JP4986997B2 - 凝集媒介障害の治療における改良ナノボディ（商標） - Google Patents

凝集媒介障害の治療における改良ナノボディ（商標） Download PDF

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Description

本発明は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対する改良ナノボディ（商標）および１つ以上の該ナノボディを含む、もしくは本質的に含むポリペプチドに関する。［注意：ナノボディ（商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（商標）はＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の商標である］
本発明は、該ナノボディおよび該ポリペプチドをコードする核酸、該ナノボディおよび該ポリペプチドの調製方法、該ナノボディまたは該ポリペプチドを発現している、または発現可能な宿主細胞、該ナノボディ、該ポリペプチド、該核酸、または該宿主細胞を含む組成物、そして特に下記の予防、治療、診断を目的とした該ナノボディ、該ポリペプチド、該核酸、該宿主細胞、該組成物の使用法にも関する。
本発明の他の態様、実施態様、利点、そして適用は、本明細書の以下での更なる記述から明らかになる。
出願者の国際公開第０４／０６２５５１号は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するナノボディおよびその調製・使用法、特に血小板媒介凝集と関連する疾患および障害の予防および／または治療に関する。
国際公開第０４／０６２５５１号記載の抗ｖＷＦナノボディは、ヒト化させることが可能であり、一価または多価でありうるが、後者ではＴＮＦに対する親和性が増大する。国際公開第０４／０６２５５１号記載の抗ｖＷＦナノボディは多特異的でもありうるが、特にｖＷＦに対する２つ以上のナノボディ、そしてインビボでの半減期を延長させる、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質に対して指向性を有する更なるナノボディを含む多特異的構造物の形であり得る。
国際公開第０４／０６２５５１号記載の抗ｖＷＦナノボディは、ｖＷＦの任意のエピトープまたは立体構造（Ａ１ドメインまたはＡ３ドメイン）に対して指向性を有することができるが、好ましくはＡ１ドメイン、特にＡ１ドメインの活性型の立体構造を標的とする。
国際公開第０４／０６２５５１号には、抗ｖＷＦナノボディ、抗ｖＷＦナノボディをコードするヌクレオチド配列、そして抗ｖＷＦナノボディを含む医薬組成物の調製についても記載されている。
国際公開第０４／０６２５５１号記載の抗ｖＷＦナノボディおよび組成物は、非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠動脈閉塞、末梢動脈閉塞症、冠状動脈バイパス移植に起因する再狭窄および障害、冠動脈弁置換術および血管形成、ステント術、または粥腫切除などの冠状動脈インターベンション、血管形成、粥腫切除、または動脈ステント術後の肥厚化、血管系での閉塞性症候群または罹患動脈における開通性の欠如、血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）、一過性脳虚血発作、不安定／安定狭心症、脳梗塞、ヘルプ症候群、頚動脈内膜切除術、頸動脈狭窄症、危機的四肢虚血、心塞栓症、末梢性の血管疾患、再狭窄、心筋梗塞などの血小板媒介凝集と関連する疾患または障害の予防または治療に使用できる。
国際公開第０４／０６２５５１号記載の医薬組成物は、静脈内、皮下、経口、舌下、局所、経鼻、腟内、直腸内、または吸入投与に適しており、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、一本鎖ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アシルプラスミノーゲンストレプトキナーゼ複合体などの血栓溶解剤を含みうる。国際公開第０４／０６２５５１号記載の抗ｖＷＦナノボディは、（任意に、キットの一部の形で）診断の目的で、またはステントなどの医療用具のコーティングにも使用できる。
ｖＷＦ、特にヒトｖＷＦに対するナノボディを提供することが本発明の主な目的である。
特に、ｖＷＦ、特にヒトｖＷＦに対するナノボディを提供すること、そして治療および／または診断での用途、特に上記のようなｖＷＦに関する、および／またはｖＷＦを介した１つ以上の疾患および障害の予防、治療、および／または診断での用途に適した、および／または上記のようなｖＷＦに関する、および／またはｖＷＦを介した１つ以上の疾患および障害の予防、治療、および／または診断のための医薬組成物の調製に使用できる、該ナノボディを含むタンパク質またはポリペプチドを提供することが本発明の目的である。
特に、国際公開第０４／０６２５５１号記載のｖＷＦに対するナノボディを提供して、国際公開第０４／０６２５５１号記載のｖＷＦに対するナノボディおよびポリペプチドの代替物となる、および／または国際公開第０４／０４１８６２号記載のｖＷＦに対するナノボディおよびポリペプチドと比較して、１つ以上の特性または特徴を改良した該ナノボディを含むタンパク質およびポリペプチドを提供することが、本発明の目的である。
さらに特に、ｖＷＦに対するナノボディを提供すること、そして国際公開第０４／０６２５５１号記載のｖＷＦに対するナノボディおよびポリペプチドと比較して、以下の特性または特徴の１つ以上を改良した前記ナノボディを含むタンパク質およびポリペプチドを提供することが、本発明の目的である：
− 一価型、多価型（例、二価型）および／または多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）のいずれかでのｖＷＦに対する親和性の増大；
− 多価型（例、二価型）設定に対する適合性の改良；
− 多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）設定に対する適合性の改良；
− 「ヒト化」置換（本明細書で規定）に対する適合性または感受性の改良；および／または
− 一価型、多価型（例、二価型）および／または多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）、一価型のいずれかでの免疫原性の低下；
− 一価型、多価型（例、二価型）、および／または多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）、一価型のいずれかにおける安定性の増大；
− 一価型、多価型（例、二価型）、および／または多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）、一価型のいずれかにおけるｖＷＦに対する特異性の増大；
− 異なる種由来のｖＷＦとの交差感受性の低下、または必要に応じて、上昇；
および／または
− 一価型、多価型（例、二価型）、および／または多特異型（例、国際公開第０４／０６２５５１号記載または後述の多特異型の１つ）のいずれかでの医薬用途（予防的使用または治療的使用など）および／または診断的用途（撮像目的での使用、しかしこれに限定されない）に望ましい１つ以上の特性の改良。
これらの目的は、ｖＷＦに対するナノボディおよび本明細書記載のポリペプチドによって達成される。本明細書に記載のｖＷＦに対するナノボディおよびポリペプチドは、特にヒトｖＷＦに対して指向性を有するが、本発明の抗ｖＷＦ ナノボディおよびポリペプチドのいくつかは、他の脊椎動物、特に他の温血動物、特に他の哺乳動物、特に以下の実施例において使用するヒヒなどの他種の霊長類のｖＷＦと交差反応性を示しうることは、本発明の範囲に含まれる。一方で、国際公開第０４／０６２５５１号に記載の抗ｖＷＦ ナノボディと同様に、本発明は、最も広い意味では、本発明のナノボディおよびポリペプチドに対して指向性を有し、ｖＷＦの特定のエピトープ、ドメイン、高次構造に特に限定されない、または規定されない。一方で、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、その活性型ないし非活性型の立体構造を問わず、ｖＷＦのＡ１ドメインに対して指向性を有することが一般に想定されており、好ましい。
したがって、第一の態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなるフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するナノボディと関連しており、ここで
ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、または本質
的にアミノ酸配列からなり：
ＮＹＧＭＧ ［配列番号：１５］
ＳＹＴＬＧ ［配列番号：１６］
ＮＹＮＭＧ ［配列番号：１７］
ＳＳＡＭＡ ［配列番号：１８］
ＹＹＮＴＧ ［配列番号：１９］
ＩＧＡＭＧ ［配列番号：２０］
ＩＧＴＭＧ ［配列番号：２１］
ＹＮＰＭＧ ［配列番号：２２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、または本質的にアミノ酸配列からなり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは本質的にアミノ酸配列からなり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、または本質的にアミノ酸配列からなり：
ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ ［配列番号：２３］
ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ ［配列番号：２４］
ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ ［配列番号：２５］
ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ ［配列番号：２６］
ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２７］
ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２８］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ ［配列番号：２９］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：３０］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ ［配列番号：３１］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ ［配列番号：３２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、または本質的に前記アミノ酸配列からなり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは本質的にアミノ酸配列からなり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、または本質的にアミノ酸配列からなり：
ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３３］
ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ ［配列番号：３４］
ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３５］
ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ ［配列番号：３６］
ＶＶＤＧＫＲＡＰ ［配列番号：３７］
ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ ［配列番号：３８］
ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：３９］
ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：４０］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ ［配列番号：４１］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４２］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４３］
あるいは、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは本質的に前記アミノ酸配列からなり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは本質的に前記アミノ酸配列からなり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
別の態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなる、ｖＷＦに対するナノボディと関連しており、ここで
ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＮＹＧＭＧ ［配列番号：１５］
ＳＹＴＬＧ ［配列番号：１６］
ＮＹＮＭＧ ［配列番号：１７］
ＳＳＡＭＡ ［配列番号：１８］
ＹＹＮＴＧ ［配列番号：１９］
ＩＧＡＭＧ ［配列番号：２０］
ＩＧＴＭＧ ［配列番号：２１］
ＹＮＰＭＧ ［配列番号：２２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ ［配列番号：２３］
ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ ［配列番号：２４］
ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ ［配列番号：２５］
ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ ［配列番号：２６］
ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２７］
ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２８］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ ［配列番号：２９］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：３０］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ ［配列番号：３１］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ ［配列番号：３２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３３］
ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ ［配列番号：３４］
ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３５］
ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ ［配列番号：３６］
ＶＶＤＧＫＲＡＰ ［配列番号：３７］
ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ ［配列番号：３８］
ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：３９］
ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：４０］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ ［配列番号：４１］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４２］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４３］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）で
あり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
上記の、そして以下で更に記述するｖＷＦに対するナノボディは、本明細書において本発明のナノボディとも呼ばれる。
本発明のナノボディの中で、上に明記した１つ以上のＣＤＲを含むナノボディが特に好ましく、上に明記した２つ以上のＣＤＲを含むナノボディが更に特に好ましく、上に明記した３つ以上のＣＤＲを含むナノボディが最も好ましい。
別の態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなるｖＷＦに対するナノボディと関連しており、これは以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の組み合わせの１つを伴うナノボディからなるグループから選択される：
［配列表］
Figure 0004986997
上記のＣＤＲの組み合わせを含む本発明のナノボディにおいて、各ＣＤＲは、記載のＣＤＲと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有している、アミノ酸配列からなるグループ選択されるＣＤＲにより置換でき；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくは、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸配列の１つの、記載したＣＤＲと３つ、２つまたは１つのみ(前項に示す)「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有している、アミノ酸配列からなるグループ選択されるＣＤＲにより置換でき；ここで、
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくは、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
一方で、上記のＣＤＲの組み合わせを含む本発明のナノボディの中で、上記の１つ以上のＣＤＲを含むナノボディが特に好ましく；上記の２つ以上のＣＤＲを含むナノボディが更に特に好ましく；上記の３つのＣＤＲを含むナノボディが特に最も好ましい。
表２：ＣＤＲ、ＣＤＲおよび枠組配列、そしてＣＤＲおよびヒト化ＦＲの好ましい組み合わせ。
Figure 0004986997
Figure 0004986997
Figure 0004986997
このように、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも１つが表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなるグループ；または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列のグループ；および／または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つと３つ、２つ、または１つだけアミノ酸が異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなるグループからそれぞれ適切に選択される。この文脈において、「適切に選択される」とは、該当する場合、それぞれ、ＣＤＲ１配列が適切なＣＤＲ１配列（本明細書で規定）から選択され、ＣＤＲ２配列が適切なＣＤＲ２配列（本明細書で規定）から選択され、ＣＤＲ３配列が適切なＣＤＲ３配列（本明細書で規定）から選択さる。
特に、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列が表２に記載のＣＤＲ３からなるグループ、または表２に記載のＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ３配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ３の少なくとも１つと３つ、２つ、または１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ３配列からなるグループから適切に選択される。
好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも２つが表２記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなるグループ、または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列が表２に記載のＣＤＲ３からなるグループ、または表２に記載のＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ３配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ３の少なくとも１つと３つ、２つ、または１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ３配列からなるグループからそれぞれ適切に選択され、少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列の少なくとも１つが、表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列からなるグループ、または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
最も好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の３つ全てが表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列からなるグループ、または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
更により好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも１つが表２記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。好ましくは、本実施態様において、存在する他の２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、またはいずれも表２に記載の対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列、および／または表２に記載の対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくとも存在するＣＤＲ３配列は表２に記載のＣＤＲ３からなるグループから適切に選択される。好ましくは、本実施態様において、存在する他のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列の少なくとも１つ、好ましくはいずれも表２に記載の対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列のグループ、および／または表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
更により好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の少なくとも２つが表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。好ましくは、本実施態様において、存在する残りのＣＤＲ配列が表２に記載の対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列のグループ、および／または表２記載の対応する配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくともＣＤＲ３配列が表２に記載のＣＤＲ３配列からなるグループから適切に選択され、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列のいずれかが表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。好ましくは、本実施態様において、存在する残りのＣＤＲ配列が表２に記載の対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列のグループ、および／または表２記載の対応する配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ配列からなるグループから適切に選択される。
更により好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の３つ全てが、表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列からなるグループからそれぞれ適切に選択される。
また、一般に、表２に記載のＣＤＲの組み合わせ（表２の同じ行に記載の組み合わせ）が好ましい。このように、本発明のナノボディのＣＤＲは、表２に記載のＣＤＲ配列であるか、または表２に記載のＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列のグループ、；および／または表２に記載の対応する配列の少なくとも１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸が異なるＣＤＲ配列のグループから選択される場合、他のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくはいずれも表２で同じ組み合わせ（表２の同じ行に記載）に属するＣＤＲ配列から適切に選択される、または同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列のグループ、および／または同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列と３つ、２つ、または１つだけアミノ酸が異なるＣＤＲ配列からなるグループから適切に選択されることが一般に好ましい。
上項に示される他の優先事項は、表２に記載のＣＤＲの組み合わせにも当てはまる。このように、非限定的な例としては、本発明のナノボディが、例えば、表２に記載のＣＤＲ１配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表２に記載の（しかし、異なる組み合わせに属する）ＣＤＲ２配列の１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ２配列、そしてＣＤＲ３配列を含むことができる。
本発明の、好ましいいくつかのナノボディとしては、例えば、（１）表２に記載のＣＤＲ１配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ１配列；表２に記載の（しかし、異なる組み合わせに属する）ＣＤＲ２配列の１つと３つ、２つまたは１つのアミノ酸の異なるＣＤＲ２配列；および表２に記載の（しかし、異なる組み合わせに属する）ＣＤＲ３配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ３配列；または（２）表２に記載のＣＤＲ１配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ１配列；ＣＤＲ２配列、そして表２に記載のＣＤＲ３配列；または（３）ＣＤＲ１配列、表２に記載のＣＤＲ２配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ２配列；ＣＤＲ２配列と同じ組み合わせに属する、表２に記載のＣＤＲ３配列の１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ３配列：を含む可能性がある。
本発明の、特に好ましいいくつかナノボディとしては、例えば、（１）表２に記載のＣＤＲ１配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ２配列と３つ、２つまたは１つのアミノ酸が異なるＣＤＲ２配列；および同じ組み合わせに属する、表２に記載のＣＤＲ３配列と８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ３配列；（２）ＣＤＲ１配列；表２に記載のＣＤＲ２、および表２に記載（ここでは、ＣＤＲ２配列とＣＤＲ３配列が異なる組み合わせに属する可能性がある）のＣＤＲ３配列：を含む可能性がある。
本発明の更に好ましいいくつかのナノボディとしては、例えば、（１）表２に記載のＣＤＲ１配列の１つと８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ２配列；および異なる組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ３配列；または（２）表２に記載のＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ２配列と３つ、２つまたは１つのアミノ酸が異なり、異なる組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ３配列；および８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ２配列：を含む可能性がある。
本発明の特に好ましいナノボディとしては、例えば、表２に記載のＣＤＲ１配列、同じ組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ２配列と８０％以上の配列同一性を有するＣＤＲ２配列、同じ組み合わせに属する表２に記載のＣＤＲ３配列を含む可能性がある。
本発明の最も好ましいナノボディでは、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列が、表２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列の組み合わせの１つからそれぞれ適切に選択される。
好ましくは、ＣＤＲ配列が、表２に記載のＣＤＲ配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するＣＤＲ配列のグループから適切に選択される場合；および／または表２に記載のＣＤＲ配列の１つと３つ、２つまたは１つだけアミノ酸の異なるＣＤＲ配列からなるグループから適切に選択される場合：
ｉ）任意のアミノ酸置換は、好ましくは、保存アミノ酸置換（本明細書で規定）であり；および／または
ｉｉ）アミノ酸配列は、表２に記載のＣＤＲ配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
本発明の非限定的であるが好ましい実施態様によると、本発明のナノボディのＣＤＲ配列は上で規定するとおりであり、また本発明のナノボディが、１０−５〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒ（Ｍ）以下、好ましくは１０−７〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒ（Ｍ）以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒ（Ｍ）の解離定数（ＫＤ）、および／または少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１（少なくとも１０１２Ｍ−１）の結合定数（ＫＡ）、そして特に５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満）のＫＤでｖＷＦに結合するようにする。ｖＷＦに対する本発明のナノボディのＫＤ、ＫＡ値は、例えば、本明細書に記載の分析法を利用して、それ自体公知の方法で測定可能である。より一般には、本明細書に記載のナノボディは、好ましくは、本項に記載のとおり、ｖＷＦに関する解離定数を有する。
別の態様では、本発明は、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７からなるグループ、または配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７の１つ以上のアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上（９９％以上）の「配列同一性」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を伴うナノボディに関しており、該アミノ酸配列は、最も好ましくはナノボディの枠組配列に関する概要で更に規定する枠組配列を有する。
具体的であるが非限定的な実施態様に従って、以下で更に記載するとおり、アミノ酸配列は「ヒト化」されている。
最も好ましくは、本発明のナノボディは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７からなるグループから選択され、このうち配列番号：８６〜９７の「ヒト化」ナノボディが特に好ましい。
本発明による特に好ましいナノボディは、１２Ｂ６（配列番号：６２）のナノボディおよびその相同体および変異体、特にそのヒト化変異体である。特に好ましいが非限定的ないくつかの相同体および（ヒト化）変異体は、例えば、１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ｆ２（配列番号：７２）、１４Ｈ１０（配列番号：７３）、そして１２Ｂ６Ｈ１（配列番号：８６）、１２Ｂ６Ｈ２（配列番号：８７）、１２Ｂ６Ｈ３（配列番号：８８）、１２Ｂ６Ｈ４（配列番号：８９）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）、１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディなどのヒト化変異体である。
本発明において特に好ましいのは、１２Ａ２（配列番号：７１）のナノボディ、そしてその相同体および変異体、特にそのヒト化変異体である。特に好ましいが非限定的ないくつかの相同体および（ヒト化）変異体は、例えば、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）、１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディであり、このうち１２Ａ２Ｈ１（配列番号９０）のナノボディが特に好ましい。
このように、本発明の好ましいが非限定的な一態様は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するナノボディに関しており、該ナノボディは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなり：
ａ）ＣＤＲ１が以下を含む、あるいは以下から本質的になり：
− アミノ酸配列ＹＮＰＭＧ；あるいは
− アミノ酸配列ＹＮＰＭＧと２つまたは１つのみアミノ酸が異なるアミノ酸配
列；
および
ｂ）ＣＤＲ２が以下を含む、あるいは以下から本質的になり：
− アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；あるいは
− アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
− アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧと２つまたは１つだけアミノ酸が異なるアミノ酸配列；
および
ｃ）ＣＤＲ３が以下を含む、あるいは以下から本質的になる：
− アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ；あるいは
− アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
− アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦと１つだけアミノ酸が異なるアミノ酸配列。
特に、本発明は、該ナノボディに関すものであり：
− ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧを含む、または本質的にＹＮＰＭＧからなり；
または：
− ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧを含む、または本質的にＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧからなり；
または
− ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦを含む、または本質的にＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦからなる。
例えば、本発明は、該ナノボディに関すものであり：
− ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧを含む、または本質的にＹＮＰＭＧからなり；およびＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦを含む、または本質的にＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦからなり；
または：
− ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧを含む、または本質的にＹＮＰＭＧからなり；
およびＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧを含む、または
本質的にＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧからなり；
または：
− ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧを含む、または本質的にＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧからなり；およびＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦを含む、または本質的にＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦからなる。
一態様では、本発明は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧを含む、または本質的にＹＮＰＭＧからなり；およびＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦを含む、または本質的にＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦからなる前記ナノボディに関する。
本発明は前記ナノボディのヒト化変異体にも関する。好ましいが非限定的ないくつかのヒト化置換は本明細書に記載しており、または本明細書に開示の対応する非ヒト化／ヒト化ナノボディを比較することで当業者には明らかであろう。いくつかの特に有用なヒト化置換は、１２Ａ２のヒト化変異体に存在する１つ以上の置換であり、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）の配列と、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）、１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）の対応するヒト化配列との比較から当業者には明らかであろう。
本発明の非限定的であるが好ましい別の一態様は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するナノボディに関しており、該ナノボディは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなり：
ｄ）ＣＤＲ１が：
− 前記アミノ酸配列ＹＮＰＭＧ；または
− 前記アミノ酸配列ＹＮＰＭＧと２つまたは１つのみアミノ酸が異なるアミノ酸
配列であり；
および
ｅ）ＣＤＲ２が：
− 前記アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；または
− 前記アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
− 前記アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧと２つまたは１つだけアミノ酸が異なるアミノ酸配列であり；
および
ｆ）ＣＤＲ３が：
− 前記アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ；または
− 前記アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
− 前記アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦと１つだけアミノ酸が異なるアミノ酸配列である。
特に、本発明は、
ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧであり、
またはＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧであり、
またはＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦである、前記ナノボディと関連する。
例えば、本発明は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧであり、ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦである、
またはＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧであり、ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴ ＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧである、
またはＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧであり、ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦである、
前記ナノボディと関連する。
一態様では、本発明は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧであり、ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦである、前記ナノボディと関連する。
本発明は、前記ナノボディのヒト化変異体とも関連する。好ましいが非限定的ないくつかの好ましいヒト化置換が本明細書に記載してあり、または本明細書に開示の対応する非ヒト化／ヒト化ナノボディを比較することで当業者には明らかであろう。いくつかの特に有用なヒト化置換は、１２Ａ２のヒト化変異体に存在する１つ以上の置換であり、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）の配列と、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）、１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）の対応するヒト化配列との比較から当業者には明らかであろう。
本明細書に記載のナノボディは、ＧＬＥＷクラスナノボディ、「１０３ Ｐ、Ｒ、またはＳ」クラスナノボディ、またはＫＥＲＥクラスナノボディ（全て本明細書に記載）でありうる。特に、本明細書に記載のナノボディはＫＥＲＥクラスナノボディでありうるが、本発明はこれに限定されない。
別の態様では、本発明は、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７からなるグループのナノボディの少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するナノボディに関する。
特に、本発明は、１２Ｂ６（配列番号：６２）、１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ｆ２（配列番号：７２）、１４Ｈ１０（配列番号：７３）、１２Ｂ６Ｈ１（配列番号：８６）、１２Ｂ６Ｈ２（配列番号：８７）、１２Ｂ６Ｈ３（配列番号：８８）、１２Ｂ６Ｈ４（配列番号：８９）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディの少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するナノボディに関する。
特に、本発明は、１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディの少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するナノボディに関する。
更に特に、本発明は、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）のナノボディと少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するナノボディに関する。
本発明は、前記ナノボディのヒト化変異体とも関連する。非限定的な、いくつかの好ましいヒト化置換が本明細書に記載しており、または本明細書に開示の対応する非ヒト化／ヒト化ナノボディを比較することで当業者には明らかであろう。特に有用ないくつかのヒト化置換は、１２Ａ２のヒト化変異体に存在する１つ以上の置換であり、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）の配列と、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）、１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）の対応するヒト化配列との比較から当業者には明らかであろう。
本発明は、配列番号：６０−７３および配列番号：８６−９７のナノボディからなるグループから選択されるナノボディにも関する。
特に、本発明は、１２Ｂ６（配列番号：６２）、２１１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ｆ２（配列番号：７２）、１４Ｈ１０（配列番号：７３）、１２Ｂ６Ｈ１（配列番号：８６）、１２Ｂ６Ｈ２（配列番号：８７）、１２Ｂ６Ｈ３（配列番号：８８）、１２Ｂ６Ｈ４（配列番号：８９）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディからなるグループから選択されるナノボディに関する。
更に特に、本発明は、１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）のナノボディからなるグループから選択されるナノボディに関する。特に有用なナノボディは１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）のナノボディである。
本明細書記載のナノボディは、好ましくは、本明細書で詳述される枠組配列を有する。いくつかの特に好ましい枠組配列（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）は、ナノボディ １２Ａ２およびそのヒト化変異体の配列であり、前記枠組配列の１つと、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する枠組配列、および／または、前記枠組配列の１つと３つ、２つまたは１つだけ「アミノ酸の差違」を有するアミノ酸配列のグループからの枠組配列である（ここで、任意のアミノ酸置換は好ましくは保存アミノ酸の置換であり、および／または前記アミノ酸配列は好ましくは３つまでのアミノ酸の欠失または３つまでのアミノ酸の挿入を有する）。このような枠組配列を伴うｖＷＦに対するナノボディは、本発明の別の態様を形成する。
