KR19990022378A - 사람 ｇ-단백질 결합된 수용체(ｈｅｔｇｑ23) - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드 및 이와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA(RNA), 및 이와 같은 폴리펩타이드를 재조합 기술에 의해 생산하는 방법을 기술하고 있다. 또한, 이와 같은 폴리펩타이드를 사용하여 이와 같은 폴리펩타이드에 대한 길항제 및 효능제를 동정하는 방법 및 치료학적 효능제 및 길항제를 사용하여 각각 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드의 저발현 및 저발현과 관련된 질환을 치료하는 방법이 기술되어 있다. 또한, G-단백질 결합된 수용체 핵산 서열에서의 돌연변이체 및 변화된 수준의 가용성 형태의 수용체를 검출하는 진단 방법이 기술되어 있다.

Description

사람 Ｇ-단백질 결합된 수용체(ＨＥＴＧＱ23)

본 발명은 새롭게 확인된 폴리뉴클레오타이드, 이와 같은 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이와 같은 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 용도 및 이와 같은 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 7-격막(transmembrane) 수용체이다. 또한, 본 발명은 이와 같은 폴리펩타이드의 작용을 억제시키는 것에 관한 것이다.

의학적으로 중요한 다수의 생물학적 과정이 G-단백질 및/또는 제2 메신저, 예를 들어 cAMP를 포함하는 시그날 형질도입 경로에 관여하는 단백질에 의해 매개된다[참조: Lefkowitz, Nature, 351: 353-354(1991)]. 본원에 있어서 이들 단백질은 G-단백질 또는 PPG 단백질을 포함하는, 경로에 관여하는 단백질로 언급된다. 이들 단백질의 몇몇 예에는 GPC 수용체, 예를 들어 아드레날린성 제제 및 도파민에 대한 수용체[참조: Kobilka, B. K., et al., PNAS, 84: 46-50(1987); Kobilka, B. K., et al., Science, 238: 650-656(1987); Bunzow, J.R., et al., Nature, 336: 783-787(1988)], G-단백질 자체, 효능제 단백질, 예를 들어 포스포리파제 C, 아데닐 사이클라제 및 포스포디에스테라제, 및 활성화 단백질, 예를 들어 단백질 키나제 및 단백질 키나제 C[참조: Simon, M.I., et al., Science, 252: 802-8 (1991)]이 포함된다.

예를 들면, 시그날 형질도입의 한가지 형태에 있어서 호르몬 결합의 효과는 세포내에서 효소, 즉 아데닐산 사이클라제를 활성화시키는 것이다. 호르몬에 의한 효소 활성화는 뉴클레오타이드 GTP의 존재에 따라 달라지며, 또한 GTP는 호르몬 결합에 영향을 미친다. G-단백질은 아데닐산 사이클라제에 호르몬 수용체를 연결시킨다. G-단백질은 호르몬 수용체에 의해 활성화되는 경우 GTP를 결합된 GDP로 교환시키는 것으로 밝혀졌다. G-단백질 자체에 의해 촉매되는 GTP의 GDP로의 가수분해는 G-단백질을 이의 기본적인 불활성 형태로 순환시킨다. 따라서, G-단백질은 수용체로부터 효능제로의 시그날을 중계하는 중간체로서 및 시그날의 존속을 조절하는 시계로서 이중 역할을 한다.

G-단백질 결합된 수용체의 막 단백질 유전자 상과(superfamily)는 7개의 추정된 격막 도메인을 갖는 것으로 특징지워진다. 이 도메인은 세포외 또는 세포질 루프에 의해 연결된 격막 α-헬릭스를 나타내는 것으로 생각된다. G-단백질 결합된 수용체는 호르몬, 바이러스, 성장 인자 및 신경수용체와 같이 다양한 생물학적 활성 수용체를 포함한다.

G-단백질 결합된 수용체의 특징은 약 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 7개의 본존된 소수성 스트렛치를 포함하고 8개 이상의 상이한 친수성 루프를 연결한다는 것이다. 결합된 수용체의 G-단백질 부류는 정신 및 신경 질환의 치료에 사용되는 신경 약물에 결합하는 도파민 수용체를 포함한다. 이러한 부류의 기타 구성원의 예에는 칼시토닌, 아드레날린, 엔도텔린, cAMP, 아데노신, 무스카린, 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 트롬빈, 키닌, 난포 자극 호르몬, 옵신, 내피 분화 유전자-1 수용체, 로돕신, 취기제, 사이토메갈로바이러스 수용체 등이 포함된다.

대부분의 G-단백질 결합된 수용체는 작용성 단백질 구조를 안정화시키는 것으로 생각되는 디설파이드 결합을 형성하는 최초 2개의 세포외 루프 각각에 단일 보존된 시스테인 잔기를 포함한다. 7개의 격막 영역은 TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 및 TM7로서 명명된다. TM3은 시그날 형질도입에 관여한다.

시스테인 잔기의 포스포릴화 및 지질화(팔미틸화 또는 파르네실화)는 일부 G-단백질 결합된 수용체의 시그날 형질도입에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 G-단백질 결합된 수용체는 제3의 세포질 루프내의 효능있는 포스포릴화 부위 및/또는 카복시 말단을 함유한다. β-아드레노수용체와 같은 몇몇 G-단백질 결합된 수용체의 경우, 단백질 키나제 A 및/또는 특이적 수용체 키나제가 수용체 탈감작을 매개한다.

일부 수용체의 경우, G-단백질 결합된 수용체의 리간드 결합 부위는 몇몇 G-단백질 결합된 수용체 격막 도메인에 의해 형성된 친수성 소켓을 포함하는 것으로 생각되는데, 이 소켓은 G-단백질 결합된 수용체의 소수성 잔기에 의해 둘러싸여 있다. G-단백직 결합된 수용체 격막 헬릭스 각각의 친수성 부분은 안쪽으로 향하여 극성 리간드 결합 부위를 형성하는 것으로 생각된다. TM3은 예를 들어 TM3 아스파라긴산염 잔기와 같은 리간드 결합 부위를 포함하기 때문에 몇몇 G-단백질 결합된 수용체와 관련된다. 추가로, TM5 세린, TM6 아스파라긴 및 TM6 또는 TM7 페닐알라닌 또는 티로신은 리간드 결합과 관련된다.

G-단백질 결합된 수용체는 이형삼량체 G-단백질에 의해 여러가지 세포내 효소, 이온 채널 및 운반체와 세포내에서 결합될 수 있다[참조: Johnson et al., Endoc., Rev., 10: 317-331(1989)]. 상이한 G-단백질 α-아단위는 특정 작동체를 바람직하게 자극하여 세포에서 다양한 세포 기능을 조절한다. G-단백질 결합된 수용체의 세포질 잔기의 포스포릴화는 일부 G-단백질 결합된 수용체의 G-단백질 결합하는 조절하기 위한 중요한 기작으로써 확인되었다. G-단백질 결합된 수용체는 포유동물 숙주의 다수 부위에서 발견된다.

본 발명의 한가지 양태에 따라서, 신규한 성숙 폴리펩타이드 및 생물학적으로 활성이고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편 및 유도체가 제공된다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 사람 기원이다.

본 발명의 또다른 양태에 따라서, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자뿐만 아니라, 이의 안티센스 동족체 및 생물학적으로 활성이고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합체 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 상기 폴리펩타이드의 발현을 촉진시키는 조건하에 배양한 다음 상기 폴리펩타이들 회수함을 포함하는, 재조합 기술에 의해 이와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 추가의 양태에 따라서 이와 같은 폴리펩타이드에 대한 항체가 제공된다.

본 발명의 추가의 또다른 양태에 따라서, 본 발명의 수용체 폴리펩타이드에 결합하고 이와 같은 수용체 폴리펩타이드를 활성화시키거나 이의 활성화를 억제시키는 화합물 및 수용체 리간드를 스크리닝하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 추가의 양태에 따라서, G-단백질 결합된 수용체의 저발현과 관련된 질환을 치료하기 위해 이와 같은 활성화 화합물을 사용하여 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 자극하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 추가의 양태에 따라서, 이와 같은 억제 화합물을 사용하여 G-단백질 결합된 수용체의 과발현과 관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 추가의 양태에 따라서, 수용체가 G-단백질 결합된 수용체 리간드를 결합시키거나 G-단백질 결합된 수용체 리간드 결합을 정량적 또는 정성적으로 조절할 수 있도록 본 발명의 G-단백질 결합된 수용체의 하나 이상의 격막 도메인을 갖는 단편, 컨센서스 단편 및/또는 보존된 아미노산 치환체를 갖는 서열인 비-천연 발생 합성의 분리된 및/또는 재조합 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 또다른 추가의 양태에 따라서, 이들의 예상되는 생물학적 특성에 기인하여 리간드에 결합하거나 리간드 결합을 조절함으로써 G-단백질 결합된 수용체 기능의 효능있는 조절제로서 유용하고 진단 분야, 치료 분야 및/또는 연구 분야에 유용할 수 있는 합성 또는 재조합 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드, 이의 보존 치환체 및 유도체, 항체, 항-유전자형 항체, 조성물 및 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 목적은 수용체 유형 및 아유형으로서 여러가지 G-단백질 결합된 수용체 또는 이의 단편을 억제시키거나 이와 유사하게 작제된 합성의 분리된 또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 양태에 따라서 본 발명의 핵산 서열과 하이브리드화하기에 충분한 길이를 갖는 핵산 분자를 포함하는 진단 프로브가 제공된다.

