MX2007014564A - Anticuerpos de vhh de dominio unico contra el factor de von willebrand. - Google Patents

Anticuerpos de vhh de dominio unico contra el factor de von willebrand.

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Abstract

La presente invencion se relaciona con NanocuerposTM mejorados contra el Factor de von Willebrand (vWF), asi como tambien con polipeptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o mas de tales Nanocuerpos. La invencion tambien se relaciona con acidos nucleicos que codifican tales Nanocuerpos y polipeptidos; con metodos para preparar tales Nanocuerpos y polipeptidos; con celulas huesped que expresan o son capaces de expresar tales Nanocuerpos o polipeptidos; con composiciones que comprenden tales Nanocuerpos, polipeptidos, acidos nucleicos o celulas huesped; y con usos de tales Nanocuerpos, tales polipeptidos, tales acidos nucleicos, tales celulas huesped o tales composiciones, en particular para propositos profilacticos, terapeuticos o diagnosticos, tales como los propositos profilacticos, terapeuticos o diagnosticos.

Description

ANTICUERPOS DE VHH DE DOMINIO ÚNICO CONTRA EL FACTOR DE VON WILLEBRAND CAMPO D? LA INVENCIÓN, La presente invención se relaciona con Nanocuerpos™ mejorados contra el factor de Von Willebran (Vwf) , así como también con polipéptidos que comprenden o consissten esencialmente de uno o más de tales Nanocuerpos. [Nota : Nanocuerpo , Nanocuerpos y Nanoclon son marcas regist rada de Ablynx N. V. ] La invención también se relaciona con ácidos nuclei os que codifican tales Nanocuerpos y polipéptidos; métodos para preparar tales Nanocuerpos y polipéptidos; células huésped que expresan o son capaces de expresar tales Nanocuerpos o polipéptidos; composiciones que compreiiden tales Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos o células huésped; y usos de tales Nanocuerpos, i tales polipéptidos, tales ácidos nucleicos, tales células i huésped o tales composiciones, en particular para propósitos profilácticos, terapéuticos o diagnósticos, tales como los propósitos profilácticos, terapéuticos diagnósticos mencionados en lo siguiente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención llegarán a ser claras a partir de la descripción posterior a continuación. WO 04/062551 del Solicitante se relaciona con Nanoc erpos contra el Factor de Von Willebrand (vWF) y con la preparación y uso de los mismos, en particular para la preverción y/o tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la agregación mediada por plaquetas. Los Nanocuerpos anti-vWF de acuerdo con WO 04/06255 pueden humanizarse y pueden ser monovalentes o multivalentes, lo último de lo cual conduce a una afinidad incrementada por vWF. Los Anticuerpos anti-vWF de acuerdo con WO 04/062551 pueden también ser multi-específicos, y pueden en particular encontrarse en la forma de una construcción multi-específica que comprende dos o más Nanocu<;rpos contra vWF y un Nanocuerpo adicional dirigido contra ¡ una proteína sérica tal como albúmina sérica humana, lo cual conduce a una vida media incrementada in vivo. I ¡ Los anticuerpos anti-vWF descritos en WO 04/062551 pueden dirigirse contra cual epítopo conformación de vWF (tal como el dominio Al o dominio A3) , pero de preferencia se dirigen contra el dominio Al, y en particular contra la conformación activada del dominio Al.
I WO 04/062551 también describe la preparación de los Naijiocuerpos anti-vWF, secuencias de nucleótidos que codifican los Nanocuerpos anti-vWF, así como también o rectal, o para administración por inhalación; y pueden también comprender un agente trombolítico, tal como estafllocinasa, activador de plasminógeno tisular, estreptocinas, estreptosinasa de cadena sencilla, urocinasa y complejo de estreptocinasa acil plasminógeno. Los anticuerpos anti-vWF descritos en WO 04/062551 pueden también usarse para propósitos diagnósticos (opcionalmente en la forma de un juego de partes) o en recubrimientos para dispositivos médicos tales como las endoprótesis vascul ¡ares .
! SUMARIO DE LA INVENCIÓN I i Es un objeto general de la presente invención Nanocuerpos contra vWF, en particular contra i En particular, es un objeto de la presente invención proporcionar Nanocuerpos contra vWF, en i particular contra vWF humano, y proporcionar proteínas o I polipép'tidos que comprenden los mismos, que son adecuados para uso terapéutico y/o diagnóstico, y en particular para i la prevención, tratamiento y/o diagnóstico de una o más i enfermedades y trastornos asociados con y/o mediados por vWF tales como aquellos mencionados en los anterior, y/o que pue|den usarse en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una o tales ención cionar ue son contra o más ón con en WO j Más en particular, es un objeto de la invención proporcionar Nanocuerpos contra vWF, y proporcionar proteínas o polipéptidos que comprenden los mismos, que se I I mejoran en comparación con los Nanocuerpos y polipéptidos contra vWF descritos en WO 04/062551 con respecto a una o más de jlas siguientes propiedades o características: i i afinidad incrementada por vWF, ya sea en un formato i monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en jun formato bivalente) y/o en un formato multi- específico (por ejemplo, uno de los formatos multi- específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación) mejor conveniencia para formatear en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) ; mejoír conveniencia para formatear en un formato multi- específico (por ejemplo, uno de los formatos multi-específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación) ; conveniencia o susceptibilidad mejoradas para "humanizar" sustituciones (como se define en la presente) ; y/o menor inmunogenicidad, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multi-específico (por ejemplo, uno de los formatos multi-específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación) en un formato monovalente; estabilidad incrementada ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multi-específico (por ejemplo, uno de los formatos multi-específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación) er un formato monovalente; especificidad incrementada hacia vWF, ya sea en un fqrmato monovalente, en un formato multivalente (por e] emplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multi-específico (por ejemplo, uno de los formatos multi-específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación) en un formato monovalente; reactividad cruzada disminuida o, cuando se desee, mcrementada con vWF de especies diferentes; y/o una o más de otras propiedades mejoradas deseables bara uso farmacéutico (incluyendo uso profiláctico y/o uso terapéutico) y/o para uso diagnóstico (incluyendo pero no limitada al uso para propósitos de adquisición ce imágenes) , ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multi-específico (por jemplo, uno de los formatos multi-específicos descritos en WO 04/062551 o a continuación. Estos objetos se logran por los Nanocuerpos contra vWF y por los polipéptidos descritos en la presente. Los Nanocuerpos contra vWF y polipéptidos descritos en la presen:e se dirigen en particular contra vWF humano, pero se incluye dentro del alcance de la invención que algunos de los Nanocuerpos anti-vWF y polipéptidos de la invención i pueden ¡ mostrar reactividad cruzada con vWF de otros animales vertebrados, en particular de otros animales de sangre caliente, más en particular de otros mamíferos, y en particular de otras especies de primates tales como los mandriles usados en los ejemplos en lo siguiente. Sin embargo, como con los Nanocuerpos anti-vWF descritos en WO 04/062551, la presente invención en su sentido más amplio no se limita particularmente a o se define por un epítopo, dominio o confirmación específicos vWF contra el cual los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se dirigen. Sin embar?O, se asume en general y se prefiere que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se dirijan contra el dominio Al de vWF, ya sea en su confirmación activado o no activada. De esta manera, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un Nanocuerpo (como se define en la presente) , contra vWF, el cual consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente), en las cuales: i) CDRl comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: NYGMG [SEQ ID NO: 15] SYTLG [SEQ ID NO: 16] NYNMG [SEQ ID NO: 17] SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG [SEQ ID NO: 20] IGTMG [SEQ ID NO: 21] YNPMG [SEQ ID NO: 22] i o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las t secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : i (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación I y en la cual: ii) CDR2 comprende o esencialmente consiste de una sesuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23] GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24] TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25] SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26] TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27] AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO: 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 30] AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31] AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las i secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual i (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ie define en la presente) ; y/o : (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimin ciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) i con upa de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : | I (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores; y en la cual : i iii) CDR3 comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36] VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42] AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43] I o del grupo que consiste de secuencias de amino,ácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de sefuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o i i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no i eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: ! I (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ¿e define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo (contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la ¡o las secuencias de aminoácidos anteriores.
¡ En otro aspecto, la invención se relaciona con un í Nanocijierpo (como se define en la presente) , contra vWF, el cual consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente) , en las cuales : | i) CDRl es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: i NYGMG [SEQ ID NO: 15] ' SYTLG [SEQ ID NO: 16] | NYNMG [SEQ ID NO: 17] i SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG [SEQ ID NO: 20] j IGTMG [SEQ ID NO: 21] YNPMG [SEQ ID NO: 22] ¡ o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuenqias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo I contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; i y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferejncias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: j í ¡ (1) cualquier sustitución de aminoácidos es ¡ preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o I (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo I contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la ¡o las secuencias de aminoácidos anteriores; ¡ y en la cual: j ii) CDR2 es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23] ¡ 1 GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24] ¡ TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25] ¡ SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26] j TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27] I ! AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO 30] AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO 31] AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO 32] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, identidad una de las (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o aminoácidos preferentemente de aminoácidos, y no aminoácidos, en comparación con la ! o las secuencias de aminoácidos anteriores; ! ¡ y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las i diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y en la cual : iii) CDR3 es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36] VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42] AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43] i o del grupo que consiste de secuencias de aminoádidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por loj menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, ii inclus '1cj más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual i (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimi aciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoájcidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la I cual : (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ee define en la presente) ; y/o i ' (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la | o las secuencias de aminoácidos anteriores. Los Nanocuerpos contra vWF como se describe en lo anterior y como se describe además a continuación son I referidos también en la presente como Nanocuerpos de la invenc-Ljon De los Nanocuerpos de la invención, los Nanocue!rpos que comprenden una o más de las CDR explícitamente listadas en lo anterior son particularmente preferidos; los Nanocuerpos que comprenden dos o más de las CDR | explícitamente listadas en lo anterior son particularmente más preferidos; y los Nanocuerpos que comprenden tres de las CDR explícitamente listadas en lo anterijor son particularmente los más preferidos. I En otro aspecto, la invención se relaciona con un Nanoc erpo contra vWF, el cual consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respecitivamente) , el cual se elige del grupo que consiste de Nanocuerpos con una de las siguientes combinaciones de CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente: ! - CDR1:NYGMG; CDR2 : SISWSGTYTAYSDNVKG; I CDR3 : QSRYRSNYYDHDDKYAY - CDR1:SYTLG; CDR2 : GISWSGVSTDYAEFAKG; CDR3 : LGRYRSNWRNIGQYDY - CDR1:NYGMG; CDR : TSISWSGSYTAYADNVKG; CDR3 : QSRYSSNYYDHDDKYAY - CDR1:NYNMG; CDR2 : SISWSGMSTYYTDSVKG; CDR3 : SNRYRTHTTQAMYNY CDRl : SSAMA; CDR2:TITSGGRTSYADSVKG; CDR3:VVDGKRAP CDRl : YYNTG; CDR2 :AISWSGGLTYYADSVKG; CDR3 :NRRQKTVQMGERAYDY CDR1:IGAMG; CDR2 : TITSGGSTNYADPVKG; CDR3 :NLKQGSYGYRFNDY - CDR1:IGAMG; CDR2 :TITSGGSTNYADSVKG; CDR3 : NLKQGSYGYRFNDY - CDR1-IGAMG; CDR2 :TITSGGSTNYADSVKG; CDR3 : LKQGDYGYRFNDY - CDR1:IGT G; CDR2 :TITSGGSTNYADSVKG; CDR3 : NLKQGDYGYRFNDY - CDR1:YNPMG; CDR2 :AISRTGGSTYYARSVEG; CDR3 :AGVRAEDGRVRTLPSEYNF I - CDR1:YNPMG; CDR2 :AISRTGGSTYYPDSVEG; CDR3:AGVRAEDGRVRTLPSEYTF - CDR1:YNPMG; CDR2 :AISRTGGSTYYPDSVEG; 1 CDR3:AGVRAEDGRVRSLPSEYTF En los Nanocuerpos de la invención que comprenden las ombinaciones de las CDR mencionadas en lo anterior, cada CDR puede reemplazarse por una CDR elegida del grupo que cfnsiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo prefeijentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o 2 ) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo j contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o elegida del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 (como se indica en el párrafo precedente) "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la o las CDR mencionadas, una de las secuencias de aminoácidos i anterijores, en la cual: i (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo í contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación i con la ¡o las secuencias de aminoácidos anteriores. i Sin embargo, de los Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de las CDR mencionadas en lo anterior, los Nanocuerpos que comprenden una o más de las CÉ)R listadas en lo anterior son particularmente preferidos; los Nanocuerpos que comprenden dos o más de las CDR listadas en lo anterior son particularmente más preferídos; y los Nanocuerpos que comprenden tres de las CDR listadas en lo anterior son particularmente los más IV) IV) o cp cn t-i Mi — fcí— TABLA I: Combinaciones preferidas de CDR's, de secuencias CDR's y estructura base, y de CDR's y FR's humanizadas Tabla I (continuación) cp O cp O cp De esta manera, en los Nanocuerpos de la invención, por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes se elige en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I; o del grupo de secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de "identidad de secuencia" (como se define en la presente) con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la T^bla I. En este contexto, por "elegida en forma adecuada" se da entender que, según convenga, una secuencia CDRl se elige de secuencias CDRl adecuadas (es decir, como I se define en la presente) , una secuencia CDR2 se elige de secuencias CDR2 adecuadas (es decir, como se define en la presente) , y una secuencia CDR3 se elige de una secuencia CDR3 adecuada (es decir, como se define en la presente) , respectivamente . En particular, en los Nanocuerpos de la inven?ión, por lo menos la secuencia CDR3 presente se elige en fo::ma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla I o del grupo de secuencias CDR3 Tabla | I; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR3 que t:-enen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoáfcidos con por lo menos una de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla I. | Preferentemente, en los Nanocuerpos de la invención, por lo menos dos de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes se eligen en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I o del grupo que consisjte de secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, ?ás preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I; y/o del grupo que i consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tapia I. I En particular, en los Nanocuerpos de la invención, por lo menos la secuencia CDR3 presente se elige en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla I o del grupo de secuencias CDR3 que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, imás preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla i I, respectivamente; y por lo menos una de las secuencias CDRl y CDR2 presentes se elige en forma adecuada del qrupo que consiste de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, listadas en la Tabla I o del grupo de secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, que tienen por lo menos ¡ 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, listadas en la Tabla I; y/o del grupo que consiáte de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con por lo menos una de las secuencias CDRl y CDR2, ¡respectivamente, listadas en la Tabla I. I De mayor preferencia, en los Nanocuerpos de la invención, la totalidad de las tres secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes se elige en forma adecuada del grupo que i consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I o del grupo de CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, I respectivamente, listadas en la Tabla I; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, I respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en i la Tabjla I. Incluso más preferentemente, en los Nanocuerpos de la 'invención, por lo menos una de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes se elige en forma adecuada del grupo que onsiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I. Preferentemente, en esta modalidad, por lo menos una o de preferencia las otras dos secuencias CDR presentes se eligen en forma adecuada de secuencias CDR que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDR correspondientes, respectivamente, listadas en la Tabla I; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con por lo menos una de las secuencias correspondientes, respectivamente, listadas en la Tabla I. En particular, en los Nanocuerpos de la invenéión, por lo menos la secuencia CDR3 presente se elige en fojjrma adecuada del grupo que consiste de la CDR3 listada en la Tabla I. Preferentemente, en esta modalidad,, por lo menos una y preferentemente ambas secuencias CDRl y CDR2 preseifites se eligen en forma adecuada de los grupos de secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, en la Tabla! I; y/o del grupo que consiste de las secuencias CDRl y CDR|2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o [Las diferencias en aminoácidos con por lo menos una de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, listadas en la Tablal I. Incluso más preferentemente, en los Nanocuerpos de lal invención, por lo menos dos de las secuencias CDRl, I CDR2 y CDR3 presentes se eligen en forma adecuada del grupo que ¿onsiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I. Preferentemente, en esra modalidad, la secuencia CDR restante presente se elige en forma adecuada del grupo de secuencias CDR que tiener. por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias CDR correspondientes listadas en la Tabla I; y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con por lo menos una de las secuencias correspondientes listadas en la Tabla I. En particular, en los Nanocuerpos de la invenéión, por lo menos la secuencia CDR3 se elige en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla I, y la secuencia CDRl o la secuencia CDR2 be elige en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDRl y CDR2, respectivamente, listadas en la Tabla! I. Preferentemente, en esta modalidad, la secuencia CDR restante presente se elige en forma adecuada del grupo de secuencias CDR que tienen por lo menos 80%, !i preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por i lo mehos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos una de las I secuencias CDR correspondientes listadas en la Tabla I; y/o del gjrupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con las secuencias CDR correspondientes listadas en la Tabla I. Incluso más preferentemente, en los Nanocuerpos de la invención, la totalidad de las tres secuencias CDRl, CDR2 CDR3 presentes se elige en forma adecuada del grupo que consiste de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respefctivamente, listadas en la Tabla I. También, generalmente, las combinaciones de las CDR listadas en la Tabla I (es decir, aquellas mencionadas en la misma línea en la Tabla I) se prefieren. De esta manera, se prefiere generalmente que, cuando una CDR en un Nanocuerpo de la invención sea una secuencia CDR mencionada en la Tabla I o se elija en forma adecuada del grupo de secue cias CDR que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lio menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, 2 o sblamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con del grupo de secuencias CDR que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la o las secuencias CDR que pertenecen a la misma combinación y/o del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o .-as diferencias en aminoácidos con la o las secuencias CDR que pertenecen a la misma combinación. Las otras preferencias indicadas en los párrafos anteriores también se ap.-ican a las combinaciones de las CDR mencionadas en la Tabla I. De esta manera, por medio de ejemplos no limitantes, un Nanocuerpo de la invención puede por ejemplo comprender una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl como se menciona en la Tabla I, una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia en aminoácidos con una de las secuencias CDR2 )^omo se menciona en la Tabla I (pero que pertenece a pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl como se menciona en la Tabla I; una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia en aminoácidos con una de las secuencias CDR2 como se menciona en la Tabla I (pero que pertenece a una combinación diferente) ; y una secuencia CDR3 que tiene más de 80 % de identidad de secue Incia con una de las secuencias CDR3 mencionadas en la Tabla) I (pero que pertenece a una combinación diferente) ; o (2) ujna secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl como se menciona en la Tabla I; una secuencia CDR2, y una de las secuencias CDR3 listadas en la Tabla I; o (3) una secuencia CDRl; una secuencia CDR2 que tiene más de 80% de identidad de se ¡cuencia con una de la secuencia CDR2 listada en la Tabla I; y una secuencia CDR3 que tiene 3, 2 o 1 diferí ncias en aminoácidos con la secuencia CDR3 mencionada en la i Tabla I que pertenece a la misma combinación que la secuencia CDR2. Algunos Nanocuerpos particularmente preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl como se menciona en la] Tabla I; una secuencia CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia CDR2 mencionada en la i Tabla I que pertenece a la misma combinación; y una secuencia CDR3 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia, con la secuencia CDR3 mencionada en la Tabla I que pertenece a la misma combinación; (2) una secuencia i CDRl; 'una CDR 2 listada en la Tabla. I y una secuencia CDR3 listada en la Tabla I (en la cual la secuencia CDR2 y secuencia CDR3 pueden pertenecer a combinaciones diferentes) . Algunos Nanocuerpos incluso más preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender: (1) una secuencia CDRl que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias CDRl como se menciona en la Tabla I; la secuencia CDR2 listada en la Tabla I que pertenece a la misma combinación; y una secuencia CDR3 mencionada en la Tabla I que pertenece a una combinación diferente; o (2) una s cuencia CDRl mencionada en la Tabla I; una secuencia CDR2 ue tiene 3, 2 o 1 diferencias en aminoácidos con la secuencia CDR2 mencionada en la Tabla I que pertenece a la misma combinación; y más de 80% de identidad de secuencia con la secuencia CDR3 listada en la Tabla I que pertenece a la misjma combinación diferente. ¡ Nanocuerpos particularmente preferidos de la invención pueden por ejemplo comprender una secuencia CDRl mencionada en la Tabla I, una secuencia CDR2 que tiene más de 80 % de identidad de secuencia con la secuencia CDR2 mencionada en la Tabla I que pertenece a la misma combinación; y la secuencia CDR3 mencionada en la Ta'oia I que pertenece a lo mismo. I En lo más preferido en los Nanocuerpos de la invenc-Lón, las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 presentes se eligen en forma adecuada de una de las combinaciones de secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente, listadas en la Tabla I. Preferentemente, cuando una secuencia CDR se elige! en forma adecuada del grupo de secuencias CDR que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más ¡preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como | se define en la presente) con una de las secuencias I CDR Mistadas en la Tabla I; y/o cuando una secuencia CDR se elige en forma adecuada del grupo que consiste de secuencias CDR que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las difer ncias en aminoácidos con una de las secuencias CDR listadas en la Tabla I: i) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (comoj se define en la presente) ; y/o j ii) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo j contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia CDR listada en la Tabla I. De acuerdo con una modalidad no limitante pero preferida de la invención, las secuencias CDR en los x l Nanocuerpos de la invención son como se define en lo anterjior y son también tales que el Nanocuerpo de la invenpión se une a vWF con una constante de disociación (KD) de 105 a 1012 moles/litro (M) o menor, y preferentemente 10"7 a 10~12 moles/litro ( ) o menor y más preferentemente 10"8 a 10"12 moles/litro (M) , y/o con una constante de asociación (KA) de por lo menos 10 M"1, preferentemente por lo menos 108 M_1, más preferentemente por 1o menos 109 M"1, tal como por lo menos 1012 M"';y en particular con una KD menor de 500 nM, preferentemente menor de 200 nM, más preferentemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Los valores de KD y KA del Nanocuerpo de la invención contra vWF pueden determinarse de una manera conocida per se, por ejemplo usando el ensayo descrito en la presente. Más generalmente, los Nanocuerpos descritos en la presente preferentemente tienen una const,ante de disociación con respecto a vWF que es como se descr.Lbe en este párrafo. i ¡ En otro aspecto, la invención se relaciona con un Nanocuerpo con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60 a 73 y SEQ ID NO's: 86 a 97 o del grupo que consiste de a partir de secuencias de aminoácidos que tienen más de 80%, preferentemente más de 90%, más preferentemente más de 95%, tal como 99% o más "identidad de secuencia" (como se define en li presente) con una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60 a 73 y SEQ ID NO's: 86 a 97, cuyas [secuencias de aminoácidos de mayor preferencia tienen secuencias de estructura base que son como se define además en Id siguiente bajo la descripción general de las secuencias de estructura base de los Nanocuerpos. De acuerdo con una modalidad específica, pero no limitante, las últimas secuencias de aminoácidos se han "humanizado", como se describe además en lo siguiente. j De mayor preferencia, los Nanocuerpos de la invención se eligen del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60 a 73 y SEQ ID NO's: 86 a 97, de los cuales los Nanoci.erpos "humanizados" de SEQ ID NO's: 86 a 97 pueden ser particularmente preferidos. I Nanocuerpos que son preferidos particulares de acuerdo con la invención son el Nanocuerpo 12B6 (SEQ ID NO: 62) y homólogos y variantes del mismo, y en particular variantes humanizadas del mismo. Algunos homólogos y i (humanizadas) variantes particularmente preferidas, pero no limitantes son por ejemplo los Nanocuerpos 12A2 (SEQ ID NO: 7i: 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73) y variantes humanizadas de los mismos, tales como 12B6H1 (SEQ ID NO 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6HJ1 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). Particularmente preferido en la invención es el Nanocuerpo 12A2 (SEQ ID NO: 71) y homólogos y variantes del mismot y en particular variantes humanizadas del mismo. Algunos homólogos y (humanizadas) variantes particularmente preferidas, pero no limitantes son por ejemplo los Nanocuerpos 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y 12A2H13 (SEQ ? NO: 94), de los cuales el Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID NO: 9(j)) se prefiere en particular. De esta manera, un aspecto preferido pero no limitante de la invención se relaciona con un Nanocuerpo contra, el Factor de Von Willebrand (vWF) , el Nanocuerpo consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente) , en las cuales a) CDRl comprende o consiste esencialmente de: ¡ - la secuencia de aminoácidos YNPMG; o í i - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o i solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos YNPMG; y b) CDR2 comprende o consiste esencialmente de: - la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o preferjentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o unas secuencias de aminoácidos que tienen solamente 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia de aminoacidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. En particular, la invención se relaciona con tal Nanocuerpo, en el cual: - CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuenjcia de aminoácidos YNPMG; o en el cual: - CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuenbia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o en el cual - CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. Por ejemplo, la invención se relaciona con tales Nanoctjerpos, en los cuales: - CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAE DGRVRTLPSEYTF; o en los cuales: - CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AISRT¿GSTYYPDSVEG; o en los cuales: - CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; y CDR3 comprende o esencialmente consiste de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF ! En un aspecto, la invención se relaciona con tal Nanoc?erpo, en el cual CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. La invención también se relaciona con variantes humanizadas de tal Nanocuerpo. Algunas sustituciones de i humanización preferidas, pero no limitantes se describirán en la presente, o serán claras para la persona experta al compajrar los Nanocuerpos no humanizados y humanizados correspondientes descritos en la presente. Algunas sustituciones de humanización particularmente útiles son una o más de aquellas presentes en las variantes humanizadas de 12A2 (como será claro para la persona experra a partir de una comparación de las secuencias de 12A2H|L (SEQ ID NO: 90) con las secuencias humanizadas correspondientes de 12A2H3 (SEQ ID NO. 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y 12A2H13 (SEQ ID NO: 94).
: Otro aspecto preferido pero no limitante de la invención se relaciona con un Nanocuerpo contra el Factor de Von Willebrand (vWF) , el Nanocuerpo consiste de 4 i regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regio es determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente), en las cuales: d) CDR 1 es: la secuencia de aminoácidos YNPMG; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos YNPMG; y e) CDR2 es - la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más prefeurentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; CDR3 es: la secuencia de aminoácidos AGVRAE DGRVRTLPSEYTF; o - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o unas secuencias de aminoácidos que tienen solamente 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia de aminoabidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. En particular, la invención se relaciona con tal Nanocuerpo, en el cual: - CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; o en el cual: s s s - CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y I I CDR3 ás la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o en los cuales: I - CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR2 e}s la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o en los cuales: CDR2 es la secuencia de aminoácidos AISRTGJGSTYYPDSVEG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos i AGVRAEDGRVRTLPSEYTF i i En un aspecto, la invención se relaciona con tal i Nanocuerpo, en el cual CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos AGVRAE¡DGRVRTLPSEYTF. I La invención también se relaciona con variantes humanizadas de tal Nanocuerpo. Algunas sustituciones de humanización preferidas, pero no limitantes se describirán en la Ipresente, o serán claras para la persona experta al comparar los Nanocuerpos no humanizados y humanizados correspondientes descritos en la presente. Algunas sustituciones de humanización particularmente útiles son una ¡o más de aquellas presentes en las variantes human:.zadas de 12A2 (como será claro para la persona experta a partir de una comparación de las secuencias de 12A2H!- (SEQ ID NO: 90) con las secuencias humanizadas correspondientes de 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 9-f); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). Los Nanocuerpos descritos en la presente pueden ser Nanocuerpos clase GLEW, Nanocuerpos clase "103 P, R o S" o "Nanocuerpos clase KERE" (todo como se describe en la presente) . En particular, los Nanocuerpos descritos en la presente pueden ser Nanocuerpos clase KERE, aunque la invención no se limita a lo mismo. En otro aspecto, la invención se relaciona con un I Nanoc?erpo el cual tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, O por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con por lo menos uno d¡e los Nanocuerpos del grupo que consiste de SEQ ID NO's (50-73 y SEQ ID NO's 86-97. En particular, la invención se relaciona con un Nanocuerpo el cual tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, © por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con por lo menos uno de los Nanocuerpos 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H-. (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H-J (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ]¡D NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). I Más en particular, la invención se relaciona con un Nahocuerpo el cual tiene por lo menos 80%, o por lo menos j 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con por lo menos uno de los Nanocuerpos 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o 12A21-113 (SEQ ID NO: 94) . Incluso más en particular, la invención se relaciona con un Nanocuerpo el cual tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con el Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID NO: 90) . i ! La invención también se relaciona con variantes humanizadas de tales Nanocuerpos. Algunas sustituciones de humanización preferidas, pero no limitantes se describirán en la presente, o serán claras para la persona experta al comparar los Nanocuerpos no humanizados y humanizados correspondientes descritos en la presente. Algunas sustituciones de humanización particularmente útiles son una |o más de aquellas presentes en las variantes I humanizadas de 12A2 (como será claro para la persona experta a partir de una comparación de las secuencias de 12A2HÚ. (SEQ ID NO: 90) con las secuencias humanizadas correspondientes de 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 9 ); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). La invención también se relaciona con un Nanocuerpo que se elige del grupo que consiste de los Nanocuerpos de SEQ ID NO's 60-73 y SEQ ID NO's 86-97. En particular, la invención se relaciona con un Nanocüerpo que se elige del grupo que consiste de los i Nanoc|?erpos 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NOÍ: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o l A2H13 (SEQ ID NO: 94) . ! Más en particular, la invención se relaciona con un Nanocuerpo que se elige del grupo que consiste de los i Nanociierpos 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); I 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). Un Nanocuerpo particularmente útil es el Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID NO:9?! ) • ¡ Los Nanocuerpos descritos en la presente I preferentemente tienen secuencias de estructura base que son como se describe posteriormente en la presente. Algunas secuencias de estructura base particularmente preferidas : FRI , FR2, FR3 y FR4, respectivamente) son aquellas del Nanocijierpo 12A2 y sus variantes humanizadas; y secuencias de estructura base que tienen por lo menos 80%, i preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de estructura base; y y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 Q solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de estructura base (en la cual cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de amijnoácidos; y/o en la cual la secuencia de aminoácidos preferientemente contiene sustituciones de aminoácidos y no más de 3 eliminaciones de aminoácidos o no más de 3 inserciones de aminoácidos) . Los Nanocuerpos contra vWF cón tales secuencias de estructura base de un aspecto adicional de la invención. En particular, la invención se relaciona' con un Nanocuerpo contra vWF, en el cual FRl es SEQ ID NO: 140; FR2 esi SEQ ID NO: 192; FR3 es SEQ ID 244; y FR4 es SEQ ID NO: 296; o secuencias de estructura base que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso ás preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de estructura base; y y/o del grupo que consiste de secuer.cias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o Ds diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de estructura base (en la dual cualquier sustitución de aminoácidos ee preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos; y/o en la cual la secuencia de aminoácidos preferentemente contiene sustituciones de aminoácidos y no más ce 3 eliminaciones de aminoácidos o no más de 3 inserciones de aminoácidos) . j Más en particular, la invención se relaciona con un Naiocuerpo contra vWF, en el cual FRl es SEQ ID NO: 140; FR2 e? SEQ ID NO: 192; FR3 es SEQ ID 244; y FR4 es SEQ ID NO: 2^6. i En otro aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende o consiste esencialmente de por lo menos un Nanocuerpo contra vWF como se define en la presente. Tales polipéptidos son referidos también en la presente como "polipéptidos de la invención" y pueden ser como se describe además a continuación y/o como se describe en gejneral en WO 02/062551 para los Nanocuerpos descritos i en lp misma, y pueden por ejemplo ser polipéptidos multivalentes o polipéptidos multiespecíficos, nuevamente como se describe además a continuación. | Preferentemente, un polipéptido de la invención es bivalente o trivalente (es decir, que comprende dos o tres Nanocuerpos de la invención, respectivamente, enlazados de manera opcional mediante uno o dos enlazadores como jse define en la presente, respectivamente) o un i polipéptido multiespecífico, que comprende uno o dos, y preferentemente dos, Nanocuerpos de la invención y por lo menos | un Nanocuerpo dirigido contra una proteína sérica, y en particular contra una proteína sérica humana, tal como contra albúmina sérica humana. En unas modalidades preferidas, pero no | limitantes, los Nanocuerpos de la invención presentes en los pflipéptidos de la invención se eligen del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60 a 73 y SEQ ID NO's: 86 a 97, y en particular de los Nanocuerpos "humanizados" de SEQ ID NO's 8 6 a 97. Los Nanocuerpos contra albúmina sérica humana presentes en los polipéptidos de la invención son de preferencia como se define en la presente, y se eligen más preferentemente del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 107 a 121, y en particular de los Nanocuerpos "humanizados" contra albúmina sérica humana de SEQ ID NO's 114-121.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de polipéptidos de la invención son los polipéptidos de SEQ ID NOfs: 74 a 82 y los polipéptidos de SEQ ID NO's 98-106. Otros polipéptidos de la invención pueden por ejemplo elegiirse del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen más de 80%, preferentemente más de 90%, más preferentemente más de 95%, tal como 99% o más "identidad de secuencia" (como se define en la presente) con una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 74 a 82 y/o SEQ ID NO's 98 a 106, en las cuales los i Nanocierpos comprendidos dentro de las secuencias de aminoácidos son de preferencia como se define en la preser.te . De acuerdo con un aspecto de la invención, los i Nanociierpos, proteínas y polipéptidos descritos en la presente esencialmente no tienen influencia sobre la escisi[ón de ULvWF por ADAMTS-13. En particular, cuando los Nanocuerpos, proteínas y polipéptidos descritos en la prese?te se usan a las dosis descritas en la presente, la escisión de ULvWF por ADAMTS-13 (in vivo en la administración y/o cuando se mide usando un ensayo adecuando, tal como el ensayo descrito en la presente), esencialmente no reduce o inhibe la escisión de ULvWF por ADAMTS¡-13, es decir, por no más de 50%, preferentemente no más de 20%, incluso más preferentemente no más de 10%, tal como ráenos de 5% o esencialmente en lo absoluto) . De esta manera, un aspecto adicional de la invención se relaciona con uiji Nanocuerpo, proteína o polipéptido, y en particular un Nanocuerpo, proteína o polipéptido como se describe en la presente, que esencialmente no reduce o inhibe la escisión de ULvWF por ADAMTS-13: I En otro aspecto, la invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención. Tal ácido nucleico tambi n será referido en lo siguiente como un "ácido nucleico de la invención" y puede por ejemplo estar en la forma de una construcción genética, como se define en la presente . j En otro aspecto, la invención se relaciona con un análojga a los huéspedes y células huésped descritas' en WO 02/062551, pero que expresan o son capaces de expresar un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención y/o contener un ácido nucleico como se describe en lal presente . La invención además se relaciona con un producto o composición que contiene o comprende un Nanocuerpo de la invención, un polipéptido de la invención; y/o un ácido nucleico de la invención. Tal producto o composición puede por ejemplo ser una composición farmacéutica (como describe en lo siguiente) o un producto o composición para uso diagnóstico (como se describe también en lo siguiente) . Tal producto o composición también pueden ser análogos a los productos y composiciones descritos en WO 02/062551, pero que cbntienen o comprenden un Nanocuerpo de la invención, un polipéptido de la invención o un ácido nucleico de la invención. La invención además se relaciona con métodos para preparar o generar los Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones como se describe en la presente, cuyos métodos son como se describe además en lo siguiente. Además, generalmente, los Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones descritas en la presente también pueden prepararse y usarse en una manera análoga a la maiiera descrita en WO 02/062551 La invención además se relaciona con aplicaciones y usoS de los Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones anteriores descritos en la presente, cuyas aplicaciones y usos incluyen, pero no se limitan a, las aplicaciones y usos descritos a continuación y/o los usos y aplicaciones adiciónales para Nanocuerpos contra vWF y/o para polipéptidos que contienen los mismos en WO 02/062551. Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención llegarán a aclararse a partir de la descripción adicional a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS j La Figura 1: Enlace de nanocuerpos a vF en ELISA. ' La Figura 2: Alineación de secuencias de nanocuerpos homólogos 12A5. Figura 3: Alineación de secuencias del nanocuerpo homólogo 12B6. Figura : Enlace del nanocuerpo homólogo 12A5 a vWF en BIACORE. Figura 5: Enlace de nanocuerpos homólogos 12B6 a vWF eiji BIACORE. Figura 6: Adhesión de plaquetas en diferentes concentraciones de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5. Figura 7a. Enlace en ELIA a vWF para el nanocuerpo 12B6 después del calentamiento a temperaturas incrementadas . Figura 7b: Enlace en ELISA a vWF para el nanociiierpo 12A2 después del calentamiento a temperaturas i incrementadas.
