JP2002360250A - ヒトｇタンパク質レセプターｈｉｂｅｆ５１ - Google Patents
ヒトｇタンパク質レセプターｈｉｂｅｆ５１Info
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- JP2002360250A JP2002360250A JP2002149809A JP2002149809A JP2002360250A JP 2002360250 A JP2002360250 A JP 2002360250A JP 2002149809 A JP2002149809 A JP 2002149809A JP 2002149809 A JP2002149809 A JP 2002149809A JP 2002360250 A JP2002360250 A JP 2002360250A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒトのＧタンパク質共役型７−膜貫通レセプタ
ーポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの使用、ならびにこのようなポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドの産生の方法、ならびにこ
のようなポリペプチドの作用を阻害する方法を提供する
こと。 【解決手段】以下からなる群から選択されるメンバーを
含む単離されたポリヌクレオチド：図１Ａ〜Ｅに記載の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＡＴＣＣ
受託番号 において含まれるＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド
と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド；およ
び、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチド
のポリヌクレオチドフラグメント。
ーポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの使用、ならびにこのようなポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドの産生の方法、ならびにこ
のようなポリペプチドの作用を阻害する方法を提供する
こと。 【解決手段】以下からなる群から選択されるメンバーを
含む単離されたポリヌクレオチド：図１Ａ〜Ｅに記載の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＡＴＣＣ
受託番号 において含まれるＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド
と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド；およ
び、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチド
のポリヌクレオチドフラグメント。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７−膜貫通
レセプターである。この膜貫通レセプターはＧタンパク
質共役型レセプターである。本発明はまた、このような
ポリペプチドの作用を阻害することに関する。
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７−膜貫通
レセプターである。この膜貫通レセプターはＧタンパク
質共役型レセプターである。本発明はまた、このような
ポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【０００２】
【従来の技術】多数の医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャ
ー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与
するタンパク質により媒介されることは、十分に確立さ
れている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５
１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、
これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関
与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これ
らのタンパク質のいくつかの例としては、ＧＰＣレセプ
ター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミ
ンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．
Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋ
ｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：
６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８
８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパ
ク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラー
ゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュ
エータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテイン
キナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５２：８０２−８（１９９１））が挙げられる。
が、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャ
ー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与
するタンパク質により媒介されることは、十分に確立さ
れている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５
１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、
これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関
与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これ
らのタンパク質のいくつかの例としては、ＧＰＣレセプ
ター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミ
ンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．
Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋ
ｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：
６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８
８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパ
ク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラー
ゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュ
エータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテイン
キナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５２：８０２−８（１９９１））が挙げられる。
【０００３】例えば、シグナル伝達の１つの形態では、
ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸
シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性
化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴ
Ｐはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結
させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活
性化されると、ＧＴＰを結合型ＧＤＰに変換することが
示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化され
たアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへ
の加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、
Ｇタンパク質をその基底の不活性な形態に戻す。従っ
て、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェ
クターに中継する中間物として、およびシグナルの持続
時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。
ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸
シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性
化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴ
Ｐはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結
させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活
性化されると、ＧＴＰを結合型ＧＤＰに変換することが
示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化され
たアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへ
の加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、
Ｇタンパク質をその基底の不活性な形態に戻す。従っ
て、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェ
クターに中継する中間物として、およびシグナルの持続
時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。
【０００４】Ｇタンパク質共役型レセプターの膜タンパ
ク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫
通ドメインを有するものとして特徴づけられている。こ
れらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結
合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられている。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイル
ス、増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生
物学的に活性なレセプターを含む。
ク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫
通ドメインを有するものとして特徴づけられている。こ
れらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結
合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられている。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイル
ス、増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生
物学的に活性なレセプターを含む。
【０００５】Ｇタンパク質共役型レセプターは、少なく
とも８つの分岐した親水性ループを結合する、約２０〜
３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲
を含むものとして特徴づけられている。共役型レセプタ
ーのＧタンパク質ファミリーの例として、ドーパミンレ
セプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学
的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結
合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、
カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、
セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺
激ホルモン、オプシンおよびロドプシン、臭気物質、サ
イトメガロウイルスレセプターなどが挙げられる。
とも８つの分岐した親水性ループを結合する、約２０〜
３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲
を含むものとして特徴づけられている。共役型レセプタ
ーのＧタンパク質ファミリーの例として、ドーパミンレ
セプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学
的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結
合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、
カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、
セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺
激ホルモン、オプシンおよびロドプシン、臭気物質、サ
イトメガロウイルスレセプターなどが挙げられる。
【０００６】大部分のＧＰＲは、機能的なタンパク質構
造を安定化させると考えられているジスルフィド結合を
形成する最初の２つの細胞外ループの各々において単一
の保存されたシステイン残基を有する。７つの膜貫通領
域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ
６、およびＴＭ７と命名されている。ＴＭ３はまたシグ
ナル伝達に関連付けられている。
造を安定化させると考えられているジスルフィド結合を
形成する最初の２つの細胞外ループの各々において単一
の保存されたシステイン残基を有する。７つの膜貫通領
域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ
６、およびＴＭ７と命名されている。ＴＭ３はまたシグ
ナル伝達に関連付けられている。
【０００７】システイン残基のリン酸化および脂質化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
ＧＰＲのシグナル伝達に影響を与え得る。大部分のＧＰ
Ｒは、第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末
端内に潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧ
ＰＲ（例えば、β−アドレノレセプター）について、プ
ロテインキナーゼＡおよび／または特異的なレセプター
キナーゼによるリン酸化は、レセプター脱感作を媒介す
る。
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
ＧＰＲのシグナル伝達に影響を与え得る。大部分のＧＰ
Ｒは、第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末
端内に潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧ
ＰＲ（例えば、β−アドレノレセプター）について、プ
ロテインキナーゼＡおよび／または特異的なレセプター
キナーゼによるリン酸化は、レセプター脱感作を媒介す
る。
【０００８】ＧＰＲのリガンド結合部位は、いくつかの
ＧＰＲ膜貫通ドメインにより形成される親水性受口（ｓ
ｏｃｋｅｔ）を含有すると考えられており、この受口は
ＧＰＲの親水性残基により囲まれている。各ＧＰＲ膜貫
通ヘリックスの疎水性側は内側に向いており、そしてイ
オン化リガンド結合部位を形成すると仮定されている。
ＴＭ３は、リガンド結合部位（例えば、ＴＭ３のアスパ
ラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧＰ
Ｒにおいて関連付けられている。さらに、ＴＭ５のセリ
ン、ＴＭ６のアスパラギン、およびＴＭ６のまたはＴＭ
７のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド
結合に関連付けられている。
ＧＰＲ膜貫通ドメインにより形成される親水性受口（ｓ
ｏｃｋｅｔ）を含有すると考えられており、この受口は
ＧＰＲの親水性残基により囲まれている。各ＧＰＲ膜貫
通ヘリックスの疎水性側は内側に向いており、そしてイ
オン化リガンド結合部位を形成すると仮定されている。
ＴＭ３は、リガンド結合部位（例えば、ＴＭ３のアスパ
ラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧＰ
Ｒにおいて関連付けられている。さらに、ＴＭ５のセリ
ン、ＴＭ６のアスパラギン、およびＴＭ６のまたはＴＭ
７のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド
結合に関連付けられている。
【０００９】ＧＰＲは、ヘテロ三量体のＧタンパク質に
より種々の細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトラ
ンスポーターに細胞内で共役され得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１０：３１７−３３１
（１９８９）を参照のこと）。異なるＧタンパク質のα
サブユニットは、細胞内で種々の生物学的機能を調節す
るための特定のエフェクターを優先的に刺激する。ＧＰ
Ｒの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧＰＲのＧタ
ンパタ質共役の調節のための重要な機構として同定され
ている。
より種々の細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトラ
ンスポーターに細胞内で共役され得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１０：３１７−３３１
（１９８９）を参照のこと）。異なるＧタンパク質のα
サブユニットは、細胞内で種々の生物学的機能を調節す
るための特定のエフェクターを優先的に刺激する。ＧＰ
Ｒの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧＰＲのＧタ
ンパタ質共役の調節のための重要な機構として同定され
ている。
【００１０】Ｇタンパク質共役型レセプターは、哺乳動
物宿主内の多数の部位において見出されている。例え
ば、ドーパミンは中枢神経系における重要な神経伝達物
質であり、そしてＧタンパク質共役型レセプターのリガ
ンドである。
物宿主内の多数の部位において見出されている。例え
ば、ドーパミンは中枢神経系における重要な神経伝達物
質であり、そしてＧタンパク質共役型レセプターのリガ
ンドである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの局面に
よれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに
それらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用
なフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。
本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。
よれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに
それらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用
なフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。
本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。
【００１２】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が
提供され、この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアンチセンスアナ
ログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に
有用なそれらのフラグメントを含む。
プターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が
提供され、この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアンチセンスアナ
ログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に
有用なそれらのフラグメントを含む。
【００１３】本発明のさらなる局面によれば、本発明の
レセプターポリペプチドをコードする核酸配列を含む組
換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿
主細胞を、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記
タンパク質の回収を促進する条件下で、培養する工程を
包含する組換え技術によってこのようなレセプターポリ
ペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
レセプターポリペプチドをコードする核酸配列を含む組
換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿
主細胞を、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記
タンパク質の回収を促進する条件下で、培養する工程を
包含する組換え技術によってこのようなレセプターポリ
ペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
【００１４】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供され
る。
ようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供され
る。
【００１５】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する
またはその活性化を阻害する化合物のスクリーニング方
法が提供される。
プターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する
またはその活性化を阻害する化合物のスクリーニング方
法が提供される。
【００１６】本発明のなお別の実施態様によれば、上気
道症状（例えば、アレルギー性鼻炎、枯草熱、急性コリ
ーザおよび副鼻腔炎）の防止および／または処置におい
て有用である本発明のレセプターポリペプチドに結合
し、そしてそれを活性化する化合物を宿主に投与して、
子宮性阻害を促進する、血小板凝集を刺激する、脂質代
謝を調節する、および膵臓からのグルコース媒介性イン
シュリン放出を阻害するプロセスが提供される。
道症状（例えば、アレルギー性鼻炎、枯草熱、急性コリ
ーザおよび副鼻腔炎）の防止および／または処置におい
て有用である本発明のレセプターポリペプチドに結合
し、そしてそれを活性化する化合物を宿主に投与して、
子宮性阻害を促進する、血小板凝集を刺激する、脂質代
謝を調節する、および膵臓からのグルコース媒介性イン
シュリン放出を阻害するプロセスが提供される。
【００１７】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドを、遺伝子治療を介して投与して、
ポリペプチドの過小発現またはレセプターポリペプチド
に対するリガンドの過小発現に関連する症状を処置する
方法が提供される。
プターポリペプチドを、遺伝子治療を介して投与して、
ポリペプチドの過小発現またはレセプターポリペプチド
に対するリガンドの過小発現に関連する症状を処置する
方法が提供される。
【００１８】本発明のなお別の実施態様によれば、高血
圧および他の心筋性疾患ならびに血管収縮に関する他の