본 발명의 또다른 목적에 따라서, 본 발명의 핵산 서열중의 돌연변이와 관련된 질환 또는 질환에 대한 민감성을 검출하기 위한 진단 분석법이 제공된다.

본 발명의 이러한 양태 및 기타 양태는 본원의 교시로부터 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 명백해질 것이다.

하기 도면은 단지 본 발명의 양태를 예시하기 위한 것이며, 청구의 범위에 포함된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 G-단백질 결합된 수용체의 cDNA 서열 및 상응하는 추정된 아미노산 서열을 도시한다. 아미노산에 대한 표준 1문자 약어를 사용한다. 서열 분석은 373 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 수행한다.

도 2는 본 발명의 폴리펩타이드(상부 라인) 및 사람 내피 분화 단백질(edg-1) 유전자 mRNA(하부 라인)간의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다.

도 3은 G-단백질 결합된 수용체의 2차 구조 특징을 설명하는 것이다. 제1의 7개 설명은 알파 헬릭스, 베타 쉬트, 회전 영역 또는 코일 영역인 아미노산 서열의 영역을 기재한다. 박스화된 부분은 지시된 영역에 상응하는 부분이다. 도면들의 제2 세트는 세포내, 세포질에 노출되거나 막-확장되어 있는 아미노산 서열의 부분이다. 소수성 부분은 막의 지질 이층내에 존재하는 단백질 부분, 즉 소수성 부분이고, 지질 이층 막의 외부 부분은 친수성이다. 항원성 부분이 지질 이층 막의 외부에 존재하고 항원을 결합시킬 수 있기 때문에 항원성 인덱스는 친수성 플롯에 상응한다. 또한, 표면 가능성 플롯은 항원성 인덱스 및 친수성 플롯에 상응한다. 양성 플롯은 극성 및 비극성인 13개 서열의 영역을 나타낸다. 유연성 영역은 유성성 영역이 막 외부에 존재하고 격막 영역이라는 점에서 제2 세트의 설명에 상응한다.

본 발명의 한가지 양태에 따라서, 도 1의 추정된 아미노산 서열(서열 2)을 갖는 성숙 폴리펩타이드 또는 1995년 4월 28일자로 ATCC 기탁번호 제97130호로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오타이드)이 제공된다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 사람 부신 종양 조직으로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 분리되었다. 이는 G 단백질-결합된 수용체 부류와 구조적으로 관련되어 있다. 364개 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 당해 단백질은 364개 아미노산 스트렛치에 대해 상동성 36% 및 유사성 61%을 갖는 사람 EDG-1 단백질에 대해 최고의 상동성을 나타낸다. 본 발명의 수용체 폴리펩타이드에 대한 효능있는 리간드에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아난드아미드, 세로토닌, 아드레날린 및 노르아드레날린, 혈소판 활성화 인자, 트롬빈, C5a 및 브라디키닌, 케모킨 및 혈소판 활성환 인자가 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA의 형태로 존재할 수 있는데, DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수도 있으며, 일본쇄인 경우 암호화쇄 또는 비암호화(안티센스) 쇄일 수 있다. 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1에 도시된 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일하거나, 유전 코드의 풍부 또는 변성으로 인해 암호화 서열이 도 1의 DNA(서열 1) 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1의 성숙 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 성숙 폴리펩타이드에 대한 유일한 암호화 서열; 성숙 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열(및 임의의 추가의 암호화 서열) 및 인트론과 같은 비-암호화 서열 또는 성숙 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'을 포함할 수 있다.

따라서, 용어 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 추가의 암호화 서열 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

추가로, 본 발명은 도 1의 추정된 아미노산 서열(서열 2)을 갖는 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 천연 발생 대립유전자 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드의 비-천연 발생 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1에 도시된 것과 동일한 성숙 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라, 변이체가 도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 포함한다. 이와 같은 뉴클레오타이드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체가 포함된다.

상기 기술된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 도 1에 도시된 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 천연 발생 대립유전자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실 또는 부가되고 암호화된 폴리펩타이드의 기능이 실질적으로 변화지 않은 또다른 형태의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 TM으로부터 절단된 폴리펩타이드의 세포외 부분 및 본 발명의 전체 길이의 폴리펩타이드의 세포내 도메인인 본 발명의 가용성 형태의 수용체 폴리펩타이드를 암호화한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명의 폴리펩타이드의 정제를 가능케 하는 마커 서열과 프레임내에서 융합된 암호화 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커와 융합된 성숙 폴리펩타이드를 정제하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 택(tag)이거나, 예를 들어 마커 서열은 포유 동물 숙주, 예를 들어 COS-7 세포를 사용하는 경우 헤마글루티닌(HA) 택일 수도 있다. HA 택은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37: 767(1984)].

용어 유전자는 폴리펩타이드 쇄의 생산과 관련된 DNA의 세그먼트를 의미하며, 암호화 영역 전후의 영역(리더 및 트레일러)뿐만 아니라 개개 암호화 세그먼트(엑손) 사이에 개재 서열(인트론)을 포함한다.

완전한 길이의 본 발명의 유전자의 단편은 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용하여 완전한 길이의 유전자를 분리하고 유전자와 고도의 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 기타 유전자를 분리할 수 있다. 이러한 형태의 프로브는 바람직하게는 20개 또는 30개 이상의 염기를 가지며, 예를 들어 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 또한, 당해 프로브를 사용하여 완전한 길이의 전사물 및 게놈 클론 또는 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 본 발명의 완전한 유전자를 함유하는 클론에 상응하는 cDNA 클론을 확인할 수 있다. 스크리닝의 예는 공지된 DNA 서열을 사용하여 유전자의 암호화 영역을 분리함으로써 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자 서열과 상보성인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 프로브가 라이브러리의 어떠한 구성원과 하이브리드화되는지를 측정하기 위해 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝한다.

본 발명은 또한 서열간의 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95% 이상인 상기 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에 상술된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 엄격한 조건은 서열간의 상동성이 95% 이상 및 바람직하게는 97% 이상인 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 상술된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 도 1의 cDNA(서열 1) 또는 기탁된 cDNA(들)에 의해 암호화된 성숙 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

다른 한편으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하고 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 상동성을 가지며 상술된 바와 같이 활성을 갖거나 갖지 않는 20개 이상의 염기, 바람직하게는 30개 이상, 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 염기를 가질 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 서열 1의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드의 회수를 위한 프로브로서 또는 진단용 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와의 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95% 이상인 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라, 20개 또는 30개 이상의 염기 및 바람직하게는 50개 이상의 염기를 가지는 이의 단편 및 이와 같은 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본원에 언급된 기탁물(들)은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 유지될 것이다. 이들 기탁물은 본 기술분야의 전문가에게 편의를 위해서만 제공된 것이고, 기탁이 35 U.S.C. §112하에 요구되는 승인은 아니다. 기탁된 미생물중에 함유된 폴리뉴클레오타이드의 서열 및 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 본원에 참조로서 혼입되며, 본원에서 모든 서열 기술과 관련하여 충돌하는 경우에 제어된다. 기탁된 미생물의 제조, 사용 또는 판매에는 라이센스가 요구될 것이며, 이 문서에 의해서는 이와 같은 라이센스는 허여되지 않는다.

본 발명은 또한 도 1의 추정된 아미노산 서열(서열 2) 또는 기탁된 cDNA(들)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 가지는 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이와 같은 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 언급할 경우에, 용어 단편, 유도체 및 동족체는 이와 같은 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성, 즉 G-단백질 결합된 수용체로서의 기능을 본질적으로 보유하거나, 당해 폴리펩타이드가 G-단백질 결합된 수용체, 예를 들어 가용성 형태의 수용체로서 기능하지 않을지라도 리간드 또는 수용체를 결합시키는 능력을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 동족체는 프로프로테인 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성의 성숙 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 프로프로테인을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 재조합체 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 재조합체 폴리펩타이드이다.

도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 잔기)로 치환되어 있고, 이와 같은 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화되거나 암호화되지 않을 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙 폴리펩타이드가 또다른 화합물, 예를 들어 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예: 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되어 있는 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 성숙 단백질과 융합되어 있는 것 또는 (v) 폴리펩타이드의 단편이 가용성, 즉 막을 결합시키지는 않으나 막 결합된 수용체에 리간드를 결합시키는 것일 수 있다. 이와 같은 단편, 유도체 및 동족체는 본원의 교시로부터 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 범주내에 포함된다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 동종성으로 될때까지 정제된다.

