JP2003506097A - Ａｔｐ結合カセット輸送体蛋白質ａｂｃ１を用いるコレステロール流出を増加させｈｄｌを上昇させるための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規なＡＢＣ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子に関する。また、本発明は、組換えベクター、宿舎細胞、およびＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにＡＢＣ１ポリペプチドを生産する方法に関する。また、本発明は、ＡＢＣ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、コレステロール流出を増加させる方法ならびにＡＢＣ１の発現および活性を増加させる方法に関する。本発明は、さらに、ＡＢＣ１の発現を変調する化合物を同定する方法ならびに哺乳動物対象においてＡＢＣ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの比較レベルを検出する方法に関する。また、本発明は、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットおよび組成物、ならびに化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを判断するのに適したキットおよび組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年６月１８日に出願された米国仮出願番号６０／１４０、
２６４；１９９９年９月１４日に出願された米国仮出願番号６０／１５３、８７
２；および１９９９年１１月１９日に出願された米国仮出願番号６０／１６６、
５７３に対する優先権を主張する。

【０００２】 （発明の技術分野） 本発明は、新規ＡＢＣ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子に関す
る。また、本発明は組換えベクター、宿主細胞、およびＡＢＣ１ポリヌクレオチ
ドを含む組成物、ならびにＡＢＣ１ポリペプチドを生産する方法に関する。また
、本発明はＡＢＣ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。加えて、本
発明は、コレステロール流出を増加させる方法ならびにＡＢＣ１発現および活性
を増加させる方法に関する。本発明は、さらに、ＡＢＣ１の発現を変調する化合
物を同定する方法および哺乳動物対象においてＡＢＣ１ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドの比較レベルを検出する方法に関する。また、本発明は、化合物の
ＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適した
キットおよび組成物、ならびに化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を
変調するか否かを判断するのに適したキットおよび組成物を提供する。

【０００３】 （本発明の背景） ヒトの血漿またはリンパ液中の循環脂質はコレステロール、コレステリルエス
テル、トリグリセリドおよびリン脂質よりなる。これらの脂質はリポ蛋白質と呼
ばれる大きな分子複合体中で輸送され、これはコレステリルエステルおよび／ま
たはトリグリセリドのコア、リン脂質および遊離コレステロールのエンベロープ
、アポリポ蛋白質よりなる（Ｓｃｒｉｖｅｒら．，編集．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅ
ｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， 第７版，ｐ．１８４１−１８５１（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ
ｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５））。アポリポ蛋白質は、リポ蛋白質の組み
立ておよび分泌、ならびにレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（
ＬＣＡＴ）のごときリポ蛋白質修飾酵素の活性化に関与する。加えて、アポリポ
蛋白質は構造的一体性を提供し、それは大きなスペクトルの受容体に対するリガ
ンドおよび膜ドッキング蛋白質である。血漿リポ蛋白質はサイズに従って５つの
タイプに分けられる：キロミクロン（サイズが最大であって密度は最低）、超低
密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低密度リポ蛋白質
（ＬＤＬ）および高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）。

【０００４】 キロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬは外因性および内因性コレステ
ロールおよびトリアシルグリセロールを末梢部位に輸送し、そこで、脂質は種々
の代謝経路で役割を果たし、細胞膜の主要な構成要素として働く。キロミクロン
は、ダイエットコレステロールおよびトリアシルグリセロールを種々の組織に輸
送する手段として腸粘膜で組み立てられる。ＶＬＤＬは肝臓で形成されて、肝臓
によって合成された内因性コレステロールおよびトリアシルグリセロールを筋肉
および志望組織のごとき肝臓外組織に輸送する。ＶＬＤＬは１０−１５％の合成
血清コレステロールおよび殆どのトリグリセリロを含有する。循環においては、
ＶＬＤＬはリポ蛋白質リパーゼの作用を介してＬＤＬに変換される。ＬＤＬはす
べての組織への送達のためのコレステロールの主要な血漿キャリアであり、典型
的には、６０−７０％の合計絶食血清コレステロールを含有する。

【０００５】 対照的に、ＨＤＬは「逆コレステロール輸送」、過剰のコレステロールが末梢
部位から肝臓に輸送されて戻され、そこでそれが胆汁塩の形態で分泌される経路
に関与する（Ｇｌｏｍｓｅｔ， Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，９，１
５５−１６７（１９６８））。生じたばかりのＨＤＬは、コレステロールおよび
コレステロールエステルを欠いた蛋白質が豊富なディスク−形状粒子として肝臓
および小腸出ｄｅ ｎｏｖｏにて合成される。事実、ＨＤＬの主要な機能はアポ
リポ蛋白質、主としてアポＣ−Ｉ、アポＣ−ＩＩおよびアポＥの循環貯蔵として
作用する。生じたばかりのまたは蛋白質が豊富なＨＤＬは、細胞源から得られた
コレステリルエステルの蓄積を通じて球状リポ蛋白質粒子に変換される。ＨＤＬ
は、通常、２０−３０％の合計絶食血清コレステロールを含有する。

【０００６】 現在の理論によると、細胞コレステロールのＨＤＬへの逆流出は２つのメカニ
ズムによって媒介される：水性拡散経路およびアポリポ蛋白質媒介経路を通じて
媒介される。これらの区別できるメカニズムの相対的重要性は細胞型および代謝
状態に依存する（Ｏｒａｍら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７：２７４３−
２４９１（１９９６）；Ｒｏｔｈｂｌａｔら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４
０：７８１−７９６（１９９９）；Ｓｔｅｉｎら．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏ
ｓｉｓ，１４４：２８５−３０１（１９９９））。多くの細胞では、水性拡散経
路は、それを通ってコレステロール流出が起こる主要な経路である（Ｊｈｏｎｓ
ｏｎら，Ｄｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１０８５：２９３−
２９８（１９９１））。この経路は、受動輸送のプロセスを通じる細胞外スペー
スにおいて、細胞膜およびリポ蛋白質受容体の間のコレステロールの二方向性交
換を含む（Ｒｅｍａｌｅｙ ら．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ
．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１７：１８１３−１８２１（１９９７）；Ｒｏｔｈｂ
ｌａｔら．，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．，４０：７８１−７９６（１９９９）。該交
換は小胞として知られた表面マイクロドメインとして主として起こり得る。（Ｆ
ｉｅｌｄｉｎｇら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３４：１４２９２ ９１９
９５））。ＬＣＡＴの作用による細胞外区画におけるコレステロールのコレステ
リエステルの変換によって正味の流出は駆動できる。

【０００７】 あるいは、マクロファージおよび繊維芽細胞において、コレステロールおよび
リン脂質流出は、主として、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩおよびアポＥのごときア
ポリポ蛋白質を通じて媒介される（Ｒｅｍａｌｅｙ，ｓｕｐｒａ（１９９７）；
Ｆｒａｎｃｉｓ，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７８−８７（１９
９５）； Ｖｅｇａら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２２６：５−１５（１９
８９）； Ｓａｋａｒら．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， １
４３８：８５−９８（１９９９）；Ｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６６：３０８０−３０８６（１９９１）；Ｆｉｌｅｄｉｎｇら．，Ｊ．Ｌｉｐｉ
ｄ Ｒｅｓ．，３８，１５０３−１５２１（１９９７）；Ｏｒａｍら．，Ｊ．Ｌ
ｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７，２７４３−２４９１（１９９６））。アポリポ蛋白
質−媒介脂質流出のプロセスは、それがコレステロールが負荷されたおよび／ま
たは成長が阻止された場合にマクロファージおよび他のスカベンジャー細胞にお
いて特に支配的である。アポリポ蛋白質−媒介流出は、アポリポ蛋白質と細胞表
面との直接的相互作用、アポリポ蛋白質の脂質化、および細胞からの脂質−アポ
リポ蛋白質粒子の引き続いての解離を必要とする活性な輸送プロセスである（Ｏ
ｒａｍ， ｓｕｐｒａ（１９９６）；Ｍｅｎｄｅｚ， Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｌｉｐｉ
ｄ Ｒｅｓ．，３８，１８０７−１８２１（１９９７）；Ｒｅｍａｌｅｙ， ｓ
ｕｐｒａ（１９９８）；Ｍｅｎｄｅｚ， Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．
，３７，２５１０−２５２４（１９９６））。一旦細胞から除去されると、コレ
ステロールがリッチはＨＤＬ粒子が肝臓に輸送され、記載されたごとく身体から
除去される。

【０００８】 遺伝的欠陥に由来するまたはもう１つの障害の二次的効果としての異常リポ蛋
白質機能および／または代謝は深刻な生物学的結果を有しかねない。ダイエット
影響に加えて、糖尿病、甲状腺機能低下および肝臓病のごとき障害の結果、上昇
した血漿レベルのＬＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリロが得られる。上
昇したレベルのＬＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリドは、米国および他
の産業化国家において死亡の主な原因である冠心臓病の発生率と関連する主要な
危険因子として同定されてきた（Ｈｏｋａｎｓｏｎら．，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａ
ｓｃ．Ｒｉｓｋ．，３：２１３−２１９（１９９６）；Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｔ
Ｐａｎｅｌ， ＪＡＭＡ， ２６９：３０１５−３０２３（１９９３））。動脈
壁への過剰ＬＤＬ−コレステロールの蓄積はアテローム性動脈硬化症プラークの
形成に至りかねず、これは心臓病の発生で主な役割を果たす。プラークは、動脈
壁から放出されたフリーラジカルがＬＤＬを酸化する場合に形成されると信じら
れている。理論によると、ＬＤＬの酸化された形態は炎症反応をトリガーし、循
環する細胞を、脂質プラークの形成に寄与する部位に引き寄せる。これらの中に
は、マクロファージおよびコレステロールを調節されない様式で蓄積するスカベ
ンジャー受容体を含有する他の細胞がある（Ｂｒｏｗｎら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ
． Ｂｉｏｃｈｅｎ．，５２：２２３−２６１（１９８６））。内部コレステロ
ールの膨大な貯蔵の結果、フォーム細胞表現型への変換が起こり、これは血管病
巣の発生に対する主要は寄与者であると考えられる。プラークが形成されるに従
い、動脈壁は収縮し、心臓への血流を低下させる。

【０００９】 しかしながら、興味深いことには、推定６０％の心臓発作が、上昇した血中レ
ベルのＬＤＬ−コレステロールを有しない人で起こる。これらの内、推定４５％
が平均血中レベル未満のＨＤＬ−コレステロールに関連しており、これは、低Ｈ
ＤＬ−コレステロールレベルが冠心臓病についての有意は危険因子であることを
示す。事実、最近の研究は、低下したＨＤＬ−コレステロールレベルが、未成熟
冠動脈病を持つ患者で観察された最も普通のリポ蛋白質異常性であることを示し
ている（Ｇｅｎｅｓｔ Ｊ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ８５：２０２５−２
０３３（１９９２）；Ｇｅｎｅｓｔら．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏ
ｍｂ．，１３：１７２８−１７３７（１９９３））。ＨＤＬ−コレステロールお
よび冠心臓病の間の逆関連についての基礎はよく理解されていないが、ＨＤＬの
心臓保護役割は、アテローム性動脈硬化病病巣におけるマクロファージフォーム
細胞からのコレステロール流出の促進に関連するその活性に由来し得ることを示
唆した。

【００１０】 低ＨＤＬと関連する心血管病の１つの例はタンジール病（ＴＤ）であり、これ
は、循環ＨＤＬの殆どまたは完全な不存在によって特徴付けられるまれな遺伝障
害である。ほとんどゼロの血漿レベルのＨＤＬに加え、ＴＤを持つ患者は扁桃、
リンパ節、肝臓、脾臓、胸腺、腸および手腕細胞を含めたいくつかの組織におい
てコレステリルエステルの大量の沈積および蓄積を有する（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ
ｏｎ， Ｄ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４３−２２８−２３６（１
９６４）；Ａｓｓｍａｎｎら．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏ
ｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， （ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５））。細胞メカニズムは従前に同定されていないが
、最近の実験は、ＴＤを持つ対象からの細胞が、コレステロールおよびリン脂質
のアポリポ蛋白質−媒介除去のプロセスで欠けていることを示した（Ｒｅｍａｌ
ｅｙら．，Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ，
１７，１８１３−１８２１（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ
， Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，７８−８７（１９９５）；Ｒｏｇｌｅｒら．，Ａｒ
ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１５， ６８
３−６９０（１９９５））。これらの結果は、ＴＤ患者におけるひどいＨＤＬ欠
乏が生じたばかりのアポＡ−Ｉが脂質を獲得できないことに由来する。彼らは脂
質リッチな粒子に成熟しないので、ＴＤ患者における生じたばかりのＨＤＬは迅
速に異化され、血漿から除去され、殆どゼロレベルの循環ＨＤＬが得られる（Ｒ
ｅｍａｌｅｙ ｓｕｐｒａ（１９９７）； Ｆｒａｎｃｉｓ， ｓｕｐｒａ（１
９９５）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１７
４３−１７５２（１９９３）；Ｓｃｈａｅｆｅｒら．，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．，
２２：２１７−２２８（１９８１））。

【００１１】 減少したＨＤＬ−コレステロールレベルに由来する冠心臓病に対する未成熟ア
テローム性動脈硬化症および高い危険に関連する他の障害は低アルファリポ蛋白
質血症および家族性ＨＤＬ不足症候群（ＦＨＡ）である。これらの障害を持つ人
々は、しばしば、正常なＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドレベルを有
する。加えて、糖尿病、アルコール依存症、甲状腺機能低下症、肝臓病および上
昇した血圧のごとき障害の結果、減少したＨＤＬ−コレステロールの血症レベル
がもたらされるが、これらの障害の多くは上昇したＬＤＬ−コレステロールおよ
びトリグリセリドレベルが伴う。

【００１２】 冠心臓病についての現在の治療は、主として、ＬＤＬ分泌または促進ＬＤＬタ
ーンオーバーを阻害することによってＬＤＬ−コレステロールの血症レベルを低
下させる目的でダイエット操作および／または薬物治療剤に焦点を合わせてきた
。クロフィブレート、ゲムフィルロジルおよびフェノフィブレートのごときフィ
ブリン酸の誘導体はリポ蛋白質リパーゼを活性化することによって迅速なＶＬＤ
Ｌターンオーバーを促進する。ニコチン酸は、肝臓ＶＬＤＬ分泌を阻害すること
によってＶＬＤＬおよびＬＤＬの血症レベルを低下させる。加えて、メブィノリ
ン、メバスタチン、プラブァスタチン、シムブァスタチン、フルブァチンおよび
ロバスタチンのごときＨＭＧ−ＣｏａＡレダクターゼ阻害剤は、ＬＤＬの細胞摂
取の増加を引き起こすコレステロールの細胞内構成を阻害することによって血漿
ＬＤＬレベルを低下させる。加えて、コレスチリン、コレスチポールおよびプロ
ブコールのごとき胆汁酸−結合樹脂は、肝臓中のＬＤＬ−コレステロールの異化
を増加させることによってＬＤＬ−コレステロールのレベルを減少させる。

【００１３】 しかしながら、これらの療法の多くは長期使用を妨げかねない低い効率および
／または副作用を伴う。例えば、ＨＭＧ−ＣｏａＡレダクターゼ阻害剤は毒性の
かなりの危険性を担う。なぜならば、それらは、コレステロールに加えて他の重
要なイソプレノイド化合物の合成に必要なメバロネートの合成を阻害するからで
ある。また、ゲムフィブロジルおよびニコチン酸は、腎臓損傷、筋肉障害、筋肉
グロビィン血症および許容されない皮膚の潮紅および掻痒を含めたひどい有害効
果を伴う。加えて、冠心臓病を持つ患者を治療するにおけるプロブコールの役割
は確かではない。なぜならば、その投与の結果、ＬＤＬ−コレステロールを低下
させる副作用としてより低いＨＤＬ−コレステロールレベルがもたらされるから
である。

【００１４】 さらに、単離された低いＨＬＤＬ−コレステロールレベルを有する患者の治療
は特に困難な治療挑戦を提供する。例えば、タンジール病を持つ患者は、たとえ
そのＬＤＬレベルばすでに約５０％だけ低下したにもかかわらず心血管病の４な
いし６倍増加を呈する。ゲムフィブロジルおよびニコチン酸が同時にＬＤＬレベ
ルを上昇させるという幾つかの証拠があるが、一般に血漿ＬＤＬ−コレステロー
ルレベルを低下させることを狙った療法は、減少したＨＤＬレベルの結果として
冠心臓病に悩むタンジール患者で効果的ではない。同様に、低いアルファリポ蛋
白質血症、家族性ＨＤＬ欠乏症候群、または低いレベルのＨＤＬに由来する他の
心血管病は、血漿ＬＤＬのレベルを低下させることを狙った療法から利益は受け
ない。

【００１５】 心血管病のための現在の療法に伴う問題は、部分的には、細胞内および細胞外
でのコレステロールの移動に関与する生物学は十分には理解されていないという
事実に由来する。さらに、コレステロール移動において役割を演じる蛋白質は十
分には知られていない。従って、コレステロール細胞生物学、ならびに心血管病
および高コレステロール血症を伴う他の障害に悩むヒトを治療する方法に対する
要求が依然としてある。加えて、心血管病を診断する新しい方法および心血管病
を発生する高い危険性があるものを同定するための患者をスクリーニングする新
しい方法に対する要望が依然としてある。

【００１６】 コレステロール輸送に関与する遺伝子および蛋白質の同定は、心臓病および高
コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症に関連する他の障害の治療用
医薬剤の開発で有用であろう。加えて、そのような遺伝子の同定は、コレステロ
ール輸送に関連する遺伝子の発現を調節する化合物につきスクリーニングするス
クリーニングアッセイの開発で有用であろう。そのような調節化合物の同定はさ
らなる治療剤の開発で有用であろう。さらに、コレステロール輸送に関与する遺
伝子および蛋白質の同定は、心血管病および高コレステロール血症を伴う他の障
害の診断インジケートとして有用であろう。

【００１７】 （本発明の要約） 本発明は、コレステロール流出に関与する新規なポリペプチドおよびポリヌク
レオチドを提供する。具体的には、本発明は、新規なＡＴＰ−結合カセット（Ａ
ＢＣ１）ポリペプチドおよびＡＢＣ１ポリペプチドをコードする新規なポリヌク
レオチドを提供する。用語「ＡＢＣ１」および「ＡＢＣＡ１」は、同一ＡＴＰ−
結合カセット蛋白質および遺伝子に対する別の名称である。本発明はＡＢＣ１ポ
リペプチド、ポリペプチド断片およびポリペプチド変種を提供する。１つの好ま
しい実施形態において、本発明は配列番号：２を含む単離されたポリペプチドを
提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に対
して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチ
ドを提供する。また、本発明はタンジール病患者からのＡＢＣ１ポリペプチドを
提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：８を含む単離
されたポリペプチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明
は配列番号：１０を含む単離されたポリペプチドを提供する。

【００１８】 加えて、本発明はＡＢＣ１ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片およびポ
リヌクレオチド変種を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、
配列番号：２を含むポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
を提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に
対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、他の好ましい実施形態に
おいて、本発明は、配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは配列
番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離され
たポリヌクレオチドを提供する。

【００１９】 もう１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：１を含む単離され
たＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供する。さらなる好ましい実施形態において、
本発明は、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含む単離されたポリ
ヌクレオチドを提供する。より好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：１
と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他のより好ましい
実施形態において、該ポリヌクレオチドを配列番号：１に対して少なくとも９６
％、９７％、９８％または９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また
、他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：１を含むポリヌクレオ
チドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、配列番号
：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレ
オチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、および配列番号：１と少なくと
も９０％同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに相補的
な単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２０】 また、本発明は、ＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域に対応するＡＢＣ１
ポリヌクレオチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は配列
番号：３を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。他の好ましい実施形態
において、本発明は、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８
１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含む単離され
たポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配
列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２を含む。もう１つの好ましい実施
形態において、本発明は、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに厳密な条件下
でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、他の好ま
しい実施形態において、本発明は、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１０
４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を
含むポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌク
レオチドを提供する。本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態において、配
列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有する単
離されたポリヌクレオチドが提供される。より好ましくは、該ポリヌクレオチド
は、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性を有
する。さらにより好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：３を含むポリヌ
クレオチドに対して少なくとも９５％同一性を有する。また、好ましい実施形態
において、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４
３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドに
対して少なくとも８０％同一性を有する単離されたポリヌクレオチドが提供され
る。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号：３のヌクレオチド１−１
５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、また
は１９３４−１５３２を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性
、なおより好ましくは９５％同一性を有する。加えて、本発明は、前記した５’
フランキングＡＢＣ１ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明
は、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単
離されたポリヌクレオチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、
本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１
１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１５３２を含むポリヌ
クレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提
供する。

【００２１】 また、本発明はＡＢＣ１遺伝子の３’フランキング領域に対応するＡＢＣ１ポ
リヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：
４、配列番号：５または配列番号：６を含む単離されたポリヌクレオチド、およ
びその相補的配列を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、配列
番号：４、配列番号：５、配列番号：６を含むポリヌクレオチドに厳密条件下で
ハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド、およびその相補的配列を提供
する。さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：４、配列番
号；５または配列番号：６を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同
一性を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、ポリヌ
クレオチドを、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含むポリヌク
レオチドに対して少なくとも９０％同一性を有する。なおより好ましくは、ポリ
ヌクレオチドは配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含むポリヌク
レオチドに対して少なくとも９５％同一性を有する。

【００２２】 加えて、本発明はタンジール病患者からのＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供す
る。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：８を含むポリペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する、もう１つの好ましい
実施形態において、本発明は配列番号：７を含む単離されたポリヌクレオチドを
提供する。さらにもう１つの実施形態において、本発明は配列番号：１０を含む
ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらにもう
１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：９を含む単離されたポ
リヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、記載されたポリヌクレオチドに
対する相補性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提
供する。

【００２３】 もう１つの態様において、本発明は、前記したポリヌクレオチドのいずれかお
よび適当な担体を含む組成物を提供する。１つの好ましい実施形態において、本
発明は、配列番号：２を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオ
チド、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９
１−７０７４を含むポリヌクレオチド、配列番号：２に対して少なくとも９８％
同一性を有するアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオ
チド、および適当な担体を含む組成物を提供する。もう１つの好ましい実施形態
において、組成物は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドと少なくとも９０％
同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当
な担体を含む。他の好ましい実施形態において、組成物は、配列番号：３を含む
単離されたポリヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、
１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４
−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。さらに
他の好ましい実施形態において、本発明は配列番号：３のポリヌクレオチドに厳
密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌク
レオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−
１６４３、１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドを含む組成物、ならびに
配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有する
ポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０
−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１５３
２を含むポリヌクレオチド、および適当な担体を含む組成物を提供する。また、
本発明によって提供されるのは、前記したポリヌクレオチドのいずれかに相補的
なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む
組成物である。

【００２４】 加えて、本発明は前記したＡＢＣ１ポリヌクレオチド配列のいずれかを含む組
換えベクターおよび宿主細胞を提供する。１つの好ましい実施形態において、本
発明は、配列番号：２を含むポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌク
レオチド、配列番号：１を含む単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１のヌ
クレオチド２９１−７０７４を含む単離されたポリヌクレオチド、または配列番
号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：１を含む
ポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一性、より好ましくは９５％同一性を有
するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。さらにもう１
つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：７または配列番号
：９を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明は、さらに、前記したポ
リヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレ
オチドを含む組換えベクターを提供する。さらにもう１つの好ましい実施形態に
おいて、組換えベクターは、前記したポリヌクレオチドのいずれかを含み、さら
に、異種プロモーターポリヌクレオチドを含む。１つの適当な異種プロモーター
はサイトメガロウイルスプロモーターである。特に好ましい実施形態において、
組換えベクターはｐＣＥＰｈＡＢＣ１である。

【００２５】 また、本発明は、ＡＢＣ１の５’フランキング配列を含む単離されたポリヌク
レオチドを含む組換えベクターを提供する。１つの好ましい実施形態において、
本発明は、配列番号：３を含む単離されたポリヌクレオチドまたは配列番号：３
のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２
９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチド
を含む組換えベクターを提供する。さらに、他の好ましい実施形態において、本
発明は、配列番号：３のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０
−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５
３２を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクター、ならびにこれらのポリヌク
レオチドにたいして少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチドを含む組
換えベクターを提供する。本発明は、さらに、前記したポリヌクレオチドのいず
れかに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換
えベクターを提供する。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベ
クターは記載されたポリヌクレオチドのいずれかを含み、さらに、異種ポリペプ
チドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。適当な異種ポリペ
プチドは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白質を含む。好
ましくは異種ポリペプチドはルシフェラーゼ蛋白質である。特に好ましい実施形
態において、組換えベクターはｐＡＰＲ１である。

【００２６】 加えて、本発明は前記した組換えベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供す
る。本発明は、さらに、前記した組換えベクターおよび適当な担体を含む組成物
を提供する。

【００２７】 また、本発明は哺乳動物宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を生産する方法なら
びに哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現する方法を提供する。哺乳動物
宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を生産する方法は、（ａ）検出可能なレベルの
ＡＢＣ１蛋白質を生産するのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチ
ドを含む組換え発現ベクターで哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、次いで
、（ｂ）生成したＡＢＣ１蛋白質を精製する工程を含む。哺乳動物対象において
ＡＢＣ１蛋白質を発現する方法は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現
するのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベ
クターを哺乳動物対象に投与する工程を含む。

【００２８】 加えて、本発明は、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させ
るのに適した組成物および方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては
、該方法は、細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量のＡＢＣ
１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを哺乳動物対象に投
与することを含む。適当は組換え発現ベクターは、配列番号：２を含むポリペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１を含む単離された
ポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含む単離さ
れたポリヌクレオチド、および配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を
有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ
ドを含むベクターを含む。好ましい発現ベクターは、ウイルスベクター、特にア
デノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを含む。他の実施形態にお
いて、本発明は、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ
複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ₄沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレー
ション、リポソームおよびリポフェクションを含めた非−ウイルス送達システム
を提供する。

【００２９】 もう１つの好ましい実施形態において、哺乳動物対象の細胞からのコレステロ
ール流出を増加させる方法は、細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させる治療量
の化合物を哺乳動物対象に投与することを含む。１つの適当な方法は、ｃＡＭＰ
アナログを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なｃＡＭＰアナログは８−
ブロモｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰ、および８−チオメチルｃＡＭＰを
含む。もう１つの適当な方法は、ｃＡＭＰの合成を増加させる化合物、例えば、
フォルスコリンを哺乳動物対象に投与することを含む。さらにもう１つの適当な
方法は、ホスホジエステラーゼ阻害剤のごときｃＡＭＰの分解を阻害する化合物
を哺乳動物対象に投与することを含む。適当なホスホジエステラーゼ阻害剤はロ
リプラム、テオフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Ｒ０２０−
１７２４、ビンポセチン、ザプリナスト、ジピリダモール、ミルリノン、アムリ
ノン、ピモベンダン、シロスタミド、エノキシモン、ペルオキシモンおよびベス
ナリノンを含む。

【００３０】 加えて、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるもう１つ
の適当な方法は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量の核受容体に対
する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なリ
ガンドはＬＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ、ＳＸＲおよびＰＰＡＲリガンドを含む。１つ
の好ましい実施形態において、該方法はＬＸＲ核受容体に対するリガンドを哺乳
動物対象に投与することを含む。適当なＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシ
コレステロール。、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキ
シコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、および２４（Ｓ），２５
エポキシコレステロールを含む。好ましくは、ＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒド
ロキシコレステロールである。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は
、ＲＸＲ核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当
なＲＸＲリガンドは９−シスレチノイン酸、レチノール、レチナール、全ての−
トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、アシトレチン、フェンレチニ
ド、エトレチネート、ＣＤ４９５、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴ
ＡＢ、およびＬＧＤ１０６９を含む。好ましくは，ＲＸＲリガンドは９−シスレ
チノイン酸である。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＰＰＡＲ
核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。１つの適当な
リガンドはチアゾリジンジオンのクラスから選択されるリガンドである。さらに
もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、核受容体に対する少なくとも
２つのリガンドを投与することを含む。特に好ましい実施形態において、リガン
ドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールおよび９−シスレチノイン酸である。

【００３１】 加えて、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるもう１つ
の適当な方法は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量のエイコサノイ
ドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なエイコサノイドはプロスタグラ
ンジンＥ２、プロスタグランジンＪ２、およびプロスタサイクリン（プロスタグ
ランジンＩ２）を含む。

【００３２】 もう１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物対象の細胞からのコレステ
ロール流出を増加させるのに十分な量のＡＢＣ１活性を増加させる化合物を哺乳
動物対象に投与することを特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加さ
せる方法を提供する。

【００３３】 また、本発明は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるの
に適した方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ
１の遺伝子発現を増加させるのに十分な量の核受容体に対する少なくとも１つの
リガンドを哺乳動物対照に投与することを含む。適当なリガンドはＬＸＲ、ＲＸ
Ｒ、ＦＸＲ、ＳＸＲおよびＤＰＡＲ核受容体に対するリガンドを含む。もう１つ
の好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるの
に十分な量のｃＡＭＰアナログを哺乳動物対象に投与することを含む。さらにも
う１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加さ
せるのに十分な量のｃＡＭＰの合成を増加させる化合物を哺乳動物対象に投与す
ることを含む。

【００３４】 加えて、本発明は、（ａ）レポーターｃＤＮＡを、哺乳動物ａｂｃ１遺伝子の
発現変調部分で作動可能に連結して、組換えレポーター構築体を生じさせ；（ｂ
）該組換えレポーター構築体を宿主細胞の集団にトランスフェクトし；（ｃ）宿
主細胞の試料中にてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；（ｄ）スクリ
ーニングすべきテスト化合物と宿主細胞を接触させ；（ｅ）テスト化合物との接
触の後に宿主細胞の試料中にてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；つ
いで、（ｆ）テスト化合物への暴露によって引き起こされたレポーター遺伝子発
現のレベルの相対的変化を比較し、それにより、ＡＢＣ１発現変調活性を測定す
る工程を含むことを特徴とする、ＡＢＣ１発現変調活性につきテスト化合物をス
クリーニングする方法を提供する。該組換えレポーター構築体は、本発明によっ
て提供されるＡＢＣ１の５’フランキング領域配列のいずれかのごとき、哺乳動
物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む
。１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号
：３を含む。もう１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調
部分は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８
１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３、または１３９４−１
５３２を含む。適当なレポーターｃＤＮＡはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白
質ｃＤＮＡを含む。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞である。該方法の特に
好ましい実施形態において、組換えレポーター構築体はｐＡＰＲ１である。

【００３５】 また、本発明において提供されるのは、（ａ）培養中に維持された哺乳動物細
胞の試料においてコレステロール流出のレベルをアッセイして、コレステロール
流出の対照レベルを決定し；（ｂ）該細胞をスクリーニングすべきテスト化合物
と接触させ；（ｃ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料においてコレステロ
ール流出のレベルをアッセイし；（ｄ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料
においてＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルをアッセイし、それにより
、テスト化合物が培養中の細胞からのＡＢＣ１−培養コレステロール流出を促進
するか否かを判断する工程を含むことを特徴とする、テスト化合物が培養中の細
胞からのＡＢＣ１−培養コレステロール流出を促進するか否かを判断するために
テスト化合物をスクリーニングする方法である。該細胞は一次培養または細胞系
に由来することができる。テスト化合物をスクリーニングするための適当な細胞
は繊維芽細胞、マクロファージ、肝、および腸細胞系を含む。好ましくは、該細
胞系はＲＡＷ２６４．７である。１つの好ましい実施形態において、結合に際し
てＡＢＣ１の活性を阻害する抗−ＡＢＣ１抗体を用い、ＡＢＣ１−媒介コレステ
ロール流出を測定する。もう１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１−媒介
コレステロール流出は、アンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドを用いて測定す
る。特に好ましい実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは配列番号
：５７を含む。

【００３６】 加えて、本発明は、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１発現の比較レベルを
検出する方法を提供する。かかる方法を用いて、冠心臓病に対する対象の罹患性
を測定することができる。哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１発現の比較レベ
ルを検出する方法が提供され、これは、（ａ）哺乳動物対象からの細胞試料を得
、（ｂ）細胞試料においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルをアッセイし；つい
で、（ｃ）細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルとＡＢＣ１ ｍＲ
ＮＡ発現のあらかじめ決定した標準レベルと比較し、それにより、哺乳動物対象
の細胞においてＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベルを検出することを含む。ＡＢＣ
１ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定する適当は方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノ
ーザンブロット、およびＲＮＡｓｅ保護アッセイを含む。

【００３７】 また、本発明は、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを
検出する方法を提供する。そのような方法を用いて、冠心臓病に対する対象の罹
患性を測定することができる。哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比
較量を検出する方法が提供され、これは、（ａ）哺乳動物対象からの細胞試料を
得、（ｂ）細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量をアッセイし、ついで、（ｃ）
細胞試料におけるＡＢＣ１蛋白質の量とＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標
準量とを比較し、それにより、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比
較レベルを検出することを含む。ＡＢＣ１の蛋白質の量は、当該分野で利用でき
る種々のイムノアッセイを用いて測定することができる。例えば、ＡＢＣ１蛋白
質の量は、（ａ）細胞試料を抗−ＡＢＣ１抗体の集団と接触させ、ついで、（ｂ
）試料と会合した特異的−結合性ＡＢＣ１抗体を検出することによって測定する
ことができる。ＡＢＣ１抗体を検出する適当な方法はウエスタンブロッティング
、免疫沈殿およびＦＡＣＳを含む。

【００３８】 もう１つの態様において、本発明は、記載されたＡＢＣ１ポリペプチドに特異
的に結合する抗体を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配
列番号：２を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を
提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に対
する少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチ
ドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。該抗体はモノクローナル抗体
とすることができるか、あるいは該抗体はポリクローナル抗体とすることができ
る。さらにもう１つの実施形態において、該抗体は、ＡＢＣ１ポリペプチドへの
結合に際して、ＡＢＣ１ポリペプチドのコレステロール輸送活性を阻害する。

【００３９】 加えて、本発明は、少なくとも１つのアッセイで十分な量の哺乳動物ＡＢＣ１
遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーターｃＤＮＡおよび使用のた
めの指令書を含むことを特徴とする、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定する
ために化合物をスクリーニングするのに適したキットを提供する。１つの好まし
い実施形態において、該キットは、さらに、レポーター遺伝子を検出する手段を
含む。もう１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変
調部分は配列番号：３を含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、哺
乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は、配列番号：３のヌクレオチド１−１５
３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９
４−１６４３または１３９４−１５３２を含む。適当なレポーターｃＤＮＡはル
シフェラーゼ、βーガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質ｃＤＮＡを含む。好ましくはレポーターｃＤＮ
Ａはルシフェラーゼである。該方法の特に好ましい実施形態において、組換えレ
ポーター構築体はｐＡＰＲ１である。

【００４０】 また、本発明は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか
否かを判断するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを提供する
。１つの好ましい実施形態において、該キットは、少なくとも１つのアッセイに
十分な量の不活化抗−ＡＢＣ１抗体および使用のための指令書を含む。もう１つ
の好ましい実施形態において、該キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な
量のアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドおよび使用のための指令書を含む
。特に好ましい実施形態において、アンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドは
配列番号：５３を含む。

【００４１】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明によると、細胞からのコレステロール流出を増加させる新規なポリペプ
チドが提供される。特に、本発明は、コレステロール流出を増加させることが示
された新規なＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣ１）ポリペプチドを提供する。

