadas. Aún en regiones relativamente conservadas, los aminoácidos químicamente similares pueden estar sustituidos por los residuos naturales mientras se retiene la actividad. Además, las variantes ABC1 adecuadas pueden identificarse utilizando los estudios de función de estructura para determinar los residuos en otros miembros de la familia de proteína del cásete de unión de ATP, tal como ABCR y ABC-C, que son importantes para la actividad o la estructura. Tales estudios permiten la predicción de residuos de aminoácidoe importantes en una variante ABC1 que corresponde a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en otras proteínas de cásete de unión ATP. Por ejemplo, basados en estudios de función de estructura de otras proteínas de cásete de unión ATP, los residuos de aminoácido importantes en ABC1 son probablemente encontrados en regiones asociadas con la unión del nucleótido y el transporte de esterol. Las variantes adecuadas incluyen, por ejemplo, polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácido químicamente similares para tales residuos de aminoácido predichos importantes del polipéptido ABC1.

Las variantes ABC1 adecuadas pueden también determinarse utilizando técnicas de ingeniería genética para introducir cambios de aminoácido a posiciones específicas para identificar regiones críticas para la función de polipéptido. Los cambios de aminoácido pueden hacerse utilizando, por ejemplo, mutagénesís de sitio directo o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)). Las variantes ABC1 resultantes pueden entonces probarse para actividad biológica utilizando, por ejemplo, cualquiera de los ensayos de emanación de colesterol descritos en la presente. Las variantes que tienen una sustitución de residuo de aminoácido particular que resulta en la actividad de emanación de colesterol destruida podrían no ser consideradas una variante ABC1 adecuada. Los métodos adicionales para identificar las variantes adecuadas se conocen en la técnica. Además, un experto en la técnica podría realizar cambios de aminoácido que son probables para ser permisivos a ciertas posiciones de aminoácido en la proteína (Bowie et al., supra (1990)). Por ejemplo, es generalmente conocido que los residuos de aminoácidos más enterrados o interiores (sin la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras que pocas características de las cadenas laterales de superficie o exteriores se conservan generalmente. Además, se conoce que las sustituciones de aminoácido conservadoras toleradas implican el reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrofóbicos Ala, Val, Leu e lie, reemplazo de los residuos de h id ro x i lo Ser y Thr, reemplazo de los residuos acídicos Asp y Glu, reemplazo de los residuos de amida Asn y Gln, reemplazo de los residuos básicos Lyz, Arg y His, reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, y reemplazo de los aminoácidos pequeños Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Las vanantes ABC1 pueden construirse natural o artificialmente. Ejemplos de variantes naturales son variantes alélícas y varianles de empalme. Las variantes alélicas se refieren a una o varias formas alternadas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo o población de organismos (Lewin, B. ed., Genes II, John Wiley & Sons. New York (1985)). Las variantes alélicas pueden variar ya sea al nivel de polinucleótido y/o polipéptido. Las variantes de empalme se refieren a una molécula de ácido nucleico, usualmente ARN, la cual se genera por procesamiento alternativo de secuencias intron en una transcripción de ARN, y el polipéptido correspondiente. Alternativamente, las variantes ABC1 pueden construirse artificialmente. Por ejemplo, las variantes ABC1 pueden construirse utilizando la técnica de mutagénesis de sitio dirigida. También, por ejemplo, las variantes ABC1 pueden prepararse a partir de las moléculas de ácido nucleico correspondiente que codifica tales vanantes, las cuales tienen una secuencia de ADN ..-e.? ? i *,¿..?.L que varia como se describe a partir de la secuencia de ADN de tipo silvestre como se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Los fragmentos de polipéptido se refieren a los polipéptidos que comprenden menos que la secuencia de aminoácido de longitud total de ABC1 establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2. Los fragmentos de polípéptidos preferidos incluyen aquellos fragmentos que poseen la actividad biológica de ABC1. En particular, aquellos fragmentos que median el transporte de colesterol inverso o tienen actividad de transporte de coiesterol inverso mejorado se prefieren. Los fragmentos ABC1 pueden tener uno o más aminoácidos eliminados de cualquier región del polipéptído, incluyendo el término carboxilo y/o término amino, siempre y cuando la función biológica se mantenga. Los fragmentos de polipéptido ABC1 pueden ocurrir naturalmente, a través de empalmado alternativo o actividad de proteasa in vivo, o puede ser construido artificialmente utilizando métodos bien conocidos. La invención también se refiere a los derivados de polipéptido ABC1, la cual se refiere a polipéptidos ABC1, variantes, o fragmentos, como se definen en la presente, que han sido químicamente modificados. Los derivados se modifican en una forma que es diferente de los polipéptidos ABC1 que ocurren naturalmente ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas unidas al polipéptido. Los derivados pueden además incluir polipéptidos formados por la eliminación de uno o más grupos químicos que se unen naturalmente a los polipéptidos ABC1. Además, el polipéptido ABC1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2, así como las variantes y fragmentos de ABC1 descritas anteriormente, pueden ser fusionadas a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o en un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Otro aspecto de la presente invención se refiere a polipéptidos ABC1 mutantes y fragmentos de los mismos, que corresponden a los polipéptidos aislados a partir de pacientes con Tangier. En una modalidad preferida, el polípéptido ABC1 comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 8. La proteína se aisló a partir de un paciente Tangier (TD1) y secuencia como se describe en el Ejemplo 1 y 5. La secuencia de aminoácido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 8 es similar a la secuencia de tipo silvestre con la excepción de una glutamina a una sustitución de residuo de arginína en la posición 537 (el número de residuo es de Lawn et ai., J. Clin. Invest., 104: r25-31 (1999), que corresponde a la posición 597 de la SEC. DE IDENT. NO.. 8). La ubicación de este residuo está dentro del dominio hidrofílico de amino terminal, cerca del primer dominio de transmembrana predicho. La sustitución altera la carga del aminoácido en esta región de la proteína, resultando en una proteína ABC1 que tiene actividad de emanación de coiesterol significativamente disminuida, como se muestra en la Figura 1.

En otra modalidad preferida el polipéptido ABC1 mutante comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 10 La proteína corresponde a un polipéptido aislado a partir de un paciente con Tangier (TD2) y secuenciada como se describe en los Ejemplos 1 y 5. La secuencia de aminoácido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 10 es similar a la secuencia de tipo silvestre con la excepción de una arginina a sustitución de triptofano en el residuo 527 (el número clel residuo es aquel de Lawn et al., supra (1999), que corresponde a la posición 587 de la SEC. DE IDENT. NO.: 10). Como el polipéptido TD1, esta sustitución altera la carga del residuo de aminoácido en el dominio h id rof í I ¡co amino terminal de la proteína ABC1. La proteína ABC1 mutante resultante también tiene actividad de emanación de colesterol significativamente disminuida, como se muestra en la Figura 1.

Polinucleótidos ABC1 Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos ABC1 novedosos y variantes de los mismos. La presente invención proporciona, por ejemplo, polinucleótidos aislados que codifican el polipéptido ABC1 de longitud completa, polinucleótidos que contiene el ADNc de longitud completa de ABC1 de tipo silvestre, polinucleótidos que contienen la longitud completa de la secuencia de codificación de ABC1 de tipo silvestre, y polínucleótidos que contienen secuencias 5' y 3' sin codificar de ABC1, asi como los polinucleótidos de variantes ABC1 relacionadas La presente invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican pol ipéptid os ABC1 mutantes, tales como aquellos de los pacientes con Tangier. En una modalidad preferida, el polinucléotido aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. De manera importante, en contraste a la secuencia publicada de Langmann et al, la cual codifica para una proteína de 2201 aminoácidos basados en una metionina de inicio predicha encontrada en exón 3 (Langmann et al., Biochem. Biophys. res. Comm., 257:29-33 (1999) (GenBank Acceso No. AJ012376), la secuencia de nucleótido actualmente reclamada contiene 50 exones y codifica para una proteína de 2261 aminoácidos (ver Figura 4). La secuencia de nucleótido correspondiente de la presente invención contiene una secuencia de codificación que incluye 180 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que corresponde a los siguientes 60 aminoácidos terminales amino. M AC WPQ LRLLLWKNLTFRRRQTCQLLLEVAWPLFIFLIL I SVRLSYPP Y EQHECHFPNKA Dado que existe un codón de 6 a 9 nucleótidos de detección en el marco corriente arriba a partir de esta ubicación, el sitio de inicio nuevamente predicho es el primer codón de metionina que podría producir un marco de lectura abierto continuo El alineamiento de esta nueva secuencia de ADNc ABC1 con relación a las secuencias transportadoras ABC, ABCR y ABC- C (también conocidos como ABC3) que también contienen marcos de lectura abiertos para los 60 aminoácidos adicionales, que 5 indican un grado elevado de similaridad, que implica que las proteínas transportadoras ABC están con secuencias relacionadas a la secuencia de extensión terminal propuesto por ABC1 humana. Es probable que el sitio de inicio publicado temprano del ABC1 humano se predice a partir de la secuencia de ADNc ABC1 de 10 ratón publicada (Luciani et al., Genomics, 21150-159 (1994); GenBank No. de Acceso: X75926) que contiene un nucleótido extra "n" en la región de extensión de manera que la metionina nuevamente descrita no está en el marco. Sin embargo, si el nucleótido "n" en la secuencia de ratón se ignora las secuencias 15 de ratón y humano de la región de extensión son idénticas. En la claridad de estos resultados, es probable que la proteína ABC1 humana de longitud completa contiene 2261 aminoácidos en lugar de 2201 aminoácidos, como previamente se sugiere por Langmann et al. y otros. Por consiguiente, Langmann et al., no presenta el 20 marco de lectura abierto completo de ABC1 humana. En otra modalidad preferida, el polinucleótido aislado comprende el ADNc ABC1 de longitud completa, incluyendo por lo menos una porción de ya sea secuencias sin codificación 5' y 3'. Preferiblemente, el polinucleótido comprende la secuencia de 25 nucleótido mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.. 1. La secuencia -'^-r-f^f^f- de ADNc ABC1 humana de 10.4 kb mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 1, contiene un marco de lectura abierto de 6783 nucleótidos más regiones 5' y 3' no traducidas. Existe un codón de inicio en la posición 291 y un codón de detección en la posición 7074 El presente ADNc ABC1 mostrado en la SEC. DE IDENT. NO.: 1, difiere de ADNc ABC1 publicado (GenBank No. de Acceso AJ012376) en varios aspectos. Primero, el ADNc ABC1 presente incluye 350 nucleótidos adicionales en el extremo 5' y 3136 nucleótidos adicionales en el extremo 3' (sin incluir la cola poly(A)). La secuencia ABC1 presente también difiere del ADNc ABC1 publicado por la sustitución de 10 nucleótidos en la región de codificación. De las diez diferencias, siete diferencias de nucleótido predicen cambios de aminoácido. En la permanencia consistente con la anotación publicada, los siguientes números de nucleótido y aminoácido son aquellos de Lawn et al., J. Clin. Invest. 104: R25-31 (1999) y GenBank No. de Acceso AJ012376, en lugar de aquellos de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. os cambios de nucleótido y aminoácido son como sigue: (1) A para G en 414 nucleótido; (2) A para G en 596 nucleótido (K para R en 159 aminoácidos); (3) T para C en 705 nucleótidos; (4) A para C al nucleótido 1980 (5) A para G en 2413 (I para V en 765 aminoácidos); (6) G para A en 2589 (M para I en 823 aminoácidos); (7) T para C en 4604 (I para T en 1495 aminoácidos); (8) t para C en 4883 (L para P en 1588 aminoácidos); (9) A para G en 5861 (K para R en1914 .¡.r&¿».,?£n£s¡ aminoácidos); y (10) T para C en 6443 (L para P en 2108 aminoácidos). Cinco de los cambios de aminoácido son cambios de aminoácido conservadores y pueden representar polimorfismos o errores de secuencia. En dos ejemplos, la presente secuencia predice diferencias de aminoácido importantes a partir de la secuencia GenBank. Las diferencias resultan en una leucina en lugar de una prolina en el residuo 1588 y el residuo 2108. De manera interesante, en ambas posiciones, la leucina predicha se encuentra también en cada una de las tres muestras TD analizadas así como la secuencia de proteína ABC1 de ratón altamente conservada. La presente invención también se refiere a polinucleótidos ABC1 que comprenden secuencias de nucleótido que preferiblemente tienen por lo menos 80% de identidad sobre su longitud completa en el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Más preferiblemente, el polínudeótido tiene al menos 90% de identidad sobre su longitud completa en el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Aún más preferible, el polinucleótido tiene por lo menos 95% de identidad sobre su longitud completa en el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO,: 1. Más preferiblemente el polinucíeótído tiene 100% de identidad sobre su longitud completa en el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Tales polinucleótidos ABC1 relacionados incluyen variantes de sustitución, eliminación e inserción, así como variantes alélicas, sarasa . i . t .....?.^.-.t . »^. . . i. . Aaw&t. vanantes de empalme fragmentos, derivados y ortólogos, en donde uno o más nucleótidos han sido sustituidos, eliminados, insertados o derivatizados. Los polinucleótidos preferidos incluyen aquellos polinucleótidos que codifican los polipéptidos ABC1 que poseen actividad biológica, tal como actividad de emanación de colesterol. En otra modalidad preferida, el polinucleótido aislado comprende la secuencia de codificación completa de ABC1. En una modalidad particular preferida, el polinucleótído comprende la secuencia mostrada como los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. Este polinucleótido aislado contiene un marco de lectura abierto ABC1 de 6783 nucleótidos y codifica un polipéptido de 2261 aminoácidos, como se describió anteriormente. En aún otra modalidad preferida, el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifican un polipéptido de variante ABC1. En particular, el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. También preferido es un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido la cual es por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. Por consiguiente, la invención incluye aquellos polinucleótidos que codifican los polipéptidos ABC1 descritos anteriormente, incluyen las variantes de sustitución, eliminación e inserción descritas, asi como también las variantes alehcas ABC1, variantes de empalme, fragmentos, derivados, polipéptidos de fusión, y ortólogos. Los po nucleótidos preferidos son aquellos polinucleótidos que codifican polipéptidos 5 que poseen la actividad biológica de ABC1. En particular, aquellos polinucleótidos que codifican polipéptidos que median el transporte de colesterol inverso se prefieren. También preferidos son los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de transporte de colesterol inverso mejorado. 10 Aún otro aspecto de la invención se refiere a polínucleótidos aislados que codifican polipéptidos ABC1 mutantes de pacientes con Tangier. En una modalidad preferida, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO.: 8, cuyo polipéptido se aisla del paciente TD1 y se describe 15 anteriormente. En otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 7. La secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 7, contiene el marco de lectura abierto completo, así como las secuencias de flanqueo 5' y 3'. El marco de lectura 20 abierto codifica un polipéptido de 2261 aminoácidos, conteniendo, entre otras sustituciones, una sustitución de nucleótido que resulta en una sustitución A a G en la posición 537 (utilizando la numeración de Lawn et al., supra (1999)). En o:ra modalidad preferida relacionando a los 25 polinucleótidos que codifican los polipéptidos ABC1 mutantes, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO.: 10, cuyo polipéptido se aisla a partir del paciente TD2 de Tangier y se describe también anteriormente. En aún otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 9. La secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 9 contiene el marco de lectura abierto, así como las secuencias de flanqueo 5' y 3'. El marco de lectura abierto codifica un polipéptido de 2261 aminoácidos, conteniendo, entre otras sustituciones, una sustitución de pohnucleótido que resulta en una sustitución Arg a Tryp en el residuo 527 (utilizando la numeración de Lawn et al., supra (1999)). Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden las regiones de flanqueo 5' y flanqueo 3' sin codificación de ABC1. En una modalidad, el polinucleótido aislado comprende la región de flanqueo 5' sin codificar de ABC1. Preferiblemente, la región de ílanqueo 5' contiene, pero no se limita a, la región promotora ABCl. Asi, en una modalidad preferida, el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Como se demuestra por los ensayos reporteros heterólogos, discutidos en el Ejemplo 15, el polinucleótido establecido en la SEC. DE IDENT. NO.: 3, contiene la región regulatoria transcripcional del gen ABC1. Como se muestra en la Figura 13, el polinucleótido establecido en la SEC. DE IDENT NO.: 3 es una secuencia sin codificación 1643 b.p. que contiene varios elementos reguladores de tr nscripción, incluyendo una caja TATA en las posiciones 1522, 1435 y 1383, así como los sitios de unión del factor de transcripción, incluyendo 5 varios sitios SP1 putativos, y varios sitios medios de receptor nuclear. Además, un elemento de respuesta de esterol se encuentra en la posición 1483-1500. Los ensayos reporteros heterólogos adicionales descritos en al Ejemplo 17 revelan que varias porciones discretas de la SEC. DE IDENT. NO.: 3 retienen 10 actividad promotora. Por consiguiente, en otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende nucleótidos 1-1532, 1080- 1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En una modalidad especialmente preferida, el polínucleótido comprende nucleótidos 1394-1532 de la SEC. DE 15 IDENT. NO.: 3, cuya secuencia ha sido mostrada por tener una actividad promotora ABC1 (ver Ejemplo 17). En aún otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende nucleótidos 140-1510 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, la cual se muestra para regular la respuesta transcripcional ABC1 a los ligandos LXR. 20 El polinucleótido de flanqueo 5' también comprende una secuencia de nucleótido que hibridíza bajo condiciones rigurosas, a la secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 3, en donde la secuencia de nucleótido tiene la actividad promotora ABCl. En aún otra modalidad, el polinucleótido 25 comprende una secuencia de nucleótido que hibridiza, bajo mtt<MttaÉtt..aiBaae> . _ ., . . condiciones rigurosas, a la secuencia de nucleótido que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3, en donde la secuencia de nucleótido tiene la actividad promotora ABC1. En otra modalidad, el polinucleótido aislado comprende la región de flanqueo 3' de ABC1. Varias regiones 3' no traducidas han sido identificadas las cuales pueden representar sitios alternados de poliadenilación de la transcripción ABC1. Preferiblemente, la región de flanqueo 3' contiene secuencias reguladoras. Por ejemplo, el UTR 3' de longitud completa (SEC. DE IDENT. NO.: 6) contiene 46 secuencias (AA)nCU/UC(AA)n el cual ha sido mostrado para ser necesario para la unión de Vigilina. La vigilina, una proteína ubícuota con dominios homólogos 14K, es la proteína de unión de región 3' no traducida de ARNm de vitelogenina inducible de estrógeno (J . Biol. Chem., 272: 12249-12252 (1997)). Además para unir HDL, la vigilina ha sido mostrada para unirse a la región de flanqueo 3' de los ARNms y para incrementar la vida media de la transcripción ARNm (Mol. Cell. Biol., 18:3991-4003 (1998)). Así, la región de flanqueo 3' podría alterarse, por ejemplo, para incrementar la unión de vigilina, por lo que incrementa la vida media del ARNm ABC1. Preferiblemente, el polinucleótido aislado comprende la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 4. También preferible, el polinucleótido aislado comprende la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 5. En otra modalidad preferida, el poiinucleótido aislado comprende la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT NO 6. En otras modalidades preferidas, el polmucleótido comprende una secuencia que hibridíza, bajo condiciones rigurosas, a la secuencia de nucleótido establecida en la SEC. DE IDENT NO 4, SEC. DE IDENT NO.: 5 o SEC. DE IDENT. NO.: 6. La presente invención también incluye pohnucleótidos de flanqueo 5' y 3' ABC1 relacionados. Por consiguiente, la invención se refiere a polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido que tienen por lo menos 80% de identidad sobre su longitud completa al polinucleótido que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 3, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 5, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 6, o el polinucleótido que comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Preferiblemente, el polinucleótido tiene por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 90% aún más preferiblemente por lo menos 95% y más preferiblemente 100% de identidad sobre su longitud completa a cualquiera de los polinucleótidos de flanqueo antes mencionados. Los poiinucleótidos preferidos incluyen aquellos polinucleótidos que posen actividad biológica, tal como actividad reguladora transcripcional. Se entenderá que la presente invención, además se refiere a polinucleótidos aislados que son complementarios a .» i > . cualquiera de una de las secuencias de polmucleótido descritas anteriormente Como se usa en la presente, el término "complementario" se refiere a la híbridización o pares de bases entre los nucleotidos, tales como, por ejemplo, entre las dos hebras de un po nucléotido de trenzado doble. Las dos moléculas de nucleótido de trenzado sencillo son tales para ser complementarias cuando los nucleótidos de una hebra, ópticamente alineados con las inserciones de nucleótido apropiadas, eliminaciones o sustituciones, en par con por lo menos aproximadamente 80% de los nucleótidos de la otra hebra. Otro aspecto de la presente invención se refiere a las composiciones que comprenden los polinucleótidos ABC1 novedosos descritos anteriormente y un portador adecuado. En una modalidad, la composición comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un polinucleótido que comprende los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido la cual es por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2, y un portador adecuado. En otra modalidad, la composición comprende un poiinucleótído que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 90%, o más preferiblemente 95% de identidad sobre su longitud completa al polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1 y un portador adecuado.

En otra modalidad, la composición comprende un polín ucleótido que comprende una secuencia de flanqueo 5' ABC1 y un portador adecuado. Preferiblemente, la composición comprende un polmucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.. 3 o un polinucleótido que comprende Iragmentos de nucleótido 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.. 3 y un portador adecuado. También preferiblemente, la composición comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 80%, 90%, o 95% de identidad sobre su longitud completa al pohnucleótido que comprende cualquiera de las secuencias de flanqueo 5' descritas y un portador adecuado. En aún otra modalidad, la composición comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de flanqueo 3' ABC1 y un portador adecuado. Las composiciones preferidas comprenden un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 5, o un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.. 6 así como también un polinucleótido que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 90% o más preferiblemente 95% de identidad sobre su longitud completa a cualquiera de estos polinucleótidos, y un portador adecuado. Aún otras composiciones de la invención comprenden polinucleótídos ABC1 mutantes. Preferiblemente, la composición comprende un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 7 o un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 9 y un portador adecuado.

Además, una composición de la presente invención puede comprender, en cualquier combinación, dos o más de los polinucleótidos ABC1 descritos anteriormente y un portador adecuado. Cualquier portador acuoso adecuado puede utilizarse en la composición. Preferiblemente, el portador realiza la composición estable a la temperatura deseada, tal como temperatura ambiente o temperatura de almacenamiento (es decir, 4°C a -20°C) y es de aproximadamente pH neutro. Ejemplos de portadores adecuados se conocen por aquellos de experiencia en la técnica e ¡ncluyen amortiguador Tris-EDTA y DEPC-H20.

Vectores ABC1 y Células Huésped La presente invención se refiere a vectores recombinantes que comprenden uno o más polinucleótidos ABC1 descritos anteriormente, células huésped que son construidas genéticamente con los vectores que comprenden poiinucleótido ABC1, y la producción de polipéptidos ABC1 por técnicas recombínantes. Como se mencionó, la invención proporciona vectores recombinantes que comprenden uno o más polinucleótidos ABC1 de tipo silvestre descritos anteriormente. En las modalidades preferidas, el vector recombinante comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, y el polinucleótido que comprende los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.. 1. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido variante que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido la cual es por lo menos 98% idéntic a la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO.: 2. También, en otra modalidad, el vector recombinante comprende un polinucleótido variante que es por lo menos 80% idéntica a un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En aún otra modalidad preferida, el veclor recombinante comprende un polinucleótido que es complementario a cualquiera de estos polinucleótidos. En otra modalidad, el vector recombinante comprende un polinucleótido que comprende un polínucleótido ABC1 mutante aislado a partir de un paciente con enfermedad Tangier. En una modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 8. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 10. los vectores recombinantes pueden también comprender una secuencia de polinucleótido que es complementaria a estas secuencias. Se entenderá también que el vector recornbinante puede también comprender, en cualquier combinación, dos o más de los polinucleótidos ABC1 variantes o mutantes del tipo silvestre descritos anteriormente. Un polínucleótido ABC1 aislado, tal como cualquiera de los polinucleótidos variantes o mutantes de tipo silvestre descritos .fr rt(. anteriormente, se insertan en un vector utilizando técnicas de ligación y clonación bien conocidas. Las técnicas c clonación han sido descritas en varios manuales de laboratorio estándares, incluyendo Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, (Wiley and Sons (1994)); Goeddel, ed., Gene Expression Technology (Methods in Enzymology (1991)); Murray ed., Gene Transfer and Expression Protocols (Human Press, Clifton, NJ). Cualquier vector adecuado para la inserción de polinucleótido ABC1 puede usarse. El vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de célula huésped de manera que la amplificación y/o expresión del gen puede ocurrir). Preferiblemente, el vector es compatible con bacterias, insectos, o células huésped de mamíferos. También preferiblemente, el vector es un vector de expresión (para una revisión de los vectores de expresión, ver Goeddel, D.V. ed., Methods Enzymol., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)). El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o replicación defectuosa. En el caso posterior, la propagación viral generalmente ocurrirá únicamente en complementación a las células huésped.

Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para mantenimiento de plásmido y para clonación y expresión de secuencias de nucleótido exógenas. Tales secuencias, colectivamente se refieren como "secuencias de flanqueo" deberán preferiblemente incluir una o más de las siguientes secuencias de nucleótido: un promotor, una o más secuencias mejoradas, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intron completa que contiene un donador y un sitio de empalme aceptor, una secuencia que codifica una secuencia lectora para la secreción de polipéptido, un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de polienlazador para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable. Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas (es decir, a partir de las mismas especies y/o cepa como la célula huésped), heterólogas (es decir, a partir de especies diferentes de las especies o cepas de célula huésped), híbrida (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo a partir de más de una fuente), o sintética. También las secuencias de flanqueo pueden ser secuencias nativas que normalmente funcionan para regular la expresión de polipéptido ABC1. La fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, ^.3^ a condición de que la secuencia de flanqueo es funcional en, y puede activarse por, la maquinaria de célula huésped. El vector deberá también preferiblemente incluir por lo menos un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. Un marcador seleccionable es un elemento de gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped crecida en un medio de cultivo selecto. Los genes marcadores de selección adecuados codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicína para células huésped procarióticas; (b) complemento de deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministro de nutrientes críticas no disponibles a partir de los medios de complejo. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen resistencia a zeocina, G418, higromicina, o neomicina para cultivo de célula eucariótica y resistencia a tetraciclina, kanamicina, o ampicilina para cultivar en E. coli y otra bacteria. Otros genes de selección adecuados incluyen aquellos que se usan para ampliar la expresión del gen. La amplificación es el proceso en donde los genes que están en principal demanda para la producción de una proteína crítica para crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timídin quinasa. Las transformantes de célula de mamífero se colocan bajo presión de selección en donde únicamente las transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio es sucesivamente cambiado, por lo que se carga a la amplificación del gen de selección y el gen de ABC1. Como un resultado, las cantidades incrementadas del polipéptido ABC1 se sintetizan a 10 partir del ADN amplificado. El vector deberá también preferiblemente contener una secuencia de terminación de transcripción, la cual está típicamente ubicada 3' del extremo de un polipéptido que codifica la región y sirve para terminar la transcripción. Usualmente, la 15 secuencia de terminación de transcripción en células procaríotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poly T. La secuencia puede comprarse como parte de un vector comercial o sintetizado utilizando métodos bien conocidos para síntesis de ácido nucleico. 20 El vector deberá también preferiblemente contener un sitio de unión de ribosoma, el cual es usualmente necesario para la iniciación de traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotes) o una secuencia Kozak (eucariotes). El elemento es típicamente ubicado 3' al promotor y ?-' 5' a la secuencia de codificación del polipéptido ABC1 a ser expresado. La secuencia Shine-Dalgarno se varía, pero es típicamente una polipurína (es decir, que tiene un contenido A-G elevado). Muchas secuencias Shine-Dalgarno han sido identificadas, cada una de las cuales puede ser fácilmente sintetizadas utilizando métodos bien conocidos. El vector deberá también preferiblemente contener un promotor que se reconoce, por el organismo huésped y operablemente se enlaza al polinucleótido codificado. El promotor puede ser un promotor ¡nducible o un promotor constitutivo. Los promotores inducibles inician los niveles incrementados de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En contraste, los promotores constitutivos inician la producción del producto de gen continuo; consecuentemente existe poca o ningún control de sobre expresión del gen. Un promotor adecuado es operablemente enlazado a un polinucleótido, removiendo el promotor a partir de la fuente de ADN por restricción de la digestión de enzima y la inserción de la secuencia de promotor deseada en el vector. Como se mencionó, un promotor nativo puede usarse para dirigir amplificación y/o expresión del polinucleótido. Así, el vector recombinante puede comprender cualquiera de los polinucleótidos ABC1 variantes o mutantes del tipo silvestre descritos anteriormente y un promotor ABC1, tal como aquel encontrado en la SEC. DE IDENT. NO.: 3. El vector recombinante puede también comprender, en cualquier combinación, dos o más de los polinucleótidos ABC1 vanantes o mutantes del tipo silvestre, descritos anteriormente y un promotor ABC1. Preferiblemente, un promotor heterólogo se usa si este permite mayor transcripción y rendimientos elevados de la proteina ABC1 como se compara al promotor ABC1 nativo, y si es compatible con el sistema de célula huésped que ha sido seleccionado para uso. El promotor heterólogo puede usarse solo o en conjunción con el promotor ABC1 nativo. Así, en una modalidad preferida, el vector recombinante comprende cualquiera de los polinucleótidos ABC1 de tipo silvestre descritos anteriormente y un promotor heterólogo. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende cualquiera de los polinucléotidos ABC1 variantes descritos anteriormente y un promotor heterólogo. En aún otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende cualquiera de los polinucleótídos ABC1 mutantes descritos anteriormente y un promotor heterólogo. Las modalidades preferidas también incluyen vectores recombinantes que contienen cualquier combinación de dos o más de los polinucleótidos ABC1 variantes y mutantes del tipo silvestre descritos anteriormente, y un promotor heterólogo. Los promotores heterólogos adecuados para uso con huésped procarióticos incluyen, pero no se limitan a, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa (Villa-Kamaroff ef al., 1978 Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31), un sistema promotor de a Ica lin fosfatasa, un triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31). Sus secuencias se han publicado, por lo que permite a un experto en la técnica ligarlas a la secuencia de ADN deseada, utilizando enlazadores o adaptadores como se necesita para suministrar cualesquiera sitios de restricción útiles. Otros promotores heterólogos adecuados se conocerán por aquellos expertos en la técnica. Promotores heterólogos adecuados para uso con células huésped de mamífero se conocen también e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela de corral, adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y Virus 40 Simian (SV40). Otros promotores de mamíferos adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque al calor y promotores de actina. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a: el promotor anterior SV40 y la región promotora tardía (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290:304-10); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma Rous (Yamamoto, eí al., 1980, Cell 22:787-97); el promotor de timidin quinasa de herpes (Wagner eí al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); y las secuencias reguladoras del gen de ? ' ^-e metalotionina (Bpnster eí al., 1982, Nature 296:39-42). Preferiblemente, el promotor es un citomegalovirus o promotor SV40 Así, en modalidades especialmente preferidas, el vector recombinante comprende uno de los polinucleótidos ABC1 de tipo silvestre descritos anteriormente, uno de los polinucleótidos ABC1 variantes descritos anteriormente, o uno de los polinucleótidos ABC1 mutantes descritos anteriormente y un promotor de cítomegalovirus. En otra modalidad especialmente preferida, el vector recombinante comprende, en cualquier combinación, dos o más de los polínucleótidos ABC1 variante o mutante de tipo silvestre descritos anteriormente y un promotor de citomegalovírus. El vector también preferiblemente contiene una secuencia mejorada para incrementar la transcripción de un polinucleótido, tal como ABC1. Los mejoradores adecuados para la activación de promotores eucarióticos incluyen mejoradores virales, tales como SV40, promotor anterior de citomegalovirus, polioma y mejoradores de adenovirus. Los vectores de expresión de la invención pueden construirse de un vector de inicio, tal como un vector comercialmente disponible, el cual puede o no puede contener todas de las secuencias de flanqueo deseadas. Cuando una o más de las secuencias de flanqueo descritas en la presente no están ya presentes en el vector, pueden ser individualmente obtenidas y ligadas en el vector. Los métodos usados para obtener cada una ' s"' de las secuencias de flanqueo se conocen bien por un experto en la técnica. Los vectores preferidos son aquellos que son compatibles con células bacteriales, de insecto, y huésped de mamífero. Los vectores preferidos para uso en bacteria incluyen, por ejemplo, pQE70, pQE60, y pQE-9 (Quiagen, Inc.), vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.), ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc.) y pCEP4 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Los vectores eucarióticos preferidos incluyen, pero no se limitan a pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia) y pGL3 (Promega, Madison, Wl). Otros vectores adecuados serán fácilmente aparentes por aquellos expertos. En una modalidad especialmente preferida, el vector recombinante comprende pCEPhABCI, el cual se describe en el Ejemplo 4 y se muestra en la Figura 3. El vector recombinante pCEPhABCI comprende el plásmido pCEP4 (Invitrogen), un vector de expresión que contiene el promotor y mejorador de citomegalovirus. El vector pCEPhABCI además comprende un polinucleótido ABC1 operativamente enlazado al promotor de citomegalovirus heterólogo. El polinucleótido ABC1 comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, la cual contiene el ADNc ABC1 de longitud completa, incluyendo el flanqueo 5' sin codificación (es decir, el promotor ABC1 nativo) y las secuencias de flanqueo 3'.

Además, la presente invención proporciona vectores recombinantes que comprenden polinucleótídos de secuencia de flanqueo ABC1. En una modalidad, el vector recombinante comprende un pohnucleótido que comprende una secuencia de flanqueo 5' ABC1 que preferiblemente contiene actividad promotora. Así, en una modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótído que comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En una modalidad especialmente preferida, el polinucleótido comprende los nucleótidos 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. También, en otra modalidad, el vector recombinante comprende un polinucleótido que hibridiza, bajo condiciones rigurosas, al polinucleótido establecido en la SEC. DE IDENT. NO.: 3 o el polinucleótido que comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En aún otra modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 90% y aún más preferiblemente por lo menos 95% de identidad sobre su longitud completa del polipucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3, o el polinucleótido que comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO 3. El vector i recombinante también comprende un polinucleótido que es complementario a cualquiera de las secuencias de flanqueo 5' descritas anteriormente. En otra modalidad, el vector recombinante comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de flanqueo 3' de ABC1. En una modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4. En otra modalidad preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 5. En una modalidad igualmente preferida, el vector recombinante comprende el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 6. También, en otra modalidad, el vector recombinante comprende un polinucleótido que hibridiza, bajo condiciones rigurosas, al polinucleótido establecido en la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5 o SEC. DE IDENT. NO.: 6. En aún otra modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 90%, y aún más preferiblemente por lo menos 95% de identidad sobre su longitud completa al polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 4, SEC. DE IDENT. NO.: 5 o SEC. DE IDENT. NO.: 6. El vector recombmante también comprende un polinucleótido que es complementaria a cualquiera de las secuencias de flanqueo 3' descritas anteriormente. Un polinucleótido de secuencia de flanqueo ABC1 aislado, tal como cualquiera de los polinucleótidos de secuencia de flanqueo 5' ó 3' descritos anteriormente, se insertan en un vector utilizando técnicas de ligación y clonación bien conocidas. Cualquiera de los vectores previamente descritos pueden usarse. Preferiblemente, el vector es compatible con bacterias, insectos, o células huésped de mamífero. También preferiblemente, el vector es un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. En adición a la secuencia de flanqueo ABC1, el vector puede contener una o más de las siguientes secuencias de nucleótido de flanqueo; un promotor, una o más secuencias mejoradas, un origen de replicacíón, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intron completa que contiene un donador y sitio de empalme aceptor, una secuencia que codifica una secuencia lectora para una secreción de polipéptido, un sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para inserción del ácido nucleótido que codifica el polipéptido a ser expresado, y un elemento marcador seleccíonable. Cualquiera de las secuencias de nucleótido de flanqueo descritas previamente son adecuadas. Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas, heterólogas, híbridas o sintéticas. También, las secuencias de flanqueo pueden ser secuencias nativas las cuales normalmente funcionan par regular la expresión de polipéptido ABC1. La fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia de flanqueo sea funcional en, y puede ser activada por, la maquinaria de célula huésped. Los vectores preferidos son aquellos los cuales son compatibles con bacterias, insectos y células huésped de 5 mamífero. Los vectores adecuados han sido previamente descritos e incluyen pQE70, pQE60, pQE9, vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH16A, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT5, y pCEP4 para uso en bacterias y pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, y pGL3 10 para uso en células eucarióticas. En una modalidad particularmente preferida, el vector recombinante comprende un polinucieótido que comprende la región de flanqueo 5' del gen ABC1 y además comprende por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo. El 15 polínucleótido heterólogo es operativamente enlazado a la secuencia de flanqueo ABC1 5'. La secuencia de flanqueo 5' ABC1 preferiblemente contiene el promotor ABC1. Así, preferiblemente, la secuencia de flanqueo 5' comprende la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 3. Igualmente preferida, la secuencia 20 de flanqueo 5' comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181- 1643, 1292-1643, o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. El polinucleótido heterólogo preferiblemente codifica un polipéptido que es una proteína completa o un fragmento biológicamente activo de una proteína. El vector puede también contener más de 25 un polinucleótido heterólogo. Más preferiblemente, el t.^?. mt¿mm. r,„....,?*&.,.¡... polinucleótido heterólogo codifica una proteína reportera. En tal caso, el vector recombinante preferiblemente no contiene cualesquiera secuencias promotoras adicionales. Ejemplos de proteínas reporteras adecuadas incluyen luciferasa, ß- galactosidasa, cioranfenicolacetil transferasa, y proteína fluorescente verde. Preferiblemente, el polipéptido reportero es luciferasa. Así, en una modalidad especialmente preferida, el vector recombinante comprende la secuencia de flanqueo 5' establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 3 y un polinucleótido reportero de luciferasa. En otras modalidades igualmente preferidas, el vector recombinante comprende un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT NO.: 3 y un polinucleótido reportero de luciferasa. Los vectores de expresión que comprenden la secuencia de flanqueo 5' ABC1 pueden ser construidos a partir de un vector de partida, tal como un vector comercialmente disponible, el cual contiene un polinucleótido reportero. Ejemplos de los vectores de expresión adecuados ¡ncluyen pGL3-Básico, el cual contiene un gen reportero de luciferasa (Promega, Madison, Wl) y pß-Gal- Básico (Clontech, Palo Alto, CA). Un vector preferido es el vector reportero de luciferasa pGL3-Básico, el cual es menos promotor. Una secuencia de flanqueo 5' que contiene el promotor ABC1, por ejemplo, la SEC. DE IDENT. NO.: 3, puede ser ligado en uno de los vectores de expresión anteriores utilizando métodos bien conocidos, incluyendo los métodos descritos en la presente (ver Ejemplo 15). Así una modalidad especialmente preferida, el vector recombinante es pAPR1, una construcción de gen reportero que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3 y un gen reportero de luciferasa en un vector pGL3 (ver Figura 11). La presente invención también se refiere a las células huésped que comprenden cualquiera de los vectores recombínantes anteriormente descritos. Después que el vector ha sido construido, el vector completo puede insertarse en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión de polipéptido. Las células huésped pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido ABC1 o, alternativamente un polipéptido reportero, el cual puede ser medido subsecuentemente. La célula huésped puede ser una célula huésped de mamífero, tal como una línea celular de primate o una línea celular de roedor, incluyendo lineas celulares transformadas. Las células diploides normales, cepas de células derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como también explantas primarias, son también adecuadas. Las células huésped candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente.

Un número de células huésped adecuadas se conocen en la técnica y muchas están disponibles de American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células CO DHFR (urlaub eí al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci., 97:4216-20), rinón embriónico humano (HEK) 293 o células 293T o células 3T3, líneas celulares COs-1 y COs-7 de mono y la línea celular CV-1 Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLa, células de ratón 1-929, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BKH o HAK, líneas celulares Thp-1, HepG2 y de ratón RAW. Cada una de estas líneas celulares se conoce por y están disponibles por aquellos expertos en la técnica de la expresión de proteína. Una célula huésped preferida es la línea celular de monocito de ratón RAW 264-7, la cual se usa como se describe en el Ejemplo 8. Las células huésped bacterianas adecuadas incluyen varias cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH50, DH10, y MC1061), que se conocen bien como células huésped en el campo de biotecnología. Varias cepas de b. subtilis, Pseudomonas spp, otras Bacillus sop., Streptomyces spp., y las similares pueden también emplearse en este método. También, muchas cepas de células de levadura están también disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos ABC1 Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisae y Pichia pastoris. Adicíonalmente, los sistemas celulares de insecto pueden ser células huésped adecuadas. Los sistemas celulares de insecto se describen, por ejemplo, en Kitts eí al., 1993, Biotechniques, 14:810-17; Luckiow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72; y Luckiow eí al., 1993, J. Virol., 67:4566-79. Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen). La presente invención también proporciona un método para expresar una proteína ABC1 en una célula huésped de mamífero que comprende las etapas de: (a) transfectar la célula huésped de mamífero con un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica ABC1 en una cantidad suficiente para producir un nivel detectable de proteina ABC1; y (b) purificando la proteína ABC1 producida. En una modalidad preferida, el vector de expresión recombinante comprende un polínucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.. 2. En otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En aún otra modalidad preferida, el polinucleótido comprende los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1. En aún otra modalidad preferida, el polinucleótido que codifica un polipéptido que es por lo menos 98% idéntico al polipéptido comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. La introducción del vector ABC1 recombinante en una célula huésped de mamífero puede efectuarse por métodos bien conocidos en la técnica y se describe en manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook, supra. Preferiblemente el vector recombinante se introduce en una célula huésped en un precipitado o en un complejo con un lípido cargado. Los métodos adecuados para la introducción del vector ABC1 incluyen la transfección de fosfato de calcio. La transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos en la técnica. Estos métodos se describen, por ejemplo en Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986). Si el vector ABC1 recombinante es un vector viral, éste puede ser empacado in vitro utilizando una línea celular de empacamiento apropiado y luego transducido en células huésped. El poli péptido ABC1 puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos de célula recombinante utilizando métodos bien conocidos, incluyendo sulfato de amonio o precipitación de etanol, ácido, extracción, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrcfóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, y cromatografía de lectina (ver, por ejemplo, Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)). Preferiblemente, la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos anti-ABC1 se emplea para purificación. Además, la presente invención proporciona un método para la expresión de la proteína ABC1 en un sujelo mamífero que r: .^i?r comprende la etapa de administrar a un sujeto mamífero un vector de expresión recombinante que comprende un polínucleótido que codifica ABC1 en una cantidad suficiente para expresar la proteína ABC1 en tal sujeto mamífero. Preferiblemente, el vector de 5 expresión recombinante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.. 2, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, el polinucieótido que comprende los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o el polinucleótido que codifica un polipéptido 10 que es por lo menos 98% idéntico al polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2. La introducción dei vector ABC1 recombinante en un sujeto mamífero puede efectuarse por métodos bien conocidos en la técnica y se describen en detalle aquí posteriormente. La expresión de ABC1 puede medirse obteniendo 15 una muestra de sangre del sujeto al cual el vector recombinante ABC1 se administra, separando la población de monocito, y midiendo la expresión del gen ABC1 en células de macrófago. La expresión del gen ABC1 puede medirse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como RT-PCR, y métodos descritos 20 en la presente (ver Ejemplos 9 y 10). El nivel de la proteína ABC1 puede medirse obteniendo una muestra sanguínea del sujeto, separando la población de monocito y midiendo la proteína ABC1 en células de macrófago utilizando métodos bien conocidos, tales como inmunoprecipitación, descritos en la presente en el Ejemplo 25 11.