疾患の防止および／または処置において有用である、本
発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてその活
性化を阻害する化合物を宿主に投与するプロセスが提供
される。
圧および他の心筋性疾患ならびに血管収縮に関する他の
疾患の防止および／または処置において有用である、本
発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてその活
性化を阻害する化合物を宿主に投与するプロセスが提供
される。
【００１９】本発明のさらに別の局面によれば、本発明
のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする
のに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供さ
れる。
のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする
のに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供さ
れる。
【００２０】本発明のなお別の局面によれば、このよう
なポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関
連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペ
プチドの可溶性形態の変化されたレベルを検出するため
の診断的アッセイが提供される。
なポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関
連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペ
プチドの可溶性形態の変化されたレベルを検出するため
の診断的アッセイが提供される。
【００２１】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関する
インビトロの目的のために利用するためのプロセスが提
供される。
ようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関する
インビトロの目的のために利用するためのプロセスが提
供される。
【００２２】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、以下からなる群から選択されるメンバーを含む
単離されたポリヌクレオチド： （ａ） 配列番号２に記載のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ） ＡＴＣＣ受託番号 において含まれるＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌク
レオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
ド；および （ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオ
チドのポリヌクレオチドフラグメントに関する。
発明は、以下からなる群から選択されるメンバーを含む
単離されたポリヌクレオチド： （ａ） 配列番号２に記載のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ） ＡＴＣＣ受託番号 において含まれるＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌク
レオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
ド；および （ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオ
チドのポリヌクレオチドフラグメントに関する。
【００２４】好ましい実施形態において、上記ポリヌク
レオチドは、配列番号２に記載のポリペプチドをコード
し得る。
レオチドは、配列番号２に記載のポリペプチドをコード
し得る。
【００２５】別の局面において、本発明は、上記ポリヌ
クレオチドを含むベクターに関する。
クレオチドを含むベクターに関する。
【００２６】別の局面において、本発明は、上記ベクタ
ーで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた
宿主細胞に関する。
ーで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた
宿主細胞に関する。
【００２７】別の局面において、本発明は、上記宿主細
胞から、上記ポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドを発現する工程を包含する、ポリペプチドを産
生するためのプロセスに関する。
胞から、上記ポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドを発現する工程を包含する、ポリペプチドを産
生するためのプロセスに関する。
【００２８】別の局面において、本発明は、上記ベクタ
ーで細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトす
る工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を産
生するためのプロセスに関する。
ーで細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトす
る工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を産
生するためのプロセスに関する。
【００２９】別の局面において、本発明は、以下からな
る群から選択されるレセプターポリペプチド： （ｉ） 配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および
誘導体；および（ｉｉ） ＡＴＣＣ受託番号 のｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチド、ならびにこのポリ
ペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関
する。
る群から選択されるレセプターポリペプチド： （ｉ） 配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および
誘導体；および（ｉｉ） ＡＴＣＣ受託番号 のｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチド、ならびにこのポリ
ペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関
する。
【００３０】好ましい実施形態において、上記ポリペプ
チドが配列番号２の推定アミノ酸配列を有し得る。
チドが配列番号２の推定アミノ酸配列を有し得る。
【００３１】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドに対する抗体に関する。
プチドに対する抗体に関する。
【００３２】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドを活性化する化合物に関する。
プチドを活性化する化合物に関する。
【００３３】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドの活性化を阻害する化合物に関する。
プチドの活性化を阻害する化合物に関する。
【００３４】さらに別の局面において、本発明は、上記
アンタゴニストおよびキャリアを含む、組成物に関す
る。
アンタゴニストおよびキャリアを含む、組成物に関す
る。
【００３５】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドを活性化する化合物の治療有効量を患者に投与す
る工程を包含する、上記ポリペプチドを活性化する必要
性を有する患者を処置するための方法に関する。
プチドを活性化する化合物の治療有効量を患者に投与す
る工程を包含する、上記ポリペプチドを活性化する必要
性を有する患者を処置するための方法に関する。
【００３６】好ましい実施形態において、上記化合物が
ポリペプチドであり得、そして化合物の治療有効量が、
患者にアゴニストをコードするＤＮＡを提供し、そして
インビボでアゴニストを発現することにより投与され得
る。
ポリペプチドであり得、そして化合物の治療有効量が、
患者にアゴニストをコードするＤＮＡを提供し、そして
インビボでアゴニストを発現することにより投与され得
る。
【００３７】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドの活性化を阻害する化合物の治療有効量を患者に
投与する工程を包含する、上記ポリペプチドを阻害する
必要性を有する患者を処置するための方法に関する。
プチドの活性化を阻害する化合物の治療有効量を患者に
投与する工程を包含する、上記ポリペプチドを阻害する
必要性を有する患者を処置するための方法に関する。
【００３８】好ましい実施形態において、前記化合物が
ポリペプチドであり得、そして化合物の治療有効量が、
患者にアンタゴニストをコードするＤＮＡを提供し、そ
してインビボでアンタゴニストを発現することにより投
与され得る。
ポリペプチドであり得、そして化合物の治療有効量が、
患者にアンタゴニストをコードするＤＮＡを提供し、そ
してインビボでアンタゴニストを発現することにより投
与され得る。
【００３９】別の局面において、本発明は、上記レセプ
ターポリペプチドに結合し、そして該レセプターポリペ
プチドを活性化する化合物を同定するための方法であっ
て：細胞表面上でレセプターポリペプチドを発現する細
胞と化合物とを、化合物の該レセプターポリペプチドへ
の結合を許容するのに十分な条件下で接触させる工程で
あって、レセプターは、化合物のレセプターポリペプチ
ドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される、工程；および化合物がレセプ
ター結合し得るか否かを、第２の成分により生成される
シグナルを検出することにより同定する工程、を包含す
る、方法に関する。
ターポリペプチドに結合し、そして該レセプターポリペ
プチドを活性化する化合物を同定するための方法であっ
て：細胞表面上でレセプターポリペプチドを発現する細
胞と化合物とを、化合物の該レセプターポリペプチドへ
の結合を許容するのに十分な条件下で接触させる工程で
あって、レセプターは、化合物のレセプターポリペプチ
ドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される、工程；および化合物がレセプ
ター結合し得るか否かを、第２の成分により生成される
シグナルを検出することにより同定する工程、を包含す
る、方法に関する。
【００４０】別の局面において、本発明は、上記ポリペ
プチドに結合し、そして該ポリペプチドの活性化を阻害
する化合物を同定するための方法であって：細胞表面上
でレセプターポリペプチドを発現する細胞と、レセプタ
ーポリペプチドに結合することが公知のリガンドおよび
スクリーニングされるべき化合物とを、レセプターポリ
ペプチドへの結合を許容する条件下で接触させる工程で
あって、レセプターは、化合物のレセプターポリペプチ
ドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される、工程；およびリガンドとポリ
ペプチドとの相互作用から生成されるシグナルが存在し
ないことを検出することにより、化合物がポリペプチド
の活性化を阻害するか否かを決定する工程、を包含す
る、方法に関する。
プチドに結合し、そして該ポリペプチドの活性化を阻害
する化合物を同定するための方法であって：細胞表面上
でレセプターポリペプチドを発現する細胞と、レセプタ
ーポリペプチドに結合することが公知のリガンドおよび
スクリーニングされるべき化合物とを、レセプターポリ
ペプチドへの結合を許容する条件下で接触させる工程で
あって、レセプターは、化合物のレセプターポリペプチ
ドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される、工程；およびリガンドとポリ
ペプチドとの相互作用から生成されるシグナルが存在し
ないことを検出することにより、化合物がポリペプチド
の活性化を阻害するか否かを決定する工程、を包含す
る、方法に関する。
【００４１】別の局面において、本発明は、上記レセプ
ターポリペプチドに結合する化合物を同定するために、
該化合物をスクリーニングするための方法であって：細
胞表面上でレセプターを発現する細胞と、化合物および
レセプターに結合することが公知の分析上検出可能なリ
ガンドとを、レセプターへの結合を許容する条件下で接
触させる工程；およびリガンドの該レセプターへの結合
を決定する工程、を包含する、方法に関する。
ターポリペプチドに結合する化合物を同定するために、
該化合物をスクリーニングするための方法であって：細
胞表面上でレセプターを発現する細胞と、化合物および
レセプターに結合することが公知の分析上検出可能なリ
ガンドとを、レセプターへの結合を許容する条件下で接
触させる工程；およびリガンドの該レセプターへの結合
を決定する工程、を包含する、方法に関する。
【００４２】別の局面において、本発明は、患者におい
て上記ポリペプチドの過小発現に関する疾患または疾患
に対する感受性を診断するためのプロセスであって、患
者に由来するサンプル中の該ポリペプチドをコードする
核酸配列における変異を決定する工程を包含する、プロ
セスに関する。
て上記ポリペプチドの過小発現に関する疾患または疾患
に対する感受性を診断するためのプロセスであって、患
者に由来するサンプル中の該ポリペプチドをコードする
核酸配列における変異を決定する工程を包含する、プロ
セスに関する。
【００４３】別の局面において、本発明は、宿主由来の
サンプル中の上記ポリペプチドの存在を分析する工程を
包含する、診断プロセスに関する。
サンプル中の上記ポリペプチドの存在を分析する工程を
包含する、診断プロセスに関する。
【００４４】
【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、図
１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、また
は１９９５年６月１日にＡＴＣＣ受託番号第 号として
寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレ
オチド）が提供される。
１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、また
は１９９５年６月１日にＡＴＣＣ受託番号第 号として
寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレ
オチド）が提供される。
【００４５】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、骨格筋、心臓および脳に見出され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト幼児脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーにおいて発見された。これは構造的にＧ
タンパク質共役型レセプターファミリーに関連する。こ
れは、３４９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、ヒトα2Ａアドレナリン作用性レセプターに最も高
い程度の相同性を示し、３３１アミノ酸の領域にわたっ
て２５．３８７％の同一性および５１．０８４％の類似
性を有する。
クレオチドは、骨格筋、心臓および脳に見出され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト幼児脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーにおいて発見された。これは構造的にＧ
タンパク質共役型レセプターファミリーに関連する。こ
れは、３４９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、ヒトα2Ａアドレナリン作用性レセプターに最も高
い程度の相同性を示し、３３１アミノ酸の領域にわたっ
て２５．３８７％の同一性および５１．０８４％の類似
性を有する。
【００４６】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したク
ローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはその
コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果とし
て、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮ
Ａと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配
列であり得る。
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したク
ローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはその
コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果とし
て、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮ
Ａと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配
列であり得る。
【００４７】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得
る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列およびリーダー配列または分泌配列あ
るいはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配
列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じ
てさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例え
ば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列
の５’および／または３’非コード配列）。
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得
る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列およびリーダー配列または分泌配列あ
るいはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配
列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じ
てさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例え
ば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列
の５’および／または３’非コード配列）。
【００４８】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。
【００４９】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリ
ヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然
に存在しない改変体であり得る。
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリ
ヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然
に存在しない改変体であり得る。
【００５０】従って、本発明は、図１に示すものと同じ
成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡ
によりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌク
レオチドの改変体を含む。この改変体は、図１（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオ
チド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加ま
たは挿入改変体を含む。
成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡ
によりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌク
レオチドの改変体を含む。この改変体は、図１（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオ
チド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加ま
たは挿入改変体を含む。
【００５１】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立
遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で
公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオ
チド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペ
プチドの機能を実質的に変化させない。
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立
遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で
公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオ
チド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペ
プチドの機能を実質的に変化させない。
【００５２】ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポ
リペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断された
ポリペプチドの細胞外部分であるレセプターポリペプチ
ドの可溶性形態をコードし得る。
リペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断された
ポリペプチドの細胞外部分であるレセプターポリペプチ
ドの可溶性形態をコードし得る。
【００５３】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。
【００５４】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これ
は、コード領域の前および後（リーダーおよトレイラー
（ｔｒａｉｌｅｒ））の領域ならびに個々のコードセグ
メント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含
む。
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これ
は、コード領域の前および後（リーダーおよトレイラー
（ｔｒａｉｌｅｒ））の領域ならびに個々のコードセグ
メント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含
む。
【００５５】全長レセプター遺伝子のフラグメントは、
全長遺伝子を単離するため、およびこの遺伝子に対する
高い配列類似性または類似した生物学的活性を有する他
の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得る。こ
のタイプのプローブは、好ましくは、少なくとも３０塩
基を有し、そして例えば、５０塩基以上を有し得る。プ
ローブはまた、全長の転写物に対応するｃＤＮＡクロー
ンおよびゲノムクローン、または調節およびプロモータ
ー領域、エキソン、ならびにイントロンを含む完全レセ
プター遺伝子を含有するクローンを同定するために使用
され得る。スクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を
使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することに
より、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発
明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオ
リゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ま
たはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ラ
イブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズ
するかを決定するために使用される。
全長遺伝子を単離するため、およびこの遺伝子に対する
高い配列類似性または類似した生物学的活性を有する他
