JP2003061690A - ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３） - Google Patents
ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３）Info
- Publication number
- JP2003061690A JP2003061690A JP2002162830A JP2002162830A JP2003061690A JP 2003061690 A JP2003061690 A JP 2003061690A JP 2002162830 A JP2002162830 A JP 2002162830A JP 2002162830 A JP2002162830 A JP 2002162830A JP 2003061690 A JP2003061690 A JP 2003061690A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- polypeptide
- receptor
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＧ−タンパク質結合性受容体ポリペプチ
ド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術
により製造する方法を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドを、そのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニスト
を同定するために利用する方法、ならびに該アンタゴニ
ストおよびアゴニストを治療的に使用して、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体の発現不足および過剰発現にそれぞれ
に関連のある症状を治療する方法もまた開示する。Ｇ−
タンパク質結合性受容体の核酸配列における変異および
該受容体の可溶性体のレベルの変化を検出するための診
断方法もまた開示する。
ド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術
により製造する方法を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドを、そのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニスト
を同定するために利用する方法、ならびに該アンタゴニ
ストおよびアゴニストを治療的に使用して、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体の発現不足および過剰発現にそれぞれ
に関連のある症状を治療する方法もまた開示する。Ｇ−
タンパク質結合性受容体の核酸配列における変異および
該受容体の可溶性体のレベルの変化を検出するための診
断方法もまた開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。とくに、本発明のポリペプチドは、ヒト７−膜貫通
受容体である。本発明はまた、そのようなポリペプチド
の作用を阻害することにも関する。 【０００２】 【従来の技術】多くの医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇ−タンパク質および／または第二メッセンジャ
ー、例えば、cＡＭＰを含む信号伝達経路に関与するタ
ンパク質により媒介されることは十分確立されている
(Ｌefkowitz、Ｎature、３５１:３５３−３５４(１９９
１))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇ−タ
ンパク質またはＰＰＧタンパク質を伴う経路に関与する
タンパク質と呼ぶ。これらのタンパク質の幾つかの例に
は、アドレナリン作動薬およびドーパミンに対する受容
体のようなＧＰＣ受容体(Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、ＰＮＡ
Ｓ、８４:４６−５０(１９８７);Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、
Ｓcience、２３８:６５０−６５６(１９８７);Ｂunzow,
Ｊ.Ｒ.ら、Ｎature、３３６:７８３−７８７(１９８
８))、Ｇ−タンパク質自体、エフェクタータンパク質、
例えば、ホスホリパーゼ Ｃ、アデニルシクラーゼ、お
よびホスホジエステラーゼ、並びにアクチュエーター(a
ctuator)タンパク質、例えば、プロテインキナーゼ Ａ
およびプロテインキナーゼ Ｃ(Ｓimon,Ｍ.Ｉ.ら、Ｓcie
nce、２５２:８０２−８(１９９１)が含まれる。 【０００３】例えば、信号伝達の１つの型では、ホルモ
ン結合の効果は、細胞内部での、酵素、アデニル酸シク
ラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌ
クレオチド ＧＴＰの存在に依存して、ＧＴＰはまたホ
ルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ−タンパク質は、ホルモ
ン受容体をアデニル酸シクラーゼと連結する。Ｇ−タン
パク質は、ホルモン受容体により活性化された場合、Ｇ
ＴＰを結合ＧＤＰと交換することが示された。次いで、
そのＧＴＰ担持型は、活性化アデニル酸シクラーゼに結
合する。Ｇ−タンパク質自体により触媒される、ＧＴＰ
のＧＤＰへの加水分解は、Ｇ−タンパク質をその基本の
不活性型へと戻す。従って、Ｇ−タンパク質は、受容体
からエフェクターへと信号を中継ぎする中間体として、
および信号の持続時間を制御する時計として、二重の役
割を果たす。 【０００４】Ｇ−タンパク質結合性受容体の膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定される膜貫
通ドメインを有するものとして特徴付けられている。該
ドメインは、細胞外または細胞質ループにより連結され
た膜貫通α−ヘリックスを示すと考えられている。Ｇ−
タンパク質結合性受容体には、ホルモン、ウイルス、成
長因子、および神経受容体といったような、広範囲にわ
たる生物学的に活性な受容体が含まれる。Ｇ−タンパク
質結合性受容体は、少なくとも８つの分散した親水性ル
ープを連結する、約２０〜３０個のアミノ酸からなる、
これらの７つの保存された疎水的な広がりを含むものと
して特徴付けられている。結合性受容体のＧ−タンパク
質ファミリーには、精神病性および神経学的障害を治療
するために使用される神経弛緩薬に結合するドーパミン
受容体が含まれる。このファミリーのメンバーの他の例
には、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン(end
othelin)、cＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチ
ルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニ
ン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１
受容体、ロドプシン、におい物質、サイトメガロウイル
ス受容体等が含まれる。 【０００５】大部分のＧ−タンパク質結合性受容体は、
機能的タンパク質の構造を安定化すると考えられている
ジスルフィド結合を形成する、最初の２つの細胞外ルー
プの各々に、１つの保存されたシステイン残基を有す
る。７つの膜貫通領域を、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
Ｍ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と名付ける。ＴＭ
３もまた、信号伝達に関与する。システイン残基のリン
酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化)
は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体の信号伝達に
影響を及ぼし得る。大部分のＧ−タンパク質結合性受容
体は、３番目の細胞質ループおよび／またはカルボキシ
末端内に可能性のあるリン酸化部位を含む。β−アドレ
ナリン作動性受容体のような、幾つかのＧ−タンパク質
結合性受容体に関して、プロテインキナーゼ Ａおよび
／または特異的受容体キナーゼによるリン酸化は、受容
体の脱感受性を媒介する。 【０００６】幾つかの受容体については、Ｇ−タンパク
質結合性受容体のリガンド結合部位は、数個のＧ−タン
パク質結合性受容体膜貫通ドメインにより形成された親
水性ソケットを含んでなると考えられており、このソケ
ットは、Ｇ−タンパク質結合性受容体の疎水性残基によ
り囲まれている。各々のＧ−タンパク質結合性受容体膜
貫通へリックスの親水性側は、内側を向いて、極性リガ
ンド結合部位を形成すると仮定されている。ＴＭ３は、
ＴＭ３ アスパラギン酸残基が含まれるような、リガン
ド結合部位を有するものとして、幾つかのＧ−タンパク
質結合性受容体に関係がある。加えて、ＴＭ５ セリ
ン、ＴＭ６ アスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７
フェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に
関係がある。 【０００７】Ｇ−タンパク質結合性受容体は、ヘテロト
リマーのＧ−タンパク質により、様々な細胞内酵素、イ
オンチャンネル、および輸送体に細胞内で結合すること
ができる(Ｊohnsonら、Ｅndoc.、改訂版、１０:３１７
−３３１（１９８９）を参照）。様々なＧ−タンパク質
のα−サブユニットは、特定のエフェクターを優先的に
刺激して、細胞における様々な生物学的機能を変化させ
る。Ｇ−タンパク質結合性受容体の細胞質残基のリン酸
化は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体のＧ−タン
パク質結合の調節に関する重要な機構として同定されて
いる。Ｇ−タンパク質結合性受容体は、哺乳動物の宿主
内の多くの部位において見い出される。本発明の一態様
により、新規ポリペプチドならびに生物学的に活性であ
って、診断上または治療上有用な、そのフラグメントお
よび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト
起源である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明の別の態様によ
り、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、
本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、並びに
生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、
そのフラグメントを提供する。本発明のさらなる態様に
より、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造
する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその
後の当該タンパク質の回収を促進する条件下において、
ヒトＧ−タンパク質結合性受容体の核酸配列を含む組換
え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含
んでなる方法を提供する。 【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の別
の態様により、本発明の受容体ポリペプチドに結合し
て、該ポリペプチド活性化するかまたは活性化を阻害す
る化合物に関してスクリーニングする方法を提供する。
本発明のさらに別の態様により、Ｇ−タンパク質結合性
受容体の発現不足に関係がある病態の治療に対して本発
明の受容体ポリペプチドを刺激するために、そのような
活性化化合物を使用する方法を提供する。 【００１０】本発明の別の態様により、Ｇ−タンパク質
結合性受容体の過剰発現と関連のある病態を治療するこ
とに対して本発明のポリペプチドの作用を阻害するため
に、そのような阻害化合物を使用する方法を提供する。
本発明のまた別の態様により、本発明のＧ−タンパク質
結合性受容体の少なくとも１つの膜貫通ドメインの、同
型的なアミノ酸置換を有するフラグメント、コンセンサ
スフラグメントおよび／または配列である、天然には存
在しない、合成の、単離された、および／または組換え
Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチドを提供するこ
とから、該受容体は、Ｇ−タンパク質結合性受容体リガ
ンドを結合することができ、またはこれは、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体リガンド結合を量的に、または質的に
変化させることもできる。 【００１１】本発明のさらに別の態様により、それらの
期待される生物学的特性によって、リガンドに結合する
ことにより、またはリガンド結合を変化させることによ
り、Ｇ−タンパク質結合性受容体機能の可能性のあるモ
ジュレーターとして有用であり得る、Ｇ−タンパク質結
合性受容体合成または組換えＧ−タンパク質結合性受容
体ポリペプチド、その同型的な置換誘導体、抗体、抗イ
ディオタイプ抗体、組成物、および方法を提供し、これ
らは、診断、治療および／または研究での応用に使用す
ることができる。 【００１２】本発明の別の目的により、様々なＧ−タン
パク質結合性受容体またはそのフラグメントを阻害す
る、または模倣することを意図する、合成の、単離され
た、または組換えポリペプチドを、受容体タイプおよび
サブタイプとして提供する。本発明のさらに別の態様に
より、本発明の核酸配列に対して特異的にハイブリダイ
ズするのに充分な長さの核酸分子を含んでなる診断プロ
ーブも提供する。本発明のまた別の目的により、変異し
たＧ−タンパク質結合性受容体核酸配列に関係がある疾
患、または疾患に対する感受率を検出するための診断ア
ッセイを提供する。本発明のこれらの態様および他の態
様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【００１３】本発明の一態様により、図１〜５の推定ア
ミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチド、
または１９９５年４月２８日にＡＴＣＣ寄託番号第９７
１３０号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された
核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト内皮腫瘍組
織由来のｃＤＮＡから単離された。それは、構造上、Ｇ
−タンパク質結合性受容体ファミリーに関係がある。そ
れは、３６４個のアミノ酸残基のタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク
質は、ヒトＥＤＧ−１タンパク質に対し、３６４アミノ
酸長さにわたり、３６％の同一性と６１％の類似性をも
って、最も高い程度の相同性を示す。本発明の受容体ポ
リヌクレオチドに対する潜在的リガンドは、アナンダミ
ン、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリ
ン、血小板活性化因子、トロンビン、Ｃ５ａおよびブラ
ジキニン、ケモカインならびに血小板活性化因子などが
挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【００１４】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、図１〜５に示すコード配列（配列番号１）または寄
託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あ
るいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１
〜５のＤＮＡ（配列番号１）または寄託されたcＤＮＡ
と同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配
列であってもよい。 【００１５】図１〜５の成熟ポリペプチド（配列番号
２）または寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下
のものが含まれ得る:成熟ポリペプチドのコード配列の
み;成熟ポリペプチドのコード配列（および場合により
付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード
配列のイントロンまたは非コード配列５'および／また
は３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポ
リペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチ
ド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コー
ド配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。 【００１６】本発明は、さらに、図１〜５の推定アミノ
酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードす
る、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌ
クレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在
するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存
在しない変異体であり得る。従って、本発明には、図１
〜５に示すのと同じ成熟ポリペプチド（配列番号２）ま
たは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる
同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が
含まれ、これらの変異体は、図１〜５のポリペプチド
（配列番号２）または寄託されたクローンのcＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド
変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および
挿入変異体が含まれる。 【００１７】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜５に示すコード配列（配列番号１）の天然に
存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコー
ド配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列
を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異
体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失
または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列で
あり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質
的には変えない。ポリヌクレオチドはまた、本発明の全
長ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
から切断された、本発明ポリペプチドの細胞外部分であ
る、本発明の受容体ポリペプチドの可溶性体をコードす
る。 【００１８】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７:７６７
(１９８４))。 【００１９】「遺伝子」なる語はポリペプチド鎖の製造
に関与するＤＮＡセグメントを意図している；コーディ
ング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラ
ー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソ
ン）の間の配列（イントロン）も含む。全長の本発明の
ポリヌクレオチド配列のフラググメントをｃＤＮＡライ
ブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用
して他の遺伝子を単離し、これらの遺伝子は本発明のポ
リヌクレオチド配列と高い配列類似性または同様の生物
学的活性を有する。このタイプのプローブは少なくとも
２０または３０塩基を有するのが好ましいが、５０塩基
あるいはそれ以上を有してもよい。該プローブはまた、
全長の転写物に対応するcＤＮＡクローン、および制御
領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロ
ンを含む完全な本発明の遺伝子を含む単一または複数の
ゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリー
ニングの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成する
ため公知のＤＮＡ配列を使用することによる遺伝子のコ
ーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と
相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチド
は、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブ
リダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニング
するのに使用する。 【００２０】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少
なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハ
イブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」と
いう用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましく
は少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブ
リダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好
ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドは、図１〜５のcＤＮＡ(配列
番号１)もしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは
活性を保持するポリペプチドをコードする。 【００２１】言い方を替えると、本発明ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズし、上記の同一性があり、活性を保
持するかまたはしない該ポリヌクレオチドは、少なくと
も２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、さらに好
ましくは少なくとも５０塩基を有する。たとえば、この
ようなポリヌクレオチドは、たとえば配列番号１のポリ
ヌクレオチドの回収用の該ポリヌクレオチドに対するプ
ローブとして、または診断用プローブとして、あるいは
ＰＣＲプライマーとして使用できる。したがって、本発
明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性があるポリヌクレオチド、ならびに少なくとも２０
または３０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基を有す
る、そのフラグメント、および、このようなポリヌクレ
オチドによってコードされるポリペプチドに関する。 【００２２】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２下に要求されることを承認するもので
はない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチド
の配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、
本明細書中の配列のいずれかの記載の矛盾する際はいつ
でも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、
または販売するには、実施許諾が要求され得、またその
ような実施許諾は、ここでは付与されない。 【００２３】本発明はさらに、図１〜５の推定アミノ酸
配列（配列番号２）を有する、または寄託されたcＤＮ
Ａによりコードされるアミノ酸配列を有するＧ−タンパ
ク質結合性受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのよ
うなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導
体に関する。図１〜５のポリペプチド（配列番号２）ま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナ
ログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチ
ド、すなわち、Ｇ−タンパク質結合性受容体として機能
するか、または、たとえポリペプチドがＧ−タンパク質
結合性受容体として機能しなくとも(例えば、可溶性型
の受容体)、リガンドまたは受容体を結合する能力を保
持するポリペプチドを意味する。アナログには、プロプ
ロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な
成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテイ
ンが含まれる。 【００２４】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換えポリペプチドであってよい。図１〜５のポ
リペプチド（配列番号２）または寄託されたcＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログは、(ｉ)１つまたはそれ以上のアミノ酸
残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同
型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置
換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるもので
あってもよく、またはコードされたものでなくてもよい
もの、(ｉｉ)１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換
基が含まれるもの、または(ｉｉｉ)成熟ポリペプチド
が、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例え
ば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と
融合しているもの、または(ｉｖ)リーダーもしくは分泌
配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配
列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの、また
は（ｖ）該ポリペプチドのフラグメントが可溶性、すな
わち膜に結合せず、依然として膜結合受容体に対するリ
ガンドに結合しているものであり得る。そのようなフラ
グメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示
から当業者の範囲内であると思われる。 【００２５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」とい
う用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に
存在するなら、天然の環境)から除去されていることを
意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在す
るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
ないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全
てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは
ベクターの部分となり得、および／またはそのようなポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分とな
り得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の部分ではないという点で、なお単離されてい
る。 【００２６】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに、配列
番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似
性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、さらに好
ましくは少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは
少なくとも９０％の同一性）、さらにより好ましくは少
なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは９５％
の同一性）をもつポリペプチド、および一般的に少なく
とも３０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０ア
ミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。当
業界で知られているように、２つのポリペプチド間の
「類似性」とは、ひとつのポリペプチドのアミノ酸配列
およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチ
ドのアミノ酸配列と比較することによって測定される。 【００２７】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプ
チドを生産するのに用いることができる；したがって、
該フラグメントは、全長ポリペプチドの製造用中間体と
して用いることができる。本発明のポリペプチドのフラ
グメントまたは部分は、本発明の全長ポリペプチドの合
成に用いることができる。本発明はまた、本発明のポリ
ヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで
遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプ
チドの組換え技術による製造にも関する。 【００２８】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＧ−タンパク質結合性受容体遺伝子を増幅するの
に適するよう改変された従来の栄養培地で培養すること
ができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発
現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であ
って、当業者に明らかであろう。 【００２９】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体;細菌プラスミド;ファージＤＮＡ;バキュロウ
イルス;酵母プラスミド;プラスミドとファージＤＮＡと
の組合せから得られるベクター;ワクシニア、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイ
ルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクター
も、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である
限り、使用することができる。 【００３０】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可
能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロ
モーターの代表例として、以下のものが挙げられる:Ｌ
ＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli lacまたはt
rp、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もし
くは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現
を制御することが知られている他のプロモーター。発現
ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増
幅するのに適当な配列も含み得る。 【００３１】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当な
ＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは
制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォ
ームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現
するのを可能にすることができる。 【００３２】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる:Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella typ
himuriumといったような細菌細胞;酵母のような真菌細
胞;Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９といった
ような昆虫細胞;ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノー
マといったような動物細胞；アデノウイルス;植物細胞
等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者
の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはま
た、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んで
なる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の
配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドま
たはウイルスベクターといったようなベクターを含んで
なる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさ
らに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモータ
ーを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよ
びプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販さ
れている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用:p
ＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pbs、pＤ
１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７
４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６
a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene);ptrc９９
a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、
pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用:pＷＬＮＥＯ、pＳ
Ｖ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagen
e)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmaci
a)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクター
も、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能であ
る限り、使用することができる。 【００３３】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。 【００３４】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey.Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecul
ar Ｂiology(１９８６))。宿主細胞中の構築物を通常の
方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子
産物を製造することができる。あるいはまた、本発明の
ポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的
に製造することができる。 【００３５】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual,第２版、Ｃold Ｓp
ring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載さ
れており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 【００３６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーが含まれる。 【００３７】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列と共に、
適当な相(phase)で構築される。場合により、その異種
配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物
の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプ
チドが含まれる融合タンパク質をコードすることができ
る。 【００３８】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモ
ーターを有する作動可能なリーディング相に挿入するこ
とにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持
を確実なものとするために、また所望により、宿主内で
の増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の
選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであ
ろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主に
は、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhi
murium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、お
よびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれる
が、他のものもまた、選択物質として使用することがで
きる。 【００３９】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromege Ｂiotec、Ｍadis
on、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォー
メーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖
させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例え
ば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞
をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分
離により収集し、物理的または化学的方法により破壊し
て、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のため
に保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。 【００４０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３:１７
５(１９８１)により記載されている、サルの腎臓線維芽
細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現
させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＣＨＯＨＳ２９３、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が
含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必
要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、お
よび５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろ
う。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配
列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされ
る非転写遺伝要素を与えることができる。本発明のＧ−
タンパク質結合性受容体ポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ
ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から
回収して精製することができる。必要に応じて、タンパ
ク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成す
るのに使用することができる。最後に、高性能液体クロ
マトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用するこ
とができる。 【００４１】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のＧ−タンパク
質結合性受容体は、該受容体ポリペプチドを活性化する
化合物(アゴニスト)および／または活性化を阻害する化
合物(アンタゴニスト)に関してスクリーニングする方法
において使用することができる。一般に、そのようなス
クリーニング方法は、その表面上に本発明受容体ポリペ
プチドを発現する適当な細胞を与えることを必要とす
る。このような細胞には、哺乳類、酵母、drosophilaま
たはE.Coliが含まれる。特に、本発明の受容体をコード
するポリヌクレオチドを使用して、細胞をトランスフェ
トし、そのことによって、Ｇ−タンパク質結合性受容体
を発現させる。次いで、発現した受容体を試験化合物に
接触させて、結合、機能的応答の刺激または阻害を観察
する。 【００４２】そのようなスクリーニング方法の１つは、
本発明のＧ−タンパク質結合性受容体を発現するために
トランスフェクトされる、メラノフォアの使用を必要と
する。そのような技術は、１９９２年２月６日に公開さ
れたＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０に記載されている。
従って、例えば、そのようなアッセイは、Ｇ−タンパク
質結合性受容体をコードするメラノフォア細胞を、その
受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物の両
方と接触させることにより、本発明受容体ポリペプチド
の活性化を阻害する化合物に関してスクリーニングする
ために利用することができる。該リガンドにより発生さ
れる信号の阻害は、化合物が該受容体に対して可能性の
あるアンタゴニストであること、すなわち、該受容体の
活性化を阻害することを示す。該スクリーニングは、そ
のような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ
ることにより、該受容体を活性化する化合物を決定する
ために、またそのような化合物が信号を発生するかどう
か、すなわち、該受容体を活性化するかどうかを測定す
るために利用することができる。 【００４３】他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓ
cience、第２４６巻、１８１−２９６頁(１９８９年１
０月)に記載されているような、受容体の活性化により
引き起こされる細胞外のpＨ変化を測定するシステムに
おいての、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する細胞
(例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞)の使用が
含まれる。例えば、該化合物を、本発明の受容体ポリペ
プチドを発現する細胞と接触させて、第二メッセンジャ
ー応答、例えば、信号伝達またはpＨ変化を測定して、
該受容体を活性化または阻害する可能性のある化合物が
有効であるかどうかを決定することができる。別のその
ようなスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受
容体をコードするＲＮＡを、アフリカツメガエル卵母細
胞中に導入して該受容体を一時的に発現させることを必
要とする。受容体を阻害すると考えられる化合物をスク
リーニングする場合、次いで、その受容体卵母細胞を、
その受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物
と接触させ、続いて、カルシウム信号の阻害または活性
化を検出することができる。 【００４４】別のスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク
質結合性受容体を発現させることを必要とし、ここで
は、該受容体をホスホリパーゼ ＣまたはＤに結合させ
る。そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋
細胞、胚腎臓細胞等を挙げることができる。スクリーニ
ングは、該受容体の活性化または該受容体の活性化の阻
害をホスホリパーゼ第二信号から検出することにより、
上記のように成し遂げることができる。別の方法は、標
識化リガンドの、その表面上に該受容体を有する細胞へ
の結合の阻害を測定することにより、本発明受容体ポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物に関してスクリーニ
ングすることを必要とする。そのような方法は、真核細
胞を、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするＤＮＡ
と共にトランスフェクトすることから、該細胞がその表
面上に該受容体を発現して、標識化型の既知のリガンド
の存在下、該細胞を可能性のあるアンタゴニストと接触
させることを必要とする。該リガンドは、例えば、放射
能により標識化することができる。該受容体に結合した
標識化リガンドの量は、例えば、該受容体の放射能によ
り測定する。該受容体に結合する標識化リガンドの減少
により測定されるように、もし該化合物が該受容体に結
合するならば、標識化リガンドの該受容体への結合が阻
害される。 【００４５】Ｇ−タンパク質結合性受容体は、哺乳動物
の宿主に偏在して、多くの病状を含め、多くの生物学的
機能を担う。従って、一方では、Ｇ−タンパク質結合性
受容体を刺激し、また他方では、Ｇ−タンパク質結合性
受容体を阻害するすることができる化合物および薬物を
見い出すことが望まれる。たとえば、Ｇ−タンパク質結
合性受容体を活性化する化合物は、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧症、尿うっ滞、および骨粗鬆症
の治療といったような、治療目的にも有用である。一般
に、スクリーニング方法により決定される、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体の活性化を阻害する化合物は、様々な
治療目的に使用することができ、例えば、高血圧症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺
肥大、ならびに精神分裂病、躁病性興奮、うつ病、せん
妄、痴呆、重度精神遅滞、ハンティングトン病またはジ
ル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害などの神経
および精神疾患の治療に用いられる。Ｇ−タンパク質結
合性受容体を阻害する化合物は、内因性食欲不振の軽減
および過食症のコントロールにも用いられる。 【００４６】抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌ
クレオチドは、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合する
が、第二メッセンジャー応答を引き出さないことから、
該Ｇ−タンパク質結合性受容体をアンタゴナイズする。
抗体には、通例、抗体の抗原結合部位と関連がある独自
の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体が含まれる。
可能性のあるアンタゴニスト化合物にはまた、Ｇ−タン
パク質結合性受容体のリガンドと密接に関係のあるタン
パク質、すなわち、生物学的機能を失ってしまってお
り、またＧ−タンパク質結合性受容体に結合しても、応
答を全く引き出さないリガンドのフラグメントも含まれ
る。アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセン
ス構築物は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡ
もしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することがで
き、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡま
たはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポ
リペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'
コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対
して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎu
cl.Ａcids Ｒes.、６:３０７３(１９７９);Ｃooneyら、
Ｓcience、２４１:４５６(１９８８);およびＤervan
ら、Ｓciece、２５１:１３６０(１９９１)を参照)、そ
のことによって、転写およびＧ−タンパク質結合性受容
体の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズし
て、mＲＮＡ分子のＧ−タンパク質結合性受容体への翻
訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeuroch
em.、５６:５６０(１９９１);Ｏligodeoxynucleotides
as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、Ｃ
ＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ(１９８８))。上記の
オリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発
現させて、Ｇ−タンパク質結合性受容体の産生を阻害す
ることができる。 【００４７】小さなペプチドまたはペプチド様分子など
の、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合し、リガンドに
近づき難くすることから、正常な生物学的活性を妨げる
小さな分子も、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を
阻害するのに用いることができる。受容体のフラグメン
トなどの可溶性型のＧ−タンパク質結合性受容体も、リ
ガンドに結合して、そのリガンドが、膜に結合したＧ−
タンパク質結合性受容体と相互作用できないようにする
ことにより、該受容体の活性化を阻害するのに用いるこ
とができる。 【００４８】本発明はさらに、医薬的に許容しうる担体
とともに有効量の上記阻害化合物を患者に投与して、リ
ガンドがＧ−タンパク質結合性受容体へ結合することを
遮断することにより、または第２シグナルを妨げること
により、Ｇ−タンパク質結合性受容体の活性化を阻害
し、それによって異常な状態を軽減することを特徴とす
る、Ｇ−タンパク質結合性受容体活性の過剰に関連した
異常な状態の治療方法を提供する。本発明は、また、医
薬的に許容しうる担体とともに有効量の上記活性化化合
物を患者に投与し、それによって異常な状態を軽減する
ことを特徴とする、Ｇ−タンパク質結合性受容体活性の
発現不足に関連した異常な状態の治療方法を提供する。
可溶性体のＧ−タンパク質結合性受容体、およびこのよ
うな受容体を活性化または阻害する化合物は、適当な薬
学的担体と組み合わせて使用することができる。そのよ
うな組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチドまたは
化合物、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を
含んでなる。そのような担体には、これに限定されるも
のではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれ
らの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適
合すべきである。 【００４９】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化
合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、局
所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内
経路といったような、便利な方法で投与することができ
る。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／また
は予防するのに有効な量で投与される。一般に、該医薬
組成物は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与
され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg
(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの
場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量
は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。 【００５０】該Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチ
ド、および活性化または阻害化合物は、「遺伝子治療」と
呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビ
ボにおける発現により、本発明に従って使用することが
できる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビ
ボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該
ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法
は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用
によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作する
ことができる。 【００５１】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて操作し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。 【００５２】レトロウイルスプラスミドベクターは、モ
ロニーマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイ
ルス、脾臓壊死ウイルス、ロウス肉腫ウイルス、ハーベ
イ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血
病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、
骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレト
ロウイルスから誘導することができるが、これらに限定
されるものではない。ひとつの具体例において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病
ウイルスから誘導される。ベクターには、１種または２
種以上のプロモーターが含まれる。適当なプロモーター
としては、ミラー（Miller）らのＢiotechniques,Ｖｏ
ｌ．７，Ｎｏ．９，９８０〜９９０（１９８９）に記載
されているレトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ
ー；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ
ーター、もしくはその他のプロモーター（たとえば、ヒ
ストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター
などの真核細胞性プロモーターといったような細胞性プ
ロモーター；ただし、これらに限定されるものではな
い）が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。適当なプロモーターの選択は、本発明の教示から当
業者に明らかであろう。 【００５３】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターによって調節される。適当な
プロモーターとしては、アデノウイルスメジャーレイト
プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プ
ロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；Ｍ
ＴＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど
の誘発プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブ
ミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロ
ブリンプロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼプロモーターといったようなウイルスチミジンキ
ナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（前述の修
飾レトロウイルスＬＴＲも含む）；β−アクチンプロモ
ーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターなどが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。該プロ
モーターは、該ポリペプチドをコードする遺伝子を調節
する活性（native）プロモーターである。 【００５４】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入を行い、プロデュー
サー細胞系を形成する。トランスフェクトされうるパッ
ケージング細胞としては、ミラーのHuman Gene Therap
y、Vol.１、５〜１４（１９９０）に記載された、ＰＥ５
０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１
９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣ
ＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２および
ＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。ベクターによるパッケージング細胞への形質
導入は、当業者には既知の方法で行うことができる。こ
のような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用お
よびＣａＰＯ４沈降が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。別法として、レトロウイルスプラスミ
ドベクターをリポソーム中に封入するか、または、脂質
に結合させて宿主に投与してもよい。 【００５５】プロデューサー細胞系は、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイル
スベクター粒子を生産する。次いで、このようなレトロ
ウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはイン
ビボのいずれかにて真核細胞に形質導入することができ
る。形質導入された真核細胞は、本発明のポリペプチド
をコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入さ
れうる真核細胞としては、胚幹細胞、肝細胞、線維芽細
胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細
胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体に結
合しうるような条件下で、Ｇ−タンパク質結合性受容体
を発現する哺乳動物細胞をリガンドに接触させ、該受容
体に結合するリガンドの存在を検出し、それによって該
リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体に結合するかど
うかを決定することを特徴とする、本発明のＧ−タンパ
ク質結合性受容体に結合する能力が分かっていないリガ
ンドが、このような受容体に結合しうるかどうかを決定
する方法を提供する。 【００５６】本発明はさらに、細胞の表面上でヒトＧ−
タンパク質結合性受容体と特異的に相互作用して、これ
に結合する薬物を同定するために、薬物をスクリーニン
グする方法であって、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコ
ードする、単離されたＤＮＡ分子を含んでなる哺乳動物
の細胞を、複数の薬物と接触させ、その哺乳動物の細胞
に結合するそれらの薬物を決定し、またそのことによっ
て、本発明のヒトＧ−タンパク質結合性受容体と特異的
に相互作用して、これに結合する薬物を同定することを
含んでなる方法を提供する。次いで、このような薬物を
治療的に用いて、本発明の受容体を活性化するかまたは
活性化を阻害する。 【００５７】本発明はまた、Ｇ−タンパク質結合性受容
体をコードするmＲＮＡの存在を検出することにより、
細胞の表面上でのＧ−タンパク質結合性受容体の発現を
検出する方法であって、細胞から全体のmＲＮＡを得
て、ハイブリダイズする条件下、そのようにして得られ
たmＲＮＡを、ヒトＧ−タンパク質結合性受容体をコー
ドする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイ
ブリダイズすることが可能である、本発明の核酸プロー
ブと接触させて、そのプローブにハイブリダイズしたm
ＲＮＡの存在を検出し、またそのことによって、Ｇ−タ
ンパク質結合性受容体の発現を該細胞により検出するこ
とを含んでなる方法も提供する。 【００５８】本発明はまた、本発明の受容体ポリペプチ
ドをコードする核酸配列における変異の存在に関係があ
る疾患、または疾患に体する感受率を検出するための診
断アッセイの一部としての、Ｇ−タンパク質結合性受容
体遺伝子の使用にも関する。そのような疾患、例えば、
腫瘍および癌は、細胞のトランスフォーメーションに関
係がある。ヒトＧ−タンパク質結合性受容体遺伝子にお
いて変異が起こっている個体は、様々な技術により、Ｄ
ＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、
患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検お
よび剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、
検出のために直接使用することができ、または分析前に
ＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４:１６３−１６６(１
