JP2005112859A - Ａｔｐ結合カセット輸送体蛋白質ａｂｃ１を用いるコレステロール流出を増加させｈｄｌを上昇させるための組成物および方法 - Google Patents

Ａｔｐ結合カセット輸送体蛋白質ａｂｃ１を用いるコレステロール流出を増加させｈｄｌを上昇させるための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＡＴＰ結合カセット輸送体ＡＢＣ１を用いるコレステロール流出を増加させＨＤＬを上昇させるための組成物の提供。
【解決手段】新規なＡＢＣ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子について、組換えベクター、宿主細胞、およびＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにＡＢＣ１ポリペプチドを生産する方法、ＡＢＣ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体、コレステロール流出を増加させる方法ならびにＡＢＣ１の発現および活性を増加させる方法、ＡＢＣ１の発現を変調する化合物を同定する方法ならびに哺乳動物対象においてＡＢＣ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの比較レベルを検出する方法、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットおよび組成物、ならびに化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを判断するのに適したキットおよび組成物。
【選択図】なし

Description

本出願は、１９９９年６月１８日に出願された米国仮出願番号６０／１４０、２６４；１９９９年９月１４日に出願された米国仮出願番号６０／１５３、８７２；および１９９９年１１月１９日に出願された米国仮出願番号６０／１６６、５７３に対する優先権を主張する。
（発明の技術分野）
本発明は、新規ＡＢＣ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子に関する。また、本発明は組換えベクター、宿主細胞、およびＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにＡＢＣ１ポリペプチドを生産する方法に関する。また、本発明はＡＢＣ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、コレステロール流出を増加させる方法ならびにＡＢＣ１発現および活性を増加させる方法に関する。本発明は、さらに、ＡＢＣ１の発現を変調する化合物を同定する方法および哺乳動物対象においてＡＢＣ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの比較レベルを検出する方法に関する。また、本発明は、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットおよび組成物、ならびに化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを判断するのに適したキットおよび組成物を提供する。
ヒトの血漿またはリンパ液中の循環脂質はコレステロール、コレステリルエステル、トリグリセリドおよびリン脂質よりなる。これらの脂質はリポ蛋白質と呼ばれる大きな分子複合体中で輸送され、これはコレステリルエステルおよび／またはトリグリセリドのコア、リン脂質および遊離コレステロールのエンベロープ、アポリポ蛋白質よりなる（Ｓｃｒｉｖｅｒら．，編集．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第７版，ｐ．１８４１−１８５１（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５））。アポリポ蛋白質は、リポ蛋白質の組み立ておよび分泌、ならびにレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のごときリポ蛋白質修飾酵素の活性化に関与する。加えて、アポリポ蛋白質は構造的一体性を提供し、それは大きなスペクトルの受容体に対するリガンドおよび膜ドッキング蛋白質である。血漿リポ蛋白質はサイズに従って５つのタイプに分けられる：キロミクロン（サイズが最大であって密度は最低）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）。
キロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬは外因性および内因性コレステロールおよびトリアシルグリセロールを末梢部位に輸送し、そこで、脂質は種々の代謝経路で役割を果たし、細胞膜の主要な構成要素として働く。キロミクロンは、ダイエットコレステロールおよびトリアシルグリセロールを種々の組織に輸送する手段として腸粘膜で組み立てられる。ＶＬＤＬは肝臓で形成されて、肝臓によって合成された内因性コレステロールおよびトリアシルグリセロールを筋肉および志望組織のごとき肝臓外組織に輸送する。ＶＬＤＬは１０−１５％の合成血清コレステロールおよび殆どのトリグリセリロを含有する。循環においては、ＶＬＤＬはリポ蛋白質リパーゼの作用を介してＬＤＬに変換される。ＬＤＬはすべての組織への送達のためのコレステロールの主要な血漿キャリアであり、典型的には、６０−７０％の合計絶食血清コレステロールを含有する。
対照的に、ＨＤＬは「逆コレステロール輸送」、過剰のコレステロールが末梢部位から肝臓に輸送されて戻され、そこでそれが胆汁塩の形態で分泌される経路に関与する（Ｇｌｏｍｓｅｔ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，９，１５５−１６７（１９６８））。生じたばかりのＨＤＬは、コレステロールおよびコレステロールエステルを欠いた蛋白質が豊富なディスク−形状粒子として肝臓および小腸出ｄｅ ｎｏｖｏにて合成される。事実、ＨＤＬの主要な機能はアポリポ蛋白質、主としてアポＣ−Ｉ、アポＣ−ＩＩおよびアポＥの循環貯蔵として作用する。生じたばかりのまたは蛋白質が豊富なＨＤＬは、細胞源から得られたコレステリルエステルの蓄積を通じて球状リポ蛋白質粒子に変換される。ＨＤＬは、通常、２０−３０％の合計絶食血清コレステロールを含有する。
現在の理論によると、細胞コレステロールのＨＤＬへの逆流出は２つのメカニズムによって媒介される：水性拡散経路およびアポリポ蛋白質媒介経路を通じて媒介される。これらの区別できるメカニズムの相対的重要性は細胞型および代謝状態に依存する（Ｏｒａｍら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７：２７４３−２４９１（１９９６）；Ｒｏｔｈｂｌａｔら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４０：７８１−７９６（１９９９）；Ｓｔｅｉｎら．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４４：２８５−３０１（１９９９））。多くの細胞では、水性拡散経路は、それを通ってコレステロール流出が起こる主要な経路である（Ｊｈｏｎｓｏｎら，Ｄｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０８５：２９３−２９８（１９９１））。この経路は、受動輸送のプロセスを通じる細胞外スペースにおいて、細胞膜およびリポ蛋白質受容体の間のコレステロールの二方向性交換を含む（Ｒｅｍａｌｅｙ ら．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１７：１８１３−１８２１（１９９７）；Ｒｏｔｈｂｌａｔら．，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．，４０：７８１−７９６（１９９９）。該交換は小胞として知られた表面マイクロドメインとして主として起こり得る。（Ｆｉｅｌｄｉｎｇら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１４２９２ ９１９９５））。ＬＣＡＴの作用による細胞外区画におけるコレステロールのコレステリエステルの変換によって正味の流出は駆動できる。
あるいは、マクロファージおよび繊維芽細胞において、コレステロールおよびリン脂質流出は、主として、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩおよびアポＥのごときアポリポ蛋白質を通じて媒介される（Ｒｅｍａｌｅｙ，ｓｕｐｒａ（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓ，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７８−８７（１９９５）；Ｖｅｇａら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２２６：５−１５（１９８９）；Ｓａｋａｒら．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３８：８５−９８（１９９９）；Ｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３０８０−３０８６（１９９１）；Ｆｉｌｅｄｉｎｇら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３８，１５０３−１５２１（１９９７）；Ｏｒａｍら．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７，２７４３−２４９１（１９９６））。アポリポ蛋白質−媒介脂質流出のプロセスは、それがコレステロールが負荷されたおよび／または成長が阻止された場合にマクロファージおよび他のスカベンジャー細胞において特に支配的である。アポリポ蛋白質−媒介流出は、アポリポ蛋白質と細胞表面との直接的相互作用、アポリポ蛋白質の脂質化、および細胞からの脂質−アポリポ蛋白質粒子の引き続いての解離を必要とする活性な輸送プロセスである（Ｏｒａｍ，ｓｕｐｒａ（１９９６）；Ｍｅｎｄｅｚ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３８，１８０７−１８２１（１９９７）；Ｒｅｍａｌｅｙ，ｓｕｐｒａ（１９９８）；Ｍｅｎｄｅｚ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７，２５１０−２５２４（１９９６））。一旦細胞から除去されると、コレステロールがリッチはＨＤＬ粒子が肝臓に輸送され、記載されたごとく身体から除去される。
遺伝的欠陥に由来するまたはもう１つの障害の二次的効果としての異常リポ蛋白質機能および／または代謝は深刻な生物学的結果を有しかねない。ダイエット影響に加えて、糖尿病、甲状腺機能低下および肝臓病のごとき障害の結果、上昇した血漿レベルのＬＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリロが得られる。上昇したレベルのＬＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリドは、米国および他の産業化国家において死亡の主な原因である冠心臓病の発生率と関連する主要な危険因子として同定されてきた（Ｈｏｋａｎｓｏｎら．，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｉｓｋ．，３：２１３−２１９（１９９６）；Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ，ＪＡＭＡ，２６９：３０１５−３０２３（１９９３））。動脈壁への過剰ＬＤＬ−コレステロールの蓄積はアテローム性動脈硬化症プラークの形成に至りかねず、これは心臓病の発生で主な役割を果たす。プラークは、動脈壁から放出されたフリーラジカルがＬＤＬを酸化する場合に形成されると信じられている。理論によると、ＬＤＬの酸化された形態は炎症反応をトリガーし、循環する細胞を、脂質プラークの形成に寄与する部位に引き寄せる。これらの中には、マクロファージおよびコレステロールを調節されない様式で蓄積するスカベンジャー受容体を含有する他の細胞がある（Ｂｒｏｗｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｎ．，５２：２２３−２６１（１９８６））。内部コレステロールの膨大な貯蔵の結果、フォーム細胞表現型への変換が起こり、これは血管病巣の発生に対する主要は寄与者であると考えられる。プラークが形成されるに従い、動脈壁は収縮し、心臓への血流を低下させる。
しかしながら、興味深いことには、推定６０％の心臓発作が、上昇した血中レベルのＬＤＬ−コレステロールを有しない人で起こる。これらの内、推定４５％が平均血中レベル未満のＨＤＬ−コレステロールに関連しており、これは、低ＨＤＬ−コレステロールレベルが冠心臓病についての有意は危険因子であることを示す。事実、最近の研究は、低下したＨＤＬ−コレステロールレベルが、未成熟冠動脈病を持つ患者で観察された最も普通のリポ蛋白質異常性であることを示している（Ｇｅｎｅｓｔ Ｊ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：２０２５−２０３３（１９９２）；Ｇｅｎｅｓｔら．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．，１３：１７２８−１７３７（１９９３））。ＨＤＬ−コレステロールおよび冠心臓病の間の逆関連についての基礎はよく理解されていないが、ＨＤＬの心臓保護役割は、アテローム性動脈硬化病病巣におけるマクロファージフォーム細胞からのコレステロール流出の促進に関連するその活性に由来し得ることを示唆した。
低ＨＤＬと関連する心血管病の１つの例はタンジール病（ＴＤ）であり、これは、循環ＨＤＬの殆どまたは完全な不存在によって特徴付けられるまれな遺伝障害である。ほとんどゼロの血漿レベルのＨＤＬに加え、ＴＤを持つ患者は扁桃、リンパ節、肝臓、脾臓、胸腺、腸および手腕細胞を含めたいくつかの組織においてコレステリルエステルの大量の沈積および蓄積を有する（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４３−２２８−２３６（１９６４）；Ａｓｓｍａｎｎら．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５））。細胞メカニズムは従前に同定されていないが、最近の実験は、ＴＤを持つ対象からの細胞が、コレステロールおよびリン脂質のアポリポ蛋白質−媒介除去のプロセスで欠けていることを示した（Ｒｅｍａｌｅｙら．，Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ，１７，１８１３−１８２１（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，７８−８７（１９９５）；Ｒｏｇｌｅｒら．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１５，６８３−６９０（１９９５））。これらの結果は、ＴＤ患者におけるひどいＨＤＬ欠乏が生じたばかりのアポＡ−Ｉが脂質を獲得できないことに由来する。彼らは脂質リッチな粒子に成熟しないので、ＴＤ患者における生じたばかりのＨＤＬは迅速に異化され、血漿から除去され、殆どゼロレベルの循環ＨＤＬが得られる（Ｒｅｍａｌｅｙ ｓｕｐｒａ（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓ，ｓｕｐｒａ（１９９５）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１７４３−１７５２（１９９３）；Ｓｃｈａｅｆｅｒら．，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．，２２：２１７−２２８（１９８１））。
減少したＨＤＬ−コレステロールレベルに由来する冠心臓病に対する未成熟アテローム性動脈硬化症および高い危険に関連する他の障害は低アルファリポ蛋白質血症および家族性ＨＤＬ不足症候群（ＦＨＡ）である。これらの障害を持つ人々は、しばしば、正常なＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドレベルを有する。加えて、糖尿病、アルコール依存症、甲状腺機能低下症、肝臓病および上昇した血圧のごとき障害の結果、減少したＨＤＬ−コレステロールの血症レベルがもたらされるが、これらの障害の多くは上昇したＬＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリドレベルが伴う。
冠心臓病についての現在の治療は、主として、ＬＤＬ分泌または促進ＬＤＬターンオーバーを阻害することによってＬＤＬ−コレステロールの血症レベルを低下させる目的でダイエット操作および／または薬物治療剤に焦点を合わせてきた。クロフィブレート、ゲムフィルロジルおよびフェノフィブレートのごときフィブリン酸の誘導体はリポ蛋白質リパーゼを活性化することによって迅速なＶＬＤＬターンオーバーを促進する。ニコチン酸は、肝臓ＶＬＤＬ分泌を阻害することによってＶＬＤＬおよびＬＤＬの血症レベルを低下させる。加えて、メブィノリン、メバスタチン、プラブァスタチン、シムブァスタチン、フルブァチンおよびロバスタチンのごときＨＭＧ−ＣｏａＡレダクターゼ阻害剤は、ＬＤＬの細胞摂取の増加を引き起こすコレステロールの細胞内構成を阻害することによって血漿ＬＤＬレベルを低下させる。加えて、コレスチリン、コレスチポールおよびプロブコールのごとき胆汁酸−結合樹脂は、肝臓中のＬＤＬ−コレステロールの異化を増加させることによってＬＤＬ−コレステロールのレベルを減少させる。
しかしながら、これらの療法の多くは長期使用を妨げかねない低い効率および／または副作用を伴う。例えば、ＨＭＧ−ＣｏａＡレダクターゼ阻害剤は毒性のかなりの危険性を担う。なぜならば、それらは、コレステロールに加えて他の重要なイソプレノイド化合物の合成に必要なメバロネートの合成を阻害するからである。また、ゲムフィブロジルおよびニコチン酸は、腎臓損傷、筋肉障害、筋肉グロビィン血症および許容されない皮膚の潮紅および掻痒を含めたひどい有害効果を伴う。加えて、冠心臓病を持つ患者を治療するにおけるプロブコールの役割は確かではない。なぜならば、その投与の結果、ＬＤＬ−コレステロールを低下させる副作用としてより低いＨＤＬ−コレステロールレベルがもたらされるからである。
さらに、単離された低いＨＬＤＬ−コレステロールレベルを有する患者の治療は特に困難な治療挑戦を提供する。例えば、タンジール病を持つ患者は、たとえそのＬＤＬレベルばすでに約５０％だけ低下したにもかかわらず心血管病の４ないし６倍増加を呈する。ゲムフィブロジルおよびニコチン酸が同時にＬＤＬレベルを上昇させるという幾つかの証拠があるが、一般に血漿ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させることを狙った療法は、減少したＨＤＬレベルの結果として冠心臓病に悩むタンジール患者で効果的ではない。同様に、低いアルファリポ蛋白質血症、家族性ＨＤＬ欠乏症候群、または低いレベルのＨＤＬに由来する他の心血管病は、血漿ＬＤＬのレベルを低下させることを狙った療法から利益は受けない。
心血管病のための現在の療法に伴う問題は、部分的には、細胞内および細胞外でのコレステロールの移動に関与する生物学は十分には理解されていないという事実に由来する。さらに、コレステロール移動において役割を演じる蛋白質は十分には知られていない。従って、コレステロール細胞生物学、ならびに心血管病および高コレステロール血症を伴う他の障害に悩むヒトを治療する方法に対する要求が依然としてある。加えて、心血管病を診断する新しい方法および心血管病を発生する高い危険性があるものを同定するための患者をスクリーニングする新しい方法に対する要望が依然としてある。
コレステロール輸送に関与する遺伝子および蛋白質の同定は、心臓病および高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症に関連する他の障害の治療用医薬剤の開発で有用であろう。加えて、そのような遺伝子の同定は、コレステロール輸送に関連する遺伝子の発現を調節する化合物につきスクリーニングするスクリーニングアッセイの開発で有用であろう。そのような調節化合物の同定はさらなる治療剤の開発で有用であろう。さらに、コレステロール輸送に関与する遺伝子および蛋白質の同定は、心血管病および高コレステロール血症を伴う他の障害の診断インジケートとして有用であろう。
本発明は、コレステロール流出に関与する新規なポリペプチドおよびポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、新規なＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ１）ポリペプチドおよびＡＢＣ１ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドを提供する。用語「ＡＢＣ１」および「ＡＢＣＡ１」は、同一ＡＴＰ−結合カセット蛋白質および遺伝子に対する別の名称である。本発明はＡＢＣ１ポリペプチド、ポリペプチド断片およびポリペプチド変種を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：２を含む単離されたポリペプチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。また、本発明はタンジール病患者からのＡＢＣ１ポリペプチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：８を含む単離されたポリペプチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：１０を含む単離されたポリペプチドを提供する。
加えて、本発明はＡＢＣ１ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片およびポリヌクレオチド変種を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２を含むポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：１を含む単離されたＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供する。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：１と少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他のより好ましい実施形態において、該ポリヌクレオチドを配列番号：１に対して少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また、他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、および配列番号：１と少なくとも９０％同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに相補的な単離されたポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、ＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域に対応するＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：３を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２を含む。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、他の好ましい実施形態において、本発明は、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１０４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態において、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有する単離されたポリヌクレオチドが提供される。より好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性を有する。さらにより好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％同一性を有する。また、好ましい実施形態において、ヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有する単離されたポリヌクレオチドが提供される。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１９３４−１５３２を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性、なおより好ましくは９５％同一性を有する。加えて、本発明は、前記した５’フランキングＡＢＣ１ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３を含むポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明はＡＢＣ１遺伝子の３’フランキング領域に対応するＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含む単離されたポリヌクレオチド、およびその相補的配列を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６を含むポリヌクレオチドに厳密条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド、およびその相補的配列を提供する。さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：４、配列番号；５または配列番号：６を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、ポリヌクレオチドを、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性を有する。なおより好ましくは、ポリヌクレオチドは配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％同一性を有する。
加えて、本発明はタンジール病患者からのＡＢＣ１ポリヌクレオチドを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：８を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する、もう１つの好ましい実施形態において、本発明は配列番号：７を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらにもう１つの実施形態において、本発明は配列番号：１０を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらにもう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：９を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、記載されたポリヌクレオチドに対する相補性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
もう１つの態様において、本発明は、前記したポリヌクレオチドのいずれかおよび適当な担体を含む組成物を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、および適当な担体を含む組成物を提供する。もう１つの好ましい実施形態において、組成物は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。他の好ましい実施形態において、組成物は、配列番号：３を含む単離されたポリヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。さらに他の好ましい実施形態において、本発明は配列番号：３のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドを含む組成物、ならびに配列番号：３を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチド、および適当な担体を含む組成物を提供する。また、本発明によって提供されるのは、前記したポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む組成物である。
加えて、本発明は前記したＡＢＣ１ポリヌクレオチド配列のいずれかを含む組換えベクターおよび宿主細胞を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２を含むポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１を含む単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含む単離されたポリヌクレオチド、または配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一性、より好ましくは９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：７または配列番号：９を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明は、さらに、前記したポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、前記したポリヌクレオチドのいずれかを含み、さらに、異種プロモーターポリヌクレオチドを含む。１つの適当な異種プロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。特に好ましい実施形態において、組換えベクターはｐＣＥＰｈＡＢＣ１である。
また、本発明は、ＡＢＣ１の５’フランキング配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３を含む単離されたポリヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。さらに、他の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１５３２を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクター、ならびにこれらのポリヌクレオチドにたいして少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、前記したポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは記載されたポリヌクレオチドのいずれかを含み、さらに、異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。適当な異種ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白質を含む。好ましくは異種ポリペプチドはルシフェラーゼ蛋白質である。特に好ましい実施形態において、組換えベクターはｐＡＰＲ１である。
加えて、本発明は前記した組換えベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本発明は、さらに、前記した組換えベクターおよび適当な担体を含む組成物を提供する。
また、本発明は哺乳動物宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を生産する方法ならびに哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現する方法を提供する。哺乳動物宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を生産する方法は、（ａ）検出可能なレベルのＡＢＣ１蛋白質を生産するのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、（ｂ）生成したＡＢＣ１蛋白質を精製する工程を含む。哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現する方法は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現するのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを哺乳動物対象に投与する工程を含む。
加えて、本発明は、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した組成物および方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては、該方法は、細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを哺乳動物対象に投与することを含む。適当は組換え発現ベクターは、配列番号：２を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１を含む単離されたポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含む単離されたポリヌクレオチド、および配列番号：２に対して少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。好ましい発現ベクターは、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを含む。他の実施形態において、本発明は、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ4沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソームおよびリポフェクションを含めた非−ウイルス送達システムを提供する。
もう１つの好ましい実施形態において、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させる方法は、細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させる治療量の化合物を哺乳動物対象に投与することを含む。１つの適当な方法は、ｃＡＭＰアナログを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なｃＡＭＰアナログは８−ブロモｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰ、および８−チオメチルｃＡＭＰを含む。もう１つの適当な方法は、ｃＡＭＰの合成を増加させる化合物、例えば、フォルスコリンを哺乳動物対象に投与することを含む。さらにもう１つの適当な方法は、ホスホジエステラーゼ阻害剤のごときｃＡＭＰの分解を阻害する化合物を哺乳動物対象に投与することを含む。適当なホスホジエステラーゼ阻害剤はロリプラム、テオフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Ｒ０２０−１７２４、ビンポセチン、ザプリナスト、ジピリダモール、ミルリノン、アムリノン、ピモベンダン、シロスタミド、エノキシモン、ペルオキシモンおよびベスナリノンを含む。
加えて、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるもう１つの適当な方法は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量の核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なリガンドはＬＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ、ＳＸＲおよびＰＰＡＲリガンドを含む。１つの好ましい実施形態において、該方法はＬＸＲ核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール。、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、および２４（Ｓ），２５エポキシコレステロールを含む。好ましくは、ＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールである。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＲＸＲ核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なＲＸＲリガンドは９−シスレチノイン酸、レチノール、レチナール、全ての−トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、アシトレチン、フェンレチニド、エトレチネート、ＣＤ４９５、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴＡＢ、およびＬＧＤ１０６９を含む。好ましくは，ＲＸＲリガンドは９−シスレチノイン酸である。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＰＰＡＲ核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。１つの適当なリガンドはチアゾリジンジオンのクラスから選択されるリガンドである。さらにもう１つの好ましい実施形態において、該方法は、核受容体に対する少なくとも２つのリガンドを投与することを含む。特に好ましい実施形態において、リガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールおよび９−シスレチノイン酸である。
加えて、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるもう１つの適当な方法は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量のエイコサノイドを哺乳動物対象に投与することを含む。適当なエイコサノイドはプロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＪ２、およびプロスタサイクリン（プロスタグランジンＩ２）を含む。
もう１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量のＡＢＣ１活性を増加させる化合物を哺乳動物対象に投与することを特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加させる方法を提供する。
また、本発明は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるのに適した方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるのに十分な量の核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対照に投与することを含む。適当なリガンドはＬＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ、ＳＸＲおよびＤＰＡＲ核受容体に対するリガンドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるのに十分な量のｃＡＭＰアナログを哺乳動物対象に投与することを含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるのに十分な量のｃＡＭＰの合成を増加させる化合物を哺乳動物対象に投与することを含む。
加えて、本発明は、（ａ）レポーターｃＤＮＡを、哺乳動物ａｂｃ１遺伝子の発現変調部分で作動可能に連結して、組換えレポーター構築体を生じさせ；（ｂ）該組換えレポーター構築体を宿主細胞の集団にトランスフェクトし；（ｃ）宿主細胞の試料中にてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；（ｄ）スクリーニングすべきテスト化合物と宿主細胞を接触させ；（ｅ）テスト化合物との接触の後に宿主細胞の試料中にてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；ついで、（ｆ）テスト化合物への暴露によって引き起こされたレポーター遺伝子発現のレベルの相対的変化を比較し、それにより、ＡＢＣ１発現変調活性を測定する工程を含むことを特徴とする、ＡＢＣ１発現変調活性につきテスト化合物をスクリーニングする方法を提供する。該組換えレポーター構築体は、本発明によって提供されるＡＢＣ１の５’フランキング領域配列のいずれかのごとき、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む。１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３を含む。もう１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３、または１３９４−１５３２を含む。適当なレポーターｃＤＮＡはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白質ｃＤＮＡを含む。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞である。該方法の特に好ましい実施形態において、組換えレポーター構築体はｐＡＰＲ１である。
また、本発明において提供されるのは、（ａ）培養中に維持された哺乳動物細胞の試料においてコレステロール流出のレベルをアッセイして、コレステロール流出の対照レベルを決定し；（ｂ）該細胞をスクリーニングすべきテスト化合物と接触させ；（ｃ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料においてコレステロール流出のレベルをアッセイし；（ｄ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料においてＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルをアッセイし、それにより、テスト化合物が培養中の細胞からのＡＢＣ１−培養コレステロール流出を促進するか否かを判断する工程を含むことを特徴とする、テスト化合物が培養中の細胞からのＡＢＣ１−培養コレステロール流出を促進するか否かを判断するためにテスト化合物をスクリーニングする方法である。該細胞は一次培養または細胞系に由来することができる。テスト化合物をスクリーニングするための適当な細胞は繊維芽細胞、マクロファージ、肝、および腸細胞系を含む。好ましくは、該細胞系はＲＡＷ２６４．７である。１つの好ましい実施形態において、結合に際してＡＢＣ１の活性を阻害する抗−ＡＢＣ１抗体を用い、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を測定する。もう１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出は、アンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドを用いて測定する。特に好ましい実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは配列番号：５７を含む。
加えて、本発明は、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１発現の比較レベルを検出する方法を提供する。かかる方法を用いて、冠心臓病に対する対象の罹患性を測定することができる。哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１発現の比較レベルを検出する方法が提供され、これは、（ａ）哺乳動物対象からの細胞試料を得、（ｂ）細胞試料においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルをアッセイし；ついで、（ｃ）細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルとＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のあらかじめ決定した標準レベルと比較し、それにより、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベルを検出することを含む。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定する適当は方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、およびＲＮＡｓｅ保護アッセイを含む。
また、本発明は、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出する方法を提供する。そのような方法を用いて、冠心臓病に対する対象の罹患性を測定することができる。哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較量を検出する方法が提供され、これは、（ａ）哺乳動物対象からの細胞試料を得、（ｂ）細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量をアッセイし、ついで、（ｃ）細胞試料におけるＡＢＣ１蛋白質の量とＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標準量とを比較し、それにより、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出することを含む。ＡＢＣ１の蛋白質の量は、当該分野で利用できる種々のイムノアッセイを用いて測定することができる。例えば、ＡＢＣ１蛋白質の量は、（ａ）細胞試料を抗−ＡＢＣ１抗体の集団と接触させ、ついで、（ｂ）試料と会合した特異的−結合性ＡＢＣ１抗体を検出することによって測定することができる。ＡＢＣ１抗体を検出する適当な方法はウエスタンブロッティング、免疫沈殿およびＦＡＣＳを含む。