の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得る。こ
のタイプのプローブは、好ましくは、少なくとも３０塩
基を有し、そして例えば、５０塩基以上を有し得る。プ
ローブはまた、全長の転写物に対応するｃＤＮＡクロー
ンおよびゲノムクローン、または調節およびプロモータ
ー領域、エキソン、ならびにイントロンを含む完全レセ
プター遺伝子を含有するクローンを同定するために使用
され得る。スクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を
使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することに
より、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発
明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオ
リゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ま
たはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ラ
イブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズ
するかを決定するために使用される。
【００５６】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましく
は９５％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリ
ンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配
列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも
９７％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味
する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤ
ＮＡ（単数または複数）によりコードされる成熟ポリペ
プチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれ
かを保持するポリペプチドをコードする。
％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましく
は９５％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリ
ンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配
列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも
９７％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味
する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤ
ＮＡ（単数または複数）によりコードされる成熟ポリペ
プチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれ
かを保持するポリペプチドをコードする。
【００５７】あるいは、このポリヌクレオチドは、本発
明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中
上記したように、それに対して同一性を有し、そして活
性を保持てもよいかまたはしなくてもよい、少なくとも
２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましくは
少なくとも５０塩基を有し得る。例えばそのようなポリ
ヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのため
のプローブとして（例えば、このポリヌクレオチドの回
収のためのプローブ、または診断用プローブ）あるいは
ＰＣＲプライマーとして用いられ得る。
明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中
上記したように、それに対して同一性を有し、そして活
性を保持てもよいかまたはしなくてもよい、少なくとも
２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましくは
少なくとも５０塩基を有し得る。例えばそのようなポリ
ヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのため
のプローブとして（例えば、このポリヌクレオチドの回
収のためのプローブ、または診断用プローブ）あるいは
ＰＣＲプライマーとして用いられ得る。
【００５８】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性およびよ
り好ましくは９５％の同一性を有するポリヌクレオチド
ならびにそのフラグメント（このフラグメントは、少な
くとも３０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を
有する）ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドに関する。
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性およびよ
り好ましくは９５％の同一性を有するポリヌクレオチド
ならびにそのフラグメント（このフラグメントは、少な
くとも３０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を
有する）ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドに関する。
【００５９】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る対立の場合にも管理している。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられ
るわけではない。
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る対立の場合にも管理している。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられ
るわけではない。
【００６０】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するレセプターポリ
ペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体に関する。
定アミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するレセプターポリ
ペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体に関する。
【００６１】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性（すなわち、レセプターとしての機
能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがレセプタ
ーとして機能しないとしても、リガンドまたはレセプタ
ーを結合する能力を保持するか（例えば、このレセプタ
ーの可溶性形態）のいずれかであるポリペプチドを意味
する。アナログは、膜貫通ドメインおよび細胞内部分か
ら切断されて可溶性の活性ペプチドを産生し得る細胞外
部分を含む。
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性（すなわち、レセプターとしての機
能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがレセプタ
ーとして機能しないとしても、リガンドまたはレセプタ
ーを結合する能力を保持するか（例えば、このレセプタ
ーの可溶性形態）のいずれかであるポリペプチドを意味
する。アナログは、膜貫通ドメインおよび細胞内部分か
ら切断されて可溶性の活性ペプチドを産生し得る細胞外
部分を含む。
【００６２】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００６３】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以
上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミ
ノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、
そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コー
ドによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、
またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは
（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合されているもの、あるい
は（ｉｖ）その中で成熟ポリペプチドの精製のために使
用されるさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合さ
れているもの、あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメ
ントが可溶性であるもの（すなわち、膜に結合しない
が、なお膜結合型レセプターに対するリガンドを結合す
る）であり得る。このようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内
にあると考えられる。
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以
上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミ
ノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、
そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コー
ドによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、
またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは
（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合されているもの、あるい
は（ｉｖ）その中で成熟ポリペプチドの精製のために使
用されるさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合さ
れているもの、あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメ
ントが可溶性であるもの（すなわち、膜に結合しない
が、なお膜結合型レセプターに対するリガンドを結合す
る）であり得る。このようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内
にあると考えられる。
【００６４】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。
【００６５】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０％のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有する
このようなポリペプチドの部分を含む。
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０％のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有する
このようなポリペプチドの部分を含む。
【００６６】当業者に公知なように、２つのポリペプチ
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
【００６７】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。
【００６８】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；こ
れは、コード領域の前および後（リーダーおよトレイラ
ー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソ
ン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；こ
れは、コード領域の前および後（リーダーおよトレイラ
ー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソ
ン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００６９】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生存する
動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
いて共存する物質の幾らかまたは全てから分離されてい
る同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離さ
れている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一
部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつ
そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一
部ではない点で、なお単離されている状態であり得る。
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生存する
動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
いて共存する物質の幾らかまたは全てから分離されてい
る同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離さ
れている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一
部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつ
そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一
部ではない点で、なお単離されている状態であり得る。
【００７０】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは７０％の同一性）を配列
番号２のポリペプチドに対して有し、そしてより好まし
くは９０％の類似性（より好ましくは９０％の同一性）
を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてなお
より好ましくは９５％の類似性（なおより好ましくは９
０％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミ
ノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有するこの
ようなポリペプチドの部分を含む。
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは７０％の同一性）を配列
番号２のポリペプチドに対して有し、そしてより好まし
くは９０％の類似性（より好ましくは９０％の同一性）
を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてなお
より好ましくは９５％の類似性（なおより好ましくは９
０％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミ
ノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有するこの
ようなポリペプチドの部分を含む。
【００７１】当業者に公知なように、２つのポリペプチ
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
【００７２】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリペプチドのフラグメント
または部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成す
るために使用され得る。
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリペプチドのフラグメント
または部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成す
るために使用され得る。
【００７３】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。
【００７４】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。
【００７５】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。
【００７６】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。
【００７７】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
の合成を指示する適切な発現制御配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺
伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソー
ム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベク
ターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し
得る。
の合成を指示する適切な発現制御配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺
伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソー
ム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベク
ターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し
得る。
【００７８】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。
【００７９】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。
【００８０】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
ＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細
胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると考えられる。
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
ＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細
胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると考えられる。
【００８１】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ，ｐｂｓｋｓ，ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベク
ターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、使用され得る。
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ，ｐｂｓｋｓ，ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベク
ターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、使用され得る。
【００８２】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジン
キナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウ
イルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩ
を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択
は、十分に当業者のレベル内である。
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジン
キナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウ
イルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩ
を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択
は、十分に当業者のレベル内である。
【００８３】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。
【００８４】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。
【００８５】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。
【００８６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。
【００８７】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００８８】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。
【００８９】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭＩ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭＩ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
【００９０】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。
【００９１】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。
【００９２】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。
【００９３】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：
１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞の
ＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他
の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプライ
ス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部
位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために
使用され得る。
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：
１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞の
ＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他
の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプライ
ス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部
位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために
使用され得る。
【００９４】レセプターポリペプチドは、以下を含む方
法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製さ
れ得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イ
オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再