特に、本発明は、ｖＷＦに対するナノボディと関連しており、ここでＦＲ１は配列番号：１４０、ＦＲ２は配列番号：１９２、ＦＲ３は配列番号：２４４、ＦＲ４は配列番号：２９６であり、前記枠組配列の１つと、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する枠組配列、および／または、前記枠組配列の１つと３つ、２つまたは１つだけ「アミノ酸の差違」を有するアミノ酸配列のグループからの枠組配列である（ここで、任意のアミノ酸置換は好ましくは保存アミノ酸の置換であり、および／または前記アミノ酸配列は好ましくは３つまでのアミノ酸の欠失または３つまでのアミノ酸の挿入を有する）。
更に特に、本発明は、ＦＲ１が配列番号：１４０、ＦＲ２が配列番号：１９２、ＦＲ３が配列番号：２４４、ＦＲ４が配列番号：２９６である、ｖＷＦに対するナノボディに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に規定する、ｖＷＦに対する少なくとも１つのナノボディを含む、または本質的に前記ナノボディからなるポリペプチドに関する。前記ポリペプチドは本明細書において「本発明のポリペプチド」とも呼ばれ、以下で更に記述されるとおりであり、および／または本明細書に開示のナノボディに関する国際公開第０２／０６２５５１号において概説されており、例えば、やはり以下で更に記述されている多価ポリペプチドまたは多特異的ポリペプチドでありうる。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、１つまたは２つ、好ましくは２つの本発明のナノボディ、および血清タンパク質、および特にヒト血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質に対して指向性を有する少なくとも１つのナノボディを含む、二価または三価（つまり、本明細書に規定する１つまたは２つのリンカーを介してそれぞれ任意に連結する本発明の２つまたは３つのナノボディを含む）または多特異的ポリペプチドでありうる。
好ましいが非限定的な一実施態様では、本発明のポリペプチド中に存在する本発明のナノボディは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７からなるグループ、特に配列番号：８６〜９７の「ヒト化」ナノボディから選択される。本発明のポリペプチドに存在する、ヒト血清アルブミンに対するナノボディは、好ましくは本明細書に規定するとおりであり、より好ましくは配列番号：１０７〜１２１からなるグループ、特に配列番号：１１４〜１２１のヒト血清アルブミンに対する「ヒト化」ナノボディから選択される。
本発明のポリペプチドの好ましいが非限定的ないくつかの例は、配列番号：７４〜８２のポリペプチドおよび配列番号：９８〜１０６のポリペプチドである。本発明の他のポリペプチドは、例えば、配列番号：７４〜８２および／または配列番号：９８〜１０６の１つ以上のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（９９％以上）の「配列同一性」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され、ここで前記アミノ酸配列に含まれるナノボディは好ましくは本明細書に規定するとおりである。
本発明の一態様では、本明細書に記載のナノボディ、タンパク質、ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ−１３によるＵＬｖＷＦの切断に本質的に影響を与えない。特に、本明細書に記載のナノボディ、タンパク質、ポリペプチドは、本明細書に記載の用量で使用する場合、ＡＤＡＭＴＳ−１３によるＵＬｖＷＦの切断（投与時にインビボで、および／または本明細書に記載の分析法などの適切な分析法を利用して測定される）は実質的に低下ないし阻害されない（５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下（５％以下または実質的に０％））。このように、本発明の更なる一態様は、ナノボディ、タンパク質、またはポリペプチド、特にＡＤＡＭＴＳ−１３によるＵＬｖＷＦの切断を実質的に低下ないし阻害しない、本明細書に記載のナノボディ、タンパク質、またはポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、本発明のナノボディおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。前記核酸は、以下で「本発明の核酸」とも呼ばれ、例えば本明細書に規定する遺伝子構造物の形でありうる。
別の態様では、本発明は、本発明のナノボディおよび／または本発明のポリペプチドを発現する、または発現できる、および／または本発明のナノボディおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞に関する。該宿主または宿主細胞は、国際公開第０２／０６２５５１号記載の宿主および宿主細胞とも類似しうるが、本発明のナノボディおよび／または本発明のポリペプチドを発現するか、または発現できる、および／または本明細書に記載の核酸を含む。
本発明は更に、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／または本発明の核酸を含む生成物または組成物に関する。前記生成物または組成物は、例えば、医薬組成物（後述）、または診断用の生成物または組成物（後述）でありうる。前記生成物または組成物は、国際公開第０２／０６２５５１号記載の生成物および組成物とも類似しうるが、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／または本発明の核酸を含む。
本発明は更に、本明細書に記載のナノボディ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、組成物の調製・生成法に関するもので、該方法は以下で更に記述しているとおりである。また、一般に、本明細書に記載のナノボディ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、組成物は、国際公開第０２／０６２５５１号記載の方法と類似の方法でも調製・使用できる。
本発明は更に、本明細書に記載の上記のナノボディ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、組成物の適用および使用に関するもので、該適用および使用には、後述の適用および使用、および／またはｖＷＦに対するナノボディ、および／または国際公開第０２／０６２５５１号の該ナノボディを含むポリペプチドの更なる使用および適用が含まれるが、これに限定されない。
本発明の他の態様、実施態様、利点、応用が、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
本発明の詳細な説明
本発明の上記および他の態様、そして実施態様は、以下の更なる記述から明らかになり、ａ）特に断らない限り、または規定しない限り、使用する全ての用語は該技術分野において通常の意味を有しており、当業者には明らかであろう。例えば、Sambrookら、"Molecular Cloning：A Laboratory Manual" (2nd．Eｄ．），Vols．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）；F．Ausubelら, ds．，Current protocols in molecular biology，Green Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)；Roittら、"Immunology"（6th．Eｄ．）， Mosby / Elsevier，Edinburgh（2001）；and Janewayら、"Immunobiology"（6th Ed．）Garland Science Publishing / Churchill Livingstone， Ne w York（2005）などの標準的便覧、そして上記の一般的な背景技術を参照されたい；
ｂ）特に断らない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、重鎖抗体または従来の４鎖抗体のいずれを示すために使用するかを問わず、全長の抗体、その個々の鎖、そして全ての部分、ドメイン、断片のいずれも含む一般用語として使用する（ＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたは断片が含まれるが、これらに限定されない）。また、本明細書で使用する「配列」（例、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変領域の配列」、「ＶＨＨ配列」、「タンパク質配列」などの）という用語は、文脈から限定した解釈が要求されない場合、関連するアミノ酸配列、そして該アミノ酸配列をコードする核酸配列またはヌクレオチド配列を含むと一般に理解されたい。
ｃ）特に断らない限り、具体的に詳述される全ての方法、段階、技術、操作は、当業者には明らかであるように、それ自体公知の方法で実施可能であり、また実施されている。例えば、標準的便覧、前記一般的な背景技術、そして本明細書中のさらなる引用文献を参照されたい。
ｄ）アミノ酸残基は、表３記載の標準的な３文字または１文字のアミノ酸コードで示される。
表３：１文字および３文字のアミノ酸コード
Figure 0004986997
なお、上記表は以下の通りである。
（１）極性非荷電アミノ酸とも見なされる場合がある。
（２）非極性非荷電アミノ酸とも見なされる場合がある。
（３）当業者には明らかであるように、この表においてアミノ酸残基がｐＨ６．０〜７．０で荷電、非荷電と呼ばれることは、アミノ酸残基がｐＨ６．０未満および／または７．０以上で有する荷電を決して反映しておらず、表に記載のアミノ酸残基はこのような高いまたは低いｐＨで荷電している、および／または非荷電のいずれかでありうることは、当業者には明らかであろう。
（４）当該技術分野において周知のとおり、Ｈｉｓ残基の荷電はｐＨの小さな変化にさえ大きく左右されるが、Ｈｉｓ残基は一般に約ｐＨ６．５で基本的に非荷電であると見なされうる。
ｅ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的で、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列との「配列の同一性」の割合が、［第一のヌクレオチド配列のヌクレオチド総数］で［第二のヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同じ第一のヌクレオチド内のヌクレオチド数］を割り、［１００％］を乗じることで算出可能であり、ここで第一のヌクレオチド配列と比較した第二のヌクレオチド配列における各欠失、挿入、置換または付加が単一ヌクレオチド（位置）での差違と見なされる。
または、２つ以上のヌクレオチド配列間での配列同一性の程度は、標準的な設定を利用して、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０といった配列アラインメントに関する周知のコンピュータアルゴリズムを利用して算出されうる。
他のいくつかの技術である、コンピュータアルゴリズム、そして配列同一性の程度を測定するための設定が、例えば、国際公開第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号、欧州特許第１０８５０８９号、国際公開第００／５５３１８号、国際公開第００／７８９７２号、国際公開第９８／４９１８５号、英国特許２３５７７６８（Ａ）号に記載されている。
通常、上記で概説されている計算方法に従って２つのヌクレオチド配列間での「配列の同一性」の割合を測定する目的で、ヌクレオチドが最も多いヌクレオチド配列が「第一」ヌクレオチド配列と見なされ、他のヌクレオチド配列が「第二」ヌクレオチド配列と見なされる。
ｆ）２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的で、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列との「配列の同一性」の割合が、［第一のアミノ酸配列のアミノ酸総数］で［第二のアミノ酸配列内の対応する位置のアミノ酸と同じ第一のアミノ酸配列内のアミノ酸数］を割り、［１００％］を乗じることで算出可能であり、ここで第一のアミノ酸配列と比較した第二のアミノ酸配列における各欠失、挿入、置換または付加が単一アミノ酸（位置）での差違（つまり、本明細書で規定する「アミノ酸の差違」）と見なされる。
または、２つのアミノ酸配列間での配列同一性の程度は、やはり標準的な設定を利用した、ヌクレオチド配列の同一性の程度を測定するための上記の方法といった周知のコンピュータアルゴリズムを利用して算出できる。
通常、上記の計算方法に従って２つのアミノ酸配列間での「配列の同一性」の割合を測定する目的で、アミノ酸残基が最も多いアミノ酸配列が「第一」アミノ酸配列と見なされ、他のアミノ酸配列が「第二」アミノ酸配列と見なされる。
また、２つ以上のアミノ酸配列間での配列同一性の程度を測定する際、当業者であれば、所謂「保存」アミノ酸置換を考慮に入れることができ、その保存アミノ酸置換は通常、任意のアミノ酸残基が類似の化学構造を有する別のアミノ酸残基で置換され、ポリペプチドの機能、活性、他の生物学的特性にほとんど、または実質的に影響を及ぼさないようなアミノ酸置換と言うことができる。このような保存アミノ酸置換は、例えば、国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許２３５７７６８（Ａ）号、国際公開第９８／４９１８５号、国際公開第００／４６３８３号、国際公開第０１／０９３００号から、該技術分野において周知であり、そして（好ましい）種類および／またはこのような置換の組み合わせは、国際公開第９８／４９１８５号およびさらなる引用文献の他、国際公開第０４／０３７９９９号からの関連する記述に基づいて選択できる。
このような保存置換基は、好ましくは以下のグループ（ａ）〜（ｅ）の別のアミノ酸残基によって置換される：（ａ）小さな脂肪族、非極性または弱極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、（ｂ）極性、負荷電残基およびそれらの（非電荷）アミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、（ｃ）極性、陽性荷電残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、（ｄ）大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、そして（ｅ）芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
特に好ましい保存置換は以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒ、Ａｒｇから Ｌｙｓ、ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏ、ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ、ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ、ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ、ＬｙｓからＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ、ＭｅｔからＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ、ＰｈｅからＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ、ＴｙｒからＴｒｐ、および／またはＰｈｅからＶａｌまたはＩｌｅまたはＬｅｕ。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、Schulz et al．， Principles of Protein Structure,Springeｒ-Verlag，1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度の分析、Chou and Fasman，Biochemistry 13: 211,1974 and Adv．Enzymol．，47：45-149，1978によって開発された構造形成能の分析、そしてEisenberg et al．，．Acad Sci．USA 81:140-144，1984; Kyte＆Doolittle；JMolec．Biol．157：105-132, 1981,and Goldman et al．，Ann Rev Biophys.Chem.15:321-353,1986によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析法にも基づいており、そのすべては参照により本明細書に援用される。以下の記述および上記の一般的な背景技術で与えられるナノボディの一次、二次、三次構造に関する情報。また、この目的で、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が例えばDesmyter et al．，Nature Structural Biology, Vol. 3，9，803（1996）,Spinelli et al．，Natural Structural Biology（1996）; 3, 752-757, Decanniere et al．，Structure, Vol. 7, 4,361（1999）に与えられている。
ｇ）アミノ酸配列と核酸配列はそれらが全長にわたり１００％の配列同一性（本明細書で規定）を有する場合、「厳密に同じ」であると言われる。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の差違」という用語は、第二の配列と比較して、第一の配列の任意の位置での１つのアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を言い、２つのアミノ酸配列が１つ、２つ以上のこのようなアミノ酸の違いを含むことができると理解されたい。
ｉ）核酸配列またはアミノ酸配列は、−例えば入手した天然の生物原料および／または反応媒質または培養媒体と比較した場合、−別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または巨大分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物、微小成分といった原料または培地において通常関連する少なくとも１つの他の成分から分離されている場合、「本質的な分離（型）」と見なされる。特に、少なくとも２倍、特に少なくとも１００倍、そして最高１０００倍以上に精製されていた場合、核酸配列またはアミノ酸配列は「本質的に分離されている」と見なされる。「本質的な分離型」の核酸配列またはアミノ酸配列は、適切なクロマトグラフィー技術、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法といった適切な方法を利用して測定される場合、好ましくは均質である。
ｊ）本明細書で使用する「ドメイン」という用語は、一般に抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、または該球状領域から本質的になるポリペプチドを示す。通常、該ドメインは、例えばシートまたはジスルフィド結合として、安定化したペプチドループ（例、３つまたは４つのペプチドループ）を含む。
ｋ）「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）および特に該分子の坑原結合部位によって認識される坑原上にエピトープを示す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は本明細書で互換性をもって使用できる場合もある。
ｌ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原、またはタンパク質に結合可能であり、これらに対して親和性および／または特異性を有するアミノ酸配列（本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、または一般に抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたはその断片）は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原、またはタンパク質（あるいは、その少なくとも一部、断片、エピトープ）に「対する」または「対して指向性を有する」と言われる。
ｍ）「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）分子が結合可能な多種多様な抗原または抗原決定基を示す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／または親和力に基づいて決めることができる。抗原結合タンパク質と抗原との解離平衡定数（ＫＤ）で表される親和性は、抗原結合タンパク質上での抗原決定基と抗原結合部位との結合活性の測定値であり、ＫＤ値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との結合力は強まる（または、親和性は１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）でも表すことが可能である）。当業者であれば明らかであるように（例えば本明細書でのさらなる開示に基づいて）、親和性は、目的の特定抗原に応じて、それ自体公知の方法で測定可能である。親和力は抗原結合分子（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）と関連抗原との結合活性の測定値である。親和力は、抗原結合分子上での抗原決定基とその抗原結合部位との親和性、および抗原結合分子上に存在する関係のある結合部位の数のいずれとも関連している。通常、抗原結合タンパク質（本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドなど）は、１０−５〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒ（Ｍ）以下、好ましくは１０−７〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒ（Ｍ）以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２ｍｏｌｅｓ／ｌｉｔｅｒの解離定数（ＫＤ）、および／または少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１（例、少なくとも１０１２Ｍ−１）の結合定数（ＫＡ）で結合する。１０−４Ｍ以上のＫＤ値は非特異的結合を示すと一般に考えられる。好ましくは、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（例、５００ｐＭ未満）のＫＤで目的の抗原と結合しうる。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャチャード解析および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）とサンドウィッチ競合分析などの競合結合アッセイなどそれ該技術分野において自体公知の適切な任意の方法で測定可能である。
ｎ）以下でさらに記載されているとおり、ナノボディのアミノ酸配列および構造は、限定されないが、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」を含むと考えることができ、これらは該技術分野および以下で「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」とそれぞれ呼ばれ、フレームワーク領域には３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」が割り込んでおり、これらは該技術分野において「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれる。
ｏ）以下でもさらに記載するとおり、ナノボディのアミノ酸残基の総数は１１０〜１２０個、好ましくは１１２〜１１５個の範囲内、最も好ましくは１１３個でありうる。一方、ナノボディの部位、断片、または類似体（以下でさらに記載）は、該部位、断片、類似体が下記のさらなる要件を満たし、好ましくは本明細書に記載の目的にも適している限り、その長さおよび／または大きさに特に限度はなく、好ましくは本明細書に記載の目的にも適合しており、
ｐ）前記Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＆ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの文献におけるラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるように（例えば前記参考文献の図２を参照）、ナノボディのアミノ酸残基はＫａｂａｔら（「Sequence of proteins of immunological interest」メリーランド州ベセズダＮＩＨアメリカ合衆国公衆衛生局、発表番号：９１）が示すＶＨドメインの一般的なナンバリングに従って番号がつけられる。このナンバリングに従って、ナノボディのＦＲ１は１〜３０番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１〜３６番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６〜４９番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０〜６５番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６〜９４番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５〜１０２番目の位置のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３〜１１３番目の位置のアミノ酸残基を含む。［この点に関して、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて該技術分野において周知の通り、各ＣＤＲのアミノ酸残基の総数が変化して、Ｋａｂａｔのナンバリングによって示されたアミノ酸残基の総数と一致しない（つまり、Ｋａｂａｔのナンバリングに従った１つ以上の位置が実際の配列では占有されない、または実際の配列がＫａｂａｔのナンバリングによって可能な数よりも多くのアミノ酸残基を含みうる）可能性を指摘する必要がある。このことは、一般に、Ｋａｂａｔのナンバリングが実際の配列のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応するかどうか分からないことを意味する。しかし、一般に、Ｋａｂａｔのナンバリングに従い、そしてＣＤＲ内のアミノ酸残基の数とは無関係に、Ｋａｂａｔのナンバリングに従った１番目の位置はＦＲ１の開始に対応しており、その逆の場合も同じであり、Ｋａｂａｔのナンバリングに従った３６番目の位置はＦＲ２の開始に対応しており、その逆の場合も同じであり、Ｋａｂａｔのナンバリングに従った６６番目の位置はＦＲ３の開始に対応しており、その逆の場合も同じであり、Ｋａｂａｔのナンバリングに従った１０３番目の位置はＦＲ４の開始に対応しており、その逆の場合も同じであると言える。］
ラクダ由来のＶＨＨドメインおよびナノボディにも同様に適用できる、ＶＨドメインのアミノ酸残基の別のナンバリング方法は、Ｃｈｏｔｈｉａらが記載した方法（Nature 342, 877-883（1989））であり、いわゆる「ＡｂＭ規定」および、いわゆる「接触規定」である。しかし、今回の記述、請求項、図面においては、特記しない限り、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ＆ＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによるＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔのナンバリングに従い；および
ｑ）図面、配列表、実験部分／実施例は本発明の説明のためのみに示しており、本明細書で明確に示さない限り、本発明、および／または添付請求項の範囲を限定したりするものと、解釈したり、または理解しないで頂きたい。
重鎖抗体およびその可変領域の一般的な記述については、一般的背景技術と言われる以下の参考文献をとりわけ参照されたい：出願者による国際公開第０４／０４１８６７号、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０６２５５１号、および出願者によって発表されたさらなる特許出願の他、Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌの国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９５／０４０７９号、国際公開第９６／３４１０３号、Ｕｎｉｌｅｖｅｒの国際公開第９４／２５５９１号、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第００／４０９６８号、国際公開第００／４３５０７号、国際公開第００／６５０５７号、国際公開第０１／４０３１０号、国際公開第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、国際公開第０２／４８１９３号、Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）の国際公開第９７／４９８０５号、国際公開第０１／２１８１７号、国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０３／０５４０１６号、国際公開第０３／０５５５２７号、Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．と出願者の国際公開第０３／０５０５３１号、カナダ国立研究協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）による国際公開第０１／９０１９０号、抗体研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）による国際公開第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；
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上記のとおり、本発明は一般に、下記および国際公開第０４／０６２５５１号記載の予防、治療、および／または診断の目的で使用可能な、ｖＷＦに対して指向性を有するナノボディ、そして１つ以上の該ナノボディを本質的に含むポリペプチドに関する。
上記および以下でもさらに詳述するとおり、本発明はさらに、該ナノボディおよびポリペプチドをコードする核酸、該ナノボディおよびポリペプチドの調製方法、該ナノボディまたはポリペプチドを発現している、または発現できる宿主細胞、該ナノボディ、ポリペプチド、核酸、または宿主細胞の使用、そして該ナノボディ、ポリペプチド、核酸、または宿主細胞を含む組成物に関する。
一般に、本明細書で使用するナノボディという用語は、最も広い意味において、特定の生物原料または特定の調製方法に限定されないことに留意されたい。例えば、以下に詳述するとおり、本発明のナノボディは（１）天然重鎖抗体のＶＨＨドメインの単離、（２）天然ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、（３）天然ＶＨＨドメインのヒト化または該ヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種、特に哺乳動物（例、ヒト）由来の天然ＶＨドメインのラクダ化（後述）、または該ラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）Ｗａｒｄら（上記）記載の「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、または該ラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（６）タンパク質、ポリペプチド、他のアミノ酸配列の調製のための合成、半合成技術の利用、（７）核酸合成技術を利用したナノボディをコードする核酸の調製、そしてこのようにして得られる核酸の発現、および／または（８）上記の任意の組み合わせ、によって入手できる。前記を実施するための適切な方法と技術は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであり、例えば、以下において詳述する方法および技術が挙げられる。
しかし、具体的な実施態様では、本発明のナノボディは、哺乳動物、特にヒト由来の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列といった、天然ＶＨドメインのアミノ酸配列と厳密に同じ（つまり、１００％の配列同一性）アミノ酸配列を有さない。
本発明のナノボディの特に好ましい１つの種類には、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を伴うが、「ヒト化」されている（つまり、従来のヒト４鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置に生じる１つ以上のアミノ酸残基による、前記天然ＶＨＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基の置換による）ナノボディが含まれる。例えば、以下のさらなる記述および本明細書に記述のヒト化に関する先行技術に基づいて、これはそれ自体公知の方法で実施でき、当業者には明らかであろう。ここでも、本発明の該ヒト化ナノボディはそれ自体公知の任意の適切な方法（つまり、上記の（１）〜（８）のポイントに示す方法）で入手でき、ひいては出発材料として天然ＶＨＨドメインを含むポリペプチドを利用して得たポリペプチドに厳密には限定されないことに留意されたい。
本発明の別の特に好ましいナノボディの種類には、「ラクダ化した」（つまり、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置に生じる１つ以上のアミノ酸残基による、従来の４鎖抗体由来の天然ＶＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基の置換による）天然ＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を伴うナノボディが含まれる。これはそれ自体公知の方法で実施でき、これは例えば以下の詳述に基づいて当業者には明らかであろう。国際公開第９４／０４６７８号も参照される。該ラクダ化は、好ましくは、以下でも記載のとおり、ＶＨ−ＶＬ接合部分およびいわゆるＣａｍｅｌｉｄａｅの特徴的残基（例、国際公開第９４／０４６７８号を参照）に存在するアミノ酸の位置で生じる。好ましくは、ラクダ化ナノボディの作成またはデザインにおける出発材料または開始点として使用するＶＨドメインまたは配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列である。しかし、本発明の該ラクダ化ナノボディはそれ自体公知の任意の適切な方法（つまり、上記の（１）〜（８）のポイントに示す方法）で入手でき、ひいては出発材料として天然ＶＨドメインを含むポリペプチドを利用して得たポリペプチドに厳密には限定されないことに留意されたい。
例えば、ここでも以下で詳述するとおり、「ヒト化」および「ラクダ化」のいずれも、該天然ＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を提供し、それから、それ自体公知の方法で、新しいヌクレオチド配列が本発明のヒト化またはラクダ化ナノボディをコードするように該ヌクレオチド配列の１つ以上のコドンを変化させ、本発明の目的のナノボディを提供するようにそれ自体公知の方法でこのように得たヌクレオチド配列を発現させることで実施できる。または、天然ＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、本発明の目的のヒト化またはラクダ化ナノボディのアミノ酸配列をデザインし、およびそれ自体公知のペプチド合成技術を利用してデノボ合成できる。また、天然ＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ基づいて、本発明の目的のヒト化またはラクダ化ナノボディをそれぞれコードするヌクレオチド配列をデザインし、およびそれ自体公知のデノボ核酸合成技術を利用して合成でき、その後、本発明の目的のナノボディを提供するために、このように得た核酸配列を発現できる。
天然ＶＨドメイン（またはそのアミノ酸配列）または好ましくはＶＨＨドメインおよび／またはこれをコードするヌクレオチド配列および／または核酸配列から始めて、本発明のナノボディおよび／またはこれをコードするヌクレオチド配列および／または核酸を得るための他の適切な方法および技術は、当業者には明らかであり、例えば、本発明のナノボディ（をコードするヌクレオチド配列または核酸）を提供するための適切な方法で、天然ＶＨＨドメイン由来の１つ以上のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列（例、１つ以上のＦＲまたはＣＤＲ）と、天然ＶＨドメイン由来の１つ以上のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列（例、１つ以上のＦＲおよび／またはＣＤＲ）の組み合わせを含むことができる。
本発明の、好ましいが非限定的な一態様によれば、ナノボディは、最も広い意味で、以下を含むポリペプチドと一般に規定できる：
ａ）３つの相補性決定領域／配列で分断された４つのフレームワーク領域／配列からなるアミノ酸配列において、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置での該アミノ酸残基はＱであり；
および／または：
ｂ）３つの相補性決定領域／配列で分断された４つのフレームワーク領域／配列からなるアミノ酸配列において、Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置での該アミノ酸残基はＥ、Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置での該アミノ酸残基はＲであり；
および／または：
ｃ）３つの相補性決定領域／配列で分断された４つのフレームワーク領域／配列からなるアミノ酸配列おいて、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置での該アミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳであり、ＲおよびＳからなるグループから特に選択される。
このように、好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり；
および／または：
ｉｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＥであり、Ｋａｂａｔナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＲであり；
および／または：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳからなるグループ、特にＲおよびＳからなるグループから選択され；
および：
ｉｖ）ＣＤＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＮＹＧＭＧ ［配列番号：１５］
ＳＹＴＬＧ ［配列番号：１６］
ＮＹＮＭＧ ［配列番号：１７］
ＳＳＡＭＡ ［配列番号：１８］
ＹＹＮＴＧ ［配列番号：１９］
ＩＧＡＭＧ ［配列番号：２０］
ＩＧＴＭＧ ［配列番号：２１］
ＹＮＰＭＧ ［配列番号：２２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず、
および：
ｖ）ＣＤＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ ［配列番号：２３］
ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ ［配列番号：２４］
ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ ［配列番号：２５］
ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ ［配列番号：２６］
ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２７］
ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２８］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ ［配列番号：２９］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：３０］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ ［配列番号：３１］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ ［配列番号：３２］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず、
および：
ｖｉ）ＣＤＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３３］
ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ ［配列番号：３４］
ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３５］
ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ ［配列番号：３６］
ＶＶＤＧＫＲＡＰ ［配列番号：３７］
ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ ［配列番号：３８］
ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：３９］
ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：４０］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ ［配列番号：４１］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４２］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４３］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
好ましくは、本発明のナノボディにおいて：
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＧＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＳＹＴＬＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＧＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＮＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ、（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＳＳＡＭＡ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＶＶＤＧＫＲＡＰ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＹＮＴＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３、は（１）ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＴＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
特に、本発明のｖＷＦに対するナノボディは、以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり；
および／または：
ｉｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＥであり、Ｋａｂａｔナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＲであり；
および／または：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳからなるグループ、特にＲおよびＳからなるグループから選択され；
および：
ｉｖ）ＣＤＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＮＹＧＭＧ ［配列番号：１５］
ＳＹＴＬＧ ［配列番号：１６］
ＮＹＮＭＧ ［配列番号：１７］
ＳＳＡＭＡ ［配列番号：１８］
ＹＹＮＴＧ ［配列番号：１９］
ＩＧＡＭＧ ［配列番号：２０］
ＩＧＴＭＧ ［配列番号：２１］
ＹＮＰＭＧ ［配列番号：２２］
および：
ｖ）ＣＤＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ ［配列番号：２３］
ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ ［配列番号：２４］
ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ ［配列番号：２５］
ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ ［配列番号：２６］
ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２７］
ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２８］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ ［配列番号：２９］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：３０］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ ［配列番号：３１］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ ［配列番号：３２］
および：
ｖｉ）ＣＤＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列である。
ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３３］
ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ ［配列番号：３４］
ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３５］
ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ ［配列番号：３６］
ＶＶＤＧＫＲＡＰ ［配列番号：３７］
ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ ［配列番号：３８］
ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：３９］
ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：４０］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ ［配列番号：４１］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４２］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４３］