【００４２】 ＡＢＣ１は、細胞膜に存在し、ＡＴＰ加水分解を利用して、原形質膜を横切っ
て広く種々の基質を輸送するＡＴＰ−結合カセット蛋白質のファミリーのメンバ
ーである。用語「ＡＢＣ１」および（ＡＢＣＡ１）はともに同一のＡＴＰ−結合
カセット蛋白質をいうことに注意すべきである。用語「ＡＢＣＡ１」は命名委員
会によって１９９９年に導入され、当該分野では限定された許容を受けている。
今日まで、このファミリーの３０を超えるメンバーばヒトゲノムで同定されてい
る。これらの相同蛋白質は、それを通って、分子が細胞膜を通じて輸送されるチ
ャネル−様構造およびＡＴＰと結合してエネルギー発生ＡＴＰ−加水分解を輸送
にカップリングされる１以上のドメインを含有する。ファミリーのメンバーは多
薬物抵抗性因子（ＭＤＲ／Ｐ糖蛋白質；Ｃｈｅｎら．，Ｃｅｌｌ， ４７：３８
１−３８９（１９８６）；Ｓｔｒｉｄｅら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４
９：９６２−９７１（１９９６））、抗原提示に関連する輸送体（Ｎｅｅｆｊｅ
ｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１：７６９−７７１（１９９３）；Ｓｈｅｐｈｅ
ｒｄら，Ｃｅｌｌ， ７４：５７７−５８４（１９９３））、および嚢胞性線維
症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（Ｃｈａｎｇら， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ．，２６９：１８５７２−１８５７５（１９９４）；Ｒｏｍｍｅｎｓら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０５９−１０６５（１９８９））を含む。ＡＢＣ輸
送体ファミリーのメンバーは、一般に、長い荷電領域および高度に疎水性のセグ
メントによって連結された２つの対称半体内で見いだされる４つのドメインより
なる。各半分は、６つの膜貫通セグメントを含有する疎水性ドメインならびに多
くのＡＴＰａｓｅに典型的な高度に保存されたＷａｌｋｅｒＡおよびＢ配列モチ
ーフを含有する親水性ヌクレオチド結合ドメインを含有する（Ｈｙｄｅら， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ３４６：３６２−３６５（１９９０）；Ｌｕｃｉａｎｉら， Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ，２１：１５０−１５９（１９９４））。輸送体の活性はヌクレ
オチド結合ドメインにおけるＡＴＰとの相互作用に依存し、２つの対称半体を連
結する領域における残渣のリン酸化を介する調節による（Ｂｅｃｑら， Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７２：２６９５−２６９９（１９９７））。

【００４３】 本明細書中に記載されたいくつかの系列の証拠は、細胞内コレステロール貯蔵
のアポリポ蛋白質−媒介可動化における非常に重要な蛋白質としてＡＢＣ１を同
定した。まず、ここに提示された研究は、ＡＢＣ１がタンジール病、以上ＨＤＬ
−コレステロール代謝によって特徴付けられる遺伝的障害において欠けているこ
とを示した。すでに示され、本明細書中では実施例１に示したごとく、タンジー
ル病における遺伝子欠陥は細胞内からのコレステロールのアポリポ蛋白質媒介流
出の経路において欠陥を引き起こしてその結果、かなり減少したコレステロール
流出活性および低いＨＤＬ−コレステロールレベルをもたらす（Ｏｒａｍら，Ｊ
．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７：２７４３−２４９１（１９９６）；Ｆｒａｎｃ
ｉｓら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７８−８７（１９９５））。
タンジール病を持つ家族の遺伝的連鎖解析は欠陥遺伝子を染色体９ｑ３１上の間
隔に帰属させた（Ｒｅｓｔら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０：９６
−９８（１９９８））。公のデータベースのサーチは、ＡＢＣ１遺伝子が染色体
９ｑ２２−９ｑ３１に突き止められことを明らかとし、これはＲｕｓｔらで明ら
かにされた該間隔よりも広いがそれを含む。（Ｌｕｃｉａｎｉら， Ｓｕｐｒａ
（１９９４））。そのデータに基づき、ヒトＡＢＣ１遺伝子の照射ハイブリッド
マッピングを行い、これは、Ｒｕｓｔらによって報告されたヒト染色体９ｑ３１
の７−ｃＭ領域内にはっきりとある２つのマーカーの間に該遺伝子を位置付けた
。加えて、実施例２に示されるごとく、マイクロアレイ分析は、ＡＢＣ１遺伝子
が、正常な細胞と比較してタンジール患者細胞において２．５倍過小発現される
ことを明らかとした。これらの研究は、タンジール病における欠陥遺伝子をＡＢ
Ｃ１として同定した。加えて、ここに示されたさらなる研究は、ＡＢＣ１活性を
コレステロール流出活性に結び付けた。まず、研究は、４、４−ジイソチオシア
ノスチルベン−２、２’−ジスルフォン酸（ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタ
レイン（ＢＳＰ）のごときＡＢＣ１輸送活性の阻害剤もまた繊維芽細胞からのア
ポＡＩ−媒介コレステロール流出を阻害することを示した（実施例６参照）。ま
たアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１遺伝子発現の阻害
が、繊維芽細胞からのアポＡＩ−媒介コレステロール流出を阻害することを示し
た（実施例７）。対照的に、ＡＢＣ１遺伝子がマウス単球細胞にトランスフェク
トされたトランスフェクション実験は、ＡＢＣ１の過剰発現の結果、アポＡＩ−
媒介流出の増加をもたらすことを示した（実施例８）。最後に、野生型およびタ
ンジール患者ｍＲＮＡを用いて行ったＲＩ−ＰＣＲは、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現
が正常な皮膚繊維芽細胞におけるコレステロール流出に関連する細胞状態によっ
て調製されるが、タンジール患者繊維芽細胞においてはそうではないことを明ら
かにした（実施例９）。これらの知見に基づき、ＡＢＣ１はコレステロール流出
において主要な役割を演じると判断された。

【００４４】 ＡＢＣ１は、原形質膜の外側リーフレットへの細胞内コレステロールの移動に
おいて役割を演じる。ＡＢＣ１の欠如または欠陥ＡＢＣ１による細胞内コレステ
ロールの不十分な輸送の結果、それとアポＡＩおよび他のアポリポ蛋白質が特異
的に相互作用する特異的膜ドメインにおけるコレステロールの欠如をもたらす（
Ｓｔａｎｇｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３１００２−３１００８
（１９９８）； Ｂａｂｉｔｔら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３
２４２−１３２４９（１９９７））。コレステロールのアポＡＩへの送達の失敗
は、血症から迅速に除去されるコレステロール−欠陥ＨＤＬ粒子の形成に導く（
Ｂｏｊａｎｏｖｓｋｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：１７４２−１
７４７（１９８７））。

【００４５】 （定義） 以下の定義は、本明細書を通じて用いるある用語の理解を容易にするために掲
げる。

【００４６】 本発明においては、「単離された」とは、その元の環境（例えば、もしそれが
天然に生じるのであれば天然の環境）かた取り出された物質をいい、かくして、
その天然状態から「人の手によって」改変される。例えば、単離されたポリヌク
レオチドはベクターまたは組成物の１部となることができるか、あるいは細胞内
に含有することができ、依然として「単離されている」。なぜならば、ベクター
、組成物または特定の細胞はポリヌクレオチドの元の環境ではないからである。

【００４７】 本明細書で用いるごとく、「ポリヌクレオチド」は、合成および天然の双方の
起源のＤＮＡおよびＲＮＡを含むように定義される。ポリヌクレオチドは一本鎖
または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロヂュプレック
スとして存在することができる。かくして、本発明のポリヌクレオチドはいずれ
かのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドよりなることが
でき、これは未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡで有り
得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖領域、または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一
本鎖または、より典型的には二本鎖または三本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖
領域の混合物で有り得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子より成り得
る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤ
ＮＡ双方を含む三本鎖領域よりなることができる。また、ポリヌクレオチドは１
以上の修飾された塩基または安定性または他の理由で修飾されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡ骨格を含有することもできる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化
塩基およびイノシンのごとき異常塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡ
に対して成すことができ；かくして、「ポリヌクレオチド」はポリヌクレオチド
の化学的に酵素的にまたは代謝的に修飾された形態を含む。用語「ポリヌクレオ
チド」はしばしばオリゴヌクレオチドといわれる短いポリヌクレオチドも含む。

【００４８】 用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によ
って相互に連結した２以上のアミノ酸を含むいずれのペプチドまたは蛋白質もい
う。「ポリペプチド」とは、通常はペプチドと言われる短いアミノ酸配列、なら
びに一般に蛋白質といわれるより長いアミノ酸配列をともにいう。ポリペプチド
は２０の遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。
さらに、ポリペプチドは、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然の
プロセスによって、または当該分野でよく知られた化学的修飾技術によって修飾
することができる。与えられたポリペプチドは多くのタイプの修飾を含有するこ
とができる。また、同一タイプの修飾が、ポリペプチドにおける１以上の部位に
おいて同一または種々の程度存在することができる。修飾は、ペプチドの骨格、
アミノ酸の側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めたポリペプチドのど
こかで起こることができる。修飾は、限定されるものではないが、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル
化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸
化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、セレノイル化、ならびにヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体、またはホスファチジルイノシト
ールの共有結合を含む。他の修飾は架橋、環化、ピログルタメートの形成、ＧＰ
Ｉアンカー形成、蛋白質分解プロセッシングラセミ化、およびアルギニル化およ
びユビキチン化のごときアミノ酸のｔ−ＲＮＡ−媒介負荷を含む。例えば、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；Ｗｏｒｄ，
Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｉ
ｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂ，Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｅｄ．，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ
ら．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６（１９９０）；お
よび Ｒａｔｔａｎら．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒ
ａｓｎｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａ
ｎｎ． Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８−６２（１９９２））参照
。本発明のポリペプチドはいずれかの適当な方法で調製することができる。かか
るポリペプチドは単離された天然に生じるポリペプチド、組換えにより生産され
たポリペプチド、合成により生産されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
合せによって生産されたポリペプチドを含む。かかるポリペプチドを生産する手
段は当該分野でよく知られている。

【００４９】 本発明の「ポリヌクレオチド」は、配列番号：３または配列番号：３のヌクレ
オチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１
６４３、１３９４−１６４３または１３９４−１５３２、あるいはその相補体に
対して厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチドを含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４、
配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補体に対して厳密なハイブリダ
イゼーション条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含む
。

【００５０】 「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、５０％フォルミアミド、５×Ｓ
ＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルトの溶液、１０％デキストラン硫酸塩、お
よび２０μｇ／ｍｌの変成した剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃にお
ける一晩のインキュベーション、続いての約６５℃における０．１×ＳＳＣ中で
のフィルターの洗浄をいう。

【００５１】 本明細書中で用いるごとく用語「相補性」とは、例えば、二本鎖ポリヌクレオ
チドの２つのストランドの間、またはオリゴヌクレオチドプライマーおよび増幅
もしくは配列決定されるべき一本鎖ポリヌクレオチド上のプライマー結合部位の
間のごときヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合をいう。
２つの一本鎖ヌクレオチド分子は、１つのストランドのヌクレオチドが、他のス
トランドのヌクレオチドの少なくとも約８０％にて適当なヌクレオチド挿入、欠
失または置換、対をもって最適に整列する場合に相補性であるといわれる。

【００５２】 当該分野で知られている「同一性」は、配列を比較することによって決定して
、２以上のポリヌクレオチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関
係である。また、「同一性」または「同様性」は、そのような配列のストリング
の間のマッチによって決定して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間
の配列関連性の程度をいう当該分野で認められた意味を有する。「同一性」およ
び「同様性」は、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉ
ｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，
Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ， （１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｇｇｉｎ， Ａ．Ｍ．，およ
び Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．，編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． および Ｄｅｖｅｒ
ｅｕｘ， Ｊ．，編集，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，（１９９１）； および Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．，および Ｌｉｐｔｏｎ
， Ｄ．ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８
））に公表されて入るものを含めた多数のよく知られた方法を用いて計算するこ
とができる。２つの配列の間の同一性または同様性を判断するのに通常使用され
た方法は、限定されるのものではないが、“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒｓ，” Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄ．，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９９４）， および Ｃａｒ
ｉｌｌｏ， Ｈ．，および Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３’１９８８）に開示されたものを含む。同一性を
決定する好ましい方法は、テストされる配列の間で最大のマッチを与えるように
設計される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列させるための方法は、
ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．，Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４） １２（１）：３８７（１９８４
）），ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＩＮ， ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ
．Ｆ．ら．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）．Ｂｅ
ｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅ
ｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓ
ｏｎ． ＷＩ５３７１１（Ｓｍｉｔｈ および Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８
９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用）を含めたコンピュータープ
ログラムに編集されている。

【００５３】 特定の配列が、例えば、参照配列に対して９０％同一であるか否かを判断する
のに配列整列プログラムのいずれかを用いると、パラメーターは、同一性のパー
センテージが参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全長にわたって計算さ
れ、参照ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの合計数の１０％までの同一性にお
けるギャップが許容されるように設定される。

【００５４】 グローバル配列整列ともいわれる、クエリー配列（本発明の配列）および対象
配列の間の最良の総じてのマッチを決定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら
（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のア
ルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定する
ことができる。用語「配列」はヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。配列整
列において、クエリーおよび対象配列はともにヌクレオチド配列であるか、ある
いはともにアミノ酸配列である。該グローバル配列整列の結果はパーセンと同一
性で表す。パーセント同一性を計算するＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢサーチで用い
る好ましいパラメーターは：マトリックス＝ウニタリー、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、
ミスマッチペナルティー＝１、接合ペナルティー＝３０、ランダム化基長さ＝０
、およびカットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペ
ナルティー０．０５、およびウインドウサイズ＝５００またはどれだけ短かかろ
うがヌクレオチド塩基におけるクエリー配列の長さである。アミノ酸整列のパー
セント同一性および同様性を計算するのに使用される好ましいパラメーターは：
マトリックス＝ＰＡＭ １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティー
＝１、接合ペナルティー＝２０、ランダム化基長さ＝０、カットオフスコア＝１
、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー＝０．０５、および
ウインドウサイズ＝５００またはどれだけ短かろうがアミノ酸残基におけるクエ
リー配列の長さである。

【００５５】 説明として、配列番号：１に含有される配列に対して少なくとも９０％「同一
性」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が
配列番号：１の合計長さの各１００ヌクレオチド当たり１０までの点突然変異を
含み得る以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：１に含まれ
る配列と同一であることを意味する。換言すれば、配列番号：１に対して少なく
とも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含みポリヌクレオチドを得るため
には、配列番号：１に含まれる配列においてヌクレオチドの１０％までを欠失し
、挿入しまたは他のヌクレオチドで置き換えることができる。これらの変化はポ
リヌクレオチド全体のどこかで起こることができ、ヌクレオチド内または配列番
号：１内の１以上の連続群で個々に分散し得る。

【００５６】 同様に、配列番号：２に含まれる配列に対して少なくとも９８％「同一性」の
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が配列番号：２の合計
長さの各１００アミノ酸当たり２までのアミノ酸改変を含むことができる以外は
、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２に含まれる配列と同一であること
を意味する。換言すれば、配列番号：２と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを得るためには、配列番号：２に含まれる配列中のアミノ
酸残基の２％までを欠失し、挿入し、または他のアミノ酸残基で置き換えること
ができる。これらの変化はポリペプチド全体のどこかで起こることができ、残基
間または配列番号：２内の１以上の連続群で個々に分散することができる。

【００５７】 「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、用量依存性をもってまたはそれ
なくして、特定の生物学的アッセイにおいて測定して、本発明のポリペプチドの
活性と同様であるが必ずしも同一ではない活性（例えば、コレステロール輸送活
性）を呈するポリペプチドをいう、用量依存性が存在する場合には、それは、ポ
リペプチドのそれと同一である必要はないが、むしろ、本発明のポリペプチドと
比較して与えられた活性における用量−依存性に実質的に同様である（例えば、
候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対してより大きな活性または約２
５倍以下小さい、好ましくは、約１０倍以内小さな活性、最も好ましくは約３倍
以下小さい活性を呈するであろう）。

【００５８】 「ポリペプチド変種」とは、本発明のＡＢＣ１ポリペプチドと異なるが、その
本質的な特性を保有するポリペプチドをいう。一般に、変種は総じて密接に似て
おり、多くの領域に置いて、配列番号：２を含むポリペプチドと同一である。好
ましくは、ポリペプチド変種は生物学的活性、すなわち、コレステロール輸送活
性を保持する。変種は、限定されるのものではないが、スプライス変種および対
立遺伝子変種並びに付加、欠失および置換変種を含む。

【００５９】 同様に、「ポリヌクレオチド変種」とは、本発明のポリヌクレオチドとは異な
るがその本質的特性を保有するポリヌクレオチドをいう。該変種はコーディング
領域、非コーディング領域、または双方において改変を含むことができる。かく
して、例えば、ＡＢＣ１ポリヌクレオチド変種は、配列番号：１のそれと異なる
が、コレステロール輸送活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を有する。また、例えば、ポリヌクレオチド変種は、配列番号：３のそれと異
なるが、プロモーター活性を保有するヌクレオチド配列を有する。特に好ましい
ものは、サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされたポリペプチ
ドの特性または活性を改変しない改変を含むポリヌクレオチド変種である。遺伝
暗号の縮重のためサイレント置換によって生じたヌクレオチド変種が好ましい。
さらに、１０−２０、５−１０、１−５または１−２アミノ酸がいずれかの組合
せにおいて置換され、欠失または付加された変種もまた好ましい。ポリヌクレオ
チド変種は、種々の理由で、例えば、特定の宿主のためのコドン発現を最適化す
るのに生じさせることができる（例えば、ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＥ．ｃ
ｏｌｉのごとき細菌宿主によって好まれるものへの変化）。

【００６０】 「対立遺伝子変種」は、生物の染色体上の与えられた遺伝子座を占有する遺伝
子のいくつかの代替形態のうちの１つをいう天然に生じる変種である（Ｇｅｎｅ
ｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８５））。これらの対立遺伝子変種はポリヌクレオ
チドおよび／またはポリペプチドレベルいずれかにおいて変化することができる
。別法として、天然に生じない変種は突然変異誘発技術によってまたは直接的合
成によって生じさせることができる。

【００６１】 用語「保存的アミノ酸置換」とは、その部位におけるアミノ酸残基の極性また
は電荷に対してほとんどまたは全くないような、天然アミノ酸残基の非天然残基
での置換をいう。例えば、保存的置換は、いずれかの他の非−極性残基でのポリ
ペプチド中の非極性残基の置換に由来する。保存的置換のもう１つの例は酸性残
基のもう１つの酸性残基での置換である。保存的置換は、天然に生じるＡＢＣ１
ポリペプチドのそれと同様な機能的および化学的特徴を有するＡＢＣ１ポリペプ
チドを生じると期待させる。

【００６２】 用語「相同分子種」とは、異なる主から同定されたポリペプチドに対応するポ
リペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトＡＢＣ１ポリペプチドは相同分子
種と考えられる。

【００６３】 用語「ベクター」を用いて、コーディング情報を宿主細胞に移動させるのに使
用されるいずれかの分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）をいうの
に用いられる。

【００６４】 用語「発現ベクター」とは、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸
配列の配列を指令しおよび／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発
現は、限定されるものではないが、もしイントロンが存在すれば、転写、翻訳お
よびＲＮＡスプライシングのごときプロセスを含む。

【００６５】 本明細書中で用いるごとく、用語「転写調節領域」または「発現変調部分」と
は、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサーおよびリプレッサ
ーを含めた遺伝子のいずれかの領域をいう。

【００６６】 本明細書中で用いるごとく、用語「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を
制御する（一般に、約１００ないし１０００ｂｐ内の）構造遺伝子の開始コドン
に対して上流（すなわち、５’側）に位置する転写されない配列をいう。

【００６７】 本明細書中で用いるごとく、用語「エンハンサー」とは、プロモーターに作用
して転写を増加させる、通常長さが１０−３００ｂｐであるＤＮＡのシス−作用
性エレメントをいう。エンハンサーは比較的配向および位置非依存性である。そ
れらは転写ユニットに対して５’および３’側に見いだされている。

【００６８】 「宿主細胞」は形質転換またはトランスフェクトされている、あるいは外因性
ポリヌクレオチド配列によって形質転換またはトランスフェクションが可能な細
胞である。該用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫がもとの親と形態
または遺伝子的造りが同一であるか否かに拘わらず、親細胞の子孫を含む。

【００６９】 用語「作動可能に連結した」は、ここでは、かく記載されたフランキング配列
がその通常の機能を行うように配置されまたは組み立てられたフランキング配列
の配置をいうのに用いられる。かくして、コーディング配列に作動可能に連結し
たフランキング配列はコーディング配列の複製、転写および／または翻訳を行う
ことができる。例えば、プロモーターが当該コーディング配列の転写を指令でき
る場合にコーディング配列はプロモーターに作動可能に連結している。フランキ
ング配列は、それが正しく機能する限り、コーディング配列に隣接している必要
はない。かくして、例えば、介在するいまだ翻訳されていないが転写された配列
はプロモーター配列およびコーディング配列の間に存在することができ、プロモ
ーター配列は依然としてコーディング配列に「作動可能に連結している」と考え
られることができる。

【００７０】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの摂
取をいうのに用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されてしまっていれ
ば細胞はトランスフェクトされてしまっている。多数のトランスフェクション技
術が当該分野でよく知られており、ここに開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら
， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
１９８９）； Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８６）； および Ｃ
ｈｕら， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７参照。そのような技術を用いて
１以上の外因性ＤＮＡ部位を適当な宿主細胞に導入することができる。

【００７１】 （ＡＢＣ１ポリペプチド） 本発明は新規なヒトＡＢＣ１ポリペプチドに関する。１つの実施形態において
、ＡＢＣ１ポリペプチドは配列番号；２に示されたアミノ酸配列を含む。他の者
によって報告されたヒトＡＢＣ１蛋白質とは対照的に、配列番号：２に示された
ＡＢＣ１ポリペプチドはアミノ末端にさらに６０個のアミノ酸を有し、これは２
２０１アミノ酸よりも２２６１アミノ酸のＡＢＣ１蛋白質を明らかにする（Ｌａ
ｎｇｍａｎｎら， ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍ． ２５７．２０−３３（１９９９）参照）。加えて、配列番号：２に示
されたＡＢＣ１ポリペプチドは、いくつかのアミノ酸残基において他の報告され
た配列とは異なる。具体的には配列番号：２に示された現在のＡＢＣ１ポリペプ
チドは残基１５９においてＲの代わりにＫ、７６５においてＶの代わりにＩ、８
２３においてＩの代わりにＭ、１４９５においてＴの代わりにＩ、１５８８にお
いてＰの代わりにＬ、１９１４においてＲの代わりにＫ、および２１０８におい
てＰの代わりにＬを有する。公表された記録と合致させたままとするには、前記
アミノ酸番号は配列番号：２のものよりもむしろ（Ｌａｗｎら， Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｃｅｓｔ．，１０４：Ｒ２５−３１（１９９９）のものである。後記にてさ
らに詳細に考察するごとく、配列の差異は、最初のＡＢＣ１ ｃＤＮＡがＰＣＲ
−ベースの戦略を用いてマウスからクローンされ、引き続いて報告されたヒトＡ
ＢＣ１ ｃＤＮＡ配列がマウス蛋白質の配列から予測したという事実に由来する
ようである。ＡＢＣ１蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された２４０ｋ
Ｄの近似的な分子量を有する。

【００７２】 また、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してその全長さにわたって
少なくとも９８％同一性を好ましくは有するアミノ酸配列を含むＡＢＣ１ポリペ
プチドに関する。より好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列
に対してその全長さにわたって少なくとも９９％同一性を有する。より好ましく
は、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸に対してその全長さにわたって１０
０％同一性を有する。すでに定義したごとく、用語「同一性」とは、ポリペプチ
ド配列の間の配列関連性の程度をいい、これは後記にてさらに定義する。

【００７３】 そのような関連ＡＢＣ１ポリペプチドは置換、欠失、および挿入変種ならびに
対立遺伝子変種、スプライス変種、断片、誘導体および相同分子種を含む。好ま
しいポリペプチドおよびポリペプチド断片は、ＡＢＣ１の生物学的活性を保有す
るポリペプチドおよび断片を含む。特に、逆コレステロール輸送を媒介するポリ
ペプチドおよび断片が好ましい。また、好ましいのは、改良された逆コレステロ
ール輸送活性を有するポリペプチドおよび断片である。

【００７４】 置換、欠失および挿入変種は、配列番号：２に記載されたＡＢＣ１アミノ酸配
列と比較して、１以上のアミノ酸配列置換、欠失および／または付加を含むアミ
ノ酸配列を含むＡＢＣ１ポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、該変
種は、１ないし５、約１ないし１０、または約１ないし２０、または約１ないし
４０、または約１ないし６０アミノ酸置換、付加および／または欠失を有する。
例えば、該変種は、当該変種は生物学的機能を保有する限り、ポリペプチド中の
どこかに、ならびにカルボキシル末端および／またはアミノ末端に１以上のアミ
ノ酸残基の付加を有することができる。また、例えば、１以上のアミノ酸は、生
物学的機能の実質的喪失無くしてカルボキシル末端および／またはアミノ末端を
含めたポリペプチドのいずれかの領域から欠失させることができる（Ｒｏｎら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８（１９９３）；Ｄｏ
ｂｅｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１９９−２１６（１９８８
））。ＡＢＣ１変種がその生物学的活性を保有する限りアミノ酸置換は保存的、
非−保存的またはそのいずれかの組合せであり得る。加えて、置換は非−保存ア
ミノ酸残基で行うことができ、ここに、置換された残基は遺伝暗号によってコー
ドされていてもよくまたはされていなくてもよく、アミノ酸残基は置換された基
を有する。

【００７５】 ＡＢＣ１ポリペプチドの適当は変種はよく知られて技術を用いて測定すること
ができる。例えば、生物学的活性を破壊することなく変化させることができるＡ
ＢＣ１分子の領域を同定することによって、適当なＡＢＣ１変種を測定すること
ができる。また、当該分野で認識されているごとく、生物学的活性につき、また
は構造につき重要で有り得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、ま
たはポリペプチド構造に有害に影響することなく保存的アミノ酸置換に付すこと
ができる。生物学的活性を破壊することなく変化させることができるアミノ酸残
基は、活性につき重要でないＡＢＣ１ポリペプチドの領域を同定することによっ
て測定することができる（Ｂｏｗｉｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６
−１３１０（１９９０））。例えば、種々の種からのＡＢＣ１ポリペプチドを比
較して、保存された交差種であるＡＢＣ１分子のアミノ酸残基および領域を測定
することができる。保存されたアミノ酸残基は、生物学的機能および／または構
造につき重要なようである。対照的に、保存された交差種でなく、かくして、天
然の選択によって許容されるＡＢＣ１分子の領域の変化は、生物学的活性および
／または構造に有害に影響しないであろう。従って、非−保存領域において付加
、欠失または置換をもつＡＢＣ１ポリペプチドは適当な変種のようである。比較
的保存された領域に置いてさえ、化学的に同様なアミノ酸は、活性を保有しつつ
天然に生じる残基の代わりに置き換えることができる。

【００７６】 加えて、構造−機能実験を用いて、活性または構造につき重要である、ＡＢＣ
ＲおよびＡＢＣ−Ｃのごとき、ＡＴＰ−結合カセット蛋白質ファミリーの他もメ
ンバーにおける残渣を測定することができる。そのような実験は、他のＡＴＰ−
結合カセット蛋白質において活性または構造につき重要であるアミノ酸残渣に対
応するＡＢＣ１変種における重要なアミノ酸残基の予測を可能とする。例えば、
他のＡＴＰ−結合カセット蛋白質の構造−機能実験に基づき、ＡＢＣ１における
重要なアミノ酸残基は、ヌクレオチド結合およびステロール輸送に関連する領域
で見いだされるようである。適当は変種は、例えば、ＡＢＣ１ポリペプチドのそ
のような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に同様なアミノ酸置換
を有するポリペプチドを含む。

【００７７】 特異的位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子工学技術を用いて適当なＡＢＣ１
変種を測定して、ポリペプチド機能につき非常に重要な領域を同定することもで
きる。アミノ酸変化は、例えば、部位−特異的突然変異誘発またはアラニン−走
査突然変異誘発を用いて成すことができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。ついで、例えば、本明
細書中に記載したコレステロール流出アッセイの内のいずれか１つを用い、得ら
れたＡＢＣ１変種を生物学的活性につきテストすることができる。破壊されたコ
レステロール流出活性をもたらす特定のアミノ酸残基置換を有する変種は適当な
ＡＢＣ１変種と考えられないであろう。

【００７８】 適当な変種を同定するためのさらなる方法は当該分野でよく知られている。さ
らに、当業者であれば、蛋白質中のあるアミノ酸位置で許容されるであろうアミ
ノ酸変化を認識するであろう（Ｂｏｗｉｅら， ｓｕｐｒａ（１９９０））。例
えば、一般に、（蛋白質の三次構造内にある）最も埋もれたまたは内部のアミノ
酸残基は非極性側鎖を必要とし、他方、表面または外部側鎖のより少ない特徴が
一般に保存されることは知られている。さらに、許容された保存的アミノ酸置換
は、死亡族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換、
ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置
換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨ
ｉｓの置換、芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換、小さなサイズのア
ミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換を含む。

【００７９】 ＡＢＣ１変種は天然に生じるものであるか、人工的に構築されることができる
。天然に生じる変種の例は対立遺伝子変種およびスプライス変種である。対立遺
伝子変種は、生物または生物の集団の染色体上にある与えられた遺伝子座を占有
する遺伝子のいくつかの代替形態の内の１つをいう（Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．，ｅｄ
．，ＧｅｎｅｓＩＩ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８５））。対立遺伝子変種はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ドレベルいずれかにおいて変化させることができる。スプライス変種とは核酸分
子、通常ＲＮＡをいい、これはＲＮＡ転写体、および対応するポリペプチドにお
けるイントロン配列の別のプロセッシングによって生じる。別法として、ＡＢＣ
１変種は人工的に構築することができる。例えば、ＡＢＣ１変種は、部位−特異
的突然変異誘発の技術を用いて構築することができる。また、例えば、ＡＢＣ１
変種は、配列番号：１に記載された野生型ＤＮＡ配列から記載されたごとく変化
するＤＮＡ配列を有する、該変種をコードする対応する核酸分子から調製するこ
とができる。

【００８０】 ポリペプチド断片とは、配列番号：２に記載されたＡＢＣ１の全長アミノ酸配
列未満を含むポリペプチドをいう。好ましいポリペプチド断片は、ＡＢＣ１の生
物学的活性を保有する断片を含む。特に、逆コレステロール輸送を媒介する、ま
たは改良された逆コレステロール輸送活性を有する断片が好ましい。ＡＢＣ１断
片は、生物学的機能が維持される限り、カルボキシル末端および／またはアミノ
末端を含めた、ポリペプチドのいずれかの領域から欠失された１以上のアミノ酸
を有することができる。ＡＢＣ１ポリペプチド断片は、代替スプライシングまた
はイン・ビボプロテアーゼ活性を通じるごとく天然で生じることができるか、よ
く知られた方法を用い、人工的に構築することができる。

【００８１】 また、本発明は、ここに定義されるごとく、化学的に修飾されているＡＢＣ１
ポリペプチド、変種または断片をいうＡＢＣ１ポリペプチド誘導体に関する。誘
導体は、ポリペプチドに付着した分子のタイプまたは位置いずれかにおいて、天
然に生じるＡＢＣ１ポリペプチドとは異なるように修飾される。誘導体は、さら
に、ＡＢＣ１ポリペプチドに天然で付着した１以上の化学基の欠失によって形成
されたポリペプチドを含む。加えて、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＡＢＣ
１ポリペプチドならびに前記ＡＢＣ１変種および断片を同種ポリペプチドに融合
させて、ホモダイマーを形成することができ、あるいは、異種ポリペプチドに融
合させてヘテロダイマーを形成させることができる。

【００８２】 本発明のもう１つの態様は、タンジール患者から単離されたポリペプチドに対
応する、突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドおよびその断片に関する。１つの好ま
しい実施形態において、ＡＢＣ１ポリペプチドは配列番号：８を含む。蛋白質は
タンジール患者（ＴＤ１）から単離し、実施例１および５に記載されたごとく配
列決定する。配列番号：８に記載されたアミノ酸配列は、位置５３７におけるグ
ルタミンからアルギニン残渣への置換を例外として野生型配列と同様である（残
基番号は（Ｌａｗｎら， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：ｒ２５−
３１（１９９９））のものであり、これは、配列番号：８の位置５９７に対応す
る。この残基の位置はアミノ−末端親水性ドメイン内にあり、第１の予測される
膜貫通ドメイン近くにある。置換は蛋白質のこの領域中のアミノ酸の電荷を変化
させ、その結果図１に示されるように、かなり減少したコレステロール流出活性
を有するＡＢＣ１蛋白質がもたらされる。

【００８３】 もう１つの好ましい実施形態において、突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドは配
列番号：１０を含む。該蛋白質はタンジール患者（ＴＤ２）から単離されたポリ
ペプチドに対応し、実施例１および５に記載されたごとく配列決定される。配列
番号：１０に記載されたアミノ酸配列は、残基５２７におけるアルギニンのトリ
プトファンへの置換を例外として野生型配列と同様である（残基の番号はＬａｗ
ｎら，ｓｕｐｒａ（１９９９）、これは 配列番号：１０の位置５８７に対応す
る）。ＴＥＤ１ポリペプチドと同様に、この置換は、ＡＢＣ１蛋白質のアミノ−
末端親水性ドメイン中のアミノ酸残基の電荷を変化させる。また、得られた突然
変異体ＡＢＣ１蛋白質は、図１に示されるごとく、かなり減少したコレステロー
ル流出活性を有する。

【００８４】 （ＡＢＣ１ポリヌクレオチド） 本発明のもう１つの態様は、新規なＡＢＣ１ポリペプチドおよびその変種をコ
ードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、例えば、全長ＡＢＣ
１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、野生型ＡＢＣ１の全
長ｃＤＮＡを含有するポリヌクレオチド、野生型ＡＢＣ１のコーディング配列の
全長を含むポリヌクレオチド、およびＡＢＣ１の非−コーディング５’および３
’配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、タンジール患者の
もののごとき突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
レオチドを提供する。

【００８５】 １つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
：２を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。重要なことには
、エクソン３に見いだされる予測された開始メチオニンに基づいて２２０１アミ
ノ酸の蛋白質につきコードするＬａｎｇｍａｎｎらの公表された配列とは対照的
に（Ｌａｎｇｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．，２５７：２９−３３（１９９９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪＯ１２３
７６）、現在特許請求されているヌクレオチド配列は５０のエクソンを含有し、
２２６１アミノ酸の蛋白質につきコードする（図４参照）。本発明の対応するヌ
クレオチド配列は、以下の６０アミノ酸−末端アミノ酸： ＭＡＣＷＰＱＬＲＬＬＬＷＫＮＬＴＦＲＲＲＱＴＣＱＬＬＬＥＶＡＷＰＬＦＩＦ
ＬＩＬＩＳＶＲＬＳＹＰＰＹＥＱＨＥＣＨＦＰＮＫＡ に対応する５’末端にさらなる１８０ヌクレオチドを含むコーディング配列を含
有する。