もう１つの態様において、本発明は、記載されたＡＢＣ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に対する少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。該抗体はモノクローナル抗体とすることができるか、あるいは該抗体はポリクローナル抗体とすることができる。さらにもう１つの実施形態において、該抗体は、ＡＢＣ１ポリペプチドへの結合に際して、ＡＢＣ１ポリペプチドのコレステロール輸送活性を阻害する。
加えて、本発明は、少なくとも１つのアッセイで十分な量の哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーターｃＤＮＡおよび使用のための指令書を含むことを特徴とする、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを提供する。１つの好ましい実施形態において、該キットは、さらに、レポーター遺伝子を検出する手段を含む。もう１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３を含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は、配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３または１３９４−１５３２を含む。適当なレポーターｃＤＮＡはルシフェラーゼ、βーガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質ｃＤＮＡを含む。好ましくはレポーターｃＤＮＡはルシフェラーゼである。該方法の特に好ましい実施形態において、組換えレポーター構築体はｐＡＰＲ１である。
また、本発明は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを判断するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを提供する。１つの好ましい実施形態において、該キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量の不活化抗−ＡＢＣ１抗体および使用のための指令書を含む。もう１つの好ましい実施形態において、該キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量のアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドおよび使用のための指令書を含む。特に好ましい実施形態において、アンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドは配列番号：５３を含む。
本発明によると、細胞からのコレステロール流出を増加させる新規なポリペプチドが提供される。特に、本発明は、コレステロール流出を増加させることが示された新規なＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣ１）ポリペプチドを提供する。
ＡＢＣ１は、細胞膜に存在し、ＡＴＰ加水分解を利用して、原形質膜を横切って広く種々の基質を輸送するＡＴＰ−結合カセット蛋白質のファミリーのメンバーである。用語「ＡＢＣ１」および（ＡＢＣＡ１）はともに同一のＡＴＰ−結合カセット蛋白質をいうことに注意すべきである。用語「ＡＢＣＡ１」は命名委員会によって１９９９年に導入され、当該分野では限定された許容を受けている。今日まで、このファミリーの３０を超えるメンバーばヒトゲノムで同定されている。これらの相同蛋白質は、それを通って、分子が細胞膜を通じて輸送されるチャネル−様構造およびＡＴＰと結合してエネルギー発生ＡＴＰ−加水分解を輸送にカップリングされる１以上のドメインを含有する。ファミリーのメンバーは多薬物抵抗性因子（ＭＤＲ／Ｐ糖蛋白質；Ｃｈｅｎら．，Ｃｅｌｌ，４７：３８１−３８９（１９８６）；Ｓｔｒｉｄｅら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４９：９６２−９７１（１９９６））、抗原提示に関連する輸送体（Ｎｅｅｆｊｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：７６９−７７１（１９９３）；Ｓｈｅｐｈｅｒｄら，Ｃｅｌｌ，７４：５７７−５８４（１９９３））、および嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１８５７２−１８５７５（１９９４）；Ｒｏｍｍｅｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０５９−１０６５（１９８９））を含む。ＡＢＣ輸送体ファミリーのメンバーは、一般に、長い荷電領域および高度に疎水性のセグメントによって連結された２つの対称半体内で見いだされる４つのドメインよりなる。各半分は、６つの膜貫通セグメントを含有する疎水性ドメインならびに多くのＡＴＰａｓｅに典型的な高度に保存されたＷａｌｋｅｒＡおよびＢ配列モチーフを含有する親水性ヌクレオチド結合ドメインを含有する（Ｈｙｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：３６２−３６５（１９９０）；Ｌｕｃｉａｎｉら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１：１５０−１５９（１９９４））。輸送体の活性はヌクレオチド結合ドメインにおけるＡＴＰとの相互作用に依存し、２つの対称半体を連結する領域における残渣のリン酸化を介する調節による（Ｂｅｃｑら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２６９５−２６９９（１９９７））。
本明細書中に記載されたいくつかの系列の証拠は、細胞内コレステロール貯蔵のアポリポ蛋白質−媒介可動化における非常に重要な蛋白質としてＡＢＣ１を同定した。まず、ここに提示された研究は、ＡＢＣ１がタンジール病、以上ＨＤＬ−コレステロール代謝によって特徴付けられる遺伝的障害において欠けていることを示した。すでに示され、本明細書中では実施例１に示したごとく、タンジール病における遺伝子欠陥は細胞内からのコレステロールのアポリポ蛋白質媒介流出の経路において欠陥を引き起こしてその結果、かなり減少したコレステロール流出活性および低いＨＤＬ−コレステロールレベルをもたらす（Ｏｒａｍら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７：２７４３−２４９１（１９９６）；Ｆｒａｎｃｉｓら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７８−８７（１９９５））。タンジール病を持つ家族の遺伝的連鎖解析は欠陥遺伝子を染色体９ｑ３１上の間隔に帰属させた（Ｒｅｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０：９６−９８（１９９８））。公のデータベースのサーチは、ＡＢＣ１遺伝子が染色体９ｑ２２−９ｑ３１に突き止められことを明らかとし、これはＲｕｓｔらで明らかにされた該間隔よりも広いがそれを含む。（Ｌｕｃｉａｎｉら，Ｓｕｐｒａ（１９９４））。そのデータに基づき、ヒトＡＢＣ１遺伝子の照射ハイブリッドマッピングを行い、これは、Ｒｕｓｔらによって報告されたヒト染色体９ｑ３１の７−ｃＭ領域内にはっきりとある２つのマーカーの間に該遺伝子を位置付けた。加えて、実施例２に示されるごとく、マイクロアレイ分析は、ＡＢＣ１遺伝子が、正常な細胞と比較してタンジール患者細胞において２．５倍過小発現されることを明らかとした。これらの研究は、タンジール病における欠陥遺伝子をＡＢＣ１として同定した。加えて、ここに示されたさらなる研究は、ＡＢＣ１活性をコレステロール流出活性に結び付けた。まず、研究は、４、４−ジイソチオシアノスチルベン−２、２’−ジスルフォン酸（ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）のごときＡＢＣ１輸送活性の阻害剤もまた繊維芽細胞からのアポＡＩ−媒介コレステロール流出を阻害することを示した（実施例６参照）。またアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１遺伝子発現の阻害が、繊維芽細胞からのアポＡＩ−媒介コレステロール流出を阻害することを示した（実施例７）。対照的に、ＡＢＣ１遺伝子がマウス単球細胞にトランスフェクトされたトランスフェクション実験は、ＡＢＣ１の過剰発現の結果、アポＡＩ−媒介流出の増加をもたらすことを示した（実施例８）。最後に、野生型およびタンジール患者ｍＲＮＡを用いて行ったＲＩ−ＰＣＲは、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現が正常な皮膚繊維芽細胞におけるコレステロール流出に関連する細胞状態によって調製されるが、タンジール患者繊維芽細胞においてはそうではないことを明らかにした（実施例９）。これらの知見に基づき、ＡＢＣ１はコレステロール流出において主要な役割を演じると判断された。
ＡＢＣ１は、原形質膜の外側リーフレットへの細胞内コレステロールの移動において役割を演じる。ＡＢＣ１の欠如または欠陥ＡＢＣ１による細胞内コレステロールの不十分な輸送の結果、それとアポＡＩおよび他のアポリポ蛋白質が特異的に相互作用する特異的膜ドメインにおけるコレステロールの欠如をもたらす（Ｓｔａｎｇｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３１００２−３１００８（１９９８）；Ｂａｂｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３２４２−１３２４９（１９９７））。コレステロールのアポＡＩへの送達の失敗は、血症から迅速に除去されるコレステロール−欠陥ＨＤＬ粒子の形成に導く（Ｂｏｊａｎｏｖｓｋｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：１７４２−１７４７（１９８７））。
（定義）
以下の定義は、本明細書を通じて用いるある用語の理解を容易にするために掲げる。
本発明においては、「単離された」とは、その元の環境（例えば、もしそれが天然に生じるのであれば天然の環境）かた取り出された物質をいい、かくして、その天然状態から「人の手によって」改変される。例えば、単離されたポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の１部となることができるか、あるいは細胞内に含有することができ、依然として「単離されている」。なぜならば、ベクター、組成物または特定の細胞はポリヌクレオチドの元の環境ではないからである。
本明細書で用いるごとく、「ポリヌクレオチド」は、合成および天然の双方の起源のＤＮＡおよびＲＮＡを含むように定義される。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロヂュプレックスとして存在することができる。かくして、本発明のポリヌクレオチドはいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドよりなることができ、これは未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡで有り得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域、または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖または三本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物で有り得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子より成り得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡ双方を含む三本鎖領域よりなることができる。また、ポリヌクレオチドは１以上の修飾された塩基または安定性または他の理由で修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含有することもできる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのごとき異常塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して成すことができ；かくして、「ポリヌクレオチド」はポリヌクレオチドの化学的に酵素的にまたは代謝的に修飾された形態を含む。用語「ポリヌクレオチド」はしばしばオリゴヌクレオチドといわれる短いポリヌクレオチドも含む。
用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって相互に連結した２以上のアミノ酸を含むいずれのペプチドまたは蛋白質もいう。「ポリペプチド」とは、通常はペプチドと言われる短いアミノ酸配列、ならびに一般に蛋白質といわれるより長いアミノ酸配列をともにいう。ポリペプチドは２０の遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。さらに、ポリペプチドは、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然のプロセスによって、または当該分野でよく知られた化学的修飾技術によって修飾することができる。与えられたポリペプチドは多くのタイプの修飾を含有することができる。また、同一タイプの修飾が、ポリペプチドにおける１以上の部位において同一または種々の程度存在することができる。修飾は、ペプチドの骨格、アミノ酸の側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めたポリペプチドのどこかで起こることができる。修飾は、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、セレノイル化、ならびにヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトールの共有結合を含む。他の修飾は架橋、環化、ピログルタメートの形成、ＧＰＩアンカー形成、蛋白質分解プロセッシングラセミ化、およびアルギニル化およびユビキチン化のごときアミノ酸のｔ−ＲＮＡ−媒介負荷を含む。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第二版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｗｏｒｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｉｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂ，Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６（１９９０）；および Ｒａｔｔａｎら．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｓｎｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８−６２（１９９２））参照。本発明のポリペプチドはいずれかの適当な方法で調製することができる。かかるポリペプチドは単離された天然に生じるポリペプチド、組換えにより生産されたポリペプチド、合成により生産されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せによって生産されたポリペプチドを含む。かかるポリペプチドを生産する手段は当該分野でよく知られている。
本発明の「ポリヌクレオチド」は、配列番号：３または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３または１３９４−１５３２、あるいはその相補体に対して厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補体に対して厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含む。
「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、５０％フォルミアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルトの溶液、１０％デキストラン硫酸塩、および２０μｇ／ｍｌの変成した剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション、続いての約６５℃における０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄をいう。
本明細書中で用いるごとく用語「相補性」とは、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つのストランドの間、またはオリゴヌクレオチドプライマーおよび増幅もしくは配列決定されるべき一本鎖ポリヌクレオチド上のプライマー結合部位の間のごときヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合をいう。２つの一本鎖ヌクレオチド分子は、１つのストランドのヌクレオチドが、他のストランドのヌクレオチドの少なくとも約８０％にて適当なヌクレオチド挿入、欠失または置換、対をもって最適に整列する場合に相補性であるといわれる。
当該分野で知られている「同一性」は、配列を比較することによって決定して、２以上のポリヌクレオチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。また、「同一性」または「同様性」は、そのような配列のストリングの間のマッチによって決定して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度をいう当該分野で認められた意味を有する。「同一性」および「同様性」は、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｇｇｉｎ，Ａ．Ｍ．，および Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．および Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編集，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）；および Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，および Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））に公表されて入るものを含めた多数のよく知られた方法を用いて計算することができる。２つの配列の間の同一性または同様性を判断するのに通常使用された方法は、限定されるのものではないが、“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，” Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９９４），および Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，および Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３’１９８８）に開示されたものを含む。同一性を決定する好ましい方法は、テストされる配列の間で最大のマッチを与えるように設計される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列させるための方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４） １２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＩＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）．Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ５３７１１（Ｓｍｉｔｈ および Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用）を含めたコンピュータープログラムに編集されている。
特定の配列が、例えば、参照配列に対して９０％同一であるか否かを判断するのに配列整列プログラムのいずれかを用いると、パラメーターは、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全長にわたって計算され、参照ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの合計数の１０％までの同一性におけるギャップが許容されるように設定される。
グローバル配列整列ともいわれる、クエリー配列（本発明の配列）および対象配列の間の最良の総じてのマッチを決定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。用語「配列」はヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。配列整列において、クエリーおよび対象配列はともにヌクレオチド配列であるか、あるいはともにアミノ酸配列である。該グローバル配列整列の結果はパーセンと同一性で表す。パーセント同一性を計算するＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢサーチで用いる好ましいパラメーターは：マトリックス＝ウニタリー、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティー＝１、接合ペナルティー＝３０、ランダム化基長さ＝０、およびカットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、およびウインドウサイズ＝５００またはどれだけ短かかろうがヌクレオチド塩基におけるクエリー配列の長さである。アミノ酸整列のパーセント同一性および同様性を計算するのに使用される好ましいパラメーターは：マトリックス＝ＰＡＭ １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティー＝１、接合ペナルティー＝２０、ランダム化基長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー＝０．０５、およびウインドウサイズ＝５００またはどれだけ短かろうがアミノ酸残基におけるクエリー配列の長さである。
説明として、配列番号：１に含有される配列に対して少なくとも９０％「同一性」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が配列番号：１の合計長さの各１００ヌクレオチド当たり１０までの点突然変異を含み得る以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：１に含まれる配列と同一であることを意味する。換言すれば、配列番号：１に対して少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含みポリヌクレオチドを得るためには、配列番号：１に含まれる配列においてヌクレオチドの１０％までを欠失し、挿入しまたは他のヌクレオチドで置き換えることができる。これらの変化はポリヌクレオチド全体のどこかで起こることができ、ヌクレオチド内または配列番号：１内の１以上の連続群で個々に分散し得る。
同様に、配列番号：２に含まれる配列に対して少なくとも９８％「同一性」のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が配列番号：２の合計長さの各１００アミノ酸当たり２までのアミノ酸改変を含むことができる以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２に含まれる配列と同一であることを意味する。換言すれば、配列番号：２と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、配列番号：２に含まれる配列中のアミノ酸残基の２％までを欠失し、挿入し、または他のアミノ酸残基で置き換えることができる。これらの変化はポリペプチド全体のどこかで起こることができ、残基間または配列番号：２内の１以上の連続群で個々に分散することができる。
「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、用量依存性をもってまたはそれなくして、特定の生物学的アッセイにおいて測定して、本発明のポリペプチドの活性と同様であるが必ずしも同一ではない活性（例えば、コレステロール輸送活性）を呈するポリペプチドをいう、用量依存性が存在する場合には、それは、ポリペプチドのそれと同一である必要はないが、むしろ、本発明のポリペプチドと比較して与えられた活性における用量−依存性に実質的に同様である（例えば、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対してより大きな活性または約２５倍以下小さい、好ましくは、約１０倍以内小さな活性、最も好ましくは約３倍以下小さい活性を呈するであろう）。
「ポリペプチド変種」とは、本発明のＡＢＣ１ポリペプチドと異なるが、その本質的な特性を保有するポリペプチドをいう。一般に、変種は総じて密接に似ており、多くの領域に置いて、配列番号：２を含むポリペプチドと同一である。好ましくは、ポリペプチド変種は生物学的活性、すなわち、コレステロール輸送活性を保持する。変種は、限定されるのものではないが、スプライス変種および対立遺伝子変種並びに付加、欠失および置換変種を含む。
同様に、「ポリヌクレオチド変種」とは、本発明のポリヌクレオチドとは異なるがその本質的特性を保有するポリヌクレオチドをいう。該変種はコーディング領域、非コーディング領域、または双方において改変を含むことができる。かくして、例えば、ＡＢＣ１ポリヌクレオチド変種は、配列番号：１のそれと異なるが、コレステロール輸送活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。また、例えば、ポリヌクレオチド変種は、配列番号：３のそれと異なるが、プロモーター活性を保有するヌクレオチド配列を有する。特に好ましいものは、サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を改変しない改変を含むポリヌクレオチド変種である。遺伝暗号の縮重のためサイレント置換によって生じたヌクレオチド変種が好ましい。さらに、１０−２０、５−１０、１−５または１−２アミノ酸がいずれかの組合せにおいて置換され、欠失または付加された変種もまた好ましい。ポリヌクレオチド変種は、種々の理由で、例えば、特定の宿主のためのコドン発現を最適化するのに生じさせることができる（例えば、ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＥ．ｃｏｌｉのごとき細菌宿主によって好まれるものへの変化）。
「対立遺伝子変種」は、生物の染色体上の与えられた遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つをいう天然に生じる変種である（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８５））。これらの対立遺伝子変種はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルいずれかにおいて変化することができる。別法として、天然に生じない変種は突然変異誘発技術によってまたは直接的合成によって生じさせることができる。
用語「保存的アミノ酸置換」とは、その部位におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどまたは全くないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換をいう。例えば、保存的置換は、いずれかの他の非−極性残基でのポリペプチド中の非極性残基の置換に由来する。保存的置換のもう１つの例は酸性残基のもう１つの酸性残基での置換である。保存的置換は、天然に生じるＡＢＣ１ポリペプチドのそれと同様な機能的および化学的特徴を有するＡＢＣ１ポリペプチドを生じると期待させる。
用語「相同分子種」とは、異なる主から同定されたポリペプチドに対応するポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトＡＢＣ１ポリペプチドは相同分子種と考えられる。
用語「ベクター」を用いて、コーディング情報を宿主細胞に移動させるのに使用されるいずれかの分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）をいうのに用いられる。
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸配列の配列を指令しおよび／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現は、限定されるものではないが、もしイントロンが存在すれば、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシングのごときプロセスを含む。
本明細書中で用いるごとく、用語「転写調節領域」または「発現変調部分」とは、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサーおよびリプレッサーを含めた遺伝子のいずれかの領域をいう。
本明細書中で用いるごとく、用語「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を制御する（一般に、約１００ないし１０００ｂｐ内の）構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に位置する転写されない配列をいう。
本明細書中で用いるごとく、用語「エンハンサー」とは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常長さが１０−３００ｂｐであるＤＮＡのシス−作用性エレメントをいう。エンハンサーは比較的配向および位置非依存性である。それらは転写ユニットに対して５’および３’側に見いだされている。
「宿主細胞」は形質転換またはトランスフェクトされている、あるいは外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換またはトランスフェクションが可能な細胞である。該用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫がもとの親と形態または遺伝子的造りが同一であるか否かに拘わらず、親細胞の子孫を含む。
用語「作動可能に連結した」は、ここでは、かく記載されたフランキング配列がその通常の機能を行うように配置されまたは組み立てられたフランキング配列の配置をいうのに用いられる。かくして、コーディング配列に作動可能に連結したフランキング配列はコーディング配列の複製、転写および／または翻訳を行うことができる。例えば、プロモーターが当該コーディング配列の転写を指令できる場合にコーディング配列はプロモーターに作動可能に連結している。フランキング配列は、それが正しく機能する限り、コーディング配列に隣接している必要はない。かくして、例えば、介在するいまだ翻訳されていないが転写された配列はプロモーター配列およびコーディング配列の間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコーディング配列に「作動可能に連結している」と考えられることができる。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの摂取をいうのに用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されてしまっていれば細胞はトランスフェクトされてしまっている。多数のトランスフェクション技術が当該分野でよく知られており、ここに開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；および Ｃｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７参照。そのような技術を用いて１以上の外因性ＤＮＡ部位を適当な宿主細胞に導入することができる。
（ＡＢＣ１ポリペプチド）
本発明は新規なヒトＡＢＣ１ポリペプチドに関する。１つの実施形態において、ＡＢＣ１ポリペプチドは配列番号；２に示されたアミノ酸配列を含む。他の者によって報告されたヒトＡＢＣ１蛋白質とは対照的に、配列番号：２に示されたＡＢＣ１ポリペプチドはアミノ末端にさらに６０個のアミノ酸を有し、これは２２０１アミノ酸よりも２２６１アミノ酸のＡＢＣ１蛋白質を明らかにする（Ｌａｎｇｍａｎｎら，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５７．２０−３３（１９９９）参照）。加えて、配列番号：２に示されたＡＢＣ１ポリペプチドは、いくつかのアミノ酸残基において他の報告された配列とは異なる。具体的には配列番号：２に示された現在のＡＢＣ１ポリペプチドは残基１５９においてＲの代わりにＫ、７６５においてＶの代わりにＩ、８２３においてＩの代わりにＭ、１４９５においてＴの代わりにＩ、１５８８においてＰの代わりにＬ、１９１４においてＲの代わりにＫ、および２１０８においてＰの代わりにＬを有する。公表された記録と合致させたままとするには、前記アミノ酸番号は配列番号：２のものよりもむしろ（Ｌａｗｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｃｅｓｔ．，１０４：Ｒ２５−３１（１９９９）のものである。後記にてさらに詳細に考察するごとく、配列の差異は、最初のＡＢＣ１ ｃＤＮＡがＰＣＲ−ベースの戦略を用いてマウスからクローンされ、引き続いて報告されたヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列がマウス蛋白質の配列から予測したという事実に由来するようである。ＡＢＣ１蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された２４０ｋＤの近似的な分子量を有する。
また、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してその全長さにわたって少なくとも９８％同一性を好ましくは有するアミノ酸配列を含むＡＢＣ１ポリペプチドに関する。より好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列に対してその全長さにわたって少なくとも９９％同一性を有する。より好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸に対してその全長さにわたって１００％同一性を有する。すでに定義したごとく、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列の間の配列関連性の程度をいい、これは後記にてさらに定義する。
そのような関連ＡＢＣ１ポリペプチドは置換、欠失、および挿入変種ならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、断片、誘導体および相同分子種を含む。好ましいポリペプチドおよびポリペプチド断片は、ＡＢＣ１の生物学的活性を保有するポリペプチドおよび断片を含む。特に、逆コレステロール輸送を媒介するポリペプチドおよび断片が好ましい。また、好ましいのは、改良された逆コレステロール輸送活性を有するポリペプチドおよび断片である。
置換、欠失および挿入変種は、配列番号：２に記載されたＡＢＣ１アミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸配列置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を含むＡＢＣ１ポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、該変種は、１ないし５、約１ないし１０、または約１ないし２０、または約１ないし４０、または約１ないし６０アミノ酸置換、付加および／または欠失を有する。例えば、該変種は、当該変種は生物学的機能を保有する限り、ポリペプチド中のどこかに、ならびにカルボキシル末端および／またはアミノ末端に１以上のアミノ酸残基の付加を有することができる。また、例えば、１以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的喪失無くしてカルボキシル末端および／またはアミノ末端を含めたポリペプチドのいずれかの領域から欠失させることができる（Ｒｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８（１９９３）；Ｄｏｂｅｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１９９−２１６（１９８８））。ＡＢＣ１変種がその生物学的活性を保有する限りアミノ酸置換は保存的、非−保存的またはそのいずれかの組合せであり得る。加えて、置換は非−保存アミノ酸残基で行うことができ、ここに、置換された残基は遺伝暗号によってコードされていてもよくまたはされていなくてもよく、アミノ酸残基は置換された基を有する。
ＡＢＣ１ポリペプチドの適当は変種はよく知られて技術を用いて測定することができる。例えば、生物学的活性を破壊することなく変化させることができるＡＢＣ１分子の領域を同定することによって、適当なＡＢＣ１変種を測定することができる。また、当該分野で認識されているごとく、生物学的活性につき、または構造につき重要で有り得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害に影響することなく保存的アミノ酸置換に付すことができる。生物学的活性を破壊することなく変化させることができるアミノ酸残基は、活性につき重要でないＡＢＣ１ポリペプチドの領域を同定することによって測定することができる（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０））。例えば、種々の種からのＡＢＣ１ポリペプチドを比較して、保存された交差種であるＡＢＣ１分子のアミノ酸残基および領域を測定することができる。保存されたアミノ酸残基は、生物学的機能および／または構造につき重要なようである。対照的に、保存された交差種でなく、かくして、天然の選択によって許容されるＡＢＣ１分子の領域の変化は、生物学的活性および／または構造に有害に影響しないであろう。従って、非−保存領域において付加、欠失または置換をもつＡＢＣ１ポリペプチドは適当な変種のようである。比較的保存された領域に置いてさえ、化学的に同様なアミノ酸は、活性を保有しつつ天然に生じる残基の代わりに置き換えることができる。
加えて、構造−機能実験を用いて、活性または構造につき重要である、ＡＢＣＲおよびＡＢＣ−Ｃのごとき、ＡＴＰ−結合カセット蛋白質ファミリーの他もメンバーにおける残渣を測定することができる。そのような実験は、他のＡＴＰ−結合カセット蛋白質において活性または構造につき重要であるアミノ酸残渣に対応するＡＢＣ１変種における重要なアミノ酸残基の予測を可能とする。例えば、他のＡＴＰ−結合カセット蛋白質の構造−機能実験に基づき、ＡＢＣ１における重要なアミノ酸残基は、ヌクレオチド結合およびステロール輸送に関連する領域で見いだされるようである。適当は変種は、例えば、ＡＢＣ１ポリペプチドのそのような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に同様なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
特異的位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子工学技術を用いて適当なＡＢＣ１変種を測定して、ポリペプチド機能につき非常に重要な領域を同定することもできる。アミノ酸変化は、例えば、部位−特異的突然変異誘発またはアラニン−走査突然変異誘発を用いて成すことができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。ついで、例えば、本明細書中に記載したコレステロール流出アッセイの内のいずれか１つを用い、得られたＡＢＣ１変種を生物学的活性につきテストすることができる。破壊されたコレステロール流出活性をもたらす特定のアミノ酸残基置換を有する変種は適当なＡＢＣ１変種と考えられないであろう。
適当な変種を同定するためのさらなる方法は当該分野でよく知られている。さらに、当業者であれば、蛋白質中のあるアミノ酸位置で許容されるであろうアミノ酸変化を認識するであろう（Ｂｏｗｉｅら，ｓｕｐｒａ（１９９０））。例えば、一般に、（蛋白質の三次構造内にある）最も埋もれたまたは内部のアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、他方、表面または外部側鎖のより少ない特徴が一般に保存されることは知られている。さらに、許容された保存的アミノ酸置換は、死亡族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換、芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換、小さなサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換を含む。
ＡＢＣ１変種は天然に生じるものであるか、人工的に構築されることができる。天然に生じる変種の例は対立遺伝子変種およびスプライス変種である。対立遺伝子変種は、生物または生物の集団の染色体上にある与えられた遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態の内の１つをいう（Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，ＧｅｎｅｓＩＩ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。対立遺伝子変種はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルいずれかにおいて変化させることができる。スプライス変種とは核酸分子、通常ＲＮＡをいい、これはＲＮＡ転写体、および対応するポリペプチドにおけるイントロン配列の別のプロセッシングによって生じる。別法として、ＡＢＣ１変種は人工的に構築することができる。例えば、ＡＢＣ１変種は、部位−特異的突然変異誘発の技術を用いて構築することができる。また、例えば、ＡＢＣ１変種は、配列番号：１に記載された野生型ＤＮＡ配列から記載されたごとく変化するＤＮＡ配列を有する、該変種をコードする対応する核酸分子から調製することができる。
ポリペプチド断片とは、配列番号：２に記載されたＡＢＣ１の全長アミノ酸配列未満を含むポリペプチドをいう。好ましいポリペプチド断片は、ＡＢＣ１の生物学的活性を保有する断片を含む。特に、逆コレステロール輸送を媒介する、または改良された逆コレステロール輸送活性を有する断片が好ましい。ＡＢＣ１断片は、生物学的機能が維持される限り、カルボキシル末端および／またはアミノ末端を含めた、ポリペプチドのいずれかの領域から欠失された１以上のアミノ酸を有することができる。ＡＢＣ１ポリペプチド断片は、代替スプライシングまたはイン・ビボプロテアーゼ活性を通じるごとく天然で生じることができるか、よく知られた方法を用い、人工的に構築することができる。
また、本発明は、ここに定義されるごとく、化学的に修飾されているＡＢＣ１ポリペプチド、変種または断片をいうＡＢＣ１ポリペプチド誘導体に関する。誘導体は、ポリペプチドに付着した分子のタイプまたは位置いずれかにおいて、天然に生じるＡＢＣ１ポリペプチドとは異なるように修飾される。誘導体は、さらに、ＡＢＣ１ポリペプチドに天然で付着した１以上の化学基の欠失によって形成されたポリペプチドを含む。加えて、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＡＢＣ１ポリペプチドならびに前記ＡＢＣ１変種および断片を同種ポリペプチドに融合させて、ホモダイマーを形成することができ、あるいは、異種ポリペプチドに融合させてヘテロダイマーを形成させることができる。
本発明のもう１つの態様は、タンジール患者から単離されたポリペプチドに対応する、突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドおよびその断片に関する。１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１ポリペプチドは配列番号：８を含む。蛋白質はタンジール患者（ＴＤ１）から単離し、実施例１および５に記載されたごとく配列決定する。配列番号：８に記載されたアミノ酸配列は、位置５３７におけるグルタミンからアルギニン残渣への置換を例外として野生型配列と同様である（残基番号は（Ｌａｗｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：ｒ２５−３１（１９９９））のものであり、これは、配列番号：８の位置５９７に対応する。この残基の位置はアミノ−末端親水性ドメイン内にあり、第１の予測される膜貫通ドメイン近くにある。置換は蛋白質のこの領域中のアミノ酸の電荷を変化させ、その結果図１に示されるように、かなり減少したコレステロール流出活性を有するＡＢＣ１蛋白質がもたらされる。
もう１つの好ましい実施形態において、突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドは配列番号：１０を含む。該蛋白質はタンジール患者（ＴＤ２）から単離されたポリペプチドに対応し、実施例１および５に記載されたごとく配列決定される。配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列は、残基５２７におけるアルギニンのトリプトファンへの置換を例外として野生型配列と同様である（残基の番号はＬａｗｎら，ｓｕｐｒａ（１９９９）、これは 配列番号：１０の位置５８７に対応する）。ＴＥＤ１ポリペプチドと同様に、この置換は、ＡＢＣ１蛋白質のアミノ−末端親水性ドメイン中のアミノ酸残基の電荷を変化させる。また、得られた突然変異体ＡＢＣ１蛋白質は、図１に示されるごとく、かなり減少したコレステロール流出活性を有する。