折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパ
ク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的
に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終
的な精製工程に用いられ得る。
法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製さ
れ得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イ
オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再
折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパ
ク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的
に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終
的な精製工程に用いられ得る。
【００９５】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００９６】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験薬および試験物質として使用され得る。
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験薬および試験物質として使用され得る。
【００９７】本発明のレセプターは、本発明のレセプタ
ーポリペプチドに結合し、そして活性化する化合物（ア
ゴニスト）、または本発明のレセプターポリペプチドに
結合し、そして活性化を阻害する化合物（アンタゴニス
ト）をスクリーニングするためのプロセスにおいて使用
され得る。
ーポリペプチドに結合し、そして活性化する化合物（ア
ゴニスト）、または本発明のレセプターポリペプチドに
結合し、そして活性化を阻害する化合物（アンタゴニス
ト）をスクリーニングするためのプロセスにおいて使用
され得る。
【００９８】一般的に、このようなスクリーニング手順
は、その表面でレセプターを発現する適切な細胞を提供
することを含む。特に、本発明のレセプターをコードす
るポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトし、そ
れにより、本発明のレセプターを発現させるのに用いら
れる。このようなトランスフェクションは、本明細書の
上記のような手順により達成され得る。
は、その表面でレセプターを発現する適切な細胞を提供
することを含む。特に、本発明のレセプターをコードす
るポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトし、そ
れにより、本発明のレセプターを発現させるのに用いら
れる。このようなトランスフェクションは、本明細書の
上記のような手順により達成され得る。
【００９９】１つのこのようなスクリーニング手順は、
本発明のレセプターを発現するためにトランスフェクト
されるメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスク
リーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０
（１９９２年２月６日公開）に記載されている。
本発明のレセプターを発現するためにトランスフェクト
されるメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスク
リーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０
（１９９２年２月６日公開）に記載されている。
【０１００】従って、例えば、このようなアッセイは、
レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化
合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細
胞とを接触させることにより、レセプターアンタゴニス
トをスクリーニングするために使用され得る。リガンド
により生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプタ
ーの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レ
セプターの活性化を阻害することを示す。
レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化
合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細
胞とを接触させることにより、レセプターアンタゴニス
トをスクリーニングするために使用され得る。リガンド
により生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプタ
ーの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レ
セプターの活性化を阻害することを示す。
【０１０１】このスクリーニングは、このような細胞と
スクリーニングされる化合物とを接触させ、そしてその
ような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、このよ
うな化合物がレセプターを活性化するかを決定すること
によりアゴニストを決定するために用いられ得る。
スクリーニングされる化合物とを接触させ、そしてその
ような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、このよ
うな化合物がレセプターを活性化するかを決定すること
によりアゴニストを決定するために用いられ得る。
【０１０２】他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９
年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化に
より引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系にお
いて、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフ
ェクトＣＨＯ細胞）の使用を含む。例えば、潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストは、レセプターを発現す
る細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応
答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）は、潜在的
アゴニストまたはアンタゴニストが有効であるか否かを
決定するために測定され得る。
ｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９
年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化に
より引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系にお
いて、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフ
ェクトＣＨＯ細胞）の使用を含む。例えば、潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストは、レセプターを発現す
る細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応
答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）は、潜在的
アゴニストまたはアンタゴニストが有効であるか否かを
決定するために測定され得る。
【０１０３】別のこのようなスクリーニング技術は、レ
セプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞
に導入し、一時的にレセプターを発現させることを含
む。次いでそのレセプター卵母細胞は、アンタゴニスト
をスクリーニングする場合にはレセプターリガンドおよ
びスクリーニングされる化合物と接触され得、続いて、
カルシウムシグナルの阻害の検出が行われる。
セプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞
に導入し、一時的にレセプターを発現させることを含
む。次いでそのレセプター卵母細胞は、アンタゴニスト
をスクリーニングする場合にはレセプターリガンドおよ
びスクリーニングされる化合物と接触され得、続いて、
カルシウムシグナルの阻害の検出が行われる。
【０１０４】別のスクリーニング技術は、そのレセプタ
ーがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているレセプタ
ーの発現を包含する。このような細胞の代表例として
は、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ
得る。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニン
グは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化ま
たはホスホリパーゼの２次シグナルに由来するレセプタ
ーの活性化の阻害の検出により達成され得る。
ーがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているレセプタ
ーの発現を包含する。このような細胞の代表例として
は、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ
得る。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニン
グは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化ま
たはホスホリパーゼの２次シグナルに由来するレセプタ
ーの活性化の阻害の検出により達成され得る。
【０１０５】別の方法は、細胞表面にレセプターを有す
る細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することに
よる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害
する化合物のスクリーニングを包含する。このような方
法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにレ
セプターをコードするＤＮＡで真核細胞をトランスフェ
クトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在
下で細胞と潜在的なアンタゴニストとを接触させる工程
を包含する。リガンドは、例えば、放射能により標識さ
れ得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例
えば、レセプターの放射能の測定により測定される。レ
セプターに結合する標識リガンドの減少により決定され
るように潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合す
る場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害され
る。
る細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することに
よる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害
する化合物のスクリーニングを包含する。このような方
法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにレ
セプターをコードするＤＮＡで真核細胞をトランスフェ
クトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在
下で細胞と潜在的なアンタゴニストとを接触させる工程
を包含する。リガンドは、例えば、放射能により標識さ
れ得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例
えば、レセプターの放射能の測定により測定される。レ
セプターに結合する標識リガンドの減少により決定され
るように潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合す
る場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害され
る。
【０１０６】一般に、スクリーニング手順により決定さ
れるＧタンパク質共役型レセプターに対するアンタゴニ
ストは、種々の治療目的に用いられ得る。例えば、この
ようなアンタゴニストは、高血圧、狭心症、心筋梗塞、
潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、うつ病、片頭痛（ｍ
ｉｇｒａｉｎｅ）、嘔吐、発作、摂食障害、片頭痛（ｍ
ｉｇｒａｉｎｅ ｈｅａｄａｃｈｅｓ）、ガン、および
良性前立腺肥大の処置のために用いられている。
れるＧタンパク質共役型レセプターに対するアンタゴニ
ストは、種々の治療目的に用いられ得る。例えば、この
ようなアンタゴニストは、高血圧、狭心症、心筋梗塞、
潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、うつ病、片頭痛（ｍ
ｉｇｒａｉｎｅ）、嘔吐、発作、摂食障害、片頭痛（ｍ
ｉｇｒａｉｎｅ ｈｅａｄａｃｈｅｓ）、ガン、および
良性前立腺肥大の処置のために用いられている。
【０１０７】Ｇタンパク質共役型レセプターに対するア
ゴニストはまた、治療目的（例えば、喘息、パーキンソ
ン病、急性心不全、低血圧、尿停留（ｕｒｉｎａｒｙ
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および骨粗鬆症の治療）のため
に有用である。
ゴニストはまた、治療目的（例えば、喘息、パーキンソ
ン病、急性心不全、低血圧、尿停留（ｕｒｉｎａｒｙ
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および骨粗鬆症の治療）のため
に有用である。
【０１０８】Ｇタンパク質共役型レセプターアンタゴニ
ストの例は、抗体、またはいくつかの場合には、オリゴ
ヌクレオチドを含む。それらは、Ｇタンパク質共役型レ
セプターに結合するが、Ｇタンパク質共役型レセプター
の活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を
惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合
する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を包
含する。潜在的なアンタゴニストもまた、Ｇタンパク質
共役型レセプターのリガンドに密接に関連するタンパク
質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは
生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質共役
型レセプターに結合するときに応答を惹起しない。
ストの例は、抗体、またはいくつかの場合には、オリゴ
ヌクレオチドを含む。それらは、Ｇタンパク質共役型レ
セプターに結合するが、Ｇタンパク質共役型レセプター
の活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を
惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合
する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を包
含する。潜在的なアンタゴニストもまた、Ｇタンパク質
共役型レセプターのリガンドに密接に関連するタンパク
質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは
生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質共役
型レセプターに結合するときに応答を惹起しない。
【０１０９】潜在的なアンタゴニストはまた、アンチセ
ンス技術の使用によって調製されたアンチセンス構築物
を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成もしくは
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝子発現を
制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポ
リヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに
基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長
さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５
６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５１： １３６０（１９９１）を参照のこと）、
それにより、転写およびＧタンパク質共役型レセプター
の産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そして
ｍＲＮＡ分子のＧタンパク質共役型レセプターへの翻訳
をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉ
ｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌ
クレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタンパク質共役
型レセプターの産生を阻害するためにインビボで発現さ
れ得る。
ンス技術の使用によって調製されたアンチセンス構築物
を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成もしくは
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝子発現を
制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポ
リヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに
基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長
さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５
６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５１： １３６０（１９９１）を参照のこと）、
それにより、転写およびＧタンパク質共役型レセプター
の産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そして
ｍＲＮＡ分子のＧタンパク質共役型レセプターへの翻訳
をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉ
ｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌ
クレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタンパク質共役
型レセプターの産生を阻害するためにインビボで発現さ
れ得る。
【０１１０】別の潜在的なアンタゴニストは、Ｇタンパ
ク質共役型レセプターに結合する小分子である。これ
は、正常な生物学的活性が妨げられるようにリガンドへ
の接近を不可能にする。小分子の例は、小ペプチドまた
はペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
ク質共役型レセプターに結合する小分子である。これ
は、正常な生物学的活性が妨げられるようにリガンドへ
の接近を不可能にする。小分子の例は、小ペプチドまた
はペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】潜在的なアンタゴニストはまた、可溶性形
態のＧタンパク質共役型レセプター（例えば、このレセ
プターのフラグメント）を含む。これはリガンドに結合
し、そしてこのリガンドが膜結合Ｇタンパク質共役型レ
セプターと相互作用することを妨げる。
態のＧタンパク質共役型レセプター（例えば、このレセ
プターのフラグメント）を含む。これはリガンドに結合
し、そしてこのリガンドが膜結合Ｇタンパク質共役型レ
セプターと相互作用することを妨げる。
【０１１２】Ｇタンパク質共役型レセプター、およびア
ンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリ
アと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、
治療的有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能
なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアと
しては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方
は、投与の様式に合わせるべきである。
ンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリ
アと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、
治療的有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能
なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアと
しては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方
は、投与の様式に合わせるべきである。
【０１１３】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他
の治療化合物と併用して用いられ得る。
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他
の治療化合物と併用して用いられ得る。
【０１１４】薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によ
る便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
症状の処置および／または予防に有効な量で投与され
る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１
日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から
約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮
される。
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によ
る便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
症状の処置および／または予防に有効な量で投与され
る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１
日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から
約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮
される。
【０１１５】Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチ
ド、およびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらは
ポリペプチドである）は、本発明に従って、インビボで
のこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。
これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
ド、およびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらは
ポリペプチドである）は、本発明に従って、インビボで
のこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。
これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
【０１１６】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【０１１７】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ
チドの発現のために患者に投与され得る。このような方
法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には
