TWI304737B

TWI304737B - Pharmaceutical compositions for increasing cholesterol efflux from cells of a mammalian subject

Info

Publication number: TWI304737B
Application number: TW095113205A
Authority: TW
Inventors: M Lawn Richard; Wade David; Garvin Michael
Original assignee: Cv Therapeutics Inc
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2009-01-01
Also published as: IL147022A0; EP1218515B1; CA2375787A1; CN1434865A; AR024576A1; BR0011696A; CN1379817A; WO2000078972A3; NO20016114D0; TWI259205B; HK1046708A1; CA2375787C; TW200626176A; AR024391A1; SG121852A1; TR200200441T2; MXPA01013175A; NZ531401A; NZ516061A; ATE422545T1

Description

1304737 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於新穎的ABC 1多肽和編碼相同物的核酸分子。本發明亦關於包含ABC1多核苷酸之重組載體、宿主細胞和組合物’以及產製ABC1多肽的方法。本發明亦關於與AB C1多肽專一性結合的抗體。此外，本發明係關於增加膽固醇排出的方法，以及增加ABC 1表現和活性的方法。本發明更有關於確認調節ABC1表現之化合物的方法’以及在哺乳動物個體中降低ABC 1多肽和多核誓酸在比較上之含量的方法。本發明亦提供適用於篩選化合物，以便決定該化合物之ABC 1表現調節活性的套組和組合物’以及適用於決定一化合物是否調節ABC1-依賴性之膽固醇排出的套組和組合物。【先前技術】在人類血漿或淋巴液中的循環脂質，包括膽固醇、膽固醇酯、三酸甘油酯和構脂類。這些脂質以叫做脂蛋白的大分子複合物來運送，其包括膽固醇酯及/或三酸甘油醋的核心’磷脂和自由膽固醇的被膜，以及脫辅基脂蛋白 (Scriver等人’編輯，The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，第 7版，第 1841-1851 ·· Hill，New York 1995))。脫辅基脂蛋白涉及脂蛋白的集合 , 和分泌’以及脂蛋白修改酵素的激活作用，像是卵鱗脂膽固醇醯基轉移酶（LCAT)。此外，脫輔基脂蛋白提供結構的完整性，並為大範圍受體和膜接合蛋白質的配體。根據尺

O:\110\110257.DOC 1304737 寸將血漿脂蛋白分成五種類型：乳麋微粒（在尺寸上最大，而在密度上最小的），極低密度的脂蛋白（V]LDL)，中 ' 間密度的脂蛋白（I〇L)，低密度的脂蛋白（Ldl)，以及高密度脂蛋白（HDL)。乳麋微粒、VLDLs、IDLs和LDLs運送外源和内源的膽固醇和三酸甘油酯至周圍部位，在那裏脂質在各種代謝的路中扮演某種角色，並做為細胞膜的主要組成。在腸黏膜上集合乳麋微粒，做為將飲食之膽固醇和三酸甘油酯運送至各種組織的工具。VLDLs在肝臟中形成，將經由肝臟形成的内源性膽固醇和三酸甘油酯運送至肝·以外的組織，像是肌肉和脂肪組織。在禁食的血清中，VLDLs含有 10-15%的總血清膽固醇和大部份的三酸甘油酯。在循環中’經由脂蛋白脂肪酶的作用將VLDLs轉變為LDLs。 LDLs為膽固醇的主要血漿載劑，將其遞送至所有的組織’通常含有60-70%的總禁食血清膽固醇。相反的，HDLs涉及”逆向的膽固醇運送”，藉該路徑將過 1的膽固醇從周圍部位送回肝臟，在那裏以膽鹽的形式排泄（Glomset，J.A.，j. Lipid Res，9, 155_167 (1968))。初生的HDLs重新在肝臟和小腸中合成，富含蛋白質之盤狀顆粒缺乏膽固醇和膽固醇酯。事實上，HDLs大部份的功能 .*是做為脫辅基脂蛋白的循環倉庫，主要是脫辅基c-j、脫 ,輔基孓11和脫輔基E。經由獲自細胞來源之膽固醇酯的堆 —積，將初生或富含蛋白質之HDLs轉變為球形的脂蛋白顆粒。HDL通常含有20_30%總禁食血清膽固醇。

O:\110\110257.DOC 1304737 根據目前的理論，細胞的膽固醇逆向排出至HDL，係經由兩個機制調節：含水的擴散路徑和脫輔基脂蛋白-調節之路徑。這些可區別機制相對上的重要性，係依據細胞類型和代謝狀態（Oram 等人，J. Lipid Res.，37 : 2743-2491 (1996) ; Rothblat等人，J. Lipid Res·，40 : 781-796 (1999); Stein等人，Atherosclerosis, 144: 285-301 (1999))。對許多細胞而言，含水的擴散路徑是原則上的路徑，經由它發生膽固醇的排出（Johnson 等人，Biochem. Biophys. Acta， 1085 : 273-298 (1991))。該路徑涉及膽固醇在細胞膜和脂蛋白接受者之間兩個方向的交換，像是HDL，在細胞外的空間中’經由被動運輸的過程（Remaley等人，Arterioscler. Thromb· Vase. Biol·，17 : 1813-1821 (1997) ; Rothblat 等人，J. Lip_ Res” 40 : 781-796 (1999))。該交換可能主要發生在已知為小腔的表面微功能部位處（Fielding等人， Biochemistry，34 : 14288-14292 (1995)χ。可由膽固醇在細胞外間隔中，藉著LCAT的作用轉變為膽固醇酯來推動淨排出。另外，在巨噬細胞和纖維母細胞中，膽固醇和磷脂的排出主要是經由脫輔基脂蛋白調節，像是脫輔基Α-Ι、脫辅基 Α-ΙΙ和脫輔基 E (Remaley,在前（1997) ; Francis 等人，J. Clin. Invest·，96 : 78-87 (1995) ; Vega等人，J. Intern， Med., 226 : 5-15 (1989) ; Sakar等人，Biochem. Biophys. Acta, 1438 : 85-98 (1999) ; Hara等人，J. Biol. Chem., 266 : 3080-3086 (1991) ; Fielding等人，J. Lipid Res·，38,

O:\110\110257.DOC 1304737 1503-1521 (1997) ; 〇ram 等人，j Lipid Res，37, 2743· 2491 (1996))。脫輔基脂蛋白_調節脂質排出的過程，在巨 ' 噬細胞和其他的清道夫細胞中特別佔優勢，此時它們裝載 “ 了膽固醇，並/或是生長-停止的。脫辅基脂蛋白·調節的排出是主動的運送過程，其需要在細胞表面内脫輔基脂蛋白的直接交互作用，脫輔基脂蛋白的脂質化作用，以及來自細胞之脂質·脫輔基脂蛋白顆粒的後續解離作用（〇ram，在前（1996)，Mendez，A.J.，J. Upid Res.，38，18〇7_1821 (1997) ; Remaley’ 在前（1997) ; Mendez，A.J.，j. Upid

Res·，37, 2510-2524 (1996))。一但從細胞中移出，富含膽固醇的HDL顆粒便被運送至肝臟，並如同上述從體内移出。由於遺傳缺陷或其他障礙的繼發影響而導致的異常脂蛋白功能及/或代謝，可能有嚴重的生物學後果。除了飲食的影響之外’諸如糖尿病、甲狀腺功能不足和肝臟疾病之 > 類的障礙，可能導致LDL-膽固醇和三酸甘油酯的升高企浆含量。已經確認升高的LDL-膽固醇和三酸甘油醋含量，是與發生冠狀心臟病有關的主要危險因子，其為美國和其他工業國家的主要死因（Hokanson等人，J. Cardiovasc Risk， 3 ： 213-219 (1996) ； The Expert Panel, JAMA, 269 ： 3015-3023 (1993))。過量的LDL-膽固醇堆積在動脈壁上，可導致粥樣硬化斑點的形成’其在心臟病的發展中扮演主要的 % 角色。咸相信是在從動脈壁中釋放出之自由基團氧化ldl 時形成斑點。根據理論’ LDL的乳化形式誘發炎症反應，

O:\110\110257.DOC 1304737 吸引循環中的細胞至促成脂質斑點形成的地方。其中有巨嗤細胞和其他含有清道夫受體的細胞，其以不規則的方式 -堆積膽固醇（Brown 等人 ’ Arm. Rev. Biochem.，52 : 223- 261 (1986))。大量儲存内部的膽固醇導致其轉變為泡沫化細胞的表現型’相信其為發展血管病變的主要促成者。因為斑點的逐漸建立，動脈壁收縮，減少了血流至心臟。然而，有趣的是，已確立60%心臟病發作的患者，他們並沒有升商的血·液LDL-膽固醇含量。其中，已碟立45%與低於平均值之血液HDL-膽固醇含量有關，代表低111)1^膽固醇含量是冠狀心臟病的主要危險因子。事實上，目前的研究已經指忠降低HDL-膽固醇含量為在患有未成熟之冠狀動脈疾病的患者中最常見的脂蛋白異常（Genest L， Circulation, 85 ： 2025-2033 (1992) ; Genest 等人，

Artedoscler. Thromb” 13 : 1728-1737 (1993))。雖然並未徹底瞭解在HDL-膽固醇和冠狀心臟病之間逆關連性的基礎，已經暗示HDL的心臟保護性角色可能起源自它與在粥樣硬化之病變中，發動膽固醇從巨噬細胞泡沫狀細胞中排出有關的活性。與低HDL有關之心血管疾病的一個實例為湯吉爾 (Tangier)症（TD)，一種稀少的遺傳障礙，其特徵在於接近 •，或完全缺乏循環中的HDL。除了HDL的血漿含量接近〇之 , 外，患有TD2患者在數個組織中還有膽固醇酯的大量沉版和堆積’包括扁桃腺、淋巴結、肝臟、脾臟、胸腺、腸和施萬（Schwann)細胞（Fredrickson，D.S.，J. Clin. Invest. O:\UO\110257.DOC -10- 1304737 43，228-236 (1964) ; Assmann等人，The Metabolic Basis of Inherited Disease, (McGraw-Hill, New York, 1995))。雖、然先前尚未確認細胞的機制，但是目前的研究已經顯示得 ^ 自患有TD之個體的細胞，在脫辅基脂蛋白-調節之移除膽固醇和.構脂的過程中，是有缺陷的（Remaley等人， Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 17, 1813-1821 (1997);

Francis等人，J. Clin· Invest” 96，78-87 (1995) ; Rogler等人，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol” 15,683-690 (1995)) 〇這些結果已經導致在TD患者中，嚴重的Hdl缺陷係起源自初生之脫辅基A-Ι沒有能力獲得脂質的提議。因為它們未成熟至富含脂質的顆粒，所以在TD患者中，初生的Hdl迅速地被分解代謝，並從血漿中移出，導致循環+ HDL的含量接近 0 (Remaley，在前（1997); Francis，在前（1995); Horowitz等人，J. Clin. Invest” 91，1743-1752 (1993); Schaefer等人，J. Lip. Res., 22 : 217-228 (1981))。其他與嚴重的未成熟粥樣硬化有關的障礙，和起因於減少HDL-膽固醇含量之冠狀心臟病的高風險，是血中α脂蛋白不足症和家族性HDL缺陷徵候群（FHA)。罹患這些障礙的個人通常有正常的LDL-膽固醇和三酸甘油酯含量。此外’諸如糖尿病、酒精中毒、甲狀腺功能不足、肝臟疾病 •.和升问的血壓之類的障礙，可導致HDL-膽固醇的血漿含 ,篁減少，雖然在這些障礙中有許多亦伴隨有升高的LDL-膽固醇和三酸甘油g旨含量。目刖訄狀〜臟病的治'療，主要集中於飲食的巧妙控制和

O:\110\U0257.DOC • 11 · 1304737 /或藥物治療’藉著抑制LDL的分泌或促進LDL的周轉，對準降低血漿中LDL-膽固醇的含量。纖維酸的衍生物，像是氯貝丁酯（clofibrate)、吉非貝齊（gemfibrozil)和非諾貝特 (fenofibrate)，藉著激活脂蛋白脂肪酶促進了迅速的vldl 周轉。菸鹼酸藉著抑制肝的VLdl分泌，降低了血漿中 VLDL和LDL的含篁。此外，HMG-CoaA還原酶抑制劑，像疋美非諾林（mevinolin)、美伐他j丁（mevastatin)、普伐他、汀 (pravastatin)、辛伐他丁（simvastatin)、氟伐他打（仙彻仙) 和洛伐他ί丁（lovastatin)，藉著抑制膽固醇的細胞内合成，其引起細胞攝入LDL的增加，降低了血漿中ldL的含量。此外，與膽酸結合的樹脂，像是考來泰林（ch〇lestyrine)、考來替潑（colestipol)和普羅布考（pr〇buc〇1)，藉著增加 LDL-膽固醇在肝臟中的分解代謝，降低了 [1)1^膽固醇的含量》然而’這些治療許多與低效力及/或副作用有關，可能要避免長期使用。例如，使用HMG-CoaA還原酶抑制劑，帶有毒性的顯著危險，因為它抑制了甲羥戊酸鹽的合成，其為贍固醇之外，合成其他重要的類異戊二烯化合物所必需的。再者，吉非貝齊與菸鹼酸則與嚴重的不利影響有關，包括腎臟的傷害、肌病、肌球蛋白尿和不能忍受的皮膚發紅和發癢《此外，普羅布考在治療患有冠狀心臟病之患者中的角色是可疑的，因為其投藥導致較低的11〇1^膽固醇含量’如同降低LDL-膽固醇的副作用。此外，治療患有孤立之低HDL-膽固醇含量的患者，提 O:\110\1I0257.DOC -12· 1304737 供了特別困難的治療挑戰在㈣H例如，患有湯吉爾症的患者在心金官疾病方面顯示主〇倍的增加，即使其LDL含量業已降低大約5 0 %。同日车古.» ^ ± π時有些證據，吉非貝齊和菸鹼酸可同時升高HDL含量，一炉而一般而s ’針對降低血漿LDL-膽固醇含量的治療，因為減少祖含量的結果，對於羅患冠狀病的湯吉爾症患者是無效的。同樣的，患有血中“旨 M + H㈣性HDL缺陷徵候群或其他由於低舰含 ^引起^血管疾病的患者’將無法從針對降低血毅中 LDL含量的治療中獲益。與心血管疾病目前之治療有關的問題，部份起源於尚未完全瞭解涉及膽固醇在細胞内和外移動之生物學的事實。此外，完全不知道在膽固醇移動中扮演角色的蛋白質。因此仍然要更徹底地瞭解膽固醇的細胞生物學，以及治，療罹患心血管疾病和其他與高膽固醇金症有關之障礙的人類的新方法。此外，還需要診斷心血管疾病的新方法，以 • &篩選患者的新方法，確認發展出心血管疾病之高風險的那些。在用來治療心臟病和其他與高膽固醇血症和粥樣硬化有關之障礙的藥學製劑之發展中，確認涉及膽固醇運送之基因和蛋白質將是有用的。此外，確認這類基因將可用來發展篩選測定，以便篩選調節與膽固醇運送有關之基因表現的化合物。這類調節化合物的確認，將可用來發展更多的治療劑。此外’確認涉及膽固醇運送的基因和蛋白質，將可用來做為心血管疾病及其他與高膽固醇血症有關之障礙 O:\110\110257.DOC -13- 1304737 的診斷指示劑。【發明内容】 - 本發明提供涉及膽固醇排出的新穎多肽和多核甞酸。特定而言，本發明提供新穎的ATP-結合卡匣（ABC 1)多肽，以及編碼ABC1多肽的新穎多核甞酸。”ABC1”和”ABCA1” 一詞為相同ATP-結合卡匣蛋白質和基因之可互換的名稱。本發明提供ABC 1多肽、多肽片段和多肽變體。在一個較佳的具體實施例中’本發明提供包括序列識別2號之經過分離的多肽。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括胺基酸序列之經過分離的多肽，該胺基酸序列與序列識別2號具有至少9 8 %的同一性。本發明亦提供得自湯吉爾症患者的ABC 1多肽。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括序列識別8號之經過分離的多肽。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括序列識別1〇號之經過分離的多肽。此外’本發明提供AB C1多核：y：酸，多核菩酸片段和多核甞酸變體。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供編碼包括序列識別2號之多肽的經過分離的多核嘗酸。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供編碼包括胺基酸序列之多肽的經過分離的多核铝酸，該胺基酸序列與序列識 .·別2號具有至少98%的同一性。此外，在其他較佳的具體 ..實施例中，本發明提供包括與編碼包括序列識別2號之多肽的多核甞酸互補之核芸酸序列的經過分離的多核苷酸，或包括與編碼包括胺基酸序列之多肽的多核苷酸互補之核 14 ·

O:\110\110257.DOC (8) 1304737 甞酸序列的經過分離的多核甞酸’該胺基酸序列與序列識別2號具有至少98%的同一性。 '* 在其他較佳的具體實施例中’本發明提供包括序列識別 -1號之經過分離的ABC1多核智：酸。在更佳的具體實施例中’本發明提供包括序列識別1號之核苷酸29丨_7〇74的經過分離之多核甞酸《在再更佳的具體實施例中，本發明提供包括與序列識別1號具有至少9〇%同一性之核甞酸序列的多核甞酸。更特定而言，該多核甞酸所包括的核甞酸序列’與序列識別1號具有至少95%、96%、97%、98%或 99%的同一性《再者，在其他較佳的具體實施例中，本發明提供包括與包括序列識別丨號之多核甞酸互補的核苷酸序列的經過分離之多核甞酸，包括與包括序列識別丨號之核％•酸291 -7074之多核苷酸互補的核甞酸序列的經過分離之多核誓酸’以及與包括與序列識別1號具有至少9〇0/〇同一性之核苷酸序列的多核苷酸互補的經過分離之多核苷酸。本發明亦提供相當於ABC1基因之5·側面區的ABC1多核甞酸。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括序列 3线別3號之經過分離的多核嘗酸。在另外較佳的具體實施例中，本發明提供包括序列識別3號之核苷酸1 1532、 .1〇80_1643、1181-1643、1292-1643 或 1394-1532 之經過分，離的多核甞酸◎較佳的是，該經過分離的多核甞酸包括序 '列識別3號之核甞酸1394-1532。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供在嚴格的條件下，與包括序列識別3號 O:\110\110257.DOC -15· 1304737 之多核苷酸雜交的經過分離的多核誓酸。再者，在其他較佳的具體實施例中，本發明提供在嚴格的條件下，與包括序列識別 3號之核甞酸 1-1532、1080-1643、118 1_1643、 12 92-1643或1394-1532的多核菩酸雜交之經過分離的多核甞酸。在本發明另一個較佳的具體實施例中，提供與包括序列識別3號之多核苷酸具有至少80%同一性的經過分離之多核甞酸。更佳的是’該多核甞酸與包括序列識別3號之多核嘗酸具有至少90%的同一性。再更佳的是，該多核苷酸與包括序列識別3號之多核苷酸具有至少95%的同一性。在較佳的具體實施例中，還提供與包括序列識別3號之核替酸 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643 或 1394-1532的多核甘酸具有至少80%同一性的經過分離之多核苷酸。更佳的是，該多核：y：酸與包括序列識別3號之核嘗酸 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643 或 1394_ 1532的多核甞酸具有至少90%的同一性，再更佳的是，具有至少95%的同一性。此外，本發明提供包括與上述ΑΒ(η 多肽5’側面互補之核苷酸序列的經過分離之多核誓酸。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括與包括序列識別3號之多核：y：酸互補的核甞酸序列之經過分離的多核菩酸。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括與包括序列識別3號之核苷酸1-1532、1080-1643、1181-1643、 1292-1643或1394-1532的多核苷酸互補之核苷酸序列的經過分離之多核菩酸。本發明亦提供相當於ABC1基因之3'側面區的ABC1多核 -16 ·

〇:M10\110257.DOC 1304737 芬酸。在較佳的具體實施例中，本發明提供包括序列識別 4號、序列識別5號或序列識別6號之經過分離的多核甞酸’及其互補序列。在其他較佳的具體實施例中，本發明 - 提供在嚴格的條件下，與包括序列識別4號、序列識別5號或序列識別ό號之多核苷酸雜交的經過分離之多核甞酸，及其互補序列。在其他更佳的具體實施例中，本發明提供與包括包括序列識別4號、序列識別5號或序列識別6號之多核芬酸具有至少80%同一性的經過分離之多核：y;酸，及其互補序列。更佳的是，該多核苷酸與包括序列識別4 號、序列識別5號或序列識別6號之多核：y：酸具有至少90% 的同一性。更佳的是’該多核甞酸與包括序列識別4號、序列識別5號或序列識別6號之多核甞酸具有至少9 5 %的同一性0 此外，本發明亦提供得自湯吉爾症患者的ABC 1多肽。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供編碼包括序列識別8號之多肽的經過分離之多核苷酸。在另一個較佳的具體實施例中’本發明提供包括序列識別7號之經過分離的多核甞酸。在另一個具體實施例中，本發明提供編碼包括序列識別10號之多肽的經過分離之多核替酸。在另一個較佳的具體實施例中’本發明提供包括序列識別9號之經過 • 分離的多核苷酸。本發明更提供包括與上述多核:y：酸互補之核茫酸序列的經過分離之多核省:酸。在其他的觀點中，本發明提供包括任何上述多核苷酸和適當載體的組合物。在一個較佳的具體實施例中，本發明 O:\110\110257.DOC •17· 1304737 提供包括編碼包括序列識別2號之多肽的經過分離之多核誓酸，包括序列識別1號之多核苷酸，包括序列識別1號之 • 核甞酸29丨-7074的多核甞酸，或編碼包括與序列識別2號 Λ 具有至少98%同一性之胺基酸序列的多肽的多核甞酸，以及適當載劑的組合物。在其他較佳的具體實施例中，該組合物包括經過分離之多核苷酸，其包括與包括序列識別1 號之多核菩酸具有至少90%同一性的核:y：酸序列，以及適當的載劑。在其他較佳的具體實施例中，該組合物包括經過分離之多核甞酸’其包括序列識別3號，或包括序列識別 3 號之核誓酸 i_1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643或1394-1532的經過分離之多核甞酸，以及適當的載劑。在其他較佳的具體實施例中，本發明提供包括在嚴格的條件下，與序列識別3號之多核苷酸，或包括序列識別3 號之核嘗酸 1_1532、1080-1643、1 181-1643、1292-1643 或 13 94-1532之多核苷酸雜交的多核甞酸，以及包括與包括序列識別3號之多核甞酸，或包括序列識別3號之核苷酸1- 1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643 或 1394-1532 之多核：y：酸具有至少80%同一性的多核苷酸，以及適當之載劑的組合物。本發明亦提供包括經過分離之多核甞酸，其包括與任何上述之多核苷酸互補的核甞酸序列，以及適當載劑的組合物。 • 此外’本發明亦提供包括任何上述之ABC 1多核苷酸序列的重組载體和宿主細胞，在一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括編碼包括序列識別2號之多肽的經過分離

O:\110\110257.DOC -18- 1304737 之多核芬酸’包括序列識別1號之經過分離的多核甞酸，包括序列識別1號之核苷酸29卜7074之經過分離的多核甞酸’或編碼包括與序列識別2號具有至少98%同一性之胺 - 基酸序列之多肽的經過分離之多核甞酸的重組載體。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括經過分離的多核芬酸’其包括與包括序列識別丨號之多核甞酸，具有至少 90%同一性’更佳的是至少95%同一性的核苷酸序列。在 _ 其他更佳的具體實施例中’重組載體包括含有序列識別7 號或序列識別9號的經過分離之多核苷酸。本發明更提供包括含有與上述任何多核苷酸互補之核苷酸序列的經過分離之多核甞酸的重組載體。在另一個較佳的具體實施例中’重組載體包括任何上述的多核苷酸，並更進一步包括異種的啟動基因多核甞酸。一種適合的異種啟動基因為細胞巨大病毒啟動基因。在特佳的具體實施例中，重組載體為 pCEPhABCl。 g 本發明亦提供包括含有ABC 1 5'側面序列的經過分離之多核苷酸的重組載體。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供包括經過分離之多核甞酸，其包括序列識別3號，或包括序列識別3號之核芬酸1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643或1394-1532之經過分離的多核甞酸的重 • 組載體。在另外較佳的具體實施例中，本發明提供包括在嚴格的條件下’與序列識別3號之多核菩酸，或包括序列識別 3號之核菩酸 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643或1394-1532之多核甞酸雜交的多核：y：酸的重組載 O:\110\110257.DOC -19- 1304737 體，以及包括與這些多核甞酸具有至少8〇%同一性之多核苷酸的重組載體。本發明更提供包括含有與任何上述I多x *核苷酸互補之核甞酸序列的經過分離之多核甞酸的重組載 .▲體。在另-個較佳的具體實施例中，該重組載體包括任何上述的多核苷酸，並更進一步包括至少一個編碼異種多肽的多核甞酸。適當之異種多肽包括蟲螢光素酶、万-半乳糖苷酶、氯黴素轉移酶和綠螢光蛋白質。較佳的是，該異種多肽為蟲螢光素酶蛋白質。在特佳的具體實施例中，該 _ 重組載體為pAPRl。此外，本發明提供包括任何上述之重組載體的宿主細胞。本發明更提供包括任何上述之重組载體和適當载劑的組合物。本發明亦提供在哺乳動物宿主細胞中產製Ab c 1蛋白質的方法’以及在哺乳動物個體中表現ABC 1蛋白質的方法。在哺乳動物宿主細胞中產製ABC1蛋白質之方法，包 | 括下列步驟：（a)以足以產生可檢測之ABC 1蛋白質含量的含量，以包括編碼AB C1之多核甞酸的重組表現載體轉移感染哺乳動物宿主細胞，並（b)純化所產製的ABC 1蛋白質。在哺乳動物個體中表現ABC1蛋白質的方法，包括以足以在哺乳動物個體中表現ABC 1蛋白質之含量，對該哺 • 乳動物個體投予包括編碼ABC 1之多核苷酸的重組表現載體之步驟。 ' 此外’本發明提供適用於從哺乳動物個體的細胞中，增加膽固醇排出的組合物和方法。在一個較佳的具體實施例 -20-

O:\110\110257.DOC 1304737 中’該方法包括以足以增加從細胞中排出膽固醇的含量，對該哺乳動物個體投予包括編碼ABC 1之多核甞酸的重組 '* 表現載體。適當的重組表現載體包括含有編碼包括序列識 -« 別2號之多肽的經過分離之多核甞酸，包括序列識別1號之經過分離的多核苷酸’包括序列識別1號之核甞酸291_ 7074的經過分離之多核苷酸，以及編碼包括與序列識別2 號具有至少98%同一性之胺基酸序列之多肽的經過分離之多核甞酸的載體。較佳的表現載體包括病毒的載體，特別是腺病毒載體和慢病毒載體。在其他的具體實施例中，本發明提供非-病毒的遞送系統’包括DNA-配體複合物、腺病毒-配體-DNA複合物、DNA的直接注射、CaP〇4沉澱法、基因槍技術、電穿透作用、微脂粒和脂染體。在其他較佳的具體實施例中，增加膽固醇從哺乳動物個體的細胞中排出的方法’包括對該哺乳動物個體投予治療含量的增加ABC1在細胞中表現之化合物。一種適當的方法’包括對哺乳動物個體投予cAMP類似物。適當之cAMP 類似物包括8-溴cAMP、N6-苯甲醯基cAMP和8-硫代甲基 cAMP。其他適當的方法包括對哺乳動物個體投予增加 cAMP合成的化合物’例如福斯高林（f〇rsk〇iin)。另一種適當的方法包括對哺乳動物個體投予抑制cAMP降解的化合 • 物，像是磷酸二酯酶抑制劑。適當的磷酸二酯酶抑制劑包括羅利普蘭（rolipram)、茶鹼、3_異丁基甲基黃臂吟、 R020-1724、長春西汀（vinp0cetine)、扎普内斯特 (zaprmast)、潘丁生（dipyridamole)、米力農（miirin〇ne)、 O:\110\l 10257.DOC -21· 13 04篆3?7ι 132〇5號專利申請案中文說明書替換頁(97年;月）氣力農（amrinone)、匹莫苯（pimobendan)、進丨西洛他醢胺 (eilostamide)、依諾昔酮（enoximone)、佩若西酮 (peroximone)和維司力農（vesnarinone)。此外’其他增加膽固醇從哺乳動物的細胞中排出的適當方法’包括以足以增加膽固醇排出之含量，對該哺乳動物個體投予至少一個核受體的配體。適當的配體包括LXR、 RXR、FXR、SXR和PPAR配體。在一個較佳的具體實施例中’該方法包括對哺乳動物個體投予LXR核受體的配體。適當的LXR配體包括20(s)羥基膽固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-羥基膽固醇和24(S)，25環氧膽 • 固醇。較佳的是，該LXR配體為20(S)羥基膽固醇。在其他較佳的具體實施例中，該方法包括對哺乳動物個體投予 RXR核受體的配體。適當的RXR配體包括9_順視黃酸、視黃醇、視黃醛、所有的-反視黃酸、13-順視黃酸、阿維 A(acitretin)、芬維 A 胺（fenretinide)、阿維 A 酉旨 (etretinate)、CD 495(4-(5,6,7,8_四氫 _5,5,8,8-四甲基萘并 [2,3-b]呋喃-2-基）苯甲酸）、CD 564(6_(5,6,7,8·四氫 _ 5,5,8,8-四甲基-2-萘曱醯基）_2-萘甲酸）、TTNN(6-(5,6,7,8- 四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基）-2-萘羧酸）、ττNPB(4-(E-2-[5,6,7,8_四氫_5,5,8,8-四曱基-2-萘基]-1-丙烯基）苯曱酸）' 鲁 ΤΤΑΒ(4_(5,6,7,8·四氫-5,5，Μ-四甲基_2·慈基}苯曱酸）和 LGD 1069(4-[1-(3,5,5,8,8-五曱基 _5,6,7,8_ 四氫·2_ 萘基）乙烯基]苯曱酸）。較佳的是，RXR配體為9_順視黃酸。在其他較佳的具體實施例中，該方法包括對哺乳動物個體投^ 至少兩種核受體的配體。在特佳的具體實施例中，該配體為20(S)羥基膽固醇和9-順視黃酸。 & 此外，其他增加膽固醇從哺乳動物個體的細胞中排出的適當方法，包括以足以増加膽固醇排出之含量，對該哺乳動物個體投予t生酸衍生物（eicosanoid)。適當的花生酸衍生物包括E2、前列腺素J2和前列環素12。 110257-970704.doc -22- 1304737 在其他的具體實施例中，本發明提供增加膽固醇從哺乳動物個體的細胞中排出的方法，包括以足以增加膽固醇從細胞中排出的含量’對該哺乳動物個體投予增加ABC 1活性的化合物。本發明亦提供適用於增加AB C1在哺乳動物個體中之基因表現的方法。在一個較佳的具體實施例中，該方法包括以足以增加AB C1之基因表現的含量，對該哺乳動物個體投予至少一種核受體的配體。適當的配體包括LxR、 RXR、FXR、SXR和PPAR核受體的配體。在另一個較佳的具體實施例中’該方法包括以足以增加ABC 1之基因表現的含量’對該哺乳動物個體投予cAMP類似物。在另一個較佳的具體實施例中’該方法包括以足以增加abc1之基因表現的含量’對該哺乳動物個體投予增加cAMp合成的化合物。此外’本發明亦提供就ABC1表現之調節活性來筛選受試化合物的方法，包括下列步驟：（a)以可操作之方式將報告者cDNA與哺乳動物abc 1基因之表現調節部份連接，產生重組的報告者構築體；（b)將該重組的報告者構築體轉移感染到宿主細胞的族群中；（c)測定報告者基因在宿主細胞之試樣中的表現程度；（d)使該宿主細胞與待篩選的受試化合物接觸；（e)在與受試化合物接觸之後，測定報告者美因在宿主細胞之試樣中的表現程度；並（f)比較由於與受試化合物接觸所引起之報告者基因在表現程度上的相對變化，藉此定出ABC1表現的調節活性。重組的報告者構築體包

O:\HO\110257.DOC -23- 1304737 括以可操作之方式與哺乳動物ABC1基因之表現調節部份連接的報告者基因，像是由本發明提供之任何的ABC1 5, 側面區序列。在一個較佳的具體實施例中，ABC1基因之 .，表現調郎部伤包括序列識別3號。在另一個較佳的且體實施例中，ABC1基因之表現調節部份包括序列識別3號的核苷酸 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643、1394- 1643或1394_1532。適當的報告者cDNAs包括蟲螢光素酶、半乳糖苷酶、氣黴素和綠螢光蛋白質eDNA。較佳 •的疋，該宿主細胞為哺乳動物細胞。在該方法特佳的具體實施例中，重組的報告者構築體為pAPRl。本發明亦提供篩選受試化合物，決定該受試化合物是否促進ABC 1-調節之從培養中的細胞中排出膽固醇的方法，包括下列步驟：⑷測定在維持於培養基中之哺乳動物細胞的試樣中，膽固醇排出之含量ΰΑ定出膽固醇排出的對照含量；（b)使該細胞與待_選的受試化合物接觸；（c)在與 • 受試化合物接觸之後，測定在細胞試樣中膽固醇排出的含里，（d)測疋在與文試化合物接觸之後，在細胞試樣中之 ABC1-調節之膽固醇排出的含量，#此決定該《試化合物疋否促進了 ABC 1-調節之從培養中的細胞中排出膽固醇。該細胞可衍生自初級培養物或細胞株。適合用來篩選受試 .化合物的細胞包括纖維母細胞、巨噬細胞、肝細胞和腸細胞株。較佳的是，該細胞株為RAW 264.7。在一個較佳的具體實施例中，使用在結合時抑制ABCl之活性的抗_ ABC1抗體來測量ABC1_調節的膽固醇排出。在另一個較 O:\110\110257.DOC -24- 1304737 佳的具體實施例中，#田=M u A ^ a 使用反義的ABC 1多核：y：酸來測量 ABC1-調即的膽固醇排出。在特佳的具體實施例中，該反義多核知酸包括序列識別57號。此外，本發明亦提供在哺乳動物個體的細胞中，檢測 ABC1表現之比較程度的方法。這類方法可用來定出個體對冠狀心臟病的易感'卜提供—種在哺㈣物個體的細胞中，檢測ABC1表現之比較程度的方法，包括⑷從該哺乳動物個體中獲得細胞試樣；⑻測定在該細胞試樣中ABc工 mRNA表現的程度；並⑷將在該細胞試樣中之 mRNA表現的程度，與ABC丨㈣财表現的預定標準值做比軚，藉此檢測在該哺乳動物的細胞試樣中，ABC1基因表現的比較程度。測量ABC1 mRNA表現程度的適當方法，包括例如RT-PCR、北方墨點法，以及RNA酶保護測定。本發明亦提供在哺乳動物個體的細胞中，檢測八3〇1蛋白質之比較含量的方法。這類方法可用來定出個體對冠狀心臟病的易感性。提供一種在哺乳動物個體的細胞中，檢邊J ABC 1蛋白質之比較含量的方法，包括（a)從該哺乳動物個體中獲得細胞試樣；（b)測定在該細胞試樣中ABC丨蛋白質的含量；並（c)將在該細胞試樣中之abci蛋白質的含里’與ABC 1蛋白質的預定標準含量做比較，藉此檢測在該哺乳動物的細胞試樣中，ABC 1蛋白質之比較含量。可使用此項技藝中可利用的各種免疫測定法，定出ABC1蛋白質之含量。例如，可藉著（a)使該細胞試樣與抗_ABCU^ 體的族群接觸，並（b)檢測與該試樣有關的專一性_結合之 O:\110\110257.DOC 25· 1304737 ABC1抗體，定出ABC1蛋白質之含量。檢測ABC1抗體的適當方法包括西方墨點法、免疫沉澱法和FACS。在其他的觀點中，本發明提供與上述之ABC1g肽專一性結合的抗體。在一個較佳的具體實施例中，本發明提供經過分離的抗體，其與包括序列識別2號之經過分離的多肽專一地結合。在另一個較佳的具體實施例中，本發明提供經過分離的抗體，其與包括與序列識別2號具有至少 980/〇同一性之胺基酸序列的經過分離之多肽專一地結合。該抗體可以是單株抗體，或該抗體可以是多株抗體。在另一個具體實施例中，當與ABC1多肽結合時，該抗體抑制了 A B C1多肤的膽固醇運送活性。此外，本發明亦提供適合用來篩選化合物，以便定出該化合物之AB C1表現調節活性的套組，包括以足以供至少一種測定和指示使用的含量，以可操作之方式將報告者 cDNA與哺乳動物ABC1基因的表現調節部份連接。在一個較佳的具體實施例中，套組更包括檢測報告者基團的方法。在另一個較佳的具體實施例中，哺乳動物abc1基因之表現調節部份包括序列識別3號。在另一個較佳的具體實施例中，哺乳動物ABC1基因的表現調節部份包括序列識別 3 號的核苷酸 1_1532、1080-1643、1181-1643、1292_ 1643、1394-1643或1394-1532。適當的報告者仁仍^^包括蟲螢光素酶、/3 _半乳糖苷酶、氣黴素和綠螢光蛋白質 cDNA。較佳的是’該報告者cDNA為蟲螢光素酶。在該方法特佳的具體實施例中，重組的報告者構築體為p APR i。 O:\110\110257.DOC -26- 1304737 本發明亦提供適用於筛選化合物，以便決定該化合物是否調節ABC 1 -依賴性之膽固醇排出的套組。在一個較佳的具體實施例中，該套組包括足以供至少一種測定和指示使用之3里的失活抗-AB C1抗體。在另一個較佳的具體實施例中，該套組包括足以供至少一種測定和指示使用之含量的反義ABC 1寡核：y：酸。在特佳的具體實施例中，該反義 ABC1寡核甞酸包括序列識別53號. 【實施方式】根據本發明’提供增加膽固醇從細胞中排出的新穎多肽。特定而言，本發明提供新穎的ATP-結合卡匣i(ABCl) 多肽’已經顯示其增加了膽固醇的排出。 ABC1是位在細胞膜中之ATP_結合卡匣蛋白質家族的成員’並利用ATP的水解作用運送各種物質通過原生質膜。應該注意到"ABC1”和"ABCA1"—詞均意指相同的ATP-結合卡E蛋白質。在1999年由命名委員會介紹過"AbcA1"，並在該領域中具有被承認的有限接受。目前，在人類基因組中已經確認出該家族超過3〇個的成員。這些同種蛋白質含有類似通道的結構，經由其將分子運送通過細胞膜，以及一或兩個功能部位，其與ATP結合而偶聯能量，產生 ATP-水解作用來運送之。家族成員包括多種藥物抗藥性因子（MDR/P-糖蛋白；Chen 等人，CeU，47 : 381 389 (1986) ; Stride 等人，Mol. Pharmacol.，49 : 962-971 (1996)) ’與提供抗原有關之運送者（Neefjes等人，Science， 261 · 769-771 (1993) ; Shepherd等人，Cell，74 : 577-584

