JP2003009865A - Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９ - Google Patents
Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｇタンパク質レセプターＨＴＮＡＤ２９を提
供する。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に示すポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番第 号において含まれるＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）の該ポリヌ
クレオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオ
チド；および （ｄ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドのポリ
ヌクレオチドフラグメント、からなる群から選択される
メンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。
供する。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に示すポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番第 号において含まれるＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）の該ポリヌ
クレオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオ
チド；および （ｄ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドのポリ
ヌクレオチドフラグメント、からなる群から選択される
メンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７−膜貫通
型レセプターである。この膜貫通レセプターは、時々本
明細書以下で「Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター」といわ
れる血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定さ
れている。本発明はまた、このようなポリペプチドの作
用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】多数の医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャ
ー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与
するタンパク質により媒介されることは、十分に確立さ
れている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５
１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、
これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関
与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これ
らのタンパク質のいくつかの例としては、ＧＰＣレセプ
ター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミ
ンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．
Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋ
ｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：
６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８
８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパ
ク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラー
ゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュ
エータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテイン
キナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５２：８０２−８（１９９１））が挙げられる。 【０００３】例えば、シグナル伝達の１つの形態では、
ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸
シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性
化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴ
Ｐはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結
させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活
性化されると、ＧＴＰを結合型ＧＤＰに変換することが
示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化され
たアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへ
の加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、
Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇ
タンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクター
に中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を
制御する時計としての２つの役割を果たす。 【０００４】Ｇタンパク質共役型レセプターの膜タンパ
ク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫
通ドメインを有するものとして特徴づけられている。こ
れらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結
合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタ
ンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイルス、増
殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的
に活性なレセプターを含む。 【０００５】Ｇタンパク質共役型レセプターは、少なく
とも８つの分岐した親水性ループを結合する、約２０〜
３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲
を含むものとして特徴づけられている。共役型レセプタ
ーのＧタンパク質ファミリーの例として、ドーパミンレ
セプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学
的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結
合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、
カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、
セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺
激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１レセプタ
ー、およびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイル
スレセプターなどが挙げられる。 【０００６】大部分のＧタンパク質共役型レセプター
は、機能的なタンパク質構造を安定化させると考えられ
るジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ルー
プの各々に単一の保存されたシステイン残基を有する。
７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、
ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と命名されている。ＴＭ
３は、シグナル伝達に関連付けられている。 【０００７】システイン残基のリン酸化および脂質化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
Ｇタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達に影響を
与え得る。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、
第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に
潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧタンパ
ク質共役型レセプター（例えば、β−アドレノレセプタ
ー）について、プロテインキナーゼＡおよび／または特
異的なレセプターキナーゼによるリン酸化は、レセプタ
ー脱感作を媒介する。 【０００８】Ｇタンパク質共役型レセプターのリガンド
結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプター
膜貫通ドメインにより形成される親水性受口（ｓｏｃｋ
ｅｔ）を含有すると考えられ、この受口はＧタンパク質
共役型レセプターの疎水性残基により囲まれている。各
Ｇタンパク質共役型レセプター膜貫通ヘリックスの親水
性側は内側に向いており、そして極性リガンド結合部位
を形成すると仮定されている。ＴＭ３は、リガンド結合
部位（例えば、ＴＭ３のアスパラギン酸残基を含む）を
有するとして、いくつかのＧタンパク質共役型レセプタ
ーにおいて関連付けられている。さらに、ＴＭ５のセリ
ン、ＴＭ６のアスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７
のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド結
合に関連する。 【０００９】Ｇタンパク質共役型レセプターは、ヘテロ
三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオ
ンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し
得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１
０：３１７−３３１（１９８９）を参照のこと）。異な
るＧタンパク質のαサブユニットは、細胞内で種々の生
物学的機能を調節するための特定のエフェクターを優先
的に刺激する。Ｇタンパク質共役型レセプターの細胞質
残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役型レセ
プターのＧタンパク質結合の調節のための重要な機構と
して同定されている。Ｇタンパク質共役型レセプター
は、哺乳動物宿主内の多数の部位において見出されてい
る。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの局面に
よれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに
それらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用
なフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。
本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。 【００１１】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が
提供され、この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアンチセンスアナ
ログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に
有用なそれらのフラグメントを含む。 【００１２】本発明のさらなる局面によれば、前記ポリ
ペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収
を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチド
をコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞お
よび／または組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を
包含する組換え技術によって、このようなレセプターポ
リペプチドを産生するためのプロセスが提供される。 【００１３】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供され
る。 【００１４】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する
か、またはその活性化を阻害する化合物をスクリーニン
グする方法が提供される。 【００１５】本発明のなお別の実施態様によれば、血小
板凝集による血友病の防止および／または処置におい
て、ならびに創傷治癒を促進することにおいて有用であ
る本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてそ
れを活性化する化合物を宿主に投与するプロセスが提供
される。 【００１６】本発明のなお別の実施態様によれば、アレ
ルギー、炎症、血管形成後の再狭窄、不安定狭心症、心
筋梗塞、および血栓卒中（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔ
ｒｏｋｅ）または血栓塞栓卒中（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂ
ｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）の防止および／または処
置において有用である、本発明のレセプターポリペプチ
ドに結合し、そしてその活性化を阻害する化合物を宿主
に投与するプロセスが提供される。 【００１７】本発明のなお別の局面によれば、本発明の
ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするの
に十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供され
る。 【００１８】本発明のなお別の局面によれば、このよう
なポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関
連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペ
プチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための
診断的アッセイが提供される。 【００１９】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関する
インビトロの目的のために利用するためのプロセスが提
供される。 【００２０】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。 【００２１】 【課題を解決するための手段】本発明の単離されたポリ
ヌクレオチドは、以下： （ａ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に記載のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第 号において含まれるＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌクレ
オチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
ド；および、 （ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌ
クレオチドフラグメント、からなる群から選択されるメ
ンバーを含む。 【００２２】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドはＤＮＡである。 【００２３】別の実施形態において、上記ポリヌクレオ
チドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に記載のヌクレオチ
ド５２３〜ヌクレオチド１５３３を含む。 【００２４】さらに別の実施形態において、上記ポリヌ
クレオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）のポリペプチ
ドの可溶性形態をコードする。 【００２５】さらに本発明は、上記ＤＮＡを含むベクタ
ーおよびこのベクターで形質転換されたか、またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞に関する。 【００２６】本発明は、上記宿主細胞からのＤＮＡによ
りコードされるポリペプチドを発現する工程を包含す
る、ポリペプチドを産生するためのプロセスに関する。 【００２７】本発明は、ポリペプチドを発現し得る細胞
を産生するプロセスに関する。このプロセスは、上記ベ
クターで細胞を形質転換するか、またはトランスフェク
トする工程を包含する。 【００２８】本発明のレセプターポリペプチドは、以
下：（ｉ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、
アナログ、および誘導体；および、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受
託番号第 号のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにこのポリペプチドのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体、からなる群から選択されるメンバー
を含む。 【００２９】さらに本発明は、上記ポリペプチドに対す
る抗体、このポリペプチドを活性化する化合物、および
このポリペプチドの活性化を阻害する化合物に関する。 【００３０】本発明は、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター
を活性化する必要性を有する患者を処置するための方法
に関する。この方法は、化合物の治療有効量を該患者に
投与する工程を包含する。１つの実施形態において、こ
の化合物はポリペプチドであり、患者にこのポリペプチ
ド（例えば、アゴニスト）をコードするＤＮＡを提供
し、そしてインビボでこのポリペプチドを発現すること
によって、治療有効量のポリペプチドが投与される。 【００３１】また本発明は、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターを阻害する必要性を有する患者を処置するための方
法に関し、この方法は、化合物の治療有効量を該患者に
投与する工程を包含する。 【００３２】本発明は、ポリペプチドの過小発現に関連
する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプ
ロセスに関し、このプロセスはポリペプチドをコードす
る核酸配列における変異を決定する工程を包含する。 【００３３】本発明はさらに、上記レセプターのリガン
ドに結合し得る上記ポリペプチドの可溶性フラグメント
に関する。 【００３４】本発明は、宿主由来のサンプル中の上記ポ
リペプチドの存在を分析する工程を包含する診断プロセ
スに関する。 【００３５】本発明は、上記レセプターポリペプチドに
結合してこのポリペプチドを活性化または阻害する化合
物を同定するための方法に関する。この方法は、以下：
細胞表面上でこのレセプターポリペプチドを発現する細
胞と化合物とを、このレセプターポリペプチドへの化合
物の結合を許容するのに十分な条件下で接触させる工程
（このレセプターは、レセプターポリペプチドへの化合
物の結合に応答して、検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される）；および、この化合物が、上
記第２の成分により生成されるシグナルの存在または非
存在を検出することにより、有効なアゴニストまたはア
ンタゴニストであるか否かを同定する工程、を包含す
る。 【００３６】本発明は上記ポリペプチドの過小発現に関
連する疾患または疾患に対する感受性を診断するための
プロセスに関し、このプロセスは、ポリペプチドをコー
ドする核酸配列における変異を決定する工程を包含す
る。 【００３７】 【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、図
１（Ａ、Ｂ、およびＣ）の推定のアミノ酸配列（配列番
号２）を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年６
月１日にＡＴＣＣ受託番号第 号として寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供
される。 【００３８】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、白血球、肺、および腎臓において見出さ
れ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト甲状腺由来
のｃＤＮＡライブラリーで発見された。これは構造的に
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターファミリーに関連する。
これは、３３７アミノ酸残基のタンパク質をコードする
オープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、ヒトＰＡＦレセプターに最も高い程度の相同性を示
し、３３４アミノ酸の領域にわたって２９．３７５％の
同一性および５３．４３８％の類似性を有する。 【００３９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号１）に示すコード
配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり
得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複
または縮重の結果として、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）
（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ
成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり
得る。 【００４０】図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号２）
の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列
のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコ
ード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要
に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列
（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコー
ド配列の５’および／または３’非コード配列）。 【００４１】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。 【００４２】本発明はさらに、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および
誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチド
の改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリ
ヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体または
ポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得
る。 【００４３】従って、本発明は、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチ
ド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードさ
れる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含
む。この改変体は、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオ
チド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加ま
たは挿入改変体を含む。 【００４４】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号１）
に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列
の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を
有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体
は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を