９８６))を利用することにより、酵素的に増幅すること
ができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使
用することができる。例としては、Ｇ−タンパク質結合
性受容体タンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを使用して、Ｇ−タンパク質結合性受容体変
異を同定して分析することができる。例えば、欠失およ
び挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイ
ズにおける変化により検出することができる。点変異
は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化Ｇ−タンパク質
結合性受容体のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化Ｇ
−タンパク質結合性受容体のアンチセンスＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることにより同定することができる。
完全に対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化によ
り、または融解温度の相違により、対合していない複式
物(duplexes)と区別することができる。 【００５９】参照遺伝子と「変異体」の間の配列の相違
は直接のＤＮＡシークエンシニグ方法によって明らかに
なる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメントは特
異的なＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用
する。この方法の感度はＰＣＲと組み合わされる場合に
非常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または一
本鎖鋳型分子とともに使用したシークエンシング法は修
飾したＰＣＲ産物によって産生される。配列決定は放射
線標識したヌクレオチドを使用する従来の方法によっ
て、または蛍光標識タグを有する自動シークエンシング
方法によって行われる。 ＤＮＡ配列の相違に基づいた
遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤ
ＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出
により成し遂げることができる。小さな配列の欠失およ
び挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化すること
ができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルム
アミジングラジエントゲルを変性することで区別するこ
とができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動
度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度に
より、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、
Ｍyersら、Ｓcience、２３０:１２４２(１９８５)を参
照)。 【００６０】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５:４３９７−４
４０１(１９８５))。従って、特異的なＤＮＡ配列の検
出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限
酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ))、
およびサザンブロッティングといったような方法により
成し遂げることができる。さらに従来的なゲル電気泳動
およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、insitu分
析により検出することもできる。本発明はさらに、宿主
由来のサンプルにおいてレベルが上昇することがある疾
患の指標であるところの本発明の受容体ポリペプチドの
可溶性体のレベルが変化していることを検出する診断ア
ッセイに関する。可溶性受容体ポリペプチドの検出に利
用することができるアッセイは当業者によく知られてお
り、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳ
Ａアッセイが使用される。 【００６１】ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のポリ
ペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクロー
ナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体
をモノクローナル抗体に対して調製する。該リポーター
抗体に放射能、蛍光または本実施例においては西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ酵素といったような検出可能な薬剤
を結合させる。サンプルを直ちに宿主から取り除いて、
サンプル中のタンパク質と結合する固相支持体、例えば
ポリスチレンの皿の上でインキュベートする。ついでウ
シ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質と共に
インキュベートすることにより、その皿の空いているタ
ンパク質結合部位を全て覆う。つぎに、モノクローナル
抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そ
のモノクローナル抗体はポリスチレン皿に結合したの本
発明のタンパク質に結合する。結合しなかったモノクロ
ーナル抗体を全てバッファーで洗い流す。西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に直ちに
置くと、リポーター抗体の、本発明のポリペプチドに結
合した任意のモノクローナル抗体への結合が起こる。つ
いで結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。ついで
ペルオキシダーゼ基質を皿に加え、一定時間の発色量を
標準曲線に対して比較する場合、患者のサンプルの一定
体積中に存在する本発明のタンパク質の量の測定値であ
る。 【００６２】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡
単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましく
は、１５−２５bp)を調製することにより、配列を染色
体にマップすることができる。３'の翻訳されていない
領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中
の１つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマー
を迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとす
る。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体
を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それ
らのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与
えるであろう。 【００６３】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマーキング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレ
ッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５０または６０塩基という短
いcＤＮＡで利用することができる。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes : a Ｍanual of
Ｂasic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨー
ク(１９８８)を参照。 【００６４】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance)）によって確認する。次
に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間の
cＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要があ
る。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおい
て認められるが、いずれの正常な個体においても認めら
れないなら、その変異は疾患の原因となるものであるら
しい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング
の分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化
したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝
子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベース
のマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定
する)。 【００６５】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。本発明の配列に対応するポリ
ペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動
物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動
物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得
ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体
は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方
法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする
配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体
を製造するのに使用することができる。次いで、そのよ
うな抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織
からポリペプチドを単離することができる。 【００６６】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday４:７２)、およびヒトモノクローナル抗体
を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されてい
る技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免
疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するの
に適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用
して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト
化抗体を発現させることもできる。 【００６７】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する;しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の
理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法
および／または用語を記載する。 【００６８】「プラスミド」は、前置きする小文字のpお
よび／または続けて大文字および／または数字により示
す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、
限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または
公開された方法により入手可能なプラスミドから構築で
きる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミド
は、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列により作用する制
限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す、本明細書中
で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの
反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知ら
れているように使用した。分析目的には、一般的に、緩
衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフ
ラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミ
ド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的に
は、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μg
を２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素
に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定され
ている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることが
できる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲル
で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。 【００６９】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８:４０５７(１
９８０)により記載されている８％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に
合成することができる。一本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す、そ
のような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを
有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフ
ェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチド
にライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチド
は、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲート
するであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既
知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、トランスフォーメーション
は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、
５２:４５６−４５７(１９７３)の方法に記載されてい
るようにして行った。 【００７０】 【実施例】実施例１ Ｇ−タンパク質結合性受容体（ＧＰＲＣ）ポリペプチド
の細菌発現および精製最初に、ＧＰＲＣをコードするＤ
ＮＡ配列(ＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号)を、プロセ
シングしたＧＰＲＣ核酸配列（シグナルペプチド配列を
含む）の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。ＧＰＲＣ核酸
配列に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'お
よび３'末端配列に追加する。５'オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、配列： 5' CACAGGATCCCGTGGCTGCCATCTCTACTTC 3'（配列番号：
３） を有し、ＢamＨＴ制限酵素部位を、続いて、切断された
タンパク質の推定第２アミノ酸から始まるＧＰＲＣコー
ディング配列の１７ヌクレオチドを含む。３'配列： 5' TCTCAGGTACCGTTCTCTAAACCACAGAGTGGTCA（配列番号：
４） は、ＡＳＰ７１８部位に対する相補的配列、および続く
ＧＰＲＣコーディング配列の１９ヌクレオチドを含む。
その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−３１
（キアゲン、インク）、チャタワース（Ｃhatswort
h）、カリフォルニア)上の制限酵素部位に一致する。p
ＱＥ−３１は、抗生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始
点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペ
レーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−
Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついで
pＱＥ−３１をＢamＨＴおよびＡＳＰ７１８で消化す
る。増幅した配列をpＱＥ−３１にライゲーションし、
ついでヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と
共にイン・フレームで挿入する。次いで、そのライゲー
ション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン、
インク）である大腸菌株をサンブルックら、モレキュラ
ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８
９）に記載された方法によってトランスフォームした。
Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含
み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナ
マイシン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマント
を、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定
しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選
択する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp(１００
μg／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方を補った、Ｌ
Ｂ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。その
Ｏ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜
１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の
間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)まで増殖させる。次
いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加え
た。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ
／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることに
より誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次
いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットを
カオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で
可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタ
グを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件
下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィー
により、可溶化したＧＰＲＣを精製する(ホチュリ（Ｈo
chuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography ４１１：１７７
−１８４（１９８４））。６モルのグアニジンＨＣl
（ｐＨ５.０）中、ＧＰＲＣ（純度９０％）をカラムか
ら溶出し、また再生を目的として３モルのグアニジンＨ
Ｃｌに合わせ、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０モ
ルのグルタチオン（還元された）および２ミリモルのグ
ルタチオン（酸化された）で調節する。この溶液中で１
２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリ
モルのリン酸ナトリウムにて合わせる。 【００７１】実施例 ２ ＣＯＳ細胞における組換えＧＰＲＣの発現 プラスミド、ＧＰＲＣ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０ 複
製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）大腸菌複
製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン
およびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを
含む、ベクター pcＤＮＡ３／Ａmp(インビトロゲン（Ｉ
nvitrogen)）から得られる。完全なＧＰＲＣの前駆体お
よびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタグ
をコードするＤＮＡ断片を、そのベクターのポリリンカ
ー領域にクローニングすることから、組換えタンパク質
発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタ
グは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパ
ク質から得られるエピトープに対応する(ウィルソン
（Ｉ．Ｗilson）、ニマン（Ｈ.Ｎiman）、ハイテン
（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、
コノリー（Ｍ.Ｃonnolly）、およびラーナー（Ｒ.Ｌern
er）、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我
々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。 【００７２】プラスミド構築方法を以下に記載する：Ｇ
ＰＲＣをコードするＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号の
ＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲによ
り構築する： ５'プライマー配列： 5' CAACCACAGGGATCCCATGGCTGCCATCTCTACTTCCATCCCTGTA
3'（配列番号：５） はＢamＨＩ部位（太字）、続いて開始コドンから出発す
るＧＰＲＣのコーディング配列の２７ヌクレオチドを含
む； ３'配列： 5' CCCCTCGAGCTAAACCACAGAGTGGTCATTGCTGTGAACTCCAGCC
3'（配列番号：６） は、ＸhoＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＧＰＲＣコーディング配列の最後の２
４ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。
従って、ＰＣＲ産物は、ＨindＩＩＩ部位、ＧＰＲＣコ
ーディング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨ
Ａタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終結コドン、およびＸ
hoＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片お
よびベクター、pcＤＮＡ３／Ａmpを、ＨindＩＩＩおよ
びＸhoＩ制限酵素で消化して、ライゲーションする。そ
のライゲーション混合物を大腸菌株 ＤＨ５αにトラン
スフォームし、そのトランスフォームされた培養物をア
ンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選
択する。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントか
ら単離して、正しい断片の存在に関してＰＣＲおよび制
限分析により試験する。組換えＧＰＲＣの発現のため
に、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ細胞を
発現ベクターでトランスフェクションする。(サンブル
ック、フリッチ（Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ.Ｍan
iatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリ
ー・プレス、（１９８９）)。ＧＰＲＣ ＨＡタンパク質
の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する
(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アン
チボディーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプ
リング・ラボラトリー・プレス、（１９８８）)。トラ
ンスフェクションから２日後、タンパク質を３５Ｓ−シ
ステインで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集め
て、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡバッファー(１５０mＭ
ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ
−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))
で溶菌する(ウィルソンら、同上 ３７：７６７（１９８
４）)。細胞ライゼートおよび培養培地の両方を、ＨＡ
に特異的なモノクローナル抗体で沈降させる。沈降した
タンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析す
る。 【００７３】実施例３ バキュロウイルス発現システムを用いてのＧＰＲＣのク
ローニングおよび発現全長のＧＰＲＣタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１３０号を、遺伝子
の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを利用して増幅する。 その５'プライマーは、配列: 5' TTCACCACCTACCTGGATCCACAGAGCTGTCATGGCTGCC 3'（配
列番号：７） を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(太字)、続いて、
真核細胞における翻訳の開始に有効な信号に似ている１
１ヌクレオチド(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９８７、１９６、９
４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)を含み、またこの直ぐ後
は、ＧＰＲ遺伝子の最初の１８ヌクレオチド(翻訳開始
コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)である。 その３'プライマーは、配列: 5' CCTCATCTCAGGTACCGTTCTAAACCACAGAGTGG 3'（配列番
号：８） を有し、また制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩの切断
部位、およびＧＰＲＣ遺伝子の３'の翻訳されていない
配列に対して相補的な１０ヌクレオチドを含む。増幅さ
れた配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０
１ Ｉnc.、ＬaＪolla、Ｃa.)を使用して、１％アガロー
スゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエン
ドヌクレアーゼＢam ＨＩで消化し、次いで１％アガロ
ースゲル上で再度精製した。このフラグメントをＦ２と
名付ける。 【００７４】ベクターpＡ２(pＶＬ９４１ベクターの修
飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システム
を用いてのＧＰＲＣタンパク質の発現に使用する(レビ
ューには、サマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.およびスミス
（Ｓmith）,Ｇ.Ｅ. １９８７、Ａ manual of methods f
or baculovirus vectors and insect cell culture pro
cedures、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtati
on Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクター
は、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニカニュ
クリアポリヘドロシスウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力な
ポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレ
アーゼＢam ＨＩの認識部位を含む。シミアンウイルス
(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニ
ル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するた
め、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポ
リヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘド
リンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランス
フェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡ
の、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス
配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他
のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７３、
pＶＬ９４１、ＰＧＲ１およびpＡcＩＭ１を、pＡ２の代
わりに使用することができるであろう(ラッコー（Ｌuck
ow）,Ｖ.Ａ.およびサマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.、Ｖir
ology、１７０:３１−３９)。 【００７５】プラスミドを制限酵素ＡＳＰ７１８および
Ｂam ＨＩで消化した後、当業界で既知の方法により、
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次い
で、市販のキット（“Ｇeneclean"、ＢＩＯ １０１ Ｉn
c．、La Jolla、ＣＡ）を用いてＤＮＡを１％アガロー
スゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名付
ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ
２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせた。次い
で、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォームして、Ｇ
ＰＲＣ遺伝子を有するプラスミド(pＢacＧＰＲＣ)を含
む細菌を、酵素Ｂam ＨＩを使用して同定した。クロー
ン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によ
り確認した。リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelg
ner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４:７４
１３−７４１７(１９８７))を利用して、プラスミドpＢ
acＧＰＲＣ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「Ｂa
culoＧoldＴＭ バキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharminge
n、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフ
ェクトした。 【００７６】ＢaculoＧoldＴＭ ウイルスＤＮＡ１μgお
よびプラスミドpＢacＧＰＲＣ５μgを、無血清グレイス
(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaither
sburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン
(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、
混合して、室温で１５分間インキュベートした。次い
で、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培
地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳ
f９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加した。
そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液
を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５時間イ
ンキュベートした。５時間後、そのトランスフェクショ
ン溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を
補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた。そのプレートを
インキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続け
た。４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上
記)により記載されたようにして、プラークアッセイを
行った。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechnologi
es Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用
したが、このことにより、青色に染色されたプラークを
容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセ
イ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者
のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithe
rsburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０
頁にも見い出すことができる)。 【００７７】４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加
えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペ
ットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ
管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分離に
より除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、
３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用
した。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４
℃で保存した。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ
を補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞に、感染
多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＧＰＲ
Ｃを感染させた。６時間後、その培地を除去して、メチ
オニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ培地
(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替え
た。４２時間後、５μＣiの３５Ｓ−メチオニンおよび
５μＣiの３５Ｓシステイン５μＣi(Ａmersham)を加え
た。その細胞をさらに７２時間インキュベートした後、
低張リン酸緩衝液中で細胞溶解により収穫し、細胞膜を
遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化
した。 【００７８】実施例４ 遺伝子治療における発現 皮膚生検により被験者から線維芽細胞を得る。得られる
組織を組織培養培地に置き、小片に分ける。組織小片を
組織培養フラスコの湿った表面に置く（約１０個の小片
をそれぞれ別のフラスコ内に置く）。フラスコを逆さま
にし、きつく閉じて室温にて一夜放置する。室温にて２
４時間後、フラスコを逆に戻し、組織小片をフラスコの
底に置いたまま新鮮な培養培地（たとえば、Ｈａｍ'ｓ
Ｆ１２培地に１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを加えたもの）を加える。次いで、これを３
７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新
鮮な培地を加え、続いて数日毎に培地を取り換える。さ
らなる２週間の培養後、単層の線維芽細胞が出現する。
単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに塗り付
ける。モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲにてフラン
キングされているｐＭＶ−７（カーシュマイヤー（Ｋir
schmeier），Ｐ．Ｔ．らのＤＮＡ、７：２１９〜２５
（１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩで切断
し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベク
ターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを用い
て精製する。 【００７９】それぞれ５'および３'末端配列に対応する
ＰＣＲプライマーを用いて本発明ポリペプチドのｃＤＮ
Ａを増幅する。５'プライマーはＥcoＲＩ部位を含み、
３'プライマーはＨindＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下に、等量のモロニーマウス肉腫ウイルス
の線形バックボーンおよび増幅したＥcoＲＩ断片ならび
にＨindＩＩＩ断片を一緒に加える。得られる混合物を
２つの断片のライゲーションに適当な条件下に維持す
る。ライゲーション混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形
質転換し、次いで、正しく挿入されているＧＰＲＣ遺伝
子をベクターが含んでいることを確認するためにカナマ
イシン含有寒天上に置く。１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを加えたダルベッコ
の調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、両栄養性ｐＡ３１
７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養
物中で増殖させて集密的密度にする。次いで、該遺伝子
を含むＭＳＶベクターを該培地に加え、パッケージング
細胞にベクターで形質導入する。パッケージング細胞は
ただちにＧＰＲＣ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産
生する（パッケージング細胞は今後プロデューサー細胞
と称する）。 【００８０】形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮
な培地を加え、続いて、集密的プロデューサー細胞の１
０ｃｍプレートから培地を収穫する。感染性ウイルス粒
子を含む消費された培地をミリポアフィルターで濾過し
て脱離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この
培地を用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の亜
集密的プレートから培地を除去し、プロデューサー細胞
から得た培地と素早く交換する。この培地を除去し、新
鮮な培地と交換する。もし、ウイルスの力価が高けれ
ば、すべての線維芽細胞が実質的に感染していることに
なり、選択の必要はない。もし、力価が非常に低けれ
ば、neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレ
トロウイルスベクターの使用が必要である。次いで、そ
れ単独で、あるいはサイトデックス３マイクロキャリア
ービーズ上で集密的になるまで増殖させた後に、遺伝的
に操作された線維芽細胞を宿主に注入する。線維芽細胞
はただちに該タンパク質産物を産生する。先の教示から
見て、本発明の多数の変更および変化が可能であること
から、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方
法により本発明を行うことができる。 【００８１】 【配列表】 SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: LI, ET AL. (ii) TITLE OF INVENTION: Human G Protein Coupled Receptor (HETGQ23) (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 8 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: HUMAN GENOME SCIENCES, INC. (B) STREET: 9410 KEY WEST AVE. (C) CITY: ROCKVILLE (D) STATE: MARYLAND (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 20850 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: 3.5 INCH DISKETTE (B) COMPUTER: IBM PS/2 (C) OPERATING SYSTEM: MS-DOS (D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: PCT/US95/07137 (B) FILING DATE: 05-06-1995 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: HYMEL, LIN (B) REGISTRATION NUMBER: 45,414 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: PF179JP (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 301-251-6015 (B) TELEFAX: 301-309-8439 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2456 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: GGAACCGCCC CACCGTGGTG GCGGCCGCCC AGAACTAGTG GATCCCCCGG GCTGCAGGAA 60 TTCGGCACGA GCAGACACAC TTGCTTTGGT TTACAGATCC AGTGAAGTGA AAAATCAGAA 120 CTAGAAACGT ATGCACCTTC CTAGCAGCAA AGCCGCTTCT GCGTTCTTCG CAGCCTCCAG 180 TGCAGGGCGG CGCTGGGAGA AACTTTGCGC CTTCTGGAAA GTTTAGAAAG TGAGCCACGA 240 AAGAGAGGCC ACATTTCCGG GGTTTTGCGG GCCCCGCGAT GTTTTCCAGA GCTTTTCGAG 300 TGGGAAGAGG AGAGCGACAA CGTGAAAATG CCCCGTGCCG GGGCGTCCAC CGGAGTCCTG 360 CCAGCTGTCC GGCGCTGGGG TGGACGTCTG ATTTATGAAG CTCCCCATCC ACCTATCTGA 420 GTACCTGACT TCTCAGGACT GACACCTACA GCATCAGGTA CACAGCTTCT CCTAGCATGA 480 CTTCGATCTG ATCAGCAAAC AAGAAAATTT GTCTCCCGTA GTTCTGGGGC GTGTTCACCA 540 CCTACAACCA CAGAGCTGTC ATGGCTGCCA TCTCTACTTC CATCCCTGTA ATTTCACAGC 600 CCCAGTTCAC AGCCATGAAT GAACCACAGT GCTTCTACAA CGAGTCCATT GCCTTCTTTT 660 ATAACCGAAG TGGAAAGCAT CTTGCCACAG AATGGAACAC AGTCAGCAAG CTGGTGATGG 720 GACTTGGAAT CACTGTTTGT ATCTTCATCA TGTTGGCCAA CCTATTGGTC ATGGTGGCAA 780 TCTATGTCAA CCGCCGCTTC CATTTTCCTA TTTATTACCT AATGGCTAAT CTGGCTGCTG 840 CAGACTTCTT TGCTGGGTTG GCCTACTTCT ATCTCATGTT CAACACAGGA CCCAATACTC 900 GGAGACTGAC TGTTAGCACA TGGCTCCTTC GTCAGGGCCT CATTGACACC AGCCTGACGG 960 CATCTGTGGC CAACTTACTG GCTATTGCAA TCGAGAGGCA CATTACGGTT TTCCGCATGC 1020 AGCTCCACAC ACGGATGAGC AACCGGCGGG TAGTGGTGGT CATTGTGGTC ATCTGGACTA 1080 TGGCCATCGT TATGGGTGCT ATACCCAGTG TGGGCTGGAA CTGTATCTGT GATATTGAAA 1140 ATTGTTCCAA CATGGCACCC CTCTACAGTG ACTCTTACTT AGTCTTCTGG GCCATTTTCA 1200 ACTTGGTGAC CTTTGTGGTA ATGGTGGTTC TCTATGCTCA CATCTTTGGC TATGTTCGCC 1260 AGAGGACTAT GAGAATGTCT CGGCATAGTT CTGGACCCCG GCGGAATCGG GATACCATGA 1320 TGAGTCTTCT GAAGACTGTG GTCATTGTGC TTGGGGCCTT TATCATCTGC TGGACTCCTG 1380 GATTGGTTTT GTTACTTCTA GACGTGTGCT GTCCACAGTG CGACGTGCTG GCCTATGAGA 1440 AATTCTTCCT TCTCCTTGCT GAATTCAACT CTGCCATGAA CCCCATCATT TACTCCTACC 1500 GCGACAAAGA AATGAGCGCC ACCTTTAGGC AGATCCTCTG CTGCCAGCGC AGTGAGAACC 1560 CCACCGGCCC CACAGAAGGC TCAGACCGCT CGGCTTCCTC CCTCAACCAC ACCATCTTGG 1620 CTGGAGTTCA CAGCAATGAC CACTCTGTGG TTTAGAACGG AAACTGAGAT GAGGAACCAG 1680 CCGTCCTCTC TTGTAGGATA AACAGCCTCC CCCTACCCAA TTGCCAGGGC AAGGTGGGGT 1740 GTGAGAGAGG AGAAAAGTCA ACTCATGTAC TTAAACACTA ACCAATGACA GTATTTGTTC 1800 CTGGACCCCA CAAGACTTGA TATATATTGA AAATTAGCTT ATGTGACAAC CCTCATCTTG 1860 ATCCCCATCC CTTCTGAAAG TAGGAAGTTG GAGCTCTTGC AATGGAATTC AAGAACAGAC 1920 TCTGGAGTGT CCATTTAGAC TACACTAACT AGACTTTTAA AAGATTGTGT GTGGTTTGGT 1980 GCAAGTCAGA ATAAATTCTG GCTAGTTGAA TCCACAACTT CATTTATATA CAGGCTTCCC 2040 TTTTTTATTT TTAAAGGATA CGTTTCACTT AATAAACACG TTTATGCCTA TCAGCATGTT 2100 TGTGATGGAT GAGACTATGG ACTGCTTTTA AACTACCATA ATTCCATTTT TTCCCTTACA 2160 TAGGAAAACT GTAAGTTGGA ATTATCTTTT GGTTAGAAAG CATGCATGTA ATGTATGTAT 2220 GCAGCATGCC TTACTTAAAA AGATTAAAAG GATACTAATG TTAAATCTTC TAGGAAATAG 2280 AACCTAGACT TCAAAGCCAG TATTTGTTTA GGTCATGAAG CAAACAATGC TCTAATCACA 2340 ATATTAACTG TTTAATTAAA ATGTTGTAAC AAGTATAAAA CAGGGAATGT AAGTTTATTA 2400 CCAAAGTGAT ATGTATTCCA AAAAAGGTCA TAGAAGATGA AGCAACTATA ATATTG 2456 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 364 AMINO ACIDS (B) TYPE: AMINO ACID (C) STRANDEDNESS: (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: PROTEIN (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Met Ala Ala Ile Ser Thr Ser Ile Pro Val Ile Ser Gln Pro Gln 5 10 15 Phe Thr Ala Met Asn Glu Pro Gln Cys Phe Tyr Asn Glu Ser Ile 20 25 30 Ala Phe Phe Tyr Asn Arg Ser Gly Lys His Leu Ala Thr Glu Trp 35 40 45 Asn Thr Val Ser Lys Leu Val Met Gly Leu Gly Ile Thr Val Cys 50 55 60 Ile Phe Ile Met Leu Ala Asn Leu Leu Val Met Val Ala Ile Tyr 65 70 75 Val Asn Arg Arg Phe His Phe Pro Ile Tyr Tyr Leu Met Ala Asn 80 85 90 Leu Ala Ala Ala Asp Phe Phe Ala Gly Leu Ala Tyr Phe Tyr Leu 95 100 105 Met Phe Asn Thr Gly Pro Asn Thr Arg Arg Leu Thr Val Ser Thr 110 115 120 Trp Leu Leu Arg Gln Gly Leu Ile Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser 125 130 135 Val Ala Asn Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg His Ile Thr Val 140 145 150 Phe Arg Met Gln Leu His Thr Arg Met Ser Asn Arg Arg Val Val 155 160 165 Val Val Ile Val Val Ile Trp Thr Met Ala Ile Val Met Gly Ala 170 175 180 Ile Pro Ser Val Gly Trp Asn Cys Ile Cys Asp Ile Glu Asn Cys 185 190 195 Ser Asn Met Ala Pro Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Leu Val Phe Trp 200 205 210 Ala Ile Phe Asn Leu Val Thr Phe Val Val Met Val Val Leu Tyr 215 220 225 Ala His Ile Phe Gly Tyr Val Arg Gln Arg Thr Met Arg Met Ser 230 235 240 Arg His Ser Ser Gly Pro Arg Arg Asn Arg Asp Thr Met Met Ser 245 250 255 Leu Leu Lys Thr Val Val Ile Val Leu Gly Ala Phe Ile Ile Cys 260 265 270 Trp Thr Pro Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Asp Val Cys Cys Pro 275 280 285 Gln Cys Asp Val Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ala 290 295 300 Glu Phe Asn Ser Ala Met Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Arg Asp 305 310 315 Lys Glu Met Ser Ala Thr Phe Arg Gln Ile Leu Cys Cys Gln Arg 320 325 330 Ser Glu Asn Pro Thr Gly Pro Thr Glu Gly Ser Asp Arg Ser Ala 335 340 345 Ser Ser Leu Asn His Thr Ile Leu Ala Gly Val His Ser Asn Asp 350 355 360 His Ser Val Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: CACAGGATCC CGTGGCTGCC ATCTCTACTT C 31 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: TCTCAGGTAC CGTTCTCTAA ACCACAGAGT GGTCA 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: CAACCACAGG GATCCCATGG CTGCCATCTC TACTTCCATC CCTGTA 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CCCCTCGAGC TAAACCACAG AGTGGTCATT GCTGTGAACT CCAGCC 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 40 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: TTCACCACCT ACCTGGATCC ACAGAGCTGT CATGGCTGCC 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: CCTCATCTCA GGTACCGTTC TAAACCACAG AGTGG 35 【００８２】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。とくに、本発明のポリペプチドは、ヒト７−膜貫通
受容体である。本発明はまた、そのようなポリペプチド
の作用を阻害することにも関する。 【０００２】 【従来の技術】多くの医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇ−タンパク質および／または第二メッセンジャ
ー、例えば、cＡＭＰを含む信号伝達経路に関与するタ
ンパク質により媒介されることは十分確立されている
(Ｌefkowitz、Ｎature、３５１:３５３−３５４(１９９
１))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇ−タ
ンパク質またはＰＰＧタンパク質を伴う経路に関与する
タンパク質と呼ぶ。これらのタンパク質の幾つかの例に
は、アドレナリン作動薬およびドーパミンに対する受容
体のようなＧＰＣ受容体(Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、ＰＮＡ
Ｓ、８４:４６−５０(１９８７);Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、
Ｓcience、２３８:６５０−６５６(１９８７);Ｂunzow,
Ｊ.Ｒ.ら、Ｎature、３３６:７８３−７８７(１９８
８))、Ｇ−タンパク質自体、エフェクタータンパク質、
例えば、ホスホリパーゼ Ｃ、アデニルシクラーゼ、お
よびホスホジエステラーゼ、並びにアクチュエーター(a
ctuator)タンパク質、例えば、プロテインキナーゼ Ａ
およびプロテインキナーゼ Ｃ(Ｓimon,Ｍ.Ｉ.ら、Ｓcie
nce、２５２:８０２−８(１９９１)が含まれる。 【０００３】例えば、信号伝達の１つの型では、ホルモ
ン結合の効果は、細胞内部での、酵素、アデニル酸シク
ラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌ
クレオチド ＧＴＰの存在に依存して、ＧＴＰはまたホ
ルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ−タンパク質は、ホルモ
ン受容体をアデニル酸シクラーゼと連結する。Ｇ−タン
パク質は、ホルモン受容体により活性化された場合、Ｇ
ＴＰを結合ＧＤＰと交換することが示された。次いで、
そのＧＴＰ担持型は、活性化アデニル酸シクラーゼに結
合する。Ｇ−タンパク質自体により触媒される、ＧＴＰ
のＧＤＰへの加水分解は、Ｇ−タンパク質をその基本の
不活性型へと戻す。従って、Ｇ−タンパク質は、受容体
からエフェクターへと信号を中継ぎする中間体として、
および信号の持続時間を制御する時計として、二重の役
割を果たす。 【０００４】Ｇ−タンパク質結合性受容体の膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定される膜貫
通ドメインを有するものとして特徴付けられている。該
ドメインは、細胞外または細胞質ループにより連結され
た膜貫通α−ヘリックスを示すと考えられている。Ｇ−
タンパク質結合性受容体には、ホルモン、ウイルス、成
長因子、および神経受容体といったような、広範囲にわ
たる生物学的に活性な受容体が含まれる。Ｇ−タンパク
質結合性受容体は、少なくとも８つの分散した親水性ル
ープを連結する、約２０〜３０個のアミノ酸からなる、
これらの７つの保存された疎水的な広がりを含むものと
して特徴付けられている。結合性受容体のＧ−タンパク
質ファミリーには、精神病性および神経学的障害を治療
するために使用される神経弛緩薬に結合するドーパミン
受容体が含まれる。このファミリーのメンバーの他の例
には、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン(end
othelin)、cＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチ
ルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニ
ン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１
受容体、ロドプシン、におい物質、サイトメガロウイル
ス受容体等が含まれる。 【０００５】大部分のＧ−タンパク質結合性受容体は、
機能的タンパク質の構造を安定化すると考えられている
ジスルフィド結合を形成する、最初の２つの細胞外ルー
プの各々に、１つの保存されたシステイン残基を有す
る。７つの膜貫通領域を、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
Ｍ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と名付ける。ＴＭ
３もまた、信号伝達に関与する。システイン残基のリン
酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化)
は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体の信号伝達に
影響を及ぼし得る。大部分のＧ−タンパク質結合性受容
体は、３番目の細胞質ループおよび／またはカルボキシ
末端内に可能性のあるリン酸化部位を含む。β−アドレ
ナリン作動性受容体のような、幾つかのＧ−タンパク質
結合性受容体に関して、プロテインキナーゼ Ａおよび
／または特異的受容体キナーゼによるリン酸化は、受容
体の脱感受性を媒介する。 【０００６】幾つかの受容体については、Ｇ−タンパク
質結合性受容体のリガンド結合部位は、数個のＧ−タン
パク質結合性受容体膜貫通ドメインにより形成された親
水性ソケットを含んでなると考えられており、このソケ
ットは、Ｇ−タンパク質結合性受容体の疎水性残基によ
り囲まれている。各々のＧ−タンパク質結合性受容体膜
貫通へリックスの親水性側は、内側を向いて、極性リガ
ンド結合部位を形成すると仮定されている。ＴＭ３は、
ＴＭ３ アスパラギン酸残基が含まれるような、リガン
ド結合部位を有するものとして、幾つかのＧ−タンパク
質結合性受容体に関係がある。加えて、ＴＭ５ セリ
ン、ＴＭ６ アスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７
フェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に
関係がある。 【０００７】Ｇ−タンパク質結合性受容体は、ヘテロト
リマーのＧ−タンパク質により、様々な細胞内酵素、イ
オンチャンネル、および輸送体に細胞内で結合すること
ができる(Ｊohnsonら、Ｅndoc.、改訂版、１０:３１７
−３３１（１９８９）を参照）。様々なＧ−タンパク質
のα−サブユニットは、特定のエフェクターを優先的に
刺激して、細胞における様々な生物学的機能を変化させ
る。Ｇ−タンパク質結合性受容体の細胞質残基のリン酸
化は、幾つかのＧ−タンパク質結合性受容体のＧ−タン
パク質結合の調節に関する重要な機構として同定されて
いる。Ｇ−タンパク質結合性受容体は、哺乳動物の宿主
内の多くの部位において見い出される。本発明の一態様
により、新規ポリペプチドならびに生物学的に活性であ
って、診断上または治療上有用な、そのフラグメントお
よび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト
起源である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明の別の態様によ
り、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、
