CN104271598A - 针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域 - Google Patents

针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域 Download PDF

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Abstract

本发明提供针对IgE的多肽和蛋白构建体。在一个具体的方面中，描述了与结合血清白蛋白的肽连接的针对IgE的纳米抗体。本发明还描述了编码所述多肽和蛋白构建体的核酸；包含所述多肽和蛋白构建体的组合物，特别是药物组合物；以及所述多肽、蛋白构建体和组合物的应用。

Description

针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域
发明领域
本发明涉及针对IgE的多肽和蛋白构建体；涉及编码所述多肽和蛋白构建体的核酸；涉及包含所述多肽和蛋白构建体的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述多肽、蛋白构建体和组合物的应用。
如果有任何在本文中没有明确定义的术语，则这些术语具有WO09/068627中为其所给出的含义。如果本文中所用的任何术语没有在本文中或在WO09/068627中明确定义，那么其具有其在本领域中常见的意思，对于其，例如，参考标准手册。
背景技术
国际申请WO04/041865描述了针对IgE的具体的蛋白构建体，其包含至少一个针对IgE的VHH或人源化的VHH和至少一个针对血清蛋白如（人）血清白蛋白的纳米抗体，由于存在结合血清白蛋白的纳米抗体，与相对应的单独的针对IgE的VHH’s相比，所述蛋白构建体具有增加的体内半衰期。WO04/041865中的SEQ ID NO’s:22-24给出了此类双特异性抗-IgE/抗-血清白蛋白构建体的实例。
国际申请WO04/041867描述了针对IgE的VHH’s(例如，参见WO04/041867的SEQ ID NO’s:1-11)。WO04/041867进一步提及这些VHH’s可以被人源化，并且可以适当地与一种或多种针对血清蛋白如血清白蛋白的VHH’s连接，从而提供具有增加的半衰期以及与VHH’s和纳米抗体相关的有利特性的蛋白构建体。
国际申请WO06/122787描述了多种针对（人）血清白蛋白的纳米抗体。这些纳米抗体包括称为Alb-1（WO06/122787中的SEQ ID NO:52）的纳米抗体及其人源化变体，如Alb-8(WO06/122787中的SEQ ID NO:62；本文中的SEQ ID NO:174)。[纳米抗体和纳米抗体是埃博灵克斯股份有限公司（Ablynx N.V.）的商标]。
到本申请首次提交的日期时，已经通过临床试验验证了针对(人)血清白蛋白的纳米抗体用于延长治疗结构部分如纳米抗体的半衰期的应用。例如，已经在I期临床试验中验证了ALX-0141（即，包含两种针对RANK-L的纳米抗体和一种针对人血清白蛋白的纳米抗体的蛋白构建体）的安全性、耐受性、免疫原性和药物代谢动力学(PK)（埃博灵克斯股份有限公司于2011年5月27日在伦敦的欧洲风湿病学年会（Annual EuropeanCongress of Rheumatology(EULAR)上提出的数据）。此外，多份埃博灵克斯有限公司的已公布的专利申请给出了包含一种或多种针对治疗靶标的纳米抗体和一种或多种针对血清白蛋白的纳米抗体（如Alb-8）的具有增加的半衰期的构建体的实例。例如，参考WO04/041862，WO06/122786，WO08/020079，WO08/142164，WO09/068627和WO09/147248。
尽管已经确定使用针对(人)血清白蛋白的纳米抗体是一种良好的且广泛适用的延长纳米抗体和其他治疗实体的半衰期的方式，但是，本发明人已经发现当使用WO06/122787所述的代表性纳米抗体来延长针对IgE的纳米抗体的半衰期时（以WO04/041865和WO04/041867中一般描述的方式），这样获得的构建体，虽然其针对IgE是有充分生物学活性的，并且具有适于治疗应用的半衰期，但是仍然具有一些能够得益于进一步的改善的特性。
特别地，已经发现所述包含针对IgE的纳米抗体和Alb-8（WO06/122787所述的代表性的结合血清白蛋白的纳米抗体）的多肽具有有限的保存稳定性，这留下了进一步改善的空间（例如，参见，本文实验部分中记载的结果）。
发明概述
因此，本发明通常具有提供改善的多肽和（其他）蛋白构建体的目的，所述多肽和（其他）蛋白构建体包含至少一个针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域(如纳米抗体)，并且具有增加的体内半衰期（如本文进一步所述，并且与针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域本身相比较），其与如现在已经发现的在使用WO04/041865和WO04/041867中通常所述的类型的抗-IgE构建体时存在的相同的问题不相关。
已公布的国际申请WO08/068280，WO09/127691，美国申请US2011/0243954和WO2011/095545描述了这样的肽，其针对人血清白蛋白，并且其可以与治疗结构部分（如针对治疗靶标的纳米抗体）连接，以提供具有增加的半衰期的所述治疗结构部分。这些国际申请中所述的半衰期延长技术也称为NExpediteTM技术[NExpediteTM是埃博灵克斯有限公司的商标]。WO08/068280也一般提及治疗结构部分可以是WO04/041867中所述的针对IgE的纳米抗体)。