O:\110\110257.DOC -27- 1304737 (1993)) ’以及胰囊性纖維變性穿透膜傳導力調節者（chang 等人 ’ J. Biol. Chem” 269 : 18572-18575 (1994); Rommens等人，Science，245 : 1059-1065 (1989))。ABC運送者家族的成員通常由在兩個對稱半中發現的四個功能部位組成，其藉著長的帶電區和高度忌水性的斷片連接。每半含有忌水性的功能部位’含有6個穿透膜斷片，和含有高度保留之Walker A和B序列特色的親水性核甞酸結合功月b部位’其通常是屬於許多ATP酶的（Hyde等人，Nature， 346 · 362-365 (1990)，Luciani等人，Genomics，21 : 150· 159 (1994))。運送者活性係依賴在核甞酸結合功能部位處，與ATP的交互作用，並經由在連接兩個對稱半之區域中殘基的鱗酸化作用來調節（Becq等人，j. Biol. Chem.， 272 ： 2695-2699 (1997)) 〇在本文中描述數個證據的線索，確認ABC 1在脫辅基脂蛋白-調節之細胞内膽固醇儲存的代謝中，擔任枢軸的蛋白質。首先，在本文中提供的研究顯示，Ab C1在湯吉爾症中是有缺陷的’一種其特徵在於異常之HDL-膽固醇代謝的遺傳障礙。如同先前，以及在本文的實例丨中所示，在湯吉爾症中的遺傳缺陷，引起在脫辅基脂蛋白調節之膽固醇從細胞中排出的路徑中的缺陷，導致明顯降低的膽固醇排出/舌性和低的HDL-膽固醇含量（〇rarn等人，j. Lipid Res·，37 ·· 2743-2491 (1996) ; Francis 等人，】CHn Invest·，96 : 78-87 (1995))。患有湯吉爾症之家族的遺傳連鎖分析，指派有缺陷之基因為在染色體9q31上的間隔（111^ O:\110\110257.DOC -28 - 1304737 等人，Nature Genetics，20 : 96-98 (1998))。公開資料庫的研究顯示ABC1基因係位在染色體9q22_9q31處，它比汉⑽ 等人顯示的間隔更廣大，但包括它（Luciani等人，在前 (1994))。以該資料為基礎，進行人類abc丨基因的放射雜交作圖，它將在兩個標記之間的基因，正正地放在厌口^等人報告的人類染色體9q3 1之7-公分區域内。此外，如同在實例2中所不，微陣列分析顯示與在正常細胞中的相比較，ABC1基因在湯吉爾症患者的細胞中，有2 5倍的表現不足這些研究確遇在湯吉爾症中有缺陷的基因為 ABC1。此外，在本文中提供進一步的研究，將ΑΒ(：ι活性與膽固醇排出活性連接。首先，研究顯示ABC丨運送活性的抑制劑，像是4,4-二異硫代氰基芪_2,2'_二續酸（DIDS)和硫溴鄰苯二甲酸（BSP) ’亦抑制了脫辅基a j _調節的膽固醇從纖維母細胞中排出（參見實例6)。再者，顯示使用反義 ABC1寡核答酸的ABC1基因表現之抑制作用，抑制了脫辅基A I _調節的膽固醇從纖維母細胞中排出（實例7)。相反的，其中將ABC1基因轉移感染至老鼠單核球細胞内的轉移感染研究，顯示ABC1的過度表現，導致在脫輔基a I -調節之排出上的增加（實例8)。最後’使用野外型和湯吉爾症患者之mRNA進行的RT-PCR，顯示在正常的皮膚纖維母細胞中’ ABC 1 mRNA表現係由與膽固醇排出有關的細胞條件來調節’但在湯吉爾症患者的纖維母細胞中則否（實例9)。基於這些發現，決定ABC 1在膽固醇排出中扮演主要的角色。 O:\HO\110257.DOC -29- 1304737 假定ABC 1在細胞内膽固醇移位至原生質膜的外部小葉狀物中扮演某種角色。由於缺乏ABC1或有缺陷之ABC1而 -- 產生細胞内膽固醇不充份的運送，導致在脫輔基AI和其 .. 他脫輔基脂蛋白與其專一地發生交互作用的特定膜功能部位中缺少膽固醇（Stangl等人，J. Biol. Chem., 273 : SIOOS-SIOOS (1998) ; Babitt等人 ’ J. Biol. Chem·， 272 : 13242-13249 (1997))。無法將膽固醇遞送至脫輔基AI，導致膽固醇-有缺陷之HDL顆粒的形成，其被迅速地從原生質中 ’移除（Bojanovski 等人，J. Clin. Invest.，80 : 1742-1747 (1987)) 〇定義提供下列的定義，以便更容易明瞭在本說明書中所使用的某些名詞。在本發明中，"經過分離”意指從其原始的環境中移出該物貝（例如’如果它是天然存在的，則從天然的環境中），馨亚因此從其天然狀態"藉著人手"而加以改變。例如，經過刀離的夕核苷酸可能是載體的一部份，或物質的組合物，或可包含在細胞中，但仍是"經過分離的„，因為該載體、物質的組合物或特定的細胞，並不是該多核苷酸的原始環境。 * · 在本文中使用時，”多核菩酸（們）’’ 一詞被定義為包括 .〇成和天然來源的DNA和RNA。多核苷酸可以單-或雙_股 DNA或RNA，或RNA/DNA異形雙嫘旋鏈的形式存在。因此，本發明之多核苷酸可包括任何的多核糖核苷酸或多去

O:\110\110257.DOC 1304737 氧核糖核苷酸，其可以是未經修改的RNA或DNA，或是經過修改的RNA或DNA。例如’多核：y：酸可包括單_和雙_股的DNA，該DNA為單-和雙-股區域，或單、雙-和三-股區域的混合物，單-和雙-股的RNA，而該RNA為單-和雙-股區域的混合物，包括DNA和RNA的雜種分子，它可以是單-股的，或更具代表性，為雙_股或三_股的，或單_和雙_ 股區域的混合物。此外，該多核:y：酸可包括由rNA或DNA 或RNA和DNA兩者所組成的三-股區域。多核苷酸亦可含有一或多個經過修改的鹼基，或為了穩定性或其他原因而加以修改的DNA或RNA主鏈。"經過修改的"鹼基包括，例如二笨甲基化的驗基和稀罕的驗基，像是肌苷。可對DNa 和RNA進行各種修改；因此，"多核甞酸”包括多核甞酸以化學方式、以酵素方式或以代謝方式修改的形式。"多核苷酸（們）"一詞亦包括短的多核苷酸，通常稱為寡核甞酸 (們）。

"多肽（們）” 一詞意指任何的肽或蛋白質，包括藉著肽鍵結或經過修改的肽鍵結連接在一起的二或更多個胺基酸。 "多肽"意指短的胺基酸序列，通常稱為肽，以及較長的胺基酸序列’通常稱為蛋白質。多肽可含有與2〇個基因編碼之胺基酸不同的胺基酸。再者，可藉著天然的方法，像是加工處理和其他在轉譯後的修改作用，或藉著此項技藝中已熟知的化學修改技術來修改多肽。特定的多肽可含有許多類型的修改。而相同類型的修改，彳以相同或不同的程度’出現在該多肽的-或多個部位中。修改可出現在多肤 O:\110\110257.DOC 31- 1304737 中的任何地方，包括肽主鏈、胺基酸侧鏈和胺基或羧基終端。修改包括但不限於乙醯化作用、醯化作用、ADP-核糖基化作用、醯胺化作用、甲醯化作用、-羧基化作用、糖基化作用、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉莖蔻醯化作用（myristoylation)、氧化作用、磷酸化作用、異戊烯基化作用（prenylation)、硫酸化作用和石西醯化作用（selenoylation)，以及核嘗酸或核芬酸衍生物、脂質和脂質衍生物或磷脂醯肌醇的共價附接。其他修改包括交聯、環化作用、焦穀胺酸酯的形成、GPI固定形成、蛋白水解的過程、消旋作用和t-RNA-調節的胺基酸加成，像是精胺醢基化作用（arginylation)和泛素化作用 (ubiquitination)。參見，例如 Proteins- Structure and Molecular Properties,第二版，T.E. Creighton, W.H. Freedman and Co., New York (1993) ； Wold, F.,

Posttranslational Protein Modification : Perspectives and

Prospects, in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson編輯，Academic Press, New York (1983) ; Seifter 等人，Meth. Enzymol.， 182 : 626-646 (1990);以及 Rattan 等人，Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci.，663 : 48·62 (1992))。可以任何適當的方法來製備本發明之多肽。這類多肽包括經過分離之天然存在的多肽，以重組方式產生的多肽，以合成方式產生的多肽，或藉著混合這些方法所產生的多肽。製備這類多肽的方法為此項 O:\110\110257.DOC 32· 1304737 技藝中已熟知的。本發明之"多核甞酸”亦包括那些能夠在嚴格的雜交條件下’與序列識別3號或序列識別3號的核甞酸1_1532、1080- 1643 、 1181-1643 、 1292-1643 、 1394-1643或 1394-1532雜交的多核苷酸，或其互補物。”嚴格的雜交條件"意指在42

。(：下’在含有 50% 甲醯胺、5xSSC (750 mM NaCn、75 mM 檸檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 7·6)、5x登哈特氏 (Denhardt’s)溶液、10%硫酸葡聚糖和2〇微克/毫升變性剪碎之鮭精DNA的溶液中過夜培養，接著在大約65下以 O.lxSSC沖洗濾器。當在本文中使用時，"互補"一詞意指在核苷酸之間的雜交或鹼基配對，像是例如在雙-股多核苷酸的兩股之間，或是在募核甞酸引子和待擴大或定序之單_股多核甞酸上的引子結合位置之間。畲利用適當的核甞酸插入、刪除或取代，以最佳之方式將一股核苷酸排成一直線，與另一股核¾酸至少有大約80%成對時，就是所謂的兩個單_股核苷酸分子為互補的。 "同一性"，為此項技藝中已知的，是在兩或多個多肽序列’或兩或多個多核苷酸序列之間，藉著比較該序列而定出的相互關係。”同一性”或”類似性”亦具有技藝_公認的意義’其意指藉著在這些序列串之間的配對，定出在多肽或多核菩酸序列之間序列關連性的程度。可使用許多已熟知的方法來計算"同一性”和”類似性"，包括在c〇mputati〇nai Molecular Biology, Lesk, , 〇xford University

O:\110\110257.DOC (8 -33- 1304737

Press, New York (1988) i Biocomputing ： Informatics and Genome Projects, Smith, D.W·編輯，Academic Press, New York (1993) ； Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.編輯，Humana Press，New Jersey (1994) ； Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.，Academic Press (1987);以及 Sequence Analysis Primer, Gribskov，M.和 Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York (1991)以及 Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J Applied Math 48 : 1073 (1988)中公告的那些。常用來決定兩個序列之間同一性或類似性的方法，包括但不限於在"Guide to Huge Computers"，Martin J. Bishop編輯，Academic Press，San Diego (1994)，以及 Carillo, H.和 Lipton, D.，SIAM J Applied Math 48 : 1073 (1988)中描述的那些。決定同一性的較佳方法意欲得到在受試序列之間的最大配對。在電腦程式中編寫將多核甞酸或多肤排成一直線的方法，包括GCG套裝程式（Devereux， J.，等人，Nucleic Acids Research (1984) 12(1) : 387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul，S.F.等人，J· Molec. Biol. 215 : 403 (1990)、Bestfit 程式 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive，Madison, WI 5371 1 (使用 Smith和 Waterman， Advances in Applied Mathematics 2 : 482-489 (1981)的局部同種性演算法）。 O:\110\110257.DOC •34· 1304737 當使用任何的序賴列程序來決定特定序列，例如是否與參考序列有·㈣-性時，設定參數而得以整個全長的參考多肽或多核芬酸中計笪 T <异同一性的百分比，並容許在參考多核甞酸中，在同—性中基夂也中的間隙，最多為核答酸總數的10%。定在問題序列（本發明之序列）和主題序列之間’最佳

之全面性配對的較佳方法，亦稱為全體的序列排列，可使用 FASTDB電腦程式，以BrutIag 等人（―App Bi〇sci L 237-245 (1携））的演算法為基礎來決定之。”序列”一詞包括核H和胺錢序^在序列㈣巾，問題和主題的序列均為核錢序列或胺基酸㈣。該全體的序列排列之結果’為以百分比計的同一性。在霞序列的MS而搜索中’計算百分比同—性所使用的較佳參數為：矩陣=-兀的，k-tUple=4，誤配罰點=1，連接罰點=3〇，隨機組長度=〇,且截止分數=卜間隙罰點=5，間隙大小罰點〇.〇5，

:視窗大小’或在問題序列較短時，為問題序列以核甘酸鹼基計之長《。用纟計算胺基酸排列之百分比同一性和類似性的較佳參數為：矩陣=pAM 15〇, k_tupie=2,誤配罰點=1，連接罰點=2〇，隨機組長度=〇，截止分數, 間隙罰點=5 m小罰點=〇·〇5，❿視窗大小=500，或在問題序列較短時，為問題序列以胺基酸殘基計之長度。舉例來說，與序列識別1號中所含有之序列具有至少 9 0 /〇同性之核苷酸序列的多核甞酸，意指該多核苷酸的核苷酸序列，與序列識別1號所含有的序列相同，除了

O:\110\l 10257.DOC -35· 1304737 該多核苷酸序列可能在序列識別1號的總長度中’每100個核甞酸中含有最多10個點突變之外。換句話說，欲獲得包括與序列識別1號具有至少90%同一性之核苷酸序列的多核芬酸，可刪除、插入，或以其他核苷酸取代序列識別1 號中所含有之序列最多10%的核苷酸。這些改變可發生在該多核苷酸中的任何地方，並可個別地散布在核苷酸之中，或在序列識別1號内一或多個相鄰的組中。

同樣地，與序列識別2號中所含有之序列具有至少98%，，同一性"之胺基酸序列的多肽，意指該多肽的胺基酸序列’與序列識別2號中所含有的序列相同，除了該多肽序列可能在序列識別2號的總長度中，每1〇〇個胺基酸中含有最多2個胺基酸的變化之外。換句話說，欲獲得具有與序列識別2號有至少98%同一性之胺基酸序列的多肽，可刪除、插入，或以其他胺基酸殘基取代序列識別2號中所含有之序列最多2%的胺基酸殘基。這些改變可發生在該多肽中的任何地方，並可個別地散布在殘基之中，或在序列識別2號内一或多個相鄰的組中。 ’’具有生物活性的多肽"意指以特定的生物測定來測量，顯示出與本發明的多肽（例如膽固醇運送活性）類似，但不定相同之；S•性的多肽，有或無劑量依賴性。在存有劑量依賴性的案例中’它不需要與該多肽的㈣，但在與本發月之夕肽相比較時，寧可在實質上類似特定活性的劑量依 J (也就疋忒，候選的多肽將顯示出比與本發明之多肽有關的活性更高的活性，或不超過低於大約25_倍，而更

O:\110\110257.DOC • 36 - 1304737 佳的是不超過低於大約10倍的活性，最佳的是不超過低於大約3-倍的活性）。 "多肽變體"意指與本發明的ABC1多肽不同，但保留其基本特性的多肽。—般而言，變體是全部密切類似的，且在許多區域，與包括序列識別2號之多肽相同。較佳的疋’該多肽變體保留其生物活性，也就是膽固醇的運送活性。變體包括接合變體、對偶基因變體，和加入、刪除和取代變體。同樣地，”多核甞酸變體"意指與本發明之多核苷酸不同’但保留其基本特性的多核誓酸。該變體可在密瑪區、非-密碼區或兩者中含有變化。#佳的是含有產生無聲取代、加入或刪除之變化，但不改變所編碼之多肽的性質或活性的多核苷酸變體。因為遺傳密碼的簡併而產生之核苷酸變體是較佳的。然而，其中以任何組合取代、刪除或加入10_20、5_10、1_5或1-2個胺基酸的變體亦是較佳的。為了各種理由產製多核#酸變體，例如，為了在特定宿主中最適切地發揮捃碼子的表現（例如改變在人類中的密碼子，成為諸如大腸桿菌之類的細菌宿主較喜歡的那些）。 ”對偶基因變體"為天然存在的變體，其意指在生物的染色體上佔據特定場所之基因的數個替代形式中的一種。 (Genes II，Lewin，B.，編輯，j〇hn WUey & s〇ns，New Y〇rk (1985))。這些對偶基因變體可在多核苷酸及/或多肽層面上發生改«。另夕卜，亦彳藉著突變生成技術或藉著直接合

O:\HO\110257.DOC (8) -37- 1304737 成，來產製非-天然存在的變體。 ”保留性胺基酸置換”一詞意指以非&然的殘基取代天然的胺基酸殘基，而得以對在該位置處之胺基酸殘基的極性或電荷’有很少或沒有影響。例如，由於以任何其他的非-極性殘基置換在多肽中的非-極性殘基’而產生的保留性置換。其他的保留性置換之實例為以其他酸性的殘基來置換酸性的殘基。預期保留性置換產生的ABCl多肽，具有類似天然存在之ABC 1多肽的那些功能和化學特徵。 "正類似物（ortholog)”一詞意指與從不同物種中確認之多肽相符合的多例如，老鼠和人類ABC1多肤被視為是正類似物。當在本文中使用時，”啟動基因，，一詞意指位在結構基因起始密碼子上游（也就是之未經轉錄的序列（通常在大約 100至1000個鹼基對内）’其控制該結構基因的轉錄。當在本文中使用時，"促進子"一詞意指DNA順向-作用的要素，長度通常是10-300個鹼基對，其作用在啟動基因上，以便增加轉錄作用。促進子是不依賴相對方位和位置的。已經發現它們相對於轉錄單位的5,和3,。 '宿主細胞”為已經被轉化或轉移感染，或能夠被外源的多核苷酸序列轉化或轉移感染的細胞。 ABC1多肽本發明係關於新穎的人類ABC丨多肽。在一個具體實施例中，ABC1多肽包括在序列識別2號中所示的胺基酸序列。相對於由其他人報告的人類ABC1蛋白質，在序列識

O:\110\110257.DOC •38- 1304737 別2號中所示的ABC 1多肽在胺基終端具有額外的60個胺基酸，顯示具有2261個胺基酸的ABC1蛋白質優於2201個胺基酸的（參見Langmann等人，在Biochem· Biophys. Res. Comm.，257，29-33 (1999))。此外，在序列識別2號中所示的ABC1多肽與其他人報告的不同之處在於數個胺基酸殘基。特定而言，在序列識別2號中所示的AB C1多肽，在殘基159處具有K代替R，在765處具有I代替V，在823處具有 Μ代替I，在M95處具有I代替T，在1588處具有L代替P，在1914處具有Κ代替R，並在2108處具有L代替Ρ。欲保持與公告的記數一致，上述的胺基酸編號是Lawn等人，J· Clin. Invest., 1 04 : R25-3 1 (1999)中的那些，而非序列識別2號中的那些。如同在下文中更詳細討論的，該序列差異可能是因為是從老鼠中，使用以PCR_為基礎之策略來選殖第一個ABC1 cDNA，而後續報告的人類ABC1 cDNA序列則是從老鼠蛋白質之序列預測的事實。藉著Sds-PAGE 定出該ABC1蛋白質具有大約24〇 kD的分子量。本發明亦關於包括在其整個長度上，與序列識別2號之胺基酸序列最好具有至少98%同一性之胺基酸序列的ABC i 多肽。更佳的是，該多肽在其整個長度上，與序列識別2 號之胺基酸序列具有至少99%的同一性。最佳的是，該多肽在其整個長度上，與序列識別2號之胺基酸序列具有 1〇〇%的同一性。如同先前之定義，"同-性"-詞意指在多肽序列之間序列關連性的程度，在下文中更進—步定義之。

O:\110\110257.DOC -39- 1304737 刪除和插入變體，衍生物和正類似物以這類相關的ABC 1多肤包括取代、及對偶基因變體、接合變體、片段、較佳的多肽和多肽片段包括那些具有八；6(：1之生物活性的多肽和片段。特定而言，調節反向膽固醇運送的那些多肽和片段是較佳的。較佳的還有具有經過改善之反向膽固醇運送活性的多肽和片段。

取代、刪除和插入變體意指包括與在序列識別2號中陳述之ABC1胺基酸序列相比較，含有一或多個胺基酸序列的取代、刪除及/或加入之胺基酸序列的ABC1多肽。在較佳的具體實施例中’該變體具有從大約1至5，或從大約1 至10，或從大約1至20’或從大約1至40，或從大約1至65 個胺基酸取代、加入及/或刪除。例如，該變體可在多肽中的任何地方，以及在缓基終端及/或在胺基終端，具有一或多個胺基酸殘基的加入’只要該變體仍維持生物功能。例如，亦可從該多肽的任何區域，包括羧基終端及/ 或胺基終端，刪除一或多個胺基酸，而沒有實質上生物功能的喪失（Ron 等人，J. Biol. Chem.，268 : 2984-2988 (1993)，Dobeli 等人，J. Biotechnology, 7 : 199-216 (1988))。胺基酸取代作用（們）可以是保留性、非_保留性，或其任何的組合，只要該ABC 1變體仍然維持其生物活性。此外’可利用非-保留性的胺基酸殘基，其中被取代的殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的，並以具有取代基基團的胺基酸殘基進行取代作用（們）。可使用已熟知的技術，決定ABC 1多肽的適當變體。例 O:\110\110257.DOC -40- 1304737 如，可藉著確認ABC1分子中可改變但不破壞其生物活性的區域，來決定適當的ABC1變體。再者，如同在此項技藝中領悟的，即使該區域對於其生物活性或結構是很重要的，其限制條件為該保留性之胺基酸置換，不破壞其生物活ί±或對於該多肽結構無不利影響。可加以改變但不破壞其生物活性的胺基酸殘基，可藉著確認ABC丨多肽中，對於活性不重要的區域來決定之（B〇wie等人，Sconce， 247: 13〇6-1310 (1990))。例如，可比較得自各種物種的 ABC1多肽，決定跨越物種保留之胺基酸殘基和ABci分子的區域。保留性胺基酸殘基對於生物功能及/或結構可能是很重要的。相反的，未跨越物種保留的ABC1*子之區域中的改變，並因此受到天然選擇的容忍，將不太可能對生物活性及/或結構有不利的影響。因此，在非_保留性區域有加入、刪除或取代的ABC1多肽，亦可能是適當的載體。即使是在相對上較具保留性的區域，亦可利用在化學上類似的胺基酸來取代天然存在的殘基，同時仍維持其活性。此外’可使用結構-功能研究，決定在ATP-結合卡匿蛋白質家族的其他成員中，像是ABCR和ABC-C，對活性或結構很重要的殘基，來確認適當的ABC 1變體。這類研究容許預言在ABC1變體中重要的胺基酸殘基，與在其他 ATP-結合卡匣蛋白質中，對於活性或結構很重要的胺基酸殘基一致。例如’以其他ATP-結合卡匣蛋白質之結構-功能的研究為基礎，在ABC1中很重要的胺基酸殘基，可能 O:\110\110257.DOC -41 - 1304737 在與核芬酸結合和脂醇運送有關的區域中找到。適當的變體，包括例如就ABC1多肽中，這類被預測為重要的胺基 I殘基而5 ’具有在化學上類似之胺基酸取代的多肤。亦可使用遺傳工程的技術，在特^的位置導人胺基酸的改變’以便確認該區域對於多肽功能的決定性，來決定適田的ABC 1變體。可使用例如指定位置之突變生成作用，或丙-篩選的大變生成作用，來製造胺基酸的改變 (Cunningham等人，Science，244: 1〇811〇85 (1989》。然後使用例如，在本文中描述之膽固醇排出測定中的任何一種，來測試所得的ABC1變體的生物活性。具有特定的胺基酸殘基之取代，結果導致遭受破壞的膽固醇排出活性之變體’將不被視為是適當的AB c 1變體。其他確認適當變體的方法為此項技藝中已知的。此外，熟此藝者將瞭解在該蛋白質中的某些胺基酸位置處，可能容許的胺基酸改變（B〇wie等人，在前（199〇))。例如通常已知最可能隱藏或在内部（在蛋白質的三級結構内）的胺基酸殘基需要非極性的側鏈，然而通常保留較少的表面或外部侧鏈的特徵。此外，已知被容忍的保留性胺基酸置換，涉及脂肪族或忌水性胺基酸Ala、Val、Leu和IU的置換，羥基殘基Ser和Thr的置換，酸性殘基Asp和的置換，醯胺殘基Asn和Gin的置換，鹼性殘基Lys、Arg和ms 的置換，芳香族殘基Phe、Tyr和Trp的置換，以及小-尺寸之胺基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的置換。 AB Cl變體可以是天然存在的或以人造方式構築的。天

O:\110\110257.DOC 1304737 然存在之變體的實例為對偶基因變體和接合變體。對偶臭因變體意指在生物或生物族群的染色體上，佔據特定場所之基因的數個替代形式中的一種（Lewin, B.，編輯， II’ John Wiley & Sons’ New Y〇rk (1985))。對偶基因變體可在多核嘗酸及/或多肽層面上改變。接合變體意指藉著在RNA轉錄本，以及相對應之多肽中，交替處理插入序列而產生的核酸分子，通常是RNA。另外，八3〇1構築體亦可以是以人造方式構築的《例如，可使用指定位置之突變生成的技術來建構ABC1變體。再者，例如，可從編碼該變體之相對應的核酸分子來製備ABC1變體，其具有按照上述從在序列識別1號中陳述之野外型DNA序列加以改變的DNA序列。多肽片段意指包括小於在序列識別2號中陳述之ABC丨全長胺基酸序列的多肽。較佳的多肽片段包括那些具有 ABC1之生物活性的片段。特定而言，調節反相膽固醇運送或具有改善之反相膽固醇運送活性的那些片段是較佳的。ABC1片段從該多肽的任何區域中，包括羧基終端及/ 或fe基終端，具有一或多個胺基酸的刪除，只要仍然維持其生物功能。ABCI多肽片段可以是天然存在的，像是經由交替接合或在活體内的蛋白酶活性，或可以是以人造方式使用已熟知之方法建構的。本發明亦關於ABC 1多肤的衍生物，其意指已經以化學方式修改’如同在本文中定義的ABC1多肽、變體或片段。在附接於該多肽之分子的類型或位置上，以某種方式 O:\110\110257.DOC •43· 1304737 修改’而與天然存在之ABC1多肽不同的衍生物。衍生物可進一步包括藉著刪除一或多個天然附接於AB C1多肽上的化學基團而形成的多肤。此外，可將包括序列識別2號之胺基酸序列的ABC 1多肽，以及上述的ABC 1變體和片段，與同種的多肽融合，形成同種二聚體，或與異種的多肽融合，形成異種二聚體。本發明的其他觀點係關於突變的ABC 1多肽及其片段，相當於分離自湯吉爾症患者的多肽。在一個較佳的具體實施例中，ABC1多肽包括序列識別8號。該蛋白質分離自湯吉爾症患者（TD1 )，並按照在實例1和5中的描述定序。在序列識別8號中陳述的胺基酸序列，與野外型類似，除了在位置537處有穀胺醢胺對精胺酸的取代作用之外（該殘基編號為 Lawn 等人，J. Clin. Invest.，104 : r25-31 (1999) 的’相當於序列識別8號的位置597)。該殘基的位置是在胺基終端的忌水性功能部位内，接近第一個預測的穿透膜功能部位。該取代作用改變了在蛋白質該區域之胺基酸的電荷’導致ABC 1蛋白質具有明顯降低的膽固醇排出活性，如同在圖1中所示。在另一個較佳的具體實施例中，突變的ABC1多肽包括序列識別10號。該蛋白質相當於分離自湯吉爾症患者 (TD2)的多肽，並按照在實例1和5中的描述定序。在序列識別10號中陳述的胺基酸序列，與野外型類似，除了在殘基527處有精胺酸對色胺酸的取代作用之外（該殘基編號為 Lawn等人，在前（1999)的，相當於序列識別10號的位置 O:\110\110257.DOC -44 - 1304737 587)。像TD1多肽一樣，該取代作用改變了在ABC1蛋白質之胺基終端忌水性功能部位中胺基酸殘基的電荷。所得的突變ABC1蛋白質亦具有明顯降低的膽固醇排出活性，如同在圖1中所示。 ABC1多核苷酸本發明的其他觀點係關於編碼該新穎之ABC 1多肽及其變體的經過分離之多核甞酸。例如，本發明提供編碼全長 ABC 1多肽的經過分離之多核苷酸，含有野外型ABC 1之全長cDNA的多核甞酸，含有野外型ABC 1之密碼序列的完整長度的多核甞酸，和含有ABC1之非-密碼5'和3'序列的多核甞酸，以及相關之ABC1變體的多核苷酸。本發明亦提供編碼突變之ABC 1多肽的經過分離之多核苷酸，像是湯吉爾症患者的那些。在一個較佳的具體實施例中，經過分離的多核苷酸包括編碼包括序列識別2號之多肽的核甞酸序列。重要的是，與Langmann等人發表的序列相反，其以在表現序列3中發現的預測起始甲硫胺酸為基礎，編碼具有2201個胺基酸的蛋白質（Langmann 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm., 257 : 29-33 (1999)(GenBank登錄編號 AJ012376)，而目前提出申請的核苷酸序列則含有50個表現序列，並編碼具有 2261個胺基酸的蛋白質（參見圖4)。本發明相對應的核苷酸序列，含有在5'末端包含額外180個核甞酸的密碼序列，相當於下列的60個胺基終端胺基酸：

MACWPQLRLLLWKNLTFRRRQTCQLLLEVAWPLFIFLIL O:\110\110257.DOC -45 - 1304737 ISVRLSYPPYEQHECHFPNKA。假如從該位置往上游6至9 個核甞酸，有在骨架内的終止密碼子，新近預測的起始位置就是第一個甲硫胺酸密碼子，其能夠產生連續的打開密碼。將該新穎的ABC1 cDNA序列與亦含有60個額外胺基酸之打開密碼的相關之ABC運送者序列ABCR和ABC-C(亦稱為ABC3)排成一直線，指出高度的類似性，暗示同種的 ABC運送者蛋白質始於與就人類ABC1所提出之胺基終端延伸序列有關的序列。可能較早公告的人類ABC 1之起始位置，是從公告的老鼠ABC1 cDNA序列來預測的（Luciani 等人，Genomics, 21 150-159 (1994); GenBank登錄編號： X75926)，其在延伸區中含有外核苷酸"η” ’使得新近揭示的甲硫胺酸不在骨架内。然而，如果忽視在老鼠序列中的 "η"核甞酸，則老鼠和人類序列的延伸區便是相同的。根據這些結果，可能全長的人類ABC1蛋白質含有2261個胺基酸，而非2201個胺基酸，如同先前由Langmann等人及其他人提示的。因此，Langmann等人並未提供人類ABC 1全部的打開密碼。在另一個較佳的具體實施例中’經過分離的多核甞酸包括全長的ABC1 cDNA，包括至少一部份的非-密碼5'和3'序列。較佳的是，該多核苷酸包括在序列識別1號中出示的核苷酸序列。在序列識別1號中出示之1 040〇個鹼基的人類 ABC1 cDNA序列，含有6783個核替酸的打開密碼加5'和3' 未轉譯區。在位置291處有開始密碼子，且在位置7〇74處有終止密碼子。在序列識別1號中所示的本ABC 1 cDNA與 O:\110\110257.DOC -46 - 1304737 公告之ABCl cDNA (GenBank登錄編號AJ012376)在數個方面有差異。首先，本ABC1 cDNA在5'末端包括額外的 35 0個核苷酸’並在3'末端包括額外的3136個核苷酸（不包括聚（Α)尾）。本ABC1序列與公告之ABCl cDNA不同之處，還有在密碼區中有10個核苷酸的取代作用。在十個差異中，七個核#酸的差異預測了胺基酸的改變。欲保持與公告的記數一致，下列的核甞酸和胺基酸編號為Lawn等人，J_ Clin· Invest·，104 : R25-31 (1999)和 GenBank登錄編號AJ012376的那些’而不是序列識別1號的那些。核：y：酸和胺基酸的變化如下：（1)在核苷酸414處A取代G; (2)在核苷酸596處A取代G(在胺基酸159處K取代R) ; (3)在核苷酸705處T取代C ; (4)在核苷酸1980處A取代C ; (5)在2413 處A取代G (在胺基酸765處I取代V); (6)在2589處G取代A (在胺基酸823處Μ取代I); (7)在4604處T取代C (在胺基酸 1495處I取代T); (8)在4883處Τ取代C (在胺基酸1588處L取代Ρ) ; (9)在5861處Α取代G (在胺基酸1914處Κ取代R);以及（10)在6443處T取代C (在胺基酸2108處L取代P)。胺基酸變化中有五個是保留性胺基酸變化，並可代表多形性或序列錯誤。在兩個案例中，本序列預測出與GenBank序列不同的重要胺基酸。該差異導致在殘基1588和殘基2108處，較喜愛亮胺酸而非脯胺酸。有趣的是，亦在三個接受分析的TD試樣和高度保留的老鼠ABC 1蛋白質序列中，分別在這兩個位置找到預測的亮胺酸。本發明亦關於包括在其整個長度中，與包括序列識別1 O:\110\110257.DOC •47· 1304737 號之多肽最好具有至少80%同一性之核甞酸序列的ABC 1多核甞酸。更佳的是，該多核:y：酸在其整個長度中，與包括序列識別1號之多核：y：酸具有至少90%的同一性。再更佳的疋’該多肽在其整個長度中，與包括序列識別1號之多核甞酸具有至少95%的同一性。最佳的是，該多肽在其整個長度中’與包括序列識別丨號之多核苷酸具有至少1 〇〇0/〇的同一性。這類相關的ABC1多核苷酸包括取代、删除和插入變體’以及對偶基因變體、接合變體、片段、衍生物和正類似物，其中一或多個核苷酸已經被取代、刪除、插入或衍生化。較佳的多核苷酸包括編碼具有生物活性之 ABC1多肽的那些多核苷酸，像是膽固醇排出活性。在其他較佳的具體實施例中，經過分離的多核苷酸包括 ABC1的完整密碼序列。在特佳的具體實施例中，多核苷酸包括如序列識別1號之核苷酸29^074所示的序列。該經過分離的多核甞酸含有6783個核甞酸的ABC1打開密碼，並編碼如同上述之2261個胺基酸的多肤。在另一個較佳的具體實施例中，經過分離的多核苷酸包括編碼ABC1變體多肽的核甞酸序列。特定而言，該經過分離的多核甞酸包括編碼包括與序列識別2號之胺基酸序列具有至少98%同一性的胺基酸序列之多肽的核苷酸序列。較佳的還有經過分離的多核甞酸’其包括編碼包括與序列識別2號之胺基酸序列具有至少99%同—性的胺基酸序列之多肽的核苷酸序列。因此，本發明包括那些編碼上述之ABC1多肽的多核替酸，包括上述之取代、删除和插 O:\110\110257.DOC • 48 - 1304737 入變體，以及ABC1對偶基因變體.、接合變體、片段生物、融合多肽和正類似物。較佳的多核I :且: 删生物活性之多肤的那些多核嘗酸。特定::碼二編碼調節反向膽_運送之多肽的的= 碼具有改善之反向膽固醇運送活性之多肽的多核:、亦：較佳的。疋本發明的其他觀點係關於經過分離的多核苷酸，

得自湯吉爾症患者的突變ABC1多肽。在—個較佳的= 實施例中，該多核料編碼序列識別8號之多& ,該多肤係分離自患者TD1，並如同上述。在另一個較佳的：體實施例中’該多核#酸包括在序列制m中陳述的核菩酸序列。在序列識別7號中陳述的核苷酸序列含有全部的打開密碼，以及5,和3,側面序列。該打開密碼編碼其中含有取代之2261個胺基酸的多肽，核甞酸的取代作用導致在位置537處A對G的取代（使用Lawn等人，在前（1999)中的編號）。、在另個較佳的具體實施例中，係關於編碼突變之 ABC1多肽的多核荅酸’該多核苷酸編碼序列識別1〇號的多肤’該多肽係分離自湯吉爾症患者TD2，並亦如同上述。在另一個較佳的具體實施例中，該多核苷酸包括在序列識別9號中陳述的核苷酸序列。在序列識別9號中陳述的核誓酸序列’含有全部的打開密碼，以及5,和3,側面序列。該打開密碼編碼其中含有取代之226 i個胺基酸的多肽’核答酸的取代作用導致在位置527處Arg對Tryp的取代

O:\110\110257.DOC -49- 1304737 (使用Lawn等人，在前（1999)中的編號）。本發明的其他觀點係關於經過分離的多核甞酸，其包括 ABC 1的非-密碼5'侧面和3,側面區。在一個具體實施例中’經過分離的多核甞酸包括ABC 1的非密碼5,側面區。較佳的是，該5'側面區含有但不限於ABC1啟動基因區。因此’在較佳的具體實施例中，該多核苷酸包括在序列識別 3號中出示的序列。如同經由異種報告者測定所證實的，在實例15中討論’在序列識別3號中陳述之多核苷酸含有 ABC1基因的轉錄調節區。如同在圖13中所示，在序列識別3號中陳述的多核:y：酸為1643個驗基對的非-密碼序列，其含有數個轉錄調節要素，包括在位置1522、1435和1383 處的TATA盒子，以及轉錄因子結合位置，包括數個假定的SP1位置，和數個核受體半位置。此外，亦在位置i 483_ 1500處找到已被確認的脂醇反應要素。在實例17中描述更進一步的異種受體測定，顯示序列識別3號中數個個別的蛋白質仍保有啟動基因活性。因此，在其他較佳的具體實施例中’多核芬酸包括序列識別3號的核苷酸丨_丨532、 1080-1643、1 181-1643、1292-1643 或 1394-1643。在特佳的具體實施例中，該多核芬酸包括序列識別3號的核苷酸 1394-1532，已經顯示該序列具有八3(：1啟動基因之活性（參見實例17)。在另一個較佳的具體實施例中，多核甞酸包括序列識別3號的核苷酸148〇_151〇 ,顯示其調節對配體的ABC1轉錄反應。 5’侧面之多核甞酸，亦包括在嚴格的條件下，與在序列 O:\110\110257.DOC -50. 1304737 識別3號中陳述之核嘗酸序列雜交的核嘗酸序列，其中該核甞酸序列具有ABC1啟動基因活性。在另一個具體實施 -· 例中，該多核苷酸包括在嚴格的條件下，與包括序列識別 -- 3 號之核甘酉夂 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643 或1394-1643之核苷酸序列雜交的核甞酸序列，其中該核甞酸序列具有ABC 1啟動基因活性。在另一個具體實施例中，經過分離的多核甞酸包括 ABC1的3’侧面區。已經確認出數個3ι未轉譯區，其可代表 ABC1轉錄本之聚腺替酸化作用的另一個位置。較佳的是，經過分離的多核：y：酸包括在序列識別4號中出示的序列。較佳的還有包括在序列識別5號中出示之序列的經過分離之寡核芬酸。在另一個較佳的具體實施例中，經過分離的募核甞酸包括在序列識別6號中出示的序列。在另一個較佳的具體實施例中，該多核：y：酸包括在嚴格的條件下’與在序列識別4號、序列識別5號或序列識別6號中陳述之核嘗酸序列雜交的序列。本發明亦包括相關的ABC 1之5'和3,側面多核甞酸。因此’本發明係關於包括在其整個長度中，與包括序列識別 3號之多核：y：酸、包括序列識別4號之多核甞酸、包括序列識別5號之多核甞酸、包括序列識別6號之多核甞酸，或包 . 括序列識別3號之核苷酸1-1532、1080-1643、1 181-1643、 1292-1643或1394-1643的多核苷酸，具有至少80%同一性之核芸酸序列的多核苷酸。較佳的是，該多核甞酸在其整個長度中，與任何一個上文提及之側面多核甞酸具有至少

O:\110\110257.DOC -51- 1304737 較佳的是至9〇%，更佳的是至少％ 100。/。的同—性取佳的是的…h 佳的少核甘酸包括那些具有生物活性的多核4酸，像是轉錄調節活性。