明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発
現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、ア
デノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒク
ルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために
使用され得る。
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ
チドの発現のために患者に投与され得る。このような方
法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には
明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発
現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、ア
デノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒク
ルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために
使用され得る。
【０１１８】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０１１９】ベクターは、１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない））が挙げら
れるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイ
ルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これ
らに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明
細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない））が挙げら
れるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイ
ルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これ
らに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明
細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
【０１２０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。
【０１２１】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次
いで宿主に投与され得る。
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次
いで宿主に投与され得る。
【０１２２】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、お
よび気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定され
ない。
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、お
よび気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【０１２３】Ｇタンパク質共役型レセプターは、哺乳動
物宿主において遍在し、そして多くの病理学を含む多く
の生物学的機能を担う。従って、Ｇタンパク質共役型レ
セプターを刺激する化合物、およびＧタンパク質共役型
レセプターを拮抗する化合物を見出すことが所望され
る。
物宿主において遍在し、そして多くの病理学を含む多く
の生物学的機能を担う。従って、Ｇタンパク質共役型レ
セプターを刺激する化合物、およびＧタンパク質共役型
レセプターを拮抗する化合物を見出すことが所望され
る。
【０１２４】本発明はさらに、細胞の表面上のヒトＧタ
ンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用し、そし
て結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法
は、Ｇタンパク質共役型レセプターをコードする単離さ
れたＤＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞と複数の化合物
とを接触させる工程、哺乳動物細胞に結合するこれらの
化合物を決定する工程、そしてそれによって本発明のヒ
トＧタンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用
し、そして結合する化合物を同定する工程を包含する。
ンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用し、そし
て結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法
は、Ｇタンパク質共役型レセプターをコードする単離さ
れたＤＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞と複数の化合物
とを接触させる工程、哺乳動物細胞に結合するこれらの
化合物を決定する工程、そしてそれによって本発明のヒ
トＧタンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用
し、そして結合する化合物を同定する工程を包含する。
【０１２５】本発明はまた、Ｇタンパク質共役型レセプ
ターをコードするｍＲＮＡの存在を検出することによ
り、細胞の表面におけるＧタンパク質共役型レセプター
の発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞か
ら全ｍＲＮＡを得る工程、およびそのように得られたｍ
ＲＮＡと、ヒトＧタンパク質共役型レセプターをコード
する核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブ
リダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子
を含有する核酸プローブとを、ハイブリダイズする条件
下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたｍ
ＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれによって細胞
によるＧタンパク質共役型レセプターの発現を検出する
工程を包含する。
ターをコードするｍＲＮＡの存在を検出することによ
り、細胞の表面におけるＧタンパク質共役型レセプター
の発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞か
ら全ｍＲＮＡを得る工程、およびそのように得られたｍ
ＲＮＡと、ヒトＧタンパク質共役型レセプターをコード
する核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブ
リダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子
を含有する核酸プローブとを、ハイブリダイズする条件
下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたｍ
ＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれによって細胞
によるＧタンパク質共役型レセプターの発現を検出する
工程を包含する。
【０１２６】本発明はまた、変異したＧタンパク質共役
型レセプター遺伝子の存在に関連する疾患または疾患に
対する感受性を検出するための診断アッセイの一部とし
てのＧタンパク質共役型レセプター遺伝子の使用に関連
する。このような疾患は、細胞の形質転換（例えば、腫
瘍およびガン）に関連する。
型レセプター遺伝子の存在に関連する疾患または疾患に
対する感受性を検出するための診断アッセイの一部とし
てのＧタンパク質共役型レセプター遺伝子の使用に関連
する。このような疾患は、細胞の形質転換（例えば、腫
瘍およびガン）に関連する。
【０１２７】ヒトＧタンパク質共役型レセプター遺伝子
における変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡ
レベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細
胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検物質、および剖
検物質）より得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のため
に直接使用され得るか、または分析前にＰＣＲを用いる
ことにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８６））。Ｒ
ＮＡあるいはｃＤＮＡはまた、同じ目的のために使用さ
れ得る。例として、Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
が、Ｇタンパク質共役型レセプター変異を同定および解
析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物の
サイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標
識されたＧタンパク質共役型レセプターＲＮＡまたは、
あるいは、放射性標識されたＧタンパク質共役型レセプ
ターアンチセンスＤＮＡ配列に、増幅されたＤＮＡをハ
イブリダイズさせることにより同定され得る。完全に対
合した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差に
より、誤対合した二本鎖と区別され得る。
における変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡ
レベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細
胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検物質、および剖
検物質）より得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のため
に直接使用され得るか、または分析前にＰＣＲを用いる
ことにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８６））。Ｒ
ＮＡあるいはｃＤＮＡはまた、同じ目的のために使用さ
れ得る。例として、Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
が、Ｇタンパク質共役型レセプター変異を同定および解
析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物の
サイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標
識されたＧタンパク質共役型レセプターＲＮＡまたは、
あるいは、放射性標識されたＧタンパク質共役型レセプ
ターアンチセンスＤＮＡ配列に、増幅されたＤＮＡをハ
イブリダイズさせることにより同定され得る。完全に対
合した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差に
より、誤対合した二本鎖と区別され得る。
【０１２８】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解
能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにお
いて区別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分
的融解温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される
（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１
２４２（１９８５）を参照のこと）。
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解
能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにお
いて区別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分
的融解温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される
（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１
２４２（１９８５）を参照のこと）。
【０１２９】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。
【０１３０】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直
接的なＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例え
ば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡ
のサザンブロッティングのような方法によって達成され
得る。
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直
接的なＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例え
ば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡ
のサザンブロッティングのような方法によって達成され
得る。
【０１３１】より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検
出され得る。
列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検
出され得る。
【０１３２】本発明はまた、種々の組織における本発明
のレセプターポリペプチドの可溶形態の変化したレベル
を検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来す
るサンプル中の可溶レセプターポリペプチドのレベルを
検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知で
あり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析、および好ましくはＥＬＩ
ＳＡアッセイを含む。
のレセプターポリペプチドの可溶形態の変化したレベル
を検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来す
るサンプル中の可溶レセプターポリペプチドのレベルを
検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知で
あり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析、および好ましくはＥＬＩ
ＳＡアッセイを含む。
【０１３３】ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｇタンパク質共役
型レセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する工程を最初に含
む。さらに、このモノクローナル抗体に対するレセプタ
ー抗体が調製される。放射能、蛍光、またはこの実施例
において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出
可能な試薬がレセプター抗体に付着される。ここでサン
プルは、宿主から取り出され、そして固体支持体（例え
ば、サンプル中のタンパク質に結合するポリスチレンデ
ィッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッ
シュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、非特異的
タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュ
ベートすることにより被覆される。次いで、モノクロー
ナル抗体は、ディッシュ内でインキュベートされ、この
間、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに
付着された任意のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質に付着する。全ての非結合モノクローナル抗体は、
緩衝液により洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキ
シダーゼに連結されたレセプター抗体はディッシュ内に
入れられ、これによりＧタンパク質レセプターに結合し
た任意のモノクローナル抗体へレポーター抗体が結合す
る。次いで、付着されなかったレポーター抗体は洗い流
される。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュ
に添加され、そして所定の期間における発色量が、標準
曲線と比較した場合の所定容量の患者サンプルに存在す
るＧタンパク質共役型レセプターの測定値である。
型レセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する工程を最初に含
む。さらに、このモノクローナル抗体に対するレセプタ
ー抗体が調製される。放射能、蛍光、またはこの実施例
において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出
可能な試薬がレセプター抗体に付着される。ここでサン
プルは、宿主から取り出され、そして固体支持体（例え
ば、サンプル中のタンパク質に結合するポリスチレンデ
ィッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッ
シュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、非特異的
タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュ
ベートすることにより被覆される。次いで、モノクロー
ナル抗体は、ディッシュ内でインキュベートされ、この
間、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに
付着された任意のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質に付着する。全ての非結合モノクローナル抗体は、
緩衝液により洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキ
シダーゼに連結されたレセプター抗体はディッシュ内に
入れられ、これによりＧタンパク質レセプターに結合し
た任意のモノクローナル抗体へレポーター抗体が結合す
る。次いで、付着されなかったレポーター抗体は洗い流
される。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュ
に添加され、そして所定の期間における発色量が、標準
曲線と比較した場合の所定容量の患者サンプルに存在す
るＧタンパク質共役型レセプターの測定値である。
【０１３４】本発明はまた、レセプターに結合し得るこ
とが知られていないリガンドが、このようなレセプター
に結合し得るか否かを決定するための方法を提供する。
この方法は、レセプターに対するリガンドの結合を許容
する条件下で、レセプターを発現する哺乳動物細胞とリ
ガンドとを接触させる工程、レセプターに結合するリガ
ンドの存在を検出する工程、これによりリガンドがレセ
プターに結合するか否かを決定する工程を包含する。ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するため
の本明細書上記の系はまた、レセプターに結合するリガ
ンドを決定するために使用され得る。
とが知られていないリガンドが、このようなレセプター
に結合し得るか否かを決定するための方法を提供する。
この方法は、レセプターに対するリガンドの結合を許容
する条件下で、レセプターを発現する哺乳動物細胞とリ
ガンドとを接触させる工程、レセプターに結合するリガ
ンドの存在を検出する工程、これによりリガンドがレセ
プターに結合するか否かを決定する工程を包含する。ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するため
の本明細書上記の系はまた、レセプターに結合するリガ
ンドを決定するために使用され得る。
【０１３５】本発明はまた、レセプターをコードするｍ
ＲＮＡの存在を検出することにより、細胞の表面上の本
発明のレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を
提供する。この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを得る工
程、そしてそのように得られたｍＲＮＡと、レセプター
をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的
にハイブリダイズし得る少なくとも１０ヌクレオチドの
核酸分子を含む核酸プローブとを、ハイブリダイズする
条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズし
たｍＲＮＡの存在を検出する工程、それにより細胞によ
るレセプターの発現を検出する工程を包含する。
ＲＮＡの存在を検出することにより、細胞の表面上の本
発明のレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を
提供する。この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを得る工
程、そしてそのように得られたｍＲＮＡと、レセプター
をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的
にハイブリダイズし得る少なくとも１０ヌクレオチドの
核酸分子を含む核酸プローブとを、ハイブリダイズする
条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズし
たｍＲＮＡの存在を検出する工程、それにより細胞によ
るレセプターの発現を検出する工程を包含する。
【０１３６】本発明はまた、本発明のレセプターポリペ
プチドに関連するレセプターを同定するための方法を提
供する。これらの関連するレセプターは、本発明のレセ
プターポリペプチドに対する相同性により、低ストリン
ジェンシークロスハイブリダイゼーションにより、また
は関連する天然のリガンドまたは合成のリガンドと相互
作用するレセプターおよび／または本発明のレセプター
ポリペプチドの遺伝的または薬理学的妨害後に、類似の
挙動を誘発するレセプターを同定することにより、同定
され得る。
プチドに関連するレセプターを同定するための方法を提
供する。これらの関連するレセプターは、本発明のレセ
プターポリペプチドに対する相同性により、低ストリン
ジェンシークロスハイブリダイゼーションにより、また
は関連する天然のリガンドまたは合成のリガンドと相互
作用するレセプターおよび／または本発明のレセプター
ポリペプチドの遺伝的または薬理学的妨害後に、類似の
挙動を誘発するレセプターを同定することにより、同定
され得る。
【０１３７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定す
る必要性がある。現在、染色体位置の標識化に利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識
化試薬はほとんどない。本発明のＤＮＡの染色体へのマ
ッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との
相関における重要な第１工程である。
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定す
る必要性がある。現在、染色体位置の標識化に利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識
化試薬はほとんどない。本発明のＤＮＡの染色体へのマ
ッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との
相関における重要な第１工程である。
【０１３８】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプ
ライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、
これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プ
ライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみ
が増幅フラグメントを生じる。