有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これ
はコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させ
ない。 【００４５】ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポ
リペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断された
ポリペプチドの細胞外部分であるＰＡＦレセプターポリ
ペプチドの可溶性形態をコードし得る。 【００４６】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００４７】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用
語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーシ
ョンが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは
少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じる
ことを意味する。好ましい実施態様において、本明細書
中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号
１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能また
は活性のいずれかを保持する（すなわち、ポリペプチド
は、例えば、セカンドメッセンジャー応答を誘発するこ
とにより膜結合性ＰＡＦレセプターとして機能しなくて
も、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保持
することにより可溶性ＰＡＦレセプターとして機能す
る）。 【００４８】あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明の
ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中上記
したように、それに対して同一性を有し、そして活性を
保持してもよく、または保持しなくてもよい、少なくと
も２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、そしてよ
り好ましくは少なくとも５０塩基を有し得る。例えば、
そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオ
チドの回収用の配列番号１のポリヌクレオチドに対する
プローブ、またはその改変体のプローブ、あるいは診断
プローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いられ得
る。 【００４９】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、および
より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチドならびにそのフラグメント（このフラグメ
ントは、少なくとも３０塩基、および好ましくは少なく
とも５０塩基を有する）ならびにこのようなポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドに関する。 【００５０】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または
販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてその
ような実施許諾はこれによって与えられるわけではな
い。 【００５１】本発明はさらに、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、
または寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配
列を有するＰＡＦレセプターポリペプチド、ならびにそ
のようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび
誘導体に関する。 【００５２】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、
ＰＡＦレセプターとしての機能）を保持するか、あるい
は、ポリペプチドがＧタンパク質ＰＡＦレセプター（例
えば、このレセプターの可溶性形態）として機能しなく
ても、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保
持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。 【００５３】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００５４】図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号２）
のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナロ
グまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、
（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基また
は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）
で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基
は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基であ
ってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するも
の、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）のような別の化合物と融合されているも
の、あるいは（ｉｖ）その中にさらなるアミノ酸が、成
熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のため
に使用される成熟ポリペプチドに融合されているもの、
あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメントが可溶性で
あり（すなわち膜結合性ではない）、さらにリガンドを
膜結合性レセプターに結合させるものであり得る。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００５５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。 【００５６】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そして一般に少なくとも３０
アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸
を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。 【００５７】当該分野において公知なように、２つのポ
リペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列と比較することにより決定される。 【００５８】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。 【００５９】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；こ
れは、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイ
ラー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソ
ン）の間の介在配列（イントロン）を含む。 【００６０】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の一部ではないため、なお単離され得る。 【００６１】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは９０％の類似性（より好ましくは少なく
とも９０％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対
して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも９５％
の類似性（なおより好ましくは少なくとも９５％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有するポリペ
プチドを含み、そしてまた一般に少なくとも３０アミノ
酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む
このようなポリペプチドの部分を有するこのようなポリ
ペプチドの部分を含む。 【００６２】当該分野において公知なように、２つのポ
リペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列と比較することにより決定される。 【００６３】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体と
して使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグ
メントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために使用され得る。 【００６４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００６５】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。 【００６６】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。 【００６７】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００６８】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
の合成を指示する適切な発現制制配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰＬ プロモーター、および原核生物
細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で
遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモ
ーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソ
ーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベ
クターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有
し得る。 【００６９】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。 【００７０】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００７１】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
ＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細
胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると考えられる。 【００７２】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベク
ターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、使用され得る。 【００７３】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを含む。真核
生物プロモーターは、ＣＭＶ即時初期型、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン
Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に当業者のレベル内である。 【００７４】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００７５】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。 【００７６】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。 【００７７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜３
００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転
写を増大させる。例として、複製起点の１００〜２７０
ｂｐの後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。 【００７８】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 【００７９】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。 【００８０】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。 【００８１】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。 【００８２】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００８３】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。 【００８４】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１
７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣ
ＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならび に任意の必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプ
ライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フ
ランキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプラ
イス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化
部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するため
に使用され得る。 【００８５】本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポ
リペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物
から回収され、そして精製され得る：硫安沈殿またはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必
要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄ
ｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするた
めに使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得
る。 【００８６】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 【００８７】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験試薬および試験物質として使用され得る。 【００８８】本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプター
は、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する化合
物（アゴニスト）、または本発明のレセプターポリペプ
チドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）をス
クリーニングするためのプロセスにおいて使用され得
る。 【００８９】一般的に、このようなスクリーニング手順
は、その表面で本発明のレセプターポリペプチドを発現
する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞
としては、哺乳動物、酵母、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ま
たはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。特に、本発
明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞
をトランスフェクトし、それにより、Ｇタンパク質ＰＡ
Ｆレセプターを発現させるのに用いられる。次いで、発
現されたレセプターを、試験化合物と接触させて、結
合、機能的反応の刺激または阻害を観察する。 【００９０】１つのこのようなスクリーニング手順は、
本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターを発現するため
にトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含
む。このようなスクリーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ９
２／０１８１０（１９９２年２月６日公開）に記載され
ている。 【００９１】従って、例えば、このようなアッセイは、
レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化
合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細
胞とを接触させることにより、本発明のレセプターポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングす
るために使用され得る。リガンドにより生じるシグナル
の阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴ
ニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻
害することを示す。 【００９２】このスクリーニングは、このような細胞と
スクリーニングされるべき化合物とを接触させ、そして
そのような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、こ
のような化合物がレセプターを活性化するかを決定する
ことによりレセプターを活性化する化合物を決定するた
めに用いられ得る。 【００９３】他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９
年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化に
より引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系にお
いて、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを発現する細胞
（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を含
む。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチ
ドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセ
ンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）
は、潜在的な化合物がレセプターを活性化するか、また
は阻害するかを決定するために測定され得る。 【００９４】別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇ
タンパク質ＰＡＦレセプターをコードするＲＮＡをＸｅ
ｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発
現させることを含む。次いでそのレセプター卵母細胞
は、レセプターの活性化を阻害すると考えられている化
合物をスクリーニングする場合にはレセプターリガンド
およびスクリーニングされる化合物と接触され得、続い
て、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行
われる。 【００９５】別のスクリーニング技術は、そのレセプタ
ーがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパ
ク質ＰＡＦレセプターの発現を包含する。このような細
胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細
胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中
上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパー
ゼの２次シグナルに由来するレセプターの活性化の阻害
の検出により達成され得る。 【００９６】別の方法は、細胞表面にレセプターを有す
る細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することに
よる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害
する化合物、アンタゴニストのスクリーニングを包含す
る。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを
発現するようにＧタンパク質ＰＡＦレセプターをコード
するＤＮＡで真核細胞をトランスフェクトする工程、お
よび標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物
とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、
放射能により標識され得る。標識リガンドがレセプター
に結合する量は、例えば、レセプターの放射能の測定に
より測定される。レセプターに結合する標識リガンドの
減少により決定されるようにこの化合物がレセプターに
結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻
害される。 【００９７】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターは、哺乳動
物宿主において遍在性であり、そして多くの病的な状態
を含む、多くの生物学的機能を担う。従って、一方でＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターを刺激し、そして他方でＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターをの機能を阻害し得る化合
物および薬物を見出すことが望ましい。 【００９８】例えば、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを
活性化する化合物は、治療目的（例えば、喘息、パーキ
ンソン病、急性心不全、低血圧、尿停留（ｕｒｉｎａｒ
ｙｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および骨粗鬆症の処置）に用
いられ得る。 【００９９】一般に、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターの
活性化を阻害する化合物は、種々の治療目的（例えば、
高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、
良性前立腺肥大、ならびに精神病および神経性疾患（精
神分裂病、躁病性興奮、うつ病、譫妄、痴呆、またはハ
ンチントン舞踏病またはＧｉｌｌｅｓ ｄｉｌａ Ｔｏ
ｕｒｅｔｔ症候群のような重篤な精神遅滞、ジスキネジ
ーなどを含む）の処置）に用いられ得る。Ｇタンパク質
ＰＡＦレセプターを阻害する化合物はまた、内因性食欲
不振を逆転することおよび過食症の制御において有用で
ある。 【０１００】抗体は本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプ
ター、またはいくつかの場合には、オリゴヌクレオチド
をアンタゴナイズし得る。これらは、Ｇタンパク質ＰＡ
Ｆレセプターに結合するが、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応
答を惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に
会合する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体
を包含する。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、Ｇ
タンパク質ＰＡＦレセプターのリガンドに密接に関連す
るタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含
み、これは生物学的機能を欠失しており、そしてＧタン
パク質ＰＡＦレセプターに結合するときに応答を惹起し
ない。 【０１０１】アンチセンス技術の使用によって調製され
たアンチセンス構築物は、アンチセンス技術は、三重ら
せん形成もしくはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介
して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これら
の方法の両方は、ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮ
Ａに結合することに基づいている。例えば、本発明の成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の
５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用い
られる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する
遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせ
ん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：
３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を
参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質Ｐ
ＡＦレセプターの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイ
ズし、そしてｍＲＮＡ分子のＧタンパク質ＰＡＦレセプ
ターへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎ
ｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９
１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それ
によって、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタン
パク質ＰＡＦレセプターの産生を阻害するためにインビ
ボで発現され得る。 【０１０２】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに結合する
小分子は、リガンドのレセプターへの接近を不可能に
し、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる。例え
ば、小ペプチドまたはペプチド様分子はまた、本発明の
レセプターポリペプチドの活性化を阻害するために使用
され得る。 【０１０３】可溶性形態のＧタンパク質ＰＡＦレセプタ
ー（例えば、このレセプターのフラグメント）は、本発
明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そしてこ
のリガンドが、膜結合性Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター
と相互作用するのを妨げることによりレセプターの活性
化を阻害するために使用され得る。 【０１０４】本発明はまた、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターに結合し得ることが知られていないリガンドが、こ
のようなレセプターに結合し得るか否かを決定するため
の方法を提供する。この方法は、リガンドのＧタンパク
質ＰＡＦレセプターに対する結合を許容する条件下で、
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを発現する哺乳動物細胞
とリガンドとを接触させる工程、レセプターに結合する
リガンドの存在を検出する工程、これによりリガンドが
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに結合するか否かを決定
する工程を包含する。アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを決定するための上記の系はまた、レセプター
に結合するリガンドを決定するために使用され得る。 【０１０５】本発明はまた、レセプターをコードするｍ
ＲＮＡの存在を検出することにより、細胞表面上に本発
明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドの発現
を検出する方法を提供する。この方法は、細胞から全Ｒ
ＮＡを得る工程、ハイブリダイズ条件下で、そのように
得られたｍＲＮＡと、レセプターをコードする核酸分子
の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得
る少なくとも１０ヌクレオチドの核酸分子を含む核酸プ
ローブとを接触させる工程、プローブにハイブリダイズ
したｍＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれにより
細胞によるレセプターの発現を検出する工程を包含す
る。 【０１０６】本発明はまた、本発明のレセプターポリペ
プチドに関連するレセプターを同定する方法を提供す
る。これらの関連するレセプターは、低ストリンジェン
シークロスハイブリダイゼーションにより、本発明のＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドに対する相同
性により、あるいは関連する天然のリガンドまたは合成
のリガンドと相互作用するレセプターおよび／または本
発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドの遺
伝子的または薬理学的遮断後に類似の挙動を誘発するレ
セプターを同定することにより同定され得る。 【０１０７】上記のスクリーニング法により同定される
アゴニストは、血小板凝集を誘導することによる血友病
を処置し、そして創傷治癒を刺激するために使用され得
る。 【０１０８】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに対するア
ンタゴニスト化合物は、血管形成後の再狭窄、不安定狭
心症、血栓卒中または血栓塞栓卒中、アレルギー、炎症
および心筋梗塞を予防および／または処置するために使
用され得る。 【０１０９】アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、本明細書上記に記載のもの）を有する
組成物において使用され得る。 【０１１０】アンタゴニストまたはアゴニストは、適切
な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このよ
うな組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬
学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このよ
うなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩
水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、
およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限
定されない。処方は、投与の様式に合わせるべきであ
る。 【０１１１】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチ
ドは、他の治療化合物と併用して用いられ得る。 【０１１２】薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によ
る便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
症状の処置および／または予防に有効な量で投与され
る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１
日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から
約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮
される。 【０１１３】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチ
ド、およびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらは
ポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビ
ボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得
る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。 【０１１４】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。 【０１１５】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ
チドの発現のために患者に投与され得る。このような方
法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には
明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発
現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、ア
デノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒク
ルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために
使用され得る。 【０１１６】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。 【０１１７】ベクターは、１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない）のような細
胞プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されな
い。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、
アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモ
ーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切な
プロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から
当業者に明らかである。 【０１１８】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。 【０１１９】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１ ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、またはＰＡＦを脂質に結合し
得、次いで宿主に投与され得る。 【０１２０】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細
胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細
胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限
定されない。 【０１２１】本発明はまた、診断としての本発明の遺伝
子の使用を意図する。例えば、いくつかの疾患は、遺伝
性欠損遺伝子から生じる。これらの遺伝子は、正常な遺
伝子の配列と欠損遺伝子の配列とを比較することにより
検出され得る。その後に、「変異体」遺伝子は、異常な
レセプター活性に関連することが確認され得る。さら
に、変異体レセプター遺伝子は、変異を確認するか、ま
たは同定するためのなお別の手段としての機能的アッセ
イ系（例えば、比色定量アッセイ、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ
プレート上での発現、ＨＥＫ２９３細胞のレセプター欠
損株における相補性実験）における発現に適切なベクタ
ーに挿入され得る。一旦「変異体」遺伝子が同定される
と、「変異体」レセプター遺伝子のキャリアのための集
団がスクリーニングされ得る。 【０１２２】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診
断のために用いられる核酸は、患者の細胞（例えば、血
液、尿、唾液、組織生検物質、および剖検物質由来のも
のを含むが、これらに限定されない）より得られ得る。
ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得るか、ま
たは分析前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅さ
れ得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３
−１６６（１９８６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡはま
た、同じ目的のために使用され得る。例として、本発明
の核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、本発明の遺伝子
における変異を同定および解析するために使用され得
る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比
較における増幅された産物のサイズの変化により検出さ
れ得る。点変異は、放射性標識された本発明のＲＮＡま
たは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセン
スＤＮＡ配列に、増幅されたＤＮＡをハイブリダイズさ
せることにより同定され得る。完全に対合した配列は、
ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差により、誤対合し
た二本鎖と区別され得る。このような診断は、出生前の
試験または新生児の試験のためにも特に有用である。 【０１２３】対照遺伝子と「変異体」遺伝子との間の配
列差異は、直接ＤＮＡ配列決定法により明らかにされ得
る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは、
特異的なＤＮＡセグメントを検出するためのプローブと
して使用され得る。この方法の感度は、ＰＣＲと組み合
わせた場合、非常に増強される。例えば、プライマー配
列は、二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲより作製され
た一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射
標識ヌクレオチドを用いた従来の手順によるか、または
蛍光タグを用いた自動配列決定手順により行われる。 【０１２４】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。特異的な位置での配列変化はまた、核
保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）ま
たは化学切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，
ＵＳＡ，８５：４３９７−４４０１ １９８５）により
明らかにされ得る。 【０１２５】さらに、いくつかの疾患は、ｍＲＮＡにお
ける変化により検出され得る遺伝子発現の変化の結果で
あり、すなわち遺伝子発現の変化によって特徴づけられ
る。あるいは、本発明の遺伝子は、この型のレセプター
に関連する機能の減少を示す個体を同定するための参照
として使用され得る。 【０１２６】本発明はまた、種々の組織における本発明
のＰＡＦレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化し
たレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主
に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチド
のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業
者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結
合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましく
はＥＬＩＳＡアッセイを含む。 【０１２７】ＥＬＩＳＡアッセイは、ＰＡＦレセプター
ポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体を調製する工程を最初に含む。さらに、こ
のモノクローナル抗体に対するレセプター抗体が調製さ
れる。放射能、蛍光、またはこの実施例において西洋ワ
サビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬がレ
セプター抗体に付着される。ここでサンプルは、宿主か
ら取り出され、そして固体支持体（例えば、サンプル中
のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上で
インキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の
遊離のタンパク質結合部位は、非特異的タンパク質（例
えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすること
により被覆される。次いで、モノクローナル抗体は、デ
ィッシュ内でインキュベートされ、この間、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着された任意
のＧタンパク質ＰＡＦレセプタータンパク質に付着す
る。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液により
洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキシダーゼに連
結されたレポーター抗体はディッシュ内に入れられ、こ
れによりＰＡＦレセプタータンパク質に結合した任意の
モノクローナル抗体へレポーター抗体が結合する。次い
で、付着されなかったレポーター抗体は洗い流される。
次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加さ
れ、そして所定の期間における発色量が、標準曲線と比
較した場合の所定容量の患者サンプルに存在するＰＡＦ
レセプタータンパク質の測定値である。 【０１２８】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際
の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピ
ングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関さ
せることにおける重要な第１段階である。 【０１２９】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプ
ライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、
これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プ
ライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみ
が増幅フラグメントを生じる。 【０１３０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメ
ントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローン
のプールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピング計画は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別
した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリ
ーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを
構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を
包含する。 【０１３１】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短
いｃＤＮＡで使用され得る。この技術の総説としては、
Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８８）を参照のこと。 【０１３２】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関され得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見出される（Ｊｏｈｎ
ｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで
入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマップ
される遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１３３】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列の差異を決定する必要があ
る。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察され
るがいずれの正常な個体にも観察されない場合、この変
異は疾患の原因因子であるようである。 【０１３４】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあ
たり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それら
のフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対す
る抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。
これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、または
モノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ
抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含
する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体
およびフラグメントの産生のために使用され得る。 【０１３５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。 【０１３６】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。 【０１３７】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体の発現に使用され得る。 【０１３８】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。 【０１３９】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。 【０１４０】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラ
スミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明ら
かである。 【０１４１】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約
２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築の
ためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的
には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲ
ル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。 【０１４２】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載される８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１４３】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１４４】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１４５】別に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施された。 【０１４６】 【実施例】（実施例１：Ｇタンパク質共役型レセプター
ＨＴＮＡＤ２９（ＰＡＦレセプター）の細菌発現および
精製）ＰＡＦレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴ
ＣＣ受託番号第 号）を、プロセスされたＧタンパク質
の５’配列（シグナルペプチド配列を除く）およびＰＡ
Ｆレセプター遺伝子に対して３’のベクター配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初
に増幅する。ＰＡＦレセプターに対応するさらなるヌク
レオチドを、それぞれ５’および３’配列に添加する。
５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ＣＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴ
Ｔ３’を有し、これはＥｃｏＲＩ制限酵素部位、それに
続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ
酸から始まる１８ヌクレオチドのＧタンパク質ＰＡＦレ
セプターコード配列を含む。３’配列、５’ＣＧＧＡＡ
ＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣ
３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そ
して続いてＰＡＦレセプターをコードする１８ヌクレオ
チドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗
生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、
ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／
Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタ
グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ
−９を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。
増幅配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグ
およびＲＢＳをコードする配列とインフレームで挿入す
る。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株 Ｍ
１５／ｒｅｐ ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換する。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして
制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含むクロ
ーンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μ
ｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培
養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて
１：１００〜１：２５０の比で大規模な培養物に接種す
る。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）が
０．４と０．６との間になるまで増殖させる。次いで、
ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にする。ＩＰＴＧ
は、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、
Ｐ／Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導
する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細
胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオトロ
ピック薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化する。明澄
化後、可溶化Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを、６−Ｈ
ｉｓタグを含有するタンパク質により堅く結合し得る条
件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラ
フィーによりこの溶液から精製する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，
Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１
７７−１８４（１９８４））。ＰＡＦレセプターを６Ｍ
グアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整す
る。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析する。 【０１４７】（実施例２：ＣＯＳ細胞中での組換えＰＡ
Ｆレセプターの発現）プラスミド、ＰＡＦレセプターＨ
Ａの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／
Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）
アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、
４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポ
リアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター。ＰＡＦレ
セプター前駆体全体およびその３’末端にインフレーム
で融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメント
を、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。そ
れゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター下
に支配される。ＨＡタグは、先に記載された（Ｉ．Ｗｉ
ｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ
Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、および
Ｒ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ３７，７６７）
ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク質への
ＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体
を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。 【０１４８】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：ＰＡＦレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴ
ＣＣ受託番号第 号）を、以下の２つのプライマーを用
いてクローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲによ
り構築した：５’プライマー（５’ＧＴＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴ
３’）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに続く開始コドン
から始まるＰＡＦレセプターコード配列の１８ヌクレオ
チドを含む；３’配列、５’ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧ
ＧＴＡＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴＡ
３’は、ＸｈｏＩ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、お
よびＰＡＦレセプターコード配列の最後の１８ヌクレオ
チド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。
それゆえ、ＰＣＲ産物は、部位、インフレームで融合し
たＨＡタグが続くレセプターコード配列、ＨＡタグに隣
接する翻訳終結停止コドン、およびＸｈｏＩ部位を含
む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏ
Ｉ制限酵素を用いて消化し、そして連結した。連結混合
物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎ
ｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質
転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに
播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメン
トの存在を制限酵素分析で調べた。組換えＰＡＦレセプ
ターの発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴ
ＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔ ｓｃ
ｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））により発現ベクターでトラ
ンスフェクトした。ＰＡＦレセプターＨＡタンパク質の
発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した
（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフ
ェクションの２日後、３５Ｓ−システインで８時間標識
した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性
剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ
−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶
解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上３７：７６７（１
９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ
特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降し
たタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて
分析した。 【０１４９】（実施例３：バキュロウイルス発現系を用
いるＧタンパク質共役型レセプター（ＰＡＦレセプタ
ー）のクローニングおよび発現）全長のＰＡＦレセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番
号第 号）を、この遺伝子の５’配列および３’配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅した：５’プライマーは、配列 【０１５０】 【化１】 【０１５１】を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位
（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開
始に効率的なシグナルに類似する４つのヌクレオチド
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６，９４７−
９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、およびすぐ後ろにこのＰ
ＡＦレセプター遺伝子の最初の１８ヌクレオチド（翻訳
の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を含有する。 【０１５２】３’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴ
ＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴ
Ａ３’を有し、そして制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉの切断部位およびこのＰＡＦレセプター遺伝子の３’
非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅し
た配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩ
Ｏ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を
用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、こ
のフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化
し、そして上記のように精製した。このフラグメント
を、Ｆ２と呼ぶ。 【０１５３】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いる
ＰＡＦレセプタータンパク質の発現のために用いる（総
説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔ
ｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉ
ｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこ
と）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シ
ミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、
効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイル
スを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、
それに続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトラン
スフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同
組換えのためにウイルス配列に両端で隣接させる。多く
の他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わり
に用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１７０：３１−３９）。 【０１５４】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
上記のように、１％アガロースゲルから単離した。この
ベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。 【０１５５】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＰＡＦレセプター
遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＰＡＦ ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメ
ントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。 【０１５６】５μｇのプラスミドｐＢａｃＰＡＦ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、
１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂ
ａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．）とともにコトランスフェクトした。 【０１５７】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＰＡＦ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒを、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープ
レートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加
し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートし
た。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清
を含まないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組
織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレート
を、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振
動させた。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュ
ベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプ
レートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充し
た１ｍｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートを
インキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を
続けた。 【０１５８】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。 【０１５９】ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。 【０１６０】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（Ｍ０Ｉ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−ＰＡ
Ｆレセプターで感染させた。６時間後、培地を除去し、
そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００
ＩＩ培地（Ｌｌｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２
時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。
細胞をさらに１６時間インキュベートし、その後細胞を
遠心分離により収集し、そして標識されたタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより
可視化した。 【０１６１】（実施例４：遺伝子療法を介しての発現）
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られ
た組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊（ｓｍａｌｌ ｃｈｕｎｋ）を、組織培
養フラスコの湿潤表面に置き、およそ１０片をそれぞれ
のフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉
し、そして室温にて一晩置く。室温にて２４時間後、フ
ラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固
着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％Ｆ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７
℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、
新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さら
に２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層を
トリプシン処理し、そしてより大きなフラスコ中に掻き
落とす。 【０１６２】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．
Ｔ．ら，ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を、
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクターを
アガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用いて
精製する。 【０１６３】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはさ
らにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
の存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状
骨格ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントを一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグ
メントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を
用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこれを、ベ
クターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを
確認する目的のために、カナマイシンを含有する寒天上
にプレーティングする。 【０１６４】アンホトロピックなｐＡ３１７またはＧＰ
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有
するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増
殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地
に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用い
て形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝
子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この
時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる）。 【０１６５】新鮮な培地を、形質導入したプロデューサ
ー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプ
ロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。感
染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリ
ポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデュー
サー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞
を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細
胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー
細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場
合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は
必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例え
ば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベク
ターを使用することが必要である。 【０１６６】次いで、操作された線維芽細胞を、単独
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアービーズ
上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれか
で宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質
産物を産生する。 【０１６７】本発明の多数の改変および変更が、上記の
教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範
囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。 【０１６８】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包囲されるような本発明
の範囲を限定することを意味しない。 【０１６９】 【発明の効果】本発明は、新規の成熟レセプターポリペ
プチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、かつ診断
または治療に有用なフラグメント、アナログおよび誘導
体を提供する。
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７−膜貫通
型レセプターである。この膜貫通レセプターは、時々本
明細書以下で「Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター」といわ
れる血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定さ
れている。本発明はまた、このようなポリペプチドの作
用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】多数の医学的に重要な生物学的プロセス
が、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャ
ー（例えば、ｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に関与
するタンパク質により媒介されることは、十分に確立さ
れている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５
１：３５３−３５４（１９９１））。本明細書中では、
これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関
与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これ
らのタンパク質のいくつかの例としては、ＧＰＣレセプ
ター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミ
ンに対するＧＰＣレセプター（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．
Ｋ．ら，ＰＮＡＳ，８４：４６−５０（１９８７）；Ｋ
ｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：
６５０−６５６（１９８７）；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７８３−７８７（１９８
８）））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパ
ク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラー
ゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュ
エータータンパク質（ａｃｔｕａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテイン
キナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５２：８０２−８（１９９１））が挙げられる。 【０００３】例えば、シグナル伝達の１つの形態では、
ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸
シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性
化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、そしてＧＴ
Ｐはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結
させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活
性化されると、ＧＴＰを結合型ＧＤＰに変換することが
示された。次いで、ＧＴＰを有する形態は、活性化され
たアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰのＧＤＰへ
の加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、
Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇ
タンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクター
に中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を
制御する時計としての２つの役割を果たす。 【０００４】Ｇタンパク質共役型レセプターの膜タンパ
ク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫
通ドメインを有するものとして特徴づけられている。こ
れらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結
合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタ
ンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイルス、増
殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的
に活性なレセプターを含む。 【０００５】Ｇタンパク質共役型レセプターは、少なく
とも８つの分岐した親水性ループを結合する、約２０〜
３０アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲
を含むものとして特徴づけられている。共役型レセプタ
ーのＧタンパク質ファミリーの例として、ドーパミンレ
セプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学
的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結
合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、
カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、ｃ
ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、
セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺
激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１レセプタ
ー、およびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイル
スレセプターなどが挙げられる。 【０００６】大部分のＧタンパク質共役型レセプター
は、機能的なタンパク質構造を安定化させると考えられ
るジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ルー
プの各々に単一の保存されたシステイン残基を有する。
７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、
ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と命名されている。ＴＭ
３は、シグナル伝達に関連付けられている。 【０００７】システイン残基のリン酸化および脂質化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
Ｇタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達に影響を
与え得る。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、
第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に
潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧタンパ
ク質共役型レセプター（例えば、β−アドレノレセプタ
ー）について、プロテインキナーゼＡおよび／または特
異的なレセプターキナーゼによるリン酸化は、レセプタ
ー脱感作を媒介する。 【０００８】Ｇタンパク質共役型レセプターのリガンド
結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプター
膜貫通ドメインにより形成される親水性受口（ｓｏｃｋ
ｅｔ）を含有すると考えられ、この受口はＧタンパク質
共役型レセプターの疎水性残基により囲まれている。各
Ｇタンパク質共役型レセプター膜貫通ヘリックスの親水
性側は内側に向いており、そして極性リガンド結合部位
を形成すると仮定されている。ＴＭ３は、リガンド結合
部位（例えば、ＴＭ３のアスパラギン酸残基を含む）を
有するとして、いくつかのＧタンパク質共役型レセプタ
ーにおいて関連付けられている。さらに、ＴＭ５のセリ
ン、ＴＭ６のアスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７
のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド結
合に関連する。 【０００９】Ｇタンパク質共役型レセプターは、ヘテロ
三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオ
ンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し
得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃ．，Ｒｅｖ．，１
０：３１７−３３１（１９８９）を参照のこと）。異な
るＧタンパク質のαサブユニットは、細胞内で種々の生
物学的機能を調節するための特定のエフェクターを優先
的に刺激する。Ｇタンパク質共役型レセプターの細胞質
残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役型レセ
プターのＧタンパク質結合の調節のための重要な機構と
して同定されている。Ｇタンパク質共役型レセプター
は、哺乳動物宿主内の多数の部位において見出されてい
る。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの局面に
よれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに
それらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用
なフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。
本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。 【００１１】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が
提供され、この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアンチセンスアナ
ログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に
有用なそれらのフラグメントを含む。 【００１２】本発明のさらなる局面によれば、前記ポリ
ペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収
を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチド
をコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞お
よび／または組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を
包含する組換え技術によって、このようなレセプターポ
リペプチドを産生するためのプロセスが提供される。 【００１３】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供され
る。 【００１４】本発明の別の局面によれば、本発明のレセ
プターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する
か、またはその活性化を阻害する化合物をスクリーニン
グする方法が提供される。 【００１５】本発明のなお別の実施態様によれば、血小
板凝集による血友病の防止および／または処置におい
て、ならびに創傷治癒を促進することにおいて有用であ
る本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてそ
れを活性化する化合物を宿主に投与するプロセスが提供
される。 【００１６】本発明のなお別の実施態様によれば、アレ
ルギー、炎症、血管形成後の再狭窄、不安定狭心症、心
筋梗塞、および血栓卒中（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔ
ｒｏｋｅ）または血栓塞栓卒中（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂ
ｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）の防止および／または処
置において有用である、本発明のレセプターポリペプチ
ドに結合し、そしてその活性化を阻害する化合物を宿主
に投与するプロセスが提供される。 【００１７】本発明のなお別の局面によれば、本発明の
ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするの
に十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供され
る。 【００１８】本発明のなお別の局面によれば、このよう
なポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関
連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペ
プチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための
診断的アッセイが提供される。 【００１９】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関する
インビトロの目的のために利用するためのプロセスが提
供される。 【００２０】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。 【００２１】 【課題を解決するための手段】本発明の単離されたポリ
ヌクレオチドは、以下： （ａ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に記載のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第 号において含まれるＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）のポリヌクレ
オチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
ド；および、 （ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌ
クレオチドフラグメント、からなる群から選択されるメ
ンバーを含む。 【００２２】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドはＤＮＡである。 【００２３】別の実施形態において、上記ポリヌクレオ
チドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に記載のヌクレオチ
ド５２３〜ヌクレオチド１５３３を含む。 【００２４】さらに別の実施形態において、上記ポリヌ
クレオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）のポリペプチ
ドの可溶性形態をコードする。 【００２５】さらに本発明は、上記ＤＮＡを含むベクタ
ーおよびこのベクターで形質転換されたか、またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞に関する。 【００２６】本発明は、上記宿主細胞からのＤＮＡによ
りコードされるポリペプチドを発現する工程を包含す
る、ポリペプチドを産生するためのプロセスに関する。 【００２７】本発明は、ポリペプチドを発現し得る細胞
を産生するプロセスに関する。このプロセスは、上記ベ
クターで細胞を形質転換するか、またはトランスフェク
トする工程を包含する。 【００２８】本発明のレセプターポリペプチドは、以
下：（ｉ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、
アナログ、および誘導体；および、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受
託番号第 号のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにこのポリペプチドのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体、からなる群から選択されるメンバー
を含む。 【００２９】さらに本発明は、上記ポリペプチドに対す
る抗体、このポリペプチドを活性化する化合物、および
このポリペプチドの活性化を阻害する化合物に関する。 【００３０】本発明は、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター
を活性化する必要性を有する患者を処置するための方法
に関する。この方法は、化合物の治療有効量を該患者に
投与する工程を包含する。１つの実施形態において、こ
の化合物はポリペプチドであり、患者にこのポリペプチ
ド（例えば、アゴニスト）をコードするＤＮＡを提供
し、そしてインビボでこのポリペプチドを発現すること
によって、治療有効量のポリペプチドが投与される。 【００３１】また本発明は、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターを阻害する必要性を有する患者を処置するための方
法に関し、この方法は、化合物の治療有効量を該患者に
投与する工程を包含する。 【００３２】本発明は、ポリペプチドの過小発現に関連
する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプ
ロセスに関し、このプロセスはポリペプチドをコードす
る核酸配列における変異を決定する工程を包含する。 【００３３】本発明はさらに、上記レセプターのリガン
ドに結合し得る上記ポリペプチドの可溶性フラグメント
に関する。 【００３４】本発明は、宿主由来のサンプル中の上記ポ
リペプチドの存在を分析する工程を包含する診断プロセ
スに関する。 【００３５】本発明は、上記レセプターポリペプチドに
結合してこのポリペプチドを活性化または阻害する化合
物を同定するための方法に関する。この方法は、以下：
細胞表面上でこのレセプターポリペプチドを発現する細
胞と化合物とを、このレセプターポリペプチドへの化合
物の結合を許容するのに十分な条件下で接触させる工程
（このレセプターは、レセプターポリペプチドへの化合
物の結合に応答して、検出可能なシグナルを提供し得る
第２の成分と会合される）；および、この化合物が、上
記第２の成分により生成されるシグナルの存在または非
存在を検出することにより、有効なアゴニストまたはア
ンタゴニストであるか否かを同定する工程、を包含す
る。 【００３６】本発明は上記ポリペプチドの過小発現に関
連する疾患または疾患に対する感受性を診断するための
プロセスに関し、このプロセスは、ポリペプチドをコー
ドする核酸配列における変異を決定する工程を包含す
る。 【００３７】 【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、図
１（Ａ、Ｂ、およびＣ）の推定のアミノ酸配列（配列番
号２）を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年６
月１日にＡＴＣＣ受託番号第 号として寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供
される。 【００３８】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、白血球、肺、および腎臓において見出さ
れ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト甲状腺由来
のｃＤＮＡライブラリーで発見された。これは構造的に
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターファミリーに関連する。
これは、３３７アミノ酸残基のタンパク質をコードする
オープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、ヒトＰＡＦレセプターに最も高い程度の相同性を示
し、３３４アミノ酸の領域にわたって２９．３７５％の
同一性および５３．４３８％の類似性を有する。 【００３９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号１）に示すコード
配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり
得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複
または縮重の結果として、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）
（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ
成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり
得る。 【００４０】図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号２）
の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列
のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコ
ード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要
に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列
（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコー
ド配列の５’および／または３’非コード配列）。 【００４１】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。 【００４２】本発明はさらに、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および
誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチド
の改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリ
ヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体または
ポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得
る。 【００４３】従って、本発明は、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチ
ド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードさ
れる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含
む。この改変体は、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオ
チド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加ま
たは挿入改変体を含む。 【００４４】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号１）
に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列
の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を
有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体
は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を
有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これ
はコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させ
ない。 【００４５】ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポ
リペプチドのＴＭおよび細胞内ドメインから切断された
ポリペプチドの細胞外部分であるＰＡＦレセプターポリ
ペプチドの可溶性形態をコードし得る。 【００４６】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００４７】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用
語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーシ
ョンが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは
少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じる
ことを意味する。好ましい実施態様において、本明細書
中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチドは、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号
１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能また
は活性のいずれかを保持する（すなわち、ポリペプチド
は、例えば、セカンドメッセンジャー応答を誘発するこ
とにより膜結合性ＰＡＦレセプターとして機能しなくて
も、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保持
することにより可溶性ＰＡＦレセプターとして機能す
る）。 【００４８】あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明の
ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中上記
したように、それに対して同一性を有し、そして活性を
保持してもよく、または保持しなくてもよい、少なくと
も２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、そしてよ
り好ましくは少なくとも５０塩基を有し得る。例えば、
そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオ
チドの回収用の配列番号１のポリヌクレオチドに対する
プローブ、またはその改変体のプローブ、あるいは診断
プローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いられ得
る。 【００４９】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、および
より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチドならびにそのフラグメント（このフラグメ
ントは、少なくとも３０塩基、および好ましくは少なく
とも５０塩基を有する）ならびにこのようなポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドに関する。 【００５０】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または
販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてその
ような実施許諾はこれによって与えられるわけではな
い。 【００５１】本発明はさらに、図１（Ａ、Ｂ、および
Ｃ）（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、
または寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配
列を有するＰＡＦレセプターポリペプチド、ならびにそ
のようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび
誘導体に関する。 【００５２】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番
号２）のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡにコード
されるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、
ＰＡＦレセプターとしての機能）を保持するか、あるい
は、ポリペプチドがＧタンパク質ＰＡＦレセプター（例
えば、このレセプターの可溶性形態）として機能しなく
ても、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保
持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。 【００５３】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００５４】図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）（配列番号２）
のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナロ
グまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、
（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基また
は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）
で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基
は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基であ
ってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するも
の、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）のような別の化合物と融合されているも
の、あるいは（ｉｖ）その中にさらなるアミノ酸が、成
熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のため
に使用される成熟ポリペプチドに融合されているもの、
あるいは（ｖ）ポリペプチドのフラグメントが可溶性で
あり（すなわち膜結合性ではない）、さらにリガンドを
膜結合性レセプターに結合させるものであり得る。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００５５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。 【００５６】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そして一般に少なくとも３０
アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸
を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。 【００５７】当該分野において公知なように、２つのポ
リペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列と比較することにより決定される。 【００５８】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。 【００５９】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；こ
れは、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイ
ラー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソ
ン）の間の介在配列（イントロン）を含む。 【００６０】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の一部ではないため、なお単離され得る。 【００６１】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは９０％の類似性（より好ましくは少なく
とも９０％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対
して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも９５％
の類似性（なおより好ましくは少なくとも９５％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有するポリペ
プチドを含み、そしてまた一般に少なくとも３０アミノ
酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む
このようなポリペプチドの部分を有するこのようなポリ
ペプチドの部分を含む。 【００６２】当該分野において公知なように、２つのポ
リペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列と比較することにより決定される。 【００６３】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体と
して使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグ
メントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために使用され得る。 【００６４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００６５】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。 【００６６】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。 【００６７】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００６８】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
の合成を指示する適切な発現制制配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰＬ プロモーター、および原核生物
細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で
遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモ
ーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソ
ーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベ
クターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有
し得る。 【００６９】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。 【００７０】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００７１】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
ＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細
胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると考えられる。 【００７２】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベク
ターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、使用され得る。 【００７３】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを含む。真核
生物プロモーターは、ＣＭＶ即時初期型、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン
Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に当業者のレベル内である。 【００７４】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００７５】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。 【００７６】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。 【００７７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜３
００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転
写を増大させる。例として、複製起点の１００〜２７０
ｂｐの後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。 【００７８】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 【００７９】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。 【００８０】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。 【００８１】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。 【００８２】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００８３】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。 【００８４】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１
７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣ
ＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならび に任意の必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプ
ライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フ
ランキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプラ
イス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化
部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するため
に使用され得る。 【００８５】本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポ
リペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物
から回収され、そして精製され得る：硫安沈殿またはエ
タノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必
要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄ
ｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするた
めに使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得
る。 【００８６】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 【００８７】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験試薬および試験物質として使用され得る。 【００８８】本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプター
は、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する化合
物（アゴニスト）、または本発明のレセプターポリペプ
チドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）をス
クリーニングするためのプロセスにおいて使用され得
る。 【００８９】一般的に、このようなスクリーニング手順
は、その表面で本発明のレセプターポリペプチドを発現
する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞
としては、哺乳動物、酵母、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ま
たはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。特に、本発
明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞
をトランスフェクトし、それにより、Ｇタンパク質ＰＡ
Ｆレセプターを発現させるのに用いられる。次いで、発
現されたレセプターを、試験化合物と接触させて、結
合、機能的反応の刺激または阻害を観察する。 【００９０】１つのこのようなスクリーニング手順は、
本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターを発現するため
にトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含
む。このようなスクリーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ９
２／０１８１０（１９９２年２月６日公開）に記載され
ている。 【００９１】従って、例えば、このようなアッセイは、
レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化
合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細
胞とを接触させることにより、本発明のレセプターポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングす
るために使用され得る。リガンドにより生じるシグナル
の阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴ
ニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻
害することを示す。 【００９２】このスクリーニングは、このような細胞と
スクリーニングされるべき化合物とを接触させ、そして
そのような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、こ
のような化合物がレセプターを活性化するかを決定する
ことによりレセプターを活性化する化合物を決定するた
めに用いられ得る。 【００９３】他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１８１〜２９６頁（１９８９
年１０月）に記載されるように、レセプターの活性化に
より引き起こされる細胞外のｐＨ変化を測定する系にお
いて、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを発現する細胞
（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を含
む。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチ
ドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセ
ンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）
は、潜在的な化合物がレセプターを活性化するか、また
は阻害するかを決定するために測定され得る。 【００９４】別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇ
タンパク質ＰＡＦレセプターをコードするＲＮＡをＸｅ
ｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発
現させることを含む。次いでそのレセプター卵母細胞
は、レセプターの活性化を阻害すると考えられている化
合物をスクリーニングする場合にはレセプターリガンド
およびスクリーニングされる化合物と接触され得、続い
て、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行
われる。 【００９５】別のスクリーニング技術は、そのレセプタ
ーがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパ
ク質ＰＡＦレセプターの発現を包含する。このような細
胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細
胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中
上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパー
ゼの２次シグナルに由来するレセプターの活性化の阻害
の検出により達成され得る。 【００９６】別の方法は、細胞表面にレセプターを有す
る細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することに
よる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害
する化合物、アンタゴニストのスクリーニングを包含す
る。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを
発現するようにＧタンパク質ＰＡＦレセプターをコード
するＤＮＡで真核細胞をトランスフェクトする工程、お
よび標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物
とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、
放射能により標識され得る。標識リガンドがレセプター
に結合する量は、例えば、レセプターの放射能の測定に
より測定される。レセプターに結合する標識リガンドの
減少により決定されるようにこの化合物がレセプターに
結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻
害される。 【００９７】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターは、哺乳動
物宿主において遍在性であり、そして多くの病的な状態
を含む、多くの生物学的機能を担う。従って、一方でＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターを刺激し、そして他方でＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターをの機能を阻害し得る化合
物および薬物を見出すことが望ましい。 【００９８】例えば、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを
活性化する化合物は、治療目的（例えば、喘息、パーキ
ンソン病、急性心不全、低血圧、尿停留（ｕｒｉｎａｒ
ｙｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および骨粗鬆症の処置）に用
いられ得る。 【００９９】一般に、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターの
活性化を阻害する化合物は、種々の治療目的（例えば、
高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、
良性前立腺肥大、ならびに精神病および神経性疾患（精
神分裂病、躁病性興奮、うつ病、譫妄、痴呆、またはハ
ンチントン舞踏病またはＧｉｌｌｅｓ ｄｉｌａ Ｔｏ
ｕｒｅｔｔ症候群のような重篤な精神遅滞、ジスキネジ
ーなどを含む）の処置）に用いられ得る。Ｇタンパク質
ＰＡＦレセプターを阻害する化合物はまた、内因性食欲
不振を逆転することおよび過食症の制御において有用で
ある。 【０１００】抗体は本発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプ
ター、またはいくつかの場合には、オリゴヌクレオチド
をアンタゴナイズし得る。これらは、Ｇタンパク質ＰＡ
Ｆレセプターに結合するが、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応
答を惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に
会合する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体
を包含する。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、Ｇ
タンパク質ＰＡＦレセプターのリガンドに密接に関連す
るタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含
み、これは生物学的機能を欠失しており、そしてＧタン
パク質ＰＡＦレセプターに結合するときに応答を惹起し
ない。 【０１０１】アンチセンス技術の使用によって調製され
たアンチセンス構築物は、アンチセンス技術は、三重ら
せん形成もしくはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介
して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これら
の方法の両方は、ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮ
Ａに結合することに基づいている。例えば、本発明の成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の
５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用い
られる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する
遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせ
ん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：
３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を
参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質Ｐ
ＡＦレセプターの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイ
ズし、そしてｍＲＮＡ分子のＧタンパク質ＰＡＦレセプ
ターへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎ
ｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９
１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記
のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それ
によって、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、Ｇタン
パク質ＰＡＦレセプターの産生を阻害するためにインビ
ボで発現され得る。 【０１０２】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに結合する
小分子は、リガンドのレセプターへの接近を不可能に
し、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる。例え
ば、小ペプチドまたはペプチド様分子はまた、本発明の
レセプターポリペプチドの活性化を阻害するために使用
され得る。 【０１０３】可溶性形態のＧタンパク質ＰＡＦレセプタ
ー（例えば、このレセプターのフラグメント）は、本発
明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そしてこ
のリガンドが、膜結合性Ｇタンパク質ＰＡＦレセプター
と相互作用するのを妨げることによりレセプターの活性
化を阻害するために使用され得る。 【０１０４】本発明はまた、Ｇタンパク質ＰＡＦレセプ
ターに結合し得ることが知られていないリガンドが、こ
のようなレセプターに結合し得るか否かを決定するため
の方法を提供する。この方法は、リガンドのＧタンパク
質ＰＡＦレセプターに対する結合を許容する条件下で、
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを発現する哺乳動物細胞
とリガンドとを接触させる工程、レセプターに結合する
リガンドの存在を検出する工程、これによりリガンドが
Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに結合するか否かを決定