明瞭本發明更有關於與上述多料酸序列中的任—個互補之經過分離的多料酸。當在本文中使㈣，"互補"一詞意指在料酸之間的雜交或驗基配對，像是例如在雙· 股多核#酸的績之間。S個單·股的核#时子，當一股的核H利用適當的核料插心刪除或取代，最二切地排成-直線，與另—股的核菩酸具有至少大約嶋成對時’被稱為是互補的。本發明的另一個觀點係關於包括上述之新穎的ABC1多核I和適當載劑的組合物。在一個具體實施例中，該組合物包括編碼序列識別2號之多肽的多核甞酸，包括序列識別1號之多核:y：酸，包括序列識別1號之核甞酸29丨_7〇74 的多核替酸’或編碼包括與序列識別2號之胺基酸序列具有至少98%同一性之胺基酸序列的多肽的多核嘗酸，以及適當的載劑。在其他的具體實施例中，該組合物包括在其整個長度中，與包括序列識別1號之多核甞酸具有至少 80% ’較佳的是90%，或更佳的是95%同一性的多核甞酸，和適當的載劑。在另一個具體實施例中，該組合物包括含有ABC 1 5’側面序列之多核甞酸和適當的載劑。較佳的是，該組合物包括含有序列識別3號之多核甞酸，或序列識別3號之核苷酸片段 1-1532、1080-1643、1 181-1643、1292-1643 或 1394- O:\110\110257.DOC -52- 1304737 1643的多核替酸’以及適當的载劑。較佳的還有包括在其整個長度中’與包括任-個上述5,側面序列具有至少、8G%、9G%或95%同—性之多核L適Μ㈣Μ ·物。在另-個具體實施例中，該組合物包括含有abci 3, 側面序列之多核嘗酸和適當的戟劑。較佳的組合物包括含有序列識別4號之多核苷酸、含有序列識別5號之多核苷酸，或含有序列識別6號之多核铝酸，以及在其整個長度中，與這些多核苷酸中任一個具有至少8〇%，較佳的是 90% ’或更佳的是95%同-性之多核替酸，以及適當的載劑。本發明的其他組合物包括突變的abci多核甞酸。較佳的是，該組合物包括含有序列識別7號之多核苜酸，或含有序列識別9號之多核苷酸，以及適當的載劑。此外，本發明之組合物可含有任何組合的二或多個上述的ABC 1多核甞酸和適當的載劑。任何適當的含水載劑，均可用於該組合物中。較佳的是’載劑使該組合物在想要 • 的溫度下成為穩定的，像是室溫或儲存溫度（也就是4。(：炱_ 2〇°C)，並具有大約中性的pH值。適當載劑的實例為熟諳此藝者已知的，並包括Tris-EDTA緩衝溶液和DEpc_H2〇e AB C1載體和宿主細胞本發明亦關於包括一或多個上述之ABC1多核菩酸的重 • 組載體、以遺傳工程之方式帶有包括ABC1多核：y：酸之載 • 體的宿主細胞，並藉著重組技術來產製ABC1多肽。如同已經提及的，本發明提供包括一或多個上述之野外塑 ABC1多核甞酸的重組載體。在較佳的具體實施例中，該 O:\HO\110257.DOC -53· 1304737 重組載體包括編碼包括序列識別2號之多肽的多核甞酸，包括序列識別1號之多核苷酸，以及包括序列識別1號之核甞酸291-7074的多核甞酸》在另一個較佳的具體實施例中’重組載體包括編碼包括與序列識別2號之胺基酸序列具有至少98°/。同一性之胺基酸序列之多肽的變體多核苷酸。再者’在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括與包括序列識別1號之多核：y：酸具有至少80%同一性的變體多核苷酸。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括與這些多核苷酸中任一個互補的多核苷酸。在其他的具體實施例中’重組載體包括含有分離自湯吉爾症患者之突變ABC 1多核：y：酸的多核苷酸。在較佳的具體實施例中，重組載體包括含有序列識別8號的多核苷酸。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括含有序列識別1 〇號的多核:y：酸。重組載體亦可包括與這些序列互補的多核苷酸序列。亦瞭解該重組載體也可以包括任何組合的二或多個上述之野外型、變體或突變的ABC1多核苷酸。經過分離的ABC1多核苷酸，像是任何一個上述的野外型、變體或突變的多核甞酸’可使用已熟知的連接和選殖技術’將其插入載體内。已經在數個標準實驗室手冊中描述了選殖技術，包括Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology (1986) ; Sambr〇〇k 等人，Molecular

Cloning : A Laboratory Manual，第 2 版，（Cold Spring

Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) ； Ausubel O:\110\110257.DOC -54- 1304737 等人，編輯，Current Protocols in Molecular Biology, (Wiley & Sons (1994)) ; Goeddel等人，Gene Expression - Technology (Methods in Enzymology (1991)) ; Murray編 - 輯 ’ Gene Transfer and Expression Protocols (Human Press， Clifton, NJ)。可使用任何適用於ABC1多核苷酸插入的載體。通常選擇在所使用之特定宿主細胞中具有功能的載體（也就是該 _ 載體可與宿主細胞機構相容，而得以發生基因的擴大及，或表現）。較佳的是，可與細菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞相容的載體。載體為表現載體亦是較佳的（關於表現載體的回顧’參見Goeddel, D.V.編輯，Methods Enzymol.， Academic Press Inc.，San Diego，CA (1990))。載體可以是例如噬菌體、質體、病毒或反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可以是能夠複製的或有複製缺陷的。在後者的案例中’病毒的繁殖通常僅發生在互補的宿主細胞中。 φ 通常在任何宿主細胞中使用的表現載體，將含有質體維持和選殖並表現外源核苷酸序列的序列。這類序列，集體地稱為”側面序列”，最好應該包括一或多個下列的核苷酸序列：啟動基因、一或多個促進子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有捐贈者和接受者接合位置的完整插入序 .列、編碼多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位置、 .聚腺菩酸化作用序列、插入編碼待表現之多肤的核酸的多交聯劑區，以及可選擇的標記要素。側面序列可以是同種的(也就是得自與宿主細胞相同的

O:\liO\110257.DOC -55- 1304737 物種及/或品系）’異種的（也就是得自與宿主細胞物種及/ 或品系不同的物種），雜種的（也就是得自一種以上來源之 -· 側面序列的组合），或合成的。此外，側面序列也可以是 . 天然的序列，其通常具有調節AB C1多肽表現的功能。侧面序列的來源可以是任何的原核生物或真核生物，任何脊椎動物或無脊椎動物，或任何植物，只要該侧面序列在宿主細胞的機構中具有功能的並可被活化即可。載體亦最好應該包括至少一個在宿主中繁殖的可選擇標記。可選擇標記為編碼宿主細胞在選擇性培養基中存活和生長所必需之蛋白質的基因要素。適當的可選擇標記基因，編碼⑷賦與原核生物宿主細胞，對抗生素或其他毒素，例如氨苄青黴素、四環素或康黴素之抗藥性的蛋白質’·（b)細胞的互補自營缺陷；或（c)補充無法自複雜培養基中獲得的重要營養。較佳的可選擇標記包括培養真核生物細胞的G418、潮黴素或新黴素之抗藥性，以及在培養大腸桿菌及其他細菌時的四環素、康徵素或氨爷青徵素的抗藥性。其他適當的選擇基因包括用來擴大表現基因的那些。擴大為其中在連續產生之重組細胞的染色體内，以縱列方式重覆對於產製就生長而言很重要的蛋白質有較大需求的基因之過程。對哺乳動物細胞而言’適當的可選擇標記之實例包括二氫葉酸還原酶（DHFR)和胸腺核替激酶。將哺乳動物細胞轉化物放在選擇壓力之下，纟中由於在載體中存有選擇基因’僅有唯-適應的轉化物存活1著在其中連 O:\110\110257.DOC -56- 1304737 之濃度的條件下，培養經過轉續改變在培養基中選擇製劑化的細胞’強加上選擇屋力，基因兩者的擴大。結果，從經含量的ABC1多肽。藉此導致選擇基因和ABC 1 過擴大的DNA中合成了增加載體最好也應該含有轉錄終止序列，其通常位在多肽密碼區之末端的3處，並擔任終止轉錄的職務。通常，在原核生物細胞中的轉錄終止序列為富含G-C的片&，接著是聚T序列β亥序列可以商用載體的一部份而購得，或使用核酸合成中已熟知的方法來合成。載體最好也應該含有核糖體結合位置，其通常為mRNA 開始轉譯所必需的，且其特徵為处⑹心如⑽序列（原核生物）或Kozak序列（真核生物）。該要素通常位在啟動基因的3和待表現之ABC1多肽之密碼序列的5,。处⑹-Dalgarno序列是多變的，但通常是聚嗓吟（也就是具有高A_ G内3量）。已經確認出許多Shine_Daigarn〇序列，可使用已A知的方法’迅速地合成每一個。載體最好也應該含有宿主生物認可，並以可操作方式與編碼之多核苷酸連接的啟動基因。啟動基因可以是可誘導的啟動基因，或組成的啟動基因。可誘導的啟動基因，一開始反映在培養條件中的某些改變，像是營養的存在或缺乏，或溫度的變化，而在其控制之下增加從DNA中轉錄的程度。相對的，組成的啟動基因開始連續的基因產物產製，結果導致較低或無控制的過度基因表現。藉著限制酶消化作用，從起源DNA中移出啟動基因序列，並將想要的 O:\110\110257.D〇C •57- 1304737 啟動基因播入載體内’以可操作之方式將適當的啟動基因與多核苷酸連接。如同已經提及的，可使用天然的啟動基因指揮多核甞酸的擴大及/或表現。因此，重組載體可包括任一個上述之野外型、變體或突變的ABC1多核：y：酸，和ABC1啟動基因，像是在序列識別 3號中找到的。重組載體亦可含有任何組合的二或多個上述之野外型、變體或突變的ABC1多核:y：酸，和一個ABC1啟動基因。如果與天然的ABC1啟動基因相比較，其容許較多的轉錄和較咼的ABC1蛋白質之產量，且如果其可與已經選擇使用之宿主細胞系統相容，則最好使用異種的啟動基因。可單獨或與天然的ABC1啟動基因一起使用異種的啟動基因。因此，在一個較佳的具體實施例中，重組載體包括任一個上述之野外型ABC1多核苷酸，和異種的啟動基因。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括任一個上述之變體ABC1多核苷酸，和異種的啟動基因。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括任一個上述之突變的 ABC1多核苷酸，和異種的啟動基因。較佳的具體實施例亦包括含有任何組合的二或多個上述之野外型、變體或突變的ABC1多核甞酸’和異種啟動基因的重組載體。適用於原核生物宿主的異種啟動基因，包括但不限於冷-内醯胺酶和乳糖啟動基因系統（ViUa_Kamar〇ff等人， 1978’ Proc’ Natl. Acad. Sci. U.S.A” 75 : 3727-31)、鹼性構酸酶、色胺酸（trp)啟動基因系統，和雜種啟動基因，像是 tac啟動基因（ViUa-Kamaroff等人，1978, Pr〇c Nati. Acad. O:\110\110257.DOC -58- 1304737

Sci. U.S.A., 75 : 3727-31)。已經公告它們的序列，藉此熟諳此藝者能夠使用交聯劑或接合體，將其與想要的DNA序列連接，按照需要提供任何有用的限制位置。其他適當的異種啟動基因將是熟諳此藝者已知的。適用於哺乳動物宿主細胞的適當異種啟動基因，亦是已熟知的，並包括但不限於獲自病毒之基因組的那些，像是多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（像是腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、雞肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒和猿病毒40(SV40)。其他適當的哺乳動物啟動基因，包括異種的哺乳動物啟動基因，例如熱休克啟動基因和肌動蛋白啟動基因。另外適當的啟動基因包括但不限於：SV40早期啟動基因和晚期啟動基因區（Bernoist和 Chambon, 1981，Nature 290: 304-10);在勞氏肉瘤病毒之 3'長端重複中所含有的啟動基因（Yamamoto等人，1980, Cell，22 : 787-97);邊疹胸腺核苷激酶啟動基因（Wagner等人，1981，Proc. Natl· Acad. Sci. U.S.A. 78 : 1444-45);以及金屬硫肽基因之調節序列（Brinster等人，1982，Nature 296 : 39-42)。較佳的是，啟動基因為細胞巨大病毒或 SV40啟動基因。因此，在特佳的具體實施例中，重組載體包括一個上述的野外型ABC 1多核甞酸，一個上述的變體 ABC1多核苷酸，或一個上述的突變ABC1多核甞酸，以及細胞巨大病毒啟動基因。在另一個特佳的具體實施例中，重組載體包括任何組合的二或多個上述的野外型、變體或突變的ABC 1多核苷酸，以及細胞巨大病毒啟動基因。

O:\110\110257.DOC -59- (S) 1304737 載體最好亦含有增加諸如ABC1之類的多核苷酸轉錄的促進子序列。用來活化真核生物啟動基因的適當促進子，包括病毒的促進子，像是SV40、細胞巨大病毒早期啟動基因、多瘤和腺病毒促進子。可從起始的載體來建構本發明之表現載體，像是可購得的載體，其可以含有或不含所有想要的側面序列。其中未出現在該載體中的一或多個在本文中描述的侧面序列，可分別獲得並將其連接到該載體内。用來獲得每個側面序列的方法為熟諳此藝者已熟知的。較佳的載體是可與細菌、昆蟲和哺乳動物宿主細胞相容的那些。在細菌中使用的較佳載體，包括例如PQE70、 pQE60 和 pQE-9 (Quiagen，Inc.)、pBluescript 載體、 Phagescript 載體、pNH16A 、 pNH18A 、 pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.)、ptrc99a、pKK223-3、 pDR540、pRIT5 (Pharmacia Biotech，Inc.)和 pCEP4 (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。較佳的真核生物載體包括但不限於 pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、ρΧΤΙ 矛口 pSG (Stratagene) 、 pSVK3 、 pBPV 、 pMSG 和 pSVL (Pharmacia)，以及pGL3 (Promega，Madison, WI)。其他適當的載體對熟諳此藝者而言，將是可輕易知曉的。在特佳的具體實施例中，重組載體包括pCEPhABCl，在實例4中描述它，並在圖3中出示。重組載體pCEPhABCl 包括質體pCEP4 (Invitrogen)，一種含有細胞巨大病毒啟動基因和促進子的表現載體。載體pCEPhABCl更包括了以可

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Cs) 1304737 操作之方式與異種的細胞巨大病毒啟動基因連接的ABCl 夕核4酸。該ABC 1多核甞睃包括序列識別1號，其含有全長的ABCl cDNA’包括非-密碼的5,侧面（也就是天然的 ABC1啟動基因）和3,側面序列。此外，本發明提供包括ABC 1側面序列多核甞酸的重組載體。在一個具體實施例中，重組載體包括含有ABC1 5' 側面序列的多核：y：酸’其較好地含有啟動基因活性。因此’在較佳的具體實施例中，重組載體包括含有序列識別 3號的多核嘗酸。在另一個較佳的具體實施例中，重組載體包括含有序列識別3號之核苷酸1-1532、1080-1643、 1181-1643、1292_1643或1394-1643的多核苷酸。在特佳的具體實施例中，該多核苷酸包括序列識別3號之核苷酸 13 94-1532。再者，在另外的具體實施例中，重組載體包括在嚴格的條件下，與在序列識別3號中陳述的多核苷酸，或包括序列識別3號之核甞酸1-1532、1080-1643、 1 181-1643、1292-1643或13 94-1643的多核苷酸雜交的多核苷酸。在另一個較佳的具體實施例中，多核苷酸包括在其完整長度中，與包括序列識別3號之多核苷酸，或包括序列識別 3 號之核甞酸 1-1532、1080-1643、1 181-1643、 1292-1643或1394-1643的多核甞酸，具有至少80%，較佳的是至少90%，而更佳的是95%同一性的核苷酸序列。重組載體亦包括與任何上述的5'側面序列互補的多核甘酸。在其他的具體實施例中，重組載體包括含有ABC1之3’側面序列的多核甞酸。在較佳的具體實施例中，重組載體包 O:\110\I 10257.DOC -61- 1304737 &有序歹J識別4號的多核芬酸。在另一個較佳的具體實中ί組載體包括含有序列識別5號的多核替酸。在 /較佳的具體實施例中，重組載體包括含有序列識別6 ^的夕核菩酸。此外’在其他的具體實施例中，重組載體 &在嚴格的條件下’與在序列識別4號、序列識別5號或序歹J識別6號中陳述之多核菩酸雜交的多核芬酸。在另一個具體實施例中，該多核芬酸包括在其整個長度中，與包括序列識別4號、序列識別5號或序列識別6號的多核甞酉文，具有至少80%，較佳的是至少9〇%，更佳的是至少 95%同-性的核# 序列。重組載體亦包括與任何上述之 3'側面序列互補的多核苷酸。使用已熟知的連接和選殖技術，將經過分離的八8(：1側面序列多核甞酸，像是任何上述的5,或3,側面序列多核甞酸，插入載體内。可使用任何之前描述的載體。較佳的疋，該載體是可與細菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞相容的。較佳的是’該載體為表現載體。載體可以是例如嗟菌體、質體、病毒或反轉錄病毒的載體。除了 AB C1側面序列之外’載體可含有一或多個下列的側面核苷酸序列：啟動基因、一或多個促進子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有捐贈者和接受者接合位置的完整插入序列、編碼多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位置、聚腺甞酸化作用序列、插入編碼待表現之多肽的核酸的多交聯劑區，以及可選擇的標記要素。任何前述之侧面核苷酸序列均是適當的。側面序列可以是同種的 '異

O:\110\110257.DOC -62- (S) 1304737 種的、雜種的或合成的。再者，側面序列也可以是天然的序列’其正常地具有調節ABC 1多肽表現的功能》侧面序列的來源可以是任何原核生物或真核生物，任何脊椎動物或無脊椎動物’或任何植物，只要該側面序列在宿主細胞的機構中具有功能並被活化即可。較佳的載體疋可與細菌、昆蟲和喷乳動物宿主細胞相容的那些。先前已經描述了適當的載體，並包括可在細菌中

使用的 PQE70、pQE60、pQE9、pBluescript 載體、 Phagescript 載體、pNH16A、pNH18A、pNH46A、 ptrcMa、pKK223·3、pDR54〇、pRm和 pCEp4，以及在真核生物細胞中使用的pWLNEO、PSV2CAT、p〇(344、 ρΧΤΙ、PSG、PSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和 PGL3。在一個特佳的具體實施例中，重組載體包括含有ABC1 基因之5’側面區的多核甞酸，並更進一步包括至少一個編碼異種多肽的多核料。該異種的多核#酸，以可操作之方式與ABC1 5’侧面序列連接。該ABC1 5，側面序列最好含有ABC1啟動基因。因此，較佳的是包括在序列識別罐中陳述之序列的5,側面序列。同樣好的是，包括序列識別城 ^^^^ 1-1532 > 1080-1643 . 1181.1643 , 1292.1643 ^ 1394-1643的5’側面序列。異種的多核苷酸最好編碼為完整 :::或蛋白質之具有生物活性之片段的多肽。載體亦可 ^質2以上的異種多核#酸。更佳的是，編碼報告者蛋 t =異種多«酸。在這類案例中，重組载體最好不含何額外的啟動基因序列。適當之報告者蛋白質的實例包

O:\110\110257.DOC CS) -63- 1304737 括蟲螢光素酶、万-半乳糖苷酶、氯黴素轉移酶和綠螢光蛋白質。較佳的是，該報告者多肽為蟲螢光素酶。因此，在一個特佳的具體實施例中，重組載體包括在序列識別3 號中陳述的5'側面序列，以及蟲螢光素酶報告者多核甞酸。在另一個同樣好的具體實施例中，重組載體包括序列識別 3 號之核苷酸 1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643或1394-1643和蟲螢光素酶報告者多核甞酸。可從起始載體來建構包括ABC 1 5'側面序列的表現載體，像是可購得的載體，其含有報告者多核苷酸。適當之表現載體的實例包括pGL3-Basic，其含有蟲螢光素酶報告者基因（Promega， Madison, WI)以及 p Gal-Basic (Clontech，Palo Alto, CA)。較佳的載體為 pGL3-Basic 蟲螢光素酶報告者載體’它沒有啟動基因。可使用已熟知的方法，將含有ABC 1啟動基因’例如序列識別3號的5，側面序列’連接到一個上文的表現載體内，包括在本文中描述的方法（參見實例15)。因此，在特佳的具體實施例中，重組載體為pAPRl ,為在pGL3載體中，包括序列識別3號和蟲螢光素_:報告者基因的報告者基因構築體（參見圖丨丨）。本發明亦關於包括任一個上述之重組載體的宿主細胞。在已經建構載體之後，可將完成的載體插入適當的宿主細胞中，進行擴大及/或多肽表現。宿主細胞可以是原核生物的宿主細胞（像是大腸桿菌），或真核生物的宿主細胞（像是酵母菌細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞）。#在適當的條件下培養宿主細胞時，合成ABC1多肽，或另外的報告 O:\110\110257.DOC -64 - 1304737 者多肽’其可能是實質上測量到的。宿主細胞可以是哺乳動物宿主細胞，像是靈長類細胞株或嚅齒類細胞株，包括經過轉化的細胞株。正常的二倍體細胞，在活體外衍生自原發組織之培養物的細胞品系，以及原始的移植物亦是適合的。候選的宿主細胞可以是在選擇基因上具有基因型之缺陷的，或可含有行動優勢的選擇基因。 ♦多適當的宿主細胞為此項技藝中已知的，並有許多可獲自 American Type Culture Collection (ATCC)，Manassas, V A。適當的哺乳動物宿主細胞包括但不限於中國倉鼠印巢細胞（CHO)、CO DHFR-細胞（Urlaub 等人，1980，Proc. Natl. Acad. Sci·，97: 4216-20)、人類胚胎腎臟（HEK) 293 或293T細胞’或3T3細胞、猴子COS-1和COS-7細胞株，以及CV-1細胞株。其他適當的哺乳動物細胞株包括但不限於老鼠神經胚細胞瘤N2A細胞、HeLa細胞、老鼠1-929細胞、衍生自Swiss、Balb-c或NIH老鼠的3T3細胞株、BHK 或HAK倉鼠細胞株、Thp-1、HepG2和老鼠RAW細胞株。這些細胞株均為熟諳蛋白質表現之技藝者已知並可獲得的。較佳的宿主細胞為老鼠單核球細胞株RAW 264·7，在實例8中描述其用途。適當的細菌宿主細胞包括各種品系的大腸桿菌（例如 ΗΒ101、DH50、DH10和MC1061)，在生物技術的範圍内已熟知其為宿主細胞。亦可在本方法中使用各種品系的栝草才干 fel (B. subtilis)、假單孢菌屬（pseud〇monas spp.)、其他的桿囷屬（Bacillus spp.)、鏈黴菌屬（Streptomyces spp.) -65-

O:\110\110257.DOC 1304737 及其類似物。此外’許多品系的酵母菌細胞亦可用來做為表現ABC1多肽的宿主細胞β較佳的酵母菌細胞包括例如酒酵母菌（Saccharomyces cerivisae)和巴斯德畢赤酵母菌 (Pichia pastoris)。此外，昆蟲細胞系統亦可能是適當的宿主細胞。昆蟲細胞系統描述在例如KiUs等人，1993 Biotechniques, 14 ： 810-17 ； Lucklow, 1993, Curr. 〇ρίη

Biotechnol.，4 . 564-72 ;以及 Lucklow 等人，1993 j

Virol·，67 : 4566-79中。較佳的昆蟲細胞為Sf_9* m5 (Invitrogen) ° 本發明亦提供在哺乳動物宿主細胞中表現Abc 1蛋白質的方法’包括下列步驟：（a)以足以產生可檢測之Abc 1蛋白質含量的含量，以包括編碼ABC1之多核苷酸的重組表現載體轉移感染哺乳動物宿主細胞；並（b)純化所產生的 ABC1蛋白質。在一個較佳的具體實施例中，該重組表現載體包括編碼包括序列識別2號之多肽的多核苷酸。在另一個較佳的具體實施例中，該多核甞酸包括序列識別1 號。在另一個較佳的具體實施例中，該多核苷酸包括序列識別1號的核甞酸291-7074。在另一個具體實施例中，該多核嘗酸編碼與包括序列識別2號之多肽具有至少98%同一性的多肽。可藉著此項技藝中已熟知，並描述在標準實驗室手冊中的方法，像是Sambrook，在前，完成將重組的ABC1載體導入哺乳動物宿主細胞中。較佳的是，以在含有帶電荷之脂質的沉澱物或複合物中之方式，將重組載體導入宿主細

O:\110\110257.DOC -66- 1304737 胞中。導入ABC1載體的適當方法’包括磷酸鈣轉移感染、DEAE-葡聚糖調節之轉移感染、陽離子脂質調節的轉移感染、電穿透作用、轉導仙、感染或其他此項技藝中已知的方法這些方法均描述在例如Davis等人，Basic Methods in MoleCular Bi0l0gy (1986)中。如果重組的 abci 載體為病毒的載體’可在活體外使用適當的包裝細胞株將其包裝，然後轉導至宿主細胞内。可使用已熟知的方法’從重纟且的細胞培養物巾回收和純化ABC1多肽，包括硫酸銨或乙醇沉澱法、酸、萃取作用、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素 (Ph〇Sph〇ceiiulose)層析法、忌水性交互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法和卵磷脂層析法（參見例如 Smith和Johnson，Gene 67: 31_4〇 (1988))。較佳的是使用利用抗-ABC1抗體之親和力層析法來進行純化。此外，本發明亦提供在哺乳動物個體中表現abc丨蛋白質的方法，包括以足以在該哺乳動物個體中表現abc丨蛋白質之含量，對該哺乳動物個體投予包括編碼ABC1之多核甞齔的重組表現載體之步驟。較佳的是，該重組表現載體包括編碼包括序列識別2號之多肽的多核苷酸、包括序列識別1號之多核甞酸、包括序列識別i號之核甞酸29卜 7074的多核甞酸，或編碼與包括序列識別2號之多肽，具有至少98%同一性之多肽的多核芸酸。可藉著在此項技藝中已熟知，並在下文中詳述的方法完成將重組的abci 載體導入哺乳動物個體β。可藉著從已經投予重組之 0;\110\110257.D〇C -67 - 1304737 ABCi載體的個體中，獲得血液試樣，分離單核細胞族群’並測量在巨噬細胞中ABC1基因的表現，來測量ABC1 的表現。可使用此項技藝中已熟知的方法，像是RT_ PCR，以及在本文中描述的方法（參見實例9和1〇)，來測量 ABC1基因的表現。可藉著從個體中獲得血液試樣，分離單核細胞族群，並使用已熟知的方法，測量在巨噬細胞中的AB C1蛋白貝，像疋免疫沉殿法，在本文的實例11中描述之，來測量ABC 1蛋白質之含量。增加膽固醇排出的方法和化合物在本發明另一項觀點中，提供適用於在哺乳動物個體中’增加從細胞中排出膽固醇的方法。這類方法包括以足以增加膽固醇從該細胞中排出之含量，對該哺乳動物個體投予包括ABC1多核：y：酸的重組表現載體。該重組載體可以是任何上述的載體’含有任何先前描述的野外型或變體 ABC 1多核甞酸，只要其編碼的abC 1多肽具有生物活性 (也就是膽固醇運送活性）即可。較佳的是，該重組載體包括編碼包括序列識別2號之多肽的多核：y：酸，包括序列識別1號的多核苷酸，包括序列識別1號之核甞酸29 1 -7074的多核甞酸’或編碼包括與序列識別2號之胺基酸序列具有至少98%同一性之胺基酸序列的多肽的多核苷酸。較佳的還有包括與包括序列識別1號之多核：y：酸具有至少80%、 90%或95%同一性之變體多核苷酸的重組載體，只要其編碼的ABC1多肽具有膽固醇運送活性即可。對哺乳動物個體投予重組的ABC 1表現載體，可用來在 O:\110\110257DOC -68- 1304737 該個體中表現AB C1基因，治療心血管疾病。特定而言，藉著將ABC 1基因導入在患有心血管疾病之哺乳動物的動脈病灶中找到的巨噬細胞和其他堆積膽固醇的細胞中，而達到s玄方法的治療效力。在標乾細胞中表現abc 1多肽，將具有產製更多ABC 1蛋白質的效果。後續產製的ABC 1蛋白質’將藉著增加膽固醇從在初期HDL患者之動脈病灶中找到的巨嗟細胞和其他裝載膽固酵的細胞中排出，而緩和該疾病。細胞的排出將導致從周圍部位全面性地移除膽固醇’像是富含膽固醇之動脈斑點的核心β同時降低了這些病理學病灶的大小，減少導致心臟病發作和心絞痛之動脈阻塞的風險。該方法亦可用於預防膽固醇堆積在動脈壁上0 ABC 1表現載體的足夠含量，為增加膽固醇從哺乳動物個體的細胞中排出的ABC1載體含量。可藉著在以各種劑量才又予重組的AB C1表現載體之前（對照值）和之後，測量在該個體之細胞中的膽固醇排出，並與對照值比較，決定有效增加膽固醇排出的劑量，來決定這類含量。可藉著從該個體中獲得血液試樣’分離單核球族群，並測量在該個體的巨嗤細胞中膽固酵排出之含量，來測量膽固醇的排出。可使用任何在本文中描述的測定，來測量膽固醇的排出。此外’可藉著在投予重組的ABC 1表現載體之前（對照組）和之後’定出在個體中的血漿HDL-膽固醇含量，來測量膽固醇的排出。在投予重組的ABC1表現載體之後，觀察到在個體之血清中HDL_膽固醇的增加，表示增加了膽固醇

O:\110\110257.DOC •69- 1304737 的排出。可使用此項技藝中已熟知的方法，決定在的HDL-膽固醇含量。另外，亦可藉著在投予重組的ABC1 表現在載體之前和之後，獲得血液試樣，並測量ABC1 mRNA或AB C1蛋白質在個體之巨嗟細胞中的含量，來測量膽固醇的排出。可進行例行的測定，定出在增加ABC1 mRNA濃度和膽固醇排出之間的關係。同樣的，可進行測定，使ABC1蛋白質之含量與膽固醇排出的含量發生關連。使用這類相關性的數據，在投予重叙的ABC1表現載體之後，在個體的細胞中觀察到ABC1 mRNA4ABci蛋白質的〜加，可用來表示膽固醇排出的增加。可使用在本文中描述的測疋和其他已知的mRNA和蛋白質定量技術，來測量ABC1 mRNAstABC1蛋白質的含量。在下文中更詳細地討論治療之劑量和調配物。熟諳此藝者可利用多種適用於將核酸分子導入標靶細胞中的病毒和非-病毒之方法。例如，適用於基因治療的病毒遞送載體’包括但不限於腺病毒、單純峻療病毒、癌病毒（也就是疫苗病毒）、肝炎病毒、微小病毒、乳頭狀瘤多瘤空泡化病毒、α病毒、冠狀病毒、桿形病毒、乳頭狀瘤病毒、與腺有關之病毒（AAV)、骨趙灰白質炎病毒，和 RNA病毋，像是反轉錄病毒和辛比斯⑻祕⑷病毒。亦可使用非.病毒的遞送系統來遞送ABC3㈣酸，像是裸露的DNA遞达（直接注射）、受體-調節的傳遞（DNA-配體複合物）、电牙透作用、腺病毒·配體_dna複合物、碟酸鈣 (CaP〇4)沉殿法、微粒撞擊（基因槍技術卜微緣調節的

O:\110\110257.DOC •70- 1304737 傳遞和脂染體。可使用一或多個在基因治療範圍中已熟知的技術 (Mulligan，R.，1993’ Science，260 (5110): 926-32)完成細胞的遺傳修改。基因治療的材料和方法，可包括可誘導的啟動基因、組織-專一性促進子-啟動基因、為了位置-專一性之整合而設計的DNA序列、能夠提供勝過親代細胞之選擇利益的DNA序列、確認轉化細胞的標記、負選擇系統和表現控制系統（女全性測量）、細胞-專一性的結合劑（或猫準細胞）、細胞-專一性的内化因子，以及促進從載體中表現的轉錄因子，以及製造載體的方法。實行基因治療技術之方法和材料的實例，描述在美國專利第4,97〇，154號（涉及電穿透的技術）、第5,679,559號（描述用於基因遞送的含有-脂蛋白之系統）、第5,676,954號（涉及微脂粒載劑）、第 5，5 93,875號（描述麟酸約轉移感染的方法），以及第 4,945,050號（描述其中以高速推動具有生物活性的顆粒至細胞’藉此使該顆粒貫穿細胞表面，並併入細胞内部的方法）和PCT公告第WO 96/40958號（涉及核配體）中。已經證實腺病毒載體在將基因運送至真核生物細胞内是特別有用的（Rosenfeld，M.等人，Science. 252 : 431- 4(1991);美國專利第5,631，236號）。人類第—個腺病毒_調節之基因治療的試驗’是將胰囊性纖維變性穿透膜傳導性調節者（CFTR)基因運送至肺臟（cryStai，r.等人，1994, Nat· Genet” 8(1) : 42-51)。在活體内將重組的Ad投予至不同組織的實驗性路徑’包括氣管内滴注（R〇senfeld，M.等 O:\110\110257.DOC -71· 1304737 人 ’ 1992，Cell, 68(1) : 143-55) ’ 注射至肌肉内（Quantin， B.等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(7) : 2581-4)，周圍的靜脈内注射（Herz，J·和 Gerard，R·，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，90(7) : 2812-6)，以及立體定位接種至腦（Le Gal La Salle，G.等人，1993, Science, 259 (5097) : 988-90)。腺病毒載體是熟諳此藝者可廣泛利用的，並適用於本發明中。目前已經提出與腺有關之病毒（AAV)做為基因運送系統’其在基因治療中具有潛在的應用。證實野外型AAV有高度的感染力、廣大的宿主範圍，並在整合至宿主細胞基因組中有專一性（Hermonat, P.和 Muzyczka，N.，1984, Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A.，81(20) : 6466-70)。單純峻修病毒第1型（HSV-1)是較佳的載體系統（Geller，A•等人，ι991，

Trends Neurosci” 14(10) : 428-32 ; Glorioso，J.等人， 1995，Mol. Biotechnol·，4(1): 87-99 ; Glorioso，J.等人， 1995, Anmi. Rev. Microbiol.，49: 675-710)。痘病毒家族的疫苗病毒’亦已經發展出表現載體（Smith，G.和M〇ss， Β·, 1983， Gene, 25(1) ： 21-8 ； Moss, B., 1992, Biotechnology, 20 ： 345-62 ； Moss, B., 1992, Curr. T〇p. Microbiol· Immunol.，158 : 25·38)β 上述的載體均為熟諳此藝者可廣泛利用的’並適用於本發明中。杈佳的是利用反轉錄病毒載體的病毒遞送系統。反轉錄病毒載體能夠感染高百分比的標靶細胞，並整合至細胞的基因組中（Miller, Α.和 Rosman，g.，Bi〇techniques，7(9):

O:\HO\110257.DOC -72- 1304737 980-2，984-6，989_90 (1989);美國專利第 5,672,510號）。反轉錄病毒相對上比其他病毒更早發展出基因運送載體，並第一個成功地使用它來標記基因，以及將腺甞脫氨酶 (ADA)cDNA轉導至人類的淋巴細胞内。較佳的是，反轉錄病毒載體為老鼠或禽類反轉錄病毒的衍生物，或是慢病毒載體。特佳的反轉錄病毒載體是慢病毒載體。其中可插入單一外來基因之反轉錄病毒載體的實例包括但不限於：莫洛尼（Moloney)老鼠白血病病毒（MoMuLV)、哈維 (Harvey)老鼠肉瘤病毒（HaMuSV)、老鼠乳房腫瘤病毒 (MuMTV)、SIV、BIV、HIV和勞氏肉瘤病毒（RSV)。許多額外的反轉錄病毒載體可併入多個基因。這些載體全都可運送或合併可選擇標記的基因，而得以確認和產生轉導的細胞。因為重組的反轉錄病毒是有缺陷的，它們需要協助才能產生有傳染性的載體顆粒。例如，可藉著使用協助者細胞

株來提供該協助，該協助者細胞株含有在LTR内之調節序列的控制之下，編碼該反轉錄病毒之全部結構基因的質體。協助者質體錯失能夠進行包裝機制的核苷酸序列，認出包以被膜的RNA轉錄本。因此，協助者細胞株產生空的病毒粒子’因為並未包裝基因組。適當的協助者細胞株包括但不限於ψ2、ΡΑ317和ΡΑ12β如果將反轉錄病毒載體導入這類細胞内’丨中包裝信號是完整的，但以其他感興趣的基因置換結構基因’便可包裝該载體，並產生載體的病毒粒子。然、後可使用藉著該方法產生的載體之病毒粒子 • 73-

O:\110\I10257.DOC ⑧ 1304737 感染組織細胞株，像是NIH 3T3細胞，產生大量的嵌合型反轉錄病毒的病毒粒子。可使用熟諳此藝者可廣泛利用的標準重組技術來建構本發明之載體。這類技術可在一般的分子生物學參考文獻中找到，像是 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Sambrook 等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology (Methods in

Enzymology，第 185 冊，由 D. Goeddel 編輯，1991， Academic Press，San Diego，CA)和 PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis 等人，1990, Academic Press，San Diego, CA) » 為了在標靶細胞中獲得ABC 1多核苷酸的轉錄作用，必須利用能夠在標靶細胞中驅使基因表現的轉錄調節區。轉錄調節區最好包括啟動基因和/或促進子，其以可操作之方式與ABC1多核:y：酸連接。啟動基因可與^^(^丨為同種的或異種的，其限制條件為它在將插入構築體之細胞或組織·•類型中是有活性的。應該選擇在標靶細胞中驅使高度基因表現的轉錄調節區。較佳的是，使用巨噬細胞-專一性啟動基因，像是清道夫受體八型、基質金屬蛋白酶 (MMP-12)或趨·巨噬細胞之慢病毒啟動基因（Fabunmi等人，Atherosclerosis，148: 375_386 (1999))。特佳的啟動基因為清道夫受體A型基因的5,區，其含有強的巨噬細胞啟動基因’可用來驅使ABC1基因的轉錄。此外，在細胞中增加内源的ABC1多肽表現的方法，是將—或多個促進

O:\110\110257.DOC C8) •74· 1304737 …播入啟動基因區’在那裏促進子要素可為增加獄1基因之轉錄活性效勞。同樣的，以想要在其中活化該基因的Μ織為基礎，€出所制的促進子要素（們）。因此’例如將選擇已知在主動脈組織中找到的細胞，尤其是巨噬細胞中，賦與啟動基因活化作用之促進子要素。其他適用於本發明的轉錄調節區，包括但不限於人類細胞巨大病毒（CMV)速發早期促進子，啟動基因、sv4q早期促進子/ 啟動基因、JC多瘤病毒啟動基因、白蛋白啟動基因、與 CMV促進子偶聯的驗和α_肌動蛋白啟動基因㈣^ r•等人 ’ 1996, Gene Ther.，3(5) : 437-47)。載體構築體的其他成份，可視需要包括為了位置_專一性的整合作用而設計的DNA分子（例如可用於同種重組作用的内源序列）、組織H的啟動基因、能夠提供勝過親代細胞之選擇利益的DNA分子、可用來做為確認轉化細胞之標記的DNA分子、負選擇系統、細胞專一性的結合劑 (例如細胞瞄準）、細胞-專一性的内化因子、促進從載體中表現的轉錄因子，以及能夠產製载體的因子。在一個具體實施例中’載體可包括位置-專一性之整合作用的瞄準DNA。瞄準DNA為與感興趣之基因，例如 ABC1基因之區域互補的（同種的）核苷酸序列。經由同種重組作用’可藉著將其附接於瞄準DNA上，使待插入基因組内的DNA序列指向ABC 1基因。插入的DNA序列包括例如可與ABC1多肽表現產生交互作用或控制它的dn A區域，例如側面序列。因此，完成想要之Abc 1多肽的表現，並 O:\110\110257.DOC •75- 1304737 非經由編碼ABC 1基因本身之DNA的轉移感染，而是藉著使用與DNA調節斷片偶聯的瞄準DNA，其提供内源的基因序列，帶有可供ABC1多肽之轉錄作用辨認的信號（Sauer, Curr. Opin. Biotechnol., 5 ： 521-27 (1994) ； Sauer,