Métodos y Compuestos para Incrementar la Emanación de Colesterol En otro aspecto de la presente invención, un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células en un sujeto mamífero se proporciona. Tal método comprende administrar al sujeto mamífero un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido ABC1 en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol a partir de tales células. El vector recombinante puede ser cualquiera de los vectores descritos anteriormente que contienen cualquiera de los polinucleótidos ABC1 variantes o de tipo silvestre descritos anteriormente, con la condición de que el polipéptido ABCl codificado tenga actividad biológica (es decir, actividad de transporte de colesterol). Preferiblemente, el vector recombinante comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2, el polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, el polinucleótido que comprende los nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o el polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido la cual es por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. También, preferiblemente, el vector recombinante comprende un polinucleótido vanante que es por lo menos 80%, 90%, o 95% i ¡Mtí. idéntico al polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, con la condición de que el polipéptido ABC1 codificado tenga actividad de transporte de colesteroi. La administración de un vector de expresión ABC1 5 recombinante a un sujeto mamífero puede usarse para expresar el gen ABC1 en tal sujeto para el tratamiento de enfermedad cardiovascular. Específicamente, este método podría lograr su efecto terapéutico por la introducción del gen ABC1 en células de macrófago y otras células que acumulan colesterol encontradas en 10 las lesiones arteriales de mamíferos con enfermedad cardiovascular. La expresión del polinucleótido ABC1 en células objetivo podría efectuar principal producción de la proteína ABC1. La proteína ABC1 producida subsecuentemente podría disminuir la enfermedad incrementando la emanación de colesterol a partir de 15 los macrófagos y otras células cargadas de colesterol encontradas en lesiones arteriales en partículas HDL nacientes. La emanación celular podría conducir a la remoción total de colesterol a partir de sitios periféricos, tales como el núcleo rico en colesterol de placas arteriales. Una reducción actual en el tamaño de estas lesiones 20 patológicas reduce el riesgo de bloqueo arterial que conduce a ataque cardiaco y angina. Este método podría también usarse profilácticamente para evitar la acumulación de colesterol en las paredes arteriales. Una cantidad suficiente del vector de expresión ABC1 25 es la cantidad del vector ABC1 que incrementa la emanación de •"*"" --—«""' ! f- - ¡y colesterol a partir de las células de un sujeto mamífero. Tal cantidad puede determinarse midiendo la emanación de colesteroi en las células de un sujeto antes (nivel de control) y después de la administración dei vector de expresión ABC1 a vanas dosis y determinar la dosis que efectúa un incremento en la emanación de colesterol comparada al nivel de control. La emanación de colesterol puede medirse obteniendo una muestra sanguínea del sujeto, separando la población de monocito, y midiendo la cantidad de emanación de colesterol en unas células de macrófago del sujeto. Cualquiera de los ensayos descritos en la presente pueden usarse para medir la emanación de colesterol. Además, la emanación de colesterol puede medirse determinando el nivel de plasma HDL-colesterol en un sujeto anterior (control) y después de la administración de un vector de expresión ABC1 recombinante. Un incremento observado en HDL-colesterol en el suero de un sujeto siguiendo la administración de un vector de expresión ABC1 recombinante que indica un incremento en la emanación de colesterol. Los niveles de HDL-colesterol en suero pueden determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Además, la emanación de colesteroi puede medirse midiendo el tamaño de las lesiones ateroscleróticas encontradas en la pared arterial de un sujeto anterior (nivel de control) y después de la administración del vector de expresión ABC1 recombinante. Una reducción en el tamaño de la lesión arterial lj? - ür iffH indica un incremento en la emanación de colesterol. Los ensayos para medir lesiones arteriales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la emanación de colesterol incrementada a partir de las lesiones arteriales puede medirse utilizando el modelo ratón de aterosclerosis descrito en Lawn et al , Nature, 360:670-672 (1992)), así como también cualquiera de los otros modelos conocidos. Utilizando el ratón eliminado del receptor LDL descrito en Lawn et al., la emanación de colesterol puede medirse antes y después de la administración del vector ABC1. El tamaño de lesión de depósito de grasa en grupos de anímales alimentados de una dieta aterogéníca puede medirse por tinción O roja aceitosa de secciones aórticas como se describe en Lawn et al. Una reducción en el tamaño de lesiones de depósito de grasa en el grupo que recibe el vector de expresión ABC1 comparada a un grupo que recibe un vector de control indica un incremento en la emanación de colesterol a partir de las lesiones. En humanos, el tamaño de lesiones ateroscleróticas encontradas en las paredes laterales puede medirse utilizando, por ejemplo, angiografía y métodos de ultrasonido no invasivos. Alternativamente, la emanación de colesteroi puede medirse obteniendo una muestra sanguínea y midiendo el nivel de proteína ARNin ABC1 o ABC1 en las células de macrófago de un sujeto antes y después de la administración de un vector de expresión ABC1 recombinante. Los ensayos de rutina puede realizarse para determinar la correlación entre las concentraciones ARNm ABC1 incrementadas en la emanación de colesterol. Así mismo, los ensayos pueden ser realizados para correlacionar la cantidad de la proteína ABC1 con la cantidad de la emanación de colesterol. Utilizando tales datos de correlación, un incremento observado en la proteína ARNm ABC1 o ABC1 en las células de un sujeto siguiendo la administración de un vector de expresión ABC1 recombinante puede utilizarse para indicar un incremento en la emanación de colesterol. Los niveles de proteína ARNm ABC1 y ABC1 pueden medirse utilizando los ensayos descritos en la presente y otras técnicas bien conocidas para ARNm y cuantificación de proteína. Las dosis terapéuticas y formulaciones se discuten en mayor detalle en lo siguiente. Están disponibles por un experto en la técnica métodos vírales y no virales múltiples adecuados para la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula objetivo. Por ejemplo, los vectores de suministro virales adecuados para la terapia de gen ¡ncluyen, pero no se limitan a, adenovirus, virus de herpes simple, virus de viruela (es decir, vaccinia), virus de hepatitis, parvovirus, papovavirus, alfavirus. coronavirus, rabdovirus, virus de papiloma, virus adeno-asociados (AAV), virus de polio, y virus de ARN, tales como un retrovirus y virus Sindbis. El polinucleótido ABC1 puede también suministrarse utilizando un sistema de suministro no viral, tal como suministro de ADN desnudo (inyección directa), traslado mediado por receptor (complejos de ligando ADN), electroporación, complejos de adenovirus-lingando-ADN, precipitación de fosfato de calcio (CaPOá), bombardeo de micropartícula (técnicas de disparo de gen), traslado mediado por liposoma y lipofección. La modificación genética de una célula puede lograrse utilizando una o más técnicas bien conocidas en el campo de terapia de gen (Mulligan, R., 1993, Science, 260(5110): 926-32). Los materiales de terapia de gen y métodos pueden incluir promotores inducibles, mejoradores-promotores específicos de tejido, secuencias de ADN diseñadas para integración de sitio específico, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula paterna, etiquetas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa y sistemas de control de expresión (mediciones seguras), agentes de unión de célula específica (para células objetivo), factores de internalización de célula específica, y factores de transcripción para mejorar la expresión por un vector así como métodos de fabricación de vector. Ejemplos de métodos y materiales para la práctica de las técnicas de terapia de gen se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,970,154 (implica las técnicas de electroporación), 5,679,559 (describe un sistema que contiene lipoproteína para el suministro del gen), 5,676,954 (implica portadores de liposoma), 5,593,875 (describe métodos para transfección de fosfato de calcio), y 4,945,050 (describe un proceso en donde las partículas biológicamente activas se propulsan en las células a una velocidad por la que las partículas penetran la superficie de las células y se incorporan en el interior de las células) v Publicación PCT No WO 96/40958 (implicando ligandos nucleares). Los vectores adenovirales han comprobado especialmente utilidad para la transferencia de gen en células eucaríóticas (Rosenfeld, M., eí al., Science, 252. 431-4 (1991); Patente Norteamericana No. 5,631,236). La primera prueba de la terapia de gen mediada por Ad en humanos fue la transferencia del gen regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis cístíca (CFTR) al pulmón (Crystal, R., eí al., 1994, Nat. Genet., 8(1): 42-51). Las rutas experimentales para la administración de Ad recombinante para diferentes tejidos in vivo han incluido instilación intratraqueal (Rosenfeld, M., eí al., 1992, Ce//, 68(1): 143-55) inyección en el músculo (Quantin, B., eí al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89(7): 2581-4), inyección intravenosa periferal (Herz, J., and Gerard R., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90(7): 2812-6) y inoculación esterotáctica al cerebro (Le Gal La Salle, G., eí al., 1993, Science, 259 (5097): 988-90). El vector adenoviral, entonces, es ampliamente disponible por un experto en la técnica y es adecuado para uso en la presente invención. El virus adeno-asociado (AAV) ha sido recientemente introducido como un sistema de transferencia de gen con aplicaciones potenciales en la terapia de gen. El AAV de tipo silvestre demuestra inefectividad de nivel elevado, rango huésped amplio y especificidad en la integración en el genoma celular huésped (Hermonat, P., and Muzyczka, N., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. U S.A. 81(20). 6466-70). El virus de herpes simple tipo-(HSV-1) es un sistema de vector preferido (Geller, A., eí al.. 1991, Trends Neurosci , 14(10): 428-32; Glorioso, J., er al.. 1995, Mol Biotechnol., 4(1): 87-99; Glorioso, J., eí al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49:675-710). El virus de vaccinia, de la familia de virus de viruela, ha sido también desarrollado como un vector de expresión (Smith, G., and Moss, B., 1983, Gene, 25(1): 21-8; Moss, B., 1992, Biotechnology, 20:345-62; Moss, B., 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38). Cada uno de los vectores descritos anteriormente está disponible ampliamente por un experto en la técnica y podría ser adecuado para uso en la presente invención. Preferiblemente, el sistema de suministro viral utilizando un vector retroviral. Los vectores retrovirales son capaces de infectar un porcentaje grande de las células objetivo e integrar en el genoma celular (Miller, A., and Rosman, G., Biotechniques, 7(9). 980-2, 984-6, 989-90 (1989); Patente Norteamericana No. 5,672,510). Los retrovirus se desarrollan como vectores oe transferencia de gen relativamente antes que otros virus, y se usaron primero exitosamente para la marcación de gen y traducir el ADNc de adenosin desaminasa (ADA) en linfocitos humanos. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus de murino o aviar, o es un vector lentiviral. Un vector retroviral especialmente preferido es un vector lentiviral. Ejemplos de vectores retrovirales en los cuales un gen extraño único pjede insertarse ¡ncluyen, pero no se limitan a: virus de leucemia murina Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma murino Harvey (HaMUSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), SIV, BIV, VIH y Virus de Sarcoma Rous (RSV). Un número de vectores retrovirales adicionales puede incorporar genes múltiples. Todos de estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable a fin de que las células transducidas puedan identificarse y generarse. Ya que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren asistencia para producir partículas de vector infecciosas. Esta asistencia puede proporcionarse, por ejemplo, utilizando líneas celulares auxiliadoras que contienen plásmidos que codifican todos de los genes estructurales del retrovirus bajo el control de las secuencias reguladoras con ei LTR. Los plásmidos auxiliadores están perdiendo una secuencia de nucleótido que permite el mecanismo de empacamiento para reconocer una transcripción de ARN para encapsulación. Así, las líneas celulares auxiliadoras producen viriones vacíos, ya que ningún genoma se empaca. Las líneas celulares auxiliadoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a ?2, PA317 y PA12. Si un vector retroviral se introduce en tales células en las cuales la señal de empacamiento está intacta, pero los genes estructurales se reemplazan por otros genes de interés, el vector puede empacarse y producirse el virión de vector. Los viriones de vector producidos por este método pueden entonces utilizarse para infectar una línea celular de tejido, tal como células 3T3 NIH, para producir grandes cantidades de viriones retrovirales quiméricos. Los vectores de la presente invención pueden construirse utilizando técnicas estándares recombinantes ampliamente disponibles por un experto en la técnica. Tales técnicas pueden encontrarse en referencias de biología molecular común tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991, Academíc Press, San Diego, CA), y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990, Academic Press, San Diego, CA). Para obtener la transcripción del polinucleótido ABC1 con una célula objetivo, una región reguladora transcripcional capaz de conducir la expresión del gen en la célula objetivo puede utilizarse. La región reguladora transcripcional preferiblemente comprende un promotor y/o mejorador, el cual está operativamente enlazado al polinucleótido ABC1. El promotor puede ser homólogo o heterólogo al gen ABC1, a condición de que es activo en la célula o tipo de tejido en el cual la construcción se insertará. La región reguladora transcripcional elegida deberá conducir la expresión del gen de nivel elevado en la célula objetivo. Preferiblemente, un promotor específico de macr?fago, tal como un receptor de eliminación tipo A, promotor de metaloprotemasa matriz (MMP-12), o promotor de lentivirus de macrófago-trópico (Fabunmi et al , Atherosclerosis, 148.375-386 (1999)) se usa. Un promotor particularmente preferido es la región 5' del gen receptor depurador tipo A, el cuai contiene un promotor de macrófago fuerte que puede usarse para conducir la transcripción del gen ABC1. Además, medios para incrementar la expresión de polipéptido ABCl endógena en una célula es para insertar uno o más elementos mejoradores en la región promotora, en donde los elementos mejcradores pueden servir para incrementar la actividad transcripcíonal del gen ABC1. Similarmente, los elementos mejorados usados se seleccionan basados en el tejido en el cual se desea para activar el gen. Así, por ejemplo, los elementos mejorados mostrados para conferir la activación promotora en células encontradas en tejido arterial, especialmente células macrófagas, se seleccionará. Otras regiones reguladoras transcripcionales adecuadas para uso en la presente invención ¡ncluyen, pero no se limitan a citomegalovirus humano (CMV), mejorador/promotor inmediato-anterior, el mejorador/promotor anterior SV40, el promotor de políomavirus JC, el promotor de albúmina, PGK y el promotor de a-actina acoplado al mejorador de CMV (Dolí, R., eí al., 1996, Gene Ther., 3(5): 437-47). Otros componentes de la construcción de vector pueden opcíonalmente incluir moléculas ADN diseñadas para integración de sitio específico (por ejemplo, secuencias endógenas útiles para recombinación homologa), promotores de tejido específico, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja sobre la célula paterna, moléculas de ADN útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativos, 5 agentes de unión específicos celulares (por eiemplo, células objetivo), factores de internalización de célula específica, factores de transcripción que mejoran la expresión a partir de un vector, y factores que permiten la producción del vector. En una modalidad, el vector puede incluir ADN objetivo 10 para integración de sitio específico. El ADN objetivo es una secuencia de nucleótido que es complementaria (homologa) a una región del gen de interés, por ejemplo, el gen ABC1. A través de la recombinación homologa, la secuencia de ADN insertada en el genoma puede dirigirse al gen ABC1 uniéndola al ADN objetivo. 15 Las secuencias de ADN para la inserción incluyen, por ejemplo, regiones de ADN que pueden interactuar con, o controlan la expresión de un polipéptido ABC1, por ejemplo, secuencias de flanqueo. Así, la expresión del polipéptido ABC1 deseado se logra no por transfección de ADN que codifica el gen ABC1 por sí 20 mismo, pero en su lugar por el uso de ADN objetivo acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan ia secuencia de gen endógena con señales reconocibles para la transcripción de un polipéptido ABC1 (Sauer, Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27 (1994); Sauer, Methods Enzymol., 225:890-900 (1993)) ^^»«-«»fl<aMi^a«t'*»**«^- - En aún otras modalidades, los elementos reguladores pueden incluirse para la expresión controlada del gen ABC1 en la célula objetivo. Tales elementos se convierten en respuesta a un efector apropiado. De esta manera, un polipéptido ABC1 terapéutico puede expresarse cuando se desee Un medio de control convencional implica el uso de pequeños dimerizadores de molécula o rapálogos para proteínas quiméricas dimerizadas las cuales contienen un pequeño dominio de unión de molécula y un dominio capaz de iniciar un proceso biológico, tal como proteína de unión de ADN o proteína de activación transcripcional (ver Publicaciones de PCT Nos. WO 96/41865, WO 97/31898, y WO 97/31899). La dimerización de las proteínas puede usarse para iniciar la transcripción del transgen. Otros medios de control adecuados o interruptores de gene ¡ncluyen el uso de mifepristona (RU486), la cual es un antagonista de progesterona. La unión de un dominio de unión de ligando del receptor de progesterona modifícado al agonista de progesterona activa la transcripción que formando un dímero de dos factores de transcripción que luego pasan en el núcleo para unir el ADN. El dominio de unión de ligando es modificado para eliminar la capacidad del receptor para unir al ligando natural. El sistema de receptor de hormona esteroide modificado es, además, descrito en la Patente Norteamericana No. 5,364,791 y Publicaciones PCT Nos. WO 96/40911 y WO 97/10337. Aún otros medios de control usan un transactivador controlable de tetraciclina positivo Este sistema implica un dominio de unión ai ADN de proteína represora tet mutado (los cambios de aminoácido R-4 tet mutados que resultan en la proteína transactivadora regulada de tetraciclina inversa, es decir, se une a un operador tet en la presencia de tetracichna) enlazada a un polípéptido el cual activa transcripción. Tales sistemas se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,464,758, 5,650,298 y 5,654,168. Los sistemas de control de expresión adicionales y construcciones de ácido nucleico se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,741,679 y 5,834,186. Los vectores de suministro vírales que contienen un polinucleótido ABC1 pueden hacerse específicos objetivos alterando la cubierta viral de manera que contiene un ligando que es específico para otra molécula encontrada en la célula objetivo. Esto permitirá al vector unirse específicamente al tipo de célula deseada. El ligando puede ser cualquier compuesto de interés que se unirá específicamente a una molécula encontrada en la célula objetivo, tal como un receptor de superficie celular. Preferiblemente, el receptor se encuentra exclusivamente en las células objetivos y no en otras células. Por ejemplo, los ligandos para el receptor depurador A pueden usarse para vectores de suministro virales directos a células de macrófago. Alternativamente, la cubierta viral puede alterarse de manera que contenga un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como Fab, o F(ab')2, que reconoce y une a un epítope antigénico en las células objetivo. La cubierta viral puede alterarse insertando un polinucleótido adicional que codifica el ligando en un genoma viral. Aquellos de experiencia en la técnica conocerán de otras secuencias de polinucleótido específicas que pueden insertarse en el genoma viral para permitir el suministro específico objetivo del vector que contiene el polinucleótido ABC1. Además, un polinucleótido ABC1 desnudo puede administrarse. Los polinucleótidos ABC1 y vectores de expresión ABC1 recombinantes, tales como aquellos descritos anteriormente, pueden administrarse como una composición farmacéutica. Tal composición comprende una cantidad efectiva de un polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1 recombinante, como se definió previamente en la presente, y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable seleccionado para adecuadabilidad con el modo de administración. Los materiales de formulación adecuados preferiblemente no son tóxicos a recipientes en las concentraciones empleadas y se describen en la presente posteriormente. La composición farmacéutica que comprende un polinucleótido ABC1 o un vector de expresión recombinante ABC1 puede contener materiales de formulación para modificar, mantener, o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción, o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, aspargina, arginina, o lisína), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o sulfito ácido de sodio), amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes de volumen (tales como manitol o glicina), agentes de quelación (tales como ácido etilendiamin tetraacético (EDTA)), agentes de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidina, beta-ciclodextrina, o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), rellenadores, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas), colorantes, saborizantes y agentes de dilución, agentes emulsificadores, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones que forman sal (tales como sodio), conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido ácido), solventes (tales como glicerina, propilenglicol, o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos; PEG; esteres de sorbitán; polisorbatos tales como polysorbato 20 o polysorbato 80; tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes de estabilidad mejorada (tales como sacarosa o sorbitol), agentes de tonicidad mejorada (tales como haluros de metal álcali - preferiblemente cloruro de sodio o potasio - o manitol sorbitol), vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990). Los compuestos farmacéuticamente activos (es decir, polínucleótido ABC1 o vector ABC1) pueden procesarse de acuerdo con métodos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para la administración a pacientes, incluyendo humanos y otros mamíferos. Así, la composición farmacéutica comprende un polinucleótido ABC1 o un vector de expresión recombínante ABC1 puede hacerse hasta en una forma sólida (incluyendo granulos, polvos o supositorios) o en una forma líquida (por ejemplo, soluciones, suspensiones, o emulsiones). Las formas de dosis sólidas para administración orai pueden incluir cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En tales formas de dosis sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con por lo menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosis pueden también comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales diferentes de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de las cápsulas, tabletas, y pildoras, las formas de dosis pueden también comprender agentes de amortiguamiento. Las tabletas y pildoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosis líquidas para administración oral o parenteral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables, que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua. Tales composiciones pueden también comprender adyuvantes, tales como agentes edulcorantes humectantes, saborizantes, y de perfume. Por ejemplo, un portador adecuado para inyección puede ser agua, solución fisiológica salina, o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución amortiguada salina neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son, además, portadores ejemplares. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5 el cual puede, además, incluir sorbitol o un sustituyente adecuado. El régimen de dosis para tratar una enfermedad cardiovascular con una composición que comprende un polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1 se basa en una variedad de factores, incluyendo el tipo de enfermedad cardiovascular, la edad, peso, sexo, condición médica del paciente, la severidad de la condición, la ruta de administración, y el compuesto particular empleado. Así, el régimen de dosis puede variar ampliamente, pero puede determinarse de manera rutinaria utilizando métodos estándares. Por ejemplo, la cantidad del polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1 para ser administrado es una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol a partir de las células de un sujeto mamífero. Tal cantidad puede determinarse, por ejemplo, midiendo el nivel de HDL-colesterol en plasma de un sujeto antes y después de la administración del polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1. Una cantidad suficiente del polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1 es una cantidad que incrementa el nivel de HDL-colesterol en plasma de un sujeto. Por consiguiente, el médico puede valorar la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar de aproximadamente 0.1 ?g/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polinucleótido o vector ABC1 en la formulación siendo usada. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que la dosis alcanzada logra el efecto deseado. La composición puede por lo tanto ser administrada como una dosis única, como dos o más dosis (la cual puede o no puede contener la misma cantidad de la molécula deseada), durante tiempo, o como una infusión continua a través de dispositivo o catéter de implantación. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se realiza de manera rutinaria por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas en forma rutinarias realizadas por la misma. Las dosis ? * . - i « ?- apropiadas pueden determinarse a través del uso de datos de respuesta de dosis apropiados. Las células de un sujeto mamífero pueden transfectarse in vivo, ex vivo o in vitro. La administración de un polinucleótido ABC1 o un vector recombinante que contiene un polinucleótico ABC1 a una célula objetivo in vivo puede lograrse utilizando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,672,344 describe en el sistema de transferencia de gen mediado viral in vivo implicando un vector HSV-1 neurotrófico recombinante. Las composiciones descritas anteriormente de los polinucleótidos ABC1 y vectores ABC1 recombinantes pueden ser transfectadas in vivo o por administración oral, bucal, parenteral, rectal o tópica así como por inhalación de rocío. El término "parenteral" como se usa en la presente incluye, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrasternal, técnicas de infusión o intraperítonealmente. Para la administración oral, la composición farmacéutica que contiene el polinucleótido ABC1 o vector ABC1 recombinante puede estar en la forma de, por ejemplo, una cápsula, una tableta, una suspensión, o líquido. Las composiciones farmacéuticas se hacen preferiblemente en la forma de una unidad de dosis que contiene una cantidad dada de ADN o partículas de vector viral. Por ejempio, estas pueden contener una cantidad de aproximadamente 103-1015 partículas virales, preferiblemente de aproximadamente 106-1012 partículas virales. Una dosis diaria adecuada para un humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la condición del paciente y otros factores, una vez nuevamente, puede determinarse utilizando métodos de rutina. La composición farmacéutica que contiene el ADN ABC1 o vector ABCl recombinante puede también administrarse rectalmente. Los supositorios adecuados para administración rectal del vector pueden prepararse mezclando el vector con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de cacao y polietilenglicoles que son sólidos a temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirán en el recto y liberarán el vector. Una composición farmacéutica también puede formularse por inhalación. Por ejemplo, un polinucleótido o vector ABC1 puede formularse como un polvo seco para inhalación. También, las soluciones de inhalación de vector o polinucleótido ABC1 pueden formularse con un propulsor para suministro de aerosol. En aún otra modalidad, las soluciones pueden nebulízarse. La composición farmacéutica que contiene el ADN ABC1 o vector ABC1 recombinante puede también ser inyectado. Las preparaciones inyectables, tales como suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse de acuerdo a los métodos conocidos utilizando agentes de dispersión o humectación adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede también ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1 3-butandiol. Un portador particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un polinucleótido o vector ABC1 se formula como una solución estéril, ísotónica, correctamente conservada. Entre los otros portadores y solventes aceptables que pueden emplearse son solución Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo suave puede emplearse, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. Aún otra preparación puede implicar la formulación de la molécula de ABC1 deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos, cuentecillas o liposomas, que proporcionan para la liberación controlada o sostenida del producto ABC1 (ver por ejemplo, PCT/US93/00829; Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 82:3688-3692 (1985)). También, la composición farmacéutica que contiene el ADN ABC1 o vector ABC1 recombinante puede administrarse tópicamente. Para administración tópica, el vector puede comprender de 0.001% a 10% p/p, por ejemplo de 1% a 2% por peso de la formulación, aunque ésta puede comprender tanto como 10% p/p, pero preferiblemente no más de 5% p/p. y más preferiblemente de 0.1% a 1% de la formulación. Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semi-líquidas adecuadas para penetración a través de la piel (por ejemplo, linimentos, lociones, ungüentos, cremas, o pastas) y gotas adecuadas para administración al ojo, oreja o nariz. Una dosis tópica adecuada de ingrediente activo de un vector de la presente invención se administra una a cuatro, preferiblemente dos o tres veces diariamente. Mientras los ácidos nucleicos y/o vectores de la invención pueden administrarse como el agente farmacéutico activo único, pueden también ser usados en combinación con uno o más vectores de la invención u otros agentes. Cuando se administra como una combinación, los agentes terapéuticos pueden formularse como composiciones separadas que se dan al mismo tiempo o tiempos diferentes, o los agentes terapéuticos pueden darse como una composición única. En otra modalidad de la presente invención, una célula objetivo se transfecta in vivo por implantación de una "línea celular productora" en proximidad a la población de célula objetivo (Culver, K., eí al., 1994, Hum. Gene Ther., 5(3): 343-79; Culver, K., eí al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59:685-90; Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4(1):39-69). La línea celular productora se construye para producir un vector viral que contiene el polinucleótido ABC1 y para librar sus partículas virales en la vecindad de las células objetivo, es decir, preferiblemente células de macrófago encontradas en lesiones ateroscleróticas. Una porción de las partículas virales liberadas contactan las células de macrófago objetivo e infectan aquellas células, así suministrando un polinucleótido ABC1 a la célula de macrófago objetivo. Después de la infección de la célula objetivo, la expresión del polinucleótido ABC1 ocurre, proporcionando la célula de macrófago con la proteína ABC1 funcional. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad cardiovascular por la introducción ex vivo de un polinucleótido ABC1 o vector de expresión ABC1 recombinante. En tales casos, las células, tejidos, u órganos que han sido removidos del paciente se exponen a las composiciones ABC1 después de lo cual las células, tejidos, u órganos se implantan subsecuentemente atrás en el paciente. Por ejemplo, un método incluye la remoción de una muestra sanguínea a partir de un sujeto con enfermedad cardiovascular, enriqueciendo la muestra para monocitos, y poniendo en contacto los monocitos aislados con un rector de expresión recombinante que contiene el polinucleótido ABC1 y, opcionalmente, un gen específico objetivo. Opcionalmente, las células de monocito pueden ser tratadas con un factor de crecimiento, tal como GM-CSF, para estimular el crecimiento celular, antes de la reintroducción de las células en el sujeto. Cuando se vuelven a introducir, las células específicamente elegirán la población celular a partir de la cual se aislan originalmente. De esta manera, la actividad de transporte del polipéptido ABC1 puede utilizarse para promover la emanación de colesterol en un sujeto. Otro método de administración ex vivo implica introducir el polinucleótido ABC1 o vector ABC1 recombinante en el sujeto mamífero por medio de los transplantes de piel de células que contiene el virus. Preferiblemente, un retrovirus usado por este método de administración. La expresión a largo plazo de los genes extraños en implantes, utilizando células de origen de fibroblasto, pueden lograrse si un promotor de gen gobernador fuerte se usa para accionar la transcripción. Por ejemplo, el promotor de gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) puede usarse. Las células tales como fibroblastos, pueden infectarse con viriones que contienen una construcción retroviral que contiene el polinucleótico ABC1 junto con un gen el cual se permite para objetivo específico, tal como receptor de eliminación A, y un promotor fuerte. Las células infectadas pueden empotrarse en una matriz de colágeno que pueden injertarse en el tejido conectivo de la dermis en el sujeto recipiente. Como los retrovirus proliferan y evaden la matriz específicamente infectarán la población de célula objetivo. De esta manera, los resultados de transplantación en cantidades incrementadas de actividad de emanación de colesterol en células que manifiestan el trastorno de transporte.

En otra modalidad, el vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido ABC1 puede administrarse utilizando técnicas m vitro, tales como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,399,346. Por ejemplo, un pol ipéptido ABC1 puede suministrarse implantando ciertas célulae que han sido construidas genéticamente, utilizando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar el polipéptido ABC1. Para minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes siendo administrado un polipéptído ABC1, como puede ocurrir con la administración de un polipéptido de unas especies extrañas, se prefiere que las células naturales que producen el polipéptido ABC1 sean de origen humano y produzcan polipéptido ABC1 humano. Así, se prefiere que las células recombinantes que producen el polípéptido ABC1 sean transformadas con un vector de expresión que contiene un gen que codifica un polipéptido ABC1 humano. Las células pueden ser autólogas o heterólogas. Opcíonalmente, las células pueden inmortalizarse. Para disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, cercamientos o membranas poliméricas semi-permeabies que permite la liberación de los productos de proteína, pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes. Las .. ...^i.:.'. ?i^?S células transfectadas pueden administrarse a un paciente utilizando los métodos descritos anteriormente. Las técnicas para la encapsulación de células vivientes se conoce en la técnica, y la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes puede ser rutinariamente lograda. Por ejemplo, Baetge eí al. (Publicación de PCT No. WO 95/05452 y PCT/US94/09299) describe cápsulas de membrana que contienen genéticamente células de construcción para el suministro efectivo de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las cápsulas de células encapsuladas se transfectan con moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican para moléculas biológicamente activas operativamente enlazadas a promotores que no están sujetos a baja regulación in vivo en implantación en un huésped mamífero. Los dispositivos proporcionados por el suministro de las moléculas a partir de células vivientes a sitios específicos dentro un recipiente. Además, ver Patentes Norteamericanas Nos: 4,892,538; 5,011,472; y 5,106,627. Un sistema para encapsular células vivientes se describe en la Publicación de PCT No. WO 91/10425 (Aebischer eí al.). Ver también, Publicación de PCT No. WO 91/10470 (Aebischer eí al); Winn et al., 1991, Expert. Neurol. 113:322-29; Aebischer eí al., 1991, Expert. Neurol. 111:269-75; y Tresco eí al., 1992, ASAIO 38:17-23.

Otro sistema de suministro para po nucleótidos que codifican ABC1 es un sistema de suministro "no viral". Las técnicas que han sido usadas o propuestas para terapia de gen incluyen complejos de ligando de ADN, complejos de ligando de 5 ADN-adenovirus, inyección directa de ADN, precipitación CaP0 , técnicas de disparo de gen, electroporación. lipofección, y dispersión coloidal (Mulligan, R., 1993, Science, 260(5110): 926- 32). Cualquiera de estos métodos está ampliamente disponible por un experto en la técnica y podrían ser adecuados para uso en la 10 presente invención. Otros métodos adecuados están disponibles por un experto en la técnica, y se entenderá que la presente invención puede lograrse utilizando cualquiera de los métodos disponibles de transfección. Varias de tales metodologías han sido utilizadas por aquellos expertos en la técnica con éxito variante 15 (Mulligan, R., 1993, Science, 260 (5110): 926-32). Preferiblemente, el sistema de suministro no viral es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidales incluyen complejos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, cuentecillas, y sistemas basados en lípido incluyen 20 emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma, el cual es una vesícula de membrana artificial útil como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Los liposomas se autoensamblan, las partículas coloidales en las cuales una bicapa 25 de lípido, compuesta de moléculas anfifílicas tales como fosfatidil ^?^?sá^ É^a^ts^ií^t^^ serina o fosfatidil colina, que encapsulan una porción de los medios circundados de manera que la bicapa lipida circunda un interior hidrofílico. Los liposomas unilamelares o multilamelares pueden construirse de manera que el interior contenga un químico deseado, fármaco, o como en la presente invención, una molécula de ADN aislada. Por ejemplo, se ha mostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), las cuales varían en tamaño de 0.2-4.0 µm pueden encapsular un porcentaje sustancial de un amortiguador acuoso que contiene macromoléculas largas, tales como ARN, ADN y viriones intactos. Una vez encapsuladas dentro del interior acuoso, estas macromoléculas pueden suministrarse a células de mamífero en una forma biológicamente activa (Fraley, R. and Paphadjopoulos, D. 1981, Trends Biochem. Sci., 6:77-80). Para que un iiposoma sea un vehículo de transferencia de gen eficiente, las siguientes características deben presentar: (1) encapsulación de los genes de interés a alta eficiencia mientras no se comprometa su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula objetivo en comparación a las células no objetivo; (3) suministro de los contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma de célula objetivo a alta eficiencia; y (4) expresión aguda y efectiva de la indisposición genética (Mannino, R., eí al., 1988, Biotechniques, 6(7): 682-90). La composición del liposoma es usualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de temperatura de transición de fase elevada, usualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Otros fosfolípídos u otros lípidos pueden también utilizarse. Las características físicas de liposomas dependen del pH, resistencia iónica, y la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposoma incluyen compuestos de f osf at id ililo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanoiamina, espíngolípidos, cerebrosidas, y gangliosidas. Particularmente útiles son diacilfosfatidilgliceroles, donde la porción de lípido contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono, y se satura. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatadidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidílcolina y distearoil fosfatidilcolina. El objetivo de los liposomas ha sido clasificado basado en los factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, órgano específico, célula específica, y organelo específico. Los objetivos mecanísticos pueden distinguirse basados en si es pasivo o activo. Los objetivos pasivos utilizan la tendencia natural de liposomas para distribuir las células del sistema reticulo-endotelial (RES) en órganos los cuales contienen capilaridades sinusoidales. El objetivo activo, por otro lado, implica alteración del liposoma por acoplamiento de liposoma a un ligando específico, tal como un anticuerpo policlonal o monoclonal, azúcar, glicolípido, o proteína, o cambiando la composición o tamaño del liposoma para lograr el objetivo a órganos y tipos celulares diterentee de los sitios que ocurren naturalmente de ubicación. Preferiblemente, el ligando es un anticuerpo policlonal o monoclonal el cual puede usarse a liposomas objetivos para ligandos específicos de superficie celular. El ligando puede también ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, o F(ab')2, tan grande como éste se une eficientemente a un epítope antigénico en las células objetivo. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un antígeno que se encuentra exclusivamente en la célula objetivo. Por ejemplo, ciertos antígenos expresados específicamente en células de macrófago, tales como receptor depurador A, pueden ser explotados para el propósito de elegir los objetivos de liposomas ABC1 de anticuerpo directamente a una célula de macrófago. Un número de procedimientos pueden usarse para unir covalentemente ya sea los anticuerpos policlonales o monoclonales a un una bicapa de liposoma. También, los grupos de lípidos pueden incorporarse en una bicapa de lípido del liposoma para mantener el ligando objetivo en asociación estable con bicapa liposomal. Además, varios grupos de enlaza pueden usarse para unir las cadenas de lípido al ligando objetivo. Estudios presentados en la presente muestran que los ligandos para receptores nucleares son capaces para efectuar un incremento en la emanación de colesterol. Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células en un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar al sujeto mamífero por lo menos un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol a partir de tales células. Una composición farmacéutica que comprende un ligando para un receptor nuclear puede prepararse y administrarse utilizando los métodos descritos anteriormente formulando y administrando composiciones farmacéuticas. Una cantidad suficiente de un ligando de receptor nuclear es la cantidad de ligando que incrementa la emanación de colesterol. Tal cantidad puede determinarse midiendo la emanación de colesterol antes y después de la administración del ligando a varías dosis y determinando la dosis que efectúa un incremento en la emanación de colesterol. La emanación de colesterol puede medirse utilizando ensayos previamente descritos. Los receptores nucleares son factores de transcripción activado de ligando que juegan un papel crítico en el desarrollo de vertebrado y fisiología adulta transduciendo los efectos de pequeñas, hormonas lipofílicas en las respuestas transcripcionales. Varias familias de receptores nucleares existen, incluyendo los receptores activados proliferadores de peroxisoma (PPARs), receptores X de hígado (LXR) receptor X retinoíde (RXR), receptor X de farnesoid (FXR), y el receptor de esteroide y xenobiótíco (SXR). La familia PPAR comprende los tres productos de gen cercanamente relacionados PPAR , PPAR?, y PPARß/d. PPAR(/ ha sido implicado como un regulador clave de metabolismo de lípido intra- y extracelular. Cuando se une a ácidos grasos, PPARa estimula la proliferación de peroxisomas e induce la síntesis de vanas enzimas implicadas en la ß-oxidación de ácidos grasos. El receptor PPARa es también el objetivo molecular para los fibratos, fármacos que se prescriben para la reducción de niveles elevados de triglicérido (Isseman et al., Nature, 347, 645 (1990)). Los fibratos actúan como ligandos PPAR para regular la transcripción de un gran número de genes que afectan la lipoproteína y metabolismo de ácido grasos. Además, los ligandos PPAR?. tales como compuestos que pertenecen a la clase de compuestos tiazolidíndionas, han sido mostrados para incrementar HDL y reducir niveles de triglicérido en humanos. LXR es un receptor oxiesterol que regula el catabolismo de colesterol en exceso. LXRa ha sido mostrado para unirse como un heterodímero con RXR a un elemento de respuesta de ADN en el gen CYP7a, que codifica la enzima responsable para la etapa que limita la velocidad en la conversión de colesterol a ácidos de bilis. Estudios han mostrado que los ratones que carecen de LXRa acumulan enormes cantidades de esteres de colesterol en sus hígados cuando se alimentan con una dieta rica en colesterol, debido a su incapacidad para incrementar la transcripción del CYP7a en respuesta a colesterol dietético (Peet et all, Cell, 93:693 (1998)). Estudios adicionales con LXRa de ratones nulos muestran LXRu está también implicado en la regulación de varios otros genes que participan en homeostasis de colesterol y ácido graso. El papel biológico de un receptor nuclear cercanamente relacionado, LXRß, el cual se expresa en varios tejidos y se activa por los mismos oxiesteroles como LXRa, permaneciendo incierto (Song et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 91:10809 (1994); Seol, Mol. Endocrinol., 9:72 (1995)). FXR, el cual es evolucionariamente relacionado a LXRa, está también implicado en homeostasis de colesterol. Como LXRa, las funciones de FXR como un heterodímero con el receptor RXR (Schwartz et al., Curr. Opin. Lipidol., 9:113 (1998); Vlahcevic et al., Gastroenterlogy, 113: 1949 (1997)). El FXR se activa por el retinoide sintético TTNPB y concentraciones superfisíológicas de todos los ácidos trans retinoicos (Zavacki et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 94: 7909 (1997)). Estudios recientes indican que FXR es un receptor de ácido de bilis nuclear. Primero, FXR se expresa abundantemente en tejidos a través de los cuales los ácidos de bilis circulan, incluyendo el hígado, intestino, y riñon (Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995); Forman et ai., Cell, 81:687 (1995)). También, FXR ha sido mostrado recientemente para servir como un receptor para concentraciones fisiológicas de varias sales de bilis, entre las cuales el ácido cenodesoxicólíco (CDCA) es el más potente (Kliewer et al., Science, 284: 757-284 (1999); Makishima et al., Science, 284: 1362-1363 (1999)). CDCA se conoce para regular la expresión de varios genes que participan en la homeostasis de sal de bilis, incluyendo aquellos que codifican CYP7a y la proteína de unión de ácido de bilis intestinal. Como se describe en detalle en el Ejemplo 13, los ligandos para receptores nucleares LXR, RXR, y PPAR se muestran para incrementar la emanación de colesterol inducida por apoAl en células de macrófago de ratón cargadas con colesterol. Por ejemplo, la administración de ácido c/s-retinoico 9 (30 ng/ml) producido aproximadamente a 3 veces incrementadas en la emanación de colesterol inducida por apoAl en estas células. Similarmente, la administración de 22(R)-hidroxicolesterol (5 µg/ml) producido aproximadamente a 3 veces incrementada en la emanación de colesterol inducido por apoAl. Las células que reciben fenfibrato (3 µg/ml) produjo un incremento aproximado de 2 veces en la emanación de colesterol. Estos resultados indican que los receptores nucleares pueden modularse para incrementar la velocidad de la emanación de colesteroi mediada por apolipoproteína a partir de macrófagos. Además, como se describe en el Ejemplo 13, la emanación de colesterol mediada por 9-c/s-RA a partir de células de macrófago en una forma dependiente de dosis. Otros activadores de receptor nuclear, tales como bezafibrato, se muestran para incrementar la emanación de colesterol (datos no mostrados). Por consiguiente, en el método para incrementar la emanación de colesterol administrando un ligando de receptor nuclear, el ligando es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de ligandos de receptor nuclear LXR, RXR, PPAR, FXR, y SXR. En la modalidad preferida, en donde un ligando LXR se usa para incrementar la emanación de colesterol, el ligando es más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de ligandos 20(S) hidroxicolesterol, 22(R) hidroxicolesterol, 24-hidroxicolesterol 25-hidroxicolesterol, y 24(S), 25 epoxicolesterol LXR. Más preferiblemente, el ligando LXR es 20(S) hidroxícolesterol En la modalidad preferida en donde un ligando RXR se usa para incrementar la emanación de colesterol, el ligando es más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de ácido 9-c/s retinoico, retínol, retinal, ácido retinoico todo trans, ácido 13-c/s retinoico, acitretina fenretinida, etretinato, CD 495, CD564, TTNN, TTNNPB, TTAB, LGD 1069. Más preferiblemente, el ligando RXR es ácido 9-c/s retinoico. En otra modalidad preferida en donde un ligando PPAR se usa para incrementar la emanación de colesterol, el ligando es preferiblemente seleccionado de la clase de compuestos de tiazolídindiona. En otra modalidad preferida, más de un ligando de receptor nuclear se administra al sujeto mamífero para incrementar la emanación de colesterol. Preferiblemente, cuando dos o más ligandos de receptor nuclear se administran a un sujeto, los ligandos son un ligando LXR y un ligando RXR. Más preferiblemente, los ligandos receptores nucleares son 20(S) hidroxicolesterol y ácido 9-c/s retinoico.