令人惊讶地，已经发现使用WO08/068280中、WO09/127691中、US2011/0243954中且特别是WO2011/095545中所述的结合血清白蛋白的肽来延长针对IgE的纳米抗体的半衰期不涉及在使用WO04/041865和WO04/041867中通常所述的类型的抗-IgE/抗-血清白蛋白多肽和构建体时发生的问题。特别地，已经发现包含一种或多种针对IgE的纳米抗体和如WO08/068280中、WO09/127691中、US2011/0243954中且特别是WO2011/095545中所述的一种或多种结合白蛋白的肽的构建体，与具有相当的半衰期延长的抗-IgE多肽（其中使用WO06/122787所述的代表性的结合白蛋白的纳米抗体）相比，具有提高的保存稳定性（如例如通过实施例16所述的SE-HPLC实验确定的）。同样参考本文实验部分记载的数据和结果。
除了用已知的抗-IgE构建体来解决这些问题（所述问题在现有技术中尚未被认识到）之外，在建立本发明时，本发明人也已经制成了与已知的针对IgE的纳米抗体（如WO04/041865和WO04/041867中所述的那些）相比具有某些优点的多种针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域。这些改善的针对IgE的纳米抗体能够，例如并且具有优势的，用作“结构单元”来提供本文所述的半衰期延长的抗-IgE蛋白构建体。这些抗-IgE免疫球蛋白单可变结构域(或“ISV’s)以及包含其的多肽和蛋白构建体形成本发明的另外的方面。
此外，通过将本文公开的改善的抗-IgE结构单元与WO08/068280中、WO09/127691中、US2011/0243954中且特别是WO2011/095545中所述的半衰期延长的肽组合，本发明人还已经提供了与WO04/041865中所述的半衰期延长的抗-IgE构建体相比具有改善特性的一定范围的不同半衰期延长的抗-IgE蛋白构建体，并且这些改善的蛋白构建体和多肽形成本发明的另外的方面。
本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将通过本文的进一步描述变得清楚。
详述
因此，在第一方面中，本发明涉及包含以下或基本上由以下组成的多肽、蛋白、构建体或化合物（在本文中还笼统地称为“本发明的抗-IgE多肽”或“本发明的多肽”）：
a)一种或多种(如一种或两种)针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域(ISV’s)（其可以如本文进一步所述，并且优选地是如本文所述的优选方面所述）；和
b)一种或多种(如一种或两种，包括但不限于串联重复的)针对(人)血清白蛋白的肽，其如WO08/068280中、WO09/127691中、US2011/0243954且特别是WO2011/095545中所述（其优选地是如本文所述的优选方面所述）；
其适当地直接或通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接。
所述多肽、蛋白、构建体或化合物（和/或其中存在的一种或多种针对IgE的ISV’s）可以特别是这样的，以使其能够调节、并且特别是抑制或阻断（完全或部分地）(人)IgE与(人)Fc(ε)RI(高亲和性IgE受体)之间的相互作用，例如，如在适当的测定中检测的，诸如下述实验部分中所用的一种测定（例如，实施例7中所用的测定）。例如，其可以是这样的，以使其抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用（例如，在实施例7中所述的ELISA测定中；在实施例6中所述的α筛选测定（Alphascreen assay）中）的IC50值优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M或者甚至优于10-11M。
所述多肽、蛋白、构建体或化合物（和/或其中存在的一种或多种针对IgE的ISV’s）还可以是这样的（或者另外是这样的），以使其能够调节、并且特别是抑制或阻断（完全或部分地）(人)IgE与(人)Fc(ε)RII(低亲和性IgE受体)之间的相互作用，例如，如在适当的测定中检测的，诸如下述实验部分中所用的一种测定（例如，实施例8中所用的测定）。例如，其可以是这样的，以使其抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用（例如，在实施例8中所述的ELISA测定中）的IC50值优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M或优于2.10-10M。
此外，任意所述多肽、蛋白、构建体或化合物（和/或其中存在的一种或多种针对IgE的ISV’s）可以是这样的，以使其在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM或者甚至优于0.5nM的IC50值。
结合IgE的ISV
在本发明的IgE构建体中存在的所述一种或多种针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域或“ISV’s”可以是任意适当的针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域。因此，针对IgE的ISV可以是，例如，结构域抗体、单结构域抗体、dAbTM、纳米抗体、VHH、IgNAR结构域或其他适当的针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域。优选地，所述一种或多种针对IgE的ISV’s是纳米抗体（如VHH’s，人源化的VHH’s或骆驼源化的VH’s，如骆驼源化的人VH’s）。
在本发明的抗-IgE多肽中存在的所述一种或多种针对IgE的ISV’s（并且特别是纳米抗体）可以特别是在SEQ ID NO:172的人IgE Fc序列与SEQ ID NO:173中给出的来自食蟹猴（cynomolgus monkey）的IgE Fc序列之间交叉反应的ISV’s或纳米抗体。特别地，所述ISV’s可能具有是所述ISV针对人IgE的亲和力的至少1%，例如5%，如至少10%，例如至少25%，如至少50%或更多的针对食蟹猴IgE的亲和力（如通过适当的技术确定的，如Biacore，例如使用实施例12所述的方案确定的）。例如，在本发明的抗-IgE多肽中存在的所述一种或多种针对IgE的ISV’s（并且特别是纳米抗体）可以具有优于50nM，优选地优于25nM，(KD1值–参见实施例12)和/或优于5nM，优选地优于2nM，如优于1nM(KD2值–同样参见实施例12)的针对人IgE的亲和力（如使用Biacore确定的，例如使用实施例12所述的方案确定的）；和优于50nM，如优于30nM(KD1值)和/或优于5nM，优选地优于2nM，如优于1nM(KD2值)的针对食蟹猴（cyno）IgE的亲和力。