【００８６】 この位置から上流にイン・フレーム停止コドン６ないし９ヌクレオチドがある
と仮定すれば、新しく予測される開始部位は、連続的オープンリーディングフレ
ームを生じ得る税所のメチオニンコドンである。該６０のさらなるアミノ酸につ
いてのオープンリーディングフレームをやはり含む関連するＡＢＣ輸送体配列Ａ
ＢＣＲおよびＡＢＣ−Ｃ（ＡＢＣ３としても知られている）とこの新しいＡＢＣ
１ ｃＤＮＡ配列との整列は高度の同様性を示し、これは、相同ＡＢＣ輸送体蛋
白質が、ヒトＡＢＣ１で提案されたアミノ末端延長配列に関連する配列で始まる
ことを意味する。ヒトＡＢＣ１の初期に公表された開始部位は、新しく開示され
たメチオニンがイン・フレームではないように延長領域に余分なヌクレオチド「
ｎ」を含有する公表されたマウスＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列（Ｌｕｃｉａｎｉら，
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１１５０−１５９（１９９４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
：Ｘ７５９２６）から予測されたようである。しかしながら、もしマウス配列中
の「ｎ」ヌクレオチドが無視されれば、延長領域のマウスおよびヒト配列は同一
である。これらの結果に徴すれば、全長ヒトＡＢＣ１蛋白質は、Ｌａｎｇｍａｎ
ｎらによって従前に提案されて入るごとく、２２０１アミノ酸よりはむしろ２２
６１アミノ酸を含有するようである。従って、ＬａｎｇｍａｎｎらはヒトＡＢＣ
１の十分なオープンリーディングフレームを提示していない。

【００８７】 もう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、非−
コーディング５’および３’配列いずれかの少なくとも１部を含む全長ＡＢＣ１
ｃＤＮＡを含む。好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：１に示された
ヌクレオチド配列を含む。配列番号：１に示された１０．４ｋｂヒトＡＢＣ１
ｃＤＮＡ配列は、６７８３ヌクレオチド＋５’および３’非翻訳領域のオープン
リーディングフレームを含有する。位置２９１に開始コドン、および位置７０７
４に停止コドンがある。配列番号：１に示された現在のＡＢＣ１ ｃＤＮＡは、
いくつかの点で公表されたＡＢＣ１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号．Ａ
ＪＯ１２３７６）とは異なる。まず、現在のＡＢＣ１ ｃＤＮＡは５’末端にさ
らなる３５０ヌクレオチドおよび３’末端にさらなる３１３６ヌクレオチドを含
む（ポリ（Ａ）テールは含まず）。また、本発明のＡＢＣ１配列は、コーディン
グ領域における１０ヌクレオチドの置換によって公表されたＡＢＣ１ ｃＤＮＡ
とは異なる。１０の差の内、７つのヌクレオチドの差はアミノ酸変化を予測する
。公表された記録と合致させるためには以下のヌクレオチドおよびアミノ酸番号
は配列番号：１のものよりはむしろＬａｗｎら．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
１０４：Ｒ２５−３１（１９９９）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪＯ１２３
７６のものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸変化は以下の通りである：（１
）ヌクレオチド４１４におけるＧの代わりのＡ；（２）ヌクレオチド５９６にお
けるＧの代わりのＡ（アミノ酸１５９におけるＲの代わりのＫ）；（３）ヌクレ
オチド７０５におけるＣの代わりのＴ；（４）ヌクレオチド１９８０におけるＣ
の代わりのＡ；（５）２４１３におけるＧの代わりのＡ（アミノ酸７６５におけ
るＶの代わりのＩ）；（６）２５８９におけるＡの代わりのＧ（アミノ酸８２３
におけるＩの代わりのＭ）；（７）４６０４におけるＣの代わりのＴ（アミノ酸
１４９５におけるＴの代わりのＩ）；（８）４８８３におけるＣの代わりのＴ（
アミノ酸１５８８におけるＰの代わりのＬ）；（９）５８６１におけるＧの代わ
りのＡ（アミノ酸１９１４におけうＲの代わりのＫ）；および（１０）６４４３
におけるＣの代わりのＴ（アミノ酸２１０８におけるＰの代わりのＬ）。アミノ
酸変化の内５は保存的アミノ酸変化であり、多形または配列のエラーを表し得る
。２つの例においれ、本発明の配列はＧｅｎＢａｎｋ配列からの重要なアミノ酸
の差を予測する。該差の結果、残基１５８８におけるおよび２１０８におけるプ
ロリンよりはむしろロイシンがもたらされる。興味深いことには、療法の位置に
おいて、予測されるロイシンは、分析した３つのＴＤ試料の各々ならびに高度に
保存されたマウスＡＢＣ１蛋白質にも見いだされた。

【００８８】 また、本発明は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわ
たって少なくとも８０％同一性を好ましくは有するヌクレオチド配列を含むＡＢ
Ｃ１ポリヌクレオチドに関する。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番
号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも９０％同
一性を有する。なおより好ましくは、ポリヌクレオチドが、配列番号：１を含む
ポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも９５％同一性を有する
。最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号：１を含むポリヌクレオチド
に対してその全長にわたって１００％同一性を有する。そのような関連するＡＢ
Ｃ１ポリヌクレオチドは、置換、欠失および挿入変種、ならびに対立遺伝子変種
、スプライス変種、断片、誘導体および相同分子種を含み、ここに、１以上のヌ
クレオチドは置換、欠失、挿入または誘導体化されている。好ましいポリヌクレ
オチドは、コレステロール流出活性のごとき生物学的活性を保有するＡＢＣ１ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【００８９】 もう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ
１の全コーディング配列を含む。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオ
チドは配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４に示された配列を示す。こ
の単離されたポリヌクレオチドは６７８３ヌクレオチドのＡＢＣ１オープンリー
ディングフレームを含有し、前記したごとく、２２６１アミノ酸のポリペプチド
をコードする。

【００９０】 さらにもう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは
、ＡＢＣ１変種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。特に、単離
されたポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９
８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む。また、好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む単離されたポリヌクレオチドである。従って、本発明は、記載された置
換、欠失および挿入変種、ならじにＡＢＣ１対立遺伝子変種、スプライス変種、
断片、誘導体、融合ポリペプチドおよび相同分子種を含めた、前記ＡＢＣ１ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、
ＡＢＣ１の生物学的活性を保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
である。特に、逆コレステロール輸送を媒介するポリペプチドをコードするヌク
レオチドが好ましい。また、好ましいのは、改良された逆コレステロール輸送活
性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

【００９１】 本発明のさらにもう１つの態様は、タンジール患者からの突然変異体ＡＢＣ１
ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。１つの好まし
い実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：８のポリペプチドをコード
し、そのポリペプチドは患者ＴＤ１から単離され、それは前記されている。もう
１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載され
たヌクレオチド配列を含む。配列番号：７に記載されたヌクレオチド配列は十分
はオープンリーディングフレーム、ならじに５’および３’フランキング配列を
含む。該オープンリーディングフレームは、他の置換の内でも、位置５３７にお
いてＡからＧへの置換をもたらすヌクレオチド置換を含む２２６１のアミノ酸の
ポリペプチドをコードする（Ｌａｗｎら，ｓｕｐｒａ（１９９９））のナンバリ
ングを使用）。

【００９２】 突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連するも
う１つの好ましい実施形態において、ポリペプチドは配列番号：１０のポリペプ
チドをコードし、そのポリペプチドはタンジール患者ＴＤ２から単離され、これ
はやはり前記した。さらにもう１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオ
チドは配列番号：９に記載されたヌクレオチド配列を含む。配列番号：９に記載
されたヌクレオチド配列は十分はオープンリーディングフレーム、ならびに５’
および３’フランキング配列を含む。オープンリーディングフレームは、他の置
換の内でも、残基５２７においてＡｒｇからＴｒｙｐへの置換をもたらすポリヌ
クレオチド置換を含む２２６１アミノ酸のポリペプチドをコードする（Ｌａｗｎ
ら、ｓｕｐｒａ（１９９９）のナンバリングを使用）。

【００９３】 本発明のもう１つの態様は、ＡＢＣ１の非−コーディング５’フランキングお
よび３’フランキング領域を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。１つの
実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１の非−コーディング
５’フランキング領域を含む。好まくは、５’フランキング領域は、限定される
ものではないが、ＡＢＣ１プロモーター領域を含む。かくして、好ましい実施形
態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３に示された配列を含む。異種レポ
ーターアッセイによって示され、実施例１５で議論したごとく、配列番号：３に
記載されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１遺伝子の転写調節領域を含む。図１３に
示すごとく、配列番号：３に記載されたポリヌクレオチドは、位置１５２２、１
４３５および１３８３におけるＴＡＴＡボックスを含めたいくつかの転写調節エ
レメント、ならびにいくつかの推定ＳＰ１部位、およびいくつかの核レポーター
半分部位を含めた転写因子結合部位を含有する１６４３ｂ．ｐ．非−コーディン
グ配列である。加えて、同定されたステロール応答エレメントは位置１４８３−
１５００に見いだされる。実施例１７に記載されたさらなる異種レポーターアッ
セイは、いくつかの区別される配列番号：３の部分がプロモーター活性を保有す
ることを明らかとした。従ってもう１つの好ましい実施形態において、ポリヌク
レオチドは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１
１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含む。特に
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１
３９４−１５３２を含み、この配列はＡＢＣ１プロモーター活性を有することが
示された（実施例１７参照）。さらにもう１つの好ましい実施形態において、ポ
リヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１４８０−１５１０を含み、これ
はＬＸＲリガンドに対するＡＢＣ１転写応答を調節することが示される。

【００９４】 また、５’フランキングポリヌクレオチドは、厳密条件下で配列番号：３に記
載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ここ
に、該ヌクレオチド配列はＡＢＣ１プロモーター活性を有する。さらにもう１つ
の実施形態において、ポリペプチドは、厳密な条件下で配列番号：３のヌクレオ
チド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６
４３、または１３９４−１６４３を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含み、ここに、該ヌクレオチド配列はＡＢＣ１プロモーター
活性を有する。

【００９５】 もう１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１の３’
フランキング領域を含む。ＡＢＣ１転写体のポリアデニル化の代替部位を表すこ
とができるいくつかの３’非翻訳領域が同定されて入る。好ましくは、３’フラ
ンキング領域は調節配列を含有する。例えば、全長３’ＵＴＲ（配列番号：６）
は、Ｖｉｇｉｌｉｎの結合に必要なことが示されている４６配列（ＡＡ）ｎＣＵ
／ＵＣ（ＡＡ）ｎを含有する。Ｖｉｇｉｌｉｎ、１４Ｋ相同性ドメインを持つ普
遍的蛋白質はエストロゲン−誘導性ビテロゲニンｍＲＮＡ ３’−非翻訳領域結
合蛋白質である（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７２：１２２４９−１２２５
２（１９９７））。結合ＨＤＬに加え、ＶｉｇｉｌｉｎはｍＲＮＡの３’フラン
キング領域に結合し、ｍＲＮＡ転写体の半減期を増加させることが示されて入る
（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１８：３９９１−４００３（１９９８）
）。かくして、３’−フランキング領域を変化させて、例えば、Ｖｉｇｉｌｉｎ
の結合を増加させ、それにより、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡの半減期を増加させること
ができるであろう。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配列番号：４に
示された配列を含む。また、好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配列番
号：５に示された配列を含む。もう１つの好ましい実施形態いおいて、単離され
たポリヌクレオチドは配列番号：６に示された配列を含む。他の好ましい実施形
態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で配列番号：４、配列番号：５
または配列番号：６に記載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を
含む。

【００９６】 また、本発明は関連するＡＢＣ１の５’および３’フランキングポリヌクレオ
チドを含む。従って、本発明は、配列番号：３を含むポリヌクレオチド、配列番
号：４を含むポリヌクレオチド、配列番号：５を含むポリヌクレオチド、配列番
号：６を含むポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３
２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３
９４−１６４３を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも
８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ま
しくは、ポリヌクレオチドは、前記したフランキングポリヌクレオチドのいずれ
かの１つに対してその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一性
を有する。好ましいポリヌクレオチドは、転写調節活性のごとき生物学的活性を
保有するポリヌクレオチドを含む。

【００９７】 本発明は、さらに、前記したポリヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的な
単離されたポリヌクレオチドに関することが理解される。本明細書中に用いるご
とく、用語「相補的」とは、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つのストラン
ドの間のごときヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合をい
う。２つの二本鎖ヌクレオチド分子は、１つのストランドのヌクレオチドが、適
当なヌクレオチド挿入、欠失または置換と最適に整列し、他のストランドのヌク
レオチドの少なくとも約８０％と対合する場合に相補的であるといわれる。

【００９８】 本発明のもう１つの態様は、前記した新規なＡＢＣ１および適当な担体を含む
組成物に関する。１つの実施形態において、該組成物は、配列番号：２を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌクレオチ
ド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、配
列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および担体を含む。もう１つ
の実施形態において、該組成物は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対し
てその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９
５％同一性を有するポリヌクレオチドおよび担体を含む。

【００９９】 もう１つの実施形態において、該組成物は、ＡＢＣ１ ５’フランキング配列
および適当な担体を含む。好ましくは、該組成物は、配列番号：３を含むポリヌ
クレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド断片１−１５３２、１０８０−
１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３
を含むポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。また、好ましくは、該組成物
は、記載した５’フランキング配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチドのそ
の全長にわたって少なくとも８０％、９０％または９５％同一性を有するポリヌ
クレオチドおよび適当な担体を含む。さらにもう１つの実施形態において、該組
成物は、ＡＢＣ１ ３’フランキング配列を含むポリヌクレオチドおよび適当な
担体を含む。好ましい組成物は、配列番号：４を含むポリヌクレオチド、配列番
号：５を含むポリヌクレオチド、または配列番号：６を含むポリヌクレオチド、
ならびにこれらのポリヌクレオチドのいずれかに対してその全長にわたって少な
くとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一性を有するポリヌ
クレオチドおよび適当な担体を含む。本発明のさらに他の組成物は突然変異体Ａ
ＢＣ１ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、該組成物は配列番号：７を含むポ
リヌクレオチドまたは配列番号：９を含むポリヌクレオチドおよび適当な担体を
含む。

【０１００】 加えて、本発明の組成物は、いずれかの組合せにおいて、前記ＡＢＣ１ポリヌ
クレオチドのうちの２以上および適当な担体を含む。いずれかの適当な水性担体
を該組成物で用いることができる。好ましくは、該担体は、該組成物を、室温ま
たは貯蔵温度（すなわち、４℃ないし２０℃）のごとき所望の温度で安定とし、
適当な中性のｐＨのものである。適当な担体の例は当業者に公知であり、トリス
−ＥＤＴＡおよびＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏを含む。

【０１０１】 （ＡＢＣ１ベクターと宿主細胞） また、本発明は、１以上の前記ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換えベクタ
ー、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む該ベクターで遺伝子工学的に作成した宿主
細胞、および組換え技術によるＡＢＣ１ポリヌクレオチドの生産に関する。前記
したごとく、本発明は、前記した１以上の野生型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含
む組換えベクターを提供する。好ましい実施形態において、組換えベクターは、
配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１
を含むポリヌクレオチド、および配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４
を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換え
ベクターは、配列番号：２のアミノ酸に対して少なくとも９８％同一性であるア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変種ポリヌクレオチドを含む。また
、もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：１を含
むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一である変種ポリヌクレオチド
を含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、これ
らのポリヌクレオチドのいずれかに相補的であるポリヌクレオチドを含む。

【０１０２】 もう１つの実施形態において、組換えベクターは、タンジール病患者から単離
された突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。好
ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：８を含むポリヌクレオチ
ドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：
１０を含むポリヌクレオチドを含む。また、組換えベクターは、これらの配列に
対して相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。

【０１０３】 また、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変種、ま
たは突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのうちの２以上を含むことができるこ
とも理解される。

【０１０４】 前記した野生型、変種、または突然変異体ポリヌクレオチドのいずれかのごと
き、単離されたＡＢＣ１ポリヌクレオチドはよく知られた連結およびクローニン
グ技術を用いベクターに挿入される。クローニング技術は、Ｄａｖｉｓら， Ｂ
ａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１
９８６）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ．（１９８９）； Ａｕｓｂｅｌら編， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）， （Ｗｉ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９４））；Ｇｏｅｄｄｅｌ編， Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ （１９９１））； Ｍｕｒｒａｙ編， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎ
Ｐｒｅｓｓ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）を含めたすくつかの標準的なマニュア
ルに記載されている。

【０１０５】 ＡＢＣ１ポリヌクレオチド挿入に適したいずれのベクターも用いることができ
る。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞で機能するように選択さ
れる（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または発現が起こり得るよ
うに宿主細胞マシーンに適合する）。好ましくは、ベクターは細菌、昆虫、また
は哺乳動物宿主細胞に適合する。また、好ましくは、ベクターは発現ベクターで
ある（発現ベクターのレビューについては、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．編， Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０））。ベクターは、例えば、ファー
ジ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロ
ウイルスベクターは複製コンピテントまたは複製欠陥であり得る。後者の場合、
ウイルス増殖は、一般に、補充宿主細胞のみで起こるであろう。

【０１０６】 典型的には、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミド維
持のための、および外因性ヌクレオチド配列の発現のための配列を含有する。集
合的に「フランキング配列」というそのような配列は、好ましくは、以下のヌク
レオチド配列：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止
配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配
列、ポリペプチド挿入のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合
部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿
入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメントのうちの１以上
を含むべきである。

【０１０７】 フランキング配列は同種（すなわち、宿主細胞と同一種および／または株）、
異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種）、ハイブリッド（すなわち、１
を超える源からのフランキング配列の組合せ）、または合成のものであり得る。
また、フランキング配列は、通常、ＡＢＣ１ポリペプチド発現を調節するように
機能する天然配列であり得る。フランキング配列の源は原核生物または真核生物
、いずれかの脊椎生物または無脊椎生物、またはいずれかの植物であり得るが、
フランキング配列は宿主細胞マシーンで機能し、それによって活性化され得るも
のとする。

【０１０８】 また、ベクターは、好ましくは、宿主における増殖のための少なくとも１つの
選択マーカーを含むべきである。選択マーカーは、選択的培地で増殖する宿主細
胞の生存および増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子エレメントである。適当
な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞についての抗生物質または他
のトキシン、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに
対する抵抗性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥を補う；または（ｃ）複
合培地から利用できない臨界的栄養を供給する蛋白質をコードする。好ましい選
択マーカーは真核生物培養についてのゼオシン、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ま
たはネオマイシン抵抗性およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためのテ
トラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン抵抗性を含む。

【０１０９】 他の適当な選択遺伝子は、発現された遺伝子を増幅するのに使用されるものを
含む。増幅は、増殖に臨界的な蛋白質の生産に対して大きな要求がある遺伝子が
、組換え細胞の継続的世代の染色体内で縦列反復するプロセスである。哺乳動物
細胞のための適当な選択マーカーの例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）
およびチミジンキナーゼを含む。哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、
ここに、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子により生存するのに
ユニークに適合する。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に変化し、それ
により、選択遺伝子およびＡＢＣ１遺伝子双方の増幅に導く条件下で形質転換細
胞を培養することによって課される。その結果、増大した量のＡＢＣ１ポリペプ
チドが増幅されたＤＮＡから合成される。

【０１１０】 また、ベクターは、好ましくは、典型的には、ポリペプチドコーディング配列
の末端の３’側に位置し、転写を終止させるように働く転写終止配列を含有する
。通常、原核生物における転写終止配列はＧ−Ｃリッチな断片、続いてのポリＴ
配列である。該配列は商業的ベクターの一部として購入され、あるいは核酸合成
のためのよく知られた方法を用い合成される。

【０１１１】 また、ベクターは、好ましくは、通常はｍＲＮＡの翻訳開始に必要で、シャイ
ンダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付け
られるリボソーム結合部位を含む。該エレメントは、典型的には、プロモーター
の３’側であって、発現させるべきＡＢＣ１ポリペプチドのコーディング配列の
５’側である。シャイン−ダルガノ配列は同定されており、その各々はよく知ら
れた方法によって容易に合成することができる。

【０１１２】 また、ベクターは、好ましくは、宿主生物によって認識され、コードされたポ
リヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むべきである。プロモー
ターは誘導プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る。誘導プロモータ
ーは、栄養の存在または不存在、あるいは温度の変化のごとき、培養条件のある
変化に応答して、増大したレベルのＤＮＡからの転写をそれらの制御下で開始す
る。対照的に、構成的プロモーターは継続的遺伝子産物生産を開始する；その結
果、遺伝子発現に対してほとんどまたは全く制御はない。制限酵素消化により源
ＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入す
ることによって、適当なプロモーターをポリヌクレオチドに作動可能に連結させ
る。前記したごとく、天然プロモーターを用いて、ポリヌクレオチドの増幅およ
び／または発現を指令することができる。かくして、組換えベクターは配列番号
：３に見いだされるもののごとき、前記した野生型、変種、または突然変異体Ａ
ＢＣ１ポリヌクレオチドおよびＡＢＣ１プロモーターのうちの１つを含み得る。
また、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変種または
突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびＡＢＣ１プロモーターのうちの２以
上を含むことができる。

【０１１３】 好ましくは、もしそれが天然ＡＢＣ１プロモーターと比較してＡＢＣ１蛋白質
のより大きな転写およびより高い収率を与えるならば、およびもしそれが使用の
ために選択されている宿主細胞系に適合するならば異種プロモーターを用いる。
異種プロモーターは単独で、または天然ＡＢＣ１プロモーターと組み合わせて用
いることができる。かくして、１つの好ましい実施形態において、組換えベクタ
ーは前記野生型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１
つを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは前記変種Ａ
ＢＣ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１つを含む。さらに
もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、前記突然変異体ＡＢ
Ｃ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１つを含む。また、好
ましい実施形態は、前記野生型、変種および突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチ
ドの２以上および異種プロモーターのいずれかの組合せを含む組換えベクターを
含む。

【０１１４】 原核生物宿主で用いるのに適した異種プロモーターは限定されるものではない
が、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｖｉｌｌａ−Ｋａ
ｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｌｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）、アルカリ性フォスファターゼ、トリ
プトファン （ｔｒｔ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーター （Ｖｉｌ
ｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｌｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）のごときハイブリッドプロ
モーターを含む。それらの配列は公表されており、それにより、いずれかの有用
な制限部位を供給するのに必要なリンカーまたはアダプターを用い、当業者がそ
れらを所望のＤＮＡ配列に連結するのを可能とする。他の適当な異種プロモータ
ーは当業者に知られている。

【０１１５】 哺乳動物宿主細胞で用いるのに適した異種プロモーターは良く知られており、
限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、（アデノウイ
ルス２のごとき）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類、肉腫ウイル
ス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ−型肝炎ウイルスおよびシミア
ンウイルス４０（ＳＶ４０）のごときウイルスのゲノムから得られたものを含む
。他の適当な哺乳動物プロモーターは異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱−
ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。さらなる適当なプロ
モーターは、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後記
プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ および Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１，
Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３４０−１０）；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングタ
ーミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０，
Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（
Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．．Ｓ
．Ａ．７８：１４４４−４５）；およびメタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒ
ｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）を含む。
好ましくは、プロモーターはサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０プロモーター
である。かくして、特に好ましい実施形態において、組換えベクターは前記野生
型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのうちの１つ、前記した変種ＡＢＣ１ポリヌクレオ
チドの１つ、または前記した突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびサイト
メガロウイルスプロモーターのうちの１つを含む。もう１つの特に好ましい実施
形態において、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変
種、またはＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびサイトメガロウイルスプロモーター
の２以上を含む。

【０１１６】 また、ベクターは、好ましくは、ＡＢＣ１のごとき、ポリヌクレオチドの転写
を増加させるためのエンハンサー配列を含む。真核生物プロモーターの活性化の
ための適当なエンハンサーはＳＶ４０、サイトメガロウイルス初期プロモーター
、ポリオーマおよびアデノウイルスエンハンサーのごときウイルスエンハンサー
を含む。

【０１１７】 本発明の発現ベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもまたは
しなくても良い、商業的に入手可能なベクターのごとき出発ベクターから構築す
ることができる。ここに記載するフランキング配列の１以上がベクターにすでに
存在しない場合、それらは個々に得ることができ、ベクターに連結することがで
きる。フランキング配列の各々を得るのに用いる方法は当業者に良く知られてい
る。

【０１１８】 好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細胞に適合するものであ
る。細菌で用いるのに好ましいベクターは、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０お
よびｐＱＥ−９（Ｑｕｉａｇｅｎ．Ｉｎｃ．）ブルースクリプトベクター、ファ
ージスクリプトベクター、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ｐｔｒｃ９
９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．），およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ
ｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）。好ましい真核生物ベクターは、限定さ
れるものではないが、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩお
よびｐＳＧ（（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよ
びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍｅｄ
ｉｓｏｎ， ＷＩ）を含む。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかであろ
う。

【０１１９】 特に好ましい実施形態において、組換えベクターは、実施例４に記載し、図３
に示されるｐＣＥＰｈＡＢＣ１を含む。組換えベクターｐＣＥＰｈＡＢＣ１はプ
ラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、サイトメガロウイルスプロモー
ターおよびエンハンサーを含有する発現ベクターを含む。ベクターｐＣＥＰｈＡ
ＢＣ１は、さらに、異種サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結し
たＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドは、非−コーデ
ィング５’フランキング（すなわち、天然ＡＢＣ１プロモータ）および３’フラ
ンキング配列を含めた全長ＡＢＣ１ ｃＤＮＡを含有する配列番号：１を含む。

【０１２０】 加えて、本発明はＡＢＣ１フランキング配列ポリヌクレオチドを含む組換えベ
クターを提供する。１つの実施形態において、組換えベクターは、好ましくはプ
ロモータ活性を含有するＡＢＣ１ ５’フランキング配列を含むポリヌクレオチ
ドを含む。かくして、好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：
３を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換
えベクターは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、
１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含むポ
リヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配
列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２を含む。また、もう１つの実施形
態において、組換えベクターは、厳密な条件下で配列番号：３に記載されたポリ
ヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６
４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を
含むポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらにも
う１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：３を含むポリヌク
レオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３
、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含む
ポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましく
は少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するヌク
レオチド配列を含む。また、組換えベクターは、前記５’フランキング配列のい
ずれかに相補的なポリヌクレオチドを含む。

【０１２１】 もう１つの実施形態において、組換えベクターは、ＡＢＣ１の３’フランキン
グ配列を含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、組換えベク
ターは配列番号：４を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形
態において、組換えベクターは配列番号：５を含むポリヌクレオチドを含む。同
等に好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：６を含むポリヌク
レオチドを含む。また、もう１つの実施形態において、組換えベクターは、厳密
な条件下で配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に記載されたポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらにもう１つの実
施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：５または配列
番号：６を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％
、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％同一
性を有するヌクレオチド配列を含む。また、組換えベクターは、前記３’フラン
キング配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドを含む。

【０１２２】 前記５’または３’フランキング配列ポリヌクレオチドのいずれかのごとき単
離されたＡＢＣ１フランキング配列ポリヌクレオチドは、よく知られた連結およ
びクローニング技術を用いベクターに挿入される。前記したベクターのいずれも
用いることができる。好ましくは、ベクターは細菌、昆虫または哺乳動物宿主細
胞に適合する。また、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。ベクターは
、例えば、ファージ、プラスミド、ウイスルまたはレトロウイルスベクターであ
り得る。

【０１２３】 ＡＢＣ１フランキング配列に加えて、ベクターは以下のフランキングヌクレオ
チド配列：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列
、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、
ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位
、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入す
るためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメントのうちの１以上を含
有することができる。前記したフランキングヌクレオチド配列のいずれも適当で
ある。フランキング配列は同種、異種、ハイブリッドまたは合成のものであり得
る。また、フランキング配列は、ＡＢＣ１ポリペプチド発現を調節するように通
常は機能する天然配列であり得る。フランキング配列の源は原核生物または真核
生物、いずれかの脊椎生物または無脊椎生物、またはいずれかの植物であり得る
が、フランキング配列は宿主細胞マシーンで機能し、それによって活性化できる
ものとする。

【０１２４】 好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細胞に適合するものであ
る。適当なベクターは前記したものであり、細菌で用いるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０、ｐＱＥ９、ブルースクリプトベクター、ファージスクリプトベクター、ｐＮ
Ｈ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐｋｋ２２３−３、
ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５およびｐＣＥＰ４、および真核生物細胞で用いるｐＷ
ＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ．ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬおよびｐＧＬ３を含む。

【０１２５】 １つの特に好ましい実施形態において、組換えベクターは、ＡＢＣ１遺伝子の
５’フランキング領域を含むポリヌクレオチドを含み、さらに、異種ポリペプチ
ドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。異種ポリヌクレオチ
ドはＡＢＣ１ ５’フランキング配列に作動可能に連結している。ＡＢＣ１ ５
’フランキング配列は、好ましくは、ＡＢＣ１プロモーターを含有する。かくし
て、好ましくは、５’フランキング配列は配列番号：３に記載された配列を含む
。同等に好ましくは、５’フランキング配列は配列番号：３のヌクレオチド１−
１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３また
は１３９４−１６４３を含む。異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、完全な蛋
白質または蛋白質の生物学的に活性な断片であるポリペプチドをコードする。ベ
クターは、１を超える異種ポリヌクレオチドを含有することができる。より好ま
しくは、異種ポリヌクレオチドはレポーター蛋白質をコードする。そのような場
合、組換えベクターは、好ましくは、いずれのさらなるプロモーター配列も含有
しない。適当なレポーター蛋白質の例はルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼトランスフェラーゼ、およ
び緑色蛍光蛋白質を含む。好ましくは、レポーターポリヌクレオチドはルシフェ
ラーゼである。かくして、１つの特に好ましい実施形態において、組換えベクタ
ーは配列番号：３に記載された５’フランキング配列およびルシフェラーゼレポ
ーターポリヌクレオチドを含む。他の同等に好ましい実施形態において、組換え
ベクターは、ヌクレオチド配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０
−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４
３を含むポリヌクレオチドおよびルシフェラーゼレポーターポリヌクレオチドを
含む。

【０１２６】 ＡＢＣ１ ５’フランキング配列を含む発現ベクターは、レポーターポリヌク
レオチドを含有する商業的に入手可能なベクターのごとき出発ベクターから構築
することができる。適当な発現ベクターの例は、ルシフェラーゼレポーター遺伝
子（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩおよびｐβＧａｌ−Ｂａｓｉｃ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有するｐＧＬ３−Ｂａ
ｓｉｃを含む。好ましいベクターはプロモーターがないｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃル
シフェラーゼレポーターベクターである。ＡＢＣ１プロモーターを含有する５’
フランキング配列、例えば、配列番号：３は、ここに記載する方法（実施例１５
参照）を含めた良く知られた方法を用い、前記発現ベクターのうちの１つに連結
することができる。かくして、特に好ましい実施形態において、組換えベクター
はｐＡＰＲ１、配列番号：３を含むレポーター遺伝子構築体およびｐＧＬ３ベク
ターにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子である（図１１参照）。

【０１２７】 また、本発明は、前記組換えベクターのいずれか１つを含む宿主細胞に関する
。ベクターが構築された後、完成されたベクターを、増幅および／またはポリペ
プチド発現のために適当な宿主細胞に挿入することができる。宿主細胞は（Ｅ．
ｃｏｌｉのごとき）原核生物宿主細胞または（酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動
物細胞のごとき）真核生物宿主細胞であり得る。適当な条件下で培養すると、宿
主細胞はＡＢＣ１ポリペプチド、あるいは、引き続いて測定することができるレ
ポーターポリペプチドを合成する。宿主細胞は、形質転換された細胞系を含めた
霊長類細胞系または齧歯類細胞系のごとき哺乳動物宿主細胞であり得る。正常な
ジプロイド細胞、一次組織のイン・ビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次
外植体も適当である。候補宿主細胞は、選択遺伝子に表現型的に欠陥があり得る
か、または圧倒的に作用選択遺伝子を含有することができる。

【０１２８】 多数の適当な宿主細胞が当該分野で知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ）， Ｍａｎａｓｓａｓ
， ＶＡから入手できる。適当な哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではない
が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒ
ｌａｕｂら，１９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，
９７：４２１６：２０）、ヒト胚腎臓（ｈｅｋ）２９３または２９３Ｔ細胞、ま
たは３Ｔ細胞、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系
を含む。他の適当な哺乳動物細胞系は、限定されるものではないが、マウス神経
芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウス１−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ由来の
３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨＡＫハムスター細
胞系、Ｔｈｐ−１、ＨｅｐＧ２およびマウスＲＡＷ細胞系を含む。これらの細胞
系の各々は蛋白質発現分野の当業者に知られており、入手可能である。好ましい
宿主細胞は、実施例８にその使用が記載されるマウス単球細胞系ＲＡＷん２６４
．７である。

【０１２９】 適当な細菌宿主細胞は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として良
く知られているＥ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５０、ＤＨ
１０、およびＭＣ１０６１）を含む。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐｐ．， ｏｔｈｅｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もこの方法で使用することができる
。また、酵母細胞の多くの株もＡＢＣ１ポリペプチドの発現のための宿主細胞と
して入手できる。好ましい酵母細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。加えて、昆
虫細胞系は適当な宿主細胞であり得る。昆虫細胞系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、
１９９３， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４：８１０−１７； Ｌｕｃ
ｋｌｏｗ， １９９３， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：
５６４−７２； およびＬｕｃｋｌｏｗら、 １９９３、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，
６７：４５６６−７９に記載されている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９および
Ｈｉ５ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

【０１３０】 また、本発明は（ａ）検出可能なレベルのＡＢＣ１蛋白質を生じさせるのに十
分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで哺
乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、（ｂ）生じたＡＢＣ１蛋白質を
精製する工程を含む哺乳動物宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を発現する方法を
提供する。１つの好ましい実施形態において、組換え発現ベクターは配列番号：
２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。もう１つの好まし
い実施形態において、配列番号：１を含むポリヌクレオチド。さらにもう１つの
好ましい実施形態において、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含
むポリヌクレオチド。なおもう１つの好ましい実施形態において、配列番号：２
を含むポリペプチドに対して少なくとも９８％同一であるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド。

【０１３１】 組換えＡＢＣ１ベクターの哺乳動物宿主細胞への導入は、当該分野で良く知ら
れた方法によって行うことができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲のごとき標準的な実
験室マニュアルに記載されている。好ましくは、組換えベクターは沈殿にてまた
は荷電脂質との複合体にて宿主細胞に導入される。ＡＢＣ１ベクターの導入に適
した方法はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒
介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレク
トロポレーション、形質導入、感染、または当該分野で知られた他の方法を含む
。これらの方法は、例えば、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）に記載されている。もし
組換えＡＢＣ１ベクターがウイルスベクターであれば、それは適当なパッケージ
ンング細胞系を用いイン・ビトロにてパッケージＣ、次いで、宿主細胞に導入す
ることができる。

【０１３２】 ＡＢＣ１−ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出
、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレシチンクロマ
トグラフィーを含めたよく知られた方法を用い、組換え細胞培養から回収し、精
製することができる［例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ
６３：３１−４０（１９８８）参照］。好ましくは、抗−ＡＢＣ１抗体を用いる
アフィニティークロマトグラフィーを精製で用いる。

【０１３３】 加えて、本発明は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現するのに十分
な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを哺乳動物対
象に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質
を発現させる方法を提供する。好ましくは、組換え発現ベクターは配列番号：２
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌ
クレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオ
チド、または配列番号：２を含むポリペプチドに対して少なくとも９８％同一で
あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。組換えＡＢＣ１ベクタ
ーの哺乳動物対象への導入は当該分野でよく知られた方法によって行うことがで
き、これはここに後記にて詳細に記載する。ＡＢＣ１の発現は、それに組換えＡ
ＢＣ１ベクターを投与した対象から血液試料を得、単球集団を分離し、マクロフ
ァージ細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現を測定することによって測定することが
できる。ＡＢＣ１遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲのごとき当該分野でよく知られた
方法、および本明細書に記載された方法（実施例９および１０参照）。ＡＢＣ１
蛋白質のレベルは、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、実施例１１に記
載された免疫沈殿のごときよく知られた方法を用い、マクロファージ細胞におい
てＡＢＣ１蛋白質を測定することによって測定することができる。