En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células en un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar al sujeto mamífero un eicosanoíde en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol. Una composición farmacéutica que comprende un eícosanoide puede prepararse y administrarse utilizando los métodos descritos anteriormente formulando y administrando composiciones farmacéuticas. Una cantidad suficiente de eicosanoide es la cantidad que incrementa la emanación de colesterol. Tal cantidad puede determinarse midiendo la emanación de colesterol antes y después de la administración del eícosanoide en varias dosis y determinando la dosis que efectúa un incremento en la emanación de colesterol. La emanación de colesterol puede medirse utilizando ensayos y métodos previamente descritos. Como se describe en el Ejemplo 14, los eicosanoides se muestran para incrementar la emanación de colesterol inducida por apoAl en células de macrófago cargadas con colesterol. Por ejemplo, la administración de PG12 (25 mm) produce aproximadamente un incremento 2 veces en la emanación de colesterol inducida por apoAl en estas células. Así mismo, la administración de PGE1 (25 nM) produce aproximadamente un incremento de 3 veces en la emanación de colesterol inducida por apoAl. Estos resultados demuestran que los eicosanoides pueden incrementar la velocidad de emanación de colesterol mediada por apolipoproteína a partir de macrófagos. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el eicosanoide se selecciona del grupo que consiste de eicosanoides de prostaglandina E2 prostaciclina (prostaglandina 12) y prostaglandina J2.

Métodos y Compuestos para Incrementar la Expresión/Actividad de ABCl Dado que las funciones ABC1 para promover la 10 emanación de colesterol, una forma para incrementar la emanación de colesterol es para incrementar la expresión celular de ABC1. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos adecuados para incrementar la emanación de colesterol de las células en un sujeto mamífero administrando al sujeto 15 mamífero una cantidad terapéutica de un compuesto que incrementa la expresión de ABC1 en tales células. Una cantidad terapéutica del compuesto es la cantidad del compuesto que incrementa la expresión ABC1. Tal cantidad puede determinarse midiendo la expresión del gen de ABC1 antes y después de la 20 administración del compuesto a varias dosis y determinando la dosis que efectúa un incremento en la expresión del gen ABC1. La expresión del gen ABC1 puede medirse obteniendo una muestra sanguínea a partir del sujeto, separando la población de monocito, y determinando la concentración de ARNm ABC1 utilizando -SáHMfeiafc.,.. j^... . i.. .. . . , ,? »_ „. mm , . • : .^¿¿t-»— jfl» métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente, tales como RT-PCR. En una modalidad preferida, el método comprende administrar un análogo cAMP para incrementar la expresión del gen de ABC1. Como se muestra en la Figura 8, el cAMP incrementa la expresión de ARNm ABC1 en células de fibroblastos normales aproximadamente 10 veces. Preferiblemente, el análogo cAMP se selecciona a partir del grupo que consiste de 8-bromo cAMP, N6-benzoiio, cAMP, y 8-tiometílo cAMP. En otra modalidad preferida, el método comprende administrar un compuesto que incrementa la síntesis de cAMP para incrementar la expresión del gen de ABC1. Preferiblemente, el compuesto es forskolin. En aún otra modalidad preferida, el método comprende administrar un compuesto que inhibe la ruptura de cAMP para incrementar la expresión del gen de ABC1. Un ejemplo de tal compuesto es un inhibidor de fosfodiesterasa. Preferiblemente, el inhibidor de fosfodiesterasa se selecciona del grupo que consiste de rolipram, teofilina, 3-isobutil-1 -metilxantina, R020-1724, vinpocetina, zaprinast, dipiridamol, milrinona, ampnona, pimobendan, cilostamida, enoximona, peroximona e inhibidores de vesnarinon fosfodiesterasa. En otra modalidad preferida, el método comprende administrar al sujeto mamífero un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la expresión del gen de ABC1. Como se describió en el Ejemplo 17 y se mostró en la Figura 12, los ligandos para receptores nucleares pueden sobrerregular la expresión del gen de ABC1. Los estudios de transfección utilizando pAPR1, que contienen un gen reportero de luciferasa bajo el control del promotor ABC1, mostraron que el promotor ABC1 se activó en la presencia de ligandos para receptores nucleares LXR y RXR. Específicamente, las células de macrófago transfectadas con pAPR1 produjeron un incremento de 19 veces en la actividad reportera de luciferasa en la presencia de 20 OH-chol, un incremento de 16 veces en actividad de luciferasa en la presencia de 9-c/s RA, y un incremento de 280 veces en actividad de luciferasa en la presencia de ambos ligandos comparados con control EtOH. Los resultados indican que ambos esteróles y retinoides producen una respuesta de transcripción fuerte a partir del promotor ABC1. Además, existe un efecto sinergístico aparente entre las dos clases de compuestos, como se puede ver por el incremento dramático en la actividad de luciferasa encontrada en células tratadas con ambos ligandos. De acuerdo con el método inventivo, preferiblemente, el ligando se selecciona del grupo que consiste de ligandos LXR. RXR, PPAR, FXR, y SXR. Además, para incrementar los niveles celulares de la proteína ABC1, el transporte de colesterol inverso puede promover mejorando la actividad de la proteína ABC1. Así, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de las células A. , 1-A ^-^^^^¡- en un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar al sujeto mamífero una cantidad terapéutica de un compuesto que incrementa la actividad de ABC1 en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol. Una composición farmacéutica que comprende tal compuesto puede prepararse y administrarse utilizando los métodos descritos anteriormente formulando y administrando composiciones farmacéuticas. Una cantidad terapéutica del compuesto es la cantidad del compuesto que incrementa la emanación de colesterol. Tal cantidad puede determinarse midiendo la emanación de colesterol antes y después de la administración del compuesto a varias dosis y determinando la dosis que efectúa un incremento en la emanación de colesterol utilizando métodos anteriores y descritos. Para determinar si es debido un incremento en la emanación de colesterol debido a un incremento en la actividad ABC1, la cantidad de proteína ABC1 presente en una muestra celular antes y después de la administración del compuesto se determina, utilizando métodos descritos en la presente (ver Ejemplo 11). Para ambas mediciones (es decir, pre y post-administración del compuesto), la cantidad de ia actividad de emanación de colesterol se divide por la concentración de la proteína ABC1 para determinar la cantidad de actividad de colesterol encontrada en una concentración estándar de la proteína ABC1. Un incremento observado en la actividad de colesterol estandarizado para concentración de proteína indica que el incremento se debe a un incremento en la actividad ABC1.

Métodos para Identificar Compuestos Terapéuticos Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para tamizar un compuesto para determinar si el compuesto modula (es decir, sobre-regula o des-regula) la expresión del gen de ABC1. Tales compuestos pueden ser útiles en el desarrollo de compuestos terapéuticos que incrementan la expresión ABC1 y por lo que promueven la emanación de colesterol y elevan los niveles sanguíneos de HDL-colesterol. Por consiguiente, los métodos para identificar los compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedad cardiovascular se proporcionan. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tamizar un compuesto de prueba para la expresión de ABC1 que modula la actividad que comprende las etapas de: (a) enlazar operativamente un ADNc reportero con una expresión que modula una porción del gen ABC1 de mamífero para producir una construcción reportera recombínante; (b) transfectar la construcción reportera recombinante en una población de células huésped; (c) ensayar el nivel de expresión del gen reportero en una muestra de las células huésped transfectadas; (d) poner en contacto las células huésped transfectadas con el compuesto de prueba siendo tamizado; (e) ensayar el nivel de la expresión del gen reportero en una muestra de las células huésped transfectadas después del contacto con el compuesto de prueba; y (f) comparar el cambio relativo en el nivel de la expresión del gen reportero provocado por la exposición al compuesto de prueba, por lo que determina la actividad que modula la expresión de ABC1. Primero, se construye una construcción reportera recombinante que comprende un gen reportero heterólogo operativamente enlazado a una porción que modula la expresión del gen ABC1. La expresión que modula el polinucleótido de ABC1 y el gen reportero pueden insertarse en un vector utilizando técnicas de ligación y clonación bien conocidas, tales como aquellas descritas en la presente y en manuales de laboratorio estándares incluyendo Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); y Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, (Wiley and Sons (1994)). Alternativamente, la expresión que modula el polinucleótido de ABC1 puede insertarse en una construcción reportera comercialmente disponible, tal como aquella previamente descrita. Cualquier vector adecuado para el polínucleótido ABC1 y la inserción del gen reportero pueden ser usados. El vector de elección debe ser funcional en la célula huésped particular empleada. Preferiblemente, el vector es compatible con células huésped de mamífero. Preferiblemente, la expresión que modula la porción del gen ABC1 es la región de flanqueo 5' de ABC1, que contiene la actividad promotora ABd. En una modalidad preferida, la expresión que modula la porción del gen ABC1 comprende la SEC. DE IDENT. NO : 3. En otra modalidad preferida, la expresión que modula ia porción del gen ABC1 comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1394-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.. 3. También, preferiblemente, el reportero heterólogo se selecciona del grupo que consiste de polinucleótidos que codifican la luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, y proteinas fluorescentes verdes. Más preferiblemente, el reportero heterólogo es un polinucleólido que codifica la proteína de luciferasa. En una modalidad particularmente preferida, la construcción reportera recombinante es pAPR1, se muestra en la Figura 11. Enseguida, la construcción reportera recombinante se transfecta en una población de células huésped. La construcción reportera recombinante puede introducirse en las células huésped utilizando cualquiera de los métodos de transfección descritos previamente, así como los métodos descritos en el Ejemplo 8 y 15. Por ejemplo, la construcción del reportero puede transfectarse utilizando transfecci?n de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección, o cualquiera de los métodos conocidos y descritos (ver, por ejemplo. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). La célula huésped puede ser cualquier célula que, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido reportero, el cual puede mediarse subsecuentemente. Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped de mamífero. Más preferiblemente, la célula huésped de mamífero es un macrófago, fibroblasto, célula hepática o intestinal. Más preferiblemente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de células RAW 264.7, células Thp-1, y células HepG2. La concentración de la construcción reportera y duración de la transfección puede variar, dependiendo del método de transfección y el tipo y concentración la célula huésped usada. La determinación de la concentración apropiada de la construcción reportera y tiempo de transfeccíón está bien dentro del alcance del artesano ordinario. Siguiendo la transfección, una muestra de células huésped transfectadas que no se exponen al compuesto de prueba se analizan para determinar el nivel de la expresión del gen reportero. El nivel de la expresión del gen reportero encontrado en la muestra de las células huésped transfectadas no expuestas proporciona una medición de control. Las células huésped transfectadas se lisan y el nivel de la expresión del gen reportero se analiza utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. El ensayo usado para medir el nivel de expresión del gen reportero diferido, dependiendo de la construcción reportera usada en las transfecciones. Por ejemplo, si una construcciones reportera de luciferasa se usa, la actividad de la luciferasa del lisato celular se mide como unidades de luz utilizando un luminómetro, como se describe en el Ejemplo 15.

Una muestra diferente de las células huésped transfectadas se contacta con el compuesto de prueba siendo tamizado y el ni*/el de la expresión del gen reportero encontrado en estas células se mide subsecuentemente. Prefepblemente, las células huésped transfectadas se contactan con el compuesto de prueba durante aproximadamente 4-48 horas. Más preferiblemente, las células huésped transfectadas se contactan con el compuesto de prueba durante aproximadamente 8-36 horas. Aún más preferiblemente, las células huésped transfectadas se contactan con el compuesto de prueba durante aproximadamente 24 hora. El mismo ensayo usado para medir el nivel de expresión del gen reportero en las células (control) no expuestas deben usarse para medir el nivel de la expresión del gen reportero en las células expuestas al compuesto de prueba. Finalmente, el nivel de la expresión del gen reportero encontrado en las células control no expuestas se compara con el nivel de la expresión del gen reportero encontrado en células expuestas en el compuesto de prueba para determinar si el compuesto de prueba tiene la actividad que modula la expresión ABC1. Sí el nivel de la expresión del gen en ambas muestras celulares es el mismo o aproximadamente el mismo, el compuesto de prueba no modula la expresión del gen ABC1. Un nivel elevado de la expresión del gen reportero en células expuestas al compuesto de prueba en relación con el nivel de la expresión del gen reportero encontrado en células control, indica que el compuesto de prueba sobre-regula la expresión del gen de ABC1. Un nivel inferior de la expresión del gen reportero en células expuestas al compuesto de prueba relativo al nivel de la expresión del gen reportero encontrado en las células control, indica que el compuesto de prueba sub-regula la expresión del gen de ABC1. Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para tamizar un compuesto de prueba para determinar si el compuesto promueve la emanación de colesterol mediada por ABC1. Tal método comprende: (a) ensayar el nivel de emanación de colesterol en una muestra de células de mamífero mantenidas en cultivo para determinar un nivel de control de emanación de colesterol, (b) poner en contacto las células de mamífero con el compuesto de prueba siendo tamizado; (c) ensayar el nivel de emanación de colesterol en una muestra de células después del contacto con el compuesto de prueba; y (d) ensayar el nivel de la emanación de colesterol dependiente de ABC1 en una muestra de células después del contacto con el compuesto de prueba, por lo que determina si el compuesto de prueba promueve la emanación de colesterol mediada por ABC1 a partir de las células en cultivo. El nivel de emanación de colesterol en una muestra de células cultivadas puede determinarse utilizando métodos conocidos en la lécnica y descritos en la presente (ver Ejemplo 1). Cualesquiera células de mamífero que pueden mantenerse en cultivo pueden usarse para medir la emanación de colesterol. Las células pueden derivarse de cultivos principales o de líneas celulares inmortalizadas. Para conveniente, las células pueden ser inmortalizadas por su transfección con retrovirus anfotrópicos que contienen vectores con insertos de papilomavirus humano 16, oncogenes E6 y E7, y un gen marcador seleccio abl , como se describe en el Ejemplo 1. Preferiblemente, las células de cultivo son fibroblastos, macrófago, células hepáticas o intestinales. Más preferiblemente, las células de cultivo son células RAW 264.7. El nivel de emanación de colesterol en una muestra de células que no han sido contactadas con el compuesto de prueba se mide para obtener un nivel de control de emanación de colesterol. Además, el nivel de emanación de colesterol en una muestra de células de mamífero que ha sido contactado con el compuesto de prueba se mide para determinar la cantidad de emanación de colesterol afectada por el compuesto de prueba. También, el nivel de emanación de colesterol mediada por ABC1 en una muestra de células de mamífero que ha sido contactado con el compuesto de prueba se mide para determinar la cantidad de emanación de colesterol mediada por ABC1 afectada por el compuesto de prueba. Preferiblemente, las células se contactan con el compuesto de prueba durante aproximadamente 8-24 horas antes de que la emanación de colesterol o emanación de colesterol mediada por ABC1 se ensaye. El nivel de emanación de colesterol mediada por ABC1 puede ensayarse utilizando un anticuerpo anti-ABC1 que, hasta la unión, inhibe la actividad de ABC1. Alternativamente, el nivel de emanación de colesterol mediada por ABC1 puede ensayarse utilizando un poiinucleótido ABC1 anti-sentído que inhibe la expresión de ABCl. Por ejemplo, el nivel de emanación de colesterol mediado por ABC1 puede ensayarse utilizando el polinucleótido ABC1 anti-sentido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 57 (ver Ejemplo 7). Las células deben contactarse con el anticuerpo anti-ABC1 o polinucleótido ABC1 anti-sentido al mismo tiempo y para la misma duración que se contacta con el compuesto de prueba. Si el nivel de la emanación de colesterol de control es el mismo o aproximadamente el mismo como el nivel de emanación de colesterol encontrado en células contactadas con el compuesto de prueba, el compuesto no promueve la emanación de colesterol. Un incremento en el nivel de emanación de colesterol encontrado en células contactadas con el compuesto de prueba sobre el nivel de control de la emanación de colesterol indica la cantidad de emanación de colesterol promovida por el compuesto de prueba. La diferencia entre la emanación de colesterol encontrada en células contactadas con el compuesto de prueba único y la emanación de coiesterol encontrada en células contactadas con el compuesto de prueba y el anticuerpo anti-ABC1 o polinucleótido ABC1 anti-sentido indica la cantidad de emanación de colesterol mediada a través de ABC1. Por ejemplo, si el nivel de control de emanación de colesterol es 1.0 y el nivel de emanación de colesterol encontrado en células contactadas con el compuesto de prueba es 1.1, el compuesto de prueba promueve la emanación de colesterol por 10%. Si la emanación de colesterol encontrada en las células contactadas con el compuesto de prueba y el anticuerpo anti-ABC1 o polinucleótido ABC1 anti-sentido es 1.0, el incremento en la emanación de colesterol provocada por el 5 compuesto de prueba es mediada por ABC1 completamente. Métodos para Detectar Susceptibilidad en Enfermedad Cardiaca Coronaria La presente invención también se refiere a métodos para detectar el nivel comparativo del gen ABC1 o expresión de 10 proteína en un sujeto mamífero, incluyendo un sujeto humano. Dado el papel de ABC1 en emanación de colesterol, la determinación de un nivel disminuido del gen ABC1 o expresión de proteína en un sujeto mamífero relativa a un niel estándar predeterminado del gen ABC1 o expresión de proteína puede ser 15 usado para indicar una susceptibilidad para trastorno cardiaco coronario en el sujeto. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar el nivel comparativo de la expresión del gen ABC1 en un sujeto mamífero que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de célula de prueba a partir 20 del sujeto mamífero; (b) ensayar el nivel de expresión de ARNm ABC1 en la muestra de célula de prueba; y (c) comparar el nivel de expresión de ARNm ABC1 en la muestra de la célula de prueba con un nivel estándar predeterminado de la expresión de ARNm ABC1, por lo que detecta el nivel comparativo de la expresión del 25 gen ABC1 en el sujeto mamífero. ^a?i t a^^^*3Kaafa^^?^'^ Una muestra de la célula de prueba es primero obtenida a partir de un sujeto mamífero, incluyendo un sujeto humano. La muestra de célula de prueba puede ser una muestra sanguínea en donde la población monocítica ha sido enriquecida. Los monocitos pueden enriquecerse utilizando procedimientos de separación celular bien conocidos basados en, por ejemplo, tamaño celular, densidad celular o afinidad celular. Enseguida, el nivel de la expresión de ARNm ABC1 en la muestra de célula de prueba se analiza. El nivel de expresión de ARNm ABC1 puede ensayarse utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos por la preparación y detección de ARNm, incluyendo los métodos descritos en la presente en los Ejemplos 2 y 9. Por ejemplo, la concentración de ARNm ABC1 puede determinarse por la reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa, análisis tinción northern, o ensayo de protección RNAsa. La concentración de ARNm ABC1 debe ser estandarizada a la concentración del ARNm total encontrado en la muestra de célula de prueba. Finalmente, la expresión de ABC1 en la muestra de célula de prueba se compara con un nivel estándar predeterminado de la expresión de ARNm ABC1. Un nivel estándar predeterminado de la expresión de ARNm ABC1 puede obtenerse determinando las concentraciones promedio y distribución de ARNm ABC1 encontrada en muestras celulares tomadas de una población representativa de sujetos mamíferos, en donde los sujetos mamíferos son las mismas especies como el sujeto a partir del cual la muestra de célula de prueba se obtiene, y en donde los sujetos mamíferos no tienen enfermedad cardiaca coronaria. La enfermedad de Tangier, u otra enfermedad asociada con HDL-colesterol bajo y se consideran por tener actividad de emanación de colesterol con un rango normal (es decir, como se indica por un nivel de HDL-colesterol con un rango normal). La determinación de un nivel disminuido de expresión de ARNm ABC1 en la muestra de célula de prueba de un sujeto mamífero relativo al nivel estándar predeterminado de la expresión de ARNm ABC1 puede usarse para indicar una susceptibilidad en trastorno cardiaco coronario en el sujeto mamífero. Así mismo, la detección de un nivel disminuido de la proteína ABC1 puede usarse para indicar capacidad disminuida para la emanación de colesterol y una susceptibilidad en enfermedad cardiaca coronaria. Por consiguiente, otra modalidad de la presente invención proporciona un método para detectar el nivel comparativo de la proteína ABC1 en un sujeto mamífero. Tal método comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de célula de prueba a partir del sujeto mamífero: (b) ensayar la cantidad de la proteína ABC1 en la muestra de célula de prueba; y (c) comparar la cantidad de la proteína ABC1 en la muestra de célula de prueba con una cantidad estándar predeterminada de la proteína ABC1, por lo que detecta el nivel comparativo de la proteína ABC1 en el sujeto mamífero.

La cantidad de proteína ABC1 puede ensayarse utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos de medición de proteína. Preferiblemente, la cantidad de proteína ABC1 se mide utilizando un inmunoensayo. En una modalidad, la cantidad de proteína ABC1 se determina por (a) poner en contacto la muestra celular con una población de anticuerpos anti-ABC1 y (b) detectar los anticuerpos anti-ABC1 asociados con la muestra celular. Por ejemplo, la proteína ABC1 puede contactarse con un antisuero elevado contra un péptido sintético que corresponde a KNQTVVDAVLTSFLQDEKVKES ubicado en el término C, como se describe en el Ejemplo 11. Los anticuerpos anti-ABC1 pueden detectarse utilizando varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, tinción western, inmunoprecipitación, y FACS, en donde la detección puede lograrse utilizando marcación radioactiva, colorométrica, o fluorescente. Un método preferido para medir la cantidad de la proteína ABC1 en una muestra celular es inmunoprecipitacíón, en donde las proteinas de ABC1 biotiniladas se contactan con anticuerpo anti-ABC1 y el anticuerpo anti-ABC1 encontrado se detecta utilizando peroxidasa de estreptavidina de rábano. La cantidad de la proteína ABC1 en la muestra de célula de prueba se compara con una cantidad estándar predeterminada de la proteína ABC1. Una cantidad predeterminada estándar de la proteína ABC1 puede obtenerse determinando la concentración promedio de la proteína ABC1 encontrada en las muestras celulares tomadas a partir de una población de ios sujetos mamíferos, en donde los sujetos mamíferos son las mismas especies como el sujeto a partir de la cual la muestra de célula de prueba se obtiene, y en donde los sujetos de mamífero no tienen enfermedad cardiaca coronaria. La enfermedad de Tangier, u otra enfermedad asociada con HDL-colesterol bajo y se consideran para tener actividad de emanación de colesterol con un rango normal (es decir, como se indica por un nivel de HDL-colesterol con un rango normal).

Anticuerpos ABC1 Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) significa incluir las moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse específicamente a la proteína Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, aclarado más rápidamente a partir de la circulación, y puede tener menos tejido no específico de unión que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med., 24:316-325 (1983)). Así, estos fragmentos se prefieren, así como los productos de un FAB u otra colección de expresión de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos de la presente invención ¡ncluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única, y humanizados.

Las modalidades adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales mupnos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse por técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o justo el sitio de unión de antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión de antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (careciendo del sitio de unión de antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos quiméricos y además, monoclonales diseñados incluyen aquellos descritos en Riechmann et al. {Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934 1989), y Winter and Harris (TIPS 14:139, mayo de 1993). Un método para producir un anticuerpo comprende inmunizar un animal no humano, tal como un ratón transgénico, con un polipéptido traducido a partir de un polinucleótido que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1, un polinucleótido que comprende nucleótidos 291-7074 de la SEC. DE IDENT. NO.: 1, o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad con un polinucleótido que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 1, por lo que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido traducidos a partir de los polmucleótidos descritos se generan en tal animal. Los procedimientos han sido desarrollados generando anticuerpos 5 humanos en animales no humanos. Los anticuerpos pueden ser parcialmente humanos, o preferiblemente humanos completamente. Puede emplearse los animales no humanos (tales como ratones transgénicos) en los cuales el material genético que codifica una o más cadenas de inmunoglobulina humana han sido introducidos. 10 Tales ratones transgénicos pueden alterarse genéticamente en una variedad de formas. La manipulación genética puede resultar en cadenas de polipéptido de inmunoglobulina humana reemplazando cadenas de inmunoglobulina endógena en por algunos (de preferencia virtualmente todos) los anticuerpos producidos por el 15 animal hasta la inmunización. Se proporcionan en la presente los anticuerpos producidos inmunizando animales transgénicos con un polípéptido traducido de cualquiera de los polínucleótidos descritos. Los ratones en los cuales uno o más genes de 20 inmunoglobulina endógenos se inactivan por vanos medios han sido preparados. Los genes de inmunoglobulina humanos han sido introducidos en los ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en los animales incorporan cadenas de polipéptido de inmunoglobulina humana que 25 codifica por el material genético humano introducido en el animal. ju ------ — ÉÉK-iiKiff -láaaajit . . » t «. -, ..¿...i.- Ejemplos de técnicas para la producción y uso de tales animales transgénicos se describen en las Patentes Norteamericanas 5,814,318, 5,569,825 y 5,545,806, las cuales se incorporan para referencia en la presente. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por procedimientos convencionales, por ejemplo, inmortalizando células de bazo cosechadas a partir del animal transgénico después de la terminación del horario de inmunización. Las células de bazo pueden fusionarse con células de mieloma para producir hibridomas por procedimientos convencionales. Un método para producir una línea celular de hibridoma comprende inmunizar tal animal transgénico con un ¡nmunogen que comprende por lo menos siete residuos de aminoácido contiguos de un polipéptido traducido a partir de uno de los polinucleótídos descritos; cosechando células de bazo a partir del animal inmunizado; fusionando las células de bazo cosechadas a una línea celular de mieloma, por lo que genera células de hibridoma; e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que une un polipéptido traducido a partir de uno de los polinucleótidos descritos. Tales líneas celulares de hibridoma, y anticuerpos monoclonales producidos por el mismo, se logran por la oresente invención. Los anticuerpos monoclonales secretados por la línea celular de hibridoma se purifican por técnicas convencionales. &^¡ Los anticuerpos, bajo la unión específica para un polipéptido ABC1, pueden inhibir la actividad del polipéptido ABC1. Preferiblemente, el anticuerpo, en la unión, inhibe la actividad de transporte de colesterol del polipéptído ABC1. Tales anticuerpos pueden hacerse inmunizando un animal no humano con un polipéptido que corresponde a la región esencial para el transporte de colesterol. El anticuerpo puede probarse para determinar si inhibe emanación de colesterol utilizando cualquiera de los ensayos de emanación de colesterol descritos. Tales anticuerpos de inactivación pueden emplearse en un ensayo in vitro, tal como cualquiera de los ensayos de emanación de colesterol descritos en la presente, para determinar si un compuesto de prueba promueve la emanación de colesterol mediada por ABC1. Los anticuerpos de inactivación pueden también usarse en ensayos in vitro para detectar el nivel comparativo de la proteína ABC1 en las células de un sujeto mamífero. Los anticuerpos de inactivación son también útiles en equipos adecuados para tamizar un compuesto para determinar si el compuesto modula la emanación de colesterol dependiente de ABC1.