（ＡＢＣ１ポリヌクレオチド）
本発明のもう１つの態様は、新規なＡＢＣ１ポリペプチドおよびその変種をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、例えば、全長ＡＢＣ１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、野生型ＡＢＣ１の全長ｃＤＮＡを含有するポリヌクレオチド、野生型ＡＢＣ１のコーディング配列の全長を含むポリヌクレオチド、およびＡＢＣ１の非−コーディング５’および３’配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、タンジール患者のもののごとき突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。重要なことには、エクソン３に見いだされる予測された開始メチオニンに基づいて２２０１アミノ酸の蛋白質につきコードするＬａｎｇｍａｎｎらの公表された配列とは対照的に（Ｌａｎｇｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２５７：２９−３３（１９９９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪＯ１２３７６）、現在特許請求されているヌクレオチド配列は５０のエクソンを含有し、２２６１アミノ酸の蛋白質につきコードする（図４参照）。本発明の対応するヌクレオチド配列は、以下の６０アミノ酸−末端アミノ酸：
ＭＡＣＷＰＱＬＲＬＬＬＷＫＮＬＴＦＲＲＲＱＴＣＱＬＬＬＥＶＡＷＰＬＦＩＦＬＩＬＩＳＶＲＬＳＹＰＰＹＥＱＨＥＣＨＦＰＮＫＡ
に対応する５’末端にさらなる１８０ヌクレオチドを含むコーディング配列を含有する。
この位置から上流にイン・フレーム停止コドン６ないし９ヌクレオチドがあると仮定すれば、新しく予測される開始部位は、連続的オープンリーディングフレームを生じ得る税所のメチオニンコドンである。該６０のさらなるアミノ酸についてのオープンリーディングフレームをやはり含む関連するＡＢＣ輸送体配列ＡＢＣＲおよびＡＢＣ−Ｃ（ＡＢＣ３としても知られている）とこの新しいＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列との整列は高度の同様性を示し、これは、相同ＡＢＣ輸送体蛋白質が、ヒトＡＢＣ１で提案されたアミノ末端延長配列に関連する配列で始まることを意味する。ヒトＡＢＣ１の初期に公表された開始部位は、新しく開示されたメチオニンがイン・フレームではないように延長領域に余分なヌクレオチド「ｎ」を含有する公表されたマウスＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列（Ｌｕｃｉａｎｉら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１１５０−１５９（１９９４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ７５９２６）から予測されたようである。しかしながら、もしマウス配列中の「ｎ」ヌクレオチドが無視されれば、延長領域のマウスおよびヒト配列は同一である。これらの結果に徴すれば、全長ヒトＡＢＣ１蛋白質は、Ｌａｎｇｍａｎｎらによって従前に提案されて入るごとく、２２０１アミノ酸よりはむしろ２２６１アミノ酸を含有するようである。従って、ＬａｎｇｍａｎｎらはヒトＡＢＣ１の十分なオープンリーディングフレームを提示していない。
もう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、非−コーディング５’および３’配列いずれかの少なくとも１部を含む全長ＡＢＣ１ ｃＤＮＡを含む。好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されたヌクレオチド配列を含む。配列番号：１に示された１０．４ｋｂヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列は、６７８３ヌクレオチド＋５’および３’非翻訳領域のオープンリーディングフレームを含有する。位置２９１に開始コドン、および位置７０７４に停止コドンがある。配列番号：１に示された現在のＡＢＣ１ ｃＤＮＡは、いくつかの点で公表されたＡＢＣ１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号．ＡＪＯ１２３７６）とは異なる。まず、現在のＡＢＣ１ ｃＤＮＡは５’末端にさらなる３５０ヌクレオチドおよび３’末端にさらなる３１３６ヌクレオチドを含む（ポリ（Ａ）テールは含まず）。また、本発明のＡＢＣ１配列は、コーディング領域における１０ヌクレオチドの置換によって公表されたＡＢＣ１ ｃＤＮＡとは異なる。１０の差の内、７つのヌクレオチドの差はアミノ酸変化を予測する。公表された記録と合致させるためには以下のヌクレオチドおよびアミノ酸番号は配列番号：１のものよりはむしろＬａｗｎら．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：Ｒ２５−３１（１９９９）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪＯ１２３７６のものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸変化は以下の通りである：（１）ヌクレオチド４１４におけるＧの代わりのＡ；（２）ヌクレオチド５９６におけるＧの代わりのＡ（アミノ酸１５９におけるＲの代わりのＫ）；（３）ヌクレオチド７０５におけるＣの代わりのＴ；（４）ヌクレオチド１９８０におけるＣの代わりのＡ；（５）２４１３におけるＧの代わりのＡ（アミノ酸７６５におけるＶの代わりのＩ）；（６）２５８９におけるＡの代わりのＧ（アミノ酸８２３におけるＩの代わりのＭ）；（７）４６０４におけるＣの代わりのＴ（アミノ酸１４９５におけるＴの代わりのＩ）；（８）４８８３におけるＣの代わりのＴ（アミノ酸１５８８におけるＰの代わりのＬ）；（９）５８６１におけるＧの代わりのＡ（アミノ酸１９１４におけうＲの代わりのＫ）；および（１０）６４４３におけるＣの代わりのＴ（アミノ酸２１０８におけるＰの代わりのＬ）。アミノ酸変化の内５は保存的アミノ酸変化であり、多形または配列のエラーを表し得る。２つの例において、本発明の配列はＧｅｎＢａｎｋ配列からの重要なアミノ酸の差を予測する。該差の結果、残基１５８８におけるおよび２１０８におけるプロリンよりはむしろロイシンがもたらされる。興味深いことには、療法の位置において、予測されるロイシンは、分析した３つのＴＤ試料の各々ならびに高度に保存されたマウスＡＢＣ１蛋白質にも見いだされた。
また、本発明は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％同一性を好ましくは有するヌクレオチド配列を含むＡＢＣ１ポリヌクレオチドに関する。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも９０％同一性を有する。なおより好ましくは、ポリヌクレオチドが、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも９５％同一性を有する。最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって１００％同一性を有する。そのような関連するＡＢＣ１ポリヌクレオチドは、置換、欠失および挿入変種、ならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、断片、誘導体および相同分子種を含み、ここに、１以上のヌクレオチドは置換、欠失、挿入または誘導体化されている。好ましいポリヌクレオチドは、コレステロール流出活性のごとき生物学的活性を保有するＡＢＣ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１の全コーディング配列を含む。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４に示された配列を示す。この単離されたポリヌクレオチドは６７８３ヌクレオチドのＡＢＣ１オープンリーディングフレームを含有し、前記したごとく、２２６１アミノ酸のポリペプチドをコードする。
さらにもう１つの好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ＡＢＣ１変種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。特に、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。また、好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。従って、本発明は、記載された置換、欠失および挿入変種、ならじにＡＢＣ１対立遺伝子変種、スプライス変種、断片、誘導体、融合ポリペプチドおよび相同分子種を含めた、前記ＡＢＣ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、ＡＢＣ１の生物学的活性を保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。特に、逆コレステロール輸送を媒介するポリペプチドをコードするヌクレオチドが好ましい。また、好ましいのは、改良された逆コレステロール輸送活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明のさらにもう１つの態様は、タンジール患者からの突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：８のポリペプチドをコードし、そのポリペプチドは患者ＴＤ１から単離され、それは前記されている。もう１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載されたヌクレオチド配列を含む。配列番号：７に記載されたヌクレオチド配列は十分はオープンリーディングフレーム、ならじに５’および３’フランキング配列を含む。該オープンリーディングフレームは、他の置換の内でも、位置５３７においてＡからＧへの置換をもたらすヌクレオチド置換を含む２２６１のアミノ酸のポリペプチドをコードする（Ｌａｗｎら，ｓｕｐｒａ（１９９９））のナンバリングを使用）。
突然変異体ＡＢＣ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連するもう１つの好ましい実施形態において、ポリペプチドは配列番号：１０のポリペプチドをコードし、そのポリペプチドはタンジール患者ＴＤ２から単離され、これはやはり前記した。さらにもう１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：９に記載されたヌクレオチド配列を含む。配列番号：９に記載されたヌクレオチド配列は十分はオープンリーディングフレーム、ならびに５’および３’フランキング配列を含む。オープンリーディングフレームは、他の置換の内でも、残基５２７においてＡｒｇからＴｒｙｐへの置換をもたらすポリヌクレオチド置換を含む２２６１アミノ酸のポリペプチドをコードする（Ｌａｗｎら、ｓｕｐｒａ（１９９９）のナンバリングを使用）。
本発明のもう１つの態様は、ＡＢＣ１の非−コーディング５’フランキングおよび３’フランキング領域を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１の非−コーディング５’フランキング領域を含む。好ましくは、５’フランキング領域は、限定されるものではないが、ＡＢＣ１プロモーター領域を含む。かくして、好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３に示された配列を含む。異種レポーターアッセイによって示され、実施例１５で議論したごとく、配列番号：３に記載されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１遺伝子の転写調節領域を含む。図１３に示すごとく、配列番号：３に記載されたポリヌクレオチドは、位置１５２２、１４３５および１３８３におけるＴＡＴＡボックスを含めたいくつかの転写調節エレメント、ならびにいくつかの推定ＳＰ１部位、およびいくつかの核レポーター半分部位を含めた転写因子結合部位を含有する１６４３ｂ．ｐ．非−コーディング配列である。加えて、同定されたステロール応答エレメントは位置１４８３−１５００に見いだされる。実施例１７に記載されたさらなる異種レポーターアッセイは、いくつかの区別される配列番号：３の部分がプロモーター活性を保有することを明らかとした。従ってもう１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含む。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２を含み、この配列はＡＢＣ１プロモーター活性を有することが示された（実施例１７参照）。さらにもう１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１４８０−１５１０を含み、これはＬＸＲリガンドに対するＡＢＣ１転写応答を調節することが示される。
また、５’フランキングポリヌクレオチドは、厳密条件下で配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ここに、該ヌクレオチド配列はＡＢＣ１プロモーター活性を有する。さらにもう１つの実施形態において、ポリペプチドは、厳密な条件下で配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ここに、該ヌクレオチド配列はＡＢＣ１プロモーター活性を有する。
もう１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドはＡＢＣ１の３’フランキング領域を含む。ＡＢＣ１転写体のポリアデニル化の代替部位を表すことができるいくつかの３’非翻訳領域が同定されて入る。好ましくは、３’フランキング領域は調節配列を含有する。例えば、全長３’ＵＴＲ（配列番号：６）は、Ｖｉｇｉｌｉｎの結合に必要なことが示されている４６配列（ＡＡ）ｎＣＵ／ＵＣ（ＡＡ）ｎを含有する。Ｖｉｇｉｌｉｎ、１４Ｋ相同性ドメインを持つ普遍的蛋白質はエストロゲン−誘導性ビテロゲニンｍＲＮＡ ３’−非翻訳領域結合蛋白質である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１２２４９−１２２５２（１９９７））。結合ＨＤＬに加え、ＶｉｇｉｌｉｎはｍＲＮＡの３’フランキング領域に結合し、ｍＲＮＡ転写体の半減期を増加させることが示されて入る（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：３９９１−４００３（１９９８））。かくして、３’−フランキング領域を変化させて、例えば、Ｖｉｇｉｌｉｎの結合を増加させ、それにより、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡの半減期を増加させることができるであろう。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配列番号：４に示された配列を含む。また、好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは配列番号：５に示された配列を含む。もう１つの好ましい実施形態いおいて、単離されたポリヌクレオチドは配列番号：６に示された配列を含む。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に記載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む。
また、本発明は関連するＡＢＣ１の５’および３’フランキングポリヌクレオチドを含む。従って、本発明は、配列番号：３を含むポリヌクレオチド、配列番号：４を含むポリヌクレオチド、配列番号：５を含むポリヌクレオチド、配列番号：６を含むポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、前記したフランキングポリヌクレオチドのいずれかの１つに対してその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一性を有する。好ましいポリヌクレオチドは、転写調節活性のごとき生物学的活性を保有するポリヌクレオチドを含む。
本発明は、さらに、前記したポリヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的な単離されたポリヌクレオチドに関することが理解される。本明細書中に用いるごとく、用語「相補的」とは、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つのストランドの間のごときヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合をいう。２つの二本鎖ヌクレオチド分子は、１つのストランドのヌクレオチドが、適当なヌクレオチド挿入、欠失または置換と最適に整列し、他のストランドのヌクレオチドの少なくとも約８０％と対合する場合に相補的であるといわれる。
本発明のもう１つの態様は、前記した新規なＡＢＣ１および適当な担体を含む組成物に関する。１つの実施形態において、該組成物は、配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および担体を含む。もう１つの実施形態において、該組成物は、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一性を有するポリヌクレオチドおよび担体を含む。
もう１つの実施形態において、該組成物は、ＡＢＣ１ ５’フランキング配列および適当な担体を含む。好ましくは、該組成物は、配列番号：３を含むポリヌクレオチド、または配列番号：３のヌクレオチド断片１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。また、好ましくは、該組成物は、記載した５’フランキング配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチドのその全長にわたって少なくとも８０％、９０％または９５％同一性を有するポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。さらにもう１つの実施形態において、該組成物は、ＡＢＣ１ ３’フランキング配列を含むポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。好ましい組成物は、配列番号：４を含むポリヌクレオチド、配列番号：５を含むポリヌクレオチド、または配列番号：６を含むポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドのいずれかに対してその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一性を有するポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。本発明のさらに他の組成物は突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、該組成物は配列番号：７を含むポリヌクレオチドまたは配列番号：９を含むポリヌクレオチドおよび適当な担体を含む。
加えて、本発明の組成物は、いずれかの組合せにおいて、前記ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのうちの２以上および適当な担体を含む。いずれかの適当な水性担体を該組成物で用いることができる。好ましくは、該担体は、該組成物を、室温または貯蔵温度（すなわち、４℃ないし２０℃）のごとき所望の温度で安定とし、適当な中性のｐＨのものである。適当な担体の例は当業者に公知であり、トリス−ＥＤＴＡおよびＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏを含む。
（ＡＢＣ１ベクターと宿主細胞）
また、本発明は、１以上の前記ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む該ベクターで遺伝子工学的に作成した宿主細胞、および組換え技術によるＡＢＣ１ポリヌクレオチドの生産に関する。前記したごとく、本発明は、前記した１以上の野生型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、および配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：２のアミノ酸に対して少なくとも９８％同一性であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変種ポリヌクレオチドを含む。また、もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一である変種ポリヌクレオチドを含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、これらのポリヌクレオチドのいずれかに相補的であるポリヌクレオチドを含む。
もう１つの実施形態において、組換えベクターは、タンジール病患者から単離された突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：８を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：１０を含むポリヌクレオチドを含む。また、組換えベクターは、これらの配列に対して相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。
また、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変種、または突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのうちの２以上を含むことができることも理解される。
前記した野生型、変種、または突然変異体ポリヌクレオチドのいずれかのごとき、単離されたＡＢＣ１ポリヌクレオチドはよく知られた連結およびクローニング技術を用いベクターに挿入される。クローニング技術は、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１），（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４））；Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１））；Ｍｕｒｒａｙ編，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）を含めたいくつかの標準的なマニュアルに記載されている。
ＡＢＣ１ポリヌクレオチド挿入に適したいずれのベクターも用いることができる。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞で機能するように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または発現が起こり得るように宿主細胞マシーンに適合する）。好ましくは、ベクターは細菌、昆虫、または哺乳動物宿主細胞に適合する。また、好ましくは、ベクターは発現ベクターである（発現ベクターのレビューについては、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．編，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは複製コンピテントまたは複製欠陥であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補充宿主細胞のみで起こるであろう。
典型的には、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための、および外因性ヌクレオチド配列の発現のための配列を含有する。集合的に「フランキング配列」というそのような配列は、好ましくは、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド挿入のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメントのうちの１以上を含むべきである。
フランキング配列は同種（すなわち、宿主細胞と同一種および／または株）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種）、ハイブリッド（すなわち、１を超える源からのフランキング配列の組合せ）、または合成のものであり得る。また、フランキング配列は、通常、ＡＢＣ１ポリペプチド発現を調節するように機能する天然配列であり得る。フランキング配列の源は原核生物または真核生物、いずれかの脊椎生物または無脊椎生物、またはいずれかの植物であり得るが、フランキング配列は宿主細胞マシーンで機能し、それによって活性化され得るものとする。
また、ベクターは、好ましくは、宿主における増殖のための少なくとも１つの選択マーカーを含むべきである。選択マーカーは、選択的培地で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子エレメントである。適当な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞についての抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する抵抗性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥を補う；または（ｃ）複合培地から利用できない臨界的栄養を供給する蛋白質をコードする。好ましい選択マーカーは真核生物培養についてのゼオシン、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはネオマイシン抵抗性およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン抵抗性を含む。
他の適当な選択遺伝子は、発現された遺伝子を増幅するのに使用されるものを含む。増幅は、増殖に臨界的な蛋白質の生産に対して大きな要求がある遺伝子が、組換え細胞の継続的世代の染色体内で縦列反復するプロセスである。哺乳動物細胞のための適当な選択マーカーの例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼを含む。哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、ここに、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子により生存するのにユニークに適合する。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に変化し、それにより、選択遺伝子およびＡＢＣ１遺伝子双方の増幅に導く条件下で形質転換細胞を培養することによって課される。その結果、増大した量のＡＢＣ１ポリペプチドが増幅されたＤＮＡから合成される。
また、ベクターは、好ましくは、典型的には、ポリペプチドコーディング配列の末端の３’側に位置し、転写を終止させるように働く転写終止配列を含有する。通常、原核生物における転写終止配列はＧ−Ｃリッチな断片、続いてのポリＴ配列である。該配列は商業的ベクターの一部として購入され、あるいは核酸合成のためのよく知られた方法を用い合成される。
また、ベクターは、好ましくは、通常はｍＲＮＡの翻訳開始に必要で、シャインダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられるリボソーム結合部位を含む。該エレメントは、典型的には、プロモーターの３’側であって、発現させるべきＡＢＣ１ポリペプチドのコーディング配列の５’側である。シャイン−ダルガノ配列は同定されており、その各々はよく知られた方法によって容易に合成することができる。
また、ベクターは、好ましくは、宿主生物によって認識され、コードされたポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むべきである。プロモーターは誘導プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る。誘導プロモーターは、栄養の存在または不存在、あるいは温度の変化のごとき、培養条件のある変化に応答して、増大したレベルのＤＮＡからの転写をそれらの制御下で開始する。対照的に、構成的プロモーターは継続的遺伝子産物生産を開始する；その結果、遺伝子発現に対してほとんどまたは全く制御はない。制限酵素消化により源ＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、適当なプロモーターをポリヌクレオチドに作動可能に連結させる。前記したごとく、天然プロモーターを用いて、ポリヌクレオチドの増幅および／または発現を指令することができる。かくして、組換えベクターは配列番号：３に見いだされるもののごとき、前記した野生型、変種、または突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびＡＢＣ１プロモーターのうちの１つを含み得る。また、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変種または突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびＡＢＣ１プロモーターのうちの２以上を含むことができる。
好ましくは、もしそれが天然ＡＢＣ１プロモーターと比較してＡＢＣ１蛋白質のより大きな転写およびより高い収率を与えるならば、およびもしそれが使用のために選択されている宿主細胞系に適合するならば異種プロモーターを用いる。異種プロモーターは単独で、または天然ＡＢＣ１プロモーターと組み合わせて用いることができる。かくして、１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは前記野生型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１つを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは前記変種ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１つを含む。さらにもう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは、前記突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび異種プロモーターのいずれか１つを含む。また、好ましい実施形態は、前記野生型、変種および突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドの２以上および異種プロモーターのいずれかの組合せを含む組換えベクターを含む。
原核生物宿主で用いるのに適した異種プロモーターは限定されるものではないが、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）、アルカリ性フォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｔ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）のごときハイブリッドプロモーターを含む。それらの配列は公表されており、それにより、いずれかの有用な制限部位を供給するのに必要なリンカーまたはアダプターを用い、当業者がそれらを所望のＤＮＡ配列に連結するのを可能とする。他の適当な異種プロモーターは当業者に知られている。
哺乳動物宿主細胞で用いるのに適した異種プロモーターは良く知られており、限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、（アデノウイルス２のごとき）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類、肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ−型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のごときウイルスのゲノムから得られたものを含む。他の適当な哺乳動物プロモーターは異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱−ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。さらなる適当なプロモーターは、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後記プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ および Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３４０−１０）；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；およびメタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）を含む。好ましくは、プロモーターはサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０プロモーターである。かくして、特に好ましい実施形態において、組換えベクターは前記野生型ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのうちの１つ、前記した変種ＡＢＣ１ポリヌクレオチドの１つ、または前記した突然変異体ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびサイトメガロウイルスプロモーターのうちの１つを含む。もう１つの特に好ましい実施形態において、組換えベクターは、いずれかの組合せにおいて、前記野生型、変種、またはＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびサイトメガロウイルスプロモーターの２以上を含む。
また、ベクターは、好ましくは、ＡＢＣ１のごとき、ポリヌクレオチドの転写を増加させるためのエンハンサー配列を含む。真核生物プロモーターの活性化のための適当なエンハンサーはＳＶ４０、サイトメガロウイルス初期プロモーター、ポリオーマおよびアデノウイルスエンハンサーのごときウイルスエンハンサーを含む。
本発明の発現ベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもまたはしなくても良い、商業的に入手可能なベクターのごとき出発ベクターから構築することができる。ここに記載するフランキング配列の１以上がベクターにすでに存在しない場合、それらは個々に得ることができ、ベクターに連結することができる。フランキング配列の各々を得るのに用いる方法は当業者に良く知られている。
好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細胞に適合するものである。細菌で用いるのに好ましいベクターは、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｕｉａｇｅｎ．Ｉｎｃ．）ブルースクリプトベクター、ファージスクリプトベクター、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．），およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。好ましい真核生物ベクターは、限定されるものではないが、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ（（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｅｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかであろう。
特に好ましい実施形態において、組換えベクターは、実施例４に記載し、図３に示されるｐＣＥＰｈＡＢＣ１を含む。組換えベクターｐＣＥＰｈＡＢＣ１はプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、サイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサーを含有する発現ベクターを含む。ベクターｐＣＥＰｈＡＢＣ１は、さらに、異種サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結したＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドは、非−コーディング５’フランキング（すなわち、天然ＡＢＣ１プロモータ）および３’フランキング配列を含めた全長ＡＢＣ１ ｃＤＮＡを含有する配列番号：１を含む。
加えて、本発明はＡＢＣ１フランキング配列ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。１つの実施形態において、組換えベクターは、好ましくはプロモータ活性を含有するＡＢＣ１ ５’フランキング配列を含むポリヌクレオチドを含む。かくして、好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：３を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２を含む。また、もう１つの実施形態において、組換えベクターは、厳密な条件下で配列番号：３に記載されたポリヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらにもう１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：３を含むポリヌクレオチドまたは配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また、組換えベクターは、前記５’フランキング配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドを含む。
もう１つの実施形態において、組換えベクターは、ＡＢＣ１の３’フランキング配列を含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：４を含むポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：５を含むポリヌクレオチドを含む。同等に好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：６を含むポリヌクレオチドを含む。また、もう１つの実施形態において、組換えベクターは、厳密な条件下で配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に記載されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらにもう１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含むポリヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また、組換えベクターは、前記３’フランキング配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドを含む。
前記５’または３’フランキング配列ポリヌクレオチドのいずれかのごとき単離されたＡＢＣ１フランキング配列ポリヌクレオチドは、よく知られた連結およびクローニング技術を用いベクターに挿入される。前記したベクターのいずれも用いることができる。好ましくは、ベクターは細菌、昆虫または哺乳動物宿主細胞に適合する。また、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイスルまたはレトロウイルスベクターであり得る。
ＡＢＣ１フランキング配列に加えて、ベクターは以下のフランキングヌクレオチド配列：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメントのうちの１以上を含有することができる。前記したフランキングヌクレオチド配列のいずれも適当である。フランキング配列は同種、異種、ハイブリッドまたは合成のものであり得る。また、フランキング配列は、ＡＢＣ１ポリペプチド発現を調節するように通常は機能する天然配列であり得る。フランキング配列の源は原核生物または真核生物、いずれかの脊椎生物または無脊椎生物、またはいずれかの植物であり得るが、フランキング配列は宿主細胞マシーンで機能し、それによって活性化できるものとする。
好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細胞に適合するものである。適当なベクターは前記したものであり、細菌で用いるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９、ブルースクリプトベクター、ファージスクリプトベクター、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐｋｋ２２３−３、ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５およびｐＣＥＰ４、および真核生物細胞で用いるｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ．ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬおよびｐＧＬ３を含む。
１つの特に好ましい実施形態において、組換えベクターは、ＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域を含むポリヌクレオチドを含み、さらに、異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。異種ポリヌクレオチドはＡＢＣ１ ５’フランキング配列に作動可能に連結している。ＡＢＣ１ ５’フランキング配列は、好ましくは、ＡＢＣ１プロモーターを含有する。かくして、好ましくは、５’フランキング配列は配列番号：３に記載された配列を含む。同等に好ましくは、５’フランキング配列は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含む。異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、完全な蛋白質または蛋白質の生物学的に活性な断片であるポリペプチドをコードする。ベクターは、１を超える異種ポリヌクレオチドを含有することができる。より好ましくは、異種ポリヌクレオチドはレポーター蛋白質をコードする。そのような場合、組換えベクターは、好ましくは、いずれのさらなるプロモーター配列も含有しない。適当なレポーター蛋白質の例はルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼトランスフェラーゼ、および緑色蛍光蛋白質を含む。好ましくは、レポーターポリヌクレオチドはルシフェラーゼである。かくして、１つの特に好ましい実施形態において、組換えベクターは配列番号：３に記載された５’フランキング配列およびルシフェラーゼレポーターポリヌクレオチドを含む。他の同等に好ましい実施形態において、組換えベクターは、ヌクレオチド配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３または１３９４−１６４３を含むポリヌクレオチドおよびルシフェラーゼレポーターポリヌクレオチドを含む。
ＡＢＣ１ ５’フランキング配列を含む発現ベクターは、レポーターポリヌクレオチドを含有する商業的に入手可能なベクターのごとき出発ベクターから構築することができる。適当な発現ベクターの例は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩおよびｐβＧａｌ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有するｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを含む。好ましいベクターはプロモーターがないｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポーターベクターである。ＡＢＣ１プロモーターを含有する５’フランキング配列、例えば、配列番号：３は、ここに記載する方法（実施例１５参照）を含めた良く知られた方法を用い、前記発現ベクターのうちの１つに連結することができる。かくして、特に好ましい実施形態において、組換えベクターはｐＡＰＲ１、配列番号：３を含むレポーター遺伝子構築体およびｐＧＬ３ベクターにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子である（図１１参照）。
また、本発明は、前記組換えベクターのいずれか１つを含む宿主細胞に関する。ベクターが構築された後、完成されたベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現のために適当な宿主細胞に挿入することができる。宿主細胞は（Ｅ．ｃｏｌｉのごとき）原核生物宿主細胞または（酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動物細胞のごとき）真核生物宿主細胞であり得る。適当な条件下で培養すると、宿主細胞はＡＢＣ１ポリペプチド、あるいは、引き続いて測定することができるレポーターポリペプチドを合成する。宿主細胞は、形質転換された細胞系を含めた霊長類細胞系または齧歯類細胞系のごとき哺乳動物宿主細胞であり得る。正常なジプロイド細胞、一次組織のイン・ビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植体も適当である。候補宿主細胞は、選択遺伝子に表現型的に欠陥があり得るか、または圧倒的に作用選択遺伝子を含有することができる。