本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、並びに
生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、
そのフラグメントを提供する。本発明のさらなる態様に
より、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造
する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその
後の当該タンパク質の回収を促進する条件下において、
ヒトＧ−タンパク質結合性受容体の核酸配列を含む組換
え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含
んでなる方法を提供する。 【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の別
の態様により、本発明の受容体ポリペプチドに結合し
て、該ポリペプチド活性化するかまたは活性化を阻害す
る化合物に関してスクリーニングする方法を提供する。
本発明のさらに別の態様により、Ｇ−タンパク質結合性
受容体の発現不足に関係がある病態の治療に対して本発
明の受容体ポリペプチドを刺激するために、そのような
活性化化合物を使用する方法を提供する。 【００１０】本発明の別の態様により、Ｇ−タンパク質
結合性受容体の過剰発現と関連のある病態を治療するこ
とに対して本発明のポリペプチドの作用を阻害するため
に、そのような阻害化合物を使用する方法を提供する。
本発明のまた別の態様により、本発明のＧ−タンパク質
結合性受容体の少なくとも１つの膜貫通ドメインの、同
型的なアミノ酸置換を有するフラグメント、コンセンサ
スフラグメントおよび／または配列である、天然には存
在しない、合成の、単離された、および／または組換え
Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチドを提供するこ
とから、該受容体は、Ｇ−タンパク質結合性受容体リガ
ンドを結合することができ、またはこれは、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体リガンド結合を量的に、または質的に
変化させることもできる。 【００１１】本発明のさらに別の態様により、それらの
期待される生物学的特性によって、リガンドに結合する
ことにより、またはリガンド結合を変化させることによ
り、Ｇ−タンパク質結合性受容体機能の可能性のあるモ
ジュレーターとして有用であり得る、Ｇ−タンパク質結
合性受容体合成または組換えＧ−タンパク質結合性受容
体ポリペプチド、その同型的な置換誘導体、抗体、抗イ
ディオタイプ抗体、組成物、および方法を提供し、これ
らは、診断、治療および／または研究での応用に使用す
ることができる。 【００１２】本発明の別の目的により、様々なＧ−タン
パク質結合性受容体またはそのフラグメントを阻害す
る、または模倣することを意図する、合成の、単離され
た、または組換えポリペプチドを、受容体タイプおよび
サブタイプとして提供する。本発明のさらに別の態様に
より、本発明の核酸配列に対して特異的にハイブリダイ
ズするのに充分な長さの核酸分子を含んでなる診断プロ
ーブも提供する。本発明のまた別の目的により、変異し
たＧ−タンパク質結合性受容体核酸配列に関係がある疾
患、または疾患に対する感受率を検出するための診断ア
ッセイを提供する。本発明のこれらの態様および他の態
様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【００１３】本発明の一態様により、図１〜５の推定ア
ミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチド、
または１９９５年４月２８日にＡＴＣＣ寄託番号第９７
１３０号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された
核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト内皮腫瘍組
織由来のｃＤＮＡから単離された。それは、構造上、Ｇ
−タンパク質結合性受容体ファミリーに関係がある。そ
れは、３６４個のアミノ酸残基のタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク
質は、ヒトＥＤＧ−１タンパク質に対し、３６４アミノ
酸長さにわたり、３６％の同一性と６１％の類似性をも
って、最も高い程度の相同性を示す。本発明の受容体ポ
リヌクレオチドに対する潜在的リガンドは、アナンダミ
ン、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリ
ン、血小板活性化因子、トロンビン、Ｃ５ａおよびブラ
ジキニン、ケモカインならびに血小板活性化因子などが
挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【００１４】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、図１〜５に示すコード配列（配列番号１）または寄
託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あ
るいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１
〜５のＤＮＡ（配列番号１）または寄託されたcＤＮＡ
と同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配
列であってもよい。 【００１５】図１〜５の成熟ポリペプチド（配列番号
２）または寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下
のものが含まれ得る:成熟ポリペプチドのコード配列の
み;成熟ポリペプチドのコード配列（および場合により
付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード
配列のイントロンまたは非コード配列５'および／また
は３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポ
リペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチ
ド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コー
ド配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。 【００１６】本発明は、さらに、図１〜５の推定アミノ
酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードす
る、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌ
クレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在
するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存
在しない変異体であり得る。従って、本発明には、図１
〜５に示すのと同じ成熟ポリペプチド（配列番号２）ま
たは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる
同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が
含まれ、これらの変異体は、図１〜５のポリペプチド
（配列番号２）または寄託されたクローンのcＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド
変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および
挿入変異体が含まれる。 【００１７】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜５に示すコード配列（配列番号１）の天然に
存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコー
ド配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列
を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異
体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失
または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列で
あり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質
的には変えない。ポリヌクレオチドはまた、本発明の全
長ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
から切断された、本発明ポリペプチドの細胞外部分であ
る、本発明の受容体ポリペプチドの可溶性体をコードす
る。 【００１８】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７:７６７
(１９８４))。 【００１９】「遺伝子」なる語はポリペプチド鎖の製造
に関与するＤＮＡセグメントを意図している；コーディ
ング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラ
ー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソ
ン）の間の配列（イントロン）も含む。全長の本発明の
ポリヌクレオチド配列のフラググメントをｃＤＮＡライ
ブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用
して他の遺伝子を単離し、これらの遺伝子は本発明のポ
リヌクレオチド配列と高い配列類似性または同様の生物
学的活性を有する。このタイプのプローブは少なくとも
２０または３０塩基を有するのが好ましいが、５０塩基
あるいはそれ以上を有してもよい。該プローブはまた、
全長の転写物に対応するcＤＮＡクローン、および制御
領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロ
ンを含む完全な本発明の遺伝子を含む単一または複数の
ゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリー
ニングの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成する
ため公知のＤＮＡ配列を使用することによる遺伝子のコ
ーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と
相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチド
は、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブ
リダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニング
するのに使用する。 【００２０】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少
なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハ
イブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」と
いう用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましく
は少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブ
リダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好
ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドは、図１〜５のcＤＮＡ(配列
番号１)もしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは
活性を保持するポリペプチドをコードする。 【００２１】言い方を替えると、本発明ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズし、上記の同一性があり、活性を保
持するかまたはしない該ポリヌクレオチドは、少なくと
も２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、さらに好
ましくは少なくとも５０塩基を有する。たとえば、この
ようなポリヌクレオチドは、たとえば配列番号１のポリ
ヌクレオチドの回収用の該ポリヌクレオチドに対するプ
ローブとして、または診断用プローブとして、あるいは
ＰＣＲプライマーとして使用できる。したがって、本発
明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性があるポリヌクレオチド、ならびに少なくとも２０
または３０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基を有す
る、そのフラグメント、および、このようなポリヌクレ
オチドによってコードされるポリペプチドに関する。 【００２２】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２下に要求されることを承認するもので
はない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチド
の配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、
本明細書中の配列のいずれかの記載の矛盾する際はいつ
でも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、
または販売するには、実施許諾が要求され得、またその
ような実施許諾は、ここでは付与されない。 【００２３】本発明はさらに、図１〜５の推定アミノ酸
配列（配列番号２）を有する、または寄託されたcＤＮ
Ａによりコードされるアミノ酸配列を有するＧ−タンパ
ク質結合性受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのよ
うなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導
体に関する。図１〜５のポリペプチド（配列番号２）ま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナ
ログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチ
ド、すなわち、Ｇ−タンパク質結合性受容体として機能
するか、または、たとえポリペプチドがＧ−タンパク質
結合性受容体として機能しなくとも(例えば、可溶性型
の受容体)、リガンドまたは受容体を結合する能力を保
持するポリペプチドを意味する。アナログには、プロプ
ロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な
成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテイ
ンが含まれる。 【００２４】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換えポリペプチドであってよい。図１〜５のポ
リペプチド（配列番号２）または寄託されたcＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログは、(ｉ)１つまたはそれ以上のアミノ酸
残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同
型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置
換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるもので
あってもよく、またはコードされたものでなくてもよい
もの、(ｉｉ)１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換
基が含まれるもの、または(ｉｉｉ)成熟ポリペプチド
が、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例え
ば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と
融合しているもの、または(ｉｖ)リーダーもしくは分泌
配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配
列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの、また
は（ｖ）該ポリペプチドのフラグメントが可溶性、すな
わち膜に結合せず、依然として膜結合受容体に対するリ
ガンドに結合しているものであり得る。そのようなフラ
グメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示
から当業者の範囲内であると思われる。 【００２５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」とい
う用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に
存在するなら、天然の環境)から除去されていることを
意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在す
るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
ないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全
てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは
ベクターの部分となり得、および／またはそのようなポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分とな
り得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の部分ではないという点で、なお単離されてい
る。 【００２６】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに、配列
番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似
性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、さらに好
ましくは少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは
少なくとも９０％の同一性）、さらにより好ましくは少
なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは９５％
の同一性）をもつポリペプチド、および一般的に少なく
とも３０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０ア
ミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。当
業界で知られているように、２つのポリペプチド間の
「類似性」とは、ひとつのポリペプチドのアミノ酸配列
およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチ
ドのアミノ酸配列と比較することによって測定される。 【００２７】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプ
チドを生産するのに用いることができる；したがって、
該フラグメントは、全長ポリペプチドの製造用中間体と
して用いることができる。本発明のポリペプチドのフラ
グメントまたは部分は、本発明の全長ポリペプチドの合
成に用いることができる。本発明はまた、本発明のポリ
ヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで
遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプ
チドの組換え技術による製造にも関する。 【００２８】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＧ−タンパク質結合性受容体遺伝子を増幅するの
に適するよう改変された従来の栄養培地で培養すること
ができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発
現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であ
って、当業者に明らかであろう。 【００２９】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体;細菌プラスミド;ファージＤＮＡ;バキュロウ
イルス;酵母プラスミド;プラスミドとファージＤＮＡと
の組合せから得られるベクター;ワクシニア、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイ
ルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクター
も、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である
限り、使用することができる。 【００３０】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可
能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロ
モーターの代表例として、以下のものが挙げられる:Ｌ
ＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli lacまたはt
rp、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もし
くは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現
を制御することが知られている他のプロモーター。発現
ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増
幅するのに適当な配列も含み得る。 【００３１】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当な
ＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは
制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォ
ームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現
するのを可能にすることができる。 【００３２】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる:Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella typ
himuriumといったような細菌細胞;酵母のような真菌細
胞;Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９といった
ような昆虫細胞;ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノー
マといったような動物細胞；アデノウイルス;植物細胞
等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者
の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはま
た、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んで
なる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の
配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドま
たはウイルスベクターといったようなベクターを含んで
なる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさ
らに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモータ
ーを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよ
びプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販さ
れている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用:p
ＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pbs、pＤ
１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７
４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６
a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene);ptrc９９
a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、
pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用:pＷＬＮＥＯ、pＳ
Ｖ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagen
e)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmaci
a)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクター
も、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能であ
る限り、使用することができる。 【００３３】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。 【００３４】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey.Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecul
ar Ｂiology(１９８６))。宿主細胞中の構築物を通常の
方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子
産物を製造することができる。あるいはまた、本発明の
ポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的
に製造することができる。 【００３５】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual,第２版、Ｃold Ｓp
ring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載さ
れており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 【００３６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーが含まれる。 【００３７】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列と共に、
適当な相(phase)で構築される。場合により、その異種
配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物
の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプ
チドが含まれる融合タンパク質をコードすることができ
る。 【００３８】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモ
ーターを有する作動可能なリーディング相に挿入するこ
とにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持
を確実なものとするために、また所望により、宿主内で
の増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の
選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであ
ろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主に
は、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhi
murium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、お
よびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれる
が、他のものもまた、選択物質として使用することがで
きる。 【００３９】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromege Ｂiotec、Ｍadis
on、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォー
メーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖
させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例え
ば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞
をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分
離により収集し、物理的または化学的方法により破壊し
て、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のため
に保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。 【００４０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３:１７
５(１９８１)により記載されている、サルの腎臓線維芽
細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現
させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＣＨＯＨＳ２９３、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が
含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必
要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、お
よび５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろ
う。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配
列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされ
る非転写遺伝要素を与えることができる。本発明のＧ−
タンパク質結合性受容体ポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ
ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から
回収して精製することができる。必要に応じて、タンパ
ク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成す
るのに使用することができる。最後に、高性能液体クロ
マトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用するこ
とができる。 【００４１】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のＧ−タンパク
質結合性受容体は、該受容体ポリペプチドを活性化する
化合物(アゴニスト)および／または活性化を阻害する化
合物(アンタゴニスト)に関してスクリーニングする方法
において使用することができる。一般に、そのようなス