【０１３４】 （コレステロール流出を増加させるための方法と化合物） 本発明のもう１つの態様において、哺乳動物対象において細胞からコレステロ
ール流出を増加させるのに適した方法が提供される。かかる方法は、該細胞から
ノコレステロール流出を増加させるのに十分な量でＡＢＣ１ポリヌクレオチドを
含む組換え発現ベクターを哺乳動物対照に投与することを含む。組換えベクター
は、コードされたＡＢＣ１ポリペプチドが生物学的活性（すなわち、コレステロ
ール輸送活性）を有する限り、前記した野生型または変種ＡＢＣ１ポリヌクレオ
チドのいずれかを含有する前記ベクターのいずれかであり得る。好ましくは、組
換えベクターは配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、また
は配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、好ましくは
、組換えベクターは、コードされたＡＢＣ１ポリペプチドがコレステロール輸送
活性を有する限り、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８
０％、９０％または９５％同一である変種ポリヌクレオチドを含む。

【０１３５】 組換えＡＢＣ１発現ベクターの哺乳動物対象への投与を用いて、心血管病の治
療のために該対象においてＡＢＣ１遺伝子を発現させることができる。具体的に
は、この方法は、心血管病を持つ哺乳動物の動脈病巣で見いだされるマクロファ
ージ細胞および他のコレステロール−蓄積細胞にＡＢＣ１遺伝子を導入すること
によって治療効果を達成するであろう。標的細胞におけるＡＢＣ１ポリヌクレオ
チドの発現はＡＢＣ１蛋白質のより大きな生産を行うであろう。引き続いて生産
されたＡＢＣ１蛋白質は、動脈病巣で見出されるマクロファージおよび他のコレ
ステロール−負荷細胞からのコレステロールの裸ＨＤＬ粒子への流出を増加させ
ることによって該病気を軽減するであろう。細胞流出は、動脈プラークのコレス
テロールリッチのコアのごとき末梢部位からの全コレステロールの除去に至るで
あろう。これらの病理学的病巣のサイズの同時減少は、心臓発作および狭心症に
至る動脈閉塞の危険性を減少させる。この方法は、また、動脈壁におけるコレス
テロールの蓄積を防止するために予防的に用いることもできよう。

【０１３６】 十分な量のＡＢＣ１発現ベクターは、哺乳動物対象の細胞からのコレステロー
ル流出を増加させるＡＢＣ１ベクターの量である。そのような量は、種々の投与
量の組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照レベル）および後に対照の細胞
中のコレステロール流出を測定し、対照レベルと比較したコレステロール流出の
増加を行う用量を測定することによって決定することができる。コレステロール
流出は、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、対象のマクロファージ細胞
におけるコレステロール流出の量を測定することによって測定することができる
。ここに記載したアッセイのいずれを用いてコレステロール流出を測定すること
もできる。

【０１３７】 加えて、コレステロール流出は、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照
）および後に対象における血漿ＨＤＬ−コレステロールのレベルを決定すること
によって測定することができる。組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与に続いて対
象の血清におけるＨＤＬ−コレステロールの観察された増加は、コレステロール
流出の増加を示す。血清中のＨＤＬ−コレステロールは当該分野で良く知られた
方法を用いて測定することができる。

【０１３８】 加えて、コレステロール流出は、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照
レベル）および後に対照の動脈壁に見出されるアテローム性動脈硬化症病巣のサ
イズを測定することによって測定することができる。動脈病巣のサイズの低下は
、コレステロール流出の増加を示す。動脈病巣を測定するアッセイは当該分野で
良く知られている。例えば、動脈病巣からの増加したコレステロール流出は、Ｌ
ａｗｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６０：６７０−６７２（１９９２）に記載され
ているアテローム性動脈硬化症のマウスモデル、ならびに他の公知の方法のいず
れかを用いて測定することができる。Ｌａｗｎらに記載されたＬＤＬ受容体ノッ
クアウトマウスを用い、コレステロール流出はＡＢＣ１ベクターの投与前および
後に測定することができる。アテローム発生ダイエットを与えられた動物の群に
おける脂肪ストリーク病巣のサイズは、Ｌａｗｎらに記載された大動脈切片の油
−レッドＯ染色によって測定することができる。対照ベクターを受け取った群と
比較したＡＢＣ１発現ベクターを受け取った群における脂肪ストリーク病巣のサ
イズの低下は、該病巣からのコレステロール流出の増加を示す。ヒトにおいては
、動脈壁に見出されるアテローム性動脈硬化症病巣のサイズは、例えば、アンジ
オグラフィーおよび非侵入的超音波方法を用いて測定することができる。

【０１３９】 別法として、コレステロール流出は、血液試料を得、次いで、組換えＡＢＣ１
発現ベクターの投与前および後に対象のマクロファージ細胞中のＡＢＣ１ｍＲＮ
ＡまたはＡＢＣ１蛋白質のレベルを測定することによって測定することができる
。ルーチン的アッセイを行って、ＡＢＣ１ｍＲＮＡ濃度およびコレステロール流
出の間の相関を決定することができる。同様に、アッセイを行って、ＡＢＣ１蛋
白質の量とコレステロール流出の量と相関させることができる。そのような相関
データを用い、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与後における対象の細胞でのＡ
ＢＣ１ ｍＲＮＡまたはＡＢＣ１蛋白質の観察された増加を用いて、コレステロ
ール流出の増加を示すことができる。ＡＢＣ１ｍＲＮＡおよびＡＢＣ蛋白質レベ
ルは、ここに記載されたアッセイおよびｍＲＮＡおよび蛋白質の定量のための他
の良く知られた技術を用いて測定することができる。治療投与量および処方は後
に詳細に議論する。

【０１４０】 核酸分子の標的細胞への導入に適した複数のウイルスおよび非ウイルス方法が
当業者に利用できる。例えば、遺伝子治療に適したウイルス送達ベクターは、限
定されるものではないが、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ポックスウイル
ス（すなわち、ワクシニア）、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス
、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、およびレトロウイルスおよ
びシンドビスウイルスのごときＲＮＡウイルスを含む。ＡＢＣ１ポリヌクレオチ
ドは、裸ＤＮＡ送達（直接的注入、受容体−媒介導入（ＤＮＡ−リガンド複合体
）、エレクトロポレーション、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、リン
酸カルシウム（ＣａＰＯ₄）沈殿、マクロ粒子衝撃（遺伝子銃技術）、リポソー
ム−媒介導入、およびリポフェクションのごとき非ウイルス送達系を用いて送達
することができる。

【０１４１】 細胞の遺伝子的修飾は、遺伝子治療分野で良く知られた１以上の技術を用いて
達成することができる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ， ２６０（５１１０）：９２６−３２）。遺伝子治療の材料および方法は
誘導性プロモーター、組織−特異的エンサンサー−プロモーター、部位−特異的
一体化のために設計したＤＮＡ配列、親細胞よりも優れた選択利点を提供するこ
とができるＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ
な選択系および発現制御系（安全性の尺度）、（細胞標的化のための）細胞−特
異的結合剤、細胞−特異的内部化因子、およびベクターによって発現を増強する
ための転写因子ならびにベクター製造の方法を含むことができる。遺伝子治療の
技術の実践のための方法および材料の例は（エレクトロポレーション技術を含む
）米国特許第４，９７０，１５４号、（遺伝子送達のためのリポ蛋白質−含有系
を記載する）第５、６７９、５５９号、（リポソーム担体を含む）第５、６７６
、９５４号、（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する
）第５、５９３、８７５号、および（生物学的に活性な粒子があるスピードで細
胞に推進され、それにより、粒子が細胞の表面を貫き、細胞の内部に一体化する
ようになるプロセスを記載する）第４、９４５、０５０号、および（核リガンド
を含む）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８号に記載されている。

【０１４２】 アデノウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子導入で特に有用であるこ
とが判明している（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ．ら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２
：４３１−４（１９９１）； 米国特許第５、６３１、２３６号）。ヒトにおけ
るＡｄ−媒介遺伝子治療の最初の試験は嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギ
ュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子の肺への導入であった（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．ら
， １９９４， Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．， ８（１）：４２−５１）。イン・ビ
ボで組換えＡｄを異なる組織に投与するための実験ルートは器官内点滴注入（Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ．ら， １９９２， Ｃｅｌｌ， ６８（１）：１４３
−５５）、筋肉への注射（Ｑｕａｎｔｉｎ．Ｂ．，ら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８９（７）：２５８１−４）、末梢静脈内
注射（Ｈｅｒｚ，Ｊ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０（７）：２８１２−６）および脳
への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ， Ｇ．， ら， １９９３，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５９（５０９７）：９８８−９０）を含むものであった
。従って、アデノウイルスベクターは当業者に広く入手でき、本発明で用いるの
に適する。

【０１４３】 アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は、最近、遺伝子治療における優れた適用に
て遺伝子導入系として導入されてきた。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムへ一体
化させるにおいて高レベルの感染性、広い宿主範囲および特異性を示す（Ｈｅｒ
ｍｏｎａｔ．Ｐ．， およびＭｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ．， １９８４， Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８１（２９）：６４６６−
７０）。単純疱疹ウイルスタイプ−１（ＨＳＶ−１）は好ましいベクター系であ
る（Ｇｅｌｌｅｒ， Ａ．， ら， １９９１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．， １４（１０）：４２８−３２； Ｇｌｏｒｉｏｓｏ， Ｊ．， ら，
１９９５， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４（１）：８７−９９；
Ｇｌｏｒｉｏｓｏ， Ｊ．， ら， １９９５， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．， ４９：６７５−７１０）。ポックスウイルス科のワクシニアウ
イルスもまた発現ベクターとして開発されている（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．， およ
びＭｏｓｓ， Ｂ．， １９８３， Ｇｅｎｅ， ２５（１）：２１−８； Ｍ
ｏｓｓ， Ｂ．， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０：３４５
−６２； Ｍｏｓｓ， Ｂ．， １９９２， Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：２５−３８）。前記ベクターの各々は当
業者に広く利用でき、本発明で用いるのに適しているであろう。

【０１４４】 好ましくは、ウイルス送達系はレトロウイルスベクターを利用する。レトロウ
イルスベクターは、大きな割合の標的細胞に感染し、細胞のゲノムに組み込むこ
とができる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．， およびＲｏｓｍａｎ， Ｇ．， Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７（９）：９８０−２、 ９８４−６， ９８９−９
０（１９８９）； 米国特許第５、６７２、５１０号）。レトロウイルスは、他
のウイルスよりも比較的初期に遺伝子導入ベクターとして開発され、遺伝子マー
キングおよびヒトリンパ球へのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のｃＤＮＡの
導入で最初に成功して用いられた。好ましくは、レトロウイルスベクターはネズ
ミまたは鳥類レトロウイルスの誘導体であり、またはレンチウイルスベクターで
ある。特に好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
単一の外来性遺伝子を導入することができるレトロウイルスベクターの例は、限
定されるものではないが、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ
）、Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイルス（
ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルスＲＳＶ）を含
む。多数のさらなるレトロウイルスベクターを複数遺伝子に組み込むことができ
る。これらのベクターの全ては、導入された細胞を同定し再生させることができ
るように、選択マーカーのための遺伝子に導入または一体化させることができる
。

【０１４５】 組換えレトロウイルスは欠陥があるので、それは感染性ベクター粒子を生じさ
せるには助けが必要である。この助けは、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下
でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパ
ー細胞系を用いることによって提供することができる。該ヘルパープラスミドは
、パッケージングメカニズムがカプセル化のためのＲＮＡ転写体を認識できるよ
うにするヌクレオチド配列を欠く。かくして、ゲノムはパッケージされないので
、ヘルパー細胞系は空のビリオンを生じる。適当なヘルパー細胞系は、限定され
るものではないが、ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含む。もしパッケージン
グシグナルが無傷であるが、構造遺伝子が他の注目する遺伝子によって置き換え
られているそのような細胞にレトロウイルスベクターが導入されれば、該ベクタ
ーをパッケージし、ベクタービリオンを生じさせることができる。次いで、この
方法によって生じたベクタービリオンを用いて、ＮＡＩＨ ３Ｔ３細胞のごとき
組織細胞系を感染させ、大量のキメラレトロウイルスビリオンを生じさせること
ができる。

【０１４６】 本発明のベクターは、当業者に広く利用できる標準的な組換え技術を用いて構
築することができる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９
， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ）， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１８５， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ
Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ， １９９１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉ
ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉ
ｓら， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）のごとき通常の分子生物学文献に見出すことができる。

【０１４７】 標的細胞内でのＡＢＣ１ポリヌクレオチドの転写を得るためには、標的細胞中
で遺伝子発現を駆動することができる転写調節領域が利用されなければならない
。転写調節領域は、好ましくは、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結し
たプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターはＡＢＣ１遺
伝子に対して同種または異種とすることができ、ただし、それは、当該構築体が
挿入されるであろう細胞もしくは組織−タイプで活性なものとする。選択された
転写調節領域は標的細胞において高レベルの遺伝子発現を駆動すべきである。好
ましくは、スカベンジャー受容体Ａ型、マトリックスメタロプロテイナーゼプロ
モーター（ＭＭＰ−１２）、またはマクロファージ向性レンチウイルスプロモー
ターのごときマクロファージ−特異的プロモーター（Ｆａｂｕｎｍｉら， Ａｔ
ｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， １４８：３７５−３８６（１９９９））を用い
る。特に好ましいプロモーターはスカベンジャー受容体Ａ型遺伝子の５’領域で
あり、これは、ＡＢＣ１遺伝子の転写を駆動するのに用いることができる強力な
マクロファージプロモーターを含有する。加えて、細胞において内因性ＡＢＣ１
ポリペプチドの発現を増加させるための手段は、プロモーター領域に１以上のエ
ンハンサーエレメントを挿入することであり、ここに、エンハンサーエレメント
はＡＢＣ１遺伝子の転写活性を増加させるように働くことができる。同様に、使
用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子をそこで活性化させることを望む組
織に基づいて選択される。かくして、例えば、動脈組織、特にマクロファージ細
胞で見出される細胞中でプロモーター活性化を付与することが知られているエン
ハンサーエレメントが選択されるであろう。本発明で用いるのに適した他の転写
調節領域は、限定されるものではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
即時型−初期エンハンサー（プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモ
ーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧ
Ｋ、およびＣＭＶエンハンサーにカップリングしたα−アクチンプロモーターを
含む（Ｄｏｌｌ， Ｒ．，ら、 １９９６、 Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３（５
）：４３７−４７）。

【０１４８】 ベクター構築体の他の構成要素は、所望により部位−特異的組込のために設計
されたＤＮＡ分子（例えば、同種組換えで有用な内因性配列）、組織−特異的プ
ロモーター、親細胞よりも優れた選択利点を供することができるＤＮＡ分子、形
質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選
択系、（細胞標的化のための）細胞特異的結合剤、細胞−特異的内部化因子、ベ
クターからの発現を増強させる転写因子、およびベクターの生産を可能とする因
子を含むことができる。

【０１４９】 ひとつの実施形態において、ベクターは、部位−特異的組込のための標的化Ｄ
ＮＡを含むことができる。標的化ＤＮＡは、注目する遺伝子、例えば、ＡＢＣ１
遺伝子の領域に対して相補的（同種）であるヌクレオチド配列である。同種組換
えを通じて、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的化ＤＮＡに結合
させることによってＡＢＣ１遺伝子に向けることができる。挿入のためのＤＮＡ
配列は、例えば、ＡＢＣ１ポリペプチド、例えば、フランキング配列の発現と相
互作用し、またはそれを制御することができるＤＮＡの領域を含む。かくして、
所望のＡＢＣ１ポリペプチドの発現は、ＡＢＣ１ポリペプチドの転写のための認
識可能なシグナルを持つ内因性遺伝子配列を供するＤＮＡ調節セグメントとカッ
プリングした標的化ＤＮＡの使用によるよりも、ＡＢＣ１遺伝子それ自体をコー
ドするＤＮＡのトランスフェクションによって達成される（Ｓａｕｅｒ， Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５：５２１−２７（１９９４）；
Ｓａｕｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２２５：８９０−９０
０（１９９３））。

【０１５０】 さらに他の実施形態において、標的細胞におけるＡＢＣ１遺伝子の制御された
発現のために調節エレメントを含ませることができる。そのようなエレメントは
、適当なエフェクターに応答してスイッチが入る。このように、治療ＡＢＣ１ポ
リペプチドは望まれる場合に発現させることができる。ひとつの慣用的な制御手
段は、ＤＮＡ−結合蛋白質または転写活性化蛋白質のごとき、小分子−結合ドメ
インおよび生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含有するキメ
ラ蛋白質をダイマー化するための小分子ディメライザーまたはラパログの使用を
含む（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ
９７／３１８９９参照）。蛋白質のダイマー化を用いて、トランスジーンの転写
を開始させることができる。もう１つの適当な制御手段または遺伝子スイッチは
、プロゲステロンアンタゴニストであるミフェプリストン（ＲＵ４８６）の使用
を含む。プロゲステロンアンタゴニストに対する修飾されたプロゲステロン受容
体リガンド−結合ドメインの結合は、次いで、核に通過してＤＮＡをＤＮＡに結
合する２つの転写因子のダイマーを形成することによって転写を活性化させる。
リガンド−結合ドメインは、天然リガンドに結合する受容体の能力を排除するよ
うに修飾される。修飾されたステロイドホルモン受容体系はさらに米国特許第５
、３６４、７９１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７
／１０３３７に記載されている。さらにもう１つの制御手段は、ポジティブなテ
トラサイクリン−制御可能トランスアクチベーターを用いる。この系は、転写を
活性化するポリペプチドに連結した突然変異ｔｅｔリプレッサー蛋白質（ＤＮＡ
−結合ドメイン（逆テトラサイクリン−調節トランスアクチベーター蛋白質がも
たらされる、すなわち、それがテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーター
に結合する突然変異ｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸変化）を含む。そのような系は米国
特許第５、４６４、７５８号、第５、６５０、２９８号および第５、６５４、１
６８号に記載されている。さらなる発現制御系および核酸構築体は米国特許第５
、７４１、６７９号および第５、８３４、１８６号に記載されている。

【０１５１】 ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するウイルス送達ベクターは、それが、標的
細胞に見出されるもう１つの分子に特異的なリガンドを含有するようにウイルス
コートを変化させることによって標的特異的とすることができる。これは、ベク
ターが所望の細胞型に結合するのを可能とする。該リガンドは、細胞−表面受容
体のごとき、標的細胞で見出される分子に特異的に結合する注目するいずれの化
合物でもあり得る。好ましくは、受容体は専ら標的細胞で見出され、他の細胞で
は見出されない。例えば、スカベンジャー受容体Ａに対するリガンドを用いて、
ウイルス送達ベクターをマクロファージ細胞に向けることができる。別法として
、それが、標的細胞上の抗原性エピトープを認識しそれに結合するＦａｂまたは
Ｆ（ａｂ’）₂のごとき抗体または抗体断片を含有するようにウイルスコートを
変化させることができる。ウイルスコートは、リガンドをコートするさらなるポ
リヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入することによって変化させることができ
る。当業者であれば、ウイルスゲノムに挿入して、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを
含有するベクターの標的特異的送達を可能とすることができる他の特異的ポリヌ
クレオチド配列を知っている。

【０１５２】 前記したもののごとき、加えて、裸のＡＢＣ１ポリヌクレオチドを投与するこ
とができる。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび組換えＡＢＣ１発現ベクターは医
薬組成物として投与することができる。そのような組成物は、ここに先に定義し
た効果的な量のＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１発現ベクター、
および投与の形態でもって適当性で選択された医薬上許容される処方剤を含む。
適当な処方材料は、好ましくは、使用される濃度において受容者に非毒性であり
、これは後記する。

【０１５３】 ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１組換え発現ベクターを含む医薬組成
物は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、
匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出、吸着または浸透の速度を修飾し、維
持し、または保持するための処方材料を含有することができる。適当な処方材料
は、限定されるものではないが、（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アル
ギニンまたはリシンのごとき）アミノ酸、抗微生物剤、（アルコルビン酸、亜硫
酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのごとき）抗酸化剤、（ホウ酸塩、
炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸のごと
き）緩衝液、（マンニトールまたはグリシンのごとき）増量剤、（エチレンジア
ミン４酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき）キレート化剤、（カフェイン、ポリビニルピ
ロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−
シクロデキストリンのごとき）複合体化剤、充填剤、単糖、二糖および（グルコ
ース、マンニトールまたはデキストリンのごとき）他の炭水化物、（血清アルブ
ミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのごとき）蛋白質、着色剤、香味剤、およ
び希釈剤、乳化剤、（ポリビニルピロリドンのごとき）親水性ポリマー、低分子
量ポリペプチド、（ナトリウムのごとき）塩−形成対イオン、（塩化ベンザルコ
ニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチル
パラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素
のごとき）防腐剤、（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレング
リコールのごとき）溶剤、（マンニトールまたはソルビトールのごとき）糖アル
コール、懸濁化剤、（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベ
ート２０またはポリソルベート８０のごときポリソルベート；トリロン；トロメ
タニン；レチシン；コレステロールまたはチロキサファルのごとき）界面活性剤
または湿潤剤、（スクロースまたはソルビトールのごとき）安定性増強剤、（ア
ルカリ金属ハライド（好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム−またはマンニ
トール、ソルビトールのごとき）等張性増強剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤
および／または医薬アジュバントを含む。Ｒｅｍｉｎｇｏｔｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．， Ａ．Ｒ． Ｇｅ
ｎｎａｒｏ，編、 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９
０）参照。

【０１５４】 医薬上活性な化合物（すなわち、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１ベ
クター）は、製薬の通常の方法に従って加工して、ヒトおよび他の哺乳動物を含
めた患者への投与のために医薬剤を生産することができる。かくして、ＡＢＣ１
ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１組換え発現ベクターを含む医薬組成物は（顆粒
、粉末または坐薬を含めた）固体形態または液体形態（例えば、溶液、懸濁液ま
たはエマルジョン）で作成することができる。経口投与のための固体投与形態は
カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末および顆粒を含むことができる。そのような固体
投与形態では、活性化合物はスクロース、ラクトースまたは澱粉のごとき少なく
とも１つの不活性希釈剤と混合することができる。そのような投与形態は、通常
のプラクティスにおいて、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、ステアリ
ン酸マグネシウムのごとき滑沢剤を含むことができる。カプセル剤、錠剤および
丸剤の場合には、投与形態は緩衝化剤を含むこともできる錠剤および丸剤は、加
えて、腸溶コーティングを施して調製することができる。

【０１５５】 経口または非経口投与のための液体投与形態は、医薬上許容されるエマルジョ
ン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル（水のごとき当該分野で通常用
いられる不活性希釈剤を含有）を含有する。そのような組成物は湿潤化剤、甘味
剤、香味剤、および香料剤を含むこともできる。例えば、注射用の適当な担体は
、恐らくは、非経口投与のための組成物に通常の他の物質を補足した水、生理食
塩水または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミ
ンを混合した生理食塩水はさらなる例示的担体である。他の例示的な医薬組成物
は約ｐＨ７．０ー８．５のトリス緩衝液、約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を
含み、これは、さらにソルビトールまたは適当な代替物を含むことができる。

【０１５６】 ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターを含む組成物で心血管
病を治療する投与法は、心血管病のタイプ、患者の年齢、体重、性別および医学
的状態、病気の酷さ、投与の経路および使用する特定の化合物を含めた種々の因
子に基づく。かくして、投与法は広く代わり得るが、標準的な方法を用いルーチ
ン的に決定することができる。例えば、投与すべきＡＢＣ１ポリヌクレオチドま
たはＡＢＣ１発現ベクターの量は、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流
出を増加させるのに十分な量である。そのような量は、例えば、ＡＢＣ１ポリヌ
クレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターの投与の前および後に対象の血漿ＨＤＬ
−コレステロールレベルを測定することによって決定することができる。ＡＢＣ
１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターの十分な量は、対象の血漿ＨＤ
Ｌ−コレステロールレベルを増加させる量である。従って、臨床家は投与量を決
め、投与経路を修飾して最適な治療効果を得ることができる。典型的な投与量は
、前記した因子に基づき、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ以上の
範囲であり得る。

【０１５７】 投与の頻度は、使用すべき処方におけるＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベク
ターの薬物動態学パラメーターに依存するであろう。典型的には、所望の効果を
達成する投与量に到達するまで、臨床家は組成物を投与するであろう。従って、
該組成物は、経時的に単一用量として、（所望の分子の同一量を含有してもまた
はしなくてもよい）２または以上の用量にて、または異色デバイスまたはカテー
テルを介する連続的注入として投与することができる。適当な投与量のさらなる
工夫は当業者によってルーチン的になされ、それは当業者によってルーチン的に
なされる仕事の範囲内のものである。適当な投与量は、適当な用量−応答データ
を用いることによって確認することができる。

【０１５８】 哺乳動物対象の細胞はイン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・ビトロにてトラ
ンスフェクトすることができる。イン・ビボにての、ＡＢＣ１ポリヌクレオチド
またはＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターの標的細胞への投与
は、当業者に知られた種々の技術のうちのいずれかを用いて達成することができ
る。例えば、米国特許第５、６７２、３４４号は、組換え神経栄養ＨＳＶ−１ベ
クターを含むイン・ビボウイルス−媒介遺伝子導入系を記載する。ＡＢＣ１ポリ
ヌクレオチドおよび組換えＡＢＣ１ベクターの前記組成物は、経口、口腔内、非
経口、直腸または局所投与によって、並びに吸入スプレイによってイン・ビボに
てトランスフェクトすることができる。本明細書中で用いる用語「非経口」は皮
下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入技術または腹腔内を含む。

【０１５９】 経口投与では、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含
有する医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、懸濁液または液体の形態とす
ることができる。医薬組成物は、好ましくは、与えられた量のＤＮＡまたはウイ
ルスベクター粒子を含有する投与単位の形態で作成する。例えば、これらは約１
０³−１０¹⁵ウイルス粒子、好ましくは約１０⁶−１０¹²ウイルス粒子の量を含有
することができる。ヒトまたは他の哺乳動物についての適当な日用量は、患者の
状態および他の因子に応じて広く変化させることができるが、再度、ルーチン的
方法を用いて決定することができる。

【０１６０】 また、ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物
は直腸投与することもできる。ベクターの直腸投与用の適当な坐薬は、常温では
固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解し、ベクター
を放出するカカオバターおよびポリエチレングリコールのごとき適当な非−刺激
性賦形剤とベクターとを混合することによって調製することができる。

【０１６１】 医薬組成物は吸入用に処方することもできる。例えば、ＡＢＣ１ポリヌクレオ
チドまたはベクターは吸入用の乾燥粉末として処方することもできる。また、Ａ
ＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベクター吸入溶液は、エアロゾル送達のためのプ
ロペラントを用いて処方することができる。さらにもう１つの実施形態において
、溶液は霧化することもできる。

【０１６２】 ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物は注射
することもできる。滅菌注射水性または油性懸濁液のごとき注射製剤は、適当な
分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用い、公知の方法に従って処方することが
できる。滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の
滅菌注射溶液または懸濁液とすることもでき、例えば、１、３−ブタンジオール
中の溶液とすることができる。非経口注射用の特定の適当な担体は、ＡＢＣ１ポ
リヌクレオチドまたはベクターを、適切に保存された滅菌等張溶液として処方さ
れる滅菌蒸留水である。使用することができる許容される担体および溶媒の中に
はリンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油
が、便宜には、溶媒または懸濁化媒体として使用される。この目的では、合成モ
ノ−またはジグリセリドを含めたいずれの温和な不揮発性油も使用することがで
きる。加えて、オレイン酸のごとき脂肪酸は注射剤の調製で用いることができる
。さらにもう１つの製剤は、注射マイクロスフィア、生分解性粒子、ポリマー化
合物、ビーズまたはリポソームのごとき剤での所望のＡＢＣ１分子の処方を含む
ことができ、これはＡＢＣ１製品の制御されたまたは保持された放出を提供する
（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８２：３６８８−３６９２（１９８５
）参照）。

【０１６３】 また、ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物
は局所投与することができる。局所投与では、ベクターは処方の０．００１％な
いし１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％ないし２重量％を含むことができるが、そ
れは処方の１０％ｗ／ｗもと多くを、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、より好ましく
は０．１％ないし１％を含むことができる。局所投与に適した処方は、皮膚を通
じる浸透に適した液体または半液体製剤（例えば、リニメント、ローション、軟
膏、クリーム、またはペースト）および目、耳または鼻への投与に適した点剤を
含む。本発明のベクターの有効成分の適当な局所用量を毎日１ないし４回、好ま
しくは、２回または３回投与する。

【０１６４】 本発明の核酸および／またはベクターは唯一の活性な医薬剤として投与するこ
とができるが、それは本発明または他の剤の１以上のベクターと組み合わせて用
いることもできる。組合せとして投与する場合、治療剤は、同一回数または異な
る回数投与される別々の組成剤として処方されることができるか、あるいは治療
剤は単一の組成物として投与することができる。

【０１６５】 本発明のもう１つの実施形態において、標的細胞は標的細胞集団に隣接する「
プロジューサー細胞系」の異色によってイン・ビボでトランスフェクトされる（
Ｃｕｌｖｅｒ， Ｋ．， ら， １９９４， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，
５（３）：３４３−７９； Ｃｕｌｖｅｒ， Ｋら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．， ５９：６８５−９０；
Ｏｌｄｆｉｅｌｄ， Ｅ．， １９９３， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，
４（１９：３９−６９）。該プロジューサー細胞系は、ＡＢＣ１ポリヌクレオチ
ドを含有するウイルスベクターを生産し、標的細胞、すなわち、好ましくは、ア
テローム性動脈硬化症病巣に見出されるマクロファージ細胞に近接してそのウイ
ルス粒子を放出するように作成される。放出されたウイルス粒子の一部は標的マ
クロファージ細胞と接触し、その細胞に感染し、かくして、ＡＢＣ１ポリヌクレ
オチドを標的マクロファージ細胞に送達する。標的細胞の感染に続き、ＡＢＣ１
ポリヌクレオチドの発現が起こり、マクロファージ細胞に機能的ＡＢＣ１蛋白質
を与える。

【０１６６】 もう１つの実施形態において、本発明は、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組
換えＡＢＣ１発現ベクターのＸ・ビボ導入によって心血管病を治療する方法を提
供する。そのような例において、患者から摘出された細胞、組織または器官をＡ
ＢＣ１組成物に暴露し、しかる後、細胞、組織または器官を引き続いて患者に戻
して移植する。例えば、１つの方法は、心血管病を持つ対象から血液試料を摘出
し、該試料を単球が豊富となるようにし、単離された単球を、ＡＢＣ１ポリヌク
レオチドを含有する組換え発現ベクターおよび、所望により、標的特異的遺伝子
と接触させることを含む。所望により、単球細胞をＧＭ−ＣＳＦのごとき成長因
子で処理して、対象へ再び細胞を導入する前に細胞増殖を刺激することもできる
。再び導入すれば、当該細胞は、それが元来そこから単離された細胞集団を特異
的に標的化する。このように、ＡＢＣ１ポリペプチドの輸送活性を用いて、対象
においてコレステロール流出を促進することができる。

【０１６７】 Ｘ・ビボ投与のもう１つの方法は、ウイルスを含有する細胞の皮膚移植によっ
て、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１ベクターを哺乳動物対象に
導入することを含む。好ましくは、レトロウイルスをこの投与方法で用いる。も
し強力なハウスキーピング遺伝子プロモーターを用いて転写を駆動するならば、
繊維芽細胞起源の細胞を用い、インプラントにおける外来性遺伝子の長期発現を
達成することができる。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子
プロモーターを用いることができる。繊維芽細胞のごとき細胞を、スカベンジャ
ーＡのごとき特異的標的化を可能とする遺伝子、および強力なプロモーターと共
にＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するレトロウイルス構築体を含有するビリオ
ンで感染させることができる。感染した細胞を、受容者対象中の真皮の結合組織
に移植することができるコラーゲンマトリックスに埋めることができる。レトロ
ウイルスが増殖し、マトリックスから逃げるにつれ、それは標的細胞集団を特異
的に感染するであろう。このようにして、移植の結果、輸送障害を呈する細胞に
おいてコレステロール流出活性の増加した量がもたらされる。

【０１６８】 もう１つの実施形態において、米国特許第５、３９９、３４６号に記載されて
いるごとく、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをイン・ビト
ロ技術を用いて投与することができる。例えば、ここに記載するもののごとき方
法を用い、遺伝子工学により作成したある種の細胞を移植することによって、Ａ
ＢＣ１ポリペプチドを送達してＡＢＣ１ポリペプチドを発現させることができる
。外来性種のポリペプチドの投与で起こり得るごとき、ＡＢＣ１ポリペプチドを
投与すべき患者において潜在的な免疫反応を最小化するためには、ＡＢＣ１ポリ
ペプチドを生産する天然細胞はヒト起源であり、ヒトＡＢＣ１ポリペプチドを生
産するのが好ましい。かくして、ＡＢＣ１ポリペプチドを生産する組換え細胞は
、ヒトＡＢＣ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質
転換するのが好ましい。該細胞はオートロガスまたはヘテロガスであり得る。所
望により、細胞は不死化することができる。免疫応答の機会を減少させるために
は、細胞をカプセル化して周囲の組織の侵入を回避することができる。カプセル
化材料は、典型的には、蛋白質産物の報酬を可能とするが、患者の免疫系による
、または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性の
半浸透性ポリマーの容器または膜である。前記した方法を用い、トランスフェク
トされた細胞を患者に投与することができる。

【０１６９】 生細胞のカプセル化のための技術は当該分野で知られており、カプセル化細胞
の調製および患者におけるその移植はルーチン的に達成することができる。例え
ば、Ｂａｅｔｇｅら、（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための遺伝子
工学作成細胞を含有する膜カプセルを記載する。該カプセルは生体適合性であっ
て、容易に回収することができる。該カプセルは、哺乳動物宿主への移植に際し
てイン・ビボで下降調節に付されないプロモーターに作動可能に連結した生物学
的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェ
クトされた細胞をカプセル化する。該デバイスが、受容者内の特異的な部位への
、生細胞からの分子の送達を可能とする。加えて、米国特許第４、８９２、５３
８号；第５、０１１、４７２号；および第５、１０６、６２７号参照。生細胞を
カプセル化するためのシステムはＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂ
ｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７
０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）； Ｗｉｎｎら， １９９１， Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９； Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら， １９９１， Ｅ
ｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５； およびＴｒｅｓｃｏら，
１９９２， ＡＳＡＩＯ３８：１７−２３参照。

【０１７０】 ＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドのためのもう１つの送達系は「非ウイ
ルス」送達系である。遺伝子治療で用いられるかまたは提案されている技術はＤ
ＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直
接的注入、ＣａＰＯ₄沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポフェ
クションおよびコロイド分散を含む（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．， １９９３，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０（５１１０）：９２６−３２）。これらの方法のい
ずれも当業者に広く利用でき、本発明で用いるのに適当であろう。他の適当な方
法は当業者に利用可能であり、本発明はトランスフェクションの利用可能な方法
のいずれを用いても達成できると理解されるべきである。いくつかのそのような
方法は当業者に利用されており、種々の程度の成功をおさめている（Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ，Ｒ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０（５１１０）：９２６−
３２）。