용어 분리된은 당해 물질이 이의 본래 환경(예: 천연 발생인 경우에 천연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물내에 존재하는 천연-발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않지만, 천연 시스템중에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된다. 이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부분일 수 있고/있거나 이와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부분일 수 있으며, 또한 이러한 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 폴리펩타이드(특히 성숙 폴리펩타이드)뿐만 아니라 서열 2의 폴리펩타이드와 유사성이 70% 이상인 폴리펩타이드(바람직하게는 70% 이상의 상동성) 및 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 유사성이 90% 이상인 폴리펩타이드(더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성) 및 더욱 특히 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 유사성이 95% 이상인 폴리펩타이드(더욱 바람직하게는 90%의 상동성)를 포함하며, 또한 이와 같은 폴리펩타이드의 부분이 일반적으로 30개 이상의 아미노산 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 이와 같은 폴리펩타이드의 부분을 포함한다.

본 기술분야에 공지된 바와 같이 두 개의 폴리펩타이드 사이의 유사성은 제2의 폴리펩타이드의 서열과 제1의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 비교함으로써 결정된다.

본 발명의 폴리펩타이드의 단편 또는 부분은 펩타이드 합성에 의해 상응하는 완전한-길이의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 당해 단편은 완전한 길이의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 부분은 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오타이드를 합성하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

숙주 세포는 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 사용하여 일반적으로 유전자 조작(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)된다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 유전자 조작된 숙주 세포는 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별 또는 G-단백질 결합된 수용체 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킬 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용된 것들이며, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술에 의해 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 다양한 발현 벡터중의 어느 하나에 포함시킬 수 있다. 이와 같은 벡터에는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV 40의 유도체; 세균 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA의 배합물로부터 유도된 벡터, 우두, 아데노바이러스, 계두 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이러스 DNA가 포함된다. 그러나, 숙주에서 복제 가능하고 생존할 수 있는한 기타 모든 벡터를 사용할 수 있다.

적절한 DNA 서열은 여러 가지 공정에 의해 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 본 기술분야에 공지된 공정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위에 삽입된다. 이와 같은 공정 및 기타 공정은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 범위내에 포함될 것이다.

발현 벡터중의 DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하기 위해 적절한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동적으로 연결된다. 이와 같은 프로모터의 대표적인 예로서는 다음과 같은 것들을 언급할 수 있다: LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac 또는 trp, 파지 람다 P_L프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 프로모터. 또한, 발현 벡터는 해독 개시 및 전사 종결을 위한 리보솜 결합 부위를 함유한다. 또한, 이들 벡터는 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유하여, 진핵 세포 배양물에 대한 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 또는 이. 콜라이에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공한다.

상술된 바와 같은 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 단백질을 발현시키는 적절한 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

적절한 숙주의 대표적인 예로서는 다음과 같은 것들을 언급할 수 있다: 이. 콜라이(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmolnella typhimurium); 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보우(Bow) 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적절한 숙주의 선별은 본원의 교시로부터 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 범위내에 포함될 것이다.

더욱 특히, 본 발명은 또한 상기 광범위하게 기술된 바와 같은 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합체 작제물을 포함한다. 당해 작제물은 본 발명의 서열이 전 배향 또는 역 배향으로 삽입되어 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 본 양태의 바람직한 관점에 있어서, 작제물은 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지되어 있으며, 상업상 이용가능하다. 벡터의 예는 다음과 같다: 세균: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pBS, 파게스크립트, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); 진핵 세포: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia). 그러나, 숙주에서 복제 가능하고 생존 가능한 한 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터를 사용할 수 있다.

프로모터 영역은 선별 가능한 마커를 갖는 CAT(클로람페니콜 트란스퍼라제) 벡터 또는 기타 벡터를 사용하여 임의의 목적하는 유전자로부터 선별할 수 있다. 2개의 적절한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특히 명명된 세균 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L및 trp이다. 진핵 세포 프로모터는 CMV 이미디어트 어얼리, HSV 티미딘 키나제, 어얼리 및 레이트 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I이 포함된다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선별은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자의 범위에 포함된다.

추가의 양태에 있어서, 본 발명은 상술된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 예를 들어 포유 동물 세포와 같은 고도의 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 저급 진핵 세포이거나, 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염 또는 전기천공[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)]에 의해 수행할 수 있다.

숙주 세포중의 작제물을 사용하여 통상의 방법으로 재조합체 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 생산할 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 펩타이드 합성기에 의해 합성적으로 생산할 수 있다.

성숙 단백질은 적절한 프로모터의 조절하에 포유동물 세포, 효모, 세균 또는 기타 세포에서 발현시킬 수 있다. 세포-유리 해독 시스템을 또한 사용하여, 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 이와 같은 단백질을 생산할 수 있다. 원핵 숙주 및 진핵 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 삽입된다.

고도의 진핵 생물에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 벡터내로 인헨서 서열을 삽입시킴으로써 증가된다. 인헨서는 프로모터상에서 작용하여 이의 전사를 증가시키는, 일반적으로 약 10 내지 300bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 이의 예에는 복제 기원 bp 100 내지 270의 레이트 부위상의 SV40 인헨서, 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인헨서, 복제 기원의 레이트 부위상의 폴리오마 인헨서 및 아데노바이러스 인헨서가 포함된다.

일반적으로, 재조합체 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 가능케 하는 복제 기원 및 선별가능한 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TRP1 유전자의 암피실린 내성 유전자, 및 하향 구조 서열의 전사를 유도하기 위해 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 이와 같은 프로모터는 여러 가지 중에서 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제와 같은 글리콜 분해 효소를 암호화하는 오페론 또는 열 충격 단백질로부터 유도될 수 있다. 이종성 구조 서열은 적절한 상에서 해독 개시 서열 및 종결 서열과 함께 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 목적하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합체 생성물의 안정화 또는 단순한 정제를 부여하는 N-말단 확인 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

세균용으로 유용한 발현 벡터는 적합한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께 작동가능한 리딩 상에서 기능적 프로모터에 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 삽입함으로써 작제할 수 있다. 당해 벡터는 하나 이상의 표현형 선별가능한 마커 및 복제 기원을 포함하여, 벡터를 유지시키고 필요한 경우 숙주내에서 증폭시킬 것이다. 형질전환을 위한 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 다양한 종이 포함되며, 또한 기타 숙주도 취사 선택하여 사용할 수 있다.

비제한적인 예로서, 세균용으로 유용한 발현 벡터는 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 상업상 입수가능한 플라스미드로부터 유도된 선별가능한 마커 및 세균 복제 기원을 포함할 수 있다. 이와 같은 상업용 벡터에는 예를 들어 pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)가 포함된다. 이들 pBR322 본쇄 부분은 적절한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 조합된다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적절한 세포 밀도로 숙주 균주를 증식시킨 다음, 적절한 수단(예: 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 선별된 프로모터를 유도하고, 세포를 추가의 기간동안 배양한다.

세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄되며, 수득된 조 추출물은 추가의 정제를 위해 저장된다.

단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-해빙 사이클링, 초음파 처리, 기계적 분쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 통상의 방법에 의해 분쇄시킬 수 있고, 이와 같은 방법은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지되어 있다.

또한, 여러 가지 포유동물 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합체 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23: 175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 적합한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHOHS293, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기원, 적합한 프로모터 및 인헨서를 포함할 것이며, 또한 모든 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이싱 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랭킹 비전사된 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이싱, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비전사된 유전적 요소를 제공할 수 있다.

본 발명의 G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드를 회수하고, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 락틴 크로마토그래피를 포함하는 상기 사용된 방법에 의해 재조합체 세포 배양물로부터 정제할 수 있다. 필요한 경우 단백질 재구성 단계를 성숙 단백질의 배열 완결시에 사용할 수 있다. 마지막으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 마지막 정제 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 천연적으로 정제된 생성물, 또는 화학적 합성 공정의 생성물, 또는 원핵 또는 진핵 숙주(예: 배지중의 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포)로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물일 수 있다. 재조합 생산 공정에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 글리코실화시키거나 비-글리코실화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 최초의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 G-단백질 결합된 수용체는 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 활성화(효능제) 또는 활성화를 억제(길항제)시키는 화합물을 스크리닝하는 방법에서 사용될 수 있다.

일반적으로, 이와 같은 스크리닝 공정은 이의 표면상에서 본 발명의 수용체 폴리펩타이들 발현시키는 적적한 세포를 제공하는 것이다. 이와 같은 세포에는 포유동물, 효모, 드로소필라 또는 이. 콜라이가 포함된다. 특히, 본 발명의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 이에 의해 G-단백질 결합된 수용체를 발현시키는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이어서, 발현된 수용체를 시험 화합물과 접촉시켜 결합, 기능적 반응의 자극 또는 억제를 관찰한다.