クリーニング方法は、その表面上に本発明受容体ポリペ
プチドを発現する適当な細胞を与えることを必要とす
る。このような細胞には、哺乳類、酵母、drosophilaま
たはE.Coliが含まれる。特に、本発明の受容体をコード
するポリヌクレオチドを使用して、細胞をトランスフェ
トし、そのことによって、Ｇ−タンパク質結合性受容体
を発現させる。次いで、発現した受容体を試験化合物に
接触させて、結合、機能的応答の刺激または阻害を観察
する。 【００４２】そのようなスクリーニング方法の１つは、
本発明のＧ−タンパク質結合性受容体を発現するために
トランスフェクトされる、メラノフォアの使用を必要と
する。そのような技術は、１９９２年２月６日に公開さ
れたＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１０に記載されている。
従って、例えば、そのようなアッセイは、Ｇ−タンパク
質結合性受容体をコードするメラノフォア細胞を、その
受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物の両
方と接触させることにより、本発明受容体ポリペプチド
の活性化を阻害する化合物に関してスクリーニングする
ために利用することができる。該リガンドにより発生さ
れる信号の阻害は、化合物が該受容体に対して可能性の
あるアンタゴニストであること、すなわち、該受容体の
活性化を阻害することを示す。該スクリーニングは、そ
のような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ
ることにより、該受容体を活性化する化合物を決定する
ために、またそのような化合物が信号を発生するかどう
か、すなわち、該受容体を活性化するかどうかを測定す
るために利用することができる。 【００４３】他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓ
cience、第２４６巻、１８１−２９６頁(１９８９年１
０月)に記載されているような、受容体の活性化により
引き起こされる細胞外のpＨ変化を測定するシステムに
おいての、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する細胞
(例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞)の使用が
含まれる。例えば、該化合物を、本発明の受容体ポリペ
プチドを発現する細胞と接触させて、第二メッセンジャ
ー応答、例えば、信号伝達またはpＨ変化を測定して、
該受容体を活性化または阻害する可能性のある化合物が
有効であるかどうかを決定することができる。別のその
ようなスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受
容体をコードするＲＮＡを、アフリカツメガエル卵母細
胞中に導入して該受容体を一時的に発現させることを必
要とする。受容体を阻害すると考えられる化合物をスク
リーニングする場合、次いで、その受容体卵母細胞を、
その受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物
と接触させ、続いて、カルシウム信号の阻害または活性
化を検出することができる。 【００４４】別のスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク
質結合性受容体を発現させることを必要とし、ここで
は、該受容体をホスホリパーゼ ＣまたはＤに結合させ
る。そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋
細胞、胚腎臓細胞等を挙げることができる。スクリーニ
ングは、該受容体の活性化または該受容体の活性化の阻
害をホスホリパーゼ第二信号から検出することにより、
上記のように成し遂げることができる。別の方法は、標
識化リガンドの、その表面上に該受容体を有する細胞へ
の結合の阻害を測定することにより、本発明受容体ポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物に関してスクリーニ
ングすることを必要とする。そのような方法は、真核細
胞を、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするＤＮＡ
と共にトランスフェクトすることから、該細胞がその表
面上に該受容体を発現して、標識化型の既知のリガンド
の存在下、該細胞を可能性のあるアンタゴニストと接触
させることを必要とする。該リガンドは、例えば、放射
能により標識化することができる。該受容体に結合した
標識化リガンドの量は、例えば、該受容体の放射能によ
り測定する。該受容体に結合する標識化リガンドの減少
により測定されるように、もし該化合物が該受容体に結
合するならば、標識化リガンドの該受容体への結合が阻
害される。 【００４５】Ｇ−タンパク質結合性受容体は、哺乳動物
の宿主に偏在して、多くの病状を含め、多くの生物学的
機能を担う。従って、一方では、Ｇ−タンパク質結合性
受容体を刺激し、また他方では、Ｇ−タンパク質結合性
受容体を阻害するすることができる化合物および薬物を
見い出すことが望まれる。たとえば、Ｇ−タンパク質結
合性受容体を活性化する化合物は、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧症、尿うっ滞、および骨粗鬆症
の治療といったような、治療目的にも有用である。一般
に、スクリーニング方法により決定される、Ｇ−タンパ
ク質結合性受容体の活性化を阻害する化合物は、様々な
治療目的に使用することができ、例えば、高血圧症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺
肥大、ならびに精神分裂病、躁病性興奮、うつ病、せん
妄、痴呆、重度精神遅滞、ハンティングトン病またはジ
ル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害などの神経
および精神疾患の治療に用いられる。Ｇ−タンパク質結
合性受容体を阻害する化合物は、内因性食欲不振の軽減
および過食症のコントロールにも用いられる。 【００４６】抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌ
クレオチドは、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合する
が、第二メッセンジャー応答を引き出さないことから、
該Ｇ−タンパク質結合性受容体をアンタゴナイズする。
抗体には、通例、抗体の抗原結合部位と関連がある独自
の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体が含まれる。
可能性のあるアンタゴニスト化合物にはまた、Ｇ−タン
パク質結合性受容体のリガンドと密接に関係のあるタン
パク質、すなわち、生物学的機能を失ってしまってお
り、またＧ−タンパク質結合性受容体に結合しても、応
答を全く引き出さないリガンドのフラグメントも含まれ
る。アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセン
ス構築物は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡ
もしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することがで
き、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡま
たはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポ
リペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'
コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対
して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎu
cl.Ａcids Ｒes.、６:３０７３(１９７９);Ｃooneyら、
Ｓcience、２４１:４５６(１９８８);およびＤervan
ら、Ｓciece、２５１:１３６０(１９９１)を参照)、そ
のことによって、転写およびＧ−タンパク質結合性受容
体の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズし
て、mＲＮＡ分子のＧ−タンパク質結合性受容体への翻
訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeuroch
em.、５６:５６０(１９９１);Ｏligodeoxynucleotides
as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、Ｃ
ＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ(１９８８))。上記の
オリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発
現させて、Ｇ−タンパク質結合性受容体の産生を阻害す
ることができる。 【００４７】小さなペプチドまたはペプチド様分子など
の、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合し、リガンドに
近づき難くすることから、正常な生物学的活性を妨げる
小さな分子も、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を
阻害するのに用いることができる。受容体のフラグメン
トなどの可溶性型のＧ−タンパク質結合性受容体も、リ
ガンドに結合して、そのリガンドが、膜に結合したＧ−
タンパク質結合性受容体と相互作用できないようにする
ことにより、該受容体の活性化を阻害するのに用いるこ
とができる。 【００４８】本発明はさらに、医薬的に許容しうる担体
とともに有効量の上記阻害化合物を患者に投与して、リ
ガンドがＧ−タンパク質結合性受容体へ結合することを
遮断することにより、または第２シグナルを妨げること
により、Ｇ−タンパク質結合性受容体の活性化を阻害
し、それによって異常な状態を軽減することを特徴とす
る、Ｇ−タンパク質結合性受容体活性の過剰に関連した
異常な状態の治療方法を提供する。本発明は、また、医
薬的に許容しうる担体とともに有効量の上記活性化化合
物を患者に投与し、それによって異常な状態を軽減する
ことを特徴とする、Ｇ−タンパク質結合性受容体活性の
発現不足に関連した異常な状態の治療方法を提供する。
可溶性体のＧ−タンパク質結合性受容体、およびこのよ
うな受容体を活性化または阻害する化合物は、適当な薬
学的担体と組み合わせて使用することができる。そのよ
うな組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチドまたは
化合物、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を
含んでなる。そのような担体には、これに限定されるも
のではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれ
らの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適
合すべきである。 【００４９】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化
合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、局
所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内
経路といったような、便利な方法で投与することができ
る。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／また
は予防するのに有効な量で投与される。一般に、該医薬
組成物は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与
され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg
(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの
場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量
は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。 【００５０】該Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチ
ド、および活性化または阻害化合物は、「遺伝子治療」と
呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビ
ボにおける発現により、本発明に従って使用することが
できる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビ
ボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該
ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法
は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用
によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作する
ことができる。 【００５１】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて操作し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。 【００５２】レトロウイルスプラスミドベクターは、モ
ロニーマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイ
ルス、脾臓壊死ウイルス、ロウス肉腫ウイルス、ハーベ
イ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血
病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、
骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレト
ロウイルスから誘導することができるが、これらに限定
されるものではない。ひとつの具体例において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病
ウイルスから誘導される。ベクターには、１種または２
種以上のプロモーターが含まれる。適当なプロモーター
としては、ミラー（Miller）らのＢiotechniques,Ｖｏ
ｌ．７，Ｎｏ．９，９８０〜９９０（１９８９）に記載
されているレトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ
ー；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ
ーター、もしくはその他のプロモーター（たとえば、ヒ
ストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター
などの真核細胞性プロモーターといったような細胞性プ
ロモーター；ただし、これらに限定されるものではな
い）が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。適当なプロモーターの選択は、本発明の教示から当
業者に明らかであろう。 【００５３】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターによって調節される。適当な
プロモーターとしては、アデノウイルスメジャーレイト
プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プ
ロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；Ｍ
ＴＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど
の誘発プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブ
ミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロ
ブリンプロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼプロモーターといったようなウイルスチミジンキ
ナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（前述の修
飾レトロウイルスＬＴＲも含む）；β−アクチンプロモ
ーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターなどが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。該プロ
モーターは、該ポリペプチドをコードする遺伝子を調節
する活性（native）プロモーターである。 【００５４】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入を行い、プロデュー
サー細胞系を形成する。トランスフェクトされうるパッ
ケージング細胞としては、ミラーのHuman Gene Therap
y、Vol.１、５〜１４（１９９０）に記載された、ＰＥ５
０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１
９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣ
ＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２および
ＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。ベクターによるパッケージング細胞への形質
導入は、当業者には既知の方法で行うことができる。こ
のような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用お
よびＣａＰＯ４沈降が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。別法として、レトロウイルスプラスミ
ドベクターをリポソーム中に封入するか、または、脂質
に結合させて宿主に投与してもよい。 【００５５】プロデューサー細胞系は、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイル
スベクター粒子を生産する。次いで、このようなレトロ
ウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはイン
ビボのいずれかにて真核細胞に形質導入することができ
る。形質導入された真核細胞は、本発明のポリペプチド
をコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入さ
れうる真核細胞としては、胚幹細胞、肝細胞、線維芽細
胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細
胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体に結
合しうるような条件下で、Ｇ−タンパク質結合性受容体
を発現する哺乳動物細胞をリガンドに接触させ、該受容
体に結合するリガンドの存在を検出し、それによって該
リガンドがＧ−タンパク質結合性受容体に結合するかど
うかを決定することを特徴とする、本発明のＧ−タンパ
ク質結合性受容体に結合する能力が分かっていないリガ
ンドが、このような受容体に結合しうるかどうかを決定
する方法を提供する。 【００５６】本発明はさらに、細胞の表面上でヒトＧ−
タンパク質結合性受容体と特異的に相互作用して、これ
に結合する薬物を同定するために、薬物をスクリーニン
グする方法であって、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコ
ードする、単離されたＤＮＡ分子を含んでなる哺乳動物
の細胞を、複数の薬物と接触させ、その哺乳動物の細胞
に結合するそれらの薬物を決定し、またそのことによっ
て、本発明のヒトＧ−タンパク質結合性受容体と特異的
に相互作用して、これに結合する薬物を同定することを
含んでなる方法を提供する。次いで、このような薬物を
治療的に用いて、本発明の受容体を活性化するかまたは
活性化を阻害する。 【００５７】本発明はまた、Ｇ−タンパク質結合性受容
体をコードするmＲＮＡの存在を検出することにより、
細胞の表面上でのＧ−タンパク質結合性受容体の発現を
検出する方法であって、細胞から全体のmＲＮＡを得
て、ハイブリダイズする条件下、そのようにして得られ
たmＲＮＡを、ヒトＧ−タンパク質結合性受容体をコー
ドする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイ
ブリダイズすることが可能である、本発明の核酸プロー
ブと接触させて、そのプローブにハイブリダイズしたm
ＲＮＡの存在を検出し、またそのことによって、Ｇ−タ
ンパク質結合性受容体の発現を該細胞により検出するこ
とを含んでなる方法も提供する。 【００５８】本発明はまた、本発明の受容体ポリペプチ
ドをコードする核酸配列における変異の存在に関係があ
る疾患、または疾患に体する感受率を検出するための診
断アッセイの一部としての、Ｇ−タンパク質結合性受容
体遺伝子の使用にも関する。そのような疾患、例えば、
腫瘍および癌は、細胞のトランスフォーメーションに関
係がある。ヒトＧ−タンパク質結合性受容体遺伝子にお
いて変異が起こっている個体は、様々な技術により、Ｄ
ＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、
患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検お
よび剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、
検出のために直接使用することができ、または分析前に
ＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４:１６３−１６６(１
９８６))を利用することにより、酵素的に増幅すること
ができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使
用することができる。例としては、Ｇ−タンパク質結合
性受容体タンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを使用して、Ｇ−タンパク質結合性受容体変
異を同定して分析することができる。例えば、欠失およ
び挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイ
ズにおける変化により検出することができる。点変異
は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化Ｇ−タンパク質
結合性受容体のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化Ｇ
−タンパク質結合性受容体のアンチセンスＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることにより同定することができる。
完全に対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化によ
り、または融解温度の相違により、対合していない複式
物(duplexes)と区別することができる。 【００５９】参照遺伝子と「変異体」の間の配列の相違
は直接のＤＮＡシークエンシニグ方法によって明らかに
なる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメントは特
異的なＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用
する。この方法の感度はＰＣＲと組み合わされる場合に
非常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または一
本鎖鋳型分子とともに使用したシークエンシング法は修
飾したＰＣＲ産物によって産生される。配列決定は放射
線標識したヌクレオチドを使用する従来の方法によっ
て、または蛍光標識タグを有する自動シークエンシング
方法によって行われる。 ＤＮＡ配列の相違に基づいた
遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤ
ＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出
により成し遂げることができる。小さな配列の欠失およ
び挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化すること
ができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルム
アミジングラジエントゲルを変性することで区別するこ
とができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動
度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度に
より、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、
Ｍyersら、Ｓcience、２３０:１２４２(１９８５)を参
照)。 【００６０】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５:４３９７−４
４０１(１９８５))。従って、特異的なＤＮＡ配列の検
出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限
酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ))、
およびサザンブロッティングといったような方法により
成し遂げることができる。さらに従来的なゲル電気泳動
およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、insitu分
析により検出することもできる。本発明はさらに、宿主
由来のサンプルにおいてレベルが上昇することがある疾
患の指標であるところの本発明の受容体ポリペプチドの
可溶性体のレベルが変化していることを検出する診断ア
ッセイに関する。可溶性受容体ポリペプチドの検出に利
用することができるアッセイは当業者によく知られてお
り、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳ
Ａアッセイが使用される。 【００６１】ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のポリ
ペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクロー
ナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体
をモノクローナル抗体に対して調製する。該リポーター
抗体に放射能、蛍光または本実施例においては西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ酵素といったような検出可能な薬剤
を結合させる。サンプルを直ちに宿主から取り除いて、
サンプル中のタンパク質と結合する固相支持体、例えば
ポリスチレンの皿の上でインキュベートする。ついでウ
シ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質と共に
インキュベートすることにより、その皿の空いているタ
ンパク質結合部位を全て覆う。つぎに、モノクローナル
抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そ
のモノクローナル抗体はポリスチレン皿に結合したの本
発明のタンパク質に結合する。結合しなかったモノクロ
ーナル抗体を全てバッファーで洗い流す。西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に直ちに
置くと、リポーター抗体の、本発明のポリペプチドに結
合した任意のモノクローナル抗体への結合が起こる。つ
いで結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。ついで
ペルオキシダーゼ基質を皿に加え、一定時間の発色量を
標準曲線に対して比較する場合、患者のサンプルの一定
体積中に存在する本発明のタンパク質の量の測定値であ
る。 【００６２】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡
単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましく
は、１５−２５bp)を調製することにより、配列を染色
体にマップすることができる。３'の翻訳されていない
領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中
の１つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマー
を迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとす
る。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体
を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それ
らのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与
えるであろう。 【００６３】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマーキング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレ
ッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５０または６０塩基という短
いcＤＮＡで利用することができる。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes : a Ｍanual of
Ｂasic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨー
ク(１９８８)を参照。 【００６４】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance)）によって確認する。次
に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間の
cＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要があ
る。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおい
て認められるが、いずれの正常な個体においても認めら
れないなら、その変異は疾患の原因となるものであるら
しい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング
の分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化
したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝
子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベース
のマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定
する)。 【００６５】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。本発明の配列に対応するポリ
ペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動
物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動
物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得
ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体
は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方
法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする
配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体
を製造するのに使用することができる。次いで、そのよ