Methods Enzymol·, 225 : 890-900 (1993)) ° 在另外的具體實施例中，可為了在標靶細胞中控制 ABC1基因的表現而包含調節要素。這類調節要素可反映適當的效應物而打開。以此方式，便可在需要時表現治療性的ABC 1多肽《—種傳統的控制方法涉及使用小分子的二聚體或雷帕洛體（rapalogs)，將喪合型的蛋白質二聚合，其含有小分子-結合功能部位和能夠發動生物學過程之功能部位，像是DNA-結合蛋白質或轉錄活化蛋白質（參見 PCT 出版物第 WO 96/41865、WO 97/31898 和 WO 97/31899 號）。可利用蛋白質的二聚作用發動轉殖基因的轉錄。其他適當的控制方法或基因開關包括使用米非司酮 (mifepristone)(RU486)，其為黃體酮拮抗劑。經過修改之黃體酮受體配體-結合功能部位與黃體酮拮抗劑的結合，藉著形成兩個轉錄因子的二聚體’然後通過進入核内與 DNA結合，而活化了轉錄作用。修改配體-結合功能部位，除去受體與天然配體結合的能力。在美國專利第 5,364,791 號和 PCT出版物第 WO 96/4091 1 和 w〇 97/10337號中更進一步地描述經過修改的類固醇荷爾蒙受體系統。其他的控制方法使用正的四環素可控制之轉活化劑 (transactivator)。該系統涉及與活化轉錄作用之多肽連接 O:\110\110257.DOC -76- 1304737 的突變tet阻遏物蛋白質dna-結合功能部位（突變的tet R-4 胺基酸變化’導致四環素_逆向調節的轉活化劑蛋白質，也就是說’其在四環素的存在下與tet操縱基因結合）。這類系統描述在美國專利第5,4|4,758號、5,650,298號和 M54，l68號中。額外的表現控制系統及核酸構築體，描述在美國專利第5,741，679號和5,834，186號中。可藉著改變病毒外殼，使其含有對於在標靶細胞上發現之其他分子具有專一性的配體，而製成有標靶專一性之含有ABC1多核苷酸的病毒遞送載體，這將容許該載體專一地與想要的細胞類型結合。該配體可以是任何感興趣的化合物，其將與在標靶細胞上發現的分子專一地結合，像是細胞·表面受體。較佳的是，該受體僅在標靶細胞上找到，並未在其他細胞上發現，例如，可使用清道夫受體A 的配體，使病毒遞送载體瞄準巨噬細胞β另外，亦可改變病毒的外殼，使其含有抗體或抗體片段，像是Fab或 F(ab·)2，其認得並與在標靶細胞上的抗原性抗原決定位結合。可藉著插入在病毒之基因組内編碼配體的額外多核甞酸，來改變病毒的外殼。熟諳此藝者將知道其他的專一性多核苷酸序列，可將其插入病毒的基因組内，容許含有 ABC1多核甞酸之載體的標靶專一性遞送。此外，亦可投予裸露的ABC1#核甞酸。可以醫藥組合物之形式投予ABC1多核苷酸和重組的八8〇：1表現載體，: 同上述的那些。這類組合物包括有效含量的ABC1多核苷酸或重组的八30表現載體，如同先前在本文中定義的， O:\I10\110257.DOC •77- 1304737 以及就投藥模式的適用性而選出之在藥學上可接受的調配物。適當的調配材料最好是在所使用之濃度下，對接受者無毒性，如同在下文中描述的。含有ABC 1多核茫酸或ABC 1重組表現載體的醫藥組合物’可含有用來修改、維持或保護例如該組合物之pH值、滲透性、黏性、透明度、顏色、等張性、味道、無菌性、穩定性、解離或釋放速率、吸收或滲透性的調配材料。適當的調配材料包括但不限於胺基酸（像是甘胺酸、縠胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸）、抗微生物製劑、抗氧化劑（像是抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉、緩衝溶液 (像是硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、碟酸鹽或其他的有機酸）、填充劑（像是甘露糖醇或甘胺酸）、螯合劑 (像是乙一胺四乙酸（EDTA))、配位劑（像是咖徘驗、聚乙烯吡咯烷酮、沒-環糊精或羥丙基- 環糊精）、填料、單醣類、二醣類和其他的碳水化合物（像是葡萄糖、甘露糖或糊精）、蛋白質（像是血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）、色素、香料和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物（像是聚乙烯吡咯烷酮）、低分子量的多肽、形成鹽的抗衡離子（像是鈉）、防腐劑（像是氣化苯甲烴銨、苯甲酸、水揚酸、乙基汞硫代水楊酸鈉、苯乙醇、對羥苯曱酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、氣己定（chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫）、溶劑 (像是甘油、丙二醇或聚乙二醇）、糖醇類（像是甘露糖醇或山梨糖醇）、懸浮劑、表面活性劑或濕潤劑（像是普魯尼克 (pluronics) ; PEG ;山梨聚糖酯；多乙氧基醚，像是多乙 O:\110\110257.DOC • 78* 1304737 氧基謎20或多乙氧基醚8〇;三通；三甲醇氨基甲貌 (tromethamine);卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊（tyi〇xapal)、 '* 穩定性促進劑（像是蔗糖或山梨糖醇）、張力促進劑（像是鹼 • 金屬函化物-較佳的是氯化鈉或鉀-或甘露糖醇、山梨糖醇）、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或藥學佐劑。參見 Remington's Pharmaceutical Sciences (第 18 版， A.R.Geimaro編輯，Mack Publishing Company 1990)。丨可根據傳統的藥學方法，加工處理在藥學上具有活性的化合物（也就是ABC1多核苷酸或ABC1載體），產生可供投予患者的藥劑，包括人類和其他的哺乳動物。因此，可製造固體形式（包括顆粒、散劑或栓劑）或液體形式（例如溶液、懸浮液或乳劑）之包括ABC1多核甞酸或ABC1重組表現載體的醫藥組合物。可供口服的固體劑量形式包括膠囊、錠劑、藥丸、散劑和顆粒。在這類固體的劑量形式中，可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑混合，像是蔗 _ 糖、乳糖或澱粉《在正式實施時，這類劑量形式亦可包括惰性稀釋劑以外的其他物質’例如像是硬脂酸鎂之類的潤滑劑。在膠囊、錠劑和藥丸的案例中，劑量形式亦可包括緩衝劑《錠劑和藥丸可額外地以腸衣膜製備。口服或非經腸投藥的液體劑量形式，可包括在藥學上可 .接受的乳劑 '溶液、懸浮液、糖漿和西丁劑，含有此項技藝中常用的惰性稀釋劑’像是水。這類組合物亦可包括佐劑，像是濕潤劑、增甜劑、香料和調味劑。例如，可供注射的適當載劑為水、生理鹽水溶液或人造的腦脊髓液:、可

O:\110U10257.DOC -79- 1304737 月匕補充有在非經腸投藥之組合物中常用的其他物質。中性緩衝的生理鹽水或與血清白蛋白混合的生理鹽水，為更具代表性的載劑。其他代表性的醫藥組合物包括具有大約pH 7.〇-8.5的1^8緩衝溶液，或具有大約{)114.〇_5.5的醋酸緩衝办液’其可更進一步包括山梨糖醇或適當的取代物。利用包括ABC1多核:y：酸或ABC1表現載體之組合物來治療心血管疾病的劑量攝生法，以各種因素為基礎，包括心血管疾病的類型、患者的年齡、體重、性別、醫學狀況.，病況的嚴重性'投藥的途徑，以及所使用的特定化合物。因此，可廣泛地改變劑量攝生法，但可使用標準方法例行地決定之。例如，待投予之ABC1多核苷酸或ABC1表現載體的含量’為足以增加膽固醇從哺乳動物個體之細胞中排出的含量。這類含量可藉著例如在投予ABC1多核苷酸或 ABC1表現載體之前和之後，測量個體的血漿hDL_膽固醇含量來決定之。ABC1多核甞酸或ABC1表現載體的足夠含量，為增加個體之血漿HDL-膽固醇含量的含量。因此，臨床醫師可滴定劑量並修改投藥途徑，以便獲得最佳的治療效力。代表性的劑量可從大約〇. 1 ?克/公斤到大約1 〇〇毫克/公斤或更高，依據上文提及的因素而定。投藥的頻率將依據在調配物中所使用之ABC1多核：y：酸或載體的藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師將投予組合物，直到劑量達到想要的效果為止。因此，可在一段時間内以單一劑量’或二或多個劑量（其可以或可以不是含有相同含量的想要分子）’或以連續輸液之方式經由植入 O:\110\110257.DOC • 80- 1304737 裝^套管投予該組合物。由熟諳此藝者例行地進行適當劑置更詳盡的討論，並由他們在該課題的範圍内例行地進盯。可經由使用適當的劑量.反應數據，來_定適當的劑

可在活體内、在活體外或在試管内，轉移感染哺乳動物個體的細胞。可使用任何熟諳此藝者已熟知的各種技術，完成在活體内將ABC1多核菩酸或含有ABCl多核誓酸之重組載體投予標無細胞。例如，美國專利第5,672,344號，描述在活體内的病毒-調節之基因運送系統’其涉及重組的神經營養HSV-1載體。上述的ABC1#核苷酸和重組ABC1 載體的組合物’可在活體内藉著口服、經頰、非經腸、經直腸或局邛投藥，以及藉著吸入喷霧來轉移感染。當在本文中使用"非經腸"一詞時，包括皮下、靜脈内、肌肉内、胸骨内、輸液技術或腹腔内。

關於口服投藥，含有ABC1多核苷酸或重組ABC1載體的醫藥組合物，可以是例如膠囊、錠劑、懸浮液或液體之形式°最好是以含有特定含量之DNA或病毒載體顆粒的劑量單位之形式來製造醫藥組合物。例如，這些可含有從大約 10 -10個病毒顆粒’較佳的是丨〇6_丨〇u個病毒顆粒。人類或其他哺乳動物的適當每曰劑量，可依據患者的病況和其他因素而廣泛地改變，但可再次使用例行的方法來決定之。亦可經直腸投予含有ABC1 DNA或重組ABC1載體的醫藥組合物。可藉著將載劑與適當之無刺激性的賦形劑，像

O:\110\110257.DOC • 81· 1304737 疋可可月日和聚乙二醇混合，來製備經直腸投予載體的適备栓劑，該賦形劑在常溫下為固體，但在直腸溫度下為液、· 體，因此將在直腸中融化，並釋放出載劑。 ·· 亦可為了吸入來調配醫藥組合物。例如，可將ABC1多核甘酸或載體調配成吸入用的乾粉。再者，亦可與氣溶膠遞送之推進劑一起調配腦多核誓酸或載劑吸入溶液。在另一個具體實施例中，可將該溶液霧化。 • 亦可注射含有ABC1 DNA或重組ABC1載體的醫藥組合物。可根據已知的方法’使用適當的分散或濕潤劑和懸：劑二來調配注射用的製品，像是無菌的注射用含水或含油想浮液。無菌的注射用製品，亦可以是在無毒性之非經腸可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射用溶液或懸浮液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。特別適合非經腸注射用之載劑，、為無菌的蒸館水，在其中將ABC1多核答酸或載體調配成無菌的、等張的溶液，並適當地保存。在其他可接受 • 的载劑和'合液中，可使用的有林格氏液和等張的氯化鈉溶液。此外，傳統上亦可使用無菌的固定油做為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的皁-或二甘油。此外，亦發現在注射用的製品中使用諸如油@文之類的脂肪酸。其他的製品可涉及將想要的Μα分 .子與諸如注射用的中心體、生物_可腐蝕的顆粒、聚合的 • 化σ物小珠或微脂粒之類的製劑一起調配，提供ΑΒ ς； j 產物的控制或延遲釋放（參見例如pCT/US93/〇〇829,

EpPStein 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.’ 82 : 3688-3692

O:\110\110257.DOC (s) •82- j3〇4737 (1985))。再者，亦可局部投予含有ABC1 DNA或重組ABC1載體的醫藥組合物。關於局部投藥’可含有以調配物之重量計，從0.001%到10%重量/重量，例如從1%到2%的載體，雖然可包含多達10%重量/重量，但較佳的是不超過5%重量/重量，而更佳的是從調配物的0.丨％到i。適用於局部投藥的調配物，包括適合穿過皮膚的液態或半液態的製品 (例如軟膏、洗液、油膏、乳霜或藥膏），以及適合投予除眼、耳或鼻的滴劑。本發明之載體的活性成份之適當局部劑量’為每天投藥1至4次，較佳的是2或3次。同時可投予本發明之核酸及/或載體，做為單獨的活性藥學製劑，亦可將它們與一或多個本發明之載體或其他製劑混合使用。當混合投予時，可將治療劑調配成個別的組合物，在相同或不同的時間給予，或可以單一組合物之形式給予治療劑。 • 在本發明其他的具體實施例中，藉著在標靶細胞族群附近移植”生產者細胞株"’在活體内轉移感染標靶細胞 (Culver，K.等人 ’ 1994，Hum. Gene Ther·，5(3) : 343-79 ;

Culver，K•等人，c〇ld Spring Harb. Symp.Quant· Biol” 59 ： 685-90 ； Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4(1)： .39 69) °生產者細胞株被設計成產生含有ABC1多核省:酸的 .病毒載體，並在標靶細胞附近釋放其病毒顆粒，也就是最好疋在粥樣硬化病灶中發現的巨噬細胞。一部份釋放出的病毒顆粒接觸到標靶巨噬細胞，並感染這些細胞，因此將

O:\110\110257.DOC •83· 1304737 ABC 1多核：y：酸遞送至標靶巨噬細胞。在感染標靶細胞之後’發生ABC1多核甞酸的表現，提供了帶有有功能之 ABC 1蛋白質的巨噬細胞。在其他的具體實施例中’本發明提供藉著在活體外導入 ABC 1多核甞酸或重組ABC 1表現載體，來治療心血管疾病的方法。在這類案例中，使從患者中移出的細胞、組織或器官與ABC 1組合物接觸，隨後將該細胞、組織或器官移植回該患者。例如’一種方法包括從患有心血管疾病之患者中移出金液試樣’使試樣富含單核球，並使經過分離的單核球與含有ABC1多肽之重組表現載體接觸，並可視需要與標靶專一性基因接觸。可視需要在將細胞導入個體内之則’先利用生長因子，像是GM-CSF處理單核球細胞，刺激細胞生長。當再導入之時，細胞將專一地瞄準最初從其中分離出它們的細胞族群。以此方式，可使用Ab C1多肽的運送活性，在個體中促進膽固醇的排出。其他在活體外投藥的方法涉及藉著含有該病毒之細胞的皮膚移殖，將ABC 1多核：y：酸或重組ABC丨載體導入哺乳動物個體中。較佳的是，使用該方法投予反轉錄病毒。如果使用強的管家基因啟動基因來驅動轉錄，則使用纖維母細胞來源的細胞，來完成在植入物中長期表現外來基因。例如，可使用二氫葉酸還原酶（DHFR)基因啟動基因。可利用含有反轉錄病毒構築體的病毒粒子來感染諸如纖維母細胞之類的細胞，該構築體含有ABC1多肽，連同容許專~ 瞄準，像是清道夫受體A的基因，以及強的啟動基因。可 O:\110\110257.DOC 84 ⑧ 1304737 將被感染的細胞埋入膠原蛋白基質中，可將其移植至接受者個體之真皮的結締組織内。因為反轉錄病毒的增殖並逃出該基質，它將專一地感染標靶細胞族群。以此方式移植，導致在顯露出運送障礙之細胞中，增加膽固醇排出活性的含量。在其他的具體實施例中，重組表現載體包括可使用在試管内之技術投予的ABC1多核：y：酸，像是在美國專利第 5,399,346號中的描述。例如，可藉著使用像是在本文中描述的那些方法，植入已經以遺傳方式設計，可表現ABC1 夕肽的某些細胞，來遞送AB C1多肽。為了在投予ab C1多肽的患者中，使可能的免疫學反應減至最少，像是在投予外來物種之多肽時可能發生的，最好是產製abc1多肽的天然細胞屬於人類來源的，並產生人類的ABC 1多肽。因此’較佳的是，以含有編碼人類ABC 1多肽之基因的表現載體來轉化產製ABC 1多肽的重組細胞《該細胞可以是自體的或異種的。該細胞可視需要為永存不死的。為了降低免疫反應的變化，可將該細胞包膠以避免周圍組織的浸潤。包膠的材料通常是生物可相容的，半-透性的聚合封入物或膜’其容許蛋白質產物（們）的釋放，但避免細胞受到患者免疫系統或其他來自周圍組織之有害因素的破壞。可使用上述的方法，將經過轉移感染的細胞投予患者。包膠活細胞的技術為此項技藝中已知的，並可例行地完成包膠細胞的製備，並將其植入患者。例如Baetge等人 (PCT出版編號 WO 95/05452 和PCT/US94/09299)，描述含 O:\110\U0257.DOC -85- 1304737 有以遺傳之方式設計，可有效地遞送生物活性分子之細胞的膜膠囊。該膠囊為生物可相容的，並可容易地取回。以包括DNA序列的重組〇ΝΑ分子轉移感染膠囊包膠的細胞，該DNA序列編碼具有生物活性之分子，並以可操作之方式連接啟動基因，其在植入哺乳動物宿主時不受在活體内的向下調節。該裝置提供將得自活細胞之分子遞送至接受者内的特定部位。此外，參見美國專利第4,892,538號； 5,〇11，472號和5，1〇6,627號。包膠活細胞的系統描述在卩(：丁出版編號WO 91/10425 (Aebischer等人）。亦參見PCT出版編號 WO 91/10470 (Aebischer 等人）；Winn 等人，1991， Exper. Neurol. 1 13 : 322-29 ; Aebischer等人，1991? Exper. Neurol. Ill : 269-75 ;和 Treseo等人，1992, ASAIO 38 : 17-23 。其他編碼ABC1之多核苷酸的遞送系統為"非_病毒"的遞送系統。已經使用或提出有關基因治療的技術包括dna_ 配體複合物、腺病毒-配體-DNA複合物、DNA的直接注射、CaP〇4沉澱法、基因槍技術、電穿透作用、脂染體和膠體分散法（Mulligan，R，1993，Science，260 (5110) : 926- 32)。這些方法中的任一種，為熟諳此藝者可廣泛利用的’並適用於本發明中。熟諳此藝者可利用其他適當的方法’並明瞭本發明可使用任何可利用之轉移感染的方法來完成之。熟諳此藝者已經使用過數種這類的方法學，但並不是很成功（Mulligan，R.，1993，Science，260 (51 10) 926- 32) ° O:\110\110257.DOC _ 86 _ (¾ 1304737

車乂佳的疋’非-病毒遞送系統為膠體分散系統。膠體分散系統包括巨分子複合物、毫微膠囊、中心體' 小珠和以月曰質為基礎的系統’包括水包油乳劑、膠束、混合的膠束和微脂粒。本發明較佳的膠體㈣是微脂粒，其為人造膜囊泡，用來做為遞送在試管内和在活體内的遞送囊泡。微脂粒為自我集合的膠體顆粒，丨中脂質雙層包括兩親的分子，像是磷脂醯絲胺酸或磷脂醯膽鹼，包住一部份周圍 η質，使得知質雙層圍繞親水性的内部。可建構單或多層的微脂粒，使得内部含有想要的化學物質、藥物，或是像在本發明中，為經過分離的DNA分子。例如，已經顯示大的單層囊泡（LUV)，其大小範圍是從〇·2_4 〇微米，可包封相當大百分比之含有大的巨分子，像是RNA、DNA和完整病毒粒子的含水緩衝溶液。一旦包封在含水的内部中，便可以生物活性之形式，將這些巨分子遞送至哺乳動物細胞中（Fraley，R.和 Papahadjopoulos，D. 1981，Trends Biochem.

Sci·，6 : 77-80)。為了使微脂粒成為有效的基因運送媒劑’應具有下列的特徵.（1)以兩效率包封感興趣的基因，同時不危及其生物活性；（2)與非-標乾細胞相比較，優先並實質地與標把細胞結合；（3)以高效率將囊泡的含水内容物遞送至標乾細胞的細胞質中；以及（4)確實並有效的表現遺傳訊息（Mannino，R.等人 ’ 1988，Biotechniques，6(7): 682-90)= 微脂粒的組合物通常是磷脂類的組合，特別是高-相-轉變-溫度的磷脂類，通常是類固醇的組合，尤其是膽固 O:\110\110257.DOC -87- 1304737 二其他的碟脂類或其他的脂f。微膜粒的物理微脂粒的產製中你田子在而疋。在像曰跋0質的實例包括磷脂酿基化合物，酿甘油、碟脂酿膽驗、磷脂酿絲胺酸、磷脂酿乙料、神_脂質、腦甘脂類和神經節“。特別有用的 :一酿基碟脂醯甘油’其中脂質部份含有u]8個碳原是從叫8個礙料，並是飽和的。做為範㈣碟月曰類包括㈣脂酿膽驗、二棕櫚酿基磷脂醯膽驗和二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。以解剖和機械作用的因素為基礎，將微脂粒的標挺分類。解剖的分類以選擇性的層面為基礎，例如器官-專一性、細胞-專-性和胞器_專一性。機械作用的冑準，可以它是否是被動或主動的為基礎來區分之。被動的晦準利用微脂粒分布在含有竇狀毛細管之器官中細胞的内質網系統 (RES)的自然傾向。換句話說，主動的晦準涉及藉著將微 • 脂粒與特定的配體偶聯，像是多株或單株抗體、糖、糖脂或蛋白f，來改變微脂粒，或藉著改變'组合物或微脂粒的曰大小，以便達到瞄準與局部化之天然存在位置不同的器官和細胞類型。較佳的是，配體為多株或單株抗體，可用來使微脂粒聪準特定的細胞-表面配體。配體亦可以是抗體 .片段，像是^'吐或以此，）2，只要其有效地在標靶細胞上與抗原之抗原決定位結合即可。較佳的是，認得僅在標乾細胞上找到之抗原的抗體或抗體片段。例如，為了使抗體 ABC 1微脂粒直接瞄準巨噬細胞之目的，可使用某此專一 O:\110\110257.DOC -88· 1304737 地在巨喔細胞上表現的抗原’像是清道夫受體A。可使用許多剛驅物，將多株或單株抗體共價附接在微脂粒雙層上。再者’可將脂質基團併入微脂粒的脂質雙層，以便維持猫準配體穩定地與微脂粒雙層結合。此外，可使用各種連接基團來連接脂質鏈與瞄準配體。在本文中提供的研究，顯示核受體的配體能夠有效地增加膽固醇的排出。因此’在另—個具體實施例中，本發明提供適合在哺乳動物的個體中，增加從細胞中排出膽固醇的方法，包括以足以增加膽固醇從該細胞中排出的含量，對該哺乳動物個體投予至少—個核受體之配體的步驟。包括核受體之配體的醫藥組合物，可使用上述有關於調配和技予醫藥組合物的方法，來製備和投予。核受體配體的足夠劑量，為該配體可增加膽固醇排出之含量。可藉著在以各種劑量投予該配體之前或之後，測量膽固醇排出，來決定這類含量，並決定可有效增加膽固醇排出的劑量。可使用前述的測定來測量膽固醇的排出。核受體為配體-活化之轉錄因子’其在脊椎動物發育和成年的生理學上，藉著轉導小的、親脂性荷爾蒙至轉錄反應内的作用，扮演決定性的角色。存有數個核受體家族，包括過氧化物酶體增殖者-活化的受體（PPArs)、肝X受體 (LXR)、視黃醛類（retin〇id)X受體（RXR)，以及類金合歡醇 (farnes〇id)X受體（FXR)。PPAR家族包括三個密切相關的基因產物PPARa、PPAR«r和PPAR冷/占。已經暗示ppAR α為細胞内和外之脂質代謝的關鍵調節劑。當與脂肪酸結

O:\110\110257.DOC •89- ⑧ 1304737 合時，PPAR α刺激過氧化物酶體的增殖，並誘發涉及脂肪酸之/3-氧化作用的數個酵素的合成。PPARa受體亦為纖維酸酯的分子標靶，一種指定用來降低高三酸甘油酯含量的藥物（Isseman等人，Nature，347，645 (1990))。纖維酸鹽的作用就像PPAR配體，調節大量影響脂蛋白和脂肪酸代謝之基因的轉錄。 LXR為氧基脂醇受體，其調節過量膽固醇的分解代謝。已經顯示LXR α以帶有RXR之異種二聚體的形式，與在 CYP7a基因上的DNA反應要素結合，其編碼在將膽固醇轉變為膽酸中負責速率限制之步驟的酵素。研究已經顯示缺乏LXR α的老鼠，當餱食富含高-膽固醇的飲食時，在其肝臟堆積了巨大含量的膽固醇酯，歸因於牠們無法反映飲食中的膽固醇而增加CYP7a基因的轉錄（Peet等人，Cell, 93 : 693 (1998))。進一步研究無LXRa的老鼠，顯示LXR α亦涉及調節數個其他參與膽固醇和脂肪酸體内平衡的基因。與核受體密切相關之生物學角色，LRX /5，其在數種組織中表現，並由與LXR α相同的氧基脂醇活化，仍是不清楚的（Song 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 10809 (1994) ； Seol，Mol. Endocrinol” 9 : 72 (1995))。 FXR，其在演化上與LXR α有關，亦涉及膽固醇的體内平衡。就像LXRa —樣，FXR的功能為帶有RXR受體的異種二聚體（Schwartz 等人，Curr. Opin. Lipidol., 9 : 113 (1998) ; Vlahcevic 等人，Gastroenterology, 113 : 1949 (1997))。由合成的視黃醛類TTNPB和超生理學濃度的全 O:\110\110257.DOC -90- 1304737 部-反式視黃酸活化FXR (Zavacki等人，Proc. Natl· Acad. Sci·’ 94 : 7909 (1997))。目前的研究指出fxr為核膽酸受體。首先，FXR在膽酸經由其循環的組織中豐富地表現，包括肝臟、小腸和腎臟（Seol等人，μ〇1· Endocrinol.，9 : 72 (1995) ; Forman等人 ’ Cell，81 : 687 (1995))。再者，目前已經顯示FXR擔任數種膽鹽之生理學濃度的受體，其中以黎去乳膽酸（CDCA)是最具影響力的（KHewer等人， Science，284 : 757-284 (1999) ; Makishima等人，Science， 284: 1362-1363 (1999))。已知CDCA調節數個參與膽鹽體内平衡之基因的表現，包括編碼CYP7a和腸膽酸-結合蛋白質的那些。如同在實例13中詳細描述的，顯示LXR、RXR和PPAR α核受體的配體，在裝載·膽固醇的老鼠巨噬細胞中，增加了脫輔基A I -誘發的膽固醇排出。例如，投予9順·視黃酸（30毫微克/毫升），在這些細胞中，在脫輔基AI-誘發之膽固醇排出上產生大約3 -倍的增加。同樣地，投予氧基脂醇（5微克/毫升），在脫辅基ΑΙ-誘發的膽固酵排出上，亦產生3-倍的增加。接受非謹貝特（3微克/毫升）的細胞，在膽固醇排出上，產生大約2-倍的增加。這些結果指出可調節核受體’增加脫辅基脂蛋白-調節從巨噬細胞中排出膽固醇的速率。此外，如同在實例13中的描述，9-順-RA以劑量依賴性之方式調節從巨噬細胞中排出膽固醇。其他的核受體活化劑，像是22-羥基膽固醇（LXR配體）和苯纖維酸酯（benzfibrate)，顯示可增加膽固醇的排出（數據未顯示）。 O:\llO\110257.DOC •91-

.I304f&7ii32〇5號專利申請案中文說明書替換頁(97年7月）因此’在藉著投予核受體配體來增加膽固醇排出的方法中’該配體最好是選自包括LXR、RXR、PPAR 〇:、FXR和 ..SXR核丈體配體。在較佳的具體實施例中，其中使用LXR ..配體來增加膽固醇排出，該配體較好是選自包括20(S)羥基膽固醇、22(R)羥基膽固醇、24_羥基膽固醇、25_羥基膽固醇和24(S)，25環氧膽固醇LXR配體。最佳的是，LXR配體為20(S)羥基膽固醇。在較佳的具體實施例中，其中使用KXR來增加膽固醇排出’該配體較好是選自包括9_順視 η齔視汽醇、視黃醛、全部-反式的視黃酸、13_順視黃酸、阿維Α、芬維a胺、阿維“旨、CD 49卜cd μ、、 TTNN TTNPB、TTAB、LGD 1 069。最佳的 rxr配體為 9_ 順視黃酸。在另-個較佳的具體實施例中，可對哺乳動物個 -種以上的核受體配體’以便增加膽固醇的排出。_ 疋’當對個體投予二或多個核受體配體時，該配體為⑶ 和讀配體。更佳的是，核受體配體為2〇⑻經基膽固醇和 9-順視黃酸。在另-個具體實施例中，本發明提供適合在哺乳動物的個體中，增加膽固醇從細胞中排出的方法，包括以足以辦加膽固醇排出的含量，對該哺乳動物個體投予花生酸衍生曰物㈣。_。⑷的步驟。包括花生酸衍生物的醫藥組合物，可使用上述有關於調配和投予醫藥組合物的方法來製備和花生酸衍生物的足夠含量，為可增加膽料排_ 3直。可猎者在以各種劑量投予花生酸街生物之前或之 110257-970704.doc -92- 1304737 後，測量膽固醇排出，來決定這類含量，並決定可有效增加膽固醇排出的劑量。可使用前述的測定和方法來測量膽 -- 固醇的排出。 … 如同在實例14中的描述，顯示花生酸衍生物在裝載膽固醇的老鼠巨噬細胞中，增加了脫輔基AI_誘發的膽固醇排出。例如’投予PG12 (25 nM)，在這些細胞中，在脫輔基 AI-誘發的膽固醇排出上’產生大約2_倍的增加。同樣 .地’投予PGE1 (25 nM)，在脫輔基Α ϊ -誘發的膽固酵排出上，產生大約3-倍的增加。這些結果證實花生酸衍生物可增加脫輔基脂蛋白-調節之膽固醇從巨噬細胞中排出的速率。因此’在較佳的具體實施例中，花生酸衍生物選自包括前列腺素E2、前列環素12和前列腺素J2花生酸衍生物。增加ABC 1表現/活性的方法和化合物宣布ABC1功能可促進膽固醇排出，一種增加膽固醇排出的方法是增加ABC 1的細胞表現。因此，本發明亦藉著 _ 對哺乳動物個體投予治療含量之可增加ABC 1在該細胞中表現的化合物，提供適合在哺乳動物個體中，增加膽固醇從該細胞中排出的方法。化合物的治療含量，為該化合物可增加ABC1表現的含量。這類含量可藉著在以各種劑量投予該化合物之前或之後，測量ABC 1的基因表現來決定 . 之，並定出有效增加ABC1基因表現的劑量。可藉著從個體中獲得血液試樣，分離出單核球族群，並使用此項技藝中已知的’和在本文中描述的方法，像是RT—PCR，定出 ABC1 mRNA的濃度，來測量ABC1基因表現。 O:\110\110257.DOC -93- 1304737 在一個較佳的具體實施例中，該方法包括投予C amp類似物，來增加ABC 1的基因表現。如同在圖8中所示， cAMP在正常的纖維母細胞中增加ABC1 mRNA的表現大約 10-倍。較佳的是’ cAMP類似物係選自包括8-溴cAMP、 N6-苯甲醯基CAMP，和8-硫代甲基cAMP。在另一個較佳的具體實施例中’該方法包括投予增加cAMP合成的化合物’來增加AB C1的基因表現。較佳的是，該化合物為福斯向林。在另一個更佳的具體實施例中，該方法包括投予抑制cAMP瓦解的化合物，來增加ABC 1的基因表現。這類化合物的實例為鱗酸二酯酶抑制劑。較佳的是，磷酸二酯酶抑制劑係選自包括羅利普蘭、茶驗、3_異丁基_丨_甲基黃嘌°令、R020-1724、長春西卩丁、扎普内斯特、潘丁生、米力農、氨力農、匹莫苯、西洛他醯胺、依諾昔酮、佩若西酮和維司力農磷酸二酯酶抑制劑。在另一個較佳的具體實施例中，該方法包括以足以增加 ABC1之基因表現的含量，對哺乳動物個體投予核受體之配體。如同在實例17中的描述’以及在圖12中所示，核受體的配體可向上-調節ABC 1的基因表現。轉移感染的研究使用pAPRl，其含有在ABC 1啟動基因控制之下的蟲螢光素酶報告者基因，顯示在LXR和RXR核受體之配體的存在下，活化了 ABC1啟動基因。特定而言，以pApR1轉移感染的巨噬細胞’在20 OH-膽固醇的存在下，在蟲螢光素酶報告者活性上產生19-倍的增加，在9_順尺八的存在下，在蟲螢光素酶活性上產生16-倍的增加，而與£1〇11對照組相 O:\110\110257.DOC -94- 1304737 比較，在兩種配體的存在下，在蟲螢光素酶活性上產生 280-倍的增加《該結果指出脂醇和視黃醛類兩者，從 -abC1啟動基因中誘發了強的轉錄反應。此外，在這兩類化合物之間，有明顯的協同作用，可藉著在以兩種配體處理之細胞中，發現到戲劇化地增加蟲螢光素酶活性而看出。根據本發明之方法，該配體係選自LXR、、 PPAR、FXR及SXR配體所組成之群組。除了增加ABC 1蛋白質的細胞含量之外，可藉著促進 ABC 1蛋白質之活性來助長逆向的膽固醇運送。因此，在另-個具體實施例中，本發明提供適合在哺乳動物個體中，增加從細胞中排出膽固醇的方法，包括以足以增加膽固醇排出之含量，對該哺乳動物個體投予治療含量之可增加ABC1活性的化合物的步驟。包括這類化合物的醫藥^ 合物，可使用上述關於調配和投予醫藥組合物的方法，來製備和投予之。化合物的治療含量為該化合物可增加膽固，醇排出的含量。it類含量可藉著使用料的方法，在以各 _投予該化合物之前或之後，測量膽固醇的排出來決定之，並定出有效增加膽固醇排出的劑量。欲決定膽固醇排出的增加，是否歸因於ABC1活性的增加，可使用在本文中描述的方法(參見實例u)，定出在投予化合物之前和 .之後，在細胞試樣中出現之ABC1蛋白質的含量。關於兩種測量（也就是在投予化合物之前和之後），將膽固醇排出活性總量除以ABC1蛋白質之濃度，U在ABC1蛋白f之標準濃度中找到的膽固醇活性總量。在對蛋白質濃度標準

〇:UlO\li〇257.DOC -95- 1304737 化的膽固醇活性令觀察到增加，則代表該增加是因為 ABC1活性的增加。確遇治療化合物的方法本2明的其他觀點係關於篩選化合物，決定該化合物是否調即（也就是向上-調節或向下調節）abc j之基因表現的方法。這類化合物可用來發展增加入⑽表現，並藉此促進膽固醇排出，和升高▲中HDL膽固醇含量的治療化合物。因此，提供確認可用來治療心也管疾病之化合物的方法。在一個具體實施例中，本發明提供就八们表現調節 ^性’來篩選受試化合物的方法，包括下列步驟：⑷以可 j作之方式將報告者cDNA與哺乳動物ABCi基因之表現調郎部份連接’產生重組的報告者構築體；刚該重組的報。者構築體轉移感染至宿主細胞的族群内：⑷測定在該轉移感染之宿主細胞的試樣中，報告者基因表現的程使該轉移感染的宿主細胞與待篩選的受試化合物接觸 7受試化合物接觸之後，測定在該轉移感染之宿主細胞的成樣中，報告者基因表現的程度；並⑴比較因為血受試化合物接觸而引起之在報告者基因表現的程度上的相對變匕藉此疋出AB C1的表現調節活性。首先，建構包括以可操作之方式與ABC!基因的表現满 ^部份連接之異種報告者基因的重組報告者構築體。可使用連接和選殖技術，將abci表現調節多核芬酸報°者基因插人載體中，像是在本文中和在標準實驗室手冊中描述的那些，包括Davis等人，…

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Molecular Biology (1986) ; Sambrook 等人，Molecular Cloning ： A Laboratory Manual,第 2 版，（Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989));以及 Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology (Wiley和Sons (1994))。另外，亦可將ABC1表現調節多核甞酸插入可購得的報告者構築體中，像是前述的那些。可使用任何適合插入ABC1多核苷酸和報告者基因的載體。所選出的載體在所使用的特定宿主細胞中應該是具有功能的°較佳的是’該載體是與哺乳動物宿主細胞可相容的。較佳的是’ ABC1基因的表現調節部份是abC 1的5'側面區，含有ABC 1啟動基因活性。在一個較佳的具體實施例中’ ABC 1基因的表現調節部份包括序列識別3號。在另一個較佳的具體實施例中，ABC1基因的表現調節部份包括序列識別3號的核苷酸^532、1〇8〇 1643、11811643、 1292-1643、1394-1643 或 1394-1532。再者，較佳的異種報 p者係選自包括編碼蟲螢光素酶、半乳糖苷酶、氯黴素和綠螢it蛋白質的多核魏。更佳的是，該異種的報告者為編碼蟲螢光素酶蛋白質的多核甞酸。在特佳的具體實細例中’該重組報告者構築體為pApRl，在圖“中出示。接著將重組的報告者構築體轉移感染到宿主細胞的族群可使用任何别述的轉移感染方法，以及在實例8和b 田述的方法，將重組的報告者構築體導人宿主細胞内。 :如，可使用磷酸鈣轉移感染、DEAE-葡聚糖調節的轉移感染、陽離子性脂質調節的轉移感染、電穿透作用、轉導

0:⑴ 0\110257.DOC d .97, 1304737 作用、感染或任何其他已知並描述過的方法，來轉移感染報告者構築體（參見例如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology (1986))。宿主細胞可以是任何在適當的條件下培養時’可合成報告者多肽的細胞，隨後可測量之。較佳的是’該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。更佳的是’該哺乳動物宿主細胞為巨噬細胞、纖維母細胞、肝細胞或腸細胞。最好是該宿主細胞係選自包括RAW 264.7細胞、Thp-Ι細胞和HepG2細胞。報告者構築體的濃度和轉移感染的期間，可依據所使用之轉移感染的方法和宿主細胞的類型和濃度而加以改變。熟諳一般技藝者將可圓滿地決定報告者構築體的適當濃度和轉移感染的時間。在轉移感染之後，測定尚未接觸受試化合物的經過轉移感木之伤主細胞’決定報告者基因的表現程度。在未接觸的轉移感染之宿主細胞的試樣中發現的報告者基因之表現程度，可供做為對照的測量值。使用任何此項技藝中已熟 =方法，將經過轉移感染的宿主細胞溶解，並測定報告者基因的表現程度。用來止、量報σ者基因之表現程度的測疋’依據在轉移感举中回㈣〜使用的報告者構築體而有所不同幻如，右使用蟲螢光素計來測量以Ρ Η叛口者構築體，則使用發光早位計之細胞之溶胞性，如同在實例心“ ㈣廑物中的蟲螢光素酶活只列1 5中的描述0 使轉移感染之宿主細胞的物接觸，並接著測 °樣與待師選的受試化合的程度。較佳的3些㈣中發現之報告者基因表現的疋，經過轉移感染的宿主細胞與受試化合