Figura 7c: Enlace en ELISA a vWF para el nanoc?erpo 12A5 después del calentamiento a temperaturas incrementadas . Figura 8a: Enlace de vWF a partir de diferentes espec:.es al nanocuerpo 12B6 en ELISA. Figura 8b: Enlace de vWF a partir de diferentes especies a 1 nanocuerpo 12A2 en ELISA. Figura 8c: Enlace de vWF a partir de diferentes especies al nanocuerpo 12A5 en ELISA. Figura 9: Enlace de nanocuerpos 12B6 bivalentes a vWF e? BIACORE. Figura 10: Enlace de nanocuerpos 12A2 bivalentesa a vWF en BIACORE. Figura 11: Enlace de nanocuerpos 12A5 bivalentes I a vWF en BIACORE. Figura 12a: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos i 12B6-Ba-12B6 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 12b: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12B6-(3S9-12B6 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. I Figura 12c: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12B6-?S30-12B6 bivalentes después del calentamiento a tempetaturas incrementadas. Figura 13a: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12A2-3a-12A2 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 13b: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos i 12A2-GS9-12A2 bivalentes después del calentamiento a i I temperaturas incrementadas. i Figura 13c: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12A2-GS30-12Á2 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 14a: Enlace en ELISA a vWF. de nanocuerpos 12A5-3a-12A5 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 14b: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12A5-GS9-12A5 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas . ¡ Figura 14c: Enlace en ELISA a vWF de nanocuerpos 12A5-GS30-12A5 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas. i Figura 15: Alineación de secuencias del I i nanocuerpo 12B6 humanizado. ^ Figura 16: Enlace en ELISA a vWF del tipo silvestre y nanocuerpo 12B6 humanizado. i Figura 17: Alineación de secuencias del nanocjuerpo 12A2 humanizado. Figura 18a: Enlace en ELISA a vWf de nanocuerpos 12A2H¡1 humanizados, después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 18b: Enlace en ELISA a vWf de nanocuerpos 12A2HÍ humanizados, después del calentamiento a temperaturas incrementadas. i ¡ Figura 18c: Enlace en ELISA a vWf de nanocuerpos 12A2H.-3 humanizados, después del calentamiento a temperaturas incrementadas. Figura 18d: Enlace en ELISA a vWf de nanocuerpos 12A2H humanizados, después del calentamiento a temperaturas incrementadas. I Figura 19: Enlace en ELISA a vWF a nanocuerpos 12A2 humanizados. Figura 20: Alineación de secuencias del nanocuerpo 12A5 humanizado. Figura 21: Enlace en ELISA a vWF de tipo silvestre y nanocuerpo 12A5 humanizado. Figura 22. Alineación de nanocuerpos seleccionados para forma bivalente. Figura 23: Adhesión de plaquetas a diferentes concentraciones de nanocuerpos bivalentes (humanizados) . Figura 24: Patrón de flujo sanguíneo para modelo Folts en mandriles. Figura 25: Estructura experimental para modelo Folts en mandriles. Figura 26: Estudio de Folts del grupo control de mandriles. El flujo sanguíneo en función de tiempo se muestra, indicando las CFRs (representativas de 2 experjimentos independientes). Figura 27: Estudio de Folts del grupo de mandriles tratado con Aspegic. El flujo sanguíneo en función del tiempo se muestra, indicando las CFRs (representativas de 3 experimentos independientes) . Figura 28: estudio del grupo de mandriles tratado con P^eparina. El flujo sanguíneo en función de tiempo se muestta, indicando las CFRs (representativas de 3 experimentos independientes) . Figura 29: Estudio de Folts del grupo de mandriles tratados con Plavix. El flujo sanguíneo en función de tiempo se muestra, indicando las CRFs (representativas de 4 experimentos independientes) . j Figura 30: Estudios de Folts del grupo de mandriles tratados con Reopro. El flujo sanguíneo en función del tiempo se muestra, indicando las CFRs (representativas de 3 experimentos independientes) . j Figura 31: Estudio de Folts del grupo de mandriles tratados con ALX-0081 (SEC de ID NO: 98). El flujo) sanguíneo en función de tiempo se muestra, indicando las i CFRs (representativas de 8 experimentos independientes) . | Figura 32: Lectura de flujo de mandriles ID 6 tratados con una combinación de Aspegic, Heparina , Plavix y ALX-0081. Figura 33: Promedio de pérdida de sangre relativa en función de diferentes dosis de Plavix, Reopro y ALX- 0081. Figura 34: Longitud promedio de CFRs y cantidad relativa promedio de pérdida de sangre para animales tratados con Plavix en función de dosis de fármaco incrementada. Figura 35: Longitud promedio de CFRs y cantidad relativa promedio de pérdida de sangre para anima] es tratados con Reopro en función de dosis de fármaco incrementado . Figura 36: Longitud promedio de CFRs y cantidad relativa promedio de pérdida sangre para animales tratados con AILX-0091 en función de dosis de fármaco incrementada. Figuras 37a-37i: gráficas de agregación inducida por ristocetina (%, Q) y longitud de CFRs (s, 0) para diferentes mandriles identificados como mandril 16-24 respectivamente, tratados con ALX-0081 en función de todas las dosis. Figura 38a-y 38b son las concentraciones de ALX-0081 en plasma contra la longitud de las CFRs para todos los mmandriles tratados con ALX-0081. Figura 39: Concentración de ALX-0081 en plasira contra cantidad relativa de pérdida de sangre a partir de gazas ¡ Figura 40: Estudio de Folts del mandril 1 tratados con ALX-0081 y vWF. El flujo sanguíneo en función de tiempo se muestra, indicando las CFRs. Figura 41: cadenas (flechas) de plaquetas adheridas en UlvWF secretadas a partir de células endoteliales estimuladas. j Figura 42: Ausencia de cadenas cuando se dispersan plaquetas sobre UlvWF en la presencia de ALX-0081. Figura 43: Experimento de perfusión de control: cadenas de UlvWF (panel A, indicado con flechas rojas) y durante la perfusión (panel B) con plasma normal. En panel B, las cadenas UlvWF que se escinde por ADAMTS-13 se indic¡an con flechas azules y rojas para una pieza de una cadena de UlvWF que se impulsa o para cadenas de UlvWF grandemente escindedas respectivamente. 1 Figura 44: Experimento de perfusión en presencia debi o a la escisión del UlvWF por ADMTS-13. Figura 45: Escisión de "A1-A2-A3 p006Fr ADAMTS-12 prese Úte en plasma líquido normal (NPP) en la ausencia y presencia de ALX-0081.
DESCRIPCIÓN DETALLADA D? LA INVENCIÓN Lo anterior y otros aspectos y modalidades de la invención llegarán a aclararse a partir de la descripción adicifnal a continuación, en la cual: a) A menos que se indique o se defina de otra manera, todos los términos usados tienen su significado i usual I en la técnica, el cual será claro para la perscna por ejemplo a los manuales et al, "Molecular Cloning: A Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., " Curren t protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Roitt et al., " Immunology" (dth.'Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); y Janeway et al Imm unobiology" . t Ed. ) , Garland Science Publibhing/Churchill Livingstone, New York (2005), así como i tambijln a la técnica antecedente general citada en lo anterior; i b) A menos que se indique de otra manera, el térmi¡no " secuencia de inmunoglobulina" - si se usa en la presejnte para referirse a un anticuerpo de cadenas pesadas I I o a ún anticuerpo convencional de 4 cadenas - se usa como un tétmino general para incluir el anticuerpo de longitud completa, las cadenas individuales del mismo, así co o tambi n todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluyendo pero sin limitarse a dominios o fragmentos de unión a antígeno tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente) . Además, el término " secuencia" como se usa en la presente (por ejemplo en términos como "secuencia de injnunoglobulina", "secuencia de anticuerpo", "secuencia de dominio variable", "secuencia VHH" O "secuencia de protelna") , generalmente debe entenderse que incluye la secuencia relevante de aminoácidos así como también secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican los mismos, a menos que el contexto requiera una interpretación mas limitada; ' c) A menos que se indique de otra manera, todos claro para la persona experta. Se hace referencia por ejempjlo nuevamente a los manuales estándar, a la técnica antecedente general referida en lo anterior y a las referencias adicionales citadas en la misma; ' d) Los residuos de aminoácidos se indicarán de acuerjdo con el código estándar de aminoácidos de tres letrals o de una letra, como se menciona en la Tabla I; e) Para los propósitos de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de " iden tidad de i secuencia" entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunaa secuencia de nucleótidos puede calcularse al dividir [el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos en las posicj.ones correspondientes en la segunda secuencia ae nucle?tidos] entre [el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos] y multiplicar por [100%], en lc cual cada eliminación, inserción, sustitución o adicic-n de un nucleótido en la segunda secuencia de nuclec)tidos - en comparación con la primera secuencia de nucleótidos - se considera como una diferencia en un solo nucle?tido (posición) . Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos puede calcularse usando un algoritmo de i computación conocido para alineación de secuencias tal como NCBI Elast v2.0, usando ajustes estándar. Algunas otras técnicas, algoritmos de computación y ajustes para determinar el grado de identidad de secuencia se describen por ejemplo en WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/493J85 y GB 2 357 768-A. Usualmente, para el propósito de determinar el porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias de nucleótidos de acuerdo con el método de cálculo detallado anteriormente, la secuencia de nucleótidos con el numeró más grande de nucleótidos se tomará como la 'primera" secuencia de nucleótidos, y la otra secuencia de nucleftidos se tomará como la "segunda" secuencia de nucleftidos; f) Para los propósitos de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de " identidad de secuen cia" entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunfa secuencia de aminoácidos puede calcularse al divid r [el número de residuos de aminoácidos en la primera secueñ cia ' de aminoácidos que son idén ticos a los residuos de am inoácidos en las posi ciones correspondien tes en la segunda secuencia de aminoácidos] entre [el número total de nucle ítidos en la primera secuencia de aminoácidos] y multi icar por [100%] , en lo cual cada eliminación, ínsercion, sustitución o adición de un residuo de aminoacido en la segunda secuencia de aminoácidos - en comparación con la primera secuencia de aminoácidos - se considera como una diferencia en un solo residuo de aminoácido (posición) , es decir, como una "diferencia en aminoácidos" como se define en la presente. Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede calcularse usando un algoritmo de computación conocido, tales como aquellos mencionados en lo anterior para determinar el grado de identidad de secuencia para secuencias de nucleótidos, nuevamente usando ajustes estándar.
Usualmente, para el propósito de determinar el porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos de acuerdo con el método de cálculo detal ado anteriormente, la secuencia de aminoácidos con el I númerf más grande de residuos de aminoácidos se tomará como I la "primera" secuencia de aminoácidos, y la otra secuencia de aminoácidos se tomará como la "segunda" secuencia de aminoácidos . I También, para determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, la persona experta puede tomar en cuenta las llamadas sustituciones "conservativas" de aminoácidos, las cuales pueden describirse generalmente como sustituciones de aminoácidos I en las cuales un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y el cua l tiene poca o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad o otras propiedades biológicas dei polipéptido. Tales sustituciones conservativas de aminoácidos se conocen bien en la técnica, por ejemplo de WO 04/037999, GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 y WO 01/093:00; y tipos y/o combinaciones (preferidos) de tales sustituciones pueden seleccionarse sobre la base de las enseñanzas pertinentes de WO 04/037999 así como también WO 98/49185 y de las referencias adicionales citadas en las mismas Tales sustituciones conservativas preferentemente son sustituciones en las cuales un aminoácido dentro de los i siguientes grupos (a) - (e) se sustituye por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (a) residuos alifátjicos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, r?hr, Pro y Gly; (b) residuos polares, negativamente cargados y sus amidas (sin carga) : Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares, positivamente cargados: His, Arg y Lys; . (d) residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, ' lie, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. t Sustituciones conservativas particularmente preferidas son como sigue: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; lie en Leu o en Val; Leu en lie o en Val; Lys en Arg, en Gln o en GliJi; Met en Leu, en Tyr o en lie; Phe en Met, en Leu o I en TyX Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; y/o Phe eri Val, en lie o en Leu. Cualesquiera sustituciones de aminoácidos I aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también pueden basarse en el análisis de las frecuencias de variaciones de aminoácidos entre proteínas homologas de especijes diferentes desarrollado por Schuiz et al., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, en los análisis de potenciales de formación de estructura desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv . Enzymol . , 47: 45-149, 1978, y en el análisis de patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrollado por Eisenrjerg et al., Proc . Nad. Acad Sci . USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec . Biol . 157 :' 105-132 , 198 1, y Golpman et al., Ann . Rev. Biophys . Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporados en la presente en su totalidad para Referencia. Información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanocuerpos se da en ia descripción en lo siguiente y en la técnica antecedente la presente) en su longitud total; h) cuando se comparan dos secuencias de ammoc.cidos, el término "diferencia en aminoácidos" se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un solo residuo de aminoácido en una posición de ?a primera secuer.cia, en comparación con la segunda secuencia; entendíendosé que dos secuencias de' aminoácidos pueden conter er una, dos o más de tales diferencias en aminoá cidos; i) una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de anmdinoácidos se considera que está " (en) (forma) esencialmen te aislada" - por ejemplo, en comparación con su fuente1 biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo a partir del cual se ha obtenido - cuando se ha separando de por lo menos otro componente con el cual usualpiente se asocia en la fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente o mac±omolécula biológica o por lo menos un contaminante, impurejza o componente menor. En particular, una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos se considera esencialmente aislada" cuando se ha purificado por lo menos 2 veces, en particular por lo menos 10 veces, más en particul-ar por lo menos 100 veces, y hasta 1000 veces o mas . Una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos que se encuentra "en forma esencialmente aisladla" de preferencia es esencialmente homogénea, caando se determina usando una técnica adecuada, tal como una técniqa cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en geles de poliacrilamida; j) El término "dominio" como se usa en la presenlte generalmente se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo, y en particular a una región globular de un anticuerpo de cadenas pesadas, o a un polipeptido que consiste esencialmente de tal región globular. Usualmente, tal dominio comprenderá bucles de péptidos (por ejemplo 3 o 4 bucles de péptidos) estabilizados, por ejemplo, como una lámina o por enlaces disulfiuro , k) El término ^determinante antigénico' se refierle al epítopo en el antígeno reconocido por la molécula de unión a antígeno (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención) y más en particular por el sitio de unión a antígeno de la molécula. Los términos determinante antigénico" y "epítopo" también pueden usarse de manera intercambiable en la presente. 1) Una secuencia de aminoácidos (tal como • un Nanocu¡erpo, un anticuerpo, un polipéptido de la invencicn, o generalmente una proteína o polipéptido de unión a antígeno o un fragmento de los mismos) que puede unirse a, que tiene afinidad por y/o que tiene especificidad por un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína específicos (o por al menos una parte, fragmento o epítopo de les mismos) se dice que está "contra" o "dirigido contra" el determinante antigénico, epítopo, antígeno o protelna. m) El término "especificidad" se refiere al i numere- de tipos diferentes de antígenos o determinantes antigénicos a los cuales una molécula de unión a antígeno o molécula de proteína de unión a antígeno particular (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención) pude unirse. La especificidad de una proteína de unión a antígejno puede determinarse con base en afinidad y/o avidez . La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una 'proteína de unión a antígeno (KD) , es una medida para la I fuerzaj de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: a menor valor de la KD, mayor la fuerza de unión entre un i determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno I (alternativamente, la afinidad también puede expresarse I como la constante de afinidad (KA) , la cual es 1/KD) . Como será claro para la persona experta (por ejemplo sobre la base de la descripción posterior en la presente) , la afinidad pueden determinarse de una manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión ¡ a antígeno (tal como un Nanocuerpo o polipéptido de la injvención) y el antígeno pertinente. La avidez se relaciona con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno y el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno. Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tales como los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención) se unirán con una Constante de disociación (KD) de 10~5 a 10~12 mmoolleess//litro (M) o menor, y preferentemente 10"7 a 10"12 moles/litro (M) o menor y más preferentemente 10"8 a 1012 moles/litro, y/o con una constante de asociación (KA) de por lo merlos 107 M"1, preferentemente por lo menos 108 M"1, más preferentemente por lo menos 109 M"1, tal como por lo menos i 1012 M11. Cualquier valor de KD mayor de 10"4 M se considera generalmente que indica unión inespecífica . Preferentemente, un Nanocuerpo o polipéptido de la invención se unirá al antígeno deseado con una KD menor de 500 nM, preferentemente menor de 200 nM, más preferentemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera conocida per se, incluyendo, por ejemplo, i análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RÍA) , inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición tipo interdalados, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica. n) como se describe además a continuación, la secuen(cia y estructura de los aminoácidos de un Nanocuerpo puede considerarse - sin embargo sin limitarse a lo mismo -que se comprende de cuatro regiones de estructura base o 'FR", las cuales son referidas en la técnica y a contiguación como "Región de estructura base 1" o " FRl" ; como Región de estructura base 2" o" FR2" ; como "Región de estructura base 3" o " FR3" ; y como "Región de es tructura ¿ase o " FR4" , respectivamente; cuyas regiones de estructura base se interrumpen por tres regiones determinantes de complementariedad o "CDR", las cuales son referídas en la técnica como "Región Determinante de Complemen tariedad 1" o " CDRl" ; como "Región Determinan te de Complemen tariedad 2 " o " CDR2" ; y como "Región Determinan te de Complemen tariedad 3" o XDR3" , respectivamente; o como también se describe además continuación, el número total de residuos de aminoácidos en un Nanocuerpo puede encontrarse en la región de 110-120, preferentemente es 112-115, y de mayor preferencia es 113. Debe sin embargo observarse que partes, fragmentos o análogos (como se describe además a continuación) de un Nanocuerpo no se limitan particularmente en cuanto a su i longitud y/o tamaño, en la medida en que tales partes, I fragmentos o análogos reúnan los requerimientos posteriores delineados a continuación y sean también preferentemente I adecuados para los propósitos descritos en la presente; p) los residuos de aminoácidos de un Nanocuerpo se numeran de acuerdo con la numeración general para dominios VH dada por Kabat et al. ("Seguence of proteins of immunc logí cal in terest" , US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91) , cuando se aplica a dominios VHH de Camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, referido en lo anterior (véase por ejemplo la Figura 2 de la referencia) . De acuerdo con esta numeración, FRl de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDRl de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-36, FR2 de un Nanocuerpo comprende los aminoácidos en las posiciones 36- 49, CDR2 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66- 94, CDR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113. [A este respecto, debe observarse que -como tien se conoce en la técnica para dominios VH y para dominips VHH - el número total de residuos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no correspondes al número total de residuos de aminoácidos indicado por la numeración Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con lf numeración Kabat pueden no ocuparse en la secuencia real, ¡ o la secuencia real puede contener más residuos de aminoácidos que el número permitido por la numeración Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración de acuerc.o con Kabat puede o puede no corresponder a la numeración real de los residuos de aminoácidos en la secuencia real. Generalmente, sin embargo, puede decirse que, de acuerdo con la numeración de Kabat y sin importar el número de residuos de aminoácidos en las CDR, la posición 1 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FRl y viceversa, la posición 36 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceve'rsa, la posición 66 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FR3 y viceversa, y la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inició de FR4 y viceversa.]. Métodos alternativos para numerar los residuos de ammoai!jcidos de dominios VH, cuyos métodos también pueden i aplicarse de una manera análoga a dominios VHH de Camélidos y a Nanocuerpos, son el método descrito por Chothia et al. i (Na ture 342, 877-883 (1989)), la llamada "defini dor de I AbM" y1 la llamada " definición de conta cto" . Sin embargo, en la prjesente descripción, reivindicaciones y figuras, la numeración de acuerdo con Kabat cuando se aplica a dominios VHH por Riechmann y Muyldermans se seguirá, a menos que se indique de otra manera; y q) las Figuras, Listado de Secuencias y la Parte Experimental/Ejemplos se dan solamente para ilustrar además la invención y no deben interpretarse o entenderse como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones anexas de ninguna manera, a menos que se indique explícitamente de otra manera en la presente. Para una descripción general de anticuerpos de cadenas pesadas y los dominios variables de los mismos, se hace referencia entre otras cosas las referencias siguientes, las cuales se mencionan como técnica antecedente general: WO 94/04678, WO 95/04079 y WO 96/34103 de la Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507; WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO i 03/055527 del Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB) ; WO 03/050531 de Algonomics N.V. y solicitante; WO 01/90190 por el National Research Council de Canadá; WO 03/025020 (= EP 1 433 793) por el Institute of Antibodies; así como también WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 por el solicitante y las solic tudes de patente publicadas además por el solic. tante; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 3(39(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein A996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; ¡3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol . 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhoúch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J.
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Biol. 2005 Apr 21; [publicación-E previa, a la impresión] Como se menciona en lo anterior, la invención en generó.1 se relaciona con Nanocuerpos dirigidos contra vWF, así como también con polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más de tales Nanocuerpos, que bueden usarse para los propósitos profilácticos, comprenden tales Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos o células huésped. ' En general, debe observarse que el término Nanocúerpo como se usa en la presente en su sentido más amplíe- no se limita a una fuente biológica específica o a un método específico de preparación. Por ejemplo, como se discutirá en mayor en lo siguiente, los Nanocuerpos de la invención pueden obtenerse (1) al aislar el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada que se presenta en la i naturalleza; (2) por la expresión de una secuencia de nucledtidos que codifica un dominio VHH que se presenta en la naturaleza; (3) por "humanización" (como se describe en lo sijguiente) de un dominio VHH que se presenta en la naturaleza o por la expresión de un ácido nucleico que codifica tal dominio VHH humanizado; (4) por "camelización" (como se describe en lo siguiente) de un dominio VH que se presenta en la naturaleza a partir de cualquier especie anima.., en particular una especie de mamífero, tal como de un se:: humano, o por la expresión de un ácido nucleico que codif:.ca tal dominio VH camelizado; (5) por "camelización" de un "anticuerpo de dominio" o "Dab" como se describe por Ward et al (supra) , o por la expresión de un ácido nucleico que codifica tal dominio VH; (6) usando técnicas sintéticas o semi-sintéticas para preparar proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos; (7) al propagar un ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo usando técnicas para síntesis de ácidos nucleicos, seguido por la expresión del ácido nucleico obtenido de esta manera; y/u (8) por cualquier combinación de lo anterior. Métodos y técnicas adecuados para realizar lo anterior serán claros para la persona experta con base en la descripción en la presente y por ejemplo, al incluir los métodos y técnicas descritos en mayor detalle a continuación. i Sin embargo, de acuerdo con una modalidad especifica, los Nanocuerpos de la invención no tienen una secuencia de aminoácidos que es exactamente la misma que (es decir, que un grado de identidad de secuencia de 100% con) 'la secuencia de aminoácidos de dominio de un dominio VH que se presenta en la naturaleza, tal como en la I secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se presenta en la naturaleza de un mamífero, y en particular de un ser humane} . ¡ Una clase particularmente preferida de Nanocuerpos de la invención comprende Nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoá.cidos de un dominio VHH que se presenta en la naturaleza, pero que se ha "humanizado", es decir, al reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la secuencia VHH que se presenta I en le. naturaleza por uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan en la o las posiciones correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado en lo anterior) . Esto puede realizarse de una I manera conocida per se, que será clara para la persona experta, por ejemplo, sobre la base de la descripción posterior en lo siguiente y la técnica anterior sobre humanización referida en la presente. Una vez más, se debe observjar que tales Nanocuerpos humanizados de la invención I I pueden' obtenerse de cualquier manera adecuada conocida per se (es, decir, como se indica bajo los puntos (l)-(8) en lo i anteri'or) y de esta manea no se limita estrictamente a polipéptidos que se han obtenido usando un polipéptido que comprende un dominio VHH que se presenta en la naturaleza como ún material de inicio. Otra clase particularmente preferida de Nanocúerpos de la invención comprende Nanocuerpos con una secuer.cia de aminoácidos que corresponde con la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se presenta en la naturaleza que se ha "camelizado", es decir, al reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se presenta en la naturaleza de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan en la o las posiciones correspondientes en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de una manera conocida per se, que será clara para la persona experma, por ejemplo, sobre la base de la descripción posterior en lo siguiente. Se hace referencia también a WO 94/046|78. Tal camelización puede presentarse prefesencialmente en las posiciones de los aminoácidos los cuales! se presentan en la interconexión VH-VL y en los llamadjos residuos distintivos de Camélidos (véase por ejempllo también WO 94-04678), como se menciona también lo i siguiente. De preferencia, el dominio o secuencia VH que se usa como un material de inicio o punto de inicio para generalr o diseñar el Nanocuerpo camelizado de preferencia es una; secuencia VH de un mamífero, de más preferencia la secuencia VH de un ser humano. Sin embargo, debe observarse que tales Nanocuerpos camelizados de la invención pueden obtenerse de cualquier manera adecuada conocida per se (es decir, como se indica bajo los puntos (l)-(8) en lo anterior) y de esta manera no se limitan estrictamente a dominio VH que se presenta en la naturaleza, respectivamente, y entonces cambiar, de una manera conocida per sel, uno o más codones en la secuencia de nucleótidos de manera1 que la nueva secuencia de nucleótidos codifique un Nanocúerpo humanizado o camelizado de la invención, entonces expresar la secuencia de en este modo en una manera conocida per se de manera que se proporcione el Nanocuerpo deseado i de la invención. Alternativamente, con base en la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH O dominio VH que se presenta en la naturaleza, respectivamente, la secuencia de aminoácidos de Nanocuerpo humanizado o camelizado de la invención, respectivamente, puede diseñarse y sintetizarse entonces de nuevo usando técnicas para síntesis de péptidos conocidas per se. También, con base en la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un dominio VHH o domin:-o VH que se presenta en la naturaleza, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que codifica el Najnocuerpo humanizado o camelizado de la invención, respectivamente, puede diseñarse y sintetizarse entonces de nuevo usando técnicas para síntesis de ácidos nucleicos conocidas per se, después de lo cual la secuencia de nucleótidos obtenida de este modo puede expresarse en una manera conocida per se de manera que se proporcione el Nanociierpo deseado de la invención. I Otras formas y técnicas adecuadas para obtener Nanocuerpos de la invención y/o secuencia de nucleótidos y/o ácidos nucleicos que codifiquen los mismos, iniciando de (la secuencia de aminoácidos de) dominios VH o de preferencia dominios VHH que se presentan en la naturaleza y/o la.s secuencias de nucleótidos y/o secuencias de ácidos nuclei os que codifiquen los mismos que serán claros a partir1 de la persona experta, y pueden por ejemplo comprehder la combinación de una o más secuencias de aminoácidos y/o secuencias de nucleótidos de dominios VH que se! presentan en la naturaleza (tal como uno o más FR y/o CDp.) con una o más una o más secuencias de aminoácidos y/o secuencias de nucleótidos de dominios VHH que se presentan en la naturaleza (tal como uno o más FR o CDR) de una manera adecuada de manera que se proporcione (una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifiquen) un Nanocuerpo de la invención. De acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante del aspecto de la invención, un Nanocuerpo en su sentido más amplio puede definirse generalmente como un polipéptido que comprende: , a) una secuencia de aminoácidos que se comprende de ctuatro regiones/secuencias de estructura base interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de complementariedad, en las cuales el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat es Q; x j y/o: i b) una secuencia de aminoácidos que se comprende de duatro regiones/secuencias de estructura base i interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de complementariedad, en las cuales el residuo de aminoácido i en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat es E y en las cuales el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat es una R; | y/o: \ - c) una secuencia de aminoácidos que se comprende de cµatro regiones/secuencias de estructura base interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de complementariedad, en las cuales el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste de R y S . De esta manera, en un primer aspecto preferido, pero ho limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener ¡la estructura ¡ FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 i i en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual i CDRl á CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual i i) el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdp con la numeración Kabat es Q; ¡ y/o en la cual : i | ii) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdó con la numeración Kabat es E y en la cual el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat es una R; i I y/o en la cual: j iii) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de P, R y S, y se elige en particular del grupo que c nsiste de R y S; y en la cual: I y ' iv) CDR 1 es una secuencia de aminoácidos sue se elige | el grupo que consiste de las siguientes secuencias I de aminoácidos: NYGMG [SEQ ID NO: 15] SYTLG [SEQ ID NO: 16] NYNMG [SEQ ID NO: 17] SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG [SEQ ID NO: 20] IGTMG [SEQ ID NO: 21] YNPMG [SEQ ID NO: 22] | o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, inclusp más preferentemente por lo menos 99% de identidad de sec encia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual I (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lf o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con uia de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como !se define en la presente); y/o ¡ (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo | contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lal o las secuencias de aminoácidos anteriores; I y en la cual: j v) CDR 2 es una secuencia de aminoácidos que se i elige |del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23] GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24] ¡ TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25] i SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26] ! TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27] i AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28] I TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO: 29] I TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 30] AISRTGGSTYYARSVEO [SEQ ID NO: 31] AISRTGGSTYYPDSVEO [SEQ ID NO: 32] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es I preferjentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo i contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; j y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoájcidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) I con urta de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se defíne en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente I sólo 'contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; ! y en la cual: í | vi) CDR 3 es una secuencia de aminoácidos que se elige ¡ del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos : QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36] VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42] AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43] o del grupo que consiste de secuencias de aminoábidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente i por I menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secaencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (comoise define en la presente); y/o I (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimir.aciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la; o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con ur.a de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: | (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores. Preferentemente, en los Nanocuerpos de la invención: i - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) NYGMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, irás preferentemente por lo menos 95%, incluso más i preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia i (como l se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; i entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) SISWSqTYTAYSDNVKG; '(2) secuencias de aminoácidos que tienen por lp menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoálcidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como i se define en la presente) con la secuencia de aminoá!cidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) QSRYRS!NYYDHDDKYAY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por l? menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más ¡ preferjentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como ; se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" i (como I se define en la presente) con la secuencia de i aminoácidos; : - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) SYTLG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos ! 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de amino cidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) GISWSCtvSTDYAEFAKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más i preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de i aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como i se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) LGRYRSNWRNIGQYDY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferjentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como i se define en la presente) con la secuencia de (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) NYGMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solam nte 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) TSISWSjGSYTAYADNVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoájcidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" como se define en la presente) con la secuencia de ammoaipidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) QSRYSS YYDHDDKYAY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más prefer?ntemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, Aamenté 1 "de la o las diferencias en aminoácidos' (como se define en la presente) con la secuencia ole aminoá cidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) NYNMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como ! se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) SISWSGMSTYYTDSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por ló menos, 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más I preferjentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente.) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) SNRYRTflTTQAMYNY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen ( por lc menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, o olamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos' (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) SSAMA; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos ! 80%, preferentemente por lo menos 90%, más í preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoáicidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) (2) secuencias de aminoácidos que tienen preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoápidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como i se define en la presente) con la secuencia de aminoápidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) VVDGKí^AP; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos i 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" Momo se define en la presente) con la secuencia de aminoácido?; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) YYNTG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos ¡ 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 ... solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (co.no se def?ne en la presente) con la secuencia de aminoácidos; i entoneles CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) i AISWSGfeLTYYADSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como | se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" VVDGKRiAP; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de. secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) YYNTG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferjentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamelnte 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; I entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) AISWSGGLTYYADSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por ló menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia .corno se define en la presente) con la secuencia de aminoacidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) NRRQKTVQMGERAYDY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%; incluso más prefe entemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como i se define en la presente) con la secuencia de | aminoácidos; i I - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) IGAMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos i 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia i (como i se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se defjine en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) TITSGG^TNYADPVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lej menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoacidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) NLKQGSYGYRFNDY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como ! se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) IGAMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos j 80%, preferentemente por' lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más I preferbntemente por lo menos 99% de identidad de secuencia i (como ' se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) TITSGGSTNYADSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más prefertentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) NLKQGSYGYRFNDY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoacidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoálcidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de 1) IGjAMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos | 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoábidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se defjine en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) TITSGGSTNYADSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos' .corno se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) NLKQGDYGYRFNDY; (2) secuencias de aminoácidos que' tienen por 1 menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de 1) IGTMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) i TITSGCfSTNYADSVKG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por ID menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, I 2 o s|olamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" i (como I se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) NLKQGDYGYRFNDY; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más I preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (co oi se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o bolamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) YiNPMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia .como se define en la presente) con la secuencia de aminoájcidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) AISRT XGJGSTYYARSVEG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lp menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como ¡ se define en la presente) con la secuencia de i aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o splamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como' se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) AGVRAEDGRVRTLPSEYNF; (2) secuencias de aminoácidos que tieneiti por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más ¡preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (comol se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o áolamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como1 se define en la presente) con la secuencia de i aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) YISfPMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia I (como ( se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonbes CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) AISRTGGSTYYPDSVEG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o sjolamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como' se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y CDR3 se elige del grupo que consiste de (1) AGVRAI^DGRVRTLPSEYTF; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más ¡preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (comoj se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos' (como | se define en la presente) con la secuencia de I aminoácidos; - cuando CDRl se elige del grupo que consiste de (1) YNPMG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (comoj se define en la presente) con la secuencia de i aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se de ine en la presente) con la secuencia de aminoácidos; entonces CDR2 se elige del grupo que consiste de (1) AISRTGGSTYYPDSVEG; (2) secuencias de aminoácidos que tienen por Ib menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más prefefentemente por lo menos 95%, incluso más prefetentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia i (comoj se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, I 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como | se define en la presente) con la secuencia de preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; y (3) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o i i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores. ¡ En particular, un Nanocuerpo contra vWF de acuer o con la invención puede tener la estructura: FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de I complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual i) el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat es Q; y/o en la cual: ii) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat es E y en las cuales el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat es una R; y/o en la cual: iii) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste de R y S; y en la cual: iv) CDR 1 es una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: NYGMG [SEQ ID NO: 15] SYTLG [SEQ ID NO: 16] NYNMG [SEQ ID NO: 17] SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG [SEQ ID NO: 20] IGTMG [SEQ ID NO: 21] YNPMG [SEQ ID NO: 22] y en la cual: v) CDR 2 es una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23] GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24] TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25] SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26] TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27] AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO: 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 30] AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31] I I AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32] ¡ y en la cual: ' vi) CDR 3 es una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos : QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36] VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42] AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43] Preferentemente, en los Nanocuerpos de la invenpión de acuerdo con el último aspecto: - Cuando CDRl es: NYGMG; entonces CDR2 es: CDR3 es: QSRYRSNYYDHDDKYAY CDRl es: SYTLG; entonces CDR2 es: CDR3 es: LGRYRSNWRNIGQYDY CDRl es: NYGMG; entonces CDR2 es: TSISW$GSYTAYADNVKG; y CDR3 es: QSRYSSNYYDHDDKYAY Cuando CDRl es: NYNMG; entonces CDR2 es: y CDR3 es: SNRYRTHTTQAMYNY - Cuando CDRl es: SSAMA; entonces CDR2 es: TITSGÓRTNYADSVKG; y CDR3 es: VVDGKRAP - Cuando CDRl es: YYNTG; entonces CDR2 es: I AISWSCJGLTYYADSVKG; y CDR3 es: NRRQKTVQMGERAYDY Cuando CDRl es: IGAMG; entonces CDR2 es: TITSG^STNYADPVKG; y CDR3 es: NLKQGSYGYRFNDY , - Cuando CDRl es: IGAMG; entonces CDR2 es: TITSGGSTNYADSVKG; y CDR3 es: NLKQGSYGYRFNDY i - Cuando CDRl es: IGAMG; entonces CDR2 es: i TITSG STNYADSVKG; y CDR3 es: NLKQGDYGYRFNDY; ¡ - Cuando CDRl es: IGTMG; entonces CDR2 es: i TITSGGjSTNYADSVKG; y CDR3 es: NLKQGDYGYRFNDY i - Cuando CDRl es: YNPMG; entonces CDR2 es: AISRTGJGSTYYARSVEG; y CDR3 es: AG VRAEDGRVRTLP SEYNF | - Cuando CDRl es: YNPMG; CDR2 :AISRTGGSTYYPDSVEG; y CDR3¡ es: AGVRAEDGRVRTLPSEYTF - Cuando CDRl es: YNPMG; entonces CDR2 es: AISRT GSTYYPDSVEG; y CDR3 es: AGVRAEDGRVRSLPSEYTF En particular, de acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante del aspecto de la invención, un N nocuerpo puede generalmente definirse como un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se comprende de cuatro regiones/secuencias de estructura base | interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de complementariedad, en las cuales; a-1) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de G, E, D, G, Q, R, S, L; y se elige preferentemente del grupo que consiste de G, E o Q; y I a-2) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisjte de L, R o C; y se elige preferentemente del grupo que consiste de L o R; y I a-4) el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat es Q; o en la cual: I b-l) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de E y Q; y b-2) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat es R' y b-3) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de W, R y S; y es preferentemente W; b-4) el residuo de aminoácido en la posición 108 de ac?erdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de Q y L; y es preferentemente Q; o en la cual: i c-1) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de G, E, D, Q, R, S y L; y se elige preferentemente del grupo que consiste de G, E y Q; y i i c-2) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisite de L, R y C; y se elige preferentemente del grupo que cojnsiste de L y R; y ' c-3) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de P, R y S; y se elige en particular del grupo que co'nsiste de R y S; y c-4) el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisjte de Q y L; es preferentemente Q.
De esta manera, en otro aspecto preferido, pero no licitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura I FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: j i) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerc.o con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de G, E, D, G, Q, R, S, L; y se elige preferentemente del grupo que consiste de G, E o Q; y en la cual: j ii) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo aue I consisjte de L, R o C; y se elige preferentemente del grupo que cojnsiste de L o R; y en la cual: I iii) el residuo de aminoácido en la posición 103 1 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisite de W, R o S; y es preferentemente W o R, y es de mayor ¡preferencia W ; y en la cual iv) el residuo de aminoácido en la posición IOS de acuerdo con la numeración Kabat es Q; y en la cual: v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con uja de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las dejfiniciones más preferidas en lo anterior. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un NanocUerpo de la invención puede tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl á CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: i i i) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consislte de E y Q; j y en la cual: i ii) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdo con la numeración Kabat es R; y en la cual: iii) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisite de W, R y S; y es preferentemente W; y en la cual: iv) el residuo de aminoácido en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat es Q; y en la cual: vi) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son preferentemente como se define de acuerdo con una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las d finiciones más preferidas en lo anterior. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un I Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 FR3 CDR3 - FR4 I en • la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones I I de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl ^ CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complejmentariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: j i) el residuo de aminoácido en la posición 44 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consisjte de G, E, D, Q, R, S y L; y se elige preferentemente del grupo que consiste de G, E y Q; y en la cual: í ii) el residuo de aminoácido en la posición 45 de acuerdp con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de L, R y C; y se elige preferentemente del grupo que consiste de L y R; y en la cual: iii) el residuo de aminoácido en la posición 103 de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de P, R y S; y se elige en particular del grupo que cqnsiste de R y S; y en la cual: iv) el residuo de aminoácido en la posición 108 j de acuerdo con la numeración Kabat se elige del grupo que consiste de Q y L; es preferentemente Q; y en la cual: v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo de de Dos grupos particularmente preferidos, pero no limitantes de los Nanocuerpos de la invención son aquellos de acuerdo con a) en lo anterior; de acuerdo con a-1) a a-4) en , lo anterior; de acuerdo con b) en lo anterior; de acuerqo con b-l) a b-4) en lo anterior; de acuerdo con c) i en lo¡ anterior; y/o de acuerdo con c-1) a c-4) en lo anterior, en los cuales; ! ¡ a) los residuos de aminoácidos en las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia tipo GLEW como se define en la presente) y el residuo de aminoácido en la posición 108 es Q; o en los cuales: i b) los residuos de aminoácidos en las posiciones 43-46 i de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia tipo KERE) y el residuo de aminoácido en la posición 108 es Q o L, y es preferentemente Q. i De esta manera, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estrustura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 | en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones i de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl á CDR3 se refieren a las regiones determinantes de 1 a 3, respectivamente, y en la cual: residuos de aminoácidos en las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia tipo GLEW como se define en la presente) y el residuo de aminoácido en la posición 108 es Q; y en la cual : j ii) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presehte, y son de preferencia como se define de acuerdo con una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de I las definiciones más preferidas en lo anterior. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocúerpo de la invención puede tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl á CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: i) los residuos de aminoácidos en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia tipo KERE) y el I en la posición 108 es Q o L, y es : ii) CDRl, CDR2 y CDR3 son como s'e define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con ur.a de las definiciones preferidas en lo 'anterior, y de más p eferencia son como se define de acuerdo con una de las d finiciones más preferidas en lo anterior.