多数の適当な宿主細胞が当該分野で知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。適当な哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：４２１６：２０）、ヒト胚腎臓（ｈｅｋ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ細胞、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系を含む。他の適当な哺乳動物細胞系は、限定されるものではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウス１−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ由来の３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨＡＫハムスター細胞系、Ｔｈｐ−１、ＨｅｐＧ２およびマウスＲＡＷ細胞系を含む。これらの細胞系の各々は蛋白質発現分野の当業者に知られており、入手可能である。好ましい宿主細胞は、実施例８にその使用が記載されるマウス単球細胞系ＲＡＷ２６４．７である。
適当な細菌宿主細胞は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として良く知られているＥ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５０、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）を含む。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．，ｏｔｈｅｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もこの方法で使用することができる。また、酵母細胞の多くの株もＡＢＣ１ポリペプチドの発現のための宿主細胞として入手できる。好ましい酵母細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。加えて、昆虫細胞系は適当な宿主細胞であり得る。昆虫細胞系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載されている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
また、本発明は（ａ）検出可能なレベルのＡＢＣ１蛋白質を生じさせるのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、（ｂ）生じたＡＢＣ１蛋白質を精製する工程を含む哺乳動物宿主細胞においてＡＢＣ１蛋白質を発現する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、組換え発現ベクターは配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。もう１つの好ましい実施形態において、配列番号：１を含むポリヌクレオチド。さらにもう１つの好ましい実施形態において、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド。なおもう１つの好ましい実施形態において、配列番号：２を含むポリペプチドに対して少なくとも９８％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
組換えＡＢＣ１ベクターの哺乳動物宿主細胞への導入は、当該分野で良く知られた方法によって行うことができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲のごとき標準的な実験室マニュアルに記載されている。好ましくは、組換えベクターは沈殿にてまたは荷電脂質との複合体にて宿主細胞に導入される。ＡＢＣ１ベクターの導入に適した方法はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または当該分野で知られた他の方法を含む。これらの方法は、例えば、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）に記載されている。もし組換えＡＢＣ１ベクターがウイルスベクターであれば、それは適当なパッケージンング細胞系を用いイン・ビトロにてパッケージＣ、次いで、宿主細胞に導入することができる。
ＡＢＣ１−ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレシチンクロマトグラフィーを含めたよく知られた方法を用い、組換え細胞培養から回収し、精製することができる［例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６３：３１−４０（１９８８）参照］。好ましくは、抗−ＡＢＣ１抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを精製で用いる。
加えて、本発明は、哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現するのに十分な量のＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質を発現させる方法を提供する。好ましくは、組換え発現ベクターは配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、または配列番号：２を含むポリペプチドに対して少なくとも９８％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。組換えＡＢＣ１ベクターの哺乳動物対象への導入は当該分野でよく知られた方法によって行うことができ、これはここに後記にて詳細に記載する。ＡＢＣ１の発現は、それに組換えＡＢＣ１ベクターを投与した対象から血液試料を得、単球集団を分離し、マクロファージ細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現を測定することによって測定することができる。ＡＢＣ１遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲのごとき当該分野でよく知られた方法、および本明細書に記載された方法（実施例９および１０参照）。ＡＢＣ１蛋白質のレベルは、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、実施例１１に記載された免疫沈殿のごときよく知られた方法を用い、マクロファージ細胞においてＡＢＣ１蛋白質を測定することによって測定することができる。
（コレステロール流出を増加させるための方法と化合物）
本発明のもう１つの態様において、哺乳動物対象において細胞からコレステロール流出を増加させるのに適した方法が提供される。かかる方法は、該細胞からノコレステロール流出を増加させるのに十分な量でＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを哺乳動物対照に投与することを含む。組換えベクターは、コードされたＡＢＣ１ポリペプチドが生物学的活性（すなわち、コレステロール輸送活性）を有する限り、前記した野生型または変種ＡＢＣ１ポリヌクレオチドのいずれかを含有する前記ベクターのいずれかであり得る。好ましくは、組換えベクターは配列番号：２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、または配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、好ましくは、組換えベクターは、コードされたＡＢＣ１ポリペプチドがコレステロール輸送活性を有する限り、配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、９０％または９５％同一である変種ポリヌクレオチドを含む。
組換えＡＢＣ１発現ベクターの哺乳動物対象への投与を用いて、心血管病の治療のために該対象においてＡＢＣ１遺伝子を発現させることができる。具体的には、この方法は、心血管病を持つ哺乳動物の動脈病巣で見いだされるマクロファージ細胞および他のコレステロール−蓄積細胞にＡＢＣ１遺伝子を導入することによって治療効果を達成するであろう。標的細胞におけるＡＢＣ１ポリヌクレオチドの発現はＡＢＣ１蛋白質のより大きな生産を行うであろう。引き続いて生産されたＡＢＣ１蛋白質は、動脈病巣で見出されるマクロファージおよび他のコレステロール−負荷細胞からのコレステロールの裸ＨＤＬ粒子への流出を増加させることによって該病気を軽減するであろう。細胞流出は、動脈プラークのコレステロールリッチのコアのごとき末梢部位からの全コレステロールの除去に至るであろう。これらの病理学的病巣のサイズの同時減少は、心臓発作および狭心症に至る動脈閉塞の危険性を減少させる。この方法は、また、動脈壁におけるコレステロールの蓄積を防止するために予防的に用いることもできよう。
十分な量のＡＢＣ１発現ベクターは、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるＡＢＣ１ベクターの量である。そのような量は、種々の投与量の組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照レベル）および後に対照の細胞中のコレステロール流出を測定し、対照レベルと比較したコレステロール流出の増加を行う用量を測定することによって決定することができる。コレステロール流出は、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、対象のマクロファージ細胞におけるコレステロール流出の量を測定することによって測定することができる。ここに記載したアッセイのいずれを用いてコレステロール流出を測定することもできる。
加えて、コレステロール流出は、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照）および後に対象における血漿ＨＤＬ−コレステロールのレベルを決定することによって測定することができる。組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与に続いて対象の血清におけるＨＤＬ−コレステロールの観察された増加は、コレステロール流出の増加を示す。血清中のＨＤＬ−コレステロールは当該分野で良く知られた方法を用いて測定することができる。
加えて、コレステロール流出は、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前（対照レベル）および後に対照の動脈壁に見出されるアテローム性動脈硬化症病巣のサイズを測定することによって測定することができる。動脈病巣のサイズの低下は、コレステロール流出の増加を示す。動脈病巣を測定するアッセイは当該分野で良く知られている。例えば、動脈病巣からの増加したコレステロール流出は、Ｌａｗｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：６７０−６７２（１９９２）に記載されているアテローム性動脈硬化症のマウスモデル、ならびに他の公知の方法のいずれかを用いて測定することができる。Ｌａｗｎらに記載されたＬＤＬ受容体ノックアウトマウスを用い、コレステロール流出はＡＢＣ１ベクターの投与前および後に測定することができる。アテローム発生ダイエットを与えられた動物の群における脂肪ストリーク病巣のサイズは、Ｌａｗｎらに記載された大動脈切片の油−レッドＯ染色によって測定することができる。対照ベクターを受け取った群と比較したＡＢＣ１発現ベクターを受け取った群における脂肪ストリーク病巣のサイズの低下は、該病巣からのコレステロール流出の増加を示す。ヒトにおいては、動脈壁に見出されるアテローム性動脈硬化症病巣のサイズは、例えば、アンジオグラフィーおよび非侵入的超音波方法を用いて測定することができる。
別法として、コレステロール流出は、血液試料を得、次いで、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与前および後に対象のマクロファージ細胞中のＡＢＣ１ｍＲＮＡまたはＡＢＣ１蛋白質のレベルを測定することによって測定することができる。ルーチン的アッセイを行って、ＡＢＣ１ｍＲＮＡ濃度およびコレステロール流出の間の相関を決定することができる。同様に、アッセイを行って、ＡＢＣ１蛋白質の量とコレステロール流出の量と相関させることができる。そのような相関データを用い、組換えＡＢＣ１発現ベクターの投与後における対象の細胞でのＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはＡＢＣ１蛋白質の観察された増加を用いて、コレステロール流出の増加を示すことができる。ＡＢＣ１ｍＲＮＡおよびＡＢＣ蛋白質レベルは、ここに記載されたアッセイおよびｍＲＮＡおよび蛋白質の定量のための他の良く知られた技術を用いて測定することができる。治療投与量および処方は後に詳細に議論する。
核酸分子の標的細胞への導入に適した複数のウイルスおよび非ウイルス方法が当業者に利用できる。例えば、遺伝子治療に適したウイルス送達ベクターは、限定されるものではないが、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ポックスウイルス（すなわち、ワクシニア）、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、およびレトロウイルスおよびシンドビスウイルスのごときＲＮＡウイルスを含む。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドは、裸ＤＮＡ送達（直接的注入、受容体−媒介導入（ＤＮＡ−リガンド複合体）、エレクトロポレーション、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈殿、マクロ粒子衝撃（遺伝子銃技術）、リポソーム−媒介導入、およびリポフェクションのごとき非ウイルス送達系を用いて送達することができる。
細胞の遺伝子的修飾は、遺伝子治療分野で良く知られた１以上の技術を用いて達成することができる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０（５１１０）：９２６−３２）。遺伝子治療の材料および方法は誘導性プロモーター、組織−特異的エンサンサー−プロモーター、部位−特異的一体化のために設計したＤＮＡ配列、親細胞よりも優れた選択利点を提供することができるＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制御系（安全性の尺度）、（細胞標的化のための）細胞−特異的結合剤、細胞−特異的内部化因子、およびベクターによって発現を増強するための転写因子ならびにベクター製造の方法を含むことができる。遺伝子治療の技術の実践のための方法および材料の例は（エレクトロポレーション技術を含む）米国特許第４，９７０，１５４号、（遺伝子送達のためのリポ蛋白質−含有系を記載する）第５、６７９、５５９号、（リポソーム担体を含む）第５、６７６、９５４号、（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）第５、５９３、８７５号、および（生物学的に活性な粒子があるスピードで細胞に推進され、それにより、粒子が細胞の表面を貫き、細胞の内部に一体化するようになるプロセスを記載する）第４、９４５、０５０号、および（核リガンドを含む）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８号に記載されている。
アデノウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子導入で特に有用であることが判明している（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４（１９９１）；米国特許第５、６３１、２３６号）。ヒトにおけるＡｄ−媒介遺伝子治療の最初の試験は嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子の肺への導入であった（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．ら，１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８（１）：４２−５１）。イン・ビボで組換えＡｄを異なる組織に投与するための実験ルートは器官内点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ，６８（１）：１４３−５５）、筋肉への注射（Ｑｕａｎｔｉｎ．Ｂ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（７）：２５８１−４）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ，Ｊ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（７）：２８１２−６）および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｇ．，ら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９（５０９７）：９８８−９０）を含むものであった。従って、アデノウイルスベクターは当業者に広く入手でき、本発明で用いるのに適する。
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は、最近、遺伝子治療における優れた適用にて遺伝子導入系として導入されてきた。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムへ一体化させるにおいて高レベルの感染性、広い宿主範囲および特異性を示す（Ｈｅｒｍｏｎａｔ．Ｐ．，およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１（２９）：６４６６−７０）。単純疱疹ウイルスタイプ−１（ＨＳＶ−１）は好ましいベクター系である（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．，ら，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１０）：４２８−３２；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．，ら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４（１）：８７−９９；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．，ら，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：６７５−７１０）。ポックスウイルス科のワクシニアウイルスもまた発現ベクターとして開発されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．，およびＭｏｓｓ，Ｂ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２５（１）：２１−８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：３４５−６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２５−３８）。前記ベクターの各々は当業者に広く利用でき、本発明で用いるのに適しているであろう。
好ましくは、ウイルス送達系はレトロウイルスベクターを利用する。レトロウイルスベクターは、大きな割合の標的細胞に感染し、細胞のゲノムに組み込むことができる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．，およびＲｏｓｍａｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７（９）：９８０−２、９８４−６，９８９−９０（１９８９）；米国特許第５、６７２、５１０号）。レトロウイルスは、他のウイルスよりも比較的初期に遺伝子導入ベクターとして開発され、遺伝子マーキングおよびヒトリンパ球へのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のｃＤＮＡの導入で最初に成功して用いられた。好ましくは、レトロウイルスベクターはネズミまたは鳥類レトロウイルスの誘導体であり、またはレンチウイルスベクターである。特に好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。単一の外来性遺伝子を導入することができるレトロウイルスベクターの例は、限定されるものではないが、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルスＲＳＶ）を含む。多数のさらなるレトロウイルスベクターを複数遺伝子に組み込むことができる。これらのベクターの全ては、導入された細胞を同定し再生させることができるように、選択マーカーのための遺伝子に導入または一体化させることができる。
組換えレトロウイルスは欠陥があるので、それは感染性ベクター粒子を生じさせるには助けが必要である。この助けは、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることによって提供することができる。該ヘルパープラスミドは、パッケージングメカニズムがカプセル化のためのＲＮＡ転写体を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠く。かくして、ゲノムはパッケージされないので、ヘルパー細胞系は空のビリオンを生じる。適当なヘルパー細胞系は、限定されるものではないが、ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含む。もしパッケージングシグナルが無傷であるが、構造遺伝子が他の注目する遺伝子によって置き換えられているそのような細胞にレトロウイルスベクターが導入されれば、該ベクターをパッケージし、ベクタービリオンを生じさせることができる。次いで、この方法によって生じたベクタービリオンを用いて、ＮＡＩＨ ３Ｔ３細胞のごとき組織細胞系を感染させ、大量のキメラレトロウイルスビリオンを生じさせることができる。
本発明のベクターは、当業者に広く利用できる標準的な組換え技術を用いて構築することができる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のごとき通常の分子生物学文献に見出すことができる。
標的細胞内でのＡＢＣ１ポリヌクレオチドの転写を得るためには、標的細胞中で遺伝子発現を駆動することができる転写調節領域が利用されなければならない。転写調節領域は、好ましくは、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターはＡＢＣ１遺伝子に対して同種または異種とすることができ、ただし、それは、当該構築体が挿入されるであろう細胞もしくは組織−タイプで活性なものとする。選択された転写調節領域は標的細胞において高レベルの遺伝子発現を駆動すべきである。好ましくは、スカベンジャー受容体Ａ型、マトリックスメタロプロテイナーゼプロモーター（ＭＭＰ−１２）、またはマクロファージ向性レンチウイルスプロモーターのごときマクロファージ−特異的プロモーター（Ｆａｂｕｎｍｉら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４８：３７５−３８６（１９９９））を用いる。特に好ましいプロモーターはスカベンジャー受容体Ａ型遺伝子の５’領域であり、これは、ＡＢＣ１遺伝子の転写を駆動するのに用いることができる強力なマクロファージプロモーターを含有する。加えて、細胞において内因性ＡＢＣ１ポリペプチドの発現を増加させるための手段は、プロモーター領域に１以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここに、エンハンサーエレメントはＡＢＣ１遺伝子の転写活性を増加させるように働くことができる。同様に、使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子をそこで活性化させることを望む組織に基づいて選択される。かくして、例えば、動脈組織、特にマクロファージ細胞で見出される細胞中でプロモーター活性化を付与することが知られているエンハンサーエレメントが選択されるであろう。本発明で用いるのに適した他の転写調節領域は、限定されるものではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型−初期エンハンサー（プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧＫ、およびＣＭＶエンハンサーにカップリングしたα−アクチンプロモーターを含む（Ｄｏｌｌ，Ｒ．，ら、１９９６、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３（５）：４３７−４７）。
ベクター構築体の他の構成要素は、所望により部位−特異的組込のために設計されたＤＮＡ分子（例えば、同種組換えで有用な内因性配列）、組織−特異的プロモーター、親細胞よりも優れた選択利点を供することができるＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、（細胞標的化のための）細胞特異的結合剤、細胞−特異的内部化因子、ベクターからの発現を増強させる転写因子、およびベクターの生産を可能とする因子を含むことができる。
ひとつの実施形態において、ベクターは、部位−特異的組込のための標的化ＤＮＡを含むことができる。標的化ＤＮＡは、注目する遺伝子、例えば、ＡＢＣ１遺伝子の領域に対して相補的（同種）であるヌクレオチド配列である。同種組換えを通じて、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的化ＤＮＡに結合させることによってＡＢＣ１遺伝子に向けることができる。挿入のためのＤＮＡ配列は、例えば、ＡＢＣ１ポリペプチド、例えば、フランキング配列の発現と相互作用し、またはそれを制御することができるＤＮＡの領域を含む。かくして、所望のＡＢＣ１ポリペプチドの発現は、ＡＢＣ１ポリペプチドの転写のための認識可能なシグナルを持つ内因性遺伝子配列を供するＤＮＡ調節セグメントとカップリングした標的化ＤＮＡの使用によるよりも、ＡＢＣ１遺伝子それ自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによって達成される（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７（１９９４）；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００（１９９３））。
さらに他の実施形態において、標的細胞におけるＡＢＣ１遺伝子の制御された発現のために調節エレメントを含ませることができる。そのようなエレメントは、適当なエフェクターに応答してスイッチが入る。このように、治療ＡＢＣ１ポリペプチドは望まれる場合に発現させることができる。ひとつの慣用的な制御手段は、ＤＮＡ−結合蛋白質または転写活性化蛋白質のごとき、小分子−結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含有するキメラ蛋白質をダイマー化するための小分子ディメライザーまたはラパログの使用を含む（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９参照）。蛋白質のダイマー化を用いて、トランスジーンの転写を開始させることができる。もう１つの適当な制御手段または遺伝子スイッチは、プロゲステロンアンタゴニストであるミフェプリストン（ＲＵ４８６）の使用を含む。プロゲステロンアンタゴニストに対する修飾されたプロゲステロン受容体リガンド−結合ドメインの結合は、次いで、核に通過してＤＮＡをＤＮＡに結合する２つの転写因子のダイマーを形成することによって転写を活性化させる。リガンド−結合ドメインは、天然リガンドに結合する受容体の能力を排除するように修飾される。修飾されたステロイドホルモン受容体系はさらに米国特許第５、３６４、７９１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載されている。さらにもう１つの制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン−制御可能トランスアクチベーターを用いる。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結した突然変異ｔｅｔリプレッサー蛋白質（ＤＮＡ−結合ドメイン（逆テトラサイクリン−調節トランスアクチベーター蛋白質がもたらされる、すなわち、それがテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する突然変異ｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸変化）を含む。そのような系は米国特許第５、４６４、７５８号、第５、６５０、２９８号および第５、６５４、１６８号に記載されている。さらなる発現制御系および核酸構築体は米国特許第５、７４１、６７９号および第５、８３４、１８６号に記載されている。
ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するウイルス送達ベクターは、それが、標的細胞に見出されるもう１つの分子に特異的なリガンドを含有するようにウイルスコートを変化させることによって標的特異的とすることができる。これは、ベクターが所望の細胞型に結合するのを可能とする。該リガンドは、細胞−表面受容体のごとき、標的細胞で見出される分子に特異的に結合する注目するいずれの化合物でもあり得る。好ましくは、受容体は専ら標的細胞で見出され、他の細胞では見出されない。例えば、スカベンジャー受容体Ａに対するリガンドを用いて、ウイルス送達ベクターをマクロファージ細胞に向けることができる。別法として、それが、標的細胞上の抗原性エピトープを認識しそれに結合するＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2のごとき抗体または抗体断片を含有するようにウイルスコートを変化させることができる。ウイルスコートは、リガンドをコートするさらなるポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入することによって変化させることができる。当業者であれば、ウイルスゲノムに挿入して、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するベクターの標的特異的送達を可能とすることができる他の特異的ポリヌクレオチド配列を知っている。
前記したもののごとき、加えて、裸のＡＢＣ１ポリヌクレオチドを投与することができる。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび組換えＡＢＣ１発現ベクターは医薬組成物として投与することができる。そのような組成物は、ここに先に定義した効果的な量のＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１発現ベクター、および投与の形態でもって適当性で選択された医薬上許容される処方剤を含む。適当な処方材料は、好ましくは、使用される濃度において受容者に非毒性であり、これは後記する。
ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１組換え発現ベクターを含む医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出、吸着または浸透の速度を修飾し、維持し、または保持するための処方材料を含有することができる。適当な処方材料は、限定されるものではないが、（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのごとき）アミノ酸、抗微生物剤、（アルコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのごとき）抗酸化剤、（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸のごとき）緩衝液、（マンニトールまたはグリシンのごとき）増量剤、（エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき）キレート化剤、（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンのごとき）複合体化剤、充填剤、単糖、二糖および（グルコース、マンニトールまたはデキストリンのごとき）他の炭水化物、（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのごとき）蛋白質、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、（ポリビニルピロリドンのごとき）親水性ポリマー、低分子量ポリペプチド、（ナトリウムのごとき）塩−形成対イオン、（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素のごとき）防腐剤、（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのごとき）溶剤、（マンニトールまたはソルビトールのごとき）糖アルコール、懸濁化剤、（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のごときポリソルベート；トリロン；トロメタニン；レチシン；コレステロールまたはチロキサファルのごとき）界面活性剤または湿潤剤、（スクロースまたはソルビトールのごとき）安定性増強剤、（アルカリ金属ハライド（好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム−またはマンニトール、ソルビトールのごとき）等張性増強剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントを含む。Ｒｅｍｉｎｇｏｔｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）参照。
医薬上活性な化合物（すなわち、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１ベクター）は、製薬の通常の方法に従って加工して、ヒトおよび他の哺乳動物を含めた患者への投与のために医薬剤を生産することができる。かくして、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１組換え発現ベクターを含む医薬組成物は（顆粒、粉末または坐薬を含めた）固体形態または液体形態（例えば、溶液、懸濁液またはエマルジョン）で作成することができる。経口投与のための固体投与形態はカプセル剤、錠剤、丸剤、粉末および顆粒を含むことができる。そのような固体投与形態では、活性化合物はスクロース、ラクトースまたは澱粉のごとき少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができる。そのような投与形態は、通常のプラクティスにおいて、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤を含むことができる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、投与形態は緩衝化剤を含むこともできる錠剤および丸剤は、加えて、腸溶コーティングを施して調製することができる。
経口または非経口投与のための液体投与形態は、医薬上許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル（水のごとき当該分野で通常用いられる不活性希釈剤を含有）を含有する。そのような組成物は湿潤化剤、甘味剤、香味剤、および香料剤を含むこともできる。例えば、注射用の適当な担体は、恐らくは、非経口投与のための組成物に通常の他の物質を補足した水、生理食塩水または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水はさらなる例示的担体である。他の例示的な医薬組成物は約ｐＨ７．０ー８．５のトリス緩衝液、約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、これは、さらにソルビトールまたは適当な代替物を含むことができる。
ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターを含む組成物で心血管病を治療する投与法は、心血管病のタイプ、患者の年齢、体重、性別および医学的状態、病気の酷さ、投与の経路および使用する特定の化合物を含めた種々の因子に基づく。かくして、投与法は広く代わり得るが、標準的な方法を用いルーチン的に決定することができる。例えば、投与すべきＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターの量は、哺乳動物対象の細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量である。そのような量は、例えば、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターの投与の前および後に対象の血漿ＨＤＬ−コレステロールレベルを測定することによって決定することができる。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１発現ベクターの十分な量は、対象の血漿ＨＤＬ−コレステロールレベルを増加させる量である。従って、臨床家は投与量を決め、投与経路を修飾して最適な治療効果を得ることができる。典型的な投与量は、前記した因子に基づき、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。
投与の頻度は、使用すべき処方におけるＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベクターの薬物動態学パラメーターに依存するであろう。典型的には、所望の効果を達成する投与量に到達するまで、臨床家は組成物を投与するであろう。従って、該組成物は、経時的に単一用量として、（所望の分子の同一量を含有してもまたはしなくてもよい）２または以上の用量にて、または異色デバイスまたはカテーテルを介する連続的注入として投与することができる。適当な投与量のさらなる工夫は当業者によってルーチン的になされ、それは当業者によってルーチン的になされる仕事の範囲内のものである。適当な投与量は、適当な用量−応答データを用いることによって確認することができる。
哺乳動物対象の細胞はイン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・ビトロにてトランスフェクトすることができる。イン・ビボにての、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターの標的細胞への投与は、当業者に知られた種々の技術のうちのいずれかを用いて達成することができる。例えば、米国特許第５、６７２、３４４号は、組換え神経栄養ＨＳＶ−１ベクターを含むイン・ビボウイルス−媒介遺伝子導入系を記載する。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよび組換えＡＢＣ１ベクターの前記組成物は、経口、口腔内、非経口、直腸または局所投与によって、並びに吸入スプレイによってイン・ビボにてトランスフェクトすることができる。本明細書中で用いる用語「非経口」は皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入技術または腹腔内を含む。
経口投与では、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、懸濁液または液体の形態とすることができる。医薬組成物は、好ましくは、与えられた量のＤＮＡまたはウイルスベクター粒子を含有する投与単位の形態で作成する。例えば、これらは約１０3−１０15ウイルス粒子、好ましくは約１０6−１０12ウイルス粒子の量を含有することができる。ヒトまたは他の哺乳動物についての適当な日用量は、患者の状態および他の因子に応じて広く変化させることができるが、再度、ルーチン的方法を用いて決定することができる。
また、ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物は直腸投与することもできる。ベクターの直腸投与用の適当な坐薬は、常温では固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解し、ベクターを放出するカカオバターおよびポリエチレングリコールのごとき適当な非−刺激性賦形剤とベクターとを混合することによって調製することができる。
医薬組成物は吸入用に処方することもできる。例えば、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベクターは吸入用の乾燥粉末として処方することもできる。また、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベクター吸入溶液は、エアロゾル送達のためのプロペラントを用いて処方することができる。さらにもう１つの実施形態において、溶液は霧化することもできる。
ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物は注射することもできる。滅菌注射水性または油性懸濁液のごとき注射製剤は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用い、公知の方法に従って処方することができる。滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液とすることもでき、例えば、１、３−ブタンジオール中の溶液とすることができる。非経口注射用の特定の適当な担体は、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたはベクターを、適切に保存された滅菌等張溶液として処方される滅菌蒸留水である。使用することができる許容される担体および溶媒の中にはリンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油が、便宜には、溶媒または懸濁化媒体として使用される。この目的では、合成モノ−またはジグリセリドを含めたいずれの温和な不揮発性油も使用することができる。加えて、オレイン酸のごとき脂肪酸は注射剤の調製で用いることができる。さらにもう１つの製剤は、注射マイクロスフィア、生分解性粒子、ポリマー化合物、ビーズまたはリポソームのごとき剤での所望のＡＢＣ１分子の処方を含むことができ、これはＡＢＣ１製品の制御されたまたは保持された放出を提供する（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）参照）。
また、ＡＢＣ１ ＤＮＡまたは組換えＡＢＣ１ベクターを含有する医薬組成物は局所投与することができる。局所投与では、ベクターは処方の０．００１％ないし１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％ないし２重量％を含むことができるが、それは処方の１０％ｗ／ｗもと多くを、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、より好ましくは０．１％ないし１％を含むことができる。局所投与に適した処方は、皮膚を通じる浸透に適した液体または半液体製剤（例えば、リニメント、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および目、耳または鼻への投与に適した点剤を含む。本発明のベクターの有効成分の適当な局所用量を毎日１ないし４回、好ましくは、２回または３回投与する。
本発明の核酸および／またはベクターは唯一の活性な医薬剤として投与することができるが、それは本発明または他の剤の１以上のベクターと組み合わせて用いることもできる。組合せとして投与する場合、治療剤は、同一回数または異なる回数投与される別々の組成剤として処方されることができるか、あるいは治療剤は単一の組成物として投与することができる。
本発明のもう１つの実施形態において、標的細胞は標的細胞集団に隣接する「プロジューサー細胞系」の異色によってイン・ビボでトランスフェクトされる（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，ら，１９９４，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５（３）：３４３−７９；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５９：６８５−９０；Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４（１９：３９−６９）。該プロジューサー細胞系は、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを生産し、標的細胞、すなわち、好ましくは、アテローム性動脈硬化症病巣に見出されるマクロファージ細胞に近接してそのウイルス粒子を放出するように作成される。放出されたウイルス粒子の一部は標的マクロファージ細胞と接触し、その細胞に感染し、かくして、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを標的マクロファージ細胞に送達する。標的細胞の感染に続き、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドの発現が起こり、マクロファージ細胞に機能的ＡＢＣ１蛋白質を与える。
もう１つの実施形態において、本発明は、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１発現ベクターのＸ・ビボ導入によって心血管病を治療する方法を提供する。そのような例において、患者から摘出された細胞、組織または器官をＡＢＣ１組成物に暴露し、しかる後、細胞、組織または器官を引き続いて患者に戻して移植する。例えば、１つの方法は、心血管病を持つ対象から血液試料を摘出し、該試料を単球が豊富となるようにし、単離された単球を、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターおよび、所望により、標的特異的遺伝子と接触させることを含む。所望により、単球細胞をＧＭ−ＣＳＦのごとき成長因子で処理して、対象へ再び細胞を導入する前に細胞増殖を刺激することもできる。再び導入すれば、当該細胞は、それが元来そこから単離された細胞集団を特異的に標的化する。このように、ＡＢＣ１ポリペプチドの輸送活性を用いて、対象においてコレステロール流出を促進することができる。