うな抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織
からポリペプチドを単離することができる。 【００６６】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday４:７２)、およびヒトモノクローナル抗体
を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されてい
る技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免
疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するの
に適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用
して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト
化抗体を発現させることもできる。 【００６７】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する;しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の
理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法
および／または用語を記載する。 【００６８】「プラスミド」は、前置きする小文字のpお
よび／または続けて大文字および／または数字により示
す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、
限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または
公開された方法により入手可能なプラスミドから構築で
きる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミド
は、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列により作用する制
限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す、本明細書中
で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの
反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知ら
れているように使用した。分析目的には、一般的に、緩
衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフ
ラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミ
ド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的に
は、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μg
を２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素
に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定され
ている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることが
できる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲル
で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。 【００６９】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８:４０５７(１
９８０)により記載されている８％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に
合成することができる。一本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す、そ
のような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを
有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフ
ェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチド
にライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチド
は、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲート
するであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既
知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、トランスフォーメーション
は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、
５２:４５６−４５７(１９７３)の方法に記載されてい
るようにして行った。 【００７０】 【実施例】実施例１ Ｇ−タンパク質結合性受容体（ＧＰＲＣ）ポリペプチド
の細菌発現および精製最初に、ＧＰＲＣをコードするＤ
ＮＡ配列(ＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号)を、プロセ
シングしたＧＰＲＣ核酸配列（シグナルペプチド配列を
含む）の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。ＧＰＲＣ核酸
配列に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'お
よび３'末端配列に追加する。５'オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、配列： 5' CACAGGATCCCGTGGCTGCCATCTCTACTTC 3'（配列番号：
３） を有し、ＢamＨＴ制限酵素部位を、続いて、切断された
タンパク質の推定第２アミノ酸から始まるＧＰＲＣコー
ディング配列の１７ヌクレオチドを含む。３'配列： 5' TCTCAGGTACCGTTCTCTAAACCACAGAGTGGTCA（配列番号：
４） は、ＡＳＰ７１８部位に対する相補的配列、および続く
ＧＰＲＣコーディング配列の１９ヌクレオチドを含む。
その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−３１
（キアゲン、インク）、チャタワース（Ｃhatswort
h）、カリフォルニア)上の制限酵素部位に一致する。p
ＱＥ−３１は、抗生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始
点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペ
レーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−
Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついで
pＱＥ−３１をＢamＨＴおよびＡＳＰ７１８で消化す
る。増幅した配列をpＱＥ−３１にライゲーションし、
ついでヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と
共にイン・フレームで挿入する。次いで、そのライゲー
ション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン、
インク）である大腸菌株をサンブルックら、モレキュラ
ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８
９）に記載された方法によってトランスフォームした。
Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含
み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナ
マイシン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマント
を、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定
しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選
択する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp(１００
μg／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方を補った、Ｌ
Ｂ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。その
Ｏ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜
１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の
間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)まで増殖させる。次
いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加え
た。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ
／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることに
より誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次
いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットを
カオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で
可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタ
グを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件
下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィー
により、可溶化したＧＰＲＣを精製する(ホチュリ（Ｈo
chuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography ４１１：１７７
−１８４（１９８４））。６モルのグアニジンＨＣl
（ｐＨ５.０）中、ＧＰＲＣ（純度９０％）をカラムか
ら溶出し、また再生を目的として３モルのグアニジンＨ
Ｃｌに合わせ、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０モ
ルのグルタチオン（還元された）および２ミリモルのグ
ルタチオン（酸化された）で調節する。この溶液中で１
２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリ
モルのリン酸ナトリウムにて合わせる。 【００７１】実施例 ２ ＣＯＳ細胞における組換えＧＰＲＣの発現 プラスミド、ＧＰＲＣ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０ 複
製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）大腸菌複
製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン
およびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを
含む、ベクター pcＤＮＡ３／Ａmp(インビトロゲン（Ｉ
nvitrogen)）から得られる。完全なＧＰＲＣの前駆体お
よびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタグ
をコードするＤＮＡ断片を、そのベクターのポリリンカ
ー領域にクローニングすることから、組換えタンパク質
発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタ
グは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパ
ク質から得られるエピトープに対応する(ウィルソン
（Ｉ．Ｗilson）、ニマン（Ｈ.Ｎiman）、ハイテン
（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、
コノリー（Ｍ.Ｃonnolly）、およびラーナー（Ｒ.Ｌern
er）、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我
々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。 【００７２】プラスミド構築方法を以下に記載する：Ｇ
ＰＲＣをコードするＡＴＣＣ受託番号第９７１３０号の
ＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲによ
り構築する： ５'プライマー配列： 5' CAACCACAGGGATCCCATGGCTGCCATCTCTACTTCCATCCCTGTA
3'（配列番号：５） はＢamＨＩ部位（太字）、続いて開始コドンから出発す
るＧＰＲＣのコーディング配列の２７ヌクレオチドを含
む； ３'配列： 5' CCCCTCGAGCTAAACCACAGAGTGGTCATTGCTGTGAACTCCAGCC
3'（配列番号：６） は、ＸhoＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＧＰＲＣコーディング配列の最後の２
４ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。
従って、ＰＣＲ産物は、ＨindＩＩＩ部位、ＧＰＲＣコ
ーディング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨ
Ａタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終結コドン、およびＸ
hoＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片お
よびベクター、pcＤＮＡ３／Ａmpを、ＨindＩＩＩおよ
びＸhoＩ制限酵素で消化して、ライゲーションする。そ
のライゲーション混合物を大腸菌株 ＤＨ５αにトラン
スフォームし、そのトランスフォームされた培養物をア
ンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選
択する。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントか
ら単離して、正しい断片の存在に関してＰＣＲおよび制
限分析により試験する。組換えＧＰＲＣの発現のため
に、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ細胞を
発現ベクターでトランスフェクションする。(サンブル
ック、フリッチ（Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ.Ｍan
iatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリ
ー・プレス、（１９８９）)。ＧＰＲＣ ＨＡタンパク質
の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する
(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アン
チボディーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプ
リング・ラボラトリー・プレス、（１９８８）)。トラ
ンスフェクションから２日後、タンパク質を３５Ｓ−シ
ステインで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集め
て、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡバッファー(１５０mＭ
ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ
−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))
で溶菌する(ウィルソンら、同上 ３７：７６７（１９８
４）)。細胞ライゼートおよび培養培地の両方を、ＨＡ
に特異的なモノクローナル抗体で沈降させる。沈降した
タンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析す
る。 【００７３】実施例３ バキュロウイルス発現システムを用いてのＧＰＲＣのク
ローニングおよび発現全長のＧＰＲＣタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１３０号を、遺伝子
の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを利用して増幅する。 その５'プライマーは、配列: 5' TTCACCACCTACCTGGATCCACAGAGCTGTCATGGCTGCC 3'（配
列番号：７） を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(太字)、続いて、
真核細胞における翻訳の開始に有効な信号に似ている１
１ヌクレオチド(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９８７、１９６、９
４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)を含み、またこの直ぐ後
は、ＧＰＲ遺伝子の最初の１８ヌクレオチド(翻訳開始
コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)である。 その３'プライマーは、配列: 5' CCTCATCTCAGGTACCGTTCTAAACCACAGAGTGG 3'（配列番
号：８） を有し、また制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩの切断
部位、およびＧＰＲＣ遺伝子の３'の翻訳されていない
配列に対して相補的な１０ヌクレオチドを含む。増幅さ
れた配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０
１ Ｉnc.、ＬaＪolla、Ｃa.)を使用して、１％アガロー
スゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエン
ドヌクレアーゼＢam ＨＩで消化し、次いで１％アガロ
ースゲル上で再度精製した。このフラグメントをＦ２と
名付ける。 【００７４】ベクターpＡ２(pＶＬ９４１ベクターの修
飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システム
を用いてのＧＰＲＣタンパク質の発現に使用する(レビ
ューには、サマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.およびスミス
（Ｓmith）,Ｇ.Ｅ. １９８７、Ａ manual of methods f
or baculovirus vectors and insect cell culture pro
cedures、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtati
on Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクター
は、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニカニュ
クリアポリヘドロシスウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力な
ポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレ
アーゼＢam ＨＩの認識部位を含む。シミアンウイルス
(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニ
ル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するた
め、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポ
リヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘド
リンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランス
フェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡ
の、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス
配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他
のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７３、
pＶＬ９４１、ＰＧＲ１およびpＡcＩＭ１を、pＡ２の代
わりに使用することができるであろう(ラッコー（Ｌuck
ow）,Ｖ.Ａ.およびサマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.、Ｖir
ology、１７０:３１−３９)。 【００７５】プラスミドを制限酵素ＡＳＰ７１８および
Ｂam ＨＩで消化した後、当業界で既知の方法により、
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次い
で、市販のキット（“Ｇeneclean"、ＢＩＯ １０１ Ｉn
c．、La Jolla、ＣＡ）を用いてＤＮＡを１％アガロー
スゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名付
ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ
２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせた。次い
で、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォームして、Ｇ
ＰＲＣ遺伝子を有するプラスミド(pＢacＧＰＲＣ)を含
む細菌を、酵素Ｂam ＨＩを使用して同定した。クロー
ン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によ
り確認した。リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelg
ner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４:７４
１３−７４１７(１９８７))を利用して、プラスミドpＢ
acＧＰＲＣ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「Ｂa
culoＧoldＴＭ バキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharminge
n、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフ
ェクトした。 【００７６】ＢaculoＧoldＴＭ ウイルスＤＮＡ１μgお
よびプラスミドpＢacＧＰＲＣ５μgを、無血清グレイス
(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaither
sburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレート
の無菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン
(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、
混合して、室温で１５分間インキュベートした。次い
で、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培
地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳ
f９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加した。
そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液
を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５時間イ
ンキュベートした。５時間後、そのトランスフェクショ
ン溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を
補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた。そのプレートを
インキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続け
た。４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上
記)により記載されたようにして、プラークアッセイを
行った。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechnologi
es Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用
したが、このことにより、青色に染色されたプラークを
容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセ
イ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者
のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithe
rsburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０
頁にも見い出すことができる)。 【００７７】４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加
えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペ
ットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ
管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分離に
より除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、
３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用
した。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４
℃で保存した。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ
を補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞に、感染
多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＧＰＲ
Ｃを感染させた。６時間後、その培地を除去して、メチ
オニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ培地
(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替え
た。４２時間後、５μＣiの３５Ｓ−メチオニンおよび
５μＣiの３５Ｓシステイン５μＣi(Ａmersham)を加え
た。その細胞をさらに７２時間インキュベートした後、
低張リン酸緩衝液中で細胞溶解により収穫し、細胞膜を
遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化
した。 【００７８】実施例４ 遺伝子治療における発現 皮膚生検により被験者から線維芽細胞を得る。得られる
組織を組織培養培地に置き、小片に分ける。組織小片を
組織培養フラスコの湿った表面に置く（約１０個の小片
をそれぞれ別のフラスコ内に置く）。フラスコを逆さま
にし、きつく閉じて室温にて一夜放置する。室温にて２
４時間後、フラスコを逆に戻し、組織小片をフラスコの
底に置いたまま新鮮な培養培地（たとえば、Ｈａｍ'ｓ
Ｆ１２培地に１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを加えたもの）を加える。次いで、これを３
７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新
鮮な培地を加え、続いて数日毎に培地を取り換える。さ
らなる２週間の培養後、単層の線維芽細胞が出現する。
単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに塗り付
ける。モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲにてフラン
キングされているｐＭＶ−７（カーシュマイヤー（Ｋir
schmeier），Ｐ．Ｔ．らのＤＮＡ、７：２１９〜２５
（１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩで切断
し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベク
ターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを用い
て精製する。 【００７９】それぞれ５'および３'末端配列に対応する
ＰＣＲプライマーを用いて本発明ポリペプチドのｃＤＮ
Ａを増幅する。５'プライマーはＥcoＲＩ部位を含み、
３'プライマーはＨindＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下に、等量のモロニーマウス肉腫ウイルス
の線形バックボーンおよび増幅したＥcoＲＩ断片ならび
にＨindＩＩＩ断片を一緒に加える。得られる混合物を
２つの断片のライゲーションに適当な条件下に維持す
る。ライゲーション混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形
質転換し、次いで、正しく挿入されているＧＰＲＣ遺伝
子をベクターが含んでいることを確認するためにカナマ
イシン含有寒天上に置く。１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを加えたダルベッコ
の調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、両栄養性ｐＡ３１
７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養
物中で増殖させて集密的密度にする。次いで、該遺伝子
を含むＭＳＶベクターを該培地に加え、パッケージング
細胞にベクターで形質導入する。パッケージング細胞は
ただちにＧＰＲＣ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産
生する（パッケージング細胞は今後プロデューサー細胞
と称する）。 【００８０】形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮
な培地を加え、続いて、集密的プロデューサー細胞の１
０ｃｍプレートから培地を収穫する。感染性ウイルス粒
子を含む消費された培地をミリポアフィルターで濾過し
て脱離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この
培地を用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の亜
集密的プレートから培地を除去し、プロデューサー細胞
から得た培地と素早く交換する。この培地を除去し、新
鮮な培地と交換する。もし、ウイルスの力価が高けれ
ば、すべての線維芽細胞が実質的に感染していることに
なり、選択の必要はない。もし、力価が非常に低けれ
ば、neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレ
トロウイルスベクターの使用が必要である。次いで、そ
れ単独で、あるいはサイトデックス３マイクロキャリア
ービーズ上で集密的になるまで増殖させた後に、遺伝的
に操作された線維芽細胞を宿主に注入する。線維芽細胞