Equipos para Identificar Compuestos Terapéuticos La presente invención también incluye un equipo adecuado para tamizar un compuesto para determinar la expresión ABC1 que modula la actividad de un compuesto. El equipo incluye, en una cantidad suficiente para realizar por lo menos un ensayo, una construcción reportera recombinante que comprende un ADNc reportero operativamente enlazado en una expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero, como un reactivo empacado separadamente. Las instrucciones para uso de los reactivos empacados están también típicamente incluidas. La expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero comprende la secuencia de flanqueo 5'. En una modalidad preferida, la expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 3. En otras modalidades preferidas, la expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643 o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO.: 3. El ADNc reportero puede ser cualquier gen reportero adecuado, incluyendo en una modalidad particularmente preferida, la construcción reportera recombinante es pAPR1. En otra modalidad, el equipo además, comprende medios para detectar la proteína reportera. Así, el equipo comprende reactivos, tales como amortiguadores, y sustratos, usados para la detección de proteína reportera. Como se usa en la presente, el término "paquete" se refíere a una matriz o material sólido tal como vidrio, plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno o policarbonato), papel, lámina y los similares capaces de mantener con límites fijados un vector recombinante de la presente invención. Así, por ejemplo, un paquete puede ser un frasco de vidrio usado para contener cantidades de miligramo de un vector contemplado "Instrucciones para uso" típicamente incluyen una expresión tangible que describe la concentración del reactivo o al menos un parámetro de método de ensayo tal como las cantidades relativas de reactivo y muestra para ser mezclado, periodos de tiempo de mantenimiento para mezclas de reactivo/muestra, temperatura, condiciones amortiguadas y los similares. Además, la presente invención también incluye un equipo adecuado para tamizar un compuesto para determinar sí el compuesto modula la emanación de colesterol dependiente de ABC1. En una modalidad, el equipo inciuye, en una cantidad suficiente para realizar por lo menos un ensayo, un anticuerpo anti-ABC1 inactivado, como un reactivo de empacado separadamente. Las instrucciones para uso de los reactivos empacados se incluyen también típicamente. En otra modalidad, el equipo incluye un oligonucleótido ABC1 antisentido en una cantidad suficiente por al menos un ensayo e instrucciones para uso. Preferiblemente, el oligonucleótido ABC1 antisentido comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 53.

Microdisposiciones Se apreciará que la tecnología de microdisposíción de ADN puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Las microdisposiciones de ADN son formaciones de alta densidad, de miniatura de los ácidos nucleicos colocados en un soporte sólido, tal corno vidrio. Cada célula o elemento con la disposición contiene numerosas copias de una sola especie de ácido nucleico que actúa como un objetivo para la hibridización con una secuencia de ácido nucleico complementaria (por ejemplo, ARNm). En la expresión para la perfilación utilizando tecnología de microdisposición de ADN, el ARNm es primero extraído a partir de una muestra de célula o tejido y luego convertido enzimáticamente en ADNc marcado fluorescentemente. Este material es hibridizado a la microdisposición y el ADNc no unido es removido por lavado. La expresión de los genes discretos representados en la disposición es entonces visualizada cuantificando la cantidad de ADNc marcado que está específicamente unido a cada molécula de ácido nucleico objetivo. De esta manera, la expresión de cientos de genes puede cuantificarse en un rendimiento elevado, forma paralela de una única muestra de material biológico. Así, la expresión de rendimiento elevado que perfila tiene un amplio rango de aplicaciones con respecto a las moléculas ABC1 de la invención, incluyendo, pero no limitándose a: la identificación y validación de genes relacionados a la enfermedad ABC1 como objetivos para terapéuticos; toxicología molecular de moléculas e inhibidores ABC1 relacionadas del mismo; estratificación de poblaciones y generación de marcadores sustituidos para frascos clínicos; y mejorando el polipéptido ABC1 relacionado de fármaco de molécula pequeña descubierto agregando en la identificación de los compuestos selectivos en tamices de rendimiento elevado. Como se discute en la presente, en el Ejemplo 2, un método ha sido desarrollado que utiliza muestras de ARN derivado de células de un individuo con una anormalidad genética y se compara al ARN de un individuo normal. Históricamente, la identificación de la causa de enfermedades heredadas resulta de los años de análisis bioquímico o, más recientemente, de años de mapeo de gen y clonación posicional para identificar el gen sospechoso con un intervalo de millones de pares de bases que han sido mostrados para ser enlazados correctamente defecto en estudios heredados (análisis de conexión). El uso de análisis de expresión de multigen, más notablemente a través de "chips de gen" puede revolucionar el paso de tal descubrimiento. Comparar la expresión de las muestras de ARN derivadas de las células de un individuo anormal con una enfermedad genética contra ARN de un individuo normal puede rápidamente revelar genes cuyo ARNm correspondiente se desaparece, severamente sub-representado o severamente sobre-representado en la célula enferma anormal. El término "individual" y usado en la presente se refiere a cualquier organismo viviente que tiene ARN tal como por ejemplo, mamíferos, plantas. Este método se usa preferiblemente para identificar la fuente de las anormalidades genéticas humanas. Más preferiblemente, el método es útil para detectar fuentes genéticas de trastornos cardiacos y cardiovasculares humanos, tales como la identificación de ABC1 como el defecto genético en la enfermedad de Tangier. El término "anormalidad" como se usa en la presente se refiere a diferencias genéticas que provocan una desviación fisiológica en un número pequeño de individuos en unas especies en comparación a más de individuos de las especies. La anormalidad puede ser una anormalidad positiva o una anormalidad negativa. Por ejemplo, una anormalidad de planta positiva podría ser una diferencia genética que provoca que algunas plantas individuales sean resistentes a la sequía en comparación a otros individuos en las especies. Una anormalidad negativa podría ser una que provoca un individuo en las mismas especies de planta para ser más propensa al daño de la sequía que una planta normal. El método puede ser mejor descrito por referencia a nuestra investigación en la causa genética de enfermedad de Tangier. Se ha comenzado la investigación utilizando ARN a partir de células cultivadas de un individuo con enfermedad de Tangier para resultados de sonda para identificar ABC1 como el gen defectuoso en esta enfermedad monogénica en la cual los pacientes tienen niveles de casi cero de circulamiento de lípoproteína de densidad elevada (HDL) y un riesgo incrementado en la enfermedad cardiaca. No es necesario que los resultados de gen defectuosos en un nivel cero de la señal de ARNm detectable en tal experimento. En este ejemplo exitoso, aproximadamente 175 fuera de las 58,800 sondas en la microdisposición fueron más de 2.5 veces bajo expresadas en el ARN de enfermedad de Tangier contra normal. Varias etapas adicionales pueden tomarse para confirmar la identidad del gen culpado. Incluyen repetir tal sonda de microdisposición con un individuo no relacionado con la enfermedad de Tangier, determinando la ubicación del mapa de cromosoma de cada gen para comparar con un intervalo genético largo reportado que se enlaza a la enfermedad consideración de la probable función de las proteínas candidato y sus homólogos, pruebas bioquímicas, y secuenciar el mejor candidato gen en pacientes para descubrir mutaciones. En estas formas, el análisis de microdisposición de la expresión del gen puede conducirse en la identificación de defectos genéticos heredados tales como la identificación de ABC1 como el efecto en enfermedad de Tangier. Una utilidad adicional en este método es que otros genes que están ya sea sub- o sobre-expresados en la muestra de enfermedad contra normal deben incluir aquellos que están regulados diferencialmente en consecuencia del defecto genético en el paciente, ya sea como respuestas compensatorias o como colaboradores a la patología de la enfermedad. Esto podría proporcionar identificación de otras proteínas en las trayectorias biológicas relevantes que pueden ser receptivas al fármaco desarrollado y ayudan a elucidar la patología de la enfermedad, con implicaciones para el tratamiento y diagnóstico. En los casos en donde una eliminación del gen u otra mutación provoca la ausencia completa de ARNm, como se observó en muchos ejemplos de talasemia (defectos del gen globina) y otras enfermedades genéticas, análisis de la expresión clel gen de enfermedad contra muestras normales puede conducir a la identificación del gen que falta en una manea más directa. Aunque en estos ejemplos, la disposición de expresión del gen que se investigó con muestras ARN fue del tipo en el cual las muestras de sonda fueron ADNcs dispuestas en portaobjetos de microscopio podrían bastar tecnologías de disposición alternativas. Esto podría incluir, pero no limitarse a aquellas cuyas muestras de ADN se disponen en las membranas de filtro o utilicen sondas de oligonucleótido sintetizado en los "chips de gen" por fotolitografía. Generalmente, el término microdisposición se refiere a una disposición de oligonucleótidos distintos sintetizados en un sustrato, tal como un papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, chip, vidrio, portaobjetos de vidrio, o cualquier otro soporte sólido adecuado. Las microdisposiciones pueden prepararse, usarse, y analizarse utilizando métodos conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Brennan, T.M. et al., (1995) Patente Norteamericana No. 5,474,796; Solicitud de PCT W095/25116; Shalon, D. et al. (1995) Solicitud de PCT WO95/3505; y Patente Norteamericana No. 5,605,662 las especificaciones de cada una de las cuales se incorporan en la presente para referenc?a9.

Un procedimiento de acoplamiento químico y un dispositivo de chorro de tinta puede usarse para sintetizar los elementos de disposición en la superficie del sustrato. Un análogo de disposición a una mancha de punto o ranura puede también usarse para disponerse y los elementos de enlace a la superficie de un sustrato utilizando procedimientos de unión térmicos, de UV, químicos o mecánicos. Una disposición típica puede producirse por la mano o utilizando métodos y máquinas disponibles y conteniendo cualquier número apropiado de elementos. Después de la hibridización, las sondas no hibridizadas se remueven y un analizador se usa para determinar los niveles y patrones de fluorescencia. El grado de complementariedad y la abundancia relativa de cada sonda la cual hibridiza a un elemento en la microdisposición puede evaluarse a través del análisis de las imágenes analizadas. Los ADNc de longitud completa, Tags de Secuencia Expresada (ESTs), o fragmentos de los mismos pueden comprender los elementos de la microdisposición. Los fragmentos adecuados para hibridización pueden seleccionarse utilizando software bien conocido en a técnica tal como software LASERGENE (DNASTAR). Los ADNc, ESTs, o fragmentos de los mismos de longitud completa que corresponde a las secuencias de nucleótido de un individual anormal y un individuo normal se disponen en un sustrato apropiado, por ejemplo, una diapositiva de vidrio. El ADNc se fija a la diapositiva utilizando, por ejemplo, . ' « i i i reticulamiento UV seguido por los tratamientos térmicos y químicos y secado subsecuente (Ver, por ejemplo. Schena, M. et al. (1995) Science 270:467-470; Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6:639-645). Las sondas, tales como sondas fluorescentes se preparan y usan por hibridización a los elementos en el sustrato. Para conducir un análisis de muestra utilizando las microdisposiciones, el ARN o ADN de una muestra biológica se hace en las sondas de hibridización. El ARNm se aisla, y el ADNc se produce y usa como una plantilla para hacer ARN antisentido (ARNa). El ARNa se amplifica en la presencia de nucleótidos fluorescentes, y las sondas marcadas se incuban con la microdisposición de manera que las secuencias de sonda hibridizan a los oligonucleótidos complementarios de la microdisposición. Las condiciones de incubación se ajustan a fin de que la hibridización ocurra con conjuntos complementarios o con varios grados de menos complementariedad. Después de la remoción de las sondas no hibridizadas, un analizador se usa para determinar los niveles y patrones de fluorescencia. Las imágenes analizadas se examinan para determinar el grado de complementariedad y la abundancia relativa de cada secuencia de olígonucleótido en la microdisposición. Las muestras biológicas pueden obtenerse a partir de cualesquiera fluidos corporales (tales como sangre, orina, saliva, flema, jugos gástricos, etc.), células cultivas, biopsias, u otras preparaciones de tejido. Un sistema de detección puede usarse para medir la ausencia, presencia y cantidad de hibridización para todas de las secuencias distintas simultáneamente. Estos datos pueden usarse para estudios de correlación a gran escala en las secuencias, mutaciones, variantes, o polimorfismos entre las muestras. La microdisposición está preferiblemente compuesta de un gran número de secuencias de ácido nucleico únicas, de una sola hebra, usualmente ya sea oligonucleótidos o fragmentos antisentido sintéticos de ADNc fijados a un soporte sólido. Las microdisposiciones pueden contener oligonucleótidos que cubren la secuencia conocida 5' ó 3', o contienen oligonucleótidos secuenciales que cubren la secuencia de longitud completa; u oligonucleótidos únicos seleccionados de áreas particulares a lo largo de la longitud de la secuencia. Los polinucleótidos usados en la microdisposición pueden ser oligonucleótidos que son específicos a un gen o genes de interés en los cuales por lo menos un fragmento de la secuencia se conoce o aquellos son específicos a uno o más ADNc no identificados, que son comunes a un tipo celular particular, experimental o estado de enfermedad. Para producir oligonucleótidos a una secuencia conocida para una microdisposición, el gen de interés se examinó utilizando un algoritmo de computadora que inicia en el extremo 5' o más preferiblemente en el extremo 3' de la secuencia de nucleótido. El algoritmo identifica oligómeros de longitud definida que son únicas al gen, que tiene un contenido GC con un rango adecuado para hibridización, y pérdida de estructura secundaria predicha que puede interferir con la hibpdizacíón. Los oligómeros se sintetizan en áreas diseñadas en un sustrato utilizando n proceso químico de luz dirigida. El sustrato puede ser papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, chip, diapositiva de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. Una disposición puede producirse manualmente o utilizando dispositivos disponibles (aparatos para teñido de ranura o teñido de punto), materiales y máquinas (incluyendo instrumentos robóticos) y que contiene rejas de 8 puntos, 24 puntos, 96 puntos, 384 puntos, 1536 puntos o 6144 puntos, o cualquier otro múltiple el cual se presenta al uso eficiente de la instrumentación comercialmente disponible. Una vez más las causas genéticas de la anormalidad heredada se estrechan o identifican, la potencialidad o porciones defectuosas actuales de los genes pueden usarse como objetivos en una microdisposición. La microdisposición puede usarse para verificar el nivel de expresión de un gran número de genes para desarrollar y verificar las actividades de terapias potenciales y agentes terapéuticos. Los siguientes ejemplos, además, ilustran la presente invención, pero no deberán construirse para limitar la presente invención en cualquier manera.

EJEMPLO 1 Este ejemplo demuestra que los pacientes con Enfermedad de Tangier (TD) tienen una ausencia de emanación de lípido mediada por apo A-l. Cultivos Celulares: Los fibroblastos humanos se obtuvieron a partir de los explantes de piel de dos sujetos normales (NL1) y tres pacientes no relacionados con enfermedad de Tangier (TD). Las células con TD1 se obtuvieron a partir de una hembra de 53 años con niveles de apo A-l y colesterol HDL de plasma extremadamente bajo y síntomas clínicos típicos de enfermedad de Tangier. Las células con TD2 se obtuvieron a partir de un macho de 56 años con características clínicas, morfológicas y bioquímicas de la enfermedad de Tangier, incluyendo niveles muy bajos de HDL colesterol y apo A-l en plasma (Francis, et al., J. Clin. Invest., 96, 78-87 (1995)). Las células con TD3 se obtuvieron a partir de un macho de 18 años con enfermedad de Tangier que presentó restos de amígdala anaranjados, neuropatía motora asimétrica, HDL colesterol en plasma de 5 mg/dL, y LDL colesterol de 16 mg/dL (Lawn et al., J. Clin. Invest. 104, R25-R31 (1999)). Las células normales y células objeto con TD se inmortalizaron como se describe en Oram et al., J. Lipid Res., 40: 1769-1781 (1999). Brevemente, las células se transfectaron con retrovirus anfotrópicos conteniendo vectores con insertos de 16 oncogenes E6 y E7 de papilomavirus humano y un marcador seleccionable de resistencia a neomicina. Las cél las de control se infectaron con vector único (infectado simulado) Las poblaciones de célula sumergidas se seleccionaron en la presencia de G418 durante dos pasajes, después de lo cual G418 se excluyó a partir del medio. Los fibroblastos se usaron entre el quinto y el décimo sexto pasaje (primario) o sexto y décimo cuarto pasaje (inmortalizado). Las células inmortalizadas normales y con TD se sembraron en pozos de 16 mm o discos de 35 mm y crecimiento a confluencia en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de suero bovino fetal (FBS9 antes del uso experimental. Las células de monocito de ratón RAW 264.7 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se mantuvieron también en DMEM conteniendo 10% de FBS. Ensayo para Medir Emanación de Lípido: La emanación mediada por Apo Al de colesterol y fosfolípido se analizaron de acuerdo al método descrito en Francis, et al., J. Clin. Investg. 96: 78-87 (1995). Los fibroblastos de piel cultivados a partir de sujetos normales y con TD se marcaron por crecimiento a confluencia en la presencia de 0.2-0.5 µC/ml [3H]colesterol (40-60 Ci/mmoles, Amersham Corp., Ariington Heights, IL). El colesterol radioactivo se agregó al medio de crecimiento conteniendo suero cuando las células fueron confluentes al 60-80%. Después de 3 días, las células se lavaron dos veces con PBS/BSA y simultáneamente el crecimiento interrumpido y colesterol cargado para maximizar la emanación de lípido mediada por apolipoproteína. Esto se logró incubando las células durante 48 horas en DMEM libre de suero más 2 mg/ml de albúmina de suero de bovino libre de ácido graso (DMEM/BSA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 30 µg/ml de colesterol no radioactivo. Las células RAW 264.7 se cargaron con colesterol a través del receptor eliminador por 24 horas de incubación con LDL acetilado como se describe en Smith et al., J. Biol. Chem., 271:30647-30655 (1996). Brevemente, las células RAW 264.7 en discos de 24 pozos se cargaron con coiesterol y marcaron durante la noche en 0.5 ml de DMEM suplementado con 50 µl/ml de glucosa 1M, 10 µl/ml de 200 mM de glutamina y 2% de BSA y con 50 µg/ml de lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL) y [3H]-colesterol el cual había sido preincubado durante 30 minutos a 37°C con AcLDL para producir una concentración final de 0.33 µCi/ml [3H]-colesterol. Las células se lavaron subsecuentemente cinco veces con PBS conteniendo 1% de BSA y se incubó durante la noche (16-18 horas) en DMEM/BSA para permitir por equilibrio de estanques de coiesterol. Después del equilibrio de estanques de colesterol, las células se enjuagaron cuatro veces con PBS/BSA e incubaron durante una hora a 37°C con DMEM/BSA antes de las incubaciones de emanación. El medio de emanación (DMEM/BSA) que contiene ya sea albúmina sola (control), albúmina más HDL (40 µg de proteína/ml), o albúmina más apo A-l (10 µg/ml, Biodesígn International, Kennebunk, ME) se agregó y las células se incubaron durante 4, 24 o 48 horas. Los fosfolipiclos se marcaron incluyendo 10 µCi/ml de [3H]colina (75-85 de Ci/mmoles, Amersham Corp.) en medio de equilibrio DMEM/BSA durante la noche. La radioactividad encontrada en el medio de cultivo se midió por conteo por centelleo después de 15 minutos de centrifugación a 12,000 g. La radioactividad en las células se midieron por conteo por centelleo después de la solubilización en 0.5 ml de NaOH 0.2M (Smith et al., J. Biol. Chem., 271:30647-30655 (1996)) o extracción en hexano:isopropanoi (3:2 v/v) como se describe en Francis, et al., J. Clin. Invest., 96, 78-87 (1995). Las células que contienen fosfolípidos marcados se extrajeron con 1 ml de isopropanol durante 1 hora y luego con hexano:isopropanol como se describió anteriormente. La emanación de colesterol o fosfolípido se expresó como el porcentaje de conteos de lípido tritiado en el medio sobre los conteos de lípido tritiado recuperado a partir de células y medio (medio cpm/cpm (medio + lisato) x 100). Como se muestra en la Figura 1A y C, la adición de HDL o apo A-l resulta en la remoción del colesterol a partir de fibroblastos cargados de colesterol obtenidos a partir de sujetos normales. Sin embargo, en las células con TD, la capacidad de HDL para remover colesterol es ligeramente disminuida y la capacidad de apo A-l para remover colesterol está completamente ausente. La Figura 1 muestra que las células de fibroblastos normales y con TD liberan aproximadamente 3-4% del [3H]-colesterol celular en el medio durante 48 horas de incubación con albúmina. La adición de HDL al medio de albúmina incrementó la emanación de [3H]-colesterol a partir de fibroblastos normales y con TD, aunque a una dimensión menor con células con TD (Figura 1B, D). La adición de apo A-l promueve la emanación de [3H]-colesterol a partir de fibroblastos normales (Figura 1A, C), pero tuvo poco o ningún efecto en la emanación de [ !H]-colesterol a partir de fibroblastos TD (Figura 1B, D).

EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra que 175 genes muestran por lo menos 2.5 veces disminuida la expresión y 375 genes muestran por lo menos 2.5 veces incrementada la expresión en células con TD comparadas con células normales. El gen de expresión diferencial se determinó utilizando el análisis de microdisposición del gen de expresión (GEM) de los ADNc a partir de individuos normales (sin TD) y de pacientes con TD. Cultivos Celulares: Los cultivos celulares inmortalizados obtenidos a partir de individuos normales y pacientes con TD descritos en el E?jemplo 1 se usaron. Los cultivos confluentes se mantuvieron en DMEM/BSA y se suplementaron durante 24 horas con monofosfato de adenosina cíclico 1mM 8-Bromo (8-Br-cAMP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Extracción de ARNm y Síntesis de ADNc: El ARNm a partir de las células de fibroblasto normal y con TD se preparó a partir del ARN total extraído de células con Trizol (Life Technologies Inc., Bethesda, MD, Cat. # 15596-026). El ARNm se aisló utilizando el equipo ARNm Oligotex (Qiagen Inc., Valencia, CA, Cat. # 70022) de acuerdo con los protocolos del vendedor El ARNm se transcribió inverso utilizando tinte fluorescente Cy3 o Cy5 para crear ADNc marcado fluorescentemente de acuerdo con el método descrito en DeRisi et al., Science, 24:680-686 (1997). El ADNc resultante a partir de células TD se marcaron con tinte fluorescente Cy3 y ADNc a partir de células normales se marcaron con tinte fluorescente Cy5 (Incyte Genomics, Palo Alto, CA). Análisis de Microdisposición: Para analizar la expresión de gen diferencial en células a partir de individuos con TD y normales, muestras de ADNc marcados fluorescentes Cy3 y Cy5 preparadas como se describe anteriormente se hibridizaron para un grupo de microdisposiciones Gene Álbum (GEMs) en portaobjetos de microscopio (Incyte Genomics, Palo Alto, CA). Cada uno de los seis portaobjetos contiene aproximadamente 9,800 muestras de ADNc humano más 200 muestras control, resultando en una microdisposición de 58,800 ADNc parciales. Por lo tanto, permitiendo para estimado de redundancia, aproximadamente 30-50% de genes humanos expresados se representaron. La hibridización de ADNc marcado con Cy3 preparados a partir de células TD1 y ADNc marcados con Cy5 a partir de células normales permitieron la comparación del contenido de ARN relativo de células TD contra células normales para los genes expresados. Además, el ADNc marcado con Cy3 preparado a partir de células TD2 y ADNc marcado con Cy5 a partir de células normales se hibridizaron al mismo grupo de microdisposiciones para examinar la variación de la expresión del gen entre pacientes con TD diferentes. Resultados: Los datos se analizaron utilizando software Gem Tools (Incyte Genomics, Palo Alto, CA) y se expresa como relaciones de célula TD a célula normal ARNm. Los resultados indican que la mayoría de los genes son comparablemente expresados en TD1 y células normales. Como se muestra en la Figura 2 (en la sección anterior y a la izquierda de la diagonal) únicamente 175 genes fueron más de 2.5 veces sub-expresados en células TD1 comparadas con las células normales, 375 genes fueron más de 2.5 veces sobre-expresados en células TD1 comparados con las células normales (abajo y a la derecha de la diagonal). Los genes más altamente expresados en las células TD podría incluir aquellos que son regulados diferencialmente como una consecuencia de la mutación Tangier, ya sea como una respuesta compensatoria o como un contribuidor a la patología de la enfermedad. E?ntre los genes que podrían contribuir al fenotipo observado de TD y que son más altamente expresados en células TD ¡ncluyen interferon-ß (IFN-ß), proteína-2a inflamatoria de macrófago, proteína-2 quemotáctica de granulocito, IL-11, endoperoxida sintasa-2 de prostaglandina (COX-2) trombospondina, y proteínas 1, 3 y 4 quemotácticas de monocito (Lawn et al., J. Clin. Invest., 104: R25-R31 (1999).

Ningún ARN solo que se expresa en ios fibroblastos normales se encuentra completamente ausente en cualquiera de las células TD1 o TD2. También, en comparación de los genes diferencialmente expresados en TD1 y TD2 revelaron muy poca variación entre los pacientes con TD individuales. Por ejemplo, de los genes más altamente sub-regulados en células TD2, 92% se sub-expresaron también en células TD1 comparadas con las células normales. Uno de los genes más que 2.5 veces sub-expresados en TD1 o TD2 contra células normales fue el gen para la proteína ABC1. El gen ABC1 se compró debido a las funciones atribuidas de algunos de sus homólogos y también debido a que el gen se localizó en la región de cromosoma aproximado reportado como la región de gen TD.

EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra que el gen ABC1 se localiza en el cromosoma humano 9q31. El análisis de conexión genética previa mapeo el gen TD a la región 7-cM de cromosoma humano 9q31 (Rust et al., Nat. Genet., 20, 96-98 (1998)). Además, los análisis de hibpd ización in situ revelaron que el gen ABC1 se ubicó en el intervalo cromosomal más amplio 9q22-9q31 (Luciani et al., Genomics, 21150-159 (1994)). Utilizando los métodos PCR con el panel 4 GeneBridge de híbridos de radiación de humano/hámster (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), el ABC1 humano se determinó para ubicarse entre el cromosoma 9q31. El ADN de líneas celulares híbridas de humano/hámster 93 se amplificaron por PCR utilizando cebadores LF específicos de ABC1 humanos: CCTCTCATTACACAAAAACCAGAC (SEC. DE IDENT. NO: 11) y LR: GCTTTCTTTCACTTCTCATCCTG (SEC. DE IDENT. NO: 12). Cada línea se clasificó como positiva o negativa para el producto de amplificación ABC1 humano y el mapeo de ABC1 derivado de análisis de estos datos se logró utilizando el software Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, accesado a través del internet (h ttp: //carbón. wi.mit.edu:8000/cqi-bin/contiq/rhmapper.pl). Estos resultados se confirmaron además por tinción southern de hibridización a clones de cromosoma artificial genómico/levadura humana (Research Genetics, Inc.) a partir del intervalo equivalente. Además, la búsqueda de base de datos pública (GeneMap '98; National Center for Biotechnology Information) y mapeo de híbrido de radiación que elimina los otros genes sub-expresados significativamente en los datos de microdisposición a partir de la ubicación en el intervalo genético reportado. Estos datos complementarios demuestran que el gen ABC1 se ubica en el cromosoma humano 9q31 y además indican que el gen ABC1 se asocia con la entermedad de Tangier.