O:\110\110257.DOC •98· 1304737 物接觸大約4-48小時。更佳的是，經過轉移感染的宿主細胞與受試化合物接觸大約8_36小時。再更佳的是，經過轉、移感染的宿主細胞與受試化合物接觸大㈣小時。應該使、用與在未接觸（對照级）細胞中測量報告者基因表現程度相 $的測定法’來測量在與受試化合物接觸之細胞中，報告者基因表現的程度》最後’將在未接觸之對照組細胞中發現的報告者基因表 _ 5見程度與在接觸受試化合物之細胞t發現的報告者基因表現程度做比較，決定該受試化合物是否具有abci表現調節活性。如果在兩種細胞試樣中的基因表現程度是相同的或大”勺相同的’則3亥党試化合物不能調節abc】基因表現。在接觸受試化合物的細胞中，相對於在對照組細胞中找到之報告者基因表現程度，有較高程度的報告者基因表現，代表該受試化合物向上_調節ABC1的基因表現。在接觸受試化合物的細胞中，相對於在對照組細胞中找到之報 • 告者基因表現程度，有較低程度的報告者基因表現，代表該受試化合物向下-調節ABC1的基因表現。本發明的其他觀點係關於篩選受試化合物，決定該化合物是否促進ABC1-調節之膽固醇排出的方法。這類方法包括.（a)在維持培養的哺乳動物細胞之試樣中，測定膽固醇 .排出的含量，決定膽固醇排出的對照值；（b)使該哺乳動物細胞與待篩選的受試化合物接觸；⑷在與受試化合物接觸之後，測定在該細胞之試樣中膽固醇排出的含量；並（d)在與焚試化合物接觸之後，測定在該細胞之試樣中ABc卜依

O:\110\110257.DOC -99- 1304737 否促賴性的膽固醇排出之含量，藉此決定該受試化合物是^ 進ABC 1-調節之從培養的細胞中排出膽固醇。可使用此項技藝中已知並在本文中描述的方法（參見實例1)，來決定在培養細胞之試樣中膽固醇的排出含量。$ 使用任何可維持在培養中的哺乳動物細胞，來測量膽固醇的排出。該細胞可衍生自原始培養物，或衍生自永广八仔不死的細胞株。為了方便起見’可藉著以含有插入人類乳頭狀瘤病毒16、致癌基因E6*E7，以及選擇標記基因之載體的兩向反轉錄病毒轉移感染它們，如同在實例1中的描述，使細胞永存不死《較佳的是，培養的細胞為纖維母細胞、巨噬細胞、肝細胞或腸細胞。更佳的是，培養的細胞為 RAW 264.7細胞。測量尚未與受試化合物接觸之細胞的試樣中，膽固醇排出之含量，獲得膽固醇排出的對照值。此外，測量在已經與受試化合物接觸之哺乳動物細胞的試樣中，膽固醇排出之含量，定出由受試化合物影響的膽固醇排出之含量。再者，測量已經與受試化合物接觸之哺乳動物細胞之試樣中，ABC1-調節之膽固醇排出之含量，定出由受試化合物影響的ABC1.調節之膽固醇排出的含量。較佳的是，在測定膽固醇排出或康1_調節之膽固醇排出之前，使該細胞與文试化合物接觸大約8-24小時。可使用抗_ABC1抗體，其在、纟°合時抑制ABC1的活性，來測定ΛΒ(：1-調節的膽固醇排出之含量。另外，亦可使用抑制ABC1表現的反義 ABC1多核苷酸，來測定ABd — 調節的膽固醇排出之含

O:\110\110257.DOC -100- (S) 1304737 量。例如’可使用包括序列識別57號之反義ABC1多核甞酸，來測定ABC1 -調節的膽固醇排出之含量（參見實例7) ^ -. 細胞應該與抗-AB C1抗體或反義AB C1多核答酸接觸與它 • 和受試化合物接觸相同的時間。如果對照組膽固醇排出之含量，與在與受試化合物接觸之細胞中發現的膽固醇排出之含量相同或大約相同，則該化合物不能促進膽固醇排出。在與受試化合物接觸之細胞 • 中發現的膽固醇排出之含量，增加超過膽固醇排出的對照值，則表示由該受試化合物促進了膽固醇排出的含量。在僅與受試化合物接觸之細胞中發現的膽固醇排出，和在與受試化合物和抗-ABC1抗體或反義ABC1多核苷酸接觸之細胞中發現的膽固醇排出之間的差異，表示該膽固醇排出之含夏係經由ABC 1調節。例如，若膽固醇排出的對照值為而在與受s式化合物接觸之細胞中發現的膽固醇排出值為1.1，則該受試化合物促進了 1〇%的膽固醇排出。如 • 果在與受試化合物和抗-ABC1抗體或反義ABC1多核苷酸接觸之細胞中發現的膽固醇排出為1.0，則由受試化合物引起之膽固醇排出的增加全部都是ABC1_調節的。檢測對冠狀心臟病之易感性的方法本發明亦關於在包括人類個體的哺乳動物個體中，檢測 .ABC1基因或蛋白質表現之比較含量的方法。宣布在 .膽固醇排出中的角色，可使用相對於預定之ABC1基因或蛋白質表現的標準值，定出在哺乳動物個體中降低abci 土因或蛋白質表現的程度，來表示在該個體中對冠狀心臟

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Cs) -101 - 1304737 病的易感性。因此，本發明提供在哺乳動物個體中檢測 ABC 1基因表現之比較含量的方法，包括下列步驟··（a)從該哺乳動物個體中獲得受試細胞試樣；（b)測定在該受試細胞試樣中，ABC1 mRNA表現的程度；並（c)將在受試細胞試樣中ABC1 mRNA表現的程度與預定之ABC1 mRNA表現的標準值做比較，藉此在該哺乳動物個體中檢測ABC 1基因表現的比較含量。首先從哺乳動物個體獲得受試的細胞試樣，包括人類個體。受試的細胞試樣可以是血液試樣，其中富含單核球族群。可基於例如細胞大小、細胞密度或細胞親和力，使用已熟知的細胞分離程序，使其富含單核球。接著，測定在受試細胞試樣中的ABC 1 mRNA表現程度。可使用任何已熟知有關於mRNA製備和檢測的方法，包括在本文中，在實例2和9中描述的方法，來測定ABC1 mRNA的表現程度。例如’可藉著反轉錄聚合酶連鎖反應、北方墨點分析或RNA酶保護測定，來決定ABC1 mRNA的濃度。應將 ABC 1 mRNA濃度對在受試細胞試樣中發現之總mRNA濃度標準化。最後，將在受試細胞試樣中的ABC 1表現與預定之ABC1 mRNA表現的標準值做比較。可藉著定出在取自哺乳動物個體之個別族群的細胞試樣中發現之ABC1 mRNA的平均濃度和分布，獲得預定之ABC 1 mRNA表現的標準值’其中該哺乳動物物個體是與從其中獲得受試細胞試樣之個體相同的物種，且其中該哺乳動物個體未罹患冠狀心臟病、湯吉爾症或其他與低HDL -膽固醇有關之疾 O:\110\110257.DOC -102- 1304737 病，並認為其具有在正常範圍内的膽固醇排出活性（也就是由HDL-膽固醇含量指出其在正常範圍内）。可使用相對於預定之ABC! mRNA的標準值，定出在哺乳動物個體的受試細胞試樣中降低之ABC1 mRNA表現程度，來表示該哺乳動物個體對冠狀心臟病的易感性。同樣地，可使用降低ABC1蛋白質含量的檢測，來表示降低膽固醇排出之能力，以及對冠狀心臟病的易感性。因此，本發明的其他具體實施例提供在哺乳動物個體中檢測 ABC1蛋白質之比較含量的方法。這類方法包括下列步驟：（a)從該哺乳動物個體中獲得受試細胞試樣；（b)測定在該受試細胞試樣中ABC1蛋白質之含量；並（(?）將在受試細胞試樣中的ABC1蛋白質之含量與預定之ABC1蛋白質的才示準值做比較，藉此檢測在該哺乳動物個體中之ABC 1蛋白質的比較含量。可使用任何已熟知的測量ABC1蛋白質之方法，來測定 ABC 1蛋白質之含量。較佳的是，使用免疫測定法測量 ABC1蛋白質的含量。在一個具體實施例中，藉著（a)使該細胞試樣與抗- ABC 1抗體的族群接觸，並（b)檢測與該細胞試樣結合之抗- ABC 1抗體，定出ABC 1蛋白質之含量。例如’可使ABC1蛋白質與如同在實例11中的描述，對抗位在C'終端處’符合KNQTVVDAVLTSFLQDEKVKES之合成肽而升高的抗血清接觸。可使用此項技藝中已知的數種方法’來檢測抗- ABC 1抗體，包括例如西方，墨點法、免疫沉澱法和FACS ’其中可使用放射性' 色原或螢光的標示來 ΟΛ110U10257.DOC -103- 1304737 元成檢測。一種在細胞試樣中測量AB Cl蛋白質之含量的較佳方法，是免疫沉澱法，其中使生物素基化的ABC 1蛋白質與抗-ABC1抗體接觸’並使用鏈黴菌抗生物素蛋白辣根過氧化酶來檢測已結合之抗-ABC1抗體》將在受試細胞試樣中的ABC1蛋白質含量與預定之aBC1 蛋白質的標準值做比較。可藉著定出在取自哺乳動物個體之族群的細胞試樣中發現之ABC 1蛋白質的平均濃度，獲得預定之ABC1蛋白質的標準值，其中該哺乳動物物個體是與從其中獲得受試細胞試樣之個體相同的物種，且其中該哺乳動物個體未罹患冠狀心臟病、湯吉爾症或其他與低 HDL-膽固醇有關之疾病’並認為其具有在正常範圍内的膽固醇排出活性（也就是由HDL-膽固醇含量指出其在正常範圍内）。 ABC1抗體當在本文中使用"抗體"(Ab)或"單株抗體"(Mab)—詞時，意指包括完整的分子和抗體片段（像是例如Fab和F(ab')2片段）’其能夠專一地與蛋白質結合。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗體的Fc片段，從循環中更迅速地清除，並可能具有比完整抗體更少的非專一性組織結合（Wahl等人，J. Nuel. Med·，24 ·· 316-3 25(1983))。因此，這些片段是較佳的，以及FAB或其他免疫球蛋白表現庫的產物。此外，本發明之抗體還包括嵌合型、單鏈和人類化的抗體。額外的具體實施例包括嵌合型抗體，例如老鼠單株抗體的人類化版本。這類人類化的抗體可藉著已知的技術來製 O:\110\110257.DOC -104· 1304737 備，並在將該抗體投予人類時，提供降低免疫原性的優點。在一個具體實施例中，人類化的單株抗體包括老鼠抗 • 體的可變區（或正好是其抗原決定位）和衍生自人類抗體的 . 恆定區。另外，人類化的抗體片段可包括老鼠單株抗體的抗原決定位和衍生自人類抗體的可變區片段（缺乏抗原決定位）。產生嵌合型和更進一步設計單株抗體的程序，包括在 Riechmann 等人（Nature 332 : 323，1988)、Liu 等人 (PNAS 84 : 3439，1987)、Larrick等人（Bio/Technology 7 : 934，1989)和 Winter和 Harris (TIPS 14: 139，May，1993)中描述的那些。一種產製抗體的方法包括以從包括序列識別丨號之多核苷酸、包括序列識別1號之核苷酸291-7074之多核苷酸，或包括與包括序列識別1號之多核甞酸具有至少90%同一性之核苷酸的多核甞酸轉譯的多肽，來免疫非-人類的動物’像是基因轉殖的老鼠，藉此在該動物中產生直接對抗從所述多核铝酸轉譯之多肽的抗體。已經發展出在非-人類動物中產製人類抗體的程序。該抗體可以一部份為人類的，或較佳的是完全是人類的。可使用已經將編碼一或多個人類免疫球蛋白鏈之遺傳物質導入其中的非-人類動物 (像是基因轉殖之老鼠）。可在遺傳學上，以各種方式改變 . 這類基因轉殖之老鼠。遺傳的操縱可能導致當免疫時，在由該動物產製的至少一些（最好是實際上全部的）抗體中，由人類的免疫球蛋白多肽鏈置換内源的免疫球蛋白鏈。在本文中提供了由利用從任何上述之多核苷酸轉譯之多肽免 O:\110\110257.DOC -105 - 1304737 疫的基因轉殖之動物所產生的抗體。已經製備其中藉著各種方法使一或多個内源的免疫球蛋 • 白基因失活的老鼠。已將人類的免疫球蛋白基因導入該老 -- 鼠中’來置換已經失活的老鼠基因。在合併人類免疫球蛋白多肽鏈之動物中產生的抗體，係由導入該動物内的人類遺傳物質所編碼。產製和使用這類基因轉殖動物之技術的 λ例，描述在美國專利第5,814,318號、5,569,825號和鲁 5,545,806號’將其合併於此以作為參考。可藉著傳統的程序產生單株抗體，例如藉著在完成免疫程序之後，使獲自基因轉殖之動物的脾臟細胞永存不死。可藉著傳統的程序將該脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，產生雜種瘤。產製雜種瘤細胞株的方法包括利用包括從一個上述多核甞酸轉譯之多肽的至少七個相鄰之胺基酸殘基的免疫原來免疫這類基因轉殖的動物；從已經免疫的動物中獲得脾臟 Φ 細胞；將所獲得的脾臟細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生雜種瘤細胞；並確認產生與從一個上述多核芬酸轉譯之多肽結合的單株抗體的雜種瘤細胞株。這類雜種瘤細胞株，以及從其中產生的單株抗體，均包含在本發明内。藉者傳統的技術來純化由該雜種瘤細胞株分泌的單株抗體。 . »亥抗體田與ΑΒ C1多肽專一地結合時，可抑制ΑΒ匸j多 .肽的活性。較佳的是，該抗體在結合時，抑制了 ABC1多肤的膽固醇運送活性。可在試管内的測定中使用這類失活的抗體’像是在本文中描述的任何膽固醇排出測定’決定

O:\110\110257.DOC • 106 - 1304737 交試化合物是否促進ABC 1-調節之膽固醇排出。亦可在試 s内的測疋中使用失活的抗體，來檢測在哺乳動物個體之細胞中，ABC 1蛋白質的比較含量。該失活抗體在適用於篩選化合物的套組中亦是有用的，決定該化合物是否調節 ABC1-依賴性的膽固醇排出。確sS治療化合物的套組本發明亦包括適用於篩選化合物，決定該化合物之 ABC1表現調節活性的套組。該套組包括，以足以進行至少一種測定之含量’做成個別包裝之試劑的包括以可操作之方式與哺乳動物ABC 1基因之表現調節部份連接的報告者cDNA的重組報告者構築體。通常亦包括包裝好之試劑 (們）的使用說明書。該哺乳動物ABC 1基因的表現調節部份包括5’側面序列。在一個較佳的具體實施例中，該哺乳動物ABC 1基因的表現調節部份包括序列識別3號。在另一個較佳的具體實施例中，該哺乳動物ABC1基因的表現調節部份包括序列識別3號的核苷酸^532、1080_1643、U81_ 1643 、 1292-1643 、 1394-1643 或 1394-1532 。該報告者 cDNA可以是任何適當的報告者基因，包括在特佳的具體貫施例中，該重組報告者構築體為pAPR1。在另一個具體貝施例中，該套組更包括檢測該報告者蛋白質的方法。因此，該套組包括用來檢測報告者蛋白質的試劑，像是緩衝溶液和受酶質。當在本文中使用"包裝"一詞時，意指能夠將本發明之重組載體保持在固定限制之内的固體基質或物質，像是玻 O:\I10\110257.DOC -107- 1304737 聚丙婦或聚碳酸酯）、紙該包裝可以是玻璃小瓶锡箔及用來容璃、塑膠（例如聚乙烯、其類似物。因此，例如，納以毫克計量的預期載體使用故明書”通常包括描述法之參數的有形表現，η/ '一種測定方置，试劑/試樣混合物的唯拉f 3 類似物〇㈣維持期間、溫度、緩衝條件及其 /匕外^發明亦包括適用於筛選化合物，決㈣化合物疋否調即ABC1-依賴性之膽固醇排出的套組。在一個且體實施例中，該套組包括以足以進行至少一種測定之含量，做成個別包裝之試劑的失活lABC1抗體。通f亦包括包裝好之試劑（們）的使用說明書。在另一個具體實施例中，該套組包括以足以進行至少一種測疋之含里的反義ABC 1寡核：y：酸，以及使用說明書。較佳的疋，該反義ABC 1寡核:y：酸包括序列識別53號。我們已經發展出一種方法，其使用衍生自患有遺傳異常之個體的細胞的RNA試樣，並將其與得自正常個體的RNA 做比較。從歷史上的觀點，從多年的生化分析而得以確認引起遺傳性疾病的原因’或最近從多年的基因作圖和位置選殖，在已經顯示與繼承研究中之缺陷密切相關的數以百萬計之鹼基對間隔内，確認可疑的基因（連鎖分析）。使用多基因表現分析，大多數顯著地經由"基因切片"，可大幅改革這類發現的步調。將衍生自得自罹患遺傳疾病之異常個體的細胞之RNA試樣的表現，與得自正常個體的RNA做

O:\110\110257.DOC 1304737 比較’可快速地顯示出其相對應之mRNA，在患有異常疾病的細胞中錯失、嚴重地表現不足或嚴重地過度表現的基因。當在本文中使用”個體的"一詞時，意指任何具有rna 的活生物，像是例如哺乳動物、植物。最好是使用該方法來痛§忍人類遺傳異常的來源。更佳的是，該方法可用來檢測人類心臟和新血管障礙的遺傳來源，像是確認出ABC1 是在湯吉爾症中的遺傳缺陷。當在本文中使用"異常"一詞時，意指在該物種的少數個體中，與該物種大部份的個體相比較，引起其生理學上之偏差的遺傳差異。異常可以是正的異常或負的異常。例如，正的植物異常，將是與物種中其他個體相比較時，引起一些個別植物可抵抗乾旱的遺傳差異。負的異常則是在相同的植物物種中，引起個體比正常植物更易受到乾旱傷害的異常。可藉著參考我們對於湯吉爾症之遺傳原因的調查，最佳地描述該方法。我們藉著使用得自從患有湯吉爾症之個體中培養細胞的RNA，探索含有接近6〇，_個正常人類基因的微陣列開始我們的調查’我們能純用探針，結果在該單基因的疾病中，確認出ABC1為有缺陷的基因，在該疾病中，患者具有接近〇的循環之高密度脂蛋白（hdl)含量和增加的心臟病之風險。在這類實驗t，導致可檢測之邮财信號為〇含量的有缺陷基因並非必要的。在這個成功的實例巾’在㈣列上進行的58，_次探财，大約有 ⑺次在湯吉爾症之職對正常的’有_2·5倍的表現不

O-U10\li0257.DOC •109· 1304737 足。可採取數個額外的步驟，證實該被告基因的身份。包括利用患有湯吉爾症之無關個體來重覆進行這類微陣列探測，定出每個基因的染色體舆圖位置，與已經報告之與該疾病有關連的大基因間隔做比較，考量候選蛋二^ ^ ^ 貝久具同

系物的可能功能，生化測試，並定出在患者中之最佳候選基因的序列，以便發現突變。以這些方式，基因表現微陣列刀析可引導確認遺傳性基因的缺陷，像是在湯吉_ + 確認ABC1是有缺陷的。在該方法中的其他用途，為在疾病試樣對正常者中表現不足或過度表現的其他基因，應該包括由於在患者中遺傳缺陷的結果’導致有差別地調節的那些，做為補償反應或疾病病理學的促成者。這可提供在相關的生物學路捏中確認其他的蛋白f，其可負起藥物發展的責任並幫助閣明疾病的病理學，並涉及治療和診斷。在其中由於基因刪除或其他突變而引起mRNA之完全缺乏的案例中，像是在地中海貧血（血球蛋白基因缺陷）和其他遺傳疾病的許多實例中所觀察到的’疾病對正常試樣的基因表現分析，可導致以更簡單的方式確認錯失的基因。雖然在這些實例中，利用RNA試樣探測的基因表現陣列，屬於其中探針試樣為排列在載玻片上之^舰8的類型，但亦足敷另-輯列技術之用。這些將包括但不限於將眶試樣排列在_上，或使用藉著照相平板法 (photolithography)在"基因切片”上合，工13成之养核甞酸探針的那些。 O:\HO\110257.DOC -110- 1304737 一般而言’微陣列一詞意指在受酶質上合成之不同寡核答酸的ρ車列’像是紙、尼龍或其他類型的膜、濾器、切片、玻璃片或任何其他適當的固體支撐物。可使用此項技藝中已知的方法來製備、使用和分析微陣列（參見例如 Brennan，Τ，Μ.等人（1995)美國專利第 5,474,796 號；pcT 申請案第 WO 95/251 1 16 號；Shalon，D.等人（1995) PCT 申請案第WO 95/35505號；以及美國專利第5,605,662號，將每個專利說明書合併於此以作為參考。可使用化學偶聯過程和喷墨裝置在陣列的表面上合成陣列要素。亦可使用陣列類似物來打點或刻上墨點，使用熱、UV、化學或機謝的結合程序，排列並連接要素至受酶質的表面。可藉著手工或使用便利的方法和機器產生代表性的陣列，並含有適當數量的要素。在雜交之後，移除未雜交的探針，並使用掃描器決定螢光的含量和圖式。可經由掃描影像的分析來評估與在微陣列上之要素雜交的每個探針互補性的程度和相對豐富性。全長的cDNAs、表現序列標籤（ESTs)或其片段，可包括微陣列的要素。可使用此項技藝中已知的軟體，像是 LASERGENE軟體（DNASTAR)選出適用於雜交的片段。將相當於異常個體和正常個體之核苷酸序列的全長、 ESTs或其片段，排列在適當的受酶質上，例如玻璃片。使用例如UV交聯，接著以熱和化學處理，然後再脫水，將 cDNA固定在玻片上（參見例如Schena，M.等人（1995)

Science 270 : 467-470 ; Shalon，D.等人（1996) Gen〇me Res. O:\110\110257.DOC -Ill - 1304737 6 . 639-645)。製備並使用諸如螢光探針之類的探針，與在受酶質上的要素雜交。

為了使用微陣列來經營試樣分析，將得自生物試樣的 RNA或DNA製成雜交探針。分離mRNA，並產製CDNA，用來做為製造反義RNA(aRNA)的模板。在螢光核苷酸的存在下擴大aRNA，並將已經標示的探針與微陣列一起培養，使得該探針序列與微陣列之互補的寡核甞酸雜交。調整培養條件，而得以與精確互補的相配物發生雜交作用，或具有各種程度的較低互補性《在移除未雜交的探針之後，使用掃描II决疋螢光的含量和圖式。檢查掃描的影像，決定在微陣列上每個寡核苷酸序列互補性的程度和相對豐富性。生物試樣可獲自任何體液（像是血液、尿、唾液、痰、月液等等）、培養細胞、生檢或其他組織製品。可使 =檢測系I充，同時測量所有的不同序列雜交的無、有和含量可使用及=貝料對試樣中的序列、突變、變體或多形性，進行大規模的相關性研究❶ 、單股的核酸序列，通常是義募核甞酸或cDNAs片段。微陣列最好包括大量獨特的固定在固體支撐物上的合成反微陣列可含有涵蓋已 ^大之5或3,序列的寡核苷酸，或含有涵蓋全長序列的連續寡核办似甘自文，或選自沿著序列長度之特定區域的獨特募核苷酴。—± . 在破陣列中使用的多核铝酸，可以是對感興趣之基因或美土因們有專一性的募核苷酸，其中在該序列中至少有一個片月段疋已知的，或是對一或多個未破認之cDNAs有專—帕&〜的养核苷酸，其通常是特定的細胞

O:\110\110257.DOC -112- 1304737 類型、發育或疾病狀態。

為了對微陣列的已知序列產製寡核誓酸，使用電腦演算法，查感興趣的基因’其始於該料酸序列的5，，或更佳的疋在3,末端。演算法確認出該基因獨特的限定長度之低 =物，具有在適合雜交之範圍内的〇(：内含量，並缺乏可能干擾雜交的預測之二級結構。使用光_指揮之化學過程，在受酶質上^計好的區域中合成該低聚物。該受酶質可以是紙、尼龍或其他類型的膜、濾器、切片、玻片或任何其他適當的固體支撑物。可藉著手卫或有用的裝置（刻上墨點或打上墨點的裝置）、材料和機器（包括機器人的器械）來產製陣列’並含有8點、24點、％點、训點、1536 ·』或6144點的格子’或任何其他適用於有效使用可麟得之儀器的複數部件。因，便可使用該基旦縮小或確認遺傳性異常的遺傳原因之可a或精確的缺陷部份做為微陣列的標ι。可使用微陣列來監視大量基因的表現程度，發展並監視有治療潛力和治療用製劑的活性。但不應解釋為以任何以下列之實例進一步解釋本發明方式來限制本發明。

K 1夕1J 本實例證實患有湯吉爾症（TD)之患者缺乏脫辅基A小調節的脂質排出。却胞培養_ :從得自兩個正當個轉止吊個體（NL1)和三個無關之湯吉爾症患者（TD)的皮膚移植物中寐p u d 值初甲獲侍人類的纖維母細胞。

O:\110\110257.DOC r§) -113 - 1304737 TD1細胞獲自53歲的女性，具有極低之血漿HDL膽固醇和脫辅基A-Ι含量，且其臨床症狀為湯吉爾症所特有的。 TD2細胞獲自56歲的男性，其具有湯吉爾症的臨床、形態子和生化特徵，包括極低含量的血漿^〇乙膽固醇和脫輔基 A-I (Francis等人，J. ciin· Invest.，96，78-87 (1995))。 TD3細胞獲自18歲患有湯吉爾症的男性，其呈現橘黃色的扁桃腺遺跡、不對稱的運動神經病變、血漿HDL膽固醇為 5毫克/分升’且LDL膽固醇為16毫克/分升（Lawn等人，j. Clin. Invest.，104, R25-R31 (1999))。按照在〇ram等人，j. Lipid Res” 40 : 1769-1781 (1999)中的描述，使正常細胞和TD患者的細胞永存不死。簡言之，以含有插入人類乳頭狀瘤病毒16致癌基因E6和E7，以及新黴素抗藥性可選擇標s己之載體的兩向反轉錄病毒轉移感染該細胞。僅以載體感染對照組細胞（模倣感染）。在G418的存在下傳代兩次，選擇集合的細胞族群’隨後從培養基中排除G4丨8。使用在第5和第16次傳代之間（原始的）或是在第6和第14次傳代之間（永存不死）的纖維母細胞。將永存不死的正常和TD細胞播種在16-毫米孔或35-毫米盤中，並在實驗使用之前，使其生長在杜貝可氏（Dulbecco's)經過修改之鷹式培養基 (DMEM)加10%胎牛血清（fbS)中至匯合。亦將RAW 264.7 老鼠單核球細胞（American Type Culture Collection， Rockville, MD)維持在含有 i〇% FBS 的 DMEM 中。週重脂質排出的測定:根據在Francis等人，J. Clin.

Invest·，96 : 78-87 (1995)中描述的方法，測定脫輔基a I - O:\HO\110257.DOC -114· 1304737 調節的膽固醇和磷脂之排出。藉著使得自正常和TD患者之經過培養的皮膚纖維母細胞，在〇·2-〇_5微居里/毫升 [3H]-膽固醇（40-60 居里 / 毫莫耳，Amersham Corp., Arlington Heights，IL)的存在下生長至匯合來標示之。當細胞至60-80%匯合時，將放射性的膽固醇加至含有血清的生長培養基中。在3天之後，以PBS/BSA沖洗細胞兩次’ 同時阻礙生長，並裝載膽固醇，使脫輔基脂蛋白-調節的脂質排出達到最高。藉著將細胞培養在不含血清之 DMED，加2毫克/毫升不含脂肪酸之牛血清白蛋白 (DMEM/BSA)(Sigma Chemical Co·，St· Louis，MO)和 30微克/毫升無-放射性之膽固酵中48小時來完成之。按照在 Smith等人，J. Biol. Chem.，271 : 30647-30655 (1996)中的描述，藉著與乙醯化的LDL —起培養24小時，使RAW 264.7細胞經由清道夫受體裝載膽固醇。簡言之，在24-孔的盤中，使RAW 264.7細胞在補充有50微升/毫升1M葡萄糖、10微升/毫升200 mM穀胺醯胺和2%BSA，並帶有50微克/毫升乙醯化之低密度脂蛋白（AcLDL)和[3H]-膽固醇的 0.5毫升DMEM中装載膽固醇並標示過夜，該培養基已經在 37°C下與AcLDL —起培養30分鐘，產生0.33微居里/毫升的 [3H]-膽固醇終濃度。接著以含有1% BSA的PBS沖洗細胞五次，並在DMEM/BSA中培養過夜（16-18小時），容許達到膽固醇池的平衡。在膽固醇池的平衡之後，以PBS/BSA沖洗細胞四次，並在排出培養之前，先在37°C下與DMEM/BSA —起培養1小 O:\110\110257.DOC •115- 1304737 時。加入僅含有白蛋白（對照組），含有白蛋白加HDL (40 微克蛋白質/毫升）或白蛋白加脫輔基A- I (10微克/毫升， Biodesign International, Kennebunk, ME)的排出培養基 (DMEM/BSA)，並培養細胞4、24或48小時。藉著在 DMEM/BSA中，與10微居里/毫升[3h]-膽汁素（75-85居里/ 毫莫耳，Amersham Corp.)—起培養過夜平衡培養基，來標示填脂。在以12，0 0 0 g離心1 5分鐘之後，藉著閃爍計數來測直在培養基中找到的放射性。在將細胞溶解於〇. 5毫升 0.2M NaOH 中（Smith等人 ’ J. Biol. Chem.，271 : 30647-30655 (1996))，或按照在Francis等人，J. Clin.，Invest.， 96，78-87 (1995)中的描述，在己烷··異丙醇（3 : 2體積/體積）中萃取之後’藉著閃爍計數測量在細胞中的放射性。利用1毫升異丙醇萃取含有已標示之磷脂的細胞i小時，然後按照上述以己炫^ :異丙醇萃取。以在從細胞和培養基中回收之總氚化脂質計數内’在培養基中之氚化脂質計數的百分比（cpm培養基/cpm (培養基+溶胞產物）χ1〇〇),來表示膽固醇或磷脂的排出。如同在圖1Α和C中所示，額外的HDL或脫輔基A- I，導致從獲自正常個體之膽固醇-裝載的纖維母細胞中移出膦固醇。然而，在TD細胞中，HDL移除膽固醇的能力梢微減少，而脫輔基A- I移除膽固醇的能力則完全缺乏。圖1顯示正常和TD纖維母細胞，在與白蛋白一起培養4 8小時的期間’釋放出大約3_4%的細胞[3η]_膽固醇至培養基中。將HDL加至白蛋白培養基中’增加了 ^^卜膽固醇從正常和 O:\110\110257.DOC -116- 1304737 TD纖維母細胞兩者中的排出，雖然在TD細胞中程度較低 (圖1B,D)。加入脫輔基A- I，促進了從正常的纖維母細胞中排出[3H]-膽固醇（圖1A，C)，但對於從TD纖維母細胞中排出[3H]-膽固醇，只有很少或沒有影響（圖1B，D)。實例2 本實例證實在與正常細胞相比較，在TD細胞中，175個基因顯示出至少2.5-倍降低的表現，而375個基因顯示出至少2.5-倍增加的表現。使用基因-表現微陣列（GEM)分析得自正常個體（無-TD)和得自TD患者的cDNA，定出不同的基因表現。細胞培養:使用在實例1中描述的獲自正常個體和TD患者之永存不死的細胞培養物。將匯合的培養物維持在 DMEM/BSA中，並持續24小時補充1 mM 8-溴環腺苷單磷酸（8-Br-cAMP，Sigma Chemical Co.，St_ Louis, MO)。 mRNA萃取和cDNA合成:由利用Trizol (Life Technologies Inc.，Bethesda，MD，目錄第 15596-026號）從細胞中萃取的總mRNA中，製備得自正常和TD纖維母細胞之 mRNA。使用 Oligotex mRNA 套組（Qiagen Inc·，Valencia， CA，目錄第70022號），根據販賣者的草案來分離mRNA。根據在 DeRisi等人，Science, 24 : 680-686 (1997)中描述的方法，使用Cy3或Cy5螢光染料，產生螢光標示的cDNA，反轉錄該mRNA。以Cy3螢光染料標示得自TD細胞的 cDNA，並以Cy5螢光染料標示得自正常細胞的cDNA (Incyte Genomics, Palo Alto, CA)。 O:\110\110257.DOC -117- 1304737 微陣列分析:欲分析得自患有TD之個體和正常個體之細胞中不同的基因表現，使按照上述製備之Cy3和Cy5螢光標示的cDNA試樣’與一組在載玻片上的Gene Album微陣列（GEMs)(Incyte Genomics，Palo Alto，CA)雜交。6個玻片分別含有大約9,800個人類cDNA試樣加200個對照組試樣，產生58,800個部份的cDNA之微陣列。因此，容許評估過剩物’提出大約30-50%已經表現的人類基因。從TD1 細胞製備之Cy3-標示的cDNA和得自正常細胞之Cy5-標示之cDNA的雜交，容許進行TD細胞對正常細胞在表現基因上之相對RNA内含量的比較。此外，使從TD2細胞製備之 Cy3-標示的cDNA ’和得自正常細胞之Cy5-標示的cDNA，與同一組微陣列雜交，檢查在不同TD患者之間基因表現的變化。 IH:使用 GemTools 軟體（Incyte Genomics，Palo Alto, CA)分析數據’並以TD細胞對正常細胞mRNA之比例表示。該結果顯示大部份的基因在TD1和正常細胞中，有可相比擬的表現。如同在圖2中所示（在上半部並至對角線的左邊）’僅175個基因在TD1細胞中，與正常細胞相比較，有超過2.5-倍的表現不足，而375個基因在TD1細胞中，與正常細胞相比較，有超過2.5_倍的過度表現（下方並至對角線的右邊）。在TD細胞中較高度表現的基因，可能包括由於湯吉爾突變而導致有差別地調節的那些’做為補償反應或做為疾病病理學上的促成者。在這些基因之中，可能有助於觀察到TD的表現型，並在丁〇細胞中較高度表現的， O:\110\110257.DOC -118- 1304737 包括干擾素·/SdFNj)、巨嗟細胞炎症蛋白質心、顆粒球驅化性蛋白質-2、ΙΙΜ1、前列腺素内過氧化物合成酶_2 (COX 2)血小板反應蛋白（thrombospondin)和單核球驅化性蛋白質 1、3和 4 (L_等人，j. Clin Ιη_，1〇4 : R25_ R31 (1999))。並未發現在正常纖維母細胞中表現，並在1〇1或TD2細胞中完全缺乏的單一 RNA»再者，比較在TD1和TD2中有差別表現的基因，顯示在個別的TD患者之間有極微少的變化。例如，在TD2細胞中最高度向下調節的基因，在 TD1細胞中，與正常細胞相比較，亦有92%表現不足。在 TD1或TD2對正常細胞中’有超過2·5_倍表現不足的基因之一為ABC1蛋白質之基因。追蹤ABC1基因，因為認為其同系物中有一些具有功能，亦因為該基因位在接近已報告為 TD基因區的染色體區之處。實例3 本實例證實ABC1基因位在人類染色體9q31處。先前的基因連鎖分析對人類染色體9q31的7_cM區域，進行 TD 基因的作圖（Rust 等人，Nat. Genet.，20，96-98 (1998))。此外’就地雜交分析顯示abCI基因位在較廣大的染色體間隔 9q22-9q31 (Luciani 等人，Genomics, 21， 15 0-159 (1994))。使用帶有人類/倉鼠照射雜交之Gene Bridge 4格（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)的 PCR 方法’定出人類的ABCI位在標記WI-14706到WI-4062之間’相當於人類染色體9q31的7-cM區域。使用人類ABC1-

O:\110\110257.DOC -119- 1304737 專一性引子 LF : CCTCTCATTACACAAAAACCAGAC (序列識別 11 號）和 LB : GCTTTCTTTCACTTCTCATCCTG (序列識別12號），藉著PCR擴大得自93個人類/倉鼠雜交細胞株的DNA。就人類ABC 1的擴大作用產物，將每個細胞株計分為正或負，並使用 Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research軟體完成衍生自該數據之分析的ABC 1作圖，經由網際網路登錄(http » //carbon, wi.mit.edu : 8000/cgibin/contig/rhmapper.pn 〇藉著與得自相等間隔之人類基因組/酵母菌人造的染色體純種系（Research Genetics，Inc.)進行南方墨點雜交作用，進一步證實這些結果。此外，公告的資料庫研究（GeneMap ’98; National Center for Biotechnology Information)和照射雜交作圖，滅少了其他在得自位在已報告之基因間隔的微陣列資料中，明顯表現不足的基因。這些互補的資料證實了 ABC1基因位在人類染色體9q31處，並進一步指出該ABC 1基因與湯吉爾症有關。實例4 本實例顯示定出野外型ABC 1基因的核苷酸序列，包括側面序列和完整的密碼區。使用ABI Prism 310基因分析儀，或藉著Davis定序 (Davis，CA)完成DNA定序。徹底定出兩股的序列。由獲自從正常纖維母細胞RNA建構之表現質體庫的全長CDNA純種系，定出得自正常個體之AB C 1基因打開密碼的序列。欲建構質體庫’根據Stratagene套組草案（stratagene，La O:\110\1I0257.DOC - 120-(s) 1304737

Jolla，CA) ’合成cDNA。簡言之，使用帶有灿〇1位置的募_ dT引子和MMLV反轉錄酶，在5-甲基dCTP的存在下，從 mRNA合成第一股cDNA。使用RNA酶Η和DNA聚合酶I，在未經修改之dNTPs的存在下合成第二股。在利用pfu DNA聚合酶弄純cDNA的末端之後，使EcoRI交聯劑與 cDNA連接。然後以Xhol消化cDNA，在cDNA的3'末端產生Xhol末端。保護内部的Xhol位置免於被消化，歸因於在第一股合成期間的半-甲基化作用。將已經合成的cDNA選殖到質體 pCEP4 (Invitrogen Corp·，Carlsbad,目錄第 V044-50號）的Hindlll和Xhol位置内’其為含有細胞巨大病毒啟動基因/促進子的表現載體。藉著反轉錄酶聚合酶連鎖反應（RT-PCR)，使用以已知之ABC1序列為基礎的引子，其為 5’-TCCTTGGGTTCAGGGGATTATC (序列識別 13 號）和 5，-CAATGTTTTTGTGGCTTCGGC (序列識別 14號），產生 5 85個驗基對的ABC1探針。使用該ABC1探針，使用clone Capture選擇套組，根據製造者的草案（CLONTECH Laboratories, Inc” Palo Alto，CA)，從庫中回收含有 10500 個驗基之人類ABC 1 cDNA插入序列的純種系。在圖3中出示該純種系，即pCEPhABCl。在序列識別1號中出示這 10500個驗基的ABC1 cDNA插入序列。序列確定證實該 pCEPhABCl含有人類ABC1打開密碼，具有6783個核苷酸加5’和3'未轉譯區，具有比Langmann等人在Biochem. Biophys· Res· Comm.，257，29-33 (1999)中報告之 cDNA 序列（GenBank登錄編號AJO 12376)更大的打開密碼。 O:\110\110257.DOC - 121 -Cs) 1304737 實例5 本實例證實在野外型ABC1基因和TD1、TD2和TD3基因序列之間的序列差異。 TD1、TD2和TD3之cDNA合成:藉著反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)，使用 Superscript Choice cDNA 系統和 Advantage cDNA聚合酶混合物’依據製造者的草案 (CLONTECH, Palo Alto, CA ;目錄第 8417-1號），使用兩組從正常人類ABC 1基因序列來設計的引子對，命名為： (1 )saclhabcf, 5'- AGTCGAGCTCCAAACATGTCAGCTGTTACTG GAAGTGGCC(序列識別 15 號）；habcr3851， 5'-TCTCTGGAT TCTGGGTCTATGTCAG(序列識別 16 號）和 (2)habcf3585，5，-GGGAGCCTTTGTGGAACTCTTTC (序列識別 17號）；habcrsall，5，-ACTGGTCGACCATTGAATTGCA TTGCATTGAA TAGTATCAG (序列識別 18號），從TD1、 TD2和TD3細胞來製備cDNA。利用這些引子，以0.4 uM之終濃度，擴大〇.2-0.5微克聚A+RNA，產生兩個大約3500個鹼基的部份重疊模板。使用QIAEX II系統（QIAGEN，Inc.， Valencia, CA ;目錄第20021號）以凝膠純化模板，並調整成100毫微克/微升之濃度。