する工程を包含する。アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを決定するための上記の系はまた、レセプター
に結合するリガンドを決定するために使用され得る。 【０１０５】本発明はまた、レセプターをコードするｍ
ＲＮＡの存在を検出することにより、細胞表面上に本発
明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドの発現
を検出する方法を提供する。この方法は、細胞から全Ｒ
ＮＡを得る工程、ハイブリダイズ条件下で、そのように
得られたｍＲＮＡと、レセプターをコードする核酸分子
の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得
る少なくとも１０ヌクレオチドの核酸分子を含む核酸プ
ローブとを接触させる工程、プローブにハイブリダイズ
したｍＲＮＡの存在を検出する工程、およびそれにより
細胞によるレセプターの発現を検出する工程を包含す
る。 【０１０６】本発明はまた、本発明のレセプターポリペ
プチドに関連するレセプターを同定する方法を提供す
る。これらの関連するレセプターは、低ストリンジェン
シークロスハイブリダイゼーションにより、本発明のＧ
タンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドに対する相同
性により、あるいは関連する天然のリガンドまたは合成
のリガンドと相互作用するレセプターおよび／または本
発明のＧタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチドの遺
伝子的または薬理学的遮断後に類似の挙動を誘発するレ
セプターを同定することにより同定され得る。 【０１０７】上記のスクリーニング法により同定される
アゴニストは、血小板凝集を誘導することによる血友病
を処置し、そして創傷治癒を刺激するために使用され得
る。 【０１０８】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターに対するア
ンタゴニスト化合物は、血管形成後の再狭窄、不安定狭
心症、血栓卒中または血栓塞栓卒中、アレルギー、炎症
および心筋梗塞を予防および／または処置するために使
用され得る。 【０１０９】アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、本明細書上記に記載のもの）を有する
組成物において使用され得る。 【０１１０】アンタゴニストまたはアゴニストは、適切
な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このよ
うな組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬
学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このよ
うなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩
水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、
およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限
定されない。処方は、投与の様式に合わせるべきであ
る。 【０１１１】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチ
ドは、他の治療化合物と併用して用いられ得る。 【０１１２】薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によ
る便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
症状の処置および／または予防に有効な量で投与され
る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１
日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から
約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮
される。 【０１１３】Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターポリペプチ
ド、およびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらは
ポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビ
ボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得
る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。 【０１１４】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。 【０１１５】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ
チドの発現のために患者に投与され得る。このような方
法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には
明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発
現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、ア
デノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒク
ルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために
使用され得る。 【０１１６】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。 【０１１７】ベクターは、１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない）のような細
胞プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されな
い。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、
アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモ
ーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切な
プロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から
当業者に明らかである。 【０１１８】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。 【０１１９】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１ ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、またはＰＡＦを脂質に結合し
得、次いで宿主に投与され得る。 【０１２０】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細
胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細
胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限
定されない。 【０１２１】本発明はまた、診断としての本発明の遺伝
子の使用を意図する。例えば、いくつかの疾患は、遺伝
性欠損遺伝子から生じる。これらの遺伝子は、正常な遺
伝子の配列と欠損遺伝子の配列とを比較することにより
検出され得る。その後に、「変異体」遺伝子は、異常な
レセプター活性に関連することが確認され得る。さら
に、変異体レセプター遺伝子は、変異を確認するか、ま
たは同定するためのなお別の手段としての機能的アッセ
イ系（例えば、比色定量アッセイ、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ
プレート上での発現、ＨＥＫ２９３細胞のレセプター欠
損株における相補性実験）における発現に適切なベクタ
ーに挿入され得る。一旦「変異体」遺伝子が同定される
と、「変異体」レセプター遺伝子のキャリアのための集
団がスクリーニングされ得る。 【０１２２】本発明の遺伝子における変異を有する個体
は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診
断のために用いられる核酸は、患者の細胞（例えば、血
液、尿、唾液、組織生検物質、および剖検物質由来のも
のを含むが、これらに限定されない）より得られ得る。
ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得るか、ま
たは分析前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅さ
れ得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３
−１６６（１９８６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡはま
た、同じ目的のために使用され得る。例として、本発明
の核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、本発明の遺伝子
における変異を同定および解析するために使用され得
る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比
較における増幅された産物のサイズの変化により検出さ
れ得る。点変異は、放射性標識された本発明のＲＮＡま
たは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセン
スＤＮＡ配列に、増幅されたＤＮＡをハイブリダイズさ
せることにより同定され得る。完全に対合した配列は、
ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差により、誤対合し
た二本鎖と区別され得る。このような診断は、出生前の
試験または新生児の試験のためにも特に有用である。 【０１２３】対照遺伝子と「変異体」遺伝子との間の配
列差異は、直接ＤＮＡ配列決定法により明らかにされ得
る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは、
特異的なＤＮＡセグメントを検出するためのプローブと
して使用され得る。この方法の感度は、ＰＣＲと組み合
わせた場合、非常に増強される。例えば、プライマー配
列は、二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲより作製され
た一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射
標識ヌクレオチドを用いた従来の手順によるか、または
蛍光タグを用いた自動配列決定手順により行われる。 【０１２４】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。特異的な位置での配列変化はまた、核
保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）ま
たは化学切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，
ＵＳＡ，８５：４３９７−４４０１ １９８５）により
明らかにされ得る。 【０１２５】さらに、いくつかの疾患は、ｍＲＮＡにお
ける変化により検出され得る遺伝子発現の変化の結果で
あり、すなわち遺伝子発現の変化によって特徴づけられ
る。あるいは、本発明の遺伝子は、この型のレセプター
に関連する機能の減少を示す個体を同定するための参照
として使用され得る。 【０１２６】本発明はまた、種々の組織における本発明
のＰＡＦレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化し
たレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主
に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチド
のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業
者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結
合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましく
はＥＬＩＳＡアッセイを含む。 【０１２７】ＥＬＩＳＡアッセイは、ＰＡＦレセプター
ポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体を調製する工程を最初に含む。さらに、こ
のモノクローナル抗体に対するレセプター抗体が調製さ
れる。放射能、蛍光、またはこの実施例において西洋ワ
サビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬がレ
セプター抗体に付着される。ここでサンプルは、宿主か
ら取り出され、そして固体支持体（例えば、サンプル中
のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上で
インキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の
遊離のタンパク質結合部位は、非特異的タンパク質（例
えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすること
により被覆される。次いで、モノクローナル抗体は、デ
ィッシュ内でインキュベートされ、この間、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着された任意
のＧタンパク質ＰＡＦレセプタータンパク質に付着す
る。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液により
洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキシダーゼに連
結されたレポーター抗体はディッシュ内に入れられ、こ
れによりＰＡＦレセプタータンパク質に結合した任意の
モノクローナル抗体へレポーター抗体が結合する。次い
で、付着されなかったレポーター抗体は洗い流される。
次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加さ
れ、そして所定の期間における発色量が、標準曲線と比
較した場合の所定容量の患者サンプルに存在するＰＡＦ
レセプタータンパク質の測定値である。 【０１２８】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際
の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピ
ングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関さ
せることにおける重要な第１段階である。 【０１２９】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプ
ライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、
これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プ
ライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみ
が増幅フラグメントを生じる。 【０１３０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメ
ントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローン
のプールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピング計画は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別
した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリ
ーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを
構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を
包含する。 【０１３１】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、５０または６０塩基という短
いｃＤＮＡで使用され得る。この技術の総説としては、
Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８８）を参照のこと。 【０１３２】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関され得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見出される（Ｊｏｈｎ
ｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで
入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマップ
される遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１３３】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列の差異を決定する必要があ
る。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察され
るがいずれの正常な個体にも観察されない場合、この変
異は疾患の原因因子であるようである。 【０１３４】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあ
たり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それら
のフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対す
る抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。
これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、または
モノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ
抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含
する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体
およびフラグメントの産生のために使用され得る。 【０１３５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。 【０１３６】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。 【０１３７】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体の発現に使用され得る。 【０１３８】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。 【０１３９】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。 【０１４０】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラ
スミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明ら
かである。 【０１４１】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約
２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築の
ためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的
には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲ
ル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。 【０１４２】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載される８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１４３】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１４４】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１４５】別に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施された。 【０１４６】 【実施例】（実施例１：Ｇタンパク質共役型レセプター
ＨＴＮＡＤ２９（ＰＡＦレセプター）の細菌発現および
精製）ＰＡＦレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴ
ＣＣ受託番号第 号）を、プロセスされたＧタンパク質
の５’配列（シグナルペプチド配列を除く）およびＰＡ
Ｆレセプター遺伝子に対して３’のベクター配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初
に増幅する。ＰＡＦレセプターに対応するさらなるヌク
レオチドを、それぞれ５’および３’配列に添加する。
５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ＣＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴ
Ｔ３’を有し、これはＥｃｏＲＩ制限酵素部位、それに
続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ
酸から始まる１８ヌクレオチドのＧタンパク質ＰＡＦレ
セプターコード配列を含む。３’配列、５’ＣＧＧＡＡ
ＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣ
３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に相補的な配列を含み、そ
して続いてＰＡＦレセプターをコードする１８ヌクレオ
チドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗
生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、
ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／
Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタ
グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ
−９を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。
増幅配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグ
およびＲＢＳをコードする配列とインフレームで挿入す
る。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株 Ｍ
１５／ｒｅｐ ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換する。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして
制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含むクロ
ーンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μ
ｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培
養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて
１：１００〜１：２５０の比で大規模な培養物に接種す
る。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）が
０．４と０．６との間になるまで増殖させる。次いで、
ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にする。ＩＰＴＧ
は、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、
Ｐ／Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導
する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細
胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオトロ
ピック薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化する。明澄
化後、可溶化Ｇタンパク質ＰＡＦレセプターを、６−Ｈ
ｉｓタグを含有するタンパク質により堅く結合し得る条
件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラ
フィーによりこの溶液から精製する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，
Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１
７７−１８４（１９８４））。ＰＡＦレセプターを６Ｍ
グアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整す