好ましくは、後の態様に記載の本発明のナノボディにおいて、
− ＣＤＲ１がＮＹＧＭＧの場合；ＣＤＲ２がＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧであり；ＣＤＲ３がＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹである。
− ＣＤＲ１がＳＹＴＬＧの場合；ＣＤＲ２がＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧであり；ＣＤＲ３がＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹである。
− ＣＤＲ１がＮＹＧＭＧの場合；ＣＤＲ２がＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧであり；ＣＤＲ３がＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹである。
− ＣＤＲ１がＮＹＮＭＧの場合；ＣＤＲ２がＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧであり；ＣＤＲ３がＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹである。
− ＣＤＲ１がＳＳＡＭＡの場合；ＣＤＲ２がＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧであり；
ＣＤＲ３がＶＶＤＧＫＲＡＰである。
− ＣＤＲ１がＹＹＮＴＧの場合；ＣＤＲ２がＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧであり；ＣＤＲ３がＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹである。
− ＣＤＲ１がＩＧＡＭＧの場合、ＣＤＲ２がＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧであり、
ＣＤＲ３がＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹである。
− ＣＤＲ１がＩＧＡＭＧの場合；ＣＤＲ２がＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧであり；
ＣＤＲ３がＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹである。
− ＣＤＲ１がＩＧＡＭＧの場合；ＣＤＲ２がＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧであり；
ＣＤＲ３がＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹである。
− ＣＤＲ１がＩＧＴＭＧである場合；ＣＤＲ２がＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧであり；ＣＤＲ３がＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹである。
− ＣＤＲ１がＹＮＰＭＧである場合；ＣＤＲ２がＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧであり；ＣＤＲ３がＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦである。
− ＣＤＲ１がＹＮＰＭＧである場合；ＣＤＲ２がＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧであり；ＣＤＲ３がＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦである。
− ＣＤＲ１がＹＮＰＭＧである場合；ＣＤＲ２がＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧであり；ＣＤＲ３がＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦである。
特に、本発明の好ましいが非限定的な一態様では、ナノボディは一般に３つの相補性決定領域／配列で分断された４つのフレームワーク領域／配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと規定でき、
ａ−１）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＧ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌからなるグループ、好ましくはＧ、Ｅ、またはＱからなるグループから選択され；および
ａ−２）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＬ、Ｒ、またはＣからなるグループ、好ましくはＬあるいはＲからなるグループから選択され；
および
ａ−３）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＷ、Ｒ、またはＳからなるグループ、好ましくはＷまたはＲからなるグループから選択され、最も好ましくはＷであり；
ａ−４）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり、または：
ｂ−１）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＥおよびＱからなるグループから選択され、
ｂ−２）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＷ、Ｒ、およびＳからなるグループから選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱおよびＬからなるグループから選択され、好ましくはＱであり、
または：
ｃ−１）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＧ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，Ｒ，Ｓ、およびＬからなるグループ、好ましくはＧ，Ｅ，Ｑからなるグループから選択され、
ｃ−２）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＬ、Ｒ、およびＣからなるグループ、好ましくはＬ、Ｒからなるグループから選択され、
ｃ−３）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳからなるグループ、特にＲ、Ｓからなるグループから選択され、
ｃ−４）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱおよびＬからなるグループから選択され、好ましくはＱである。
このように、好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＧ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌからなるグループ、好ましくはＧ、Ｅ、またはＱからなるグループ
から選択され、
および：
ｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＬ、Ｒ、またはＣからなるグループ、好ましくはＬまたはＲからなるグループから選択され、
および：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＷ、Ｒ、またはＳからなるグループ、好ましくはＷまたはＲからなるグループから選択され、最も好ましくはＷであり、
および：
ｉｖ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり、
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記の
より好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＥおよびＱからなるグループから選択され、
および：
ｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＲであり、
および：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＷ、Ｒ、およびＳから選択され、最も好ましくはＷであり、
および：
ｉｖ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり、
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記の
より好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＧ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＬからなるグループ、好ましくはＧ、Ｅ、およびＱからなるグループ
から選択され、
および：
ｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＬ、Ｒ、およびＣからなるグループ、好ましくはＬおよびＲからなるグループから選択され、
および：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳからからなるグループ、特にＲおよびＳからなるグループから選択され、
および：
ｉｖ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱおよび、Ｌからからなるグループから選択され、好ましくはＱであり、
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
本発明のナノボディの、特に好ましい好ましいが非限定的な２つのグループは、上記の ａ）、ａ−１）〜ａ−４）、ｂ）、ｂ−１）〜ｂ−４）、ｃ）、ｃ−１）〜ｃ−４）に従い；
ａ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４〜４７番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（または本明細書に規定するＧＬＥＷ様配列）を形成しており、１０８番目の位置のアミノ酸残基がＱであり；
または：
ｂ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４３〜４６番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥまたはＫＱＲＥ（またはＫＥＲＥ様配列）を形成しており、１０８番目の位置のアミノ酸残基がＱまたはＬ、好ましくはＱである。
このように、非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４〜４７番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（または本明細書に規定するＧＬＥＷ様配列）を形成しており、１０８番目の位置のアミノ酸残基がＱであり；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる４３〜４６番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥまたはＫＱＲＥ（またはＫＥＲＥ様配列）を形成しており、１０８番目の位置のアミノ酸残基がＱまたはＬ、好ましくはＱであり；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
Ｋａｂａｔのナンバリングによる４３〜４６番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥまたはＫＱＲＥを形成している本発明のナノボディにおいて、３７番目の位置のアミノ酸残基は好ましくはＦである。Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４〜４７番目の位置のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷを形成している本発明のナノボディにおいて、３７番目の位置のアミノ酸残基がＹ、Ｈ、Ｉ、Ｖ、Ｆからなるグループから選択され、最も好ましくはＦである。
したがって、決してこれに限定されることはないが、上記の位置に存在するアミノ酸残基に基づいて、本発明のナノボディは一般に以下の３つのグループに基づいて分類可能である：
ａ）「ＧＬＥＷグループ」：Ｋａｂａｔのナンバリングによる４４〜４７番目の位置がアミノ酸配列ＧＬＥＷであり、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置がＱであるナノボディ。本明細書にさらに記載するとおり、このグループのナノボディは通常、３７番目の位置がＶであり、１０３番目の位置がＷ、Ｐ、Ｒ、Ｓであり、好ましくは１０３番目の位置がＷである。ＧＬＥＷグループは以下の表４に記載する配列などのＧＬＥＷ様配列も含む。
ｂ）「ＫＥＲＥグループ」：Ｋａｂａｔのナンバリングによる４３〜４６番目の位置がアミノ酸配列ＫＥＲＥまたはＫＱＲＥであり、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置がＱまたはＬであるナノボディ。本明細書にさらに記載するとおり、このグループのナノボディは通常、３７番目の位置がＦであり、４７番目の位置がＬまたはＦであり、１０３番目の位置がＷ、Ｐ、Ｒ、Ｓであり、好ましくは１０３番目の位置がＷである。
ｃ）「１０３ Ｐ、Ｒ、Ｓグループ」：１０３番目の位置がＰ、Ｒ、Ｓであるナノボディ。これらのナノボディはＫａｂａｔのナンバリングによる４４〜４７番目の位置にアミノ酸配列ＧＬＥＷまたはＫａｂａｔのナンバリングによる４３〜４６番目の位置アミノ酸配列ＫＥＲＥまたはＫＱＲＥのいずれかを有しており、後者は最も好ましくは３７番目の位置がＦであり、４７番目の位置がＬまたはＦとの組み合わせであり（ＫＥＲＥグループで規定されるとおり）、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０８番目の位置がＱまたはＬ、好ましくはＱでありうる。
このように、好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディはＧＬＥＷグループに属するナノボディ（本明細書で規定）であり、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書において規定されるとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定され、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定されるとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディはＫＥＲＥグループに属するナノボディ（本明細書で規定）であり、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書において規定されるとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定され、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定されるとおりである。
このように、好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディは１０３ Ｐ、Ｒ、Ｓグループに属するナノボディ（本明細書で規定）であり、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書において規定されるとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定され、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定されるとおりである。
また、より一般的に、そして上記の１０８Ｑ、４３Ｅ／４４Ｒ、１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ残基に加えて、本発明のナノボディは、１つ以上の位置において、従来のＶＨドメイン内にＶＨ／ＶＬ接触部分（の一部）を形成して、対応する天然ＶＨまたはＶＨＨドメイン内の同じ位置に天然で生じるアミノ酸残基よりも高電荷な１つ以上のアミノ酸残基、特に１つ以上の荷電アミノ酸残基（表３記載）を含みうる。
このような置換としては、非限定的な、いわゆる「マイクロボディ」に関する国際出願国際公開第００／２９００４号記載の置換の他、以下の表４記載のＧＬＥＷ様配列が挙げられる（例、１０８番目の位置がＱ、４４〜４７番目の位置がＫＬＥＷ）。
本発明のナノボディにおいて、８３番目の位置のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ｗからなるグループから選択され、好ましくはＬである。
また、本発明のナノボディにおいて、８３番目の位置のアミノ酸残基は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｉ、Ｑからなるグループから選択され、最も好ましくはＫまたはＥ（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディ）またはＲ（以下に記載の「ヒト化」ナノボディ）である８４番目の位置のアミノ酸残基は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｖからなるグループから選択され、最も好ましくはＰ（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディ）またはＲ（以下に記載の「ヒト化」ナノボディ）である。
さらに、本発明のナノボディにおいて、１０４番目の位置のアミノ酸残基は、Ｇ、Ｄからなるグループから選択され、最も好ましくはＧである。
まとめると、１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、１０８番目の位置のアミノ酸残基は、ナノボディにおいて上記のとおり、本明細書において「特徴的残基」とも呼ばれる。最も密接に関連するヒトＶＨドメインである、ＶＨ３の対応する位置の特徴的残基およびアミノ酸残基が表４にまとめられている。
天然ＶＨＨドメインにおいて生じるのと同様のこれらの特徴的残基のいくつかの特に好ましい組み合わせが表５に記載されている。比較のために、ＤＰ−４７と呼ばれるヒトＶＨ３の対応するアミノ酸残基がイタリックで示されている。
表４：ナノボディの特徴的残基
Figure 0004986997
上記表の注釈：
（１）特に、限定しないが、４３〜４６番目の位置のＫＥＲＥまたはＫＱＲＥとの組み合わせ。
（２）通常、４４〜４７番目の位置のＧＬＥＷ。
（３）通常、４３〜４６番目の位置のＫＥＲＥまたはＫＱＲＥ、例えば４３〜４７番目の位置のＫＥＲＥＬ、ＫＥＲＥＦ、ＫＱＲＥＬ、ＫＱＲＥＦ、ＫＥＲＥＧ。または、ＴＥＲＥ（例、ＴＥＲＥＬ）、ＫＥＣＥ（例、ＫＥＣＥＬまたはＫＥＣＥＲ）、ＲＥＲＥ（例、ＲＥＲＥＧ）、ＱＥＲＥ（例、ＱＥＲＥＧ）、ＫＧＲＥ（例、ＫＧＲＥＧ）、ＫＤＲＥ（例、ＫＤＲＥＶ）などの配列も可能である。それほど好ましくはないが、可能な他の配列として、例えば、ＤＥＣＫＬおよびＮＶＣＥＬが挙げられる。
（４）４４〜４７番目の位置のＧＬＥＷおよび４３〜４６番目の位置のＫＥＲＥまたはＫＱＲＥのいずれも。
（５）多くの場合、天然ＶＨＨドメインの８３〜８４番目の位置のＫＰまたはＥＰとして。
（６）特に、限定しないが、４４〜４７番目の位置のＧＬＥＷとの組み合わせ。
（７）４４〜４７番目の位置がＧＬＥＷの場合、１０８番目の位置が常にＱであるという条件で。
（８）ＧＬＥＷグループには、４４〜４７番目の位置に、例えばＧＶＥＷ、ＥＰＥＷ、ＧＬＥＲ、ＤＱＥＷ、ＤＬＥＷ、ＧＩＥＷ、ＥＬＥＷ、ＧＰＥＷ、ＥＷＬＰ、ＧＰＥＲ、ＧＬＥＲ、ＥＬＥＷなどのＧＬＥＷ様配列も含まれる。
表５：天然ナノボディにおける特徴的残基の好ましい組み合わせ。
これらの組み合わせのヒト化に関しては明細書を参照されたい。
Figure 0004986997
ナノボディにおいて、特徴的残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの対応する位置（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）に天然に現れる任意のアミノ酸残基でありうる。
このようなアミノ酸残基は当業者であれば明らかであろう。表６〜９には、天然ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の各位置に存在する、非限定的ないくつかの残基を記載している。各位置において、天然ＶＨＨドメインの各位置に最も頻繁に現れるアミノ酸残基（およびナノボディにおける前記位置に最も好ましいアミノ酸残基）がボールド体で示されており、各位置の他の好ましいアミノ酸残基に下線を引いている（注意：天然ＶＨＨドメインの２６〜３０番目の位置で認められるアミノ酸残基の個数は、これらの位置が既にＣＤＲ１のいくつかを形成するとのナンバリングＣｈｏｔｈｉａ（上記）の基礎となる仮説を裏付けている）。
表６〜９には、ヒトＶＨ３ドメインの各位置に存在できる非限定的な残基のいくつかも記載している。ここでも、各位置について、天然ヒトＶＨ３ドメインの各位置に最も頻繁に現れるアミノ酸残基をボールド体で示しており、他の好ましいアミノ酸残基に下線を引いている。
表６：ＦＲ１のアミノ酸残基の非限定的な実施例（補足説明については、表４の脚注を参照）
Figure 0004986997
Figure 0004986997
表７：ＦＲ２のアミノ酸残基の非限定的な実施例（補足説明については、表４の脚注を参照）
Figure 0004986997
表８−１：ＦＲ３のアミノ酸残基の非限定的な実施例（補足説明については、表４の脚注を参照）
Figure 0004986997
表８−２：ＦＲ３のアミノ酸残基の非限定的な実施例（続き）
Figure 0004986997
表９：ＦＲ４のアミノ酸残基の非限定的な実施例（補足説明については、表４の脚注を参照）
Figure 0004986997
このように、好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し、
ｉ）特徴的残基は本明細書に記載のとおりであり；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことが
でき、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
および
ｉ）ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＸＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号：１］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本
明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失ままたは挿入を含まず；
および：
ｉｉ）ＦＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［３６］ＷＸＲＱＡＰＧＫＸＸＥＸＶＡ［４９］ ［配列番号：２］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失ままたは挿入を含まず；
および：
ｉｉｉ）ＦＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸＸＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］［配列番号：３］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失ままたは挿入を含まず；
および：
ｉｖ）ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１０３］ＸＸＱＧＴＸＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：４］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、
特徴的残基は「Ｘ」で示され、上記で規定するとおりであり、カッコ間の数字はＫａｂａｔナンバリングによるアミノ酸の位置を示す。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
および
ｉ）ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号：５］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｉ）ＦＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号：６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号：７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ ［４９］ ［配列番号：８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号：９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号：１０］
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号：１１］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、および４７番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、および４７番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｉｉ）ＦＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］［配列番号：１２］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３および８４番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３および８４番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｖ）ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：１４］
または、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本
明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され；
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、および１０８番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、および１０８番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
および
ｉ）ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１］ ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］［配列番号：５］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｉ）ＦＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号：６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号：７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ ［４９］ ［配列番号：８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号：９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号：１０］
および／または、上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差
違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、および４７番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｉｉ）ＦＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号：１２］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３、および８４番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｖ）ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：１４］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差
違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸
の置換（本明細書で規定）、および／または表９に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸
置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、および１０８番目の位置での特徴的残基が上記の配列内に示
されており；
および：
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書において規定するとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
および
ｉ）ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］ ［配列番号：５］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）位置での特徴的残基が上記の配列内に示されており；
および：
ｉｉ）ＦＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号：１１］
および／または、上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、および４７番目の位置での特徴的残基が上記の各配列内に示されており；
および：
ｉｉｉ）ＦＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ ［９４］［配列番号：１２］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３および８４番目の位置での特徴的残基が上記の各配列内に示されており；
および：
ｉｖ）ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択され：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号：１３］
および／または、上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され：
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表９に規定するアミノ酸置換であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、および１０８番目の位置の特徴的残基が上記の各配列内に示されており；
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書に規定するとおりであり、好ましは上記の好ましい規定の１つに従って規定するとおりであり、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定するとおりである。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明のナノボディが以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
および
ｉ）ＦＲ１が、配列番号：６０〜７３および配列番号８６〜９７のナノボディ、特に配列番号：８６〜９７のヒト化ナノボディに存在するＦＲ１配列からなるグループ、または前記ＦＲ１配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており；
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸が、前記ＦＲ１配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）位置の特徴的残基が前記ＦＲ１配列内に示されている；
アミノ酸配列からなるグループ、および／または前記ＦＲ１配列の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され、：
（１）特徴的位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表６に規定するアミノ酸置換であり、
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、前記ＦＲ１配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず、
（３）位置の特徴的残基が前記ＦＲ１配列内に示されているアミノ酸配列からなるグループから選択され；
および：
ｉｉ）ＦＲ２が、配列番号：６０〜７３および配列番号８６〜９７のナノボディ、特に配列番号：８６〜９７のヒト化ナノボディに存在するＦＲ２配列からなるグループ、または前記ＦＲ１配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり；および／または
（２）前記アミノ酸が、前記ＦＲ２配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、４７番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ２配列内に示されている；
アミノ酸配列からなるグループ、および／または前記ＦＲ２配列の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表７に規定するアミノ酸置換であり、
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、前記ＦＲ２配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）３７、４４、４５、４７番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ２配列内に示されている；アミノ酸配列からなるグループから選択され、
および：
ｉｉｉ）ＦＲ３が、配列番号：６０〜７３および配列番号８６〜９７のナノボディ、特に配列番号：８６〜９７のヒト化ナノボディに存在するＦＲ３配列からなるグループ、または前記ＦＲ３配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸が、前記ＦＲ３配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３、８４番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ３配列内に示されている；
アミノ酸配列からなるグループ、および／または前記ＦＲ３配列の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、前記ＦＲ３配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）８３、８４番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ３配列内に示されている；
アミノ酸配列からなるグループから選択され；
および：
ｉｖ）ＦＲ４が、配列番号：６０〜７３および配列番号８６〜９７のナノボディ、特に配列番号：８６〜９７のヒト化ナノボディに存在するＦＲ４配列からなるグループ、または前記ＦＲ４配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸が、前記ＦＲ４配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、１０８番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ４配列内に示されている；
アミノ酸配列からなるグループ、および／または前記ＦＲ４配列の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択され、
（１）特徴的位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）、および／または表８に規定するアミノ酸置換であり；
および／または
（２）前記アミノ酸配列が、前記ＦＲ４配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；および
（３）１０３、１０４、１０８番目の位置の特徴的残基が前記ＦＲ４配列内に示されているアミノ酸配列からなるグループから選択され；
および：
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は本明細書において規定されるとおりであり、好ましくは上記の好ましい規定の１つに従って規定され、より好ましくは上記のより好ましい規定の１つに従って規定されるとおりである。
本発明の、特に好ましいいくつかのナノボディは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７のアミノ酸配列からなるグループ（特に配列番号８６〜９７のヒト化ナノボディ）、または配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７のアミノ酸配列（好ましくは配列番号：８６〜９７）のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており、ここで
（１）特徴的残基が上記の表４に示しているとおりであり得るし；
（２）特徴的部位以外の任意の部位での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存アミノ酸置換（本明細書で規定）および／または表６〜９に規定するアミノ酸置換のいずれかであり；および／または
（３）前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
本発明の、さらに特に好ましいいくつかのナノボディは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７のアミノ酸配列からなるグループ（特に配列番号８６〜９７のヒト化ナノボディ）、または配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７のアミノ酸配列（好ましくは配列番号：８６〜９７）のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有しており、ここで
（１）特徴的残基が配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７（好ましくは配列番号：８６〜９７）から選択される関連配列に示されているとおりであり；
（２）特徴的部位以外の任意の部位の任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存アミノ酸置換（本明細書で規定）および／または表６〜９で規定されるアミノ酸置換のいずれかであり；および／または
（３）前記アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７（好ましくは配列番号：８６〜９７）から選択される関連配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
本発明の最も好ましいナノボディのいくつかは、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７のアミノ酸配列からなるグループ（特に配列番号８６〜９７のヒト化ナノボディ）から選択できる。
上記から明らかであるように、本明細書で使用する本発明のナノボディという用語は、最も広い意味において、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７に記載のナノボディの天然または合成の突然変異体、変異体、対立因子、類似体、オルソローグ（以下ではまとめて「類似体」と呼ぶ）。
一般に、このような類似体は、例えば、相同配列、機能的部分、またはナノボディの相同配列の機能的部分（以下でさらに規定）を含みうる。一般に、このような類似体において、各フレームワーク領域の各アミノ酸残基（特徴的残基以外）は、フレームワーク領域の配列同一性の程度全体が本明細書の規定のとおりある場合、他の任意のアミノ酸残基で置換可能である。好ましくは、しかし、このような類似体において：
− 上記のフレームワーク配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの同じ位置に天然に現れる１つ以上のアミノ酸残基で置換される。該置換のいくつかの例は上記の表６〜９に記載しており、
および／または：
− 上記のフレームワーク配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、上記の「保存」アミノ酸置換と見なされる１つ以上のアミノ酸残基で置換され、
および／または：
− 上記のフレームワーク配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの同じ位置に天然に現れる１つ以上のアミノ酸残基で置換される。これは一般に天然Ｖ
ＨＨ／ナノボディの全体、特に前記位置において「ヒト化」と呼ばれ、以下に詳述しており、
および：
− １つ以上のアミノ酸残基が表６〜９のＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのいずれについても記載される位置は好ましくは置換されない。
また、一般にはそれほど好ましくないが、該類似体においては、フレームワーク領域の配列同一性の程度全体が本明細書に記載のとおりである場合、（任意に、上記の１つ以上のアミノ酸置換に加えて）１つ以上のアミノ酸残基がフレームワーク領域から欠失され、および／またはフレームワーク領域内に挿入される。特徴的残基は欠失させてはならない。また、最も好ましくは、わずか１つのアミノ酸残基が上記の表６〜９のＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのいずれでも記載されているアミノ酸残基は、好ましくは欠失されない。
好ましくは、該類似体は、依然、ｖＷＦに結合でき、ｖＷＦに対する親和性および／または特異性（つまり、適切な分析法、例えば類似体のｖＷＦへの結合測定法、特に以下の実施例で利用する分析法の１つで測定される、配列番号：６０〜７３および配列番号：８６〜９７の少なくとも１つのナノボディの少なくとも１つでの親和性および／または特異性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上）を有する必要がある。
一般に、該類似体は、例えば、天然ＶＨＨドメインをコードする核酸を提供し、ヒト化される１つ以上のアミノ酸残基を対応するヒトのアミノ酸残基のコドンに変化させて、このようにして得る核酸／ヌクレオチド配列を適切な宿主または発現系において発現させ、このようにして得る類似体を任意に分離および／または精製して、前記類似体を本質的に分離した形（上記で規定）で提供することで入手できる。これは一般に、本明細書に記載のハンドブックおよび参考文献および／または以下のさらなる記述における、それ自体公知の方法および技術で実施可能であり、これらは当業者には明らかである。または、例えば、類似体をコードする核酸は、それ自体公知の方法（例えば、所定のアミノ酸配列を伴う核酸配列の合成用自動装置を利用）で合成でき、このようにして得られる核酸／ヌクレオチド配列を適切な宿主または発現系において発現させて、このようにして得る類似体を任意に分離および／または精製して、前記類似体が本質的に分離した形（上記で規定）で得られる。類似体の別の提供方法には、以下に記載する技術といった、それ自体公知のペプチド合成技術を利用した関連アミノ酸配列の化学的合成が含まれる。
（ａ）１０８番目の位置にＱ、（ｂ）４４番目の位置にＥ、および／または４５番目の位置にＲ、好ましくは４４番目の位置にＥ、および４５番目の位置にＲおよび／または（ｃ）１０３番目の位置にＰ、Ｒ、Ｓを与えるように前記ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を上記の通りに変化させることで、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１、ＤＰ−２９などのヒトＶＨ３配列などのヒトＶＨ配列（つまり、アミノ酸配列または対応するヌクレオチド配列）から始めてもナノボディ（その類似体を含む）を調製できることも当業者には一般に明らかであろう。やはり、これは一般に、ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列を開始点として使用して、前項で述べた様々な方法および技術を利用することで実施できる。
本明細書で使用するナノボディという用語は、その最も広い意味において、本明細書に規定する本発明のナノボディ（類似体を含む）の部分または断片も含むが、これについても再度、以下でさらに記述できる。
一般に、ナノボディおよび／または類似体の部分または断片は、対応する全長のナノボディまたは類似体のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端に１つ以上のアミノ酸残基、Ｃ末端に１つ以上のアミノ酸残基、１つ以上の連続的な内部アミノ酸残基、またはこれらの任意の組み合わせが欠失および／または除去されたアミノ酸配列を有する。このような部分あるいは断片の１つ以上を結合して、本発明のナノボディを提供することもできる。
好ましくは、全長のナノボディおよび／または類似体の１つ以上の部分または断片を含むナノボディのアミノ酸配列は、対応する全長のナノボディのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する必要がある。
また、全長のナノボディおよび／または類似体の１つ以上の部分または断片を含むナノボディのアミノ酸配列は、好ましくは対応する全長ナノボディのアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むようにすることが好ましい。
一般に、ナノボディおよび／または類似体の部分または断片は、対応する全長のナノボディまたは類似体のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端に１つ以上のアミノ酸残基、Ｃ末端に１つ以上のアミノ酸残基、１つ以上の連続的な内部アミノ酸残基、またはこれらの任意の組み合わせが欠失および／または除去されたアミノ酸配列を有する。該部分または該断片の１つ以上を結合させて、本発明のナノボディを提供することも可能である。
好ましい一実施態様では、本明細書で使用する断片は、本発明の全長ナノボディに存在するＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは本発明の全長ナノボディに存在するＣＤＲの少なくとも２つ、より好ましくは本発明の全長ナノボディに存在する少なくともＣＤＲ２およびＣＤＲ３、例えば本発明の全長ナノボディに存在する３つ全てのＣＤＲを含む。
特に好ましいが非限定的な別の実施態様では、該部分または断片は、例えば、国際公開第０３／０５０５３１号（Ｌａｓｔｅｒｓら）に記載の本発明の対応する全長ナノボディの少なくともＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を含む。
好ましくは、該部分または断片は、依然としてｖＷＦに結合可能であり、ｖＷＦに対する親和性および／または特異性（つまり、適切な分析法、例えば類似体のｖＷＦへの結合測定法、特に以下の実施例で利用する分析法の１つで測定される、本発明の全長ナノボディの親和性および／または特異性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上）を有する必要がある。