이와 같은 한가지 스크리닝 공정은 본 발명의 G-단백질 결합된 수용체를 발현시키도록 형질감염된 멜라닌보유 세포를 사용하는 것이다. 이와 같은 스크리닝 기술은 1992년 2월 6일자로 공개된 PCT WO92/01810에 기재되어 있다.

따라서, 예를 들어 이와 같은 검정을 사용하여 수용체 리간드 및 스크리닝될 화합물 모두와 수용체를 암호화하는 멜라닌보유 세포를 접촉시켜 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 리간드에 의해 생성된 시그날의 억제는 화합물이 수용체에 대한 효능있는 깅항제, 즉 수용체의 활성화를 억제시킴을 나타낸다.

이와 같은 세포를 스크리닝될 화합물과 접촉시키고, 이와 같은 화합물이 시그날을 생성, 즉 수용체를 활성화시키는지를 측정함으로써, 수용체를 활성화시키는 화합물을 측정하기 위해 스크리닝을 사용할 수 있다.

기타 스크리닝 기술은 예를 들어 문헌[참조: Science, volume 246, pages 181-296(October 1989)]에 기술된 바와 같이 수용체 활성화에 의해 유발된 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템에서 G-단백질 결합된 수용체(예를 들어 형질감염된 CHO 세포)를 발현시키는 세포를 하용하는 것이다. 예를 들어 당해 화합물을 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 발현시키는 세포와 접촉시키고, 제2 메신저 반응, 예를 들어 시그날 형질도입 또는 pH 변화를 측정하여 효능있는 화합물이 수용체를 활성화시키거나 억제하는지를 결정할 수 있다.

이와 같은 스크리닝의 또다른 기술은 G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 RNA를 제노푸스 난모세포내로 도입시켜 수용체를 잠재적으로 발현시키는 것이다. 이어서, 수용체 난모세포를 수용체 리간드 및 스크리닝될 화합물과 접촉시키고, 칼슘 시그날의 억제 또는 활성화를 검출하여 수용체의 활성화를 억제시키는 것으로 여겨지는 화합물에 대해 스크리닝한다.

또다른 스크리닝 기술은 수용체가 포스포리파제 C 또는 D와 연결되어 있는 G-단백질 결합된 수용체를 발현시키는 것이다. 이와 같은 세포의 대표적인 예로서는 내피 세포, 평활근 세포, 태아 신장 세포 등을 언급할 수 있다. 스크리닝은 상기 기술된 바와 같이 포스포리파제 2차 시그날로부터 수용체의 활성화 또는 수용체의 활성화의 억제를 검출함으로써 달성할 수 있다.

또다른 방법은 이의 표면상에 수용체를 갖는 세포에 대한 표지된 리간드의 결합 억제를 검출함으로써 본 발명 길항제의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제하는 화합물을 스크리닝하는 것이다. 이와 같은 방법은 세포가 세포 표면상에서 수용체를 발현시키도록 진핵 세포를 G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 DNA로 형질감염시키고 표지된 형태의 공지된 리간드의 존재하에 세포를 화합물과 접촉시키는 것이다. 리간드는 예를 들어 방사선활성에 의해 표지할 수 있다. 수용체에 결합된 표지된 리간드의 양은 예를 들어 수용체의 방사선활성을 측정하여 측정한다. 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 감소로 측정된 바와 같이 당해 화합물이 수용체에 결합하는 경우, 수용체에 대한 표지된 리간드의 결합은 억제된다.

G-단백질 결합된 수용체는 포유동물 세포중에 편재하고 있으며, 많은 병인을 포함하는 다수의 생물학적 기능에 기인할 수 있다. 따라서, 하편으로는 G-단백질 결합된 수용체를 자극하고 다른 한편으로는 G-단백질 결합된 수용체의 기능을 억제시킬 수 있는 화합물 및 약물을 발견할 필요가 있다.

예를 들면, G-단백질 결합된 수용체를 활성화시키는 화합물은 치료학적 목적, 예를 들어 천식, 파킨슨 질환, 급성 심장 질환, 고혈압, 폐뇨 및 골다공증의 치료에 사용될 수 있다.

일반적으로, G-단백질 결합된 수용체의 활성화를 억제하는 화합물은 다양한 치료학적 목적, 예를 들어 고혈압, 협심증, 심근 경색, 궤양, 천식, 알레르기, 양성 전립선 비대, 조병 흥분, 우울, 정신착란, 치매를 포함하는 및 정신분열 또는 중증의 지능 미숙, 운동장애, 예를 들어 헌팅톤 질환 또는 무엇보다도 실스 델타 토우렛 증후군의 치료에 사용될 수 있다. 또한, G-단백질 결합된 수용체를 억제하는 화합물은 내인성 식욕감퇴 및 이상 식욕 항진의 조절에 유용하다.

항체는 본 발명의 G-단백질 결합된 수용체, 또는 일부 경우에 G-단백질 결합된 수용체에 결합하지만 제2 메신저 반응을 유도하지 못하는 올리고펩타이드를 길항시켜 G-단백질 결합된 수용체의 활성을 예방한다. 항체에는 항체의 항원-결합 부위와 일반적으로 관련되는 독특한 결정기를 인식하는 항-유전자형 항체를 포함한다. 또한, 효능있는 길항제 화합물은 G-단백질 결합된 수용체의 리간드, 즉 생물학적 기능을 상식하고, G-단백질 결합된 수용체에 결합하는 경우 반응을 유도하지 못하는 리간드의 단편과 밀접하게 관련된 단백질을 포함한다.

안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물을 이용하여 삼중-헬릭스 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA에 의해 유전자 발현을 조절할 수 있으며, 이 두가지 방법은 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드의 결합에 기초하고 있다. 예를 들면, 본 발명의 성숙 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40개 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 작제한다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사와 관련된 유전자 영역과 상보성이 되도록 설계하고[참조: 삼중 헬릭스-Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073(1979); Cooney et al, Science, 241: 456(1988); and Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)], 이에 의해 G-단백질 결합된 수용체의 전사 및 생성을 예방한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 하이브리드화하고, G-단백질 결합된 수용체내에서 mRNA 분자의 해독을 차단한다[참조: 안티센스-Okano, J. Neurochem., 56:3 560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]. 또한, 상술된 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 G-단백질 결합된 수용체의 생성을 억제할 수 있도록 세포로 전달될 수 있다.

또한, G-단백질 결합된 수용체에 결합하고, 정상의 생물학적 활성이 억제되어 리간드에 접근할 수 없게 하는 소형 분자를 사용하여 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제시킬 수 있다.

본 발명에 폴리펩타이드에 대한 리간드를 결합시키고 리간드가 막 결합된 G-단백질 결합된 수용체과 상호작용하지 못하게 함으로써 가용성 형태의 G-단백질 결합된 수용체, 예를 들어 수용체의 단편을 사용하여 수용체의 활성화를 억제시킬 수 있다.

본 발명은 추가로 상술된 바와 같은 억제제 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 G-단백질 결합된 수용체에 대한 리간드의 결합을 차단시키거나 2차 시그날을 억제시키기에 효과적인 양으로 투여하여 이상 질환을 완화시킴을 포함하여, 과다한 G-단백질 결합된 수용체와 관련된 이상 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명은 또한 상술된 바와 같은 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 활성화시키는 치료학적 유효량의 화합물을 약제학적으로 허용되는 염과 배합하여 환자에게 투여하여 이상 질환을 완화시킴을 포함하여, G-단백질 결합된 수용체의 저발현과 관련된 이상 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

가용성 형태의 G-단백질 결합된 수용체, 및 이와 같은 수용체를 활성화 또는 억제시키는 화합물은 적합한 약제학적 담체와 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 조성물은 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이와 같은 담체에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물이 포함된다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 약제학적 조성물 성분이 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이와 같은 용기(들)와 관련하여 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규율하는 정부 당국에 의해 규정된 형태에 유의하여야 하며, 이는 사람 투여를 위해 제조, 이용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한 것이다. 또한, 약제학적 조성물은 다른 치료학적 화합물과 결합하여 사용될 수 있다.

약제학적 조성물은 통상의 방법, 예를 들어 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내 또는 경피 경로에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 특정한 징후의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 일반적으로, 이들은 체중 kg당 약 10μg 이상의 양으로 투여되며, 대부분의 경우에 1일당 체중 kg당 약 8mg을 초과하지 않는 양으로 투여될 것이다. 대부분의 경우, 용량은 투여 경로, 징후 등에 따라 1일당 체중 kg당 약 10μg 내지 약 1mg이다.

또한, G-단백질 결합된 수용체 폴리펩타이드, 및 이를 활성화 또는 억제시키는 화합물은 종종 유전자 치료로서 언급되는, 생체내에서 이와 같은 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

따라서, 예를 들어 세포를 생체외에서 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)로 유전자 조작할 수 있으며, 이어서 유전자 조작된 세포를 폴리펩타이드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 이와 같은 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 함유 레트로바이러스 입자를 사용하여 유전자 조작할 수 있다.