【０１７１】 好ましくは、非ウイルス送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系はマ
クロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、および水中油型エ
マルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質−ベースの系を
含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームであり、これはイン・ビトロお
よびイン・ビボにて送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。リポソームは
自己組立性のコロイド粒子であり、ここに、ホスファチジルセリンまたはホスフ
ァチジルコリンのごとき両親媒性分子より構成される脂質二層が、該脂質二層が
親水性内部を囲むように周囲の媒質の一部をカプセル化する。単一ラメラまたは
多ラメラリポソームは、内部が所望の化学物質、薬物、または本発明におけるご
とく、単離されたＤＮＡ分子を含有するように構築することができる。例えば、
０．２−４．０μｍのサイズの範囲である大きな単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）が、
ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷ビリオンのごとき大きなマクロ分子を含有する水性緩
衝液の実質的パーセンテージをカプセル化できることが示されている。一旦水性
内部内にカプセル化されれば、これらのマクロ分子は生物学的活性な形態で哺乳
動物細胞に送達することができ（Ｆｒａｌｅｙ， Ｒ．およびＰａｐａｈａｄｊ
ｏｐｏｕｌｏｓ， Ｄ．１９８１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．
， ６：７７−８０）。リポソームが効果的な遺伝子導入ビヒクルとなるために
は、以下の特徴が存在すべきである：（１）その生物学的活性を台なしにするこ
となく高効率で注目する遺伝子をカプセル化すること；（２）非標的細胞と比較
して標的細胞に優先的かつ実質的に結合すること；（３）高効率で標的細胞の細
胞質に小胞の水性内容物が送達されること；および（４）遺伝的情報が正確かつ
効果的に発現されること（Ｍａｎｎｉｎｏ， Ｒ．ら、 １９８８、 Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ６（７）：６８２−９０）。

【０１７２】 リポソームの組成物は、通常、通常はステロイド、特にコレステロールと組み
合わされた、リン脂質、特に高い相転移温度リン脂質の組合せである。他のリン
脂質または他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特徴はｐＨ、イ
オン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームの生産で有用な脂
質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドお
よびガングリオシドのごときホスファチジル化合物を含む。特に好ましいのはジ
アシルホスファチジルグリセロールであり、ここに、脂質部位は１４−１８の炭
素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している。例示的なリン脂質
は卵ホスファチジルコリン、ジパルミトリルホスファチジルコリンおよびジステ
アロイルホスファチジルコリンを含む。

【０１７３】 リポソームの標的化は解剖学的および機械的要因に基づいて分類されている。
解剖学的分類は選択性のレベル、例えば、器官−特異性、細胞−特異性およびオ
ルガネラ−特異性に基づく。機械的標的化は、それが受動的または能動的である
かに基づいて区別することができる。受動的標的化は洞様毛細血管を含有する器
官中の細網内皮細胞系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利
用する。他方、能動的標的化は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、
糖、糖脂質または蛋白質のごとき特異的リガンドにリポソームをカップリングさ
せることによって、あるいはリポソームの組成またはサイズを変化させて局所化
の天然に起こる部位以外の器官および細胞型への標的化を達成することによって
、リポソームを改変することを含む。好ましくは、該リガンドは、リポソームを
特異的細胞−表面リガンドに標的化するのに用いることができるポリクローナル
またはモノクローナル抗体である。該リガンドは、それが標的細胞上の抗原性エ
ピトープに効果的に結合する限り、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂のごとき抗体断
片とすることもできる。好ましくは、抗体または抗体断片は、標的細胞に専ら見
出される抗原を認識する。例えば、スカベンジャー受容体Ａのごとき、マクロフ
ァージ細胞上に特異的に発現されるある種の抗原は、抗体−ＡＢＣ１リポソーム
を直接的にマクロファージ細胞に標的化する目的で開発することができる。

【０１７４】 多数の手法を用いて、リポソーム二層にポリクローナルもしくはモノクローナ
ル抗体いずれかを共有結合させることができる。また、脂質基をリポソームの脂
質二層に取り込んで、リポソーム二層と安定に会合した標的化リガンドを維持す
ることができる。加えて、脂質鎖を標的化リガンドに接合するのに種々のリンキ
ング基を用いることができる。

【０１７５】 ここに示す研究は、核受容体に対するリガンドがコレステロール流出の増加を
行うことができるのを示した。従って、もう１つの実施形態において、本発明は
、哺乳動物対象における細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な
量にて核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与する工
程を含むことを特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適
した方法を提供する。医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用い、核受
容体に対するリガンドを含む医薬組成物を調製しそれを投与することができる。
核受容体リガンドの十分な量はコレステロール流出を増加させるリガンドの量で
ある。そのような量は、種々の投与量のリガンドの投与の前および後にコレステ
ロールの流出を測定し、コレステロール流出の増加を行う用量を決定することに
よって決定することができる。コレステロール流出はさきに記載したアッセイを
用いて測定することができる。

【０１７６】 核受容体は、小さな親油性ホルモンの効果を転写応答に導入することによって
、脊椎動物の発生および成体生理学において臨界的な役割を演じるリガンド−活
性化転写因子である。ペルオキシソームプロリフェレーター−活性化受容体（Ｐ
ＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ファルネ
ソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、およびステロイドおよび生体内異物受容体（ＳＸＲ
）を含めた核受容体のいくつかのファミリーが存在する。該ＰＰＡＲファミリー
は、３つの密接に関連する遺伝子産物ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲβ
／δを含む。ＰＰＡＲσは細胞内および細胞外脂質代謝の鍵となるレギュレータ
ーとして示されてきた。脂肪酸に結合すると、ＰＰＡＲαはペルオキシソームの
増殖を刺激し、脂肪酸のβ−酸化に関与するいくつかの酵素の合成を誘導する。
また、ＰＰＡＲα受容体はフィブレート、高いトリグリセリドレベルの低下につ
き処方された薬物に対する分子標的でもある（Ｉｓｓｅｍａｎら、 Ｎａｔｕｒ
ｅ， ３４７，６４５（１９９０））。フィブレートは、リポ蛋白質および脂肪
酸の代謝に影響する非常に多数の遺伝子の転写を調節するＰＰＡＲリガンドとし
て作用する。加えて、チアゾリジンジオン化合物のクラスに属する化合物のごと
きＰＰＡＲγリガンドはＨＤＬを増加させ、ヒトにおいてトリグリセリドレベル
を低下させることが示されている。

【０１７７】 ＬＸＲは、過剰コレステロールの異化を調節するオキシステッロール受容体で
ある。ＬＸＲαは、コレステロールの胆汁酸への変換で律速工程を担う酵素をコ
ードするＣＹＰ７ａ遺伝子中のＤＮＡ応答エレメントに、ＲＸＲを持つヘテロダ
イマーとして結合することが示されている。研究は、ダイエットコレステロール
に応答してＣＹＰ７ａ遺伝子の転写を増加させることができないため、コレステ
ロール−リッチなダイエットを摂取した場合、ＬＸＲαを欠くマウスは膨大な量
のコレステロールエステルをその肝臓に蓄積することを示してｉｒｕ（Ｐｅｅｔ
ら， Ｃｅｌｌ， ９３：６９３（１９９８））。ＬＸＲαナルマウスでのさら
なる研究は、コレステロールおよび脂肪酸のホメオスタシスに参画するいくつか
の他の遺伝子の調節にもＬＸＲαが関与することを示す。いくつかの組織におい
て発現され、ＬＸＲαと同一のオキシステロールによって活性化される密接に関
連する核受容体ＬＸＲβの生物学的役割は依然として明らかでない（Ｓｏｎｇら
、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９１：１０８０９（１９９４
）； Ｓｅｏｌ， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｎｏｌ．， ９：７２（１９９５））
。

【０１７８】 革命的にＬＸＲαに関連するＦＸＲもまたコレステロールのホメオスタシスに
関与する。ＬＸＲαと同様に、ＦＸＲはＲＸＲ受容体とのヘテロダイマーとして
機能する（Ｓｃｈｗａｒｔｚら， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，
９：１１３（１９９８）； Ｖｌａｈｃｅｖｉｃら， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ， １１３：１９４９（１９９７））。ＦＸＲは、合成レチノイドＴ
ＴＮＰＢおよび超生理学的濃度の全てのトランスレチノイン酸によって活性化さ
れる（Ｘａｖａｃｋｉら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９４
：７０−０（１９９７））。最近の研究は、ＦＸＲが核胆汁酸受容体であること
を示す。まず、ＦＸＲは、肝臓、腸および腎臓を含めた胆汁酸がそれを通って循
環する組織で豊富に発現される（Ｓｅｏｌら， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
．， ９：７２（１９９５）； Ｆｏｒｍａｎら， Ｃｅｌｌ， ８１：６８７
（１９９５））。また、ＦＸＲは、最近、そのうちケノデオキシコール酸（ＣＤ
ＣＡ）が最も優れている生理学的濃度のいくつかの胆汁塩に対する受容体として
働くことが示されている（Ｋｌｉｅｗｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４：７
５７−２８４（１９９９）； Ｍａｋｉｓｈｉｍａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
８４：１３６２−１３６３（１９９９））。ＣＤＣＡは、ＣＹＰ７ａおよび腸胆
汁酸−結合蛋白質をコードするものを含めた、胆汁塩のホメオスタシスに参画す
るいくつかの遺伝子の発現を調節することが知られている。

【０１７９】 実施例１３に詳細に記載するごとく、ＬＸＲ、ＲＸＲおよびＰＰＡＲ核受容体
に対するリガンドが、コレステロール−負荷マウスマクロファージ細胞において
アポＡＩ−誘導コレステロール流出を増加させることが示された。例えば、９シ
ス−レチノイン酸（３０ｎｇ／ｍｌ）の投与は、これらの細胞においてアポＡＩ
−誘導コレステロール流出のほぼ三倍増加を生じた。同様に、２２（Ｒ）ヒドロ
キシコレステロール（５μ／ｍｌ）の投与は、アポＡＩ−誘導コレステロール流
出のほぼ３倍増加を生じた。フェンフィブレート（３μｇ／ｍｌ）を摂取した細
胞は、コレステロール流出のほぼ２倍増加を生じた。これらの結果は、核受容体
を変調させて、マクロファージからのアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出
の速度を増加させることを示す。さらに、実施例１３に記載されているごとく、
９−シス−ＲＡは、用量依存的にマクロファージ細胞からのコレステロール流出
を媒介した。ベンザフィブレートのごとき他の核受容体アクチベータはコレステ
ロール流出を増加させることが示された（データは示さず）。

【０１８０】 従って、核受容体リガンドを投与することによってコレステロール流出を増加
させる方法において、リガンドは、好ましくは、ＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、Ｆ
ＸＲおよびＳＸＲ核受容体リガンドよりなる群から選択される。ＬＸＲリガンド
を用いてコレステロール流出を増加させる好ましい実施形態において、リガンド
は、より好ましくは、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）ヒドロ
キシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレ
ステロール、および２４（Ｓ）、２５エポキシコレステロールＬＸＲリガンドよ
りなる群から選択される。最も好ましくは、ＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒドロ
キシコレステロールである。ＲＸＲリガンドを用いてコレステロール流出を増加
させる好ましい実施形態において、リガンドは、より好ましくは、９−シスレチ
ノイン酸、レチノール、レチナール、オール−トランスレチノイン酸、１３−シ
スレチノイン酸、アシトレチン、フェンレチニド、エトレチネート、ＣＤ４９５
、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴＡＢ、ＬＤＧ１０６９よりなる群
から選択される。最も好ましくは、該ＲＸＲリガンドは９−シスレチノイン酸で
ある。ＰＰＡＲリガンドを用いてコレステロール流出を増加させるもう１つの好
ましい実施形態において、リガンドは、好ましくは、チアゾリジンジオン化合物
のクラスから選択される。

【０１８１】 もう１つの好ましい実施形態において、１を超える核受容体リガンドが哺乳動
物対象に投与されて、コレステロール流出を増加させる。好ましくは、２以上の
核受容体リガンドを対象に投与する場合、リガンドはＬＸＲおよびＲＸＲリガン
ドである。より好ましくは、核受容体リガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステ
ロールおよび９−シスレチノイン酸である。

【０１８２】 さらにもう１つの実施形態において、本発明は、コレステロール流出を増加さ
せるのに十分な量でエイコサノイドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを
特徴とする哺乳動物対象において、細胞からのコレステロール流出を増加させる
のに適した方法を提供する。医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用い
、エイコサノイドを含む医薬組成物を調製し、投与することができるエイコサノ
イドの十分な量は、コレステロール流出を増加させる量である。そのおうな量は
、種々の投与量エイコサノイドの投与前および後にコレステロール流出を測定し
、コレステロール流出の増加を行う用量を測定することによって決定することが
できる。コレステロール流出は前記したアッセイおよび方法を用いて測定するこ
とができる。

【０１８３】 実施例１４に記載されたごとく、エイコサノイドは、コレステロール−負荷マ
ウスマクロファージ細胞におけるアポＡＩ−誘導コレステロール流出を増加させ
ることが示された。例えば、ＰＧＩ２（２５ｎｍ）の投与は、これらの細胞にお
いてアポ−誘導コレステロール流出のほぼ２倍増加を生じさせた。同様に、ＰＧ
Ｅ１（ｎＭ）の投与はアポＡＩ−誘導コレステロール流出のほぼ３倍増加を生じ
させた。これらの結果はエイコサノイドが、マクロファージからのアポリポ蛋白
質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができることを示す。従っ
て、好ましい実施形態において、エイコサノイドはプロスタグランジンＥ２、プ
ロスタサイクリン（プロスタグランジンＩ２）およびプロスタグランジンＪ２エ
イコサノイドよりなる群から選択される。

【０１８４】 （ＡＢＣ１発現／活性を増加させるための方法と化合物）） コレステロール流出を促進するようにＡＢＣ１が機能するとすれば、コレステ
ロール流出を増加させる１つの方法はＡＢＣ１の細胞発現を増加させることであ
る。従って、本発明は、哺乳動物対象における細胞においてＡＢＣ１の発現を増
加させる化合物の治療量を哺乳動物対象に投与することによって、該細胞からの
コレステロール流出を増加させるのに適した方法を提供する。化合物の治療量は
、ＡＢＣ１発現を増加させる化合物の量である。そのような量は、種々の投与量
の化合物の投与前および後にＡＢＣ１の遺伝子発現を測定し、ＡＢＣ１遺伝子発
現の増加を行う用量を測定することによって決定することができる。ＡＢＣ１遺
伝子の発現は、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、ＲＴ−ＰＣＲのごと
き、当該分野で知られここに記載した方法を用いてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの濃度を
測定することによって測定することができる。

【０１８５】 １つの好ましい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰアナログを投与してＡ
ＢＣ１の遺伝子発現を増加させることを含む。図８に示すごとく、ｃＡＭＰは、
正常な繊維芽細胞においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの発現をほぼ１０倍増加させる。
好ましくは、ｃＡＭＰアナログは、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡ
ＭＰおよび８−チオメチルｃＡＭＰよりなる群から選択される。もう１つの好ま
しい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰの合成を増加させて、ＡＢＣ１の遺
伝子発現を増大させることを含む。好ましくは、該化合物はフォルスコリンであ
る。さらにもう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰの分解を
阻害して、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させる化合物を投与することを含む。そ
のような化合物の例はホスホジエステラーゼ阻害剤である。好ましくは、ホスホ
ジエステラーゼ阻害剤はロリプラム、テオフィリン、３−イソブチル−１−メチ
ルキサンチン、Ｒ０２０−１７２４、ビンポセチン、ザプリナスト、ジピリダモ
ール、ミルリノン、アムリノン、ピモベンダン、シロスタミド、エノキシモン、
ペルオキシモン、およびベスナリノンホスホジエステラーゼ阻害剤よりなる群か
ら選択される。

【０１８６】 もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増
加させるのに十分な量にて核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与する
ことを含む。実施例１７に記載され、図１２に示されるごとく核受容体に対する
リガンドはＡＢＣ１の遺伝子発現を上昇調節できる。ＡＢＣ１プロモーターの制
御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するｐＡＰＲ１を用いるトランス
フェクション実験は、ＡＢＣ１プロモーターが、ＬＸＲおよびＲＸＲ核受容体に
対するリガンドの存在下で活性化されることを示した。具体的には、ｐＡＰＲ１
でトランスフェクトされたマクロファージ細胞は、２０ＯＨ−コールの存在下で
ルシフェラーゼレポーター活性の１９倍増加、９−シスＲＡの存在下でルシフェ
ラーゼ活性の１６倍増加、およびＥｔＯＨ対照と比較して双方のリガンドの存在
下でルシフェラーゼ活性の２８０倍増加を生じた。結果は、ステロールおよびレ
チノイドが共にＡＢＣ１プロモーターからの強力な転写応答を誘導することを示
す。さらに、双方のリガンドで処理した細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の
劇的な増加によって理解されるごとく、二つのクラスの化合物の間には明らかな
相乗効果がある。本発明の方法によると、好ましくは、リガンドはＬＸＲ、ＲＸ
Ｒ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳＸＲリガンドよりなる群から選択される。

【０１８７】 ＡＢＣ１蛋白質の細胞レベルの増加に加えて、ＡＢＣ１蛋白質の活性を増強す
ることによって、逆コレステロール輸送を促進することができる。かくして、も
う１つの実施形態において、本発明は、コレステロール流出を増加させるのに十
分な量にてＡＢＣ１活性を増加させる化合物の治療量を哺乳動物対象に投与する
工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象において細胞からのコレステロール流
出を増加させるのに適した方法を提供する。そのような化合物を含む医薬組成物
は、医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用いて調製し、それを投与す
ることができる。化合物の治療量は、コレステロール流出を増加させる化合物の
量である。そのような量は、種々の投与量の化合物の投与の前および後にコレス
テロール流出を測定し、先に記載した方法を用いてコレステロール流出の増加を
行う用量を測定することによって決定することができる。コレステロール流出の
増加がＡＢＣ１活性の増加によるか否かを判断するために、化合物の投与の前お
よび後に細胞試料に存在するＡＢＣ１蛋白質の量をここに記載する方法を用いて
測定する（実施例１１参照）。双方の測定（すなわち、化合物の投与前および投
与後）につき、コレステロール流出活性の量をＡＢＣ１蛋白質の濃度で割って、
ＡＢＣ１蛋白質の標準的な濃度で見出されるコレステロール活性の量を決定する
。蛋白質濃度に対して標準化されたコレステロール活性の観察された増加は、該
増加がＡＢＣ１活性の増加によるものであることを示す。

【０１８８】 （治療用化合物を同定するための方法） 本発明のもう１つの態様は、化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を変調する（すな
わち、上昇調節または下降調節）するか否かを判断するために化合物をスクリー
ニングする方法に関する。そのような化合物は、ＡＢＣ１発現を増加させ、それ
により、コレステロール流出を促進し、ＨＤＬ−コレステロールの血中レベルを
上昇させる治療用化合物の開発で有用であろう。従って、心血管病の治療で有用
であり得る化合物を同定する方法が提供される。１つの実施形態において、本発
明は、（ａ）哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分とレポーターｃＤＮＡを作
動可能に連結させて、組換えレポーター構築体を生じさせ；（ｂ）組換えレポー
ター構築体を宿主細胞の集団にトランスフェクトし；（ｃ）トランスフェクトさ
れた宿主細胞の試料においてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；（ｄ
）トランスフェクトされた細胞を、スクリーニングすべきテスト化合物と接触さ
せ；（ｅ）テスト化合物との接触の後にトランスフェクトされた宿主細胞の試料
におけるレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；次いで、（ｆ）テスト化
合物への暴露によって引き起こされたレポーター遺伝子発現のレベルの相対的変
化を比較し、それにより、ＡＢＣ１発現変調活性を決定する工程を含むことを特
徴とするＡＢＣ１発現変調活性につきテスト化合物をスクリーニングする方法を
提供する。

【０１８９】 まず、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結した異種レポーター遺
伝子を含む組換えレポーター構築体を構築する。Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；
Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ 編、 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．
（１９８９））； および Ａｕｓｕｂｅｌら編、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ ＳＯｎｓ（１９９４））を含めた、ここに記載された標準実験室的マニュ
アルにおけるもののごとき、良く知られた連結およびクローニング技術を用い、
ＡＢＣ１発現変調ポリヌクレオチドおよびレポーター遺伝子をベクターに挿入す
ることができる。別法として、ＡＢＣ１発現変調ポリヌクレオチドは、先に記載
したもののごとき商業的に入手可能なレポーター構築体に挿入することができる
。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびレポーター遺伝子の挿入に適したいずれのベ
クターも用いることができる。選択されたベクターは、使用される特定の宿主細
胞で機能すべきである。好ましくは、ベクターは哺乳動物宿主細胞に適合する。

【０１９０】 好ましくは、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は、ＡＢＣ１プロモーター活性を
含有するＡＢＣ１の５’フランキング領域である。１つの好ましい実施形態にお
いて、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３を含む。もう１つの好まし
い実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３のヌクレオ
チド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６
４３、１３９４−１６４３または１３９４−１５３２を含む。また、好ましくは
、異種レポーターは、ルシフェラーゼ、βーガラクトシダーゼ、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質をコードするポリヌク
レオチドよりなる群から選択される。より好ましくは、異種レポーターは、ルシ
フェラーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましい実施形態
において、組換えレポーター構築体は図１１に示されるｐＡＰＲ１である。

【０１９１】 次に、組換えレポーター構築体は宿主細胞の集団にトランスフェクトされる。
組換えレポーター構築体は、先に記載されたトランスフェクション方法、並びに
実施例８および１５に記載された方法のいずれかを用いて宿主細胞に導入するこ
とができる。例えば、レポーター構築体は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒
介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、他の公知
の記載された方法のいずれかを用いてトランスフェクトすることができる（例え
ば、（Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）参照）。宿主細胞は、適当な条件下で培養す
ると、引き続いて測定することができるレポーターポリペプチドを合成するいず
れの細胞でもあり得る。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。より
好ましくは、哺乳動物宿主細胞はマクロファージ、繊維芽細胞、肝細胞または腸
細胞である。より好ましくは、宿主細胞はＲＡＷ２６４．７細胞、Ｔｈｐ−１細
胞およびＨｅｐＧ２細胞よりなる群から選択される。レポーター構築体の濃度お
よびトランスフェクションの持続は、トランスフェクション方法および用いる宿
主細胞のタイプおよび濃度に依存して変化させることができる。レポーター構築
体の適当な濃度およびトランスフェクション時間の決定は当業者の技量の範囲内
のものである。

【０１９２】 トランスフェクションに続き、テスト化合物に暴露されなかったトランスフェ
クト宿主細胞の試料をアッセイして、レポーター遺伝子発現のレベルを測定する
。未暴露トランスフェクト宿主細胞の試料で見出されるレポーター遺伝子発現の
レベルは対照測定を提供する。トランスフェクトされた宿主細胞を溶解させ、レ
ポーター遺伝子発現のレベルを、当該分野で良く知られた方法のいずれかを用い
てアッセイする。レポーター遺伝子発現のレベルを測定するのに用いられるアッ
セイは、トランスフェクションで用いるレポーター構築体に依存して異なる。例
えば、もしルシフェラーゼレポーター構築体を用いれば、細胞溶解物のルシフェ
ラーゼ活性は、実施例１５に記載されたごとく、ルミノメーターを用いて光単位
として測定される。

【０１９３】 トランスフェクトされた宿主細胞の異なる試料を、スクリーニングすべきテス
ト化合物と接触させ、これらの細胞で見出されるレポーター遺伝子発現のレベル
を引き続いて測定する。好ましくは、トランスフェクトされた宿主細胞をテスト
化合物と約４−４８時間接触させる。より好ましくは、トランスフェクトされた
宿主細胞をテスト化合物と約８−３６時間接触させる。なおより好ましくは、ト
ランスフェクトされた宿主細胞をテスト化合物と約２４時間接触させる。未暴露
（対照）細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルを測定するのに用いられる
同一アッセイを用いて、テスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺伝
子発現のレベルを測定すべきである。

【０１９４】 最後に、未暴露対照細胞で見出されたレポーター遺伝子の発現のレベルをテス
ト化合物に暴露された細胞で見出されたレポーター遺伝子発現のレベルと比較し
て、テスト化合物がＡＢＣ１発現変調活性を有するか否かを決定する。もし双方
の細胞試料における遺伝子発現のレベルが同一またはほぼ同一であれば、テスト
化合物はＡＢＣ１遺伝子発現を変調しない。対照細胞で見出されたレポーター遺
伝子発現のレベルに対するテスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺
伝子発現のより高いレベルは、テスト化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を上昇調節
することを示す。対照細胞で見出されたレポーター遺伝子発現のレベルに対する
テスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺伝子発現のより低いレベル
は、テスト化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を下降調節することを示す。

【０１９５】 本発明のもう１つの態様は、化合物がＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促
進するか否かを決定するためにテスト化合物をスクリーニングする方法に関する
。そのような方法は、（ａ）培養中に維持された哺乳動物細胞の試料におけるコ
レステロール流出のレベルをアッセイして、コレステロール流出の対照レベルを
決定し、（ｂ）哺乳動物細胞をスクリーニングすべきテスト化合物と接触させ；
（ｃ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料におけるコレステロール流出のレ
ベルをアッセイし；次いで、（ｄ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料にお
けるＡＢＣ１−依存性コレステロール流出のレベルをアッセイし、それにより、
テスト化合物が培養中の細胞からのＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促進す
るか否かを決定することを含む。

【０１９６】 培養細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルは、当該分野で知られこ
こに記載した方法を用いて測定することができる（実施例１参照）。培養に維持
することができるいずれの哺乳動物細胞を用いてもコレステロール流出を測定す
ることができる。該細胞は一次培養から、または不死化細胞系から由来すること
ができる。便宜のため、実施例１に記載されたごとく、ヒトパピローマウイルス
１６のインサート、オンコジーンＥ６およびＥ７、および選択マーカー遺伝子を
持つベクターを含有する両種性レトロウイルスでトランスフェクトすることによ
って細胞を不死化することができる。好ましくは、培養された細胞は繊維芽細胞
、マクロファージ、肝細胞または腸細胞である。より好ましくは、培養された細
胞はＲＡＷ２６４．７細胞である。

【０１９７】 テスト細胞と接触されなかった細胞の試料におけるコレステロール流出のレベ
ルを測定して、コレステロール流出の対照レベルが得られる。加えて、テスト化
合物と接触された哺乳動物細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルを測
定して、テスト化合物によって影響されたコレステロール流出の量が測定される
。また、テスト化合物と接触された哺乳動物細胞の試料におけるＡＢＣ１−媒介
コレステロール流出のレベルを測定して、テスト化合物によって影響されたＡＢ
Ｃ１−媒介コレステロール流出の量が測定される。好ましくは、コレステロール
流出またはＡＢＣ１−媒介コレステロール流出をアッセイする約８−２４時間前
に、細胞をテスト化合物と接触させる。ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレ
ベルは、結合に際して、ＡＢＣ１の活性を阻害する抗−ＡＢＣ１抗体を用いてア
ッセイすることができる。別法として、ＡＢＣ１の発現を阻害するアンチセンス
ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベル
をアッセイすることができる。例えば、配列番号：５７を含むアンチセンスＡＢ
Ｃ１ポリヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルをア
ッセイすることができる（実施例７参照）。テスト化合物と接触させると同時に
および同一の持続の間、細胞を抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡＢＣ１ポ
リヌクレオチドと接触させるべきである。

【０１９８】 もし対照コレステロール流出のレベルが、テスト化合物と接触させた細胞で見
出されたコレステロール流出のレベルと同一またはほぼ同一であれば、当該化合
物はコレステロール流出を促進しない。コレステロール流出の対照レベルよりも
大きいテスト化合物と接触した細胞で見出されたコレステロール流出のレベルの
増加は、テスト化合物によって促進されたコレステロール流出の量を示す。テス
ト化合物単独と接触した細胞で見出されたコレステロール流出およびテスト化合
物および抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドと接触
した細胞で見出されたコレステロール流出の間の差は、ＡＢＣ１を通じて媒介さ
れたコレステロール流出の量を示す。例えば、もしコレステロール流出の対照レ
ベルが１．０であって、テスト化合物と接触した細胞で見出されたコレステロー
ル流出のレベルが１．１であれば、テスト化合物は１０％だけコレステロール流
出を促進する。もしテスト化合物および抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡ
ＢＣ１ポリヌクレオチドと接触した細胞で見出されたコレステロール流出が１．
０であれば、テスト化合物によって引き起こされたコレステロール流出の増加は
全くＡＢＣ１−媒介される。

【０１９９】 （冠動脈心臓病に対する罹患性を検出する方法） また、本発明は、ヒト対象を含めた哺乳動物対象においてＡＢＣ１遺伝子また
は蛋白質の発現の比較レベルを検出する方法に関する。コレステロール流出にお
けるＡＢＣ１の役割を仮定すれば、ＡＢＣ１遺伝子または蛋白質発現のあらかじ
め決定した標準レベルに対する哺乳動物対象におけるＡＢＣ１遺伝子または蛋白
質発現の増加したレベルの測定を用いて、該対象における冠心臓病に対する罹患
性を示すことができる。従って、本発明は、（ａ）哺乳動物対象からテスト細胞
試料を得；（ｂ）テスト細胞試料においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルをア
ッセイし；次いで、（ｃ）テスト細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレ
ベルとＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のあらかじめ決定した標準レベルとを比較し、そ
れにより、哺乳動物対象におけるＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベルを検出する工
程を含むことを特徴とする哺乳動物対象においてＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベ
ルを検出する方法を提供する。

【０２００】 まず、ヒト対象を含めた哺乳動物対象からテスト細胞試料を得る。テスト細胞
試料は、単球集団が豊富化された血液試料であり得る。単球は、例えば、細胞サ
イズ、細胞密度または細胞新和性に基づいて良く知られた細胞分離手法を用いて
豊富化することができる。次に、テスト細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発
現のレベルをアッセイする。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルは、実施例２およ
び９においてここに記載した方法を含めた、ｍＲＮＡの調製および検出について
の良く知られた方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、Ａ
ＢＣ１ ｍＲＮＡの濃度は、逆転写ポリメラーゼ鎖反応、ノーザンブロット分析
またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって測定することができる。ＡＢＣ１ ｍＲ
ＮＡ濃度は、テスト細胞試料で見出された全ｍＲＮＡの濃度に対して標準化され
るべきである。最後に、テスト細胞試料におけるＡＢＣ１発現を、あらかじめ決
定した標準レベルのＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現と比較する。あらかじめ決定した標
準レベルのＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現は、哺乳動物対象の代表的な集団から採取し
た細胞試料で見出されたＡＢＣ１ ｍＲＮＡの平均濃度および分布を測定するこ
とによって得ることができ、ここに、哺乳動物対象は、それからテスト細胞試料
が得られた対象と同一の種であり、およびここに、哺乳動物対象は冠心臓病、タ
ンジール病、または低ＨＤＬ−コレステロールに関連する他の病気を有さず、（
正常範囲内にあるＨＤＬ−コレステロールレベルによって示して）正常範囲内の
コレステロール流出活性を有すると考えられる。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のあら
かじめ決定した標準レベルに対する哺乳動物対象のテスト細胞試料におけるＡＢ
Ｃ１ ｍＲＮＡ発現の減少したレベルの測定を用いて、哺乳動物対象における冠
心臓病に対する罹患性を示すことができる。

【０２０１】 同様に、ＡＢＣ１蛋白質の減少したレベルの検出を用いて、コレステロール流
出に対する減少した能力および冠心臓病に対する罹患性を示すことができる。従
って、本発明のもう１つの実施形態は哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質の比
較レベルを検出する方法を提供する。そのような方法は、（ａ）哺乳動物対象か
らテスト細胞試料を得；（ｂ）テスト細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量をア
ッセイし；次いで（ｃ）テスト細胞試料におけるＡＢＣ１蛋白質の量をＡＢＣ１
蛋白質のあらかじめ決定した標準量と比較し、それにより、哺乳動物対象におけ
るＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出する工程を含む。

【０２０２】 ＡＢＣ１蛋白質の量は、蛋白質を測定する良く知られた方法のいずれかを用い
てアッセイすることができる。好ましくは、ＡＢＣ１蛋白質の量はイムノアッセ
イを用いて測定する。１つの実施形態において、ＡＢＣ１蛋白質の量は、（ａ）
細胞試料を抗−ＡＢＣ１抗体の集団と接触させ、次いで、（ｂ）細胞試料と会合
した抗−ＡＢＣ１抗体を検出することによって測定される。例えば、ＡＢＣ１蛋
白質は、実施例１１に記載されたごとくＣ−末端に位置するＫＮＱＴＶＶＤＡＶ
ＬＴＳＦＬＱＤＥＫＶＫＥＳに対応する合成ペプチドに対して生起した抗血清と
接触させることができる。抗−ＡＢＣ１抗体は、例えば、ウエスタンブロッティ
ング、免疫沈殿およびＦＡＣＳを含めた当該分野で知られたいくつかの方法を用
いて検出することができ、ここに、該検出は放射能、比色または蛍光標識を用い
て達成することができる。細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量を測定するため
の１つの好ましい方法は免疫沈殿であり、ここに、ビオチン化ＡＢＣ１蛋白質を
抗−ＡＢＣ１抗体と接触させ、結合した抗−ＡＢＣ１抗体をストレプトアビジン
ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて検出する。

【０２０３】 テスト細胞試料中のＡＢＣ１蛋白質の量をＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定し
た標準量と比較する。ＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標準量は、哺乳動物
対象の集団から採取した細胞試料で見出されたＡＢＣ１蛋白質の平均濃度を測定
することによって得ることができ、ここに、哺乳動物対象は、それからテスト細
胞試料が得られた対象と同一の種であり、およびここに、哺乳動物対象は冠心臓
病、タンジール病または低ＨＤＬ−コレステロールに関連する他の病気を有さず
、（正常範囲内にあるＨＤＬ−コレステロールレベルによって示して）正常範囲
内のコレステロール流出活性を有すると考えられる。

【０２０４】 （ＡＢＣ１抗体） 本明細書中で用いるごとく、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」
（Ｍａｂ）は、無傷分子、ならびに蛋白質に特異的に結合することができる（例
えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片のごとき）抗体断片を含むことを意味す
る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片は無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からよ
り迅速に除去され、無傷抗体よりも低い非特異的組織結合を有することができる
（Ｗａｈｌら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．， ２４，３１６−３２５（１９
８３））。かくして、これらの断片、ならびにＦＡＢの産物または他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリが好ましい。さらに、本発明の抗体はキメラ、単一鎖およ
びヒト化抗体を含む。

【０２０５】 さらなる実施形態はキメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化
バージョンを含む。そのようなヒト化抗体は公知の技術によって調製することが
でき、該抗体をヒトに投与すると低下した免疫原性の利点を提供する。ひとつの
実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体はネズミ抗体の可変領域（または
ちょうどその抗原結合部位）およびヒト抗体に由来する定常領域を含む。別法と
して、ヒト化抗体断片はネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗
体に由来する（抗原結合部位を欠く）可変領域断片を含むことができる。キメラ
およびさらに工夫したモノクローナル抗体の生産のための手法はＲｉｅｃｈｍａ
ｎｎら， （Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， １９８８）， Ｌｉｕら（ＰＮ
ＡＳ ８４：３４３９， １９８７）， Ｌａｒｒｉｃｋら， （Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， １９８９）， およびＷｉｎｔｅｒおよびＨ
ａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９， Ｍａｙ １９９３）に記載されている
ものを含む。