上記から、本明細書で使用するアミノ酸配列は、ヒト由来抗体の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列など、天然ＶＨドメインのアミノ酸配列からのフレームワーク領域の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つのアミノ酸の位置が異なることは明らかであろう。特に、本明細書で使用するナノボディのアミノ酸配列では、ラクダおよび／またはヒトの抗体の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列などの天然ＶＨドメインのアミノ酸配列とは特徴的残基の少なくとも１つが異なることは明らかであろう。
このように、より具体的な１つの実施態様では、本発明のナノボディは天然ＶＨドメインのアミノ酸配列とはフレームワーク領域の１つにおいて少なくとも１つのアミノ酸の位置が異なるアミノ酸配列を有する。本発明の、より具体的であるが非限定的な実施態様では、本発明のナノボディは天然ＶＨドメインのアミノ酸配列とは特徴的残基の少なくとも１つが異なるアミノ酸配列を有する。
上記から、本発明のヒト化ナノボディなど、本発明のナノボディのいくつかでのアミノ酸配列が、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列とは少なくとも１つのフレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸の位置（つまり、特徴的残基の位置または別の位置）で異なりうることも明らかであろう。このように、具体的であるが非限定的な一実施態様では、本発明のナノボディは、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列とはフレームワーク領域の１つにおいて少なくとも１つのアミノ酸の位置が異なるアミノ酸配列を有する。本発明の、より具体的であるが非限定的な実施態様では、本発明のナノボディは天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列とは少なくとも１つの特徴的残基が異なるアミノ酸配列を有する。
上記のとおり、本発明は、少なくとも１つのＶＨＨドメイン（つまり、本発明の方法を利用して同定される）またはこれに基づく少なくとも１つのナノボディを含むタンパク質またはポリペプチドにも関する。
本発明の非限定的な一実施態様では、本発明の該ポリペプチドはナノボディから本質的になっている。「本質的になる」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、ナノボディのアミノ酸配列（上記）と厳密に同じであるか、または限られた数のアミノ酸残基（１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜６個のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸残基）が、ナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端、カルボキシ末端のいずれにも付加したナノボディのアミノ酸配列と一致することを意味する。
該アミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性に、変化、改変、または他の影響を及ぼしても及ぼさなくてもよく、ナノボディに他の機能性を付与してもしなくてもよい。例えば、該アミノ酸残基は、
ａ）例えば、その配列または残基に対して指向性を有するアフィニティー法を用いて、ナノボディの精製を可能にし、または容易にするアミノ酸配列または残基である「タグ」を形成していてよい。その後、その配列または残基を（化学分解または酵素分解等により）除去し、本発明のヌクレオチド配列を得ることができる（このために、配列または残基は、場合によっては、分解可能なリンカー配列を介して本発明のアミノ酸配列に結合してもよい）。該残基の好ましいが非限定的ないくつかの例は、複数のヒスチジン配列またはグルタチオン残基である。
ｂ）例えば、異種宿主細胞または宿主生物で発現された結果としてのＮ−末端のＭｅｔ残基であってよい。
ｃ）官能基を有していてもよく、かつ／またはそれ自体公知の方法で官能基化されていてもよい1つ以上のアミノ酸残基であってよい。例えば、公知であるように、リジン等のアミノ酸残基、特にシステインは、ＰＥＧ基と結合することができ、タンパク質の表面部位を被覆することにより、例えば、免疫源性を低下させ、血漿中での半減期を増大させ、タンパク質分解酵素による切断に対する安定性を増大させることができる；
ｄ）ナノボディまたは本発明のポリペプチドの血清中での半減期を増大させる。インビボにおける半減期を増大させるために、治療効果を有するタンパク質と結合および／または融合することができるアミノ酸配列は当業者に周知であり、ヒト血清タンパク質またはその断片（ヒト血清アルブミンまたはその断片）、さらには、抗体（特にヒト抗体）のＦｃ領域が挙げられる。また、上述のとおり、該半減期を増大させるためのアミノ酸配列は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに対して指向性を有するナノボディ等の、血清タンパク質に対して指向性を有するアミノ酸配列であってよい。
ＰＥＧ化について留意すべき点は、一般に、本発明は、ＰＥＧ化が、（１）インビボにおける半減期を増大させ、（２）免疫源性を低下させ、（３）ＰＥＧ化について知られている1つ以上の有益な性質を付与し、（４）ナノボディおよび／またはポリペプチドのｖＷＦに対する親和性にはほとんど影響を及ぼさず（例えば、以下の実施例に記載の方法等の適切なアッセイで決定される場合において、該親和性を９０％以上低減させず、好ましくは５０％以上低減させず、より好ましくは１０％以上低減させない）、かつ／または（４）本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドの有する他の望ましい性質にほとんど影響を及ぼさないように、1つ以上のアミノ酸がＰＥＧ化されている本発明のナノボディおよび／または本発明のポリペプチドを含んでいることである。好適なＰＥＧ基およびこれらを特異的に、または非特異的に結合させる方法は、当業者に明らかである。該ＰＥＧ化に好適なキットおよび試薬は、例えばNektar社（米国カリフォルニア州）より入手可能である。
非限定的な一実施態様では、本発明のナノボディまたはポリペプチドのアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸残基に特異的にＰＥＧを結合させるために、1つ以上のアミノ酸残基を追加、挿入し、かつ／または1つ以上のアミノ酸残基で置換することができる。
本発明はまた、通常（後に詳述するように）、本発明のナノボディまたはポリペプチドの発現に用いた宿主に依存する1つ以上のアミノ酸の部位でグリコシル化された、本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドも含んでいる。
非限定的な一実施態様では、用いる宿主生物がグリコシル化することができる1つ以上の特異的なアミノ酸残基および／または部位を与えるように、本発明のナノボディまたはポリペプチドのアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸残基を追加、挿入し、かつ／または1つ以上のアミノ酸残基で置換することができる。好ましいが非限定的な例によって、本発明のナノボディのCDR２領域内の５０位のＮ残基が、例えば、ピチア属によるグリコシル化等のためのグリコシル化部位を提供するために、例えば、Ｑ、D、またはＳ残基によって置換されてもよい。
別の実施態様によると、本発明のポリペプチドが、アミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両者、ならびにカルボキシ末端で少なくとも１つの他のアミノ酸配列と融合したナノボディのアミノ酸配列を含んでいてよい。
この場合においても、前記他のアミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性に、変化、改変、または別の影響を及ぼしても及ぼさなくてもよく、ナノボディに別の機能を付与してもしなくてもよい。
例えば、好ましいが非限定的な一実施態様では、該他のアミノ酸配列は、少なくとも２つ、例えば３つ、４つまたは５つのナノボディを含み、該ナノボディは、1つ以上の（本明細書に規定）リンカー配列に場合によっては結合している、本発明のポリペプチドを提供するために、少なくとも１つの別のナノボディを含んでいてよい。
２つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本明細書において、「多価」ポリペプチドとも呼ばれる。例えば、本発明の「二価」ポリペプチドは、場合によってはリンカー配列を介して結合する２つのナノボディを含み、本発明の三価ポリペプチドは、場合によっては２つのリンカー配列を介して結合する３つのナノボディを含んでおり、４価以上の場合も同様である。
本発明の多価ポリペプチドにおいて、２つ以上のナノボディは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明の多価ポリペプチドにおける２つ以上のナノボディは：
− 同一の抗原、すなわち、同一の抗原における同一の部分もしくはエピトープ、または
同一の抗原における２つ以上の異なる部分もしくはエピトープに対して指向性を有するものであってもよく；および／または：
− 異なる抗原に対して指向性を有するものであってもよく；
または両者を組み合わせたものであってもよい。
したがって、本発明の２価ポリペプチドは、例えば、
− ２つの同一のナノボディを含んでいてもよく；
− 抗原の第１の部分または第１のエピトープに対する第１のナノボディと、該抗原の同一の部分もしくはエピトープに対して指向性を有する、または該抗原の異なる部分もしくはエピトープに対して指向性を有する第２のナノボディを含んでいてもよく；
− または第１の抗原に対して指向性を有する第１のナノボディと、該第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して指向性を有する第２のナノボディを含んでいてもよく、本発明の３価ポリペプチドは、例えば：
− 同一の抗原の同一または異なる部分もしくはエピトープに対して指向性を有する、３つの同一または異なるナノボディを含んでいてもよく；
− 第１の抗原の同一または異なる部分もしくはエピトープに対する、２つの同一または異なるナノボディと、第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して指向性を有する第３のナノボディを含んでいてもよく；または
− 第１の抗原に対して指向性を有する第１のナノボディと、該第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して指向性を有する第２のナノボディと、該第１および第２の抗原とは異なる第３の抗原に対して指向性を有する第３のナノボディを含んでいてもよい。少なくとも２つのナノボディを含み、そのうち少なくとも１つのナノボディが第１の抗原に対して指向性を有するものであり、少なくとも１つのナノボディが第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して指向性を有するものである本発明のポリペプチドは、「多特異性」ナノボディとも呼ばれる。したがって、「２特異性」ナノボディは、第１の抗原に対して指向性を有する少なくとも１つのナノボディと、第２の抗原に対して指向性を有する少なくとも１つの別のナノボディを含むナノボディであり、「３特異性」ナノボディは、第１の抗原に対して指向性を有する少なくとも１つのナノボディと、第２の抗原に対して指向性を有する少なくとも１つの別のナノボディと、第３の抗原に対して指向性を有する少なくとも１つの別のナノボディを含むナノボディであり、４特異性以上の場合も同様である。
したがって、最も簡単な形態において、本発明の２特異性ポリペプチドは、第１の抗原に対する第１のナノボディと、第２の抗原に対する第２のナノボディを含み、該第１および第２のナノボディが、場合によっては（本明細書に規定した）リンカー配列を介して結合している本発明の（本明細書に規定した）２価ポリペプチドであり、３特異性ポリペプチドは、第１の抗原に対する第１のナノボディと、第２の抗原に対する第２のナノボディと、第３の抗原に対する第３のナノボディを含み、該第１、第２および第３のナノボディが、場合によっては１種類以上、具体的には１種類、より具体的には２種類のリンカー配列を介して結合している本発明の（本明細書に規定した）３価ポリペプチドである。
しかし、上述の記載から、本発明の多特異性ポリペプチド、２種類以上の異なる抗原に対して指向性を有する任意の数のナノボディを含みうるという点において本発明は、これらの記載に限定されないことは明らかである。
1つ以上のVHH領域を含む多価および多特異性ポリペプチドおよびこれらの製造方法については、Conrathら、J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350、および欧州特許第０ ８２２ ９８５号を併せて参照されたい。
多価および多特異性ポリペプチドに用いるリンカーは、当業者に明らかのものであり、例えば、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のもの等のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（国際公開第９９／４２０７７号に記載の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３等）、天然の重鎖抗体のヒンジ領域または同様の配列等のヒンジ類似領域等が挙げられる。別の好適なリンカーについては、上で引用した一般的な背景技術に関する文献も参照されたい。特に好ましいリンカーは、配列番号８３〜８５に示すものであり、配列番号８４および８５に示すものが特に好ましい。
リンカーは、多価または多特異性ポリペプチドに何らかの機能を付与してもよい。例えば、1つ以上の荷電アミノ酸残基（上記表３参照）を含むリンカーは、親水性を増大させ、小さなエピトープまたはタグを形成または包含するリンカーは、検出、同定および／または精製のために用いることができる。
本明細書にさらに記載しているように、所望の抗原、および後述の血漿タンパク質等の少なくとも１種類の血漿タンパク質、具体的にはヒト血漿アルブミンに対して指向性を有する本発明の多特異性ポリペプチドは、対応する１価のナノボディに比べて血漿中での半減期が増大している。
上述のように、本明細書に記載の方法は、該本発明の多価多特異性ポリペプチドの生成に特に適している。
本発明のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのナノボディが、通常のVH領域またはVH領域の天然または合成アナローグに、場合によってはリンカー配列を介して結合していてもよい。
本発明のポリペプチドにおいて、通常のscFV断片と同様の形態を有するが、VH領域の代りにナノボディを含む本発明のポリペプチドを提供するために、少なくとも１つのナノボディが、通常のVL領域またはVL領域の天然または合成アナローグに、場合によってはリンカー配列を介して結合していてもよい。
本発明のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのナノボディが、1つ以上のCH1、CH2、および／またはCH3領域に、場合によってはリンカー配列を介して結合していてもよい。例えば、適切なCH1領域に結合したナノボディは、通常のFabまたはF（ab'）2断片と同様であるが、通常のVH領域のうち一方、または（F（ab'）2断片の場合）一方もしくは双方がナノボディに置換された抗体断片／構造を得るために、例えば、適切な軽鎖領域とともに用いることができる。例えば、ラクダ科の動物より誘導された適切なCH2およびCH3領域と結合したナノボディは、単特異性または２特異性の重鎖抗体を形成するために用いることができる。最後に、例えばヒトから誘導された適切なCH1、CH2、およびCH3領域に結合したナノボディは、適切な短鎖とともに、通常の４鎖抗体と同様であるが、通常のＶＨ領域の一方または双方がナノボディに置換された抗体を形成するために用いることができる。
また、本発明のポリペプチドは、1つ以上のナノボディ以外に、例えば、後述するもの等の治療効果を有する物質、および／または後で詳述するような蛍光マーカー、同位体等のマーカーもしくは標識等の官能基、基、または残基を含んでいてもよい。
本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、およびこれらをコードする核酸は、それ自体公知であり、本明細書の以下の記載より自明である方法を用いて調製することができる。ナノボディ、ポリペプチドおよび核酸を製造するための、好ましいが非限定的ないくつかの方法は、上述の手法、および／または以下にさらに記載する手法を含んでいる。
当業者に明らかであるように、本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドの調製に特に有用な１つの方法は、通常、以下の工程を含んでいる：
− 適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書において「本発明の宿主」ともいう）または本発明の該ナノボディまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書において「本発明の核酸」ともいう）の他の適切な発現系における発現、次いで：
− このようにして、得た本発明の、ナノボディまたはポリペプチドの単離および／または精製。
特に、該方法は、以下の工程を含んでもよい：
− 本発明の宿主が本発明の、少なくとも１種類のナノボディおよび／またはポリペプチドを発現および／または産生するような条件下での本発明の宿主の培養および／または維持；場合によって、次いで：
− 得た本発明のナノボディまたはポリペプチドの単離および／または精製。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態を取ることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態を取る。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞または宿主生物に特異的に適合するコドンを用いたＤＮＡ等）であってよい。
本発明の一実施態様では、本発明の核酸は、上述のようにほぼ単離された形態を取ることができる。
本発明の核酸は、例えば、プラスミド、コスミド、またはＹＡＣ等のベクターの一部の形態をとり、かつ／または存在していてもよく、同様にほぼ単離された形態を取ることができる。
本発明の核酸は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、それ自体公知の方法により調製し、または得ることができ、かつ／または適切な天然資源より単離することができる。アナローグを得るためには、天然のVHH領域をコードするヌクレオチド配列に、例えば、部位特異的な突然変異生成を起こさせ、該アナローグをコードする本発明の核酸を得ることができる。同様に、当業者に明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１つの核酸および例えば、１種類以上のリンカーをコードするヌクレオチド配列等のいくつかのヌクレオチド配列は適切な方法で結合してもよい。
本発明の核酸を生成するための手法は、当業者に明らかであり、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異生成、２つ以上の天然および／または合成配列（またはこれらのうち２つ以上の部分）の結合、切断された遺伝子産物を産生する変異の導入、（例えば、適切な制限酵素を用いて容易に消化および／または切断することができるカセットおよび／または部位を生成するための）1つ以上の制限部位の導入、および／または1つ以上の「ミスマッチ」プライマーを用い、天然のＧＰＣＲをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応による変異の導入等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法および別の方法は当業者に明らかであり、上述のSambrookら、およびAubuselらによる通常のハンドブックや、後述する実施例等を参照されたい。
本発明の核酸は、当業者には明らかであるように、遺伝子構造物の一部としての形態を取り、かつ／または存在することもできる。該遺伝子構造物は、通常、例えば、１種類以上の適切な制御要素（適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、および後述する遺伝子構造物の他の要素等の、1つ以上のそれ自体公知の遺伝子構造物の要素と、場合によっては結合している少なくとも１種類の本発明の核酸を含んでおり、少なくとも１つの本発明の核酸を含む該遺伝子構造物は、本明細書において「本発明の遺伝子構造物」ともいう。
本発明の遺伝子構造物は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の二本鎖ＤＮＡは、目的とする宿主細胞または宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡへの組み込みに好適な形態、または目的とする宿主細胞または宿主生物における単独での複製、保持および／または継代に好適な形態を取ることができる。例えば、本発明の遺伝子構造物は、例えば、プラスミド、コスミド、またはＹＡＣ、ウィルスベクターまたはトランスポゾン等のベクターの形態を取ることができる。具体的には、ベクターは、インビトロおよび／またはインビボ（好適な宿主細胞、宿主生物および／または発現系等）での発現のために提供されるベクターである発現ベクターであってよい。
好ましいが非限定的な実施態様では、本発明の遺伝子構造物は、
ａ）少なくとも１つの本発明の核酸であって、場合によっては
ｂ）プロモーター、および場合によっては好適なターミネーター等の、１種類以上の制御要素に結合しており、
ｃ）場合によっては、さらに
ｄ）1つ以上のそれ自体公知の遺伝子構造物の要素とも結合している；
この場合、「制御要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、および「動作可能に結合している」という語句は、本技術分野における通常の意味（後に詳述する）を有しており、遺伝子構造物中に存在する該「他の要素」は、例えば、３'−または５'−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター配列、および／または形質転換または組み込み（の効率）を促進または増大させる要素であってよい。該遺伝子構造物に好適なこれらおよび他の好適な要素は当業者に明らかであり、例えば、用いる構造物の種類、目的とする宿主細胞または宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列が発現される方法（構成的発現、一時的発現、または誘導性発現等）、および／または用いる形質転換手法に依存する。
好ましくは、本発明の遺伝子構造物において、該少なくとも１種類の本発明の核酸、および該制御要素、および場合によっては該１種類以上の他の要素は、互いに「動作可能に結合」しており、これにより、これらは互いに機能的な関係にある。例えば、プロモーターが、形質転換および／またはコーディング配列の発現を、開始または他の方法により制御／調節することができる（該コーディング配列は、該プロモーターの「制御下にある」と理解されたい）場合、コーディング配列に「動作可能に結合」していると考えられる。通常、２つのヌクレオチド配列が動作可能に結合されている場合、これらは同一の配向を有し、通常同一のリーディングフレームの内部にある。必ずしも必要ではないが、これらはほとんど隣接している。
好ましくは、本発明の遺伝子構造物の制御要素および他の要素は、このようにして、目的とする宿主細胞または宿主生物において所望の生物学的機能を付与することができる。
例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、目的とする宿主細胞または宿主生物において「動作可能」である必要があり、これにより、該プロモーターが、形質転換および／または（上で規定）動作可能に結合しているヌクレオチド配列−コーディング配列等−の発現を、開始または他の方法により制御／調節することができる
特に好ましいプロモーターには、後に詳述され、かつ／または実施例において用いるもの等の、それ自体公知の細菌内での発現のためのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
選択マーカーは、適切な条件下で、本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（うまく）起こった宿主細胞および／または宿主生物を、形質転換が（うまく）起こらなかった宿主細胞および／または宿主生物と区別できるようなものでなければならない。好ましいが非限定的な、該マーカーのいくつかの例としては、抗生物質（カナマイシンまたはアンピシリン等）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、形質転換されていない細胞または臓器が生存する上で不可欠な、ある種の因子、化合物、および／または（食品）成分を欠いた培地中で、宿主細胞または宿主生物の生存を可能にする遺伝子がある。
リーダー配列は、目的とする宿主細胞または宿主生物において、所望の翻訳後修飾を可能にし、かつ／または転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の位置またはオルガネラに配向させるような配列である。リーダー配列は、該細胞から発現生成物を分泌させてもよい。該ものとして、リーダー配列は、宿主細胞または宿主生物中で動作可能な任意のプロ配列またはプレプロ配列であってよい。リーダー配列は、細菌細胞中で発現する必要はない。
発現マーカーまたはレポーター遺伝子は、宿主細胞または宿主生物中で、遺伝子構造物の発現（遺伝子またはヌクレオチド配列の存在）を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、細胞の特定の部位またはオルガネラ、および／または多細胞生物における特定の細胞、組織、臓器、または部位に局在化させてもよい。該レポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列との融合タンパク質として発現されてもよい。好ましいが非限定的ないくつかの例には、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が含まれる。
好ましくは、本発明のナノボディにおいて：
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＧＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＳＹＴＬＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＧＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＮＹＮＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ、（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＳＳＡＭＡ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＶＶＤＧＫＲＡＰ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＹＮＴＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３、は（１）ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＡＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＩＧＴＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
− ＣＤＲ１が、（１）ＹＮＰＭＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択される場合は、ＣＤＲ２は、（１）ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；
からなるグループから選択され、およびＣＤＲ３は、（１）ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ；（２）前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；（３）前記アミノ酸配列と３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列；からなるグループから選択され、
（１）任意のアミノ酸置換が好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比較した場合、好ましくアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
特に、本発明のｖＷＦに対するナノボディは、以下の構造を持つことができ、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４をそれぞれ示し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３をそれぞれ示し：
ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる１０８番目の位置のアミノ酸残基はＱであり；
および／または：
ｉｉ）Ｋａｂａｔナンバリングによる４４番目の位置のアミノ酸残基はＥであり、Ｋａｂａｔナンバリングによる４５番目の位置のアミノ酸残基はＲであり；
および／または：
ｉｉｉ）Ｋａｂａｔのナンバリングによる１０３番目の位置のアミノ酸残基はＰ、Ｒ、およびＳからなるグループ、特にＲおよびＳからなるグループから選択され；
および：
ｉｖ）ＣＤＲ１が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＮＹＧＭＧ ［配列番号：１５］
ＳＹＴＬＧ ［配列番号：１６］
ＮＹＮＭＧ ［配列番号：１７］
ＳＳＡＭＡ ［配列番号：１８］
ＹＹＮＴＧ ［配列番号：１９］
ＩＧＡＭＧ ［配列番号：２０］
ＩＧＴＭＧ ［配列番号：２１］
ＹＮＰＭＧ ［配列番号：２２］
および：
ｖ）ＣＤＲ２が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＩＳＷＳＧＴＹＴＡＹＳＤＮＶＫＧ ［配列番号：２３］
ＧＩＳＷＳＧＶＳＴＤＹＡＥＦＡＫＧ ［配列番号：２４］
ＴＳＩＳＷＳＧＳＹＴＡＹＡＤＮＶＫＧ ［配列番号：２５］
ＳＩＳＷＳＧＭＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧ ［配列番号：２６］
ＴＩＴＳＧＧＲＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２７］
ＡＩＳＷＳＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：２８］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＰＶＫＧ ［配列番号：２９］
ＴＩＴＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：３０］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ ［配列番号：３１］
ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ ［配列番号：３２］
および：
ｖｉ）ＣＤＲ３が、以下のアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列である。
ＱＳＲＹＲＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３３］
ＬＧＲＹＲＳＮＷＲＮＩＧＱＹＤＹ ［配列番号：３４］
ＱＳＲＹＳＳＮＹＹＤＨＤＤＫＹＡＹ ［配列番号：３５］
ＳＮＲＹＲＴＨＴＴＱＡＭＹＮＹ ［配列番号：３６］
ＶＶＤＧＫＲＡＰ ［配列番号：３７］
ＮＲＲＱＫＴＶＱＭＧＥＲＡＹＤＹ ［配列番号：３８］
ＮＬＫＱＧＳＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：３９］
ＮＬＫＱＧＤＹＧＹＲＦＮＤＹ ［配列番号：４０］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ ［配列番号：４１］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４２］
ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ ［配列番号：４３］
発現マーカーまたはレポーター遺伝子は、宿主細胞または宿主生物中で、遺伝子構造物の発現（遺伝子またはヌクレオチド配列の存在）を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、細胞の特定の部位またはオルガネラ、および／または多細胞生物における特定の細胞、組織、臓器、または部位に局在化させてもよい。該レポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列との融合タンパク質として発現されてもよい。好ましいが非限定的ないくつかの例には、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が含まれる。
好適なプロモーター、ターミネーター、および他の要素の好ましいが非限定的ないくつかの例には、下記の実施例で用いられているものが含まれる。
ターミネーター、転写および／または翻訳エンハンサーおよび／または組込み因子等の、本発明の遺伝子構造物中に存在する／用いることができるプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及び他の要素についての（他の）非限定的ないくつかの例については、上述のSambrookら、およびAubuselらによるハンドブック、および国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９６／２３８１０号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９５／２１１９１号、国際公開第９７／１１０９４号、国際公開第９７／４２３２０号、国際公開第９８／０６７３７号、国際公開第９８／２１３５５号、米国特許第６，２０７，４１０号、米国特許第５，６９３，４９２、および欧州特許第１ ０８５ ０８９号に示されたものを参照されたい。他の例は当業者に明らかである。上述の一般的な背景技術に関する参考文献および後述する参考文献も参照されたい。
本発明の遺伝子構造物は、通常、例えば、上述のSambrookら、およびAusubelらによる一般的なハンドブックに記載の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を、1つ以上の上述の他の要素と適切に連結させることにより得ることができる。
しばしば、本発明の遺伝子構造物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体公知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的ないくつかの例としては、実施例において用いるもの、および後述するものがある。
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子構造物は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを発現および／または産生させるための、宿主細胞または宿主生物の形質転換に用いることができる。好適な宿主または宿主細胞は、当業者に明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、または真核細胞もしくは細胞株、または、例えば下記の任意の好適な真菌、原核、または真核生物：
− 大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の菌株、蛍光菌等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、枯草菌またはブレビス菌等のバチルス属の菌株、ストレプトミセスリビダンス等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカスカルノザス等のブドウ球菌の菌株、および乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌が挙げられるが、これらに限定されない細菌株；
− トリコデルマリーゼイ等のトリコデルマ属、ニューロスポラクラッサ等のニューロスポラ属、ソルダリアマクロスポラ等のソルダリア属、アスペルギルスニガーまたはアスペルギルスソーヤ等のアスペルギルス属、または他の糸状菌由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない真菌細胞；
− 出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセスポンベ等のシゾサッカロミセス属、ピチアパストリスまたはピチアメタノリカ等のピチア属、ハンセヌラポリモルファ等のハンセヌラ属、クルイベロミセスラクティス等のクルイベロミセス属、Arxulaadeninivorans等のArxula属、ヤロウィアリポリチカ等のヤロウィア属由来の細胞
が挙げられるが、これらに限定されない酵母細胞；
− アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞；
− シロイチモンジヨトウSF9およびSF21細胞等の鱗翅目より誘導された細胞／細胞株、またはシュナイダー細胞およびKc細胞等のショウジョウバエより誘導された細胞／細胞株等の昆虫より誘導された細胞または細胞株；
− タバコ等の植物または植物細胞；および／または
− CHO細胞、BHK細胞（BHK-21細胞等）、およびHeLa細胞、COS細胞（COS-7細胞等）、およびPER C6細胞等のヒトから誘導された細胞または細胞株を含むがこれらに限定されない、ヒト、哺乳類から誘導された細胞または細胞株等の哺乳類細胞または細胞株；
および抗体および抗体断片（（単一の）抗体領域およびｓｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）を発現および産生することが公知な他の宿主または宿主細胞であってよく、これらは当業者に明らかである。上で引用した一般背景技術に関する文献および、例えば、国際公開第９４／２９４５７号、国際公開第９６／３４１０３号、国際公開第９９／４２０７７号、Frenkenら、（1998）、上掲、RiechmannおよびMuyldermans、（1999）、上掲、van der Linden、（2000）、上掲、Thomassen ら（2002）、上掲、Joostenら、（2003）、上掲、Joostenら、（2005）、上掲、および本明細書でさらに引用した文献を参照されたい。
本発明のナノボディおよびポリペプチドは、予防および／または治療（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１種類以上の細胞、組織、または臓器に導入し、発現させることができる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えば、このように（例えば、リポソームを用いて）、または適切な（例えば、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス等のパルボウィルス等のレトロウィルスより誘導された）遺伝子治療用ベクターに挿入後、等の任意の好適な方法を用いて細胞または組織に導入することができる。当業者に明らかであるように、該遺伝子治療は、本発明の核酸または本発明の核酸をコードする適切な遺伝子治療用ベクターを、患者または患者の特定の細胞または特定の組織もしくは臓器、に投与することにより患者の体内において、インビボおよび／またはその場で行うことができ、または好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物または組織生検試料等の、治療対象となる患者より採取された）細胞を、本発明のヌクレオチド配列をインビトロで治療し、次いで患者の体内に好適に（再）導入することができる。これらは全て、Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano, Nature F Medicine 2 （1996）, 534-539、Schaper, Circ. Res. 79 （1996）, 911-919、Anderson, Science 256 （1992）,808-813、Verma, Nature 389 （1994）,239、Isner, Lancet 348 （1996）,370-374、Muhlhauser, Circ. Res. 77 （1995）,1077-1086、Onodera, Blood 91; （1998）,30- 36、Verma, Gene Ther. 5 （1998）,692-699、Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 （1997）, 289-292、Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 （1998）, 2243-51、Wang, Nature Medicine 2 （1996）,714-716、国際公開第９４／２９４６９号、国際公開第９７／００９５７号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９５４６６、またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 （1996）, 635-640によって当業者に周知の遺伝子治療用ベクター、手法、およびデリバリーシステムを用いて行うことができる。例えば、ｓｃＦｖ断片（Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 （2003））およびダイアボディー（Blancoら、J. Immunol, 171, 1070-1077 （2003））のその場発現について報告がなされている。
細胞中でのナノボディの発現のために、これらは、例えば、国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、および米国特許第７００４９４０号、国際公開第０３／０１４９６０号、Cattaneo, A. & Biocca, S. （1997） Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; and in Kontermann, Methods 34, （2004）, 163-170に記載の、いわゆる「イントラボディー（細胞内発現抗体）」として発現させることができる。
産生のために、本発明のナノボディまたはポリペプチドを、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギまたはヒツジの母乳等のトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳類に導入する一般的な手法については、例えば、米国特許第６，７４１，９５７号、米国特許第６，３０４，４８９号、および米国特許第６，８４９，９９２号を参照されたい）、または植物もしくは葉、花、果実、種、根、塊茎等の植物の一部分（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、またはアルファルファ）、または、例えば、カイコガの蛹中に産生させることができる。
さらに、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、細胞を含まない発現系で発現および／または産生させてもよく、該系の好適な例は当業者に明らかである。好ましいが非限定的ないくつかの例には、小麦麦芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、またはZubayの方法による大腸菌を用いた系が含まれる。
上述のように、ナノボディを用いる利点の１つは、これを用いるポリペプチドが、適切な細菌系、および適切な細菌発現系における発現によって調製することができる点であり、ベクター、宿主細胞、調節要素等が、例えば上述した参考文献によって当業者に明らかである。しかし、本発明は最も広い意味で細菌系での発現に限定されないことに留意されたい。
好ましくは、本発明において、本発明のポリペプチドを、医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（インビボまたはインビトロ）発現系が用いられ、該発現系も当業者に明らかである。これも当業者に明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することもできる。
工業的スケールでの製造において、ナノボディまたはナノボディを含む治療剤の（工業的）製造のために好ましい非相同性宿主細胞としては、大スケールでの発現／産生／培養、特に大スケールでの医薬上の発現／産生／培養に適した大腸菌、ピチアパストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。該菌株の好ましい例は、当業者に明らかである。該菌株および産生／発現系は、Biovitrum社（スウェーデン、ウプサラ）等の企業より市販されている。
あるいは、哺乳類細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大スケールでの発現／産生／培養、特に大スケールでの医薬上の発現／産生／培養のために用いることができる。該菌株および産生／発現系も、上述の企業等より市販されている。
特定の発現系の選択は、ある発現後修飾、より具体的にはグリコシル化に一部依存する。グリコシル化が望ましいあるいは必要とされる、ナノボディを含む組換えタンパク質の産生は、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類宿主細胞を必要とする。得られるグリコシル化パターン（種類、数、及び残基が結合する位置）が、発現に用いる細胞または細胞株に依存することは、当業者に明らかである。好ましくは、ヒト細胞もしくはヒト細胞株（本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）、または本質的に、および／または機能的にヒトのグリコシル化パターンと同一、または少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与える別の哺乳類の細胞株を用いる。通常、大腸菌等の原核細胞はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等原核細胞は、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンを与える。それにもかかわらず、上述の宿主細胞および発現系が、得ようとする所望のナノボディまたはタンパク質に応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
したがって、本発明の非限定的な一実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドはグリコシル化される。本発明の非限定的な別の実施態様により、本発明のナノボディおよびポリペプチドはグリコシル化されない。
本発明の好ましいが非限定的な一実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細菌細胞中、具体的には大スケールでの医薬上の製造に適した、上述の細胞株等の細菌細胞中で製造される。
本発明の好ましいが非限定的な別の実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、酵母細胞中、具体的には大スケールでの医薬上の製造に適した、上述の細胞株等の酵母細胞中で製造される。