유사하게는, 세포는 예를 들어 본 기술분야에 공지된 방법에 따라 생체내에서 유전자 조작하여 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 함유 레트로바이러스 입자를 생산하는 생산자 세포는 환자에게 투여되어 생체내에서 세포를 유전자 조작하고 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 이와 같은 방법에 의해 투여하는 이들 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백해질 것이다. 예를 들면, 세포를 유전자 조작하기 위한 발현 비히클은 레트로바이러스 입자 이외의 것, 예를 들어 아데노바이러스일 수 있으며, 적합한 전달 비히클롸 배합한 다음 이를 사용하여 생체내에서 세포를 유전자 조작할 수 있다.

상술된 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 유도할 수 있는 레트로바이러스는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 몰로니 쥐 백혈구 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어 로우스 육종 바이러스, 하베이 육종 바이러스, 유인원 백혈구 바이러스, 긴팔원숭이 백혈구 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스가 포함된다. 한가지 양태에 있어서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 쥐 백혈구 바이러스로부터 유도된다.

벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터[참조: Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990(1989)], 또는 임의의 기타 프로모터(예: 이로써 제한되는 것은 아니지만 히스톤, pol III 및 β-액틴 프로모터를 포함하는 진핵 세포 프로모터와 같은 세포 프로모터)가 포함된다. 사용될 수 있는 기타 바이러스 프로모터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 포함된다. 적합한 프로모터의 선별은 본원의 교시로부터 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백해질 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 존재한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터; 또는 이종성 프로모터, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터; 호흡 신시셜 바이러스(RSV) 프로모터, 유도성 프로모터, 예를 들어 MMT 프로모터; 메탈로티오네인 프로모터; 열 충격 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR(상술된 바와 같은 변형된 레트로바이러스 LTR를 포함함); β-액틴 프로모터 및 사람 성장 호르몬 프로모터가 포함된다. 또한, 프로모터는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 조절하는 천연 프로모터일 수 있다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 생산자 세포주를 형성하기 위해 패키징 세포주를 형질도입시킬 수 있다. 형질감염시킬 수 있는 패키징 세포주의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, vol. 1, pgs. 5-14(1990)]에 기술된 DNA 세포주가 포함되며, 상기 문헌은 본원에 참조로서 삽입된다. 벡터는 본 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이와 같은 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 전기천공, 리포좀의 사용 및 CaPO₄침전이 포함된다. 다른 한편으로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀내로 캡슐화시키거나, 지질과 결합시킨 다음 숙주에 투여할 수 있다.

생산자 세포주는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생산한다. 이어서, 이와 같은 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 진핵 세포를 형질도입할 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현시킬 수 있다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 배 암 세포, 및 조혈 간세포, 간세포, 섬유아세포, 근원세포, 케라티노사이트, 내피 세포 및 기관지 상피 세포가 포함된다.

또한, 본 발명은 G-단백질 결합된 수용체에 대한 리간드의 결합을 가능케 하는 조건하에 리간드와 G-단백질 결합된 수용체를 발현시키는 포유동물 세포를 접촉시키고, 수용체에 결합하는 리간드의 존재를 검출하여 리간드가 G-단백질 결합된 수용체에 결합하는지를 측정함을 포함하여, 본 발명의 G-단백질 결합된 수용체와 결합할 수 있는 것으로 알려져 있지 않은 리간드가 이와 같은 수용체에 결합할 수 있는지를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 분리된 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 다수의 약물과 접촉시키는 단계, 포유동물 세포에 결합하는 이들 약물을 측정하는 단계, 및 본 발명의 사람 G-단백질 결합된 수용체와 특이적으로 상호작용하고 이에 결합하는 약물을 확인하는 단계를 포함하여, 약물을 스크리닝하여 세포 표면상의 사람 G-단백질 결합된 수용체와 특이적으로 상호작용하고 이에 결합하는 약물을 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포로부터 전체 mRNA를 수득하는 단계, 이렇게 수득한 mRNA를 사람 G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 핵산 분자의 서열내에 포함된 서열과 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 본 발명의 핵산 프로브와 하이브리드화 조건하에 접촉시키는 단계, 프로브와 하이브리드화된 mRNA의 존재를 검출하는 단계, 및 세포에 의한 G-단백질 결합된 수용체의 발현을 검출하는 단계를 포함하여, G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 mRNA의 존재를 검출함으로써 세포 표면상에서 G-단백질 결합된 수용체의 발현을 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 돌연변이와 연관된 질환 또는 질환에 대한 민감성을 검출하는 진단 분석법의 방편으로서 G-단백질 결합된 수용체 유전자의 용도에 관한 것이다. 상기 질환은 예를 들어 종양 및 암과 같은 세포 형질전환과 연관되어 있다.

사람 G-단백질 결합된 수용체 유전자의 돌연변이를 함유하는 환자는 여러 가지 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들어 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 및 부검 물질로부터 수득될 수 있다. 검출을 위해 게놈 DNA를 직접 사용할 수 있으며, 또한 분석전에 PCR[참조: Saiki et al., Nature, 324: 163-166(1986)]을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. 또한, 동일한 목적으로 RNA 또는 cDNA를 사용할 수도 있다. 예를 들면, G-단백질 결합된 수용체를 암호화하는 핵산에 상보성인 PCR 프라이머를 사용하여 G-단백질 결합된 수용체 돌연변이를 확인 및 분석할 수 있다. 예를 들면, 결실물 및 삽입물은 정상 게놈형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기 변화로 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 방사선 표지된 G-단백질 결합된 수용체 RNA 또는 방사선 표지된 G-단백질 결합된 수용체 안티센스 DNA 서열과 증폭된 DNA를 하이브리드화시켜 확인할 수 있다. 완전하게 매칭된 서열은 RNase A 분해 또는 융점의 차이에 의해 미스매칭된 이본쇄와 구별할 수 있다.

관련 유전자 및 변이체 함유 유전자 간의 서열 차이는 직접적인 DNA 서열분석 방법에 의해 발혀진다. 또한, 클론된 DNA 세그먼트를 프로브로서 사용하여 특이적 DNA 세그먼트를 검출할 수 있다. 이 방법에 대한 민감성은 PCR과 배합하는 경우 크게 향상된다. 예를 들면, 서열분석 프라이머는 이본쇄 PCR 생성물 또는 변형된 PCR에 의해 생성된 일본쇄 주형으로 사용된다. 서열 결정은 방사선 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 통상의 공정 또는 형광-택을 사용한 자동화 서열분석 공정에 의해 수행한다.

DNA 서열 차이에 기초한 유전자 시험은 변성제를 사용하거나 사용하지 않으면서 겔중에서 DNA 단편의 전기영동 이동성의 변화를 검출함으로써 달성될 수 있다. 작은 서열 결실물 및 삽입물은 고분해 겔 전기영동법에 의해 가시화할 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 이들의 특정한 융점 또는 부분적 융점에 따라 상이한 DNA 단편의 이동이 상이한 위치에서 겔내에서 지연되는 포름아미드 구배 겔의 변성에 따라 구별할 수 있다[참조: Myers et al., Science, 230: 1242(1985)].

또한, 특정한 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 검정 또는 화학적 절단 방법에 의해 나타날 수 있다[참조: Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401(1985)].

따라서, 특이적 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 시퀀싱과 같은 방법 또는 제한 효소(예: 제한 단편 길이 다형태(RFLP))의 사용 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.

더욱 통상적인 겔-전기영동법 및 DNA 서열화 이외에, 또한 자체 분석에 의해 돌연변이를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 여러 가지 조직에서 본 발명에 따른 가용성 형태의 변화된 수준의 수용체 폴리펩타이드를 검출하는 진단 검정법에 관한 것이다. 숙주로부터 유도된 샘플중에서 가용성 수용체 폴리펩타이듸 수준을 검출하기 위해 사용된 검정법은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지되어 있으며, 방사선 면역검정, 경쟁-결합 검정, 웨스턴 블롯팅 검정 및 바람직하게는 ELISA 검정 검정이 있다.

ELISA 검정은 먼저 수용체 폴리펩타이드의 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다. 또한, 리포터 항체는 모노클로날 항체에 대해 제조된다. 리포터 항체에 방사활성, 형광 또는 예를 들어 고추냉이 퍼옥시다제 효소와 같은 검출 가능한 시약을 부착시킨다. 이어서, 샘플을 숙주로부터 제거하고, 샘플중의 단백질을 결합시키는 고체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 접시상에서 항온처리한다. 이어서, 소 혈청 알부민과 같은 비-특이적 단백질과 함께 항온처리함으로써 접시상의 모든 유리 단백질의 결합 부위를 덮는다. 이어서, 폴리스티렌 접시에 부착된 본 발명의 모든 폴리펩타이드에 모노클로날 항체가 부착되는 동안에 모노클로날 항체를 접시에서 항온처리한다. 결합되지 않은 모든 모노클로날 항체를 완충액으로 세척하여 제거한다. 이어서, 고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 접시에 넣어서 목적하는 폴리펩타이드에 결합된 모든 모노클로날 항체에 리포터 항체를 결합시킨다. 이어서, 부착되지 않은 리포터 항체를 세척한다. 이어서, 부착되지 않은 리포터 항체를 세척 제거한다. 이어서, 퍼옥시다제 기질을 접시에 가하고, 표준 곡선과 비교하는 경우 주어진 시간에서 현상된 색깔의 양은 주어진 환자 샘플의 용적내에 존재하는 수용체 단백질 양의 측정치이다.