En los Nanocuerpos de la invención en los cuales los residuos de aminoácidos en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia KERE o KQRE, el residuo de aminoácido en la posición 37 es de mayor preferencia F. En los Nanocuerpos de la invención en los cuales los residuos de aminoácidos en las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración Kabat forman la secuencia GLEW, el residuo de aminoácido en la posición 37 se elige del grupo que consiste de Y, H, I, V o F, y es de mayor ¡preferencia F. ' De esta manera, sin limitarse a lo mismo de alguna, forma, sobre la base de los residuos de aminoácidos presentes en las posiciones mencionadas en lo anterior, los Nanociierpos de la invención generalmente pueden clasificarse sobre la base de los siguientes tres grupos: a) El " grupo GLEW" : Nanocuerpos con la secuencia i de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 de acuerdo con i la numeración Kabat y Q en la posición 108 de acuerdo con I la nurrjeración Kabat. Como se describe posteriormente en la presente, los Nanocuerpos dentro de este grupo usualmente tienenj una V en la posición 37, y pueden tener una W, P, R I I o S eri la posición 103, y preferentemente tienen una W en la poáición 103. El grupo GLEW también comprende algunas secuencias tipo GLEW tales como aquellas mencionadas en la Tabla 2 en lo siguiente; i b) El " grupo KERE" : Nanocuerpos con la secuencia i de aminoácidos KERE o KQRE o en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración Kabat y Q o L en la posición 108 de apuerdo con la numeración Kabat. Como se describe posteriormente en la presente, los Nanocuerpos dentro de este drupo usualmente tienen una F en la posición 37, una L o F en la posición 47; y pueden tener una W, P, R o S en la posición 103, y preferentemente tienen una W en la posición 103; l c) El " grupo 103 P, R, S" : Nanocuerpos con una P R o S en la posición 103. Estos Nanocuerpos pueden tener la secuer.cia de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 de la numeración Kabat o la secuencia de aminoácidos KERE o KQRE en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración Kabat, la última de mayor preferencia en combinación con una F en la posición 37 y una L o una F en la posición 47 (como se defin para el grupo KERE) ; y pueden tener Q o L en la posición 108 de acuerdo con la numeración Kabat, y preferentemente tienen Q. De esta manera, en otro aspecto preferido, pero no lirtiitante, un Nanocuerpo de la invención puede ser un NanocUerpo que pertenece al grupo GLEW (como se define en la présente) , y en el cual CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo c?on una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de i acuerdo con una de las definiciones más preferidas en lo anterior.
I En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocúerpo de la invención puede ser un Nanocuerpo que pertenece al grupo KERE (como se define en la presente) , y en la cual CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con urja de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más p eferencia son como se define de acuerdo con una de las d finiciones más preferidas en lo anterior. De esta manera, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede ser un Nanocuerpo que pertenece al grupo 103 P, R, S (como se define en la presente) , y en la cual CDRl, CDR2 y CDR3 son como sje define en la presente, y son de preferencia como se define! de acuerdo con una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las definiciones más preferidas en lo anterior I También, más generalmente y además de los residujos 108Q, 43E/44R y 103P,R,S mencionados en lo anternor, los Nanocuerpos de la invención pueden contener, en una o más posiciones que, en un dominio convencional VH, pueden formar (parte de) la interconexión VH/VL, contener uno o: más residuos de aminoácidos que se encuentran más altamente cargados que los residuos de aminoácidos de orige? natural en la o las mismas posiciones en el dominio VH O VHH correspondiente de origen natural, y en particular uno cj> más residuos cargados de aminoácidos (como se menciona en la Tabla I) . Tales sustituciones incluyen, pero no se limitan a las | secuencias tipo GLEW como se menciona en la Tabla 2 en lo ! siguiente; así como también las sustituciones que se describen en la Solicitud Internacional WO 00/29004 para los lllamados "mi crocuerpos" , por ejemplo una Q en la posición 108 y KLEW en las posiciones 44-47. ; En los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoálcido en la posición 83 se elige del grupo que í consiste de L, M, S, V y W; y es preferentemente L. | También, en los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoácido en la posición 83 se elige del grupo i que nsiste de R, K, N, E, I y Q; y es de mayor preferjencia K o E (para Nanocuerpos que corresponden a dominios VHH de origen natural) o R (para Nanocuerpos "humanizados", como se describe en lo siguiente) . El i residuo de aminoácido en la posición 84 se elige del grupo que consiste de P, A, R, S, D y V, y es de mayor preferencia P (para Nanocuerpos que corresponden a dominios VHH de origen natural) o R (para Nanocuerpos "humanizados", como $e describe en lo siguiente) . Adicionalmente, en los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoácido en la posición 104 se elige ¡ del grupo que consiste de G y D; y es de mayor i preferencia G. En forma colectiva, los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108, los cuales en los Nanocuerpos son como se menciona en lo anterior, también serán referidos en la presente como los "Residuos Dis tin tivos" . Los Residuos Distintivos y los residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes del dfminio VH humano más estrechamente relacionado, VH3, se resumen en la Tabla 2. i Algunas combinaciones especialmente preferidas de estos ¡Residuos Distintivos, como ocurre en dominios VHH de origenl natural, se mencionan en la Tabla 3. Para comparación, los residuos correspondientes de aminoácidos del VH3 humano llamados DP-47 se han indicado en cursivas.
Notas :| r (1): En particular, pero no exclusivamente, en combiriación con KERE o KQRE en las posiciones 43-46. ¡ (2) : Usualmente como GLEW en las posiciones 44-47. i (3) : Usualmente como KERE o KQRE en las posiciones 43-46, por ejemplo como KEREL, KEREF, KQREL, KQREF o KEREG en las posiciones 43-47. Alternativamente, también secuensias tales como TEFE (por ejemplo TEREL) , KECE (jpor ejemplo KECEL o KECER) , RERE (por ejemplo REREG) , QERE ípor ejemplo QEREG) , KGRE (por ejemplo KGREG) , KDRE (por ejemplo KDREV) son posibles. Algunas otras secuencias posibles, pero menos preferidas incluyen por ejemplo DECKL y NVCEL. j (4) : Con GLEW en las posiciones 44-47 y KERE o KQRE en las posiciones 43-46. (5) : Con frecuencia como KP o EP en las posiciones 83-84 de dominios VHH de origen natural. (6): En particular, pero no exclusivamente, en combinación con GLEW en las posiciones 44-47. (7) : Con la condición de que cuando las posicijones 44-47 son GLEW, la posición 108 siempre es Q. grupo GLEW también contiene secuencias tipo posiciones 44-47, tal como, por ejemplo GVEW, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER f en o Lp O <_p En los Nanocuerpos, cada residuo de aminoácido en cualquier otra posición diferente a los Residuos Distintivos puede ser cualquier residuo de aminoácido de origer. natural en la posición correspondiente (de acuerdo con la numeración Kabat) de un dominio VHH de origen natural . Algunos residuos de aminoácidos serán claros para la peicsona experta. Las Tablas 4 - 7 mencionan algunos i residuos no limitantes que pueden presentarse en cada posici .ón (de acuerdo con la numeración Kabat) de la FRl, FR2, FJR3 y FR4 de dominios VHH de origen natural. Para cada posición, el residuo de aminoácido que se presenta con mayor i frecuencia en cada posición de un dominio VHH de origen natural (y el cual es el residuo más preferido de aminoácido para la posición en un Nanocuerpo) se indica en negrasi; y otros residuos preferidos de aminoácidos para I cada pjosición se han subrayado (nota: el número de residuos i de amilnoácidos que se encuentran en las posiciones 26-30 de dominijos VHH de origen natural soporta la hipótesis que subyace la numeración Chothia (supra) de que los residuos en estjas posiciones ya forman parte de CDRl.) I En Tablas 4 - 7, algunos de los residuos no i limitantes que pueden presentarse en cada posición de un dominib VH3 humano se han mencionado también. Nuevamente, para cada posición, el residuo de aminoácido que se preseijita con mayor frecuencia en cada posición de un domin:.o VH3 humano de origen natural se indica en negras; y otros j residuos preferidos de aminoácidos se han subrayado. i De .esta manera, en otro aspecto preferido, pero no lirt?tante, un Nanocuerpo de la invención pueden tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: I i) los Residuos distintivos son como se define en la presente; y en la cual: ii) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la i presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con urja de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de l i las d finiciones más preferidas en lo anterior. 1 En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanoculerpo de la invención pueden tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 i en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: y en la cual i) FRl se elige del grupo que consiste de la secueijicia de aminoácidos: [1] Q?QLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26; [SEQ ID NO: 1] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos anterior; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualqúier posición diferente a una Posición distintiva es prefe entemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de amino?icidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimiriaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con 1 o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferfncias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : i I (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ' se define en la presente) y/o una sustitución de I aminoácidos como se define en la Tabla 4; y/o ! (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente I sólo ' contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la! o las secuencias de aminoácidos anteriores; y en la cual: i ii) FR2 se elige del grupo que consiste de la secuenjcia de aminoácidos: I i [36] xRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID NO: 2] i I I i o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la i secuencia de aminoácidos anterior; en la cual I (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ' se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lal o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las i diferejncias en aminoácidos" (como se define en la presente) con urja de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como 'se define en la presente) y/o una sustitución de i aminoápidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ' contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; l y en la cual: 1 ¡ iii) FR3 se elige del grupo que consiste de la secuenbia de aminoácidos: [66; RFTISRDNAKNTVYLQMNSL3XEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 3] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente I por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secueiicia de aminoácidos anterior; en la cual ¡ (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferjentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡ contiene sustituciones de aminoácidos, y no ! y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoápidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con unja de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: ! ! (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualqujLer posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores; y en la cual: I i I iv) FR4 se elige del grupo que consiste de la secuerícia de aminoácidos: [103] XXQGTXVTVSS [113; [SEQ ?D NO: 4 o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por l menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, ! inclus'o más preferentemente por lo menos 99% de identidad I de sejcuencia (como se define en la presente) con la i secuenjcia de aminoácidos anterior; en la cual i (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferjentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como i se define en la presente) y/o una sustitución de aminoájcidos como se define en la Tabla 6; y/o | (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : 1 (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ¡ se define en la presente) y/o una sustitución de aminoálcidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; i y en la cual: i i v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de i las definiciones más preferidas en lo anterior; en la cual los Residuos Distintivos se indican por "X" y son como se define anteriormente y en la cual los números entre corchetes se refieren a las posiciones de los aminoácidos de acuerdo con la numeración Kabat, En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocúerpo de la invención pueden tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 ! en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones I | de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: y en la cual i) FRl se elige del grupo que consiste de la secuenlcia de aminoácidos: [1] Q^QLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5] i o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, inclusp más preferentemente por lo menos 99% de identidad i de sebuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos anterior; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualqu-Ler posición diferente a una Posición distintiva es prefersntemente una sustitución conservativa de aminoácidos como se define en la presente) y/o una sustitución de a inoacidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se indlica en la secuencia en lo anterior; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoa cidos anteriores, en la cual: 1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es prefersntemente una sustitución conservativa de aminoácidos .corno se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 4; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se indica en la secuencia en lo anterior; y en la cual: ii) FR2 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos: o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por l? menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, inclusjo más preferentemente por lo menos 99% de identidad I de sequencia (como se define en la presente) con una de las secuenicias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o ¡ (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente I I sólo ' contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación I con laj o las secuencias de aminoácidos anteriores; y i (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la c las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo i contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lal o las secuencias de aminoácidos anteriores; y ¡ (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; i y en la cual: | iii) FR3 se elige del grupo que consiste de la secuenlcia de aminoácidos: 66] FTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por ID menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la secuencia de aminoácidos anterior; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ¡ se define en la presente) y/o una sustitución de aminoálcidos como se define en la Tabla 6; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente i sólo j contiene sustituciones de aminoácidos, y no I eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lai o las secuencias de aminoácidos anteriores; y i (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterijor; i y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con unja de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la I cual: ¡ I (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como i se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores; y t I (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias en lo i anterior; i I ' y en la cual: ¡ iv) FR4 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos: [103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13] [103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lf menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, I inclusp más preferentemente por lo menos 99% de identidad i I de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquH-er posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 103, |L04 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; I y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoálcidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con ur(a de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: i (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡ contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; y en la cual : v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con ura de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las dejfiniciones más preferidas en lo anterior. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención pueden tener la estructura FRl CDRl - FR2 CDR2 FR3 - CDR3 -FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base l a 4, respectivamente, y en la cual CDRl 4 CDR3 se refieren a las regiones determinantes de comple,mentariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: y en la cual ! i) FRl se elige del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos: [1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5] | y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimi-[-aciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se in?ica en la secuencia en lo anterior; y en la cual: ii) FR2 se elige del grupo que consiste de las secueiticias de aminoácidos: [36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6] [36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7] [36] FRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8] [36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9] [36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10] y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: , (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimir aciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 43, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuer.cias en lo anterior; y en la cual: iii) FR3 se elige del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos: [66] F.FTISRDNAKNTVYLQ NSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12] I y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: i (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 s|on como se indica en cada una de las secuencias en lo anteripr; I y en la cual: I I iv) FR4 se elige del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos: i i [103; WGQGTQVTVSS [113; [SEQ ID NO: 13; [103; WGQGTLVTVSS [113; [SEQ ID NO: 14; i y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : i (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualqujier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 7; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡ contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; y en la cual: v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo con una de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las deifiniciones más preferidas en lo anterior. i En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención pueden tener la estructura FRl CDRl- FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl c. CDR3 se refieren a las regiones determinantes de I complefnentariedad 1 a 3 , respectivamente , y en la cual : y en la ¡cual i) FRl se elige del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos: [1] QVjQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5] y/o del grupo que consiste de secuencias de I aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoábidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ! contiene sustituciones de aminoácidos, • y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se indica en la secuencia en lo anterior; y en la cual: i ii) FR2 se elige del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos: [36] WYRQAPGKGLEWA [49] ;SEQ ID NO: 1M y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con u?a de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: i (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es i preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ! se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y ¡ (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; y en la cual: iii) FR3 se elige del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos: [66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12] y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoáicidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con ur.a de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos Domo se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; y en la cual: iv) FR4 se elige del grupo que consiste de la secuenIcia de aminoácidos : [103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13] y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoápidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o 1as diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con ura de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 7; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con l o las secuencias de aminoácidos anteriores; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias en lo anterior; i I y en la cual: i | v) CDRl, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente, y son de preferencia como se define de acuerdo I con uijia de las definiciones preferidas en lo anterior, y de más preferencia son como se define de acuerdo con una de las definiciones más preferidas en lo anterior. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanoc erpo de la invención pueden tener la estructura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FRl a FR4 se refieren a las regiones de estructura base 1 a 4, respectivamente, y en la cual CDRl a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la cual: y en la cual i) FRl se elige del grupo que consiste de las secuencias FRl presentes en los Nanocuerpos de SEQ ID NO' s 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular en los Nanocujerpos humanizados de SEQ ID NO's 86 a 97, o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de seduencia (como se define en la presente) con una de las secuencias FRl; en la cual (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualq ier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ¡ contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con M secuencia FRl; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se indica en la secuencia FRl; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias FRl, en la cual: (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualqu ier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 4; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia FRl; y (3) el Residuo distintivo en la posición es como se indica en la secuencia FRl; y en la cual: ii) FR2 se elige del grupo que consiste de las secuencias FR2 presentes en los Nanocuerpos de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de SEQ ID NO's 86 a 97, o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuercias FR2; en las cuales (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con le secuencia FR2; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en la secuencia FR2 ; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con u?a de las secuencias FR2, en las cuales: (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos ¡como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 5; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia FR2; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en la secuencia FR2; y en la cual: iii) FR3 se elige del grupo que consiste de las secuencias FR3 presentes en los Nanocuerpos de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular en los Nanociierpos humanizados de SEQ ID NO's 86-97, j o del grupo que consiste de secuencias de aminoáicidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lp menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de sefuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias FR3; en las cuales (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos I (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o ¡ (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ntiene sustituciones de aminoácidos, y no elimi ones o inserciones de aminoácidos, en comparación con l cuencia FR3; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 como se indica en la secuencia FR3; y/o del grupo que consiste de secuencias de i ammoa ¡¡cidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las difere -ncias en aminoácidos" (como se define en la presente) con unía de las secuencias FR3, en las cuales: (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es prefer|entemente una sustitución conservativa de aminoácidos .como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoájcidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lal secuencia FR3; y (3) los Residuos distintivos en las posiciones 83 y 84 son como se indica en la secuencia FR3; y en la cual: iv) FR4 se elige del grupo que consiste de las secuencias FR4 presentes en los Nanocuerpos de SEQ ID NO' s 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de SEQ ID NO's 86 a 97, o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias FR4 ; en las cuales (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualq ier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (1) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo dontiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia FR4 ; y (2) los Residuos distintivos en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en la secuencia FR3; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con unía de las secuencias FR4, en las cuales: I (1) cualquier sustitución de aminoácidos en cualquier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácidos como se define en la Tabla 6; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoá cidos como se define en las Tablas 4-7; y/o (3) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores. Algunos Nanocuerpos incluso más. particularmente preferidos de la invención pueden elegirse del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO' s 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de SEQ ID NO's 86 a 97 o del grupo que cqnsiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de amiinoácidos de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97 (y preferentemente de SEQ ID NO's 86 a 97); en la cual (1) los Residuos distintivos son como se indica en la secuencia pertinente elegida de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ IC) NO's 86 a 97 (y preferentemente de SEQ ID NO's 86 a 97); (2) cualquier sustitución de aminoácidos en cualq ier posición diferente a una Posición distintiva es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) y/o una sustitución de I aminoácidos como se define en las Tablas 4-7; y/o (3) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no elimi aciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia pertinente elegida de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97 (y preferentemente de SEQ ID NO's 86 a 97) . Algunos de los Nanocuerpos más preferidos de la invención pueden elegirse del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, y en particular de los Nanocuerpos i humanizados de SEQ ID NO's 86 a 97. Como será claro a partir de lo anterior, el término Nanocuerpos de la invención como se usa en la I prese te en su sentido más amplio también comprende mutantes, variantes, alelos, análogos y ortólogos (a contiguación referidos en forma colectiva como análogos " ) natur¿?les o sintéticos de los Nanocuerpos mencionados en las S¿Q ID NO's 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97. Generalmente, tales análogos pueden por ejemplo comprender secuencias homologas, porciones funcionales, o una porción funcional de una secuencia homologa (como se defin además en lo siguiente) de un Nanocuerpo.
Generalmente, en tales análogos, cada residuo de aminoácido (diferente al Residuo Distintivo) en cada una de las regiónes de estructura base puede reemplazarse por cualqu ier otro residuo de aminoácido, a condición de que el grado total de identidad de secuencia de las regiones de estrudtura base permanezca como se define en la presente, Preferentemente, sin embargo, en tales análogos: uno o los residuos de aminoácidos en las secuencias de estructura base anteriores se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de origen natural en la misma posición en un dominio VHH de origen natural. Algunos ejempl os de tales sustituciones se mencionan en las Tablas 4-7 er lo anterior; y/o: uno o los residuos de aminoácidos en las secuercias de estructura base anteriores se reemplazan por I uno o ¡ más residuos de aminoácidos que pueden considerarse una sustitución "conservativa" de aminoácidos, como se describe anteriormente; y/o: I uno o los residuos de aminoácidos en las secuencias de estructura base anteriores se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de origen natural en la misma posición en un dominio VH de origen natural de un ser humanoD Esto es generalmente referido como "humanización" del V?p/Nanocuerpo de origen natural en general y de la posición en particular, y se discutirá en mayor detalle a continuación; - posiciones para las cuales solamente un residuo de aminoácido se menciona para ambos dominio VH y dominio VHH en1 las Tablas 4 — 7 anteriores no se reemplazan prefer ntemente . También, aunque generalmente menos preferidos, en tales ¡análogos, uno o más residuos de aminoácidos pueden eliminarse a partir de las regiones de estructura base y/o insertados en las regiones de la estructura base (de manera opcional además de una o más sustituciones de aminoácidos como e menciona en lo anterior) , a condición de que el grado total de identidad de secuencia de las regiones de i estructura base permanezca como se define en la presente.
Los Rejsiduos Hallmark no deben eliminarse. Además, de mayor i preferjencia, los residuos de aminoácidos para el cual solamente un residuo de aminoácido se menciona para ambos del dominio VH y el dominio VHH en las Tablas 4 — 7 en lo anterior no son preferentemente eliminados. i ! Preferentemente, tales análogos deben ser tales que pueden aún unirse, tienen afinidad y/o tienen especificidad por vWF, es decir, con una afinidad y/o a especificidad la cual es por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 70%, incluso más preferentemente por lo menos 80%, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% o más, de la afinidad y/o especificidad de por lo menos uno de los Nanocderpos de SEQ ID No' s 60 a 73 y SEQ ID NO's 86 a 97, cuando se determina usando un ensayo adecuado, por ejemplo un ensjayo para determinar la unión del análogo a vWF, y en particular uno de los ensayos como se usa en los Ejemplos en lo siguiente. i Generalmente, tales análogos pueden por ejemplo obtenerse para proporcionar un ácido nucleico que codifica un dominio VHH de origen natural, cambiando los codones para mno o más residuos de aminoácidos que se humanizaran en los codones para el o los residuos humanos correspondientes de aminoácido, que expresan el ácido nucleico/secuencia de nucleótidos de esta manera obtenida en un ¡sistema huésped o de expresión adecuada; y de manera opcionbl aislar y/o purificar el análogo de esta manera ¡ obtenido para proporcionar el análogo en forma nucleico que codifica un análogo que puede ser sintetizado de una manera conocida per se (por ejemplo usando un aparato automatizado para sintetizar secuencias de ácidos nucleicos con una secuencia de aminoácidos preferida) y pueden expresarse en un sistema huésped o expresión, en la cual él análogo de esta manera obtenido puede de manera opcional aislarse o purificarse de modo que proporciona el análogo en forma esencialmente aislada (como se define anteriormente) . Otra forma para proporcionar los análogos involubra sintesis quimica de la secuencia pertinente de aminoácidos usando técnicas para la sintesis de péptido i conocidas per se, tales como aquellas mencionadas a continuación . Serán también generalmente claros para la persona experta que los Nanocuerpos (incluyen análogos de los mismos1) también pueden prepararse iniciando a partir de las secuenbias VH humanas (es decir, secuencias de aminoácidos o las secuencias correspondientes de nucleótidos) , tal como, por ejemplo secuencias VH3 humana tales como DP-47, DP-51 p DP-29, cambiando uno o más residuos de aminoácidos en la ¡secuencia de aminoácidos de dicho dominio VH humano, de modo que proporciona una secuencia de aminoácidos que tiene (a) una Q en la posición 108; y/o (b) E en la posición 44 y/o R en la posición 45, y preferentemente E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) P, R o S en la posición 103, como se describe en lo anterior. Nuevamente, esto generalmente puede realizarse usando los diversos métodos y técnicas referidas en el párrafo previo, usando una secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleó(tidos para un dominio VH humano como un punto inicial . El término Nanocuerpos como se usa en la presente en su sentido más amplio también comprende partes o fragmentos de los Nanocuerpos (incluyen análogos) de la invención como se define en la presente, los cuales pueden nuevamente ser como se describe además en lo siguiente. Generalmente, partes o fragmentos de los Nanocuerpos y/o análogos tienen secuencias de aminoácidos en los que, en comparación con la secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo o análogo que corresponde a la longitud completa, uno o más de los residuos de aminoácidos en el i Extremó N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el i i extremo C-terminal, uno o más residuos de aminoácidos contigjaos internos, o cualquier combinación de los mismos, se han eliminado y/o removido. También es posible combinar uno o más de tales partes o fragmentos que proporcionan un Nanocuerpo de la invención. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo que comprende una o más partes o fragmentos de un Nanocuerpo y/o análogo de longitud completa debe tener ' un grado de identidad de secuencia de por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 60%, más preferentemente por lo menos 70%, tal como por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95%, con la secuencia de aminoácidos del Nanocúerpo de longitud completa correspondiente. Además, la secuencia de aminoácidos de un Nanocifierpo que comprende una o más partes o fragmentos de un Nanocuerpo de longitud completa y/o análogo es preferentemente tal que se comprende por lo menos de 10 resid?os de aminoácidos' contiguos, preferentemente por lo menos de 20 residuos de aminoácidos contiguos, más preferentemente por lo menos de 30 residuos de aminoácidos contiguos, tal como por lo menos de 40 residuos de aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos del Nanoc erpo de longitud completa correspondiente. Generalmente, tales partes o fragmentos de los Nanocüerpos de la invención tendrán secuencias de aminoácidos en las que, en comparación con la secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo de longitud completa correspondiente de la invención, uno o más de los residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, uno o más residuos i de amlinoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de les mismos, se han eliminado y/o removido. También es posiblle combinar una o más de las partes o fragmentos para proporcionar un Nanocuerpo de la invención. i De acuerdo con una modalidad preferida, un fragmento como se usa en la presente comprende por lo menos una df las CDR presentes en Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, preferentemente por lo menos dos de las CDR presentes en Nanocuerpo de tamaño completo de la invencjión, más preferentemente por lo menos CDR2 y CDR3 prese?tes en un Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, tal como, por ejemplo las tres CDR's presentes en un Nanocuerpo de tamaño completo de la invención. De acuerdo con otra particularmente preferida, pero no modalidad limitante, tal parte o fragmento comprende por lo menos FR3, CDR3 y FR4 del Nanocuerpo de longitud completa correspondiente de la invención, es decir, como por ejemplo descrita en la solicitud Internacional WO 03/050531 (Lasters et al.). I 1 Preferentemente, las partes o fragmentos deben ser tales que pueden aún unirse a, teniendo afinidad por i y/o teniendo especificidad por vWF, es decir, con una afinidad y/o especificidad la cual es por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, más preferentemente por lo merlos 70%, incluso más preferentemente por lo menos 80%, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% o más, de la afinidad y/o especificidad del Nanocuerpo de tacaño completo correspondiente de la invención, por ejemplo un ensayo para determinar la unión del análogo en vWF, y en particular uno de los ensayos como se usa en los Ejemplos en lo siguiente. j A partir de la descripción antes mencionada, será claro que las secuencias de aminoácidos de los Nanocuerpos usadas en la presente difieren de por lo menos una posición de arrinoácido en por lo menos una de las regiones de estructura base de las secuencias de aminoácidos de dominios VH de origen natural de anticuerpos de seres humanps. En particular, será claro que las secuencias de aminoácidos de los Nanocuerpos utilizados en la presente difieren de por lo menos uno de los Residuos Distintivos de secuencias de aminoácidos de dominios VH de origen natural, tal como las secuencias de aminoácidos de dominios VH de i origen natural de los anticuerpos de Camélidos y/o seres . De esta manera, de acuerdo con una modalidad especifica, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de por lo menos una posición de aminoácido en una de las regiones de estructura base jde la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen natural. De acuerdo con una modalidad más especifica, pero no limitante de la invención, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de al menos uno de los Residuos disti tivos de la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen natural. i A partir de la descripción anterior, también sera claro que las secuencias de aminoácidos de algunos de los Nanocúerpos de la invención, tal como los Nanocuerpos humanizados de la invención, diferirán por lo menos de una posición de aminoácido de por lo menos una de las regiones de estructura base (es decir, cualquiera en la posición de un reiiduo distintivo o en otra posición) de las secuencias de amµ-noácidos de dominios VHH de origen natural. De esta manera, de acuerdo con una modalidad especifica, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de al menos una pos?c:-ón de aminoácido en una de las regiones de estructura base de la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH de origen natural. De acuerdo con una modalidad mas especifica, pero no limitante de la invención, un Nanocuerpo de 1a invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de al menos uno de los Residuos distintivos de la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH de origen natural. Como se menciona en lo anterior, la invención también se relaciona con proteinas o polipeptidos que I comprenden por lo menos una dominio VHH (es decir, como se identifica usando el métodos de la invención) o por lo menos un Nanocuerpo basado en el mismo. De acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, tal polipéptido de la invención consiste esencialmente de un Nanocuerpo. Por "esencialmente consiste de" se da entender que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención ya sea es exactamente a la misma como la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo (como se menciona en lo anterior) o corresponde a la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo en la cual un número limitante de residuos de aminoácidos, tal como 1-10 residuos de aminoácidos y preferentemente 1-6 residuos de aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de amino cidos, se han agregado al extremo terminal amino, en el en el extremo terminal carboxi, o tanto el extremo terminal amino y en el extremo terminal carboxi de la secuencia de aminoácido del Nanocuerpo. i I Los residuos de aminoácidos pueden o no pueden cambiar, alterar o de otra manera influenciar las propiedades (biológicas) del Nanocuerpo y pueden o no agregarse a la funcionalidad adicional al Nanocuerpo. Por ejemp;.o, los residuos de los aminoácidos pueden: a) formar un "rótulo", es decir, una secuencia de aminoácidos o residuo que permite o facilita la purificación' del Nanocuerpo, por ejemplo usando afinidad técnicas dirigida contra la secuencia o residuo.
Posteriormente, la secuencia o residuo puede eliminarse (por ejemplo por escisión quimica y enzimática) proporciona la secuencia de nucleótidos de la invención (para este propósito, la secuencia o residuo puede de manera opcional unirse a la secuencia de aminoácidos de la invención mediarte una secuencia enlazadora escindible) . Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de algunos residuos son esiduos de histidina múltiples y residuos de glutatjiona, b) puede ser un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula huésped heteróloga u organismo huésped. c) puede ser uno o más residuos de aminoácidos que p?eden proporcionarse con grupos funcionales y/o que I han sido funcionalizados, de una manera conocida per se. Por ejemplo, como se conoce en la técnica, residuos de aminoácidos tal como lisina y en particular cisterna I permita la unión de grupos PEG, los cuales pueden enmascarar el sitio de superficie en una proteina y de esta manera por ejemplo disminuir la inmunogenicidad, mejorar la vida media en el plasma y se estabiliza contra la escisión proteofLitica; ¡ d) incrementa la media vida en el suero de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Secuencias de aminoácidos que pueden unirse a y/o fusionarse a las proteinas terapéuticas para incrementar sus medias in vivo se conocen bien por la persona experta e incluyen proteina sérica^ humana o fragmentos de los mismos (tal como albúmina sérica, humana o una parte o fragmento de los mismos) , o includo porciones Fc de anticuerpos (en particular de anticuerpos humanos) . Además, como ya se describió en la preserte, tal secuencia de aminoácidos que incrementa la media vida puede ser una secuencia de aminoácidos dirigidos contra! una proteina sérica, tal como un Nanocuerpo dirigido i contraj una proteina sérica, por ejemplo contra albúmina sérica! humana. Con respecto a la pegilación, debe observarse que generalmente, la invención también abarca cualquier Nanocuerpo de la invención y/o polipéptido de la invención i que ha sido pegilado en una o más posiciones de los aminoácidos, preferentemente en tal forma que la pegilación ya sea| (1) incrementa la media vida in vivo; (2) reduce la i inmuno; ¡genicidad; ( 3 ) proporciona una o más propiedades benéfi .cas adicionales conocidas per se para la pegilación; (4) no afecta esencialmente la afinidad del Nanocuerpo y/o polipéptido por vWF (por ejemplo no reduce la afinidad por más dé 90%, preferentemente no por más de 50%, y más preferentemente no por más de 10%, cuando se determina por un ensayo adecuado, tal como aquellos descritos en los Ejemplps en lo siguiente); y/o (4) no afecta ninguno de las otras propiedades deseadas de los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención. Grupos PEG adecuados y métodos para unirlos, ya sea específicamente o non- i específicamente, serán claros para la persona experta. Los equipos adecuados y reactivos para tal pegilación puede por ejemplo obtenerse de Nektar (CA, USA) . De acuerdo con una modalidad no limitante, uno o más residuos de aminoácidos puede agregarse a, insertarse ;n y/o sustituirse en la secuencia de aminoácidos de un Nanoc erpo o polipéptido de la invención, de modo que proporciona uno o más residuos de aminoácidos específicos para unirse al grupo PEG. La invención también abarca cualquier Nanocuerpo I de la invención y/o polipéptido de la invención que ha sido glicosilado en una o más posiciones de los aminoácidos, usualmente dependiendo en el huésped utilizado para I expresar el Nanocuerpo o polipéptido de la invención (como se describe además en lo siguiente) . De acuerdo con una modalidad no limitante, uno o más r siduos de aminoácidos puede agregarse, insertarse en y/o sustituirse en la secuencia de aminoácidos de un I Nanocuerpo o polipéptido de la invención, de modo que proporciona uno o más residuos específicos de aminoácidos y/o un sitio que puede glicosilarse por el organismo huésped utilizando . Por medio de un ejemplo preferido, pero no limitante, el residuo N en la posición 50 dentro de CDR2 de urt- Nanocuerpo de la invención puede por ejemplo i rernpla zarse por un residuo Q, D o S de modo que proporciona un sitio glicósido, por ejemplo para glicosilación por Pichia, . De acuerdo con otra modalidad, un polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de un iNanocuerpo, el cual se fusiona en su extremo terminal I amino,¡ en su extremo terminal carboxi, o tanto e en su I extrepjo terminal amino y en su extremo terminal carboxi con por id menos una secuencia de aminoácidos adicional. Nuevamente, la o las secuencias de aminoácidos adiciónales pueden o no pueden cambiar, alter o de otra manera influenciar las propiedades (biológicas) del Nanocuerpo y pueden o no pueden agregar además i funcionalidad al Nanocuerpo. i Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad preferida, pero no limitante, la secuencia de aminoácidos I adicional puede comprender por lo menos un Nanocuerpo adicional, de modo que proporciona un polipéptido de la invención que comprende por lo menos dos, tal como tres, cuatro o cinco, Nanocuerpos, en los cuales los Nanocuerpos pueden, de manera opcional unirse mediante una o más secuencias enlazadoras (como se define en la presente) . ' Los polipéptidos de la invención comprenden dos o más Nanocuerpos que también se referirán en la presente i I como i polipéptidos "multivalentes". Por ejemplo un polipeptido "bivalente" de la invención comprende dos Nanocuerpos, enlazados de manera opcional mediante una secuencia enlazadora, mientras que un polipéptido "trivalente" de la invención comprende tres Nanocuerpos, enlazados de manera opcional mediante dos secuencias enlazaldoras; etc. En un polipéptido multivalente de la invención, dos o más Nanocuerpos pueden ser los mismos o diferentes. Por epemplo, dos o más Nanocuerpos en un polipéptido multivalente de la invención: I I - pueden dirigirse contra el mismo antigeno, es decir,| contra las mismas partes o epitopos del antigeno o contra¡ dos o más partes diferentes o epitopos del antigeno; y/o. | I ! - pueden dirigirse contra los antigenos I difere Zntes; o una combinación de los mismos De esta manera, un polipéptido bivalente de la invención por ejemplo: l - puede comprender dos Nanocuerpos idénticos; I - puede comprender un primer Nanocuerpo dirigido contra! una primera parte o epitopo de antigeno y un segundo Nanocu^rpo dirigido contra la misma parte o epitopo del antigéno o contra otra parte o epitopo del antigeno; o puede comprender un primer Nanocuerpo dirigí.do contra un primer antigeno y un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antigeno diferente del primer mientras un polipéptido trivalente de la por ejemplo: - puede comprender tres Nanocuerpos idénticos o diferentes dirigidos contra las mismas o diferentes partes o epitopos del mismo antigeno; - puede comprender dos Nanocuerpos idénticos o diferentes dirigidos contra las mismas o diferentes partes o epi:opos en el primer antigeno y un tercer Nanocuerpo dirigijdo contra un segundo antigeno diferente del primer antigeno; o - puede comprender un primer Nanocuerpo dirigido contral un primer antigeno, un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antigeno diferente del primer antigeno, y un tercer Nanocuerpo dirigido contra un tercer antigeno i diferejnte del primer y segundo antigeno, polipéptidos de la invención que contienen por lo menos dos Nanocuerpos, en los cuales por lo menos un Nanocuerpo se dirige contra un primer; antigeno y por lo menos un Nanocuerpo se dirige contra un segundo Nanocuerpo diferente del primer antigeno, I tambiéjn serán referidos como Nanocuerpos "multiiespecificos" . De esta manera, un Nanocuerpo "biespecifico" es un Nanocuerpo que comprende por lo menos un Na?ocuerpo dirigido contra un primer antigeno y por lo menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antigemo, mientras un Nanocuerpo "triespecifico" es un Nanocúerpo que comprende por lo menos un Nanocuerpo dirigido contra un primer antigeno, por lo menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antigeno, y por lb menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra a tercer! antigeno; etc. ¡ Por consiguiente, en su forma más simple, un polipéptido biespecifico de la invención es un polipéptido bivalente de la invención (como se define en la presente) , que comprende un primer Nanocuerpo dirigido contra un primer antigeno y un segundo Nanocuerpo dirigido contra un i segundo antigeno, en el cual el primer y segundo Nanocuerpo pueder de manera opcional unirse mediante una secuencia enlaz^dora (como se define en la presente) ; mientras un polipéptido tri-especifico de la invención en en su forma más simple es un polipéptido trivalente de la invención (como se define en la presente) , que comprende un primer Nanocuierpo dirigido contra un primer antigeno, un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antigeno y un tercer Nanocuerpo dirigido contra a tercer antigeno, en el cual el primer., segundo y tercer Nanocuerpo pueden de manera opcio?al unirse mediante uno o más, y en particular uno y más e? particular dos, secuencias enlazadoras. multiespecifico de la invención puede comprender cualquier número de Nanocuerpos dirigidos contra dos o más diferentes antige'nos . Para polipéptidos multivalentes y multinspecificos que contienen uno o más dominios VHH y su i preparación, se hace también referencia a Conrath et al., J. Bi¿l . Chem . , Vol. 276, 10. 7346-7350, asi como también a la EP 0 822 985. Los enlazadores para su uso en polipéptidos multivalentes y multiespecificos serán comprensibles por la persora experimentada, y por ejemplo incluyen enlazadores gly-seir, por ejemplo del tipo (glyxsery)z, tal como (por ejemplo (gly4ser)3 o (gly3ser2)3, como se describe en la WO 99/42077, regiones similares a bisagra tales como las i regiories de bisagra de anticuerpos de cadenas pesadas de origen natural o secuencias similares. Para otros enlazadores adecuados, se hace también referencia a la técniqa antecedente general citada anteriormente. Algunos enlazadores particularmente preferidos se dan en la SEQ ID NO 83 a 85, en las cuales los enlazadores de la SEQ ID NO 84 y 8¡5 son particularmente preferidos.