本発明の好ましいが非限定的なさらに別の実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、哺乳類細胞中、具体的には大スケールでの医薬上の製造に適した、上述の細胞株等の哺乳類細胞中で製造される。
宿主細胞中での発現を、本発明のナノボディおよびタンパク質の製造に用いる場合、本発明のナノボディおよびタンパク質は、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生され、次いで細胞から、場合によってはさらに単離され、場合によっては精製してもよく、または細胞外（例えば、細胞を培養する培地中）で産生され、次いで細胞から、場合によってはさらに単離され、場合によっては精製してもよい。真核宿主細胞を用いる場合、得られるナノボディまたはタンパク質のさらなる単離および下流工程での処理が大幅に容易になるため、細胞外産生が好ましい。通常、大腸菌の菌株等の上述の細菌細胞は、毒素および血液毒等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌しないため、大腸菌における分泌物産生とは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を転移させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して、いくつかの利点を有している。例えば、分泌タンパク質のＮ−末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌信号配列の切断後の天然遺伝産物と同一であってよい。また、ペリプラズムにおいて、細胞質よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中においては、混入するタンパク質が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。他の利点は、ペリプラズムは細胞質よりもより酸化的な環境をもたらすため、正しい位置にジスルフィド結合を形成することができるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性の凝集物中に見られることが多い。これらの封入体は、細胞質中にもペリプラズム中にも存在することができ、これらの封入体からの生理活性タンパク質の回収は、変性／リフォールディング過程を必要とする。治療効果を有するタンパク質等の多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。あるいは、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、具体的には本発明のナノボディまたはポリペプチドを分泌するように遺伝的に改変された細菌の組換え菌株を用いることができる。
したがって、本発明の非限定的な一実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細胞内で産生され宿主細胞、具体的には細菌細胞または細菌細胞中の封入体から単離されたナノボディまたはポリペプチドであってよい。本発明の別の非限定的な実施態様により、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたナノボディまたはポリペプチドであってよい。
これらの宿主細胞で用いるためのプロモーターの、好ましいが非限定的ないくつかの例としては、以下が含まれ、
− 大腸菌中での発現のための：lacプロモーター（lac5プロモーター等のこれらの誘導体）、アラビノースプロモーター、λファージの左側（ＰＬ）および右側（ＰＲ）プロモーター、trpオペロンのプロモーター、ハイブリッドlac/trpプロモーター（tacおよびtrc）、T7-プロモーター（より具体的にはT7-ファージ遺伝子１０のプロモーター）、
および他のT-ファージプロモーター、Tn10テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、1つ以上の外来制御オペレーター配列を含む上述のプロモーターの組換え変異体；
− 出芽酵母中での発現のための： ADH1（アルコール脱水素酵素１）、ENO（エノラーゼ）、CYC1（チトクロームｃ異性化酵素１）、GAPDH（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水酵素）、PGK1（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、PYK1（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター、GAL1,10,7（ガラクトース代謝酵素）、ADH2（アルコール脱水素酵素２）、PHO5（酸ホスファターゼ）、CUP1（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター、CaMV（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター）の外来プロモーター；
− ピチアパストリスでの発現のための：AOX1プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
− 哺乳類細胞での発現のための：ヒトサイトメガロウィルス（hCMV）前初期エンハンサー／プロモーター、プロモーターがTetリプレッサーによって制御可能なように２つのテトラサイクリンオペレーター配列を含むヒトサイトメガロウィルス（hCMV）
前初期プロモーター変異体、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（TK）プロモーター、ラウス肉腫ウィルスの長い末端反復（RSV LTR）エンハンサー／プロモーター、
ヒト、チンパンジー、マウス、またはラット由来の伸長因子１α（ｈEF-1α）プロモーター、SV40初期プロモーター、HIV-1の長い末端反復プロモーター、βアクチン
プロモーター；
これらの宿主細胞で用いるためのベクターの、好ましいが非限定的ないくつかの例としては、以下が含まれ：
− 哺乳類細胞中での発現のためのベクター：pMAMneo（Clontech）、pcDNA3（Invitrogen）, pMC1neo （Stratagene）、pSG5 （Stratagene）、EBO-pSV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1（8-2）（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo（342-12）（ATCC 37224）、pRSVgpt （ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2-dhfr（ATCC 37146）、
pUCTag（ATCC 37460）および1ZD35（ATCC 37565）、ならびにアデノウィルスに基づくもの等のウィルスに基づく発現系；
− 細菌細胞中での発現のためのベクター：pET ベクター（Novagen）およびpQEベクター（Qiagen）；
− 酵母または別の真菌細胞中での発現のためのベクター：pYES2（Invitrogen）およびピチア発現ベクター（Invitrogen）；
− 昆虫細胞中での発現のためのベクター：pBlueBacII（Invitrogen）および別のバキュロウィルスベクター；
− 植物または植物細胞中での発現のためのベクター：例えば、カリフラワーモザイクウィルスまたはタバコモザイクウィルス、アグロバクチリウムの好適な菌株またはTi-プラスミドに基づくベクター；
これらの宿主細胞で用いるための分泌配列の、好ましいが非限定的ないくつかの例としては、以下が含まれる：
− 大腸菌等の細菌細胞中での発現のための：PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等、TATシグナルペプチド、ヘモリシン
Ｃ−末端分泌シグナル；
− 酵母中での発現のための：α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（pho1）、インベルターゼ（Suc）；
− 哺乳類細胞での発現のための：標的タンパク質が真核細胞由来である場合には、固有シグナル、マウスＩｇκ鎖V-J2-Cシグナルペプチド等；
本発明の宿主または宿主細胞の形質転換のために好適な手法は当業者に明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物および用いる遺伝子構造物に依存する。ここでも、上述のハンドブックおよび特許出願を参照されたい。
形質転換後、本発明の核酸／遺伝子構造物によってうまく形質転換された宿主細胞または宿主生物を検出および選択する工程を行うことができる。この工程は、例えば、本発明の遺伝子構造物に含まれる選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、または、例えば、特異的抗体を用いで本発明のアミノ酸配列を検出する工程であってよい。
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態を取ることができる）または宿主生物（安定な変異体系列または株の形態を取ることができる）は、本発明の別の態様をなす。
好ましくは、これらの宿主生物または宿主生物（宿主生物の場合には、その少なくとも１個の細胞、部位、組織または臓器）は、本発明のアミノ酸配列を発現し、または（少なくとも）（例えば、好適な条件下で）発現することができる。本発明はまた、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、子孫および／または次の世代を含んでおり、それらは、例えば、細胞分裂または有性もしくは無性生殖によりえられるものであってよい。
本発明のアミノ酸配列を発現させ／得るために、形質転換された宿主生物は、（所望の）アミノ酸配列が発現／産生されるような条件下で飼育、維持および／または培養される。好適な条件は当業者に明らかであり、通常、用いる宿主細胞／生物、および（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する制御因子に依存する。この場合にも、上述のハンドブックおよび特許出願における、本発明の遺伝子構造物に関連する段落を参照されたい。
通常、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌および／または好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、および場合によっては好適な誘導因子または化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導因子により制御される場合）が含まれ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、該条件下で、本発明のアミノ酸配列は、連続的、一時的、または適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
本発明のアミノ酸配列は、まず（上述の）未成熟型として発現され、次いで、用いる宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよい。また、本発明のアミノ酸配列は、この場合にも、用いる宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
本発明のアミノ酸配列は、次いで、宿主細胞／宿主生物から、および／または該宿主細胞／宿主生物が培養される培地から、（分取）クロマトグラフィー法、および／または電気泳動法、分別沈殿法、（例えば、本発明のポリペプチドに融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いた）アフィニティー法、および／または（単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いた）分取免疫法等の、公知のタンパク質の単離および／または精製手法を用いて単離される
通常、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１種類の本発明のポリペプチド、少なくとも１種類の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、および／または補助剤を含み、１種類以上の他の医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を場合によっては含む、医薬品として製剤することができる。非限定的な例により、該製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内もしくは皮下注射、または静脈内点滴等による）のため、全身投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、座剤等による投与のために適した形態を取ることができる。投与の方法、およびその製剤で用いるための方法および担体に応じて、固体、半固体または液体であってよい、該好適な投与形態は、当業者に明らかであり、以下に詳述する。
したがって、さらなる態様では、本発明は、少なくとも１種類の本発明のナノボディまたは本発明のポリペプチドおよび少なくとも１種類の好適な担体（獣医学的使用に好適な担体）を含み、場合によっては１種類以上の他の活性物質を含む医薬組成物に関する。
本発明の一実施態様は、vWF、vWFのA1領域、活性化vWFのA1領域、vWFのA3領域のうち任意のものに対する少なくとも１種類の本発明のナノボディを含むポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、本発明のナノボディが、活性化vWFのA1領域に対して指向性を有し、血栓形成部位における活性化vWFのコンホメーションを特異的に認識するが、循環している不活性型のvWFに結合しない、上述のポリペプチド構造物である。
本発明のナノボディは、免疫応答を誘発することができる断片等の、vWFの断片、vWFのA1領域、活性型vWFのA1領域、vWFのA3領域に対して指向性を有してもよい。標的も、vWFの断片、vWFのA1領域、活性型vWFのA1領域、vWFのA3領域であり、「親」全長標的に対して構築された本発明のナノボディに結合することができる。
本明細書で用いる場合、断片は、１００％未満（例えば、９９%、９０%、８０%、７０%、６０%、５０%、４０%、３０%、２０%、１０%等）であるが、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のアミノ酸を含む配列を意味する。断片は、１×１０−６Mまたはそれよりも高い親和性で対象となる相互作用が維持されるような長さを有している。
本明細書で用いる場合、断片とは、場合によっては、標的が、野生型の標的に対して生成された本発明のナノボディに結合する能力をほとんど変化させない1つ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換されたものも意味する。挿入、欠失または置換されるアミノ酸の数は、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０アミノ酸以下である。
標的に対する本発明のナノボディとは、一般に、標的に対し、１０−６Mよりも高い親和性で結合することができる本発明のナノボディを意味する。
本発明の別の実施形態は、少なくとも１種類の本発明のナノボディがヒト化配列である上述のポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、少なくとも１種類の本発明のナノボディがラクダ科のVHH抗体である上述のポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、本発明のナノボディが、本発明の全長ナノボディの相同配列、機能部位、または相同配列の機能部位である上述のポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、ポリペプチド構造物が、該ポリペプチド構造物の相同配列、その機能部位、またはその相同配列の機能部位である上述のポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、１種類以上の血清タンパク質、特に１種類以上のヒト血清タンパク質に対する少なくとも１種類の本発明のナノボディをさらに含む上述のポリペプチド構造物である。
本発明の別の実施形態は、該少なくとも１種類の（ヒト）血清タンパク質が、（ヒト）血清アルブミン、（ヒト）血清免疫アルブミン、（ヒト）チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、または（ヒト）フィブリノーゲンまたはこれらの断片のうち任意のものである、上述のポリペプチド構造物である。
本発明の具体的であるが非限定的な態様によると、本発明のポリペプチドは、１種類以上の本発明のナノボディ以外に、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１種類のナノボディを含んでいる。ヒト血清アルブミンに対するこれらのナノボディは、国際公開第０４／０６２５５１号に一般的に記載されているもの、または同公報に引用されている参考文献に記載されているものであってもよいが、特に好ましいが非限定的な実施態様によると、ヒト血清アルブミンに対する該ナノボディは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、FR1〜FR4）、および３つの相補性決定領域（それぞれ、CDR1〜CDR3）を有し：
ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＦＧＭＳ ［配列番号：４４］
ＬＮＬＭＧ ［配列番号：４５］
ＩＮＬＬＧ ［配列番号：４６］
ＮＹＷＭＹ ［配列番号：４７］
および／または上記のアミノ酸の１つと２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：４８］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：４９］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：５０］
ＳＩＮＧＲＤＤＴＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：５１］
ＡＩＳＡＤＳＳＴＫＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：５２］
ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：５３］
ＲＩＳＴＧＧＧＹＳＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号：５４］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および：
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＤＲＥＡＱＶＤＴＬＤＦＤＹ ［配列番号：５５］
または、上記のアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず；
または以下からなるグループから選択されるアミノ酸配列であり：
ＧＧＳＬＳＲ ［配列番号：５６］
ＲＲＴＷＨＳＥＬ ［配列番号：５７］
ＧＲＳＶＳＲＳ ［配列番号：５８］
ＧＲＧＳＰ ［配列番号：５９］
および／または上記のアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にアミノ酸配列からなる、もしくはアミノ酸配列であり：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
別の態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、FR1〜FR4）、および３つの相補性決定領域（それぞれ、CDR1〜CDR3）を有し、下記のCDR1、CDR2、およびCDR3のそれぞれの組み合わせのうち１つを有するナノボディからなる群より選択される、vWFに対するナノボディに関する。
Figure 0004986997
上述のCDRを有する本発明のナノボディにおいて、それぞれのCDRは、上述のCDRと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列からなるグループから選択されるＣＤＲにより置換でき；
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まず、
および／または上述のCDRアミノ酸の１つと３つ、２つまたは１つのみ（前章に提示）「アミノ酸の差違」（本明細書で規定）を有しているアミノ酸配列からなるグループから選択されるＣＤＲにより置換でき：
（１）任意のアミノ酸置換が、好ましくは保存アミノ酸の置換（本明細書で規定）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列が、上記のアミノ酸配列と比較した場合、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の欠失または挿入を含まない。
しかし、上述のCDRの組み合わせを含む本発明のナノボディのうち、上に列挙した１種類以上のCDRを含むナノボディが特に好ましく、上に列挙した２種類以上のCDRを含むナノボディがよりさらに好ましく、上に列挙した３種類以上のCDRを含むナノボディが特に最も好ましい。
ヒト血清アルブミンに対するこれらのナノボディにおいて、フレームワーク領域FR1〜FR4は、好ましくは、本発明のナノボディについて上で規定されたものである。
特に好ましいヒト血清アルブミンに対するナノボディは、配列番号１０７〜１２１からなる群より選択される。これらは、本出願人らによる、２００５年５月１８日出願の、係属中の、発明の名称「Improved Nanobodies(商標) against Tumor Necrosis Factor-alpha」に関する米国特許仮出願に記載の、配列番号６１〜６７、配列番号８７〜８９、および配列番号１００〜１０４のヒト血清アルブミンに対するナノボディに対応する。
より一般的には、本発明における使用に好適な、血清アルブミンに対するナノボディは、２００６年５月１７日出願の、発明の名称「serum albumin binding proteins」に関する国際特許出願に記載されている。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物をコードする核酸である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物および少なくとも１種類の血栓溶解剤を含む、患者への同時投与、分離投与、または連続投与のための組成物である。
本発明の別の実施態様は、該血栓溶解剤が、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、一本鎖ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびアシルプラスミノーゲンストレプトキナーゼ複合体のうち任意のものである、上述の組成物である。
本発明の別の実施態様は、血小板媒介凝集またはその機能不全の治療、予防、および／または軽減のために用いる、上述のポリペプチド構造物、または上述の核酸、または上述の組成物である。
本発明の別の実施態様は、血小板媒介凝集またはその機能不全の治療、予防、および／または軽減のための薬剤の調製への、上述のポリペプチド構造物、または上述の核酸、または上述の組成物の使用である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物、または、該疾患が、一過性脳虚血発作、不安定または安定狭心症、狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈狭窄症、再狭窄、冠状動脈バイパス移植または冠状動脈弁置換、および血管形成、ステントグラフト留置術、頸動脈内膜剥離術、またはアテローム切除術等の冠状動脈インターベンションのうち任意のものである、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物の使用である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物、または、該疾患が、非梗塞性血栓の形成、梗塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠状動脈梗塞、再狭窄、PCTAまたはステントグラフト留置術後の再狭窄、狭窄動脈における血栓形成、血管形成後の過形成、アテローム切除術または動脈ステント留置、血管系における閉塞症または病変動脈の開通性の欠如のうち任意のものである、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物の使用である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物、または、該疾患が、高せん断条件下におけるプラークまたは血栓形成である、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物の使用である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物、または、該ポリペプチド構造物、が、静脈内、皮下、経口、舌下、局所、経鼻、経膣、直腸、または吸入投与される、上述のポリペプチド構造物、核酸、もしくは組成物の使用である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物もしくは該ポリペプチド構造物をコードする核酸、または上述の組成物、および医薬として許容されるビヒクルを含む組成物である。
本発明の別の実施態様は、
（ａ）上述のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養する工程と、
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収する工程を含む、上述のポリペプチドを製造する方法である。
本発明の別の実施態様は、該細胞が細菌または酵母である上述の方法である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物で機器をコーティングする工程を含む、侵襲部位周辺の血小板媒介凝集を防止するための侵襲的な医療機器の処理方法である。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物でコーティングされた、侵襲部位周辺の血小板媒介凝集を回避するための医療機器である。
本発明の別の実施態様は、
（ａ）上述のポリペプチド構造物を、調節剤の候補の存在下または非存在下、該ポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、その標的に対応するポリペプチドまたはその断片に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドとの結合を測定し、該調節剤の候補の存在下において、該調節剤の候補の非存在下における結合に対する結合の減少により、該調節剤の候補が血小板媒介凝集を調節する薬剤として同定される工程を含む血小板媒介凝集を調節する薬剤の同定方法である。
本発明の別の実施態様は、上述の方法により、血小板媒介凝集を調節する薬剤をスクリーニングするためのキットである。
本発明の別の実施態様は、上述の方法により、血小板媒介凝集を調節する薬剤であると同定された未知の薬剤である。
本発明の別の実施態様は、
（ａ）サンプルを上述のポリペプチド構造物と接触させる工程と、
（ｂ）該ポリペプチド構造物の該サンプルに対する結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）における結合を標準と比較した場合、該サンプルに対する結合との差が、血小板媒介凝集の機能不全を特徴とする疾患または障害の存在を示す診断結果である工程を含む、血小板媒介凝集の機能不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法である。
本発明の別の実施態様は、上述の方法により、血小板媒介凝集の機能不全を特徴とする疾患または障害の診断のためにスクリーニングするためのキットである。
本発明の別の実施態様は、上述のポリペプチド構造物を含む、上述のキットである。
本発明のポリペプチドにおいて、標的に対して指向性を有する１種類以上の本発明のナノボディは、同一の配列を有していてよい。あるいは、それらは同一の配列を有していなくてもよい。同一の配列を共有していないが、同一の標的、またはその断片、その１種類以上の抗原に対して指向性を有する本発明の抗標的ナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
任意の２種類の本発明のナノボディが、異なるエピトープ／標的、すなわち、vWF、vWFのA1領域、活性化vWFのA1領域、vWFのA3領域のうち任意のものに対して指向性を有する、２種類以上の本発明のナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本発明の別の態様をなす。
本発明の別の態様は、vWF、vWFのA1領域、活性化vWFのA1領域に対する本発明のナノボディと、vWFのA3領域に対する別のナノボディを含む、本発明の二特異性ポリペプチドである。本発明の該二特異性ポリペプチドは、vWFとコラーゲンとの相互作用、およびvWFと血小板との相互作用を阻害する。
本発明のある態様によると、本発明のポリペプチドは、結合した２種類以上の本発明のナノボディを含んでいてよい。本発明のナノボディは、配列が同一であり、同一の標的または抗原に対して指向性を有するものであってよい。結合したVHHの数に応じて、多価VHHは、二特異性（2 VHH）、三特異性（3 VHH）、四特異性（4 VHH）であってよく、またはより多価の分子を有していてよい。
本発明はまた、それぞれ、患者の血清タンパク質に対して指向性を有する１種類以上の本発明のナノボディをさらに含む本発明のポリペプチドが、驚くべきことに、該患者の体内循環において、該構造物の一部ではない本発明の抗標的ナノボディと比べて、非常に長い半減期を有するという発見にも関する。さらに、該構造物は、マウス中における高い安定性の保持、非常に高いｐＨ耐性、高温安定性、および高い標的親和性等の、VHHと同一の好ましい性質を示すことを発見した。
血清タンパク質は、患者の血清中に見出される任意の好適な血清タンパク質、またはその断片であってよい。本発明のある態様において、血清タンパク質は、血清アルブミン、血清免疫アルブミン、チロキシン結合タンパク質、トランスフェリン、またはフィブリノーゲンである。効果的な治療のために必要な半減期、および／または標的抗原等の目的とされる使用に応じて、VHHの結合の相手方は、上述の血清タンパク質の１つを対象とすることができる。
該構造物は、患者の血清中で数日間にわたって循環することが可能であるため、治療の回数や、患者の不便を減少させることにより、治療コストを低減させる。さらに、本明細書に開示した本発明のポリペプチドの半減期を、構造物中に存在する、数種類の本発明の抗血清タンパク質ナノボディにより制御することができることは、本発明の一態様である。半減期が制御可能であることは、例えば、本発明の治療効果を有するポリペプチドの定期投与への応用等のいくつかの状況下において望ましい。
本発明の別の態様は、さらに血栓溶解剤を含む上述の本発明のポリペプチドである。
該血栓溶解剤は、本発明のナノボディに、共有または非共有手段を介して、共有結合または非共有結合していてもよい。該共有手段については後述する。非共有手段には、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用等のタンパク質の相互作用、または免疫結合を介した相互作用が含まれる。
あるいは、血栓溶解剤は、本発明のポリペプチドと、同時、分離、または連続投与することができる。
本発明の別の態様は、少なくとも１種類の本発明のポリペプチドと、少なくとも１種類の血栓溶解剤を含む、患者への同時、分離、または連続投与のための組成物である。
本発明の一態様は、有効量の少なくとも１種類の本発明のポリペプチドと、少なくとも１種類の血栓溶解剤を、個人に同時、分離または連続投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法である。
本発明の別の態様は、少なくとも１種類の本発明のポリペプチドと、少なくとも１種類の血栓溶解剤を含む、患者への同時、分離、または連続投与のためのキットである。キットを、本発明によって用いることができることは、本発明の態様である。キットを、本明細書に記載の疾患の治療に用いることができることは、本発明の態様である。
同時投与とは、ポリペプチドおよび血栓溶解剤を、患者に同時に投与することを意味する。例えば、該成分を含む混合物または組成物として。例としては、それぞれの製剤が対象となる成分を含む、静脈内投与される溶液剤、錠剤、液剤、局所クリーム等が挙げられるが、これらに限定されない。
分離投与とは、ポリペプチドおよび血栓溶解剤を、患者に同時に、またはほぼ同時に投与することを意味する。成分は、キット中において、別個の、混合されていない製剤として存在する。例えば、ポリペプチドおよび血栓溶解剤は、キット中において、個々の錠剤として存在していてよい。錠剤は、双方の錠剤を同時に、または他方の錠剤の直後に一方の錠剤を服用することにより、患者に投与することができる。
連続投与とは、ポリペプチドおよび血栓溶解剤を、連続的に患者に投与することを意味する。ポリペプチドおよび血栓溶解剤は、キット中において、別個の、混合されていない製剤として存在している。投与の間に、時間間隔が存在する。例えば、ある成分が、ある成分の投与の３３６、３１２、２８８、２６４、２４０、２１６、１９２、１６８、１４４、１２０、９６、７２、４８、２４、２０、１６、１２、８、４、２、１または０．５時間後以内に投与される。
連続投与において、ある成分を、１回または任意の回数、種々の投与法で、別の成分の投与の前および／または後に投与することができる。連続投与を、同時または分離投与と組み合わせることができる。
後述する、本発明のポリペプチドの医学的用途は、本発明のポリペプチドと、少なくとも１種類のポリペプチド血栓溶解剤を含む、上述の患者への同時、分離、および連続投与のための組成物にもあてはまる。
本発明の血栓溶解剤は、例えば、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、一本鎖ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびアシルプラスミノーゲンストレプトキナーゼ複合体を含んでいてよい。
公知の方法または任意の将来の方法を用いて、２種類以上の本発明のナノボディを含む、本明細書に開示の本発明の任意のポリペプチドを形成するために、本発明のナノボディを結合させることができる。例えば、BlattlerらによるBiochemistry 24,1517-1524、欧州特許第２９４７０３号に記載の有機誘導化剤を用いてアミノ酸残基を反応させることによる化学的架橋により、これらを融合させることができる。あるいは、本発明のナノボディを、ＤＮＡレベルで融合、つまり、１種類以上の本発明の抗標的ナノボディ、および１種類以上の本発明の抗血清タンパク質ナノボディを含む本発明の全長ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド構造物を形成することができる。本発明の二価または多価VHHポリペプチドの製造方法は、ＰＣＴ特許出願公開第９６／３４１０３号に開示されている。複数の本発明のナノボディを結合させる方法は、本発明のナノボディをコードする配列を、直接またはペプチドリンカーを介して結合させることによる遺伝子的経路によるものである。例えば、本発明の第１のナノボディのＣ末端を、次の本発明のナノボディのＮ末端に結合させることができる。本発明のナノボディをさらに結合させ、三官能性、四官能性等の機能性構造物を構築するために、この結合様式を拡張することができる。
本明細書に開示の本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の方法または将来的な方法にしたがって当業者が作製してもよい。例えば、VHHは当技術分野で公知の方法を使用して得てもよい。その方法は例えば、ラクダを免疫化し、そこからハイブリドーマを得ることによってか、あるいは当技術分野で公知の分子生物学技術およびファージディスプレイを利用した連続的選択を使用し、本発明のナノボディのライブラリーをクローニングすることによって行う。
ナノボディは単一可変ドメインからなる独特の構造を有する。ラクダ科抗体由来のVHH 分子は、公知の最小の無傷抗原結合ドメインの間に存在し（およそ１５kDa、あるいは通常ＩｇＧよりも１０倍小さい）、したがって緻密組織への送達に非常に適しており、また、血小板媒介凝集の過程に関与するまたはそれを開始する巨大分子間の限定した空間にアクセスするのに非常に適している。
ナノボディはサイズが小さく、よって浸透では有利であるにもかかわらず、該小分子がｖＷＦ （最大６０モノマー）などの大きなポリマーとコラーゲン間の相互作用を該高効率で阻害することが可能であることは、依然として意外であると思われている。ｖＷＦの多量体形態のみが、止血作用上、活性であることが記述されている（Furlan, M,. 1996, Ann. Hematol. 72:341-348）。多量体ｖＷＦのコラーゲンへの結合は、単量体ｖＷＦ断片の結合よりも最大で１００倍高い親和性で起こる。
高せん断力実験の結果から、患者には低用量で投与してもよいことが分かる。したがって、副作用が低いことが期待される（免疫原性または出血の問題など）。
本発明の別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、同じ標的に向けられる本発明の１つ以上のナノボディを含み、さらに同じ標的であるが同じドメインの異なるエピトープに向けられる本発明の１つ以上のナノボディを含む。
本発明の別の実施態様は、同じ標的に向けられた本発明のナノボディの数が２種類以上である本発明のポリペプチドである。
本発明の別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、同じ標的の１つのドメインに向けられる本発明の１つ以上のナノボディを、ならびに同じ標的に向けられるが同じ標的の別のドメインに向けられる本発明の１つ以上のナノボディを含む。異なるドメインの例として、ｖＷＦのＡ１およびＡ３ドメインが可能性としてある。
本発明の非限定的な一態様として、本発明の異種特異的ポリペプチドにおけるＡ１ドメインに向けられた少なくとも一ＶＨＨはｖＷＦの活性的立体構造を認識する。単量体ＶＨＨと比較して本発明の該ポリペプチドは、優れた抗血栓効果を有している可能性がある。かん流実験をフローチャンバー内で行い、高せん断力下で血小板凝集を調べ、本発明のこれらのポリペプチドの効果を検討した。
ラマ、ヒトコブラクダおよびラクダの本発明の天然ナノボディの発見により、新しい種類の治療分子が明らかになった。この分子は、モノクローナル抗体の利点、例えば特異性、低毒性とともに小分子の利点、例えば組織浸透性および安定性を合わせ持っている。不運にも、これらのタンパク質に基づく適当な治療製品の開発は、ラクダ科由来であり、したがってヒト由来ではないいう欠点を有する。非ヒトタンパク質は、ヒト患者に注入すると免疫原となり得るアミノ酸残基を含んでいる。ラクダ科由来ＶＨＨをマウスに注入した場合は免疫原にならないことが研究で分かってはいるが、ラクダ科残基をヒト残基で置換することが好ましい。これらのヒト化ポリペプチドはヒトには実質的に非免疫原性であるが野生型ポリペプチドの親和性および活性を保持していることが好ましい。
ヒト化した結果として、ヒト患者に投与した場合の免疫原性は最小限かまたは存在しないことが好ましい。本発明にしたがってポリペプチドをヒト化することは、ヒト共通配列に見られるようなそれらのヒト対応物によって１つ以上のラクダ科アミノ酸を置換する工程を含み、そこでは、そのポリペプチドがその典型的性質を失うことはなく、すなわちヒト化が、得られたポリペプチドの抗原結合能に著しくは影響を及ぼさないということである。
国際公開第０４／０６２５５１号および本明細書の別の記述には、抗原に対するドメインの元来の親和性を減少させることなく、その免疫原性を減少しながら修飾される可能性がある抗体可変領域（ＶＨＨ）のアミノ酸残基の、いくつかの好ましいが限定的でない例が記載されており、それは異種；異種に投与するのに有用な同定された残基での修飾部位を有するＶＨＨの使用；およびこのように修飾されたＶＨＨに関連している。さらに具体的には、本発明は、修飾ＶＨＨの調製も包含し、ＶＨＨはヒトへの投与、得られたＶＨＨ自体、およびヒト疾患の治療における該「ヒト化」ＶＨＨの使用のために修飾される。
国際公開第０４／０６２５５１号および本明細書の別の記述で述べられているように、ＶＨＨポリペプチドのヒト化は、単一ポリペプチド鎖中の限られた数のアミノ酸の導入および変異誘発しか必要とせず、結合および／または阻害活性が過剰に喪失することがない。これは、２つの鎖、軽鎖および重鎖でのアミノ酸変化の導入および両鎖の集合の防止を必要とするｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２およびＩｇＧのヒト化と対照的である。
ヒト化技術は、以下の残基の単独または組み合わせのいずれかの置換：ＦＲ１位置１、５、２８および３０、ＦＲ２における位置３７、４４、４５および４７での特質アミノ酸、ＦＲ３残基７４、７５、７６、８３、８４、９３および９４、およびＦＲ４における位置１０３、１０４、１０８および１１１；Ｋｏｂａｔ ナンバリングにしたがったナンバリングを含む方法で行ってよい
本発明のナノボディはヒト生殖細胞ＶＨ ＤＰ‐４７への高度の相同性を有する。さらにヒト化は、単一ポリペプチド鎖中の限られた量のアミノ酸の導入および変異誘発もまた含んでよい。これは、２つの鎖、軽鎖および重鎖でのアミノ酸変化の導入および両鎖の集合の防止を必要とするｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２およびＩｇＧのヒト化と対照的である。
該ポリペプチドはＦＲ２中のヒト様残基を含んでいる。ヒト化は位置１および５でのＦＲ１中の残基の変異誘発も含んでよく、この残基はレパートリーのクローン化に使用するプライマーによって導入され、ラマ配列では自然発生しない。これらの残基を変異誘発しても、結合および／または阻害活性が喪失することはなかった。ＦＲ１のヒト化は位置２８および３０の変異誘発も必要とした。これらの残基が変異誘発してもまた、結合および／または阻害活性が喪失することはなかった。
ヒト化はまた、位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、９４のＦＲ３における残基の変異誘発を含む。これらの残基を変異誘発しても、結合および／または阻害活性が喪失することはなかった。
ヒト化はまた、位置１０４、１０８および１１１のＦＲ４における残基の変異誘発を含んでよい。Ｑ１０８Ｌを変異誘発すると、大腸菌の産生レベルは低下した。位置１０８はラクダ科ＶＨＨで溶剤に暴露しており、一方、ヒト抗体では、この位置はＶＨ‐ＶＬ界面に埋め込む（Spinelli, 1996; Nieba, 1997）。単離ＶＨで位置１０８は溶剤に暴露している。極性の非荷電Ｇｌｎの替わりに非極性疎水性Ｌｅｕを導入すると、分子の固有の折り畳み性／安定性が顕著に影響されることが可能となる。
本発明の一実施態様には、以下のステップを含むＶＨＨをヒト化する方法がある：
（ａ）以下の残基の単独または組み合わせのいずれかの置換：
ＦＲ１位置１、５、２８および３０、
ＦＲ２における位置３７、４４、４５および４７での特質アミノ酸、
ＦＲ３残基７４、７５、７６、８３、８４、９３および９４、
およびＦＲ４における位置１０３、１０４、１０８および１１１；
Ｋｏｂａｔ ナンバリングにしたがったナンバリング
該ヒト化配列の例は後述しており、添付の配列リストにある。
血小板関連凝集の調節を必要とする病状の治療として、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等の起源由来の抗体、およびそのヒト化誘導体を使用することは、いくつかの理由から問題をはらんでいる。従来の抗体は室温では安定的でなく、また、時間と費用に寄与する冷蔵機能を備えた研究設備、保存および輸送を必要とする調製および保存のために冷蔵しなければならない。冷蔵は発展途上国で実現不可能であることがある。前記Ｆａｂ分子の発現率は非常に低く、産生の方法は非常に重労働である。さらに、前記抗体の製造または小規模生産は費用がかかる。なぜなら、無傷で活性な抗体の発現に必要な哺乳動物細胞系は、時間と設備に関して高レベルのサポートを必要とし、収率は非常に低いからである。さらに、従来の抗体はｐＨに依存する結合活性を有し、したがって通常の生理的ｐＨ範囲から外れた環境で、例えば胃出血、胃の手術の治療には適していない。さらに、従来の抗体は低または高ｐＨでは不安定で、したがって、経口には適していない。しかしながら、ラクダ科抗体は、過度のｐＨ、変性試薬および高温などの厳しい条件に耐えることが実証されており（Ewert S etら、Biochemistry 2002 Mar 19; 41 (11): 3628-36）、よってそれらの抗体は経口投与による送達に適合するように作られている。さらに、従来の抗体は温度に依存する結合活性を有し、したがって生物学的な活性温度範囲から外れた温度（例えば、３７±２０oC）で扱われる分析法やキットの使用には適していない。
本発明のナノボディおよびポリペプチドは低毒性や高選択性などの通常抗体の有利な性質を有するだけでなく、付加的な性質も示す。それらは、通常抗体と比較すると、より可溶であり、より高い濃度で保存および／または投与できる可能性があることを意味している。それらは室温で安定的であり、冷蔵設備を使用することなく、調製、保存および／または輸送できることを意味し、費用、時間および環境面の節約になる。従来の抗体と比較して、他の有利な性質としては、循環における半減期が短いことであり、これは本発明にしたがって、例えばアルブミンカップリング、アルブミンに対する１つの特異性および標的に対する他の特異性を有する二重特異性ナノボディ、Ｆｃカップリング、ＶＨＨカップリング（二価ＶＨＨ）によって、あるいはペグ化によって調節してもよい。短く制御可能な半減期は、例えば時間が限られている血小板媒介凝集の阻害を必要とする手術手順に望ましい。また、出血の問題または別の合併症が起こった場合、投与量はすみやかに減少させることができる。本発明のポリペプチドはまた、通常生理的範囲から外れたｐＨおよび温度での結合活性を維持し、このことは、胃手術、胃出血の制御、室温での分析法等において血小板媒介凝集の調節を必要とする過度のｐＨおよび温度の状況で、本発明のポリペプチドが有用であることを意味している。本発明のポリペプチドはまた、過度のｐＨでも安定性が長期であることを示し、これは経口による送達に適していることを意味している。本発明のポリペプチドは、大腸菌および酵母などの簡便な組み換え宿主生物中の発酵によって費用効果が高い生産ができる可能性があり、高額な哺乳動物細胞培養設備をも必要とする通常の抗体とは異なり、発現の達成可能なレベルは高まる。例としては、本発明のポリペプチドの収率は１〜１０mg/ml （大腸菌）および最大１g/l（酵母）である。本発明のポリペプチドはまた、広範囲の異なる抗原タイプに対する高結合親和性、および通常抗体で認識されないエピトープへの結合能を示し；例えば腔に浸透する可能性を有する長いＣＤＲベースのループ構造を提示し、酵素機能阻害を示す。さらに、結合はＣＤＲ３ループのみを経て起こることが多いので、ＣＤＲ３由来ペプチドは治療に使用できることが予想される（Desmyterら、J Biol Chem, 2001, 276: 26285-90）。本発明のポリペプチドはまた、酵素または毒素を有する融合タンパク質として完全結合能を維持できる。さらに、Ｆｃ：Ｆｃ受容体が媒介する血小板凝集の活性化および／またはインビボで無傷ＩｇＧまたはＦ（ａｂ'）（２）を使用するときに見られる血小板のＦ（ａｂ'）（２）媒介架橋によって起こる望ましくない血小板減少症（Cauwenberghs N.ら、Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular biology, 2000, 20:1347を参照）は、ＶＨＨがＦｃを持たず二価ではないことから、ＶＨＨの使用時に避けられるであろう。したがって、本発明のポリペプチド、その相同体または機能部分によって、血小板媒介凝集に関する病状を治療および診断する場合に、費用および時間をかなり節約でき、前記ポリペプチドを必要とする患者は従来の薬剤に伴う問題にほとんど遭遇しないであろう。