TD1、TD2和TD3 cDNA的定庠:在利用個別定序引子的反應中，將各8微升之按照上述產生的每個模板定序，該定序引子係以野外型ABC 1序列為基礎來設計，且終濃度為 0·5μΜ。引子如下：IF: 5'-TTTCCTGGTGGACAATGAA

O:\110\110257.DOC -122-

Cs) 1304737 (序列識別 19號）；2F : 5'-AGTGACATGCGACAGGAG (序列識別 20號）；3F : 5，-GATCTGGAAGGCATGTGG (序列識別 21號）；4F: 5’-CCAGGCAGCATTGAGCTG (序列識別 22 號）；5F : 5，-GGCCTGGACAACAGCATA (序列識別 23 %) \ 6F ： 5'-GGACAACCTGTTTGAGAGT (序列識別 24 號）；7F ： 5'_AAGACGACCACCATGTCA (序列識別 25 號）；8F : 5，-ATATGGGAGCTGCTGCTG (序列識別 26號）； 9F: 5'-GGGCATGAGCTGACCTATGTGCTG (序列識別 27 號）；10F : 5，-AAGAGACTGCTAATTGCC (序列識別 28 號）；11F : 5，-AGCGACAAAATCAAGAAG (序列識別 29 號）；12F : 5’-TGGCATGCAATCAGCTCT (序列識別 30 號）；13F : 5'-TCCTCCACCAATCTGCCT (序列識別 31 號）；14F : 5，-TTCTTCCTCATTACTGTT (序列識別 32號）； 15F ： 5'-GATGCCATCACAGAGCTG (序列識別 33 號）； 16F: 5'-AGTGTCCAGCATCTAAA (序列識別 34號）；1R: 5，-CAAAGTTCACAAATACTT (序列識別 35號）；2R: 5’-CTTAGGGCACAATTCCACA (序歹識別 36 號）；3R : 5’-TGAAAGTTGATGATTTTC (序列識別 37 號）；4R ： 5'-TTTTTCACCATGTCGATGA (序列識別 38 號）；5R : 5'-CTCCACTGATGAACTGC (序列識別 39 號）；6R : 5'-GTTTCTTCATTTGTTTGA (序列識別 40 號）；7R ： 5'-AGGGCGTGTCTGGGATTG (序列識別 41 號）；8R : 5'-CAGAATCATTTGGATCAG (序列識別 42 號）；9R : 5'-CATCAGAACTGCTCTGAG (序列！线別 43 號）；10R :

O:\liO\110257.DOC 123 -

1304737 5'AGCTGGCTTGTTTTGCTTT (序列識別 44號）；11R: 5'-TGGACACGCCCAGCTTCA (序列識別 45 號）；12R ： 5'-CCTGCCATGCCACACACA (序列識別 46號）；13R : 5，-CTCATCACCCGCAGAAAG (序列識別 47號）；14R ： 5'-CACACTCCATGAAGCGAG (序列識別 48號）；15R ： 5'-TCCAGATAATGCGGGAAA (序列識別 49號）；16R ： 5'-TCAGGATTGGCTTCAGGA (序列識別 50號）；UTRIR: 5'-AAGTTTGAGCTGGATTTCTTG (序列識別 5 1 號）。結果:核甞酸編號依據在Lawn等人（1999)中找到的編號。患者TD1保留全部的打開密碼，與野外型序列（序列識別8號）有2個實質上的差異。其中一個是A對G的取代，導致在2201個胺基酸序列的位置537處，從榖胺醯胺至精胺酸殘基的改變，如同由Lawn等人（1999)發表的。該殘基的位置是在NH2-終端親水性的功能部位内，接近第一個預測的穿透膜功能部位。患者TD2亦保留打開密碼，在殘基 527處（序列識別10號）有精胺酸至色胺酸的取代。因此TD1 和TD2在相同的蛋白質區域中，均含有改變胺基酸電荷的取代。TD3 DNA在其ABC1 cDNA中，在一個對偶基因中，在核苷酸5697之後含有14個核苷酸的插入，並在另一個對偶基因中，在核苷酸5062之後有138個鹼基對的插入0 TD1、TD2和TD3 DNAs的基因組定序，證實在個別的 cDNAs中發現改變。藉著PCR擴大分離自纖維母細胞之基因組DNA的156個鹼基對區域產生的基因組序列，其含有 O:\110\110257.DOC -124- 1304737 在得自TD1和TD2之cDNA中發現的突變。基因組定序亦指出就榖胺醯胺對精胺酸之取代而言，患者TD1是同種接合子的。基因組DNA分析顯*TD2是化合物異種胚子，一個對偶基因含有檢測出之取代，而第二個對偶基因（其無法產生可檢測的mRNA)含有未定的檢測。在無_TD個體之基因组DNA的80個以上的對偶基因中’未曾發現任何的取代突變。藉著序列分析確認TD3的插入，並藉著RT_pcR，使用在插入點周圍的引子而加以證實。在核苷酸5697之後Μ 個鹼基對的插入引起移㉟，從在第二個Ατρ結合功能部位之前的地方，上至早熟蛋白質終止的點，產生野外型胺基酸序列的置換個對偶基因中，在核#酸漏之後的138個鹼基對的插入，含有骨架内的終止密碼子。本貝例《a實ABC 1運送活性之抑制劑’亦可抑制脫辅基 A- I -調節的從纖維母細胞中排出膽固醇。欲測試ABC1的抑制作用是否影響脫輔基脂蛋白_調節之膽固醇排出的過紅’在監視脫輔基脂蛋白調節之膽固醇排出的測定中，測試兩種已報WABC1抑制劑的化合物。已經報告化合物4,4·:異硫代氰基^2,2|_二韻（DIDS)和硫溴鄰苯二甲酸，，、，π, 1 ( SP)以劑量_依賴之形式，抑制了 ABC1的陰離子運送活性（Β τ D., (ecq寺人，J. B1〇I. Chem.，272 : 2695-2699 (1997) ； Hamnn ^ / ^ n 等人 ’ Blood，90 : 291 1-2915 (1997))。按照在實例1中沾中的為述，並附帶特別提到的改變，來進行脫輔基脂蛋白贪白调即的膽固醇排出測定。將裝

O:\110\110257.DOC -125- 1304737 載膽α %並以[η]·膽m醇標示的正常纖維母細胞（㈣）與或不與5微克/毫升脫輔基A_ !和〇、〇 2鳥戈〇 4福卿8 =起培養6小時。此外，將裝載膽固醇並以邮膽固醇標不的正常纖維母細胞（n=3)與或不與5微克/毫升脫辅基A_ I 和〇、〇_2 mM或(Μ mM BSP 一起培養6小時。按照在實例ι 中的描述’藉著閃爍計數測量[3Η]_膽固醇的排出，並以在培養基中出現之總放射性標示的膽固醇的百分比來計算。在圖5中以在減去不含脫輔基之培養基的值之後，在脫輔基A-Ι存在下的排出平均值±SD (η=3)來表示該結果。圖5顯示DIDS和BSP兩者均抑制由脫辅基脂蛋白A—工調卽之iiil化膽固醇的排出6小時。此外，在使用didS和 BSP時，對氚化磷脂醯膽鹼的排出，觀察到同樣的抑制作用（數據未顯示）。這些試驗的結果與在實例丨中描述的，衍生自患有TD之患者的纖維母細胞中的排出缺陷極為相似。實例7 本實例證實ABC 1 mRNA表現的反義抑制作用，抑制了脫輔基A- I -調節的從纖維母細胞中排出膽固醇。按照在實例1中的描述’以[3H]-膽固醇標示正常的皮膚纖維母細胞。然後藉著在30 μΜ對照組嗎啉募核：y：酸（5，_ CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATAJ'，相當於 0 _血球蛋白地中海貧血之mRNA的反義補體；序列識別5 2號），或3 〇

μΜ ABC1 反義嗎啉募核苷酸（5'-CATGTTGTTCATAGGGT GGGTAGCTC-3,；序列識別53號）的存在下刮擦，使細胞 O:\110\110257.DOC -126- 1304737 ㈣寡核《，並再播種於新的培養盤上。對照組細胞則在以[H]-膽固醇標示之後’藉著刮擦假裝裝載，並在缺乏券核嘗酸之下再播種。在12小時之後，藉著閃料數，以在培養基中出現之總放射性標記之膽固醇的百分比，測量脫輔基Ad _調節的排出。在圖6中’以在每個實驗中對於在缺乏寡核#酸之下，脫辅基人小專—性排出的值㈣化之三個個別實驗的平均值土SEM來表示該結果。如同在圖6中所示，反義寡核甞酸直接對抗ABCl mRNA，與對照組反義募核苷酸（沒-血球蛋白反義募核芸酸）相比較，在從正常纖維母細胞中排出膽固醇方面，引起5〇%的降低。實例8 本實例aa實人類ABC1基因的過度表現，導致增加脫輔基A- I 調節之從單核細胞中排出膽固醇。尽—?64·7細胞的穩定轉移感染:以人類ABC 1之 pCEPhABCl表現質體穩定地轉移感染老鼠單核的RAW 264·7細胞。在實例4中描述了含有人類ABC1之打開密碼的pCEPhABCl質體的建構。在〇.8毫升不含血清的DMEM 中’利用2微克pCEPhABCl DNA和12微升Geneporter轉移感染試劑（Gene Therapy Systems, Inc.，San Diego，CA ;目錄第T201007號）轉移感染大約lxlO6個RAW 264.7細胞5小時。兩天之後，按照範圍從1 : 2到1 : 5 0之比例分配細胞，並藉著在培養基中加入150微克/毫升潮黴素，運用選擇。在兩週之後，挑選出潮黴素-抗藥性菌落並擴大之。

脫輔某A- I -調節之贍固酵排出測定:使親代的RAW O:\110\110257.DOC -127· 1304737 264.7細胞和三個穩定表現人類ABC1的選殖株（L3、匕和 L6)生長至匯合。按照在實例丨中的描述，藉著與〇 5微居 -里7毫升[3H]_膽固酵和50微克/毫升乙醯化之LDL—起培養 .24小時，將該細胞裝載膽固醇並標示之。藉著在 DMEM/BSA中過夜培養，平衡膽固醇池之後，按照在實例 1中的描述，沖洗細胞並加入排出培養基。按照先前的描述，藉著在細胞培養基中氚化膽固醇的閃爍計數，來測量脫輔基A-Ι-調節的膽固醇排出，以從細胞和培養基中回收之總計數的百分比表示之。以在每個實驗中對得自親代 RAW 264.7細胞之脫輔基A- I _調節的排出值標準化之三個個別實驗的平均值土SEM來表示該結果。圖7顯示從親代 RAW 264·7細胞和L3、L5和L6轉移感染細胞株中，脫輔基 A- I _調節的膽固醇排出。如同所見到的，利用abci表現載體的轉移感染，導致在脫辅基調節之膽固醇排出上有4-倍（L6)到8-倍（L3和L5)的增加。這些結果代表ABC1 φ 基因的過度表現，實質上可增加從巨噬細胞中排出之膽固醇的含量。實例9

本實例也貝在正常的皮膚纖維母細胞中，ab c 1 A 的表現係經由與膽固醇排出有關之細胞條件來調節，但在 TD纖維母細胞中則否。欲決定ABC 1在細胞脂醇的排出中，是否扮演著速率限制的角色，在各種與膽固醇排出過程有關的細胞條件下測量AB C1的合成。特定而言，分別使正常的纖維母細胞和

O:\HO\110257.DOC -128- 1304737 TD纖維母細胞暴露在過量cAMP、膽固醇或脫辅基A- I的條件下。按照在實例1中的描述製備正常的皮膚纖維母細胞和TD1與TD2纖維母細胞的細胞培養物《藉著rt-PCR測量ABC1 mRNA的含量》細胞培養:按照在實例1中的描述，製備正常的皮膚纖維母細胞和TD1與TD2纖維母細胞之永存不死的細胞培養物。在以DMEM/BSA置換之前，使細胞在DMEM/10%FBS 中生長至傳代匯合，並顯示額外的24或48小時。按照在實例2中的描述來製備RNA。 RT-PCR :使用GeneAmp 5700序列檢測系統（卩6化111-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)完成定量的 PCR。簡言之，使用2.5 μΜ的隨機六聚體引子，將500毫微克DNA酶-處理過的mRNA反轉錄。藉著PCR，使用 SYBR綠核心套組（PE Applied Biosystems，Foster City， CA ;目錄第4304886號）和人類ABC1引子1^:5，-CCTCTCATTACACAAAAACCA GAC (序列識別 11 號）和 LB ： 5'-GCTTTCTTTCACTTCTCAT CCTG (序列識別 12 號），擴大該反應大約5%，產生82個鹼基對的片段，相當於人類八8(：1的核苷酸7018-7099。？〇11循環條件如下：95 °C 10分鐘；接著95°C 15秒循環40次；以及60°C 60秒。藉著檢測由於SYBR綠與在每次PCR循環期間產生之雙股擴大產物結合所引起的螢光增加，來定量在每個試樣中的 mRNA。所有的試樣均執行一式三份，並對石·肌動蛋白 mRNA標準化，在平行的反應中利用引子肌動蛋白F : 5·- O:\110\110257.DOC -129- 1304737 TCACCCACACTGTGCCATCTACGA (序列識別 54號）和肌動蛋白 B : 5，-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG (序列識別55號）擴大。在相同的PCR板上跑出ABC1和肌動蛋白的標準曲線。 8-Br-cAMP測定:使正常的、TD1和TD2的纖維母細胞在DMEM/10%FBS中生長至傳代匯合，然後以在 DMEM/BSA 中的 ImM 8_Br-cAMP處理 24小時。膽固醇測定:使正常的、TD1和TD2的纖維母細胞在 DMEM/10%FBS中生長至傳代匯合，然後以在DMEM/BSA 中30微克/毫升自由膽固醇處理48小時，接著在 DMEM/BSA中平衡18-24小時。脫輔基A- I測定：使正常的、TD1和TD2的纖維母細胞在DMEM/10%FBS中生長至傳代匯合，然後以在 DMEM/BSA中3 0微克/毫升自由膽固醇處理48小時，接著在DMEM/BSA加10微克/毫升脫輔基A-Ι中平衡18·24小時。結果:圖8顯示在正常的纖維母細胞中，藉著暴露在8_ Br-cAMP下使ABC1 mRNA增加大約10-倍，並藉著在不含血清的培養基中，暴露在膽固醇下，使其增加大約17_ 倍。後續使裝載膽固醇的細胞暴露在脫輔基A-Ι下，導致 ABC 1 mRNA的表現明顯地降低。雖然尚未證實該機制，但先前的研究已經顯示在諸如cAMP和膽固醇之類化合物的存在下，促進了膽固醇的排出（Hokland等人，j. BiQh Chem·，268 : 25343-25349 (1993))。本結果指出，在正常 O:\110\110257.DOC -130- 1304737 的纖維母細胞中，藉著這些已知的膽固醇排出路徑之效應物，誘發ABCl mRNA，並藉著暴露在脫輔基脂蛋白膽固醇接受者之下而壓抑之，證實ABC1的表現是由與脫輔基脂蛋白-調節之膽固醇排出有關的細胞條件來調節。相反的，得自TD患者的纖維母細胞，不受膽固醇排出之效應物的調節。首先’在TD1和TD2細胞中c AMP-可誘導之 ABCl mRNA的含量僅為正常細胞的大約4〇%。此外，使裝載膽固醇的細胞暴露在脫辅基八_ I之下，並未改變ABC j 的表現（TD1細胞）’或稍微增加ABC1的表現（TD2細胞）。這些結果反映了對TD細胞所描述之在脫輔基_八_ j _調節之膽固醇排出上的缺陷。有趣的是，細胞在含有血清的培養基中生長’壓抑了 ABC1的信息至接近檢測的限制（數據未顯示）。這可能反映出使脂質排出路徑具有功能，需要細胞靜止或其他降低膽固醇需要之細胞狀態的事實。總之，與增加細胞之膽固醇排出有關的條件（也就是膽固醇裝載、cAMP處理、血清的剝奪），亦導致在正常的纖維母細胞中，增加ABC 1 mRNA的表現。相反的，使裝載膽固醇的正吊纖維母細胞暴露在脫輔基A- I之下，降低了 abC1 的表現。實例10 本實例證實LXR核受體的配體，像是20-羥基膽固醇，和RXR受體的配體’像疋9 -順視黃酸，可增加ab c 1基因在老鼠RAW 264.7細胞中的表現。 LXR核受體為轉錄因子’其與核受體rxr形成必要的異 O:\110\110257.DOC -131 - 1304737 種二聚體，並藉著與一種氧基脂醇，包括22-羥基膽固醇和20-羥基膽固醇結合而將其活化，促進其標靶基因的轉錄作用（Janowski等人，Nature，383 : 728-731 (1996))。它本身是調節膽固醇誘發之基因轉錄的候選者。此外，從研究的觀點來看，顯示在纖維母細胞和巨嗤細胞中增加 ABC 1 mRNA和蛋白質，係反映膽固醇的裝載，而其他的研究則顯示藉著暴露在氧化的LDL之下，使LXR和RXR在裝載膽固醇的巨噬細胞中增加表現，故LXR和RXR核受體是ABC 1基因之轉錄活化劑極為合理的候選者。欲決定 LXR和RXR受體在ABC1基因表現中是否扮演某種角色，須測量反映20-羥基膽固醇和9-順視黃酸的ABC1 mRNA之含量® 使老鼠RAW 264.7細胞在DMEM/10%FBS中生長至傳代匯合，然後在不含血清的DMEM/BSA中以9-順視黃酸（10 μΜ)、20-羥基膽固醇（10 μΜ)或兩種配體一起（總共20 μΜ) 處理24小時。對照組細胞僅接受乙醇媒劑（0.1%體積/體積）。按照在實例9中的描述萃取RNA，以DNA酶處理，並藉著 RT-PCR ，使用 PE Biosystems SYBR Green Technology，測量ABC1 mRNA。圖9顯示利用20-經基膽固醇或9-順視黃酸的處理，導致ABC1 mRNA表現的增加。此外，圖9亦顯示利用兩種配體一起的處理，產生明顯的協同效果，具有勝過在單一配體中觀察到的ABC1表現大約6-倍的增加。這些結果證實核受體之配體LXR和RXR ’ 可增加ABC1基因的表現。 O:\110\110257.DOC -132- 1304737 實例11 本實例證實在原生質膜中，促進ABC1蛋白質的表現，與脂質的排出有關。使用細胞-表面標示和免疫沉澱法，決定在原生質膜中增加ABC1蛋白質的表現是否與增加膽固醇的排出有關連 (圖10)。藉著使在完整細胞上的表面蛋白質與不可通透膜的製劑硫-NHS-生物素交聯，接著進行膜溶解作用、與 ABC1抗體的免疫沉澱作用、SDS-PAGE並利用鏈黴菌抗生物素蛋白來檢測的步驟，定出在細胞表面上ABC 1的相對含量。細胞培養:按照在實例1中的描述，使正常的和TD1纖維母細胞永存不死。在對照組條件和已知可增加脫輔基脂蛋白-調節之膽固醇排出的條件（Oram等人，J. Up. Res., 40 : 1769-1781 (1999))下，培養正常的和TD1細胞。使對照組細胞在DMEM/10% FBS中生長至匯合，然後在無添加物的DMEM/BSA中培養18小時（對照組）。使cAMP-處理過的細胞在DMEM/10% FBS中生長至匯合，然後在帶有ImM 8-Br-cAMP的DMEM/BSA中培養18小時（cAMP)。使裝載膽固醇的細胞在DMEM/10% FBS中生長至匯合，然後在帶有 30微克/毫升膽固醇的DMEM/BSA中培養48小時，加上在無添加物之下培養1 8小時（膽固醇）。使以cAPM處理之裝載膽固醇的細胞在DMEM/10% FBS中生長至匯合，然後在帶有30微克/毫升膽固醇的DMEM/BSA中培養48小時，加上在帶有ImM 8-Br-cAMP之下培養18小時（膽固醇+cAMP)。 O:\110\110257.DOC - 133- 1304737 細胞-表面的標示：關於原生質膜ABC1的選擇性標示，在0°C下將細胞與含有1毫克/毫升硫-NHS-生物素（Pierce， Rockford, IL ;目錄第212 17號）的PBS—起培養30分鐘，使細胞表面的蛋白質生物素基化（參見Walker等人， Biochemistry, 50 : 14009-14014 (1993))。免疫沉澱法:ABC 1之兔抗血清，會對相當於位在人類 ABC1 之 C-終端，推衍之肽 KNQTVVDAVLTSFLQDEK VKES的合成肽而升高。藉著將細胞溶解於含有1%三通又-100 (Sigma, St. Louis, MO)和蛋白酶抑制劑白肽（1 mM)、胃蛋白酶抑制素（ImM)和抑肽酶（1 mM)的PBS中，完成免疫沉澱作用。在4°C下，以1 : 200之稀釋度，將細胞萃取物與抗-ABC1抗血清一起培養過夜，接著與5微升蛋白質 A-塗覆之磁性小珠（Dynal, Lake Success, NY ;目錄第 1001.01號）一起培養額外的1小時。以磁鐵使抗體-抗原複合物沉降，以1 %三通-X/PB S沖洗小珠兩次，並以1 %醋酸洗脫出蛋白質。 ABC1I白質之檢測:使洗脫出的生物素基化之蛋白質經歷SDS-PAGE (6%凝膠；150伏特，5小時），並移至硝基纖維素膜上（200毫安培，18小時）。利用稀釋成300-倍的鏈黴菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶（Amersham Pharmacia Piscataway，NJ;目錄第RPN 1231號）探測該硝基纖維素膜，並根據販賣者的草案（Amersham Pharmacia Piscataway, NJ)，藉著增加的化學發光標記（ECL)來檢測。欲測試細胞内蛋白質可能的生物素基化作用，利用針對細 O:\110\110257.DOC -134- 1304737 胞内蛋白質沒-COP的老鼠單株抗體處理在免疫沉澱之後的上清液，並藉著鏈黴菌抗生物素蛋白墨點法，測定免疫沉澱的生物素基化之石-COP。並未檢測到任何東西。 Ιϋ:如同在圖10中所示，以二重峰顯示24〇kDa ABC1 蛋白質。s亥ABC 1蛋白質部份位在正常（1 o a)和td 1 (1 〇B) 纖維母細胞兩者的原生質膜上。在第二個正常的纖維母細胞株和TD2纖維母細胞中看到類似的結果（數據未顯示）。當細胞在利用8-Br-cAMP處理的血清中生長時（正常的和 TO 1細胞）’ ABC 1在細胞-表面的表現有輕微地增加。剝奪血清並裝載膽固醇的正常和TD1細胞，明顯地增加ab C 1在細胞-表面的表現’並藉著cAMP的處理更進一步地促進。這些結果代表AB C1在細胞表面的表現，係由促進脫輔基脂蛋白-調節之脂質排出的條件調節，與其位在原生質膜上’在其脂質運送功能中扮演關鍵性之角色的想法一致。在TD1和TD2細胞中的突變，似乎未嚴重地損害ABC1的表現或加工處理，意味著對脂質運送或與附屬蛋白質之交互作用的二次影響，依據其NH2-終端的功能部位，即發生突變之處。實例12 本實例顯示抑制3,5·環狀AMP之降解的製劑，像是磷酸二醋酶抑制劑’增加了從巨噬細胞中，脫輔基脂蛋白A_ I -調節的排出。如同在圖10中所示，c AMP可增加ABC 1的活性。進行本研究’定出在升高之CAMP的存在下，從巨噬細胞中排出

O:\110\110257.DOC -135- 1304737 的膽固醇。可在刺激cAMP合成或抑制cAMp降解之製劑的存在下，達到升高含量的cAMp ^例如，羅利普蘭是藉著抑制磷酸二酯酶，一群降解CAMP的酵素，來調*CAMP含量的化合物。使用在實例！中描述的脫辅基脂蛋白·調節之膽固醇排出測定，來決定升高之cAMp對膽固醇排出的影響簡&之，使以1.25 X 105個細胞/毫升之密度懸浮的raw 264.7細胞’在補充有丙酮酸鹽的dmeM/10% FBS中生長。在24小時之後，移出培養基，並以DMEM/BSA加放射性標示的膽固醇（1微居里/毫升[3h]_膽固醇）和5〇微克/毫升乙醯化的LDL置換24小時。然後將細胞維持在由 DMEM/BSA加單獨的脫辅基A_ j (2〇微克/毫升）、脫辅基A_ I和S-BrUCamp (1 mM)或脫輔基A_;[和羅利普蘭（5〇 μΜ)組成之平衡培養基中24小時。在12-24小時之後，按照在實例1中的描述，藉著閃燦計數測量[3Η]_膽固醇排出，並以在培養基中出現之總放射性標示之膽固醇的百分比來计异。該結果顯示未接受脫輔基A_ J之裝載膽固醇的對照，、且細胞，顯示3%的膽固醇排出，而接受脫輔基A_ J的細胞僅顯示5%的排出。接受脫辅基A-Ι和CAMP之裝載膽固醇的細胞’顯示出32%的膽固醇排出，證實升高的cAMp 可促進膽固醇排出。同樣地，接受脫輔基A- I和磷酸二酯酶抑制劑（羅利普蘭）的細胞，顯示出17〇/〇的膽固醇排出。實例13 本實例顯示核受體配體之製劑，像是LXR、RXR* PPAR核受體，增加了從巨噬細胞中，脫辅基A_工調節的

O:\110\110257.DOC -136- 1304737 排出。欲決定核受體之配體是否影響脫輔基脂蛋白-調節之膽固醇排出的過程，使用在實例12中描述的脫輔基A_ I _調節之膽固醇排出測定，來測量各種配體。核受體的超級家知包括數個成員，像是肝臟受體LXR、視黃酸·類受體RXR 和過氧化物酶體增殖者-活化的受體PPAR，其已經涉及脂質的代謝（Russell，D.W.，Cell, 97 : 539-542 (1999); Spiegelmam，B.W” Cell，93 : 153-155 (1998) ; janowski等人，Nature, 383 : 728-731 (1996))。此外，已經觀察到這些受體中有一些的配體增加血漿的HDL，且基因表現的特徵性（微陣列）數據已經顯示荷爾蒙受體經由氧化的LDL，負起膽固醇裝載之責任。使用上述的測定，測試9-順視黃酸（RXR配體）、氧基脂醇（LXR配體）和非諾貝特（ppar配體），定出對膽固醇排出的影響。未接受脫辅基A-Ι之裂載膽固醇的對照組細胞，顯示3%的膽固醇排出，而接受脫辅基A-Ι的細胞僅顯示出5%的排出。相反的，接受脫辅基A- I和9-順視黃酸（30毫微克/毫升）之裝載膽固醇的細胞，顯示出16%的膽固醇排出《接受脫辅基A- I和氧基脂醇（5微克/毫升）的細胞，顯示出14%的膽固醇排出。接受脫辅基A- I和非諾貝特（3微克/毫升）的細胞，顯示出1〇% 的膽固醇排出。這些結果表示可調整荷爾蒙受體，增加脫輔基脂蛋白-調節之從巨噬細胞中排出膽固醇的速率。再者，當使用各種濃度的9-順-RA(0.3毫微克/毫升、3.0 毫微克/毫升或30毫微克/毫升）來進行排出測定時，結果顯 O:\110\110257.DOC -137- 1304737

不9-順-RA以劑量依賴性之方式來調節從巨噬細胞中排出膽固醇。特定而言，對照組細胞（僅有脫辅基A- I )顯示出 1890c.p.m_，Q.3 毫微克 / 毫升 9-順 _ra顯示出 I522c.p.m.， 3-0¾ Μ克/毫升9-順_ra顯示出3568c.p.m.，而30毫微克/毫升9-順-RA顯示出8597c.p.m· 〇此外，使用類似的測定，其中使RAW 264.7細胞裝載膽固醇48小時，顯示其他的核受體活化劑’像是22-羥基膽固醇（LXR配體）和苯纖維酸酯，亦可增加膽固醇的排出（數據未顯示）。實例14 本實例顯示花生酸衍生物，像是前列腺素E丨和前列環素 PG12 ’增加了從巨噬細胞中，脫輔基脂蛋白A_ I調節的排出。花生酸衍生物，像是前列腺素和前列環素，已經顯示其在尚膽固醇血症的治療上是有效的。欲決定花生酸衍生物是否影響脫辅基脂蛋白-調節之膽固醇排出的過程，使用在實例12中描述的脫辅基A- I -調節之膽固醇排出測定，來測試PGE1和PG12。該測定顯示未接受脫辅基Α·ι之裝載膽固醇的對照組細胞，具有3%的膽固醇排出，而接受脫輔基A- I的細胞僅有5%的排出。接受脫輔基Α_ I和 PG12(25nM)之裝載膽固醇的細胞，顯示出10%的膽固醇排出。接受脫輔基A- I和PGE1(25 nM)的細胞，顯示出15% 的膽固醇排出。這些結果證實花生酸衍生物可增加脫輔基脂蛋白-調節之從巨噬細胞中排出膽固醇的速率。實例1 5 O:\110\110257.DOC -138- 1304737 本實例證實可使用在AB C1啟動基因控制之下的報告者基因’來測試化合物調節ABC1之基因表現的能力。使用PGL3蟲螢光素酶報告者載體系統（Pr〇mega， Madison，WI) ’產生重組質體，來測量在ABC 1啟動基因控制之下的報告者基因的表現。 ^ ^ ^ ^ ^ ^ :使用質體 pGL3-Basic (Promega，

Madison，WI;目錄第E1751號）做為含有無啟動基因之蟲螢光素酶基因的對照組質體。藉著將得自ABC1基因之5,側面區的基因組片段（hAPRl 5,啟動基因，相當於序列識別3 號的核甞酸1080-1643)選殖到GL3-Basic質體的SacI位置，產生質體GL-6a’來製造含有ABC1啟動基因和蟲螢光素酶基因的報告者構築體。接下來，以Spel和Acc65I消化質體 GL-6a。從；I傳代純種系中切除BsiWI-Spel片段，將相當於序列識別3號之核苷酸1 -1534，代表ABC 1基因組序列連接到藉著該消化作用產生之剩下的載體/ABC 1啟動基因片段内。所得的質體pAPRl，在1750個鹼基之人類ABC1啟動基因序列的轉錄控制之下，編碼蟲螢光素酶報告者基因。報.告考構築體的韓蒋威.染:將上述的對照組或pAPR 1質體轉移感染到維持在含有10%胎牛血清之DMEM中的RAW 264.7細胞之匯合培養物中。以pGL3-Basic、pGL3-啟動基因或pAPRl DNA (1微克）、蟲螢光素酶質體DNA (1微克）和 12 微升 Geneporter 試劑（Gene Therapy Systems, San Diego，CA ;目錄第T201007號），轉移感染12孔培養盤中 O:\UO\110257.DOC •139· 1304737 的每一孔5小時。此外，加入0.1微克pCMV召質體 DNA(Clontech，Palo Alto，CA ;目錄第 6177-1號），做為轉移感染效力的對照組。在5小時之後，在乙醯化之LDL (100微克/毫升）的存在或缺乏之下，以不含企清的 DMEM/BSA置換培養基，並培養24小時。在高輸出入總量的篩選中，為了便於加入，可使用下列的程序穩定地以報告者質體轉移感染培養細胞。首先，在 60毫米的盤中，以在帶有50微升Geneporter轉移感染試劑 (Gene Therapy Systems, San Diego，CA)之 10毫升不含血清的 DMEM 中的 9微克 pAPRl 質體和 pCMV-script (Stratagene， La Jolla，CA)轉移感染5xl06個RAW 264.7細胞5小時。接著，以完全培養基置換轉移感染培養基，並在37。(：下培養細胞過夜。隨後，以範圍在1 : 5至1 : 1000之間的稀釋度，將細胞移至個別的培養盤中，並在含有800微克/毫升 G41 8 (Life Technologies，Bethesda，MD)的選擇培養基中培養20天。挑選肉眼可見的菌落，擴大，並如下述測定其蟲螢光素酶的活性。使用該方法，確認出五個蟲螢光素酶活性為陽性的純種系細胞株，在高輸出入總量的測定中使用之。蟲螢光素B每的測定:在轉移感染之後，將每孔中的細胞溶解於70微升IX細胞溶解試劑（promega，Madison，WI，目錄弟E3971號）中’接受一次冷;東-融解循環，並藉著以 12,000g離心5分鐘，使溶胞產物澄清。在離心之後，在1〇微升溶胞產物中加入1 〇〇微升蟲螢光素酶測定試劑 O:\110\110257.DOC •140- 1304737 (Promega，Madison, WI ;目錄第E1501號）。使用發光計測量每個溶胞產物以光單位計的蟲螢光素酶活性。此外，使用由Galacto-光套組中提供的化學發光測定試劑，根據製造者的說明（Tropix lnc.，Bedford, MA ;目錄第 BL100G 號）’測量每個溶胞產物的/3 -半乳糖苷酶活性。藉著將蟲螢光素酶活性除以已經定出之石-半乳糖甞酶值，定出每個溶胞產物之標準化的蟲螢光素酶活性，並以相對的光單位報告。 Ιϋ :在以pAPRl轉移感染的細胞中檢測到的蟲螢光素酶活性，比在以僅含有蟲螢光素酶cDNA之pGL3-Basic質體轉移感染的對照組細胞中檢測到的活性高3 _3-倍。這些結果顯示ABC1的轉錄調節區是在適當之處。當將p apr 1 轉移感染的細胞與100微克/毫升乙醯基LDL—起培養24小時時’其蟲螢光素酶活性比在未以乙醯基LDL處理之細胞中的高3.25-倍。這些結果暗示基因組的ABC1序列，含有在5’侧面區找到之"膽固醇反應性"要素，其調節天然ABC1 基因的膽固醇裝載反應。該報告者系統亦可用來測試其他的化合物’決定該化合物是否調節Ab c 1的表現。實例16 本實例證實可使用其他的測定，使用在内源之ABC j啟動基因的控制之下的報告者基因，來測量化合物調節 ABC1基因表現的能力。本測定涉及建構含有無啟動基因之報告者基因和選擇標記基因的重組載體。將該載體弄直，並轉移感染到細胞 O:\110\110257.DOC -141 - 1304737 内，使仔報告者基因在内源的AB Cl啟動基因之下游，整合到該細胞的基因組中。使用該測定，藉著内源的abC1 啟動基因，對党試化合物產生反應，而驅動報告者基因的表現。盤蚩者質體致建樽：可從ABC1的7000個驗基之Ec〇ri& 因組片段，其含有表現序列0(其包含ABC1起始點）和插入序列1的部份，開始製造含有無啟動基因之報告者基因的重組載體。使用指定位置之突變生成作用，可在兩個已知之起始點下游的表現序列〇序列中產生8&11限制位置。藉著將含有無啟動基因之報告者基因，像是蟲螢光素酶，和無啟動基因的選擇性標記，像是嘌呤黴素抗藥性的〇]^入片段插入Sail位置，產生重組載體。應該將内部的核糖體進入信號插在報告者基因和標記基因之間，而得以正確的方位轉錄該基因。該重組載體含有兩個Ec〇47In位置，必須使用例如指定位置之突變生成作用，除去其中一個。剩下的 φ Eco47III位置，位在表現序列〇之上游，用來弄直載體。邀.的轉移感染,:藉著任何此項技藝中已知的各種轉移感染方法，將已經弄直之含有報告者基因和標記基因的重組載體，導入包括人類細胞的培養細胞内。例如可使用在實例15中描述的方法，來轉移感染已經弄直、的載體。含有就！序列之弄直的重組載體，容許將該載體整合到細胞基因組的内源ABC1基因之位置内。在培養基中加入適當的杬生素，容許僅選擇已經以適當之方位將報。者基因和標記基因整合到内源之ABCl啟動基因下游

O:\110U10257.DOC -142- 1304737 中的那些細胞。例如，如果該載體含有插入報告者基因下游的嗓呤黴素抗藥性基因，則應該使經過轉移感染的細胞生長在嘌呤黴素的存在下。只有適當整合嘌呤黴素抗藥性基因’並可藉此編碼具有功能之蛋白質的那些細胞，將在示呤黴素的存在下存活。因此，應該使經過轉移感染的細胞’在適當抗生素的存在下，在誘導ABC1啟動基因之活性的條件下生長。可選殖培養存活的細胞，並使用PCR或南方墨點分析定出DNA序列，來測試基因組序列的適當整合作用。所得的細胞含有在内源之ABC1啟動基因控制之下的報告者基因’可使用它來決定受試化合物是否調節ABC1的表現。精著測定在暴露於受試化合物之下的細胞中發現之報告者基因表現的程度，來決定該化合物的ABC1調節活性。例如’使用具有已經整合之蟲螢光素酶基因的細胞，藉著測量在暴露於該化合物下之細胞中發現的蟲螢光素酶活性的含量’來決定受試化合物的ABC1調節活性。實例17 本實例證實核受體之配體在ABC1啟動基因的控制之下’向上-調節報告者基因的表現。欲決定LXR α、LXR冷和rxr α核受體之配體是否可調節ABC1的基因表現，將含有在^^^。啟動基因控制之下的蟲螢光素酶報告者基因之pAPR1質體，轉移感染到以至少一種核受體之配體處理過的RAW 264·7細胞中（圖12)。報告者構築.霞構和韓移感染:按照在實例15中的描

O:\110\110257.DOC -143- 1304737 述’獲得報告者構築體pAPRl和對照組報告者構築體 pGL3-Basic。按照在實例15中的描述，將RAW 264.7細胞 • 維持在培養基中，並以pGL3-Basic (1微克）或pAPRl (1微克）轉移感染。以乙醇（EtOH)(0.1%體積/體積）、20(S)-羥基膽固醇（20(S)OH-膽固醇）（1〇 μΜ)、9-順視黃酸（9-順-RA)(l〇 μΜ)或20(S)OH-膽固醇和 9-順-RA (總共 20 μΜ)兩者處理經過轉移感染的RAW 264.7細胞24小時。按照在實例15中的描述，測量蟲螢光素酶活性’並以相對的光單位 ® 報告。丝JL:在圖12中出示本研究的結果。以pGL3-BasiC轉移感染的對照組細胞並未顯示出蟲螢光素酶活性（數據未顯不）。與EtOH對照組相比較，以pApR1轉移感染的細胞，在20 OH-膽固酵的存在下，在蟲螢光素酶報告者活性上產生了 19-倍的增加，在9·順RA的存在下，在蟲螢光素酶活性上產生了 16-倍的增加，而在兩種配體的存在下，在蟲參螢光素酶活性上產生了 280-倍的增加。這些結果表示脂醇和類視黃醛兩者，從在pAPR1中的ABC1 5，側面序列，誘發了強的轉錄反應。此外，這兩種化合物具有明顯的協同政果可藉著在以兩種配體處理之細胞中發現的蟲螢光素酶活性戲劇化地增加而看出。已知LXRa*RXRa受體形 •成有活性的異種二聚體。因此，兩種核受體之配體_誘導的活化作用，可在轉錄作用中同時產生觀察到的協同增 ' 加。這些數據證實經基脂醇’像是2Q(sm基膽固醇和類視