Como se menciona anteriormente, los métodos descritos en la presente se ajustan particularmente para generar tales polipéptidos multivalentes o multiespecificos de la invención. En un polipéptido de la invención, al menos un Nanocuerpo también puede enlazarse a un dominio VH convercional o a un análogo natural o sintético de un dominio VH, opcionalmente a través de una secuencia enlaz dora.
¡ En un polipéptido de la invención, al menos un Nanocuerpo puede enlazarse también a un dominio VL o a un análogo natural o sintético de un dominio VL, opcionalmente a tra.vés de una secuencia enlazadora, de manera que propoi'ciona un polipéptido de la invención que está en la forma análoga a un fragmento scFv convencional, pero que contiene un Nanocuerpo en lugar de un dominio VH. En un polipéptido de la invención, al menos un Nanocuerpo también puede enlazarse a uno o más de un dominio CH1, CH2 y/o CH3, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora. Por ejemplo, un Nanocuerpo enlazado a un dominio CH1 adecuado podria utilizarse por ejemplo -junto con cadenas ligeras adecuadas - para generar fragmentos/estructuras de anticuerpo análogas a fragmentos Fab convencionales o fragmentos F(ab')2, pero en los cuales uno o (en caso de un fragmento F(ab')2) uno o ambos de los dominios VH convencionales se ha reemplazado por un Nanocuerpo. Tales fragmentos pueden ser también heteroespecificos o biespecificos, es decir, dirigirse contra, dos o más antigenos. Un nanocuerpo enlazado a los dominios CH2 y CH3 adecuados, por ejemplo derivados de Camélidos, podria utilizarse para formar un anticuerpo de cadenas pesadas monoespecifico o biespecifico . Finalmente, un Nanocuerpo enlazado a los dominios CH1, CH2 y CH3 adecúa.dos, por ejemplo, derivados de un ser humano, podria utili?.arse - junto con cadenas ligeras adecuadas - para formar' un anticuerpo que es análogo a un anticuerpo de 4 cadena.s convencionales, pero en el cual uno o ambos de los dominios VH convencionales se ha reemplazado por un Nanocuerpo. También, además de uno o más Nanocuerpos, los Polipéptidos de la Invención pueden también contener grupos funcionales, porciones ? residuos, por ejemplo, sustancias terapéuticamente activas, tales como aquellas mencionadas posteriormente, y/o marcadores o etiquetas, tales como marcadores fluorescentes, isótopos, etc., como se describe además más adelante. Los Nanocuerpos de la invención, los polipéptidos de la invención, y ácidos nucleicos que codifican los mismos, pueden prepararse en una manera conocida per se, como será comprensible por la persona experimentada a partir! de la descripción adicional en la presente. Algunos métodos preferidos, pero no limitantes para preparar los Nanocuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y técnicas mencionadas anteriormente y/o se describen además más adelante. Como será comprensible por la persona experimentada, un método particularmente útil para preparar un Nanocuerpo y/o un polipéptido de la invención comprende en general las etapas de: la expresión, en una célula huésped u organismo De acuerdo con una modalidad de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se define anteriormente. El ácido nucleico de la invención puede estar ta biéén en la forma de, presentarse en y/o ser parte de un vector , tal como por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC, el cüa 1 de nuevo puede estar en forma esencialmente aislada Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse en una manera conocida per se, basada en la información en las secuencias de aminoácidos para 1 os polipéptidos de la invención dados en la presente, y/o p'ueden aislarse a partir de una fuente natural adecuada. Para proporcionar análogos, las secuencias de nuclectidos que codifican dominios VHH de origen natural por ejemplo, pueden someterse a mutagénesis dirigida en el sitio, de manera que proporciona un ácido nucleico de la invención que codifica el análogo. También, como será comprensible por la persona experimentada, para preparar un ácido nucleico de la invención, también varias secuencias de nucleótidos, tal como al menos una secuencia de nuclectidos que codifica un Nanocuerpo y por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican uno o más enlazadores pueden unirse) juntos en una manera adecuada. Técnicas para generar los ácidos nucleicos de la como por ejemplo uno o más elementos reguladores adecuados (tal como uno o unos promotores, mejoradores, terminadores adecuados, etc.) y los elementos adicionales de las construcciones genéticas referidas más adelante. Tales construcciones genéticas que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención se referirán también en la presente como " construcciones genéticas de la invención ". Las construcciones genéticas de la invención puede ser ADN o ARN, y son de preferencia ADN de doble hebra. Las construcciones genéticas de la invención pueden también estar en una forma adecuada para transformación de la cédula huésped u organismo huésped pretendido, en una forma adecuada para integración en el ADN genómico de la célula huésped pretendida o en una forma adecuada de replicación, mantenimiento y/o herencia independientes en el organismo huésped pretendido. Por ejemplo, las construcciones genéticas de la invención pueden estar en la j forma ' de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar expresión in vi tro y/o in vivo (por ejemplo en una célula huésped, organismo huésped y/o sistema de expresión adecuado) . En una modalidad preferida, pero no limitante, una construcción genética de la invención comprende a) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado de forma operable a ¡ b) uno o más elementos reguladores, tal como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; c) y opcionalmente también d) uno o más elementos adicionales de construcciones genéticas conocidas per se; en los cuales los términos "elemento regulador", "prom tor", "terminador" y "conectado de forma operable" tiene su significado usual en la técnica (como se describe además posteriormente) ; y en los cuales los "elementos adicionales" presentes en las construcciones genéticas pueden ser por ejemplo secuencias 3' o 5' -UTR, secuencias liderés, marcadores de selección, marcadores de expreáión/genes reporteros y/o elementos que pueden facilitar o incrementar (la eficiencia de) la transformación o integración. Estos y otros elementos adecuados para las construcciones genéticas serán comprensibles por la persona experimentada, y pueden por ejempío depender del tipo de construcción utilizada, la célula huésped u organismo huésped pretendido; la manera en la cual las secuencias de nucleótidos de la invención de I interés van a expresarse (por ejemplo, a través de exprefión constitutiva, transitoria o inducible) ; y/o la técnica de transformación que se utiliza.
De preferencia, en las construcciones genéticas de la j invención, al menos un ácido nucleico de la invención y los! elementos reguladores, y opcionalmente uno o más elementos adicionales, se "enlazan de forma operable" entre si, por lo cual significa en general que están en una relación funcional entre si. Por ejemplo, un promotor se considera "enlazado de forma operable" a una secuencia de codificación si el promotor es capaz de iniciar o de otra forma controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de codificación (en la cual la secuencia de codificación debe entenderse como estando "bajo el control del" promotor) . En general, cuando dos secuencias de nu<j:leótidos se enlazan de forma operable, estarán en la misma ! orientación y usualmente también en el mismo marco de lectura. Éstas usualmente estarán también esencialmente contiguas, aunque esto puede no requerirse tampoco. De preferencia, los elementos reguladores y adicifnales de las construcciones genéticas de la invención son tales que son capaces de proporcionar su función biológica pretendida en la célula huésped u organismo huésped pretendido. Por ejemplo, un promotor, mejorador o terminador debe ser " operable " en la célula huésped u organismo huésped pretendido, por lo cual se da a entender que (por ejemplo) el promotor debe ser capaz de iniciar o de otra forma controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucléotidos - por ejemplo una secuencia de codificación - a la cual se enlaza operablemente (como se define en la presente) . Algunos promotores particularmente preferidos, incluyen, pero no se limitan a, promotores conocidos per se para ¡la expresión en células bacterianas, tales como aquellas mencionadas más adelante y/o aquellas utilizadas en los Ejemplos. Un marcador de selección debe ser tal que permita i - es pecir, bajo condiciones de selección apropiadas - que las células huésped y/u organismos huésped que se han transformado (exitosamente) con la secuencia de nucleótidos de la invención se distingan de las células huésped/organismos que no se han transformado (exitosamente) . Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales marcadores son genes que proporcionan resistencia contra antibióticos (tales como kanamicina o i ampicilina) , genes que hacen posible la resistencia a la tempe atura, o genes que permiten a la célula huésped u organismo huésped mantenerse en la ausencia de ciertos factores, compuestos y/o componentes (alimento) en el medio que sbn esenciales para la supervivencia de las células u organismos no transformados. j Una secuencia lider debe ser tal que - en la célul huésped u organismo huésped pretendido - permita las modificaciones de la traducción posterior deseadas y/o de manerai que dirija el ARNm transcrito a una parte deseada u organeilo de una célula. Una secuencia lider también puede permitjir la secreción del producto de expresión a partir de la célula. Como tal, la secuencia lider puede ser cualquier pro-, pre-, o prepro-secuencia operable en la célula huésped u organismo huésped. Las secuencias líderes pueden no requerirse para expresión en una célula bacteriana. , Un marcador de expresión o gen reportero debe ser - en la célula huésped u organismo huésped - la detección de la- expresión de (un gen o secuencia de nucleótidos presente en) la construcción genética. Un marcador de expresión también puede opcionalmente permitir la loralización del producto expresado, por ejemplo, en una parte u organelo especifico de una célula y/o en (a) la o las células, el o los tejidos, el o los órganos o la o las partes especificas de un organismo multicelular. Tales genes reporteros pueden también expresarse como una fusión de pioteina con la secuencia de aminoácidos de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes incluyen proteinas fluorescentes tales como GFP. ¡ Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de promotores, terminadores y elementos adicionales adecufdos incluyen aquellos utilizados en los Ejemplos posteriormente. Para algunos ejemplos (adicionales) no limitantes de los promotores, marcadores de selección, secuencias líderes, marcadores de expresión y elementos adicionales que pueden presentarse/utilizarse en las construcciones genéticas de la invención - tales como terminadores, mejoradores de transcripción y/o traducción y/o f ctores de integración - se hace referencia a los manuales generales tales como Sambrook et al . , y Ausubel et al., mencionados anteriormente, asi como también a los ejemplos que se dan en la WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06"37, WO 98/21355, US-A-6, 207 , 410, US-A-5, 693, 492 y EP 1 085 089. Otros ejemplos serán comprensibles por la persona experimentada. Se hace también referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente y las referencias adicionales citadas más adelante. invención en forma invención a uno! o más elementos adicionales descritos anteriormente, por ejemplo utilizando las técnicas descritas en los manuaies generales tales como Sambrook et al., y Ausubel et al., rkencionados anteriormente. ! A menudo, las construcciones genéticas de la invención se obtendrán al insertar una secuencia de nucleó/tidos de la invención en un vector (de expresión) i adecu do conocido per se. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de los vectores de expresión adecuados son aquelios utilizados en los Ejemplos posteriormente, asi como t.ambién aquellos mencionados posteriormente. Los ácidos nucleicos de la invención y/o construcciones genéticas de la invención pueden utilizarse para transformar una célula huésped u organismo huésped, es decir, para expresión y/o producción del Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Huéspedes o células huésped adecuados serán comprensibles por la persona experimentada, y pueden por ejemplo, ser cualquier célula o linea celular fungida, procariótica o eucariótica o por ejemplo, cualquier organismo fúngico, procariótico o eucariótico. una cepa bacteriana, incluyendo pero sin limitarse a cepas gram-negativas tales como cepas de Esche i chia coli ; de Proteus, por ejemplo, de Proteus mirab.llis; de Pseudomonas, por ejemplo de Pseudomonas i fl uor scens ; y cepas gram-positivas tales como cepas de Bacil? us, por ejemplo de Bacill us subtilis o de Bacill us ! brevi ; de Streptomyces, por ejemplo de Streptomyces livid$ns; de Staphylococcus , por ejemplo de Staphylococcus carnosus; y de Lactococus, por ejemplo de Lactococcus lactiX - una célula fúngica, incluyendo pero sin limitarse a células de la especie de Trichoderma , por ejemplo, de Tri choderma reesei ; de Na urospora , por ejemplo de Neurospora crassa , de Sordaría , por ejemplo de Sordaria macrospora ; de Aspergillus, por ejemplo de Aspergillus I Niger o de Aspergill us sojae; o de otros hongos filamentosos; - una célula de levadura, incluyendo pero sin limitairse a células de la especie de Saccharomyces , por ejemp].o de Saccharomyces cerevisiae; de Schi zosaccharomyces, por ejemplo de Schi zosaccharomyces pombe; de Pi chia , por ejemplo de Pi chia pastoris o de Pichia methanolica ; de Hansenula , por ejemplo de Hansenula polymorpha ; de Kl uyveromyces, por ejemplo de Kl uyveromyces lactis; de Arxula , por ejemplo de Arxula adeninivorans ; de Yarrouia , por ejemplo de Yarrowia lipolytica ; - una célula o linea celular anfibia, tal como Xenop s oocytes; una célula o linea celular derivada de insectos, tal como células/lineas celulares derivadas de lepidópteros, incluyendo pero sin limitarse a células de Spodoptera SF9 y Sf21 o células/lineas celulares derivadas de Drósophila , tal como células Schneider y Kc; ¡ - una planta o célula vegetal, por ejemplo en i plantas de tabaco; y/o - una célula o linea celular de mamífero, por ejemplo, una célula derivada o linea celular derivada de un ser humano, de los mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a células CHO, células BHK (por ejemplo, células BHK-21) y células o lineas celulares humanas tales como HeLa, COS (por ejemplo, COS-7) y células PER.C6; asi como todos los otros huéspedes o células huésped conocidas per se para la expresión y producción de i antic erpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo, pero sin ..imitarse a anticuerpos de dominio (sencillo) y i fragmentos de ScFv) , los cuales serán comprensibles por la persona experimentada. Se hace también referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente, asi como también por ejemplo la WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann y Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), suprai Joosten et al., (2005), supra; y referencias adiciónales citadas en la presente. Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención puedef introducirse y expresarse también en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo, para propósitos profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como una terapia genética) . Para este propósito, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden introducirse en las células o tejidos en cualqiiier modo adecuado, como (por ejemplo, utilizando liposomas) , o después de que se han insertado dentro de un vecto de terapia genética adecuada (por ejemplo, derivada de retrovirus tal como adenovirus, o parvovirus, tal como virus adeno-asociado) . Como será comprensible también por la persona experimentada, tal terapia genética puede realizarse in vivo y/o in si tu en el cuerpo de un paciente al administrar un ácido nucleico de la invención o un vector de terapia genética que codifica el mismo al paciente o a células especificas o un tejido u órgano especifico del paciente; o células adecuadas (a menudo tomadas del cuerpo del paciente que se trata, tal como linfocitos explantados, aspiraciones de médula ósea o biopsias de tejido) pueden tratarse in vitro con una secuencia de nucleótidos de la invención y luego (re- ) introducirse en forma adecuada dentro del cuerpo del I paciente. Todo esto puede realizarse utilizando vectores de terapia genética, técnicas y sistemas de suministro los cuales; son bien conocidos por la persona experimentada, i para (±ulver, K.W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y.). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Cir. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Cir. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998 , 692-699; Nabel, An. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-2 92 ; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00967, US 5,580,859, 1 US 5,5895466; o Schaper, Current Opinic n in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Por ejemplo, se ha descrito en la técnica la expresión in situ de fragme ntos de ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) y de diacuerpos (Blanco et al., J. Immunc 1, 171, 1070-1077 (2003) ) . Para expresión de los Nanocuerpos en una célula, éstos pueden también expresarse como "intracuerpos" asi llamados, como por ejemplo, los descritos en WO 94/02610, WO 95/ 22618 y US-A-7004940; WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca!, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Appliqations, Landes and Springer-Verlag; y en Kontermann, Methoc s 34, (2004) , 163-170. Para producción, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención pueden por ejemplo producirse también en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (véase por ejemplo US-A- 6,741,957, US-A-6,304,489 y US-A-6, 849, 992 para técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos) , en plantas o partes de plantas incluyendo, pero sin limitarse a sus hojas, flores, frutos, semillas, raices o tubérculos (por ejemplo en tabaco, maiz, soya o alfalfa) o en por ejempio, larvas del gusano de seda Bombix mori . Además, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención pueden expresarse y/o producirse también en sistemas de expresión libres de células, y ejemplos adecuados de tales sistemas serán comprensibles por la persora experimentada. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes incluyen la expresión en el sistema de germen de trigo; en lisatos de reticulocito de conejo; o en el sisteirla Zubay E . coli . Como se menciona anteriormente, una de las ventaj as del uso de los Nanocuerpos es que los polipéptidos basadc s en los mismos pueden prepararse mediante la exprésion en un sistema bacteriano adecuado, y sistemas de exprésion bacterianos adecuados, vectores, células huésped, eleme tos reguladores, etc., serán comprensibles por la persona experimentada, por ejemplo de las referencias i citadals anteriormente. Se debe observar, sin embargo, que la invención en su sentido más amplio no se limita a la i expresiión en los sistemas bacterianos. I I De preferencia, en la invención, se utiliza un I sisterra de expresión (in vivo o in vitro), tal como un sisterra de expresión bacteriana, que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es adecuada para su uso farmacéutico, y tales sistemas de expresión serán de nuevo comprensibles por la persona experimentada. Como feerá comprensible por la persona experimentada, los Polippptidos de la invención adecuados para su uso farmaqéutico pueden prepararse utilizando técnicas para síntesis de péptido. Para la producción en escala industrial, huéspedes heterólogos preferidos para la producción (industrial) de Nanocuerpos o terapia de proteina que contienen Nanocuerpos incluyen cepas de E . coli , Pichia pastoris , S . cerevisiae que son adecuados para expregión/producción/fermentación a gran escala, y en partidular para expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. Ejemplos adecuados de tales cepas serán comprensibles por la persona experimentada. Tales cepas y sistemas de producción/expresión están tambiéjn disponibles por compañías tales como Biovitrum (Uppsalla, Suecia) . I Alternativamente, lineas celulares de mamíferos, i en particular células de ovario de hámster chino (CHO) , pueden utilizarse para expresión/producción/fermentación a gran escala, en particular para i expres¡ión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala!. De nuevo, tales sistemas de expresión/producción están | también disponibles por algunas de las compañías mencionadas anteriormente.
La elección del sistema de expresión especifico podria depender en parte del requerimiento para ciertas modif caciones de post-traducción, más específicamente glicosilación. La producción de una proteina recombinante que contiene un Nanocuerpo para lo cual se desea o requiere la glicosilación necesitarla el uso de huéspedes de expresión de mamífero que tengan la capacidad de glicosilar la próteina expresada. En este aspecto, será comprensible por lal persona experimentada que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, la clase, número y posición de residuos unidos) dependerá de la célula o linea celular que se utiliz¡a para la expresión. De preferencia, se utiliza ya sea ur.a célula human o linea celular (es decir, conducir a una proteina que tiene esencialmente un patrón de glicosjilación humano) o se utiliza otra linea celular de mamifero que puede proporcionar un patrón de glicosilación que eis esencial y/o funcionalmente el mismo como la glicosDlación humana o al menos imita la glicosilación humanal. En general, huéspedes procarióticos tales como E. coli no tienen la capacidad para glicosilar proteinas, y el uso de eucariotes inferiores tales como levaduras se conduqen usualmente a un patrón de glicosilación que difiere de la glicosilación humana. No obstante, se debe entender que todas las células huésped y sistemas de expresiión anteriores pueden utilizarse en la invención, dependiendo del Nanocuerpo o la proteina deseada que se obtier e . i De este modo, de acuerdo con una Omodalidad no limit nte de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la invención se glicosila. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la invención no se glicosila. i De acuerdo con una modalidad preferida, pero no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la in ención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para producción farmaoéutica a gran escala, tal como células de las cepas mencionadas anteriormente. De acuerdo con otra modalidad preferida, pero no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de i la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como células de i las especies mencionadas anteriormente. ¡ De acuerdo con aún otra modalidad preferida, pero no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una linea celular humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una linea celular humana que es adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como Uas lineas celulares mencionadas anteriormente. Cuando la expresión de una célula huésped se utiliza para producir los Nanocuerpos y las proteinas de la invención, los Nanocuerpos y las proteinas de la invención pueden producirse ya sea intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego l aislarse desde las células huésped y opcionalmente purificarse además; o pueden producirse extracelularmente (por ejemplo, en el medio en el cual las células huésped se cultiv,an) y luego aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse además. Cuando se utilizan células huésped eucarióticas, la producción extracelular se prefiebre usualmente, ya que ésta facilita considerablemente el aislamiento adicional y procesamiento corriente abajo de I los tllanocuerpos y proteinas obtenidos. Las células bacterianas tales como las cepas de E. coli mencionadas anteriormente normalmente no secretan proteínas extracélularmente, excepto para unas cuantas clases de i proteinas tales como toxinas y hemolisina, y la producción secretora en E. coli se refiere al desplazamiento de proteínas a través de la membrana interna al espacio periplásmico. La producción periplásmica proporciona varias ventajas sobre la producción citosólica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos N-terminal del producto secretado puede (ser idéntica al producto genético natural después de la esqisión de la secuencia de señal de secreción por una I peptidpsa de señal especifica. También, parece haber mucho i I menos i actividad de proteasa en el periplasma que en el i citoplasma. Además, la purificación de la proteina es más simple debido a menos proteinas contaminantes en el periplasma. Otra ventaja es que los enlaces disulfuro correctos pueden formarse debido a que el periplasma proporciona un ambiente más oxidativo que el citoplasma.
Las proteinas sobreexpresadas en E. coli a menudo se encuentran en agregados insolubles, conocidos como cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión pueden ubicarse en el citosol o en el periplasma; la recuperación de proteinas biológicamente activas a partir de estos cuerpos de inclusion requiere un proceso de desnatiuralización/replegado. Muchas proteinas recomblinantes, incluyendo proteinas terapéuticas, se recuperan a partir de cuerpos de inclusión. i Alternativamente, como será comprensible por la persona experimentada, pueden utilizarse cepas recombinantes de bacterias que se han modificado genéticamente de manera que secretan una proteina deseada, y en particular un Nanocuierpo o un polipéptido de la invención. i ¡ De este modo, de acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la intención es un Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido intracelularmente y que se ha aislado de la célul huésped, y en particular desde una célula bacteriana o desde un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la invención es un Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido extracelularmente, y que se ha ai?lado a partir del medio en el cual se cultiva la célula! huésped. | Algunos promotores preferidos, pero no limitantes I para s|u uso con estas células huésped incluyen, i - para expresión en E. coli: el promotor lac (y derivados del mismo tal como el promotor lacUV5) ; promotor y promotor del operón promotor T7 (más eispecificamente aquel del gen 10 del fago T7) y otros promotores del fago T; promotor del gen de resistencia a tetracjiclina TnlO; variantes diseñadas de los promotores anteriores que incluyen una o más copias de una secuencia operadora reguladora externa; ¡ - para expresión en S. cerevisiae; constitutiva: i ADH1 ¡(alcohol deshidrogenasa 1), ENO (enolasa), CYCl (citocromo c iso-1) , GAPDH (gliceraldehidos-3-fosfato deshid^ogenasa) ; PGK1 (fosfoglicerato cinasa), PYK1 (piru?fato cinasa), regulada: GAL1,10,7 (enzimas metabólicas de galactosa) , ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2) , PH05 (ácido fosfatasa) , CUPl (metalotioneina de cobre) ; heterólogo; CaMV ¿promotor 35S del virus del mosaico de coliflor) ; | - para expresión en Pichia pastoris: el promotor AOXl (alcohol oxidasa I) para expresión en células de mamífero: me orador/promotor temprano inmediato de citomegalovirus humane (hCMV) , variante promotora temprana inmediata de I citomegalovirus humano (hCMV) que contiene dos secuencias operadoras de tetraciclina de manera que el promotor puede regularse por el represor Tet; promotor de timidina cinasa (TK) del Virus del Herpes Simple; mej orador/promotor de repetición Terminal larga del Virus de Sarcoma Rous (RSV LTR) ; promotor del factor de alargamiento la (hEF-la) de seres humanos, chimpancés, ratones o ratas; el promotor I tempratno SV40; promotor de repetición terminal largo VIH-1; promotor de ß-actina; ¡ Algunos vectores preferidos, pero no limitantes para s ? uso con estas células huésped incluyen: ?SV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y 1ZD35 (ATCC 37565),, asi como sistemas de expresión con base viral, tales ¡como aquellos basados en adenovirus; I - vectores para expresión en células bacterianas; vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen) ; i - vectores para expresión en levadura u otras célula!s fúngicas; pYES2 (Invitrogen) y vectores de expres?ón de Pichia (Invitrogen); - vectores para expresión en células de insectos; pBlueBacII (Invitrogen) y otros vectores de baculovirus - vectores para expresión en plantas o células vegetai ,les; por ejemplo, vectores con base en virus de mosaico de coliflor o virus de mosaico de tabaco, cepas adecúa as de Agrobacterium, o vectores con base en plásmido Ti. i Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitantes para su uso con estas células huésped incluyen: | - para su uso en células bacterianas tales como E. coiji: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StlI, PhoA, PhoE, ¡MalE, Lpp, LamB y similares; péptido de señal TAT, señal tie secreción C-terminal de hemolisina i - para su uso en levadura: prepro-secuencia de factor de acoplamiento a, fosfatasa (phol) , invertasa (Suc) , etc. ; ! - para su uso en células de mamíferos: señal indígena en caso de la proteina objetivo es de origen eucariótico; de péptido de señal V-J2-C de cadena K de Ig de murino; etc. I Técnicas adecuadas para transformar un huésped o célula! huésped de la invención serán comprensibles por la persoHa experimentada y pueden depender de la célula huésped/organismo huésped pretendido y la construcción genética que se utiliza. Se hace de referencia de nuevo a los jnanuales y solicitudes de patente mencionadas anteri1ormente. j Después de la transformación, puede realizarse una e;apa para detectar y seleccionar aquellas célalas huésped u organismos huésped que se han transformado exitosamente con la secuencia de nucleótidos/construcción genética de la invención. Esto puede por ejemplo ser una etapa de selección basada en un marcador seleccionable presente en la construcción genética de la invención o una etapa ' que implica la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos. ! La célula huésped transformada (la cual puede estar I en la forma de una linea celular estable) u organismos huésped (los cuales pueden estar en la forma de una linea mutante estable o cepa) forman aspectos adicio ales de la presente invención.
De preferencia, estas células huésped u organijsmos huésped son tales que expresan, o son capaces (al menos) de expresar (por ejemplo, bajo condiciones adecuadas) , una secuencia de aminoácidos de la invención (y i en ca¿o de un organismo huésped; en al menos una célula, parte,¡ tejido u órgano del mismo). La invención también incluye generaciones adicionales, progenie y/o descedientes de la célula huésped u organismo huésped de la invención, que pu'eden por ejemplo obtenerse por división celular o por I reproducción sexual o asexual. i ¡ Para producir/obtener la expresión de las secuen ias de aminoácidos de la invención, la célula huésped transformada u organismo huésped transformado pueden retenerse, mantener y/o cultivarse generalmente bajo condiciones tales que la secuencia de aminoácidos (deseada) de la ¡invención se exprese/produzca. Condiciones adecuadas serán ¡ comprensibles por la persona experimentada y dependerán usualmente de la célula huésped/organismo huésped utilizado, asi como en los elementos reguladores que co trolan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relev nte) de la invención. De nuevo, se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionadas anteriormente en los párrafos en las construcciones genéticas de la invención. En general, condiciones adecuadas pueden incluir el usó de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor o compuesto de inducción adecuado (por ejemplo, cuandc las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible); todos los cuales pueden seleccionarse por la persona experimentada. De nuevo,' bajo tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden expresarse en una manera constitutiva; en una manera transitoria, o solamente cuando se indjucen de forma apropiada. Será comprensible por la persona experimentada que la secuencia de aminoácidos de la invención puede (primeíro) generarse en una forma inmadura (como se menciona i anteriormente) , la cual puede entonces someterse a i modificación de post-traducción, dependiendo de la célula huésped/organismo huésped utilizado. También, la secuencia de aminoácidos de la invención puede glicosilarse, i dependiendo nuevamente de la célula huésped/organismo huésped utilizado. I La secuencia de aminoácidos de la invención puede entonces aislarse a partir de la célula huésped/organismo huésped y/o desde el medio en el cual se cultivó la célula huésped u organismo huésped, utilizando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteina conocidas per se, tales como técnicas de cromatografía (preparativa) y/o de electrbforesis, técnicas de precipitación diferencial, técni .cas de afinidad (por ejemplo, utilizando una secuencia de aminoácidos especifica, escindible fusionada con la secuen ia de aminoácidos de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, utilizando anticu erpos contra la secuencia de aminoácidos que se aisla En general, para su uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención pueden formularse como una preparación farmacéutica que comprende al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador, diluye te o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptaole y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente aceptables adicionales. Por medio de ejemplos no limitantes, tal formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa) , para administración tópica, para administración por inhalación, por un parche dérmico, por un implante, por un supositorio, etc. Tales formas de administración adecuadas - las cuales pueden ser sólidas, semi-splidas o liquidas, dependiendo de la manera de administración - asi como métodos y portadores para su uso en la preparación de los mismos, serán comprensibles por la persona experimentada y se describen adicionalmente más adelante. De este modo, en un aspecto adicional, la invención se relaciona a una composición farmacéutica que contiene al menos un Nanocuerpo de la invención o al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador adecuado (es decir, un portador adecuado para su uso veterinario) , y opcionalmente una o más sustancias activas adiciónales. Una modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido que comprende: al menos un nanocuerpo de la invención, es decir, dirigido contra cualquiera del dominio vWF, vWF Al, dominio Al del dominio vWF, vWF A3 activado. ¡ Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, en donde el Nanocuerpo de la invención dirigido contra el dominio Al de vWF activado reconoce específicamente la conformación vWF activada en el sitio de formación de trombo, pero no se une a formas inactivadas circulantes de vWF. , ! Los Nanocuerpos de la invención pueden también dirigirse contra un fragmento del dominio vWF, vWF Al, el tal como un fragmento capaz de producir una respuesta inmune. Un objetivo es también un fragmento del dominio vWF, vWF Al, i dominio Al del dominio vWF, vWF A3, capaz de unirse a un Nanocuerpo de la invención proyectado contra el objetivo de longitud total ^progenitor' . Un fragmento como se utiliza en la presente se refierfe a menos de 100% de la secuencia (por ejemplo, 99%, 90%, ^0%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, etc.), pero comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos. Un fragmento es de suficiente longitud de manera que la interacción de interés se mantiene con afinidad de 1 x 10-6 M o mejor. Un fragmento como se utiliza en la presente se refiere también a inserciones, eliminaciones y sustituciones opcionales de uno o más aminoácidos los cuales no alteran sustancialmente la capacidad del objetivo I para enlazarse a un Nanocuerpo de la invención proyectado I contra el objetivo de tipo silvestre. El número de inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos es de preferencia de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 21 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ó 70 aminoácidos.
Un Nanocuerpo de la invención dirigido contra un objetivo significa en general un Nanocuerpo de la invención que es capaz de enlazarse a su objetivo con una afinidad mejor que 10"6 M. Otra modalidad de la presente invención es una constnucción de polipéptido como se describe anteriormente en onde a menos un Nanocuerpo de a nvenc n es un anticuerpo VHH Camelidae. ¡ Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, en donde el Nanocuerpo de la invención es una secuencia homologa, una porción funcional, o una porción funcional de una secuencia homologa del Nanocuerpo de longitud total de I la intención. Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, en donde la construcción de polipéptido es una secuencia homologa de la construcción de polipéptido, una porción i funcional de la misma, de una secuencia homologa de una porción funcional de la misma. Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, que ccjmprende además al menos un Nanocuerpo de la invención dirigida contra una o más proteinas séricas, en particular una o más proteínas séricas humanas. Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido como se describe anteriormente en dónde al menos una proteina sérica (humana) es cualquiera de albúmina sérica (humana) , inmunoglobulinas sérica's (humanas) , proteina de enlace de tiroxina (humana) , transferrina (humana) , o fibrinógeno (humano) o un fragmento de los mismos. De acuerdo con un aspecto especifico, pero no limita te de la invención, los polipéptidos de la invención I contie en, además de uno o más Nanocuerpos de la invención, al mehos un Nanocuerpo contra albúmina sérica humana.
Aunque estos Nanocuerpos contra albúmina sérica humana i pueden1 ser como se describe generalmente en WO4/062551 o en las referencias adicionales citadas en la presente, de acuerdó con una modalidad particularmente preferida, pero no limitante, tal Nanocuerpo contra albúmina sérica humana consisjte de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones que determinan complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente) , en las cuales i) CDRl es una secuencia de aminoácidos elegida a RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO: 54] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, de preferencia al i menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia (como ¡se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en las cuales 1) cualquier sustitución de aminoácidos es de preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en la presente) ; y/o | (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoápidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "diferencia de aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las i secuencias de aminoácidos, en las cuales: (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora j (como se define en la presente) ; y/o i (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia i contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores; I y en las cuales: iii) CDR3 es una secuencia de aminoácidos elegida del gr|apo que consiste de: DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 55] o del grupo que consiste de secuencias de ammoa :idos que tienen al menos 80%, de preferencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en las cuales (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora [como µe define en la presente) ; y/o 2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contiehe solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 de "la o las diferencias de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en las cuales : (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en la presente) ; y/o | (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores; o del grupo que consiste de: GGSLSR [SEQ ID NO: 56] RRTWHSEL [SEQ ID NO: 57] j GRSVSRS [SEQ ID NO: 58] GRGSP [SEQ ID NO: 59] ¡ y/o del grupo que consiste de secuencias de "la o las presente) cuales: (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no i I eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con i las secuencias de aminoácidos anteriores. En otro aspecto, la invención se relaciona a un Nanocu^rpo contra vWF, el cual consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones que ¡determinan complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente) , el cual se elige del grupo que consiste de Nanocuerpos con una de las siguientes combinaciones de i CDRl, CDR2 y CDR3, respectivamente: - CDRl SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3 : GGSLSR; - CDRl LNLMG; CDR2 : TITVGDSTNYADSVKG; CDR3 : RRTWHSEL; - CDRl INLLG; CDR2 : TITVGDSTSYADSVKG; CDR3 : RRTWHSEL; - CDRl: SFGMS; CDR2 : SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3 : GRSVSRS; - CDRl : SFGMS; CDR2 : AISADSSDKRYADSVKG; CDR3 : GRGSP; - CDRl1: SFGMS; CDR2 : AISADSSDKRYADSVKG; CDR3 : GRGSP; - CDRl NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3 : DREAQVDTLDFDY.
En los Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de CDR mencionadas anteriormente, cada CDR puede reemplazarse por una CDR elegida del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, <jie preferencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con i las CEiR mencionadas anteriormente; en las cuales (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de I preferencia una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contiene solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o se eligen del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 tomo se indica en el párrafo anterior) de "la o las diferencias de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores de la o las CDR mencionadas anteriormente, en las cuales: (1) cualquier sustitución de aminoácidos es de prefer ncia una sustitución de aminoácidos conservadora (como e define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos de preferencia contie :?e solamente sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, comparadas con las secuencias de aminoácidos anteriores. Sin embargo, de los Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de las CDR mencionadas anteriormente, los Nanocuerpos que comprenden una o más de las CDR listadas anteriormente son particularmente preferidas; los Nanocuerpos que comprenden dos o más de las CDR iistadas anteriormente son más particularmente preferidas ; y los Nanocuerpos que comprenden tres de las CRD listadas anteriormente son más particularmente preferidas . En estos Nanocuerpos contra albúmina sérica humana, las Regiones FRl a FR4 de estructura base son de preferencia como se definen anteriormente para los Nanocuprpos de la invención. Nanocuerpos particularmente preferidos contra albúmina sérica humana se eligen desde el grupo que consiste de las SEQ ID NO: 107-121. Éstas corresponden a los Nanocuerpos contra albúmina sérica humana de las SEQ ID NO: 61 a 67, SEQ ID NO 87 a 89 y SEQ ID NO 100-104 de la Norteamericana co-pendiente del Improved Nanobodies™ aga ins t Tumor con una fecha de presentación del 18 Más generalmente, los Nanocuerpos contra albúmina sérica adecuada para su uso en la invención se describen en la solicitud Internacional por el solicitante titulada "serum albumin brinding proteins" con una fecha de presentación internacional del 17 de mayo del 2006. Otra modalidad de la presente invención es un ácido inucleico que codifica una construcción de polipéptido como sie describe anteriormente. i Otra modalidad de la presente invención es una composición que comprende una construcción de polipéptido como se describe anteriormente y al menos un agente trombclitico, para administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto. ¡ Otra modalidad de la presente invención es una composición como se describe anteriormente en donde el agente trombolitico es cualquiera de estafilocinasa, activador de plasminógeno de tejido, estreptocinasa, estreptocinasa de cadena sencilla, urocinasa y complejo de acilo plasminógeno estreptocinasa. Otra modalidad de la presente invención es una constricción de polipéptido como se describe anteriormente, o un ácido nucleico como se describe anteriormente, o una composición como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos que se I relacionan a agregación mediada por plaquetas o disfunción I de las! mismas . Otra modalidad de la presente invención es un uso de una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, o un ácido nucleico como se describe anteriormente, o una composición como se describe anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos que se relacionan a agregación mediada por plaquetas o disfunción de last mismas. Otra modalidad de la presente invención es una I constricción de polipéptido, ácido nucleico o composición i como se describe anteriormente o un uso de una construcción de po'lipéptido, ácido nucleico o composición como se describe anteriormente en donde tales trastornos son | cualesquiera que se originan de ataque isquémico cerebral transitorio, angina inestable o estable, angina de pecho, infartó- cerebral, infarto de miocardio, enfermedad oclusiva arterial, oclusión coronaria aguda, restenosis, restenosis despué|s de PCTA o estenosis, formación de trombo en arterias estenosas, hiperplasia después de angioplastia, ateredtomia o estenosis arterial, sindrome oclusivo en un I sistepja vascular o falta de permeabilidad de arterias enfermas . | Otra modalidad de la presente invención es una construcción de polipéptido, ácido nucleico o composición como se describe anteriormente o un uso de una construcción de pdlipéptido, ácido nucleico o composición como se describe anteriormente en donde tal trastorno es una formación de placa o trombo en ambientes muy escarpados.