血小板媒介凝集は、ｖＷＦ結合コラーゲンが血小板および／または血小板受容体に付着する過程であり、最終的には血小板が活性化される。血小板活性化は、フィブリノゲン結合を招き、最終的には血小板が凝集する。ｖＷＦ‐コラーゲン結合、ｖＷＦ‐血小板受容体付着、コラーゲン‐血小板受容体付着、血小板活性化、フィブリノゲン結合および／または血小板凝集などの血小板媒介凝集を含む過程を調節するポリペプチドを提供することは、本発明の範囲内である。
本発明の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは本発明の全長ポリペプチドの相同配列であってもよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは本発明の全長ポリペプチドの機能的部分であってもよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは本発明の全長ポリペプチドの相同配列であってもよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは本発明の全長ポリペプチドの相同配列の機能的部分であってよい。本発明の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは本発明のポリペプチドの配列を含んでよい。
本発明の態様にしたがって、本発明のポリペプチドを形成するのに使用する本発明のナノボディは、完全な本発明のナノボディ（例えばＶＨＨ）またはその相同配列であってよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドを形成するのに使用する本発明のナノボディは、完全な本発明のナノボディの機能的部分であってよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドを形成するのに使用する本発明のナノボディは、完全な本発明のナノボディの相同配列であってよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドを形成するのに使用する本発明のナノボディは、完全な本発明のナノボディの相同配列の機能的部分であってよい。
本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは親配列の相同配列であってよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは機能的部分親配列であってよい。本発明の別の態様にしたがって、本発明のポリペプチドは親配列の相同配列の機能的部分であってよい。
本明細書に記載するように、相同配列は１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含んでよく、このことはポリペプチドの機能的性質を実質的には改変しないものである。アミノ酸の欠失または置換の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０アミノ酸以下が好ましい。
本発明にしたがった相同配列はアミノ酸の付加によって伸長されたポリペプチドを含み、ヒト重鎖抗体またはヒト単一ドメイン重鎖抗体を形成し、このことは非修飾ポリペプチドの機能的性質を実質的には改変しないものである。
相同配列が配列同一性を示す場合、それは配列が親配列と高い配列同一性（７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%または９８%を超える配列同一性）を示していることを意味し、また、親配列の類似の特性、すなわち親和性、既知の方法を使用して計算した前記同一性によって特徴づけられることが好ましい。
あるいは、相同配列はまた、下記式にしたがった親配列の任意の数の位置で可能となった置換に起因する任意のアミノ酸配列であってもよい：
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＡｓｎによって置換されたＳｅｒ；
Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＧｌｕの中の１つによって置換されたＡｒｇ；
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔおよびＶａｌの中の１つによって置換されたＬｅｕ；
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＴｈｒの中の１つによって置換されたＰｒｏ；
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＨｉｓおよびＧｌｎの中の１つによって置換されたＴｈｒ；
Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＰｒｏの中の１つによって置換されたＡｌａ；
Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＩｌｅおよびＬｅｕの中の１つによって置換されたＶａｌ；
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＳｅｒの中の１つによって置換されたＧｌｙ；
Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＶａｌおよびＬｅｕの中の１つによって置換されたＩｌｅ；
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＬｅｕの中の１つによって置換されたＰｈｅ；
Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＬｅｕの中の１つによって置換されたＴｙｒ；
Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＴｈｒおよびＡｒｇの中の１つによって置換されたＨｉｓ；
Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、ＴｈｒおよびＡｒｇの中の１つによって置換されたＧｌｎ；
Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎおよびＳｅｒの中の１つによって置換されたＡｓｎ；
Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓおよびＡｒｇの中の１つによって置換されたＬｙｓ；
Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎの中の１つによって置換されたＡｓｐ；
Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＨｉｓおよびＡｒｇの中の１つによって置換されたＧｌｕ；
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＴｙｒの中の１つによって置換されたＭｅｔ。
本発明に記載の相同性は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００または１０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列を指す場合があり、この配列は、厳しいハイブリダイゼーション条件下でポリペプチドをコードできるヌクレオチド配列の逆相補体にハイブリダイズできる（例えば、SAMBROOKら、Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory、報道機関、ニューヨーク、に記載されているもの）。
本明細書で使用しているとおり、機能的部分は、目的の相互作用が１ｘ１０〜６Ｍ以上の親和性で維持されるのに十分な長さの本発明のナノボディを指す。
あるいは、本発明のナノボディの機能的部分は、完全アミノ酸配列の部分的欠失を含み、標的との結合および相互作用に必要な結合部位およびタンパク質ドメインを依然として維持する。
あるいは、本発明の任意のナノボディの機能的部分は、完全アミノ酸配列の部分的欠失を含み、ｖＷＦのコラーゲンへの結合を阻害するのに必要な結合部位およびタンパク質ドメインを依然として維持するポリペプチドである。
あるいは、本発明の任意のナノボディの機能的部分は、完全アミノ酸配列の部分的欠失を含み、ｖＷＦのＡ１ドメインとの結合および相互作用に必要な結合部位およびタンパク質ドメインを依然として維持するポリペプチドである。
あるいは、本発明の任意のナノボディの機能的部分は、完全アミノ酸配列の部分的欠失を含み、コラーゲンとの結合および相互作用に必要な結合部位およびタンパク質ドメインを依然として維持するポリペプチドである。
あるいは、機能的部分は、ポリペプチドの完全アミノ酸配列の部分的欠失を含み、それが引き起こされる抗原との結合および相互作用に必要な結合部位およびタンパク質ドメインを依然として維持する。それはＶＨＨドメインを含むが、それに限定はされない。
本明細書で使用するように、ポリペプチド配列を指しているような機能的部分は、１００%未満の配列（例えば９９%、９０%、８０%、７０%、６０%、５０%等）を指すが、５以上のアミノ酸を含んでいる。
ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指すような部分は１００%未満の配列（例えば９９%、９０%、８０%、７０%、６０%、５０%等）を指すが、１５以上のヌクレオチドを含んでいる。
本発明の態様は、注入の必要性のない本発明にしたがった本発明のポリペプチドの投与である。従来の抗体をベースにした治療法は、標的に対し特異性が優れ、本来備わっている毒性が低いため、薬剤として重要な可能性を有している。しかしながら、それら治療法は、比較的不安定であり、プロテアーゼによる崩壊に感受性であるという１つの重要な欠陥を有している。このことは従来の抗体薬が、経口、舌下、局所的、経鼻的、経膣的、経直腸的または吸入では投与ができないことを意味する。何故なら、それら従来の抗体薬はこれらの部位での低ｐＨに対し耐性がなく、これらの部位や血中でのプロテアーゼ活性に対し耐性がないため、および／またはサイズが大きいためである。いくつかのこれらの問題を払拭するために、それらは注射（静脈、皮下等）によって投与する必要がある。正確に安全に皮下シリンジまたは注射針を使用するためには、注射投与は熟練した専門家が必要である。それにはさらに、滅菌装置、治療ポリペプチドの液体製剤、滅菌時の前記ポリペプチドのバイアル包装、安定した剤形および、注射針を挿入するための被験体の好適な部位が必要である。また、被験体は通常、注射前および注射中には、肉体的および精神的ストレスを経験する。
本発明の態様は、本発明のポリペプチド構造物を提供することによって、先行技術のこれらの問題を払拭する。前記構造物は、活性の喪失のない実質的な経口、舌下、局所的、経鼻的、経膣的、経直腸的または吸入による送達に対して十分に小さく、耐性で安定している。本発明のポリペプチド構造物は注射の必要性がなく、費用／時間を節約するだけでなく被験体に対してより簡便で快適なものである。
本発明の一実施態様は、血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するために使用され、該物質が不活化されることなく胃環境を通過できる本発明のポリペプチドである。
本発明の前記ポリペプチドを一度所有したことのある当業者に公知のとおり、製剤技術は正しい位置（胃、腸等）に最大量のポリペプチドを放出するために適用してよい。送達のこの方法は、標的が腸管系にある疾患の症状を治療、予防および／または緩和するのに重要である。
本発明の態様は、血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための、また該物質が本発明のポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく胃環境を通過できる方法である。
本発明の別の実施態様は、血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための、また該物質が不活化されることなく胃環境を通過できる、本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を腸管系に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達するための方法である。
本発明の別の実施態様は、膣および／または直腸管に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい症状または疾患を治療、予防および／または緩和する場合に使用するための本発明のナノボディまたはポリペプチドである。
非限定的な例では、本発明に記載の製剤は、ゲル、クリーム、坐薬、フィルムの形態での、あるいは海綿の形態での、あるいは経時的に有効成分を徐放する腟内リングとしての本発明のナノボディまたはポリペプチドを含む（該製剤は欧州特許第７０７４７３号、欧州特許第６８４８１４号、米国特許第５６２９００１号に記載されている）。
本発明の態様は、膣および／または直腸管に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経膣的およびまたは経直腸的に投与することで治療、予防および／または緩和するための方法である。
本発明の別の実施態様は、膣および／または直腸管に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための、本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体の膣および／または直腸管に投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を膣および／または直腸管に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体の膣および／または直腸管に投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達するための方法である。
本発明の別の実施態様は、鼻、上気道および／または肺に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和する場合に使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。
非限定的な例では、本発明に記載の製剤は、鼻腔用スプレー（例えばエアロゾル）あるいは吸入器の形態での本発明のナノボディまたはポリペプチドを含む。本発明のナノボディまたはポリペプチドの小ささから、それは治療ＩｇＧ分子よりもかなり効果的に標的に到達することが可能である。
本発明の態様は、上気道および肺に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に投与することで、また口または鼻から吸入させることで治療、予防および／または緩和するための方法である。
本発明の別の実施態様は、鼻、上気道および／または肺に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための、また該ポリペプチドが不活化されることのない、本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体の鼻、上気道および／または肺に投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の鼻、上気道および肺に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体の鼻、上気道および／または肺に投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達するための方法である。
本発明の一実施態様は、腸粘膜に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすく腸粘膜の透過性が増加する疾患の症状を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。本発明のナノボディまたはポリペプチドはサイズが小さいため、それは腸粘膜を通過し、腸粘膜の透過性を増加させる疾患を患う被験体においてさらに効果的に血流に到達することが可能である。
本発明の態様は、腸粘膜に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすく腸粘膜の透過性が増加する疾患の症状を、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって治療、予防および／または緩和するための方法である。
この過程はさらに、本発明の追加的な態様‐活性的輸送担体の使用によってより促進することが可能である。本発明のこの態様では、ＶＨＨは腸壁から血流への移送を促進する担体に融合させる。非限定的例では、この「担体」は治療的ＶＨＨと融合する第二のＶＨＨである。該融合構造物は当技術分野に公知の方法を使用して作製する。「担体」ＶＨＨは腸壁の受容体に特異的に結合し、壁経由の活性的移送を誘導する。
本発明の別の実施態様は、腸粘膜に送達された血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすく、腸粘膜の透過性を増加させる疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための、本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を腸粘膜に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達するための方法である。
この過程はさらに、本発明の追加的な態様‐活性的輸送担体の使用によってより促進することが可能である。本発明のこの態様では、本明細書に記載の本発明のナノボディまたはポリペプチドは腸壁から血流への移送を促進する担体と融合する。非限定的例では、この「担体」は前記ポリペプチドに融合するＶＨＨである。該融合構造物が当技術分野に公知の方法を使用して作製した。「担体」ＶＨＨは腸壁の受容体に特異的に結合し、壁経由の活性的移送を誘導する。
本発明の一実施態様は、効果的に舌下組織を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。本発明の前記ナノボディまたはポリペプチドの剤形、例えばタブレット、スプレー、ドロップは舌下に留置し、粘液膜経由で舌下の毛細血管網に吸着する。
本発明の態様は、効果的に舌下組織を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に舌下投与することにより、治療、予防および／または緩和するための方法である。
本発明の別の実施態様は、舌下組織を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための、本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に舌下投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を舌下組織に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に経口投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達するための方法である。
本発明の一実施態様は、効果的に皮膚を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。
本発明の前記ナノボディまたはポリペプチドの剤形、例えばクリーム、フィルム、スプレー、ドロップ、パッチは皮膚に留置し、通過させる。
本発明の態様は、効果的に皮膚を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に局所投与することにより、治療、予防および／または緩和するための方法である。
本発明の別の実施態様は、効果的に皮膚を通過できる血小板媒介凝集を制御する物質による調節に影響されやすい疾患の症状を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製するための本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に局所投与することによって該物質が不活化されることなく、血小板媒介凝集を制御する物質を皮膚に送達するための方法である。
本発明の態様は、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に局所投与することによって、血小板媒介凝集を制御する物質を被験体の血流に送達する方法である。
本発明の別の実施態様では、本発明のナノボディまたはポリペプチドはさらに、本発明のナノボディまたはポリペプチドを、肺ルーメンを介して血液へと輸送するための活性的な輸送担体として活性する本発明の担体ナノボディ（例えばＶＨＨ）を含む。
本発明のナノボディまたはポリペプチドはさらに、粘膜面（気管支上皮細胞）に存在する受容体に特異的に結合する担体を含み、ポリペプチドが肺ルーメンから血液へと活性的に輸送されることとなる。本発明の担体ナノボディは本発明のナノボディまたはポリペプチドと融合してもよい。当技術分野で公知の方法を使用して作製した該融合構造物は本明細書に記述されている。本発明の「担体」ナノボディは粘膜面の受容体に特異的に結合し、表面経由の活性的移送を誘導する。
本発明の別の態様は、本発明のナノボディ（例えばＶＨＨ）が経鼻投与で血流へと活性的に輸送されていることを判定する方法である。同様にナイーブな、または免疫ＶＨＨファージライブラリーが経鼻投与可能であり、投与後の異なる時点の後、血液または器官は単離し、血流に活性的に輸送されたファージの増殖を助けることが可能である。肺ルーメンから血流へ活性的に輸送するための受容体の非限定的例は、Ｆｃ受容体Ｎ（ＦｃＲｎ）である。本発明の一態様は、方法によって同定されたＶＨＨ分子を含む。該ＶＨＨはその後、治療ＶＨＨを血流中の対応する標的に経鼻投与で送達するための担体ＶＨＨとして使用することができる。
本発明の一実施態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関する疾患の症状を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。前記疾患には、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、一過性脳虚血発作、不安定または安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄がある。前記疾患にはさらに、冠状動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術および冠動脈インターベンション、このような血管形成術、ステント術または粥腫切除から起こる疾患もある。
別の疾患は、非閉塞性血栓の形成、閉塞性血栓の形成、動脈血栓の形成、急性冠動脈閉塞症、再狭窄、ＰＣＴＡまたはステント術後の再狭窄、狭窄動脈における血栓形成、血管形成術、粥腫切除または動脈ステント術後の過形成、脈管系における閉塞性症候群、あるいは病的動脈の開存性の欠如のいずれかである。
本発明の一態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関連する疾患または病気を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドであり、ここでは本発明の前記ナノボディまたはポリペプチドは静脈、皮下、経口、舌下、局所、経鼻、経膣、経直腸投与または吸入による投与を行う。
本発明の別の態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関連する疾患または病気を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製する本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用であり、ここでは本発明の前記ナノボディまたはポリペプチドは静脈、皮下、経口、舌下、局所、経鼻、経膣、経直腸投与または吸入による投与を行う。
本発明の別の態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関連する疾患または病気を治療、予防および／または緩和し、本発明のナノボディまたはポリペプチドを被験体に投与することも含む方法であり、ここでは本発明の前記異種特異的ナノボディまたはポリペプチドは静脈、皮下、経口、舌下、局所、経鼻、経膣、経直腸投与または吸入による投与を行う。
本発明の別の態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関連する疾患または病気を治療、予防および／または緩和するために使用する本発明のナノボディまたはポリペプチドである。
本発明の別の態様は、血小板媒介凝集またはその機能障害に関連する疾患または病気を治療、予防および／または緩和するための薬物を調製する本発明のポリペプチドの使用である。
ポリペプチドのｖＷＦへの結合を調節する薬剤をスクリーニングするために、本発明のナノボディまたはポリペプチドを使用できる。結合または前記ポリペプチド置換のみを測定する分析法において同定する場合、薬剤は、血小板媒介凝集の調節剤として作用しているかどうか判定するために機能テストに供さなければならないであろう。好適なスクリーニング法のいくつかの例が国際公開第０４／０６２５５１号に記載されている。無論これらの方法は、本明細書に開示の本発明のナノボディまたはポリペプチドとｖＷＦ間の結合を改変する候補モジレーターのスクリーニングに容易に適用することが可能である。
本発明にしたがって有用な細胞は、例えば大腸菌などの細菌細胞、例えば出芽酵母やピキア・パストリスなどの酵母細胞、例えば上述のような昆虫細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択されることが好ましい。
本発明にしたがって有用な細胞は、本明細書で規定したとおり、ポリペプチドが自然レベルまたは上述の自然レベルで発現するように、本発明のナノボディまたはポリペプチドをコードする核酸配列が導入され得る、または導入された任意の細胞であり得る。本明細書で規定したとおり、細胞で発現した本発明のポリペプチドは、正常または正常に近い薬理作用を示すことが好ましい。
本発明の好ましい実施態様にしたがって、細胞は、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ (ＴＫ‐)細胞、ＮＩＨ‐３Ｔ３細胞、ＨＥＫ‐２９３細胞、Ｋ‐５６２細胞または１３２１Ｎ１星状細胞腫細胞、ならびに他のトランスフェクトできる細胞系からなる群から選択される。
概して、「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」は望ましい１つまたは複数の結果を達成する（血小板凝集を治療および予防する）ために必要とされる量を意味する。当業者であれば、血小板媒介凝集を阻害する本発明で使用する様々なナノボディまたはポリペプチドに対して作用強度ひいては「有効量」が変更可能であることは理解するであろう。当業者であればナノボディまたはポリペプチドの作用強度を容易に評価できる。
「医薬的に許容できる」は、生物学的にまたはその別の観点から不適切ではない物質を意味し、すなわち該物質は、望ましからざる生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれを含む医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、ナノボディまたはポリペプチドにしたがって個体に投与してよい。
本明細書に開示の発明は、被験体において血小板媒介凝集という病気の治療または予防に対して有用であり、ＢＴＫを阻害し、血小板媒介凝集を阻害する医薬的有効量のナノボディまたはポリペプチドまたは組成物を投与することを含む。
本明細書に開示の発明は、被験体において血栓形成の最初のステップの治療または予防に対して有用であり、本発明にしたがった医薬的有効量のナノボディまたはポリペプチドまたは組成物を投与することを含む。
本明細書に開示の発明は、被験体において再狭窄の治療または予防に対して有用であり、本発明にしたがった医薬的有効量のナノボディまたはポリペプチドまたは組成物を投与することを含む。
本発明の一態様は、被験体において血小板媒介凝集という病気を治療または予防する本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用であり、他の物質、例えばアスピリンと併用した医薬的有効量のナノボディまたはポリペプチドを投与することを含む。
本発明の一態様は、被験体において血小板媒介凝集という病気を治療または予防する本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用であり、他の物質、例えば血栓溶解剤と併用した医薬的有効量のナノボディまたはポリペプチドを投与することを含む。
本発明の別の態様は、個体においてプラークまたは血栓を治療または予防する本発明のナノボディまたはポリペプチドの使用である。前記のプラークまたは血栓形成は高湾曲状態下で起こる。血栓症および再閉塞の両方で、高せん断速度での血小板の可逆的な付着あるいは連結の後には、血小板上のコラーゲン受容体を介した膜付着が起こり、血小板が活性化される；血小板がｖＷＦによって、損傷した血管壁中で露出したコラーゲンに連結することは高せん断力状態下では特に重要である。本発明者らによって、本発明のナノボディまたはポリペプチドが高せん断力状態下で予想外に良好に機能することが見出されている。
本発明は、本発明の単一ナノボディまたはポリペプチドを含む製剤の投与に限定されるものではない。製剤を、本発明の１つを超えるナノボディまたはポリペプチドを含む該製剤を必要とする患者に投与する併用療法を提供することは本発明の範囲内である。
血小板媒介凝集という病気には、不安定狭心症、安定狭心症、狭心症、栓塞形成、深部静脈血栓症、溶血性尿毒症症候群、溶血性貧血、急性腎不全、血栓溶解合併症、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝血障害、血栓症、冠動脈心疾患、血栓塞栓性合併症、心筋梗塞、再狭窄および、心房細動、慢性不安定狭心症、一過性脳虚血発作および虚血脳卒中、末梢血管疾患、動脈血栓症、妊娠中毒症、塞栓症、再狭窄における心房血栓形成および／または血管形成術、頚動脈内膜剥離術、移植血管閉塞の吻合および心血管装置への慢性被曝後の血栓症が含まれるが、これらに限定されるものではない。該条件は、血栓溶解療法中またはその後、血管形成術後および冠動脈バイパス術後の血栓塞栓症および再閉塞が原因である場合もある。
本明細書に記載の標準試験または別の類似した試験を利用した血小板媒介凝集の阻害の測定法は、当技術分野では公知である。該方法では、血小板媒介凝集の減少は少なくとも１０%、例えば１５%、２０%、２５%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%またはそれらの間の任意の量の結果になることが好ましく、９０％減少することがより好ましい。
同様に、該方法では細胞内カルシウム可動化は少なくとも１０%減少した結果になり、例えば１５%、２０%、２５%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%という結果もあり得る。同様に、該方法ではリン酸化ＰＬＣｇ２レベルは少なくとも１０%減少した結果になり、例えば１５%、２０%、２５%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%という結果もあり得る。
該減少は、例えば血小板凝集能年代測定装置において光学インピーダンスを比較することによって測定することが可能である。任意の他の公知の測定法を使用してもよい。例えば、（１）コラーゲン刺激において、コラーゲン誘発細胞内カルシウム可動化のレベルは経時的に増加し、したがって測定はコラーゲン誘発細胞内カルシウムのレベルを測定することを含んでよい、あるいは（２）コラーゲン刺激において、リン酸化ＰＬＣｇ２のレベルは経時的に増加し、したがって測定はリン酸化ＰＬＣｇ２のレベルを測定することを含んでよい。
細胞はインビトロで、例えば本発明のナノボディまたはポリペプチドを培地に加えることで（連続的点滴により、ボーラス輸送により、または培地をナノボディまたはポリペプチドを含む培地に変えることにより）、あるいは、インビボで、ナノボディまたはポリペプチドを細胞外液に加えることで（局所輸送、全身輸送、吸入、静脈注射、ボーラス輸送または連続的点滴により）接触可能となる。細胞との「接触」持続時間または細胞数は時間により測定し、ナノボディまたはポリペプチドは、生理学的有効レベルまたは予想される生理学的有効レベルで、単数または複数の細胞を入れた培地または細胞外液中に存在する。好ましくは、接触持続時間は１〜９６時間であり、より好ましくは２４時間であるが、該時間はナノボディまたはポリペプチドの半減期に基づいて変化するものであり、通常実験で当業者によって最適化が可能であった。
本発明で有用なナノボディまたはポリペプチドは、医薬組成物として処方し、ヒト患者または家畜などの哺乳動物宿主に、選択された投与経路に適した様々な形態、すなわち経口、非経口、経鼻、吸入、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路で投与可能である。
本発明のナノボディまたはポリペプチドはまた、送達の遺伝子治療法を使用し投与できる。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい。これは全体的に参照により組み込まれる。送達の遺伝子治療法を使用し、本発明のナノボディまたはポリペプチドの遺伝子でトランスフェクトされた一次細胞は付加的に、組織特異性プロモーターで、標的特異性器官、組織、移植片、腫瘍または細胞へトランスフェクトできる。
したがって、本ナノボディまたはポリペプチドは、例えば経口で不活性希釈剤または吸収可能な食用担体などの医薬的に許容可能なビヒクルとの併用で、全身投与してもよい。それらはハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入、錠剤に圧縮、または患者の食事中の食物に直接混入させてもよい。治療的経口投与では、ナノボディまたはポリペプチドは１つ以上の賦形剤と組み合わせて、また錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等の剤形で使用してもよい。該組成物および製剤は少なくとも０．１％のナノボディまたはポリペプチドを含むことが好ましい。組成物と製剤のパーセンテージは無論変更してもよく、所与の単位剤形中、重量約２〜約６０％であることが都合良い。該治療効果のある組成物中のナノボディまたはポリペプチドの量は有効投与量レベルが得られるような量である。
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は以下のものを含んでよい：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトシターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなどの甘味剤、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリー香料などの香味料を添加してよい。単位剤形がカプセルである場合、上記のタイプの材料の他に、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含んでよい。別の様々な材料は被覆剤として、あるいはその他固形単位剤形の物理的形状を改変するように存在してよい。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは砂糖等で被覆してよい。シロップまたはエリキシル剤はナノボディまたはポリペプチド、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存料としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、着色料およびチェリーまたはオレンジ香料などの香味料を含んでよい。無論、任意の剤形を調製するのに使用する任意の材料は医薬的に許容可能で、決定された量で実質的に非毒性であることが好ましい。さらに、ナノボディまたはポリペプチドは徐放性製剤および装置に組み込まれてもよい。
ナノボディまたはポリペプチドは点滴または注射で静脈内または腹腔内投与してよい。ナノボディまたはポリペプチドの溶液は、任意に非毒性界面活性剤と混合して、水中で調製できる。分散は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物中で、および油中で調製できる。保存および使用の通常条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存料を含む。
注射あるいは点滴に適した医薬品剤形は、滅菌された注射液または点滴液またはそれらの散液の即席の調製に適している活性成分を含む滅菌水溶液または散液、あるいは滅菌粉末を含むことが可能で、任意にリポソームに被包することも可能である。あらゆる場合で、究極の剤形は滅菌してあり、流体であり、製造および保存の条件下で安定していることが必要である。液体担体またはビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適度な流動性は、例えばリポソーム形成によって、散液の場合は所望の粒子径を維持することによって、あるいは界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の活動は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等で防止できる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことは好ましいとされている。注入可能な組成物の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンの組成中で使用することで延長できる。
滅菌された注入可能な溶液はナノボディまたはポリペプチドを、上記に列挙した様々な他の成分を含む適当な溶媒中に必要量、組み込むことによって調製し、必要に応じてその後、ろ過滅菌を行う。滅菌された注入可能な溶液の調整用滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、事前にろ過滅菌した溶液に存在する任意の付加的な目的成分に加えて有効成分の粉末を生成する。
局所投与では、本ナノボディまたはポリペプチドは、その化合物だけで、すなわち液体である場合に適用してよい。しかしながら、組成物または製剤として、固体または液体であり得る皮膚科学的に許容可能な担体と組み合わせて皮膚に投与することが一般的に望ましい。
有用な固体担体は、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉化した固体を含む。有用な液体担体は、水、ヒドロキシアルキル、あるいはグリコールまたは水‐アルコール／グリコールの混合物を含み、本ナノボディまたはポリペプチドは有効レベルで溶解または懸濁可能で、任意に非毒性界面活性剤を援用することもある。芳香剤や付加的な抗菌薬などのアジュバントを添加して、所与の使用に対して性質を最適化できる。得られた液体組成物は吸収剤パッド経由で適用が可能であり、包帯や他のドレッシングに含浸させるために用いられ、あるいはポンプ型またはエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧することが可能である。
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性無機材料などの増粘剤は、延展可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸等を形成する液体担体とともに使用することが可能であり、使用者の皮膚に直接塗布できる。
ナノボディまたはポリペプチドを皮膚に送達するのに使用できる有用な皮膚科学的組成物の例は当技術分野に公知であり、例えば、Jacquetら、（米国特許第４，６０８，３９２号）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号）、Smithら、（米国特許第４，５５９，１５７号）およびWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
ナノボディまたはポリペプチドの有用な投与量は、動物モデルでインビトロおよびインビボでのその活性を比較することによって決定できる。マウスおよび他の動物での有効投与量の外挿をヒトに当てはめる方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
概して、ローションなどの液体組成物中のナノボディまたはポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５重量％から、好ましくは約０．５〜１０重量％からとされている。ゲルや粉末のような半固体または固体組成物の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％とされている。
治療に使用するために必要なナノボディまたはポリペプチドの量は、投与経路、治療条件の性質および患者の年齢と状態で変化し、最終的には担当の内科医または臨床医の判断に委ねられるとされている。またナノボディまたはポリペプチドの投与量も、標的細胞、腫瘍、組織、移植片または器官にしたがって変化する。
望ましい用量は一日、一回量で提供されること、あるいは適当な間隔、例えば２、３、４回以上の分配用量に分けて投与することが都合がよい。分配用量自体をさらに、例えば吸入器での複数回の吸入あるいは複数回の点眼による投与などの数回の個々に大まかな間隔のある投与になるよう分けてもよい。
投薬計画では、長期にわたる毎日の治療が可能であった。「長期」という用語は、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月間または数年間を意味する。この投与範囲の必要な変更は、本明細書に記述した通常実験のみを利用する当業者が決定してもよい。RemingtonのPharmaceutical Sciences （Martin, E.W.、編、４）、Mack Publishing 社、イーストン、ペンシルベニア州、を参照されたい。また投与量はどんなに複雑な場合でも、個々の内科医によって調製できる。
本発明は、血小板媒介凝集の調節剤である薬剤を提供する。
候補薬剤は合成薬剤または薬剤の混合物、あるいは天然産物（例えば植物エキスまたは培養液上清）でもよい。本発明に記載の候補薬剤としては、合成可能な小分子、天然エキス、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪等がある。
合成または天然薬剤の大規模ライブラリーから得られた候補調節薬剤はスクリーニングが可能である。手段の多くは現在、サッカライド、ペプチドおよび核酸をベースにした薬剤のランダムな合成および目的を持った合成に使用されている。合成薬剤ライブラリーは多数の会社、Maybridge Chemical社(Trevillet、コーンウォール、UK)、Comgenex（プリンストン、ニュージャージー州）、Brandon Associates（メリマク、ニューハンプシャー州）およびMicrosource (ニューミルフォード、コネチカット州) から入手可能である。稀有な化学ライブラリーはAldrich（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手可能である。組み合わせたライブラリーは入手可能であり調製可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物のエキスの形態での天然薬剤のライブラリーは、例えばPan研究所（ボセル、ワシントン州）またはMycoSearch(ノースカロライナ州)から入手でき、あるいは当技術分野で公知の方法で容易に生産できる。また、天然の、および合成したライブラリーならびに薬剤は、従来の化学的、物理学的および生化学的手段によって容易に改変する。
有用な薬剤は多数の化学的分類群中で見られる場合がある。有用な薬剤は有機薬または小分子有機薬である場合がある。小分子有機薬の分子量は、５０ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満、好ましくは約７５０ダルトン未満、さらに好ましくは約３５０ダルトン未満である。分類群の好ましい例としては、複素環、ペプチド、サッカライド、ステロイド等がある。薬剤は改変して、有効性、安定性、医薬的適合性等を促進してよい。薬剤の構造的同定は、付加的薬剤を同定、産生またはスクリーニングするために利用してよい。例えばペプチド薬を同定する場合、ペプチド薬はD‐アミノ酸、特にD‐アラニンなどの非天然アミノ酸を使用するなど安定性を促進するために様々な方法で改変してよく、それはアミノ末端またはカルボキシル末端を官能基化、例えばアミノ基にはアシル化またはアルキル化、ならびにカルボキシル基にはエステル化またはアミド化等することによって可能となる。
一次スクリーニングでは、本発明に記載の候補薬剤の有用な濃度は約１０mMから約１００μM 以上（すなわち１mM、１０mM、１００mM、１M等）である。一次スクリーニング濃度は上限として使用され、二次スクリーニングまたは濃度曲線の産生のために半対数の間隔で（例えば９つの追加の濃度で）一次スクリーニング濃度を減少させることによって付加的濃度が決定される９つの付加的濃度とともに使用されている。
本発明に記載のハイスループットスクリーニングキットは、好ましくは濃度１μM〜１mMの範囲にあるポリペプチドの存在下で、例えばｖＷＦまたはその断片などの本発明の標的と相互作用することによって、血小板媒介凝集を調節する薬剤を検出するのに必要な全ての手段および媒体を含んでいる。該キットには以下のものが含まれる：マイクロタイタープレート、より好ましくは９６ウェルマイクロタイタープレートなどの固体支持体上のキットにしたがって増殖する、ｖＷＦまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含み発現する本発明の組み替え細胞であり、これは特に国際公開第００／０２０４５号に記載された当業者に公知の方法にしたがったものである。あるいは、ｖＷＦまたはその断片は、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートに固定された精製された形態で当業者によって供給される。あるいは、ｖＷＦまたはその断片は、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートに予め固定されたキットで供給される。濃度約１μM〜１mM以上の本発明に記載の調節薬剤は、適当な濃度の本発明のナノボディまたはポリペプチドの存在下で規定のウェルに添加する。前記ポリペプチドの前記濃度は、１μM〜１mMの範囲にあることが好ましい。キットは１つを超えるポリペプチドを含んでよい。
結合分析法は本明細書にすでに開示の方法に従って行い、その結果を、例えば本発明のポリペプチドに結合するｖＷＦまたはその断片のベースラインレベルと比較する。しかし調節薬剤は添加しない。（例えば）調節剤が無い活性レベルと比べて、ｖＷＦ‐ポリペプチド結合が少なくとも２倍、好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは１００倍以上増加または減少するウェルを、さらに分析するために選ぶ。
本発明は、血小板媒介凝集の調節剤をスクリーニングするのに有用なキット、ならびに異常調節血小板媒介凝集によって特徴づけられる疾患または障害を診断するのに有用なキットを提供する。本発明にしたがって有用なキットは単離したｖＷＦまたはその断片を含むことが可能である。あるいは、またはさらに、キットは形質転換しｖＷＦまたはその断片を発現することができる。さらなる実施態様では、本発明に記載のキットはｖＷＦまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むことが可能である。別のさらなる実施態様では、本発明に記載のキットはｖＷＦまたはその断片の増幅に有用な特異性プライマーを含んでよい。本発明にしたがって有用なキットは、本発明のナノボディまたはポリペプチドを含むことが可能である。本発明に記載のキットは、形質転換して前記ポリペプチドを発現する細胞を含むことが可能である。キットは一種以上のポリペプチドを含んでよい。さらなる実施態様では、本発明に記載のキットは、巨大分子、例えばｖＷＦまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むことが可能である。別のさらなる実施態様では、本発明に記載のキットは、例えばｖＷＦまたはその断片などの巨大分子の増幅に有用な特異性プライマーを含んでよい。本発明に記載のキットはすべて、規定のアイテムまたはアイテムの組み合わせ、および必然的に包装材料を含むとされている。またキットは使用説明書を含むものである。