【０２０６】 抗体を生産するひとつの方法は、トランスジェニックマウスのごとき非−ヒト
動物を、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２
９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、または配列番号：１を含むポリヌクレ
オチドに対して少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチドから翻訳されたポリペプチドで免疫化し、それにより、記載したポリ
ヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドに対して向けられた抗体が該動物にお
いて創製されることを含む。非−ヒト動物においてヒト抗体を創製するための手
法が開発されている。該抗体は部分的にヒトであるか、または好ましくは完全に
ヒトのものとすることができる。その中に１以上の免疫グロブリン鎖をコードす
る遺伝物質が導入された（トランスジェニックマウスのごとき）非−ヒト動物を
使用することができる。そのようなトランスジェニックマウスは種々の方法で遺
伝子的に改変することができる。遺伝子走査の結果、免疫化に際して動物によっ
て生産された少なくともいくつかの（好ましくは、実質的にすべての）抗体にお
いて内因性免疫グロブリン鎖を置き換えたヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を
得ることができる。トランスジェニック動物を、記載したポリヌクレオチドのい
ずれかから翻訳されたポリペプチドで免疫化することによって生産された抗体が
ここに提供される。

【０２０７】 １以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が種々の手段で不活化されたマウスが調
製されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子はマウスに導入されて、不活化マウス
遺伝子を置き換えている。動物で生産された抗体は、動物に導入されたヒト遺伝
物質によってコードされたヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を一体化させる。
生産のための技術およびかかるトランスジェニック動物の使用の例は、ここに引
用して一体化させる米国特許第５、８１４、３１８号、第５、５６９、８２５号
および第５、５４５、８０６号に記載されている。

【０２０８】 モノクローナル抗体は、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェ
ニック動物から収穫された脾臓細胞の不死化することによって通常の手法によっ
て生産することができる。通常の手法によって、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合さ
せてハイブリドーマを生産することができる。

【０２０９】 ハイブリドーマ細胞系を生産する方法は、そのようなトランスジェニック動物
を、記載されたポリヌクレオチドのひとつから翻訳されたポリペプチドの少なく
とも７つの連続アミノ酸残基を含む免疫原で免疫化し；免疫化された動物から脾
臓細胞を収穫し；収穫された脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合させ、それにより、
ハイブリドーマ細胞を創製し；次いで、記載したポリヌクレオチドの１つから翻
訳されたポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系を同定するを含む。そのようなハイブリドーマ細胞系、およびそれから生
産されたモノクローナル抗体は本発明に含まれる。ハイブリドーマ細胞系によっ
て分泌されたモノクローナル抗体は通常の技術によって精製される。

【０２１０】 該抗体は、ＡＢＣ１ポリペプチドへの特異的結合に際して、ＡＢＣ１ポリペプ
チドの活性を阻害することができる。好ましくは、抗体は、結合に際して、ＡＢ
Ｃ１ポリペプチドのコレステロール輸送活性を阻害する。そのような抗体は、コ
レステロール輸送に必須の領域に対応するポリペプチドで非−ヒト動物を免疫化
することによって作成することができる。抗体は、記載したコレステロール流出
アッセイのいずれかを用いて、それがコレステロール流出を阻害するか否かを判
断するためにテストすることができる。そのような不活化抗体を用いて、ここに
記載したコレステロール流出アッセイのいずれかのごときイン・ビトロアッセイ
で使用して、テスト化合物がＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促進するか否
かを決定することができる。また、不活化抗体をイン・ビトロアッセイで用いて
、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出することがで
きる。該不活化抗体は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調す
るか否かを決定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットで有用
である。

【０２１１】 （治療用化合物同定のためのキット） また、本発明は、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をス
クリーニングするのに適したキットを含む。該キットは、少なくとも１つのアッ
セイを行うのに十分な量にて、別々にパッケージされた試薬として、哺乳動物Ａ
ＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーターｃＤＮＡを含む組
換えレポーター構築体を含む。パッケージされた試薬の使用のための指令書もま
た典型的には含まれる。哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は５’フランキ
ング配列を含む。１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の
発現変調部分は配列番号：３を含む。１つの好ましい実施形態において、哺乳動
物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、
１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１
６４３または１３８４−１５３２を含む。レポーターｃＤＮＡはいずれの適当な
レポーター遺伝子でもあり得る。特に好ましい実施形態において、組換えレポー
ター構築体はｐＡＰＲ１である。もう１つの実施形態において、該キットは、さ
らに、レポーター蛋白質を検出するための手段を含む。かくして、キットは、レ
ポーター蛋白質検出で用いられる緩衝液および基質のごとき試薬を含む。

【０２１２】 本明細書中で用いるごとく、用語「パッケージ」とは、本発明の組換えベクタ
ーを固定された限界内に保持することができるガラス、プラスチック、（例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカルボネート）、紙、ホイル等のご
とき固体マトリックスまたは材料を言う。かくして、例えば、パッケージは、ミ
リグラム量の考えられるベクターを含有させるのに用いるガラスバイアルであり
得る。

【０２１３】 「使用のための指令書」は、典型的には、試薬濃度または試薬および混合すべ
き試料の相対的量、試薬／試料混合のための維持時間、温度、緩衝液の条件等の
ような少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する触れることができ
る表現を含む。

【０２１４】 加えて、本発明は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調する
か否かを決定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを含む。
１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分
な量にて、別々にパッケージされた試薬としての不活化抗−ＡＢＣ１抗体を含む
。パッケージされた試薬の使用のための指令書もまた典型的には含まれる。

【０２１５】 もう１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な
量のアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドおよび使用のための指令書を含む
。好ましくは、アンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドは配列番号：５３を含
む。

【０２１６】 （マイクロアレイ） ＤＮＡマイクロアレイ技術を本発明に従って利用することができるのは認識さ
れるであろう。ＤＮＡマイクロアレイは、例えばガラスのような、固体支持体上
に位置させた核酸のミニチュア高密度アレイである。該アレイ内の各細胞または
エレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーショ
ンのための標的として作用する単一核酸種の多数のコピーを含有する。ＤＮＡマ
イクロアレイ技術を用いる発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡをまず細胞
または組織試料から抽出し、次いで、酵素により蛍光標識ｃＤＮＡに変換する。
この物質をマイクロアレイにハイブリダイズさせ、未結合ｃＤＮＡを洗浄によっ
て除去する。次いで、アレイ上に表された区別される遺伝子の発現を、各標識核
酸分子に特異的に結合した標識ｃＤＮＡの量を定量することによって可視化する
。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的物質の単一試料から高スル
ープット平行方法で定量することができる。

【０２１７】 この高スループット発現プロファイリングは、限定されるものではないが：治
療剤での標的としてのＡＢＣ１病気−関連遺伝子の同定および有効化；関連する
ＡＢＣ１分子およびその阻害剤の分子毒物学；臨床試験のための代用物マーカー
の集団の層化およびその創製；および高スループットスクリーニングにおける選
択的化合物の同定で助けることによる関連ＡＢＣ１ポリペプチド小分子薬物発見
の増強を含めた、本発明のＡＢＣ１分子に対する広い範囲の適用を有する。

【０２１８】 実施例２においてここで考察したごとく、遺伝的異常を持つ個体の細胞に由来
するＲＮＡの試料を用い、それらを、正常個体からのＲＮＡと比較する方法が開
発された。歴史的には、遺伝した病気の原因の同定は、遺伝実験（連鎖分析）に
おいて欠陥に密接にリンクすることが示されている数百万の塩基対の間隔内で疑
われる遺伝子を同定するための、数年の生化学的分析、またはより最近では、数
年の遺伝子マッピングおよび位置クローニングに由来した。最も顕著には「遺伝
子チップ」を介するマルチジーン発現分析の使用は、そのような発見のペースを
改革することができる。遺伝病をもつ異常個体からの細胞に由来するＲＮＡ−対
−正常個体からのＲＮＡの試料の発現を比較することは、その対応するｍＲＮＡ
が異常病気細胞において失われ、ひどく過小表現されるかまたはひどく過剰表現
される遺伝子を迅速に明らかにすることができる。

【０２１９】 本明細書中で用いる用語「個体」とは、例えば、哺乳動物、植物のごとくＲＮ
Ａを有する生きた生物をいう。この方法は、好ましくは、ヒト遺伝子異常性の源
を同定するのに用いられる。より好ましくは、該方法は、タンジール病における
遺伝的欠陥としてＡＢＣ１を同定するごときヒト心臓および心血管障害の遺伝的
源を検出するのに有用である。

【０２２０】 本明細書中で用いられる用語「異常性」とは、ある種の個体の大部分と比較し
て該種における少数の個体で生理学的偏差を引き起こす遺伝的差異をいう。該異
常性はポジティブな異常性またはネガティブな異常性であり得る。例えば、ポジ
ティブな植物異常性は、該種における他の個体と比較していくつかの個体植物を
日照り抵抗性とする遺伝的差異であろう。ネガティブな異常性は、植物の同一種
における個体を正常植物よりも日照り損傷を受けやすくするものであろう。

【０２２１】 該方法は、タンジール病の遺伝的原因に我々の調査を参照することによって最
良に記載することができる。我々は、タンジール病を持つ個体から培養した細胞
からのＲＮＡを用いて、ほぼ６０、０００の正常ヒト遺伝子を含有するマイクロ
アレイをプローブすることによって我々の調査を開始し、我々は、患者がほとん
どゼロレベルの循環高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）および心臓病の増大した危険性
を有するこの単一遺伝子病における血管遺伝子としてＡＢＣ１を同定するのにプ
ローブ結果を用いることができた。血管遺伝子の結果、そのような実験において
ゼロレベルの検出可能なｍＲＮＡシグナルが得られる必要はない。この成功した
例において、マイクロアレイ上の５８、８００プローブのうち大ざっぱに１７５
が、タンジール病ＲＮＡ−対−正常において２．５倍を超えて過小発現された。
いくつかのさらなる工程を採用して、クルプリット遺伝子の同一性を確認するこ
とができる。これらは、タンジール病を持つ無関係な個体でそのようなマイクロ
アレイプローブを反復し、各遺伝子の染色体地図の位置を決定して、病気にリン
クした報告された大きな遺伝子間隔と比較すること、候補蛋白質およびそれらの
ホモログの同様の機能の考慮、生化学的テスト、および突然変異を見い出すため
の患者における最良の候補遺伝子の配列決定を含む。これらの方法において、遺
伝子発現マイクロアレイ分析は、タンジール病における欠陥としてのＡＢＣ１の
同定のごとき遺伝子した遺伝子欠陥の同定に導くことができる。

【０２２２】 この方法におけるさらなる利用性は、病気試料ｖｓ．正常において過小または
過剰発現される他の遺伝子が、補償的応答として、または病気原因に対する寄与
者としての、患者における遺伝的欠陥の結果で異なって調節されるものを含む。
これは、薬物開発に使用でき、治療および診断に対する関係で、病気の原因を解
明するのを助けることができる関連生物学的経路における他の蛋白質の同定を提
供することができる。遺伝子欠失または他の突然変異が、サラセミア（グロビン
遺伝子欠陥）および他の遺伝子病の多くの例で観察されるごとく、ｍＲＮＡの完
全な不存在を引き起こす場合、病気−対−正常試料の遺伝子発現分析は、より直
接的な方法で失われた遺伝子の同定に導くことができる。

【０２２３】 これらの例においては、ＲＮＡ試料でプローブされた遺伝子発現アレイは、プ
ローブ試料が顕微鏡スライド上に整列されたｃＤＮＡであるタイプのものである
が、別のアレイ技術が十分であろう。これらは、限定されるものではないが、Ｄ
ＮＡ試料をフィルター膜上に整列させるか、またはフォトリソグラフィーによっ
て「遺伝子チップ」上で合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるものを
含むであろう。

【０２２４】 一般に、用語マイクロアレイとは、紙、ナイロンもしくは他のタイプの膜、フ
ィルター、チップ、カバーグラス、またはいずれかの他の適当な個体支持体のご
とき基材上で合成された区別されるオリゴヌクレオチドのアレイをいう。当該分
野で知られた方法を用い、マイクロアレイを調製し、使用し、分析することがで
きる（例えば、その各々の明細書をここに引用して一体化させるＢｒｅｎｎａｎ
， Ｔ．Ｍ．ら（１９９５）米国特許第５、４７４、７９６号；ＰＣＴ出願ＷＯ
９５−２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．ら（１９９５）ＰＣＴ出願ＷＯ９５／
３５５０５；および米国特許第５、６０５、６６２号参照）。

【０２２５】 化学的カップリング手法およびインクジェットデバイスを用いて、基材の表面
上でアレイエレメントを合成することができる。また、ドットまたはスロット、
ブロットと類似したアレイを用いて、熱的、ＵＶ、化学的または機械的結合手法
を用い、基材の表面にエレメントを配置しリンクさせることができる。典型的な
アレイが、手動によって、または利用できる方法およびマシーンを用いることに
よって作成することができ、それは適切な数のエレメントを含有することができ
る。ハイブリダイゼーションの後、未ハイブリダイズドプローブを除去し、スキ
ャナーを用いて蛍光のレベルおよびパターンを測定することができる。マイクロ
アレイ上のエレメントにハイブリダイズする各プローブの相補性の程度および相
対的豊富さを、スキャンしたイメージの分析を介して評価することができる。

【０２２６】 全長ｃＤＮＡ、発現された配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片はマイクロア
レイのエレメントを含むことができる。ハイブリダイゼーションに適した断面は
、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のごとき当該分野でよく
知られたソフトウェアを用いて選択することができる。異常個体および正常個体
のヌクレオチド配列に対応する全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはその断片を適当な基
材、例えば、スライドグラス上に配置する。該ｃＤＮＡを、例えば、ＵＶ架橋を
用いて該スライドに固定し、続いて、熱的および化学的処理および引き続いて乾
燥を行う（例えば、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
０：４６７−４７０；Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．ら（１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒ
ｅｓ． ６：６３９−６４５）。蛍光プローブのごときプローブを調製し、基材
上のエレメントへのハイブリダイゼーションで用いる。

【０２２７】 マイクロアレイを用いて試料分析を行うためには、生物学的試料からのＲＮＡ
またはＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブに作成する。ｍＲＮＡを単離し
、ｃＤＮＡを生じさせ、それを鋳型として用いてアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ
）を作成する。ａＲＮＡを蛍光ヌクレオチドの存在下で増幅し、標識されたプロ
ーブを、プローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズするようにマイクロアレイと共にインキュベートする。インキュベーショ
ン条件は、正確な相補性マッチにて、または種々の程度のより低い相補性にてハ
イブリダイゼーションが起こるように調整する。ハイブリダイズしなかったプロ
ーブの除去の後、スキャナーを用いて蛍光のレベルおよびパターンを測定する。
スキャンしたイメージを調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチドの相
補性の程度および相対的豊富さを測定する。生物学的試料は、いずれかの体液（
例えば、血液、尿、唾液、粘液質、胃液等）、培養された細胞、バイオプシー、
または他の組織調製物から得ることができる。検出システムを用いて、区別され
る配列の全てについての存在、不存在およびハイブリダイゼーションの量を同時
に測定することができる。このデータは、試料間の配列、突然変異、変種または
多形についての大規模な修正実験で用いることができる。

【０２２８】 マイクロアレイは、好ましくは、非常に多数のユニークな一本鎖核酸配列、通
常は、個体支持体に結合した合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮ
Ａの断片いずれかよりなる。マイクロアレイは、既知の５’または３’配列をカ
バーするオリゴヌクレオチドを含有することができるか、あるいは全長配列をカ
バーする順次のオリゴヌクレオチド；または配列の長さに沿った特定の領域から
選択されたユニークなオリゴヌクレオチドを含有することができる。マイクロア
レイで用いるポリヌクレオチドは、配列の少なくとも断片が知られている注目す
る遺伝子または複数遺伝子に特異的な、あるいは特定の細胞型、発生または病気
の状態に共通する１以上の同定されていないｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオ
チドであり得る。

【０２２９】 マイクロアレイのために公知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生じさせる
ためには、ヌクレオチド配列の５’またはより好ましくは３’末端で出発するコ
ンピューターアルゴリズムを用い、注目する遺伝子を調べる。該アルゴリズムは
、遺伝子にユニークな、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含有量を
有する、およびハイブリダイゼーションに干渉し得る予測される二次構造を欠く
規定された長さのオリゴマーを同定する。オリゴマーは、光−指向性化学プロセ
スを用いて基材上の指定された領域で合成される。基材は紙、ナイロンもしくは
他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドグラスまたはいずれかの他の適
当な個体支持体であり得る。アレイは、手動によって、または利用可能なデバイ
ス（スロットブロットまたはドットブロット装置）材料およびマシーン（ロボッ
ト装備を含む）を用いて作ることができ、８ドット、２４ドット、９６ドット、
３８４ドット、１５３６ドットまたは６１４４ドットのグリッド、あるいは商業
的に入手可能な装備の効果的な使用に適するいずれかの他の複数のグリッドを含
有することができる。

【０２３０】 一旦遺伝した異常性の遺伝子的原因がせばめられるかまたは同定されれば、遺
伝子の潜在的にまたは現実の欠陥部分をマイクロアレイにおいて標的として用い
ることができる。マイクロアレイを用いて、非常に多数の遺伝子の発現レベルを
モニターし、潜在的な治療剤および治療剤の活性を開発しモニターすることがで
きる。

【０２３１】 以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明を断じて限定するものと解
釈されるべきではない。

【０２３２】 （実施例１） 本実施例は、タンジール病（ＴＤ）を持つ患者はアポＡ−Ｉ−媒介脂質流出の
不存在を有することを示す。

【０２３３】 細胞培養：ヒト繊維芽細胞は、ふたりの正常な対象（ＮＬ１）および３人のタ
ンジール病（ＴＤ）を持つ無関係な患者からの皮膚外植体から得た。ＴＤ１細胞
は、極端に低い血漿ＨＤＬコレステロールおよびアポＡ−Ｉレベルならびにタン
ジール病に典型的な臨床的兆候を持つ５３歳の女性から得た。ＴＤ２細胞は、非
常に低いレベルの血漿ＨＤＬコレステロールおよびアポＡ−Ｉを含めたタンジー
ル病の臨床的、形態学的および生化学的特徴を持つ５６歳の男性から得た（Ｆｒ
ａｎｃｉｓら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， ９６， ７８−８７（１９
９５））。ＴＤ３細胞は、オレンジ色の扁桃片、非対称運動神経障害、５ｍｇ／
ｄＬの血漿ＨＤＬコレステロールおよび１６ｍｇ／ｄＬのＬＤＬコレステロール
を呈するタンジール病を持つ１８歳の男性から得た（Ｌａｗｎら， Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， １０４， Ｒ２５−Ｒ３１（１９９９））。正常な細胞
およびＴＤ対象細胞は、Ｏｒａｍら， Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ４０：１
７６９−１７８１（１９９９）に記載されたごとく不死化した。略言すれば、ヒ
トパピローマウイルスの１６のオンコジインＥ６およびＥ７のインサートおよび
ネオマイシン抵抗性選択マーカーを持つベクターを含有する両種性レトロウイル
スで細胞をトランスフェクトした。対照細胞はベクター単独で感染させた（模擬
感染）。プールした細胞集団をＧ４１８の存在下で２継代の間選択し、しかる後
、Ｇ４１８を培地から排除した。繊維芽細胞を第５および１６継代（初代培養）
または第６および１５継代（不死化）の間で用いた。不死化された正常およびＴ
Ｄ細胞を１６−ｍｍウェルまたは３５−ｍｍ皿に接種し、実験で使用する前にダ
ルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で
密集するまで増殖させた。また、ＲＡＷ２６４．７マウス単球細胞（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ， ＭＤ）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で維持した。

【０２３４】 脂質流出を測定するアッセイ：コレステロールおよびリン脂質のアポＡＩ−媒
介流出は、Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， ９６：７８
−８７（１９９５）に記載されている方法にしたがってアッセイした。正常およ
びＴＤ対象からの培養された皮膚繊維芽細胞を、０．２−０．５μＣｉ／ｍｌ［ ³ Ｈ］コレステロール（４０−６０ Ｃｉ／ミリモル， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃ
ｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）の存在下で密集す
るまで増殖させることによって標識した。細胞が６０−８０％密集すると、放射
性コレステロールを血清−含有増殖培地に添加した。３日後、細胞をＰＢＳ／Ｂ
ＳＡで２回洗浄し、同時に増殖を阻止し、かつコレステロールを負荷して、アポ
リポ蛋白質−媒介脂質流出を最大化した。これは、無血清ＤＭＥＭ＋２ｍｇ／ｍ
ｌの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＤＭＥＭ／ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）および３０μｇ／ｍｌ
非放射性コレステロール中で細胞を４８時間インキュベートすることによって達
成された。ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｓｍｉｔｈら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．， ２７１：３０６４７−３０６５５（１９９６）に記載されているごとく、
アセチル化ＬＤＬでの２４時間インキュベーションによってスカベンジャー受容
体を介してコレステロール−負荷した。略言すれば、２４−ウェル皿中のＲＡＷ
２６４．７細胞をコレステロール−負荷し、ＡｃＬＤＬと共に３７℃にて３０分
間プレインキュベートした、５０μｌ／ｍｌの１Ｍグルコース、１０μｌ／ｍｌ
の２００ｍＭグルタミンおよび２％ＢＳＡを、およびアセチル化低密度リポ蛋白
質（ＡｃＬＤＬ）および［³Ｈ］−コレステロールを補足した０．５ｍｌのＤＭ
ＥＭ中で一晩標識して、０．３３μＣｉ／ｍｌ［³Ｈ］−コレステロールの最終
濃度を得た。引き続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を５回洗浄し、Ｄ
ＭＥＭ／ＢＳＡ中で一晩（１６−１８時間）インキュベートして、コレステロー
ルプールを平衡化した。

【０２３５】 コレステロールプールの平衡の後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで４回すすぎ、流出
インキュベーションの前にＤＭＥＭ／ＢＳＡと共に３７℃にて１時間インキュベ
ートした。アルブミン単独（対照）、アルブミン＋ＨＤＬ（４０μｇ蛋白質／ｍ
ｌ）またはアルブミン＋アポＡ−Ｉ（１０μｇ／ｍｌ， Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ， ＭＥ）いずれかを含有
する流出培地（ＤＭＥＭ／ＢＳＡ）を添加し、細胞を４、２４または４８時間イ
ンキュベートした。ＤＭＥＭ／ＢＳＡの一晩の平衡培地中に１０μＣｉ／ｍｌの
［³Ｈ］コリン（７５−８５Ｃｉ／ミリモル， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．
）を含めることによってリン脂質を標識した。培養培地中で見出された放射能は
、１２、０００ｇにおける１５分間の遠心後のシンチレーションカウンティング
によって測定した。細胞における放射能は、０．５ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ（
Ｓｍｉｔｈら、 Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２１：３０６４７−３０６５
５（１９９６））中での可溶化またはＦｒａｎｃｉｓら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．， ９６， ７８−８７（１９９５）に記載されているヘキサン：イ
ソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ）中での抽出の後のシンチレーションカウンテ
ィングによって測定した。標識されたリン脂質を含有する細胞を１ｍｌのイソプ
ロパノールで１時間、次いで、前記したごときヘキサン：イソプロパノールで抽
出した。コレステロールまたはリン脂質の流出は、細胞および培地から回収され
た合計トリチウム化脂質カウントを超える培地中のトリチウム化脂質カウントの
パーセンテージとして表した（ｃｐｍ培地／ｃｐｍ（培地＋溶解物）×１００）
。

【０２３６】 図１ＡおよびＣに示すごとく、ＨＤＬまたはアポＡ−Ｉの添加の結果、正常対
象から得られたコレステロール−負荷繊維芽細胞からコレステロールが除去され
る。しかしながら、ＴＤ細胞においては、コレステロールを除去するＨＤＬの濃
度はわずかに減少し、コレステロールを除去するアポＡ−Ｉの能力は完全に存在
しない。図１は、正常およびＴＤ繊維芽細胞が、アルブミンとの４８時間のイン
キュベーションの間に、約３−４％の［細胞：³Ｈ］−コレステロールを培地に
放出することを示す。アルブミン培地へのＨＤＬの添加は正常およびＴＤ繊維芽
細胞双方からの［³Ｈ］−コレステロールの流出を増加させるが、ＴＤ細胞では
程度が低い（図１Ｂ、Ｄ）。アポＡ−Ｉの添加は正常な繊維芽細胞からの［³Ｈ
］−コレステロールの流出を促進した（図Ａ、Ｃ）が、ＴＤ繊維芽細胞からの［ ³ Ｈ］−コレステロール流出に対してはほとんどまたは全く効果を有しなかった
。

【０２３７】 （実施例２） 本実施例は、１７５の遺伝子が、正常細胞と比較して、ＴＤ細胞において、少
なくとも２．５倍減少した発現を示し、３７５の遺伝子が少なくとも２．５倍増
加した発現を示すことを示す。異なる遺伝子発現は、正常個体（非−ＴＤ）から
の、およびＴＤを持つ患者からのｃＤＮＡの遺伝子−発現マイクロアレイ（ＧＥ
Ｍ）分析を用いて測定した。

【０２３８】 細胞培養：正常個体および実施例１に記載されたＴＤ患者から得られた不死化
細胞培養を用いた。密集培養をＤＭＥＭ／ＢＳＡ中に維持し、１ｍＭの８−ブロ
モ環アデノシン１リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）で２４時間補足した。

【０２３９】 ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成：正常およびＴＤ繊維芽細胞双方からのｍＲ
ＮＡは、トリゾール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， Ｃａｔ．＃１５５９６−０２６）で細胞から抽出した
全ＲＮＡから調製した。該ｍＲＮＡはＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡキット（Ｑｉ
ａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， Ｃａｔ．＃７００２２）
を用い販売業者のプロトコルにしたがって単離した。Ｃｙ３またはＣｙ５蛍光色
素を用いてｍＲＮＡを逆転写して、ＤｅＲｉｓｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
：６８０−６８６（１９９７）に記載された方法にしたがって蛍光標識ｃＤＮＡ
を得た。ＴＤ細胞から得られたｃＤＮＡをＣｙ３蛍光色素で標識し、正常細胞か
らのｃＤＮＡをＣｙ５蛍光色素（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃｓ， Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ， ＣＡ）で標識した。

【０２４０】 マイクロアレイ分析：ＴＤを持つ個体および正常個体からの細胞における異な
る遺伝子発現を分析するために、前記したごとく調製したＣｙ３およびＣｙ５蛍
光標識ｃＤＮＡ試料を、顕微鏡スライド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃｓ， Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）上のＧｅｎｅ Ａｌｂｕｍマイクロアレイ（ＧＥＭ
）の組にハイブリダイズさせた。６つのスライドの各々は約９、８００ヒトｃＤ
ＮＡ試料＋２００対照試料を含有し、５８、８００部分的ｃＤＮＡのマイクロア
レイとなった。したがって、重複性の見積もりを行い、発現されたヒト遺伝子の
ほぼ３０−５０％が表された。ＴＤ１細胞から調製されたＣｙ３−標識ｃＤＮＡ
および正常細胞からのＣｙ５−標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＴＤ
細胞 ｖｓ．正常細胞の相対的ＲＮＡ含有量の発現された遺伝子についての比較
を可能とした。加えて、ＴＤ２細胞から調製されたＣｙ３−標識ｃＤＮＡおよび
正常細胞からのＣｙ５−標識ｃＤＮＡをマイクロアレイの同一組にハイブリダイ
ズさせて、異なるＴＤ患者の間の遺伝子発現の変動を調べた。

【０２４１】 結果：データはＧｅｍＴｏｏｌｓソフトウェア（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃ
ｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて分析し、正常細胞に対するＴＤ細
胞のｍＲＮＡの比率として表した。結果は、大部分の遺伝子がＴＤ１および正常
細胞で比較的発現されることを示した。図２（前記セクションにおける対角線の
左側）に示すごとく、正常細胞と比較して１７５の遺伝子のみがＴＤ１細胞にお
いて２．５倍過少発現され、他方、正常細胞と比較して３７５遺伝子がＴＤ１細
胞において２．５倍過剰発現された（下方であって対角線の右側）ＴＤ細胞でよ
り高度に発現された遺伝子は、補償的応答として、または病気病理学に対する寄
与として、タンジール突然変異の結果として異なって調節されるものを含む。Ｔ
Ｄの観察された表現型に寄与し、ＴＤ細胞でより高度に発現される遺伝子は、イ
ンターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、マクロファージ炎症性蛋白質−２α、顆粒
球走化性蛋白質−２、ＩＬ−１１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシン
ターゼ−２（ＣＯＸ−２）、トロンボスポンジンおよび単球走化性蛋白質１、３
および４を含む（Ｌａｗｎ ら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， １０４：
Ｒ２５−Ｒ３１（１９９９））。

【０２４２】 正常繊維芽細胞で発現された単一ＲＮＡで、ＴＤ１またはＴＤ２細胞いずれに
おいても完全に存在しないものは見出されなかった。また、ＴＤ１およびＴＤ２
における異なって発現された遺伝子の比較により、個々のＴＤ患者の間でほとん
ど変動はないことが明らかにされた。例えば、ＴＤ２細胞で最も高度に下降調節
された遺伝子のうち、正常細胞と比較して９２％もまたＴＤ１細胞で過少発現さ
れた。遺伝子のうち、ＴＤ１またはＴＤ２ ｖｓ．正常細胞で２．５倍過少発現
されたのはＡＢＣ１蛋白質についての遺伝子であった。ＡＢＣ１遺伝子はその相
同体のいくつかの帰せられる機能のため追跡し、また、当該遺伝子がＴＤ遺伝子
領域として報告された染色体領域にほぼ位置決定されたからである。

【０２４３】 （実施例３） 本実施例は、ＡＢＣ１遺伝子がヒト染色体９ｑ３１に位置決定されることを示
す。

【０２４４】 従前の遺伝子連鎖分析がＴＤ遺伝子をヒト染色体９ｑ３１の７−ｃＭ領域にマ
ップした（Ｒｕｓｔら， Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．， ２０， ９６−９８（１９
９８））。加えて、イン・サイチュハイブリダイゼーション分析により、ＡＢＣ
１遺伝子がより広い染色体間隔９ｑ２２−９ｑ３１に位置決定されることが明ら
かとされた（Ｌｕｃｉａｎｉら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２１， １５０−１５
９（１９９４））。ヒト／ハムスター照射ハイブリッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）のＧｅｎｅＢ
ｒｉｄｇｅ４ パネルでのＰＣＲ方法を用い、ヒトＡＢＣ１はマーカーＷＩ−１
４７０６およびＷＩ−４０６２の間に位置すると決定され、これは、ヒト染色体
９ｑ３１の７−ｃＭ領域に対応する。９３ヒト／ハムスターハイブリッド細胞系
からのＤＮＡは、ヒトＡＢＣ１−得意的プライマーＬＦ： ＣＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣ（配列番号：１１）および
ＬＲ： ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号：１２） を用いるＰＣＲによって増幅した。各系はヒトＡＢＣ１増幅産物につき陽性また
は陰性としてスコアを採り、このデータの分析から得られたＡＢＣ１のマッピン
グは、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：
８０００／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｆｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）を介して
アクセスされるＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳｏｆｔｗａｒｅのためのＷ
ｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒを用いて達成さ
れた。これらの結果は、さらに、同等の間隔からのヒトゲノム／酵母人工染色体
クローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）へのサザーンブ
ロットハイブリダイゼーションによって確認された。加えて、公のデータベース
サーチング（ＧｅｎｅＭａｐ’９８； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏ
ｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および照射ハイブ
リッドマッピングは、報告された遺伝子間隔における位置からのマイクロアレイ
データにおいて他の有意に過少発現された遺伝子を排除した。これらの補充的デ
ータは、ＡＢＣ１遺伝子がヒト染色体９ｑ３１に位置することを示し、さらに、
ＡＢＣ１遺伝子がタンジール病に関連することを示す。

【０２４５】 （実施例４） 本実施例は、フランキング領域および全コーディング領域を含めた野生型ＡＢ
Ｃ１遺伝子のヌクレオチド配列の決定を示す。

【０２４６】 ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０遺伝子分析器を用い、またはＤ
ａｖｉｓ配列決定（Ｄａｖｉｓ， ＣＡ）によって行った。両方のストランドは
全体を配列決定した。正常な対象からのＡＢＣ１遺伝子のオープンリーディング
フレームの配列は、正常繊維芽細胞ＲＮＡから構築した発現プラスミドライブラ
リから得られた全長ｃＤＮＡクローンから決定した。プラスミドライブラリを構
築するためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅキットプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ， Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）にしたがってｃＤＮＡを合成した。略言すれば
、５−メチルｃＣＴＰの存在下で、ＸｈｏＩ部位を持つオリゴ−ｂＴプライマー
およびＭＭＬＶ逆転写構造を用い、第１ストランドｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成
した。未修飾ｄＬＴＰの存在下で、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて第２ストランドを合成した。ｃＤＮＡをｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカーを該ｃＤＮＡに連結した。次いで、該ｃ
ＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、ｃＤＮＡの３’末端にＸｈｏＩ末端を生じさせた。
第１ストランド合成の間に、内部ＸｈｏＩ部位をセミ−メチル化によるこの消化
から保護した。合成されたｃＤＮＡをプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ＃ＶＯ４４−５０）、サイトメ
ガロウイルスプロモーター／エンハンサーを含有する発現ベクターのＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＸｈｏＩ部位にクローンした。５’−ＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧＧ
ＧＧＡＴＴＡＴＣ（配列番号：１３）および５’−ＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧ
ＧＣＴＴＣＧＧＣ（配列番号：１４）であった既知のＡＢＣ１配列に基づくプラ
イマーを用い、逆転写構造ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって５８５
ｂｐ ＡＢＣ１プローブを創製した。このＡＢＣ１プローブを用い、製造業者の
プロトコルによるＣｌｏｎｅＣａｐｔｕｒｅ選択キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用い
て、ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡの１０．５ｋｂインサートを含有するクローンをラ
イブラリから回収した。このクローンをｐＣＥＰｈＡＢＣ１として図３に示す。
該１０．５ｋｂ ＡＢＣ１ ｃＤＮＡインサート配列は配列番号：１に示す。配
列決定により、ｐＣＥＰｈＡＢＣ１が６７８３ヌクレオチドのヒトＡＢＣ１オー
プンリーディングフレーム＋５’および３’非翻訳領域を含有し、Ｌａｎｇｍａ
ｎｎら ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．， ２
５７，２９−３３（１９９９）（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＡＪＯ１２３７６）
によって報告されているｃＤＮＡ配列よりも大きなオープンリーディングフレー
ムを有することが確認された。

【０２４７】 （実施例５） 本実施例は、野生型ＡＢＣ１遺伝子およびＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３遺伝子
配列の間の配列の差を示す。

【０２４８】 ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３のｃＤＮＡ合成：ｃＤＮＡは、（１）ｓａｃＩｈ
ａｂｃｆ、５’−ＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＡ
ＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＣ（配列番号：１５）； ｈａｂｃｒ３５８１、５’−ＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＡＴＧＴＣ
ＡＧ（配列番号：１６）および（２）ｈａｂｃｆ３５８５、５’−ＧＧＧＡＧＣ
ＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣ（配列番号：１７）；ｈａｂｃｒｓａｌＩ
、５’ −ＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＴＡＧ
ＴＡＴＣＡＧ（配列番号：１８）と命名された、正常ヒトＡＢＣ１遺伝子配列か
ら設計されたプライマー対の２つの組を用い、製造業者のプロトコル（ＣＬＯＮ
ＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ； Ｃａｔ．＃８４１７−１）に従い
、Ｓｕｅｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｃＤＮＡシステムおよびＡｄｖａｎ
ｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼミックスを用いる逆転写ポリメラーゼ鎖反応（
ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３細胞から調製した。０．
４μＭの最終濃度のこれらのプライマーでの０．２−０．５μｇポリＡ＋ＲＮＡ
の増幅により、ほぼ３．５ｋｂの２つの重複する鋳型が生じた。ＱＩＡＥＸ Ｉ
Ｉシステム（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ； Ｃａ
ｔ．＃２００２１）を用いて該鋳型をゲル−精製し、１００ｎｇ／μｌの濃度に
調整した。