Otra modalidad de la presente invención es una composición construcción de poiipéptido como se describe anteriormente en donde la construcción de polipéptido se administra en forma intravsnosa, subcutánea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectal o por inhalación. Otra modalidad de la presente invención es una composición que comprende una construcción de polipéptido como ée describe anteriormente o un ácido nucleico que codifiba tal construcción de polipéptido, o una composición como se describe anteriormente y un vehiculo farmacéuticamente aceptable. Otra modalidad de la presente invención es un método para producir un polipéptido como se describe anteriormente, que comprende ¡ (a) cultivar células huésped que comprenden ácido i nucleibo capaz de codificar un polipéptido como se describe I anteriormente bajo condiciones que permiten la expresión del po-ipéptido, y, (b) recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo. Otra modalidad de la presente invención es un método como se describe anteriormente, en donde las células huésped son bacterianas o de levadura. i Otra modalidad de la presente invención es un I método1 para tratar dispositivos médicos invasivos para prevenir agregación mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasión que comprende la etapa de recubrir el dispositivo con una construcción de polipéptido como se describe anteriormente. i Otra modalidad de la presente invención es un dispositivo médico invasivo para maniobrar la agregación I mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasión, en donde el dispositivo se recubre con una construcción de polipéjptido como se describe anteriormente. Otra modalidad de la presente invención es un métodoi para identificar un agente que modula agregación mediada por plaquetas que comprende (a) poner en contacto una construcción de polipéjptido como se describe anteriormente con un i polipéptido que corresponde a su objetivo, o un fragmento i del mismo, en la presencia y ausencia de un modulador candidato bajo condiciones que permiten la unión entre tales polipéptidos, y i (b) medir el enlace entre los polipéptidos de la t etapa (a) , en donde una disminución en el enlace en la presencia del modulador candidato, con relación al enlace en la ausencia del modulador candidato identifica al modulador candidato como un agente que modula agregación mediada por plaquetas. Otra modalidad de la presente invención es un equipo para seleccionar agentes que modulan la agregación mediada por plaquetas de acuerdo con el método como se descri oe anteriormente. Otra modalidad de la presente invención es un agente desconocido que modula agregación mediada por plaquetas identificada de acuerdo con el método como se describe anteriormente. Otra modalidad de la presente invención es un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizada por disfunción de agregación mediada por plaquetas que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra con una construcción de polipéptido como se describe anteriormente, (b) detectar el enlace de la construcción de polipéptido a la muestra, y ! (c) comparar el enlace detectado en la etapa (b) I con uno estándar, en donde una diferencia en el enlace con relación a la muestra es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por disfunción de agregación mediada por plaquetas. Otra modalidad de la presente invención es un equipoi para seleccionar un diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por disfuncion de agregación mediada por plaquetas de acuerdo conl método como se descripe anteriormente . Otra modalidad de la presente invención es un equipo como se describe anteriormente que comprende una construcción de polipéptido como se describe anteriormente. En los polipéptidos de la invención, uno o mas de los Nanocuerpos de la invención los cuales se dirigen contra un objetivo pueden ser de la misma secuencia. Alternativamente, pueden no tener toda la misma secuencia.
Está dentro del alcance de la invención que un polipéptido de la | invención comprenda Nanocuerpos anti-objetivo de la invención los cuales no comparten la misma secuencia, pero los cu|ales se dirigen contra el mismo objetivo, o fragmento del mismo, uno o más antigenos del mismo. Es otro aspecto de la invención que el polipébtido de la invención comprenda dos o más Nanocuerpos de la invención, en donde cualquiera de los dos Nanocuerpos de ia invención se dirigen contra diferentes epitopps/objetivos, es decir, cualquiera del dominio vWf, vWF Al, dominio Al del dominio vWF, vWF A3 activado. Otro aspecto de la invención es un polipéptido biespejcifico de la invención que comprende un Nanocuerpo de la invención dirigido contra el dominio vWF Al, dominio Al de vWF| activado, y otro Nanocuerpo de la invención dirigido contra el dominio vWF A3. Tal polipéptido biespecifico de la invención inhibe la interacción entre vWF y colágeno, y la interacción entre vWF y plaquetas. De acuerdo con un aspecto de la presente ínvencion un polipéptido de la invención puede comprender dos o más Nanocuerpos de la invención los cuales se han unido, Los Nanocuerpos de la invención pueden ser idénticos en secuencia y dirigirse contra el mismo objetivo o antigeno. Dependiendo del número de los VHH enlazados, o tienen moléculas de valencia más elevada. La presente invención también se relaciona con el descubrimiento de que un polipéptido de la invención que comprende además uno o más Nanocuerpos de la invención, cada uno dirigido contra una proteina sérica de un sujeto, sorprendentemente tiene una vida media notablemente prolorgada en la circulación sanguínea del sujeto comparada I con lá vida media del Nanocuerpo anti-objetivo de la o las invenciones cuando no es parte de la construcción. Además, se encontró que las construcciones exhiben las mismas propiedades favorables de los VHH tal como alta estabilidad que permanece intacta en ratones, resistencia a pH extremoso, estabilidad a alta temperatura y alta afinidad al objetivo. La proteina sérica puede ser cualquier proteina adecuada encontrada en el suero del sujeto o fragmento del mismo1. En un aspecto de la invención, la proteina sérica es albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteina de enlace de tiroxina, transferrina o fibrinógeno. Dependiendo del µso pretendido tal como la vida media requerida para tratamiento y/o compartimentación del antigeno objetivo, la pareja de VHH puede dirigirse a una de las proteinas séricas anteriores. l Tales construcciones son capaces de circular en el suero del sujeto durante varios dias, reduciendo la frecuencia de tratamiento, la inconveniencia para el sujeto y resulta en un costo disminuido de tratamiento. Además, es un aspecto de la invención que la vida media del polipéptido de la invención descrita en la presente pueda controlarse por el número de Nanocuerpos de proteina anti-suero de la invención presente en la construcción. Una vida media! controlable es deseable en varias circunstancias, por ejemp|lo, en la aplicación de una dosis planeada de un polipéptido terapéutico de la invención. Otra modalidad de la presente invención es un polipléptido de la invención como se menciona en la presente, que comprende además un agente trombolitico. Tal agente trombolitico puede unirse en forma no covalante o covalente a un Nanocuerpo de la invención mediante medios covalentes o no covalentes. Tales medios covalentes se describen posteriormente. Medios no covalentes incluyen mediante una interacción de proteina I tal como biotina/estrepavidina o mediante un inmunoconj ugado . Alternativamente, el agente trombolitico puede ¡ adminjlstrarse en forma simultánea, separada o secuencial con respecto a un polipéptido de la invención. Otro aspecto de la invención es una composición que comprende al menos un polipéptido de la invención y al menos un agente trombolitico, para administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto. | Un aspecto de la invención es un método para trata}: una enfermedad autoinmune que comprende administrar a unj individuo una cantidad efectiva de al menos un polipéptido de la invención y al menos un agente trombolitico, en forma simultánea, separada o secuencial. | Otro aspecto de la invención es un equipo que contiene al menos un polipéptido de la invención y al menos i un ajjente trombolitico para administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto. Es un aspecto de la i invención que el equipo pueda utilizarse de acuerdo con la invención. Es un aspecto de la invención que el equipo pueda tratar las enfermedades como se cita en la presente.
! Por administración simultánea se da a entender que e'i polipéptido y agente trombolitico se administran a un sujjeto al mismo tiempo. Por ejemplo, como una mezcla o una icomposición que comprende tales componentes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a una solución I administrada intravenosamente, una tableta, liquido, crema tópica, etc., en donde cada preparación comprende los componentes de interés. Por administración separada se da a entender que el polipéptido y el agente trombolitico se administran a un sujetó al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo.
Los ' componentes se presentan en el equipo como preparaciones separadas, no mezcladas. Por ejemplo, el polipáptido y el agente trombolitico pueden presentarse en el equipo como tabletas individuales. Las tabletas pueden admin-strarse al sujeto tragando ambas tabletas al mismo tiempo, o una tableta directamente después de la otra. i Por administración secuencial se da a entender que ei polipéptido y el agente trombolitico se administran a un i sujeto secuencialmente. El polipéptido y el agente I trombplitico se presentan en el equipo como preparaciones separ das, no mezcladas. Existe un intervalo de tiempo entre' las dosis. Por ejemplo, un componente podria administrarse hasta a 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, j.44, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 ó 0.5 horas después del otro componente. i En la administración secuencial, puede administrarse un componente una vez, o cualquier número de veces y en varias dosis antes y/o después de la administración de otro componente. La administración secuencial puede combinarse con administración simultánea o secuencial . i Los usos médicos del polipéptido de la invención descritos posteriormente, también se aplican a la composición que comprende un polipéptido de la invención y al menos un agente trombolitico de polipéptido, para administración simultánea, separada o secuencial a un i sujetó como se describe aqui anteriormente. Los agentes tromboliticos de acuerdo con la invenbión pueden incluir, por ejemplo, estafilocinasa, activador del plasminógeno de tejido, estreptocinasa, i estreptocinasa de cadena sencilla, urocinasa y complejo de acilo¡ plasminógeno estreptocinasa. Los Nanocuerpos de la invención pueden unirse para ¡ formar cualquiera del polipéptido de la invención descrita en la presente que comprende más de un Nanocuerpo I de la| invención utilizando métodos conocidos en la técnica o cuajlquier método futuro. Por ejemplo, pueden fusionarse por reticulación quimica haciendo reaccionar residuos de amino cido con un agente de derivación orgánica tal como se describe por Blatter et al, Biochemistry 24,1517-1524; EP2941703. Alternativamente, el Nanocuerpo de la invención puede; fusionarse genéticamente en el nivel del ADN, es decir, una construcción de polinucleótido formada la cual codifica el polipéptido completo de la invención que comprende uno o más Nanocuerpos anti-objetivo de la invención y uno o más Nanocuerpos de proteina anti-suero de la i vención. Un método para producir un polipéptido VH bivalente o multivalente de la invención se describe en la solicitud de patente PCT WO 96/34103. Una forma de unir múltiples Nanocuerpos de la invención es a través de la ruta genética uniendo el Nanocuerpo de las secuencias de i codifp-cación de la invención ya sea directamente o a través de u enlazador peptidico. Por ejemplo, el extremo C-terminal del primer Nanocuerpo de la invención puede unirse i al extremo N-terminal del siguiente Nanocuerpo de la invención. Este modo de unión puede extenderse con el fin de urir Nanocuerpos adicionales de la invención para la construcción y producción de construcciones tri-, tetra-, i etc. , ¡ funcionales. El polipéptido de la invención descrito en la presente puede hacerse por el técnico calificado de acuerdo con métodos conocidos en la técnica o cualquier método futuro. Por ejemplo, los VHH pueden obtenerse utilizando conocidos en la técnica tales como al inmunizar un y al obtener hibridomas del mismo, o al clonar una biblioteca de Nanocuerpos de la invención utilizando técnicas de biologia molecular conocidas en el arte y la selección subsecuente al utilizar despliegue de fago. Los Nanocuerpos tienen una estructura única que consiste en un dominio variable sencillo. Las moléculas de VHH derivadas de anticuerpos de Camello están entre los dominios de enlace de antigeno intacto más pequeño conocidos (aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeño que un IgG convencional) y por lo tanto están bien adaptados hacia el suministro en tejidos densos y para acceder el espacio limitado entre las macromoléculas que participan en o inician el proceso de agregación mediada por plaquetas. A pesar del tamaño pequeño de los nanocuerpos, y de este modo de las ventajas para penetración, es sorprendente aún que tal molécula pequeña pueda inhibir inter,cciones entre polimeros grandes tales como vWF (hasta 60 mo ómeros) y colágeno y con tal eficiencia elevada. Se I ha descrito que sólo las formas multiméricas grandes de vWF ¡ son nemostáticamente activas (Furlan, M. , 1996, Ann. i Hematol. 72:341-348). El enlace de vWF multimérico a colágeno ocurre con una afinidad -100 veces más elevada que el enlace de los fragmentos de vWF monoméricos. Los resultados de los experimentos de esfuerzo cortante elevado indican que puede administrarse a los pacientes una dosis más baja. Por lo tanto, se esperan i menos efectos secundarios (tal como inmunogenicisad o prob emas de sangrado) . En otra modalidad de la presente invención, un polipéptido de la invención comprende uno o más Nanocuerpos de la invención dirigidos al mismo objetivo, y además compr.ende uno o más Nanocuerpos de la invención dirigidos al milsmo objetivo, pero a un diferente epitopo en el mismo dominio. Otra modalidad de la presente invención es un polipéptido de la invención en donde el número de Nanocuerpos de la invención dirigido al mismo objetivo es dos o más. modalidad de la presente invención, un invención comprende uno o más Nanocuerpos de lal invención dirigidos a un dominio del mismo objetivo, y uno o más Nanocuerpos de la invención dirigidos al mismo objetivo, pero a otro dominio del mismo objetivo. Ejemplos de deferentes dominios podrían ser los dominios Al y A3 de I vWF. | Es un aspecto no limitante de la invención que al rigido al dominio Al en un polipéptido de la invención reconozca la conformación activ^ de vWF. Tal polipéptido de la invención puede tener efectos anti-trombóticos superiores comparados con los VHH monomlricos. Se realizó el experimento de perfusión en una cámara de flujo, para estudiar la agregación de plaquetas bajo ¡esfuerzo cortante elevado para estudiar los efectos de estosj polipéptidos de la invención. El descubrimiento de Nanocuerpos de origen natural de la invención en llamas, dromedarios y Camélidos reveló una nueva clase de moléculas terapéuticas las cuales combinan las ventajas de anticuerpos monoclonales por ejemplo, especificidad, toxicidad baja con las ventajas de pequeñas moléculas por ejemplo penetración y estabilidad de tejido. Desafortunadamente, el desarrollo de productos terapéuticos apropiados con base en estas proteinas tiene la desventaja de derivarse de los Camelidae, y no asi de un ser humano. Proteinas no humanas contienen residuos de aminoácido que pueden ser inmunogénicas cuando se inyectan en urt paciente humano. Aunque estudios han demostrado que los VHH derivado de los Camelidae no son inmunogénicos cuando se inyectan en ratones, es preferible reemplazar residuos de Camelidae por residuos humanos. Estos polipéptidos humanizados deben ser sustancialmente no inmun|ogénicos en seres humanos, pero retienen la afinidad y actividad del polipéptido de tipo silvestre. El resultado de humanización es de preferencia I inmunogenicidad en la administración en pacientes es menor o inexistente. Al humanizar un polipéptido, de acuerdo con la presente invención, comprende una etapa para reemplazar uno o más de los aminoácidos de los Camelidae por su contraparte humana como se encuentra en la secuencia consenso humana, sin que el polipléptido pierda su carácter tipico, es decir la humanización no afecta notablemente la capacidad de enlace del antigeno del polipéptido resultante. La WO 04/062251 y la descripción adicional en la presente describe algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de residuos de aminoácido del dominio variable de anticuerpo (VHH) el cual puede modificarse sin disminuir la afjinidad nativa del dominio para el antigeno y 'mientras redu?e su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga; el uso de los VHH que tienen modificaciones en los ¡residuos identificados los cuales son útiles para administración a especie heteróloga; y al VHH asi modificado. Más específicamente, la invención abarca también la preparación de los VHH modificados, los cuales se nidifican por la administración a seres humanos, los VHH-resultantes mismos, y el uso de tales VHH "humanizados" en el tr'atamiento de enfermedades en seres humanos. ; Como se menciona en la WO 04/062551 y en la descripción adicional en la presente, la humanización de los polipéptidos de VHH requieren la introducción y mutagénesis de solamente un número limitado de aminoácidos en una cadena de polipéptido sencilla sin pérdida dramática de actividad de enlace y/o inhibición. Esto es en contraste a la¡ humanización de ScFv, Fab, (Fab) 2 e IgG, lo cual requijere la introducción de cambios de aminoácido en dos I caderas, la cadena ligera y la pesada y la conservación del ensamble de ambas cadenas. Una técnica de humanización puede realizarse por un método que comprende el reemplazo de cualquiera de los siguientes residuos ya sea solos o en combinación: posiciones 1, 5, 28 y 30 de FRl, el aminoácido de marca en la posición 37, 44, 45 y 47 en residuos FR2, FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94 y las posiciones 103, 104, 108 y 111 en FR4; numerando de acuerdo con la numeración Kabat Los Nanocuerpos de la invención tienen un grado elevado de homología a la linea germinal humana VH DP-47.
La humanización adicional también puede implicar la introducción y mutagénesis de una cantidad limitada de aminoácidos en una cadena de polipéptido sencillo. Esto es en contraste a la humanización de scFv, Fab, (Fab) 2 e IgG, lo cual requiere la introducción de cambios de aminoácido i en dos cadenas, la cadena ligera y la pesada y la conservación del ensamble de ambas cadenas. ! Los polipéptidos contienen residuos con características humanas en FR2. La humanización también puede implicar mutagénesis de residuos en FRl en la posición 1 y 5, las cuales se introdujeron por el cebador utilizado para clonación de repertorio y no se originan de forma natural en la secuencia de llama. La mutagénesis de aquellos residuos no resultó en la pérdida de actividad de enlace y/o inhibición. La humanización de FRl también requiere mutagénesis de la posición 28 y 30. La mutagénesis de aquello residuos no resultó tampoco en la pérdida de actividad de enlace y/o inhibición. //////La humanización también puede implicar mutagénesis de residuos en FR3 en la posición 74, 75, 76, 83, 84, 93, 94. La mutagénesis de aquellos residuos no resultó en la pérdida de actividad de enlace y/o inhibícion. La humanización también puede implicar mutagénesis de residuos en FR4 en la posición 104, 108 y 111. I La mutagénesis de Q108L resulta en el nivel de producción inferior en Escherichia coli. La posición 108 es i solve te expuesto en VHH de Camélidos, mientras en los anticuerpos humanos esta posición se enmascaró en la interfase VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997) . En la posición 108 de VHs aislada se expone el solvente. La introducción de un Leu hidrofóbico no polar en lugar de un Gln S|in carga polar puede tener un efecto drástico en la plegabilidad/estabilidad intrínseca de la molécula. ¡ Una modalidad de la presente invención es un método para humanizar un VHH que comprende las etapas de: [a) reemplazar cualquiera de los siguientes residuos ya sea solos o en combinación: Posiciones 1, 5, 28 y 30 de FRl, el aminoácido de marca (residuo distintivo) en la posición 37, 44, 45 y 47 en FR2, residuos 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94 de FR3, y posiciones 103, 104, 108 y 11 en FR4 ; numerando de acuerdo con la numeración Rabat . Ejemplos de tales secuencias humanizadas se dan posteriormente y en la lista de secuencias anexa. El uso de anticuerpos derivados de fuentes tales como ¡ ratón, oveja, cabra, conejo etc., y derivados humanizados de los mismos como un tratamiento para condiciones las cuales requieren una modulación de agregación asociada con plaquetas, es problemático por varias razones. Anticuerpos tradicionales no son estables a tempejratura ambiente, y tienen que refrigerarse para la preparación y almacenamiento, requiriendo equipo de laboratorio refrigerado necesario, almacenamiento y transporte, lo cual contribuye a tiempo y gasto. La refriberación es algunas veces no factible en paises desarrollados. Los rendimientos de expresión de tales moléculas Fab son muy bajos y el método de producción es de labor muy intensa. Además, la fabricación de producción de pequeña escala de tales anticuerpos es cara debido a que los sistemas celulares de mamífero necesarios para la expresión de anticuerpos intactos y activos requieren nivelas elevados de estructura base en términos de tiempo y equipo, y los rendimientos son muy bajos. Además, anticuerpos tradicionales tienen una actividad de enlace la i cual ¡depende del pH, y por lo tanto son inapropiados para su uso en ambientes fuera del intervalo de pH fisiológico usuali tal como por ejemplo, para tratar sangrado gástrico, cirugía gástrica. Además, anticuerpos tradicionales son inestables a pH bajo o elevado y por lo tanto no son adecuados para administración oral. Sin embargo, se ha i demostrado que anticuerpos de Camélidos resisten condibiones severas, tales como pH extremo, reactivos de desnaturalización y temperaturas elevadas (Ewert S et al, Biochemistry 2002 Mar 19; 41 ( 11) : 3628-36) , haciéndolos adecuados para el suministro por administración oral. Además, anticuerpos tradicionales tienen una actividad de enlace la cual depende de la temperatura, y por lo tanto I son inestables para su uso en ensayos o equipos realizados a temperaturas fuera de los intervalos de temperatura biológicamente activos (por ejemplo, 37 ± 20°C) . Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención no sólo ¡poseen la característica ventajosa de anticuerpos convencionales, tales como toxicidad baja y alta selectividad, sino también exhiben propiedades adicionales. Son más solubles, significando que pueden almacenarse y/o adminjistrarse en concentraciones más elevadas en ! comparación con anticuerpos convencionales. Son estables a temperatura ambiente significando que .pueden prepararse, almacenarse y/o transportarse sin el uso de equipo de refrigeración, produciendo un ahorro de costo, tiempo y ahorró ambiental. Otras características ventajosas como se compara a anticuerpos convencionales incluyen vida media corta en la circulación la cual puede modularse de acuerdo con la invención por ejemplo, por acoplamiento de albúmina, un nánocuerpo biespecifico con una especificidad contra albúmina y otra contra el objetivo, acoplamiento de Fc, acoplamiento de VHH (los VHH bivalentes) o por pegilación.
Una ¡vida media corta y controlable es deseable para procedimientos quirúrgicos, por ejemplo, los cuales requieren una inhibición de agregación mediada por plaqµetas durante un periodo de tiempo limitado. También, cuando ocurren problemas de sangrado u otras i complicaciones, pueden reducirse las dosis inmediatamente. i Los jj-olipéptidos de la presente invención también retienen actividad de enlace en un pH y temperatura lejos de aquellas de los intervalos fisiológicos usuales, lo cual significa que pueden ser útiles en situaciones de pH extremo y temperatura lo cual requiere una modulación de agregación mediada por plaquetas, tal como en cirugía gástrica, control de sangrado gástrico, ensayos realizados a temperatura ambiente, etc. Los polipéptidos de la presente invención también exhiben una estabilidad prolongada en extremos de pH, significando que podrían ser adecuados para el suministro por administración oral. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser costos efectivamente producidos a través de la fermentación en organismos huésped recombinantes convenientes tales como Eschejrichia coli y levadura; a diferencia de anticuerpos convencionales los cuales también requieren instalaciones para cultivo celular de mamífero caras, los niveles i alcanjzables de la expresión son elevados. Ejemplos de rendimientos de los polipéptidos de la presente invención son 1 a 10 mg/ml (E. coli) y hasta 1 g/1 (levadura) . Los polipéptidos de la presente invención también exhiben afinidad de enlace elevada para un rango amplio de i diferentes tipos de antigeno, y capacidad para enlazarse a i epitqpos no reconocidos por anticuerpos convencionales; por i ejemplo, despliegan estructuras de bucle con base en CDR larg4s con el potencial para penetrar en cavidades y exhiben inhibición de función de enzima. Además, ya que el enlace a menudo ocurre a través del bucle de CDR3 solamente, se visualiza que los péptidos derivados de CDR3 podrían utilizarse terapéuticamente (Desmyter et al., J Biol I Chem, 2001, 276: 26285-90). Los polipéptidos de la inveijición son también capaces de retener capacidad de enlace completa como proteína de fusión con una enzima o toxina. Además, se podría esperar que la trombocitopenia indeseable causada por activación mediada por el receptor Fc:Fc de agregación de plaquetas y/o reticulación mediada por E'(ab') (2) de plaquetas las cuales se han observado cuandp utilizan IgG intacto o F(ab') (2) terapéuticamente in vivo i (véase Cauwenberghs N. et al, Arteriosclersosi, Trombosis and Vascular biology, 2000, 20: 1347), se evitará en el uso de VHH. ya que VHH no contiene Fc y no es bivalente. De este modo, los polipéptidos de la invención homólogos o porciones funcionales de los mismos proporcionan un ahorro de costo y tiempo considerable en el tratamiento y diagnóstico de condiciones relacionadas a agregación mediada por plaquetas, y el paciente con necesidad de tales polipéptidos encontrarla pocos problemas asociados con agentes convencionales. La agregación mediada por plaquetas es el proceso en dohde el colágeno enlazado a vWF se adhiere a plaquetas y/o ¡receptores de plaquetas, resultando finalmente en activación de plaquetas conduce y finalmente a agregación de alcance de la presente invención proporcionar polipéptidos los cuales modular el proceso el cual Comprende agregación mediada por plaquetas tal como el enlace de vWF-colágeno, adhesión receptora de vWF-plaqujetas, adhesión receptora de colágeno-plaquetas, activación de plaquetas, enlace de fibrinógeno y/o agregación de plaquetas. ¡ De acuerdo con un aspecto de la invención, un polipéptido de la invención puede ser una secuencia homologa de un polipéptido de longitud total de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipléptido de la invención puede ser una porción funcional de u? polipéptido de longitud total de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido de la invención puede ser una secuencia homologa de un polipéptido de longitud total de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido de la inverción puede ser una porción funcional de una secuencia homologa de un polipéptido de longitud total de la invención. De acuerdo con un aspecto de la invención un polipéptido de la invención puede comprender una secuencia ! de uri polipéptido de la invención. I ' De acuerdo con un aspecto de la invención un Nanocuerpo de la invención utilizado para formar un polipéptido de la invención puede ser un Nanocuerpo completo de la invención (por ejemplo, un VHH) O una secuencia homologa de la misma. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo de la invención utilizado paral formar el polipéptido de la invención puede ser una porción funcional de un Nanocuerpo completo de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo de la invención utilizada para formar el I polipjéptido de la invención puede ser una secuencia homologa de un Nanocuerpo completo de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo de la invención utilizado para formar el polipéptido de la invenbión puede ser una porción funcional de una secuencia homologa de un Nanocuerpo completo de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención un polipsptido de la invención puede ser una secuencia homologa de la secuencia progenitora. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido de la invención puede ser una secuencia progenitora de porción funcional. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido de la invención puede ser una porción funcional de una secuencia homologa de la secuencia progenitora. | Como se utiliza en la presente, una secuencia homologa puede comprender adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, la cual no altera sustancialmente las características funcionales del polipéptido . El número de eliminaciones o sustituciones de aminoácidos es de preferencia hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, i 9, l?[ 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ó 70 aminoácidos. I ¡ Una secuencia homologa de acuerdo con la presente invenjción incluye polipéptidos extendidos por la adición de aminoácidos para formar un anticuerpo de cadenas pesadas humanb o un anticuerpo de cadenas pesadas de dominio sencillo humano, el cual no altera sustancialmente las características funcionales del polipéptido no modificado. Cuando la secuencia homologa indica identidad de i secue cia, significa una secuencia la cual presenta una identjidad de secuencia elevada (más de 70%, 75%, 80%, 85%, Alternativamente, una secuencia homologa también puede¡ ser una secuencia de aminoácidos que resulta de sustituciones permitidas en cualquier número de posiciones de la secuencia progenitora de acuerdo con la fórmula posteriormente : Ser sustituida por Ser, Thr, Gly y Asn; Arg sµstituida por una de Arg, His, Gln, Lys y Glu; Leu sustituida por una de Leu, lie, Phe, Tyr, Met y Val; Pro sustituida por una de Pro, Gly, Ala y Thr; Thr sustituida por una de Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His yGln; Ala sustituida por una de Ala, Gly, Thr y Pro; Val sustituida por una de Val, Met, Tyr, Phe, lie y Leu; Gly sustituida por una de Gly, Ala, Thr, Pro y Ser; lie sustituida por una de lie, Met, Tyr, Phe, Val y Leu; Phe sustituida por una de Phe, Trp, Met, Tyr, lie, Val y Leu; Tyr sustituida por una de Tyr, Trp, Met, Phe, lie, Val y Leu; His sustituida por una de His, Glu, Lys, Gln, Thr y Arg; Gln sustituida por una de Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr y I Arg; | Asn sµstituida o una de Asn, Glu, Asp, Gln y Ser; Lys sustituida por una de Lys, Glu, Gln, His y Arg; Asp sustituida por una de Asp, Glu y Asn; Glu sustituida por una de Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His y Arg; Met sustituida por una de Met, Phe, lie, Val, Leu y Tyr. Un homólogo de acuerdo con la presente invención puede¡ referirse a secuencias de nucleótidos de más de 50, I 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 ó 1000 nucleótidos capaces de hibridizar al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos capaz de codificar un polipéptido bajo i condiciones de hibridización severas (tales como aquellas descritas por SAMBROOK et al., Molecular Cloning, Labor^tory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York) . i Como se utiliza en la presente, una proteína funcional se refiere a un Nanocuerpo de la invención de suficiente longitud de manera que la interacción de interés se mantiene con afinidad de 1 x 10-6 M o mejor. Alternativamente, una porción funcional de un Alternativamente, una porción funcional de cualquier Nanocuerpo de la invención es un polipéptido el cual comprende una eliminación parcial de la secuencia de aminoácidos completa y la cual mantiene aún el o los sitios de enlace y el o los dominios de proteína necesarios para la inhibición de enlace de vWF a colágeno. Alternativamente, una porción funcional de cualquier Nanocuerpo de la invención es un polipéptido el cual comprende una eliminación parcial de la secuencia de aminoácidos completa y el cual mantiene aún el o los sitios de enjlace y el o los dominios de proteína necesarios para | el enlace de, y la interacción con el dominio Al de vWF. Alternativamente, una porción funcional de cualquier Nanocuerpo de la invención es un polipéptido el cual ¡comprende una eliminación parcial de la secuencia de aminoácidos completa y el cual mantiene aún el o los sitios de enlace y el o los dominios de proteina necesarios para el enlace de, y la interacción con colágeno. i Alternativamente, una porción funcional comprende i I o una eliminación parcial de la secuencia de aminoácidos I completa de un polipéptido y el cual mantiene aún el o los sitiob de enlace y el o los dominios de proteina necesarios I para ¡el enlace de, y la interacción con el antigeno contra lo cual se originó. Ésta incluye, pero no se limita a dominios de VHH- i Como se utiliza en la presente, una porción funcional como se refiere a una secuencia de polipéptido se refiejre a menos de 100% de la secuencia (por ejemplo, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, etc.), pero comprende 5 o más aminoácidos . Una porción como se refiere a una secuencia de nuclejótidos que codifica una secuencia de polipéptido se refiere a menos de 100% de la secuencia (por ejemplo, 99%, 90%, ?80%, 70%, 60%, 50%, etc.), pero comprende 15 o más nucleftidos . Un aspecto de la presente invención es la adminjistración de un polipéptido de la invención de acuerdo con (La invención que puede evitar la necesidad para inyección. Terapias con base en anticuerpo convencional tieneh potencial notable como fármacos debido a que tienen exquisita especificidad a su objetivo y una toxicidad inherente baja, sin embargo, tienen una importante desventaja: son relativamente inestables, y son sensibles a desintegración por proteasas. Esto significa que los fármacos de anticuerpo convencional no pueden administrarse oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectalmente o por inhalación debido a que no son resistentes al ph bajo en sus Sitios, la acción de proteasas en estos sitios y en la sangrje y/o debido a su tamaño grande. Estos tienen que administrarse por inyección (intravenosa, subcutáneamente, etc.) para superar algunos de estos problemas. La administración por inyección requiere la capacidad del especialista con el fin de utilizar una jeringa hipodérmica o aguja correctamente y de forma segura. Esto requiere además un equipo estéril, una formulación líquida del polipéptido terapéutico, el frasco envasado del polipéptido en una forma estéril y estable y, del sujeto, un sitio adecuado para la entrada de la aguja. Además, los sujetos experimentan comúnmente tensión física y fisiológica antes de y,¡ al recibir una inyección. Un aspecto de la presente invención supera estos problemas de la técnica anterior, al proporcionar las construcciones de polipéptidos de la presente invención. Tale-} construcciones son apropiadamente pequeñas, resistentes y estables para suministrarse oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectalmente o por inhalación sustancial sin pérdida de actividad. Las construcciones de polipéptido de la presente invención evitan la necesidad para inyecciones, que no solo ahorran costo/tiempo, sino también son más convenientes y más confortables para el sujet|o. Una modalidad de la presente invención es un polip¡éptido de la invención para su utilización en tratar, prevejnir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través del ambiente gástrico sin que la sustancia se inactive . Como se sabe por personas experimentadas en la I técnica, una vez en posesión del polipéptido de la invención, puede aplicarse tecnología de formulación para liberar una cantidad máxima de polipéptido en la ubicación correcta (en el estómago, en el colon, etc.). Este método de sjuministro es importante para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos cuyos objetivos se ubica|n en el sistema intestinal. Un aspecto de la invención es un método para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de un trastorno susceptible a modulación por una sustancia que controla agreqación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través del ambiente gástrico sin inactivarse, administrando oralmente a un sujeto un polipéptido de la inveríición.
I! Otra modalidad de la presente invención es un uso I de uh Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través del ambiente gástrico sin inactivarse. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas al sistema intestinal sin que tal sustancia se ijnactive, administrando oralmente a un sujeto un Nanoquerpo o polipéptido de la invención. i ¡ Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla agregación mediada j por plaquetas al flujo sanguíneo de un sujeto sin que la sustaincia se inactive, administrando oralmente a un sujeto j un Najnocuerpo o polipéptido de la invención. ¡ Otra modalidad de la presente invención es un i Nanoquerpo o polipéptido de la invención para su utilización en tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas o trast¡ornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas suministrada al tracto vaginal y/o rectal. En un ejemplo no limitante, una formulación de acuerdo con la invención comprende un Nanocuerpo o polipéptido de la invención, en la forma de un gel, crema, supositorio, película o en la forma de una esponja o como un anillo vaginal que libera lentamente el ingrediente activó con el tiempo (tales formulaciones se describen en i EP 70J7473, EP 684814, US 5629001) . Un aspecto de la invención es un método para tratafr, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas suministrada al tracto vaginal y/o rectal, administrando vaginal y/o rectalmente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. i 1 Otra modalidad de la presente invención es un uso de u? Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas suministrada al tracto vaginal y/o rectal . Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla agregación medida por plaquetas al tracto vaginal y/o rectal sin que la sustajncia se inactive, administrando al tracto vaginal y/o rectal de un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Un aspecto de la invención es un método para I sumir.istrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas al flujo sanguíneo de un sujeto sin que la sustancia se inactive, administrando al tracto vaginal y/o rectal de un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de lc. invención. j Otra modalidad de la presente invención es un Nanoouerpo o polipéptido de la invención, para su utilización en tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trast.ornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas suministrada a la nari::, en el tracto respiratorio y/o pulmón. En un ejemplo no limitante, una formulación de I acuerdo con la invención, comprende un Nanocuerpo o i polióéptido de la invención en la forma de un rociador nasa-, (por ejemplo, un aerosol) o inhalador. Ya que el Nanobuerpo o polipéptido de la invención es pequeño, puede i alcanzar su objetivo mucho más efectivamente que las i moléculas de IgG terapéuticas. Un aspecto de la invención es un método para tratfr, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agredación mediada por plaquetas suministrada al tracto I respiratorio superior y al pulmón, administrando a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención, por inhalación a través de la boca o nariz. i Otra modalidad de la presente invención es un uso de u Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas suministrada a la nariz, al tracto respiratorio superior y/o al pulmón, sin que el polipeptido se inactive . Un aspecto de la invención es un método para sumir istrar una sustancia que controla agregación mediada por pilaquetas a la nariz, al tracto respiratorio superior y al pulmón sin inactivación, administrando a la nariz, tracto respiratorio superior y/o pulmón de un sujeto un Nanoc}uerpo o polipéptido de la invención. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas al flujo sanguíneo de un sujeto sin inactivación administrando a la nariz, tracto respiratorio superjior y/o pulmón de un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Una modalidad de la presente invención es un Nanocuerpo o polipéptido de la invención para su utilización en tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla agregación mediada por plaquetas suministrada a la mucosa intestinal, en donde el trastorno incrementa la permeabilidad de la mucosa intestinal. Debido a su pequeño tamañ|o, un Nanocuerpo o polipéptido de la invención puede pasar a través de la mucosa intestinal y alcanzar el flujo sanguíneo más eficientemente en sujetos que sufren de trastornos los cuales causan un incremento en la I permeabilidad de la mucosa intestinal. Un aspecto de la invención es un método para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas suministrada a la mucosa intestinal, en donde el trastorno incrementa la i permeabilidad de la mucosa intestinal, administrando i I oralmente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención . ¡ Este proceso puede incluso mejorarse además por un as¡pecto adicional de la presente invención - el uso de portadores de transporte activo. En este aspecto de la invención, el VHH se combina con un portador el cual mejora la transferencia a través de la pared intestinal dentro del flujo, sanguíneo. En un ejemplo no limitante, este "portador" es un segundo VHH el cual se combina con el VHH terapéutico. Tal construcción de fusión se hace utilizando métodos conocidos en la técnica. El "portador" VHH se ^ enlaja específicamente a un receptor en la pared intestinal lo cual induce a una transferencia a través de la pared. Una modalidad de la presente invención es un uso de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaqueta que es capaz de pasar a través del tejidb detrás de la lengua efectivamente. Una formulación de Nanocuerpo o polipéptido de la invención, por ejemplo, una tableta, aspersor, gragea, se coloca debajo de la lengua y se absorbe a través de las membranas de mucosa en la red de capilaridad bajo la lengua. ¡ Un aspecto de la invención es un método para tratajr, prevenir y/o aliviar los síntomas de los trastornos susceptibles a la modulación por una sustancia que controla las agregación mediada por plaquetas que es capaz de pasar a través del tejido detrás de la lengua efectivamente, por la administración sublingual a un sujeto de Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Otra modalidad de la presente invención es- un uso i de u Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través de los tjejidos debajo de la lengua. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas a los tejidos debajo de la lengua sin inactivarse, administrando sublingualmente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas al flujo sanguíneo de un sujeto sin inactivarse, administrando oralmente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. : Una modalidad de la presente invención es un Nanocuerpo o polipéptido de la invención par uso para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través de la piel efectivamente. Una formulación de tal Nanocuerpo o polipéptido de la1 invención, por ejemplo, una crema, pelicula, rocío, gota, parche, se coloca en la piel y pasa a través de ella. Un aspecto de la invención es un método para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través de la piel efectivamente, administrando tópiqamente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Otra modalidad de la presente invención es un uso de uñ Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o i aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a I modulación por una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas la cual es capaz de pasar a través de la piel efectivamente. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas a la piel sin inactivarse, administrando tópicamente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Un aspecto de la invención es un método para suministrar una sustancia que controla la agregación mediada por plaquetas al flujo sanguíneo de un sujeto, i adminiistrando tópicamente a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. En otra modalidad de la presente invención, un Nanocuerpo o polipéptido de la invención comprende además un Nanocuerpo portador de la invención (por ejemplo, VHH) el cual actúa como un portador de transporte activo para el transporte del Nanocuerpo o polipéptido de la invención a i travéjs del lumen del pulmón a la sangre. ' Un Nanocuerpo o polipéptido de la invención comprende además un portador que se enlaza específicamente a un ' receptor presente en la superficie mucosal (células epiteliales bronquiales) resultando en el transporte activo del polipéptido a partir del lumen del pulmón a la sangre. i El Najnocuerpo portador de la invención puede combinarse al Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Tales construcciones de fusión se hacen utilizando métodos conocidos en la técnica y se describen en la presente. El Nanocaerpo "portador" de la invención se enlaza específicamente a un receptor en la superficie mucosal la cual induce una transferencia activa a través de la superficie . ¡ Otro aspecto de la presente invención es un método para determinar cuales Nanocuerpos de la invención (por ejemplo, los VHH) se transportan de forma activa en el flujo sanguíneo en la administración nasal. De forma similar, una biblioteca de fago VHH simple o inmune puede administrarse nasalmente, y después de diferentes puntos de tiempo después de la administración, la sangre y los órganos pueden aislarse para rescatar fagos que se han transportado de forma activa al flujo sanguíneo. Un ejemplo no lijmitante de un receptor para el transporte activo a partijr del lumen del pulmón al flujo sanguíneo es el receptor N de Fc (FcRn) . Un aspecto de la invención incluye las pjoléculas de VHH identificadas por el método. Tal VHH puede entonces utilizarse como un portador VHH para el suministro de un VHH terapéutico al objetivo correspondiente en el flujo sanguíneo en la administración nasal!. Una modalidad de la presente invención es un Nanocuerpo o polipéptido de la invención para su utilización en tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastprnos que se relacionan a la agregación mediada por plaquetas o disfunción de la misma. Tales trastornos incluyen púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) , ataque isquémica cerebral transitorio, angina de pecho inestable o estabjLe, infarto cerebral, infarto de miocardio, enfermedad oclusiva arterial periférica, restenosis. Tales trastornos ademá? incluyen aquellos que se originan de injerto de by-pass Coronario, reemplazo de válvula de arteria coronaria e intervenciones coronarias tales como angioplastia, estenosis o aterectomia. Otros trastornos son cualquiera de la formación de uifi trombo no oclusivo, la formación de un trombo oclusivo, formación de trombo arterial, oclusión coronaria aguda, restenosis, restenosis después de PCTA o estenosis, formación de trombo en arterias estenosadas, hiperplasia después de angioplastía, aterectomia o estenosis arterial, sindrjome oclusivo en un sistema vascular o falta de permeabilidad de arterias enfermas. Un aspecto de la invención es un Nanocuerpo o polipjéptido de la invención para su uso en el tratamiento, prevénción y/o alivio de trastornos o condiciones que se relacionan a la agregación medida por plaquetas o disfunción' de las mismas, en donde tal Nanocuerpo o polipéptido de la invención se administra intravenosa, subcutánea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectalmente o por inhalación. Otro aspecto de la invención es el uso de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos o condiciones que se relacionan a agregación mediada por plaquetas o disfunción de las mismas, en donde el Nanocuerpo o polipéptido de la invención se administra intravenosa, subcutánea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectalmente o por inhalación . Otro aspecto de la invención es un método para tratar, prevenir y/o aliviar trastornos o condiciones que se relacionan a la agregación mediada por plaquetas o disfunción de la misma, que comprende administrar a un sujeto un Nanocuerpo o polipéptido de la invención, en dondq el Nanocuerpo o polipéptido heteroespecifico de la invención se administra intravenosa, subcutánea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectalmente o por i inhalación. Otro aspecto de la invención es un Nanocuerpo o polipíéptido de la invención para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos o condiciones que se relacionan a agregación mediada por plaquetas o disfunción de la's mismas. Otro aspecto de la invención es un uso de un polipjéptido de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos o condiciones que se relacionan a la agregación mediada por plaquetas o disfunción de la misma. ¡ Uno puede utilizarse un Nanocuerpo o polipéptido I de lp invención de la presente invención con el fin de I seleccionar agentes que modulen el enlace del polipéptido a un vWF. Cuando se identifica en un ensayo que mide el enlaqe o desplazamiento del polipéptido solo, los agentes i tendrán que someterse a prueba funcional para determinar si actúan como moduladores de la agregación mediada por plaquetas. Algunos ejemplos de métodos de selección adecuados se discuten en WO 04/062251. Por supuesto, estos métoclos pueden aplicarse fácilmente para seleccionar moduladores candidatos los cuales alteran el enlace entre el Nanocuerpo o polipéptido de la invención descritos en la presente y vWF. Una célula que es útil de acuerdo con la inverición se selecciona de preferencia del grupo que consiste de células bacterianas tales como por ejemplo, E. coli , células de levadura tales como por ejemplo, S. cere isiae , P. pastoris , células de insectos o células de mamif¡eros, por ejemplo como se menciona anteriormente. i Una célula que es útil de acuerdo con la invención puede ser cualquier célula dentro de la cual puede estar una secuencia de ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo o polipéptido de la invención o se ha normajl o casi normal, como se define en la presente. De acuerdo con una modalidad preferida de la i presente invención, una célula se selecciona del grupo que consiste de células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, una célula HEK-293, una célula K-562 o una célula de astrocitoma 1321NI, pero también otras! lineas celulares transfectables .