Ｘ・ビボ投与のもう１つの方法は、ウイルスを含有する細胞の皮膚移植によって、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドまたは組換えＡＢＣ１ベクターを哺乳動物対象に導入することを含む。好ましくは、レトロウイルスをこの投与方法で用いる。もし強力なハウスキーピング遺伝子プロモーターを用いて転写を駆動するならば、繊維芽細胞起源の細胞を用い、インプラントにおける外来性遺伝子の長期発現を達成することができる。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子プロモーターを用いることができる。繊維芽細胞のごとき細胞を、スカベンジャーＡのごとき特異的標的化を可能とする遺伝子、および強力なプロモーターと共にＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含有するレトロウイルス構築体を含有するビリオンで感染させることができる。感染した細胞を、受容者対象中の真皮の結合組織に移植することができるコラーゲンマトリックスに埋めることができる。レトロウイルスが増殖し、マトリックスから逃げるにつれ、それは標的細胞集団を特異的に感染するであろう。このようにして、移植の結果、輸送障害を呈する細胞においてコレステロール流出活性の増加した量がもたらされる。
もう１つの実施形態において、米国特許第５、３９９、３４６号に記載されているごとく、ＡＢＣ１ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをイン・ビトロ技術を用いて投与することができる。例えば、ここに記載するもののごとき方法を用い、遺伝子工学により作成したある種の細胞を移植することによって、ＡＢＣ１ポリペプチドを送達してＡＢＣ１ポリペプチドを発現させることができる。外来性種のポリペプチドの投与で起こり得るごとき、ＡＢＣ１ポリペプチドを投与すべき患者において潜在的な免疫反応を最小化するためには、ＡＢＣ１ポリペプチドを生産する天然細胞はヒト起源であり、ヒトＡＢＣ１ポリペプチドを生産するのが好ましい。かくして、ＡＢＣ１ポリペプチドを生産する組換え細胞は、ヒトＡＢＣ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換するのが好ましい。該細胞はオートロガスまたはヘテロガスであり得る。所望により、細胞は不死化することができる。免疫応答の機会を減少させるためには、細胞をカプセル化して周囲の組織の侵入を回避することができる。カプセル化材料は、典型的には、蛋白質産物の報酬を可能とするが、患者の免疫系による、または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性の半浸透性ポリマーの容器または膜である。前記した方法を用い、トランスフェクトされた細胞を患者に投与することができる。
生細胞のカプセル化のための技術は当該分野で知られており、カプセル化細胞の調製および患者におけるその移植はルーチン的に達成することができる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら、（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための遺伝子工学作成細胞を含有する膜カプセルを記載する。該カプセルは生体適合性であって、容易に回収することができる。該カプセルは、哺乳動物宿主への移植に際してイン・ビボで下降調節に付されないプロモーターに作動可能に連結した生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。該デバイスが、受容者内の特異的な部位への、生細胞からの分子の送達を可能とする。加えて、米国特許第４、８９２、５３８号；第５、０１１、４７２号；および第５、１０６、６２７号参照。生細胞をカプセル化するためのシステムはＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら，１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら，１９９２，ＡＳＡＩＯ３８：１７−２３参照。
ＡＢＣ１をコードするポリヌクレオチドのためのもう１つの送達系は「非ウイルス」送達系である。遺伝子治療で用いられるかまたは提案されている技術はＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接的注入、ＣａＰＯ4沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびコロイド分散を含む（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０（５１１０）：９２６−３２）。これらの方法のいずれも当業者に広く利用でき、本発明で用いるのに適当であろう。他の適当な方法は当業者に利用可能であり、本発明はトランスフェクションの利用可能な方法のいずれを用いても達成できると理解されるべきである。いくつかのそのような方法は当業者に利用されており、種々の程度の成功をおさめている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０（５１１０）：９２６−３２）。
好ましくは、非ウイルス送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系はマクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質−ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームであり、これはイン・ビトロおよびイン・ビボにて送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。リポソームは自己組立性のコロイド粒子であり、ここに、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンのごとき両親媒性分子より構成される脂質二層が、該脂質二層が親水性内部を囲むように周囲の媒質の一部をカプセル化する。単一ラメラまたは多ラメラリポソームは、内部が所望の化学物質、薬物、または本発明におけるごとく、単離されたＤＮＡ分子を含有するように構築することができる。例えば、０．２−４．０μｍのサイズの範囲である大きな単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）が、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷ビリオンのごとき大きなマクロ分子を含有する水性緩衝液の実質的パーセンテージをカプセル化できることが示されている。一旦水性内部内にカプセル化されれば、これらのマクロ分子は生物学的活性な形態で哺乳動物細胞に送達することができ（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７−８０）。リポソームが効果的な遺伝子導入ビヒクルとなるためには、以下の特徴が存在すべきである：（１）その生物学的活性を台なしにすることなく高効率で注目する遺伝子をカプセル化すること；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合すること；（３）高効率で標的細胞の細胞質に小胞の水性内容物が送達されること；および（４）遺伝的情報が正確かつ効果的に発現されること（Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．ら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６（７）：６８２−９０）。
リポソームの組成物は、通常、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わされた、リン脂質、特に高い相転移温度リン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特徴はｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームの生産で有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドのごときホスファチジル化合物を含む。特に好ましいのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここに、脂質部位は１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している。例示的なリン脂質は卵ホスファチジルコリン、ジパルミトリルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
リポソームの標的化は解剖学的および機械的要因に基づいて分類されている。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば、器官−特異性、細胞−特異性およびオルガネラ−特異性に基づく。機械的標的化は、それが受動的または能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的化は洞様毛細血管を含有する器官中の細網内皮細胞系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利用する。他方、能動的標的化は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、糖、糖脂質または蛋白質のごとき特異的リガンドにリポソームをカップリングさせることによって、あるいはリポソームの組成またはサイズを変化させて局所化の天然に起こる部位以外の器官および細胞型への標的化を達成することによって、リポソームを改変することを含む。好ましくは、該リガンドは、リポソームを特異的細胞−表面リガンドに標的化するのに用いることができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。該リガンドは、それが標的細胞上の抗原性エピトープに効果的に結合する限り、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2のごとき抗体断片とすることもできる。好ましくは、抗体または抗体断片は、標的細胞に専ら見出される抗原を認識する。例えば、スカベンジャー受容体Ａのごとき、マクロファージ細胞上に特異的に発現されるある種の抗原は、抗体−ＡＢＣ１リポソームを直接的にマクロファージ細胞に標的化する目的で開発することができる。
多数の手法を用いて、リポソーム二層にポリクローナルもしくはモノクローナル抗体いずれかを共有結合させることができる。また、脂質基をリポソームの脂質二層に取り込んで、リポソーム二層と安定に会合した標的化リガンドを維持することができる。加えて、脂質鎖を標的化リガンドに接合するのに種々のリンキング基を用いることができる。
ここに示す研究は、核受容体に対するリガンドがコレステロール流出の増加を行うことができるのを示した。従って、もう１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物対象における細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量にて核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法を提供する。医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用い、核受容体に対するリガンドを含む医薬組成物を調製しそれを投与することができる。核受容体リガンドの十分な量はコレステロール流出を増加させるリガンドの量である。そのような量は、種々の投与量のリガンドの投与の前および後にコレステロールの流出を測定し、コレステロール流出の増加を行う用量を決定することによって決定することができる。コレステロール流出はさきに記載したアッセイを用いて測定することができる。
核受容体は、小さな親油性ホルモンの効果を転写応答に導入することによって、脊椎動物の発生および成体生理学において臨界的な役割を演じるリガンド−活性化転写因子である。ペルオキシソームプロリフェレーター−活性化受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、およびステロイドおよび生体内異物受容体（ＳＸＲ）を含めた核受容体のいくつかのファミリーが存在する。該ＰＰＡＲファミリーは、３つの密接に関連する遺伝子産物ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲβ／δを含む。ＰＰＡＲσは細胞内および細胞外脂質代謝の鍵となるレギュレーターとして示されてきた。脂肪酸に結合すると、ＰＰＡＲαはペルオキシソームの増殖を刺激し、脂肪酸のβ−酸化に関与するいくつかの酵素の合成を誘導する。また、ＰＰＡＲα受容体はフィブレート、高いトリグリセリドレベルの低下につき処方された薬物に対する分子標的でもある（Ｉｓｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３４７，６４５（１９９０））。フィブレートは、リポ蛋白質および脂肪酸の代謝に影響する非常に多数の遺伝子の転写を調節するＰＰＡＲリガンドとして作用する。加えて、チアゾリジンジオン化合物のクラスに属する化合物のごときＰＰＡＲγリガンドはＨＤＬを増加させ、ヒトにおいてトリグリセリドレベルを低下させることが示されている。
ＬＸＲは、過剰コレステロールの異化を調節するオキシステッロール受容体である。ＬＸＲαは、コレステロールの胆汁酸への変換で律速工程を担う酵素をコードするＣＹＰ７ａ遺伝子中のＤＮＡ応答エレメントに、ＲＸＲを持つヘテロダイマーとして結合することが示されている。研究は、ダイエットコレステロールに応答してＣＹＰ７ａ遺伝子の転写を増加させることができないため、コレステロール−リッチなダイエットを摂取した場合、ＬＸＲαを欠くマウスは膨大な量のコレステロールエステルをその肝臓に蓄積することを示してｉｒｕ（Ｐｅｅｔら，Ｃｅｌｌ，９３：６９３（１９９８））。ＬＸＲαナルマウスでのさらなる研究は、コレステロールおよび脂肪酸のホメオスタシスに参画するいくつかの他の遺伝子の調節にもＬＸＲαが関与することを示す。いくつかの組織において発現され、ＬＸＲαと同一のオキシステロールによって活性化される密接に関連する核受容体ＬＸＲβの生物学的役割は依然として明らかでない（Ｓｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：１０８０９（１９９４）；Ｓｅｏｌ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｎｏｌ．，９：７２（１９９５））。
革命的にＬＸＲαに関連するＦＸＲもまたコレステロールのホメオスタシスに関与する。ＬＸＲαと同様に、ＦＸＲはＲＸＲ受容体とのヘテロダイマーとして機能する（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，９：１１３（１９９８）；Ｖｌａｈｃｅｖｉｃら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１３：１９４９（１９９７））。ＦＸＲは、合成レチノイドＴＴＮＰＢおよび超生理学的濃度の全てのトランスレチノイン酸によって活性化される（Ｘａｖａｃｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：７０−０（１９９７））。最近の研究は、ＦＸＲが核胆汁酸受容体であることを示す。まず、ＦＸＲは、肝臓、腸および腎臓を含めた胆汁酸がそれを通って循環する組織で豊富に発現される（Ｓｅｏｌら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９：７２（１９９５）；Ｆｏｒｍａｎら，Ｃｅｌｌ，８１：６８７（１９９５））。また、ＦＸＲは、最近、そのうちケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）が最も優れている生理学的濃度のいくつかの胆汁塩に対する受容体として働くことが示されている（Ｋｌｉｅｗｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：７５７−２８４（１９９９）；Ｍａｋｉｓｈｉｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１３６２−１３６３（１９９９））。ＣＤＣＡは、ＣＹＰ７ａおよび腸胆汁酸−結合蛋白質をコードするものを含めた、胆汁塩のホメオスタシスに参画するいくつかの遺伝子の発現を調節することが知られている。
実施例１３に詳細に記載するごとく、ＬＸＲ、ＲＸＲおよびＰＰＡＲ核受容体に対するリガンドが、コレステロール−負荷マウスマクロファージ細胞においてアポＡＩ−誘導コレステロール流出を増加させることが示された。例えば、９シス−レチノイン酸（３０ｎｇ／ｍｌ）の投与は、これらの細胞においてアポＡＩ−誘導コレステロール流出のほぼ三倍増加を生じた。同様に、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール（５μ／ｍｌ）の投与は、アポＡＩ−誘導コレステロール流出のほぼ３倍増加を生じた。フェンフィブレート（３μｇ／ｍｌ）を摂取した細胞は、コレステロール流出のほぼ２倍増加を生じた。これらの結果は、核受容体を変調させて、マクロファージからのアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることを示す。さらに、実施例１３に記載されているごとく、９−シス−ＲＡは、用量依存的にマクロファージ細胞からのコレステロール流出を媒介した。ベンザフィブレートのごとき他の核受容体アクチベータはコレステロール流出を増加させることが示された（データは示さず）。
従って、核受容体リガンドを投与することによってコレステロール流出を増加させる方法において、リガンドは、好ましくは、ＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳＸＲ核受容体リガンドよりなる群から選択される。ＬＸＲリガンドを用いてコレステロール流出を増加させる好ましい実施形態において、リガンドは、より好ましくは、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、および２４（Ｓ）、２５エポキシコレステロールＬＸＲリガンドよりなる群から選択される。最も好ましくは、ＬＸＲリガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールである。ＲＸＲリガンドを用いてコレステロール流出を増加させる好ましい実施形態において、リガンドは、より好ましくは、９−シスレチノイン酸、レチノール、レチナール、オール−トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、アシトレチン、フェンレチニド、エトレチネート、ＣＤ４９５、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴＡＢ、ＬＤＧ１０６９よりなる群から選択される。最も好ましくは、該ＲＸＲリガンドは９−シスレチノイン酸である。ＰＰＡＲリガンドを用いてコレステロール流出を増加させるもう１つの好ましい実施形態において、リガンドは、好ましくは、チアゾリジンジオン化合物のクラスから選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、１を超える核受容体リガンドが哺乳動物対象に投与されて、コレステロール流出を増加させる。好ましくは、２以上の核受容体リガンドを対象に投与する場合、リガンドはＬＸＲおよびＲＸＲリガンドである。より好ましくは、核受容体リガンドは２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールおよび９−シスレチノイン酸である。
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量でエイコサノイドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象において、細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法を提供する。医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用い、エイコサノイドを含む医薬組成物を調製し、投与することができるエイコサノイドの十分な量は、コレステロール流出を増加させる量である。そのおうな量は、種々の投与量エイコサノイドの投与前および後にコレステロール流出を測定し、コレステロール流出の増加を行う用量を測定することによって決定することができる。コレステロール流出は前記したアッセイおよび方法を用いて測定することができる。
実施例１４に記載されたごとく、エイコサノイドは、コレステロール−負荷マウスマクロファージ細胞におけるアポＡＩ−誘導コレステロール流出を増加させることが示された。例えば、ＰＧＩ２（２５ｎｍ）の投与は、これらの細胞においてアポ−誘導コレステロール流出のほぼ２倍増加を生じさせた。同様に、ＰＧＥ１（ｎＭ）の投与はアポＡＩ−誘導コレステロール流出のほぼ３倍増加を生じさせた。これらの結果はエイコサノイドが、マクロファージからのアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができることを示す。従って、好ましい実施形態において、エイコサノイドはプロスタグランジンＥ２、プロスタサイクリン（プロスタグランジンＩ２）およびプロスタグランジンＪ２エイコサノイドよりなる群から選択される。
（ＡＢＣ１発現／活性を増加させるための方法と化合物））
コレステロール流出を促進するようにＡＢＣ１が機能するとすれば、コレステロール流出を増加させる１つの方法はＡＢＣ１の細胞発現を増加させることである。従って、本発明は、哺乳動物対象における細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させる化合物の治療量を哺乳動物対象に投与することによって、該細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法を提供する。化合物の治療量は、ＡＢＣ１発現を増加させる化合物の量である。そのような量は、種々の投与量の化合物の投与前および後にＡＢＣ１の遺伝子発現を測定し、ＡＢＣ１遺伝子発現の増加を行う用量を測定することによって決定することができる。ＡＢＣ１遺伝子の発現は、対象から血液試料を得、単球集団を分離し、ＲＴ−ＰＣＲのごとき、当該分野で知られここに記載した方法を用いてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの濃度を測定することによって測定することができる。
１つの好ましい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰアナログを投与してＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させることを含む。図８に示すごとく、ｃＡＭＰは、正常な繊維芽細胞においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの発現をほぼ１０倍増加させる。好ましくは、ｃＡＭＰアナログは、８−ブロモｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰおよび８−チオメチルｃＡＭＰよりなる群から選択される。もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰの合成を増加させて、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増大させることを含む。好ましくは、該化合物はフォルスコリンである。さらにもう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ｃＡＭＰの分解を阻害して、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させる化合物を投与することを含む。そのような化合物の例はホスホジエステラーゼ阻害剤である。好ましくは、ホスホジエステラーゼ阻害剤はロリプラム、テオフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Ｒ０２０−１７２４、ビンポセチン、ザプリナスト、ジピリダモール、ミルリノン、アムリノン、ピモベンダン、シロスタミド、エノキシモン、ペルオキシモン、およびベスナリノンホスホジエステラーゼ阻害剤よりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、該方法は、ＡＢＣ１の遺伝子発現を増加させるのに十分な量にて核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与することを含む。実施例１７に記載され、図１２に示されるごとく核受容体に対するリガンドはＡＢＣ１の遺伝子発現を上昇調節できる。ＡＢＣ１プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するｐＡＰＲ１を用いるトランスフェクション実験は、ＡＢＣ１プロモーターが、ＬＸＲおよびＲＸＲ核受容体に対するリガンドの存在下で活性化されることを示した。具体的には、ｐＡＰＲ１でトランスフェクトされたマクロファージ細胞は、２０ＯＨ−コールの存在下でルシフェラーゼレポーター活性の１９倍増加、９−シスＲＡの存在下でルシフェラーゼ活性の１６倍増加、およびＥｔＯＨ対照と比較して双方のリガンドの存在下でルシフェラーゼ活性の２８０倍増加を生じた。結果は、ステロールおよびレチノイドが共にＡＢＣ１プロモーターからの強力な転写応答を誘導することを示す。さらに、双方のリガンドで処理した細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の劇的な増加によって理解されるごとく、二つのクラスの化合物の間には明らかな相乗効果がある。本発明の方法によると、好ましくは、リガンドはＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳＸＲリガンドよりなる群から選択される。
ＡＢＣ１蛋白質の細胞レベルの増加に加えて、ＡＢＣ１蛋白質の活性を増強することによって、逆コレステロール輸送を促進することができる。かくして、もう１つの実施形態において、本発明は、コレステロール流出を増加させるのに十分な量にてＡＢＣ１活性を増加させる化合物の治療量を哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象において細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法を提供する。そのような化合物を含む医薬組成物は、医薬組成物を処方しそれを投与する前記方法を用いて調製し、それを投与することができる。化合物の治療量は、コレステロール流出を増加させる化合物の量である。そのような量は、種々の投与量の化合物の投与の前および後にコレステロール流出を測定し、先に記載した方法を用いてコレステロール流出の増加を行う用量を測定することによって決定することができる。コレステロール流出の増加がＡＢＣ１活性の増加によるか否かを判断するために、化合物の投与の前および後に細胞試料に存在するＡＢＣ１蛋白質の量をここに記載する方法を用いて測定する（実施例１１参照）。双方の測定（すなわち、化合物の投与前および投与後）につき、コレステロール流出活性の量をＡＢＣ１蛋白質の濃度で割って、ＡＢＣ１蛋白質の標準的な濃度で見出されるコレステロール活性の量を決定する。蛋白質濃度に対して標準化されたコレステロール活性の観察された増加は、該増加がＡＢＣ１活性の増加によるものであることを示す。
（治療用化合物を同定するための方法）
本発明のもう１つの態様は、化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を変調する（すなわち、上昇調節または下降調節）するか否かを判断するために化合物をスクリーニングする方法に関する。そのような化合物は、ＡＢＣ１発現を増加させ、それにより、コレステロール流出を促進し、ＨＤＬ−コレステロールの血中レベルを上昇させる治療用化合物の開発で有用であろう。従って、心血管病の治療で有用であり得る化合物を同定する方法が提供される。１つの実施形態において、本発明は、（ａ）哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分とレポーターｃＤＮＡを作動可能に連結させて、組換えレポーター構築体を生じさせ；（ｂ）組換えレポーター構築体を宿主細胞の集団にトランスフェクトし；（ｃ）トランスフェクトされた宿主細胞の試料においてレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；（ｄ）トランスフェクトされた細胞を、スクリーニングすべきテスト化合物と接触させ；（ｅ）テスト化合物との接触の後にトランスフェクトされた宿主細胞の試料におけるレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイし；次いで、（ｆ）テスト化合物への暴露によって引き起こされたレポーター遺伝子発現のレベルの相対的変化を比較し、それにより、ＡＢＣ１発現変調活性を決定する工程を含むことを特徴とするＡＢＣ１発現変調活性につきテスト化合物をスクリーニングする方法を提供する。
まず、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結した異種レポーター遺伝子を含む組換えレポーター構築体を構築する。Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；および Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ＳＯｎｓ（１９９４））を含めた、ここに記載された標準実験室的マニュアルにおけるもののごとき、良く知られた連結およびクローニング技術を用い、ＡＢＣ１発現変調ポリヌクレオチドおよびレポーター遺伝子をベクターに挿入することができる。別法として、ＡＢＣ１発現変調ポリヌクレオチドは、先に記載したもののごとき商業的に入手可能なレポーター構築体に挿入することができる。ＡＢＣ１ポリヌクレオチドおよびレポーター遺伝子の挿入に適したいずれのベクターも用いることができる。選択されたベクターは、使用される特定の宿主細胞で機能すべきである。好ましくは、ベクターは哺乳動物宿主細胞に適合する。
好ましくは、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は、ＡＢＣ１プロモーター活性を含有するＡＢＣ１の５’フランキング領域である。１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３を含む。もう１つの好ましい実施形態において、ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３または１３９４−１５３２を含む。また、好ましくは、異種レポーターは、ルシフェラーゼ、βーガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質をコードするポリヌクレオチドよりなる群から選択される。より好ましくは、異種レポーターは、ルシフェラーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましい実施形態において、組換えレポーター構築体は図１１に示されるｐＡＰＲ１である。
次に、組換えレポーター構築体は宿主細胞の集団にトランスフェクトされる。組換えレポーター構築体は、先に記載されたトランスフェクション方法、並びに実施例８および１５に記載された方法のいずれかを用いて宿主細胞に導入することができる。例えば、レポーター構築体は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、他の公知の記載された方法のいずれかを用いてトランスフェクトすることができる（例えば、（Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）参照）。宿主細胞は、適当な条件下で培養すると、引き続いて測定することができるレポーターポリペプチドを合成するいずれの細胞でもあり得る。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。より好ましくは、哺乳動物宿主細胞はマクロファージ、繊維芽細胞、肝細胞または腸細胞である。より好ましくは、宿主細胞はＲＡＷ２６４．７細胞、Ｔｈｐ−１細胞およびＨｅｐＧ２細胞よりなる群から選択される。レポーター構築体の濃度およびトランスフェクションの持続は、トランスフェクション方法および用いる宿主細胞のタイプおよび濃度に依存して変化させることができる。レポーター構築体の適当な濃度およびトランスフェクション時間の決定は当業者の技量の範囲内のものである。
トランスフェクションに続き、テスト化合物に暴露されなかったトランスフェクト宿主細胞の試料をアッセイして、レポーター遺伝子発現のレベルを測定する。未暴露トランスフェクト宿主細胞の試料で見出されるレポーター遺伝子発現のレベルは対照測定を提供する。トランスフェクトされた宿主細胞を溶解させ、レポーター遺伝子発現のレベルを、当該分野で良く知られた方法のいずれかを用いてアッセイする。レポーター遺伝子発現のレベルを測定するのに用いられるアッセイは、トランスフェクションで用いるレポーター構築体に依存して異なる。例えば、もしルシフェラーゼレポーター構築体を用いれば、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性は、実施例１５に記載されたごとく、ルミノメーターを用いて光単位として測定される。
トランスフェクトされた宿主細胞の異なる試料を、スクリーニングすべきテスト化合物と接触させ、これらの細胞で見出されるレポーター遺伝子発現のレベルを引き続いて測定する。好ましくは、トランスフェクトされた宿主細胞をテスト化合物と約４−４８時間接触させる。より好ましくは、トランスフェクトされた宿主細胞をテスト化合物と約８−３６時間接触させる。なおより好ましくは、トランスフェクトされた宿主細胞をテスト化合物と約２４時間接触させる。未暴露（対照）細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルを測定するのに用いられる同一アッセイを用いて、テスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルを測定すべきである。
最後に、未暴露対照細胞で見出されたレポーター遺伝子の発現のレベルをテスト化合物に暴露された細胞で見出されたレポーター遺伝子発現のレベルと比較して、テスト化合物がＡＢＣ１発現変調活性を有するか否かを決定する。もし双方の細胞試料における遺伝子発現のレベルが同一またはほぼ同一であれば、テスト化合物はＡＢＣ１遺伝子発現を変調しない。対照細胞で見出されたレポーター遺伝子発現のレベルに対するテスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺伝子発現のより高いレベルは、テスト化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を上昇調節することを示す。対照細胞で見出されたレポーター遺伝子発現のレベルに対するテスト化合物に暴露された細胞におけるレポーター遺伝子発現のより低いレベルは、テスト化合物がＡＢＣ１の遺伝子発現を下降調節することを示す。
本発明のもう１つの態様は、化合物がＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促進するか否かを決定するためにテスト化合物をスクリーニングする方法に関する。そのような方法は、（ａ）培養中に維持された哺乳動物細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルをアッセイして、コレステロール流出の対照レベルを決定し、（ｂ）哺乳動物細胞をスクリーニングすべきテスト化合物と接触させ；（ｃ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルをアッセイし；次いで、（ｄ）テスト化合物との接触の後に細胞の試料におけるＡＢＣ１−依存性コレステロール流出のレベルをアッセイし、それにより、テスト化合物が培養中の細胞からのＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促進するか否かを決定することを含む。
培養細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルは、当該分野で知られここに記載した方法を用いて測定することができる（実施例１参照）。培養に維持することができるいずれの哺乳動物細胞を用いてもコレステロール流出を測定することができる。該細胞は一次培養から、または不死化細胞系から由来することができる。便宜のため、実施例１に記載されたごとく、ヒトパピローマウイルス１６のインサート、オンコジーンＥ６およびＥ７、および選択マーカー遺伝子を持つベクターを含有する両種性レトロウイルスでトランスフェクトすることによって細胞を不死化することができる。好ましくは、培養された細胞は繊維芽細胞、マクロファージ、肝細胞または腸細胞である。より好ましくは、培養された細胞はＲＡＷ２６４．７細胞である。
テスト細胞と接触されなかった細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルを測定して、コレステロール流出の対照レベルが得られる。加えて、テスト化合物と接触された哺乳動物細胞の試料におけるコレステロール流出のレベルを測定して、テスト化合物によって影響されたコレステロール流出の量が測定される。また、テスト化合物と接触された哺乳動物細胞の試料におけるＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルを測定して、テスト化合物によって影響されたＡＢＣ１−媒介コレステロール流出の量が測定される。好ましくは、コレステロール流出またはＡＢＣ１−媒介コレステロール流出をアッセイする約８−２４時間前に、細胞をテスト化合物と接触させる。ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルは、結合に際して、ＡＢＣ１の活性を阻害する抗−ＡＢＣ１抗体を用いてアッセイすることができる。別法として、ＡＢＣ１の発現を阻害するアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルをアッセイすることができる。例えば、配列番号：５７を含むアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドを用い、ＡＢＣ１−媒介コレステロール流出のレベルをアッセイすることができる（実施例７参照）。テスト化合物と接触させると同時におよび同一の持続の間、細胞を抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドと接触させるべきである。
もし対照コレステロール流出のレベルが、テスト化合物と接触させた細胞で見出されたコレステロール流出のレベルと同一またはほぼ同一であれば、当該化合物はコレステロール流出を促進しない。コレステロール流出の対照レベルよりも大きいテスト化合物と接触した細胞で見出されたコレステロール流出のレベルの増加は、テスト化合物によって促進されたコレステロール流出の量を示す。テスト化合物単独と接触した細胞で見出されたコレステロール流出およびテスト化合物および抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドと接触した細胞で見出されたコレステロール流出の間の差は、ＡＢＣ１を通じて媒介されたコレステロール流出の量を示す。例えば、もしコレステロール流出の対照レベルが１．０であって、テスト化合物と接触した細胞で見出されたコレステロール流出のレベルが１．１であれば、テスト化合物は１０％だけコレステロール流出を促進する。もしテスト化合物および抗−ＡＢＣ１抗体またはアンチセンスＡＢＣ１ポリヌクレオチドと接触した細胞で見出されたコレステロール流出が１．０であれば、テスト化合物によって引き起こされたコレステロール流出の増加は全くＡＢＣ１−媒介される。
（冠動脈心臓病に対する罹患性を検出する方法）
また、本発明は、ヒト対象を含めた哺乳動物対象においてＡＢＣ１遺伝子または蛋白質の発現の比較レベルを検出する方法に関する。コレステロール流出におけるＡＢＣ１の役割を仮定すれば、ＡＢＣ１遺伝子または蛋白質発現のあらかじめ決定した標準レベルに対する哺乳動物対象におけるＡＢＣ１遺伝子または蛋白質発現の増加したレベルの測定を用いて、該対象における冠心臓病に対する罹患性を示すことができる。従って、本発明は、（ａ）哺乳動物対象からテスト細胞試料を得；（ｂ）テスト細胞試料においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルをアッセイし；次いで、（ｃ）テスト細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルとＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のあらかじめ決定した標準レベルとを比較し、それにより、哺乳動物対象におけるＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベルを検出する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象においてＡＢＣ１遺伝子発現の比較レベルを検出する方法を提供する。
まず、ヒト対象を含めた哺乳動物対象からテスト細胞試料を得る。テスト細胞試料は、単球集団が豊富化された血液試料であり得る。単球は、例えば、細胞サイズ、細胞密度または細胞新和性に基づいて良く知られた細胞分離手法を用いて豊富化することができる。次に、テスト細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルをアッセイする。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のレベルは、実施例２および９においてここに記載した方法を含めた、ｍＲＮＡの調製および検出についての良く知られた方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡの濃度は、逆転写ポリメラーゼ鎖反応、ノーザンブロット分析またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって測定することができる。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ濃度は、テスト細胞試料で見出された全ｍＲＮＡの濃度に対して標準化されるべきである。最後に、テスト細胞試料におけるＡＢＣ１発現を、あらかじめ決定した標準レベルのＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現と比較する。あらかじめ決定した標準レベルのＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現は、哺乳動物対象の代表的な集団から採取した細胞試料で見出されたＡＢＣ１ ｍＲＮＡの平均濃度および分布を測定することによって得ることができ、ここに、哺乳動物対象は、それからテスト細胞試料が得られた対象と同一の種であり、およびここに、哺乳動物対象は冠心臓病、タンジール病、または低ＨＤＬ−コレステロールに関連する他の病気を有さず、（正常範囲内にあるＨＤＬ−コレステロールレベルによって示して）正常範囲内のコレステロール流出活性を有すると考えられる。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のあらかじめ決定した標準レベルに対する哺乳動物対象のテスト細胞試料におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現の減少したレベルの測定を用いて、哺乳動物対象における冠心臓病に対する罹患性を示すことができる。
同様に、ＡＢＣ１蛋白質の減少したレベルの検出を用いて、コレステロール流出に対する減少した能力および冠心臓病に対する罹患性を示すことができる。従って、本発明のもう１つの実施形態は哺乳動物対象においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出する方法を提供する。そのような方法は、（ａ）哺乳動物対象からテスト細胞試料を得；（ｂ）テスト細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量をアッセイし；次いで（ｃ）テスト細胞試料におけるＡＢＣ１蛋白質の量をＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標準量と比較し、それにより、哺乳動物対象におけるＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出する工程を含む。
ＡＢＣ１蛋白質の量は、蛋白質を測定する良く知られた方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。好ましくは、ＡＢＣ１蛋白質の量はイムノアッセイを用いて測定する。１つの実施形態において、ＡＢＣ１蛋白質の量は、（ａ）細胞試料を抗−ＡＢＣ１抗体の集団と接触させ、次いで、（ｂ）細胞試料と会合した抗−ＡＢＣ１抗体を検出することによって測定される。例えば、ＡＢＣ１蛋白質は、実施例１１に記載されたごとくＣ−末端に位置するＫＮＱＴＶＶＤＡＶＬＴＳＦＬＱＤＥＫＶＫＥＳに対応する合成ペプチドに対して生起した抗血清と接触させることができる。抗−ＡＢＣ１抗体は、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫沈殿およびＦＡＣＳを含めた当該分野で知られたいくつかの方法を用いて検出することができ、ここに、該検出は放射能、比色または蛍光標識を用いて達成することができる。細胞試料においてＡＢＣ１蛋白質の量を測定するための１つの好ましい方法は免疫沈殿であり、ここに、ビオチン化ＡＢＣ１蛋白質を抗−ＡＢＣ１抗体と接触させ、結合した抗−ＡＢＣ１抗体をストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて検出する。