【０２４９】 ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３ ｃＤＮＡの配列決定：前記したごとく創製され
た８μｌの各鋳型を、０．５μＭの最終濃度の野生型ＡＢＣ１配列に基づいて設
計された個々の配列決定プライマーでの反応で配列決定した。プライマーは以下
のとおりであった：１Ｆ：５’−ＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡ（配
列番号：１９）、２Ｆ：５’ −ＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＡＣＡＧＧＡＧ（配列番号：２０）；３Ｆ：５’−Ｇ
ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＧＧ（配列番号：２１）；４Ｆ：５’−ＣＣＡ
ＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧ（配列番号：２２）；５Ｆ：５’−ＧＧＣＣＴ
ＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡ（配列番号：２３）；６Ｆ：５’−ＧＧＡＣＡＡＣ
ＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＴ（配列番号：２４）；７Ｆ：５’−ＡＡＧＡＣＧＡＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡ（配列番号：２５）；８Ｆ：５’−ＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：２６）；９Ｆ：５’−ＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧ
ＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号：２７）；１０Ｆ：５’−ＡＡＧＡＧＡＣ
ＴＧＣＴＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号：２８）：１１Ｆ：５’−ＡＧＣＧＡＣＡＡ
ＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧ（配列番号：２９）；１２Ｆ：５’−ＴＧＧＣＡＴＧＣＡ
ＡＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号：３０）；１３Ｆ：５’−ＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡ
ＡＴＣＴＧＣＣＴ（配列番号：３１）；１４Ｆ：５’−ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴ
ＴＡＣＴＧＴＴ（配列番号：３２）；１５Ｆ：５’−ＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＴＧ（配列番号：３３）；１６Ｆ：５’−ＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣ
ＴＡＡＡ（配列番号：３４）；１Ｒ：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣ
ＴＴ（配列番号：３５）；２Ｒ：５’−ＣＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣ
Ａ（配列番号：３６）；３Ｒ：５’−ＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＣ（
配列番号：３７）；４Ｒ：５’−ＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＡ（配
列番号：３８）；５Ｒ：５’−ＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号
：３９）；６Ｒ：５’−ＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡ（配列番号：４
０）；７Ｒ：５’−ＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＴＧ（配列番号：４１）
；８Ｒ：５’−ＣＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＧ（配列番号：４２）；９
Ｒ：５’−ＣＡＴＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧ（配列番号：４３）；１０Ｒ
：５’−ＡＧＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴ 配列番号：４４）、１１Ｒ
：５’−ＴＧＧＡＣＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡ（配列番号：４５）、１２Ｒ：
５’−ＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号：４６）、１３Ｒ：５
’−ＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＡＧ（配列番号：４７）、１４Ｒ：５’
−ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＧＡＣ（配列番号：４８）、１５Ｒ：５’−
ＴＣＣＡＧＡＴＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡ（配列番号：４９）、１６Ｒ：５’−Ｔ
ＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡ（配列番号：５０）、ＵＴＲ１Ｒ：５’−
ＡＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧ（配列番号：５１）。

【０２５０】 結果：ヌクレオチドナンバリングはＬａｗｎら（１９９９）に見出されるナン
バリングにしたがう。患者ＴＤ１は全長オープンリーディングフレームを保有し
、野生型配列とは２つの実質的差異がある（配列番号：８）。これらのうち１つ
はＡからＧへの置換であり、その結果、Ｌａｗｎら（１９９９）によって公表さ
れているごとく、２２０１アミノ酸配列の位置５３７においてグルタミンからア
ルギニン残基への変化がもたらされる。この残基の位置は、第１の予測される膜
貫通ドメインの近くの、ＮＨ2−末端親水性ドメイン内にある。また、患者ＴＤ
２はオープンリーディングフレームを保有し、残基５２７においてアルギニンか
らトリプトファンへの置換がある（配列番号：１０）。かくして、ＴＤ１および
ＴＤ２は共に蛋白質の同一領域においてアミノ酸の電荷を変化させる置換を含む
。ＴＤ３ ＤＮＡは、ひとつの対立遺伝子においてヌクレオチド５６９７に続く
そのＡＢＣ１ ｃＤＮＡ中に１４ヌクレオチド挿入を含み、他の対立遺伝子にお
いてヌクレオチド５０６２後に１３８ｂｐ挿入を含む。

【０２５１】 ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３のＤＮＡのゲノム配列決定は、各ｃＤＮＡで見出
された変化を確認した。ＴＤ１およびＴＤ２からのｃＤＮＡで見出された突然変
異を含む繊維芽細胞から単離されたゲノムＤＮＡの１５６ｂｐ領域のＰＣＲ増幅
によって、ゲノム配列が創製された。ゲノム配列決定は、また、患者ＴＤ１がグ
ルタミンからアルギニン置換につきホモ接合であることを示した。ゲノムＤＮＡ
分析は、ＴＤ２が、検出された置換を含む１つの対立遺伝子および未決定の欠陥
を含む（検出可能なｍＲＮＡを生産できない）第２の対立遺伝子に関し化合物ヘ
テロ接合であることを示した。非−ＴＤ個体のゲノムＤＮＡの８０を超える対立
遺伝子において、置換突然変異は見出されなかった。ＴＤ３挿入は配列分析によ
って同定され、挿入点を囲うプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって確認され
た。ヌクレオチド５６９７に続く１４−ｂｐ挿入はフレームシフトを引き起こし
、その結果、第２のＡＴＰ結合ドメイン前の位置から、未成熟蛋白質終止の点ま
での、野生型アミノ酸配列の置換がもたらされた。他の対立遺伝子におけるヌク
レオチド５０６２に続く１３８ｂｐ挿入はインフレーム停止コドンを含む。

【０２５２】 （実施例６） 本実施例は、ＡＢＣ１輸送活性の阻害剤が繊維芽細胞からのアポＡ−Ｉ−媒介
コレステロール流出を阻害することを示す。

【０２５３】 ＡＢＣ１の阻害がアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出のプロセスに影響
し得るか否かをテストするために、ＡＢＣ１阻害剤であると報告された２つの化
合物をアッセイでテストし、アポリポ蛋白質媒介コレステロール流出をモニター
した。化合物４、４−ジイソチオシアノスチルベン−２、２’−ジスルホン酸（
ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）は、用量依存的にＡＢＣ１
のアニオン輸送活性を阻害すると報告されている（Ｂｅｃｑら， Ｊ．Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２６９５−２６９９（１９９７）；Ｈａｍｏｎら，
Ｂｌｏｏｄ， ９０：２９１１−２９１５（１９９７））。アポリポ蛋白質−
媒介コレステロール流出アッセイは、示された変化を施して実施例１に記載され
ているごとく行った。コレステロール−負荷および［³Ｈ］コレステロール−標
識正常繊維芽細胞（ｎ＝３）を、５μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉおよび０、０．２ｍＭ
または０．４ｍＭ ＤＩＤＳと共にまたはそれなくして６時間インキュベートし
た。加えて、コレステロール−負荷および［³Ｈ］コレステロール−標識正常繊
維芽細胞（ｎ＝３）を、５μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉおよび０、０．２ｍＭまたは０
．４ｍＭＢＳＰと共にまたはそれなくして６時間インキュベートした［³Ｈ］コ
レステロール流出は実施例１に記載されたシンチレーションカウンティングによ
って測定し、培地中に出現する全放射性標識コレステロールのパーセンテージと
して計算した。結果は、アポＡ−Ｉ−フリー培地についての値を差し引いた後に
おけるアポＡ−Ｉの存在下での流出の平均±ＳＤ（ｎ＝３）として図５に示す。
図５は、ＤＩＤＳおよびＢＳＰが共にアポリポ蛋白質Ａ−Ｉによって媒介される
トリチウム化コレステロールの６時間流出を阻害することを示す。加えて、ＤＩ
ＤＳおよびＢＳＰを用いるトリチウム化ホスファチジルコリンの流出で同様の阻
害が観察された（データは示さず）。これらのテストの結果は、実施例１に記載
された、ＴＤを持つ患者に由来する繊維芽細胞における流出欠陥と似ている。

【０２５４】 （実施例７） 本実施例は、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害が繊維芽細胞からの
アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を阻害することを示す。

【０２５５】 正常皮膚繊維芽細胞を実施例１に記載したごとく［³Ｈ］コレステロールで標
識した。次いで、３０μＭ対照モルホリノオリゴヌクレオチド（β−グロビンサ
ラセミアｍＲＮＡのアンチセンス相補体に対応する５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴ
ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’；配列番号：５２）または３０μＭ Ａ
ＢＣ１アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＧＴＴＧＴＴ
ＣＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣ−３’；配列番号：５３）いずれかの存在
下で掻き、新しい皿の上に再度接種することによって、細胞にオリゴヌクレオチ
ドを負荷した。オリゴヌクレオチドの不存在下で掻き、再度接種することによっ
て、対照細胞を［³Ｈ］コレステロール−標識後に模擬負荷した。培地中に出現
する全放射性標識コレステロールのパーセンテージとしてのシンチレーションカ
ウンティングによって、１２時間後に、アポＡ−Ｉ−媒介流出を測定した。結果
は、各実験においてオリゴヌクレオチドの不存在下でのアポＡ−Ｉ−特異的流出
についての値に対して正規化した、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして図
６に示す。図６に示すごとく、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡに対して向けられたアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（β−グロビ
ンアンチセンスオリゴヌクレオチド）と比較して、正常繊維芽細胞からのコレス
テロール流出の５０％低下を引き起こした。

【０２５６】 （実施例８） 本実施例は、ヒトＡＢＣ１遺伝子の過剰発現の結果、単球細胞からのアポＡ−
Ｉ−媒介コレステロール流出の増加がもたらされることを示す。

【０２５７】 ＲＡＷ２６４．７細胞の安定なトランスフェクション：マウス単球ＲＡＷ２６
４．７細胞を、ヒトＡＢＣ１についてのｐＣＥＰｈＡＢＣ１発現プラスミドで安
定にトランスフェクトした。ヒトＡＢＣ１のオープンリーディングフレームを含
有するｐＣＥＰｈＡＢＣ１プラスミドの構築を実施例４に記載する。０．８ｍｌ
無血清ＤＭＥＭ中の２μｇのｐをＣＥＰｈＡＢＣ１ ＤＮＡおよび１２μｌのｇ
ＥＮＥＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｈｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；ＣＡＴ．＃Ｔ２
０１００７）で、ほぼ１×１０⁶ＲＡＷ２６４．７細胞を５時間トランスフェク
トした。２日後、細胞を１：２−１：５０の範囲の比率で分け、培養培地に１５
０μｇ／ｍｌヒグロマイシンを添加することによって選択を適用した。２週間後
、ヒグロマイシン−抵抗性コロニーを拾い、増殖させた。

【０２５８】 アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出アッセイ：親ＲＡＷ２６４．７細胞およ
びヒトＡＢＣ１を安定に発現する３つのクローン系（Ｌ３、Ｌ５およびＬ６）を
密集するまで増殖させた。細胞をコレステロール−負荷し、実施例１に記載した
ごとく、０．５μＣｉ（ｍｌ）［³Ｈ］コレステロールおよび５０μｇ／ｍｌア
セチル化ＬＤＬでの２４時間のインキュベーションによって標識した。ＤＭＥＭ
／ＢＳＡ中での一晩のインキュベーションによるコレステロールプールの平衡の
後、細胞を洗浄し、実施例１に記載したごとく流出培地を添加した。細胞培地中
でのトリチウム化コレステロールのシンチレーションカウンティングによって、
アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を前記したごとく測定し、細胞および培地
から回収された全カウントのパーセンテージとして表した。結果は、各実験内で
親ＲＡＷ２６４．７細胞からのアポＡ−Ｉ−特異的流出についての値に対して正
規化した３つの別々の実験の平均±ＳＥＭとして表す。図７は、親ＲＡＷ２６４
．７細胞およびＬ３、Ｌ５およびＬ６トランスフェクト細胞系からのアポＡ−Ｉ
−媒介コレステロール流出を示す。理解されるごとく、ＡＢＣ１発現ベクターで
のトランスフェクションの結果、アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出が４倍（
Ｌ６）ないし６倍（Ｌ３およびＬ５）増加する。これらの結果は、ＡＢＣ１遺伝
子の過剰発現はマクロファージ細胞からのコレステロール流出の量を実質的に増
加させることができるのを示す。

【０２５９】 （実施例９） 本実施例は、ＡＢＣ１ｍＲＮＡの発現が、正常皮膚繊維芽細胞においてコレス
テロール流出に関連する細胞状態によって調節されるが、ＴＤ繊維芽細胞では調
節されないことを示す。

【０２６０】 ＡＢＣ１が細胞ステロール流出において律速的役割を演じるか否かを判断する
ために、コレステロール流出プロセスに関連する種々の細胞条件下でＡＢＣ１の
合成を測定した。具体的には、正常繊維芽細胞およびＴＤ繊維芽細胞を過剰のｃ
ＡＭＰ、コレステロールまたはアポＡ−Ｉの条件に個々に暴露した。正常皮膚繊
維芽細胞およびＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞の細胞培養は実施例１に記載した
ごとく調製した。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲによって測定した
。

【０２６１】 細胞培養：正常皮膚繊維芽細胞およびＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞の不死化
細胞培養は実施例１に記載したごとく調製した。ＤＭＥＭ／ＢＳＡおよび示した
添加剤での置換前に細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４または４８時間密集
下まで増殖させた。ＲＮＡは実施例２に記載したごとく調製した。

【０２６２】 ＲＴ−ＰＣＲ：定量的ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用い
て行った。略言すれば、５００ｎｇのＤＮａｓｅ−処理ｍＲＮＡを２．５μのラ
ンダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。ＳＹＢＲ緑色コアキット（Ｐ
Ｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃ
Ａ； ＃４３０４８８６）ならびにヒトＡＢＣ１プライマーＬＦ：５’−ＣＣＴ
ＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣ（配列番号：１１）およびＬＲ：
５’−ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号：１２）を
用いるＰＣＲによって、この反応のほぼ５％を増幅して、ヒトＡＢＣ１のヌクレ
オチド７０１８−７０９９に対応する８２ｂｐ断片を得た。ＰＣＲサイクル条件
は以下のとおりであった：９５℃における１０分間；続いて９５℃、１５秒間の
４０サイクルおよび６０秒間の６０℃。各ＰＣＲサイクルの間に生じた二本鎖増
幅産物へのＳＹＢＲ緑色結合によって引き起こされた蛍光の増加を検出すること
によって、各試料中のｍＲＮＡを定量した。全ての試料は三連で実行し、β−ア
クチンｍＲＮＡに対して正規化し、プライマーアクチンＦ：５’−ＴＣＡＣＣＣ
ＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ（配列番号：５４）およびアクチンＢ：
５’−ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号：５５
）での平行反応で増幅した。標準曲線は同一ＰＣＲプレート上でＡＢＣ１および
β−アクチン双方について作成した。

【０２６３】 ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥ
Ｍ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の１ｍ
Ｍの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰで２４時間処理した。

【０２６４】 コレステロールアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥＭ／
１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の３０βｇ
／ｍｌ遊離コレステロールで４８時間処理し、続いてＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８
−２４時間平衡化した。

【０２６５】 アポＡ−Ｉアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥＭ／１０
％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の３０μｇ／ｍ
ｌ遊離コレステロールで４８時間処理し、続いてＤＭＥＭ／ＢＳＡ＋１０μ／ｍ
ｌアポＡ−Ｉ中で１８−２４時間平衡化した。

【０２６６】 結果：図８は、正常繊維芽細胞においては、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡは８−Ｂｒ−
ｃＡＭＰへの暴露によってほぼ１０倍増加し、無血清培地中のコレステロールへ
の暴露によってほぼ１７倍増加することを示す。コレステロール−負荷細胞のア
ポＡ−Ｉへの引き続いての暴露の結果、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現が顕著に減少す
る。メカニズムは示されていないが、従前の研究は、コレステロール流出はｃＡ
ＭＰおよびコレステロールのごとき化合物の存在下で促進されることを示してい
る（Ｈｏｋｌａｎｄら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６８：２５３４３−
２５３４９（１９９３））。本結果は、正常繊維芽細胞においては、ＡＢＣ１
ｍＲＮＡはコレステロール流出経路のこれらの既知のエフェクターによって誘導
され、アポリポ蛋白質コレステロール受容体への暴露によって抑制されることを
示し、これは、ＡＢＣ１の発現がアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出に関
連する細胞条件によって調節されることを示す。対照的に、ＴＤ患者からの繊維
芽細胞はコレステロール流出のエフェクターによって調製されない。まず、ＴＤ
１およびＴＤ２細胞双方におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡのｃＡＭＰ−誘導レベルは
正常細胞のそれのほぼ４０％に過ぎない。さらに、コレステロール−負荷細胞の
アポＡ−Ｉへの暴露はＡＢＣ１発現を変化させず（ＴＤ１細胞）またはＡＢＣ１
発現をわずかに増加させた（ＴＤ２細胞）。これらの結果は、ＴＤ細胞について
記載されたアポ−Ａ−Ｉ媒介コレステロール流出における欠陥を反映する。興味
深いことには、血清含有培地中での細胞の増殖は、ＡＢＣ１メッセージを検出限
界近くまで抑制した（データは示さず）。これは、脂質流出経路の機能は細胞休
止または低下したコレステロール必要性の他の細胞状態を必要とするという事実
を反映し得る。結論において、細胞コレステロールの増加した流出に関連する条
件（すなわち、コレステロール負荷、ｃＡＭＰ処理、血清枯渇）の結果、正常繊
維芽細胞においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの発現が増加する。逆に、コレステロール
−負荷正常繊維芽細胞のアポＡ−Ｉへの暴露はＡＢＣ１発現を低下させる。

【０２６７】 （実施例１０） 本実施例は、２０−ヒドロキシコレステロールのごときＬＸＲ核受容体に対す
るリガンド、および９−シスレチノイン酸のごときＲＸＲ受容体に対するリガン
ドがマウスＲＡＷ２６４．７細胞においてＡＢＣ１遺伝子発現を増加させること
ができるのを示す。

【０２６８】 ＬＸＲ核受容体は核受容体ＲＸＲを持つ絶対ヘテロダイマーを形成する転写因
子であり、これは、２２−ヒドロキシコレステロールおよび２０−ヒドロキシコ
レステロールを含めたオキシステロールのクラスに結合することによって、活性
化されてその標的遺伝子の転写を増強する（Ｊａｎｏｗｓｋｉら， Ｎａｔｕｒ
ｅ， ３８３：７２８−７３１（１９９６））。それ自体、それらはコレステロ
ール−誘導遺伝子転写の媒介についての候補である。さらに、ＡＢＣ１ ｍＲＮ
Ａおよび蛋白質がコレステロール負荷に応答して繊維芽細胞およびマクロファー
ジで増加することを示した実験、およびＬＸＲおよびＲＸＲ発現が酸化されたＬ
ＤＬへの暴露によってコレステロール−負荷マクロファージ細胞で増加すること
を示した他の実験に徴すると、ＬＸＲおよびＲＸＲ核レポーターは、ＡＢＣ１遺
伝子の転写アクチベータについてのかなり可能性のある候補である。ＬＸＲおよ
びＲＸＲレポーターがＡＢＣ１遺伝子発現で役割を演じるか否かを判断するため
に、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡのレベルを、２０−ヒドロキシコレステロールおよび９
−シスレチノイン酸に応答して測定した。

【０２６９】 マウスＲＡＷ２６４．７細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖さ
せ、次いで、９−シスレチノイン酸（１０μＭ）、２０−ヒドロキシコレステロ
ール（１０μＭ）または双方のいっしょにしたリガンド（２０μＭ合計）を含む
無血清ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で２４時間処理した。対照細胞はエタノールビヒクル
のみを摂取した（０．１％ｖ／ｖ）。ＲＮＡを抽出しＤＮａｓｅで処理し、実施
例９に記載したごとくＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いるＲＴ−ＰＣＲによってＡＢＣ１ ｍＲＮＡを測定し
た。図９は、２０−ヒドロキシコレステロールまたは９−シスレチノイン酸いず
れかでの処理の結果、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現が増加することを示す。加えて、
実施例９はいっしょにした双方のリガンドでの処理の結果、顕著な相乗的効果が
もたらされ、いずれかのリガンド単独で観察されたＡＢＣ１発現に対しほぼ６倍
増加することを示す。これらの結果は核受容体ＬＸＲおよびＲＸＲに対するリガ
ンドがＡＢＣ１遺伝子の発現を増加させることができるのを示す。

【０２７０】 （実施例１１） 本実施例は、原形質膜におけるＡＢＣ１蛋白質の増強された発現は脂質流出に
関連することを示す。

【０２７１】 細胞−表面標識および免疫沈殿を用いて、原形質膜中でのＡＢＣ１蛋白質の増
加した発現がコレステロール流出の増加と相関するか否かを判断した（図１０）
。細胞表面のＡＢＣ１の相対的量は、無傷細胞上の表面蛋白質を膜不浸透性剤ス
ルホ−ＮＨＳ−ビオチンで架橋させ、続いて、膜可溶化、ＡＢＣ１抗体での免疫
沈殿、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびストレプトアビジンでの検出での工程によって測
定した。

【０２７２】 細胞培養：正常およびＴＤ１繊維芽細胞を実施例１に記載したごとく不死化し
た。正常およびＴＤ１細胞双方を制御条件およびアポリポ蛋白質−媒介コレステ
ロール流出を増加させることが知られている条件（Ｏｒａｍ．ら， Ｊ．Ｌｉｐ
．Ｒｅｓ．， ４０：１７６９−１７８１（１９９９））下で培養した。対照細
胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するまで増殖させ、次いで、添加物なくし
てＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８時間インキュベートした（対照）。ｃＡＭＰ−処理
細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するまで増殖させ、次いで、１ｍＭの８
−Ｂｒ−ｃＡＭＰを含むＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８時間インキュベートした（ｃ
ＡＭＰ）。コレステロール−負荷細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するま
で増殖させ、次いで、３０μｇ／ｍｌコレステロールを含むＤＭＥＭ／ＢＳＡ中
で４８時間、および添加物なしで１８時間インキュベートした（コレステロール
）。ｃＡＭＰで処理したコレステロール−負荷細胞をＤＭＥＭ／１０％中で密集
するまで増殖させ、次いで、３０μｇ／ｍｌコレステロールを含むＤＭＥＭ／Ｂ
ＳＡ中で４８時間、および１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを含むので１８時間イン
キュベートした（コレステロール＋ｃＡＭＰ）。

【０２７３】 細胞−表面標識：原形質膜ＡＢＣ１の選択的標識のために、１ｍｇ／ｍｌスル
ホ−ｎｈＳ−ビオチン（３０μｇ／ｍｌコレステロールを含む（Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ．ＩＬ；Ｃａｔ．＃２１２１７）を含有する９℃で３０分間
ビオチン化した（Ｗａｌｋｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５０：１４
００９−１４０１４（１９９３））参照。

【０２７４】 免疫沈殿：ヒトＡＢＣ１のＣ−末端に位置した推定ペプチドＫＮＱＴＶＶＤＡ
ＶＬＴＳＦＬＱＤＥＫＶＫＥＳに対応する合成ペプチドに対してＡＢＣ１につい
てのウサギ抗血清を生起させた。１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１ｍＭ
）、およびペプスタチン（１ｍＭ）、およびアプロチニン（１ｍＭ）を含有する
ＰＢＳ中で細胞を可溶化することによって、免疫沈殿を行った。細胞抽出物を１
：２００希釈にて抗−ＡＢＣ１抗血清で細胞抽出物を４℃にて一晩インキュベー
トし、５μｌのプロテインＡ−被覆磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｌａｋｅ Ｓｕ
ｃｃｅｓｓ， ＮＹ； Ｃａｔ．＃１００１．０１）と共にさらに１時間インキ
ュベートした。抗体−抗原複合体を磁石で沈降させ、ビーズを１％トリトン−Ｘ
／ＰＢＳで２回洗浄し、蛋白質を酢酸で１％溶出させた。

【０２７５】 ＡＢＣ１蛋白質の検出：溶出したビオチン化蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％
ゲル；１５０Ｖ、５時間）に付し、ニトロセルロース膜（２００ｍＡ、１８時間
）に移した。該ニトロセルロースをストレプトアビジン−ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ， ＮＪ；Ｃａｔ．＃ＲＰＮ１２３１）でプローブし、３００倍希釈し、販売
業者のプロトコル（Ａｍａｅｒｓｈａｍ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，ＮＪ）に従って増強された化学ルミネセンス標識（ＥＣＬ）によって
検出した。細胞内蛋白質の可能なビオチン化につきテストするために、免疫沈殿
後上清を細胞内蛋白質β−ＣＯＰに対するマウスモノクローナル抗体で処理し、
免疫沈殿したビオチン化β−ＣＯＰをストレプトアビジンブロッティングによっ
てアッセイした。何も検出されなかった。

【０２７６】 結果：図１０にしめすごとく、２４０ｋＤａのＡＢＣ１蛋白質がダブレットと
して出現する。正常（１０Ａ）およびＴＤ１（１０Ｂ）双方において、ＡＢＣ１
蛋白質は原形質膜に部分的に局所化される。同様の結果が、第２の正常繊維芽細
胞系で、およびＴＤ２繊維芽細胞で観察された（データは示さず）。ＡＢＣ１の
細胞−表面発現は、血清中で増殖させた細胞（正常およびＴＤ１細胞）を８−Ｂ
ｒ−ｃＡＭＰで処理した場合にわずかに増加した。正常およびＴＤ１細胞双方の
血清枯渇およびコレステロール−負荷はＡＢＣ１の細胞−表面発現を顕著に増加
させ、これはｃＡＭＰ処理によってさらに増強された。これらの結果は、細胞表
面におけるＡＢＣ１の発現が、アポリポ蛋白質−媒介脂質流出を増強する条件に
よって調節され、これは原形質膜へのその局所化がその脂質輸送機能において鍵
となる役割を果たすという考えに合致することを示す。ＴＤ１およびＴＤ２細胞
における突然変異は、ＡＢＣ１の発現またはプロセッシングをひどくは損なわな
いようであり、これは、脂質輸送またはアクセサリー蛋白質との相互作用に対す
る二次効果がそのＮＨ2末端ドメイン（ここで突然変異が起こる）に依存するこ
とを示唆する。

【０２７７】 （実施例１２） 本実施例は、ホスホジエステラーゼ阻害剤のごとき３’、５’環状ＡＭＰの分
解を阻害する剤がマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流出を
増加させることを示す。

【０２７８】 図１０に示すごとく、ｃＡＭＰはＡＢＣ１の活性を増加させる。本実験は、上
昇したｃＡＭＰの存在下でマクロファージ細胞からのコレステロール流出を測定
するために行った。上昇したレベルのｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ合成を刺激するか、
またはｃＡＭＰの分解を阻害する剤の存在下で達成することができる。例えば、
ロリプラムは、ホスホジエステラーゼ（ｃＡＭＰを分解する一群の酵素）を阻害
することによってｃＡＭＰレベルを調節する化合物である。コレステロール流出
に対する上昇したｃＡＭＰの効果は、実施例１に記載されたアポリポ蛋白質−媒
介コレステロール流出アッセイを用いて測定した。略言すれば、１．２５×１０ ⁵ 細胞／ｍｌの密度で懸濁させたＲＡＷ２６４．７細胞を、ピルベートを補足し
たＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。２４時間後、培地を取り出し、ＤＭ
ＥＭ／ＢＳＡ＋放射性標識コレステロール（１μＣｉ／ｍｌ［³Ｈ］−コレステ
ロール）および５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬで２４時間で置き換えた。次
いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ＋アポＡ−Ｉ単独（２０μｇ／ｍｌ）、アポＡ−Ｉおよ
び８−ブロモ３’、５’ｃＡＭＰ（１ｍＭ）またはアポＡ−Ｉおよびロリプラム
（５０μＭ）いずれかよりなる平衡培地中で細胞を２４時間維持した。１２−２
４時間後、実施例１に記載したごとくシンチレーションカウンティングによって
［³Ｈ］コレステロール流出を測定し、培地に出現する全放射性標識コレステロ
ールのパーセンテージとして計算した。結果は、アポＡ−Ｉを摂取しなかったコ
レステロール−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を示し、他方、アポＡ−
Ｉのみを摂取した細胞は５％流出を示すことを示した。アポＡ−ＩおよびｃＡＭ
Ｐを摂取したコレステロール−負荷細胞は３２％コレステロール流出を示し、こ
れは上昇したｃＡＭＰがコレステロール流出を促進することを示す。同様に、ア
ポＡ−Ｉおよびホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラム）を摂取した細胞は１
７％コレステロール流出を示した。

【０２７９】 （実施例１３） 本実施例は、ＬＸＲ、ＲＸＲおよびＰＲＡＲ核受容体のごとき核受容体に対す
るリガンドである剤がマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流
出を増加させることを示す。

【０２８０】 核受容体に対するリガンドがアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出に影響
するか否かを判断するために、実施例１２に記載したアポＡ−Ｉ−媒介コレステ
ロール流出アッセイを用いて種々のリガンドをテストした。核受容体スーパーフ
ァミリーは、脂質代謝に関係づけられてきた（Ｒｕｓｓｅｌｌ． Ｄ．Ｗ．，
Ｃｅｌｌ，９７：５３９−５４２（１９９９）；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ， Ｂ．
Ｗ．， Ｃｅｌｌ，９３：１５３−１５５（１９９８）；Ｊａｎｏｗｓｋｉら，
Ｎａｔｕｒｅ， ３８３：７２８−７３１（１９９６））肝臓受容体ＬＸＲ、
レチノイド受容体ＲＸＲおよびペルオキシソームプロリフェレーター−媒介受容
体ＰＰＡＲのごときいくつかのメンバーを含む。さらに、これらの受容体をいく
つかに対するリガンドは血漿ＨＤＬを増加させることが観察されており、遺伝子
発現プロファイリング（マイクロアレイ）データは、ホルモン受容体が参加され
たＬＤＬを介してコレステロール負荷に応答することを示した。前記したアッセ
イを用い、９シス−レチノイン酸（ＲＸＲリガンド）、オキシステロール（ＬＸ
Ｒリガンド）およびフェンフィブレート（ＰＰＡＲリガンド）をテストして、コ
レステロール流出に対する効果を測定した。アポＡ−Ｉを摂取しなかったコレス
テロール−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を示し、他方、アポＡ−Ｉの
みを摂取した細胞は５％流出を示した。対照的に、アポＡ−Ｉおよび９シス−レ
チノイン酸（３０ｎｇ／ｍｌ）を摂取したコレステロール−負荷細胞は１６％コ
レステロール流出を示した。アポＡ−Ｉおよびオキシステロール（５μｇ／ｍｌ
）を受容する細胞は１４％コレステロール流出を示した。アポＡ−Ｉおよびフェ
ンフィブレート（３μｇ／ｍｌ）を摂取した細胞は１０％コレステロール流出を
示した。これらの結果は、ホルモン受容体を変調して、マクロファージからのア
ポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができるのを示
す。

【０２８１】 さらに、種々の濃度の９−シス−ＲＡ（０．３ｎｇ／ｍｌ、３．０ｎｇ／ｍｌ
または３０ｎｇ／ｍｌ）を用いて流出アッセイを行うと、結果は、９−シス−Ｒ
Ａが用量依存的にマクロファージからのコレステロール流出を媒介することを示
した。具体的には、対照細胞（アポＡ−Ｉのみ）は１８９０ｃ．ｐ．ｍ．を示し
、０．３ｎｇ／ｍｌの９−シス−ＲＡは１５２２ｃ．ｐ．ｍ．を示し、３．０ｎ
ｇ／ｍｌの９−シス−ＲＡは３５６８ｃ．ｐ．ｍ．を示し、および３０ｎｇ／ｍ
ｌの９−シス−ＲＡは８５９７ｃ．ｐ．ｍ．を示した。加えて、ＲＡＷ２６４．
７細胞を４８時間コレステロール−負荷させる同様のアッセイを用い、２２−ヒ
ドロキシコレステロール（ＬＸＲリガンド）およびベンズフィブレートのごとき
他の核受容体アクチベータはコレステロール流出を増加させることが示された（
データは示さず）。

【０２８２】 （実施例１４） 本実施例は、プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＰＧ１２のご
ときエイコサノイドがマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流
出を増加させることを示す。

【０２８３】 プロスタグランジンおよびプロスタサイクリンのごときエイコサノイドは、高
コレステロール血症の治療で効果的であることが示されている。エイコサノイド
がアポリポ蛋白質−媒介流出に影響するか否かを判断するために、実施例１２に
記載されたアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出アッセイを用いてＰＥＧ１およ
びＰＧ１２をテストした。このアッセイは、アポＡ−Ｉを摂取したコレステロー
ル−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を有し、アポＡ−Ｉのみを摂取した
細胞は５％流出を有することを示した。アポＡ−ＩおよびＰＧ１２（２５ｎＭ）
を摂取したコレステロール−負荷細胞は１０％コレステロール流出を示した。ア
ポＡ−ＩおよびＰＥＧ１（２５ｎＭ）を摂取した細胞は１５％コレステロール流
出を示した。これらの結果は、エイコサノイドがマクロファージからのアポリポ
蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができるのを示す。

【０２８４】 （実施例１５） 本実施例は、ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を用いて
、ＡＢＣ１遺伝子発現を調節する能力につき化合物をテストすることができるの
を示す。

【０２８５】 ｐＧＬ３レシフェラーゼレポーターベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、組換えプラスミドを創製し、ＡＢＣ１プロモータ
ーの制御下にあるレポーター遺伝子発現を測定した。

【０２８６】 レポータープラスミドの構築：プロモーターなしのルシフェラーゼ遺伝子を含
有する対照プラスミドとして、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ （Ｐｒｏｎｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ；Ｃａｔ．＃Ｅ１７５１）を用いた。ＡＢＣ１プロ
モーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーターは、ＡＢＣ１遺伝子
（ｈＡＰＲ１ ５’プロモーター、配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１
６４３に対応）の５’フランキング領域からのゲノム断片をＧＬ３−Ｂａｓｉｃ
プラスミドのＳａｃＩ部位にクローンして、プラスミドＧＬ−６ａを得ることに
よって作成した。つぎに、プラスミドＧＬ−６ａをＳｐｅＩおよびＡｃｃ６５Ｉ で消化した。配列番号：３のヌクレオチド１−１５４２に対応するＡＢＣ１ゲノ
ム配列を表す、ラムダサブクローンから切り出したＢｓｉＷＩ−ＳｐｅＩ断片を
、この消化によって生じた残りのベクター：ＡＢＣ１プロモーターに連結した。
得られたプラスミドｐＡＰＲ１は、ヒトＡＢＣ１プロモーター配列の１．７５ｋ
ｂの転写制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。

【０２８７】 レポーター構築体のトランスフェクション：前記対照またはｐＡＰＲ１プラス
ミドを、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中に維持したＲＡＷ２４６．７
細胞の密集培養にトランスフェクトした。１２ウエル皿の各ウエルを、ｐＧＬ３
−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ３−プロモーターまたはｐＡＰＲ１ ＤＮＡ（１μｇ）、
ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（１μ）および１２μｌのＧｅｎｅｐｏｒｄｅ
ｒ試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ； Ｃａｔ．＃Ｔ２０１００７）いずれかで５時間トランスフェクトした
。加えて、０．１μｇのｐＧＭＶβプラスミドＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， Ｃａｔ．＃６１７７−１）を、トランスフェクシ
ョン効率のための対照として添加した。５時間後、培養培地を、アセチル化ＬＤ
Ｌ（１００βｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で無血清ＤＭＥＭ／ＢＳＡで置
き換え、２４時間インキュベートした。