EJEMPLO 4 Este ejemplo muestra la determinación de la secuencia de nucleótido del gen ABC1 de tipo silvestre, incluyendo las regiones de flanqueo y la región de codificación entera. La secuenciación de ADN se realizó utilizando un ABl Prism 310 Genetíc Analyzer o por Davis Sequencing (Davis, CA). Ambas hebras se secuenciaron por todos lados. La secuencia del marco de lectura abierto del gen ABC1 a partir del sujeto normal se determinó a partir del clon de ADNc de longitud completa a partir de una colección de plásmido de expresión construida a partir del ARN de fibroblasto normal. Para construir la colección de plásmido, el ADNc se sintetizó de acuerdo con el protocolo de equipo Stratagene (Stratagene, La Jolla, CA). Brevemente, la primera hebra de ADNc se sintetizó a partir de ARNm utilizando un cebador oligo-dT con un sitio Xhol y la transcriptasa inversa MMLV en la presencia de 5-metil dCTP. La segunda hebra se sintetizó utilizando RNasa H y ADN polimerasa I en la presencia de dNTPs no modificados. Después el ADNc se finalizó debilitado con polimerasa de ADN pfu, un enlazador EcoRi se ligó al ADNc. El ADNc se digirió entonces con Xhol, creando extremos Xhol al extremo 3' del ADNc. Los sitios Xhol internos se protegieron a partir de esta digestión debida a la semi-metilación durante la primera síntesis de hebra. El ADNc sintetizado se clonó en los sitios Hindlll y Xhol del plásmido pCEP4 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA #VO44-50), y el vector de expresión que contiene citomegalovirus promotor/mejorador. Una sonda de 585 bp ABC1 se generó por reacción de cadena de pohmerasa de transcpptasa inversa (RT-PCR) utilizando cebadores basados en secuencia de ABC1 conocida, la cual fue 5'-TCCTTGGGTTCAGGGGATTATC (SEC. DE IDENT. NO: 13) y 5'-CAATGTTTTTGTGGTTCGGC (SEC. DE IDENT. NO: 14). Utilizando esta sonda ABC1, un clon que contiene un inserto de 10.5 kb de ADNc ABC1 humano se recuperó a partir de la colección utilizando el equipo de selección CloneCapture de acuerdo al protocolo del fabricante (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Este clon se mostró en la Figura 3 como pCEPhABCl. La secuencia de inserto de ADNc ABC1 de 10.5 kb se mostró en la SEC. DE IDENT. NO. 1. La determinación de secuencia confirmó que pCEPhABCl contiene el marco de lectura abierto ABC1 humano de 6783 nucleótidos más regiones no traducidas 5' y 3', que tienen un marco de lectura abierto más grande que la secuencia de ADN reportada por Langmann et al. en Biochem. Biophys. Res. Comm., 257, 29-33 (1999) (GenBank No. de Acceso AJ012376).

EJEMPLO 5 Este ejemplo demuestra las diferencias de secuencia entre el gen ABC1 de tipo silvestre y las secuencias de gen TD1, TD2 y TD3. Síntesis de ADNc de TD1. TD2 v TD3: El ADNc se preparó a partir de células TD1, TD2 y TD3 por reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) utilizando el sistema de ADNc de Elección Superscript y la mezcla de polimerasa de ADNc Advantage siguiendo el protocolo del fabricante (CLONTECH, Palo Alto, CA; Cat #8417-1) utilizando dos juegos de cebadores pares diseñados a partir de la secuencia de 5 gen ABC1 humano normal, diseñada: (1) saclhabcf, 5'- AGTCGAGCTCCAAACATGTCAGCTGTTACTGGAAGTGGCC (SEC. DE IDENT. NO. 15); habcr3851, 5'- TCTCTGGATTCTGGGTCTATGTCAG (SEC. DE IDENT. NO. 16) y (2) habcf3585, 5'-GGGAGCCTTTGTGGAACTCTTTC (SEC. DE 10 IDENT. NO. 17); habcrsall, 5'- ACTGGTCGACCATTGAATTGCATTGCATTGAATAGTATCAG (SEC. DE IDENT. NO. 18). La amplificación de poIyA + ARN de 0.2-0.5 µg con estos cebadores a la concentración final de 0.4 µM generó dos 15 plantillas translapantes de aproximadamente 3.5 kb. Las plantillas se purificaron con gel utilizando el sistema QIAEX II (QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Cat #20021) y se ajustaron a una concentración de 100 ng/µl. Secuenciación de ADNc TD1, TD2 y TD3: Ocho µl de 20 cada plantilla generada como se describió anteriormente se secuenció en una reacción con cebadores de secuenciación individuales diseñados en las bases de la secuencia ABC1 de tipo silvestre en la concentración final de 0.5 µM. Los cebadores fueron como sigue : 1F: 5'- TTTCCTGGTGGACAATGAA (SEC. DE 25 IDENT NO: 19), 2F: d'-AGTGACATGCGACAGGAG (SEC. DE _^^^b?*to?Cj-^,fe IDENT. NO: 20); 3F: 5'- GATCTGGAAGGCATGTGG (SEC. DE IDENT. NO: 21); 4F: 5'- CCAGGCAGCATTGAGCTG (SEC. DE IDENT. NO: 22), 5F: d'-GGCCTGGACAACAGCATA (SEC. DE IDENT. NO: 23); 6F: 5'- GGACAACCTGTTTGAGAGT (SEC. DE IDENT. NO: 24); 7F: 5'- AAGACGACCACCATGTCA (SEC. DE IDENT. NO: 25); 8F: 5'-ATATGGGAGCTGCTGCTG (SEC. DE IDENT. NO: 26); 9F: 5'-GGGCATGAGCTGACCTATGTGCTG (SEC. DE IDENT. NO: 27); 10F: d'-AAGAGACTGCTAATTGCC (SEC. DE IDENT. NO: 28); 11 F: 5'- AGCGACAAAATCAAGAAG (SEC. DE IDENT. NO: 29); 12F: 5'- TGGCATGCAATCAGCTCT (SEC. DE IDENT. NO: 30); 13F: 5'-TCCTCCACCAATCTGCCT (SEC. DE IDENT. NO: 31); 14F: 5'- TTCTTCCTCATTACTGTT (SEC. DE IDENT. NO: 32); 15F: 5'- GATGCCATCACAGAGCTG (SEC. DE IDENT. NO: 33); 16F: 5'-AGTGTCCAGCATCTAAA (SEC. DE IDENT. NO: 34); 1R: 5'- CAAAGTTCACAAATACTT (SEC. DE IDENT. NO: 35); 2R: 5'- CTTAGGGCACAATTCCACA (SEC. DE IDENT. NO: 36); 3R: 5'-TGAAAGTTGATGATTTTC (SEC. DE IDENT. NO: 37); 4R: 5'-TTTTTCACCATGTCGATGA (SEC. DE IDENT. NO: 38); SR: 5'-CTCCACTGATGAACTGC (SEC. DE IDENT. NO: 39); 6R: 5'-GTTTCTTCATTTGTTTGA (SEC. DE IDENT. NO: 40); 7R: 5'-AGGGCGTGTCTGGGATTG (SEC. DE IDENT. NO 41); 8R: 5'-CAGAATCATTTGGATCAG (SEC. DE IDENT. NO: 42); 9R: 5'-CATCAGAACTGCTCTGAG (SEC. DE IDENT. NO: 43); 10R: 5'-AGCTGGCTTGTTTTGCTTT (SEC. DE IDENT. NO: 44), 11R: 5'-TGGACACGCCCAGCTTCA (SEC. DE IDENT. NO: 45), 12R: 5'- CCTGCCATGCCACACACA (SEC. DE IDENT. NO: 46), 13R: 5'-CTCATCACCCGCAGAAAG (SEC. DE IDENT. NO: 47), 14R: 5'-CACACTCCATGAAGCGAG (SEC. DE IDENT. NO: 48), 15R: 5'-TCCAGATAATGCGGGAAA (SEC. DE IDENT. NO: 49), 16R: 5'-TCAGGATTGGCTTCAGGA (SEC. DE IDENT. NO: 50), UTR1R: 5'-AAGTTTGAGCTGGATTTCTTG (SEC. DE IDENT. NO: 51). Resultados: La numeración de nucleótidos siguió la numeración encontrada en Lawn et al. (1999). El paciente con TD1 retuvo el marco de lectura totalmente abierto, con 2 diferencias sustanciales de la secuencia de tipo silvestre (SEC. DE IDENT. NO: 8). Una de estas es una sustitución A a G, resultando en un cambio de un residuo de glutamina a arginina en la posición 537 de la secuencia 2201 de aminoácido, como se publicó por Lawn et al. (1999). La ubicación de este residuo está dentro del dominio hidrofílico terminal NH2, cerca del primer dominio de transmembrana predicho. El paciente con TD2 también retuvo el marco de lectura abierto con una sustitución de arginina a triptofano en el residuo 527 (SEC. DE IDENT. NO. 10). Así, ambos TD1 y TD2 contienen una sustitución que altera la carga de un aminoácido en la misma región de la proteína. El ADN con TD3 contiene una inserción de 14 nucleótidos en su ADNc ABC1 siguiendo el nucleótido 5697 en un alelo y una inserción de 138 bp después del nucleótido 5062 en el otro alelo. La secuenciación genómica de los ADNs con TD1, TD2 y TD3 confirmó loe. cambios encontrados en los ADNcs respectivos.

La secuencia genómica se generó por amplificación de PCR de una región de 156 bp del ADN genómico aislado a partir de fibroblastos que contienen las mutaciones encontradas en el ADNc a partir de TD1 y TD2. La secuenciación genómica también indicó que el paciente con TD1 se volvió homocigoso para la sustitución de glutamina a arginina. El análisis de ADN genómico mostró que TD2 fue un compuesto heterocigoto con un alelo conteniendo la sustitución detectada y el segundo alelo (el cual falló para producir ARNm detectable) conteniendo un defecto indeterminado. Ninguna de las mutaciones de sustitución se encontró en más de 80 alelos del ADN genómico de individuos sin TD. Las inserciones con TD3 se identificaron por análisis de secuencia y confirmaron por RT-PCR utilizando cebadores circundantes a los puntos de inserción. La inserción de 14 bp siguiendo el nucleótido 5697 provocó el cambio del marco, resultando en el reemplazo de la secuencia de aminoácido de tipo silvestre a partir de la ubicación antes del segundo dominio de unión ATP, hasta el punto de una terminación de proteína prematura. La inserción de 138 bp siguiendo el nucleótido 5062 en el otro alelo contiene un codón de detección en el cuadro.

EJEMPLO 6 Este ejemplo demuestra que los inhibidores de la actividad de transporte ABC1 también inhiben la emanación de colesterol mediada por apo A-l a partir de células de fibroblasto.

La prueba si la inhibición de ABC1 podría afectar el proceso de emanación de colesterol mediada por apolipoproteína, dos compuestos que reportaron ser inhibidores ABC1 se probaron en ensayos los cuales emanan de colesterol mediado por apolipoproteína verificadora. Los compuestos del ácido 4,4-diisotiocianoestilben-2,2'-disulfónico (DIDS) y sulfobromoftaieina (BSP) se reportaron para inhibir las actividades transportadoras de anión de ABC1 en una forma dependiente de dosis (Becq et al., J. Biol. Chem., 272:2695-2699 (1997); Hamon et al., Blood, 90:2911-2915 (1997)). Los ensayos de emanación de colesterol mediados por apolipoproteina se realizaron como se describió en el Ejemplo 1 con los cambios anotados. El colesterol cargado y fibroblastos normales marcados con [3H]colesterol normal (n = 3) se incubaron durante 6 horas con o sin 5 µg/ml de apo A-l y cualquier 0, 0.2 mM o 0.4 mM de DIDS. Además, el colesterol cargado y los fibroblastos normales marcados con [3H]colesterol (n = 3) se incubaron durante 6 horas con o sin 5 µg/ml de apo A-l y cualquier 0, 0.2 mM o 0.4 mM de BSP. Se midió la emanación de [3H]colesterol per conteo por centelleo como se describió en el Ejemplo 1 y se calculó como el porcentaje del colesterol radiomarcado presentándose en el medio. Los resultados se mostraron en la Figura 5 como el significado ± SD (n = 3) de la emanación en la presencia de apo A-l después de la sustracción de valores para medio libre de apo A-l. La Figura 5 muestra que DIDS y BSP inhiben la emanación de 6 horas de colesterol tritiado mediado por apolipoproteina A-l. Además, una inhibición similar se observó con la emanación de fosfatidil colina tptiada utilizando DIDS y BSP (datos no mostrados). Los resultados de estas pruebas imitan el defecto de emanación en fibroblastos derivados de pacientes con TD, descritos en el Ejemplo 1.

EJEMPLO 7 Este ejemplo demuestra que la inhibición antisentído de la expresión de ARNm ABC1 inhibe la emanación de colesterol mediada por apo A-l a partir de células de fibroblasto. Los fibroblastos de piel normales se marcaron con [3H]colesterol como se describió en el Ejemplo 1. Las células se cargaron entonces con oligonucleótido raspando en la presencia de cualquier 30 µM de oligonucleótido de Morfolino de control (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3' que corresponde al complemento antisentido de un ARNm talasémico ß-globina; SEC. DE IDENT. NO: 52) o 30 µM de oligonucleótido de Morfolino antisentido ABC1 (5'-CATGTTGTTCATAGGGTGGGTAGCTC-3'; SEC. DE IDENT NO. 53) y re-sembrado en nuevos discos. Las células control se cargaron fingidas después de la marcación de [3H]colesterol raspando y re-sembrando en la ausencia del oligonucleótido. La emanación mediada por apo A-l se midió después de 12 horas por conteo por centelleo como el porcentaje de colesterol radiomarcado presentándose en el medio. Los resultados se muestran en la Figura 6 como el significado ± SEM de los tres experimentos separados, normalizados al valor para la emanación específica de apo A-l en la ausencia del oligonucleótído en cada experimento. Como se muestra en la Figura 6, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra ARNm ABC1 provocan un 50% de reducción en la emanación de colesterol a partir de fibroblastos normales comparada con el oligonucleótido antisentido de control (oligonucleótido antisentido ß-globina).

EJEMPLO 8 Este ejemplo demuestra que la sobreexpresión del gen ABC1 humano resulta en un incremento en la emanación de colesterol mediada por apo A-l a partir de las células de monocito. Transfección Estable de Células RAW 264.7: Las células de monocito de ratón RAW 264.7 se transfectaron establemente con el plásmido de expresión pCEPhABCl para ABC1 humano. La construcción del plásmido pCEPhABCl que contiene el marco de lectura abierto de ABC1 humano se describe en el Ejemplo 4. Aproximadamente 1 x 106 células RAW 264.7 se transfectaron durante 5 horas con 2 µg de ADN de pCEPhABCl y 12 µl de reactivo de transfección Geneporter (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA; Cat. #T201007) en 0.8 ml de DMEM libre de suero. Dos días después, las células se dividieron en relaciones que varían de 1:2 -1 50 y la selección se aplicó agregando 150 µg/ml ^^ .,. de higromicina al medio de cultivo. Después de dos semanas, las colonias resistentes a higromicina se recogieron y expandieron. Ensayo de Emanación de Colesterol Mediado por Apo A-I: Las células RAW 264.7 paternas y las tres lineas clónales (L3, L5 y L6) que expresaron establemente ABC1 humano se desarrollaron a confluencia. Las células se cargaron con colesterol y se marcaron por incubación durante 24 horas con 0.5 µCi/ml de [3H]colesterol y 50 µg/ml de LDL acetilado como se describió en el Ejemplo 1. Después del equilibrio de estanques de colesterol por una incubación durante la noche en DMEM/BSA, las células se lavaron y el medio de emanación se agregó como se describe en el Ejemplo 1. La emanación de colesterol mediada por Apo A-l se midió como se describió previamente por los conteos por centelleo del colesterol tritiado en el medio celular, expresadas como un porcentaje de los conteos totales recuperados a partir de las células y el medio. Los resultados se presentaron como el significado ± SEM de los tres experimentos separados normalizados al valor para la emanación específica de apo A-l de células RAW 264.7 paternas con cada experimento. La Figura 7 muestra la emanación de colesterol mediada por apo A-l a partir de las células RAW 264.7 paternas y líneas celulares transfectadas L3, L5 y L6. Como puede verse, la transfección con el vector de expresión ABC1 resulta en 4 veces (L6) a 8 veces (L3 y L5) incrementadas en la emanación de colesterol mediada por apo A-l. Estos resultados indican que la sobreexpresión del gen ABC1 puede sustancialmente incrementar la cantidad de la emanación de colesterol a partir de células de macrófago.

EJEMPLO 9 Este ejemplo demuestra que la expresión ARNm ABC1 se reguló por condiciones celulares relacionadas con la emanación de colesterol en fibroblastos de piel normales, pero no en fibroblastos con TD. Para determinar si ABC1 juega un papel que limita la velocidad en la emanación de esterol celular, la síntesis de ABC1 se midió bajo varias condiciones celulares relacionadas con los procesos de emanación de colesterol. Específicamente, los fibroblastos normales y fibroblastos con TD se expusieron individualmente a condiciones de exceso cAMP, colesterol, o Apo A-l. Los cultivos celulares de fibroblastos de piel normales y fibroblastos con TD1 y TD2 se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. El nivel de ARNm ABC1 se midió por RT-PCR. Cultivos Celulares: Los cultivos celulares inmortalizados de fibroblastos de piel normales y fibroblastos con TD1 y TD2 se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. Las células se desarrollaron a subconfluencia en DMEM/10% de FBS antes del reemplazo con DMEM/BSA y el aditivo indicado durante 24 ó 48 horas. El ARN se preparó como se describió en el Ejemplo 2. RT-PCR: La PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando el Sistema de Detección de Secuencia GeneAmp 5700 (Perkin- Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Brevemente, 500 ng de ARNm tratada con DNasa- se transcribió inverso utilizando cebadores de hexámero aleatorio a 2.5 µM. Aproximadamente 5% de esta reacción se amplificó por PCR utilizando el equipo de núcleo verde SYBR (PE Applied Biosystems, Foster, City, CA; Cat #4304886) y cebadores ABC1 humanos LF: 5'- CCTCTCATTACACAAAAACCAGAC (SEC. DE IDENT. NO: 11) y LR: 5'-GCTTTCTTTCACTTCTCATCCTG (SEC. DE IDENT. NO: 12) para producir un fragmento de 82 bp correspondiente a los nucleótidos 7018-7099 de la ABC1 humana. Las condiciones de ciclo de PCR se siguen: 10 minutos a 95°C; seguido por 40 ciclos de 95°C, 15 segundos; y 60°C, 60 segundos. El ARNm en cada muestra se cuantificó detectando el incremento en fluorescencia provocado por verde SYBR uniendo al producto de amplificación de doble hebra generado durante cada ciclo de PCR. Todas las muestras se operaron por triplicado y se normalizaron contra ARNm ß-actina, amplificado en reacciones paralelas con cebadores actinF: 5'-TCACCCACACTGTGCCATCTACGA (SEC. DE IDENT. NO: 54) y actinB: 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG (SEC. DE IDENT. NO. 55). Las curvas estándares se operaron para ABC1 y ß-actina en la misma placa de PCR. ensayo 8-Br-cAMP: Las células de fibroblasto normales, con TD1 y TD2 se desarrollaron a subconfluencia en DMEM/10% de FBS y luego se trataron con 1 mM de 8-Br-cAMP en DMEM/BSA durante 24 horas Ensayo de Colesterol: Las células de fibroblasto normales, con TD1 y TD2 se desarrollaron a subconfluencia en DMEM/10% de FBS y luego se trataron con 30 µg/ml de colesterol libre en DMEM/BSA durante 48 horas seguidas por 18-24 horas de equilibrio en DMEM/BSA. Ensayo de Apo A-l: Las células de fibroblasto normales, con TD1 y TD2 se desarrollaron a subconfluencia en DMEM/10% de FBS y luego se trataron con 30 µg/ml de colesterol libre en DMEM/BSA durante 48 horas seguidas por 18-24 horas de equilibrio en DMEM/BSA más 10 µg/ml de apo A-l. Resultados: La Figura 8 muestra que en los fibroblastos ARNm ABC1 normales se incrementa aproximadamente 10 veces por exposición a 8-Br-cAMP y se incrementó aproximadamente 17 veces por exposición a colesterol en un medio libre de suero. La exposición subsecuente de células cargadas con colesterol a resultados Apo A-l en una disminución marcada en la expresión de ARNm ABC1. Aunque el mecanismo no ha sido demostrado, estudios previos han mostrado que la emanación de colesterol se promueve en la presencia de tales compuestos como cAMP y colesterol (Hokland et al., J. Biol. Chem., 268:25343-25349 (1993)). Los presentes resultados indican que los fibroblastos normales, ARNm ABC1 se inducen por estos efectuadores de la trayectoria de emanación de colesterol y reprimido por la exposición a un aceptador de colesterol de apolipoproteína, demostrando que la expresión de ABC1 se regula por las condiciones celulares relacionadas a la emanación de colesterol mediada por apolipoproteína. En contraste, las células de fibroblasto a partir de pacientes con TD no se regulan por los efectuadores de la emanación de colesterol. Primero, el nivel inducible de cAMP de ARNm ABC1 en ambas células con TD1 y TD2 es única y aproximadamente 40% de aquel en células normales. Además, la exposición de las células cargadas con colesterol a Apo A-l ya sea que no altere la expresión de ABC1 (células con TD1) o ligeramente incremente la expresión de ABC1 (células con TD2). Estos resultados reflejan los defectos en la emanación de colesterol mediada por Apo-A-I descrita por las células con TD. De manera interesante el crecimiento de células en un medio que contiene suero suprime ei mensaje de ABC1 para acercarse al límite de detección (datos no mostrados). Esta puede reflejar el hecho de que el funcionamiento de la trayectoria de emanación de lípido requiere un estado de reposo celular u otros estados celulares de necesidad de colesterol reducida. En conclusión, las condiciones que se asocian con la emanación incrementada de colesterol celular (es decir, cargando el colesterol, tratamiento de cAMP, privación de suero), también resulta en expresión incrementada de ARNm ABC1 en células de fibroblasto normales. De manera inversa, la exposición de las células de fibroblasto normales cargadas con colesterol a A-l reduce la expresión de ABC1.

EJEMPLO 10 Este ejemplo demuestra que los ligandos para el receptor nuclear LXR, tal como 20-hidroxicolesterol, y ligandos para el receptor RXR, tales como ácido 9-c/s retinoico, puede incrementar la expresión del gen ABC1 en células de ratón RAW 264.7. Los receptores nucleares LXR son factores de transcripción que forman heterodímeros obligados con ei receptor nuclear RXR, y se activan para mejorar la transcripción de sus genes objetivo por la unión de una clase de oxiesteroles incluyendo 2,2-hidroxicolesterol y 20-hidroxicolestrol (Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996)). Como tal, son candidatos para la mediación de transcripción de gen inducido por colesterol. Además, a la luz de los estudios que muestran que ARNm ABC1 y proteína incrementada en fibroblastos y macrófagos en respuesta a la carga de colesterol, y otros estudios que mostraron que la expresión de LXR y RXR incrementada en células de macrófago cargadas por colesterol por exposición a LDL oxidízada, los receptores nucleares LXR y RXR son candidatos altamente plausibles para activadores transcripcionales del gen ABC1. Para determinar si los receptores LXR y RXR juegan un papel en el gen de expresión ABC1, el nivel de ARNm ABC1 se midió en respuesta a 20-hidroxicolesterol y ácido 9-c/s retinoico. Las células de ratón RAW 264.7 se desarrollaron a subclonfuencia en DMEM/10% de FBS y luego se trataron durante 24 horas en DMEM/BSA libre de suero con cualquier ácido 9-c/s retinoico (10 µM), 20-hidroxicolesterol (10 µM), o ambos ligandos juntos (20 µM totales). Las células control recibieron vehículo de etanol únicamente (0.1% v/v). El ARN se extrajo, se trató con DNasa, y ARNm, ABC1 medida por RT-PCR utilizando PE Biosystems SYBR Green Technology como se describió en el Ejemplo 9. La Figura 9 muestra que el tratamiento con cualquier 20-hidroxicolesterol o ácido 9-c/s retinoico resulta en un incremento en la expresión de ARNm ABCl. Además, la Figura 9 muestra que el tratamiento con ambos ligandos juntos resulta en un efecto marcadamente sinergístico, con un incremento de aproximadamente 6 veces sobre la expresión de ABC1 observada con cualquier ligando solo. Estos resultados demuestran que los ligandos para los receptores nucleares LXR y RXR pueden incrementar la expresión del gen ABC1.

EJEMPLO 11 Este ejemplo demuestra que la expresión mejorada de la proteína ABC1 en la membrana de plasma se asocia con la emanación de lípido. La marcación e inmunoprecipitación de superficie celular se usó para determinar si la expresión incrementada de la proteína ABC1 en la membrana de plasma se correlacionó con un incremento en la emanación de colesterol (Figura 10). La cantidad relativa de ABC1 en la superficie celular se determinó por proteínas de superficie reticuladas en células intactas con el agente impermeable de membrana sulfo-NHS-biotina, seguida por las etapas de solubilización de membrana, inmunoprecípitación con anticuerpo ABC1, SDS-PAGE, y detección con estreptavidina. Cultivo Celular: Las células de fibroblasto normal y con TD1 se inmortalizaron como se describió en el Ejemplo 1. Tanto las células normales como con TD1 se cultivaron bajo condiciones control y condiciones conocidas para incrementar la emanación de colesterol mediada por apolipoproteína (Oram, et al., J. Lip. Res., 40:1769-1781 (1999)). Las células control se desarrollaron por confluencia en DMEM/10% de FBS y luego se incubaron en DMEM/BSA durante 18 horas sin aditivos (control). Las células tratadas con cAMP se desarrollaron a confluencia en DMEM/10% de FBS y luego se incubaron en DMEM/BSA durante 18 horas con 1 mM de 8-Br-cAMP (cAMP). Las células cargadas con colesterol se desarrollaron a confluencia en DMEM/10% de FBS y luego se incubaron en DMEM/BSA durante 48 horas con 30 µg/ml de colesterol más 18 horas sin aditivos (colesterol). Las células cargadas con colesterol tratadas con cAMP se desarrollaron a confluencia en DMEM/10% de FBS y luego se incubaron en DMEM/BSA durante 48 horas con 30 µg/ml de colesterol más 18 horas con 1 mM de 8-Br-cAMP (colesterol + cAMP). Marcación de Superficie Celular: Para marcación selectiva de membrana de plasma ABC1, las células se incubaron durante 30 minutos a 0°C con PBS conteniendo 1 mg/ml de sulfo- NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL; Cat. #21217) a proteínas de superficie celular biotiniladas (véase Waiker et al.. Biochemistry, 50:14009-14014 (1993)). Inmunoprecipitación: El antisuero de conejo para ABC1 se elevó contra un péptido sintético correspondiendo al péptido deducido KNQTVVDAVLTSFLQDEKVKES ubicado en el término C de ABC1 humano. La inmunoprecipitación se realizó solubilizando las células en PBS conteniendo 1% de Tritón X-100 (Sigma, St. Louis, MO) e inhibidores de proteasa leupeptina (1 mM), pepstatina (1 mM), y aprotinina (1 mM). El extracto celular se incubó durante la noche a 4°C con antisuero anti-ABC1 a 1:200 diluciones seguido por una incubación de 1 hora adicional con 5 µl de perlas magnéticas recubiertas con proteína A (Dynal, Lake Succes, NY; Cat. #1001.01). El complejo de anticuerpo-antígeno se sedimentó con un imán, las perlas se lavaron dos veces con 1% de Triton-X/PBS, y las proteínas se eluyeron con 1% de ácido acético. Detección de Proteína ABC1: Las proteínas biotiniladas eluidas se sometieron a SDS-PAGE (6% de gel; 150V, 5 horas) y transfirieron a membrana de nitrocelulosa (200 mA, 18 horas). La nitrocelulosa se sondeó con peroxidasa de rábano de estreptavídina (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ; Cat. #RPN 1231) diluida 300 veces y detectada por marcación quimioluminiscente mejorada (ECL) de acuerdo con el protocolo del vendedor (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Para probar _¡*_¿ í_ái ,^Éb^ para posible biotinilación de proteínas intracelulares, el sobrenadante de pos-inmunoprecípitación se trató con un anticuerpo monoclonal de ratón a la proteína ¡ntracelular ß-COP y ß-COP biotinilado inmunoprecipitado se ensayó por manchado de 5 estreptavidina. Ninguno se detectó. Resultados: Como se muestra en la Figura 10, la proteína ABC1 240 kDA aparece como un doblete. La proteína ABC1 está parcialmente ubicada a la membrana de plasma en células de fibroblasto normales (10A) y con TD1 (10B). Los 10 resultados similares se vieron con una segunda línea celular de fibroblasto normal y con fibroblastos con TD2 (datos no mostrados). La expresión de superficie celular de ABC1 se incrementó ligeramente cuando el crecimiento celular en suero (células normales y con TD1) se trataron con 8-Br-cAMP. La 15 privación de suero y carga de colesterol tanto en las células normales como con TD1 de expresión de superficie marcadamente incrementada de ABC1, la cual se mejoró además por tratamiento cAMP. Estos resultados indican que la expresión de ABC1 a la superficie celular se regula por las condiciones que mejoran la 20 emanación de lípido mediada por apolipoproteína, consistente con la idea que esta ubicación en la membrana de plasma juega un papel clave en su función de transporte de lípido. Las mutaciones en células con TD1 y TD2 no parecen dañar severamente la expresión o procesamiento de ABC1, implicando que los efectos 25 secundarios en el transporte o interacciones de lípido con &é á* &&ffi&^& i ^ * .* proteinas accesorias dependen de su dominio terminal NH2, en donde ocurren las mutaciones.