本発明はまた、本発明のナノボディまたはポリペプチドで被覆した観血医療器具あるいは該ナノボディまたはポリペプチドを必要とする器具に使用する本発明のスクリーニング法に起因する薬剤を用意している。器具の非限定的な例には、外科的チューブ、閉塞器具、人工装具がある。前記器具の応用には、観血部位周辺の血小板媒介凝集の調節を必要とする外科的手技がある。
本発明の一態様は、観血部位周辺の血小板媒介凝集を防止する観血医療器具を扱う方法であり、本発明のナノボディまたはポリペプチドあるいは本発明に記載の薬剤で該器具を被覆するステップを含む。
本発明の別の実施態様は観血部位周辺の血小板媒介凝集を回避する観血医療器具であり、該器具は本発明のナノボディまたはポリペプチドあるいは本発明に記載の薬剤で被覆されている。
別の態様では、本発明は、（本明細書に記載の）少なくとも１つの凝集媒介障害の予防および／または治療する方法に関しており、前記方法は、医薬的有効量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドおよび／またはそれらを含む医薬組成物を、それらを必要とする被験体に投与することを含む。
本発明の内容において、用語「予防および／または治療」は疾患を予防および／または治療することだけでなく、一般に疾患の発症を防止する、疾患の進行を遅延あるいは後退させる、疾患に伴う１つ以上の症状の発症を防止または遅延する、疾患に伴う１つ以上の症状を緩和および／または軽減する、疾患および／またはそれに伴うあらゆる症状の重症度および／または持続期間を緩和する、および／または疾患および／またはそれに伴うあらゆる症状の重症度がさらに増加することを予防する、疾患により生じたあらゆる生理学的損傷を予防、緩和または後退すること、ならびに一般的に治療中の患者に有益なあらゆる薬理学的作用も含んでいる。
治療を受ける被験体が任意の温血動物であってよく、特に哺乳類、さらにヒトであることが特に都合よい。当業者に明らかなように、特に治療される被験体は、本明細書に記載の疾患および障害を患う、またはその危険に瀕した人であるとされている。
本発明はまた、本発明のナノボディまたはポリペプチドを患者に投与することによって予防および／または治療できる少なくとも１つの疾患または障害を予防および／または治療する方法に関しており、前記方法は、医薬的有効量の本発明のナノボディ、ポリペプチドおよび／またはそれらを含む医薬組成物を必要とする被験体に投与することを含む。
より具体的には、本発明は本明細書に一覧にされた疾患および障害からなる群から選択された、少なくとも１つの疾患または障害を予防および／または治療する方法に関しており、前記方法は、医薬的有効量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドおよび／またはそれらを含む医薬組成物を、それらを必要とする被験体に投与することを含む。
別の実施態様では、本発明は免疫療法、特に受動免疫療法の方法に関しており、その方法は本明細書に記載の疾患および障害に苦しむ、またはその危険に瀕した被験体に、医薬的有効量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドおよび／またはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む。
上記の方法では、本発明のナノボディおよび／またはポリペプチド、および／またはそれらを含む組成物は、使用の特定の医薬製剤または医薬組成物しだいで、任意の好適な方法で投与することが可能である。したがって、本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドおよび／またはそれらを含む組成物は、また使用の特定の医薬製剤または医薬組成物しだいで、例えば経口的に、腹腔内に（例えば静脈内、皮下、筋肉内投与、あるいは消化管を回避する他の投与経路を経て）、鼻腔内に、経皮的に、局所的に、座薬投与で、吸入で投与することが可能である。臨床医は、予防または治療される疾患または障害およびその臨床医がよく知る他の因子しだいで、好適な投与経路および該投与に使用する好適な医薬製剤または医薬組成物を選択できるであろう。
本明細書に記載のとおり、ならびに当業者には明らかなように、急性疾患および合併症（すなわち本明細書に記載のいくつかの凝集媒介障害で発症するような状態）では通常、点滴、注射または任意の他の好適な手段で血流に直接投与することが好ましいとされている。
本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドおよび／またはそれらを含む組成物は、予防または治療される疾患または障害を予防および／または治療するのに好適な治療の体系にしたがって投与する。臨床医は一般的に、予防または治療される疾患または障害などの要因、治療される疾患の重症度および／またはその症状の重症度、使用の本発明の特定のナノボディまたはポリペプチド、特定の投与経路および使用の医薬製剤または医薬組成物、年齢、性別、体重、食事、患者の全身状態およびその臨床医がよく知る類似の因子にしたがって、好適な治療計画を決定できるであろう。
概して、治療計画は、一種以上の医薬的有効量または用量で、１つ以上の本発明のナノボディおよび／またはポリペプチド、あるいはそれらを含む１つ以上の組成物を投与することを含むとされている。投与される（一種または複数の）特定の量または用量は、また上記で引用された因子に基づいて臨床医によって決定できる。
概して、本明細書で述べられた疾患および障害を予防および／または治療するために、治療される特定の疾患または障害、使用する特定の本発明のナノボディおよびポリペプチドの作用強度、特定の投与経路および使用の特定の医薬製剤または医薬組成物にしたがって、本発明のナノボディおよびポリペプチドは概して、１日一回用量として、または１日中の複数回用量として、１g〜０．０１μg／体重kg／日の範囲の量で、好ましくは約１、１０、１００または１０００μg／体重kg／日などの０．１g〜０．１μg／体重kg／日で、各々連続的に（例えば点滴）投与するとされている。臨床医は概して、本明細書に記載の因子にしたがって、好適な１日用量を決定できるとされている。ある特定のケースでは、臨床医が、例えば上記に引用した因子および専門家としての判断に基づいて上記の量以外を選択する可能性があることは明白だとされている。概して、投与される量に関してのいくつかの手引きは、親和性／結合力、有効性、生体内分布、半減期および当業者に公知の類似の因子がいかに異なっているかを配慮して、本質的に同じ経路を経て投与される同じ標的に対する同等の従来の抗体または抗体断片のための通常投与量から得ることが可能である。
通常、上記の方法においては、本発明の単一ナノボディまたはポリペプチドを使用するとしている。しかしながら併用する２つ以上の本発明のナノボディおよび／またはポリペプチドを使用することは本発明の範囲内である。
本発明のナノボディおよびポリペプチドは１つ以上のさらに医薬活性な化合物または成分と併用、すなわち併用した治療計画として使用してもよいが、これは相乗効果をもたらすかどうかは定かではない。臨床医は再度、上記に引用した因子および専門家としての判断に基づいて、該さらなる化合物または成分ならびに好適な併用治療計画を選択することが可能となるであろう。
特に、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、本明細書に引用された疾患および障害の予防および／または治療に使用するまたは使用できる他の医薬活性化合物または成分と併用してもよく、その結果として相乗効果が得られるかどうかは定かではない。該化合物および成分、ならびにこれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または組成物は、臨床医には明白であり、例えばヘパリン、アスピリン（例えばAspegic（登録商標））、Plavixおよび／またはReoproがあるが、これらに限定されるものではない。
２つ以上の物質または成分を、併用した治療計画の一部として使用することになる場合、それらは同一投与経路または異なる投与経路で、本質的に同時または異なる時間に（例えば本質的に同時に、連続的に、あるいは交互に投与する体系にしたがって）投与することが可能である。それらの物質または成分を同一投与経路で同時になるように投与する場合、当業者に明らかなように、それらは異なる医薬製剤または医薬組成物、または併用した医薬製剤または医薬組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の活性物質または成分を併用した治療計画の一部として使用することになる場合、該物質または成分の各々は同一量で、化合物または成分がそのままで使用するときに用いられるような同一計画にしたがって投与してよいが、該併用は相乗効果をもたらすかどうかは定かではない。しかしながら、２つ以上の活性物質または成分の併用が相乗効果をもたらす場合、１つ、それ以上またはすべての投与される物質または成分の量を減らすことも可能であり、それでも依然として目的の治療効果に到達できる。このことは例えば、通常量で使用するときの１つ以上の物質または成分の使用に伴う望ましくないすべての副作用を回避、制限または減少させることに有用である可能性があり、それでも依然として目的の医薬的効果または治療効果を得ることができる。
本発明にしたがって使用された治療計画の効果は、臨床医に明らかなように、関連した疾患または障害についての自体公知の方法で判定および／または理解されてもよい。臨床医は適切におよびまたはケースバイケースで特定の治療計画を変更または修正し、そうすることによって望ましい治療効果を実現し、望ましくない副作用を回避、制限または減少させ、および／または、一方で目的の治療効果を得て、また他方では望ましくない副作用を回避、制限または減少させるといった両者の間の適切なバランスを得ることができる。
治療される被験体は任意の温血動物でよいが、特に哺乳動物、より格別にはヒトであることが都合よい。当業者に明らかなように、治療される被験体は特に、本明細書に記載の疾患および障害に苦しむまたはその危険に瀕した人であるとされている。
本発明はまた、本発明のナノボディまたはポリペプチドを患者に投与することによって予防および／または治療できる少なくとも１つの疾患または障害（例えば本明細書に記載の凝集障害）を予防および／または治療するための医薬組成物を調製する場合に本発明のナノボディまたはポリペプチドを使用することに関する。
一般的に、目的の治療効果が得られるまで、および／または目的の治療効果が維持されている間は、治療計画は続けられる。このことは臨床医によって再度判定され得る。
最終的に、本発明のナノボディの上述した１つ以上のＣＤＲを他の「足場」に「移植」できることは当業者にとって明確なことであり、これはヒト足場または非免疫ブロブリン足場も含むが、これらに限定されるものではない。該ＣＤＲ移植に好適な足場および技術は当業者に明確であり、当技術分野に公知であり、例えば、米国特許出願第７，１８０，３７０号、国際公開第０１／２７１６０号、欧州特許第０ ６０５ ５２２号、欧州特許第０ ４６０ １６７号、米国特許出願第７，０５４，２９７号、Nicaiseら,Protein Science（2004）,13：1882-1891；Ewertら, Methods、2004 Oct；34（2）：184-199；Kettleboroughら、Protein Eng.1991 Oct; 4（7）：773-783；O'BrienおよびJones, Methods Mol. Biol.2003：207：81-100；およびSkerra, J. Mol. Recognit、2000：13：167-187、およびSaerensら、J. Mol. Biol.、2005 Sep 23；352（3）：597-607、および本明細書に記載の別の参考文献を参照されたい；また、該足場および技術は例えば、他の（単一）ドメイン抗体の骨格領域もまた含む。例えば、マウスまたはラットのＣＤＲをヒト骨格および足場に移植する自体公知の技術は、１つ以上の本発明のナノボディのＣＤＲおよび１つ以上のヒト骨格領域または配列を含むキメラタンパク質を提供する類似した方法で利用可能である。
したがって別の実施態様では本発明は、本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列からなる群から選択された少なくとも一ＣＤＲ配列を有するキメラポリペプチドを含む。好ましくは、該キメラポリペプチドは、本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ３配列からなる群から選択した少なくとも1つのＣＤＲ配列を含み、および任意に、本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列からなる群から選択した少なくとも１つのＣＤＲ配列も含む。例えば、該キメラポリペプチドは、本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ３配列からなる群から選択した１つのＣＤＲ配列、本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ１配列からなる群から選択した１つのＣＤＲ配列、および本発明のナノボディの、本明細書に記載したＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列からなる群から選択した一ＣＤＲ配列を含んでよい。本発明のナノボディに好適な、本明細書に記載のＣＤＲの組み合わせは、通常これらのキメラポリペプチドにも好適であるとされている。
前記キメラポリペプチドにおいて、ＣＤＲはさらなるアミノ酸配列と結合、および／またはアミノ酸配列を介して互いに結合してよい。ここでは前記アミノ酸配列は、骨格配列として作用する、またはＣＤＲを表す足場を一緒になって形成する骨格配列またはアミノ酸配列であることが好ましい。参照を、最後のパラグラフに記述された先行技術に対して再度提供する。好ましい一実施態様にしたがって、アミノ酸配列は、ヒト骨格配列、例えばＶＨ３骨格配列である。しかしながら、非ヒト、合成、半合成または非免疫グロブリン骨格配列も使用してよい。好ましくは、使用の骨格配列は以下のようなものである：（１）キメラポリペプチドは、ｘｘｘｘに結合可能である、すなわち少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％の親和性、例えば少なくとも２５％、および５０％まで、あるいは９０％以上の対応する本発明のナノボディの親和性を持つ；（２）キメラポリペプチドは医薬品としての使用に適している；および（３）キメラポリペプチドは本質的に、それが医薬品として使用（すなわち適応、投与法、有効量および治療計画）されるように意図された条件（それは本質的に本発明のナノボディの使用に対して本明細書で記述した条件に類似していてよい）下で非免疫原性であることが好ましい。
非限定的一実施態様にしたがって、キメラポリペプチドは、少なくとも１つの骨格配列を介して結合している（上述した）少なくとも２つのＣＤＲ配列を含んでおり、好ましくは該２つのＣＤＲ配列のうち少なくとも１つは、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列である他のＣＤＲ配列と結合しているＣＤＲ３配列である。好ましいが限定的ではない実施態様に従って、キメラポリペプチドは、少なくとも２つの骨格配列を結合している（上述した）少なくとも２つのＣＤＲ配列を含んでおり、好ましくは該３つのＣＤＲ配列のうち少なくとも１つは、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列、好ましくは一ＣＤＲ１配列および一ＣＤＲ２配列である他の２つのＣＤＲ配列と結合しているＣＤＲ３配列である。一特に好ましいが限定的ではない実施態様に従って、キメラポリペプチドは、構造ＦＲ１'‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２'‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３'‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４'を有し、ここではＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は本発明のナノボディのＣＤＲに対して本明細書で規定されており、ＦＲ１'、ＦＲ２'、ＦＲ３'およびＦＲ４'は骨格配列である。ＦＲ１'、ＦＲ２'、ＦＲ３'およびＦＲ４'は特に、それぞれ（ＶＨ３配列などの）ヒト抗体の骨格１、骨格２、骨格３および骨格４配列および／または該骨格配列の一部断片であってよい。構造ＦＲ１'‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２'‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３'‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４'を有するキメラポリペプチドの一部または断片も使用可能である。該一部または断片は前述のパラグラフに設定された基準を満たすものであることが好ましい。
実施例
Ａ．ｖＷＦに特異的であり血小板付着を阻害するナノボディの選択およびスクリーニング
実施例１：抗原特異性一価ナノボディ
表１５の配列番号６０〜６６に示されるナノボディは、ヒトｖＷＦまたはｖＷＦの組み替えＡ１ドメインで免疫化したラマから得る。ナノボディはｖＷＦのＡ１ドメインに結合し、血小板上のｖＷＦおよびｇｐＩｂ間相互作用を阻害する。
実施例２
ナノボディの発現および精製
プラスミドを調製（QIAGEN、メーカーの使用説明書にしたがって）し、ＷＫ６またはＴＧ１エレクトロコンピテント細胞へ形質転換した。単一コロニーを使用し、２%のグルコースおよび１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ中で一夜培養を開始した。この一夜培養した培養液を、１００μg/mlのアンピシリンを含む２ｘ３００mlのＴＢ培地に１００倍希釈し、６００nmでのＯＤが０．５になるまで３７℃でインキュベートした。1mMのＩＰＴＧを添加し、培養液を３７℃で３時間以上、または２８℃で一晩インキュベートした。
培養液を、１００００rpm、４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを−２０℃で一晩、または１時間凍結させた。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、２０mlのpｅｒｉバッファー（５０mMのＮａＨ２ＰＯ４および３００mMのＮａＣｌ）中に再懸濁し、室温で１時間振盪した。ペリプラズム断片を２００００rpm、４℃で２０分間遠心分離し単離した。ナノボディをメーカーが記述したとおりにニッケルカラム（TALON、Clonetech）で精製し、発現率を表１６に示したとおりに算出した。
実施例３
ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへのナノボディの結合
ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合について実施例１のナノボディを試験した。したがって、２００倍希釈したｖＷＦ（Red Cross）でマイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorb）を被覆し３７℃で１５分間、事前に加温した。プレートは４℃で一晩コーティングした。その後プレートはＰＢＳ‐Tween で洗浄し、ＰＢＳ‐１%カゼインを使用し室温で２時間ブロッキングした。洗浄後、試料を１０mg/mlの濃度から接触させ、ＰＢＳ中に３倍希釈した。２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１０００倍希釈したマウスモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を室温で１時間接触させた。プレートを洗浄し、ポリクローナル抗マウスＨＲＰ（DAKO）を１０００倍希釈し室温で１時間接触させた。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２ 基質を接触させた。４０５nmでのＯＤを測定した。結果を図１に示す。
実施例４
フローチャンバーにおけるナノボディによる血小板付着の阻害
タンパク質試料をかん流チャンバーで分析した。Thermanox coverslips（Nunc）を８０%エタノールに一晩浸漬し、蒸留水で完全に洗い流し風乾した。ヒト胎盤コラーゲンＩＩＩ型（Sigma）を０．０５mol/l の酢酸に可溶化し、レタッチエアブラシにより３０μg/cm2の最終密度でカバースリップ上にスプレーした。スプレー後、カバースリップをＰＢＳの１%ヒトアルブミン溶液で、室温で少なくとも１時間ブロッキングした。かん流を一過式かん流チャンバーによって非拍動のフロー条件で、０．１mmのスリット高さおよび２mmのスリット幅を有する、改変した小かん流チャンバーを用いて行った。血液は健常ボランティアから静脈穿刺によって得、Penta/PPACKで抗凝固処理した。３重カバースリップをチャンバーに挿入した。５mlの血液を、２μg/mlのナノボディを添加して、あるいは添加せずに３７℃で５分間事前に加温し、その後、輸液ポンプを用いて１６００ｓ‐１の壁せん断速度でチャンバーに５分間循環させた。かん流運転の後、カバースリップをチャンバーから取り出し、Hepesバッファーで緩衝した生理食塩水（１０mM のHepes、１５０mMのNaCL、ph７．４）で洗い流し、０．５%のグルタルアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、メタノール中で脱水し、May-GrunwaldおよびGiemsa（Riedel de Haen）で染色した。光学顕微鏡およびコンピューター支援機器を使用して血小板表面被覆率として血小板沈着を評価した。結果を表１７に示す。明らかにナノボディ１２Ｂ６および１２Ａ５は、高せん断速度にてかん流チャンバー中でコラーゲンＩＩＩ型への血小板付着を阻害する。
実施例５
相同体ナノボディのｖＷＦへの結合についてのＢＩＡＣＯＲＥ分析
ナノボディ１２Ｂ６および１２Ａ５はかん流チャンバーにおける血小板付着を阻害する。相同体配列は、表１８の配列番号６７〜７３に示されるアミノ酸の相違を有するラマから得た。図２および３は、１２Ａ５および１２Ｂ６相同体ナノボディ配列のアラインメントを表している。
アミンのカップリングを介してｖＷＦをセンサーチップ表面に共有結合させた。ＥＤＣ／ＮＨＳ（混合比１：１の０，４Mの１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミドおよび０，１MのＮ‐ヒドロキシスクシンイミドの水溶液）を注入することによってチップのＣＭ５表面を７分間活性化した。活性下では、検出された反応単位が６０００に上昇するまでｖＷＦを注入した。過度の反応群を、１Mのエタノールアミン‐ＨＣｌ（ｐＨ８，５）で７分間不活化した。固定化手順の間、流速は５ul/minに一定に保った。溶離バッファーは、０，１５MのＮａＣｌ、３mMのＥＤＴＡおよび０，００５%のSurfactant P20を含む０，０１MのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）であった。
図４および５に示すとおり５μg/mlのナノボディ濃度でｖＷＦについてＢＩＡＣＯＲＥでナノボディ１２Ｂ６および１２Ａ５ならびにそれらの相同体タンパク質を分析した。評価したＫ‐ｏｎ、Ｋ‐ｏｆｆおよびＫＤ値を表１９および２０に表した。ナノボディ１２Ａ５および１２Ｂ５は最大Ｋ‐ｏｎおよびＫ‐ｏｆｆ速度を有する。ナノボディ１２Ａ２および１２Ｂ６は最大Ｋ‐ｏｎ速度を有し、Ｋ‐ｏｆｆ速度はすべての試験ナノボディとかなり同程度である。
表２１は、ナノボディ濃度の範囲を用いたＢＩＡＣＯＲＥでのｖＷＦについての実質ＫＤ値を表す。各ナノボディに対して生じた曲線の設定から、平衡状態になったこれらの曲線のみを使用し、安定状態の親和性を介してＫＤ値を導いた。
急性の事象に対処するためには、ｖＷＦを迅速に阻害することが非常に重要であり、したがってＫ‐ｏｎ速度は速いことが好ましい。Ｋ‐ｏｎ速度は、ヒトまたは動物に注入されたときにナノボディがその標的（ｖＷＦ）にどれくらい速く結合するかを判定する。
実施例６
かん流チャンバーにおける作用強度についてのナノボディ阻害の比較
血小板付着の阻害について作用強度を比較するために、ナノボディ１２Ａ２、１２Ｂ６および１２Ａ５を０．２、０．４および０．６μg/mlで、かん流チャンバー中で試験した。実験はすべてのナノボディに対して同一のドナーで行った。結果を表２２および図６に示す。かん流チャンバー中でナノボディは、０．６μg/mlのナノボディ濃度での血小板付着の完全な阻害とかなり同程度の阻害能を示す。
実施例７
上昇温度でのナノボディの安定性
ＰＢＳ中２００μg/ml濃度のナノボディ原液を調製し、いくつかの試験管に分注した。ナノボディが入った各試験管を様々な温度で１時間インキュベートし、その後室温で２時間冷却し、４℃で一晩置いた。翌日、試料を１３０００rpmで３０分間遠心分離し、２８０nmでのＯＤについて上清を試験した。上清濃度を分光測光法で測定し、室温でのパーセント濃度として表した。結果を表２３に要約する。
実施例３で上述されたようにｖＷＦへの結合について上清もＥＬＩＳＡにて試験した。図７ａ（１２Ｂ６）、７ｂ (１２Ａ２) および７ｃ (１２Ａ５)に示すとおり、ナノボディは上昇温度で非常に安定している。
実施例８
他の種から得たナノボディのｖＷＦとの交差反応
マイクロタイタープレートを１／１０００希釈したマウス抗ｍｙｃで４℃で一晩コーティングした。プレートはＰＢＳ‐Tween で洗浄し、ＰＢＳ‐１%カゼインを使用し室温で２時間ブロッキングした。洗浄後、ＰＢＳ中１０mg/mlの濃度でナノボディを接触させた。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、初めは５倍希釈から血漿（イヌ、ブタ、ヒト、ヒヒおよびカキクイザル）を接触させ、ＰＢＳでさらに２倍希釈した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ポリクローナル抗ｖＷＦ‐ＨＲＰ（DAKO）を、室温で１時間、２０００倍希釈で接触させた。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／H２O２基質を接触させた。４０５nmでのＯＤを測定した。
図８ａ（１２Ｂ６）、８ｂ（１２Ａ２）および８ｃ（１２Ａ５）に示すとおり、ナノボディ１２Ａ５、１２Ａ２および１２Ｂ６は、ヒト、ヒヒおよびカニクイザルのｖＷＦと交差反応している。ナノボディ１２Ａ２および１２Ｂ６もまたブタｖＷＦと交差反応している。したがってこれらのナノボディは、ブタにおいて有効性および安全性について試験することが可能である。どのナノボディもイヌｖＷＦとは交差反応しない。
Ｂ．ｖＷＦに特異的であり血小板付着を阻害する二価ナノボディの構築
実施例９
二価ナノボディのアミノ酸配列
表２４の配列番号７４〜８２は、１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５に対して構築された二価ナノボディを表している。ナノボディは表２５の配列番号８３〜８５に示されるリンカーと結合した。
実施例１０
二価ナノボディの発現および精製
実施例２で上述したように発現を行った。発現率を表２６に要約する。
実施例１１
ＢＩＡＣＯＲＥにおける二価ナノボディの分析
実施例５で上述したようにＢＩＡＣＯＲＥで、実施例９の二価ナノボディを１，３nMで分析し、ｖＷＦ対一価ナノボディについての親和性を比較した。二価ナノボディ１２Ｂ６（図９）、１２Ａ２（図１０）および１２Ａ５（図１１）では、一価ナノボディと比較してｖＷＦに対する親和性が改善されている。
実施例１２
上昇温度での二価ナノボディの安定性
実施例７で上述したように二価ナノボディの安定性を測定した。上清濃度（mg/ml）を測定し、室温での濃度パーセントとして表した。結果を表２７（二価１２Ｂ６）、表２８（二価１２Ａ２）および表２９（二価１２Ａ５）に要約する。
実施例３で上述したようにｖＷＦへの結合についてＥＬＩＳＡで上清を試験した。上清を、最初に１／１００希釈で接触させ、さらにＰＢＳで１／５に希釈した。結果を図１２（１２Ｂ６）、図１３（１２Ａ２）および図１４（１２Ａ５）に示す。
実施例１３
フローチャンバー中の一価および二価１２Ａ２の分析
実施例４で上述したように、かん流チャンバーでナノボディ１２Ａ２（一価および二価形態）を試験した。実験はすべてのナノボディに対して同一のドナーで行った。結果を表３０に要約する。二価ナノボディは一価形態よりも効率的に血小板付着を阻害する。
Ｃ．ｖＷＦに特異的であり血小板付着を阻害するナノボディのヒト化
実施例１４
１２Ｂ６ナノボディのヒト化
表３１の配列番号８６〜８９は４つのヒト化１２Ｂ６ナノボディを示している。表１１では、これらの配列を可能にするために起こったアミノ酸変化を一覧にしている。図１５は１２Ｂ６に対するヒト化配列のアラインメントを示している。
表１１：非限定的ヒト化置換
Figure 0004986997
実施例２に記載のとおりに発現を行った。発現率を表３２に要約する。
実施例７に記載のとおりにヒト化ナノボディの安定性を測定した。表３３では、室温での濃度パーセントとして表した上清の２８０nmでのＯＤ濃度（μg/ml）が要約してある。
図１６には、実施例３に記載のとおりに行われたＥＬＩＳＡでのヒト化１２Ｂ６ナノボディのｖＷＦへの結合が示されている。
ｖＷＦに対するヒト化１２Ｂ６ナノボディの親和性をＢＩＡＣＯＲＥで判定した。ＫＤ値は表３５に要約する。
実施例１５
１２Ａ２ナノボディのヒト化
表３５の配列番号９０〜９４は５つのヒト化１２Ａ２ナノボディを表している。表１２および１３では、これらの配列を可能にするために行われた以下のアミノ酸変化を一覧にしている。図１７は１２Ａ２に対するヒト化配列のアラインメントを示している。
表１２：非限定的ヒト化置換
Figure 0004986997
表１３
Figure 0004986997
実施例２に記載のとおりに発現を行った。発現率を表３６に要約する。
実施例７に記載のとおりにヒト化ナノボディの安定性を測定した。表３７では、室温での濃度パーセントとして表した上清の２８０nmでのＯＤ濃度（μg/ml）が要約してある。ヒト化１２Ａ２ナノボディはすべて上昇温度での加熱中、非常に安定している。
実施例３に記載のとおりに図１８および１９のＥＬＩＳＡを行った。１２Ａ２Ｈ１および１２Ａ２Ｈ４はＥＬＩＳＡにおいて非常に良好にｖＷＦに結合している。
ナノボディを、０．７μg/ml および１．５μg/mlの濃度でフローチャンバー中で試験した。実施例４に記載のとおりに実験を行った。結果を表３８および３９に示す。
ｖＷＦに対するヒト化１２Ａ２ナノボディの親和性をＢＩＡＣＯＲＥで判定した。ＫＤ値を表４０に要約する。
実施例１６
１２Ａ５ナノボディのヒト化
表４１の配列番号９５〜９７は３つのヒト化１２Ａ５ナノボディを示している。表１４では、これらの配列を可能にするために行われたアミノ酸変化を一覧にしている。図２０は１２Ａ５に対するヒト化配列のアラインメントを示している。
表１４：非限定的ヒト化置換
Figure 0004986997
実施例２に上述したとおりに発現を行った。各ヒト化１２Ａ５ナノボディについてＴＡＬＯＮ精製後の発現率を表４２に要約する。
実施例７に上述したとおりにヒト化１２Ａ５ナノボディの安定性を測定した。上清の２８０nmにおけるＯＤを測定し、室温での２８０nmにおけるＯＤパーセントで表した。結果を表４３に要約する。ヒト化１２Ａ５ナノボディはすべて上昇温度での加熱中、野生型と同等に安定している。
実施例３に記載のとおりにＥＬＩＳＡを行った。図２１はＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦに対する結合活性を説明するものである。
ｖＷＦに対するヒト化１２Ａ５ナノボディの親和性をＢＩＡＣＯＲＥで判定した。ＫＤ値を表４４に要約する。
実施例１７
二価ヒト化ナノボディ
３つのヒト化ナノボディ１２Ａ２Ｈ１、１２Ａ２Ｈ４および１２Ｂ６Ｈ２を、３ａリンカーを有する二価形態のために選択した。これら３つのナノボディの配列は、図２２に示すとおり２、３のアミノ酸のみが異なっている。表４５の配列番号９８〜１００では、二価ナノボディの配列を一覧にしている。表４５の配列番号１０１〜１０６では、それぞれＧＳ９およびＧＳ３０リンカーと結合しているヒト化二価ナノボディの配列を一覧にしている。
実施例２に記述したとおりに発現を行った。（Ｈｉｓ）６‐タグを含むナノボディをメーカーが記述したとおりにニッケルカラム（TALON、Clonetech）で精製した。タグ‐配列は、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨである。タグのないナノボディをタンパク質Ａで精製した。発現率を算出し、表４６に要約する。
実施例７に記述したとおりにヒト化二価ナノボディの安定性を測定した。上清の２８０nmでのＯＤを測定し、室温での２８０nmでのＯＤパーセントで表した。結果を表４７に要約する。
（ヒト化ならびに野生型の）ナノボディを、０．１５μg/ml、０．３μg/mlおよび０．６μg/mlの濃度でフローチャンバー中で試験した。全ての実験に同一のドナーを使用した。実施例４に記述したとおりに実験を行った。図２３は異なる二価ナノボディ濃度での血小板付着を示している。表４８では、野生型およびヒト化二価ナノボディの血小板付着を一覧にしている。
Ｄ．ヒヒＦＯＬＴＳモデルにおける動脈血栓症に対する（二価）ナノボディの効果
実施例１８：ALX-0081でのヒヒＦＯＬＴＳモデル
本試験では、ヒヒのＦｏｌｔｓ血栓症モデルにおいてALX-0081の有効性および安全性を評価した。
また、ヒヒのＦｏｌｔｓ血栓症モデルにおけるALX-0081の有効性および安全性をReopro、Plavix、Aspegic、HeparinおよびEpinephrinなどの臨床で現在使用されている他の薬物と比較した。これらを全て０．９%の塩化ナトリウムに希釈し、静脈内ボーラス注射で投与した。本研究は、これらの各化合物に対する有効量を決定するために、同様にうまく考えられている。
最終的に、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）の設定において臨床で現在使用されているAspegic、HeparinおよびPlavix などの薬物を併用したヒヒのＦｏｌｔｓ血栓症モデルの有効性を試験した。さらに本発明者らは、追加投与された場合ALX-0081はこの併用の有効性を改善できるかを評価した。
本発明者らは、出血誘発、ｖＷＦおよびファクターＶＩＩＩのレベル、および血小板数、ＰＴならびにａＰＴＴなどの安全性評価基準を調べた。
研究プロトコール
適用された研究プロトコールは、後述の元のＦｏｌｔｓモデルおよびいくつかの改変型である（Folts JDら、Circulation. 1976; 54: 365-370）。
健常ヒヒ（Papio ursinus）の雄または雌を使用した。動物の体重は８〜１７kgであり、使用前の少なくとも２週間は疾患にはかかっていなかった。ヒヒにはドライの標準的餌のみを与えた。異なる時点でヒヒを使用した。ヒヒの体重は表４９（ALX-0081の有効性試験および個々の薬剤との比較）、および表５０（薬剤の併用および該併用にALX-0081を加えた場合の有効性）に要約する。
動物を麻酔し、保温テーブルを用いて体温を３７℃に保つ。大腿動脈の断片を切除し、周辺組織が無い状態にした。大腿静脈および大腿動脈の間にシャントを留置し、高せん断速度を得た。平均および血流相を、実験の全工程にわたって連続的に記録した。基準流量を２０分間記録した。その後大腿動脈の近位切除部位を、鉗子を使用し１秒間動脈を二重に閉塞することによって損傷させた。クランプを損傷部位にわたって留置し、外部狭窄を作った。
血小板付着および凝集による血流の段階的減少が見られた。流量がセロまで減少したら、クランプを開いて血流を回復させ、多血小板血栓を取り除いた。血流を減少させ、続いて機械的に回復させるこの反復パターンは、循環流減少（ＣＦＲ）と称される。必要に応じて内皮損傷を繰り返し追加し、最終的にこれらのヒヒにおいてＣＦＲが安定した。取り除く必要のある血栓の階数はＣＦＲの数を決定する。図２４はヒヒのＦｏｌｔｓモデルにおける血流パターンを説明するものである。
再生可能ＣＦＲの３０分間の対照期間の後、内部対照としてビヒクルを投与し、さらに３０分間ＣＦＲを経過観察した。この期間の後、試験薬（生理食塩水（ｎ＝２）、Reopro（ｎ＝３）、Aspegic（ｎ＝３）、Plavix（ｎ＝４）、Heparin（ｎ＝３）またはALX-0081ナノボディ（商標）（ｎ＝９））を静脈内ボーラス注射で投与し（この後、ALX-0081を連続的に点滴する）、薬剤を投与した後３０分まで監視を続けた。この手順を、該試験物質の用量を増加しながら数回繰り返した。薬剤投与の前後のＣＦＲの長さを比較して抗血栓効果を定量した。ＣＦＲが完全に阻害されていることを観察したときに、阻害が治療効果であり、自然治癒現象ではないことを確認するため新たに損傷を行った。実験の最後に、ＣＦＲの弱い阻害と強い阻害を区別するためにEpinephrin（２．２μg/kg/min）を注入した。実際、同一モデルでアスピリン（弱い抗血小板薬剤）を使用した場合、Epinephrinの存在下でＣＦＲが再び現れることは以前、実証されていた。
実験の準備は説明された図２５である。
試験化合物の各服用後におけるＣＦＲの長さを表５０〜５５に要約する。ＣＦＲが完全に阻害される用量に影をつけた。
Folts モデル実験中の血流の代表的な読み出しは図２６〜３１に示す。
結果から、ＣＦＲは少なくとも３時間で対照動物内に得られ、その間に新しく損傷する必要は無いことが分かる。ＣＦＲの平均的な長さは２〜５分であり、生理食塩水の注入によってＣＦＲの長さは影響を受けない（図２６、表５０）。
Aspegic
３匹の動物にAspegic（注入可能なアスピリン）を注入し、ＣＦＲの阻害を調査した。診療所では、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）手技の開始直前に患者に２５０mg（±３〜５mg/kg）をボーラス注射で投与する。２匹の動物（ヒヒ３および５）において、それぞれ８０および４０mg/kgものAspegicの用量でＣＦＲは阻害され得なかった（図２７、表５１）。ヒヒ４では、対照相でＣＦＲの安定した反復パターンを定着させることは非常に難しかった。損傷を新しく数回（本発明者らが生理食塩水を注入した時点に）行った後、安定したＣＦＲを得た。Aspegic の５mg/kg 用量でＣＦＲは完全に阻害されたが、より高い用量で新たに阻害すると、ＣＦＲの平均的長さはAspegic 投与前より３〜４倍長かったにもかかわらずＣＦＲは元に戻った。Epinephrinの投与後、ＣＦＲはすみやかに完全に元に戻った（表５１）。
Heparin
３匹の動物に非分画Heparinを注入し、ＣＦＲの阻害を調査した。診療所では、患者に６０〜７０IU/kgをボーラス注射で投与し、ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を３０分間毎に監視した。ａＰＴＴが＜２５０秒なら過剰なHeparinを投与する。ヒヒ７および８において、２４０IU/kgほどの用量ではないときでさえＣＦＲは阻害され得なかった（図２８、表５２）。ヒヒ６において、最初の１５IU/kg用量およびさらに高用量でＣＦＲは完全に阻害されたが、新たに阻害するとＣＦＲは各時点で戻った。２４０IU/kgの最高用量で、新たな損傷の後でさえＣＦＲは阻害されたが、流量は減少し、Epinephrinを注入するとＣＦＲはすみやかに元に戻った。
Plavix
４匹のヒヒにPlavix を投与し、Folts試験に使用した。本発明者らは、タブレットをメタノールに再懸濁することによって注入可能薬剤として使用した。したがって、本発明者らは、他の薬剤に関して用量漸増実験行うことができた。患者に３００〜６００mgのPlavixを経口投与し、Plavixの単独経口投与の２時間後に血小板凝集の阻害が見られた。ヒヒに２．５mg/kgを最終投与した時点ですでに、ＣＦＲの長さに効果的であることが分かったが、この阻害効果は注入からわずか１０分後に始まった（図２９、表５３）。ヒヒ１２において、この２，５mg/kg 用量でＣＦＲは完全に阻害された。他の３匹のヒヒにおいて、５mg/kgの最終用量でＣＦＲは完全に阻害された。新たに損傷したときＣＦＲは阻害されたままであったが、Epinephrinの注入後元に戻った。Epinephrin注入を止めると、ＣＦＲはさらに５分間残っていたがその後再び完全に阻害された（図２９）。
Reopro
３匹のヒヒのFolts モデルで有効性についてReoproを試験した。診療所では、患者に２５０μg/kgを投与し、その後７，５μg/kg/時間で連続的に点滴する。これも、ＣＦＲが完全に阻害されるために、ヒヒ１３、１４および１５に必要とされる用量である（最終用量１７０〜４２０μg/kg（図３０、表５４）。本発明者らはボーラス注射のみでヒヒに投与した。新たに損傷したとき、ＣＦＲの完全な阻害は維持され、Epinephrinを注入してもこの阻害は逆行できなかった（図３０）。
ALX-0081
ALX-0081を９匹のヒヒに投与しFoltsモデルで使用した。すべてのヒヒにおいて、３０μg/kg＋４５μg/kg/時（最終用量４３μg/kg）の用量でCFRは完全に阻害された。２匹のヒヒにおいて、１０μg/kg＋１５μg/kg/時ですでに完全に阻害された（ヒヒ１７および２２）。９匹のヒヒすべてにおいて、新たに損傷し、Epinephrinを注入した後、阻害は維持されていた（図３１、表５５）。
Aspegic‐Heparin‐Plavix‐ALX-0081（Asp/Hep/Plav/ALX）の併用
7匹のヒヒに５mg/kgのAspirin、６０IU/kgのHeparinおよび漸増用量のPlavixをボーラス注射で投与した。過剰なHeparinを異なる時点で投与し、一定のレベルを維持した（ａＰＴＴは対照に対して少なくとも2倍行うことが好ましい）。試験化合物の各服用後３０分間ＣＦＲを監視した。Plavixの投与を１mg/kgで開始し、３０分後に1 mg/kgを追加した。薬剤投与の前後のＣＦＲの長さを比較して抗血栓効果を定量した。ＣＦＲが完全に阻害されていることを観察したときに、新たに損傷を行った。Epinephrinを注入し、実験が終了するまで継続した。ＣＦＲが元に戻らなければ、新たに損傷を行う。２〜３回ＣＦＲがあった後、漸増用量のALX-0081を添加した：（１）、３、１０または３０μg/kg。本発明者らはALX-0081の各服用後、２回のＣＦＲを待ち、ＣＦＲが完全に阻害されるまで用量を増加した。ＣＦＲが完全に阻害された時点で、１，５倍用量/kg/時のALX-0081の連続的な点滴を開始し、３０分間行い、epinephrin注入を続けた。１０〜１５分後、新たに損傷を行った。本試験で使用のヒヒの詳細を表５６に示す。
各試験化合物のこれらの研究から得た結果を個別に表５７に要約する。Aspirin、HeparinまたはPlavixと比較して、ALX-0081およびReoproではFolts血栓ヒヒモデルにおいて明確で優れた抗血栓効果を観察した：新たに阻害を行い、Epinephrinを注入した後、Aspegic、HeparinまたはPlavixを投与した動物モデルと対照的に、ALX-0081およびReopro投与ヒヒのFoltsモデルではＣＦＲは元に戻らない。ＣＦＲを完全に阻害するのに必要なALX-0081の用量は、Reoproに必要な用量のおよそ１０倍少ない。したがって、ALX-0081はReoproよりも効果的であると結論づけられる。
５mg/kgのAspirin、６０IU/kgのHeparin、漸増用量のPlavixを併用した後、この最終用量で７匹のヒヒにおいてＣＦＲが完全に阻害された。完全な阻害に必要なPlavixの用量は、Plavix単独を投与したときに必要とする用量よりも２，５倍少ない。試験したヒヒすべてで、ＣＦＲは、新たに損傷が行われたとき元に戻らなかった（図３２）。しかしながら、Epinephrinを注入すると、ヒヒ５、８、９および１０でＣＦＲが自然に元に戻り、新たに損傷を与えると、ヒヒ４、６および７で元に戻った。過剰なHeparinをepinephrinと同時に注入した。２回のＣＦＲの後、Epinephrinの注入を継続しながら漸増用量のALX-0081を投与した。ALX-0081の用量は１μg/kgから、３〜１０μg/kgは除いて３０μg/kgまで増やした。ＣＦＲが完全に阻害されたら、１，５倍の有効用量/kg/時間でALX-0081の連続的な点滴を開始した。７匹すべてのヒヒにおいて、３０μg/kg用量でＣＦＲは完全に阻害された。ALX-0081のこの有効量は、ALX-0081単独を投与したときにFoltsモデルのＣＦＲを完全に阻害するのに必要な量と同じである。
したがって本発明者らは、Plavix、HeparinおよびAspegicの同時注入ではALX-0081の有効性は増大しないと結論付けることができる。この所見は本発明者らの仮説と完全に一致している：ALX-0081は、血小板と損傷した動脈壁の露出したコラーゲン間の全く初めての相互作用を阻害する。他方PlavixおよびAspegicは、血栓を発生させるカスケードにおける終了段階をさらに阻害する。したがって、ALX-0081は血栓形成の最初の段階をすでに阻害しているので、PlavixおよびAspirinは有効性にはあまり寄与していない。さらに、ALX-0081を有効量で投与した場合に新たに損傷を行うと、ＣＦＲは元に戻らず、このことからこのナノボディ（商標）の抗血栓効果が強力であることが分かる。結果を表５８に要約する。
測定
以下のパラメーターを測定した：ａ）出血分析、ｂ）ｖＷＦ濃度、因子ＶＩＩＩレベル、および血小板数、ＰＴおよびａＰＴＴ ｃ）リストセチン誘導血小板凝集 ｄ）ALX-0081の濃度、およびｅ）再狭窄についての動脈区分の分析、ｆ）ALX-0081の免疫原性。
ａ）出血分析
出血を分析するために、鼠径部をメスで切開した。このことは基準流量を記録した１５分後に行い、このとき動脈に損傷を加えた。ガーゼを創傷に挿入し、試験化合物を各々新たに服用する直前に３０分毎に交換した。試験化合物の各服用後の失血量を、ガーゼを秤量して測定した。（生理食塩水の注入の間）第二の対照ガーゼの失血量と比較した失血を表す（表５９〜６１）。
すべてのヒヒにPlavixおよびReoproを投与したにもかかわらず、有効用量から失血は多い（それぞれ最高用量で９〜４０倍まで）。ALX-0081を投与した動物では、失血はPlavix 投与動物のものよりも少なく、Reopro 投与動物と比較して非常に少ない。
抗血栓薬としてのPlavix、ReoproおよびALX-0081の安全性対有効性レベルを判定するために、第二の対照ガーゼと比較した平均失血量を、これらの薬剤について、多様な有効用量としての薬剤用量の関数で示す（図３３）。Plavixの有効用量は５mg/kg、Reoproでは２５０μg/kg 、ALX-0081では３０μg/kgである（表５３〜５５）。これらの結果により、ReoproおよびPlavixと比較してALX-0081の優れた安全性がうまく実証される：出血の顕著な増加もなくALX-0081が投与され得る枠は、PlavixおよびReoproと比較してかなり広い。
ガーゼの平均失血量から得た結果を（可能であれば）、図３４〜３６のＣＦＲの平均的長さと合わせた。
Folts モデルにおいてALX-0081の広い治療枠が見られた：４３μg/kgから４０３μg/kgまでの範囲の累積的投与量で顕著な出血もなく、強い血栓効果を示した（図３６）。しかしながら、対照として、同一モデルにおけるReoproおよびPlavixの治療枠は、有効抗血栓効果と失血多量を合わせて考えて、ALX-0081と比べて極めて狭かった（図３４〜３５）。
第二の対照ガーゼと比較した総失血量の平均（＝試験化合物について最初の５回の用量のガーゼから得られた失血の合計）は表６２に要約する。この表では、本発明者らは多種の有効量（＝有効用量別の５つの用量の合計）として最終用量も示す。前に述べたように、Plavixの有効用量は５mg/kgであり、Reoproでは２５０μg/kg 、ALX-0081では３０μg/kgである。
表６２に示した結果から、総失血量はPlavixを投与した動物では有意に増加し、Reoproを投与した動物ではより広範囲に増加することが判る。ALX-0081を投与した動物の失血量は、PlavixまたはReoproを投与した動物のものよりも、それぞれ２および４倍少ない。このことから、有効量の１０倍を超える用量を使用したにもかかわらず、出血の危険に関してALX-0081はPlavixおよびReoproよりも安全であることが再度明確に立証される。
Aspegic、HeparinおよびPlavixを効果的に併用すると、対照ガーゼと比較して１４倍まで失血が増加する（表６３）。Aspegic、HeparinおよびPlavixの併用にALX-0081を添加すると、ヒヒ４および７以外では出血は増加しなかった。ヒヒ７では、epinephrin、過剰heparinおよび非有効用量のALX-0081の投与後出血量はかなり増加したが、有効用量のALX-0081の投与後では再び減少した。これらの結果から、臨床状況で現在使用されている薬剤を併用することに加えて、ALX-008を追加した場合、ALX-0081は安全であることが判った。
ｂ）ｖＷＦ濃度、因子ＶＩＩＩレベル、血小板数、ＰＴおよびａＰＴＴ
ｖＷＦ