¡ En general, "cantidad terapéuticamente efectiva", dosiJs terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" significa la cantidad necesaria para conseguir el resultado o rebultados deseados (tratando o evitando agregación de plaqu etas) . Alguien de experiencia ordinaria en la técnica recor ocerá que la potencia y, por lo tanto, una "cantidad efect iva" puede variar para los diversos Nanocuerpos o polip éptidos que inhiben agregación mediada por plaquetas utili zada en la invención. Alguien de experiencia en la técnica puede evaluar fácilmente la potencia del Nanocuerpo o pol ipéptido. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere decir un material que no es biológicamente o de otra forma indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el Nanocuerpo o polipéptido sin provocar ningunos efectos biológicos indeseables o interiactuando en una manera nociva con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la cual está contenido. La invención descrita en la presente es útil para tratar o evitar una condición de agregación medida por píaqu)etas, en un sujeto y que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un Nanocuerpo o polipéptido o composición que inhibe BTK y que inhibe agregación mediada por plaquetas .
La invención descrita en la presente es útil para tratar o evitar las primeras etapas de formación de trombo, en un sujeto y comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un Nanocuerpo o polipéptido o compc|sición de acuerdo con la invención. La invención descrita en la presente es útil para tratar o evitar restenosis, en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente aceptable de un NanoQuerpo o polipéptido o composición de acuerdo con la i invención. Un aspecto de la presente invención es el uso de Nanocuerpos o polipéptidos de la invención para tratar o evitar una condición de agregación mediada por plaquetas, en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente aceptable de un Nanocuerpo o polipéptido en combinación con otro, tal como por ejemplo, aspirina. i Un aspecto de la presente invención es el uso de Nanocuerpos o polipéptidos de la invención para tratar o evitar una condición de agregación mediada por plaquetas,-en ln sujeto y comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un Nanocuerpo o polipéptido en ¡ combinación con otro, tal como por ejemplo un agente trombjolitico. Otro aspecto de la presente invención es un uso de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención para tratar o evitar placa o trombo en un individuo. Tal formación de placa) o trombo puede estar bajo condiciones de esfuerzo cortante elevadas. Tanto en la trombosis como en la reocl usión, la adhesión reversible o unidas de las píaquetas en Índice de esfuerzo cortante elevado se sigue por una adhesión firme a través del receptor de colágeno en plaqu etas que resultan en activación de plaquetas; la cauti vidad de plaquetas por vWF a colágeno expuesto en la paree. del vaso sanguíneo dañado es especialmente importante bajo condiciones de esfuerzo cortante elevadas. Los inverjtores han encontrado que el Nanocuerpo o polipéptido de 1 a invención de la presente invención inesperado se reali za apropiadamente bajo condiciones de esfuerzo cortante elevadas. La presente invención no se limita a la administración de formulaciones que comprenden un i Nanoduerpo o polipéptido sencillo de la invención. Está dentr)o del alcance de la invención proporcionar tratamientos de combinación en donde una formulación se adminiistra a un paciente con necesidad de la misma que comprende más de un Nanocuerpo o polipéptido de la mvenjcion , Condiciones de agregación mediada por plaquetas incluyen, pero no se limitan a, angina inestable, angina estable, angina de pecho, formación de émbolo, trombosis de vena • profunda, sindrome urémico hemolitico, anemia hemolitica, falla renal aguda, complicaciones tromboliticas, púrpura trombocitopénico trombótico, I comg^lopatia intravascular diseminada, trombosis, enfermedad cardiaca coronaria, complicaciones i tromboembólicas, infarto de miocardio, restenosis y formación de trombosis atrial en fibrilación atrial, angina inestable crónica, ataques isquémicos transitorios y apoplejías, enfermedad vascular periférica, trombosis arterial, pre-eclampsia, embolismo, restenosis y/o i trombosis después de angioplastia, endarterectomía de carótida, anastomosis de injertos vascualres, y exposición crónica a dispositivos cardiovasculares. Tales condiciones pueden resultar también de tromboembolismo y reoclusión durante y después de la terapia trombolitica, después de angioplastia y después de by-pass de arteria coronaria. ii Se conoce bien en la técnica cómo determinar la inhibición de la agregación mediada por plaquetas i utilizando pruebas estándares descritas en la presente, o utilizando otras pruebas similares. De preferencia, el podría resultar en al menos una reducción del 10% en la 1 agregación mediada por plaquetas, incluyendo por ejemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ó cualquier cantidad en promedio, más preferiblemente 90%. De forma similar, el método podria resultar en al del 10% en movilización intracelular de calcip incluyendo, por ejemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, ¡60%, 70%, 80%, 90%, 100%. De forma similar, el método podria resultar en al menos una reducción del 10% en el nivel de PLCg 2 fosforilado incluyendo, por ejemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%. La reducción puede medirse, por ejemplo, al comparar la impedancia óptica en un agregómetro plaquetario de cronología. Cualquier otro método de medición conocido puede! utilizarse también. Por ejemplo, (1) en estimulación de colágeno, el nivel de movilización intracelular de calcio inducido por colágeno se incrementa con el tiempo y así la medición puede incluir medir el nivel de calcio intrapelular inducido por colágeno o (2) en estimulación de I colágeno, el nivel de PLCg 2 fosforilado se incrementa con i el tiempo y asi la medición puede incluir medir el nivel de PLCg2| fosforilado. i i 1 Las células pueden entrar en contacto in Vitro, por ejemplo, agregando un Nanocuerpo o polipéptido de la invención al medio de cultivo (por infusión continua, por suministro de bolo, o cambiando el medio a un medio que I I contiene el Nanocuerpo o polipéptido) o agregando el Nanocuerpo o polipéptido al fluido extracelular in vivo (por suministro local, suministro sistémico, inhalación, inyección intravenosa, suministro de bolo, o infusión continua) . La duración de "contacto" con una célula población de células se determina por el tiempo en el que el Nanocuerpo o polipéptido se presenta en niveles fisi Ológicamente efectivos o en niveles presumidos fisiológicamente efectivos en el medio o fluido extracelular al lavar la célula o células. De preferencia, la duración de contacto es 1-96 horas, y más preferiblemente, durante 24 horas, pero tal tiempo variará con liase en la vida media del Nanocuerpo o polipéptido y podri|a optimizarse por un experto en la técnica utilizando una experimentación de rutina. El Nanocuerpo o polipéptido útil en la presente ínvenlción puede formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente mamífero o un animal doméstico en una variedad de formas adapt|adas a la ruta elegida de administración, es decir, oral o parenteralmente, intransalmente por inhalación, rutas intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea. El Nanocuerpo o polipéptido de la presente invención puede administrarse también utilizando métodos de terapia genética de suministro. Véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,399,346, la cual se incorpora para referencia en su totalidad. Al utilizar un método de terapia genética de suministro, las células primarias transfectadas con gen para el Nanocuerpo o polipéptido de la piresente invención pueden transfectarse adicionalmente con promotores específicos de tejido a órganos específicos de tejido, tejido, injertos, tumores o células. un portador comestible asimilable. Estos pueden confinarse en cápsulas de gelatina dura o suave, pueden estar comprimidos en tabletas, o pueden incorporarse directamente con I el alimento de la dieta del paciente. Para i administración terapéutica oral, el Nanocuerpo o polip'éptido puede combinarse con un o más excipientes y utilizarse en la forma de tabletas digeribles, tabletas bucaies, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 0.1% del Nanocuerpo o polipéptido. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente i 60% ¡del peso de una forma de dosis unitaria dada. La i cantidad del Nanocuerpo o polipéptido en tales I composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosis efectivo. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: aglutinantes tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de naíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálCÍco; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y puede agregarse un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartame o un agente saborizante como menta!, aceite de gaulteria, o saborizante de cereza. Cuando la fo!rma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Varios otros materiales pueden presentarse como recubrimientos o modificar de otra forma la forma fisica de la forma de dosis unitaria sólida. Por ejemplo, tabletas, pildoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, shellac o azúcar y similares. Un jarabe o elixir pueden contener el Nanocuerpo o polipéptido, sacarosa o fructosa i como ¡un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservadores, un tinte y saborizante tal como sabor de cereza y naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de dosis unitaria debe ¡ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxicb en las cantidades empleadas. Además, el Nanocuerpo o polipéptido puede incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida. I El Nanocuerpo o polipéptido puede administrarse intr venosa o intraperitonealmente por infusión o inyedción. Soluciones del Nanocuerpo o polipéptido pueden prepararse en agua, mezclarse opcionalmente con un agente tensioactivo no tóxico. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triaqetina y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas 1 preparaciones contienen un conservador para evitar el i crecijmiento de microorganismos. . Las formas de dosis farmacéuticas adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo los cuales se adaptan a la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables o infundibles estériles, encapsuladas opciohalmente en liposomas. En todos los casos, la última formal de dosis debe ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador liquido o vehiculo puede ser un medio de dispersión solvente o liquido que comprende por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glierol, propilenglicol, polie ilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, glicerilésteres no tóxicos y mezclas adecuadas de lfs mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por la formación de liposomas, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersiones o por el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede producirse por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerjosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones i o cl|oruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por el uso en i las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se preparan soluciones inyectables estériles al incorporar el Nanocuerpo o polipéptido en la cantidad reque'rida en el solvente apropiado con varios de los otros i ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguido por esterilización de filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vadlo y técnicas de secado por congelamiento, las cuales producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado presente en las soluciones filtradas previamente estériles. ' Para administración tópica, el presente Nanosuerpo o polipéptido puede aplicarse en forma pura, es decir1, cuando son líquidos. Sin embargo, será deseable en generjal administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador i dermajtológicamente aceptable, el cual puede ser un sólido o un líquido. Portadores sólidos útiles incluyen sólidos finarrtente divididos tales como talco, arcilla, celulosa micrcjcristalina, silice, alúmina y similares. Portadores i liquijdos útiles incluyen agua, hidroxialquilos o glicoles o i mezclas de agua-alcohol/glicol, en las cuales el presente Nanocuerpo o polipéptido puede disolverse o dispersarse a niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de agentes tensioactivos no tóxicos. Adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales pueden agregarse para optimizar las propiedades para un uso dado. Las I composiciones liquidas resultantes pueden aplicarse a partir de almohadillas absorbentes para impregnar vendas y otrosj vendajes o rociarse sobre el área afectada utilizando rociadores de tipo bomba o en aerosol. i Espesantes tales como polimeros sintéticos, ácido's grasos, sales de ácido graso y esteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas materiales minerales modificados pueden emplearse también con portadores líquidos para formar pastas dispersables, geles, ungüentos, jabo?es y similares, para aplicación directamente a la piel del usuario. Ejemplos de composiciones dermatológicas útiles las c-iuales pueden utilizarse para suministrar el Nanocuerpo o poLipéptido a la piel se conocen en la técnica; por ejemplo, véase Jacques et al. (Patente Norteamericana No. 4,608,392), Geria (Patente Norteamericana No. 4,992,478), Smith et al. (Patente Norteamericana No. 4,559,157) y Wortzman (Patente Norteamericana No. 4,820,508). Dosis útiles del Nanocuerpo o polipéptido pueden determinarse al comparar su actividad in Vitro, y actividad in vivo en modelos animal. Métodos para la extrapolación de dosisi efectivas en ratones y otros animales, a seres humanos se conoce en la técnica; por ejemplo, véase la Patente Norteamericana No. 4,938,949. En general, la concentración de Nanocuerpo o polip|éptido en una composición líquida, tal como una i loción, será de aproximadamente 0.1-25% en peso, de ! preferencia de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración es una composición semi-sólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0.1-5% en peso,) de preferencia aproximadamente 0.5-2.5% en peso. La cantidad del Nanocuerpo o polipéptido requerida para su uso en el tratamiento variará con la ruta de administración, la naturaleza de la condición que se trata y la edad y condición del paciente y será finalmente en la discreción del doctor o médico que atiende. También, la dcsis del Nanocuerpo o polipéptido varia dependiendo de la célula objetivo, tumor, tejido, injerto u órgano. La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis sencilla o como dosis divididas administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por dia. La sub-dosis misma puede dividirse además por ejemplo, en un I númerlo de administraciones ampliamente separadas discretas; tales como inhalaciones múltiples desde un insuflador o por la aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo. I Un régimen de administración podria incluir tratamiento diario a largo plazo. Por "largo plazo" se quiere decir al menos dos semanas y de preferencia, varias seman¡as, meses o años de duración. Modificaciones necesarias en este intervalo de dosis pueden determinarse i por alguien de experiencia ordinaria en la técnica al utilizar sólo experimentación de rutina dadas las enseñjanzas en la presente. Véase Remington Pharmaceutical I Scien¡ces (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Eastojn, PA. La dosis puede ajustarse por el medico el caso de cualquier complicación. invención proporciona un agente que es un modular de agregación mediada por plaquetas.
I El agente candidato puede ser un agente i sintéjtico, o una mezcla de agentes, o puede ser un producto naturjal (por ejemplo, un extracto vegetal o sobrenadante de cultivo) . Un agente candidato de acuerdo con la invención incluye una molécula pequeña que puede sintetizarse, un extracto natural, péptidos, proteinas, carbohidratos, lípidos, etc. i Pueden seleccionarse agentes moduladores candidatos a partir de bibliotecas grandes de agentes sintéticos o naturales. Numerosos medios se utilizan actualmente para síntesis aleatoria y dirigida de agentes i con base en sacárido, péptido y ácido nucleico. Las bibliotecas de agentes sintéticos están comercialmente disponibles de un número de compañías incluyendo Maybridge Chemical Co . (Trevillet, Cornwall, UK) , Comgenex (Prir.ceton, NJ) , Brandon Associates (Merrimack, NH) y Micrqsource (New Milford, CT) . Una biblioteca quimica rara I I está' disponible de Aldrich (Milwaukee, Wl). Bibliotecas comb-^natoriales están disponibles y pueden prepararse. i Alternativamente, las bibliotecas de agentes naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y anim41es están disponibles de por ejemplo, Pan Laboratorios (Botfyell, WA) o MycoSearch (NC) o son fácilmente ¡ prodúcibles por métodos bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, bibliotecas y agentes naturales y sintéticamente producidas son fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales . Pueden encontrarse agentes útiles dentro de numerosas clases químicas. Agentes útiles pueden ser agent :es orgánicos, o agentes orgánicos pequeños. Agentes orgánicos pequeños tienen un peso molecular de más de 50 incluso menos de aproximadamente 2,500 daltons, de preferencia menos de aproximadamente 750, más prefejriblemente menos de aproximadamente 350 daltones. Clases ejemplares incluyen heterociclos, péptidos, sacáridos, esteroides y similares. Los agentes pueden I modificarse o mejorar la eficacia, estabilidad, compatibilidad farmacéutica, y similares. La identificación estructural de un agente puede utilizarse para identificar, generar o seleccionar agentes adicionales. Por ejemplo, en caso len donde agentes de péptido se identifican, pueden modificarse en una variedad de formas para mejorar su estabilidad, tal como utilizando un aminoácido no natural, tal como un aminoácido D, particularmente D-alanina, haciendo funcionar el término amino o carboxílico, por ejemplo, por el grupo amino, acilación o alquilación, y para el grupo carboxilo, esterificación o acidificación, o similares . ! Para selección primaria, una concentración útil de un agente candidato de acuerdo con la invención es de i aproximadamente 10 mM a aproximadamente 10 µM o más (es i decir¡, 1 mM, 10 mM, lOOmM, 1 M, etc.). La concentración de i selección primaria se utilizará como un limite superior, junto) con nueve concentraciones adicionales, en donde las concentraciones adicionales se determinan al reducir la concentración de selección primaria en intervalos de vida media (por ejemplo, para 9 concentraciones más) para selecciones secundarias o para generar curvas de concentración. Un equipo de selección de rendimiento elevado de acuerdo con la invención comprende todos los medios necesarios y medios para realizar la detección de un agente que modula agregación mediada por plaquetas interactuando i con u¡n objetivo de la invención, tal como por ejemplo vWF, 0 frabmento del mismo en la presencia de un polipéptido, de preferencia en una concentración en el intervalo de 1 µM a 1 mM. El equipo comprende lo siguiente. Células recomjoinantes de la invención, que comprenden y expresar la secue cia de nucleótidos que codifica vWF, o fragmento del mismo, los cuales se cultivan de acuerdo conl equipo en un soporte sólido, tal como una placa microtituladora, más preferiblemente una placa microtituladora de 95 pozos, de acuerdo con métodos bien conocidos por la persona experimentada en la técnica especialmente como se describe en WÓ 00/02045. Alternativamente, vWF, o fragmento del mismo se suministra en una forma purificada para inmovilizarse en, por ejemplo, una placa microtituladora de 95 ppzos por la persona experimentada en la técnica.
Alternativamente, vWF, o fragmento del mismo se suministra en eZ equipo pre-inmovilizado en por ejemplo, una placa microtituladora de 96 pozos. Los agentes moduladores de acuerdo con la invención, en concentraciones desde aproximadamente 1 µM a 1 mM o más, se agregan para definir pozosj en la presencia de una concentración apropiada del i Nanocuerpo o polipéptido de la invención, la concentración del polipéptido de preferencia está en el rango de 1 µM a 1 mM. L!os equipos pueden contener más de un polipéptido. Los ensayos de enlace se realizan de acuerdo con los mlétodos ya descritos en la presente y los resultados se compa'ran al nivel de punto de partida de por ejemplo, el vWF, ¡o fragmento del mismo que se enlaza a un polipéptido de lá invención, pero en la ausencia del agente modulador agregado. Los pozos que muestran al menos 2 veces, de i preferencia 5 veces más preferiblemente 10 veces y más preferiblemente 100 veces o más incremento o disminución en el enlace de polipéptido de vWF (por ejemplo, como se compaira al nivel de actividad en la ausencia del modulador, se seleccionan par análisis adicional. La invención proporciona equipos útiles para seleccionar modulación de agregación mediada por plaquetas, asi como equipos útiles para diagnóstico o enfermedades o trastornos caracterizados por desregulación de agregación mediada por plaquetas. Los equipos útiles de acuerdo con la invención pueden incluir un vWF aislado, o fragmento del mismo. Alternativamente, o además, un equipo puede comprender células transformadas para expresar vWF, o un fragmento del mismo. En una modalidad particular, un equipo de acuerdo con la invención puede comprender un polinucleótido que codifica vWF, o un fragmento del mismo. En una modalidad aún adicional, un equipo de acuerdo con la invenqión puede comprender los cebadores específicos útiles para amplificación de vWF, o fragmento del mismo. Equipos útiles de acuerdo con la invención pueden comprender un Nanocuerpo o polipéptido de la invención. Un equipo de acuerdo con la invención puede comprender células 1 transíormadas que expresan tal polipéptido. Los equipos I puedeh contener más de un polipéptido. En una modalidad i adicional, un equipo de acuerdo con la invención puede comprender un polinucleótido que codifica una macromolécula, por ejemplo, vWF, o fragmento del mismo. En una modalidad aún adicional, un equipo de acuerdo con la invención puede comprender los cebadores específicos útiles para amplificación de una macromolécula tal como por ejempjlo, vWF, o un fragmento del mismo. Todos los equipos de atuerdo con la invención comprenderán los articulos establecidos o combinaciones de articulos y materiales empapados de los mismos. Los equipos incluirán también instrucciones de uso. La invención también proporciona dispositivos médicos invasivos recubiertos con un Nanocuerpo o polipéptido de la invención o un agente que resulta de un método de selección de la invención para su uso en dispositivos que requieren los mismos. Ejemplos no limitantes de dispositivos incluyen entubado quirúrgico, dispositivos de oclusión, dispositivos prostéticos. La i aplicación de tales dispositivos incluye procedimientos quirúrgicos los cuales requieren una modulación de agregación mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasion. Una modalidad de la presente es un método para trata'r dispositivos médicos invasivos para prevenir i I agregación mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasión que comprende la etapa de recubrir el dispositivo con un Nanocuerpo o polipéptido de la invención o agente de I acuer¡do con la invención. | Otra modalidad de la presente es dispositivos médiqos invasivo que rodea la agregación mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasión, en donde el dispositivo se recubre con un Nanocuerpo o polipéptido de la invención o agente de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la invención se relaciona a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos un trastorno mediado por agregación (como se describe en la presente), el método comprende administrar, a un sujeto con necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. En el contexto de la presente invención, el ¡ término "prevención y/o tratamiento" no solamente comprende i evitar y/o tratar la enfermedad, sino también comprende en general evitar el inicio de la enfermedad, reduciendo o revirtiendo el progreso de la enfermedad, evitando o reduciéndole inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reduciendo y/o aliviando uno o más síntomas asociados con la enfermedad reduciendo la severidad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualesquiera síntomas asociados con la misma y/o evitando un incremento adicional en 1 a severidad de la enfermedad y/o de cualesquiera síntomas asociados con la misma, evitando, reduciendo revirtiendo cualquier daño fisiológico causado por la enferjnedad, y en general cualquier acción farmacológica que es bejnéfica al paciente que se trata. El sujeto que se trata puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será comprensible por la persona experimentada, el sujeto que se trata en parti ¡cular será una persona que sufre de o está en riesgo de, las enfermedades o trastornos mencionados en la prese te. La invención también se relaciona a un método para | la prevención y/o el tratamiento de al menos una I enfermedad o trastorno que puede evitarse y/o tratarse al administrar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención a un pa.ciente, el método comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo, una cantidad farmacéuticamente activ.a de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la, invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. ! Más en particular, la invención se relaciona a un métodp para la prevención y/o el tratamiento de al menos i aceptable de la misma. | En otra modalidad, la invención se relaciona a un método para inmunoterapia, y en particular para i inmunbterapia pasiva, cuyo método comprende administrar a un sujeto que sufre de, o está en riesgo de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. ' i Más en particular, la invención se relaciona a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, cuyo método comprende administrar a un sujeto que sufre de o está en riesgo de las enfermedades I y trastornos mencionados en la presente, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. En los métodos anteriores, los Nanocuerpos y/o polipáptidos de la invención y/o las composiciones que comprande los mismos pueden administrarse en cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica especifica que se utiliza. De este modo, los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse por ejemplo oral, intraperitonealmente (por ejempLo, intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, o mediante cualquier otra ruta de administración que rodea el tracto gastrointestinal) , intranasal, transdérmica, tópicamente, por medio de un supositorio, por inhalación, de nuevo dependiendo de la formulación farmacéutica especifica o composición que se utiliza. El médico será capaz de seleccionar una ruta adecuada de administración y una formulación o composición farmacéutica adecuada que se utiliza en tal administración, dependiendo de la enfermedad o trastorno que se evita o trata y otros factores bien conocidos por el médico. Como se menciona en la presente y como será comprensible por la persona experimentada, para condiciones agudas y complicaciones (es decir, como puede ocurrir con algunos de los trastornos mediados por agregación mencionados en la presente) , usualmente se preferirá la administración directamente en el flujo sanguíneo por infusión o inyección o cualquier otro medio adecuado.
Los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se administran de acuerdo conl régimen de tratamiento que es adecuado para evitar y/o tratar la enfermedad o trastorno que se evita o se trata. El médico será capaz en general de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de los factores tales como la enfermedad o el trastorno que se evita o se trata, la severidad de la enfermedad que se trata y/o la severidad de los síntomas de la misma, el i Nanocµerpo o polipéptido específico de la invención que se utiliza, la ruta especifica de administración y la formulación farmacéutica o composición que se utiliza, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el médico. En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de uno o más Nanocuerpos y/o polipéptidos de 1^ invención, o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente aceptables. La o las cantidades o dosis especificas que se administran pueden determinarse por el médico, de nuevo con base en los factores citados anteriormente . 1 ! En general, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico que se t¡rata, la potencia del Nanocuerpo y polipéptido I especifico de la invención que se utiliza, la ruta especifica de administración y la formulación o composición farmacéutica específica utilizada, los Nanocuerpos y los polipeptidos de la invención se administrará generalmente en una cantidad entre 1 gramo y 0.01 microgramos por kg de peso corporal por día, de preferencia entre 0.1 gramo y 0.1 microgramos por kg de peso corporal por dia, tal como aproximadamente 1, 10, 100 ó 1000 microgramos por kilogramo de peso corporal por dia, ya sea continuamente (por ejemplo por infusión) como una dosis diaria sencilla o como dosis divididas múltiples durante el día. El médico será capaz en 1 I general de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en la presente. Será 'también comprensible que en casos específicos, el medicó puede elegir desviar a partir de estas cantidades usualmente administradas para anticuerpos convencionales comparables o fragmentos de anticuerpo contra el mismo objetivo administrados mediante esencialmente la misma i ruta, tomando en cuenta sin embargo, diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, vida media y I factoires similares bien conocidos por la persona experiimen«t.aHda . Usualmente, en el método anterior, un Nanocuerpo o polipéptido sencillo de la invención se utilizará. Está sin embargo dentro del alcance de la invención utilizar dos o más Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención en combinación. i Los Nanocuerpos y los polipéptidos de la invención pueden también utilizarse en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente aceptables, es decir, como un régimen de tratamiento combinado, el cual puede o no conducir a un efecto sinergistico . De nuevo, el médico será capaz de seleccionar tales compuestos o principios adicionales, asi como un régimen de tratamiento combinado adecuado, con base en los factores citados anteriormente y su juicio experto. En particular, los Nanocuerpos y polipéptidos de la i ención pueden utilizarse en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que son o puede utilizarse para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos citados en la presente, como un resultado del cual un efecto sinergistico puede o no obtenerse. Ejemplos de tales compuestos y principios, asi como rutas, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos será comprensible por el médico y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a Heparina, aspirina (por ejemplo, Aspegic®, Plavix y/o Reopró. Cuando dos o más sustancias o principios van a cuale .quiera efectos secundarios indeseados que se asocian con e1 uso de una o más de las sustancias o principios cuando se utilizan en sus cantidades usuales, mientras se obtie:ne aún el efecto farmacéutico o terapéutico deseado. La efectividad del régimen de tratamiento utilizado de acuerdo con la invención puede determinarse y/o seguirse en cualquier forma conocida per se para la enfermedad o trastorno implicado, como será comprensible por el médico. El médico será capaz también, cuando sea apropiado y, o en base caso por caso, de cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, de manera que logre el efecto terapéutico deseado, para evitar, limit,ar o reducir efectos secundarios indeseados, y/o para logra:: un equilibrio apropiado entre lograr el efecto terapéutico deseado por un lado y evitar, limitar o reducir efectos secundarios indeseados por otro lado. El sujeto que se trata puede ser cualquier animal de saingre caliente, pero es en particular un mamífero, y más e? particular un ser humano. Como será comprensible por la persona experta, el sujeto que se trata será en particular una persona que sufre de, o está en riesgo de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente. I La invención se relaciona también al uso de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno (por ejemplo, un trastorno de agregación como se menciona en la presente) que puede evitar y/o tratarse administrando un Nanocµerpo o polipéptido de la invención a un paciente. En general, el régimen de tratamiento será seguido hasta que el efecto terapéutico deseado se logre la invención sobre otros "andamiajes" incluyendo, pero sin limitarse a andamiajes humanos o andamiajes sin inmunoglobulina. Andamiajes adecuados y técnica para tal injerto de CDR serán comprensibles por la persona experimentada y se conocen bien en la técnica, véase por i ejemplo, US-A-7, 180, 370, WO 01/27160, EP 0 605 622, EP 0 460 167, US-A-7, 054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2' 184-199; Kettieborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O'Briend and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; y Skerra, J. Mol. Recognit . 2000: 13: 167-187, y Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23; 352 (3) : 597-607, y las referencias adicionales citadas en la presente; y también incluyen por ejemplo, las regiones de estructura base de otros anticuerpos de dominio (sencillos). Por ejemplo, técnicas conocidas per se para injertar CDR de ratón o rata sobre soportes y andamiajes de i humano pueden utilizarse en una manera análoga para proporcionar proteinas quiméricas que comprenden uno o más de las CDR de los Nanocuerpos de la invención y una o más regiones o secuencias de estructura base. De este modo, en otra modalidad, la invención comprende un polipéptido quimérico que comprende al menos una secuencia de CDR elegida a partir del grupo que consiste de secuencias de CDRl, secuencias de CDR2 y secuencias de CDR3 mencionadas en la presente para los Nanocuerpos de la invención. De preferencia, tal polipéptido quimérico comprende al menos una secuencia de CDR elegida a partir del grupo que consiste de las secuencias de CDR3 mencionadas en la presente para los Nanocuerpos de la invención y opcionalmente también al menos una secuencia de CDR elegida del grupo que consiste de las secuencias de CDRl y las secuencias de CDR2 mencionadas en la presente para los Nanocuerpos de la invención. Por ejemplo, tal polipéptido quimérico puede comprender una secuencia de CDR elegida del grupo que consiste de las secuencias de CDR3 mencionadas en la i presente para los Nanocuerpos de la invención, una secuencia de CDR elegida del grupo que consiste de las secuencias de CDRl mencionadas en la presente para los Nanocuerpos de la invención y una secuencia de CDR elegida para el grupo que consiste de las secuencias de CDRl y las secuencias de CDR2 mencionadas en la presente para los Nanocuerpos de la invención. Las combinaciones de las CDR que SB mencionan en la presente como se prefiere para los Nanocuerpos de la invención serán también usualmente preferidas para estos polipéptidos quiméricos. En tales polipéptidos quiméricos, las CDR pueden unirse a secuencias de aminoácidos y/o pueden unirse entre sí mediante secuencias de aminoácidos, en las cuales las secuencias de aminoácidos son de preferencia secuencias de estructura base o secuencias de aminoácidos que actúan como secuencias de estructura base, o juntas forman un andamiaje para presentar las CDR. Se hace de nuevo referencia a la técnica anterior mencionada en el último párrafo. De acuerdo con una modalidad preferida, las secuencias de aminoácidos son secuencias de estructura base humanas, por ejemplo, secuencias de estructura base VH3. Sin embargo, secuencias de estructura base no humanas, sintéticas, semi-sintéticas o sin inmunoglobulina pueden también utilizarse. De preferencia, las secuencias de estructura base utilizadas son tales que (1) el polipéptido quimérico es capaz de enlazar xxxx, es decir, con una afinidad que es al menos i 1%, de preferencia al menos 5%, más preferiblemente específicamente preferida, pero no limitante, los polipéptidos quiméricos tienen la estructura FRl'- CDRl - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4 ' , en la cual CDRl, CDR2 y CDR3 son como se definen en la presente para las CDR de los I Nanocuerpos de la invención, y FRl', FR2', FR3' y FR4 ' son secuencias de estructura base. FRl', FR2', FR3' y FR4 ' pueden en particular ser las secuencias de Estructura base i 1 1, Estructura base 2, Estructura base 3 y Estructura base 4, respectivamente, de un anticuerpo humano (tal como secuencias de VH3) y/o partes o fragmentos de tales secuencias de Estructura base. Es también posible utilizar partes o fragmentos de un polipéptido quimérico con la estructura FRl' - CDRl - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR .
De preferencia, tales partes o fragmentos son tales que cumplen el criterio establecido en el párrafo precedente. Tabla 8: Lista de secuencia de nanocuerpos anti-vWF ¡ ¡ Tabla 9: Rendimientos de expresión de nanocuerpos anti- WF , Tabla 10: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos anti-vWF Tabla 11: Lista de secuencias de nanocuerpos homólogos 12B6 y 12A5 j Tabla 12: Valores de K-activada, K-desactivada y KD estimados para nanocuerpos homólogos 12A5 Tabla 13: Valores de K-activada, K-desactivada y KD estimados para nanocuerpos homólogos 12B6 Tabla 14: Valor KD real de nanocuerpos 12B6, 12A2 i y 12A¿. Tabla 15: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 Tabla 16: Concentración de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 después del calentamiento a temperaturas incrementadas ' Tabla 17: Lista de secuencias de nanocuerpos bivalentes Tabla 18: Lista de secuencia de secuencias enlaz^doras Tabla 19: Rendimientos de expresión de nanocúerpos 12B6, 12A2 y 12A5 bivalentes Tabla 20: concentración de nanocuerpos bivalentes 12B6 después del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 21: Concentración de nanocuerpos 12A2 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas 1 Tabla 23: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos 12A2 bivalentes ! Tabla 24: Lista de secuencias de nanocuerpos 12B6 humanizados | ! Tabla 25: Rendimientos de expresión de nanocµerpos 12B6 de tipo silvestre y humanizados Tabla 26: Concentración de nanocuerpos 12B6 de tipo silvestre y humanizados después del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 27: Valores KD de nanocuerpos 12B6 de tipo silvestre y humanizados I Tabla 28: Lista de secuencias de nanocuerpos 12A2 i humanizados Tabla 29: Rendimientos de expresión de nanocuerpos 12A2 de tipo silvestre y humanizados Tabla 30. Concentración de nanocuerpos 12A2 de tipo silvestre y humanizados después del calentamiento a temperaturas incrementadas i Tabla 31: Adhesión de plaquetas de nanocuerpos 12A2 de tipo silvestre y humanizados en cámara de perfusión a 0.7 y 1.5 µg/ml Tabla 32: Adhesión de plaquetas de nanocuerpos 12A2 tie tipo silvestre y humanizados en cámara de perfusión a 0.5^ 1 y 2 µg/ml i Tabla 33: Valores KD para nanocuerpos 12A2 de tipo silvestre y humanizados | Tabla 34: Lista de secuencia de nanocuerpos 12A5 humanizados Tabla 35: Rendimientos de expresión de nanocuerpos 12A5 de tipo silvestre y humanizados Tabla 36: Concentración de nanocuerpos 12A5 de tipo silvestre y humanizados después del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 37: Valores KD para nanocuerpos 12A5 de tipo silvestre y humanizados Tabla 38: Lista de secuencia de nanocuerpos bivalentes humanizados i Tabla 39: Rendimientos de expresión de nanoc?erpos bivalentes humanizados ! ¡ Tabla 40: Concentración del nanocuerpo bivalente humanizado después del calentamiento a temperaturas increm ¡entadas Tabla 41: Adhesión de plaquetas de nanocuerpos bivalentes de tipo silvestre y humanizados j Tabla 42: Mandriles utilizados con diferentes compuestos de prueba en estudio de Folts I Tabla 43: Longitud de CFRs (s) para animales control (ND = no hecho) ¡ ! Tabla 44: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Aspegic™ (ND= no hecha) i Tabla 45: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Heparina ™ (ND = no hecha) Tabla 46: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Plavix™ (ND = no hecha) ! Tabla 47: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Reopro™ (ND = no hecha) Tabla 48: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con ALX-0081 (ND = no hecha) Tabla 49: Mandriles utilizados con diferentes compuestos de prueba en estudio de Folts Tabla 50: Inhibición de CFRs en el modelo Folts para ¡ los diferentes fármacos probados. El número de experimentos en los cuales como una función de CFRs se observó en las diferentes condiciones mencionadas se I muestra como una función del número total de repeticiones diferentes de esa condición. Tabla 51: Longitud de CFRs (segundos) para cada mandril y cada dosis de Aspegic, Heparina , Plavix y ALX- 0081.» La dosis efectiva se indica en amarillo i Tabla 52: Pérdida de sangre con relación a la I segunqa gasa control para animales tratados con Plavix™ en función de una dosis final (STD = desviación estándar) ! Tabla 53: Pérdida de sangre relativa a la segunda gasa qontrol para animales tratados con Reopro™ en función de do^is final (STD = desviación estándar) Tabla 54: Pérdida de sangre con relación a la segunda gasa control para animales tratados con ALX-0081 en función de dosis final (STD = desviación estándar) ! Tabla 55: El promedio de la cantidad total de pérdida de sangre (= suma de pérdida de sangre a partir de las primeras cinco dosis del compuesto de prueba) como con relación a la segunda gasa control Tabla 56: Pérdida sanguínea en gasas con relación a la segunda gasa control para cada mandril tratado con Aspegic, Heparina , Plavix y ALX-0081 en función de dosis de fármaco. La dosis efectiva de fármacos en la cual una inhibición completa de CFRs se observó, se indica en amarillo Tabla 57: % de agregación de plaquetas inducida por ^istocetina para cada mandril tratado con Aspegic, Heparina , Plavix y ALX-0091 en función de dosis de fármaco Tabla 58: Concentración de ALX-0081 [µg/ml) en 1 muestras sanguíneas obtenidas a 10 minutos después de la administración Tabla 59: Longitud de CFRs [segundos] para mandriles tratados con ALX-0081 y con vWF I ¡ Tabla 60: Volúmenes [µl] para preparar las diferentes mezclas para estudio de escisión de A1A2A3 por I ADAMTS13. ! Los nanocuerpos representados en Tabla 8 de SEQ ID Nos: 60 a 66 se obtienen a partir de llamas inmunizadas con vWF humano o con el dominio Al recombinante de vWF. Los nanocuerpos se enlazan al dominio Al de vWF e inhiben la inter cción entre vWF y gplb en las plaquetas.
Lo 2 : Expresión y puri icación de nanocuerpos I Se preparó el plásmido (QIAGEN, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes) y se trasformó en células electro-competentes WK6 o TG1. Se utilizó una colonia sencilla para iniciar un cultivo durante la noche en LB que contiene 2% de glucosa y 100 µg/ml de ampicilina.
Se diluyó este cultivo durante la noche 100 veces en 2x300 ml de medio TB que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y se incubó a 37 °C hasta OD600nm=0.5 1 mM de IPTG se agregó y el cultivo se incubó para 3 más horas a 37°C o durante la noche i a 28°C. | Se centrifugaron los cultivos durante 20 minutos a lOOfO rpm a 4°C. El granulo se congeló durante la noche o para 1 hora a -20°C. Luego, el granulo se descongeló a temprátura ambiente durante 40 minutos, se volvió a suspender en 20 ml de tampón peri (50 mM de NaH2P04 y 300 mM de NaCl) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se aisló la fracción periplásmica por centrifugación durante 20 minutos a 4°C a 20000 rpm. Se purificaron nanocijerpos en una columna Nikel (TALÓN, Clonetech) como se describe por el fabricante y se calcularon los rendimientos de exbresión como se representó en la Tabla 9.
Ejemplo 3: Enlace de nanocuerpos a vWF en ELISA Los nanocuerpos del Ejemplo 1 se probaron para I enlac^ de vWF en ELISA. Por lo tanto, se recubrió una placa I microtituladora (Nunc, Maxisorb) con vWF (Red Cross) a una dilución de 200 veces y se pre-calentó durante 15 minutos a I 37°C.¡La placa se recubrió durante la noche a 4°C. La placa se lajvó entonces con PBS-Tween y se bloqueó durante dos horas a temperatura ambiente con PBS-1% de caseina. Después del lavado, las muestras se aplicaron a partir de una conce?tración de 10 µg/ml y se hicieron diluciones 3 veces en PBS. Después de un periodo de incubación de dos horas, las placas se lavaron y el anticuerpo anti-myc monoclonal de ra?ón se aplicó en una dilución de 1000 veces durante 1 hora á temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se aplicó el anti-ratón-HRP policlonal (DAKO) en una dilución de 1000 veces durante una hora a temperatura ambiente. Las 1 placas¡ se lavaron y se aplicó el sustrato ABTS/H202. Se midió la OD 405 nm. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 4 : Inhibición de adhesión de plaquetas para nanoctierpos en una cámara de flujo Se analizaron las muestras de proteinas en una cámarp de perfusión. Se mojaron cubreobjetos Themanox (Nunc^ durante la noche en 80%, se enjuagaron completamente con a'gua destilada y se secaron en aire. Se solubilizó colágeno placentario humano del tipo III (Sigma) en 0.05 molesj1 de ácido láctica y se rocío en el cubreobjetos en I una densidad final de 30 µg/cm2 con un aerógrafo de retoque. Después de rociar los cubreobjetos se bloquearon con l|% de solución de albúmina humana en PBS durante al menos i 1 hora a TA. Las perfusiones se realizaron con una cámara de perfusión de paso sencillo bajo condiciones de flujo no pulsátiles utilizando una cámara de perfusión pequeña modificada con una altura de hendidura de 0.1 mm y un ancho de hendidura de 2 mm. La sangre se obtuvo por venepikntura de voluntarios saludables y se anti-coaguló con Penta PPACK. Cubreobjetos por triplicado se insertaron en la cámara. Cinco mililitros de sangre se pre-calentaron a 37 °C I durante 5 minutos con o sin la adición de 2 microgramos/ml del nanocuerpo y luego se recircula a través de la cámara durante 5 minutos en un Índice de esfuerzo cortante de pared de 1600 s"1 utilizando una bomba de infusión. Después de una secuencia de perfusión, el cubreobjeto se toma a partir de la cámara, se enjuaga en solución salina tamponada Hepes (10 mM de Hepes, 150 mM de NaCL, pH 7.4 ) , se fija en 0.5% de glutaraldehído en PBS, se deshidrata en metanol y se tiñe con May-Grünwald y Giemsa (Riedel de Haén) . La deposición de plaquetas se evalúo como coberjtura de superficie de plaquetas utilizando microscopia de luz y análisis asistida por computadora. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Los nanocuerpos 12B6 y 12A5 claramente inhibe la adhesión de plaquetas al colágeno de tipo III en la cámara de perfusión en un índice de esfuerzo cortante elevado.
Lo 5 : Análisis en BIACORE para enlace a vWF para nanocuerpos homólogos Los nanocuerpos 12B6 y 12A5 inhiben adhesión de plaquetas en la cámara de perfusión. Las secuencias homologas se obtuvieron a partir de la llama que comprende las diiferencias de aminoácido como se muestra en la Tabla i 11 SED ID Nos 67 a 73. La Figura 2 y 3 representan la alineación de las secuencias de nanocuerpos homólogos 12A5 hidroixisuccinimida en agua) durante 7 minutos. En la activación vWF se inyectó hasta que se detectó un mcrernlee.nto de 6000 unidades de respuesta. El exceso de grupos reactivos se desactivó con 1 M de Etanolamina-HCl (pH 8?.5) durante 7 minutos. La Índice de flujo se mantuvo constante durante el procedimiento de inmovilización a 5 µl/mijnutos. El tampón eluyente fue 0,01 M de HEPES (pH 7.4) con 0|, 15 M de NaCl, 3 mM de EDTA y 0,005% de Tensioactivo P20. Los nanocuerpos 12B6 y 12A5 y sus proteínas homologas se analizaron en BIACORE en vWF en una concentración del nanocuerpo de 5 µg/ml como se muestra en la Figura 4 y 5. Los valores de K-activadas, K-desactivadas y KD estimados se representan en la Tabla 12 y 13. Los nanocúerpos 12A5 y 12B5 tienen los mejores índices de K-activáda y K-desactivada. Los nanocuerpos 12A2 y 12B6 tiene? el mejor Índice de K-activada, los índices de K-desactivada son muy comparables a todos los nanocuerpos probados . i La Tabla 14 muestra el valor KD real para vWF en BIACOI^E utilizando un rango de concentraciones de los nanoc erpos . A partir del conjunto de curvas que se generó para ¡cada nanocuerpo, sólo aquellas curvas en donde el equilibrio se alcanzó, se utilizaron para derivar la válvu a KD a través de afinidad de estado estable.
Para el tratamiento de eventos agudos, la inhibición rápida de vWF es muy importante, y así un índice de K-activada rápido se prefiere. El Índice de K-activada determina que tan rápido un nanocuerpo se enlaza a su objetivo (vWF) cuando se inyecta en seres humanos o I animales .
Ejemplo 6: Comparación de nanocuerpos de inhibición para potencia en la cámara de perfusión Para comparar la potencia para inhibición de adhesión de plaquetas, los nanocuerpos 12A2, 12B6 y 12A5 se probajron en la cámara de perfusión en 0.2, 0.4 y 0.6 µg/ml. i El exjperimento se realizó utilizando el mismo donador para todos i los anticuerpos. Los resultados se muestran en la Tabla | 15 y la Figura 6. Los nanocuerpos muestran una capacidad de inhibición muy comparable en la cámara de perfusión, con inhibición total de adhesión de plaquetas en una c ncentración de 0.6 µg/ml del nanocuerpo.
Ejemplo 7: Estabilidad de nanocuerpos a temperaturas elevadas I ¡ Una solución madre de nanocuerpos en una concentración de 200 µg/ml en PBS se preparó y dividió en varios tubos. Cada tubo que contiene un nanocuerpo se incubó a diferentes temperaturas durante 1 hora, luego se enfrió a temperatura ambiente durante 2 horas y se colocó a 4°C durante la noche. Al siguiente día, las muestras se centrifugaron durante 30 minutos a 13000 rpm, y el I sobrenadante se probó para OD280 nm. La concentración de sobre dantes se midió espectrofotométricamente y se I expresó como un porcentaje de la concentración a temperatura ambiente. Los resultados se resumen en la Tabla 16. ¡ Los sobrenadantes se probaron también en ELISA para ¡enlace a vWF como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Como se muestra en la figura 7a (12B6), 7b (12A2; y 7c (12A5), los nanocuerpos son muy estables a temperaturas elevadas.
Ejemplo 8: Reactividad cruzada de los anticuerpos con vWF a partir de otras especies Se recubrió una placa microtituladora con anti-myc dé ratón a 1/1000 durante la noche a 4°C. La placa se 1 lavó 'con PBS-Tween y se bloqueó durante dos horas a temperatura ambiente con PBS-1% de caseína. Después del lavado, los nanocuerpos se aplicaron a una concentración de 10 µgi/ml en PBS. Después de un periodo de una hora de incubación, las placas se lavaron y el plasma (de perro, cerdo,¡ humano, mandril y mono de la India) se aplicó a partir de una dilución de cinco veces y realizando diluciones de dos veces adicionales en PBS. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y el anti-vWF-HRP policlonal (DAKO) se aplicó a una dilución de 2000 veces durante una hora a temperatura ambie te. Las placas se lavaron y se aplicó el sustrato de i ABTS/H202. Se midió la OD 405 nm. Como se muestra en la Figura 8a (12B6) , 8b (12A2) y 8c ¡ (12A5), los nanocuerpos 12A5, 12A2 y 12B6 son de reactividad cruzada con vWF de seres humanos, mandriles y I J I monos de la India. Los nanocuerpos 12A2 y 12B6 son también de reactividad cruzada con vWF de cerdo. Estos nanocuerpos pueden por lo tanto probarse para eficiencia y seguridad en cerdos. Ningunos de los nanocuerpos es de reactividad cruzada con vWF de perro.
B. Construcción de nanocuerpos bivalentes para vWF y adhesjón de plaquetas de inhibición I Lo 9 : Secuencias de aminoácidos de los nanocuerpos bivalentes | La Tabla 17 SEQ ID Nos. 74 a 82 representa i nanocierpos bivalentes construidos para 12B6, 12A2 y 12A5. Los ¡ nanocuerpos se unieron con los enlazadores representados en la Tabla 8 SEQ ID Nos 83 a 85.
Ejemplo 10: Expresión y purificación de los nanocuerpos bivalentes Se realizaron las expresiones como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Los rendimientos de expresión se resumen en la Tabla 19. .o 11 : Análisis de los nanocuerpos bivalentes en BI CORE I Los nanocuerpos bivalentes del Ejemplo 9 se analizaron en BIACORE, a 1,3 nM como se describe i anteriormente en el Ejemplo 5 para comparar las afinidades para vWF contra el nanocuerpo monovalente. Los nanocuerpos monovalentes 12B6 (Figura 9), 12A2 (Figura 10) y 12A5 (Figufa 11) tienen una afinidad mejorada para vWF cuando se compara al nanocuerpo monovalente.
Ejemplo 12: Estabilidad de los nanocuerpos bivalentes a temperaturas elevadas I 1 La estabilidad de los nanocuerpos bivalentes se midió como se describe anteriormente en el Ejemplo 7. La concentración (µg/ml) de los sobrenadantes se midió y I expresó como un porcentaje de la concentración a temperatura ambiente. Los resultados se resumen en la Tabla 20 (1 B6 bivalente), Tabla 21 (12A2 bivalente) y Tabla 22 (12A5 'bivalente) 1 Los sobrenadantes se probaron en ELISA par el enlace a vWF como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Lo,s sobrenadantes se aplicaron a partir de una dilución de 1/100 y 1/5 diluciones se hicieron en PBS. Los resultados se muestran en la Figura 12 (12B6) , Figura 13 (12A2& y Figura 14 (12A5) .
EjempJLo 13: Análisis de 12A2 monovalente y bivalente en la cámara de flujo El nanocuerpo 12A2 (formas monovalente y bivalente) se probó en la cámara de perfusión como se describe anteriormente en el Ejemplo 4. El experimento se realizó utilizando el mismo donador para todos los nanocµerpos. Los resultados se resumen en la Tabla 23. Los nanocuerpos bivalentes inhiben adhesión de plaquetas más eficientemente que la forma monovalente. adhesión de plaquetas de inhibición Ejemplo 14 : Humanización del nanocuerpo 12B6 ! La Tabla 24 SEQ ID Nos. 85 a 89 representa cuatro nanocúerpos 12B6 humanizados. La Tabla 11 lista los cambios de a inoácidos que se realizaron para lograr estas secuencias. La Figura 14 representa el alineamiento de las secuencias humanizadas para 12B6.
Tabla II: sustituciones humanizadas no limitantes ! Se realizaron las expresiones como se describe en el Ejemplo 2. Los rendimientos de expresión se resumen en la Tabla 25. I La estabilidad de los nanocuerpos humanizados se midió como se describe en el Ejemplo 7. La tabla 26 resume concentraciones de OD280 mm (µg/ml) de los sobrenadantes I exprefados como un porcentaje de la concentración a i temperatura ambiente. i i La Figura 16 muestra el enlace de nanocuerpos 126B humanizados a vWF en ELISA realizada como se describe en el | Ejemplo 3. i La afinidad de nanocuerpos 12B6 humanizados para vWF se determinó en BIACORE. Los valores KD se resumen en la Tabla 27 Ejemplo 15: Humanización del nanocuerpo 12A2 i La Tabla 28 SEQ ID Nos 90 a 94 representa cinco nanocaerpos 12A2 humanizados. Las tablas III y IV listan los siguientes cambios de aminoácido que se realizaron para lograjr estas secuencias. La Figura 17 representa el aline miento de las secuencias humanizadas para 12A2.
Tabl Tabla! IV: Se realizaron las expresiones como se describe en el Ejemplo 2. Los rendimientos de expresión se resumen en la Tabla 29. La estabilidad de nanocuerpos humanizados se midió como se describe en el Ejemplo 7. La tabla 30 resume las concentraciones OD280 mm (µg/ml) de los sobrenadantes I expresados como porcentaje de la concentración a temperatura ambiente. Todos los nanocuerpos 12A2 human{Lzados son muy estables en el calentamiento a temperaturas incrementadas. | El ELISA de la Figura 18 y 19 se realizó como se describe en el Ejemplo 3. 12A2H1 y 12A2H4 se enlaza muy bien vWF en ELISA. Los nanocuerpos se probaron en la cámara de flujo í en unja concentración de 0.7 µg/ml y 1.5 µg/ml. El mismo donador se utilizó para todos los experimentos. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se resumen en la Tabla 31 y 32. l La afinidad de nanocuerpos 12a2 humanizados para vWF se determinó en BIACORE. Los valores KD se resumen en i la Ta la 3.
I -jemplo 16: Humanización del nanocuerpo 12A5 La Tabla 34 SEQ ID Nos: 95 a 97 representa tres nanocµerpos 12A5 humanizados. La Tabla V lista los cambios de aminoácido que se realizaron para lograr estas secuencias. La Figura 20 representa la alineación de las secuencias humanizadas para 12A5.
Tabla 'V: sustituciones humanizadas no limitantes: ¡ Se realizaron las expresiones como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Los rendimientos de expresión después de la purificación TALÓN se resumen en la Tabla! 35 para cada nanocuerpo 12A5 humanizado. i La estabilidad de los nanocuerpos 12A5 se midió como ?e describe anteriormente en el Ejemplo 7. La OD280 de los sobrenadantes se midió y expresó como porcentaje de la OD280 a temperatura ambiente. Los resultados se resumen en la Tabla 36. Todos los nanocuerpos 12A5 humanizados son compa ablemente estables en el calentamiento a temperaturas incrementadas al tipo silvestre. I i ELISA se realizó como se describe en el Ejemplo 3. La ! Figura 21 ilustra la actividad de enlace para vWF en ELISAJ I ¡ La afinidad de nanocuerpos 12A5 humanizados para vWF s determinó en BIACORE. Los valores KD se resumen en la Tabla 37.
Ejemplo 17: Nanocuerpos humanizados bivalentes ! Tres nanocuerpos humanizados 12A2H1, 12A2H5 y Figura 23 muestra la adhesión de plaquetas en diferentes concentraciones de nanocuerpos bivalentes. La Tabla 41 listaj la adhesión de plaquetas de nanocuerpos bivalentes humanizados y de tipo silvestre.
D. Efecto del nanocuerpo (bivalente) en trombosis artorial en un modelo Folts de mandriles >lo 18: Modelo Folts de mandriles con A X-0081 I En este estudio, la eficacia y seguridad de ALX- I 0091 ^e evaluó en modelo de trombosis Folts en mandriles. i para ?ada uno de estos compuestos. I Finalmente, la eficacia en un modelo de trombosis Folts ¡ en mandriles de una combinación de fármacos que se utiliia actualmente en el aspecto clinico en un ambiente de intervención coronaria percutánea (PCI) se probó: Aspegic, Heparina y Plavix. Se evaluó además si ALX-0081 pueda mejor r la eficacia de esta combinación cuando se agrega en la paifte superior. i Se examinó en parámetros de seguridad tales como I inducción de sangrado, vWF y niveles del factor VIII y contéb plaquetario, PT y aPTT.
Protocolo de Estudio | El protocolo de estudio que se aplicó es el modelb Folts original y algunas modificaciones descritas posteriormente (Folts JD, et al, Circulation. 1976; 54 : 365- 370) . i ' Se utilizaron mandriles machos o hembras I saludables ( Papio ursinus) . Los animales tuvieron 8-17 kg i de pepo y estaban libres de enfermedades durante al menos 2 semanas antes del uso. Se alimentaron a los mandriles con alimento estándar seco solamente. Los mandriles se utilizaron en diferentes puntos de tiempo. El peso de los mandriles se resumen en la tabla 42 (estudio de eficacia ALX-0(¡)91 y comparación con fármacos individuales) y la tabla 50 (eficacia de una combinación de fármacos y AL-0081 como parte de esta combinación) . | Se anestesiaron a los animales y se mantuvo la temperatura corporal a 37 °C con una mesa térmica. Un segmento de una arteria femoral se disectó libremente del tejidq circundante. Se colocó un derivador entre la vena | femoral y la arteria femoral para obtener Índices de esfuerzo cortante elevados. El flujo sanguíneo promedio y en bases se registró continuamente a través del experimento. El flujo de punto de partida se registró durante 20 minutos. El sitio de disección próximo de la arteria femoral se daño entonces al aplicar dos oclusiones de trjaslape de la arteria durante 1 segundo utilizando un i forcebs. Se colocó una abrazadera sobre el sitio dañado para producir una estenosis externa. ! i Un declive gradual en el flujo sanguíneo debido a I la adhesión y agregación de plaquetas se observó. Cuando se i redujo el flujo a cero, el flujo de sangre se restauró abriendo la abrazadera para remover el trombo rico en i plaquetas. Este patrón repetitivo de disminución de flujo sanguíneo que sigue la restauración mecánica se refiere a reducciones de flujo cíclicas (CFRs) . Se repite el daño endotélial adicional si es necesario para obtener finalmente CFRs en estos mandriles. El número de veces para i ^ que fuera removido el trombo determina el número de CFRs.
La Figura 24 ilustra el patrón de flujo sanguíneo durante el mofelo Folts en mandriles. ¡ Después de un periodo de control de 30 minutos de CFRs ¡reproducibles, el vehiculo se administró como un control interno y las CFRs se siguieron por 30 minutos más. Después de este periodo, los agentes de prueba (solución salin^ (n=2), Reopro (n=3) , Aspegic (n=3) , Plavix (n=4), Heparj|na ( n=3 ) o ALX-0081 Nanobody™ (n=9 ) ) , se proporcionaron a través de una inyección de bolo intravenosa (seguida por una infusión continua para ALX-0081) y el monitoreo se continuó hasta 30 minutos después de lá administración del fármaco. Este procedimiento se repit .ó varias veces con dosis incrementadas de la sustancia de prueba. El efecto anti-trombótico se cuantificó al comparar la longitud de CFRs antes y después de lá administración del fármaco. Cuando la inhibición totalj de CFRs se observó, un nuevo daño se aplicó con el i fin de confirmar que la inhibición fue un efecto del trata iento, pero no de un fenómeno de salud natural. En el final¡ de los experimentos, se inyectó epinefrina (2.2 µg/ml/min) con el fin de diferenciar entre una inhibición débil i y una fuerte de las CFRs. Más bien, se ha demostrado antes ¡ que las CFRs reaparezcan en la presencia de Epinefrina cuando se utiliza aspirina (un fármaco anti-plaqu tas débil) en el mismo modelo. ¡ 1 La longitud de las CFRs, después de cada dosis del Compuesto de prueba se resume en las tablas 43-48. Las dosis ¡en la cual la inhibición total de las CFRs se obtiene se sombrean. ¡ Una lectura representativa del flujo sanguíneo durante los experimentos de modelo Folts se muestra en las figuráis 26-31. | Los resultados demuestran que las CFRs pueden obtenerse en los animales control durante al menos 3 horas, sin la necesidad para un nuevo daño entre éstas. La longitud promedio de las CFRs es2-5 minutos y no existe efecto en la longitud de las CFRs por inyección de solución salina (Figura 26, tabla 43).
AspegUc Se inyectaron animales con Aspegic (Aspirina i inyectable) y se investigaron para inhibición de CFRs. En I el asjpecto clinico, una inyección de bolo de 250 mg (± 3-5 mg/kg} se administra al paciente, justo antes de iniciar un procedimiento de intervención coronaria percutánea (PCI).
En dojs animales (mandriles 3 y 5) ninguna inhibición de CFRs pudo obtenerse en dosis tan altas como 80 y 40 mg/kg de Asipegic respectivamente (figura 27, tabla 44). En el mandril 4, fue muy difícil establecer un patrón repetitivo I estable de CRs en la fase control. Después que se hicieron varios nuevos daños (esto es en el momento de la solución inyectada), se obtuvieron las CFRs estables. La inhibición total de CFRs se obtuvo en la dosis de 5 mg/kg de Aspegic, pero én dosis más elevadas y en el nuevo daño, las CFRs regresaron, aunque la longitud promedio de las CFRs fue 3-4 veces más largas que antes de la administración de Aspegic. ¡ Despu s de la infusión de Epinerina, las CFRs regresaron inmediata y completamente (tabla 44! Tres animales se inyectaron con Heparina no fraccionada y se investigaron para inhibición de CFRs. En el aspecto clínico, una inyección de bolo de 60-70 IU/kg se administra al paciente y el aPTT (tiempo de tromboplastina parci l activada) se verifica cada 30 minutos. La heparina extra1 se administra si el aPTT es <250 segundos. En mandriles 7 y 8, ninguna inhibición de las CFRs pudo obtenerse incluso sin dosis tan elevadas como 240 IU/kg ! (figuia 28, tabla 45). En el mandril 6, la inhibición total de lap CFRs se obtuvo en la primera dosis de 15 IU/kg y una dosis | más elevada, pero cuando se hizo un nuevo daño las i CFRs regresaron cada vez. En la dosis más elevada de 240 IU/kgl las CFRs se inhibieron incluso después de un nuevo daño, i pero el flujo se redujo y en la infusión de Epinefrina, las CFRs regresaron inmediatamente.
Plavik Se trataron cuatro mandriles con Plavix y se utilizaron para estudio Folts. Se utilizó Plavix como fármaco inyectable al volver a suspender tabletas en metan l. Por lo tanto, fue posible realizar un experimento de escalamiento de dosis como para los otros fármacos. En pacientes, se administra oralmente 300-600 mg de Plavix, la inhibición de agregación de plaquetas pueden observarse 2 I horas¡ después de dosis oral sencilla de Plavix.
Previamente, en la dosis final de 2.5 mg/kg en los mandriles, un efecto en la longitud de las CFRs pudo demostrarse, pero este efecto inhibidor inició sólo 10 minutps después de la inyección (figura 29, tabla 46) . En 12, la inhibición total de las CFRs se obtuvo en esta dosis de 2.5 mg/kg. En los otros tres mandriles la i I inhibición total de CFRs se obtuvo en la dosis final de 5 mg/kg. Las CFRs permanecieron inhibidas cuando un nuevo daño i se hizo, pero regresó después de la infusión de Epinefrina. Cuando se detuvo la infusión de epinefrina, las CFRs permanecieron durante otros 5 minutos, pero entonces I se obtuvo de nuevo la inhibición total (figura 29) . I I Reoprb Se probó el Reopro para eficacia en el modelo Folts1 en tres mandriles. En el aspecto clínico, los pacieijites recibieron una dosis de 250 µg/kg seguidos por una imfusión continua de 7,5 µg/kg/hora. Esto es también la I dosis' la cual es necesaria en mandriles 13, 14 y 15 para obtene Ir la inhibición total de las CFRs (dosis final de 170-4^0 µg/kg (figura 30, tabla 47) . Se administró a los I mandriles una inyección de bolo solamente. Cuando se aplicó un nuevo daño, la inhibición completa de las CFRs se retuvo y la infusión de epinefrina pudo no revertir esta inhiblición (figura 30) .
ALX-0081 ! Nueve mandriles recibieron ALX-0081 y se utilizaron en el modelo Folts. En todos los mandriles la inhibición total de CFRs se obtuvo en la dosis de 30 µg/kg + 45 µg/kg/hora (dosis final de 43 µg/kg) . En 2 mandriles, la injhibición completa se obtuvo previamente en 10 µg/kg i + 15 | µg/kg/hora (mandriles 17 y 22) . La inhibición se retuvo en un nuevo daño y después de la infusión de Epine::rina en todos los nuevos mandriles (figura 31, tabla 48) . I i | Siete mandriles recibieron una inyección de bolo de 5 ¡ mg/kg de Aspirina, 60 IU/kg de Heparina y dosis incre entada de Plavix. Se administró Heparina extra en diferentes puntos de tiempo para sostener un cierto nivel (el apTT debe ser al menos doblada contra el control) las CFRs se monitorearon durante 30 minutos después de cada dosis ¡ de los compuestos de prueba. Se inició en una dosis de 1 ¡mg/kg de Plavix y se agregó 1 mg/kg después de 30 minutos. El efecto anti-trombótico se cuantificó al comparar la longitud de CFRs antes y después de la administración del fármaco. Cuando la inhibición total de I CFRs jse observó, un nuevo daño se aplicó. La epinefrina se inyectó y continuó hasta el final del experimento. Si no regresaron las CFRs, se aplicó un nuevo daño. Después se agregaron 2-3 dosis incrementadas de CFRs de ALX-0081: (1), 3, l?| ó 30 µg/kg. Se esperó después de cada dosis de ALX-0081 para 2 CFRs y se incrementó la dosis hasta que la inhibición total de las CFRs se obtuvo. En la inhibición total] de las CFRs, se inició la infusión continua de 1,5 veces de dosis de ALX-0081/kg/hora durante 30 minutos y la infusión de epinefrina se continuó. Un nuevo daño se aplicó después de 10-15 minutos. Las especificaciones para los mandriles que se utilizaron en este estudio se representan en la1 tabla 49. i Los resultados a partir de estos estudios para cada compuesto de prueba individualmente se resumen en la tabla i 50. Un efecto anti-trombótico superior claro en el modeló de mandril de trombosis Folts se observa para ALX- 0091 |y Reopro cuando se compara a Aspirina, Heparina o Plavix; en el nuevo daño y después de la infusión de Epinefrina, las CFRs no regresan en el modelo Folts en mandriles tratados con ALX-0081 y Reopro en contrasta al modelo en animales tratados con Aspegic, Heparina o Plavix.
La dfsis de ALX-0081 requerida para inhibición total de CFRs ¡ es aproximadamente 10 veces más baja que la dosis necesaria para Reopro. Por lo tanto, se concluye que ALX-0081 íes más potente que Reopro. I i Después de la administración de una combinación de 5 mg/kg de Aspirina, 60 IU/kg de heparina y dosis incrementadas de Plavix, en los siete mandriles de inhibición total de las CFRs se obtuvo en esta dosis final.
La dqsis de Plavix requerida para inhibición total es 2,5 veces más baja que la dosis necesaria cuando se administra Plavix solo. Para todos los mandriles probados, las CFRs no regresaron cuando se realizó un nuevo daño (figura 32) . Sin embarígo, en la inyección de Epinefrina, las CFRs regresaron espontáneamente a los mandriles 5, 8, 9 y 10 y en un nuevo daño en mandriles 4, 6 y 7. La heparina extra se inyectó al mismb tiempo como epinefrina. Después de 2 CFRs, dosis incrementadas de ALX-0081 se administraron mientras se i continúa la infusión de epinefrina. La dosis de ALX-0081 se incrementó de 1 a más de 3-10 a 30 µg/kg. Cuando la inhibición total de CFRs se obtuvo, una infusión continua de ALX-0081 se inició en 1,5 veces la dosis 1 efectiva/kg/hora . En todos los siete mandriles, la inhibición total de CFRs se obtuvo en la dosis de 30 µg/kg. Esta dosis efectiva de ALX-0081 es la misma como se requiere para la inhibición completa de CFRs en el modelo FOLTS, cuando ALX-0081 se administra solo. Por lo tanto, se concluye que la eficacia de ALX- I 0081 no se incrementa por infusión simultánea de Plavix, Heparina y Aspegic. La observación está completamente en linea! con esta hipótesis. ALX-0081 inhibe la primera I interacción entre las plaquetas y el colágeno expuesto en la patred arterial dañada. Plavix y Aspegic por otro lado se inhiben además corriente abajo en la cascada que conduce al desarrollo de un trombo. Por lo tanto, Plavix y Aspirina no contribuyen a mejor eficacia cuando ALX-0081 interfiere ya con la primera etapa en formación de trombo. Además, cuando se aplicó un nuevo daño en la dosis efectiva de ALX-0081, las CFRs no regresaron, demostrando un efecto antittombótico potente de este Nanobody™. Los resultados se resumen en la tabla 51.
Mediciones Se midieron los siguientes parámetros: a) análisis de sangrado, b) concentración de vWF, niveles del faetón VIII, y conteo de plaquetas, PT y aPTT c) agregación de plaquetas inducida por ristocetina d) concentración de ALX-0081 y e) análisis de secciones arteriales para restenosis, f) inmunogenicidad de ALX-0081. a) Análisis de sangrado i Para analizar el sangrado, se hizo una incisión con ?n escalpelo en la ingle. Esto se hizo 15 minutos despufes de registrar el flujo de punto de partida, cuando I se hizo el daño en la arteria. Se insertaron gasas en la herida y se reemplazaron cada 30 minutos justo antes de cada dosis del compuesto de prueba. La cantidad de pérdida de sahgre después de cada dosis del compuesto de prueba se I determinó al pesar las gasas. La pérdida de sangre se I expresa con relación a la cantidad de pérdida de sangre en la segunda gasa control (durante la inyección salina) (tablas 52-54) . I ¡ Para todos los mandriles tratados con Plavix y | Reoprf, la pérdida de sangre es alta (hasta 9-40 veces respectivamente en la dosis más elevada) , iniciando a I partii: de la dosis efectiva. Para animales tratados con ALX-0081 el sangrado es más bajo que en animales tratados con P^avix, y mucho más bajo cuando se compara con animales tratados con Reopro. ! Con el fin de determinar la seguridad contra el nivel I de eficacia de Plavix, Reopro y ALX-0081 como fármaqos antitrombóticos, los promedios de pérdida de sangre con relación a la segunda gasa control se muestran para estos fármacos en función de la dosis de fármaco como múltiple de la dosis efectiva (figura 33) . La dosis efectiva para Plavix es 5 mg/kg, para Reopro 250 µg/kg y para ! ALX-0081 30 µg/kg (tabla 46-48). Estos resultados demuejstran de forma benevolente la seguridad superior de ALX-0081 cuando se compara a Reopro y Plavix: la ventana en la cual ALX-0081 pudo administrarse sin un mayor incremento en sangrado es mucho más amplia comparada con Plavix y Reoprp. resultados de los promedios de pérdida de gasas (si está disponible) se combinaron con los promedios de las longitudes de las CFRs en las figuras ! Una ventana terapéutica amplia se observó para ALX-0(81 en el modelo Folts: un efecto antitrombótico fuerte pudo demostrarse sin sangrados mayores para dosis acumuladas que varían de 43 µg/kg hasta 403 µg/kg (figura 36) . tn contraste, sin embargo, la ventana terapéutica para I Reoprf y Plavix en el mismo modelo fue mucho más angosto comparado con ALX-0081, combinando un efecto antitrombótico I efectivo con una pérdida de sangre elevada (figura 34-35) . ¡ El promedio de la cantidad total de pérdida de sangre (= suma de pérdida de sangre a partir de las gasas de las primeras cinco dosis del compuesto de prueba) como relativa a la segunda gasa control se resumen en la tabla 55. E esta tabla, se indicó también la dosis final como múltiple de la dosis efectiva (= suma de las cinco dosis divididas por la dosis efectiva) . Como se menciona anteriormente, la dosis efectiva para Plavix es 5 mg/ g, para Reopro 250 µg/kg y para ALX-0081 30 µg/kg. Los resultados mostrados en la tabla 55 muestran i clarajnente que la pérdida de sangre total se incrementa notablemente en los animales tratados con Plavix y a un gradoi incluso más elevado en animales tratados con Reopro. La pérdida de sangre en animales que reciben ALX-0081 es 2 I veces1 y 4 veces menor que en animales tratados con Plavix o i Reopró, respectivamente. Esto demuestra claramente de nuevo que AJL?X-0081 es más segura que Plavix y Reopro en términos de riesgo de sangrado, aunque se utilizaron dosis de más de 10 ve<f;es la dosis efectiva. | La combinación efectiva de Aspegic, Heparina y Plavii resulta en un incremento en pérdida de sangre de hasta] 14 veces cuando se compara a la gasa control (tabla 56) . ¿a adición de ALX-0081 como parte de la combinación de I I Aspegic, Heparina y Plavix no resulta en sangrado increrhentado excepto para mandriles 4 y 7. En el mandril 7, el sangrado fue en gran medida incrementado después de la administración de epinefrina, la heparina extra y no dosis efecti.va de ALX-0081, fue más baja de nuevo después de la administración de la dosis efectiva de ALX-0081. Estos resultados demostraron que ALX-0081 es seguro cuando se agrega como parte de la combinación de fármacos que se utiliiza actualmente en un ambiente clínico. b) concentración de vWF, nivel del Factor VIII, conteo de plaquetas, PT y aPTT vWF Los niveles de vWF en el plasma rico en plaquetas PRP) de muestras de sangre tomadas después de la administración de las diferentes dosis de los fármacos en el modelo Folts se determinaron utilizando un ensayo de inmunbsorbente y se expresaron como un porcentaje del estándar humano ( HO 5h Internacional Standard for factor VIII y VWF) . i Los resultados demuestran claramente que los diferentes fármacos en el modelo no tienen mayor efecto en el nivel de vWF.
Factor VIII 1 ¡ Los niveles de factor VIII en el PRP de muestras de sajngre tomados después de la administración de las diferentes dosis de los fármacos en el modelo Folts se determinaron utilizando la prueba de aPTT. No se probaron las r?uestras de plasma de los mandriles tratados con Heparina, como se demuestra que la Heparina prolonga el tiempo aPTT. Los niveles de FVIII se expresaron como porcentaje de la primera muestra control, tomada 10 minutos despu s del daño de la arteria femoral. No se observa ningún efecto de los tratamientos en la prueba de aPTT.