또한, 본 발명의 서열은 염색체 확인을 위해 유용하다. 당해 서열은 개개 사람 염색체상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되고, 특정 위치와 하이브리드화될 수 있다. 게다가, 염색체상의 특정 부위를 확인하기 위해 현재 요구된다. 실제 서열 데이터(반복 다형성)에 기초하는 소수의 염색체 표시 시약은 염색체 위치를 표시하기 위해 현재 이용가능하다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNA 맵핑은 질환과 관련된 유전자를 이들 서열과 관련시키는 중요한 첫 번째 단계이다.

요약하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15-25bp)를 제조함으로써 염색체에 대한 서열을 맵핑할 수 있다. 3' 비해독된 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA에서 하나 이상의 엑손을 연장하지 않는 프라이머를 신속히 선별함으로써 증폭 공정이 복잡하게 될 수 있다. 이어서, 이들 프라이머는 각각의 사람 염색체를 함유하는 체세포 하이드리드의 PCR 스크리닝에 사용된다. 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이드리드만이 증폭된 단편을 생성할 것이다.

체세포 하이브리드의 PCR 맵핑은 특정한 DNA를 특정한 체세포에 지정하는 신속한 공정이다. 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 본 발명을 이용하면, 특이적 염색체로부터의 단편의 패널 또는 거대한 게놈 클론의 풀을 동일한 방법으로 아국소화시킬 수 있다. 이의 염색체를 맵핑하기 위해 유사하게 사용될 수 있는 기타 맵핑 방법은 특정부 하이브리드화가 포함되며, 이는 표지된 유동-분류된 염색체로 예비 스크리닝하고 하이브리드화에 의해 예비선별하여 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하는 것이다.

중기 염색체 연장으로 cDNA 클론의 형광 특정부 하이브리드화(FISH)를 사용하여 1단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이 기술은 50개 또는 60개 염기쌍과 같은 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 본 기술에 비추어, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조하라.

정확한 염색체 위치에 대한 서열이 맵핑되면, 염색체상의 서열의 물리적 위치를 유전적 맵 데이터와 상호관련시킬 수 있다. 이와 같은 데이터는 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 입수 가능한 정보)]에서 발견된다. 이어서, 동일한 염색체 영역에서 맵핑된 유전자와 질환의 상관관계를 결합 분석을 통해 확인한다(물리적으로 인접한 유전자의 상속성).

이어서, 발병된 환자와 발병되지 않은 환자 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 측정해야 한다. 돌연변이가 임의의 정상 환자에서가 아니라 발병된 환자 전부 또는 일부에서 관찰되면, 돌연변이는 질환의 유발제인 것으로 간주한다.

물리적 맵핑 및 유전적 맵핑 기술의 현재의 분석과 관련하여, 질환과 관련된 염색체 영역에서 정확하게 국소화된 cDNA는 50개 내지 500개의 잠재적인 유발 유전자중의 하나일 수 있다(이것은 1메가베이스 맵핑 분석 및 20kb당 하나의 유전자를 추정한다).

폴리펩타이드, 이들의 단편 또는 기타 유도체, 또는 이의 동족체, 또는 이를 발현하는 세포는 이에 대한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 이들 항체는 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메릭성의 일본쇄 사람 항체 및 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 본 기술분야에 공지된 여러 가지 공정을 이와 같은 항체 및 단편의 생산에 사용할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는 당해 폴리펩타이드를 동물내로 직접 주사하거나 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 이어서, 이렇게 수득된 항체는 폴리펩타이드 자체와 결합할 것이다. 이 방법에 있어서, 당해 폴리펩타이드의 단편만을 암호화하는 서열을 사용하여 전체의 순수한 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 이어서, 이와 같은 항체를 사용하여 당해 폴리펩타이드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩타이드를 분리할 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 모든 기술을 사용할 수 있다. 이의 예에는 하이브리도마 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497], 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 및 사람 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]이 포함된다.

일본쇄 항체에 대해 기술된 기술[참조: 미국 특허 제4,946,778호]을 적용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 일본쇄 항체를 생산할 수 있다. 또한, 유전자 이식 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 사람 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명은 하기 실시예와 관련하여 추가로 기술될 것이다. 하지만, 이와 같은 실시예로 본 발명은 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 달리 언급되지 않으면, 모든 부 및 양은 중량에 의한 것이다.

하기 실시예의 이해를 돕기 위하여, 특히 빈번히 나오는 방법 및/또는 용어를 기술할 것이다.

플라스미드는 대문자 및/또는 수자 전후에 소문자 p로 표시된다. 본원의 출발 플라스미드는 상업상 입수가능하고 비제한적 근거하에 공개적으로 입수가능하거나, 공개된 방법에 따라 입수가능한 플라스미드로부터 작제할 수 있다. 또한, 기술된 플라스미드와 동등한 플라스미드는 본 기술분야에 공지되어 있고, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 명백할 것이다.

DNA의 분해는 DNA중의 특정한 서열에서만 작용하는 제한 효소를 사용한 DNA의 촉매적 절단을 의미한다. 본원에 사용된 여러 가지 제한 효소는 상업상 입수가능하고, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 알려진 바와 같이 이들의 반응 조건, 보조 인자 및 기타 요구조건이 사용된다. 분석을 위해 플라스미드 또는 DNA 단편 1μg은 전형적으로 완충액 약 20μl중의 효소 약 2단위와 함께 사용된다. 플라스미드 작제물에 대한 DNA 단편을 분리하기 위해 DNA 5 내지 50μg은 전형적으로 보다 큰 용적중의 효소 20 내지 250단위로 분해된다. 특정한 제한 효소에 대한 적절한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 지시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되지만, 공급업자의 지시에 따라 달라질 수 있다. 분해시킨 후, 반응은 폴리아크릴아미드 겔상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리한다.

절단된 단편의 크기 분별은 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

올리고뉴클레오타이드는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성될 수 있는 2개의 상보성 폴리데옥시뉴클레오타이드를 의미한다. 이와 같은 합성 올리고뉴클레오타이드는 5' 포스페이트를 포함하지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 가하여 또다른 올리고뉴클레오타이드에 연결시켜야 한다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

연결은 2개의 이본쇄 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 언급한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 달리 제시되지 않으면, 연결은 연결되는 대략 동일 몰량 DNA 단편의 0.5μg당 T4 DNA 리가제(리가제) 10단위와 함께 공지된 완충액 및 조건을 사용하여 수행할 수 있다.

달리 언급되지 않으면, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457(1973)]의 방법에 기술된 바와 같이 수행한다.

실시예 1

G-단백질 결합된 수용체(GPCR) 폴리펩타이드의 세균 발현 및 정제

GPCR를 암호화하는 DNA 서열(ATCC #97,130)을 처리된 GPTC 단백질의 5' 및 3' 말단 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. GPCR 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 추가의 뉴클레오타이드를 각각 5' 및 3' 서열에 부가한다. 5' 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 5' CACAGGATCCCGTGGCTGCCATCTCTACTTC 3'(서열 3)을 가지며, BamHT 제한 효소 부위를 함유하고, 이의 뒤에 처리된 단백질의 추정된 제2 아미노산으로부터 출발하는 GPCR 암호화 서열이 위치한다. 3' 서열; 5' TCTCAGGTACCGTTCTCTAAACCACAGAGTGGTCA 3'(서열 4)는 ASP718 부위에 대한 상보성 서열을 함유하고, 뒤에 GPCR 암호화 서열의 19개 뉴클레오타이드가 위치한다. 제한 효소 부위는 세균 발현 벡터 pQE-31상의 제한 효소 부위에 상응한다[참조: Qiagen, Inc. Chatsworth, CA]. pQE-31은 항생제 내성(Amp^r), 세균 복제 기원(ori), IPTG-조절 가능한 프로모터 작동자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 택 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 이어서, pQE-31을 BamHT 및 ASP718로 분해한다. 증폭된 서열은 pQE-31에 연결시키고, 프레임내에서 히스티딘 택 및 RBS를 암호화하는 서열에 삽입한다. 이어서, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 공정에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(Qiagen, Inc)을 형질전환시킨다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 복수 카피를 함유하는데, 이는 lacI 억제제를 발현시키고 카나마이신 내성(Kan')을 제공한다. 형질전환체를 LB 플레이트상에서 성장하는 이들의 능력에 의해 확인하고, 암피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 분석에 의해 확인한다.