Foltsモデルにおける異なる用量の薬剤投与後に得た血液試料の多血小板血漿（ＰＲＰ）のｖＷＦレベルは、免疫吸着分析法で判定しヒト標準（因子ＶＩＩＩおよびＶＷＦに関するＷＨＯ第５国際基準）の百分率で表した。
結果から、モデルに使用した異なる薬剤がｖＷＦレベルに何ら大きな効果がないことがはっきりと実証される。
因子ＶＩＩＩ
Folts モデルにおける異なる用量の薬剤投与後に得た血液試料のＰＲＰの因子ＶＩＩＩレベルは、ａＰＴＴ試験で判定した。本発明者らはHeparinがａＰＴＴ時間を延長することを立証したので、Heparinを投与したヒヒの血漿試料は試験しなかった。ＦＶＩＩＩレベルを、大腿動脈の損傷から１０分後に得た最初の対照試料に対する百分率で表した。ａＰＴＴ試験への治療効果は何も見られなかった。
血小板数、ＰＴおよびａＰＴＴ
Foltsモデル実験での血小板数を測定した。データから、ヒヒ１５は他の動物と比較して血小板数がかなり少ないことが判った。Plavix投与以外の全種の治療で血小板数は対照動物に見られるものとかなり同程度であり、長時間ほとんど一定である。
ＰＴ値から、試験化合物はＰＴ時間には何ら影響を与えないことが分かるが、例外的に２４０IU/kg用量のHeparinを投与したヒヒでは、ＰＴの多少の増加が見られた。
Foltsモデル研究で観察したａＰＴＴ値を要約する。これらの結果から、試験化合物はａＰＴＴ値には何ら影響を与えないことが分かるが、Heparinを投与したヒヒは例外である。これらの動物において、患者でも見られるようにａＰＴＴ値は３０〜６０IU/kg用量以降、延長されている。Heparinはアンチトロンビンと複合体を形成し、ＸＩａ、ＩＸａ、Ｘａおよびトロンビンなどの活性化血液凝固因子（因子ＩＩａ）を触媒することによって抗凝固剤として作用する。これらの因子はすべて、機能性をａＰＴＴ試験で測定する内因性凝固カスケードに関連している。
ｃ）ALX-0081を投与したヒヒから得た血液におけるリストセチン誘導血小板凝集の測定
ALX-0081を投与したヒヒから得た血液を血小板凝集の阻害について分析した。Chronolog 全血および光学凝集能測定装置で血小板凝集を行った（Model 560CA、Chronolog、USA）。全血を１２００rpmで５分間遠心分離しＰＲＰを調製した（０．３８mol/Lのクエン酸塩に集めた）。ＰＲＰを含む上方の画分を注意深く分離した。下方の画分をさらに３０００rpmで１０分間遠心分離し乏血小板血漿（ＰＰＰ）を調製した。ＰＲＰ中で血小板を計数し、終濃度が２００、０００個／μlになるようにＰＰＰに希釈した。３mg/mlのリストセチン（DAKO）を添加し、凝集を測定した。
エクスビボでの血小板凝集を、ALX-0081を投与したヒヒにおいてFolts実験にて得た血液試料中で測定した。ｖＷＦを介したGPIb-IX-V依存血小板凝集を、リストセチンを調節剤として測定する。凝集のパーセンテージを各時点および各用量で測定する。動脈損傷の１０分後に対照試料を得る。
ＲＩＰＡ試験から得た結果を、ALX-0081を投与した各ヒヒについてのＣＦＲ阻害と比較する（図３７）。図３７に示すように、ＲＩＰＡとＣＦＲの長さ間に逆相関が見られた。さらにこれらの結果から、ヒヒ１６、１８、１９および２３において、ＲＩＰＡ試験での完全阻害はＣＦＲの完全阻害よりも低い用量で得られることが明らかである。ヒヒ２０、２１、２２および２４について、ＲＩＰＡでの結果とFoltsモデルでの有効性についての結果とは明確に同等である。
ｄ）ALX-0081の濃度
マイクロタイタープレートを１０００希釈したマウスポリクローナル抗ｍｙｃで４℃で一晩コーティングする。プレートはＰＢＳ‐Tween で洗浄し、ＰＢＳ‐１%カゼインを使用し室温で２時間ブロッキングする。２５%の基準ヒヒ血漿中にある非被覆マイクロタイタープレートに試料を希釈する。ナノボディを同一の基準ヒヒ血漿試料に希釈して標準曲線を調製する。試料を抗ｍｙｃ被覆プレートに接触させ、室温で２時間結合させる。プレートをＰＢＳ‐Tweenで５回洗浄する。ウサギ抗ｖＷＦ‐ＨＲＰ（DAKO）を３０００倍希釈で室温にて１時間接触させる。４０５nmでのＯＤを測定するため、試料をＰＢＳ‐Tweenで５回洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２ 基質を添加する。
本発明者らは、各ボーラス注射の１０分後に得られた血漿試料中でALX-0081濃度を測定した。ボーラス注射の直後、連続的な点滴を行った。濃度（μg/ml）を表６５に要約する。
すべてのヒヒでは、血漿試料中のALX-0081の上昇レベルは、ALX-0081の用量増加後にＥＬＩＳＡによって測定した。ヒヒ１６では、測定されたALX-0081の量は、１０μg/kg服用後に得られた血漿試料では、３０μg/kg服用後に得られた試料と比較して常に高かった。その試料におけるALX-0081レベルも、ALX-0081の同じ投与スケジュールを行った他のすべてのヒヒで記録したものよりも実質的に高い。高めの用量服用後のヒヒ１６でのALX-0081レベルは予測上のものなので、本発明者らは、血液のサンプリング中の未知の異常がこの異常値の原因であると推定する。
異なるヒヒでの各用量についてのALX-0081濃度は、変化可能である。３μg/kg用量に対して、濃度は０，０３〜０，１４μg/mlの範囲にあり、１０μg/kg用量に対しては０，１８〜１，２３μg/ml の範囲にあり、３０μg/kg用量に対しては０，５１〜１，１４μg/ml の範囲にあり、９０μg/kg用量に対しては１，３８〜６，７７μg/ml の範囲にあり、また２７０μg/kg用量に対しては４，０３〜３５，１４μg/ml の範囲にある。
図３８では、血漿中ALX-0081濃度対ＣＦＲの長さをプロットしている。
ＣＦＲを完全に阻害するのに必要なALX-0081の濃度は０，３〜０，５μg/mlの範囲にあり、これは高せん断速度でのフローチャンバー内での血小板のコラーゲンへの付着を阻害するのに必要な濃度と完全に一致しており、このときALX-0081はヒト血液中で急上昇する。青色（図３８、パネルＢ）はALX-0081の濃度範囲を示し、この濃度で阻害が始まる（ヒヒ１６での１０μg/kg用量は除外する）。
ALX-0081濃度対カーゼから得た相対的失血量をプロットしたとき、１μg/mlを超える用量で出血が２倍を超える上昇となることが分かる（図３９）。ALX-0081 濃度が有効濃度の４０〜６０倍である１９μg/mlのとき、１０倍の失血増加が見られた。
ｅ）再狭窄に関する動脈切片の分析
第２の動脈の治療の４週間後に、動脈を切開し周囲組織が無い状態にする。動脈を、シャントを留置した部位を含む内皮損傷の上および下部で縛る。ある部位を２cm切り取り、下部（シャント部位）および上部（狭窄および損傷した部位）でカットし、１０%ホルムアルデヒドで保存する。その後ヒヒをeuthanase注射で屠殺する。起源にしたがって動脈に印を付し、各２mmに輪切りにする。輪は、組織学的手技に適した、印を付けたカセットに入れる。その後カセットを自動ＶＩＰ組織Ｔｅｋ処理機中で、Bancroft に記述された一夜処理スケジュールにしたがって一晩放置する。（Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory and Practice of Histological Techniques. 第３版）。
処理後、印を付けたパラフィンワックスブロックに動脈を包埋し凍結プレート上で冷却する。ロータリーミクロトーム上でワックスブロックをカットし各４μの連続的な切片にする。切片を選びガラススライドに載せ、組織学的評価をするために染色する。弾性繊維染色のためのヘモトキシリン法、エオシン法ならびにVerhoeff法を、各動脈で行う（Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Theory and Practice of Histological Techniques. 第３版）。染色後、スライドを乾燥し、透明にし、設置し、標識化する。切片を事実に基づかずに分析を行う。
ｆ）免疫原性分析
３匹のヒヒの血漿におけるALX-0081免疫グロブリンの有無を２つの方法、ＢｉａｃｏｒｅでのそれぞれＥＬＩＳＡ法およびＳＰＲをベースにした方法で評価した。ヒヒに漸増用量（１０mg/kgから開始）のALX-0081を８週間投与した。その８週間の間、ALX-0081の注入で免疫原性反応は見られなかった。ALX-0081の半減期は７〜９時間の範囲であった。
実施例２０
ALX-0081の解毒剤としてのｖＷＦの使用
ヒヒにおけるALX-0081の安全性が分かり、ナノボディ（商標）をすみやかに除去したにもかかわらず、本発明者らはALX-0081の解毒剤としてのｖＷＦの使用を評価することを決定した。このことはヒヒのFolts モデルで試験し、動脈血栓形成へのALX-0081 の阻害効果がｖＷＦ注入によって逆行が可能かを評価した。
実験手順は、前述の実施例１８に記述のとおり改変した元のFoltsモデルに従った。
健常雄ヒヒ（チャクマヒヒ）を本研究に使用した。動物の体重は９〜１２kgであり、使用前の少なくとも２週間は疾患にはかかっていなかった。ヒヒにはドライの標準的餌のみを与えた。
３匹のヒヒを本研究に使用し、対照相中の、また生理食塩水、ALX-0081およびｖＷＦ投与後のＣＦＲの長さを表６６に要約する。
各ヒヒおよび実験の時間的関数としての血流量を図４０に示す。
３匹すべてのヒヒにおいて、ALX-0081の３０μg/kg＋４５μg/kg/時の用量でＣＦＲは完全に阻害され、新たに損傷を追加してもＣＦＲは元に戻らなかった。ｖＷＦ（２５０IU）の最初の用量を注入すると、流量は段階的に減少するが、ＣＦＲは、２５０IUのｖＷＦが過剰投与されるまで元に戻らなかった。この結果から、ALX-0081の活性はｖＷＦを投与することによって逆行することが可能であり、したがってｖＷＦはこのナノボディ（商標）の優れた解毒剤になることがうまく実証された。
したがって、本発明の別の態様はｖＷＦ、その好適な断片、ＤＤＡＶＰ（デスモプレシン）またはその好適な断片、あるいは前述のいずれかを含む医薬組成物の使用に関する。それらはｖＷＦに対するナノボディ、タンパク質またはポリペプチド、特に本明細書に記載のナノボディ、タンパク質またはポリペプチドの使用に伴う合併症または望ましくない副作用に対する解毒剤として使用する。
実施例２１
内皮細胞由来ＵｌｖＷＦへの血小板付着およびＡＤＡＭＴＳ‐１３の活性に対するALX-0081の効果
本試験は、ＴＴＰ患者の薬剤としてALX-0081 が使用できるという考えを裏付けるものである。ALX-0081の非存在および存在下で、ＴＴＰ血漿（非ＡＤＡＭＴＳ１３）で再構築された血小板のかん流を、ＵＬｖＷＦを分泌する内皮細胞上で行う。別の実験において、ｖＷＦのＡ１ドメインに結合するALX-0081がＡＤＡＭＴＳ‐１３活性に干渉するかを試験する。ＡＤＡＭＴＳ‐１３はｖＷＦのＡ２ドメインに結合し切断する。
Maruyama法で内皮細胞をヒト臍帯静脈から得た（Z.Zellforsch. Mikrosk. A4nat. 60:69; 1963）。かん流実験の前に、内皮細胞を１００μMのヒスタミン（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）により室温で１５分間活性化した。
前１０日間アスピリンまたは他の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を服用していない健常なボランティアから血液を採取し、１０分の１量の３．４％クエン酸ナトリウムと混合した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を遠心分離（室温において２００ｇで１０分間）で全血から調製した。ＰＲＰを１０分の１量のＡＣＤ（２．５%のクエン酸三ナトリウム、１．５%のクエン酸および２%のＤ‐グルコース）を添加して酸性化し、血小板を沈降させた（５００g、１５分間）。血小板ペレットをＨＥＰＥＳ（Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ'‐２‐エタンスルホン酸）‐Ｔｙｒｏｄｅバッファー（１０mMのＨＥＰＥＳ、１３７mMのＮａＣｌ、２．６８mMのＫＣｌ、０．４２mMのＮａＨ２ＰＯ４、１．７mMのＭｇＣｌ２、５mMのＤ‐グルコース、ｐＨ６．５）に再懸濁した。プロスタサイクリン（ＰＧＩ２、１０ng/mL）を添加し、引き続く洗浄工程の間血小板活性を防止する。血小板を沈降させ、少量のＨＥＰＥＳ‐Ｔｙｒｏｄｅバッファーに再懸濁した。この血小板懸濁液を、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳバッファーまたはＴＴＰ血漿に希釈した。
かん流を一過式かん流チャンバーにて前述のように行った。実験の後、実時間ビデオ顕微鏡観察を行った。
実験の第２型において、表６７に要約したように異なる反応混合物を調製したが、Ａ１Ａ２Ａ３構造物は添加しなかった。Ａ１Ａ２Ａ３構造物は、ｖＷＦのＡ１、Ａ２およびＡ３ドメインからなる組み換え断片である。混合物を５分間３７℃ でプレインキュベートし、その後Ａ１Ａ２Ａ３断片を添加し、混合物をウォーターバス中で３７℃にて一晩インキュベートする。翌日、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを試料（１２%、BioRad のマーカー、Precision Plus Protein Standardとして使用）で行い、Immobilon-FL（Millipore）上にブロットする。ブロットをブロックバッファー（１：１Odysseyブロックバッファーを含む１ｘＴＢＳ、ｐＨ＝７，４）を用いて室温で２時間ブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ｖＷＦ（DAKO）とともにインキュベートした。検出にはAlexa Fluor 680ヤギ抗ウサギを使用した。ODYSSEYでスキャンを行い、分解産物を検出した。
対照実験：ＵＬｖＷＦへの血小板の結合
臍静脈の内部のコラゲナーゼ消化によって新たに得たヒト臍帯から、内皮細胞を単離した。細胞を均質集団として組織培地中で培養した。培養したヒト内皮細胞は、正反対の多角大細胞の単分子層として成長し、それらは細胞質内封入も行う（Weibel-Palade体）。ヒト臍帯から単離した、ヒスタミン刺激性の内皮細胞は特大von Willebrand因子（ＵＬｖＷＦ）をその表面上で発現する。これらの刺激細胞を、バッファーあるいはＴＴＰに罹患した患者由来の血漿のいずれかに懸濁した単離血小板とともにかん流させると、血小板はＵＬｖＷＦで沈殿する（８）。これらのＵＬｖＷＦ付着血小板はいわゆる「糸」として現れ、かん流実験を実時間ビデオ顕微鏡で監視すると目に見える（図４１）。
ALX-0081による血小板の糸の生成に対する阻害
血小板をバッファーまたはＴＴＰ血漿に再懸濁し、本実験で使用したALX-0081の濃度は０，２、２および１０mg/mlであった。ヒト臍帯から単離した、ヒスタミン刺激性の内皮細胞を上述のようにこれらの血小板懸濁液とともにかん流させる。
ALX-0081を、バッファーまたはＴＴＰ患者由来の血漿に再懸濁した血小板に添加すると、すべての試験条件下で糸形成が完全に阻害される（図４２）。かん流実験は、２．５dyn/cm2のせん断応力で４分間行う。この４分間のかん流で、少なくとも２０の顕微鏡視野が試験され、また、ナノボディ（商標）の存在下で、糸はすべての試験条件では明らかにならなかった（図４２）。
ＡＤＡＭＴＳ‐１３によるＵＬｖＷＦの切断
ＡＤＡＭＴＳ‐１３は、ＶＷＦ Ａ２ドメイン中のＹ８４２／Ｍ８４３ペプチド結合を特異的に切断することによって、大および特大ＶＷＦ多量体のサイズをより小さな形へと減少させる。ＡＤＡＭＴＳ‐１３によるＵＬｖＷＦの切断に対するALX-0081の効果を評価するために、２つのタイプの分析法、すなわちかん流分析法および組み替えｖＷＦ断片の切断を観察する分析法を使用した。
最初の実験では、ヒスタミン刺激内皮細胞上で、バッファーに再懸濁した洗浄済み血小板を４分間かん流させることで糸を生成した。次いで、バッファーのかん流を４分間行って非付着血小板を洗い流した。その後、バッファーをさらに４分間かん流し、続いてＡＤＡＭＴＳ‐１３を含む蓄正常血漿を４分間かん流した。蓄正常血漿のかん流後、血小板糸の解離を観察した（図４３）。４分間のかん流後、９５%を超える糸が切断された。
次の実験では、ヒスタミン刺激内皮細胞上で、バッファーに再懸濁した洗浄済み血小板を４分間かん流させることで糸を生成し、上記のようにバッファーのかん流を４分間行って非付着血小板を洗い流した。その後、ALX-0081（１０mg/mlを含むバッファー）を４分間かん流し、続いてALX-0081（１０mg/ml＝ｖＷＦより１０倍過剰モル濃度）およびＡＤＡＭＴＳ‐１３を含む蓄正常血漿を４分間かん流した。血小板の糸の解離が明確に示され、４分間のかん流後、糸の９５%が切断された（図４４）。
これらの結果から、ALX-0081はＡＤＡＭＴＳ‐１３によるＵＬｖＷＦの糸の切断に有効ではないことが明確に示される。
第２の分析法では、ｖＷＦのＡ１‐Ａ２‐Ａ３ドメインを含む組み換え断片をＡＤＡＭＴＳ‐１３を含む正常プール血漿（ＮＰＰ)と混合し、その結果、ウエスタンブロット分析で観察した断片がタンパク質分解的に切断された。ＡＤＡＭＴＳ‐１３活性を１０mg/mlのALX-0081の非存在および存在下で試験した。図４５に示すとおり、ALX-0081はｖＷＦ断片の切断に対しては有効ではない（レーン６、７、８）。
観察した切断がＡＤＡＭＴＳ‐１３に特異的であることを証明するため、ＥＤＴＡはＡＤＡＭＴＳ‐１３の活性を阻害することから、ＥＤＴＡの存在下での対照実験を行った。予想通り、ＮＰＰ中にＥＤＴＡが存在すると、断片の切断は阻害された（図４５、レーン４）。
本実験により、ALX-0081はＡＤＡＭＴＳ‐１３活性に有効ではないことが再度明らかになる。
表１５：抗ｖＷＦナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表１６：抗ｖＷＦナノボディの発現率
Figure 0004986997
表１７：抗ｖＷＦナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
Figure 0004986997
表１８：１２Ｂ６および１２Ａ５相同体ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表１９：１２Ａ５相同体ナノボディの評価されたＫ‐ｏｎ、Ｋ‐ｏｆｆおよびＫＤ値
Figure 0004986997
表２０：１２Ｂ６相同体ナノボディの評価されたＫ‐ｏｎ、Ｋ‐ｏｆｆおよびＫＤ値
Figure 0004986997
表２１：１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの実質ＫＤ値
Figure 0004986997
表２２：１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
Figure 0004986997
表２３：上昇温度での加熱後の１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表２４：二価ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表２５：リンカー配列の配列リスト
Figure 0004986997
表２６：二価１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの発現率
Figure 0004986997
表２７：上昇温度での加熱後の１２Ｂ６二価ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表２８：上昇温度での加熱後の１２Ａ２二価ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表２９：上昇温度での加熱後の１２Ａ５二価ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表３０：１２Ａ２二価ナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
Figure 0004986997
表３１：１２Ｂ６ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表３２：野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディの発現率
Figure 0004986997
表３３：上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表３４：野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディのＫＤ値
Figure 0004986997
表３５：ヒト化１２Ａ２ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表３６：野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの発現率
Figure 0004986997
表３７：上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表３８：０．７および１．５ug/mlでのかん流チャンバーにおける野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの血小板付着
Figure 0004986997
表３９：０．５、１および２ug/mlでのかん流チャンバーにおける野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの血小板付着
Figure 0004986997
表４０：野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディのＫＤ値
Figure 0004986997
表４１：ヒト化１２Ａ５ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表４２：野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディの発現率
Figure 0004986997
表４３：上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表４４：野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディのＫＤ値
Figure 0004986997
表４５：ヒト化二価ナノボディの配列リスト
Figure 0004986997
表４６：ヒト化二価ナノボディの発現率
Figure 0004986997
表４７：上昇温度での加熱後のヒト化二価ナノボディの濃度
Figure 0004986997
表４８：野生型およびヒト化二価ナノボディの血小板付着
Figure 0004986997
表４９：Foltsの研究において異なる試験化合物で使用するヒヒ
Figure 0004986997
表５０：対照動物のＣＦＲ（秒）の長さ（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５１：Aspegic（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５２：Heparin（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５３：Plavix （商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５４：Reopro （商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５５：ALX-0081（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
Figure 0004986997
表５６：Foltsの研究において異なる試験化合物で使用するヒヒ
Figure 0004986997
表５７：異なる試験薬剤についてのFoltsモデルにおけるＣＦＲの阻害：ＣＦＲの阻害を上述の様々な条件で観察した実験の数を、その条件の独立した反復の総数の関数として示す。
Figure 0004986997
表５８：各ヒヒについてのＣＦＲ（秒）の長さ、ならびにAspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081の各用量：有効量は黄色で示す。
Figure 0004986997
表５９：最終用量の関数における、Plavix（商標）を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
Figure 0004986997
表６０：最終用量の関数における、Reopro（商標）を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
Figure 0004986997
表６１：最終用量の関数における、ALX-0081を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
Figure 0004986997
表６２：第二の対照ガーゼに相関する、失血の平均総量（試験化合物の最初の５回の服用から得た失血総量）
Figure 0004986997
表６３：薬剤用量の関数における、Aspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081を投与した各ヒヒに対する第二の対照ガーゼに相関するガーゼの失血：ＣＦＲの完全な阻害が観察される有効用量を黄色で示す。
Figure 0004986997
表６４：薬剤用量の関数における、Aspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081を投与した各ヒヒについてのリストセチン誘導血小板凝集（%）
Figure 0004986997
表６５：投与から１０分後に得られた血液試料中のALX-0081濃度［μg/ml］
Figure 0004986997
表６６：ALX-0081およびｖＷＦを投与したヒヒについてのＣＦＲの長さ（秒）
Figure 0004986997
表６７：ＡＤＡＭＴＳ１３によるＡ１Ａ２Ａ３の切断を研究するために異なる混合物を調製するための量［ml］
Figure 0004986997
また、この中で本記述の不可欠な部分を形成する表は以下のとおりである：
（表１５） 抗ｖＷＦナノボディの配列リスト
（表１６） 抗ｖＷＦナノボディの発現率
（表１７） 抗ｖＷＦナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
（表１８） １２Ｂ６および１２Ａ５相同体ナノボディの配列リスト
（表１９） １２Ａ５相同体ナノボディの評価されたＫ‐ｏｎ、Ｋ‐ｏｆｆおよびＫＤ値
（表２０） １２Ｂ６相同体ナノボディの評価されたＫ‐ｏｎ、Ｋ‐ｏｆｆおよびＫＤ値
（表２１） １２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの実質ＫＤ値
（表２２） １２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
（表２３） 上昇温度での加熱後の１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの濃度
（表２４） 二価ナノボディの配列リスト
（表２５） リンカー配列の配列リスト
（表２６） 二価１２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの発現率
（表２７） 上昇温度での加熱後の１２Ｂ６二価ナノボディの濃度
（表２８） 上昇温度での加熱後の１２Ａ２二価ナノボディの濃度
（表２９） 上昇温度での加熱後の１２Ａ５二価ナノボディの濃度
（表３０） １２Ａ２二価ナノボディのかん流チャンバーにおける血小板付着
（表３１） １２Ｂ６ナノボディの配列リスト
（表３２） 野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディの発現率
（表３３） 上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディの濃度
（表３４） 野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディのＫＤ値
（表３５） ヒト化１２Ａ２ナノボディの配列リスト
（表３６） 野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの発現率
（表３７） 上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの濃度
（表３８） ０．７および１．５ug/mlでのかん流チャンバーにおける野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの血小板付着
（表３９） ０．５、１および２ug/mlでのかん流チャンバーにおける野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディの血小板付着
（表４０） 野生型およびヒト化１２Ａ２ナノボディのＫＤ値
（表４１） ヒト化１２Ａ５ナノボディの配列リスト
（表４２） 野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディの発現率
（表４３） 上昇温度での加熱後の野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディの濃度
（表４４） 野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディのＫＤ値
（表４５） ヒト化二価ナノボディの配列リスト
（表４６） ヒト化二価ナノボディの発現率
（表４７） 上昇温度での加熱後のヒト化二価ナノボディの濃度
（表４８） 野生型およびヒト化二価ナノボディの血小板付着
（表４９） Foltsの研究において異なる試験化合物で使用するヒヒ
（表５０） 対照動物のＣＦＲ（秒）の長さ（ＮＤ＝未判定）
（表５１） Aspegic（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
（表５２） Heparin（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
（表５３） Plavix （商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
（表５４） Reopro （商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
（表５５） ALX-0081（商標）を投与した動物のＣＦＲの長さ（秒）（ＮＤ＝未判定）
（表５６） Foltsの研究において異なる試験化合物で使用するヒヒ
（表５７） 異なる試験薬剤についてのFoltsモデルにおけるＣＦＲの阻害：ＣＦＲの阻害を上述の様々な条件で観察した実験の数を、その条件の独立した反復の総数の関数として示す。
（表５８） 各ヒヒについてのＣＦＲ（秒）の長さ、ならびにAspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081の各用量：有効量は黄色で示す。
（表５９） 最終用量の関数における、Plavix（商標）を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
（表６０） 最終用量の関数における、Reopro（商標）を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
（表６１） 最終用量の関数における、ALX-0081を投与した動物に対する第二の対照ガーゼに相関する失血（ＳＴＤ＝標準偏差）
（表６２） 第二の対照ガーゼに相関する、失血の平均総量（試験化合物の最初の５回の服用から得た失血総量）
（表６３） 薬剤用量の関数における、Aspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081を投与した各ヒヒに対する第二の対照ガーゼに相関するガーゼの失血：ＣＦＲの完全な阻害が観察される有効用量を黄色で示す。
（表６４） 薬剤用量の関数における、Aspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081を投与した各ヒヒについてのリストセチン誘導血小板凝集（%）
（表６５） 投与から１０分後に得られた血液試料中のALX-0081濃度［μg/ml］
（表６６） ALX-0081およびｖＷＦを投与したヒヒについてのＣＦＲの長さ（秒）
（表６７） ＡＤＡＭＴＳ１３によるＡ１Ａ２Ａ３の切断を研究するために異なる混合物を調製するための量［ml］
本発明はここでさらに、以下の非限定的実施例および図を用いて記述する。図は以下のものを示す：
ＥＲＩＳＡにおけるナノボディのｖＷＦに対する結合 １２Ａ５相同体ナノボディ配列のアラインメント １２Ｂ６相同体ナノボディ配列のアラインメント ＢＩＡＣＯＲＥにおける１２Ａ５相同体ナノボディのｖＷＦへの結合 ＢＩＡＣＯＲＥにおける１２Ｂ６相同体ナノボディのｖＷＦへの結合 １２Ｂ６、１２Ａ２および１２Ａ５ナノボディの異なる濃度における血小板付着 上昇温度での加熱後の１２Ｂ６ナノボディについての、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 上昇温度での加熱後の１２Ａ２ナノボディについての、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 上昇温度での加熱後の１２Ａ５ナノボディについての、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 ＥＬＩＳＡにおける異なる種から１２Ｂ６ナノボディへのｖＷＦの結合 ＥＬＩＳＡにおける異なる種から１２Ａ２ナノボディへのｖＷＦの結合 ＥＬＩＳＡにおける異なる種から１２Ａ５ナノボディへのｖＷＦの結合 ＢＩＡＣＯＲＥにおける二価１２Ｂ６ナノボディのｖＷＦへの結合 ＢＩＡＣＯＲＥにおける二価１２Ａ２ナノボディのｖＷＦへの結合 ＢＩＡＣＯＲＥにおける二価１２Ａ５ナノボディのｖＷＦへの結合 上昇温度での加熱後の二価１２Ｂ６ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 上昇温度での加熱後の二価１２Ａ２ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 上昇温度での加熱後の二価１２Ａ５ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 ヒト化１２Ｂ６ナノボディ配列のアラインメント 野生型およびヒト化１２Ｂ６ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 ヒト化１２Ａ２ナノボディ配列のアラインメント 上昇温度での加熱後のヒト化１２Ａ２ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 ヒト化１２Ａ２ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 ヒト化１２Ａ５ナノボディ配列のアラインメント 野生型およびヒト化１２Ａ５ナノボディの、ＥＬＩＳＡにおけるｖＷＦへの結合 二価形態に対して選択されたナノボディのアラインメント 二価（ヒト化）ナノボディの異なる濃度における血小板付着 ヒヒにおけるFoltsモデルについての血流パターン ヒヒにおけるFoltsモデルについての実験装置 ヒヒ対照群のFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（２つの独立した実験を表す例） Aspegicを投与したヒヒ群のFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（３つの独立した実験を表す例） Heparin処理したヒヒ群の研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（３つの独立した実験を表す例） Plavixを投与したヒヒ群のFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（４つの独立した実験を表す例） Reoproを投与したヒヒ群のFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（３つの独立した実験を表す例） ALX-0081（配列番号９８）を投与したヒヒ群のFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している（８つの独立した実験を表す例） Aspegic、Heparin、PlavixおよびALX-0081の組み合わせを投与したヒヒＩＤ６から読み出した血流 異なる用量のPlavix、ReoproおよびALX-0081の関数における相対的失血の平均 増加する薬剤用量の関数における、Plavixを投与した動物についてのＣＦＲの平均的長さおよび失血の平均的相対量 増加する薬剤用量の関数における、Reoproを投与した動物についてのＣＦＲの平均的長さおよび失血の平均的相対量 増加する薬剤用量の関数における、ALX-0081を投与した動物についてのＣＦＲの平均的長さおよび失血の平均的相対量 すべての用量の関数における、ALX-0081を投与した各ヒヒについてのリストセチン誘導凝集（%、■）およびＣＦＲの長さ（s、ひし形） ALX-0081を投与したすべてのヒヒについての、血漿中ALX-0081濃度対ＣＦＲの長さ ガーゼから得た血漿中ALX-0081濃度対失血相対量 ALX-0081およびｖＷＦを投与したヒヒ１についてのFoltsの研究：時間の関数における血流が示されており、ＣＦＲを表している 刺激された内皮細胞から分泌されたＵＬｖＷＦへ付着した血小板の糸（矢印） ALX-0081の存在下で血小板をＵＬｖＷＦでかん流したときの、糸が無い状態 対照かん流実験：正常血漿でのかん流前（赤い矢印で示されたパネルＡ）およびかん流中（パネルＢ）のＵＬｖＷＦ糸：パネルＢでは、ＡＤＡＭＴＳ‐１３によって切断されるＵＬｖＷＦ糸は、青色と赤色の矢印で示されており、それぞれ、遠ざかる一部のＵＬｖＷＦ糸、大きく切断されたＵＬｖＷＦを表している ALX-0081存在下でのかん流実験：正常血漿でのかん流前のフィールド（パネルＡ）およびかん流後（パネルＢ）の同一フィールドでの顕微鏡像：ＵｌｖＷＦ糸は赤色の矢印でパネルＡに示されており、パネルＢでは、ＡＤＡＭＴＳ‐１３によってＵＬｖＷＦが切断されるので存在しない ALX-0081の非存在および存在下での、正常プール血漿（ＮＰＰ）にあるＡＤＡＭＴＳ‐１３によるＡ１‐Ａ２‐Ａ３の切断

Claims (29)

  1. ４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から成るフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するナノボディであって、
    ｉ）ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＮＰＭＧ［配列番号：２２］から成り、
    ｉｉ）ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ［配列番号：３２］またはアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ［配列番号：３２］とアミノ酸が２つもしくは１つ異なるアミノ酸配列から成り、および
    ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４２］またはアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４２］とアミノ酸が１つ異なるアミノ酸配列から成る、
    ２つの同一の該ナノボディを含むタンパク質またはポリペプチド。
  2. ＣＤＲ２がＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ［配列番号：３２］またはＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＡＲＳＶＥＧ［配列番号：３１］のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチド。
  3. ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ［配列番号：３２］である、請求項２記載のタンパク質またはポリペプチド。
  4. ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４２］、ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＮＦ［配列番号：４１］またはＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＳＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４３］のアミノ酸配列からなる、請求項１記載のタンパク質またはポリペプチド。
  5. ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４２］である、請求項４記載のタンパク質またはポリペプチド。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドであって、ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＹＮＰＭＧ［配列番号：２２］であり；ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＥＧ［配列番号：３２］であり、およびＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＧＶＲＡＥＤＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦ［配列番号：４２］である、タンパク質またはポリペプチド。
  7. ナノボディがＫＥＲＥクラスナノボディである、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  8. タンパク質またはポリペプチドがナノボディのヒト化変異体である、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  9. ナノボディが１２Ｂ６（配列番号：６２）、１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ｆ２（配列番号：７２）、１４Ｈ１０（配列番号：７３）、１２Ｂ６Ｈ１（配列番号：８６）、１２Ｂ６Ｈ２（配列番号：８７）、１２Ｂ６Ｈ３（配列番号：８８）、１２Ｂ６Ｈ４（配列番号：８９）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）からなるグループから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  10. ナノボディが１２Ａ２（配列番号：７１）、１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）、１２Ａ２Ｈ３（配列番号：９１）、１２Ａ２Ｈ４（配列番号：９２）、１２Ａ２Ｈ１１（配列番号：９３）および／または１２Ａ２Ｈ１３（配列番号：９４）からなるグループから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  11. ナノボディが１２Ａ２Ｈ１（配列番号：９０）である、請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  12. ２つのナノボディがリンカーを介して互いに連結している、請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  13. リンカーがアミノ酸からなる、請求項１２記載のタンパク質またはポリペプチド。
  14. リンカーが１〜４０個のアミノ酸残基を含む、請求項１３記載のタンパク質またはポリペプチド。
  15. リンカーがグリシン残基およびセリン残基を含む、請求項１４記載のタンパク質またはポリペプチド。
  16. リンカーがリンカーＧＳ９（配列番号：８４）を含む、請求項１５記載のタンパク質またはポリペプチド。
  17. リンカーが１〜１０個のアラニン残基を含む、請求項１４記載のタンパク質またはポリペプチド。
  18. リンカーが３個のアラニン残基からなる、請求項１７に記載のタンパク質またはポリペプチド。
  19. タンパク質またはポリペプチドが配列番号：９８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチド。
  20. 請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドをコードする、ヌクレオチドまたは核酸。
  21. 請求項２０記載のヌクレオチドもしくは核酸を含む、または請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドを発現するかもしくは発現可能な、宿主細胞。
  22. 前記宿主細胞が請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドを産生または発現する条件下での請求項２１記載の宿主細胞の培養・維持を含み、そして請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドの分離をさらに任意に含む、請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドの調製方法。
  23. 請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド、そして少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を任意に含む、医薬組成物。
  24. 血小板媒介凝集と関連する疾患または障害の予防または治療のための、請求項２３記載の医薬組成物、または請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  25. 非閉塞性血栓、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠動脈閉塞、末梢動脈閉塞症、冠状動脈バイパス移植に起因する再狭窄および障害、冠動脈弁置換術および血管形成、ステント術、または粥腫切除などの冠状動脈インターベンション、血管形成、粥腫切除、または動脈ステント術後の肥厚化、血管系での閉塞性症候群または罹患動脈における開通性の欠如、血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）、一過性脳虚血発作および虚血脳卒中、不安定／安定狭心症、脳梗塞、ヘルプ症候群、頚動脈内膜切除術、頸動脈狭窄症、危機的四肢虚血、心塞栓症、末梢性の血管疾患、再狭窄、心筋梗塞から選択される、血小板媒介凝集と関連する疾患または障害の予防または治療のための、請求項２４記載の医薬組成物、または請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチド。
  26. 凝固媒介性の障害の予防・治療のための１つ以上の他の有効成分をさらに含む、請求項２４記載の医薬組成物。
  27. １つ以上の他の有効成分がアスピリン（Ａｓｐｅｇｉｃ）、ヘパリンからなるグループから選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 血小板媒介凝集と関連する疾患または障害の予防または治療用の薬剤の調製における、請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドの使用。
  29. 非閉塞性血栓、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠動脈閉塞、末梢動脈閉塞症、冠状動脈バイパス移植に起因する再狭窄および障害、冠動脈弁置換術および血管形成、ステント術、または粥腫切除などの冠状動脈インターベンション、血管形成、粥腫切除、または動脈ステント術後の肥厚化、血管系での閉塞性症候群または罹患動脈における開通性の欠如、血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）、一過性脳虚血発作および虚血脳卒中、不安定／安定狭心症、脳梗塞、ヘルプ症候群、頚動脈内膜切除術、頸動脈狭窄症、危機的四肢虚血、心塞栓症、末梢性の血管疾患、再狭窄、心筋梗塞から選択される、血小板媒介凝集と関連する疾患または障害の予防または治療用の薬剤の調製時での、請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質またはポリペプチドの使用。
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