る。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析する。 【０１４７】（実施例２：ＣＯＳ細胞中での組換えＰＡ
Ｆレセプターの発現）プラスミド、ＰＡＦレセプターＨ
Ａの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／
Ａｍｐは以下を含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）
アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、
４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポ
リアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーター。ＰＡＦレ
セプター前駆体全体およびその３’末端にインフレーム
で融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメント
を、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。そ
れゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーター下
に支配される。ＨＡタグは、先に記載された（Ｉ．Ｗｉ
ｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ
Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、および
Ｒ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，Ｃｅｌｌ３７，７６７）
ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク質への
ＨＡタグの融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体
を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。 【０１４８】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：ＰＡＦレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴ
ＣＣ受託番号第 号）を、以下の２つのプライマーを用
いてクローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲによ
り構築した：５’プライマー（５’ＧＴＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴ
３’）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、それに続く開始コドン
から始まるＰＡＦレセプターコード配列の１８ヌクレオ
チドを含む；３’配列、５’ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧ
ＧＴＡＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴＡ
３’は、ＸｈｏＩ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、お
よびＰＡＦレセプターコード配列の最後の１８ヌクレオ
チド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。
それゆえ、ＰＣＲ産物は、部位、インフレームで融合し
たＨＡタグが続くレセプターコード配列、ＨＡタグに隣
接する翻訳終結停止コドン、およびＸｈｏＩ部位を含
む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏ
Ｉ制限酵素を用いて消化し、そして連結した。連結混合
物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎ
ｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質
転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに
播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメン
トの存在を制限酵素分析で調べた。組換えＰＡＦレセプ
ターの発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴ
ＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔ ｓｃ
ｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））により発現ベクターでトラ
ンスフェクトした。ＰＡＦレセプターＨＡタンパク質の
発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した
（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフ
ェクションの２日後、３５Ｓ−システインで８時間標識
した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性
剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ
−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶
解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上３７：７６７（１
９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ
特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降し
たタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて
分析した。 【０１４９】（実施例３：バキュロウイルス発現系を用
いるＧタンパク質共役型レセプター（ＰＡＦレセプタ
ー）のクローニングおよび発現）全長のＰＡＦレセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番
号第 号）を、この遺伝子の５’配列および３’配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅した：５’プライマーは、配列 【０１５０】 【化１】 【０１５１】を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位
（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開
始に効率的なシグナルに類似する４つのヌクレオチド
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６，９４７−
９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、およびすぐ後ろにこのＰ
ＡＦレセプター遺伝子の最初の１８ヌクレオチド（翻訳
の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を含有する。 【０１５２】３’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴ
ＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴ
Ａ３’を有し、そして制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉの切断部位およびこのＰＡＦレセプター遺伝子の３’
非翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅し
た配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩ
Ｏ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を
用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、こ
のフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化
し、そして上記のように精製した。このフラグメント
を、Ｆ２と呼ぶ。 【０１５３】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いる
ＰＡＦレセプタータンパク質の発現のために用いる（総
説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔ
ｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉ
ｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこ
と）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シ
ミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、
効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイル
スを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、
それに続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトラン
スフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同
組換えのためにウイルス配列に両端で隣接させる。多く
の他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１の代わり
に用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１７０：３１−３９）。 【０１５４】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
上記のように、１％アガロースゲルから単離した。この
ベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。 【０１５５】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＰＡＦレセプター
遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＰＡＦ ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメ
ントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。 【０１５６】５μｇのプラスミドｐＢａｃＰＡＦ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、
１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂ
ａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．）とともにコトランスフェクトした。 【０１５７】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＰＡＦ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒを、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープ
レートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加
し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートし
た。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清
を含まないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組
織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレート
を、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振
動させた。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュ
ベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプ
レートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充し
た１ｍｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートを
インキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を
続けた。 【０１５８】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。 【０１５９】ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。 【０１６０】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（Ｍ０Ｉ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−ＰＡ
Ｆレセプターで感染させた。６時間後、培地を除去し、
そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００
ＩＩ培地（Ｌｌｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２
時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。
細胞をさらに１６時間インキュベートし、その後細胞を
遠心分離により収集し、そして標識されたタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより
可視化した。 【０１６１】（実施例４：遺伝子療法を介しての発現）
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られ
た組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊（ｓｍａｌｌ ｃｈｕｎｋ）を、組織培
養フラスコの湿潤表面に置き、およそ１０片をそれぞれ
のフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉
し、そして室温にて一晩置く。室温にて２４時間後、フ
ラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固
着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％Ｆ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７
℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、
新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さら
に２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層を
トリプシン処理し、そしてより大きなフラスコ中に掻き
落とす。 【０１６２】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．
Ｔ．ら，ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を、
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクターを
アガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用いて
精製する。 【０１６３】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはさ
らにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
の存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状
骨格ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントを一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグ
メントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を
用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこれを、ベ
クターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを
確認する目的のために、カナマイシンを含有する寒天上
にプレーティングする。 【０１６４】アンホトロピックなｐＡ３１７またはＧＰ
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有
するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増
殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地
に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用い
て形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝
子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この
時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる）。 【０１６５】新鮮な培地を、形質導入したプロデューサ
ー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプ
ロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。感
染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリ
ポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデュー
サー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞
を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細
胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー
細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場
合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は
必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例え
ば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベク
ターを使用することが必要である。 【０１６６】次いで、操作された線維芽細胞を、単独
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアービーズ
上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれか
で宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質
産物を産生する。 【０１６７】本発明の多数の改変および変更が、上記の
教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範
囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。 【０１６８】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包囲されるような本発明
の範囲を限定することを意味しない。 【０１６９】 【発明の効果】本発明は、新規の成熟レセプターポリペ
プチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、かつ診断
または治療に有用なフラグメント、アナログおよび誘導
体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、血小板活性化因子レセプターとし
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決
定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図１Ｂ】図１Ｂは、血小板活性化因子レセプターとし
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す（図１Ａの続きである）。 【図１Ｃ】図１Ｃは、血小板活性化因子レセプターとし
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す（図１Ｂの続きである）。 【図２】図２は、本発明のＧタンパク質レセプター（上
の行）とヒトＰＡＦレセプター（下の行）との間のアミ
ノ酸アラインメントを例示する。
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決
定を、３７３自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図１Ｂ】図１Ｂは、血小板活性化因子レセプターとし
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す（図１Ａの続きである）。 【図１Ｃ】図１Ｃは、血小板活性化因子レセプターとし
て推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプ
ターのｃＤＮＡ配列、および対応する推定アミノ酸配列
を示す（図１Ｂの続きである）。 【図２】図２は、本発明のＧタンパク質レセプター（上
の行）とヒトＰＡＦレセプター（下の行）との間のアミ
ノ酸アラインメントを例示する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(71)出願人 597018381
9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ,
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(72)発明者 リ イ
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
カイザースバーグ， ホワード ランデ
ィング ドライブ 16125
(72)発明者 レベッカ エイ． フルドナー
アメリカ合衆国 バージニア 20838，
バーネスビル， バーネスビル ロード
18040， ピー．オー． ボックス 306
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA63 CA04 DA02 EA02
FA02 GA11 HA01
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）図１（Ａ、Ｂ、およびＣ）に示すポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第 号において含まれるＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして（ａ）または（ｂ）の該ポリヌ
クレオチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオ
チド；および （ｄ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドのポリ
ヌクレオチドフラグメント、からなる群から選択される
メンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002151456A JP2003009865A (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002151456A JP2003009865A (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09500379 Division |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003009865A true JP2003009865A (ja) | 2003-01-14 |
Family
ID=19194751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002151456A Pending JP2003009865A (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003009865A (ja) |
-
2002
- 2002-05-24 JP JP2002151456A patent/JP2003009865A/ja active Pending
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040914 |
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| A02 | Decision of refusal |
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