목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100μg/ml) 및 Kan(25μg/ml) 모두로 보충된 LB 배지중의 액체 배양액에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 거대 배양물을 접종시킨다. 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)에서 세포를 성장시킨다. 이어서, 최종 농도 1mM로 IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)를 가한다. IPTG는 lacI 리프레서를 활성화시키고 P/O를 제거하여 유전자 발현을 증가시킨다. 세포를 추가로 3 내지 4시간 동안 성장시킨다. 이어서, 원심분리에 의해 세포를 수거한다. 세포 펠렛을 카오트로픽제 6M 구아니딘 HCl에 용해시킨다. 분별한 후, 6-His 택을 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합시키는 조건하에 니켈-킬레이트 칼럼상에서 크로마토그래피에 의해 당해 용액으로부터 용해된 용해된 GPCR를 정제한다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184(1984)]. GPCR를 pH 5.0의 6M 구아니딘 HCl중의 칼럼으로부터 용출시키고, 변성을 위해 3M 구아니딘 HCl, 100mM 인산나트륨, 10mM 글루타티온(환원됨) 및 2mM 글루타티온(산화됨)으로 조절한다. 당해 용액을 12시간 동안 배양한 후, 단백질을 10mM 인산나트륨에 투석한다.

실시예 2

COS7 세포에서 재조합체 GPCR의 발현

플라스미드 GPCR HA의 발현은 (1) SV40 복제 기원, (2) 암피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기원, (4) 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위 앞의 CMV 프로모터를 함유하는 벡터 pcDNA3/Amp(Invitrogen)로부터 유도한다. 전체 GPCR 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 프레임내에서 이의 3' 말단과 융합된 HA 택을 벡터의 폴리링커 영역으로 클로닝하고, 이렇게 하여 재조합체 단백질의 발현을 CMV 프로모터의 조절하에 유도한다. HA 택은 상술된 바와 같은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37: 767]. 표적 단백질에 HA 택의 주입은 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합체 단백질을 용이하게 검출케 한다.

플라스미드의 작제 방법은 다음과 같다:

GPCR를 암호화하는 DNA 서열(ATCC #97,130)은 2개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 작제된다: 5' 프라이머 5' CAACCACAGGGATCCCATGGCTGCCATCTCTACTTCCATCCCTGTA 3'(서열 5)은 개시 코돈에서 출발하는 GPCR 암호화 서열의 27개 뉴클레오타이드 앞에 BamHI 부위(굵게 표시)를 함유하고, 3' 서열 5' CCCCTCGAGCTAAACCACAGAGTGGTCATTGCTGTGAACTCCAGCC 3'(서열 6)은 XhoI 부위(굵게 표시)에 대한 상보성 서열, 해독 종결 코돈, HA 택 및 GPCR 암호화 서열의 마지막 24개 뉴클레오타이드를 함유한다(종결 코돈은 포함하지 않는다). 따라서, PCR 생성물은 HindIII 부위, 프레임내에서 융합된 HA 택 앞의 GPCR 암호화 서열, HA 택 다음의 전사 종결 정지 코돈 및 XhoI 부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNA3/Amp를 각각의 HindIII 및 XhoI 제한 효소로 분해하고, 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5α로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트상에 도말한 다음 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리하고, 정확한 단편의 존재를 제한 분석에 의해 검사한다. 재조합체 GPCR의 발현을 위해, COS7 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다. GPCR HA 단백질의 발현은 방사선 표지화 및 면역침전 방법[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)]에 의해 검출한다. 세포를 형질감염후 2일 경과하여 8시간 동안³⁵S-시스테인으로 표지한다. 이어서, 배양 배지를 수집하고, 세포를 세정제[RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)][참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984)]로 용균시킨다. 세포 용균물 및 배양물 모두를 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전시킨다. 침전된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔상에서 분석한다.

실시예 3

바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 GPCR의 클로닝 및 발현

완전한 길이의 GPCR 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97,130)를 하기 5' 및 3' 유전자 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 서열 5' TTCACCACCTACCTGGATCCACAGAGCTGTCATGGCTGCC 3'(서열 7)을 가지고, BamHI 제한 효소 부위(굵게 표시)를 함유하며, 당해 유전자의 최초 18개 뉴클레오타이드(해독을 위한 개시 코돈 ATG는 밑줄되어 있다) 바로 뒤에 위치하는 진핵 세포에서 해독 개시를 위한 효율적인 시그날을 닮은 11개 뉴클레오타이드가 뒤에 위치한다[참조: Kozac, M., J. Mol. Biol., 196: 947-950(1987)].

3' 프라이머는 서열 5' CCTCATCTCAGGTACCGTTCTAAACCACAGAGTGG 3'(서열 8)을 가지고, 제한 엔도뉴클레아제 Asp718 및 GPCR 유전자의 3' 비-해독된 서열에 상보성인 10개 뉴클레오타이드를 함유한다. 증폭된 서열을 상업상 입수가능한 키트를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다[참조: Geneclean BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.]. 이어서, 이 단편을 각각 엔도뉴클레아제로 분해하고, 1% 아가로즈 겔상에서 다시 정제한다. 이 단편을 F2로 명명한다.

벡터 pA2(하기 기술된 바와 같은 pVL941 벡터의 변형)는 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 GPCR 단백질 발현에 사용된다[참조: Summers, M. D. and Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 이 발현 벡터는 위에 제한 엔도뉴클레아제 BamHI에 대한 인식 부위가 위치된 오토그라프 캘리포니아 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터를 함유한다. 원숭이 바이러스 (SV)40의 폴리아데닐화 부위는 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용된다. 재조합체 바이러스의 선별을 위해 이. 콜라이로부터의 베타-갈라토시다제 유전자를 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날 앞의 폴리헤드린 프로모터와 동일한 배향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열은 동시-형질감염된 야생형 바이러스 DNA의 세포-매개된 상동성 재조합을 위해 바이러스 서열에 의해 양측에서 플랭킹되어 있다. pAc373, pVL941, pRG1 및 pAcIM1과 같은 pA2 대신에 기타 많은 바쿨로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[참조: Luckow, V. A. and Summers, M. D., Virology, 170: 31-39].

플라스미드를 제한 효소 ASP718 및 BamHT로 분해하고, 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈포스포릴화시킨다. 이어서, DNA를 상업상 입수가능한 키트를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다[참조: Geneclean BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.]. 이 벡터를 V2로 명명한다.

단편 F2 및 탈포스포릴화된 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시키고, 제한 효소 BamHI를 사용하여 GPCR와 함께 플라스미드(pBacGPCR)를 함유하는 세균을 확인한다. 클론된 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인한다.

플라스미드 pBacGPCR 5μg을 지방감염 방법[참조: Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417(1987)]을 사용하여 상업상 입수가능한 선형 바쿨로바이러스[참조: BaculoGold^TM바쿨로바이러스 DNA, Pharmingen, San Diego, CA.] 1.0μg으로 동시-형질감염시킨다.

BaculoGold^TM바이러스 DNA 1μg 및 플라스미드 5μg을 혈청 유리 그레이스 배양액(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50μl를 함유하는 미소역가 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다. Lipofectin 10μl + 그레이스 배양액 90μl를 가한 후, 혼합하고 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 이어서, 형질감염 혼합물을 혈청없는 1ml 그레이스 배양액을 포함하는 35mm 조직 배양 플레이트에 시딩된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 플레이트를 앞뒤로 움직여서 새롭게 첨가된 용액을 혼합한다. 이어서, 플레이트를 5시간 동안 27℃에서 항온처리한다. 5시간 후, 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고, 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배양액 1ml를 가한다. 이 플레이트를 항온기에 다시 넣고, 27℃에서 4일 동안 계속 항온처리한다.

4일 후, 상청액을 수집하고, 플라크 검정을 상기 Summers 및 Smith 등의 문헌에 기술된 방법과 유사하게 수행한다. 변형으로서 Blue Gal[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg]를 포함하는 아가로즈 겔을 사용하여 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리한다(또한, 플라크 검정의 상세한 설명은 Life Technologies Inc., Gaithersburg, page 9-10에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이올로지에 대한 사용자 지침에서 발견될 수 있다).

멸균 희석후 4일 경과하여, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫의 팁으로 채집한다. 이어서, 재조합체 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배양액 200μl를 함유하는 에펜도르프 튜브에 재현탁시킨다. 아가를 단시간 원심분리에 의해 제거하고, 재조합체 바쿨로바이러스를 함유하는 상청액을 사용하여 35mm 접시에 시딩된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 경과하여, 이들 배양 접시의 상청액을 수집하고, 이어서 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 그레이스 배양액에서 성장시킨다. 2의 감염 중복도(MOI)에서 재조합체 바쿨로바이러스 V-GPCR로 세포를 감염시킨다. 6시간 경과하여, 배지를 제거하고, 메티오닌 및 시스테인이 없는 SF900 II 배양액으로 대체한다[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg]. 42시간 경과하여,³⁵S-메티오닌 5μCi 및³⁵S 시스테인 5μCi(Amersham)을 가한다. 인산염 완충액중에서 세포 용균에 의해 세포를 수집하고, 원심분리하여 세포 막을 수집한 다음 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동방사그라프에 의해 가시화한다.