テスト細胞試料中のＡＢＣ１蛋白質の量をＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標準量と比較する。ＡＢＣ１蛋白質のあらかじめ決定した標準量は、哺乳動物対象の集団から採取した細胞試料で見出されたＡＢＣ１蛋白質の平均濃度を測定することによって得ることができ、ここに、哺乳動物対象は、それからテスト細胞試料が得られた対象と同一の種であり、およびここに、哺乳動物対象は冠心臓病、タンジール病または低ＨＤＬ−コレステロールに関連する他の病気を有さず、（正常範囲内にあるＨＤＬ−コレステロールレベルによって示して）正常範囲内のコレステロール流出活性を有すると考えられる。
（ＡＢＣ１抗体）
本明細書中で用いるごとく、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、無傷分子、ならびに蛋白質に特異的に結合することができる（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片のごとき）抗体断片を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片は無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に除去され、無傷抗体よりも低い非特異的組織結合を有することができる（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２４，３１６−３２５（１９８３））。かくして、これらの断片、ならびにＦＡＢの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリが好ましい。さらに、本発明の抗体はキメラ、単一鎖およびヒト化抗体を含む。
さらなる実施形態はキメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化バージョンを含む。そのようなヒト化抗体は公知の技術によって調製することができ、該抗体をヒトに投与すると低下した免疫原性の利点を提供する。ひとつの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体はネズミ抗体の可変領域（またはちょうどその抗原結合部位）およびヒト抗体に由来する定常領域を含む。別法として、ヒト化抗体断片はネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠く）可変領域断片を含むことができる。キメラおよびさらに工夫したモノクローナル抗体の生産のための手法はＲｉｅｃｈｍａｎｎら，（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８），Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９，１９８７），Ｌａｒｒｉｃｋら，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９），およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９，Ｍａｙ １９９３）に記載されているものを含む。
抗体を生産するひとつの方法は、トランスジェニックマウスのごとき非−ヒト動物を、配列番号：１を含むポリヌクレオチド、配列番号：１のヌクレオチド２９１−７０７４を含むポリヌクレオチド、または配列番号：１を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドで免疫化し、それにより、記載したポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドに対して向けられた抗体が該動物において創製されることを含む。非−ヒト動物においてヒト抗体を創製するための手法が開発されている。該抗体は部分的にヒトであるか、または好ましくは完全にヒトのものとすることができる。その中に１以上の免疫グロブリン鎖をコードする遺伝物質が導入された（トランスジェニックマウスのごとき）非−ヒト動物を使用することができる。そのようなトランスジェニックマウスは種々の方法で遺伝子的に改変することができる。遺伝子走査の結果、免疫化に際して動物によって生産された少なくともいくつかの（好ましくは、実質的にすべての）抗体において内因性免疫グロブリン鎖を置き換えたヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を得ることができる。トランスジェニック動物を、記載したポリヌクレオチドのいずれかから翻訳されたポリペプチドで免疫化することによって生産された抗体がここに提供される。
１以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が種々の手段で不活化されたマウスが調製されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子はマウスに導入されて、不活化マウス遺伝子を置き換えている。動物で生産された抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質によってコードされたヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を一体化させる。生産のための技術およびかかるトランスジェニック動物の使用の例は、ここに引用して一体化させる米国特許第５、８１４、３１８号、第５、５６９、８２５号および第５、５４５、８０６号に記載されている。
モノクローナル抗体は、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から収穫された脾臓細胞の不死化することによって通常の手法によって生産することができる。通常の手法によって、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生産することができる。
ハイブリドーマ細胞系を生産する方法は、そのようなトランスジェニック動物を、記載されたポリヌクレオチドのひとつから翻訳されたポリペプチドの少なくとも７つの連続アミノ酸残基を含む免疫原で免疫化し；免疫化された動物から脾臓細胞を収穫し；収穫された脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合させ、それにより、ハイブリドーマ細胞を創製し；次いで、記載したポリヌクレオチドの１つから翻訳されたポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を同定する事を含む。そのようなハイブリドーマ細胞系、およびそれから生産されたモノクローナル抗体は本発明に含まれる。ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体は通常の技術によって精製される。
該抗体は、ＡＢＣ１ポリペプチドへの特異的結合に際して、ＡＢＣ１ポリペプチドの活性を阻害することができる。好ましくは、抗体は、結合に際して、ＡＢＣ１ポリペプチドのコレステロール輸送活性を阻害する。そのような抗体は、コレステロール輸送に必須の領域に対応するポリペプチドで非−ヒト動物を免疫化することによって作成することができる。抗体は、記載したコレステロール流出アッセイのいずれかを用いて、それがコレステロール流出を阻害するか否かを判断するためにテストすることができる。そのような不活化抗体を用いて、ここに記載したコレステロール流出アッセイのいずれかのごときイン・ビトロアッセイで使用して、テスト化合物がＡＢＣ１−媒介コレステロール流出を促進するか否かを決定することができる。また、不活化抗体をイン・ビトロアッセイで用いて、哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１蛋白質の比較レベルを検出することができる。該不活化抗体は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを決定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットで有用である。
（治療用化合物同定のためのキット）
また、本発明は、化合物のＡＢＣ１発現変調活性を測定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを含む。該キットは、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量にて、別々にパッケージされた試薬として、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分に作動可能に連結したレポーターｃＤＮＡを含む組換えレポーター構築体を含む。パッケージされた試薬の使用のための指令書もまた典型的には含まれる。哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は５’フランキング配列を含む。１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３を含む。１つの好ましい実施形態において、哺乳動物ＡＢＣ１遺伝子の発現変調部分は配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３、１３９４−１６４３または１３８４−１５３２を含む。レポーターｃＤＮＡはいずれの適当なレポーター遺伝子でもあり得る。特に好ましい実施形態において、組換えレポーター構築体はｐＡＰＲ１である。もう１つの実施形態において、該キットは、さらに、レポーター蛋白質を検出するための手段を含む。かくして、キットは、レポーター蛋白質検出で用いられる緩衝液および基質のごとき試薬を含む。
本明細書中で用いるごとく、用語「パッケージ」とは、本発明の組換えベクターを固定された限界内に保持することができるガラス、プラスチック、（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカルボネート）、紙、ホイル等のごとき固体マトリックスまたは材料を言う。かくして、例えば、パッケージは、ミリグラム量の考えられるベクターを含有させるのに用いるガラスバイアルであり得る。
「使用のための指令書」は、典型的には、試薬濃度または試薬および混合すべき試料の相対的量、試薬／試料混合のための維持時間、温度、緩衝液の条件等のような少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する触れることができる表現を含む。
加えて、本発明は、化合物がＡＢＣ１−依存性コレステロール流出を変調するか否かを決定するために化合物をスクリーニングするのに適したキットを含む。１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量にて、別々にパッケージされた試薬としての不活化抗−ＡＢＣ１抗体を含む。パッケージされた試薬の使用のための指令書もまた典型的には含まれる。
もう１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量のアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドおよび使用のための指令書を含む。好ましくは、アンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドは配列番号：５３を含む。
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術を本発明に従って利用することができるのは認識されるであろう。ＤＮＡマイクロアレイは、例えばガラスのような、固体支持体上に位置させた核酸のミニチュア高密度アレイである。該アレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションのための標的として作用する単一核酸種の多数のコピーを含有する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いる発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡをまず細胞または組織試料から抽出し、次いで、酵素により蛍光標識ｃＤＮＡに変換する。この物質をマイクロアレイにハイブリダイズさせ、未結合ｃＤＮＡを洗浄によって除去する。次いで、アレイ上に表された区別される遺伝子の発現を、各標識核酸分子に特異的に結合した標識ｃＤＮＡの量を定量することによって可視化する。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的物質の単一試料から高スループット平行方法で定量することができる。
この高スループット発現プロファイリングは、限定されるものではないが：治療剤での標的としてのＡＢＣ１病気−関連遺伝子の同定および有効化；関連するＡＢＣ１分子およびその阻害剤の分子毒物学；臨床試験のための代用物マーカーの集団の層化およびその創製；および高スループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定で助けることによる関連ＡＢＣ１ポリペプチド小分子薬物発見の増強を含めた、本発明のＡＢＣ１分子に対する広い範囲の適用を有する。
実施例２においてここで考察したごとく、遺伝的異常を持つ個体の細胞に由来するＲＮＡの試料を用い、それらを、正常個体からのＲＮＡと比較する方法が開発された。歴史的には、遺伝した病気の原因の同定は、遺伝実験（連鎖分析）において欠陥に密接にリンクすることが示されている数百万の塩基対の間隔内で疑われる遺伝子を同定するための、数年の生化学的分析、またはより最近では、数年の遺伝子マッピングおよび位置クローニングに由来した。最も顕著には「遺伝子チップ」を介するマルチジーン発現分析の使用は、そのような発見のペースを改革することができる。遺伝病をもつ異常個体からの細胞に由来するＲＮＡ−対−正常個体からのＲＮＡの試料の発現を比較することは、その対応するｍＲＮＡが異常病気細胞において失われ、ひどく過小表現されるかまたはひどく過剰表現される遺伝子を迅速に明らかにすることができる。
本明細書中で用いる用語「個体」とは、例えば、哺乳動物、植物のごとくＲＮＡを有する生きた生物をいう。この方法は、好ましくは、ヒト遺伝子異常性の源を同定するのに用いられる。より好ましくは、該方法は、タンジール病における遺伝的欠陥としてＡＢＣ１を同定するごときヒト心臓および心血管障害の遺伝的源を検出するのに有用である。
本明細書中で用いられる用語「異常性」とは、ある種の個体の大部分と比較して該種における少数の個体で生理学的偏差を引き起こす遺伝的差異をいう。該異常性はポジティブな異常性またはネガティブな異常性であり得る。例えば、ポジティブな植物異常性は、該種における他の個体と比較していくつかの個体植物を日照り抵抗性とする遺伝的差異であろう。ネガティブな異常性は、植物の同一種における個体を正常植物よりも日照り損傷を受けやすくするものであろう。
該方法は、タンジール病の遺伝的原因に我々の調査を参照することによって最良に記載することができる。我々は、タンジール病を持つ個体から培養した細胞からのＲＮＡを用いて、ほぼ６０、０００の正常ヒト遺伝子を含有するマイクロアレイをプローブすることによって我々の調査を開始し、我々は、患者がほとんどゼロレベルの循環高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）および心臓病の増大した危険性を有するこの単一遺伝子病における血管遺伝子としてＡＢＣ１を同定するのにプローブ結果を用いることができた。血管遺伝子の結果、そのような実験においてゼロレベルの検出可能なｍＲＮＡシグナルが得られる必要はない。この成功した例において、マイクロアレイ上の５８、８００プローブのうち大ざっぱに１７５が、タンジール病ＲＮＡ−対−正常において２．５倍を超えて過小発現された。いくつかのさらなる工程を採用して、クルプリット遺伝子の同一性を確認することができる。これらは、タンジール病を持つ無関係な個体でそのようなマイクロアレイプローブを反復し、各遺伝子の染色体地図の位置を決定して、病気にリンクした報告された大きな遺伝子間隔と比較すること、候補蛋白質およびそれらのホモログの同様の機能の考慮、生化学的テスト、および突然変異を見出すための患者における最良の候補遺伝子の配列決定を含む。これらの方法において、遺伝子発現マイクロアレイ分析は、タンジール病における欠陥としてのＡＢＣ１の同定のごとき遺伝子した遺伝子欠陥の同定に導くことができる。
この方法におけるさらなる利用性は、病気試料ｖｓ．正常において過小または過剰発現される他の遺伝子が、補償的応答として、または病気原因に対する寄与者としての、患者における遺伝的欠陥の結果で異なって調節されるものを含む。これは、薬物開発に使用でき、治療および診断に対する関係で、病気の原因を解明するのを助けることができる関連生物学的経路における他の蛋白質の同定を提供することができる。遺伝子欠失または他の突然変異が、サラセミア（グロビン遺伝子欠陥）および他の遺伝子病の多くの例で観察されるごとく、ｍＲＮＡの完全な不存在を引き起こす場合、病気−対−正常試料の遺伝子発現分析は、より直接的な方法で失われた遺伝子の同定に導くことができる。
これらの例においては、ＲＮＡ試料でプローブされた遺伝子発現アレイは、プローブ試料が顕微鏡スライド上に整列されたｃＤＮＡであるタイプのものであるが、別のアレイ技術が十分であろう。これらは、限定されるものではないが、ＤＮＡ試料をフィルター膜上に整列させるか、またはフォトリソグラフィーによって「遺伝子チップ」上で合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるものを含むであろう。
一般に、用語マイクロアレイとは、紙、ナイロンもしくは他のタイプの膜、フィルター、チップ、カバーグラス、またはいずれかの他の適当な個体支持体のごとき基材上で合成された区別されるオリゴヌクレオチドのアレイをいう。当該分野で知られた方法を用い、マイクロアレイを調製し、使用し、分析することができる（例えば、その各々の明細書をここに引用して一体化させるＢｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９５）米国特許第５、４７４、７９６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５−２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．ら（１９９５）ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５；および米国特許第５、６０５、６６２号参照）。
化学的カップリング手法およびインクジェットデバイスを用いて、基材の表面上でアレイエレメントを合成することができる。また、ドットまたはスロット、ブロットと類似したアレイを用いて、熱的、ＵＶ、化学的または機械的結合手法を用い、基材の表面にエレメントを配置しリンクさせることができる。典型的なアレイが、手動によって、または利用できる方法およびマシーンを用いることによって作成することができ、それは適切な数のエレメントを含有することができる。ハイブリダイゼーションの後、未ハイブリダイズドプローブを除去し、スキャナーを用いて蛍光のレベルおよびパターンを測定することができる。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各プローブの相補性の程度および相対的豊富さを、スキャンしたイメージの分析を介して評価することができる。
全長ｃＤＮＡ、発現された配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片はマイクロアレイのエレメントを含むことができる。ハイブリダイゼーションに適した断面は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のごとき当該分野でよく知られたソフトウェアを用いて選択することができる。異常個体および正常個体のヌクレオチド配列に対応する全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはその断片を適当な基材、例えば、スライドグラス上に配置する。該ｃＤＮＡを、例えば、ＵＶ架橋を用いて該スライドに固定し、続いて、熱的および化学的処理および引き続いて乾燥を行う（例えば、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：６３９−６４５）。蛍光プローブのごときプローブを調製し、基材上のエレメントへのハイブリダイゼーションで用いる。
マイクロアレイを用いて試料分析を行うためには、生物学的試料からのＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブに作成する。ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生じさせ、それを鋳型として用いてアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を作成する。ａＲＮＡを蛍光ヌクレオチドの存在下で増幅し、標識されたプローブを、プローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするようにマイクロアレイと共にインキュベートする。インキュベーション条件は、正確な相補性マッチにて、または種々の程度のより低い相補性にてハイブリダイゼーションが起こるように調整する。ハイブリダイズしなかったプローブの除去の後、スキャナーを用いて蛍光のレベルおよびパターンを測定する。スキャンしたイメージを調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチドの相補性の程度および相対的豊富さを測定する。生物学的試料は、いずれかの体液（例えば、血液、尿、唾液、粘液質、胃液等）、培養された細胞、バイオプシー、または他の組織調製物から得ることができる。検出システムを用いて、区別される配列の全てについての存在、不存在およびハイブリダイゼーションの量を同時に測定することができる。このデータは、試料間の配列、突然変異、変種または多形についての大規模な修正実験で用いることができる。
マイクロアレイは、好ましくは、非常に多数のユニークな一本鎖核酸配列、通常は、個体支持体に結合した合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡの断片いずれかよりなる。マイクロアレイは、既知の５’または３’配列をカバーするオリゴヌクレオチドを含有することができるか、あるいは全長配列をカバーする順次のオリゴヌクレオチド；または配列の長さに沿った特定の領域から選択されたユニークなオリゴヌクレオチドを含有することができる。マイクロアレイで用いるポリヌクレオチドは、配列の少なくとも断片が知られている注目する遺伝子または複数遺伝子に特異的な、あるいは特定の細胞型、発生または病気の状態に共通する１以上の同定されていないｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
マイクロアレイのために公知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生じさせるためには、ヌクレオチド配列の５’またはより好ましくは３’末端で出発するコンピューターアルゴリズムを用い、注目する遺伝子を調べる。該アルゴリズムは、遺伝子にユニークな、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含有量を有する、およびハイブリダイゼーションに干渉し得る予測される二次構造を欠く規定された長さのオリゴマーを同定する。オリゴマーは、光−指向性化学プロセスを用いて基材上の指定された領域で合成される。基材は紙、ナイロンもしくは他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドグラスまたはいずれかの他の適当な個体支持体であり得る。アレイは、手動によって、または利用可能なデバイス（スロットブロットまたはドットブロット装置）材料およびマシーン（ロボット装備を含む）を用いて作ることができ、８ドット、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドットまたは６１４４ドットのグリッド、あるいは商業的に入手可能な装備の効果的な使用に適するいずれかの他の複数のグリッドを含有することができる。
一旦遺伝した異常性の遺伝子的原因がせばめられるかまたは同定されれば、遺伝子の潜在的にまたは現実の欠陥部分をマイクロアレイにおいて標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、非常に多数の遺伝子の発現レベルをモニターし、潜在的な治療剤および治療剤の活性を開発しモニターすることができる。
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明を断じて限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
本実施例は、タンジール病（ＴＤ）を持つ患者はアポＡ−Ｉ−媒介脂質流出の不存在を有することを示す。
細胞培養：ヒト繊維芽細胞は、ふたりの正常な対象（ＮＬ１）および３人のタンジール病（ＴＤ）を持つ無関係な患者からの皮膚外植体から得た。ＴＤ１細胞は、極端に低い血漿ＨＤＬコレステロールおよびアポＡ−Ｉレベルならびにタンジール病に典型的な臨床的兆候を持つ５３歳の女性から得た。ＴＤ２細胞は、非常に低いレベルの血漿ＨＤＬコレステロールおよびアポＡ−Ｉを含めたタンジール病の臨床的、形態学的および生化学的特徴を持つ５６歳の男性から得た（Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，７８−８７（１９９５））。ＴＤ３細胞は、オレンジ色の扁桃片、非対称運動神経障害、５ｍｇ／ｄＬの血漿ＨＤＬコレステロールおよび１６ｍｇ／ｄＬのＬＤＬコレステロールを呈するタンジール病を持つ１８歳の男性から得た（Ｌａｗｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，Ｒ２５−Ｒ３１（１９９９））。正常な細胞およびＴＤ対象細胞は、Ｏｒａｍら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４０：１７６９−１７８１（１９９９）に記載されたごとく不死化した。略言すれば、ヒトパピローマウイルスの１６のオンコジインＥ６およびＥ７のインサートおよびネオマイシン抵抗性選択マーカーを持つベクターを含有する両種性レトロウイルスで細胞をトランスフェクトした。対照細胞はベクター単独で感染させた（模擬感染）。プールした細胞集団をＧ４１８の存在下で２継代の間選択し、しかる後、Ｇ４１８を培地から排除した。繊維芽細胞を第５および１６継代（初代培養）または第６および１５継代（不死化）の間で用いた。不死化された正常およびＴＤ細胞を１６−ｍｍウェルまたは３５−ｍｍ皿に接種し、実験で使用する前にダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で密集するまで増殖させた。また、ＲＡＷ２６４．７マウス単球細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で維持した。
脂質流出を測定するアッセイ：コレステロールおよびリン脂質のアポＡＩ−媒介流出は、Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７８−８７（１９９５）に記載されている方法にしたがってアッセイした。正常およびＴＤ対象からの培養された皮膚繊維芽細胞を、０．２−０．５μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］コレステロール（４０−６０ Ｃｉ／ミリモル，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の存在下で密集するまで増殖させることによって標識した。細胞が６０−８０％密集すると、放射性コレステロールを血清−含有増殖培地に添加した。３日後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄し、同時に増殖を阻止し、かつコレステロールを負荷して、アポリポ蛋白質−媒介脂質流出を最大化した。これは、無血清ＤＭＥＭ＋２ｍｇ／ｍｌの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＤＭＥＭ／ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）および３０μｇ／ｍｌ非放射性コレステロール中で細胞を４８時間インキュベートすることによって達成された。ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３０６４７−３０６５５（１９９６）に記載されているごとく、アセチル化ＬＤＬでの２４時間インキュベーションによってスカベンジャー受容体を介してコレステロール−負荷した。略言すれば、２４−ウェル皿中のＲＡＷ２６４．７細胞をコレステロール−負荷し、ＡｃＬＤＬと共に３７℃にて３０分間プレインキュベートした、５０μｌ／ｍｌの１Ｍグルコース、１０μｌ／ｍｌの２００ｍＭグルタミンおよび２％ＢＳＡを、およびアセチル化低密度リポ蛋白質（ＡｃＬＤＬ）および［3Ｈ］−コレステロールを補足した０．５ｍｌのＤＭＥＭ中で一晩標識して、０．３３μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］−コレステロールの最終濃度を得た。引き続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を５回洗浄し、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で一晩（１６−１８時間）インキュベートして、コレステロールプールを平衡化した。
コレステロールプールの平衡の後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで４回すすぎ、流出インキュベーションの前にＤＭＥＭ／ＢＳＡと共に３７℃にて１時間インキュベートした。アルブミン単独（対照）、アルブミン＋ＨＤＬ（４０μｇ蛋白質／ｍｌ）またはアルブミン＋アポＡ−Ｉ（１０μｇ／ｍｌ，Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）いずれかを含有する流出培地（ＤＭＥＭ／ＢＳＡ）を添加し、細胞を４、２４または４８時間インキュベートした。ＤＭＥＭ／ＢＳＡの一晩の平衡培地中に１０μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］コリン（７５−８５Ｃｉ／ミリモル，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）を含めることによってリン脂質を標識した。培養培地中で見出された放射能は、１２、０００ｇにおける１５分間の遠心後のシンチレーションカウンティングによって測定した。細胞における放射能は、０．５ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１：３０６４７−３０６５５（１９９６））中での可溶化またはＦｒａｎｃｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，７８−８７（１９９５）に記載されているヘキサン：イソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ）中での抽出の後のシンチレーションカウンティングによって測定した。標識されたリン脂質を含有する細胞を１ｍｌのイソプロパノールで１時間、次いで、前記したごときヘキサン：イソプロパノールで抽出した。コレステロールまたはリン脂質の流出は、細胞および培地から回収された合計トリチウム化脂質カウントを超える培地中のトリチウム化脂質カウントのパーセンテージとして表した（ｃｐｍ培地／ｃｐｍ（培地＋溶解物）×１００）。
図１ＡおよびＣに示すごとく、ＨＤＬまたはアポＡ−Ｉの添加の結果、正常対象から得られたコレステロール−負荷繊維芽細胞からコレステロールが除去される。しかしながら、ＴＤ細胞においては、コレステロールを除去するＨＤＬの濃度はわずかに減少し、コレステロールを除去するアポＡ−Ｉの能力は完全に存在しない。図１は、正常およびＴＤ繊維芽細胞が、アルブミンとの４８時間のインキュベーションの間に、約３−４％の［細胞：3Ｈ］−コレステロールを培地に放出することを示す。アルブミン培地へのＨＤＬの添加は正常およびＴＤ繊維芽細胞双方からの［3Ｈ］−コレステロールの流出を増加させるが、ＴＤ細胞では程度が低い（図１Ｂ、Ｄ）。アポＡ−Ｉの添加は正常な繊維芽細胞からの［3Ｈ］−コレステロールの流出を促進した（図Ａ、Ｃ）が、ＴＤ繊維芽細胞からの［3Ｈ］−コレステロール流出に対してはほとんどまたは全く効果を有しなかった。
（実施例２）
本実施例は、１７５の遺伝子が、正常細胞と比較して、ＴＤ細胞において、少なくとも２．５倍減少した発現を示し、３７５の遺伝子が少なくとも２．５倍増加した発現を示すことを示す。異なる遺伝子発現は、正常個体（非−ＴＤ）からの、およびＴＤを持つ患者からのｃＤＮＡの遺伝子−発現マイクロアレイ（ＧＥＭ）分析を用いて測定した。
細胞培養：正常個体および実施例１に記載されたＴＤ患者から得られた不死化細胞培養を用いた。密集培養をＤＭＥＭ／ＢＳＡ中に維持し、１ｍＭの８−ブロモ環アデノシン１リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）で２４時間補足した。
ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成：正常およびＴＤ繊維芽細胞双方からのｍＲＮＡは、トリゾール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｃａｔ．＃１５５９６−０２６）で細胞から抽出した全ＲＮＡから調製した。該ｍＲＮＡはＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，Ｃａｔ．＃７００２２）を用い販売業者のプロトコルにしたがって単離した。Ｃｙ３またはＣｙ５蛍光色素を用いてｍＲＮＡを逆転写して、ＤｅＲｉｓｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：６８０−６８６（１９９７）に記載された方法にしたがって蛍光標識ｃＤＮＡを得た。ＴＤ細胞から得られたｃＤＮＡをＣｙ３蛍光色素で標識し、正常細胞からのｃＤＮＡをＣｙ５蛍光色素（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で標識した。
マイクロアレイ分析：ＴＤを持つ個体および正常個体からの細胞における異なる遺伝子発現を分析するために、前記したごとく調製したＣｙ３およびＣｙ５蛍光標識ｃＤＮＡ試料を、顕微鏡スライド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）上のＧｅｎｅ Ａｌｂｕｍマイクロアレイ（ＧＥＭ）の組にハイブリダイズさせた。６つのスライドの各々は約９、８００ヒトｃＤＮＡ試料＋２００対照試料を含有し、５８、８００部分的ｃＤＮＡのマイクロアレイとなった。したがって、重複性の見積もりを行い、発現されたヒト遺伝子のほぼ３０−５０％が表された。ＴＤ１細胞から調製されたＣｙ３−標識ｃＤＮＡおよび正常細胞からのＣｙ５−標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＴＤ細胞 ｖｓ．正常細胞の相対的ＲＮＡ含有量の発現された遺伝子についての比較を可能とした。加えて、ＴＤ２細胞から調製されたＣｙ３−標識ｃＤＮＡおよび正常細胞からのＣｙ５−標識ｃＤＮＡをマイクロアレイの同一組にハイブリダイズさせて、異なるＴＤ患者の間の遺伝子発現の変動を調べた。
結果：データはＧｅｍＴｏｏｌｓソフトウェア（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｉｃｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて分析し、正常細胞に対するＴＤ細胞のｍＲＮＡの比率として表した。結果は、大部分の遺伝子がＴＤ１および正常細胞で比較的発現されることを示した。図２（前記セクションにおける対角線の左側）に示すごとく、正常細胞と比較して１７５の遺伝子のみがＴＤ１細胞において２．５倍過少発現され、他方、正常細胞と比較して３７５遺伝子がＴＤ１細胞において２．５倍過剰発現された（下方であって対角線の右側）ＴＤ細胞でより高度に発現された遺伝子は、補償的応答として、または病気病理学に対する寄与として、タンジール突然変異の結果として異なって調節されるものを含む。ＴＤの観察された表現型に寄与し、ＴＤ細胞でより高度に発現される遺伝子は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、マクロファージ炎症性蛋白質−２α、顆粒球走化性蛋白質−２、ＩＬ−１１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ−２（ＣＯＸ−２）、トロンボスポンジンおよび単球走化性蛋白質１、３および４を含む（Ｌａｗｎ ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：Ｒ２５−Ｒ３１（１９９９））。
正常繊維芽細胞で発現された単一ＲＮＡで、ＴＤ１またはＴＤ２細胞いずれにおいても完全に存在しないものは見出されなかった。また、ＴＤ１およびＴＤ２における異なって発現された遺伝子の比較により、個々のＴＤ患者の間でほとんど変動はないことが明らかにされた。例えば、ＴＤ２細胞で最も高度に下降調節された遺伝子のうち、正常細胞と比較して９２％もまたＴＤ１細胞で過少発現された。遺伝子のうち、ＴＤ１またはＴＤ２ ｖｓ．正常細胞で２．５倍過少発現されたのはＡＢＣ１蛋白質についての遺伝子であった。ＡＢＣ１遺伝子はその相同体のいくつかの帰せられる機能のため追跡し、また、当該遺伝子がＴＤ遺伝子領域として報告された染色体領域にほぼ位置決定されたからである。
（実施例３）
本実施例は、ＡＢＣ１遺伝子がヒト染色体９ｑ３１に位置決定されることを示す。
従前の遺伝子連鎖分析がＴＤ遺伝子をヒト染色体９ｑ３１の７−ｃＭ領域にマップした（Ｒｕｓｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０，９６−９８（１９９８））。加えて、イン・サイチュハイブリダイゼーション分析により、ＡＢＣ１遺伝子がより広い染色体間隔９ｑ２２−９ｑ３１に位置決定されることが明らかとされた（Ｌｕｃｉａｎｉら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１，１５０−１５９（１９９４））。ヒト／ハムスター照射ハイブリッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）のＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ パネルでのＰＣＲ方法を用い、ヒトＡＢＣ１はマーカーＷＩ−１４７０６およびＷＩ−４０６２の間に位置すると決定され、これは、ヒト染色体９ｑ３１の７−ｃＭ領域に対応する。９３ヒト／ハムスターハイブリッド細胞系からのＤＮＡは、ヒトＡＢＣ１−得意的プライマーＬＦ：
ＣＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣ（配列番号：１１）およびＬＲ：
ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号：１２）
を用いるＰＣＲによって増幅した。各系はヒトＡＢＣ１増幅産物につき陽性または陰性としてスコアを採り、このデータの分析から得られたＡＢＣ１のマッピングは、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０００／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｆｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）を介してアクセスされるＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳｏｆｔｗａｒｅのためのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒを用いて達成された。これらの結果は、さらに、同等の間隔からのヒトゲノム／酵母人工染色体クローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）へのサザーンブロットハイブリダイゼーションによって確認された。加えて、公のデータベースサーチング（ＧｅｎｅＭａｐ’９８；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および照射ハイブリッドマッピングは、報告された遺伝子間隔における位置からのマイクロアレイデータにおいて他の有意に過少発現された遺伝子を排除した。これらの補充的データは、ＡＢＣ１遺伝子がヒト染色体９ｑ３１に位置することを示し、さらに、ＡＢＣ１遺伝子がタンジール病に関連することを示す。
（実施例４）
本実施例は、フランキング領域および全コーディング領域を含めた野生型ＡＢＣ１遺伝子のヌクレオチド配列の決定を示す。
ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０遺伝子分析器を用い、またはＤａｖｉｓ配列決定（Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）によって行った。両方のストランドは全体を配列決定した。正常な対象からのＡＢＣ１遺伝子のオープンリーディングフレームの配列は、正常繊維芽細胞ＲＮＡから構築した発現プラスミドライブラリから得られた全長ｃＤＮＡクローンから決定した。プラスミドライブラリを構築するためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅキットプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にしたがってｃＤＮＡを合成した。略言すれば、５−メチルｃＣＴＰの存在下で、ＸｈｏＩ部位を持つオリゴ−ｂＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写構造を用い、第１ストランドｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成した。未修飾ｄＬＴＰの存在下で、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを用いて第２ストランドを合成した。ｃＤＮＡをｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカーを該ｃＤＮＡに連結した。次いで、該ｃＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、ｃＤＮＡの３’末端にＸｈｏＩ末端を生じさせた。第１ストランド合成の間に、内部ＸｈｏＩ部位をセミ−メチル化によるこの消化から保護した。合成されたｃＤＮＡをプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ＃ＶＯ４４−５０）、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーを含有する発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にクローンした。５’−ＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴＡＴＣ（配列番号：１３）および５’−ＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＣＴＴＣＧＧＣ（配列番号：１４）であった既知のＡＢＣ１配列に基づくプライマーを用い、逆転写構造ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって５８５ｂｐ ＡＢＣ１プローブを創製した。このＡＢＣ１プローブを用い、製造業者のプロトコルによるＣｌｏｎｅＣａｐｔｕｒｅ選択キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡの１０．５ｋｂインサートを含有するクローンをライブラリから回収した。このクローンをｐＣＥＰｈＡＢＣ１として図３に示す。該１０．５ｋｂ ＡＢＣ１ ｃＤＮＡインサート配列は配列番号：１に示す。配列決定により、ｐＣＥＰｈＡＢＣ１が６７８３ヌクレオチドのヒトＡＢＣ１オープンリーディングフレーム＋５’および３’非翻訳領域を含有し、Ｌａｎｇｍａｎｎら ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２５７，２９−３３（１９９９）（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＡＪＯ１２３７６）によって報告されているｃＤＮＡ配列よりも大きなオープンリーディングフレームを有することが確認された。
（実施例５）
本実施例は、野生型ＡＢＣ１遺伝子およびＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３遺伝子配列の間の配列の差を示す。
ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３のｃＤＮＡ合成：ｃＤＮＡは、（１）ｓａｃＩｈａｂｃｆ、５’−ＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＣ（配列番号：１５）；
ｈａｂｃｒ３５８１、５’−ＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号：１６）および（２）ｈａｂｃｆ３５８５、５’−ＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣ（配列番号：１７）；ｈａｂｃｒｓａｌＩ、５’
−ＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＴＡＧＴＡＴＣＡＧ（配列番号：１８）と命名された、正常ヒトＡＢＣ１遺伝子配列から設計されたプライマー対の２つの組を用い、製造業者のプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｃａｔ．＃８４１７−１）に従い、Ｓｕｅｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｃＤＮＡシステムおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼミックスを用いる逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３細胞から調製した。０．４μＭの最終濃度のこれらのプライマーでの０．２−０．５μｇポリＡ＋ＲＮＡの増幅により、ほぼ３．５ｋｂの２つの重複する鋳型が生じた。ＱＩＡＥＸ ＩＩシステム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；Ｃａｔ．＃２００２１）を用いて該鋳型をゲル−精製し、１００ｎｇ／μｌの濃度に調整した。
ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３ ｃＤＮＡの配列決定：前記したごとく創製された８μｌの各鋳型を、０．５μＭの最終濃度の野生型ＡＢＣ１配列に基づいて設計された個々の配列決定プライマーでの反応で配列決定した。プライマーは以下のとおりであった：１Ｆ：５’−ＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号：１９）、２Ｆ：５’
−ＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＡＣＡＧＧＡＧ（配列番号：２０）；３Ｆ：５’−ＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＧＧ（配列番号：２１）；４Ｆ：５’−ＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧ（配列番号：２２）；５Ｆ：５’−ＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡ（配列番号：２３）；６Ｆ：５’−ＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＴ（配列番号：２４）；７Ｆ：５’−ＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡ（配列番号：２５）；８Ｆ：５’−ＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：２６）；９Ｆ：５’−ＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号：２７）；１０Ｆ：５’−ＡＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号：２８）：１１Ｆ：５’−ＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧ（配列番号：２９）；１２Ｆ：５’−ＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号：３０）；１３Ｆ：５’−ＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＣＣＴ（配列番号：３１）；１４Ｆ：５’−ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＴ（配列番号：３２）；１５Ｆ：５’−ＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号：３３）；１６Ｆ：５’−ＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡ（配列番号：３４）；１Ｒ：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴ（配列番号：３５）；２Ｒ：５’−ＣＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ（配列番号：３６）；３Ｒ：５’−ＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＣ（配列番号：３７）；４Ｒ：５’−ＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＡ（配列番号：３８）；５Ｒ：５’−ＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号：３９）；６Ｒ：５’−ＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡ（配列番号：４０）；７Ｒ：５’−ＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＴＧ（配列番号：４１）；８Ｒ：５’−ＣＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＧ（配列番号：４２）；９Ｒ：５’−ＣＡＴＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧ（配列番号：４３）；１０Ｒ：５’−ＡＧＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴ 配列番号：４４）、１１Ｒ：５’−ＴＧＧＡＣＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡ（配列番号：４５）、１２Ｒ：５’−ＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号：４６）、１３Ｒ：５’−ＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＡＧ（配列番号：４７）、１４Ｒ：５’−ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＧＡＣ（配列番号：４８）、１５Ｒ：５’−ＴＣＣＡＧＡＴＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡ（配列番号：４９）、１６Ｒ：５’−ＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡ（配列番号：５０）、ＵＴＲ１Ｒ：５’−ＡＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧ（配列番号：５１）。
結果：ヌクレオチドナンバリングはＬａｗｎら（１９９９）に見出されるナンバリングにしたがう。患者ＴＤ１は全長オープンリーディングフレームを保有し、野生型配列とは２つの実質的差異がある（配列番号：８）。これらのうち１つはＡからＧへの置換であり、その結果、Ｌａｗｎら（１９９９）によって公表されているごとく、２２０１アミノ酸配列の位置５３７においてグルタミンからアルギニン残基への変化がもたらされる。この残基の位置は、第１の予測される膜貫通ドメインの近くの、ＮＨ2−末端親水性ドメイン内にある。また、患者ＴＤ２はオープンリーディングフレームを保有し、残基５２７においてアルギニンからトリプトファンへの置換がある（配列番号：１０）。かくして、ＴＤ１およびＴＤ２は共に蛋白質の同一領域においてアミノ酸の電荷を変化させる置換を含む。ＴＤ３ ＤＮＡは、ひとつの対立遺伝子においてヌクレオチド５６９７に続くそのＡＢＣ１ ｃＤＮＡ中に１４ヌクレオチド挿入を含み、他の対立遺伝子においてヌクレオチド５０６２後に１３８ｂｐ挿入を含む。
ＴＤ１、ＴＤ２およびＴＤ３のＤＮＡのゲノム配列決定は、各ｃＤＮＡで見出された変化を確認した。ＴＤ１およびＴＤ２からのｃＤＮＡで見出された突然変異を含む繊維芽細胞から単離されたゲノムＤＮＡの１５６ｂｐ領域のＰＣＲ増幅によって、ゲノム配列が創製された。ゲノム配列決定は、また、患者ＴＤ１がグルタミンからアルギニン置換につきホモ接合であることを示した。ゲノムＤＮＡ分析は、ＴＤ２が、検出された置換を含む１つの対立遺伝子および未決定の欠陥を含む（検出可能なｍＲＮＡを生産できない）第２の対立遺伝子に関し化合物ヘテロ接合であることを示した。非−ＴＤ個体のゲノムＤＮＡの８０を超える対立遺伝子において、置換突然変異は見出されなかった。ＴＤ３挿入は配列分析によって同定され、挿入点を囲うプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって確認された。ヌクレオチド５６９７に続く１４−ｂｐ挿入はフレームシフトを引き起こし、その結果、第２のＡＴＰ結合ドメイン前の位置から、未成熟蛋白質終止の点までの、野生型アミノ酸配列の置換がもたらされた。他の対立遺伝子におけるヌクレオチド５０６２に続く１３８ｂｐ挿入はインフレーム停止コドンを含む。
（実施例６）
本実施例は、ＡＢＣ１輸送活性の阻害剤が繊維芽細胞からのアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を阻害することを示す。
ＡＢＣ１の阻害がアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出のプロセスに影響し得るか否かをテストするために、ＡＢＣ１阻害剤であると報告された２つの化合物をアッセイでテストし、アポリポ蛋白質媒介コレステロール流出をモニターした。化合物４、４−ジイソチオシアノスチルベン−２、２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）は、用量依存的にＡＢＣ１のアニオン輸送活性を阻害すると報告されている（Ｂｅｃｑら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２６９５−２６９９（１９９７）；Ｈａｍｏｎら，Ｂｌｏｏｄ，９０：２９１１−２９１５（１９９７））。アポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出アッセイは、示された変化を施して実施例１に記載されているごとく行った。コレステロール−負荷および［3Ｈ］コレステロール−標識正常繊維芽細胞（ｎ＝３）を、５μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉおよび０、０．２ｍＭまたは０．４ｍＭ ＤＩＤＳと共にまたはそれなくして６時間インキュベートした。加えて、コレステロール−負荷および［3Ｈ］コレステロール−標識正常繊維芽細胞（ｎ＝３）を、５μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉおよび０、０．２ｍＭまたは０．４ｍＭＢＳＰと共にまたはそれなくして６時間インキュベートした［3Ｈ］コレステロール流出は実施例１に記載されたシンチレーションカウンティングによって測定し、培地中に出現する全放射性標識コレステロールのパーセンテージとして計算した。結果は、アポＡ−Ｉ−フリー培地についての値を差し引いた後におけるアポＡ−Ｉの存在下での流出の平均±ＳＤ（ｎ＝３）として図５に示す。図５は、ＤＩＤＳおよびＢＳＰが共にアポリポ蛋白質Ａ−Ｉによって媒介されるトリチウム化コレステロールの６時間流出を阻害することを示す。加えて、ＤＩＤＳおよびＢＳＰを用いるトリチウム化ホスファチジルコリンの流出で同様の阻害が観察された（データは示さず）。これらのテストの結果は、実施例１に記載された、ＴＤを持つ患者に由来する繊維芽細胞における流出欠陥と似ている。
（実施例７）
本実施例は、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害が繊維芽細胞からのアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を阻害することを示す。
正常皮膚繊維芽細胞を実施例１に記載したごとく［3Ｈ］コレステロールで標識した。次いで、３０μＭ対照モルホリノオリゴヌクレオチド（β−グロビンサラセミアｍＲＮＡのアンチセンス相補体に対応する５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’；配列番号：５２）または３０μＭ ＡＢＣ１アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣ−３’；配列番号：５３）いずれかの存在下で掻き、新しい皿の上に再度接種することによって、細胞にオリゴヌクレオチドを負荷した。オリゴヌクレオチドの不存在下で掻き、再度接種することによって、対照細胞を［3Ｈ］コレステロール−標識後に模擬負荷した。培地中に出現する全放射性標識コレステロールのパーセンテージとしてのシンチレーションカウンティングによって、１２時間後に、アポＡ−Ｉ−媒介流出を測定した。結果は、各実験においてオリゴヌクレオチドの不存在下でのアポＡ−Ｉ−特異的流出についての値に対して正規化した、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして図６に示す。図６に示すごとく、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（β−グロビンアンチセンスオリゴヌクレオチド）と比較して、正常繊維芽細胞からのコレステロール流出の５０％低下を引き起こした。
（実施例８）
本実施例は、ヒトＡＢＣ１遺伝子の過剰発現の結果、単球細胞からのアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出の増加がもたらされることを示す。
ＲＡＷ２６４．７細胞の安定なトランスフェクション：マウス単球ＲＡＷ２６４．７細胞を、ヒトＡＢＣ１についてのｐＣＥＰｈＡＢＣ１発現プラスミドで安定にトランスフェクトした。ヒトＡＢＣ１のオープンリーディングフレームを含有するｐＣＥＰｈＡＢＣ１プラスミドの構築を実施例４に記載する。０．８ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中の２μｇのｐをＣＥＰｈＡＢＣ１ ＤＮＡおよび１２μｌのｇＥＮＥＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＣＡＴ．＃Ｔ２０１００７）で、ほぼ１×１０6ＲＡＷ２６４．７細胞を５時間トランスフェクトした。２日後、細胞を１：２−１：５０の範囲の比率で分け、培養培地に１５０μｇ／ｍｌヒグロマイシンを添加することによって選択を適用した。２週間後、ヒグロマイシン−抵抗性コロニーを拾い、増殖させた。
アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出アッセイ：親ＲＡＷ２６４．７細胞およびヒトＡＢＣ１を安定に発現する３つのクローン系（Ｌ３、Ｌ５およびＬ６）を密集するまで増殖させた。細胞をコレステロール−負荷し、実施例１に記載したごとく、０．５μＣｉ（ｍｌ）［3Ｈ］コレステロールおよび５０μｇ／ｍｌアセチル化ＬＤＬでの２４時間のインキュベーションによって標識した。ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中での一晩のインキュベーションによるコレステロールプールの平衡の後、細胞を洗浄し、実施例１に記載したごとく流出培地を添加した。細胞培地中でのトリチウム化コレステロールのシンチレーションカウンティングによって、アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を前記したごとく測定し、細胞および培地から回収された全カウントのパーセンテージとして表した。結果は、各実験内で親ＲＡＷ２６４．７細胞からのアポＡ−Ｉ−特異的流出についての値に対して正規化した３つの別々の実験の平均±ＳＥＭとして表す。図７は、親ＲＡＷ２６４．７細胞およびＬ３、Ｌ５およびＬ６トランスフェクト細胞系からのアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を示す。理解されるごとく、ＡＢＣ１発現ベクターでのトランスフェクションの結果、アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出が４倍（Ｌ６）ないし６倍（Ｌ３およびＬ５）増加する。これらの結果は、ＡＢＣ１遺伝子の過剰発現はマクロファージ細胞からのコレステロール流出の量を実質的に増加させることができるのを示す。
（実施例９）
本実施例は、ＡＢＣ１ｍＲＮＡの発現が、正常皮膚繊維芽細胞においてコレステロール流出に関連する細胞状態によって調節されるが、ＴＤ繊維芽細胞では調節されないことを示す。
ＡＢＣ１が細胞ステロール流出において律速的役割を演じるか否かを判断するために、コレステロール流出プロセスに関連する種々の細胞条件下でＡＢＣ１の合成を測定した。具体的には、正常繊維芽細胞およびＴＤ繊維芽細胞を過剰のｃＡＭＰ、コレステロールまたはアポＡ−Ｉの条件に個々に暴露した。正常皮膚繊維芽細胞およびＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞の細胞培養は実施例１に記載したごとく調製した。ＡＢＣ１ ｍＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
細胞培養：正常皮膚繊維芽細胞およびＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞の不死化細胞培養は実施例１に記載したごとく調製した。ＤＭＥＭ／ＢＳＡおよび示した添加剤での置換前に細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４または４８時間密集下まで増殖させた。ＲＮＡは実施例２に記載したごとく調製した。
ＲＴ−ＰＣＲ：定量的ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。略言すれば、５００ｎｇのＤＮａｓｅ−処理ｍＲＮＡを２．５μのランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。ＳＹＢＲ緑色コアキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；＃４３０４８８６）ならびにヒトＡＢＣ１プライマーＬＦ：５’−ＣＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣ（配列番号：１１）およびＬＲ：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号：１２）を用いるＰＣＲによって、この反応のほぼ５％を増幅して、ヒトＡＢＣ１のヌクレオチド７０１８−７０９９に対応する８２ｂｐ断片を得た。ＰＣＲサイクル条件は以下のとおりであった：９５℃における１０分間；続いて９５℃、１５秒間の４０サイクルおよび６０秒間の６０℃。各ＰＣＲサイクルの間に生じた二本鎖増幅産物へのＳＹＢＲ緑色結合によって引き起こされた蛍光の増加を検出することによって、各試料中のｍＲＮＡを定量した。全ての試料は三連で実行し、β−アクチンｍＲＮＡに対して正規化し、プライマーアクチンＦ：５’−ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ（配列番号：５４）およびアクチンＢ：５’−ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号：５５）での平行反応で増幅した。標準曲線は同一ＰＣＲプレート上でＡＢＣ１およびβ−アクチン双方について作成した。
８−Ｂｒ−ｃＡＭＰアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰで２４時間処理した。
コレステロールアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の３０βｇ／ｍｌ遊離コレステロールで４８時間処理し、続いてＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８−２４時間平衡化した。
アポＡ−Ｉアッセイ：正常、ＴＤ１およびＴＤ２繊維芽細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中の３０μｇ／ｍｌ遊離コレステロールで４８時間処理し、続いてＤＭＥＭ／ＢＳＡ＋１０μ／ｍｌアポＡ−Ｉ中で１８−２４時間平衡化した。
結果：図８は、正常繊維芽細胞においては、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡは８−Ｂｒ−ｃＡＭＰへの暴露によってほぼ１０倍増加し、無血清培地中のコレステロールへの暴露によってほぼ１７倍増加することを示す。コレステロール−負荷細胞のアポＡ−Ｉへの引き続いての暴露の結果、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現が顕著に減少する。メカニズムは示されていないが、従前の研究は、コレステロール流出はｃＡＭＰおよびコレステロールのごとき化合物の存在下で促進されることを示している（Ｈｏｋｌａｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２５３４３−２５３４９（１９９３））。本結果は、正常繊維芽細胞においては、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡはコレステロール流出経路のこれらの既知のエフェクターによって誘導され、アポリポ蛋白質コレステロール受容体への暴露によって抑制されることを示し、これは、ＡＢＣ１の発現がアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出に関連する細胞条件によって調節されることを示す。対照的に、ＴＤ患者からの繊維芽細胞はコレステロール流出のエフェクターによって調製されない。まず、ＴＤ１およびＴＤ２細胞双方におけるＡＢＣ１ ｍＲＮＡのｃＡＭＰ−誘導レベルは正常細胞のそれのほぼ４０％に過ぎない。さらに、コレステロール−負荷細胞のアポＡ−Ｉへの暴露はＡＢＣ１発現を変化させず（ＴＤ１細胞）またはＡＢＣ１発現をわずかに増加させた（ＴＤ２細胞）。これらの結果は、ＴＤ細胞について記載されたアポ−Ａ−Ｉ媒介コレステロール流出における欠陥を反映する。興味深いことには、血清含有培地中での細胞の増殖は、ＡＢＣ１メッセージを検出限界近くまで抑制した（データは示さず）。これは、脂質流出経路の機能は細胞休止または低下したコレステロール必要性の他の細胞状態を必要とするという事実を反映し得る。結論において、細胞コレステロールの増加した流出に関連する条件（すなわち、コレステロール負荷、ｃＡＭＰ処理、血清枯渇）の結果、正常繊維芽細胞においてＡＢＣ１ ｍＲＮＡの発現が増加する。逆に、コレステロール−負荷正常繊維芽細胞のアポＡ−Ｉへの暴露はＡＢＣ１発現を低下させる。
（実施例１０）
本実施例は、２０−ヒドロキシコレステロールのごときＬＸＲ核受容体に対するリガンド、および９−シスレチノイン酸のごときＲＸＲ受容体に対するリガンドがマウスＲＡＷ２６４．７細胞においてＡＢＣ１遺伝子発現を増加させることができるのを示す。
ＬＸＲ核受容体は核受容体ＲＸＲを持つ絶対ヘテロダイマーを形成する転写因子であり、これは、２２−ヒドロキシコレステロールおよび２０−ヒドロキシコレステロールを含めたオキシステロールのクラスに結合することによって、活性化されてその標的遺伝子の転写を増強する（Ｊａｎｏｗｓｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３８３：７２８−７３１（１９９６））。それ自体、それらはコレステロール−誘導遺伝子転写の媒介についての候補である。さらに、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡおよび蛋白質がコレステロール負荷に応答して繊維芽細胞およびマクロファージで増加することを示した実験、およびＬＸＲおよびＲＸＲ発現が酸化されたＬＤＬへの暴露によってコレステロール−負荷マクロファージ細胞で増加することを示した他の実験に徴すると、ＬＸＲおよびＲＸＲ核レポーターは、ＡＢＣ１遺伝子の転写アクチベータについてのかなり可能性のある候補である。ＬＸＲおよびＲＸＲレポーターがＡＢＣ１遺伝子発現で役割を演じるか否かを判断するために、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡのレベルを、２０−ヒドロキシコレステロールおよび９−シスレチノイン酸に応答して測定した。
マウスＲＡＷ２６４．７細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集下まで増殖させ、次いで、９−シスレチノイン酸（１０μＭ）、２０−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）または双方のいっしょにしたリガンド（２０μＭ合計）を含む無血清ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で２４時間処理した。対照細胞はエタノールビヒクルのみを摂取した（０．１％ｖ／ｖ）。ＲＮＡを抽出しＤＮａｓｅで処理し、実施例９に記載したごとくＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いるＲＴ−ＰＣＲによってＡＢＣ１ ｍＲＮＡを測定した。図９は、２０−ヒドロキシコレステロールまたは９−シスレチノイン酸いずれかでの処理の結果、ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ発現が増加することを示す。加えて、実施例９はいっしょにした双方のリガンドでの処理の結果、顕著な相乗的効果がもたらされ、いずれかのリガンド単独で観察されたＡＢＣ１発現に対しほぼ６倍増加することを示す。これらの結果は核受容体ＬＸＲおよびＲＸＲに対するリガンドがＡＢＣ１遺伝子の発現を増加させることができるのを示す。
（実施例１１）
本実施例は、原形質膜におけるＡＢＣ１蛋白質の増強された発現は脂質流出に関連することを示す。
細胞−表面標識および免疫沈殿を用いて、原形質膜中でのＡＢＣ１蛋白質の増加した発現がコレステロール流出の増加と相関するか否かを判断した（図１０）。細胞表面のＡＢＣ１の相対的量は、無傷細胞上の表面蛋白質を膜不浸透性剤スルホ−ＮＨＳ−ビオチンで架橋させ、続いて、膜可溶化、ＡＢＣ１抗体での免疫沈殿、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびストレプトアビジンでの検出での工程によって測定した。
細胞培養：正常およびＴＤ１繊維芽細胞を実施例１に記載したごとく不死化した。正常およびＴＤ１細胞双方を制御条件およびアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出を増加させることが知られている条件（Ｏｒａｍ．ら，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．，４０：１７６９−１７８１（１９９９））下で培養した。対照細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するまで増殖させ、次いで、添加物なくしてＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８時間インキュベートした（対照）。ｃＡＭＰ−処理細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するまで増殖させ、次いで、１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを含むＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で１８時間インキュベートした（ｃＡＭＰ）。コレステロール−負荷細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で密集するまで増殖させ、次いで、３０μｇ／ｍｌコレステロールを含むＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で４８時間、および添加物なしで１８時間インキュベートした（コレステロール）。ｃＡＭＰで処理したコレステロール−負荷細胞をＤＭＥＭ／１０％中で密集するまで増殖させ、次いで、３０μｇ／ｍｌコレステロールを含むＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で４８時間、および１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを含むので１８時間インキュベートした（コレステロール＋ｃＡＭＰ）。
細胞−表面標識：原形質膜ＡＢＣ１の選択的標識のために、１ｍｇ／ｍｌスルホ−ｎｈＳ−ビオチン（３０μｇ／ｍｌコレステロールを含む（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ．ＩＬ；Ｃａｔ．＃２１２１７）を含有する９℃で３０分間ビオチン化した（Ｗａｌｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０：１４００９−１４０１４（１９９３））参照。
免疫沈殿：ヒトＡＢＣ１のＣ−末端に位置した推定ペプチドＫＮＱＴＶＶＤＡＶＬＴＳＦＬＱＤＥＫＶＫＥＳに対応する合成ペプチドに対してＡＢＣ１についてのウサギ抗血清を生起させた。１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）およびプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（１ｍＭ）、およびペプスタチン（１ｍＭ）、およびアプロチニン（１ｍＭ）を含有するＰＢＳ中で細胞を可溶化することによって、免疫沈殿を行った。細胞抽出物を１：２００希釈にて抗−ＡＢＣ１抗血清で細胞抽出物を４℃にて一晩インキュベートし、５μｌのプロテインＡ−被覆磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ；Ｃａｔ．＃１００１．０１）と共にさらに１時間インキュベートした。抗体−抗原複合体を磁石で沈降させ、ビーズを１％トリトン−Ｘ／ＰＢＳで２回洗浄し、蛋白質を酢酸で１％溶出させた。
ＡＢＣ１蛋白質の検出：溶出したビオチン化蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％ゲル；１５０Ｖ、５時間）に付し、ニトロセルロース膜（２００ｍＡ、１８時間）に移した。該ニトロセルロースをストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｃａｔ．＃ＲＰＮ１２３１）でプローブし、３００倍希釈し、販売業者のプロトコル（Ａｍａｅｒｓｈａｍ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従って増強された化学ルミネセンス標識（ＥＣＬ）によって検出した。細胞内蛋白質の可能なビオチン化につきテストするために、免疫沈殿後上清を細胞内蛋白質β−ＣＯＰに対するマウスモノクローナル抗体で処理し、免疫沈殿したビオチン化β−ＣＯＰをストレプトアビジンブロッティングによってアッセイした。何も検出されなかった。
結果：図１０にしめすごとく、２４０ｋＤａのＡＢＣ１蛋白質がダブレットとして出現する。正常（１０Ａ）およびＴＤ１（１０Ｂ）双方において、ＡＢＣ１蛋白質は原形質膜に部分的に局所化される。同様の結果が、第２の正常繊維芽細胞系で、およびＴＤ２繊維芽細胞で観察された（データは示さず）。ＡＢＣ１の細胞−表面発現は、血清中で増殖させた細胞（正常およびＴＤ１細胞）を８−Ｂｒ−ｃＡＭＰで処理した場合にわずかに増加した。正常およびＴＤ１細胞双方の血清枯渇およびコレステロール−負荷はＡＢＣ１の細胞−表面発現を顕著に増加させ、これはｃＡＭＰ処理によってさらに増強された。これらの結果は、細胞表面におけるＡＢＣ１の発現が、アポリポ蛋白質−媒介脂質流出を増強する条件によって調節され、これは原形質膜へのその局所化がその脂質輸送機能において鍵となる役割を果たすという考えに合致することを示す。ＴＤ１およびＴＤ２細胞における突然変異は、ＡＢＣ１の発現またはプロセッシングをひどくは損なわないようであり、これは、脂質輸送またはアクセサリー蛋白質との相互作用に対する二次効果がそのＮＨ2末端ドメイン（ここで突然変異が起こる）に依存することを示唆する。
（実施例１２）
本実施例は、ホスホジエステラーゼ阻害剤のごとき３’、５’環状ＡＭＰの分解を阻害する剤がマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流出を増加させることを示す。
図１０に示すごとく、ｃＡＭＰはＡＢＣ１の活性を増加させる。本実験は、上昇したｃＡＭＰの存在下でマクロファージ細胞からのコレステロール流出を測定するために行った。上昇したレベルのｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ合成を刺激するか、またはｃＡＭＰの分解を阻害する剤の存在下で達成することができる。例えば、ロリプラムは、ホスホジエステラーゼ（ｃＡＭＰを分解する一群の酵素）を阻害することによってｃＡＭＰレベルを調節する化合物である。コレステロール流出に対する上昇したｃＡＭＰの効果は、実施例１に記載されたアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出アッセイを用いて測定した。略言すれば、１．２５×１０5細胞／ｍｌの密度で懸濁させたＲＡＷ２６４．７細胞を、ピルベートを補足したＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。２４時間後、培地を取り出し、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ＋放射性標識コレステロール（１μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］−コレステロール）および５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬで２４時間で置き換えた。次いで、ＤＭＥＭ／ＢＳＡ＋アポＡ−Ｉ単独（２０μｇ／ｍｌ）、アポＡ−Ｉおよび８−ブロモ３’、５’ｃＡＭＰ（１ｍＭ）またはアポＡ−Ｉおよびロリプラム（５０μＭ）いずれかよりなる平衡培地中で細胞を２４時間維持した。１２−２４時間後、実施例１に記載したごとくシンチレーションカウンティングによって［3Ｈ］コレステロール流出を測定し、培地に出現する全放射性標識コレステロールのパーセンテージとして計算した。結果は、アポＡ−Ｉを摂取しなかったコレステロール−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を示し、他方、アポＡ−Ｉのみを摂取した細胞は５％流出を示すことを示した。アポＡ−ＩおよびｃＡＭＰを摂取したコレステロール−負荷細胞は３２％コレステロール流出を示し、これは上昇したｃＡＭＰがコレステロール流出を促進することを示す。同様に、アポＡ−Ｉおよびホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラム）を摂取した細胞は１７％コレステロール流出を示した。
（実施例１３）
本実施例は、ＬＸＲ、ＲＸＲおよびＰＲＡＲ核受容体のごとき核受容体に対するリガンドである剤がマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流出を増加させることを示す。
核受容体に対するリガンドがアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出に影響するか否かを判断するために、実施例１２に記載したアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出アッセイを用いて種々のリガンドをテストした。核受容体スーパーファミリーは、脂質代謝に関係づけられてきた（Ｒｕｓｓｅｌｌ．Ｄ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ，９７：５３９−５４２（１９９９）；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ，９３：１５３−１５５（１９９８）；Ｊａｎｏｗｓｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３８３：７２８−７３１（１９９６））肝臓受容体ＬＸＲ、レチノイド受容体ＲＸＲおよびペルオキシソームプロリフェレーター−媒介受容体ＰＰＡＲのごときいくつかのメンバーを含む。さらに、これらの受容体をいくつかに対するリガンドは血漿ＨＤＬを増加させることが観察されており、遺伝子発現プロファイリング（マイクロアレイ）データは、ホルモン受容体が参加されたＬＤＬを介してコレステロール負荷に応答することを示した。前記したアッセイを用い、９シス−レチノイン酸（ＲＸＲリガンド）、オキシステロール（ＬＸＲリガンド）およびフェンフィブレート（ＰＰＡＲリガンド）をテストして、コレステロール流出に対する効果を測定した。アポＡ−Ｉを摂取しなかったコレステロール−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を示し、他方、アポＡ−Ｉのみを摂取した細胞は５％流出を示した。対照的に、アポＡ−Ｉおよび９シス−レチノイン酸（３０ｎｇ／ｍｌ）を摂取したコレステロール−負荷細胞は１６％コレステロール流出を示した。アポＡ−Ｉおよびオキシステロール（５μｇ／ｍｌ）を受容する細胞は１４％コレステロール流出を示した。アポＡ−Ｉおよびフェンフィブレート（３μｇ／ｍｌ）を摂取した細胞は１０％コレステロール流出を示した。これらの結果は、ホルモン受容体を変調して、マクロファージからのアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができるのを示す。
さらに、種々の濃度の９−シス−ＲＡ（０．３ｎｇ／ｍｌ、３．０ｎｇ／ｍｌまたは３０ｎｇ／ｍｌ）を用いて流出アッセイを行うと、結果は、９−シス−ＲＡが用量依存的にマクロファージからのコレステロール流出を媒介することを示した。具体的には、対照細胞（アポＡ−Ｉのみ）は１８９０ｃ．ｐ．ｍ．を示し、０．３ｎｇ／ｍｌの９−シス−ＲＡは１５２２ｃ．ｐ．ｍ．を示し、３．０ｎｇ／ｍｌの９−シス−ＲＡは３５６８ｃ．ｐ．ｍ．を示し、および３０ｎｇ／ｍｌの９−シス−ＲＡは８５９７ｃ．ｐ．ｍ．を示した。加えて、ＲＡＷ２６４．７細胞を４８時間コレステロール−負荷させる同様のアッセイを用い、２２−ヒドロキシコレステロール（ＬＸＲリガンド）およびベンズフィブレートのごとき他の核受容体アクチベータはコレステロール流出を増加させることが示された（データは示さず）。
（実施例１４）
本実施例は、プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＰＧ１２のごときエイコサノイドがマクロファージ細胞からのアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ−媒介流出を増加させることを示す。
プロスタグランジンおよびプロスタサイクリンのごときエイコサノイドは、高コレステロール血症の治療で効果的であることが示されている。エイコサノイドがアポリポ蛋白質−媒介流出に影響するか否かを判断するために、実施例１２に記載されたアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出アッセイを用いてＰＥＧ１およびＰＧ１２をテストした。このアッセイは、アポＡ−Ｉを摂取したコレステロール−負荷対照細胞は３％コレステロール流出を有し、アポＡ−Ｉのみを摂取した細胞は５％流出を有することを示した。アポＡ−ＩおよびＰＧ１２（２５ｎＭ）を摂取したコレステロール−負荷細胞は１０％コレステロール流出を示した。アポＡ−ＩおよびＰＥＧ１（２５ｎＭ）を摂取した細胞は１５％コレステロール流出を示した。これらの結果は、エイコサノイドがマクロファージからのアポリポ蛋白質−媒介コレステロール流出の速度を増加させることができるのを示す。
（実施例１５）
本実施例は、ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を用いて、ＡＢＣ１遺伝子発現を調節する能力につき化合物をテストすることができるのを示す。
ｐＧＬ３レシフェラーゼレポーターベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、組換えプラスミドを創製し、ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子発現を測定した。
レポータープラスミドの構築：プロモーターなしのルシフェラーゼ遺伝子を含有する対照プラスミドとして、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｎｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ；Ｃａｔ．＃Ｅ１７５１）を用いた。ＡＢＣ１プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーターは、ＡＢＣ１遺伝子（ｈＡＰＲ１ ５’プロモーター、配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６４３に対応）の５’フランキング領域からのゲノム断片をＧＬ３−ＢａｓｉｃプラスミドのＳａｃＩ部位にクローンして、プラスミドＧＬ−６ａを得ることによって作成した。つぎに、プラスミドＧＬ−６ａをＳｐｅＩおよびＡｃｃ６５Ｉで消化した。配列番号：３のヌクレオチド１−１５４２に対応するＡＢＣ１ゲノム配列を表す、ラムダサブクローンから切り出したＢｓｉＷＩ−ＳｐｅＩ断片を、この消化によって生じた残りのベクター：ＡＢＣ１プロモーターに連結した。得られたプラスミドｐＡＰＲ１は、ヒトＡＢＣ１プロモーター配列の１．７５ｋｂの転写制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。
レポーター構築体のトランスフェクション：前記対照またはｐＡＰＲ１プラスミドを、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中に維持したＲＡＷ２４６．７細胞の密集培養にトランスフェクトした。１２ウエル皿の各ウエルを、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ３−プロモーターまたはｐＡＰＲ１ ＤＮＡ（１μｇ）、ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（１μ）および１２μｌのＧｅｎｅｐｏｒｄｅｒ試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｃａｔ．＃Ｔ２０１００７）いずれかで５時間トランスフェクトした。加えて、０．１μｇのｐＧＭＶβプラスミドＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，Ｃａｔ．＃６１７７−１）を、トランスフェクション効率のための対照として添加した。５時間後、培養培地を、アセチル化ＬＤＬ（１００βｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で無血清ＤＭＥＭ／ＢＳＡで置き換え、２４時間インキュベートした。
高スループットスクリーニングにおける負荷された便宜のために、培養された細胞を、以下の手法を用いレポータープラスミドで安定にトランスフェクトすることができる。まず、５０μｌのＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中、５×１０6ＲＡＷ２６４．７細胞を、９μのｐＭＰＲ１プラスミドおよびｐＣＭＶｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）で６０ｍｍ皿中で５時間トランスフェクトする。引き続いて、トランスフェクション培地を完全培地で置き換え、細胞を３７℃にて一晩インキュベートする。引き続いて、１：５ないし１：１０００の範囲の希釈にて細胞を別々の皿に移し、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含有する選択培地中で２０日間インキュベートする。目に見えるコロニーを拾い、増殖させ、後記するごとくルシフェラーゼ活性につきアッセイした。この方法を用い、ルシフェラーゼ活性につき陽性の５つのクローン細胞系が、高スループットアッセイで用いるために同定された。
ルシフェラーゼアッセイ：トランスフェクションに続き、各ウエル中の細胞を７０μｌの１Ｘ細胞溶解試薬８Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｃａｔ．＃Ｅ３９７１）中で溶解させ、凍結−解凍の１サイクルに付し、溶解物を１２、０００ｇにおいて５分間の遠心によって除去した。遠心後に、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｃａｔ．＃Ｅ１５０１）を１０μｌの溶解物に添加した。各溶解物のルシフェラーゼ活性を、ルミノメータを用いて光単位として測定した。加えて、製造業者の指示（Ｔｒｏｐｉｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ：Ｃａｔ．＃ＢＬ１００Ｇ）に従い、Ｇａｌａｃｔｏ−光キット中に供給された化学ルミネセントアッセイ試薬を用いて、各溶解物のβ−ガラクトシラーゼを測定した。ルシフェラーゼ活性値を測定されたβ−ガラクトシラーゼ値で割ることによって、各溶解物についての正規化されたルシフェラーゼ活性を決定し、相対的光単位として報告する。
結果：ｐＡＰＲ１でトランスフェクトされた細胞で検出されたルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼｃＤＮＡのみを含有するｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミドでトランスフェクトされた対照細胞で検出された活性よりも３．３倍高かった。これらの結果は、ＡＢＣ１の転写調節領域が所定の位置にあることを示した。ｐＡＰＲ１でトランスフェクトした細胞を１００μｇ／ｍｌアセチルＬＤＬとともに２４時間インキュベートすると、ルシフェラーゼ活性はアセチルＬＤＬで処理されていない細胞におけるよりも３．２５倍高かった。これらの結果は、ゲノムＡＢＣ１配列が、天然ＡＢＣ１遺伝子のコレステロール負荷応答を媒介する５’フランキング領域で見出される「コレステロール応答性」エレメントを含有することを示唆する。このレポーター系は、他の化合物をテストして化合物がＡＢＣ１発現を変調するか否かを決定するのにも用いることができる。
（実施例１６）
本実施例は、内因性ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を用い、ＡＢＣ１遺伝子発現を調節する能力につき化合物をテストするのに用いることができるさらなるアッセイを示す。
このアッセイは、プロモーター無しのレポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子を含有する組換えベクターを構築することを含む。該ベクターを線状化し、レポーター遺伝子が内因性ＡＢＣ１プロモーターの下流の細胞ゲノムに組み込まれるように細胞にトランスフェクトする。このアッセイを用い、レポーター遺伝子の発現は、テスト化合物に応答して内因性ＡＢＣ１プロモーターによって駆動される。