【０２８８】 高スループットスクリーニングにおける負荷された便宜のために、培養された
細胞を、以下の手法を用いレポータープラスミドで安定にトランスフェクトする
ことができる。まず、５０μｌのＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒトランスフェクション試
薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を含む１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中、５×１０⁶ＲＡＷ２６４．７細胞を
、９μのｐＭＰＲ１プラスミドおよびｐＣＭＶｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）で６０ｍｍ皿中で５時間トランスフェクトす
る。引き続いて、トランスフェクション培地を完全培地で置き換え、細胞を３７
℃にて一晩インキュベートする。引き続いて、１：５ないし１：１０００の範囲
の希釈にて細胞を別々の皿に移し、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８ （Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含有する選択培地中で
２０日間インキュベートする。目に見えるコロニーを拾い、増殖させ、後記する
ごとくルシフェラーゼ活性につきアッセイした。この方法を用い、ルシフェラー
ゼ活性につき陽性の５つのクローン細胞系が、高スループットアッセイで用いる
ために同定された。

【０２８９】 ルシフェラーゼアッセイ：トランスフェクションに続き、各ウエル中の細胞を
７０μｌの１Ｘ細胞溶解試薬８Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ，Ｃ
ａｔ．＃Ｅ３９７１）中で溶解させ、凍結−解凍の１サイクルに付し、溶解物を
１２、０００ｇにおいて５分間の遠心によって除去した。遠心後に、１００μｌ
のルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｃａ
ｔ．＃Ｅ１５０１）を１０μｌの溶解物に添加した。各溶解物のルシフェラーゼ
活性を、ルミノメータを用いて光単位として測定した。加えて、製造業者の指示
（Ｔｒｏｐｉｘ Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ：Ｃａｔ．＃ＢＬ１００
Ｇ）に従い、Ｇａｌａｃｔｏ−光キット中に供給された化学ルミネセントアッセ
イ試薬を用いて、各溶解物のβ−ガラクトシラーゼを測定した。ルシフェラーゼ
活性値を測定されたβ−ガラクトシラーゼ値で割ることによって、各溶解物につ
いての正規化されたルシフェラーゼ活性を決定し、相対的光単位として報告する
。

【０２９０】 結果：ｐＡＰＲ１でトランスフェクトされた細胞で検出されたルシフェラーゼ
活性は、ルシフェラーゼｃＤＮＡのみを含有するｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミ
ドでトランスフェクトされた対照細胞で検出された活性よりも３．３倍高かった
。これらの結果は、ＡＢＣ１の転写調節領域が所定の位置にあることを示した。
ｐＡＰＲ１でトランスフェクトした細胞を１００μｇ／ｍｌアセチルＬＤＬとと
もに２４時間インキュベートすると、ルシフェラーゼ活性はアセチルＬＤＬで処
理されていない細胞におけるよりも３．２５倍高かった。これらの結果は、ゲノ
ムＡＢＣ１配列が、天然ＡＢＣ１遺伝子のコレステロール負荷応答を媒介する５
’フランキング領域で見出される「コレステロール応答性」エレメントを含有す
ることを示唆する。このレポーター系は、他の化合物をテストして化合物がＡＢ
Ｃ１発現を変調するか否かを決定するのにも用いることができる。

【０２９１】 （実施例１６） 本実施例は、内因性ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を
用い、ＡＢＣ１遺伝子発現を調節する能力につき化合物をテストするのに用いる
ことができるさらなるアッセイを示す。

【０２９２】 このアッセイは、プロモーター無しのレポーター遺伝子および選択マーカー遺
伝子を含有する組換えベクターを構築することを含む。該ベクターを線状化し、
レポーター遺伝子が内因性ＡＢＣ１プロモーターの下流の細胞ゲノムに組み込ま
れるように細胞にトランスフェクトする。このアッセイを用い、レポーター遺伝
子の発現は、テスト化合物に応答して内因性ＡＢＣ１プロモーターによって駆動
される。

【０２９３】 レポータープラスミドの構築：プロモーターなしのレポーター遺伝子を含有す
る組換えベクターは、（ＡＢＣ１開始部位を含む）エクソン０およびイントロン
１の部分を含有するＡＢＣ１の７ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノム断片で出発して作成す
ることができる。部位特異的突然変異誘発を用い、２つの既知の開始部位の上流
のエクソン０配列に、ＳａｌＩ制限部位を生じさせることができる。組換えベク
ターは、ルシフェラーゼのごときプロモーター無しのレポーター遺伝子、および
ピューロマイシン抵抗性のごときプロモーター無しの選択マーカーそ含むＤＮＡ
断片をＳａｌＩ部位に挿入することによって生じさせる。内部リボソームエント
リーシグナルは、遺伝子が正しい向きに転写されるようにレポーター遺伝子およ
びマーカー遺伝子の間に挿入すべきである。組換えベクターは２つのＥｃｏ４７
ＩＩＩ部位を含有し、そのうちの１つは、例えば、部位−特異的突然変異誘発を
用いて排除されなければならない。エクソン０の上流に位置した残りのＥｃｏ４
７ＩＩＩ部位を用いてベクターを線状化する。

【０２９４】 レポーター構築体のトランスフェクション：レポーター遺伝子およびマーカー
遺伝子を含有する線状化組換えベクターを、当該分野で知られた種々のトランス
フェクション方法のいずれかによって、ヒト細胞を含めた培養細胞に導入する。
例えば、実施例１５に記載された方法を用い、線状化ベクターをトランスフェク
トすることができる。線状化組換えベクターは、ベクターが内因性ＡＢＣ１遺伝
子の部位において細胞ゲノムに組み込まれるようにするＡＢＣ１配列を含有する
。培養培地への適当な抗生物質の添加は、レポーター遺伝子およびマーカー遺伝
子が正しい向きで内因性ＡＢＣ１プロモーターの下流に組み込まれている細胞の
みの選択を可能とする。例えば、もしベクターがレポーター遺伝子の下流に挿入
されたピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有するならば、トランスフェクトされ
た細胞はピューロマイシンの存在下で増殖するはずである。適切に組み込まれた
ピューロマイシン抵抗性遺伝子を有し、それにより、機能的な蛋白質をコードす
ることができる細胞のみがピューロマイシンの存在下で生存する。かくして、ト
ランスフェクトされた細胞は、適当な抗生物質の存在下でＡＢＣ１プロモーター
活性を誘導する条件下で増殖するはずである。生存する細胞をクローン的に培養
することができ、ＰＣＲまたはサザーンブロット分析を用いてＤＮＡを配列決定
し、ゲノム配列の適切な組込につきテストすることができる。

【０２９５】 内因性ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含有する得ら
れた細胞を用いて、テスト化合物がＡＢＣ１の発現を変調するか否かを決定する
ことができる。化合物のＡＢＣ１変調活性は、テスト化合物に暴露された細胞で
見出されるレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイすることによって決定され
る。例えば組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞を用いて、化合物に
暴露された細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の量を測定することによって、
テスト化合物のＡＢＣ１変調活性を決定することができる。

【０２９６】 （実施例１７） 本実施例は、核受容体に対するリガンドが、ＡＢＣ１プロモーターの制御下に
あるレポーター遺伝子の発現を上昇調節することを示す。

【０２９７】 ＬＸＲα、ＬＸＲβおよびＲＸＲα核レポーターに対するリガンドがＡＢＣ１
遺伝子発現を調節できるか否かを判断するために、ＡＢＣ１プロモーターの制御
下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するｐＡＰＲ１プラスミドを、
核受容体に対する少なくとも１つのリガンドで処理したＲＡＷ２６４．７細胞に
トランスフェクトした（図１２）。

【０２９８】 レポーター構築体の構築およびトランスフェクション：レポーター構築体ｐＡ
ＰＲ１および対照レポーター構築体ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを実施例１５に記載さ
れているごとく得た。ＲＡＷ２６４．７細胞を培地に維持し、実施例１５に記載
されたごとくｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１μｇ）またはｐＡＰＲ（１μｇ）いずれ
かでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＲＡＷ３６４．７細胞をエ
タノール（ＥｔＯＨ）（０．１％ｖ／ｖ）、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロ
ール（２０（Ｓ）ＯＨ−コール）（１０μＭ）、９−シスレチノイン酸（９−シ
ス（ＲＡ）（１０αＭ）または２０（Ｓ）ＯＡ−コールおよび９−シスＲＡ（合
計２４μＭ）双方のいずれかで２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性を測定し
、実施例１５に記載されたごとく相対的光単位として報告する。

【０２９９】 結果：この実験の結果は図１２に示す。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃでトランスフェ
クトした対照細胞はルシフェラーゼ活性を示さなかった（データは示さず）。Ｅ
ｔＯＨ対照と比較し、ｐＡＰＲ１でトランスフェクトされた細胞は２０ＯＨ−コ
ールの存在下でルシフェラーゼレポーター活性の１９倍増加を生じ、９−シスＲ
Ａの存在下でルシフェラーゼ活性の１６倍増加を生じ、および双方のリガンドの
存在下でルシフェラーゼ活性の２８０倍増加を生じた。これらの結果は、ステロ
ールおよびレチノイドの双方はｐＡＰＲ１におけるＡＢＣ１ ５’フランキング
配列からの強力な転写応答を誘導することを示す。さらに、双方のリガンドで処
理した細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の劇的な増加によってわかるごとく
、２つのクラスの化合物の明らかな相乗効果がある。ＬＸＲαおよびＲＸＲαレ
ポーターは活性なヘテロダイマーを形成することが知られている。かくして、双
方の核受容体のリガンド−誘導活性化は同時に転写の観察された相乗的増加を生
じ得る。

【０３００】 これらのデータは、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールのごときヒドロキシ
ステロール、および９−シスレチノイン酸のごときレチノイドがＡＢＣ１プロモ
ーターを活性化することを示し、これは、これらおよび関連する化合物が、マク
ロファージ細胞においてＡＢＣ１発現を増加させて、過剰のコレステロールの末
梢部位を取り除く治療化合物の開発で有用で有り得ることを示す。加えて、本発
明のＡＢＣ１プロモーター／レポーター遺伝子スクリーニングアッセイを用いて
、ＡＢＣ１発現を増加させる他の化合物をスクリーニングし、さらなる治療化合
物を同定することができる。

【０３０１】 （実施例１８） 本実施例は、ＬＸＲ応答エレメントの同定を含めたＡＢＣ１プロモーター領域
のさらなる特徴付けを示す。

【０３０２】 ＡＢＣ１の５’フランキング領域のいずれの部分が核リガンドに応答して転写
活性を保持するかを判断するために、５’フランキング領域の異なる部分および
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する種々のプラスミドを、核受容体に対
する少なくとも１つのリガンドで処理したＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェ
クトした。この系を用い、配列番号；３のヌクレオチド１４８０−１５１０に対
応するステロール応答エレメントを同定した。該ステロール応答エレメントは直
接反復−４エレメントＴＧＡＣＣＧａｔａｇＴＡＡＣＣＴを含有する。部位−特
異的突然変異誘発およびバンド−シフトアッセイ技術を用いてステロール応答エ
レメントの確認が得られた。

【０３０３】 レポーター構築体の構築：レポーター構築体ｐＡＰＲ１および対照レポーター
構築体ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃは実施例１５に記載されているごとく得られた。ま
た、配列番号；３のヌクレオチド１−１５２３、１０８０−１６４３、１１８１
−１６４３、１２９２−１６４３また１３９４−１６４３いずれかを含有するレ
ポーター構築体を構築した。配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６２３を
含有するレポーター構築体（ＧＬ−６ａ）は実施例１５に記載したごとく構築し
た。配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２を含有するレポーター構築体は、
ｐＡＰＲ１をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ついで、ゲル−精製ベクター断
片を再び連結することによって構築した。ヌクレオチド１１８１ないし１６４３
を含有するレポーター構築体は、まずＧＬ−６ａをＳｔｙＩで消化し、粘着末端
をクレノウ酵素で平滑とし、得られたベクターをＳａｃＩで消化し、ついで、４
６２塩基対平滑−ＳａｃＩ粘着末端断片を単離することによって構築した。ＧＬ
−６ａをＡｃｃ６５Ｉで消化し、粘着末端をクレノウ酵素で平滑とし、ＳａｃＩ で消化し、ついで、ベクター断片をゲル単離することによって得られたベクター
にこれをクローンした。ヌクレオチド１２９２−１６４３を含有するレポーター
構築体は、ＧＬ−６ａをＡｃｃ６５Ｉで連続的に消化し、末端をクレノウ酵素で
平滑とし、ＳａｃＩＩで消化し、末端をＴ４ポリメラーゼで平滑とし、ついで、
ゲル−単離ベクター断片を再び連結することによって構築した。ヌクレオチド１
２９４−１６４３を含有するレポーター構築体は、ＧＬ−６ａをＡｃｃ６５Ｉで
消化し、末端をクレノウ酵素で平滑とし、ＡｐａＩで引き続いて消化し、Ｔ４ポ
リメラーゼで末端を平滑とし、ついで、ゲル−単離ベクター断片を再び連結する
ことによって構築した。

【０３０４】 レポーター構築体のトランスフェクション：実施例１５に記載された方法に従
い、ＲＡＷ２６４．７細胞を培養に維持し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ （１μｇ）
、ｐＡＰＲ１（１μｇ）または他のレポーター構築体の内の１ついずれかでトラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞をエタノール
（ＥｔＯＨ）（０．１％ｖ／ｖ）、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（
２０（Ｓ）ＯＨコール）（１０μＭ）、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール
（２２（Ｒ）ＯＨ−コール）（１０μＭ）、９−シスレチノイン酸（９−シスＲ
Ａ）（１０μＭ）、または２０（Ｓ）ＯＨ−コールおよび９−シスＲＡ（合計２
０μＭ）双方のいずれかで２４時間処理した。実施例１５に記載されているごと
く、ルシフェラーゼ活性を測定し、相対的光単位として報告した。

【０３０５】 部位−特異的突然変異誘発：配列番号：３のヌクレオチド１４８０−１５１０
に対応するステロール応答エレメントを、部位−特異的突然変異誘発を用いて前
記１０８０−１６４３配列中に突然変異した。具体的には、製造業者のプロトコ
ルに従い、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を用いて、直接反復−４エレメントＴＧＡＣＣＧａｔａｇＴＡＡＣＣＴを
含有する応答エレメントをＣＴＧＣＡＣａｔａｇＴＡＡＣＣＴに突然変異した。

【０３０６】 ゲル−シフトアッセイ：Ｏｈｌｌｓｓｏｎら， Ｃｅｌｌ，４５：３５−５５
（１９８６）の方法によって、核抽出物をＲＡＷ２６４．７細胞から調製した。
ＬＸＲ応答エレメント（ＴＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＧ
Ａ；配列番号：５６）およびその突然変異したカウンターパート（ＴＣＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＣＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡ；配列番号：５７）に対応する³²Ｐ
−標識オリゴヌクレオチド（５ｎｇ）を、ＬＸＲαおよびＬＸＲβ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−１５９１，Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する１μｇ抗血清またはＲＸＲ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−７７４， Ｓａ
ｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する抗血清の存在または不存在下、２０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴ
Ｔ、６６．６μｇ／ｍｌのポリ（ＤｉｄＣ）および１０％グリセロール中で、室
温にて３０分間、５μｇの核蛋白質と共に個々にインキュベートした。蛋白質−
ＤＮＡ複合体を、０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１５０Ｖにて４％非−変成ポリアク
リルアミドゲルに１．５時間適用した。蛋白質−ＤＮＡ複合体は乾燥したゲルの
オートラジオグラフィーによって検出した。

【０３０７】 結果：配列番号：３のヌクレオチド１−１６４３（すなわち、ｐＡＰＲ１）、
１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２１６４３，
または１３９４−１６４３）に対応する５’フランキング領域を含有する個々の
レポーター構築体でのトランスフェクション（各々は同一結果を生じた）。個々
の構築体の全ては、ＥｔＯＨ対照と比較して、２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは２
２（Ｒ）ＯＨ−コールの存在下で、ルシフェラーゼレポーター活性の３ないし４
倍増加を生じた。また、個々の構築体の全ては、９−シスＲＡの存在下でルシフ
ェラーゼレポーター活性の８ないし１０倍増加を生じた。加えて、構築体のいず
れかでのトランスフェクションは、ＥｔＯＨ対照と比較して、オキシステロール
リガンド（（２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは２２（Ｒ）ＯＨコール）いずれか）
およびレチノイドリガンド（９−シスＲＡ）の存在下で、ルシフェラーゼ活性の
２５ないし５０倍増加を生じ、これは相乗的相互反応を示す。記載された構築体
の各々は、テストしたリガンドに応答してルシフェラーゼ活性の匹敵するレベル
を示し、これは、より短い５’フランキング配列がステロールおよびレチノイド
についての転写調節配列を含有したことを示す。具体的には、これらの結果は、
ステロールおよびレチノイドについての転写調節配列が配列番号：３のヌクレオ
チド１３９４−１５３２に対応する５’フランキング領域に位置することを示し
た。

【０３０８】 これらの結果は、配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６４３に対応する
野生型配列を含有するレポーター構築体および配列番号：３のヌクレオチド１０
８０−１６４３に対応する突然変異した配列を含有するレポーター構築体を用い
るルシフェラーゼ活性によって確認され、ここに、ヌクレオチド１４８０−１５
００で見出されたステロール応答エレメントは前記したごとく突然変異させた。
野生型配列でのトランスフェクションは、２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは９−シ
スＲＡ単独いずれかの存在下で、ルシフェラーゼ活性の増加によって測定して転
写応答を生じ、リガンドを一緒にした双方の存在下で相乗的応答を生じた。対照
的に、突然変異した配列でのトランスフェクションは、２０（Ｓ）ＯＨ−コール
または２２（Ｒ）ＯＨ−コールの存在下で転写応答を生じなかった。突然変異し
た配列のトランスフェクションは９−シスＲＡに対する低下した応答を保持し、
野生型配列で観察された８ないし１０倍増加よりもむしろ、転写活性の４ないし
５倍増加を生じた。また、突然変異した配列のトランスフェクションは、２０（
Ｓ）ＯＨ−コールおよび９−シスＲＡを一緒にした存在下で観察された相乗的転
写応答を無くした。これらの結果は、さらに、ステロールコンセンサス配列（ヌ
クレオチド１４８０−１５１０）およびその突然変異したカウンターパートを用
いるゲルーシフトアッセイによって確認した。ゲル−シフトアッセイは、ＲＡＷ
２６４．７細胞から単離された核結合蛋白質がステロールコンセンサス配列に結
合したが、核蛋白質は突然変異した配列に結合しなかったことを示した。さらに
、ＬＸＲ抗血清の存在下での野生型ステロールコンセンサス配列との核蛋白質の
インキュベーションの結果、スーパーシフテッド複合体（すなわち、抗体−蛋白
質−ＤＮＡ複合体）が形成され、核受容体ＬＸＲに結合するステロール応答エレ
メントとしての配列が同定された。対照的に、ＲＸＲ抗血清の存在下での野生型
ステロール応答エレメントとの核蛋白質のインキュベーションの結果、スーパー
シフテッド複合体は形成されず、これは、ＲＸＲがこの配列に結合しないことを
示す。これらの結果は、コンセンサス配列に結合する核蛋白質を破壊する突然変
異がＬＸＲリガンドに対する転写応答を無くさせ、ＲＸＲリガンドに対する応答
を減少させることを示す。さらに、ＬＸＲまたはＲＸＲ抗血清の存在下で行った
核結合実験により、ヌクレオチド１４８０−１５１０で見出されたコンセンサス
配列はＬＸＲ応答エレメントであることが確認された。このエレメントは、また
、９−シスＲＡに対する部分的応答を媒介する。

【０３０９】 特許および刊行物を含めた本明細書中に引用した文献の全ては、出典明示して
その全体を本明細書に一体化させる。本発明を本発明の好ましい態様に対する強
調を持って記載してきたが、好ましい実施形態の変形を用いることができ、本発
明はここに具体的に記載された以外に実施できることが意図されることは当業者
に明らかであろう。従って、本発明は、前記した特許請求の範囲によって定義さ
れた本発明の精神および範囲内に含まれる全ての修飾を含む。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−Ｄは、対照コレステロール流出、および正常繊維芽細胞（１Ａ、Ｃ）
およびタンジール病患者からの繊維芽細胞（１Ｂ、Ｄ）からのＨＤＬおよびアポ
Ａ−Ｉの存在下でのコレステロール流出の結果を示すグラフである。塗りつぶし
ていない丸はＨＤＬまたはアポＡ−Ｉに暴露されなかった細胞からのコレステロ
ール流出を表し、塗りつぶした丸はＡＤＬに暴露された細胞からのコレステロー
ル流出を表し、塗りつぶした菱形はアポＡ−Ｉに暴露されたコレステロール流出
を表す。

【図２】 図２は、タンジール患者（ＴＤ１）からの細胞で見出された遺伝子発現および
正常細胞で見出されたそれの比較を示す遺伝子発現マイクロアレイ分析のグラフ
表示であり、それにより、合計５８、８００ヒトｃＤＮＡはｃＡＭＰ−処理ＴＤ
１細胞ｃＤＮＡのｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（Ｃｙ３色素で標識）と、お
よびｃＡＭＰ−処理正常細胞のｍＡＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（Ｃｙ５色素
で標識）とハイブリダイズした。

【図３】 図３は、ヒトＡＢＣ１遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する組換
え発現ベクターｐＣＥＰｈＡＢＣ１の制限地図を示す模式図である。

【図４】 図４は、公表されたヒトＡＢＣ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号Ａ
Ｊ０１２３７６）およびＮ−末端に６０のさらなるアミノ酸を有する現在開示さ
れ特許請求されたヒトＡＢＣ１アミノ酸配列（「ＣＶＴ」）の間の比較を示す、
ヒトＡＢＣ１の遺伝子構造の模式図である。

【図５】 図５は、ＡＢＣ１輸送阻害剤４、４−ジイソチオシアノスチルベン−２、２’
−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）がアポＡ
−Ｉ−媒介コレステロール流出に対して有する阻害効果を示すグラフ表示であり
、ここに、塗りつぶしていない丸はＢＳＰの存在下におけるアポＡ−Ｉ−媒介コ
レステロールを示し、塗りつぶした丸はＤＩＤＳの存在下におけるアポＡ−Ｉ−
媒介コレステロールを示す。

【図６】 図６は、アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出に対するアンチセンスＡＢＣ１
オリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフであり、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドなくしてインキュベートした細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロー
ル流出、３０μＭのβ−グロビンアンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露された
細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出、および３０μＭのＡＢＣ１
アンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露された細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コ
レステロール流出を示す。

【図７】 図７は、ヒトＡＢＣ１についての発現プラスミド（ｐＣＥＰｈＡＢＣ１）で安
定にトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を用い
てＡＢＣ１遺伝子の過剰発現によって引き起こされたアポＡ−Ｉ−媒介コレステ
ロール流出の刺激を示すグラフ表示であり、対照親細胞（ｐＣＥＰｈＡＢＣ１無
し）におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出およびｐＣＥＰｈＡＢＣ１で
トランスフェクトされたクローン細胞（Ｌ３、Ｌ５、Ｌ６）におけるアポＡ−Ｉ
−媒介コレステロール流出を示す。

【図８】 図８は、アルブミン（塗りつぶした棒線）に暴露された、８−ｂＲ−ｃＡＭＰ
（塗りつぶしていない棒線）に暴露した、コレステロール−負荷（陰を付けた棒
線）に暴露された、またはコレステロール−負荷および引き続いてアポＡ−Ｉ−
（ハッチングを施した棒線）に暴露したのいずれかである正常細胞およびタンジ
ール病患者（ＴＤ１およびＴＤ２）からの細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現のレ
ベルを示す逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のグラフ表示である。

【図９】 図９はエタノール（０．１％ｖ／ｖ）、９−シスレチノイン酸（９−シスＲＡ
；１０μＭ）、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２０（Ｓ）−ＯＨ；１０
μＭ）、または９−シスＲＡおよび２０（Ｓ）−ＯＨ（各々１０μＭ）いずれか
に暴露されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現のレベルを示す
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果のグラフ表示である。

【図１０】 図１０は、添加物無し（対照）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）、コレステロ
ール（３０μｇ／ｍｌ）またはコレステロールおよび８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（各々
、３０μｇ／ｍｌおよび１ｍＭ）の存在下で正常繊維芽細胞（ＮＬ１、１０Ａ）
およびタンジール病患者（ＴＤ１、１０Ｂ）で見出された細胞−表面ＡＢＣ１蛋
白質のレベルを示す免疫沈殿分析の結果を示す。

【図１１】 図１１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム
の上流に位置したＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域を含有する、組換え発
現ベクターｐＡＰＲ１の制限地図を示す模式図である。

【図１２】 図１２は、ＥｔＯＨ（対照）、２０（Ｓ）−ＯＨ（１０μＭ）、９−シスＲＡ
（１０μＭ）、または２０（Ｓ）−ＯＨおよび９−シスＲＡ双方（各々１０μＭ
の存在下でｐＡＲＰ１でトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞において誘
導されたルシフェラーゼレポーター遺伝子発現のレベルを示すグラフ表示である
。

【図１３】 図１３は、ＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域の模式図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月８日（２００１．１０．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/5575 Ａ６１Ｋ 31/5585 ４Ｃ０８６ 31/5585 31/56 ４Ｃ０８７ 31/56 35/14 Ｚ ４Ｃ２０６ 35/14 35/76 35/76 39/00 Ｚ 38/00 45/00 38/43 48/00 39/00 Ａ６１Ｐ 1/16 45/00 3/06 48/00 3/10 Ａ６１Ｐ 1/16 5/14 3/06 9/00 3/10 9/10 5/14 9/12 9/00 25/32 9/10 43/00 １１１ 9/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 25/32 1/19 43/00 １１１ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/19 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 1/68 37/48 (31)優先権主張番号 ６０／１６６，５７３ (32)優先日 平成11年11月19日(1999．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウエイド、 デイヴィッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト アパートメント エル カートナー アヴェニュー 383 (72)発明者 ガーヴィン、 マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94019 サンフランシスコ ホワイト ス トリート 17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA09 CA12 GA23 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ53 QQ60 QQ76 QQ79 QR32 QR36 QR41 QR48 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 4B065 AA93Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA08 BA23 CA53 CA56 CA59 DB01 DC25 NA14 ZA362 ZA422 ZA452 ZA752 ZA812 ZC022 ZC062 ZC332 ZC352 ZC392 4C085 AA32 BA99 EE01 4C086 AA01 AA02 DA01 DA02 DA03 DA06 DA08 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZA75 ZA81 ZC06 ZC33 ZC35 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA05 NA13 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZA75 ZA81 ZC06 ZC33 ZC35 ZC39 4C206 AA01 AA02 CA08 CB02 DA05 MA01 MA04 ZA36 ZA42 ZA45 ZA75 ZA81 ZC06 ZC33 ZC35 ZC39

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：３を含む単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６
   ４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３または１
   ３９４−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 該ポリヌクレオチドが配列番号：３のヌクレオチド１３９４
   −１５３２を含む請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 厳密な条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドにハイブ
   リダイズする単離されたポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 厳密な条件下で請求項２に記載のポリヌクレオチドにハイブ
   リダイズする単離されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一
   であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項２に記載のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一
   であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリヌクレオチドに相補的な単離されたポ
   リヌクレオチド。
9. 【請求項９】 請求項２に記載のポリヌクレオチドに相補的な単離されたポ
   リヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリヌクレオチドおよび適当な担体を含
    む組成物。
11. 【請求項１１】 請求項２に記載のポリヌクレオチドおよび適当な担体を含
    む組成物。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター
    。
13. 【請求項１３】 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター
    。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
16. 【請求項１６】 さらに、異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つの
    ポリペプチドを含む請求項１２に記載の組換えベクター。
17. 【請求項１７】 さらに、異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つの
    ポリペプチドを含む請求項１３に記載の組換えベクター。
18. 【請求項１８】 該異種ポリヌクレオチドがルシフェラーゼ、β−ガラクト
    シダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼトランスフェラー
    ゼおよび緑色蛍光蛋白質よりなる群より選択される請求項１６に記載の組換えベ
    クター。
19. 【請求項１９】 該異種ポリペプチドがルシフェラーゼである請求項１８に
    記載の組換えベクター。
20. 【請求項２０】 該ベクターがｐＡＰＲ１である請求項１９に記載の組換え
    ベクター。
21. 【請求項２１】 細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量
    の核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与する工程を
    含むことを特徴とする哺乳動物対象からコレステロール流出を増加させるのに適
    した方法。
22. 【請求項２２】 該リガンドがＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳ
    ＸＲリガンドよりなる群より選択される請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 該ＬＸＲリガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール
    、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール
    、２５ヒドロキシコレステロールおよび２４（Ｓ），２５エポキシコレステロー
    ルよりなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 該リガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールである
    請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 該ＲＸＲリガンドが９−シスレチノイン酸、レチノール、
    レチナール、全ての−トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、アシト
    レチン、フェンレチニド、エトレチネート、ＣＤ４９５、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ
    、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴＡＢ、ＬＧＤ１０６９よりなる群から選択される請求項２
    ２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 該リガンドが９−シスレチノイン酸である請求項２５に記
    載の方法。
27. 【請求項２７】 少なくとも二種のリガンドが哺乳動物対象に投与される請
    求項２２に記載の方法。
28. 【請求項２８】 コレステロール流出の増加が、いずれかのリガンド単独で
    のコレステロール流出のレベルに対して少なくとも２５倍である請求項２７に記
    載の方法。
29. 【請求項２９】 リガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールおよび９
    −シスレチノイン酸である請求項２７に記載の方法。
30. 【請求項３０】 哺乳動物対象の細胞においてコレステロール流出を増加さ
    せるのに十分な量のエイコサノイドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを
    特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法。
31. 【請求項３１】 該エイコサノイドがプロスタグランジンＥ２、プロスタサ
    イクリン１２およびプロスタグランジンＪ２よりなる群から選択される請求項３
    ０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させる
    のに十分な量の核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与する工程を含む
    ことを特徴とする該細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させるのに適した方法。
33. 【請求項３３】 該リガンドがＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳ
    ＸＲリガンドよりなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 レポーターｃＤＮＡを哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調
    部分で作動可能に連結して組換えレポーター構築体を生じさせ； 該組換えレポーター構築体を宿主細胞の集団にトランスフェクトし； 宿主細胞の試料におけるレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし； 宿主細胞をスクリーニングすべきテスト化合物と接触させ； テスト化合物との接触の後に宿主細胞の試料におけるレポーター遺伝子発現の
    レベルをアッセイし；次いで、 テスト化合物への暴露によって引き起こされたレポーター遺伝子発現のレベル
    の相対的変化を比較し、それにより、ＡＢＣ１発現変調活性を決定する； 工程を含むことを特徴とするＡＢＣ１発現変調活性につきテスト化合物をスクリ
    ーニングする方法。
35. 【請求項３５】 ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分が５’フランキング領域で
    ある請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 該５’フランキング領域が配列番号：３を含む請求項３５
    に記載の方法。
37. 【請求項３７】 該５’フランキング領域が配列番号：３のヌクレオチド１
    −１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、
    １３９４−１６４３、または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドを含む
    請求項３５に記載の方法。
38. 【請求項３８】 レポーターｃＤＮＡがルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
    ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白
    質ｃＤＮＡよりなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
39. 【請求項３９】 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項３４に記載の方法。
40. 【請求項４０】 組換えレポーター構築体がｐＡＰＲ１である請求項３８に
    記載の方法。
41. 【請求項４１】 少なくとも１つのアッセイに十分な量の哺乳動物ＡＢＣ１
    遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーターｃＤＮＡを含む組換えレ
    ポーター構築体および使用するための指示書を含む化合物のＡＢＣ１発現変調活
    性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキット。
42. 【請求項４２】 哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分が請求項１に記載
    のポリヌクレオチドを含む請求項４１に記載のキット。
43. 【請求項４３】 哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分が請求項２に記載
    のポリヌクレオチドを含む請求項４１に記載のキット。
44. 【請求項４４】 レポーターｃＤＮＡがルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
    ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質
    ｃＤＮＡよりなる群から選択される請求項４１に記載のキット。
45. 【請求項４５】 レポーターｃＤＮＡがルシフェラーゼｃＤＮＡである請求
    項４２に記載のキット。
46. 【請求項４６】 レポーターｃＤＮＡがルシフェラーゼｃＤＮＡである請求
    項４３に記載のキット。
47. 【請求項４７】 組換えレポーター構築体がｐＡＰＲ１である請求項４５に
    記載のキット。
48. 【請求項４８】 さらに、レポーター遺伝子を検出するための手段を含む請
    求項４１に記載のキット。
49. 【請求項４９】 ａ．遺伝した異常性を持つ第１の個体から第１のＲＮＡ試
    料を得； ｂ．正常な第２の個体から第２のＲＮＡ試料を得； ｃ．該第１のＲＮＡ試料からｍＲＮＡを調製して、第１のｍＲＮＡ試料を与え
    ； ｄ．該第２のＲＮＡ試料からｍＲＮＡを調製して第２のｍＲＮＡ試料を与え； ｅ．該第１のｍＲＮＡ試料を逆転写することによって標識された第１のｃＤＮ
    Ａ試料を調製し； ｆ．該標識された第１のｃＤＮＡ試料から遺伝子発現アレイを調子し； ｇ．該第２のｍＲＮＡ試料を逆転写することによって標識された第２のｃＤＮ
    Ａ試料を調製し； ｈ．該標識された第２のｃＤＮＡ試料から遺伝子発現アレイを調製し；次いで
    、 ｉ．該標識された第１のｃＤＮＡ試料の第１の遺伝子発現アレイをプローブし
    、かつ該標識された第２のｃＤＮＡ試料の第２の遺伝子発現アレイをプローブし
    、次いで、第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび第２のｃＤＮＡ試料に対
    応するＲＮＡの間の遺伝子発現の変動を同定する； 工程を含むことを特徴とする遺伝した異常性の原因である遺伝子を同定する方法
    。
50. 【請求項５０】 該第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび該第２のｃ
    ＤＮＡ試料に対応するＲＮＡの間の差を分析して、第２のＲＮＡと比較して過剰
    発現される第１のＲＮＡ、第２のＲＮＡと比較して過小発現される第１のＲＮＡ
    、第２のＲＮＡと比較して存在しない第１のＲＮＡ、および第２のＲＮＡと比較
    して存在する第１のＲＮＡよりなる群から選択される特性を同定する請求項４９
    に記載の方法。
51. 【請求項５１】 該異常性がネガティブな異常性である請求項４９に記載の
    方法。
52. 【請求項５２】 該個体が哺乳動物である請求項４９に記載の方法。
53. 【請求項５３】 該哺乳動物がヒトである請求項５２に記載の方法。
54. 【請求項５４】 該第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび該第２のｃ
    ＤＮＡ試料に対応するＲＮＡの間の少なくとも１つの変動を評価して、それが異
    常性に寄与するかを決定する請求項４９に記載の方法。
55. 【請求項５５】 第１の個体と同一の異常性を有する第３の個体から第３の
    ＲＮＡ試料を得、工程（ａ）−（ｇ）の方法を反復して、第１のＲＮＡ試料に代
    えて第３のＲＮＡ試料で置き換え、第１および第２と第２および第３の間の差を
    比較し、次いで、異常個体に共通する遺伝子発現の差を同定する請求項４９に記
    載の方法。