EJEMPLO 12 Este ejemplo muestra que los agentes que inhiben la degradación de AMP 3'5' cíclico, tal como inhibidores de fosfodiesterasa, la emanación mediada por A-l de apolipoproteína incrementada a partir de las células de macrófago. Como se muestra en la Figura 10, el cAMP incrementa la actividad de ABC1. Los presentes estudios se realizan para determinar la emanación de colesterol a partir de células de macrófago en la presencia de cAMP elevado. Los niveles elevados de cAMP pueden unirse en la presencia de agentes ya sea que estimulen la síntesis de cAMP o inhiban la degradación de cAMP. Por ejemplo, rolipram es un compuesto que regula los niveles de cAMP inhibiendo fosfodiesterasas, un grupo de enzimas que degradan cAMP. El efecto de CAMP elevado en la emanación de colesterol se determinó utilizando los ensayos de emanación de colesterol mediados por apolipoproteína descritos en el Ejempio 1. Brevemente, las células RAW 264.7 se suspendieron en una densidad de 1.25 x 105 células/ml se desarrollaron en DMEM/10% de FBS suplementado con piruvato. Después de 24 horas, el medio se removió y reemplazó con DMEM/BSA más colesterol radiomarcado (1 µCi/ml [3H]-colesterol) y 50 µg/ml de LDL acetilado durante 24 horas. Las células se mantuvieron entonces durante 24 horas en un medio de equilibrio que consiste de DMEM/BSA más cualquier apo A-l solo (20 µg/ml), apo A-l y 8-bromo 3'-5' cAMP (1 mM) o apo A-l y rolipram (50 µM). Después de 12-24 horas, la emanación de [3H]colesterol se midió por conteo de centelleo como se describe en el Ejemplo 1 y se calculó como el porcentaje de colesterol radiomarcado total apareciendo en el medio. Los resultados indicaron que las células control cargadas con colesterol que no recibieron apo A-l mostraron una emanación de colesterol al 3%, mientras que las células que reciben apo A-l únicamente mostraron una emanación del 5%. Las células cargadas con colesterol que recibieron apo A-l y cAMP mostraron una emanación de 32% de colesterol, demostrando que cAMP elevado promueve la emanación de colesterol. Similarmente, las células que reciben apo A-l y un inhibidor de íosfodiesterasa (rolipram) mostró una emanación de colesterol al 17%.

EJEMPLO 13 Este ejemplo muestra que los agentes que son ligandos para receptores nucleares, tales como LXR, RXR, y receptores nucleares PRAR, incrementan la emanación mediada por A-l de apolipoproteína incrementada a partir de células de macrófago. Para determinar si los ligandos para receptores nucleares afectan el proceso de la emanación de colesterol mediada por apolipoproteína, varios ligandos se probaron utilizando el ensayo de emanación de colesterol mediada por apo A-l en el Ejemplo 12. La superfamilia de receptor nuclear incluye varios miembros, tales como el receptor LXR de hígado, el receptor retinoide RXR, y el receptor PPAR activado proliferador de peroxisoma, que había sido implicado en el metabolismo de lípido (Russell. D.W., Cell, 97:539-542 (1999); Spiegelman, B.W. Cell, 93:153-155 (1998); Janowski et al., Nature 383:728-731 (1996)). Además, los ligandos para algunos de estos receptores han sido observados para incrementar el plasma HDL y prolíferando los datos del gen de expresión (microdisposicíón) que muestran que los receptores de hormona respondan a la carga de colesterol a través de LDL oxidizada. Utilizando los ensayos descritos anteriormente, se probó el ácido 9 c/s-retinoico (ligando RXR9, oxisterol (ligando LXR), y fenfibrato (ligando PPAR) para determinar el efecto en la emanación de colesterol. Las células control cargadas con colesterol que no recibieron apo A-l mostraron una emanación de colesterol al 3%, mientras que las células que recibieron apo A-l únicamente mostraron un 5% de emanación. En contraste, las células cargadas con colesterol que recibieron apo A-l y ácido 9 c/s-retinoico (30 ng/ml) mostraron una emanación de colesterol al 16%. Las células que recibieron apo A-I y oxiesterol (5 µg/ml) mostraron una emanación de colesterol al 14%. Las células que recibieron apo A-l fenfibrato (3 µg/ml) mostraron una emanación de colesterol al 10%. Estos resultados indican que los receptores de hormona pueden modularse para -* ***- > incrementar la velocidad de la emanación de colesterol mediada por apolípoproteína a partir de macrófagos. Además, cuando el ensayo de emanación se realizó utilizando varias concentraciones de 9-c/s-RA (0.3 ng/ml, 3.0 ng/ml, o 30 ng/ml), los resultados mostraron que la emanación de colesterol mediada por 9-c/s-RA a partir de células de macrófago en una manera dependiente de dosis. Especialmente, las células control (apo A-l únicamente) mostraron 1890 c.p.m., 0.3 ng/ml 9-c/s-RA mostraron 1522 c.p.m., 3.0 ng/ml de 9-c/'s-RA mostró 3568 c.p.m. y 30 ng/ml 9-c/s-RA mostró 8597 c.p.m. Además, utilizando un ensayo similar en donde RAW 264.7 células se cargaron con colesterol durante 48 horas, otros activadores de receptor nuclear, tales como 22-hidroxicolesterol (ligando LXR) y benzfibrato, donde se mostró para incremento la emanación de colesterol (datos no mostrados).

EJEMPLO 14 Este ejemplo muestra que los eicosanoides, tales como prostaglandina E1 y protaciclina PG12, incrementaron emanación mediada por apolípoproteína A-l a partir de células de macrófago. Los eicosanoides tales como prostaglandinas y prostaciclinas, se han mostrado para ser efectivos en el tratamiento de hípercolesterolemia. Para determinar si los eicosanoides afectan el proceso de la emanación de colesterol mediada por apolipoproteína, PGE1 y PG12 se probaron utilizando el ensayo de emanación de colesterol mediada por apo A-l descrito en el Ejemplo 12. Este ensayo mostró que las células control cargadas con colesterol que no recibieron apo A-l tienen una emanación de colesterol al 3%, mientras que las células que recibieron apo A-l únicamente tienen una emanación del 5%. Las células cargadas con colesterol que recibieron apo A-l y PG12 (25 nm) mostraron una emanación de colesterol al 10%. Las células que recibieron apo A-l y PGE1 (25 nM) mostraron una emanación de colesterol al 15%. Estos resultados demuestran que los eicosanoides pueden incrementar la velocidad de emanación de colesterol mediada por apolipoproteína a partir de macrófagos.

EJEMPLO 15 Este ejemplo demuestra que un gen reportero bajo el control de un promotor ABC1 puede usarse en compuestos probados para la capacidad para regular el gen de expresión ABC1. El sistema de vector reportero de luciferasa pGL3 (Promega, Madison, Wl) se usó para crear un plásmído recombinante para medir el gen de expresión reportero bajo control del promotor ABC1. Construcción de Plásmidos Reporteros: Se usó plásmido pGL3-Basíc (Promega, Madison, Wl; Cat. #E 1751) como un plásmido control que contiene el gen de luciferasa menos promotor. La construcción reportera que contiene el promotor ABC1 y gen de luciferasa se hizo clonando un fragmento genómico a partir de la región de flanqueo 5' del gen ABC1 (hAPR1 5' promotor, correspondiendo a los nucleótidos 1080-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3) en el sitio Sacl del plásmido GL3-Básico para generar el plásmido GL-6a. Enseguida, el plásmido GL-6a se digirió con Spel y Acc65l. Un fragmento BsiWI-Spel extirpado a partir del subclon lambda, representando la secuencia genómica ABC1 correspondiendo a los nucleótidos 1-1534 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 se ligó en el fragmento del vector restante/promotor ABC1 producido por esta digestión. El plásmido resultante, pAPR1, codifica el gen reportero de luciferasa bajo control transcripcional de 1.75 kb de la secuencia promotora ABC1 humana. Transfección de Construcciones Reporteras: El control descrito anteriormente o plásmido pAPR se transfectó en cultivos confluentes de RAW 264.7, células mantenidas en DMEM conteniendo 10% de suero bovino fetal. Cada pozo de un disco de 12 pozos se transfectó durante 5 horas con cualquier pGL3-Básico, pGL3-promotor o pAPR1 ADN (1 µg), plásmido de luciferasa de ADN (1 µg), y 12 µl de reactivo Genporter (Gene Therapy Systems, San Diego, CA; Cat. #T201007). Además, 0.1 µg de plásmido pCMBß de ADN (Clontech, Palo Alto, CA, Cat. #6177-1) se agregó como un control para eficiencia de transfección. Después de 5 horas, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM/BSA libre de suero en la presencia de o ausencia de LDL acetilado (100 µg/ml) y se incubó durante 24 horas ^ $ " A i i. Ám^ ^té .A Para conveniencia agregada en tamizado de alto rendimiento, las células cultivadas pueden transfectarse establemente con plásmidos evaluadores utilizando el siguiente procedimiento. Primero, las células 5x106 RAW 264.7 se 5 transfectaron durante 5 horas en un disco de 60 mm con 9 µg del plásmido pAPR1 y guión pCMV (Stratagene, LaJolla, CA) en 10 ml de DMEM libre de suero con 50 µl de reactivo de transfección Geneporter (Gene Therapy Systems, San Diego, CA). Subsecuentemente, el medio de transfección se reemplazó con un 10 medio completo y las células se incubaron durante la noche a 37°C. Subsecuentemente, las células se transfectaron para separar los discos a diluciones que varían de 1:5 a 1:1000 y se incubaron en un medio de selección conteniendo 800 µg/ml de G418 (Life Technologies, Bethesda, MD) durante 20 días. Las 15 colonias visibles se escogieron, se expandieron, y se ensayaron para actividad de luciferasa como se describe posteriormente. Utilizando este método, cinco líneas celulares clónales positivas para la actividad de luciferasa se identificaron para uso en ensayos de alto rendimiento. 20 Ensayo de Luciferasa: Siguiendo la transfección, las células en cada pozo se Usaron en 70 µl de reactivo de lisis de célula 1X (Promega, Madison, Wl, Cat. #E3971), se sometieron a un ciclo de congelado-descongelado, y el lisato aclarado por centrifugación durante 5 minutos a 12,000 g. Después de la 25 centrifugación, se agregó 100 µl de reactivo de ensayo de ^»-Á¿.ia^^'ii- iiMHMih luciferasa (Promega, Madison, Wl; Cat. #E1501) a 10 µl de lisato. La actividad de luciferasa de cada lisato se midió como unidades de luz utilizando un luminómetro. Adicionalmente, la actividad de ß-galactosidasa de cada lisato se midió utilizando los reactivos de ensayo quimioluminiscentes suministrados en el equipo Galacto-light de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tropix Inc., Bedford, MA: Cat. #BL100G). La actividad de luciferasa normalizada para cada lisato se determinó dividiendo el valor de actividad de luciferasa por el valor de ß-galactosidasa determinada y reportada como unidades de luz relativas. Resultados: La actividad de luciferasa detectada en células transfectadas con pAPR1 fueron 3.3 veces más altas que la actividad detectada en las células control transfectadas con plásmido pGL3-Básico conteniendo luciferasa de ADNc únicamente. Estos resultados indican que las regiones reguladoras transcripcionales de ABC1 estuvieron en el lugar. Cuando las células pAPR1 transfectadas se incubaron con 100 µg/ml de acetilo LDL durante 24 horas, la actividad de luciferasa fue 3.25 veces más alta que en células que no se hubieron tratado con acetilo LDL. Estos resultados sugieren que la secuencia de ABC1 genómica contiene un elemento de "colesterol sensible" encontrado en la región 5' de flanqueo que media la respuesta de carga de colesterol del gen ABC1 nativo. Este sistema reportero puede también utilizarse para probar otros compuestos para determinar sí el compuesto modula la expresión de ABC1.

EJEMPLO 16 Este eiemplo demuestra un ensayo adicional que puede utilizarse en los compuestos de prueba para la capacidad para regular el gen de expresión ABC1 utilizando un gen reportero bajo el control de un promotor de ABC1 endógeno. Este ensayo implica la construcción de un vector recombínante que contiene un gen reportero promotor y un gen marcador de selección. El vector es linearizado y transfectado en células tales como el gen reportero se integró en el genoma celular corriente abajo del promotor ABC1 endógeno. Utilizando este ensayo, la expresión del gen reportero se accionó por el promotor ABC1 endógeno en respuesta a un compuesto de prueba. Construcción de Plásmidos Evaluadores El vector de recombinación conteniendo un gen reportero promotor puede hacerse iniciando con un fragmento genómico 7kb EcoRI de ABC1 que contiene exo 0 (que incluye los sitios de partida ABC1) y parte del intron 1. Utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, un sitio de restricción Salí puede generarse en la secuencia de exon 0 corriente abajo de los dos sitios de partida conocidos. El vector de recombinación se generó insertando un fragmento de ADN conteniendo un gen reportero menos promotor, tal como una lucíferasa, y un marcador selectivo promotor, tal como resistencia puromicina, en el sitio Salí. Una señal de ingreso de ribosoma interno debe insertarse entre el gen reportero y el gen marcador de manera que los genes se transcribirán en la orientación correcta. El vector recombinante contiene dos sitios Eco47111 uno de los cuales puede ser eliminado, utilizando por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigida. El sitio Eco47111 restante, ubicado corriente arriba del exon 0 se usó para linearizar el vector. Transfección de Construcciones Reporteras: El vector de recombinación linearizado que contiene el gen reportero y el gen marcador se introdujo en células de cultivo, incluyendo células humanas, por cualquiera de los varios métodos de transfección conocidos en la técnica. Por ejemplo, el vector linearizado puede transfectarse utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 15. El vector de recombinación linearizado contiene secuencias de ABC1 que permiten al vector integrarse en el genoma celular en el sitio del gen ABC1 endógeno. La adición de un antibiótico apropiado al medio de cultivo permite la selección de únicamente aquellas células en las cuales el gen reportero y el gen marcador tiene integrado corriente abajo del promotor ABC1 endógeno en la orientación propia. Por ejemplo, si el vector contiene un gen de resistencia a puromicina insertada corriente abajo del gen evaluador, las células transfectadas deben desarrollarse en la presencia de puromicina. Únicamente aquellas células que tienen un gen de resistencia a puromicina propiamente integrado, y pueden por lo tanto codificar una proteína funcional, sobrevivirán en la presencia de puromicina. Así, las células transfectadas deben desarrollarse bajo condiciones que inducen la actividad promotora ABC1 en la presencia del antibiótico apropiado. Las células sobrevivientes pueden cultivarse clonalmente y la secuencia de ADN utilizando PCR o análisis southern blot para probarse para su integración apropiada de secuencias genómicas. Las células resultantes que contiene un gen reportero bajo el control del promotor ABC1 endógeno pueden usarse para determinar si un compuesto de prueba modula la expresión de ABC1. La actividad que modula ABC1 de un compuesto se determina ensayando el nivel del gen de expresión reportero encontrado en las células expuestas al compuesto de prueba. Por ejemplo, las células que tienen un gen de luciferasa integrado pueden usarse para determinar la actividad que modula ABC1 de un compuesto de prueba midiendo la cantidad de actividad de luciferasa encontrada en las células expuestas al compuesto.

EJEMPLO 17 Este ejemplo demuestra que los ligandos para los receptores nucleares sobre-regulan la expresión de un gen reportero bajo el control del promotor ABC1. Para determinar si los ligandos para los receptores nucleares LXRa, LXRß y RXRa podrían regular el gen de expresión ABC1, el plásmido pAPR1 que contiene el gen reportero de luciferasa bajo control del promotor de ABC1 se transfectó en células RAW 264.7 tratadas con por lo menos un ligando para los receptores nucleares (Figura 12).

Construcción Transfec ción de C o n s t rucciones Reporteras: La construcción reportera pAPR1 y construcción reportera control pGL3-Básico se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 15. Las células RAW 264.7 se mantuvieron en cultivo y se transfectaron con cualquier pGL3-Bás?co (1 µg) o pAPR1 (1 µg) como se describe en el Ejemplo 15. Las células RAW 264.7 transfectadas se trataron con cualquier etanol (EtOH) (0.1% de v/v), 20(S)-hidroxicolesterol (20(S) OH-col (10 µM), ácido 9-c/s retinoico (9-c/s RA) (10 µM) o ambos 20(S) OH-col y 9-c/s RA (20 µM totales) durante 24 horas. La actividad de luciferasa se midió y se reportó como las unidades ligeras relativas como se describió en el Ejemplo 15. Resultados: Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 12. Las células control transfectadas con pGL3-Básicas no mostraron actividad de luciferasa (datos no mostrados). Las células se transfectaron con pAPRI que produjo un incremento de 19 veces en actividad reportera de luciferasa en la presencia de 20 OH-col, un incremento de 16 veces en actividad de luciferasa en la presencia de 9-c/'s RA, y un incremento de 280 veces en actividad de luciferasa en la presencia de ambos ligandos comparada con control EtOH. Estos resultados indican que el esterol y el retinoide produjeron una respuesta de transcripción fuerte a partir de la secuencia de flanqueo 5' ABC1 en pAPR1. Además, existe un efecto sinergístico aparente de las dos clases de compuestos, como puede verse por el incremento dramático en la actividad de luciferasa encontrado en células tratadas con ambos ligandos. Se conoce que los receptores LXRa y RXRa forma los heterodímeros activos. Así, la activación inducida por el ligando de ambos receptores nucleares simultáneamente podría producir el incremento sinergístico observado en la transcripción. Esto datos demuestran que los hidroxi esteróles, tales como 20(S) hidroxicolesterol, y retinoides, tales como ácido 9-c/s retinoico, activó el promotor ABC1, indicando que estos y los compuestos relacionados pueden utilizarse en el desarrollo de compuestos terapéuticos para incrementar la expresión ABC1 en células de macrófago para sitios periféricos liberados de colesterol en exceso. Adicionalmente, el gen promotor/reportero ABC1 presente tamizando el ensayo puede usarse para tamizar otros compuesto que incrementan la expresión de ABC1 para identificar compuestos terapéuticos adicionales.

EJEMPLO 18 Este ejemplo demuestra la caracterización adicional de la región promotora ABC1, incluyendo la identificación de un elemento de respuesta LXR. Para determinar qué porción de la región de flanqueo 5' de ABC1 retiene la actividad transcripcional en respuesta a los ligandos nucleares, varios plásmidos que contienen una porción diferente de la región de flanqueo 5' y un gen reportero de luciferasa se transfectan en células RAW 264.7 tratadas con por lo menos un ligando para los receptores nucleares Utilizando este sistema, un elemento de respuesta de esterol que corresponde a los nucleótidos 1480-1510 y la SEC. DE IDENT. NO: 3, se identificó. El elemento de respuesta de esterol contiene un elemento directo 4 repetido TGACCGatagTAACCT. La confirmación del elemento de respuesta de esterol se obtuvo utilizando mutagénesis de sitio dirigida y técnicas de ensayo de cambio de banda. Construcción de Construcciones Reporteras: L a construcción pAPR1 reportera y la construcción pGL3-Básica reportera control se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 15. Las construcciones reporteras que contienen cualesquiera nucleótidos 1-1532,1080-1643,1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 se construyeron también. Una construcción reportera que contiene nucleótidos 1080-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 (GL-6a) se construyó como se describe en el Ejemplo 15. Una construcción reportera que contiene nucleótidos 1-1532 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 se construyó por digestión de pAIPRI con Spe I y Nhe I, y la re-ligación del fragmento del vector purificado con gel. Una construcción reportera que contiene nucleótidos 1181 a 1643 se construyó principalmente digiriendo GL-6a con Sty I, debilitando los extremos cohesivos con enzima Klenow, digiriendo el vector resultante con Sac I y aislando los 462 pares de bases del fragmento final debilitado cohesivo Sac-I. Esto se clonó en un vector obtenido por digestión de GL-6a debilitando Acc65 I de los extremos cohesivos con enzima Klenow. digestión con Sac I y aislamiento de gel del fragmento de vector. Una construcción reportera que contiene los nucleótidos 1292-1643 se construyó por digestión consecutiva de GL-6a con Acc65 I, debilitando los extremos con enzima Klenow, la digestión con Sac II, debilitando los extremos con polimerasa T4, y volviendo a ligar el fragmento de vector aislado por gel. Una construcción reportera que contiene nucleótidos 1394-1643 se construyó por digestión de GL-6a con Acc65 I, debilitando los extremos con enzima Klenow, digestión subsecuente con Apa I, debilitamiento extremo con polimerasa T4 y re-ligación del fragmento del vector aislado con gel. Transfección de las Construcciones Reporteras: Las células RAW 264.7 se mantuvieron en cultivo y transfectaron con cualquier pGL3-Básico (1 µg), pAPR1 (1 µg), o una de las otras construcciones reporteras de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 15. Las células RAW 264.7 transfectadas se trataron con cualquier etanol (EtOH) (0.1% v/v), 20(S)-hidroxicolesterol (20(S) OH-col) (10 µM), 22(R)-hidroxicolesterol (22(R) OH-col) (10 µM), ácido 9-c/s retinoico (9-c/s RA) (10 µM), o tanto 20(s) OH-col como 9-c/s RA (20 µM totales) durante 24 horas. La actividad de luciferasa se midió y reportó como unidades ligeras relativas como se describe en el Ejemplo 15.

Mutaq nesis Sitio Dirigida: El elemento de respuesta de esterol que corresponde a los nucleótidos 1480-1510 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 se mutó en la secuencia 1080-1643 descrita anteriormente utilizando mutagénesis de sitio dirigida. Específicamente, el elemento de respuesta que contiene un elemento 4 repetido directo TGACCGatagTAACCT se mutó a CTGCACatagTAACCT utilizando el sistema GeneEditor (Promega, Madison, Wl) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ensayos de Cambio de Gel: El extracto nuclear se preparó a partir de células RAW 264.7 por el método de Ohisson et al., Cell, 45:35-44 (1986). Los oligonucleótidos 3 P marcados (5 ng) que corresponden al elemento de respuesta LXR (TCGAGTGACCGATAGTAACCTCTCGA; SEC. DE IDENT. NO: 56) y su contraparte mutada (TCGAGCTGCACATAGTAACCTCTCGA; SEC. DE IDENT. NO. 57) se incubaron individualmente con 5 µg de proteína nuclear durante 30 minutos a temperatura ambiente en 20 mM de HEPES, pH 7.9, 60 mM KCL, 1 mM MgCI2, 1mM DTT, 66.6 µg/ml poli(dldC), y 10% de glícerol en la presencia o ausencia de 1 µg de antisuero para LXRa y LXRß (Santa Cruz Biotechnology, Cat No. SC-1591, Santa Cruz, CA) o antisuero para RXR (Santa Cruz Bíotechnology, Cat. No. SC-774, Santa Cruz, CA). Los complejos de proteína de ADN se aplicaron a un 4% de gel de poliacrilamida desnaturalizada durante 1.5 horas a 150V en amortiguador de TBE 0.5X. Los complejos de ADN de proteína se detectaron por autorradiografía del gel secado.

Resultados: La transfección con las construcciones reporteras individuales que contienen la región de flanqueo 5' correspondiente a los nucleótidos 1-1643 (es decir, pAPR1), 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643 o 1394-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3, cada uno produce los mismos resultados. Todas las construcciones individuales producen un incremento de 3 a 4 veces en la actividad reportera de luciferasa en la presencia de 20(S) OH-col o 22(R) OH-col comparada con el EtOH control. También, todas de las construcciones individuales producen una actividad reportera de luciferasa incrementada de 8 a 10 veces en la presencia de 9-c/s RA. Además, la transfección con cualquiera de las construcciones producen un incremento de 25 a 50 veces en la actividad de luciferasa en la presencia de ligando de oxiesterol (ya sea (20(S) OH-col o 22(R) OH-col)) y ligando de retinoide (9-cis RA) juntos comparados con EtOH control, indicando una interacción sinergística. Cada una de las construcciones descritas demostraron niveles comparables de actividad de luciferasa en respuesta a los ligandos probados, indicando que aún las secuencias de flanqueo 5' más cortas contienen secuencias reguladoras transcripcionales para esteróles y retinoides. Específicamente estos resultados demuestran que las secuencias reguladoras transcripcionales para esteróles y retinoides se ubican en la región de flanqueo 5' que corresponde a los nucleótidos 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO: 3. - -- mal iiiii Estos resultados se confirmaron por ensayos de luciferasa utilizando una construcción reportera que contiene la secuencia de tipo silvestre que corresponden a los nucleótídos 1080-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3 y una construcción reportera que contiene una secuencia mutada correspondiente a los nucleótidos 1080-1643 de la SEC. DE IDENT. NO: 3, en donde el elemento de respuesta de esterol encontrado en los nucleótídos 1480-1500 se mutó como se describe anteriormente. La transfección con la secuencia del tipo silvestre produce una respuesta transcripcional, como se midió por un incremento en la actividad de luciferasa, en la presencia de ya sea 20(S) OH-col o 9-c/s RA solo y produce una respuesta sinergística en la presencia de ambos ligandos juntos. En contraste, la transfección con la secuencia mutada no produce una respuesta transcripcional en la presencia de 20(S) OH-col o 22 (R) OH-col. La transfección de la secuencia mutacla conservó una respuesta reducida a 9-c/s RA, produciendo un incremento de 4 a 5 veces en la actividad transcripcional, en lugar del incremento de 8 a 10 veces observado con la secuencia de tipo silvestre. La transfección de la secuencia mutada también anuló la respuesta transcripcional sinergística vista en la presencia de 20(S) OH-col y 9-c/s RA juntos. Estos resultados se confirmaron además por ensayos de cambio de gel utilizando la secuencia de consenso de esterol (nucleótidos 1480-1510) y su contraparte mutada. Los ensayos de cambio de gel mostraron que mientras las proteínas de unión nucleares aisladas a partir de las células RAW 264.7 unidas a la secuencia de consenso de esterol, las proteínas nucleares no se unieron a la secuencia mutada. Además, la incubación de las proteínas nucleares con la secuencia de consenso de esterol de tipo silvestre en la presencia de antisuero LXR resultado en la formación de complejos supercambiados (es decir, complejos de ADN de proteína de anticuerpo), identificando la secuencia como un elemento de respuesta de esterol que se une al receptor nuclear LXR. En contraste, la incubación de las proteínas nucleares con ei elemento de respuesta de esterol de tipo silvestre en la presencia del antisuero RXR no resulta en la formación de complejos supercambiado, indicando que RXR no se une a esta secuencia. Estos resultados muestran que las mutaciones que destruyen la proteína nuclear unidas a la secuencia de consenso también anulan la respuesta transcripcional a ligandos LXR y disminuye la respuesta a los ligandos RXR. Además, los estudios de unión nucleares realizados en la presencia de antisuero LXR o RXR confirman que la secuencia de consenso encontró a los nucleótidos 1480-1510 es un elemento de respuesta LXR. Este elemento también media una respuesta parcial a 9-c/s RA. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo patentes y publicaciones, se incorporan en la presente en su totalidad para referencia. Mientras que la invención ha sido descrita con un énfasis hasta los aspectos preferidos de la invención, será fácilmente evidente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica que variaciones de las modalidades preferidas pueden usarse y que se pretende que la invención puede practicarse de otra manera que la que es específicamente descrita en la presente. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las siguientes reivindicaciones. *.l?A?átpt?> LISTA DE SECUENCIAS -110. Lawn, Richard M. Wade, David Garvín, Michael Oram, John F. 120 COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR LA EMANACIÓN DE COLESTEROL Y ELEVAR HDL UTILIZANDO LA PROTEINA ABC1 TRANSPORTADORA DE CÁSETE DE ENLACE ATP <130> 99,395-A <140> <141> 150> US 60/140,264 <1S1> 1999-06-161 150> US 60/153,372 <151> 1999-08-14 <150> US 60/166, 573 <151> 1999-11 -19 <160> S7 170> Pacentln Ver. 2.0 210 1 <211> 10442 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggccgggacc cgcagagccg agccgaccct tctctcccgg gctgcggcag ggcagggcgg 60 ggagccccgc gcaccaacag agccggttct cagggcgctt tgctccttgt tttttccccg 120 gctctgtttt ctccccttct ccggaaggcc tgtcaagggg taggagaaag agacgcaaac 180 acaaaagtgg aaaacagtta atgaccagcc acgggcgtcc ccgctgtgag ctctggccgc 240 tgccttccag ggctcccgag ccacacgctg ggcgtgctgg ctgagggaac atggcctgtt 300 ggcctcagct gaggttgctg ctgtggaaga acctcacttt cagaagaaga caaacacgtc 360 agctgttact ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc tctgttcggc 420 tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc atgccctctg 480 caggaacact tccttgggtt 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Tyr Asp Asn Ser Thr Thr 340 345 350 Pro Tyr Cys Asn Asp Leu Met Lys Asn Leu Glu Ser Ser Pro Leu Ser 355 360 365 Arg He He Trp Lys Ala Leu Lys Pro Leu Leu Val Gly Lys He Leu 370 375 380 Tyr Thr Pro Asp Thr Pro Ala Thr Arg Gln Val Met Ala Glu Val Asn 385 390 395 400 Lys Thr Phe Gln Glu Leu Ala Val Phe His Asp Leu Glu Gly Met Trp 405 410 415 Glu Glu Leu Ser Pro Lys He Trp Thr Phe Met Glu Asn Ser Gln Glu 420 425 430 Met Asp Leu Val Arg Met Leu Leu Asp Ser Arg Asp Asn Asp His Phe 435 440 445 Trp Glu Gln Gln Leu Asp Gly Leu Asp Trp Thr Ala Gln Asp He Val 450 455 460 Ala Phe Leu Ala Lys His Pro Glu Asp Val Gln Ser Ser Asn Gly Ser 465 470 475 480 Val Tyr Thr Trp Arg Glu Ala Phe Asn Glu Thr Asn Gln Ala He Arg 485 490 495 Thr He Ser Arg Phe Met Glu Cys Val Asn Leu Asn Lys Leu Glu Pro 500 505 510 He Ala Thr Glu Val Trp Leu He Asn Lys Ser Met Glu Leu Leu Asp 515 520 525 Glu Arg Lys Phe Trp Ala Gly He Val Phe Thr Gly He Thr Pro Gly 530 535 540 Ser He Glu Leu Pro His His Val Lys Tyr Lys He Arg Met Asp He 545 550 555 560 Asp Asn Val Glu Arg Thr Asn Lys He Lys Asp Gly Tyr Trp Asp Pro 565 570 575 Giy Pro Arg Ala Asp Pro Phe Glu Asp Met Trp Tyr Val Trp Gly Gly 580 585 590 Phe Ala Tyr Leu Gln Asp Val Val Glu Gln Ala He He Arg Val Leu 595 600 605 Thr Gly Thr Glu Lys Lys Thr Gly Val Tyr Met Gln Gln Met Pro Tyr 610 615 620 Pro Cys Tyr Val Asp Asp He Phe Leu Arg Val Met Ser Arg Ser Met 625 630 635 640 Pro Leu Phe Met Thr Leu Ala Trp He Tyr Ser Val Ala Val He He 645 650 655 Lys Gly He Val Tyr Glu Lys Glu Ala Arg Leu Lys Glu Thr Met Arg 660 665 670 lie Met Gly Leu Asp Asn Ser He Leu Trp Phe Ser Trp Phe He Ser 675 680 685 Ser Leu He Pro Leu Leu Val Ser Ala Gly Leu Leu Val Val He Leu 690 695 700 r.^ra¿,'r-StÜ^..