실시예 4

유전자 치료에 의한 발현

섬유아세포는 피부 생검에 의해 개체로부터 수득한다. 수득된 조직은 조직-배양 배지에 넣고, 소형 조각으로 분리한다. 조직의 소형 조각을 조직 배양 플라스크의 습윤 표면상에 놓고, 약 10개의 조각을 각각의 플라스크에 넣는다. 당해 플라스크를 상하로 흔들고, 완전히 밀폐시킨 다음 실온에서 밤새 정치시킨다. 실온에서 24시간 경과한 후, 플라스크를 뒤집어서 잔류하는 조직의 조각을 플라스크의 하부에 고정시킨 다음 신선한 배지(예: 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 Ham's F12 배지)를 가한다. 이어서, 이것을 약 1주일 동안 37℃에서 항온처리한다. 이때, 신선한 배지를 가하고, 몇일마다 연속적으로 교환한다. 추가로 2주간 배양시킨 후, 섬유아세포의 단층이 출현한다. 단층을 트립신화시키고, 보다 큰 플라스크에 넣는다.

몰로니 쥐 육종 바이러스의 긴 말단 반복서열에 의해 플랭킹된 pMV-7[참조: Kirschmeier, P.T. et al, DNA, 7:219-25(1988)]을 EcoRI 및 HindII로 분해시키고, 이어서 송아지 장 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔상에서 분별하여 유리 비드로 정제한다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 각각 5' 및 3' 말단 서열에 상응하는 PCR 프라이머로 증폭시킨다. 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 함유하고, 3' 프라이머는 또한 HindII 부위를 포함한다. 동일량의 몰로니 쥐 육종 바이러스 선형 본쇄 및 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 T4 DNA 리가제의 존재하에 함께 가한다. 2개의 단편을 연결시키기에 적적한 조건하에 생성된 혼합물을 유지한다. 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질전환시키고, 이어서 아가-함유 카나마이신상에 도말하여 당해 벡터가 적절하게 삽입된 목적하는 유전자를 포함하는지를 확인한다.

10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)중에서 일정한 밀도로 조직 배양으로 양성 pA317 또는 GP+am12 팩킹 세포를 성장시킨다. 이어서, 당해 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 가하고, 팩키징 세포를 벡터에 형질도입한다. 이제, 팩키징 세포는 당해 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산한다(팩키징 세포는 이후 생산자 세포라 한다).

신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고, 연속적으로 배지를 계대배양 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 수거한다. 감염성 바이러스 입자를 함유하는 소비된 배지를 미공 여과지를 통해 여과하여 분리된 생산자 세포를 제거하고, 이어서 이 배지를 사용하여 섬유아 세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 계대배양 플레이트로부터 제거하고, 급속히 생산자 세포로부터의 배지로 대체한다. 이 배지를 제거하고, 신선한 배지로 대체한다. 바이러스의 역가가 높으면, 모든 섬유아세포는 수직적으로 감염될 것이고, 어떠한 선별도 불필요하다. 역가가 매우 낮으면, neo 또는 his와 같은 선별가능한 마커를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 사용해야 한다.

이어서, 유전자 조작된 섬유아세포는 단독으로 또는 성장시켜 사이토덱스 3 미세담체 비드상에서 계대배양한 후에 숙주내로 주입된다. 이제, 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산한다.

상술된 교시에 비추어 본 발명의 다수의 변형 및 변화가 가능할 수 있으므로, 특히 기술된 것이외의 본 발명을 첨부된 청구의 범위내에서 실시할 수도 있다.

서열 목록

(1) 일반 정보

(i) 출원인: 리 등

(ii) 발명의 명칭: 사람 G 단백질 결합된 수용체

(iii) 서열 수: 8

(iv) 서신 주소:

(A) 주소: 칼렐라, 바이른, 베인, 길필란, 세치, 스튜워트 및 올스테인

(B) 거리: 벡커 팜 로오드 6

(C) 도시: 로즈랜드

(D) 주: 뉴저지주

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 07068

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 형태: 3.5인치 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PS/2

(C) 운영 체계: MS-DOS

(D) 소프트웨어: WORD PERFECT 5.1

(vi) 현재 출원 정보:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(C) 분류 번호:

(vii) 선행 출원 정보:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(viii) 대리인/관리인 정보:

(A) 성명: 페라로 그레고리 디

(B) 등록 번호: 36,134

(C) 참조/도켓 번호: 325800-358

(xi) 통신 정보:

(A) 전화 번호: 201-994-1700

(B) 텔리 팩스: 201-994-1744

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 2456개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 364개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄의 수:

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 46개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

CAACCACAGG GATCCCATGG CTGCCATCTC TACTTCCATC CCTGTA 46

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 46개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

CCCCTCGAGC TAAACCACAG AGTGGTCATT GCTGTGAACT CCAGCC 46

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 40개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

TTCACCACCT ACCTGGATCC ACAGAGCTGT CATGGCTGCC 40

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: 올리고뉴클레오타이드

(xi) 서열 기술:

CCTCATCTCA GGTACCGTTC TAAACCACAG AGTGG 35

Claims (19)

1. (a) 서열 2에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

   (b) ATCC 기탁번호 제97,130호에 포함된 DNA에 의해 발현된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

   (c) 폴리뉴클레오타이드 (a) 또는 (b)와 하이브리드화할 수 있고 서열 상동성이 70% 이상인 폴리뉴클레오타이드; 및

   (d) 폴리뉴클레오타이드 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된 구성원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
2. 제1항에 있어서, 서열 2에 기술된 아미노산 제1번 내지 아미노산 제364번을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
3. 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터.
4. 제3항의 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포.
5. 제4항에 따른 숙주 세포로부터 상기 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시킴을 포함하여, 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
6. 제3항에 따른 벡터로 유전자 조작된 세포를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포를 생산하는 방법.
7. (i) 서열 2의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 단편, 동족체 및 유도체, 및

   (ii) ATCC 기탁번호 제97,130호의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 이의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리펩타이드.
8. 제7항에 있어서, 서열 2의 추정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
9. 제7항의 폴리펩타이드에 대한 항체.
10. 제7항에 따른 폴리펩타이드를 활성화시키는 화합물.
11. 제7항에 따른 폴리펩타이드의 활성화를 억제시키는 화합물.
12. 수용체를 활성화시킬 필요가 있는 환자에게 치료학적 유효량의 제10항의 화합물을 투여함을 포함하여, 환자를 치료하는 방법.
13. 수용체를 억제시킬 필요가 있는 환자에게 치료학적 유효량의 제11항의 화합물을 투여함을 포함하여, 환자를 치료하는 방법.
14. 제12항에 있어서, 화합물이 폴리펩타이드이고, 효능제를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하여 생체내에서 효능제를 발현시킴으로써 치료학적 유효량의 화합물이 투여되는 방법.
15. 제13항에 있어서, 화합물이 폴리펩타이드이고, 길항제를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하여 생체내에서 길항제를 발현시킴으로써 치료학적 유효량의 화합물이 투여되는 방법.
16. 제7항에 따른 폴리펩타이드(여기서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 대한 화합물의 결합 반응으로 검출가능한 시그날을 제공할 수 있는 제2 성분과 관련되어 있다)를 표면상에서 발현시키는 세포를 폴리펩타이드에 화합물을 결합시키기에 충분한 조건하에서 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    제2 성분에 의해 생성된 시그날을 검출함으로써 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 화합물을 동정하는 단계를 포함하여, 제7항에 따른 폴리펩타이드에 결합하고 이를 활성화시키는 화합물을 동정하는 방법.
17. 제7항에 따른 수용체 폴리펩타이드(여기서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 대한 화합물의 결합 반응으로 검출가능한 시그날을 제공할 수 있는 제2 성분과 관련되어 있다)에 결합하는 것으로 공지된 분석학적으로 검출가능한 리간드를 폴리펩타이드에 대한 결합을 가능케 하는 조건하에서 제7항에 따른 폴리펩타이드를 표면상에서 발현시키는 세포와 접촉시키는 단계; 및

    리간드와 폴리펩타이드의 상호작용으로부터 생성된 시그날의 부재를 검출함으로써 리간드가 폴리펩타이드에 결합하는지를 측정하는 단계를 포함하여, 제7항에 따른 폴리펩타이드에 결합하고 이의 활성화를 억제시키는 화합물을 동정하는 방법.
18. 환자로부터 유래된 샘플중에서 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열중의 돌연변이를 검출함을 포함하여, 환자에게서 제7항에 따른 폴리펩타이드의 저발현과 관련된 질환 또는 질환에 대한 민감성을 진단하는 방법.
19. 숙주로부터 유래된 샘플중에서 제7항에 따른 폴리펩타이드의 존재를 분석함을 포함하는 진단 방법.