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプ
ライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、
これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プ
ライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみ
が増幅フラグメントを生じる。
【０１３９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ
ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用い
るプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よる前選択を包含する。
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ
ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用い
るプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よる前選択を包含する。
【０１４０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短
いｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説につ
いては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短
いｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説につ
いては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１４１】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能であ
る）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能であ
る）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１４２】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要
がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察さ
れるが、いずれの正常な個体には観察されない場合、こ
の変異は疾患の原因因子であるようである。
ＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要
がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察さ
れるが、いずれの正常な個体には観察されない場合、こ
の変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１４３】物理的マッピング技術および遺伝子マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する）。
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する）。
【０１４４】このポリペプチド、そのフラグメントまた
は他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体
であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、お
よびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、または
Ｆａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で
公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生のために使用され得る。
は他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体
であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、お
よびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、または
Ｆａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で
公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生のために使用され得る。
【０１４５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られることができる。この動物は、好ましくは非ヒトで
ある。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペ
プチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチド
のフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然の
ポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用
され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチ
ドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使
用され得る。
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られることができる。この動物は、好ましくは非ヒトで
ある。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペ
プチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチド
のフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然の
ポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用
され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチ
ドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使
用され得る。
【０１４６】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
【０１４７】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体を発現するために使用され得る。
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体を発現するために使用され得る。
【０１４８】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０１４９】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。
【０１５０】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、ま
たは公開された手順に従って入手可能なプラスミドから
構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野において公知であり、そして当業
者には明らかである。
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、ま
たは公開された手順に従って入手可能なプラスミドから
構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野において公知であり、そして当業
者には明らかである。
【０１５１】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的のためには、典型的には１μｇのプ
ラスミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２単位の酵素
と共に約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミ
ド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のた
めには、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが、２０〜２
５０単位の酵素を用いてより大きな容量中で消化され
る。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量
は、製造者により特定される。３７℃で約１時間のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリア
クリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメ
ントを単離する。
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的のためには、典型的には１μｇのプ
ラスミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２単位の酵素
と共に約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミ
ド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のた
めには、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが、２０〜２
５０単位の酵素を用いてより大きな容量中で消化され
る。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量
は、製造者により特定される。３７℃で約１時間のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリア
クリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメ
ントを単離する。
【０１５２】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８： ４０５７（１９８０）により記載された８
％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８： ４０５７（１９８０）により記載された８
％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０１５３】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
と共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチ
ドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
と共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチ
ドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。
【０１５４】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供しなければ、連結は公知の緩衝液および条件を使用
して、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供しなければ、連結は公知の緩衝液および条件を使用
して、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０１５５】他に記載しない限り、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．
およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ
れるように、形質転換を実施した。
およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ
れるように、形質転換を実施した。
【０１５６】
【実施例】（実施例１ Ｇタンパク質共役型レセプター
の細菌発現および精製）レセプターをコードするＤＮＡ
配列（ＡＴＣＣ受託番号 ）を、プロセシングされたレ
セプタータンパク質（シグナルペプチド配列を除く）の
５’側およびこの配列、ならびにレセプター遺伝子の
３’側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて最初に増幅する。レセプターに
対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および
３’配列に添加した。５’オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、配列５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡ
ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴを有し、これはＥｃｏＲＩ
制限酵素部位、それに続くプロセシングされたタンパク
質コドンの推定末端アミノ酸から始まる１８ヌクレオチ
ドのレセプターコード配列を含む。３’配列、５’−Ｃ
ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＴは、ＨｉｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そ
して続いてレセプターの１８ヌクレオチドを含む。制限
酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素部
位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍ
ｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能
プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合
部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位
をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９
内に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコー
ドする配列とともにインフレームで挿入した。次いで、
連結混合物を用いて、Ｑｉａｇｅｎから商標Ｍ１５／ｒ
ｅｐ ４の下で入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定する。そしてアンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、そし
て制限酵素分析により確認した。
の細菌発現および精製）レセプターをコードするＤＮＡ
配列（ＡＴＣＣ受託番号 ）を、プロセシングされたレ
セプタータンパク質（シグナルペプチド配列を除く）の
５’側およびこの配列、ならびにレセプター遺伝子の
３’側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて最初に増幅する。レセプターに
対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および
３’配列に添加した。５’オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、配列５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡ
ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴを有し、これはＥｃｏＲＩ
制限酵素部位、それに続くプロセシングされたタンパク
質コドンの推定末端アミノ酸から始まる１８ヌクレオチ
ドのレセプターコード配列を含む。３’配列、５’−Ｃ
ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＣ
ＡＴＴは、ＨｉｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そ
して続いてレセプターの１８ヌクレオチドを含む。制限
酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素部
位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍ
ｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能
プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合
部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位
をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９
内に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコー
ドする配列とともにインフレームで挿入した。次いで、
連結混合物を用いて、Ｑｉａｇｅｎから商標Ｍ１５／ｒ
ｅｐ ４の下で入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定する。そしてアンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、そし
て制限酵素分析により確認した。
【０１５７】所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ
（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との
両方を補充したＬＢ培地中の液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２
５０の比で大規模な培養物に接種する。細胞を、６００
の光学密度（Ｏ．Ｄ．600）が０．４と０．６との間に
なるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピ
ル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍ
Ｍの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサ
ーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏの解放（ｃｌｅａ
ｒ）を誘導して遺伝子発現の増加を導く。細胞をさらに
３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により
収集した。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６Ｍグア
ニジンＨＣｌ中で可溶化した。明澄化後、可溶化レセプ
ターを、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質により堅
く結合され得る条件下で、ニッケル−キレートカラムに
おけるクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した
（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ４１１： １７７−１８４（１９８４））。
レセプタータンパク質を６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ
５．０）中でカラムから溶出し、そして再生の目的で、
３ＭグアニジンＨＣｌ，１００ｍＭリン酸ナトリウム、
１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭグルタ
チオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間
のインキュベーションの後、タンパク質を１０ｍＭリン
酸ナトリウムに対して透析した。
（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との
両方を補充したＬＢ培地中の液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２
５０の比で大規模な培養物に接種する。細胞を、６００
の光学密度（Ｏ．Ｄ．600）が０．４と０．６との間に
なるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピ
ル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍ
Ｍの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサ
ーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏの解放（ｃｌｅａ
ｒ）を誘導して遺伝子発現の増加を導く。細胞をさらに
３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により
収集した。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６Ｍグア
ニジンＨＣｌ中で可溶化した。明澄化後、可溶化レセプ
ターを、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質により堅
く結合され得る条件下で、ニッケル−キレートカラムに
おけるクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した
（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ４１１： １７７−１８４（１９８４））。
レセプタータンパク質を６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ
５．０）中でカラムから溶出し、そして再生の目的で、
３ＭグアニジンＨＣｌ，１００ｍＭリン酸ナトリウム、
１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭグルタ
チオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間
のインキュベーションの後、タンパク質を１０ｍＭリン
酸ナトリウムに対して透析した。
【０１５８】（実施例２ ＣＯＳ細胞中での組換えレセ
プターの発現）プラスミド、Ｇタンパク質共役型レセプ
ターＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮ
ＡＩ／Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起
点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、
およびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター。
レセプター前駆体全体およびその３’末端にインフレー
ムで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメン
トを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。
それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター
下に支配される。ＨＡタグは、先に記載された（Ｉ．Ｗ
ｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、
Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、お
よびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ ３７，７
６７）ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由
来のエピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク
質へのＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識す
る抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能に
なる。
プターの発現）プラスミド、Ｇタンパク質共役型レセプ
ターＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮ
ＡＩ／Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起
点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、
およびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター。
レセプター前駆体全体およびその３’末端にインフレー
ムで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメン
トを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。
それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター
下に支配される。ＨＡタグは、先に記載された（Ｉ．Ｗ
ｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、
Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、お
よびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ ３７，７
６７）ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由
来のエピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク
質へのＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識す
る抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能に
なる。
【０１５９】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する： レセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
受託番号第 号）を、以下の２つのプライマーを用いて
クローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲにより構
築した：５’プライマー（５’−ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴ−
３’）（配列番号５）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに
続く開始コドンから始まるレセプターコード配列の１８
ヌクレオチドを含む；３’配列、５’−ＣＴＡＧＣＴＣ
ＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧ
ＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴ
ＴＡＡＧ−３’（配列番号６）は、ＸｈｏＩ部位、翻訳
停止コドン、ＨＡタグ、およびレセプターコード配列の
最後の１８ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相
補的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くレ
セプターコード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止
コドン、およびＸｈｏＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ
フラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）
を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消
化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅ
ｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
９２０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から
単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限酵素分
析で調べた。組換えレセプターの発現のために、ＣＯＳ
細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））によ
り発現ベクターでトランスフェクトした。レセプターＨ
Ａタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法に
より検出した（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細
胞を、トランスフェクションの２日後、35Ｓ−システイ
ンで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして
細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５））で溶解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上
３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養
培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて
沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルにおいて分析した。
する： レセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
受託番号第 号）を、以下の２つのプライマーを用いて
クローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲにより構
築した：５’プライマー（５’−ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴ−
３’）（配列番号５）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに
続く開始コドンから始まるレセプターコード配列の１８
ヌクレオチドを含む；３’配列、５’−ＣＴＡＧＣＴＣ
ＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧ
ＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴ
ＴＡＡＧ−３’（配列番号６）は、ＸｈｏＩ部位、翻訳
停止コドン、ＨＡタグ、およびレセプターコード配列の
最後の１８ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相
補的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くレ
セプターコード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止
コドン、およびＸｈｏＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ
フラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）
を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消
化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅ
ｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
９２０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から
単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限酵素分
析で調べた。組換えレセプターの発現のために、ＣＯＳ
細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））によ
り発現ベクターでトランスフェクトした。レセプターＨ
Ａタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法に
より検出した（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細
胞を、トランスフェクションの２日後、35Ｓ−システイ
ンで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして
細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５））で溶解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上
３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養
培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて
沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルにおいて分析した。
【０１６０】（実施例３ バキュロウイルス発現系を用
いるＧタンパク質共役型レセプターのクローニングおよ
び発現）全長のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列（ＡＴＣＣ受託番号第号）を、この遺伝子の５’
配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅した：５’プライマーは、配
列５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣ
ＡＣＣＴＴＧＧＡＴ（配列番号７）を有し、そしてＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位（太字）と、それに続く真核生物細
胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
つのヌクレオチド（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，
１９６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、および
すぐ後ろにこのレセプター遺伝子の最初の１８ヌクレオ
チド（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を
含有する。
いるＧタンパク質共役型レセプターのクローニングおよ
び発現）全長のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列（ＡＴＣＣ受託番号第号）を、この遺伝子の５’
配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅した：５’プライマーは、配
列５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣ
ＡＣＣＴＴＧＧＡＴ（配列番号７）を有し、そしてＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位（太字）と、それに続く真核生物細
胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
つのヌクレオチド（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，
１９６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、および
すぐ後ろにこのレセプター遺伝子の最初の１８ヌクレオ
チド（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を
含有する。
【０１６１】３’プライマーは、配列５’−ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＴ−
３’（配列番号８）を有し、そして制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩの切断部位およびこのレセプター遺伝子
の３’非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。
次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで消化し、次いで実施例１に記載のように精製し
た。このフラグメントを、Ｆ２と呼ぶ。
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＴ−
３’（配列番号８）を有し、そして制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩの切断部位およびこのレセプター遺伝子
の３’非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。
次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで消化し、次いで実施例１に記載のように精製し
た。このフラグメントを、Ｆ２と呼ぶ。
【０１６２】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いる
レセプタータンパク質の発現のために用いる（総説につ
いて、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｈ，Ｇ．
Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。
この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアン
ウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的
なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容
易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに
続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同
方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェ
クトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換え
のためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他の
バキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わりに用い
られ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およ
びｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．および
Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７
０：３１−３９）。
の改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いる
レセプタータンパク質の発現のために用いる（総説につ
いて、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｈ，Ｇ．
Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。
この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアン
ウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的
なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容
易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに
続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同
方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェ
クトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換え
のためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他の
バキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わりに用い
られ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およ
びｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．および
Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７
０：３１−３９）。
【０１６３】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
実施例１に記載のように、１％アガロースゲルから単離
した。このベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
実施例１に記載のように、１％アガロースゲルから単離
した。このベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。
【０１６４】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、レセプター遺伝子
を有するプラスミド（ｐＢａｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を
含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列
を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、レセプター遺伝子
を有するプラスミド（ｐＢａｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を
含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列
を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１６５】５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：
７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０μ
ｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃｕｌ
ｏＧｏｌｄTMｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．）ととも
にコトランスフェクトした。
ｔｏｒを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：
７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０μ
ｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃｕｌ
ｏＧｏｌｄTMｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．）ととも
にコトランスフェクトした。
【０１６６】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒを、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフ
ェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混
合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次
いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含ま
ないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養
プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレートを、新た
に加えられた溶液を混合するために、前後に振動させ
た。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベート
した。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍ
ｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキ
ュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続け
た。
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒを、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフ
ェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混
合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次
いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含ま
ないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養
プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレートを、新た
に加えられた溶液を混合するために、前後に振動させ
た。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベート
した。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍ
ｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキ
ュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続け
た。
【０１６７】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。
【０１６８】ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。
【０１６９】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−レセ
プターで感染させた。６時間後、培地を除去し、そして
メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２
時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞
をさらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心
分離により収集し、そして標識されたタンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視
化した。
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−レセ
プターで感染させた。６時間後、培地を除去し、そして
メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２
時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞
をさらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心
分離により収集し、そして標識されたタンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視
化した。
【０１７０】（実施例４ ヒト組織におけるＧタンパク
質共役型レセプターの発現パターン）ノーザンブロット
分析を、ヒト組織におけるレセプターの発現レベルを調
べるために行った。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚ
ｏｌTMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２３ Ｓｏｕｔｈ ＬｏｏｐＥ
ａｓｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ７７０３３）を用いて
単離した。それぞれの特定したヒト組織から単離した約
１０μｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲルで分離し、
そしてナイロンフィルター上にブロットした（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
９））。標識反応を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍ
ｅ−Ｉｔキットに従って５０ｎｇのＤＮＡフラグメント
を用いて行った。標識したＤＮＡを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ
−５０カラムを用いて精製した（５ Ｐｒｉｍｅ−３
Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．５６０３Ａｒａｐａｈｏｅ Ｒｏ
ａｄ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ ８０３０３）。次いで、
フィルターを、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌで放射
能標識した全長レセプター遺伝子と、０．５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4（ｐＨ７．４）および７％ ＳＤＳ中で６５℃にて
一晩ハイブリダイズさせた。室温にて２回、そして６０
℃にて２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて
洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンを用い
て−７０℃にて一晩感光させた。レセプターに対するメ
ッセージＲＮＡは、骨格筋において豊富である。
質共役型レセプターの発現パターン）ノーザンブロット
分析を、ヒト組織におけるレセプターの発現レベルを調
べるために行った。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚ
ｏｌTMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２３ Ｓｏｕｔｈ ＬｏｏｐＥ
ａｓｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ７７０３３）を用いて
単離した。それぞれの特定したヒト組織から単離した約
１０μｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲルで分離し、
そしてナイロンフィルター上にブロットした（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
９））。標識反応を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍ
ｅ−Ｉｔキットに従って５０ｎｇのＤＮＡフラグメント
を用いて行った。標識したＤＮＡを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ
−５０カラムを用いて精製した（５ Ｐｒｉｍｅ−３
Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．５６０３Ａｒａｐａｈｏｅ Ｒｏ
ａｄ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ ８０３０３）。次いで、
フィルターを、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌで放射
能標識した全長レセプター遺伝子と、０．５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4（ｐＨ７．４）および７％ ＳＤＳ中で６５℃にて
一晩ハイブリダイズさせた。室温にて２回、そして６０
℃にて２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて
洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンを用い
て−７０℃にて一晩感光させた。レセプターに対するメ
ッセージＲＮＡは、骨格筋において豊富である。
【０１７１】（実施例５ 遺伝子療法を介しての発現）
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られ
た組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊（ｓｍａｌｌ ｃｈｕｎｋ）を、組織培
養フラスコの湿潤表面に置き、およそ１０片をそれぞれ
のフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉
し、そして室温にて一晩置く。室温にて２４時間後、フ
ラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固
着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％Ｆ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７
℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、
新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さら
に２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層を
トリプシン処理し、そしてより大きなフラスコ中に掻き
落とす。
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られ
た組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊（ｓｍａｌｌ ｃｈｕｎｋ）を、組織培
養フラスコの湿潤表面に置き、およそ１０片をそれぞれ
のフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉
し、そして室温にて一晩置く。室温にて２４時間後、フ
ラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固
着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％Ｆ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７
℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、
新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さら
に２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層を
トリプシン処理し、そしてより大きなフラスコ中に掻き
落とす。
【０１７２】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．
Ｔ．ら，ＤＮＡ，７： ２１９−２５（１９８８））
を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクタ
ーをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用
いて精製する。
に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．
Ｔ．ら，ＤＮＡ，７： ２１９−２５（１９８８））
を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクタ
ーをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用
いて精製する。
【０１７３】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはさ
らにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
の存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状
骨格ならびに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを一緒に加える。得られた混合物を、２つ
のフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結
混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこ
れを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有す
ることを確認する目的のために、カナマイシンを含有す
る寒天上にプレーティングする。
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはさ
らにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
の存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状
骨格ならびに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを一緒に加える。得られた混合物を、２つ
のフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結
混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこ
れを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有す
ることを確認する目的のために、カナマイシンを含有す
る寒天上にプレーティングする。
【０１７４】アンホトロピックなｐＡ３１７またはＧＰ
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有
するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増
殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地
に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用い
て形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝
子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この
時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる）。
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有
するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増
殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地
に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用い
て形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝
子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この
時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる）。
【０１７５】新鮮な培地を、形質導入したプロデューサ
ー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプ
ロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。感
染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリ
ポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデュー
サー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞
を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細
胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー
細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場
合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は
必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例え
ば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベク
ターを使用することが必要である。
ー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプ
ロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。感
染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリ
ポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデュー
サー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞
を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細
胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー
細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場
合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は
必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例え
ば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベク
ターを使用することが必要である。
【０１７６】次いで、操作された線維芽細胞を、単独
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアービーズ
上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれか
で宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質
産物を産生する。
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアービーズ
上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれか
で宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質
産物を産生する。
【０１７７】本発明の多数の改変および変更が、上記の
教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範
囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。
教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範
囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。
【０１７８】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定することを意味しない。
あり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定することを意味しない。
【０１７９】ヒトＧタンパク質共役型レセプターポリペ
プチド、およびこのようなポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え技術によりこのような
ポリペプチドを産生するための手順を開示する。このよ
うなポリペプチドを利用して、このようなポリペプチド
に対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するた
めの方法、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを
治療的に用いて、レセプターポリペプチドの過小発現お
よび過剰発現それぞれに関する症状を処置するための方
法もまた開示する。レセプター核酸配列における変異を
検出するための診断方法および宿主由来のサンプル中の
可溶性形態のレセプターのレベルを検出するための診断
方法もまた開示する。
プチド、およびこのようなポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え技術によりこのような
ポリペプチドを産生するための手順を開示する。このよ
うなポリペプチドを利用して、このようなポリペプチド
に対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するた
めの方法、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを
治療的に用いて、レセプターポリペプチドの過小発現お
よび過剰発現それぞれに関する症状を処置するための方
法もまた開示する。レセプター核酸配列における変異を
検出するための診断方法および宿主由来のサンプル中の
可溶性形態のレセプターのレベルを検出するための診断
方法もまた開示する。
【０１８０】
【発明の効果】本発明に従って、ヒトのＧタンパク質共
役型７−膜貫通レセプターポリペプチド、このようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、なら
びにこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
産生の方法、ならびにこのようなポリペプチドの作用を
阻害する方法を提供し得る。
役型７−膜貫通レセプターポリペプチド、このようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、なら
びにこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
産生の方法、ならびにこのようなポリペプチドの作用を
阻害する方法を提供し得る。
【０１８１】
【０１８２】
【表１Ａ】
【０１８３】
【表１Ｂ】
【０１８４】
【表１Ｃ】
【０１８５】
【表１Ｄ】
【０１８６】
【表１Ｅ】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のＧタンパク質共役型レセ
プターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配
列を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列
決定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行っ
た。
プターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配
列を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列
決定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行っ
た。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きの、本発明のＧタン
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂの続きの、本発明のＧタン
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃの続きの、本発明のＧタン
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、図１Ｄの続きの、本発明のＧタン
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
パク質共役型レセプターのｃＤＮＡ配列、および対応す
る推定アミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のＧタンパク質共役型レセ
プターとヒトアドレナリン作用性α2Ａレセプターとの
アミノ酸アラインメントを示す。
プターとヒトアドレナリン作用性α2Ａレセプターとの
アミノ酸アラインメントを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの続きの、本発明のＧタン
パク質共役型レセプターとヒトアドレナリン作用性α2
Ａレセプターとのアミノ酸アラインメントを示す。
パク質共役型レセプターとヒトアドレナリン作用性α2
Ａレセプターとのアミノ酸アラインメントを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 7/02 9/10 9/00 9/12 9/10 15/00 9/12 27/16 15/00 29/00 27/16 37/08 29/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 リ イ アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ， ホワード ランデ ィング ドライブ 16125 (72)発明者 マーク ディー． アダムス アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ノース ポトマック，ダフィーフ ドライ ブ 15205 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA13 HA01 4C084 AA02 AA06 AA13 BA03 CA53 DC50 NA14 ZA072 ZA342 ZA362 ZA392 ZA422 ZA532 ZA812 ZB132 ZC332 ZC352 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA07 ZA34 ZA36 ZA39 ZA42 ZA53 ZA81 ZB13 ZC33 ZC35
Claims (1)
- 【請求項１】 以下からなる群から選択されるメンバー
を含む単離されたポリヌクレオチド： （ａ） 図１Ａ〜Ｅに記載のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ） ＡＴＣＣ受託番号 において含まれるＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌク
レオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
ド；および（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポ
リヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149809A JP2002360250A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトｇタンパク質レセプターｈｉｂｅｆ５１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149809A JP2002360250A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトｇタンパク質レセプターｈｉｂｅｆ５１ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09500376 Division |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002360250A true JP2002360250A (ja) | 2002-12-17 |
Family
ID=19194720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002149809A Pending JP2002360250A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトｇタンパク質レセプターｈｉｂｅｆ５１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002360250A (ja) |
-
2002
- 2002-05-23 JP JP2002149809A patent/JP2002360250A/ja active Pending
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040629 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
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|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041105 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041129 |