レポータープラスミドの構築：プロモーターなしのレポーター遺伝子を含有する組換えベクターは、（ＡＢＣ１開始部位を含む）エクソン０およびイントロン１の部分を含有するＡＢＣ１の７ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノム断片で出発して作成することができる。部位特異的突然変異誘発を用い、２つの既知の開始部位の上流のエクソン０配列に、ＳａｌＩ制限部位を生じさせることができる。組換えベクターは、ルシフェラーゼのごときプロモーター無しのレポーター遺伝子、およびピューロマイシン抵抗性のごときプロモーター無しの選択マーカーそ含むＤＮＡ断片をＳａｌＩ部位に挿入することによって生じさせる。内部リボソームエントリーシグナルは、遺伝子が正しい向きに転写されるようにレポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の間に挿入すべきである。組換えベクターは２つのＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を含有し、そのうちの１つは、例えば、部位−特異的突然変異誘発を用いて排除されなければならない。エクソン０の上流に位置した残りのＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を用いてベクターを線状化する。
レポーター構築体のトランスフェクション：レポーター遺伝子およびマーカー遺伝子を含有する線状化組換えベクターを、当該分野で知られた種々のトランスフェクション方法のいずれかによって、ヒト細胞を含めた培養細胞に導入する。例えば、実施例１５に記載された方法を用い、線状化ベクターをトランスフェクトすることができる。線状化組換えベクターは、ベクターが内因性ＡＢＣ１遺伝子の部位において細胞ゲノムに組み込まれるようにするＡＢＣ１配列を含有する。培養培地への適当な抗生物質の添加は、レポーター遺伝子およびマーカー遺伝子が正しい向きで内因性ＡＢＣ１プロモーターの下流に組み込まれている細胞のみの選択を可能とする。例えば、もしベクターがレポーター遺伝子の下流に挿入されたピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有するならば、トランスフェクトされた細胞はピューロマイシンの存在下で増殖するはずである。適切に組み込まれたピューロマイシン抵抗性遺伝子を有し、それにより、機能的な蛋白質をコードすることができる細胞のみがピューロマイシンの存在下で生存する。かくして、トランスフェクトされた細胞は、適当な抗生物質の存在下でＡＢＣ１プロモーター活性を誘導する条件下で増殖するはずである。生存する細胞をクローン的に培養することができ、ＰＣＲまたはサザーンブロット分析を用いてＤＮＡを配列決定し、ゲノム配列の適切な組込につきテストすることができる。
内因性ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含有する得られた細胞を用いて、テスト化合物がＡＢＣ１の発現を変調するか否かを決定することができる。化合物のＡＢＣ１変調活性は、テスト化合物に暴露された細胞で見出されるレポーター遺伝子発現のレベルをアッセイすることによって決定される。例えば組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞を用いて、化合物に暴露された細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の量を測定することによって、テスト化合物のＡＢＣ１変調活性を決定することができる。
（実施例１７）
本実施例は、核受容体に対するリガンドが、ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現を上昇調節することを示す。
ＬＸＲα、ＬＸＲβおよびＲＸＲα核レポーターに対するリガンドがＡＢＣ１遺伝子発現を調節できるか否かを判断するために、ＡＢＣ１プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するｐＡＰＲ１プラスミドを、核受容体に対する少なくとも１つのリガンドで処理したＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトした（図１２）。
レポーター構築体の構築およびトランスフェクション：レポーター構築体ｐＡＰＲ１および対照レポーター構築体ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを実施例１５に記載されているごとく得た。ＲＡＷ２６４．７細胞を培地に維持し、実施例１５に記載されたごとくｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１μｇ）またはｐＡＰＲ（１μｇ）いずれかでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＲＡＷ３６４．７細胞をエタノール（ＥｔＯＨ）（０．１％ｖ／ｖ）、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０（Ｓ）ＯＨ−コール）（１０μＭ）、９−シスレチノイン酸（９−シス（ＲＡ）（１０αＭ）または２０（Ｓ）ＯＡ−コールおよび９−シスＲＡ（合計２４μＭ）双方のいずれかで２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性を測定し、実施例１５に記載されたごとく相対的光単位として報告する。
結果：この実験の結果は図１２に示す。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃでトランスフェクトした対照細胞はルシフェラーゼ活性を示さなかった（データは示さず）。ＥｔＯＨ対照と比較し、ｐＡＰＲ１でトランスフェクトされた細胞は２０ＯＨ−コールの存在下でルシフェラーゼレポーター活性の１９倍増加を生じ、９−シスＲＡの存在下でルシフェラーゼ活性の１６倍増加を生じ、および双方のリガンドの存在下でルシフェラーゼ活性の２８０倍増加を生じた。これらの結果は、ステロールおよびレチノイドの双方はｐＡＰＲ１におけるＡＢＣ１ ５’フランキング配列からの強力な転写応答を誘導することを示す。さらに、双方のリガンドで処理した細胞で見出されたルシフェラーゼ活性の劇的な増加によってわかるごとく、２つのクラスの化合物の明らかな相乗効果がある。ＬＸＲαおよびＲＸＲαレポーターは活性なヘテロダイマーを形成することが知られている。かくして、双方の核受容体のリガンド−誘導活性化は同時に転写の観察された相乗的増加を生じ得る。
これらのデータは、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールのごときヒドロキシステロール、および９−シスレチノイン酸のごときレチノイドがＡＢＣ１プロモーターを活性化することを示し、これは、これらおよび関連する化合物が、マクロファージ細胞においてＡＢＣ１発現を増加させて、過剰のコレステロールの末梢部位を取り除く治療化合物の開発で有用で有り得ることを示す。加えて、本発明のＡＢＣ１プロモーター／レポーター遺伝子スクリーニングアッセイを用いて、ＡＢＣ１発現を増加させる他の化合物をスクリーニングし、さらなる治療化合物を同定することができる。
（実施例１８）
本実施例は、ＬＸＲ応答エレメントの同定を含めたＡＢＣ１プロモーター領域のさらなる特徴付けを示す。
ＡＢＣ１の５’フランキング領域のいずれの部分が核リガンドに応答して転写活性を保持するかを判断するために、５’フランキング領域の異なる部分およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する種々のプラスミドを、核受容体に対する少なくとも１つのリガンドで処理したＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトした。この系を用い、配列番号；３のヌクレオチド１４８０−１５１０に対応するステロール応答エレメントを同定した。該ステロール応答エレメントは直接反復−４エレメントＴＧＡＣＣＧａｔａｇＴＡＡＣＣＴを含有する。部位−特異的突然変異誘発およびバンド−シフトアッセイ技術を用いてステロール応答エレメントの確認が得られた。
レポーター構築体の構築：レポーター構築体ｐＡＰＲ１および対照レポーター構築体ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃは実施例１５に記載されているごとく得られた。また、配列番号；３のヌクレオチド１−１５２３、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２−１６４３また１３９４−１６４３いずれかを含有するレポーター構築体を構築した。配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６２３を含有するレポーター構築体（ＧＬ−６ａ）は実施例１５に記載したごとく構築した。配列番号：３のヌクレオチド１−１５３２を含有するレポーター構築体は、ｐＡＰＲ１をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ついで、ゲル−精製ベクター断片を再び連結することによって構築した。ヌクレオチド１１８１ないし１６４３を含有するレポーター構築体は、まずＧＬ−６ａをＳｔｙＩで消化し、粘着末端をクレノウ酵素で平滑とし、得られたベクターをＳａｃＩで消化し、ついで、４６２塩基対平滑−ＳａｃＩ粘着末端断片を単離することによって構築した。ＧＬ−６ａをＡｃｃ６５Ｉで消化し、粘着末端をクレノウ酵素で平滑とし、ＳａｃＩで消化し、ついで、ベクター断片をゲル単離することによって得られたベクターにこれをクローンした。ヌクレオチド１２９２−１６４３を含有するレポーター構築体は、ＧＬ−６ａをＡｃｃ６５Ｉで連続的に消化し、末端をクレノウ酵素で平滑とし、ＳａｃＩＩで消化し、末端をＴ４ポリメラーゼで平滑とし、ついで、ゲル−単離ベクター断片を再び連結することによって構築した。ヌクレオチド１２９４−１６４３を含有するレポーター構築体は、ＧＬ−６ａをＡｃｃ６５Ｉで消化し、末端をクレノウ酵素で平滑とし、ＡｐａＩで引き続いて消化し、Ｔ４ポリメラーゼで末端を平滑とし、ついで、ゲル−単離ベクター断片を再び連結することによって構築した。
レポーター構築体のトランスフェクション：実施例１５に記載された方法に従い、ＲＡＷ２６４．７細胞を培養に維持し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１μｇ）、ｐＡＰＲ１（１μｇ）または他のレポーター構築体の内の１ついずれかでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞をエタノール（ＥｔＯＨ）（０．１％ｖ／ｖ）、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０（Ｓ）ＯＨコール）（１０μＭ）、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）ＯＨ−コール）（１０μＭ）、９−シスレチノイン酸（９−シスＲＡ）（１０μＭ）、または２０（Ｓ）ＯＨ−コールおよび９−シスＲＡ（合計２０μＭ）双方のいずれかで２４時間処理した。実施例１５に記載されているごとく、ルシフェラーゼ活性を測定し、相対的光単位として報告した。
部位−特異的突然変異誘発：配列番号：３のヌクレオチド１４８０−１５１０に対応するステロール応答エレメントを、部位−特異的突然変異誘発を用いて前記１０８０−１６４３配列中に突然変異した。具体的には、製造業者のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、直接反復−４エレメントＴＧＡＣＣＧａｔａｇＴＡＡＣＣＴを含有する応答エレメントをＣＴＧＣＡＣａｔａｇＴＡＡＣＣＴに突然変異した。
ゲル−シフトアッセイ：Ｏｈｌｌｓｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，４５：３５−５５（１９８６）の方法によって、核抽出物をＲＡＷ２６４．７細胞から調製した。ＬＸＲ応答エレメント（ＴＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡ；配列番号：５６）およびその突然変異したカウンターパート（ＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡ；配列番号：５７）に対応する32Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（５ｎｇ）を、ＬＸＲαおよびＬＸＲβ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−１５９１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する１μｇ抗血清またはＲＸＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−７７４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する抗血清の存在または不存在下、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、６６．６μｇ／ｍｌのポリ（ＤｉｄＣ）および１０％グリセロール中で、室温にて３０分間、５μｇの核蛋白質と共に個々にインキュベートした。蛋白質−ＤＮＡ複合体を、０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１５０Ｖにて４％非−変成ポリアクリルアミドゲルに１．５時間適用した。蛋白質−ＤＮＡ複合体は乾燥したゲルのオートラジオグラフィーによって検出した。
結果：配列番号：３のヌクレオチド１−１６４３（すなわち、ｐＡＰＲ１）、１−１５３２、１０８０−１６４３、１１８１−１６４３、１２９２１６４３，または１３９４−１６４３）に対応する５’フランキング領域を含有する個々のレポーター構築体でのトランスフェクション（各々は同一結果を生じた）。個々の構築体の全ては、ＥｔＯＨ対照と比較して、２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは２２（Ｒ）ＯＨ−コールの存在下で、ルシフェラーゼレポーター活性の３ないし４倍増加を生じた。また、個々の構築体の全ては、９−シスＲＡの存在下でルシフェラーゼレポーター活性の８ないし１０倍増加を生じた。加えて、構築体のいずれかでのトランスフェクションは、ＥｔＯＨ対照と比較して、オキシステロールリガンド（（２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは２２（Ｒ）ＯＨコール）いずれか）およびレチノイドリガンド（９−シスＲＡ）の存在下で、ルシフェラーゼ活性の２５ないし５０倍増加を生じ、これは相乗的相互反応を示す。記載された構築体の各々は、テストしたリガンドに応答してルシフェラーゼ活性の匹敵するレベルを示し、これは、より短い５’フランキング配列がステロールおよびレチノイドについての転写調節配列を含有したことを示す。具体的には、これらの結果は、ステロールおよびレチノイドについての転写調節配列が配列番号：３のヌクレオチド１３９４−１５３２に対応する５’フランキング領域に位置することを示した。
これらの結果は、配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６４３に対応する野生型配列を含有するレポーター構築体および配列番号：３のヌクレオチド１０８０−１６４３に対応する突然変異した配列を含有するレポーター構築体を用いるルシフェラーゼ活性によって確認され、ここに、ヌクレオチド１４８０−１５００で見出されたステロール応答エレメントは前記したごとく突然変異させた。野生型配列でのトランスフェクションは、２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは９−シスＲＡ単独いずれかの存在下で、ルシフェラーゼ活性の増加によって測定して転写応答を生じ、リガンドを一緒にした双方の存在下で相乗的応答を生じた。対照的に、突然変異した配列でのトランスフェクションは、２０（Ｓ）ＯＨ−コールまたは２２（Ｒ）ＯＨ−コールの存在下で転写応答を生じなかった。突然変異した配列のトランスフェクションは９−シスＲＡに対する低下した応答を保持し、野生型配列で観察された８ないし１０倍増加よりもむしろ、転写活性の４ないし５倍増加を生じた。また、突然変異した配列のトランスフェクションは、２０（Ｓ）ＯＨ−コールおよび９−シスＲＡを一緒にした存在下で観察された相乗的転写応答を無くした。これらの結果は、さらに、ステロールコンセンサス配列（ヌクレオチド１４８０−１５１０）およびその突然変異したカウンターパートを用いるゲルーシフトアッセイによって確認した。ゲル−シフトアッセイは、ＲＡＷ２６４．７細胞から単離された核結合蛋白質がステロールコンセンサス配列に結合したが、核蛋白質は突然変異した配列に結合しなかったことを示した。さらに、ＬＸＲ抗血清の存在下での野生型ステロールコンセンサス配列との核蛋白質のインキュベーションの結果、スーパーシフテッド複合体（すなわち、抗体−蛋白質−ＤＮＡ複合体）が形成され、核受容体ＬＸＲに結合するステロール応答エレメントとしての配列が同定された。対照的に、ＲＸＲ抗血清の存在下での野生型ステロール応答エレメントとの核蛋白質のインキュベーションの結果、スーパーシフテッド複合体は形成されず、これは、ＲＸＲがこの配列に結合しないことを示す。これらの結果は、コンセンサス配列に結合する核蛋白質を破壊する突然変異がＬＸＲリガンドに対する転写応答を無くさせ、ＲＸＲリガンドに対する応答を減少させることを示す。さらに、ＬＸＲまたはＲＸＲ抗血清の存在下で行った核結合実験により、ヌクレオチド１４８０−１５１０で見出されたコンセンサス配列はＬＸＲ応答エレメントであることが確認された。このエレメントは、また、９−シスＲＡに対する部分的応答を媒介する。
特許および刊行物を含めた本明細書中に引用した文献の全ては、出典明示してその全体を本明細書に一体化させる。本発明を本発明の好ましい態様に対する強調を持って記載してきたが、好ましい実施形態の変形を用いることができ、本発明はここに具体的に記載された以外に実施できることが意図されることは当業者に明らかであろう。従って、本発明は、前記した特許請求の範囲によって定義された本発明の精神および範囲内に含まれる全ての修飾を含む。
図１Ａ−Ｄは、対照コレステロール流出、および正常繊維芽細胞（１Ａ、Ｃ）およびタンジール病患者からの繊維芽細胞（１Ｂ、Ｄ）からのＨＤＬおよびアポＡ−Ｉの存在下でのコレステロール流出の結果を示すグラフである。塗りつぶしていない丸はＨＤＬまたはアポＡ−Ｉに暴露されなかった細胞からのコレステロール流出を表し、塗りつぶした丸はＡＤＬに暴露された細胞からのコレステロール流出を表し、塗りつぶした菱形はアポＡ−Ｉに暴露されたコレステロール流出を表す。 図２は、タンジール患者（ＴＤ１）からの細胞で見出された遺伝子発現および正常細胞で見出されたそれの比較を示す遺伝子発現マイクロアレイ分析のグラフ表示であり、それにより、合計５８、８００ヒトｃＤＮＡはｃＡＭＰ−処理ＴＤ１細胞ｃＤＮＡのｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（Ｃｙ３色素で標識）と、およびｃＡＭＰ−処理正常細胞のｍＡＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ（Ｃｙ５色素で標識）とハイブリダイズした。 図３は、ヒトＡＢＣ１遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する組換え発現ベクターｐＣＥＰｈＡＢＣ１の制限地図を示す模式図である。 図４は、公表されたヒトＡＢＣ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＪ０１２３７６）およびＮ−末端に６０のさらなるアミノ酸を有する現在開示され特許請求されたヒトＡＢＣ１アミノ酸配列（「ＣＶＴ」）の間の比較を示す、ヒトＡＢＣ１の遺伝子構造の模式図である。 図５は、ＡＢＣ１輸送阻害剤４、４−ジイソチオシアノスチルベン−２、２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）およびスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）がアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出に対して有する阻害効果を示すグラフ表示であり、ここに、塗りつぶしていない丸はＢＳＰの存在下におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロールを示し、塗りつぶした丸はＤＩＤＳの存在下におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロールを示す。 図６は、アポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出に対するアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドなくしてインキュベートした細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出、３０μＭのβ−グロビンアンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露された細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出、および３０μＭのＡＢＣ１アンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露された細胞におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を示す。 図７は、ヒトＡＢＣ１についての発現プラスミド（ｐＣＥＰｈＡＢＣ１）で安定にトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を用いてＡＢＣ１遺伝子の過剰発現によって引き起こされたアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出の刺激を示すグラフ表示であり、対照親細胞（ｐＣＥＰｈＡＢＣ１無し）におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出およびｐＣＥＰｈＡＢＣ１でトランスフェクトされたクローン細胞（Ｌ３、Ｌ５、Ｌ６）におけるアポＡ−Ｉ−媒介コレステロール流出を示す。 図８は、アルブミン（塗りつぶした棒線）に暴露された、８−ｂＲ−ｃＡＭＰ（塗りつぶしていない棒線）に暴露した、コレステロール−負荷（陰を付けた棒線）に暴露された、またはコレステロール−負荷および引き続いてアポＡ−Ｉ−（ハッチングを施した棒線）に暴露したのいずれかである正常細胞およびタンジール病患者（ＴＤ１およびＴＤ２）からの細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現のレベルを示す逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のグラフ表示である。 図９はエタノール（０．１％ｖ／ｖ）、９−シスレチノイン酸（９−シスＲＡ；１０μＭ）、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２０（Ｓ）−ＯＨ；１０μＭ）、または９−シスＲＡおよび２０（Ｓ）−ＯＨ（各々１０μＭ）いずれかに暴露されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＡＢＣ１遺伝子発現のレベルを示すＲＴ−ＰＣＲ分析の結果のグラフ表示である。 図１０は、添加物無し（対照）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）、コレステロール（３０μｇ／ｍｌ）またはコレステロールおよび８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（各々、３０μｇ／ｍｌおよび１ｍＭ）の存在下で正常繊維芽細胞（ＮＬ１、１０Ａ）およびタンジール病患者（ＴＤ１、１０Ｂ）で見出された細胞−表面ＡＢＣ１蛋白質のレベルを示す免疫沈殿分析の結果を示す。 図１１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に位置したＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域を含有する、組換え発現ベクターｐＡＰＲ１の制限地図を示す模式図である。 図１２は、ＥｔＯＨ（対照）、２０（Ｓ）−ＯＨ（１０μＭ）、９−シスＲＡ（１０μＭ）、または２０（Ｓ）−ＯＨおよび９−シスＲＡ双方（各々１０μＭの存在下でｐＡＲＰ１でトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞において誘導されたルシフェラーゼレポーター遺伝子発現のレベルを示すグラフ表示である。 図１３は、ＡＢＣ１遺伝子の５’フランキング領域の模式図である。

Claims (20)

  1. 細胞からのコレステロール流出を増加させるのに十分な量の核受容体に対する少なくとも１つのリガンドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳動物対象からコレステロール流出を増加させるのに適した方法。
  2. 該リガンドがＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳＸＲリガンドよりなる群より選択される請求項１に記載の方法。
  3. 該ＬＸＲリガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５ヒドロキシコレステロールおよび２４（Ｓ），２５エポキシコレステロールよりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
  4. 該リガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールである請求項３に記載の方法。
  5. 該ＲＸＲリガンドが９−シスレチノイン酸、レチノール、レチナール、全ての−トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、アシトレチン、フェンレチニド、エトレチネート、ＣＤ４９５、ＣＤ５６４、ＴＴＮＮ、ＴＴＮＮＰＢ、ＴＴＡＢ、ＬＧＤ１０６９よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
  6. 該リガンドが９−シスレチノイン酸である請求項５に記載の方法。
  7. 少なくとも二種のリガンドが哺乳動物対象に投与される請求項２に記載の方法。
  8. コレステロール流出の増加が、いずれかのリガンド単独でのコレステロール流出のレベルに対して少なくとも２５倍である請求項７に記載の方法。
  9. リガンドが２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロールおよび９−シスレチノイン酸である請求項７に記載の方法。
  10. 哺乳動物対象の細胞においてコレステロール流出を増加させるのに十分な量のエイコサノイドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする該細胞からのコレステロール流出を増加させるのに適した方法。
  11. 該エイコサノイドがプロスタグランジンＥ２、プロスタサイクリン１２およびプロスタグランジンＪ２よりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
  12. 哺乳動物対象の細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させるのに十分な量の核受容体に対するリガンドを哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする該細胞においてＡＢＣ１の発現を増加させるのに適した方法。
  13. 該リガンドがＬＸＲ、ＲＸＲ、ＰＰＡＲ、ＦＸＲおよびＳＸＲリガンドよりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
  14. ａ．遺伝した異常性を持つ第１の個体から第１のＲＮＡ試料を得；
    ｂ．正常な第２の個体から第２のＲＮＡ試料を得；
    ｃ．該第１のＲＮＡ試料からｍＲＮＡを調製して、第１のｍＲＮＡ試料を与え；
    ｄ．該第２のＲＮＡ試料からｍＲＮＡを調製して第２のｍＲＮＡ試料を与え；
    ｅ．該第１のｍＲＮＡ試料を逆転写することによって標識された第１のｃＤＮＡ試料を調製し；
    ｆ．該標識された第１のｃＤＮＡ試料から遺伝子発現アレイを調製し；
    ｇ．該第２のｍＲＮＡ試料を逆転写することによって標識された第２のｃＤＮＡ試料を調製し；
    ｈ．該標識された第２のｃＤＮＡ試料から遺伝子発現アレイを調製し；次いで、
    ｉ．該標識された第１のｃＤＮＡ試料の第１の遺伝子発現アレイをプローブし、かつ該標識された第２のｃＤＮＡ試料の第２の遺伝子発現アレイをプローブし、次いで、第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび第２のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡの間の遺伝子発現の変動を同定する；
    工程を含むことを特徴とする、遺伝した異常性の原因である遺伝子を同定する方法。
  15. 該第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび該第２のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡの間の差を分析して、第２のＲＮＡと比較して過剰発現される第１のＲＮＡ、第２のＲＮＡと比較して過小発現される第１のＲＮＡ、第２のＲＮＡと比較して存在しない第１のＲＮＡ、および第２のＲＮＡと比較して存在する第１のＲＮＡよりなる群から選択される特性を同定する請求項１４に記載の方法。
  16. 該異常性がネガティブな異常性である請求項１４に記載の方法。
  17. 該個体が哺乳動物である請求項１４に記載の方法。
  18. 該哺乳動物がヒトである請求項１７に記載の方法。
  19. 該第１のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡおよび該第２のｃＤＮＡ試料に対応するＲＮＡの間の少なくとも１つの変動を評価して、それが異常性に寄与するかを決定する請求項１４に記載の方法。
  20. 第１の個体と同一の異常性を有する第３の個体から第３のＲＮＡ試料を得、工程（ａ）−（ｇ）の方法を反復して、第１のＲＮＡ試料に代えて第３のＲＮＡ試料で置き換え、第１と第２、および第２と第３の間の差を比較し、次いで、異常個体に共通する遺伝子発現の差を同定する、請求項１４に記載の方法。
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1854880A1 (en) * 1999-03-15 2007-11-14 University of British Columbia Methods and reagents for modulating cholesterol levels
CA2367955C (en) 1999-03-15 2009-05-19 University Of British Columbia Abc1 polypeptide and methods and reagents for modulating cholesterol levels
WO2001003705A1 (en) * 1999-07-08 2001-01-18 Tularik Inc. Compositions and methods for raising hdl cholesterol levels
EP1239848A2 (en) * 1999-09-01 2002-09-18 University of British Columbia Compositions and methods for modulating hdl cholesterol and triglyceride levels
US6555323B2 (en) * 2000-02-08 2003-04-29 Pfizer Inc. Assay for ABCA1
BR0110541A (pt) 2000-05-02 2003-04-01 Aventis Pharma Sa ácido nucleico isolado, vetor recombinante, célula hospedeira, mamìfero transgênico não-humano, método para triar uma substância ou uma molécula, kit para triar, in vitro, uma molécula ou substância candidato, método para triar, in vivo, uma substância ou molécula, kit ou pacote para triar, in vivo, pelo menos uma molécula ou substância candidato, substância que modifica a transcrição de um polinucleotìdeo de interesse, composição farmacêutica, método e kit para detectar um enfraquecimento da transcrição do gene abc1 em um indivìduo, e, kit ou pacote para triar uma molécula ou substância candidato
EP1203588A1 (en) * 2000-11-06 2002-05-08 Bayer Ag Sterol-independent regulation of ABC1 promoter via oncostatinM
US7033790B2 (en) 2001-04-03 2006-04-25 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
WO2003004692A2 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Xenon Genetics, Inc. Screening processes for agents modulating cholesterol levels
WO2003033023A1 (fr) * 2001-10-12 2003-04-24 Grelan Pharmaceutical Co., Ltd. Medicaments ameliorant l'hypocholesterolemie hdl
US6924311B2 (en) 2001-10-17 2005-08-02 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Methods for affecting various diseases utilizing LXR compounds
ES2367539T3 (es) 2001-12-21 2011-11-04 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Moduladores heterocíclicos de receptores nucleares.
US7482366B2 (en) 2001-12-21 2009-01-27 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Modulators of LXR
AU2002351412B2 (en) 2001-12-21 2010-05-20 Exelixis Patent Company Llc Modulators of LXR
WO2004058717A1 (en) 2002-12-20 2004-07-15 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Isoquinolinone derivatives and their use as therapeutic agents
US8466143B2 (en) 2003-07-23 2013-06-18 Exelixis, Inc. Azepine derivatives as pharmaceutical agents
WO2005116057A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-08 Baker Medical Research Institute Monoclonal antibody against abca1
MX363423B (es) 2005-05-18 2019-03-22 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
MX2007014564A (es) 2005-05-20 2008-02-07 Ablynx Nv Anticuerpos de vhh de dominio unico contra el factor de von willebrand.
CA2613522A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Exelixis, Inc. Imidazole based lxr modulators
US7790745B2 (en) 2005-10-21 2010-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Tetrahydroisoquinoline LXR Modulators
US7741317B2 (en) 2005-10-21 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company LXR modulators
JP5227803B2 (ja) 2006-11-24 2013-07-03 ハイクス ラボラトリーズ合同会社 スピロキノン化合物及び医薬組成物
EP2102244A2 (en) 2006-12-19 2009-09-23 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
US20100062004A1 (en) 2006-12-19 2010-03-11 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
CA2706425A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
JP2011525476A (ja) 2008-03-05 2011-09-22 アブリンクス エン．ヴェー． 新規の抗原結合二量体複合体、その製造方法及び使用
CA2720763A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof
EP2403873A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
US20120053229A1 (en) * 2009-03-31 2012-03-01 The General Hospital Corporation Regulation of MIR-33 MicroRNAs in the Treatment of Cholesterol-Related Disorders
AU2010233658B2 (en) 2009-04-10 2013-11-28 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of IL-6R related diseases and disorders
SI2435410T1 (sl) 2009-05-28 2017-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Lxr modulatorji
WO2011045079A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Intercell Ag Hepatitis b virus specific human antibodies
AR083784A1 (es) 2010-11-08 2013-03-20 Novartis Ag Polipeptidos de enlace de los receptores de quimiocina
TW201242953A (en) 2011-03-25 2012-11-01 Bristol Myers Squibb Co Imidazole prodrug LXR modulators
EP2723772A1 (en) 2011-06-23 2014-04-30 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against ige
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
KR20150023729A (ko) 2012-06-14 2015-03-05 암브룩스, 인코포레이티드 핵 수용체 리간드 폴리펩티드에 접합된 항-psma 항체
US9101745B2 (en) * 2013-03-14 2015-08-11 Sonogene Llc Sonochemical induction of ABCA1 expression and compositions therefor
JP6442475B2 (ja) 2013-03-15 2018-12-19 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｘｒ調節因子
WO2014152738A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Lxr modulators
NL1040254C2 (en) 2013-05-17 2014-11-24 Ablynx Nv Stable formulations of immunoglobulin single variable domains and uses thereof.
GB201315136D0 (en) * 2013-08-23 2013-10-09 Univ Glasgow Cholesterol modulation
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
TN2018000180A1 (en) 2015-11-27 2019-10-04 Ablynx Nv Polypeptides inhibiting cd40l
US11098113B2 (en) 2016-09-15 2021-08-24 Vib Vzw Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
BR112019010061A2 (pt) 2016-11-16 2019-08-13 Ablynx Nv polipeptídeos de recrutamento de células t capazes de se ligarem ao cd123 e tcr alfa/beta
CA3064318A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Merck Patent Gmbh Polypeptides binding adamts5, mmp13 and aggrecan
SG10202113337YA (en) 2017-06-02 2021-12-30 Ablynx Nv Aggrecan binding immunoglobulins
AU2018277343A1 (en) 2017-06-02 2020-01-02 Ablynx N.V. Adamts binding immunoglobulins
EP3630178A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Merck Patent GmbH Mmp13 binding immunoglobulins
CN115433733A (zh) 2021-06-04 2022-12-06 生物岛实验室 环状RNA Circ-ACE2翻译的多肽及其应用
CN114369162B (zh) 2021-12-28 2023-05-30 合肥天港免疫药物有限公司 抗体及其应用
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0110541A (pt) * 2000-05-02 2003-04-01 Aventis Pharma Sa ácido nucleico isolado, vetor recombinante, célula hospedeira, mamìfero transgênico não-humano, método para triar uma substância ou uma molécula, kit para triar, in vitro, uma molécula ou substância candidato, método para triar, in vivo, uma substância ou molécula, kit ou pacote para triar, in vivo, pelo menos uma molécula ou substância candidato, substância que modifica a transcrição de um polinucleotìdeo de interesse, composição farmacêutica, método e kit para detectar um enfraquecimento da transcrição do gene abc1 em um indivìduo, e, kit ou pacote para triar uma molécula ou substância candidato

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