O:\UO\110257.DOC •144- 1304737 黃醛，像是9-順視黃酸’活化abC1啟動基因，表示這些及相關的化合物可用來發展增加ABC1在巨噬細胞中表現的治療性化合物’除去周圍位置的過量膽固醇。此外，本 ABC 1啟動基因/報告者基因的篩選測定，可用來篩選其他增加ABC 1表現的化合物，以便確認更多的治療性化合物。實例18 本實例證實ABC1啟動基因區的更多特徵，包括LXR反應要素的確認。欲定出ABC 1之5'侧面區反映核受體而保留轉錄活性的部位’將含有5'側面區不同部位和蟲螢光素酶報告者基因的各種質體轉移感染到以至少一種核受體之配體處理的RAW 264.7細胞内。使用該系統，確認出脂醇反應要素相當於序列識別3號的核苷酸1480-1 5 10。該脂醇反應要素含有直接重覆-4要素TGACCGatagTAACCT »證實使用指定位置之突變生成作用和帶-轉移測定技術，獲得該脂醇反應要素。報告者構築體的建構:按照在實例15中的描述，獲得報告者構築體pAPRl和對照組報告者構築體pGL3-Basic。亦建構含有序列識別3號之核苷酸1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643或1394-1643的報告者構築體。按照在實例15中的描述，建構含有序列識別3號之核苷酸1080-1643 的報告者構築體（GL-6a)。以S_pel和Nhel消化pAPRl，並再度連接凝膠-純化的載體片段’來建構含有序列識別3號之 O:\110\U0257.DOC • 145- 1304737 核芬酸1-1532的報告者構築體。藉著首先以_消化gl_ 6a，以Klenow酵素將黏性末端弄鈍，以消化所得的載 . 體，並分離462個鹼基對之弄鈍的_saci點性末端片段，來建構含有核苷酸U81·1643的報告者構築體。將其選殖到藉著以消化GL-6a，以Klenow酵素弄鈍黏性末端，以消化，並以凝膠純化載體片段而獲得的載體内。藉著以ACC65I連續消化GL-6a，以Klenow酵素弄鈍末端，以 > ^辽消化，以T4聚合酶弄鈍末端，並再度連接凝膠-分離之載體片段，來建構含有核：y：酸1292-1643的報告者構築體。藉著以Ac_c65I^化GL-6a，以Klenow酵素弄鈍末端，接著以Apal消化，以T4聚合酶弄鈍末端，並再度連接凝膠-分離之載體片段’來建構含有核苷酸1394_1643的報告者構築體。報_告者構築_體的轉移感差_ :根據在實例1 5中描述的方法’將RAW264.7細胞維持在培養基中’並以pGL3-Basic • (1微克）、pAPRl (1微克）或其他報告者構築體其中之一轉移感染。以乙醇（EtOH)(0.1%體積/體積）、2〇(s)_羥基膽固醇（20(S)OH-膽固醇）（ι〇 μΜ)、22(R)_羥基膽固醇 (22(R)OH-膽固醇）（1〇 μΜ)'9-順視黃酸（9-順 RA)(l〇 μΜ) 或20(S)OH-膽固醇和9-順RA (總共20 μΜ)處理經過轉移感染的RAW 264.7細胞24小時。按照在實例15中的描述，測量蟲螢光素酶活性，並以相對的光單位報告。 * 指立置之_突變生咸作用:使用指定位置之突變生成作用’使在上述之1080-1643序列中，相當於序列識別3號之 O:\110\110257.DOC •146· 1304737 核苷酸1480-15 10的脂醇反應要素突變。特定而言，使用 GeneEditor系統（Promega，Madison，MI)，根據製造者的草案，使含有直接重覆-4要素TGACCGatag TAACCT的反應要素突變為 CTGCACatagTAACCT。凝膠-轉移測定:藉著Ohlsson等人，Cell，45 : 35-44(1986)的方法，從RAW 264.7細胞中製備核萃取物。在室溫下，在20 mM HEPES，ρΗ7·9、60 mM KC1、1 mM MgCl2、1 mM DTT、66.6微克/ 毫升聚（dldC)和 10%甘油中，在1微克對LXR α和LXR冷之抗jk清（Santa Cruz Biotechnology,目錄第 SC-1591 號，Santa Cruz，CA)，或對 RXR之抗血清（Santa Cruz Biotechnology，目錄第 SC-774 號，Santa Cruz，CA)的存在或缺乏之下，使相當於LXR反應要素的32P-標示之寡核苷酸（TCGAGTGACCGATAGT AACCTCTCGA ，序列識別56號）及其突變副本 (TCGAGCTGCACATAGTAACCTCTCGA ，序列識別 57 號）(5毫微克）分別與5微克核蛋白質一起培養30分鐘。將蛋白質-DNA.複合物應用在4%無-變性聚丙烯醯胺凝膠上，在 0.5X TBE緩衝溶液中以150伏特跑1.5小時。藉著脫水凝膠的放射自顯術，來檢測該蛋白質-DNA複合物。結果:利用分別含有相當於序列識別3號之核苷酸1 -1643 (也就是 pAPRl)、1-1532、1080-1643、1181-1643、 1292-1643或1394-1643的5’側面區之個別報告者構築體來進行的轉移感染，均產生相同的結果。與EtOH對照組相比較，所有個別的構築體，在20(S)OH-膽固醇或22(R)OH- O:\110M10257.DOC -147- 1304737 膽固醇的存在下，在蟲螢光素酶報告者活性上均產生3至 4-倍的增加。再者，所有個別的構築體，在9_順尺八的存在下，在蟲螢光素酶報告者活性上均產生8至1〇_倍的增加。此外，以任何構築體進行的轉移感染，在氧基脂醇配體 (20(S)OH-膽固醇或22(R)〇H-膽固醇兩者）和類視黃醛（9_順 RA) —起的存在下，與Et〇H對照組相比較，在蟲螢光素酶的活性上，均產生25至50-倍的增加，表示協同的交互作用。證實每個上述的構築體’對受試配體反映出可相比擬的蟲螢光素酶活性之含量，表示即使較短的5，側面序列，仍含有月曰醇和類視黃搭的轉錄調節序列。特定而言，這些結果證實脂醇和類視黃醛的轉錄調節序列位在相當於序列識別3號之核甞酸1394-1532的5'側面區中。可藉著蟲螢光素酶活性測定，使用含有相當於序列識別 3號之核智:酸1 〇8〇_ 1643的野外型序列之構築體，以及含有相當於序列識別3號之核智:酸1 〇80-1643的突變序列之報告者構築體，其中按照上述使在核苷酸1480-1500處發現的脂醇反應要素突變’來證實這些結果。利用野外型序列的轉移感染’藉著測量蟲螢光素酶活性的增加，在單獨 20(S)OH-膽固醇或9-順RA的存在下產生轉錄反應，並在兩種配體一起存在之下，產生協同的反應。相反的，利用突變序列的轉移感染，在20(S)OH-膽固醇或22(R)OH-膽固醇的存在下，未產生轉錄反應》突變序列的轉移感染，保留了對9-順RA的降低反應，在轉錄活性上產生4至5-倍的增加’而非在野外型序列中觀察到的8至1 〇-倍的增加。突變 O:\110\110257.DOC -148- 1304737 序列的轉移感染亦廢止了在20(S)OH-膽固醇和9-順RA—起存在下’所看到的協同轉錄反應。進一步藉著凝膠_轉移、· 測定，使用脂醇一致序列（核甞酸1480-1510)及其突變的副 • 本來證實這些結果。凝膠-轉移測定顯示從RAW 264.7細胞中分離的核結合蛋白質，與脂醇一致序列結合，同時核蛋白質不與突變的序列結合。此外，在LXR抗血清的存在下’將核蛋白質與野外型脂醇一致序列一起培養時，導致鲁超轉移之（supershifted)複合物（也就是抗體_蛋白質-DNA複合物）的形成，確認該序列就是與核受體Lxr結合的脂醇反應要素。相反的，在RXR抗血清的存在下，將核蛋白質與野外型知醇反應要素一起培養，並不會導致超轉移複合物的开y成，代表RXR不與該序列結合。這些結果顯示該突變破壞了核蛋白質與一致序列的結合，亦廢止LXR配體的轉錄反應，並減少RXR配體的反應。此外，在LXR和rxr 抗血清的存在下，進行核的結合研究，證實在核芬酸 • M8(M510處發現的一致序列為LXR反應要素。該要素亦調節9-順RA的部份反應。所有在本文中提及的參考文獻，包括專利和出版物，均將其完整内容合併於此以作為參考。在描述本發明的同時，特別強調本發明的較佳觀點，熟諳此藝者將可輕易地 .知曉可使用較佳具體實施例的變化，並企圖以與在本文中特別描述的不同的方式來實行本發明。因此，本發明包括 '-所有包含在由下列申請專利範圍定義之本發明的精神及範圍内的修改。 O:\110\110257.DOC 149 (8) 1304737 【圖式簡單說明】圖1A-D為顯示從正常的纖維母細胞（ία，C)和得自湯吉爾症患者之纖維母細胞（1B，D)中，對照組膽固醇的排出，以及在HDL和脫辅基A-Ι的存在下，膽固醇排出之結果的圖解說明。空心的圓形代表得自未與HDL或脫輔基a- I接觸之細胞的膽固醇排出，實心的圓形代表得自與HDL接觸之細胞的膽固醇排出，而實心的菱形代表得自與脫辅基A_ I接觸之細胞的膽固醇排出；圖2為基因表現微陣列分析的圖解說明，顯示將在得自湯吉爾症患者（TD1)之細胞中發現的基因表現，與在正常細胞中發現的基因表現做比較，藉以使總共58,8〇〇個的人類cDNAs ’與從以cAMP-處理之TD1細胞eDNA的mRNA來製傷的Cdna (以Cy3染料標示），和從以cAMP-處理之正常細胞的mRNA來製備的cDNA (以Cy5染料標示）雜交；圖3為顯示重組表現載體pCEPhABCl之限制舆圖的圖解說明，其含有人類ABC 1基因的打開密碼；圖4為人類ABC1之基因結構的圖解說明，顯示在公告的人類ABC1胺基酸序列（GenBank，登錄編號#AJ012376)與目前揭示和提出申請的人類ABC1胺基酸序列（"CVT")之間的比較’後者在N-終端具有60個額外的胺基酸；圖5為顯示ABC 1運送抑制劑4,4-二異硫代氰基芪-2,2’-二磺酸（DIDS)和硫溴鄰苯二甲酸（BSP)對脫辅基A- I -調節的膽固醇排出之抑制影響的圖解說明，其中空心的圓形代表在BSP的存在下，脫輔基A- I -調節的膽固醇，而實心的圓

O:\110\110257.DOC 1304737 形代表在DIDS的存在下，脫辅基n -調節的膽固醇；圖6為顯示反義ABC1募核苷酸對脫輔基-調節的膽固醇排出之抑制影響的圖解說明’顯示在未與反義寡核苷酸一起培養之細胞中，脫輔基A_；[_調節的膽固醇排出，在與30 μΜ召-血球蛋白反義寡核甞酸接觸的細胞中，脫輔基A- I -調節的膽固醇排出，以及在與3〇 A]BC1反義寡核甞酸接觸的細胞中，脫輔基A_ I -調節的膽固醇排出；圖7為使用以人類ABC1的表現質體（pCEPhABCl)，穩定轉移感染的RAW 264.7老鼠巨噬細胞，證實經由ABC 1基因的過度表現而引起脫輔基A- I -調節的膽固醇排出之刺激作用的圖解說明，顯示在對照組的親代細胞（無 pCEPhABCl)中，脫辅基a- I -調節之膽固醇排出，以及在以pCEPhABCl轉移感染的純種系之細胞（L3、L5、L6)中，脫輔基A-Ι-調節之膽固醇排出；圖8為反轉錄聚合酶連鎖反應（rT_pcr)分析的圖解說明’顯示在正常細胞和得自已經與白蛋白接觸（實心長條）、與8-溴-cAMP接觸（空心長條）、裝滿-膽固醇（陰影長條），或裝滿-膽固醇並接著與脫輔基八_1接觸（晝影線的長條）之湯吉爾症患者（TD1和TD2)的細胞中，ABC1基因表現的程度；圖9為RT-PCR分析之結果的圖解說明，顯示在與乙醇 (0.1%體積/體積）、9-順視黃酸（9-順RA; 10 μΜ)、20(S)羥基膽固醇（20(S)-OH; 10 μΜ)或 9-順 RA和 20(S)-OH (各 10 O:\ilO\110257.DOC 151 - 1304737 μΜ)接觸之RAW 264.7細胞中，abci基因表現的程度. 圖10顯示免疫沉澱分析的結果，指出在正常的纖維母細胞（NL1，10A)和得自湯吉爾症患者之纖維母細胞 10B)中’在無添加物（對照組）、溴_eAMP(i mM)、膽固醇（30微克/毫升）或膽固醇和8-溴-CAMP (分別為1 111%和3〇微克/毫升）的存在下，所發現之細胞-表面ABC1蛋白質的含量；圖11為顯示重組表現載體pARP 1之限制興圖的圖解說明，其含有位在蟲螢光素酶報告者基因之打開密碼上游的 ABC1基因的5'侧面區；圖12為顯示在EtOH(對照組）、20(S)-OH (10 mM)、9-順 RA (10 μΜ)或20(S)-OH和9-順RA (分別為1〇 μΜ)兩者的存在下，包含在以pAPRl轉移感染的RAW 264.7細胞中，被誘導的蟲螢光素酶報告者基因之表現程度的圖解說明；圖13為ABC1基因之5,侧面區的圖解說明。

O:\110\110257.DOC 152 CS) 1304737 序列表 <110> Lawn, Richard M.

Wade, Davxd Garvin. Michael 使用AIP.结合卡送要白質咖㈣加膽团碎排出並升高刚^的組合物及方法

<120> 33,39S-B <14〇> cX4l>

<15〇> US 60/140.264 ^15i> 1399-06-18 •a：IS〇> US 60/153,872 <15X> 1999-09-14 <15Q> US 6C/X6q#S73 <15a> 19$9-11-X9 <.X60^- S7 <17〇> Pacencln Ver. 2.0 <2lo> 1 <211> 3.0442 <.21.2> DNA <=213> 人頦 <400» 1

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acaacgacca cccccgggaa ca^cagrcgg acg^cccaga cc.ggacagcc caagac&ccg 1680 ^99C9Cttrc ggccaagcac ccagaggacg tccagcccsLg taacggccct gcgeacaccc 1740 ggagagaagc ctccaacgag acnaaccagg caacccggac cacaccccgc cccacggagc X800 gcgccaaccc gaacaagcca gaacccacag caacagaagc ccggcccacc aacaagccca I860 tggagccgci: ggacgagagg aagccctggg ccggcaccgc gctcaccgga accacrccag 1920 gcagcaccga gccgccccac cangccaagc acaagacccg aacggacacc gacaargcgg 1500 agaggacaaa caaaaccaag gacgggtacc gggaccccgg cccccgagcc gaccccrccg 2040 aggacatgcg gcacgcccgg 99999ccc〇9 cccaicccgca gsatgcggtg gagcaggc^a 2X00 tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaaccggtgt ccatatgcaa cagatgcccc 2l€〇 atcccugcta cgctgacgac atccctccgc gggcgatgag ccggccaatg ccccccttca 2220 cgacgccggc ccggaccnac ccagcggccg cgancatcaa gggcaccgcg natgagaagg 2280 aggcacggcc gaaagagacc acgcggacca cgggcccgga caacagcata ccccggccra 2340 gccggrrcac tagcagcctc nrcccccccc ctgcgagcgc cggcctgcca gcggccaccc 2400 cgaagccagg aaacccgccg ccccacagcg accccagcgc 99cgcccgcc cccctgcccg 2460 cgcccgccgt ggcgacaacc ccgcagcgcc ccccgactag eacacccctc cccagagcca 2520 acccggcagc agcccgcggg ggcaccaccc accccacgcc gcacccgccc cacgtcccgc 2S80 gcgcggcatg gcaggaccac gcgggcccca cacccaagac ccucgccagc ccgccgcccc 2640 ccgcggcccc cgggnncggc ngcgagcacc ctgcccctcc cgaggagcag ggcaccggag 2700 cgcagcggga caacecgccc gagagtcccg cagaggaaga cggctccaac cccaccaccc 2760 cgacccccac gacgccgccc gacacccccc xiccacggggc gacgacccgg cacaccgagg 2320 ccgccctccc aggccagcac ggaaccccca ggccccggca ctictccccgc accaagtccc 28 80 accggc^cgg cgaggaaagi; gatigagaag^ gccaccctgg ccccaaccag aagagaacgn 2940 cagaaacccg catggaggag gaacccaccc acttgaagcc gggcgngtcc atccagaacc 3000. cggcaaaagt ctaccgagac g9gangaagg cggccgccga cggcccggca ctgaaccccc 3060 acgagggcca gaccaccccc ctcctgggcc acaatggagc ggggaagacg accaccacgc 3120

caacccrgac cggsccgtcc cccccsaccc cgggcaccgc ctacaccccg ggaaaagaca 31SO cccgccccga gacgagcacc atccggcaga acccgggggc ctgcccccag caca.acgt:gc 3240 cgrucgacai: gccgaccgcc gaagaacaca cctggrccca cgcccgcctg aaagggcccc 3300 ccgagaagca cgtgaaggcg gagacggagc agacggcccc ggacgccggc ccgccaccaa 3360 gcaagcrgaa aagcaaaaca agccagctgc caggc^gaac gcagagaaag ccaccrgrgg 3420 ccncggcccn cgccggggga cccaaggccg ccaccccgga cgaacccaca gccggcgcgg 3460

acccctaccc ccgcagggga acargggagc cgccgccgaa acaccgacaa ggccgcacca 35-aO ccac wcrccc cacacjtccac ACggatgaag cggacgccct gggggacagg actigccacca 3豸〇〇 ccccccacgg gaagcugcgc cgcgcgggcc cccccccgtc cccgaagaac cagccgggaa 3560 2- 110257-序列表.doc 1304737

caggccacca cccgaccctg gccaagaaag acgcggaacc cccccccagt· ccccgca^aa acagragrag caccgcgcca cacccgaaaa aggaggacag cgccccccag agcagccccg angcrggccc gggcagcgac cacgagagtg acacgccgac cftccgacgtc tctgctaccc ccaacctcac caggaagcac gcgcctgaag cccggccggc ggaagacaca gggcacgagc rgacccacgc gctgccarar gaagccgcta aggagggagc cctcgcggaa ccccctcacg agacrgarga ccggctccca gacctgggca ttcccagcca cggcacccca gagacgaccc rggaagaaac accccccaag gcggccgaag agagcggggr ggacgctgag accccagacg gcaccctgcc agcaagacga aacaggcggg cccccgggga caagcagagc cgcccccgcc cguccacrga a^acgacgcr gccgacccaa acgacuccga cacagacccd. ^aacccagag agacagaccc gcccagcggg acggacggca aagggcccca ccaggcgaaa ggccggaaac tcacacagca aeagcccgcg gcccccrcgc ggaagagacc gcraaccgcc agacggagcc ggaaaggacc ntccgcccag accgccctgc cagccgcgcn tgcccgcact gcccrtgcgc ccagcccgac cgtgccaccc cccggcaagc accccagcct ggaaccccag ccccggargi: acaacgaaca gracacarrt grcagcaacg acgcccccga ggacacggga acccrggaac ccccaaacgc ccccaccaaa gaccctggcc ccgggacccg ctgtacggaa ggaaacccaa ccccagacac gccccgccag gcaggggagg a&gagcggac caccgcccca gccccccaga ccaccatgga eeccccccag aacggg^acc ggaca^.cgca gaa.cccccca cccgca-ngcc

agcgcagcag cgcccccTicc acaccccgga agacccgggc cacccccrcc cggccaagga tggacaccag ccccccrgaa ctagccarna cagaggcggc caacgiccct caaaac&ccc cccgagacac cccagcagaa cgcacgggcg gcacagccca ccacccccgc agcccgcgcc aaaaccaggc caccccggga cccccaccac agcnaccccc acggcggagg agcggaagcc ccccs99a9^ ccgccaccag tacaccagaa gagaacac9c crggcgagcg accacagtrgg ccgcggcgcc cgacaaaacc acaaagaaaa ntatccggcg gaacgagctt gagccaagaa cagccccgca aaacaacgcc cgccaccaac cggaacuacc ccngacgacc cgccccagcc gcagcccacc gcgcaaccac grcccacgcg grcaaccaca gccggagctg ctcgaccccc aacggccgat cccggcggga cgccccgacc cctgaatgac ccasaacgac cgctgccgac caacggggct agg^gangcc catgs9〇cac ggagccccct ggcgat仁egg &99caacaaa cccggacgaa aagaagatgc caaaacacrg aagacgracg aggcacggcg gccaatgacg gaccgatcrc aaggcgrggc aacgccacr:c gccntcaarc acaccagcgg agccccgccg agcggagcga gccgcccccg cccnccacca ccccccacgc accagcccga cccaccgaca ccacartccc gccccggaaa. cgaaaccccc cagcacagac gaagacgaag accccaga^a aggacccgcg ggaaaaccac ctccccaaca cgcccccagr gcccccccga aaaccgggcc cgca^gcccc cccaccacag cgcccgngrg cagacaccci: ngcagaccac gccccccccc ccaticaaaca ccaacagecc tcaacaacaa

Eccgggccaa atcccccgaa acgcccccgc cacccccgac agcccgccac ccsicaccggr atcrgcccgc acccagcctc accnccccac

Acaagccgaa cfccc99gac9 ggcncgggga ccgccacggc tccrcaccag acgrgaggcg ccaaggagcc cgggcactcc caacccuc&d aaaacagcac tcgatgccac gag^agcccc ccgcgaagra craeagcca-c gcanggaccc ccccccaggg ccaggacccg agccaaaagc gggcgccagr aacgaagaaa gggaagaccx: gggccggcar cctgcaaaag cctcaccaag gcccacccgc ccaggngcgg ccaccggccc caccaccacc gctagccccc ccccgcgcrc cggcaccaac caac&cc&ac agggcccacc gaaccgcccc cgcggaaggg gcccagacct ggaaagacag ga.cgfta.9aca ccctggcgag gatgctaaca cccatcaaac cacagagcug agagaaagaa C93agaaaaa ggccccgacc caaagcccgg gcagg9999c acaggaagaa ccaaagaaca aa.cacccQa.g cacccaaagc acgacaggac gcaaccagcc ggagagaacc cagcagcccc gccacctccg gccagcaaag cccaaccccg ctcatccgcc ccacrtccgc aagaccccca ggcagcgcgg 9&cacccc9a gacacggc^st gcgccaccac gcggcgcccc gcaaacgcaa agaacccccg cacagaagga cgccctgggc ggagacacca arccacgaag ctgaccgcga gtcggcaagg cargccggca ggcgggccnc cggctctcgc 3720 3760 3840 3900 3960 4020 4030 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4^80 4740 4800 4860 4520 4980 S〇4〇 5100 5160 5220 52&0 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 S820 58e〇 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6260 5420 〇480 6540 110257-序列表.doc d

1304737 ggaaccstgc ccraagcgcc a9c$ccceica tcncacagca cggaagaang cgaagccccc rgcaccagga cgscaaccac ggtcaacgga aggctcaggc gccccggcag cgcccagcac ctaaaaaaca ggcccggaga cggccataca atagcrgrac gaacagcagg gcccaacccg gacccgaagc ccgcccagga cccccccgga ctcgcarccc ccggaagxign cccaaaagag aaacaccgga acaugctaca acaccagccr ccaccctcac cacccccccc ggccaggata cccagcaccc ccccccagag caaaaagcga ccccacacag aagaccactic cgcttctcag acaacactcg accaagcatc tgtgaaccti: gccaaggacc aaagcgacgd. c.gaccact:ta asiagaccccc caccacacaa aaaccagaca gcagcggacg ccgcagcccc cacanccntc ccacaggatg agaaagcgaa agaaagccac gcacgaagaa tcctgcncac acggggcggc cgaaagcaaa gaggaaccag acttcccccc gcaccacgcg aagcgrcgcg gagaaaagag ccagaagccg acgrgggaag aagcaaaccg gacactgrac cgacaccacc caacgcaacg caacccaacg caacgaaaac aaaaccccac cacaggggca gcgcccccgc agcccacgcc ccgcacggcc cccaagcgaa agacccgaac ccagcctccc acccacaccc atgtgaaaci: ccactatgga acccaacgga catacgggtc cgaacccaca cccccmcTit -cccccgcrc ccgc9carcc ccaccggggc cgcaacaaca atrccaccaag caaccacggc cagcgaccac cgaccaaaac caaaaggcaa c^cacacccr cacccaccaa gccacgccac gcccaggaga ccggcccccc ggcgacacac ccattgccgg caacgagtgc accagagcca ccagcgccaa gccccccaga aagcctgaag caccatiggcg cgccacgccc acccccgcga aagccgcccc gcccagagcc caccaacacc gaacaccagc cgacagaacg gcgccacgcg cggccaacar cccsctccga ccccctctga caagctgncc cggcggcagc aacacgcaac aaaaAcgcgg gcgrcrccag gcAcgggaaa cctggcccca ccgctacatc gccccacgcc ccgagccacg ggcccacagg gtcaccccca cgagaccctc aaacacaccc agaccccggc aagaggcaaa gaaccaacag ccaaaccgcc ggggccgcaa gccgccgaag ccagggcacg ggacraaaga gaccgcgcgr ccaaacccag ggaagcccgr gcccatrcgc cccgacrgcc tgccaacacg gcacaccgca ccccaagacg cccacccgac acaagcgcac catrcticcggc ccccrgaatc a&cccagQaa acgaaa&gAr gg^gccgcac cccgacaaaa anguccgcac cctncaatgc cacccggaac crcaagrccc accagrgacc cccgaatccn cagaacggcc cccccgcaga accccgcggc aragaggagc acggccaccg ccccaccacc cccacccccc cargcaagcc cgcacaccag tcacgaccag cgcccagaaa gcaacgcgac. ggccaggacc ccacgacatc acacccgagc cccccccaga ccancnagga cacccccaac cccaccccac caaccaaaca ccccccgagc gcacgccgna gccgaaagag uacgtacgca cgcanaagac cagagagaco cnaagrctca gtacactccc cgtgccacgc cacccagccc accggrrcac aaacacaggt cgtc-ccgrgg ccgcaggagc ccaccgcaac aacaccgggc agccctcncc crccccccct: aactgcaaca argcaaaagc caagaaagta caagggccac aagcucaaac aacgaacccc tcaacaggga aaacagccag cccgaaaacc cgccgaaaaa cacaactrgc grttacggca cccagcaccr ccaaacaatc ggcttcgcag acacrggaca ccccatnaaa cccgacagrc ncaaaccccc catcccccca accaccagcc aagaaaaaca caaaaacaac aaacacntcc acacggagca cnccccagag ccrcccaacc cagccccacc cdctagcca gcaaacaccc gcaaaaacac cgccccacca acacccactg ccaaccgrcc cgagagsaaa gaaaaacatg agagaactac cgttcgggga agcccaagtg accccccaat accaccacra acccccccca ccucccccaa aacccgaaca rtaacgccaa aggcguaaga ccccagacrc caaaccaarc ucccracact cttcaaacrr acagaacacc acacaaccca ccgccgaaaa agaaaaaaac gactgcccca gaagccaaag ccaacaccga cccraaacac aagcaargaa ggcaracrcc caataaccag cgacacggca tcgccgcaan cCacagcacc cccaaaaaca caga-attrac agaacaaccc ccccccaccc aatacc'c.n'c.c aaaarcaaag ccauggccic ctcacccrac caaaaccgca ccccaacccc tcarracagn aaatccatga gcaacucccc ^ccccggcrc ccccgarccc aaggccacat tccaaaaaat caaaaggcac cgcgaaccac ttcgaagaaa acacgacacc ctaacacaga ttgaaaggac cccttctgaa 6600 6€$Q ¢130 6780 6840 6900 7020 7050 7140 7200 72€0 7320 7380 74^0 7S00 7560 7620 76S0 7740 7800 7860 7920 7$80 8040 8100 8160 8220 82Θ0 8340 8400 8460 S520 85BO 86a0 8700 6760 8Θ20 6880 89-30 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 110257-序列表.doc -4- ⑧ 1304737 gccagaaaca atccctcaca caaccaagca cccaaaacac ccaacaaccg ccagcaca'ac accgaaagca accaccgacc aucccccaaa ggacccc.cgg cc9.aaa.cg9c ccccccacac caagcacccc aaaaccagac aaagaaftaeta cgccgcaaca aaaaaaaaaa aa acccacdg^c ctctcccgcg aaacccctgc gcgcrcaaaa tgaacdcgag ccaccgrcaa aacgccccgc aaagccatrc gagcc&cgcg caccacccac gcaccccccc cccaagatga acgctzgcccg aaaagcccca aaccccgcac caacgagcca aaaaaaaaaa acacdtccccc caaacccaac acaccccccg acccccgccc aaatacagaa aaaacaacca gaccactaaa gccgcgcccc ccatgcaaca cag'aacaacg caaaangccc agccgccccn caacgggacc caacagaccc gtcAAiraacc caaaaraaag aaaaaaaAAa accd&caccg cgcggcagaa cggaacgcac ctgoacccrt: gaaaataara aaccccacac cgccgcacac ccccctgcgg ccgaaccccc caacaccgna racccccaca gtgcccttcg cacccrcgca ccaagttaaa ccacacgaag crgtgacagc aaidaaaaaa cgccaccccc attrccacca ccacgcgagc ^ggacacccc agccccccac taccgcaccc cacccaccca ncgnacacar cgacaccgag gaaacacc0c aggacccagc ctcaccactg ctggaacacc ccatccccac caccaaaacg cctgccaaaa aaaaaaaaaa eaaaacagca accccatacc cccagaaacc agaaaactrca acacaaacgc caccacccgc ccgcacagca caggcaaaac acaccaaccc cccaacrccr rcgcttatcc gcccrcaccc cgagaacrgc caaaaggaaa cacai:cccta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3iSO 9540 9600 9660 $720 9780 9300 99S0 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10442 <210> 2 c211> 2261 <212>蛋白質人類 <400 5- 2

Met Ala Cys Trp Pro Gin Leu Arg Leu Leu Leu Trp Lys Aan Leu Thr 15 10 15

Phc Arg Arg Arg Gin Thr Cve Gin i-eu Leu Leu Glu val Ala Trp Pro 20 25 30

Leu ?he lie ?he Leu lie Leu lie Ser Val Arg Leu ser Tyr Pro Pro 35 今〇 45

Tyr Glu Gin His Glu Cys tCia Phe Pro Asn Lys Ala Men Pro Ser Ala 50 55 60

Gly Thr Leu Pro Trp Val Gin Gly lie lie Ονε Αβη Ala Asn Aan Pro 6S 70 75 30

Cya Phe Arg Tyr Pro Thr Pro Gly Glu Ala Pro Cly Val Val Gly Asn 85 90 95

Phe Asn Lys Ser lie Val Ala Arg Leu Pile SeT Asp Ala Arg Arg Leu 100 105 110

leu Leu Tyr Ser Gin Lys Aj&p Thr Ser Mec ϊ-ya Asp Men Arg Lys Val 115 120 12S 110257-序列表.doc 1304737

Leu Arg Thr Leu Gin Gin He Lye 130 135

Gin Xsp'Phe Leu Val Asp Aan Glu 1^5 150

Asn Leu Ser Leu Pro Lys Ser Thr X£5

Val lie L&xi Hi3 Lys Val Phe Leu 180

Ser Leu Cys Aan Gly ser Lys Ser 195 200

Gin Glu val Ser Glu Leu Cys Gly 210 215 AJla Glu Arg Val Leu Arg Ser Aen 22s 230

Arg Thr Leu .Asn Ser Ti:r Ser Pro 245

Ala Thr Lys Thr teu Leu Hia Sor 2^0

Phe ser Mec Arg Ser Trp Ser Asp 275 2S0

Thr Asn Vai Asn Ser Ser Ser Ser 290 295

Ser Arg lie Val Cys Oly. His Pro 305 310

Ser Leu Asn Trp Tyr Gl\i Asp A-cn 32S

Asn Gly Tiir Glu Glu Asp Ala Glu 340 i.ys Ser Ser Ser Asn Leu Lys Leu X40

Thr Phe Ser Gly Phe Leu Tyx His 155 160

val Asp Lys Met Leu Arg Ala Asp 170 17S

Gin Gly Tyr Gin Leu Hia Leu Thr 185 i$o

Glu Glu Mer lie Cln Leu Gly λ^ρ 205

Leu Pro Lys Glu Lys Leu Ala Ala 220

Mec Asp He Leu Lys Pro lie Leu 235 240

Phe Pro Ser Lya Glu Leu Ala Clu 250 255 L*au Gly Thr Leu Ala Gin Glu "Leu 26S 270

Met Arg Gin Glu Val Men Phe Leu 2B5

Ser Thr Gin Xl® Tyr- Gin Ala Val 300

Glu Gly Gly Gly Leu Lys Xle Lys 31S 320

Aen Tyr Lys Ala Lea Phe Gly Gly 330 335

Tlxr Phe Tyr Asp Asn 5er Thr TJir 3^5 350

Pro Tyr Cys Asn Asp Ueu Mec Lys AsrT Leu 61ii Ser Ser Pro Leu Ser 3SS 360 365

Arg lie 11= Trp Lys Ala Leu Lys Pro Leu Leu val Gly Lys lie Leu 370 375 380 110257-序列表.doc - 6 - fs) 1304737

Tyr Thr Pro Aop thr Pro Ala Tax Arg Gin val Mec Ala Glu Val Asn 3QS 39Q 395 400

Lye Thr'Phe Gin Glu Leu Ala Val Phe His Asp Leu 61¾ Gly Met Trp 405 ^10 415

Glu Glu Ueu Ser Pro Lys lie Trp Thr Phe Met Glu Aan Ser Gin Glu 420 425 430

Mec Aap Leu Axg Mec Leu Leu Asp Ser Arg Asp Asn Asp His Phe 4 35 44 0 445

Trp Glu Gin Glu Leu Asp Gly Leu Asp Trp Thr Ala Gin Asp lie Val 450 455 4^0

Ala Phe Leu Ala Uys His Pro Glu Asp val Gin Ser Ser Asn Gly Ser 465 470 47S 4S0

Val Tyr Thr Trp Arg Glu Ala Phs Asn Glu Thr Aan Gin Ala lie Arg 4fiS 490 495

Thr lie Ser .Arg Phe Met Glu Cys Val Asn Leu Asn Lys Leu Glu Pro 500 505 510

He Ala Thr Glu Val Trp Leu lie' Asn Lys Ser Met Glu Leu Leu Asp 515 520 525 olu Arg Lys Phe Tirp Ala Gly Il6 Phe Thr Gly lie Tha： Pjro Gly 530 535 540

Ser lie Glu Leu Pro His His val Lys Tyr l*ys He Arg Met Asp lie S45 550 555 SS0

Asp Asn Val Glu Arg Thr Asn Lys IIa Lys Asp Gly Tyr Trp. Asp Pro S65 570 575

Gly Pro Arg Ala Asp Pro Pbe Glu Asp Mec Arg Tyr val Trp Qly Gly 580 585 590

Pile Ala Tyr Leu Gin Asp Val val Glu Gin Ala lie lie Arg Val Leu 595 600 605

Thr Gly Thr Glu Lys Lys Thr Gly val Tyr Mec Gin Gin Mec Pro Tyr 6X0 SIS 620

Pro Cye Tyr val Xap Aap He Phe Leu Arg VaX Mac Ser Arg Ser Met 62.5 S30 635 64〇 110257-序列表.doc 1304737

Pro Leu Phe Met Tiir Leu Ala Trp lie Tyr Ser Val Ala.Val 11^ lie £45 650 SSB L/s Gly lie Val Glu Ly6 Glu Ala Arg TLeu Lys Glu Thr Met: Arg G€0 €65 670

lie Men C31y Leu Asp Asn Ser He Lea Trp Phe Ser Trp Phe He Ser $75 680 6QS

Ser Leu lie Pro Lea Leu Val Ser Ala Gly Leu Leu Val Val Xle Leu 690 695 700

Lys Leu <31y Asrx Leu Leu Pro T/r Ser Asp Pro Ser Val Val Phc Val 70S 710 ΊΧ5 720

PHe ΐ-eu sor Val Ala \/al Val Thr lie Leu Gin Cys Phe Leu lie 725 730 735

Ser Thr Leu Phe Ser Arg Ala Aan Z.ea Ala Ala Ala Cys Gly Gly lie 740 745 750 lie Tyr Phfe TUr Leu Tyr Leu Pro Tyr Val Leu Cys Val Ala Trp Gin 755 160 765

Asp Tyr val Cly Pht? *Thr Leu Lys lie Phe Ala Ser Leu Leu Ser Pro 770 775 780 val Ala Phe Gly Phe Gly Cys Glu Tyr Phe Ala Leu Phe Glu Glu Gin 785 790 795 B00

Gly lie C31y Val Gin Trp Asp Acn Leu Phe Glu Ser Pro Val Glu Glu BQS 810 815

A5p Gly Phe Asn Leu Thr Thr Ser Xle Ser Mec Mec I.eu Phe Asp Thr 820 Θ25 830

Phc Leu Tyr Gly Val Mec Thr Trp Tyr lie Glu Ala Val Phs Pro Gly 83S 840 Θ45

Gin Tyr Gly lie Pro Arg Pro xrp Tyr Phc Pro cya χλγ ϊ-ys s©r Tyr 850 855 8£0

Trp Phe Gly Glu Glu ser Asp Glu Lys Ser His Pro Gl/ Ser Asa Gin ess 870 - 875 BBO

Lys Arg Mec S«r Glu lie Cys Mec Glu Glu Glu Pro Thr His Leu Lys 8&5 890 895 110257-序列表.doc 1304737

Leu Gly Vai Ser lie Gin Asn Leu Val Lys Val Tyr Arg Aep Gly Met 900 905 510

Lya Val" Ala vai Asp Gly Leu Ala Leu hsn PUe Tyr Glu Gly Gin lie 915 920 525

Thr Ser Phe L6U Gly His Asn Gly Ala Gly Lys Ttir Thr Thar Mec Sesr 930 93S ?40

He Leu Thr Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Thr Ala Tyr He Leu 94S θ50 955 960

Gly Lya Asp Xl6 Axrg Sex Glu Mec Ser τϊιγ II© AX9 Gin Asn Leu Gly 965 970 975

Val Cys Pro Gin His Asn val Lea Phi Asp Mat Lau Thr val Glu Glu 980 585 990 Ηαβ lie Trp Phe Tyr Ala Arg Leu Lys Gly leu Ser Olu Lys His Val S9S 1000 1005

Lys Ala Glu.Mec Glu G2n MfcC Ala Leu Asp val Gly Lau Pro Ser Ser 1010 1015 1020

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Leu Ser Val Ala Leu Ala Phe val Gly Gly Ser Lys val Val He Leu 1045 1050 1055