はただちに該タンパク質産物を産生する。先の教示から
見て、本発明の多数の変更および変化が可能であること
から、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方
法により本発明を行うことができる。 【００８１】 【配列表】 SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: LI, ET AL. (ii) TITLE OF INVENTION: Human G Protein Coupled Receptor (HETGQ23) (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 8 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: HUMAN GENOME SCIENCES, INC. (B) STREET: 9410 KEY WEST AVE. (C) CITY: ROCKVILLE (D) STATE: MARYLAND (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 20850 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: 3.5 INCH DISKETTE (B) COMPUTER: IBM PS/2 (C) OPERATING SYSTEM: MS-DOS (D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: PCT/US95/07137 (B) FILING DATE: 05-06-1995 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: HYMEL, LIN (B) REGISTRATION NUMBER: 45,414 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: PF179JP (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 301-251-6015 (B) TELEFAX: 301-309-8439 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2456 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: GGAACCGCCC CACCGTGGTG GCGGCCGCCC AGAACTAGTG GATCCCCCGG GCTGCAGGAA 60 TTCGGCACGA GCAGACACAC TTGCTTTGGT TTACAGATCC AGTGAAGTGA AAAATCAGAA 120 CTAGAAACGT ATGCACCTTC CTAGCAGCAA AGCCGCTTCT GCGTTCTTCG CAGCCTCCAG 180 TGCAGGGCGG CGCTGGGAGA AACTTTGCGC CTTCTGGAAA GTTTAGAAAG TGAGCCACGA 240 AAGAGAGGCC ACATTTCCGG GGTTTTGCGG GCCCCGCGAT GTTTTCCAGA GCTTTTCGAG 300 TGGGAAGAGG AGAGCGACAA CGTGAAAATG CCCCGTGCCG GGGCGTCCAC CGGAGTCCTG 360 CCAGCTGTCC GGCGCTGGGG TGGACGTCTG ATTTATGAAG CTCCCCATCC ACCTATCTGA 420 GTACCTGACT TCTCAGGACT GACACCTACA GCATCAGGTA CACAGCTTCT CCTAGCATGA 480 CTTCGATCTG ATCAGCAAAC AAGAAAATTT GTCTCCCGTA GTTCTGGGGC GTGTTCACCA 540 CCTACAACCA CAGAGCTGTC ATGGCTGCCA TCTCTACTTC CATCCCTGTA ATTTCACAGC 600 CCCAGTTCAC AGCCATGAAT GAACCACAGT GCTTCTACAA CGAGTCCATT GCCTTCTTTT 660 ATAACCGAAG TGGAAAGCAT CTTGCCACAG AATGGAACAC AGTCAGCAAG CTGGTGATGG 720 GACTTGGAAT CACTGTTTGT ATCTTCATCA TGTTGGCCAA CCTATTGGTC ATGGTGGCAA 780 TCTATGTCAA CCGCCGCTTC CATTTTCCTA TTTATTACCT AATGGCTAAT CTGGCTGCTG 840 CAGACTTCTT TGCTGGGTTG GCCTACTTCT ATCTCATGTT CAACACAGGA CCCAATACTC 900 GGAGACTGAC TGTTAGCACA TGGCTCCTTC GTCAGGGCCT CATTGACACC AGCCTGACGG 960 CATCTGTGGC CAACTTACTG GCTATTGCAA TCGAGAGGCA CATTACGGTT TTCCGCATGC 1020 AGCTCCACAC ACGGATGAGC AACCGGCGGG TAGTGGTGGT CATTGTGGTC ATCTGGACTA 1080 TGGCCATCGT TATGGGTGCT ATACCCAGTG TGGGCTGGAA CTGTATCTGT GATATTGAAA 1140 ATTGTTCCAA CATGGCACCC CTCTACAGTG ACTCTTACTT AGTCTTCTGG GCCATTTTCA 1200 ACTTGGTGAC CTTTGTGGTA ATGGTGGTTC TCTATGCTCA CATCTTTGGC TATGTTCGCC 1260 AGAGGACTAT GAGAATGTCT CGGCATAGTT CTGGACCCCG GCGGAATCGG GATACCATGA 1320 TGAGTCTTCT GAAGACTGTG GTCATTGTGC TTGGGGCCTT TATCATCTGC TGGACTCCTG 1380 GATTGGTTTT GTTACTTCTA GACGTGTGCT GTCCACAGTG CGACGTGCTG GCCTATGAGA 1440 AATTCTTCCT TCTCCTTGCT GAATTCAACT CTGCCATGAA CCCCATCATT TACTCCTACC 1500 GCGACAAAGA AATGAGCGCC ACCTTTAGGC AGATCCTCTG CTGCCAGCGC AGTGAGAACC 1560 CCACCGGCCC CACAGAAGGC TCAGACCGCT CGGCTTCCTC CCTCAACCAC ACCATCTTGG 1620 CTGGAGTTCA CAGCAATGAC CACTCTGTGG TTTAGAACGG AAACTGAGAT GAGGAACCAG 1680 CCGTCCTCTC TTGTAGGATA AACAGCCTCC CCCTACCCAA TTGCCAGGGC AAGGTGGGGT 1740 GTGAGAGAGG AGAAAAGTCA ACTCATGTAC TTAAACACTA ACCAATGACA GTATTTGTTC 1800 CTGGACCCCA CAAGACTTGA TATATATTGA AAATTAGCTT ATGTGACAAC CCTCATCTTG 1860 ATCCCCATCC CTTCTGAAAG TAGGAAGTTG GAGCTCTTGC AATGGAATTC AAGAACAGAC 1920 TCTGGAGTGT CCATTTAGAC TACACTAACT AGACTTTTAA AAGATTGTGT GTGGTTTGGT 1980 GCAAGTCAGA ATAAATTCTG GCTAGTTGAA TCCACAACTT CATTTATATA CAGGCTTCCC 2040 TTTTTTATTT TTAAAGGATA CGTTTCACTT AATAAACACG TTTATGCCTA TCAGCATGTT 2100 TGTGATGGAT GAGACTATGG ACTGCTTTTA AACTACCATA ATTCCATTTT TTCCCTTACA 2160 TAGGAAAACT GTAAGTTGGA ATTATCTTTT GGTTAGAAAG CATGCATGTA ATGTATGTAT 2220 GCAGCATGCC TTACTTAAAA AGATTAAAAG GATACTAATG TTAAATCTTC TAGGAAATAG 2280 AACCTAGACT TCAAAGCCAG TATTTGTTTA GGTCATGAAG CAAACAATGC TCTAATCACA 2340 ATATTAACTG TTTAATTAAA ATGTTGTAAC AAGTATAAAA CAGGGAATGT AAGTTTATTA 2400 CCAAAGTGAT ATGTATTCCA AAAAAGGTCA TAGAAGATGA AGCAACTATA ATATTG 2456 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 364 AMINO ACIDS (B) TYPE: AMINO ACID (C) STRANDEDNESS: (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: PROTEIN (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Met Ala Ala Ile Ser Thr Ser Ile Pro Val Ile Ser Gln Pro Gln 5 10 15 Phe Thr Ala Met Asn Glu Pro Gln Cys Phe Tyr Asn Glu Ser Ile 20 25 30 Ala Phe Phe Tyr Asn Arg Ser Gly Lys His Leu Ala Thr Glu Trp 35 40 45 Asn Thr Val Ser Lys Leu Val Met Gly Leu Gly Ile Thr Val Cys 50 55 60 Ile Phe Ile Met Leu Ala Asn Leu Leu Val Met Val Ala Ile Tyr 65 70 75 Val Asn Arg Arg Phe His Phe Pro Ile Tyr Tyr Leu Met Ala Asn 80 85 90 Leu Ala Ala Ala Asp Phe Phe Ala Gly Leu Ala Tyr Phe Tyr Leu 95 100 105 Met Phe Asn Thr Gly Pro Asn Thr Arg Arg Leu Thr Val Ser Thr 110 115 120 Trp Leu Leu Arg Gln Gly Leu Ile Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser 125 130 135 Val Ala Asn Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg His Ile Thr Val 140 145 150 Phe Arg Met Gln Leu His Thr Arg Met Ser Asn Arg Arg Val Val 155 160 165 Val Val Ile Val Val Ile Trp Thr Met Ala Ile Val Met Gly Ala 170 175 180 Ile Pro Ser Val Gly Trp Asn Cys Ile Cys Asp Ile Glu Asn Cys 185 190 195 Ser Asn Met Ala Pro Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Leu Val Phe Trp 200 205 210 Ala Ile Phe Asn Leu Val Thr Phe Val Val Met Val Val Leu Tyr 215 220 225 Ala His Ile Phe Gly Tyr Val Arg Gln Arg Thr Met Arg Met Ser 230 235 240 Arg His Ser Ser Gly Pro Arg Arg Asn Arg Asp Thr Met Met Ser 245 250 255 Leu Leu Lys Thr Val Val Ile Val Leu Gly Ala Phe Ile Ile Cys 260 265 270 Trp Thr Pro Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Asp Val Cys Cys Pro 275 280 285 Gln Cys Asp Val Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ala 290 295 300 Glu Phe Asn Ser Ala Met Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Arg Asp 305 310 315 Lys Glu Met Ser Ala Thr Phe Arg Gln Ile Leu Cys Cys Gln Arg 320 325 330 Ser Glu Asn Pro Thr Gly Pro Thr Glu Gly Ser Asp Arg Ser Ala 335 340 345 Ser Ser Leu Asn His Thr Ile Leu Ala Gly Val His Ser Asn Asp 350 355 360 His Ser Val Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: CACAGGATCC CGTGGCTGCC ATCTCTACTT C 31 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: TCTCAGGTAC CGTTCTCTAA ACCACAGAGT GGTCA 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: CAACCACAGG GATCCCATGG CTGCCATCTC TACTTCCATC CCTGTA 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CCCCTCGAGC TAAACCACAG AGTGGTCATT GCTGTGAACT CCAGCC 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 40 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: TTCACCACCT ACCTGGATCC ACAGAGCTGT CATGGCTGCC 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 BASE PAIRS (B) TYPE: NUCLEIC ACID (C) STRANDEDNESS: SINGLE (D) TOPOLOGY: LINEAR (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: CCTCATCTCA GGTACCGTTC TAAACCACAG AGTGG 35 【００８２】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図２】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図３】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図４】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図５】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図６】 本発明のポリペプチド(上段)とヒト内皮分化
タンパク質（ｅｄｇ−１）遺伝子のｍＲＮＡ(下段)との
間のアミノ酸ホモロジーである。 【図７】 本発明のポリペプチド(上段)とヒト内皮分化
タンパク質（ｅｄｇ−１）遺伝子のｍＲＮＡ(下段)との
間のアミノ酸ホモロジーである。 【図８】 Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特
徴である。最初の７段は、αヘリックス、βシート、タ
ーン領域またはコイル領域といったようなアミノ酸配列
の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応す
るエリアである。図中、２番目のセットは、細胞内、細
胞質に接触しているかまたは膜を貫通しているエリアの
アミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートで
は、膜の脂質２層内に存在し、したがって疎水性である
タンパク質配列のエリア、ならびに親水性であり、脂質
２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エ
リアとは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエ
リアであるために、抗原インデックスは、親水性プロッ
トに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデッ
クスおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロッ
トは、極性および非極性である１３配列の領域を示す。
フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域であ
り、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意
味において、２番目のセットに対応する。 【図９】 Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特
徴である。最初の７段は、αヘリックス、βシート、タ
ーン領域またはコイル領域といったようなアミノ酸配列
の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応す
るエリアである。図中、２番目のセットは、細胞内、細
胞質に接触しているかまたは膜を貫通しているエリアの
アミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートで
は、膜の脂質２層内に存在し、したがって疎水性である
タンパク質配列のエリア、ならびに親水性であり、脂質
２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エ
リアとは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエ
リアであるために、抗原インデックスは、親水性プロッ
トに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデッ
クスおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロッ
トは、極性および非極性である１３配列の領域を示す。
フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域であ
り、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意
味において、２番目のセットに対応する。
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図２】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図３】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図４】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図５】 本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定
は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂi
osystems,Ｉnc.)を使用して行った。 【図６】 本発明のポリペプチド(上段)とヒト内皮分化
タンパク質（ｅｄｇ−１）遺伝子のｍＲＮＡ(下段)との
間のアミノ酸ホモロジーである。 【図７】 本発明のポリペプチド(上段)とヒト内皮分化
タンパク質（ｅｄｇ−１）遺伝子のｍＲＮＡ(下段)との
間のアミノ酸ホモロジーである。 【図８】 Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特
徴である。最初の７段は、αヘリックス、βシート、タ
ーン領域またはコイル領域といったようなアミノ酸配列
の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応す
るエリアである。図中、２番目のセットは、細胞内、細
胞質に接触しているかまたは膜を貫通しているエリアの
アミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートで
は、膜の脂質２層内に存在し、したがって疎水性である
タンパク質配列のエリア、ならびに親水性であり、脂質
２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エ
リアとは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエ
リアであるために、抗原インデックスは、親水性プロッ
トに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデッ
クスおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロッ
トは、極性および非極性である１３配列の領域を示す。
フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域であ
り、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意
味において、２番目のセットに対応する。 【図９】 Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特
徴である。最初の７段は、αヘリックス、βシート、タ
ーン領域またはコイル領域といったようなアミノ酸配列
の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応す
るエリアである。図中、２番目のセットは、細胞内、細
胞質に接触しているかまたは膜を貫通しているエリアの
アミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートで
は、膜の脂質２層内に存在し、したがって疎水性である
タンパク質配列のエリア、ならびに親水性であり、脂質
２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エ
リアとは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエ
リアであるために、抗原インデックスは、親水性プロッ
トに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデッ
クスおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロッ
トは、極性および非極性である１３配列の領域を示す。
フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域であ
り、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意
味において、２番目のセットに対応する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８６
45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 ４Ｃ０８７
48/00 3/04 ４Ｈ０４５
Ａ６１Ｐ 1/04 9/00
3/04 9/04
9/00 9/10
9/04 9/12
9/10 11/06
9/12 13/02
11/06 13/08
13/02 19/10
13/08 25/14
19/10 25/18
25/14 25/20
25/18 25/24
25/20 25/28
25/24 37/08
25/28 43/00 １１１
37/08 Ｃ０７Ｋ 14/705
43/00 １１１ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ
33/50 33/566
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ダニエル・アール・ソペット
アメリカ合衆国22020バージニア州センタ
ービル、スティルフィールド・プレイス
15050番
(72)発明者 リ・イ
アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ
ザーズバーグ、ハワード・ランディング・
ドライブ16125番
(72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン
アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ
トンズビル、ローリング・ヒル・ロード
22400番
(72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン
アメリカ合衆国20832メリーランド州オル
ネー、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ
18528番
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36
4B024 AA01 BA63 CA04 CA11 DA02
DA06 EA02 EA04 GA11 GA18
GA19 HA03 HA17
4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24
CE02 CE12 DA01
4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 AA13
AA16 BA01 BA02 BA22 DC50
MA52 MA55 MA56 MA59 MA66
NA14 ZA022 ZA052 ZA122
ZA152 ZA162 ZA182 ZA362
ZA422 ZA432 ZA592 ZA662
ZA682 ZA812 ZA972 ZB132
ZC422
4C085 AA13 AA14 AA15 CC22 CC23
GG01
4C086 AA01 AA03 EA15 MA01 MA04
MA05 MA52 MA55 MA56 MA59
MA66 NA14 ZA02 ZA05 ZA12
ZA15 ZA16 ZA18 ZA36 ZA42
ZA43 ZA59 ZA66 ZA68 ZA81
ZA97 ZB13 ZC42
4C087 AA01 BC83 MA52 MA55 MA56
MA59 MA66 NA14 ZA02 ZA05
ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA36
ZA42 ZA43 ZA59 ZA66 ZA68
ZA81 ZA97 ZB13 ZC42
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40
DA50 EA20 FA74 GA26
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 本明細書に記載されたいずれかの発明。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002162830A JP2003061690A (ja) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002162830A JP2003061690A (ja) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３） |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09500363 Division |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003061690A true JP2003061690A (ja) | 2003-03-04 |
Family
ID=19194996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002162830A Pending JP2003061690A (ja) | 2002-06-04 | 2002-06-04 | ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３） |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003061690A (ja) |
-
2002
- 2002-06-04 JP JP2002162830A patent/JP2003061690A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1007670B1 (en) | Two human g-protein coupled receptors: ebv-induced gpcr 2 (ebi-2) and edg-1-like gpcr | |
| US5776729A (en) | Human G-protein receptor HGBER32 | |
| JPH11503012A (ja) | ヒトｇタンパク質結合レセプター | |
| US5817477A (en) | Adrenergic receptor | |
| US20050214281A1 (en) | G-protein coupled receptor | |
| US5756309A (en) | Nucleic acid encoding a human G-protein receptor HPRAJ70 and method of producing the receptor | |
| US20050266527A1 (en) | Human G-protein receptor HIBEF51 | |
| US6372891B1 (en) | Human G-protein receptor HPRAJ70 | |
| US5869632A (en) | Human G-protein receptor HCEGH45 | |
| EP0832126A1 (en) | G-protein receptor htnad29 | |
| US20110112177A1 (en) | Human G-Protein Coupled Receptor (HETGQ23) | |
| JPH11506921A (ja) | ヒトｇ−タンパク質受容体ｈｃｅｇｈ４５ | |
| US20050059114A1 (en) | G-protein receptor HTNAD29 | |
| US20080312178A1 (en) | Human G-Protein Receptor HGBER32 | |
| CA2220978A1 (en) | Human g-protein coupled receptor (hetgq23) | |
| JP2003061690A (ja) | ヒトｇ−タンパク質結合性受容体（ｈｅｔｇｑ２３） | |
| WO1998024900A1 (en) | Human g-protein receptor hcegh45, a pacap-like (g-protein pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-like) receptor | |
| AU760468B2 (en) | G-protein receptor HTNAD29 | |
| AU716023B2 (en) | Human G-protein coupled receptor (HETGQ23) | |
| AU763827B2 (en) | Human G-protein coupled receptor (HETGQ23) | |
| JP2003018998A (ja) | ヒトｇ−タンパク質受容体ｈｐｒａｊ７０ | |
| JP2002355082A (ja) | ヒトｇタンパク質結合レセプター | |
| AU2003235001A1 (en) | G-Protein Receptor HTNAD29 | |
| JPH11507503A (ja) | ヒトｇ−タンパク質受容体ｈｐｒａｊ７０ | |
| JP2003009865A (ja) | Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050920 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060613 |