Con tep de plaquetas , PT y aPTT Se realizaron mediciones de conteo de plaquetas durante los experimentos de modelo Folts. Los datos i muestjran que el mandril 15 tiene un conteo de plaquetas muy bajo (cuando se compara a los otros animales. Los conteos de plaquetas para toda clase de tratamientos, excepto para el i trataijniento con Plavix, son muy comparables a lo que se obserj/a en los animales control y son muy constantes con el tiemp<b. Los valores PT no demuestran efecto de los compuestos de prueba en el tiempo PT, excepto para mandriles tratados con la dosis de 240 IU/kg de Heparina en donde I se observó un incremento menor en PT. ¡ Los valores aPTT observados durante estudio de modeló Folts se resumen. Estos resultados indican que los compu stos de prueba no tienen efecto en valores aPTT, excepto para los mandriles tratados con Heparina. En estos animales, los valores de aPTT se prolongan a partir de 30-60 ILJ/kg sobre la dosis, como se observa también en pacientes. La heparina actúa como un anticoagulante al formar un complejo con antitrombina y catalizando la inhibición de factores de coagulación de sangrado activado al co o Xla, IXa,Xa y trombina (factor lia). Estos factores estánl todos implicados en la cascada de coagulación intrínseca de la cual se funcionalidad se mide en la prueba de aPtTT. c) Mpdición de agregación de plaquetas inducidas por ristopetina en sangre obtenida a partir de mandriles tratados con ALX-0081 La sangre obtenida de mandriles tratados con ALX-0081 analizó para inhibición de agregación de plaquetas.
Se realizaron las agregaciones de plaquetas en un Agregómetro de sangre completa y óptica Chronolog (Modelo I 560CA> Chronolog, USA) . Se preparó el PRP (recolectado en 0.38 triol/l de citrato) centrifugando la sangre completa a i I 1200 j rpm durante 5 minutos. La fracción superior que contiene el PRP se removió cuidadosamente. La fracción más baja ¡se centrifugó además a 3000 rpm durante 10 minutos I para ' preparar plasma pobre en plaquetas (PPP) . Las plaquetas se contaron en PRP y se diluyeron en PPP a una concentración final de 200.000 plaquetas por microlitro. Se agrega» 3 mg/ml de ristocetina (DAKO) y se midió la agregación. La agregación de plaquetas ex vivo se mide en las muestras de sangre tomadas durante el experimento Folts en los rriandriles tratados con ALX-0081. La agregación de plaquetas dependiente de GPIb-IX-V a través de vWF se mide utilizando ristocetina como un modulador. El % de agregación se mide en cada punto de tiempo y en cada dosis. La muestra control se toma 10 minutos después de daño arterial . Los resultados a partir de la prueba RIPA. se comparan a la inhibición de las CFRs para cada mandril tratado con ALX-0081 (figura 37) .. Como se muestra en la figur 37, una relación inversa entre la RIPA y la longitud I de la CFRs se observó. Además, estos resultados demuestran que lia inhibición total en la prueba RIPA se obtuvo en dosis : más bajas que la inhibición total de CFRS en mandriles 16, 18, 19 y 23. Para los mandriles 20, 21, 22 y 24, los resultados con RIPA se comparan muy bien los resultados para eficacia en el modelo Folts. d) Concentración de ALX-0081 i ¡ Se recubren mic'oplacas con anti-myc policlonal durante la noche a 4°C en una dilución de 1000 veces. Las placad ¡ se lavan con PBS-Tween y se bloquean durante 2 horas a TA con PBS-1% de caseína. Las muestras se diluyen en una placa microtituladora no recubierta en 25% de plasma de i mandril de referencia. La curva estándar se prepara al diluir el nanocuerpo en la misma muestra de plasma de referencia. Las muestras se aplican en las placas recubiertas con anti-myc -y se permite unirlas durante 2 horas a TA. Las placas se lavan 5 veces con PBS-Tween. Se aplicla anti-vWF-HRP de conejo (DAKO) en una dilución de 3000 veces durante una hora a TA. Para medir OD405 nm, las se lavan 5 veces con PBS-Tween y sustrato se agrega. Se determina la concentración de ALX-0081 en muestiras de plasma tomadas 10 minutos después de cada inyección de bolo. La inyección de bolo se siguió inmediatamente por una infusión continua. Las I concentraciones (µg/ml) se resumen en la tabla 58. ¡ Para todos los mandriles un nivel incrementado de ALX-0081 en las muestras de plasma se midió por ELISA después de incremento de dosis de ALX-0081. Para el mandril 16, cantidades consistentemente más elevadas de ALX-0081 se deterninaron en la muestra de plasma tomada después de 10 µg/kg de dosis en comparación con la muestra tomada después de 30 µg/kg. El nivel de ALX-0081 en esa muestra es -también sustarjicialmente más elevado que lo que se observa para todos I los otros mandriles dado el mismo horario de dosificación de ALX-0081. Ya que los niveles de ALX-0081 para l mandril 16 después que las dosis más elevadas están en linea de las expectativas, se asume que una anormalidad desconocida durante la muestra sanguínea responsable de este anexo.
La concentración de ALX-0081 para cada dosis en los diferentes mandriles es variable. Para la dosis de 3 µg/kg, los rangos de concentración entre 0,03 y 0,14 µg/ml para 10 µg/kg entre 0,18 y 1,23 µg/ml, para 30 µg/kg entre 0,51 y 1,14 µg/ml, para 90 µg/kg entre 1,38 y 6,77 µg/ml y para 270 µg/kg entre 4,03 y 35,14 µg/ml. i j En la figura 38, se trazó la concentración de ALX-0D81 en plasma contra la longitud de las CFRs. i La concentración de ALX-0081 requerida para inhibición total de las CFRs está entre 0,3 y 0,5 µg/ml, la cual está en concordancia total con la concentración requerida para inhibir adhesión de plaquetas a colágeno en la cámara de flujo en un Índice de esfuerzo cortante, I cuando ALX-0081 se asegura en la sangre humana. En azul ! i (figura 38, panel B) se indica el rango de concentración de i ALX-0081 en donde inicia la inhibición (omitiendo la dosis j de 10 ; µg/kg en el mandril 16) . ¡ Cuando se traza la concentración de ALX-0081 contra la cantidad relativa de pérdida de sangre a partir de la? gasas, se observa un incremento de más de 2 veces en sangrado en dosis arriba de 1 µg/ml (figura 39). Se observó i un incremento de 10 veces en pérdida de sangre cuando la concentración de ALX-0081 es 19 µg/ml, el cual es de 40-60 veces !la concentración efectiva. sitioi en donde se coloca el derivador. Se remueve una sección de 2 centímetros, se corta en una parte inferior (sitió de derivación) y superior (sitio estenosado y dañado) y se almacenó en 10% de formaldehido. Los mandriles I I se s crifican entonces por inyección en eutanasia. Las arterias se marcan de acuerdo con el origen y se cortan en anill s de 2 mm cada uno. Los anillos se colocan en casetes marcados adecuados para procesamiento de histología. Los casetes se colocan entonces durante la noche en un procesador VIP Tissue Tek automatizado siguiendo el horario de procesamiento durante la noche como se describe en Bancrfft (Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory i and P2factice of Histological Techniques . Third Edition) . i i Después del procesamiento, las arterias se insertan en bloques de cera de parafina marcados y se enfrian en una placa de congelamiento. Los bloques de cera se cortan en secciones en series de 4 mieras cada una en un micrót|omo giratorio. Las secciones se obtuvieron en portaobjetos y se tiñeron para evaluación histológica. Haemot¡o?ilina y Eosina si como el método de Verhoeff para tinciones de fibras elásticas se realizan en cada una de i las arterias (Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory and Practice of Histological Techniques. Tercera Edición) . Después del teñido, los portaobjetos se deshi ratan, remueven, montan y etiquetan. Se realiza el análisis ciego de las secciones. f) Análisis de inmunogenicidad la presencia de inmunoglobulinas de ALX-C081 en plasma de tres mandriles se evalúo por dos métodos, respectivamente un método ELISA y un método con base en SPR en Biécore. Los mandriles se trataron durante 8 semanas con dosis incrementadas de ALX-0081 (iniciando a partir de 10 µg/kgj . Durante 8 semanas, no se pudo observar ninguna respuesta inmunogénica en la inyección de ALX-0081. La ida media ' de ALX-0081 varia entre 7 y 9 horas. jsmpio 20: Uso d© vWF como un antidoto para ?LX-0081 A pesar de la seguridad probada de ALX-0081 en mandriles, y la eliminación rápida del NanobodyTI'', se decidió evaluar el uso de vWF como un antidoto para ALX-0081. Esto se probó en un modelo Folts en mandriles en donde ! se evalúo si el efecto inhibidor de ALX-0081 en formapión de trombo arterial puede invertirse por inyección de vWF.
El procedimiento experimental siguió el modelo Foltsl original con las modificaciones como se describe en el ej mplo 18 previo. i | Se utilizaron mandriles (papio ursinus ) machos saludables en este estudio. Los animales tuvieron 9-12 kg de PQSO y estuvieron libres de enfermedades durante al menos 2 semanas antes del uso. Se alimentaron a los I mandriles con alimento estándar seco solamente. Tres mandriles se utilizaron en este estudio, la longitud de las CFRs durante la fase control, después de la administración salina, ALX-0081 y vWF se resume en la tabla 59. El flujo sanguíneo como una función de tiempo para cada mandril y el experimento se muestran en la figura 40 En los tres mandriles, la inhibición total de CFRs ¿e obtuvo en dosis de 30 µg/kg + 45 µg/kg/hora de ALX-0081, i incluso cuando se aplicó un nuevo daño, las CFRs no regresaron. En la inyección de la primera dosis de vWF (250 ?u: el flujo disminuyó gradualmente, pero las CRS no regresaron hasta que una dosis extra de 250 IU de vWF se I I administró. Este resultado demuestra apropiadamente que la i actividad de ALX-0081 puede invertirse por la administración de vWF, y que por lo tanto, la VWF podria ser uh buen antidoto para este Nanobody™.
I De este modo, otro aspecto de la invención se I relaciona al uso de vWF, de un fragmento adecuado del mismo, de DDAVP (desmopresinor) o un fragmento adecuado del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de lo anterior, como un antidoto para complicaciones o efectos secundarios indeseados asociados I con el uso de un Nanocuerpo, proteina o polipéptido contra vWF, len particular un Nanocuerpo, proteina o polipéptido I como Se describe en la presente. para el uso de ALX-0081 como un fármaco en pacientes TTP. Las perfusiones de plaquetas reconstituidas en plasma TTP (sin ¡ADAMTS13) se realizan en células endoteliales que secretan ULvWF, en la ausencia y presencia de ALX-0081. En un experimento separado se probó si ALX-0081, el cual se enlaz^ al dominio Al de vWF, interfiere con la actividad de ADAMTS-13. ADAMTS-13 se enlaza a y escinde el dominio A2 de vWF. ' 1 Se obtuvieron células endoteliales a partir de venas ¡de cordón umbilical humano por el método de Maruyama (Z.Zellforsch. Mikrosk. A4nat. 60:69; 1963). Se activaron células endoteliales con 100 µM de histamina (Sigma-Aldrich, St Louis, O) durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de los experimentos de perfusión. La sangre se extrajo de voluntarios saludables quienes excluyeron ingestión de aspirina u otros fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAIDs) para los 10 dias precedentes en una décima de volumen de 3.4% de citrato de sodio. Se preparó el plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre completa por centrifugación (10 minutos a 200 g a temperatura ambiente) . El PRP se acidificó por la adición de una décima de volumen de ACD (2.5% de citrato trisódico, 1.5% de ácido cítrico y 2% de D-glucosa) , y las plaquetas se centrifugaron (500 g, 15 minutos) . El granulo de plaquetas se volvió a suspender en tampón de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N' -2-etansulfónico) -Tyrode (10 mM de HEPES, 137 mM de NaCl, 2.68 mM de! KC1, 0.42 M de NaH2P04, 1.7 mM de MgCl2, 5 mM de D-glucoáa, pH 6.5). Prostaciclina (PGI2, 10 ng/ml) se agregó para evitar activación de plaquetas durante la etapa de lavada subsecuente. Las plaquetas se centrifugaron y volvieron a suspender en un pequeño volumen de tampón de i HEPEs-fTyrode . Esta suspensión de plaquetas se diluyó en tampón de HEPES en pH 7. , o en plasma de TTP. i Se realizaron las perfusiones en una cámara de perfusión de un solo paso como se describe previamente. El experimento se siguió por videomicroscopia de tiempo real. En un segundo tipo de experimento, diferentes mezclas de reacción se prepararon como se resume en la i tabla| 60, sin embargo, sin la adición de la construcción I A1A2A . La construcción A1A2A3 es un fragmento recombinante I que consiste del dominio Al, A2 y A3 de vWF. Las mezclas se pre-incubaron durante 5 minutos a 37 °C después de lo cual el fragmento A1A2A3 se agrega y la mezcla se incuba en un baño de agua durante la noche a 37 °C. Al dia siguiente una reducción de SDS-PAGE se activa en las muestras (12%, y utilizando como marcador the Precisión Plus Protein i Stand rd de BioRad) y se tiñe en Immoboilon-FL (Millipore) .
La tención se bloquea durante 2 horas a temperatura ambiente con tampón de bloque (tampón de bloque 1:1 Odyssey en lxTBS pH 7,4) y se incuba con anti-vWF policlonal de conejf (DAKO). Se utilizó anti-conejo de cabra Alexa Fluor 680 piara detección. El barrido se hizo en ODYSSEY para detectar los productos de degradación.
Esepezfeaento Control : enlace de plaquetas a ULvWF | Se aislaron células endoteliales de cordones ¡ umbilicales humanas recientemente obtenidos por digestión por qolagenasa del interior de la vena umbilical. Las célul Is se cultivaron en cultivo de tejido como una población homogénea. Células endoteliales humanas cultii'radas se cultivan como monocapas de células grandes poligónales, estrechamente opuestas y contienen inclusiones cito P ásmicas (cuerpo de Wiebel-Palade) . Las células endot liales estimuladas con histamina aisladas de cordones umbilicales humanos expresan un factor ultra grande von Willebrand (ULvWF) en su superficie. La perfusión de estas células estimuladas con plaquetas de sangre aisladas, las cuales se suspenden en cualquier tampón o plasma 'a partir de un paciente con TTP adquirido, resulta en la deposición de plaquetas sobre el ULvWF (8). Estas plaquetas adheridas i a ULyWF aparecen como ^cadenas' asi llamadas, las cuales son ¡visibles cuando el experimento de perfusión se monitórea por video microscopía en tiempo real (figura 41).
Inhibición por ALX-0081 para la generación de cadenas de plaquetas Se resuspendieron las plaquetas en tampón o en plasma de TTP y las concentraciones de ALX-0081 utilizadas en eite experimento fueron 0,2 2 y 10 µg/ml. Células i endoteliales estimuladas con histamina aisladas de cordones umbilicales humanos se filtraron con estas suspensiones de plaquetas como se describe anteriormente. La adición de ALX-0081 a plaquetas resuspendidas en tampón o en plasma a partir de un paciente TTP resulta en una inhibición completa de formación de cadenas bajo todas i las condiciones probadas (figura 42). Se realizaron experimentos de perfusión en una tensión de esfuerzo cortante de 2.5 dyn/cm2 durante 4 minutos. Durante esta perfusión de 4 minutos, se examinaron al menos 20 campos microscópicos, y en la presencia del Nanobody™, no se pudieron demostrar cadenas en todas las condiciones probadas (figura 42) . i Escisión de ULvWF por ?DMM S-13 ADAMTS-13 reduce el tamaño de multimeros VWF grandes y ultragrandes a formas más pequeñas al escinder específicamente el enlace de péptido Y842/M843 en el domingo A2 de VWF. Dos tipos de ensayos se utilizaron para evaluar el efecto de ALX-0081 en la escisión de ULvWF por ADAMTS-13: es decir, un ensayo de perfusión y un ensayo observando la escisión de un fragmento vWF recombinante . ! En un primer experimento, se generaron cadenas I por una perfusión de 4 minutos de plaquetas lavadas resusjbendidas en tampón sobre células endoteliales estimuladas con histamina. Subsecuentemente, se lavaron plaquetas no adheridas se lavaron durante una perfusión de 4 minutos de tampón. Después de eso, el tampón se filtró durante otros 4 minutos, seguidos por una perfusión de 5 minutos de plasma normal agrupado que contiene ADAMTS-13. La separación de las cadenas de plaquetas se observó después de la perfusión de plasma normal agrupado (figura 43) . Más del 95% de las cadenas se dividieron después de la perfusión de 4 minutos. i En un siguiente experimento, se generaron cadenas por una perfusión de 4 minutos de plaquetas lavadas resuspendidas en tampón sobre células endoteliales estimuladas con histamina y las plaquetas no adheridas se lavaron por una perfusión de 4 minutos de tampón como en lo anter:.or. Después de eso, ALX-0081 (10 µg/ml en tampón) se filtro durante 4 minutos, seguido por una perfusión de 4 minutos de plasma normal agrupado que contiene ALX-0081 (10 µg/ml = exceso molar de 10 veces sobre vWF) y ADAMTS-13. Se pudo demostrar claramente la separación de las cadenas de plaquetas y 95% de las cadenas se dividieron después de la perfusión de 4 minutos (figura 44). Estos resultados demuestran claramente que ALX- 0081 ño tiene un efecto en la escisión de cadenas de ULvWF por AfAMTS-13. En un segundo ensayo, un fragmento recombinante que dontiene el dominio A1-A2-A3 de vWF se mezcló con plasma normal agrupado (NPP) que contiene ADAMTS-13, resultando en escisión proteolótica del fragmento el cual se obiservó por un análisis Western Blot. La actividad de ADAMTS-13 se probó en la ausencia y presencia de 10 µg/ml de ALX-0081. Como se indica en la figura 45, ALX-0081 no tiene i efecto en la escisión del fragmento de vWF (lineas 6-7-8) . Con el fin de demostrar que la escisión observada es especifica para ADAMTS-13, un experimento control en la presencia de EDTA se realizó como EDTA que inhibe la actividad de ADAMTS-13. Como se espera, la presencia de EDTA en NPP resulta en inhibición de escisión del fragmento I 'figura 45, linea 4) . Este experimento de nuevo demuestra que ALX-0081 no ti ne efecto en la actividad de ADAMTS-13.
Tabl 8: Lista de secuencias de nanocuerpos anti-v F Nombre SEQ Secuencia ID NO 12Á5 60 AVQ VESGGGLVQPGGSLRLSCLASGRIFSIGAMGMYRQAPGKQRELVATITSGGSTN YADPVKGRFTISRDGPKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYANLKQGSYGYRFNDYWGQGT QVTVSS 12B1 61 QVQLVESGGGLVQAGGS RLSCAASGRTFSNYGMGWFRQAPGKEREFVTSISWSGTYT AYSDNVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAAQSRYRSNYYDHDDKYAYW GQGTQVTVSS 12B 62 QVQLVESGGGLVQAGGALRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKERDVVAAISRTGGST YYARSVEGRFTISRDNAKR VYLQMNA KPEDTAVYYCAAAGV AEDGRVRTLPSEYN FWGQGTQVTVSS 12D11 63 AVQLVDSGGG VQAGGSLR SCTASERTTFSSYTLGWFRQAPGKEREFVGGIS SGVS TDYAEFAKGRFTISRDHAANTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAA GRYRSNWRNIGQYDYW GQGTOVTVSS 12H 64 EVQ VESGGGLVQAGGS RLSCAASGRTFNNYGMGWFRQAPGKEREFVTSISWSGSYT AYADNVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDS KPGDTAVYYCAAQSRYSSNYYDHDDKYAYW GQGTQVTVSS 12d9 65 AVQLVESGGGLVQPGGSLK SCATSGSIFSSSAMAWYRQASGKQRELVATITSGGRTS YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCNFVVDGKRAPWGQGTQVTVSS 14H8 66 AVQ VESGGGLVQAGES RLSCTSSGRAFSYYNTGWFRQAPGKEREFVAAIS SGG T YYADSVKGRFTISRDNAKDMVY QMASLKPEDTAVYYCAANRRQKTVQ GERAYDYWG QGTQVTVSS Tabla 9: Rendimientos de expresión de nanocuerpos anti-vWF Tabla 10: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos anti-vWF Tabla 12: Valores de K-activada, K-desactivada y KD estimados para nanocuerpos homólogos 12A5 T bla 13: Valores de K-activada, K-desactivada y KD estimados para nanocuerpos homólogos 12B6 Tabla 14: Valor KD real de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 Tabla 15: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 Tabla 16: Concentración de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 después del calentamiento a temperaturas incrementadas tabla 18: Lista de secuencia de secuencias enlazadoras ombre Secuencia SD NO 3a 83 AAA GS9 84 GGGGSGGGS GS30 85 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS tabla 19: Rendimientos de expresión de nanocuerpos 12B6, 12A2 y 12A5 bivalentes tabla 20: Concentración de nanocuerpos bivalentes 12B6 después del calentamiento a temperaturas incrementadas tabla 21 : Concentración de nanocuepros 12A2 bivalentes después del calentamiento a temperaturas incrementadas tabla 22: Concentración de nanocuerpos bivalentes 12A5 después del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 23: Adhesión de plaquetas en cámara de perfusión de nanocuerpos bivalentes 12A2 Tabla 24: Lista de secuencias de nanocuerpos 12B6 humanizadas Tabla 25: Rendimientos de expresión de nanocuerpos 12B6 humanizados y de tipo silvestre Tabla 26: Concentración de nanocuerpos 12B6 humanizados y de tipo silvestre después del calentamiento a temperaturas incrementadas Rendimientos de expresión de nanocuerpos 12A5 humanizados y de tipo silvestre [Tabla 36: Concentración de nanocuerpos 12A5 humanizados y de tipo silvestre después ¡del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 37: Valores Kd para nanocuerpos 12A5 humanizados y de tipo silvestre Tabla 39: Rendimientos de expresión de nanocuerpos bivalentes humanizados Tabla 40: Concentración de nanocuerpo bivalente humanizado después del calentamiento a temperaturas incrementadas Tabla 41 : Adhesión de plaquetas de nanocuerpos bivalentes humanizados y de tipo silvestre Tab a 42: mandriles utilizados con diferentes compuestos de prueba en el estudio Folts Tab a 43: Longitud de las CFRs (s) para animales control (ND = no hecha) Tab a 44: Longitud de las CFRs (s) para animales tratdos con Aspegic™ (ND= no hecha) Tabla 45: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Heparin™ (ÍMD = no hecha) Tabla 46: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Plavix™ (ND = no hecha) Tabla 47: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con Reopro™ (ND = no hecha) tabla 48: Longitud de CFRs (s) para animales tratados con ALX-0081 (ND = no hecha) abla 49: mandriles utilizados con diferentes compuestos de prueba en el estudio Folts abla 50: Inhibición de CFRs en el modelo Folts para los diferentes fármacos probados. El Eúmero de experimentos en los cuales una inhibición de CFRs se observó en las diferentes ondiciones mencionadas se muestra como una función del número total de repeticiones independientes de esa condición.
Tabla 52: Pérdida de sangre con relación a la segunda gasa control para animales tratados con PlavixtM en función de dosis final (STD = desviación estándar) Tabla 53: Pérdida de sangre con relación a la segunda gasa control para animales tratados con Reoprb™ en función de una dosis final (STD = desviación estándar) Tabla i 5544:: I Pérdida de sangre con relación a la segunda gasa control para animales tratados con ALX-0Ó81 en función de dosis final STD = desviación estándar Tabla 58: Concentración de ALX-0081 [µg/ml) en muestras de sangre obtenidas 10 minutos después de la administración Tabla 59: Longitud de CFRs [segundos] para mandriles tratados con ALX-0081 y con vWF Tabla 60: Volúmenes [µl] para preparar las diferentes mezclas para estudio de escisión de A1A2AÍ3 por ADAMTS13

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. REIVINDICACIONES 1. Un Nanocuerpo contra el Factor de Von illebrand (vWF) , el Nanocuerpo está caracterizado porque consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respe tivamente) y 3 regiones determinantes de complfmentariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente) , en las cualef : i) CDR1 comprende, consiste esencialmente de, o es urja secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de: NYGMG [SEQ ID NO: 15] I SYTLG [SEQ ID NO: 16] NYNMG [SEQ ID NO: 17] SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG [SEQ ID NO: 20] i IGTMG [SEQ ID NO: 21] YNPMG [SEQ ID NO: 22] o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por Ib menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual 1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como se define en la presente) ; y/o l (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente i sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con 1^ o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de i aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : i i (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como1 se define en la presente); y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no i eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y en la cual: ! ii) CDR2 comprende, consiste esencialmente de o es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que i consiste de: SIS SGTYTAYSDNVKG [SEQ ID NO: 23] GIS SGVSTDYAEFAKG [SEQ ID NO: 24] TSIS SGSYTAYADNVKG [SEQ ID NO: 25] SIS SGMSTYYTDSVKG [SEQ ID NO: 26] TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID NO: 27] AIS SGGLTYYADSVKG [SEQ ID NO: 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID NO: 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 30] AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID NO: 31] AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID NO: 32] o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores; ¡ y/o del grupo que consiste de secuencias de ! aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual : (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos , como se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo contiene sustituciones de aminoácidos, y no t eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con lá o las secuencias de aminoácidos anteriores; l y en la cual: iii) CDR3 comprende, consiste esencialmente de o es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que I I consiste de: QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID NO: 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID NO: 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID NO: 36] VVDGKRAP [SEQ ID NO: 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID NO: 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID NO: 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID NO: 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID NO: 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID NO: 42] I AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID NO: 43] I ! i o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, preferentemente por Ib menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores; en la cual I ¡ (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ¡se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo ! contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores; y/o del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solamente 1 "de la o las diferencias en aminoácidos" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos anteriores, en la cual: l (1) cualquier sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservativa de aminoácidos (como ¡se define en la presente) ; y/o (2) la secuencia de aminoácidos preferentemente sólo 'contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con l4 o las secuencias de aminoácidos anteriores. 2. La variante humanizada de un Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 1. i i 3. Un Nanocuerpo contra el Factor de Von i Willebrand (vWF) , el Nanocuerpo está caracterizado porque consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente) , en las cuales: g) CDR1 comprende o consiste esencialmente de: i - la secuencia de aminoácidos YNPMG; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamfnte 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos YNPMG; y h) CDR2 comprende o consiste esencialmente de: - la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o soláronte 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuerjcia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; i) CDR3 comprende o consiste esencialmente de: la secuencia de aminoácidos AGVRAÍDGRVRTLPSEYTF; o - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos j 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o unas secuencias de aminoácidos que tienen solamente 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. I 4. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque CDR1 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG J I 5. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos i AISRTGGSTYYPDSVEG ! 6. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF . 7. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque: - CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o - CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AISRTCfGSTYYPDSVEG; o - CDR2 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF 8 El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque CDRl comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. 9. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque CDRl comprende o i consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos YNPMG; CDR2 comprende o consiste esencialmente de la I secuerjicia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAÍDGRVRTLPSEYTF . 10. El Nanocuerpo de conformidad con cualquiera de la§ reivindicaciones 3-9, caracterizado porque i - cualquier sustitución de aminoácidos es una sustitución conservativa de aminoácidos; y/o - la secuencia de aminoácidos solamente contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las i secuencias de aminoácidos anteriores. 11. Un Nanocuerpo contra el Factor de Von ille rand (vWF) , el Nanocuerpo está caracterizado porque i consiste de 4 regiones de estructura base (FRl a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRl a CDR3 respectivamente) , en las cuale^ : ¡ a) CDRl es: I I - la secuencia de aminoácidos YNPMG; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos YNPMG; b) CDR2 es: - la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo i menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más I preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con 1 secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solamente 1 de la o las diferencias en aminoácidos con la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG; y c) CDR3 es: la secuencia de aminoácidos AGVRAEÍDGRVRTLPSEYTF; o i - una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, incluso más preferentemente por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o - unas secuencias de aminoácidos que tienen solamente 1 diferencia en aminoácidos con la secuencia de i aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. j 12. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque CDRl es la ! secuencia de aminoácidos YNPMG. 13. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque CDR2 ' ee la secuencia de aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG. 14. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque CDR3 es la secuerjcia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. 15. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque: - CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 ejs la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; o - CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos AISRTQGSTYYPDSVEG; o ¡ - CDR2 es la secuencia de aminoácidos t AISRTGGSTYYPDSVEG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF 16. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; y CDR3 comprende o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. 17. El Nanocuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque CDRl es la secuencia de aminoácidos YNPMG; CDR2 es la secuencia de i aminoácidos AISRTGGSTYYPDSVEG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos AGVRAEDGRVRTLPSEYTF. ¡ 18. El Nanocuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16, caracterizado porque - cualquier sustitución de aminoácidos es una sustitución conservativa de aminoácidos; y/o - la secuencia de aminoácidos solamente contiene sustituciones de aminoácidos, y no eliminaciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la o las secuencias de aminoácidos anteriores. 19. El Nanocuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-18, caracterizado porque es un Nanocúerpo clase KERE. 20. La variante humanizada de un Nanocuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-19. 21. Un Nanocuerpo, caracterizado porque tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con por lo menos uno de los Nanocuerpos del grupo 'que consiste de SEQ ID NO' s 60-73 y SEQ ID NO' s 86-97. | ! 22. Un Nanocuerpo, caracterizado porque tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia con por lo menos uno de los Nanocuerpos 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); JL2F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6HI (SEQ ÍD NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID i NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). 23. Un Nanocuerpo, caracterizado porque tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo mejos 99% de identidad de secuencia (como se define en la présente) con por lo menos uno de los Nanocuerpos .12A2 ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: ; 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o caracterizado porque tiene por lo meijios 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con el Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID NO: 90) . 25. La variante humanizada de un Nanocuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-24. 26. Un Nanocuerpo, caracterizado porque se elige del grupo que consiste de los Nanocuerpos de SEQ ID NO's60-73 y $EQ ID NO' s 86-97. ! 27. Un Nanocuerpo, caracterizado porque se elige del grupo que consiste de los Nanocuerpos 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); 12B6H4 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2HÍ1 (SEQ ID NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94) . i 28. Un Nanocuerpo, caracterizado porque se elige i del grupo que consiste de los Nanocuerpos 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ t ID NO: 94) . 29. El Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID NO: 90). i 30. Una proteina o polipéptido, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29. 31. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de por lo menos un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29. i 32. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-31, caracterizado porque comprende por lo menos dos Nanocuerpos de acuerdo i con cualquiera de las reivindicaciones 1-29. 33. La proteina o polipéptido de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 30-31, caracterizado i porqu^ comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29. t 34. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porque el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina o polipéptido son Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-20 35. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado i porqué el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina o pol:.péptido son Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22-29. 36. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porque el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina o polipéptido son Nanocuerpos de acuerdo con la reivinidicación 24. ¡ 37. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porque el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina polipéptido se eligen del grupo que consiste de los i I Nanocúerpos 12B6 (SEQ ID NO: 62); 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12F2 (SEQ ID NO: 72); 14H10 (SEQ ID NO: 73); 12B6H1 (SEQ ID NO: 86); 12B6H2 (SEQ ID NO: 87); 12B6H3 (SEQ ID NO: 88); I 12B6H41 (SEQ ID NO: 89); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ ID NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). 38. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porqué el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina o polipéptido se eligen del grupo que consiste de los Nanoc?erpos 12A2 (SEQ ID NO: 71); 12A2H1 (SEQ ID NO: 90); 12A2H3 (SEQ ID NO: 91); 12A2H4 (SEQ ID NO: 92); 12A2H11 (SEQ "D NO: 93) y/o 12A2H13 (SEQ ID NO: 94). ¡ 39. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porqué el Nanocuerpo o Nanocuerpos presentes en La proteina o polipéptido son el Nanocuerpo 12A2H1 (SEQ ID Ib: 90). 40. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-39, caracterizado porque comprende dos Nanocuerpos o por lo menos dos i Nanocúerpos, y porque los dos o por lo menos dos Nanocúerpos se enlazan directamente entre si o se enlazan entre si mediante un enlazador, 41. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende dos Nanocúerpos o por lo menos dos Nanocuerpos, y porque los dos Nfnocuerpos o por lo menos dos Nanocuerpos se enlazan entre si mediante un enlazador. i 42. La proteina o polipéptido de conformidad con la re vindicación 41, caracterizado porque el enlazador es una s cuencia de aminoácidos. ¡ 43. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el enlazador comprende entre 1 y 40 residuos de aminoácidos, tal como entre ¡2 y 30 residuos de aminoácidos. SEQ ID NO's 80-82 o SEQ ID NOS 98-106. 50. Una proteina o polipéptido, caracterizado porque tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con por lo menos uno de los polipéptidos del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 74-76 y SEQ I¿ NOS: 98, 99, 101, 102, 104, 105 y 106. 1 51. Una proteina o polipéptido, caracterizado i porque tiene por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo I menos ¡ 95%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con los polipéptidos de SEQ 52. El polipéptido de SEQ ID NO: 90. 53. Un fragmento de un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29. 54. Un fragmento de un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-20. | 55. Un fragmento de un Nanocuerpo de acuerdo con i cualquiera de las reivindicaciones 22-29. 56. Un fragmento de un Nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 24. 57. Un fragmento de un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-29. j 58. El fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53-57, caracterizado porque tiene un grado de identidad de secuencia de por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 60%, más preferentemente por lo menos 70%, tal como por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95%, con la secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo completo correspondiente. 59. Una proteina o polipéptido, caracterizado porqué comprende o consiste esencialmente de un fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53-58. 60. La proteina o polipéptido de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque comprende o ! consiste esencialmente de por lo menos una fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53-58. 61. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 ó 60, caracterizado porque; comprende por lo menos dos fragmentos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53-58. 62. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59-61, caracterizado porque: comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las1 reivindicaciones 1-29. 63. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59-62, caracterizado porqué comprende dos fragmentos o por lo menos dos fragmentos, y porque los dos fragmentos o por lo menos dos fragmentos se enlazan directamente entre si o se enlazan entre si mediante un enlazador. 64. Una proteina o polipéptido, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de un Nanocuerpo que no inhibe esencialmente la escisión de ULvWF por ADAMTS-13. 65. La proteina o polipéptido de conformidad con la r ivindicación 59, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de por lo menos un Nanocuerpo que no inhibe esencialmente la escisión de ULvWF por ADAMTS-13. ¡ 66. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 ó 60, caracterizado porque comprende por lo menos dos Nanocuerpos que esencialmente no inhiben la escisión de ULvWF por ADAMTS-13. I 67. La proteina o polipéptido de conformidad con ! cualquiera de las reivindicaciones 59-61, caracterizado porque comprende dos Nanocuerpos que esencialmente no inhiben la escisión de ULvWF por ADAMTS-13. 68. La proteina o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-68, caracterizado i porque comprende dos fragmentos o por lo menos dos fragmentos, y porque los dos fragmentos o por lo menos dos fragmentos se enlazan directamente entre si o se enlazan entre si mediante un enlazador. 69, Una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico, caracterizado porque codifica un Nanocuerpo, prote^na, polipéptido o fragmento de acuerdo con cualquiera de la^ reivindicaciones precedentes. 70. Una célula huésped, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 64, o porque expresa o es capaz de expresar un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-68. ¡ 71. Un método para preparar un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de acuerdo con cualquiera i I de lias reivindicaciones 1-68, caracterizado porque comprende cultivar o mantener una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 65 bajo condiciones tales que la célula huésped produzca o exprese un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-68; y porque opcionalmente además ! comprende aislar el Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-68. i 72. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende por lo menos un Nanocuerpo, proteina, polipéjptido o fragmento de acuerdo con cualquiera de las i reivindicaciones 1-68, y de manera opcional por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable. 73. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 72, o un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-73, caracterizada para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con agreg; ción mediada por plaquetas. 74. La composición farmacéutica de conformidad con a reivindicación 73, o un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de conformidad con cualquiera de las re ivindicaciones 1-68, caracterizada para la prevención o trat amiento de una enfermedad o trastorno relacionado con agrega ción mediada por plaquetas, elegido de trombo no oclus vo, la formación de un trombo oclusivo, formación de tromb arterial, oclusión aguda de arterias coronarias, enferir edad oclusiva arterial periférica, restenosis y traste rnos que surgen de injerto de derivación de arterias coronalrias, reemplazo de válvula arterial coronaria e intervenciones en arterias coronarias como angioplastia, colocación de endoprótesis vascular o aterectomia, hiperplasia después de angioplastia, aterectomia o colocación de endoprótesis vascular arterial, síndrome oclusilvo en un sistema vascular o ausencia de evidencia de arterias enfermas, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) , infarto isquémico cerebral transitorio, angina de pecho inestable o estable, infarto cerebral, síndrome HELLP, endoarterectomia de carótidas, estenosis de arterias carótidas, isquemia limbica critica, cardioembolia, enfermedad vascular periférica, restenosis e infarto del miocardio . 75. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque además contiene una o más de otras sustancias activas para la prevención o tratamiento de trastornos mediados por agregación, tal como asperina (Aspegic) , heparina, Plavix © y/o Rejopro® ¡ 76. Un uso de un Nanocuerpo, proteina, i polipé¡ptido o fragmento de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-68, en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con agregación mediada por plaquetas. 77. El uso de un Nanocuerpo, proteina, polipéptido o fragmento de conformidad con cualquiera de i las reivindicaciones 1-68, en la preparación de un i medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con agregación mediada por plaquetas, elegido de trombo no oclusivo, la formación de un! trombo oclusivo, formación de trombo arterial, oclusión aguda de arterias coronarias, enfermedad oclusiva arterial periférica, restenosis y trastornos que surgen de injerto de derivación- de arterias coronarias, reemplazo de válvula arterial coronaria e intervenciones en arterias coronarias como angioplastia, colocación de endoprótesis vascular o aterectomia, hiperplasia después de angio lastia, aterectomia o colocación de endoprótesis vascular arterial, síndrome oclusivo en un sistema vascular o ausencia de evidencia de arterias enfermas, púrpura I trombqcitopénica trombótica (TTP) , infarto isquémico cerebral transitorio, angina de pecho inestable o estable, infarto cerebral, síndrome HELLP, endoarterectomia de carótijdas, estenosis de arterias carótidas, isquemia i limbida critica, cardioembolia, enfermedad vascular periférica, restenosis e infarto del miocardio. 78. Un uso de vWF, de un fragmento adecuado del mismo,! de DDAVP (desmopressinor) o un fragmento adecuado del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de lo anterior, como un antidoto para complicaciones o efectos colaterales asociados con el uso de un Nanocuerpo, proteina o polipéptido contra vWF, en partiqular de un Nanocuerpo, proteina o polipéptido de acuerc.o con cualquiera de las reivindicaciones 1-68.
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