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cgcccagccc agcaacggcc ccgugcacac gcunccaacg agaccaacca IdOO ggcaacccgg accacacccc gccccacgga gcgcgccaac ccgaacaagc ragaacccac 1360 agcaacagaa gcccggccca cc^acaastc cai:ggagccg ccggacgaga ggaagccccg 192 0 ggctggcact gcgctcactg gaaccacccc aggcagcacc gagctgcccc atcacgccaa 1930 gcacaagatc cgaacggaca ttgacaatgc ggagaggaca aacaaaatca aggacgggra 2040 ccggcacccc ggcccccgag ccgacccccc tgaggacacg cggcacgccc gg99gggcct 2100 cgcccacccg cgggatgcgg cggagcaggc aaccaccagg gcgccgacgg gcaccgagaa 21S0 gaaaacc99t: scccatargc aacagacgcc ccacccccgc cacgctgacg acarcrtcct 2220 gcgggrgaug agccggccaa cgcccccccr cacgacgccg gcecggatri： acccagcggc 2280 cgcgaccacc aagggcaccg cgnacgagaa ggaggcacgg ccgaaagaga ccatgcggat: 2340 cacgggcccg gacaacagca caccccggtc cagctggcuc accagcagcc Ccaccccccc 2400 tccrgngagc gccggcccgc cagtggrcac cccgaagtca ggaaaccngc cgccctaca9 2450 cgaccccagc gcggcgcctg cctccccgrc cgcgtccgcc gtggcgacaa ccctgcagcg 2520 ctccccgacc agcacacrcc cccccagagc caacciiggca gcagcccgcg ggggcaccat 2580 ccaccrcacg ccgracccgc cctacgtcct gcgcgcggca cggcaggacr acgcgggccc 2640' cacacccaag acctccgcca gcccgccgcc ccccgcggcc cccgggcccg gccgtgagca 2700 cttcaccccc rccgaggagc agggcarcgg agcgcagcgg gacaacccgc ccgagagccc 2760 cgcggaggaa gacggcccca atcccaccac cccgatcccc acgacgccgt ccgacacccc 2820 cccccatggg grgacgacct ggcacattga ggctgcccct; ccaggccagc acggaacrcc 28日0 caggccctgg canrcccctt gcaccaagrc ccaccggrcc ggcgaggaaa gcgacgagaa 2940 gagccacccc ggccccaacc agaagagasic gccagaaacc cgcacggagg aggaacccac 3000 ccactcgaeg ctgggcgtgc ccacccagaa cccggnaaaa gcccaccgag acgggacgaa 3060 ggcggctgcc gacggcccgg caccgaatcc tcacgagggc cagaccaccc cccccccggg 3120 ccacaargoa gcggS9aaga cgaccaccac gtcaaccctg accgggccgc rccccccgae 3180 ctcgggcacc gcccacaccc cgggaaaaga carccgctcc gagangagca ccacccggca 3240 18- 110257·序列表.doc 1304737 gaacccgggg cacccggccc gcagacggcc Qccaggtgga cgccaccccg Sccgctgecg agc^gacgcc cccccccccg agacguggaa aaaggaggac cgacacgccg agcccggccg caaggaggga cacucctagc agagagcggg ggccc ccggg aaacgacccx: caaagggccc gcggaagaga gccagcrgtg graccccagc cgacgccccr ccccgggacc ggaagagcgg ctggacaacg gccgcccgcg cgcagacacc cgcgcagacc cggccucccc cgccaccaaa ccccaacagc gcccaacaac cccccgggcc ccaccccccg ggacgccccc cgcacccccg gaagcccgcc cgccacaccg caacccgccc gcacccagcc gaacccctcc caacaagccg ccgcccggga aaggctitiggg ccrcgccacg aucccccarc agacgcgagg aaccaaggag gcccgccccc racQcccgcc ccggacgrcg acgcagagaa g&cgauccca aaacaccgac ccgggggaca tccccgaaga ccccccctca agcgcccccc accaccgacg gcggaagaca gccctcgcgg cacggcaccc gcggatgccg gacaagcaga gacaragacc cacca^gcga ccgccaatcg ccngrccgca ccggaacccc gaggacacgg cgccgcacgg accactgccc cagaaccccc cgccccccag ccccaggacc aragccaaaa ccgggcgcca caaacgaaga cc939aaSau aagggccggc aacccgcaaa aaccccacca gcgcccatcc acccaggagc acccaccggc 9cca&caT：ca gugccagccc tcccccgcgc actQ9caxca aacaacacca cgagggcuca gagaaccgcc gccgrggaag aggcccagac cgggaaagac ccgacgaaga agcacaacgc cgaaagggcc gcrcgccacc agccacccgc cagccggcgt aaggccgcac ggactgccac accagccggg gcccccgcag agagcagccc nccctgccac nagggcatga aaccccccca cagagacgac agacctcaga gccgccctcg caga&cccas aaggctggaa ccagacggag rcgcccccg-c agccccggac gaaccccgga a&ggaaaccc cagcccccca caccrgcacg gggcaggggg cgacaggaag gcrraaagaa gcaacaccca aacacccaaa cco.i：9acag9 acgcaaccag agggagagaa agcagcagcc gcgccacccc gggccagcaa cccccaacnc cccccacccg tccraccccc ccaagatccc ac9gcag〇9c acgacacccc ccgacacggc tcgcgtcacc 999cggrgtt: ccgcaaatgc cacacagaag gccgrtcgac ccccgagaag aagcaagccg

Sgccctggcc ggacccccac caccaccccc caccccccac aacaggctac aaacagcagc tgacgctggc ctccaacccc gccgacccac tgagacrgac cccggaagaa cggcacccng cccgcccacc agagac^gac acccacacag ccggaaagga gcccagcccg gcacaacgaa acccccaaac aatcccagac gaccaccacg ccagrgcagc gctgcccccc aaacaccccg caagacctrgg agcacccccr gccs9ccaag accggacacc cccccccccg ccccagccac cccag&ggtg cgcaacgccc ascaaaacac cgcccgggac ctcccagcag gccgcacggg cagcacagcc ggccaccrcc gaagcccgcg gaaaaaccag accaccccgg cccccccaTic aaagccaccc rganggcgga gaagcggaag acgccgactg cacgtgaagg aaaagcaaaa tccgtcgggg ccccgcaggg cccacacacc gggaagccgc cacctgaccc agcaccgcgc ccgggcagcg arcaggaagc gcgccgccac gaccggcccc acacccccca cc&cfcaagac gaagacgacg tcgcccagcg caacagcccg tcccccgccc accgcgccac cagcacacac gcccccacca acgccccgcc gacccccccc agcgacaaaa ccacaaagaa gactacccgg gcgaacgagx: gacagctccg agaaacaarg aacgccacca cac99a.&rt:& gccctzsacga ttcgccccag crgcagcrca acgcgcaatt aagtcccacg cggrcaacca cacgcggcgc gcgccggagc tcctcgaccc gcaacggccg gactcggcgg accgccccga cccctgaaig ggccagaacg ccrgcrgTicg ccgaagaaca c^ga^acgga caagccagcc gaccraaggc gaacacggga acacggacga

Sccgrgtagg tiggccaagaa cacacccgaa accacgagag acgcgcccga acgaagcrgc cagacctggg aggcggccga gaaacaggcg ctgccgatcc ^gacggacgg tggccccccT： agaccgcccc cccccggeaa ccgccagcaa aagaccccgg aggcagggga agaacgggaa ccaagaagac aacaaaacac cgaagac9ra ccaggcacgg aagccaatga cagaccgacc rcaaggcgcg acaacgccac ccgcccccaa ccacaccagc ccagccccgt tcagrggagt acgttgcccc cgccctrccac caccccncac ccaccagcgn cgtccaccga ccccacaccc augccccgga gacgaaaccc tccagcacag

argaagacgA acaccctaga acaggarteg 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3^20 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4360 4440 4500 4560 4〇20 4680 4740 4B00 48S0 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 S340. 5400 5460 5520 5560 5640 5700 5760 5820 5880 5940 €000 6060 6X20 19 110257-序列表.doc 1304737

C9t999cacc ccccctggcg agcgccctgg gctcccggga H^caacgggg ccggaaa^rc 6XS0 acca&ccccc aagacgntaa caggagacac caccgccacc agaggagacg ctccccccaa 6240 caaaaacagt accccatcaa acacccacga agcacaccag aacacgggcr accgccccca 63〇0 gtccgacgcc accacagagc cgccgaccgg gagagaacac gcggagttcc ctgccccccc 6360 gagaggagcc ccagagaaag aagtcggcaa ggccggtgag cgggcgatcc ggaaaccggg 6420 cpccgcgaag cacggagaaa aacacgccgg caaccacagc g^aggcaaca aacgcaagct 6480 ccccacagcc acggccccga ccggcgggcc ccccgcggcg cttccggatg aacccaccac 6540 agscacggac cccaaagccc ggcggtcc：：!： gcggaatcgc gccccaagcg ccgccaagga 6600 ggggagacca gcagcgcnca caccccacag tacggaagaa cgcgaagccc cccgcactrag €660 gacggcaatrc atggccaacg gaaggcccag gcgccccggc agcgcccagc accraaaaaa 6720 caggctt^ga 9&T：93tcat:a caatagtcgc acgaacagca gggcccaacc cggacctgaa 6780 gcccgcccag gaccccccrg gacctgcacc ccccggaagt gcccraaaag agaaacaccg 6840 9aacacgcta caacaccagc ccccaccccc accacccccc ccggccagga tacccagcac £900 ccccccccag agcaaaaagc gaccccacac agaagaccac cccgrtcccc agacaacacc 6960 itgaccaagca cccgcgaacr ccgccaagga ccaaagcgac gatgaccacc taaaagacct 7020 cccaccacac aaaaaccaga cagcagcgga cgtcgcagtt cccacacccc rtccacagga 7080 cgagaaagrg aaa.3aaagcc acgtiacgaag aacccngccc acacggggcg gcrgaaagca 71^0 aaoaggaacc agacttcccc ccgcaccac9 cgaagcgtcg cggagaaaaQ agccagaagc 7200 cgargrggga agaagraaac cggacacrgr accgauacca cccaacgcaa cgcaacccaa 7260 cgcaacgaaa acaaaacccc accacagggg cagcgccccc gtagcccacg ccccgcacgg 7320 cccccaagcg aaagacccga accragrtcc ccacccacac ctatgcgaaa ccccaccacg 7380 gaacccaatg gacacacggg ccrgaaccca eaecccrccc cccrttncgr tcccgcgcac 7440 ccccaccsag grcgeaacaa taacccacca agcaatcacg gccagcgatc accgaccaaa 7500 accaaaaggc aatgcacacc cccacccacc aagccacgcc acgcccagga gaccggcccc 75〇0 ccggcgacac acccaccgcc ggcaacgagc gcgccagagc caccagcgcc aagcccccca 7〇20 gaaagctcga agcaccacgg cgcgncacgc ccacccccgc gaaagctgct: ccgcccagag 76Θ0 uccaccaaca ccgaacacca gttgacagaa tggcgccacg cgrggctaac accccgccct 7740 gacrcccccc gacaagccgc ccrg^cggca gtaacargca acaaaaacgc gggrgrcccc 7800 aggcacggga aacccggccc caccg-ccaca ccgccccacg ccccgagcca cgggcccaca 78ί>〇 gggccacccc cacgagaczc ccaaanacac ctagaccccg gtaag&ggca a^saaccaac 7920 agccaaactg ctggggccgc aagctgcrga agccagggca tgggactaaa gagatcgcgc 79B0 gcccaaaccc agggaagccc gcgcccaccc sccccgaccg cergccaaca cggcacaccg β〇4〇 caccccaaga cgccuacccg acacaagcgc accacccccg gccccccgaa ccaacccaga SX00 aaargaaaag acggagccgc accccgacaa aaacgtrcgc actccccaac gccacctzgga 8160 accccaagcc ccaccagcga ccccrgaacc cccagaacgg cccccccgca gaaccccstg Θ220 gcacagagsa gcacggccac cgccccacca ctcccacccc cccacgcaag ctngcacauc S28Q aeccacgacc. agcgcccaga aagcaacgcg acggccagga cctcacgaca ccacacccga 8340 gccccctcca gaccacccag gacaccctca acctcacccc atcaaccaaa caccctccga 8400 gcgcacgccg cagcrgaaag agcacgtacs cacgcacaag accagagaga caccaagccc 8460 cagcacacxc cccgcgccac gccactcagc rcaccggccn acaaacacag gccgccccgc 8520 ggrcgcaggii gcccaccgca acaacaccgg gcagcccrcc tccccccccc tceaccgcaa 6580 caacgcaaaa gccaagaaag cacaagggcc acaagcccats acaacga^cc ccrcaacagg 8β4〇 gaaaacagct: agcctgaaaa cccgccgaaa aacacaactc gcgctcacgg cacccagcac 8700 ccccaaacaa ccggccccgc agacatcgga caccccacca aac：ccgaca9 ccccaaatcc B760 ctcacccctc caaccacrag ucaagaaaaa cataaaaaca acaaacaccc ccacacggag 8S20 cacrccccag agcx:cccraa cccagcccra ctcccccagr cagcaaacac ccgcaaaa&c S880 acccccccac caacacccac tgnraaccgc cccgagagaa aagaaaaaca cgagagaaec 6940 actgcccggy gaagcncaag tgarcctcca acaccaccac caacctcccc cacccccccc 9000 110257-序列表.doc -20- (S: 1304737 aaaacccgaa raccaacgcc aaagscgcaa gaccccagac cccaaarcaa tccccccata 90S0 ctrccua^ac craeagaaca cracacaacc caccgctgaa aaagaaaaaa acgaccgccc 9120 cagaagccaa agccaaracc gaccccaaat ataagcaacg aaggcacacc cccaacaacc 9180 agcgacangg caccgccgca accracagca cctccaaaaa cacagaaczc acagaacaac 9240 cccrccccac ccaacaccrc ccaaaaccaa agrracggcc cccccacccc accaaaaccg 9300 caccccaacc cccca.tcaca gcaaacccac gagcaacccc craccccggc ccccccgacc 92€ύ tcaag^ccac. axcttaaaaa accaaaas^c accgcg总act accccgaaga aaacacgaca 9420 cctcaacaca gaccg^aagg accccccctg aa^ccagaaa caacccarag cracacarcc 9480 ccaccaacac cgcgcraccc cccaaaatag caactrccta cacccccccg tgcaaaccca 9540 utcgcggcag aaactcccac caacccraca cccaaccaag caaaaccccc gtanacLccc 9600 tgcggaacgt acccacgcga gncccragaaa ctcccaaaac acgcgtccaa aaacccctgc cxccgc3cci: ccgggacacc ccagaaaacc caccaacaac cgcga&cacg agaaacacag 972 0 aagaaaacaa caagcccccn acacacaaac gcccagcaca acccattgrci: aaaaaacaac 978 0 caaaccccac accactgcac cccaccatcc gcaccgaaag caaacgccrr grgaccacca 9340

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Mec Ala Cys Trp Pro Gin Leu Arg Leu Leu Leu Trp Lys Asn. Leu Thr 1 5 ao IS .

Phc Arg Ar〇 Arg Gin Tiir Cya Gin Leu Leu Leu Glu Val Ala Txp Pro 20 25 30

Leu Phe He -Phe Leu lie Leu lie ser val Arg Leu ser xyr Pro pro 35 40 45

Tyr Glu Glr. His Glu Cys Hie Phe pro Asn Lys Ala Mec Pro Ser Ala 50 5S 60

Gly Thr Leu Pro Trp val Gin Gly lie lie Cys A3n Ala Asn Asn Pro 65 70 75 3〇 C^e Piae Arg Tyr Pro Thr Pro Gly Glu Ala Pro Gly val Val Gly Asn 110257-序列表.doc 21 (S) 1304737 6$ 90 95 ·

Phe Asn Lys Ser He Val Ala Arg Lea Phe Ser Aap Ala Arg Arg Leu 100 XOS 110

Leu Leu Tyr Ser Qln Lys Asp Thr Ser Met Lys Aap Mec Arg Lys Val 115 X20 125

Leu Arg Thr Leu Gin Gin lie tys Lya Ser Ser Ser Asn Leu Lys Leu 130 13S 140

Cln Asp Phe Leu Val Asp Asn Qlu Tnr Phe Ser Gly Phe Leu Tyr His

145 ISO XS5 ISO

Asn Leu Ser Leu Pro Lys Ser Thr Val Asp Lys Met Leu Arg Ala Asp 165 170 175 val lie Leu Hie Lys val Phe Leu Gin Cly Tyr Gin Leu Hie Leu Thr 180 185 190

Ser Leu Cys Asa Gly Ser Lys Ser Glu Glu Mec He Gin Leu Gly Asp X95 ^00 . 205

Qln Qlu Val Ser Glu Leu Cys Gly Lau Pro Lys Glu Lys X-su Ala Ala 210 21S 220

Ala Glu Arg Val Leu Arg Ser Asn Met Asp lie Leu Lys Pro He Leu 225 230 235 2i0

Arg Thr L6u Asn Ser Thr Ser Pro Phe Pro Ser Lys Glu Leu λΐ^ Glu 24S 250 255

Ala Thr Lys Thr Leu Leu His Ser Leu Gly Thr Leu Ala Gin Glu Leu 260 265 270

Phe Ser Mcr Arg Ser Trp Ser Aap Mec Arg Gin Glu Val Mec Phe Leu

275 280 2SS

Thr Asn Val Asn Ser Ser Ser Ser Ser Thr Gin lit Tyr Gin Ala val 290 235 300

Ser Arg He Val Cys Gly His Pro Glu Gly Gly Gly Leu Lys lie Lys 30S 310 315 320

Sar Leu Aan Trp Tyr Glu Asp Asn Asn Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Gly 325 330 335

Asn Gly Thr Clu Glu Asp Ala Glu Tnr Phe Tyr Asp'Asn Ser Thr Ttir 22 110257-序列表.d〇c 1304737 340 3^5 350

Pro Tyr Cya Asn Asp Leu Mec Lya Aan Leu Glu Ser Ser Pro Leu Ser 355 360 3^5

Arg lie lie Trp Lys Ala Leu Lys Pro Leu Leu Val Gly Lye lie Leu 370 375 3$0

Tyr Thr Prc Asp Thr Pro Ala Thr 385 350 Uys Thr PHe Gin Glu Leu Ala Val 405 Glu Giu L6u Ser* Pro Lys lie Trp 420 Mec Asp 1-eu Val Arg Met Leu Leu 435 44C

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1304737 3BS 390

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Gin Aan Pro Scr Pro Ala Cya Gin Cya Ser Ser Asp Lys lie Lys I«ys 1460 1465 1470

Mec Lfiu Pro Val Cya Pro Pro Gly Ala Gly Gly Leu Pro ?ro Pro Gla 1^75 1^80 1485

Arg uys Gin Asn Thr Ala Asp lit； L*u Gin Asp Leu Thr Gly Arg Asn X«d0 1495 1500

He Ser Asp Tyr Leu val Lys Thr Tyr Val Oln lie lie A.la Lys Ser 1505 a510 1515 1S20

Leu Lys Aan Lys He Trp Val Aan C3lu Phe Arg Tyr Gly Gly Phe Ser 1S2S 1530 1535

Leu Gly Val Ser Asn Thr Gin Ala Leu Pro Pro Ser Gin Glu Val Xsn 1540 154S X550

Aap Ala lie Lys Gin Mfct Lys tys His Leu Lys Leu Ala Lys Asp Ser XSS5 1565

Ser Ala Asp Arg Phe Leu Asn Ser X-cu Qly Arg Phe Mec Thr Cly Leu 1570 1S75 XSSO

Asp Thr Arg Aen Xsn Val Lys Vai Trp Phe Asn Asn Lys Gly Trp His isas 1590 1595 1600

Ala He Ser Ser Phe Leu Asn Val lie Asn Asn Ala lie I-eu Axg Ala

1605 X$10 ISIS

Asn Leu Gin Lys Gly Glu Asn Pro Ser His Tyr Gly He Thr Ala Phe 1620 1625 1630

Asn His Pro Leu Asn Leu mr Lys Gin Gla Leu Ser Glu Val Ala Leu X635 1640 164S

Mec Tiir Thr Ser Val Asp Val Leu Val Ser lie Cys Val 工le Pile Alsi XSSO 1655 XS6Q

Met： Ser Fhe Val Pro Ala Scr Phe Val Val Phe Leu lie Gin Glu Arg •40- 110257-序列表.doc 1304737 aS65 1570 1S7S 1680

Val Ser Lye Ala Lys His Leu Gin Phe lie Ser Gly Val Lys Pro val 16S5 1650 1695

Il6 Tyr Trp Leu Ser Aan Phe val Trp Asp Mec Cys Aan Tyr Val Val 1*700 1705 1710

Pro Ala Thr Leu Val lie lie lie Phe lie Cys Phe Gin Qln Lya Ser 1715 1720 1725

Tyr Val Ser Ser Thr Asn Leu Pro Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu 1730 1735 1740

Tyr* Gly Trp Ser lie Thr Pro Leu Mec Tyr Pro Ala Ser Pbe Val Phe 1745 1750 1755 1760

Lys lie Pro Ser Ttir Ala Tyr Val val Leu Thr Ser Val Asn Leu Phe 1765 X770 1775 lie Gly lie Αβη Gly Ser Val Ala Thr Pha Val Leu Glu Leu Pile Thr 1780 X785 . 1730

Asp Asn Lys Leu Asn Asn He Asn Asp He teu Lye Ser Val Phe Leu 1795 1800 180S XXc Phe Hxs Pbe Cys I-eu Gly Arg Gly Leu lie Asp Met Val Lya 1810 1815 1820

Asn Qln Ala Met： Ala A5p Ala i-eu Glu Arg Phe Gly Glu Asn Arg Phe Ί.Θ25 1B30 1835 1B40

Val Ser Pro Ueu Ser Trp* Asp Leu Val Gly Arg Asn Leu Pbe Ala Met 1845 1850 1855 A.la Val Glu Gly Val Val Phe Phe Leu lie Thr Val Leu lie Gin Tyr I860 1865 1870

Arg Phe phe lie Arg Pro Arg Pro val λεη Ala Lys Leu Ser Pro Leu 1875 1880 1835

Asn Asp Glu Asp Glu Asp Val Arg Arg Qlu Arg Gin Arg lie Leu Asp 1890 1B95 1500

Cly Gly Gly Gin A3n Asp lie Leu Glu lie Lys Glu Leu Thr Lya lie 1905 1910 191S 1320

Tyr Arg Ar9 i.ys Arg Lys Pro Ala val A=p Arg lie- cys Val aly He -41 - 110257-序列表.doc

1304737 1925 1330 ， 1335

Pro Pro Gly Glu cys Phe Oly i-eu Cly v/al Acn Gly Ala Gly Lys 19a5 1950

5er S<ar Tiir Phe Lys Met Leu Ttir Gly Asp Thr Tftr val Tbr Arg Gly 1955 I960 196S

Asp Ala Ptie· X*eu Asa Lys Asn Ser· lie Leu Ser Asrx lie His Glu Val 1370 1975 1580

His Gin Asn Mec Gly Tyr Cys 9ro Gin Pile Asp Ala lie Thr Qlu Leu 1990 19SS 2000

Leu Thr Gly Arg Clu Kia Phe Phe Ala Leu Leu Arg Gly Val 2005 2010 2015

Pro Glu Lys Glu Val Gly Lys val Gly Olu Trp Ala lie Arg Lys Leu 2020 202S 2030

Gly Leu Val Lys Tyr Gly Glu Lys Tyr Ala Gly Asn. Tyr Ser Gly Gly 2035 2040 2045

Asn Lys Arg Lys i.eu Ser Thr Ala Mec Ala Leu 工le Gly Gly Pro Pr*o 2050 2055 2060 val val ?he Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Mec Asp Pro Lys Ala Arg 2065 2070 2075 2080 «xg Phe Leu Trp Asn Cys Ala Leu ser Val val Lys Glu Gly Arg Ser 20日S 2030 2095

Val Val Lea Thr Ser Ha.3 Ser Her Glu Clu Cys Glu Ala Leu Cys TUr 2X00 2105 2110

Ar-g Men Ala lie Men Val Asn Gly 211S 2120 Gin His Le*u Lys Aaa Arg Phe cly 2130- 2135 He Xla Gly Ser Asn Pro Asp Leu • 2145 2150 Leu Ala Phe Pro Gly Ser Val Leu 2165 Gin Tyr Gin ueu Pro Ser Ser Leu

Arg Phe Arg Cys Leu Gly Ser \7al 2135 Asp Gly Tyr Thr lie Val Val Arg 2140 Lys Pro Val Gin Asp Phe Phe Gly 2155 2X60 Lys Qlu Lys His Arg Asn Met Leu 2170 2175 Scr Ser Leu Ala Arg He Pha Ser 42- 110257-序列表,doc

1304737 21B0 2135 lie Leu Ser OXn Ser Lys Lys Arg Leu Hia He Glu Asp Ser val 2195 2200 2205

Ser Gin Thr Thr Leu Asp Gin Val Pfte val Aan Phe Ala ty〇 2210 2213 2220

Ser A3p Asp Aap Hia Leu Lys Aap Leu Ser Leu Hia L/s Α3Π Qln Thr 2225 2230 2235 22^0

val Val A3p val A.la Val Leu Thv ser Phe Leu Gin Aap Clu Lye Val 2245 2250 2255

Lys Glu Ser Tyr Val 2260 <210> 11 24 <212> DNA <213>人造的序列 <220> c220> <220> ^220> <223>人造序列的説明：ABC1擴大引子

ΐ·5〇ο> II · 24 cctcccacca cacaftaaacc agac <210^ 12 <211> 23 <212> .ΟΝΛ <213>人造的序列 <220> <220> <220> <220> 110257-序列表.doc 43-

231304737

<223> 人造序列的説明：ABC1擴大引子 <400> 12_ gccctccccc accccccatc ccg <210> 13 <211> 22 <2i2> DNA <23·3>人造的序列 a220> <220> <223> Description of Artificial Sequence： ASCI RT-PCR. primer <400> 13 tccccgggrc caggggacca zc <210> 14 <211^ 21 <2Z2> DNA 人造的序列 <22Q> <220> c223> Description of Artificial Sequence： A3CX RT-PCit primer c4 0 0 > 14 caatgcctcc gcggctccgg c 22 21 <210> 15 <211> 40 <2X2> CN*A <213> 人造的序列 <220> <220> <223>人造序歹ij的説明：ABC 1 RT-PCR引子 <β〇0> XG agcc3agci：c caaacacgcc agccgrracc ggaagcggcc 110257-序列表.doc 44· 40 1304737

<210> 16 <2U> 2S <2\2z. DiQA人造的序列 <220> <22〇> <223> 人造序列的説明：ABC1 RT-PCR引子 <400> 16cccccggacc crgggcccac gccag<210^. 17 <211> 23 *：2X2> DNA <213>人造的序列 <220> ^22Q> · <223>人造序列的説明：ABC1 RJ~PCR引子 <400> 17gggagccccc gcggaacccc ccc <210i 18 ^2XX> <212> ONA <213;人造的序列 <220> • . <220> <223>人造序列的説明：ABC1 RT-PCR引子 <^00> 18ac^99ccgac cacrgaaccg caccgcaccg aacagcacca g <^10> 19 IS <.212> DNA *ς 2 13 >人造的序列 -t220> 25 23 41 110257-序列表.doc •45· 1304737 <220> <223：>人造序列的説明：ABCi定序引子 <^00> 19 ccccccgg^g gacaacgaa <210> 20 <2XX> 18 <212> DHA <213>人造的序列 <22Q>

<220> <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 <40Q> 20 agcgacatgc gacaggag <210> 21 18 " <212> DHA c：H3> 人造的序列 <220> <22Q> «223>人造序列的説明：ABC1定序引子 <4〇Q> 21 gauccgga&g gcacscgs <210二 22 <211^ IS <212? Dm <2U>人造的序列 <220> <22〇> 心23>人造序列的説明：ABC1定序引子 <400> 22 110257-序列表.doc 1304737 ccaggcagca ccgagccg <210> 23 011¾ 18 -<2X2> DMA <213。人造的序列 <220> <22Q> <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 c..¾ 〇〇> 23

ggcccggaca acagcaca <2X0> 24. <211> 13 <212> ΟΝΛ 人造的序列 <220> <220> <223> .人造序列的説明：ABC1定序引子 <4 OQ> 24 ggacaacccg ctcgagagc <2\0> 25 c211> xa <2X2> DNA <213>人造的序列 <220^ <220> <223》人造序列的説明：ABC1定序-引子 <%00> 25 aa9&c9acCa ccacgtca. <210=· 26 <211> 18 <212> DNA <213>人造的序列 -47- 110257-序列表.doc 1304737 <220> <220> 人造序列的説明：ABC1定序引子 <^00> 26 acacgggagc cgccgccg <210> 27 <211> 24 <212 ^ DNA <213> 人造的序列 <220> <220>

<223·*•人造序列的説明：ABC1定序弓I子 ^400> 2? gggcacgagc cgacccacgc gccg «210> 28 -ί2ΐα> ia c212> DNA <213>人造的序列 <220> <220> c223> •人造序列的説明：ABC1定序引子 <400> 28 aagagaccge caatcgcc <2X0> 29

之211> IS <212> DNA < 2 13二人造的序列 <220> <220> <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 -48 110257-序列表.doc 18 1304737 <400> 29 agcgacaaaa tcaagaag

<210^ 30 <211> xa <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <220? <223> 人造序列的説明：ABC1定序引子 <400> 30 tggcacgcaa ccagccec ^2Z0> 31 <2ia> 18 <212> DNA <213> 人造的序列 ·· <220> <220> <223> 人造序列的説明：ABC1定序引子 18 <400> 31ccccccacca acctrgccc <210> 32 · <211> 18 <212> DNA <213 >人造的序列 . <220> ' <220^ <223>人造序列的説明：ABCi定序引子 15 <400> 32 cractgct: 18

<210> 33 <211> IB 110257-序列表.doc -49- 1304737 <212> P«A ^213> 人造的序列 c220> - <220> <223>人造序列的説明： ABC1定序引子 ς4〇0> 33 gacgccatca cagagccg <l210> 34 17 <212=· DNA ^213> 人造的序列 <220> <220> <223> 人造序列的説明： ABC1定序引子 <4〇〇> 34 agcgcccagc acccaaa <210p> 35 <211> 18 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <220> <22l> 入造序列的説明： ABC1定序引子 ^^00> 35 18 17 18 caaagcccac aaacacct

<210> 36 c211> 19 <212> DNA 人造的序列〇20> <220^ •50· 110257-序列表.doc 1304737 <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 ..一 > · <400> 36 ctcagggcac aaccccaca <210> 37 <211? IS <212> DNA <213>人造的序列 <22〇>

<220> <223>人造序列的説明：ABCi定序引予 x400> 37 cgaaagccga cgacctcc <210> 38 <211> 19 <212> DCJA · <213>人造的序列 c220> -22〇> <223> Λ造序列的說明：ABC1定序引子 38 cccc-ccacca cgccgacga

ί210> 39 <211> 17 <212> DNA <213>人造的序列 · ^22〇> <22Q> <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 -*4 00> 39 ccccaci:gat gaactgc -51 - 110257-序列表.doc 1304737 a210> 40 <2ll> 18 <2\2> ΟΝλ <213 >人造的序列 c22〇j· <220> <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 c4〇〇p- 40 gcctccccac ccgcccga -2i〇> 41 is <212> DNA ^2132*人造的序列 ^.220> <220> 人造序列的説明：ABC1定序引子 <^00> 41 agg9e9^9tc cgggaccg <21〇> 42 c211> 18 <212ONA <213>人造的序列 <22〇> <22D> · <223>人造序列的説明：ABC1定序引子 • .-»· ' <4〇〇> 42 cagaarcacr tggaccag c21〇> Ί3 <211> 18 <212> DMA dl3>人造的序列 <22Q> -52 110257-序列表.doc 181304737 <220> <233>人造序列的説明：ABC1定/MZ子 <400> 43 caccagaacc gccctrgag <210> 44 <2XX> 19 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <220^

c223>人造序列的説明：ABC1定序引子 <^Q〇s> 19 agctgscccg ccctgcxztc <210二 45 <211> 18 <212> DWA <213>人造的序列 ^220> <22〇> - " 人造序列的説明：ABC1定序引子 <Λ〇0> 4 5

18 cggacacgcc cagctcca <210> 46 <2ll> 18 <212> DNA OI3 >人造的序列 <220> <220> <223，人造序列的説明：ABC1定序引子 -c4〇〇> 4 6 110257-序列表.doc 1304737 αβ cccgccacgc cacacaca <210> 47 <211> 1Θ . ^.212^ DNA <213>人造的序列 <220> <.22Q> c223>人造序列的説明：ABCI定序引子 c4〇〇> 令7 18

cccaccaccc gcagaaag ^210> 43 <2i^> ia ^212> DNA <=213>人造的序列

<22Q> -c220> <223^ 人造序列的説明：ABCl定序引子 . · <4 OOi· 48 cacaccccac gaagcgag <210> 49 <2ll> IB <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> <223> 人造序列的説明：ABCl定序引子 <4〇0> 49 cccagataac gcgggaaa <21〇> 50 <21\> ia <212> DNA <.212=. 人造的序列 18 1Θ 110257-序列表.doc 54- 1304737 <22Q> <220> - 屬 n <223> 人造序列的説明：ABC1定序引子參. <.400> 50 ccaggaccgg ccncagga <210> 51 <211> 21 <212> DWA <213> 人造的序列 <22Q> • ^220> <223> 人造序列的説明：ABC1定序引子 ιβ c4〇 0 > 51 aagcccgagc cggacccccc g <210> 52 <211>

<212> DNA <213："人造的序列 <22〇> q220> <223s人造序列的説明：P·血球蛋白反義寡核苷黢

<!〇0> 52 ccccccacct cagtcacaac ccaca 25

c21〇> 53 <211> 26 <212> DNA 人造的序列 <220> 〜220> <223>人造序列的説明：ABC1反義寡核:y：酸 110257-序列表.doc -55- "S) 1304737 <4〇0> 53 cargccgticc acagggtggg cagcrc

^;2X〇> 54 <2\X> 24 <212> DNA ^213> 人造的序列 <220> <220> <223> 人造序列的説明 :Ρ-肌動蛋白擴大引子 <4 00> 54 ccacccacac cgcgcca iCCC excga <210> 55 ^211> 25 <212> DNA <213^ 人造的序列 <220二 <220> <222> 人造序列的説明：β-肌動蛋白擴大引子 •s.4 0 0 > 55 cagcggaacc gcccactgcc aaugg <21〇> 56 <21X> 26 <212> DNA <2X3> 人造的序列 <.220> <22Q> <223> 人造序列的説明 :脂醇反應要素寡核站酸 00 > 56 ccgagcgacc gacagtaacc ccccga <210? S7 2S 24 25 26 110257-序列表.doc -56- 1304737 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <220> <223> 人造序列的説明：突變的脂醇反應要素寡核苷酸 <4 00> 57 ccgagcT：gca cacagtaacc ccccga 2δ 110257-序列表.doc -57-

Claims

ή% 130^7&了132〇5號專利申請案中文申請專利範圍替換本(97年7月）十、申請專利範圍： 1. 一種用於增加從哺乳動物個體之細胞中排出膽固醇的醫藥組合物，其包括足以增加從該細胞中排出膽固醇的: 量之至少一種核受體之配體，其中該配體係選自2〇(8)經基膽固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25_羥基膽固傳、24(S)，25環氧基膽固醇、9-順視黃酸、視普醇、視黃酸、所有的-反視黃酸、13_順視黃酸、阿維 A(acitretin)、芬維 A 胺（fenretinide)、阿維 A 酯 (etretinate)、CD 495(4-(5,6,7,8-四氫 _5,5,8,8-四甲基萘并 [2,3-b]呋喃-2-基）苯甲酸）、CD 564(6-(5,6,7,8-四氫 _ 5.5.8.8- 四甲基-2-萘曱醯基）-2-萘曱酸）、ΤΤΝΝ(6-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四曱基-2-萘基），2-萘羧酸）、 ΤΤΝΡΒ(4-(Ε-2-[5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基]-l_ 丙烯基）苯甲酸）、ΤΤΑΒ(4-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四曱基-2-蒽基）苯曱酸）和 LGD 1069(4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基- 5.6.7.8- 四氫-2-萘基）乙烯基]苯甲酸）所組成之群。 2. 根據申請專利範圍第i項之醫藥組合物，其中該配體為 2〇(S)羥基膽固醇。 3. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該配體為9-順視黃酸。 4. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其進一步包含第二個配體，其中該第二個配體係選自20(S)羥基膽固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、24(S),25環氧基膽固醇、9-順視黃酸、視黃醇、視 110257-970704.doc .1304737 黃搭、所有的-反視黃酸、13-順視黃酸、阿維 A(acitretin)、芬維 A 胺（fenretinide)、阿維 A 西旨 (etretinate)、CD 495(4-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四曱基萘并 ^ [2,3_b]咬喃 _2-基）苯甲酸）、CD 564(6-(5,6,7,8_ 四氫 _ V· 5,5,8,8-四甲基-2-萘甲醯基）-2-萘甲酸）、ττνν(6_ (5,6,7,8-四氫_5,5,8,8-四甲基-2-萘基）_2_萘羧酸）、 ΤΤΝΡΒ(4-(Ε-2-[5,6,7,8-四氫 _5,5,8,8·四曱基 _2_ 萘基] 丙烯基）笨甲酸）、TTAB(4-(5,6,7,8-四氫_5,5,8,8_四甲基· • 2_蒽基）苯甲酸）和 LGD 1〇69(4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基 _ 5,6,7,8-四氫-2-萘基）乙烯基]苯甲酸）所組成之群，且該第二個配體與第一個配體不同。 5. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該膽固醇排出的增加，相對於單獨使用任一個配體的膽固醇排出，為至少25-倍。 6. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該配體為 2〇(S)羥基膽固醇和9_順視黃酸。 _ 7. 一種用於增加從哺乳動物個體之細胞中排出膽固醇的醫藥組合物，其包括足以在該細胞中增加膽固醇排出之含量之花生酸衍生物，其中該花生酸衍生物係為前列腺素 E1或前列環素丨2。 8. —種用於在哺乳動物個體之細胞中表現abci的醫藥組 &物其包括足以在該細胞中增加ABC 1表現之含量之 -核爻體之配體，其中該配體係選自20(S)羥基膽固醇、 22(R)羥基膽固醇、24(s)羥基膽固醇、25_羥基膽固醇、 Il0257-970704.doc 1304737 24(S)，25環氧基膽固醇、9-順視黃酸、視黃醇、視黃醛、所有的-反視黃酸、13-順視黃酸、阿維 A(acitretin)、芬維 A 胺（fenretinide)、阿維 A 酯 (etretinate)、CD 495(4-(5,6,7,8-四氫 _5,5,8,8-四曱基萘并 [2,3-b]呋喃-2-基）苯甲酸）、CD 564(6-(5,6,7,8-四氣 _ 5.5.8.8- 四甲基-2-萘甲醯基）-2- 萘甲酸）、TTNN(6- (5，6，7，8 -四氮-5，5，8，8 -四曱基-2 -蔡基）-2 -蔡缓酸）、 TTNPB(4-(E-2_[5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四曱基-2-萘基] 丙稀基）苯甲酸）、TTAB(4-(5,6,7,8 -四氫-5,5,8,8-四甲基_ 2-蒽基）苯曱酸）和 LGD 1069(4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基 _ 5.6.7.8- 四氫-2-萘基）乙稀基]苯甲酸）所組成之群。

110257-970704.doc