Lys Leu Gly Asn L=u Leu Pro Tyr Ser Asp Pro Ser Val Val Phe Val 705 710 715 720 Phe Leu Ser Val Phe Ala Val Val Thr He Leu Gln Cys Phe Leu He 725 730 735 Ser Thr Leu Phe Ser Arg Ala Asn Leu Ala Ala Ala Cys Gly Gly He 740 745 750 He Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu Pro Tyr Val Leu Cys Val Ala Trp Gln 755 760 765 Asp Tyr Val Gly Phe Thr Leu Lys He Phe Ala Ser Leu Leu Ser Pro 770 775 780 Val Ala Phe Gly Phe Gly Cys Glu Tyr Phe Ala Leu Phe Glu Glu Gln 785 790 795 800 Gly He Gly Val Gln Trp Asp Asn Leu Phe Glu Ser Pro Val Glu Glu 805 810 815 Asp Gly Phe Asr Leu Thr Thr Ser He Ser Met Met Leu Phe Asp Thr 8: 0 825 830 Phe Leu Tyr Gly Val Met Thr Trp Tyr He Glu Ala Val Phe Pro Gly 835 840 845 Gln Tyr Gly He Pro Arg Pro Trp Tyr Phe Pro Cys Thr Lys Ser Tyr 850 855 860 Trp Pne Gl/ Glu Glu Ser Asp Glu Lys Ser His Pro Gly Ser Asn Gln 865 870 875 380 Lys Arg Met Ser Clu He Cys Met Glu Glu Glu Pro Thr His Leu Lys 885 890 895 Leu Gly Val Ser He Gln Asn Leu Val Lys Val Tyr Arg Asp Gly Met 900 905 910 Lys Val Ala Val Asp Gly Leu Ala Leu Asn Phe Tyr slu Gly Gln He 915 920 925 Thr Ser Phe Leu Gly His Asn Gly Ala. Gly Lys Thr Thr Thr Met Ser 930 935 940 He Leu Thr Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Thr Ala Tyr He Leu 945 950 955 960 Gly Lys Asp He ?rg Ser Glu Met Ser Thr He Arg Gln Asn Leu Gly 965 970 975 Val Cys Pro Gln His Asn Val Leu Phe Asp Met Leu Thr Val Glu Glu 980 985 990 His He Trp Phe Tyr Ala Arg Leu Lys Gly Leu Ser Glu Lys His Val 995 1000 1005 Lys Ala Glu Met Glu Gln Met Ala Leu Asp Val Gly Leu Pro Ser Ser 1010 1015 1020 Lys Leu Lys Ser L/s Thr Ser Gln Leu Ser Gly Gly Met Gln Arg Lys 1025 1030 1035 1040 Leu Ser Val Ala Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Lys Val Val He Leu 1045 1050 1055 Asp Glu Pro Thr Ala Gly Val Asp Pro Tyr Ser Arg Arg Gly He Trp 1060 1065 1070 Glu Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Gln Gly Arg Thr He He Leu Ser Thr 1075 1080 1085 His His Met Asp Glu Ala Asp Val Leu Gly Asp Arg He Ala He He 1090 1095 1100 Ser His Gly Lys Leu Cys Cys Val Gly Ser Ser Leu Phe Leu Lys Asn 1105 1110 1115 1120 Gln Leu Gly Thr Gly Tyr Tyr Leu Thr Leu Val Lys Lys Asp Val Glu 1125 1130 1135 Ser Ser Leu Ser Ser Cys Arg Asn Ser Ser Ser Thr Val Ser Tyr Leu 1140 1145 1150 Lys Lys Glu Asp Ser Val Ser Gln Ser Ser Ser Asp Ala Gly Leu Gly - - - * 1155 1160 1165 Ser Asp HI? Glu Ser Asp Thr Leu Thr He Asp Val Ser Ala He Ser 1170 1175 1180 Asn Leu He Arg Lys His Val Ser Glu Ala Arg Leu Val Glu Asp He 1185 1190 1195 1200 Gly His Glu Leu Thr Tyr Val Leu Pro Tyr Glu Ala Ala Lys Glu Gly 1205 1210 1215 Ala Phe Val Glu Leu Phe His Glu He Asp Asp Arg Leu Ser Asp Leu 1220 1225 1230 Gly He Ser Ser Tyr Gly He Ser Glu Thr Thr Leu Glu Glu He Phe 1235 1240 1245 Leu Lys Val Ala Glu Glu Ser Gly Val Asp Ala Glu Thr Ser Asp Gly 1250 1255 1260 Thr Leu Pro Ala Arg Arg Asn Arg Arg Ala Phe Gly Asp Lys Gln Ser 1265 1270 1275 1280 Cys Leu Arg Pro Phe Thr Glu Asp Asp Ala Ala Asp Pro Asn Asp Ser 1285 1290 1295 Asp He Asp Pro Glu Ser Arg Glu Thr Asp Leu Leu Ser Gly Met Asp 1300 1305 1310 a/?Sb.~*Jí?m iVi?tt¿&* t*.

Gly Lys Gly Ser Tyr Gln Val Lys Gly Trp Lys Leu Thr Gln Gln Gln 1315 1320 1325 Phe Val Ala Leu Leu Trp Lys Arg Leu Leu He Ala Arg Arg Ser Arg 1330 1335 1340 Lys siy Phe Phe Ala Gln He Val Leu Pro Ala Val Phe Val Cys He 1345 1350 1355 1360 Ala Leu Val Phe Ser Leu He Val Pro Pro Phe Gly Lys Tyr Pro Ser 1365 1370 1375 Leu Glu Leu Gln Pro Trp Met Tyr Asn Glu Gln Tyr Thr Phe Val Ser 1380 1385 1390 Asn Asp Ala Pro Glu Asp Thr Gly Thr Leu Glu Leu Leu Asn Ala Leu 1395 1400 1405 Thr Lys Asp Pro Gly Phe Gly Thr Arg Cys Met Glu Gly Asn Pro He 1410 1415 1420 Pro Asp Thr Pro Cys Gln Ala Gly Glu Glu Glu Trp Thr Thr Ala Pro 1425 1430 1435 1440 Val Pro Gln Thr He Met Asp Leu Phe Gln Asn Gly Asn Trp Thr Met 1445 1450 1455 Gln Asn Pro Ser Pro Ala Cys Gln Cys Ser Ser Asp Lys He Lys Lys 1460 1465 1470 Met Leu Pro Val Cys Pro Pro Gly Ala Gly Gly Leu Pro Pro Pro Gln 1475 1480 1485 Arg Lys Gln Asn Thr Ala Asp He Leu Gln Asp Leu Thr Gly Arg Asn 1490 1495 1500 He Ser Asp Tyr Leu Val Lys Thr Tyr Val Gln He He Ala Lys Ser 1505 1510 1515 1520 Leu Lys Asn Lys He Trp Val Asn Glu Phe Arg Tyr Gly Gly Phe Ser 1525 1530 1535 Leu Gly Val Ser Asn Thr Gln Ala Leu Pro Pro Ser Gln Glu Val Asn 1540 1545 1550 Asp Ala He Lys Gln Met Lys Lys His Leu Lys Leu Ala Lys Asp Ser 1555 1560 1565 Ser Ala Asp Arg Phe Leu Asn Ser Leu Gly Arg Phe Met Thr Gly Leu 1570 1575 1580 Asp Thr Arg Asn Asn Val Lys Val Trp Phe Asn Asn Lys Gly Trp His 1585 1590 1595 1600 Ala He Ser Ser Phe Leu Asn Val He Asn Asn Ala He Leu Arg Ala 1605 1610 1615 , sn Leu Gln Lys Gly Glu Asn Pro Ser His Tyr Gly He Thr Ala Phe 1620 1625 1630 Asn His Pro Leu Asn Leu Thr Lys Gln Gln Leu Ser Glu Val Ala Leu 1635 1640 1645 Met Thr Thr Ser Val Asp Val Leu Val Ser He Cys Val He Phe Ala 1650 1655 1660 Met Ser Phe Val Pro Ala Ser Phe Val Val Phe Leu He Gln Glu Arg 1665 1670 1675 1680 Val Ser Lys Ala Lys His Leu Gln Phe He Ser Gly Val Lys Pro Val 1685 1690 1695 He Tyr Trp Leu Ser Asn Phe Val Trp Asp Met Cys Asn Tyr Val Val 1700 1705 1710 Pro Ala Thr Leu Val He He He Phe He Cys Phe Gln Gln Lys Ser 1715 1720 1725 Tyr Val Ser Ser Thr Asn Leu Pro Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu 1730 1735 1740 Tyr Gly Trp Ser He Thr Pro Leu Met Tyr Pro Ala Ser Phe Val Phe 1745 1750 1755 1760 Lys He Pro Ser Thr Ala Tyr Val Val Leu Thr Ser Val Asn Leu Phe 1765 1770 1775 He Gly He Asn Gly Ser Val Ala Thr Phe Val Leu Glu Leu Phe Thr 1780 1785 1790 Asp Asn Lys Leu Asn Asn He Asn Asp He Leu Lys Ser Val Phe Leu 1795 1800 1805 He Phe Pro His Phe Cys Leu Gly Arg Gly Leu He Asp Met Val Lys 1810 1815 1820 Asn Gln Ala Met Ala Asp Ala Leu Glu Arg Phe Gly Glu Asn Arg Phe 1825 1830 1835 1840 Val Ser Pro Leu Ser Trp Asp Leu Val Gly Arg Asn Leu Phe Ala Met 1845 1850 1855 Ala Val slu Gly Val Val Phe Phe Leu He Thr Val Leu He Gln Tyr 1860 1865 1870 Arg Phe Phe He Arg Pro Arg Pro Val Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu 1875 1880 1885 Asn Asp Glu Asp Glu Asp Val Arg Arg Glu Arg Gln Arg He Leu Asp 1890 1895 1900 Gly Gly Gly Gln Asn Asp He Leu Glu He Lys Glu Leu Thr Lys He 1905 1910 1915 1920 Tyr Arg Arg Lys Arg Lys Pro Ala Val Asp Arg He Cys Val Gly He 1925 1930 1935 Pro Pro Gly Glu Cys Phe Gly Leu Leu Gly Val Asn sly Ala sly Lys 1940 1945 1950 Ser Ser Thr Phe Lys Met Leu Thr sly Asp Thr Thr Val Thr Arg Gly 1955 1960 1965 Asp Ala Phe Leu Asn Lys Asn Ser He Leu Ser Asn He His Glu Val 1970 1975 1980 His Gln Asn Met Gly Tyr Cys Pro Gln Phe Asp Ala He Thr Glu Leu 1985 1990 1995 2000 Leu Thr Gly Arg Glu His Val Glu Phe Phe Ala Leu Leu Arg Gly Val 200S 2010 2015 Pro Glu Lys Glu Val Gly Lys Val Gly Glu Trp Ala He Arg Lys Leu 2020 2025 2030 Gly Leu Val Lys Tyr Gly Glu Lys Tyr Ala Gly Asn Tyr Ser Gly Gly 2035 2040 2045 Asn Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Met Ala Leu He Gly Gly Pro Pro 2050 2055 2060 Val Val Phe Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Met Asp Pro Lys Ala Arg 2065 2070 2075 2080 Arg Phe Leu Trp Asn Cys Ala Leu Ser Val Val Lys Glu Gly Arg Ser 2085 2090 2095 Val Val Leu Thr Ser His Ser Met Glu Glu Cys Glu Ala Leu Cys Thr 2100 2105 2110 Arg Met Ala He Met Val Asn Gly Arg Phe Arg Cys Leu Gly Ser Val 2115 2120 2125 Gln His Leu Lys Asn Arg Phe Gly Asp Gly Tyr Thr He Val Val Arg 2130 2135 2140 He Ala Gly Ser Asn Pro Asp Leu Lys Pro Val Gln Asp Phe Phe Gly 2145 2150 2155 2160 Leu Ala Phe Pro Gly Ser Val Leu Lys Glu Lys His Arg Asn Met Leu 2165 2170 2175 Gln Tyr Gln Leu Pro Ser Ser Leu Ser Ser Leu Ala Arg He Phe Ser 2180 2185 2190 He Leu Ser Gln Ser Lys Lys Arg Leu His He Glu Asp Tyr Ser Val 2195 2200 2205 Ser Gln Thr Thr Leu Asp sin Val Phe Val Asn Phe Ala Lys Asp Gln 2210 2215 2220 Ser Asp Asp Asp His Leu Lys Asp Leu Ser Leu His Lys Asn Gln Thr 2225 2230 2235 2240 Val Val Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Phe Leu Gln Asp Glu Ly3 Val 2245 2250 2255 Lys Glu Ser Tyr Val 2260 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> <220> <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de amplificación ABC1 <400> 11 cctctcatta cacaaaaacc agac 24 <210> 12 <211> 23 <212 DNA < 13> Secuencia Artificial -220 <220> <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de amplificación ABC1 <400> 12 gctttctttc acttctcatc ctg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador ABC1 RT-PCR <400> 13 cccttgggtt caggggatta tc 22 210> 14 <211> 21 212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador ABCl RT-PCR <400> 14 caatgttttt gtggcttcgg c 21 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220 <223> Descripción de ia Secuencia Artificial: cebador ABCl RT-PCR fratta^adat^ <400> 15 agtcgagctc caaacatgtc agctgttact ggaagtggcc 40 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213 Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador ABCl RT-PCR <400> 16 tctctggatt ctgggtctat gtcag 25 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador ABCl RT-PCR <400> 17 gggagccttt gtggaactct tt 23 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220 > <220 > <223 Descripción de la Secuencia Artificial: cebador ABCl RT-PCR <400> 18 actggtcgac cattgaattg cattgcattg aatagtatca g 41 <210 19 <211? 19 <212> DNA <213 Secuencia Artificial <220 > <220 > <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 < 400 > 19 tttcctggtg gacaatgaa 19 <210> 20 «-211.» 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400 20 agtgacatgc gacaggag 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 400> 21 gatctggaag gcatgtgg 18 <210> 22 <211> 13 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 Descripción die la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 22 ccaggcagca ttgagctg 18 <210> 23 <211> 18 c212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> 2 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 23 ggcctggaca acagcata 18 210> 24 <211.-. 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 24 ggacaacctg tttgagagt 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA < 213 > secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 25 aagacgacca ccatgtca 18 <210> 26 <211 18 <212> DNA < 213 > Secuencia Artificial <220 > <220 > <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 26 atatgggagc tgctgctg 8 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <2i3 > Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 27 gggcatgagc tgacctatgt gctg 24 <=210> 28 <211> B <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 28 aagagactgc taattgcc 18 <210> 29 <211> 18 c212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 29 agcgacaaaa tcaagaag 1S <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> <220 > <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400 > 30 tggcatgcaa tcagctct 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> <220> = 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 31 tcctccacca atctgcct 18 :210> 32 <211> 18 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciacjón ABC1 <400> 32 ttcttcctca ttactgtt 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <: 213 > Secuencia Artificial <220> <220> <223 Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 33 gatgccatca cagagctg 18 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 34 agtgtccagc atctaaa 17 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <2i3 > Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 35 caaagttcac aaatactt 18 :2I0=. 36 :211> 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 36 cttagggcac aattccaca 19 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400= 37 tgaaagttga tgattttc 18 <210> 38 <211> 19 ^ <212> DNA <213> Secuencia Artificial :220: <220> ;223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 38 tttttcacca tgtcgatga 19 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 39 ctccactgat gaactgc 17 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213 Secuencia Artificial <220> <220> :223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 40 gtttcttcat ttgtttga 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 41 agggcgtgtc tgggattg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial :220: <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 42 cagaatcatt tggatcag 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de ia Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 43 catcagaact gctctgag 18 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial :220 <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 44 agctggcttg ttttgcttt 19 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 220> <220> -223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 45 tggacacgcc cagcttca 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> :223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 46 cctgccatgc cacacaca 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 47 ctcatcaccc gcagaaag 18 <210> 48 <211 18 <212> DNA < 213 > Secuencia Artificial :220: <220> :223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 48 cacactccat gaagcgag 18 <210> 49 <211> 18 <212 DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 49 tccagataat gcgggaaa 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <220> :223 Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 50 tcaggattgg cttcagga 18 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial .220: <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de secuenciación ABC1 <400> 51 aagtttgagc tggatttctt g 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial : <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: beta-globina oligonocleótido de antisentido <400> 52 cctcttacct cagttacaat ttata 25 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: oligonocleótido de antisentido ABC1 <400> 53 catgttgttc atagggtggg tagctc 26 <210> 54 211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> < 220 > <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: beta-actina cebador de amplificación ABC1 <400> 54 tcacccacac tgtgccatct acga 24 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: beta-actina cebador de amplificación ABC1 <400> 55 cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> < 220 > < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: de elemento de respuesta al esterol oligonucleótido < 400 56 tcgagtgacc gatagcaacc tctcga 26 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213 > Secuencia Artificial <220> <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: de elemento de respuesta al esterol oligonucleótido mutado < 400 > 57 tcgagctgca catagtaacc tctcga 26

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende la SEC. DE IDENT. NO: 3. 2. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643 o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO: 3. 3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polinucleótido comprende los nucleótidos 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO: 3. 4. El polinucleótido aislado que hibridiza bajo condiciones rigurosas al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 5. El polinucleótido aislado que hibridiza bajo condiciones rigurosas al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 6. El polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos 80% idéntica al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 7. El polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos 80% idéntica al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 8. El polinucleótido aislado que es complementario al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 9. El polinucleótido aislado que es complementario al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 10. La composición, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 y un portador adecuado. 11. La composición, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, y un portador adecuado. 12. El vector recombinante, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 13. El vector recombinante, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 14. La célula huésped, caracterizada porque comprende el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 12. 15. La célula huésped, caracterizada porque comprende el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 13. 16. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende además por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo. 17. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende además por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo. 18. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque tal polipéptido heterólogo se selecciona a partir del grupo que consiste de luciferasa, ß- galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa transferasa, y proteína fluorescente verde. 19. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque tal polipéptido heterólogo 5 es luciferasa. 20. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tal vector es pAPR1. 21. Un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero, 10 caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto mamífero por lo menos un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol incrementada a partir de tales células. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, 15 caracterizado porque el ligando se selecciona a partir del grupo que consiste de los ligandos LXR, RXR, PPAR, FXR, y SXR. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque tal ligando LXR se selecciona a partir del grupo que consiste de 20(S) hidroxicolesterol, 22(R) 20 hidroxicolesterol, 24(S) hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, y 24(S), 25 epoxicolesterol. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque tal ligando es 20(S) hidroxicolesterol. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, 25 caracterizado porque tal ligando RXR se selecciona a partir del ~-frT*~?trtiFÍÉÍfcÍti grupo que consiste de ácido 9-c/s retinoico, retinol, retinal, ácido retinoico todo trans, ácido 13-cs retinoico, acitretin, fenretinida, etretinato, CD 495, CD564 TTNN, TTNNPB, TTAB, LGD 1069. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque tal ligando es ácido 9-c/s retinoico. 27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque por lo menos dos ligandos se administran al sujeto mamífero. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el incremento de emanación de colesterol es por lo menos 25 veces relativo al nivel de emanación de colesterol con cualquier ligando solo. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque los ligandos son 20(S) hidroxicolesterol y ácido 9-c/s retinoico. 30. Un método adecuado para incrementar la emanación de colesterol a partir de células de un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar al sujeto mamífero un eícosanoide en una cantidad suficiente para incrementar la emanación de colesterol en tales células. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque tal eicosanoide se selecciona a partir del grupo que consiste de prostaglandina E2, prostaciclina 12, y prostaglandina J2. 32. Un método adecuado para incrementar la expresión de ABC1 en las células de un sujeto mamífero que comprende la etapa de administrar a tal sujeto mamífero un ligando para un receptor nuclear en una cantidad suficiente para incrementar la expresión de ABC1 en tales células. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el ligando se selecciona a partir del grupo que consiste de los ligandos LXR, RXR, PPAR, FXR, y SXR. 34. Un método para tamizar un compuesto de prueba para la expresión ABC1 que modula la actividad, caracterizado porque comprende las etapas de: enlazar operativamente un ADNc reportero con una porción que modula la expresión del gen ABC1 de mamífero para producir una construcción reportera recombinante; transfectar la construcción reportera recombinante en una población de células huéspedes; ensayar los niveles del gen de expresión reportero en una muestra de las células huéspedes; poner en contacto las células huéspedes con el compuesto de prueba siendo tamizado; ensayar el nivel del gen de expresión reportero en una muestra de las células huéspedes después del contacto con el compuesto de prueba; y comparar el cambio relativo en el nivel del gen de expresión reportero provocado por la exposición al compuesto de prueba, por lo que determina la actividad que modula la expresión ABC1. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la expresión que modula la porción del gen ABC1 es la región de flanqueo 5'. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la región de flanqueo 5' comprende la SEC. DE IDENT. NO: 3. 37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la región de flanqueo comprende un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1-1532, 1080-1643, 1181-1643, 1292-1643, 1394-1643, o 1394-1532 de la SEC. DE IDENT. NO: 3. 38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el ADNc reportero se selecciona a partir del grupo que consiste de luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol, acetil transferasa, y ADNc de proteína fluorescente verde. 39. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la célula huésped es una célula de mamífero. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la construcción reportera recombinante es pAPRL 41. Un equipo adecuado para tamizar un compuesto para determinar la actividad que modula la expresión ABC1 del compuesto comprende una construcción reportera recombinante * " ' '- •*• aj t ^ que comprende un ADNc reportero operativamente enlazado a una porción que modula la expresión del gen ABC1 de mamífero en una cantidad suficiente por al menos un ensayo e instrucciones para uso. 42. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 43. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la expresión que modula la porción del gen ABC1 de mamífero comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 44. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el ADNc reportero se selecciona a partir del grupo que consiste de luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, y ADNc de proteína fluorescente verde. 45. El equipo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el ADNc reportero es un ADNc de luciferasa. 46. El equipo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el ADNc reportero es un ADNc de luciferasa. 47 El equipo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la construcción reportera recombinante es pAPRL 48. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque comprende medios para detectar el gen evaluador. 49. Un método para identificar genes que son responsables de una anormalidad heredada, caracterizado porque comprende las etapas de: a. obtener una primera muestra de ARN a partir de un primer individuo con la anormalidad; b. obtener una segunda muestra de ARN a partir de un segundo individuo normal; c. preparar el ARNm a partir de una primera muestra de ARN para dar una primera muestra de ARNm; d. preparar el ARNm a partir de la segunda muestra de ARN para dar una segunda muestra de ARNm; e. preparar una primera muestra de ADNc marcada por transcripción inversa a la primera muestra de ARNm; f. preparar una disposición de expresión de gen a partir de la primera muestra de ADNc marcada; g. preparar una segunda muestra de ADNc marcada por transcripción inversa a la segunda muestra de ARNm; h. preparar una disposición de expresión de gen a partir de la segunda muestra de ADNc marcada; y i. sondear la primera disposición de expresión de gen a partir de la primera muestra de ADNc marcada y sondear la segunda disposición de expresión de gen de la segunda muestra de ADNc marcada e identificar las variaciones en expresión de gen entre el ARN que corresponde a la primera muestra de ADNc y el ARN correspondiente a la segunda muestra de ADNc. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque las diferencias entre el ARN que corresponde a la primera muestra de ADNc y ARN correspondiente a la segunda muestra de ADNc se analizan para identificar una propiedad seleccionada a partir del grupo que consiste del primer ARN que se sobreexpresa en comparación con el segundo ARN, el primer ARN que se subexpresa en comparación con el segundo ARN, el primer ARN que está ausente en comparación con el segundo ARN, y el primer ARN que está presente en comparación con el segundo ARN. 51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la anormalidad es una anormalidad negativa. 52. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el individuo es un mamífero. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el mamífero es un humano. 54. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque por lo menos una variación entre el ARN que corresponde a la primera muestra de ADNc y el ARN que corresponde a la segunda muestra de ADNc se evalúa para determinar si esto contribuye a la anormalidad. tU.?r?- ,tt.-?.rl.ti...;.r, . aeytSSU 55. E l método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la tercera muestra de ARN se obtiene a partir de un tercer individuo que tiene la misma anormal idad como el primer ind ividuo y el método de las etapas (a)-(g) se repiten sustituyendo la tercera muestra de ARN para la primera muestra de ARN y comparando las diferencias entre el primero y el segundo y el segundo y el tercero y para identificar las diferencias de la expresión del gen que son comunes en los individuos anormales. •/*~ — - - •-*•* • -a^-J* " - La presente invención se refiere a polipéptidos novedosos ABC1 y moléculas de ácidos nucleicos que codifican a los mismos. La invención también se refiere a 5 vectores recombinantes, células huésped y composiciones que comprenden polinucleotidos ABC1 , así como a los métodos de producción de polipéptidos ABC1. La invención también se refiere a anticuerpos que se enlazan específicamente a polipéptidos ABC1. Además, la invención se refiere a métodos para incrementar el eflujo de colesterol, así como a los métodos para incrementar la actividad y la 10 expresión ABC1. La presente invención además se relaciona con los métodos para identificar compuestos que modulan la expresión de ABC1 y con los métodos para detectar el nivel comparativo de polipéptidos ABC1 y polinucleotidos en un sujeto mamífero. La presente invención también proporciona equipos y composiciones adecuados para el análisis en pantalla de compuestos para determinar la actividad 15 de modulación de la expresión ABC1 del compuesto, así como equipos y ~¿— —— —,. . . . . ., ^ .^^.aa^ ..„.. composiciones adecuados para determinar si un compuesto modula el eflujo de colesterol dependiente de ABC1. ^_^_^&?