可以用在本发明的抗-IgE多肽中的针对IgE的纳米抗体的一些非限制性的实例为WO04/041865或WO04/041867中所述的抗-IgE纳米抗体，如VHH#2C3，VHH#4G12，VHH#2C1，VHH#2H3，VHH#2D12，VHH#2G4，VHH#4C5，VHH#4A2，VHH#2D4，VHH#2B6或VHH#2H11(见WO04/041867的表14和SEQ ID NO’s:1-11)，或其人源化的和/或序列优化的变体。可以用在本发明的抗-IgE多肽中的其他针对IgE的纳米抗体是本文中所述的抗-IgE纳米抗体，如39B02(SEQ ID NO:114)，39D8(SEQ ID NO:115)，42D7(SEQ ID NO:116)，42G5(SEQ ID NO:117)，36G5(SEQ ID NO:118)或其人源化的和/或序列优化的变体，且特别是39D11(SEQ ID NO:119)，即“39D11-型序列”(如本文定义)和特别是“39D11样”(如本文定义)，如39D11的人源化的和/或序列优化的变体，例如SEQ ID NO’s:120-133的变体，其中IGE026(SEQ ID NO:128，在本文中还称为IGE0045或IgE66G02)是特别优选的实例。此类结构单元（特别是当其存在于N末端时）的另一个特别优选的实例是在位置1具有E突变为D的突变的IGE026。该结构单元在本文中还称为IgE66G02(E1D)或IgE66G02E1D(SEQID NO:129)。
39D11的氨基酸序列为(其中的CDR’s以下划线和粗体表示。这些CDR’s也分别在SEQ ID NO’s:134，136和137中给出)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYDMSWWRQAPGKGPEWVSSIDT GGDITHYADSVKGRFTISRDNANWMLYLQMNSLKPEDTAVYWCATDEDYALG PNEYDYYGQGTQVTVSS[SEQIDNO:I19,
一种优选的39D11人源化的和序列优化的变体（与39D11相比其也是亲和力成熟的）是IGE026(也称为IgE0045)。IGE026的氨基酸序列是(其中的CDR’s以下划线和粗体表示。这些CDR’s也分别在SEQ ID NO’s:135，136和138中给出；应该理解39D11和IGE026的CDR2是相同的)：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYDMAWVRQAPGKRPEwVSSIDT GGDITHYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYWCATDEETAKGP NEFDYYGQGTLVT\ISS[SEQIDNO:1281
如本文定义，“39D11-型序列”，“39D11-型ISV”或“39D11-型结构单元”在其最广泛意义上为免疫球蛋白单可变结构域，并且特别是纳米抗体，其是这样的，以致(i)其与39D11竞争与(人)IgE结合(例如，在适当的结合测定中，如在BIAcore测定中，例如，如基本上实施例9中所述的BIAcore测定设置或α筛选测定，但是使用39D11替代奥马珠单抗（omalizumab）)；和/或(ii)其与39D11结合(人)IgE上相同的表位；和/或(iii)其交叉阻断(如WO09/068627中定义)39D11与IgE的结合。39D11-型序列还优选地在人IgE与食蟹猴IgE之间交叉反应，如本文进一步所述。“39D11型序列”，“39D11-型ISV”或“39D11-型结构单元”优选地进一步是这样的，以致其(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M或甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM或者甚至优于0.5nM的IC50值。
因此，“39D11-型序列”也形成本发明的一部分。
如本文定义，“39D11-样序列”，“39D11-样序列”，“39D11-样ISV”或“39D11-样结构单元”定义为包含下述的ISV（如本文所述）：
a)包含以下或基本上由以下组成的CDR1：(i)氨基酸序列SYDMS(SEQID NO:134)和/或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)或(ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)和/或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列；和/或
b)包含以下或基本上由以下组成的CDR2：(i)氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)或(ii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)仅具有7，6，5，4，3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列；和/或
c)包含以下或基本上由以下组成的CDR3：(i)氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)或(ii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)仅具有7，6，5，4，3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列；
其中在此类ISV中存在的构架序列进一步如本文所述，并且其中CDR1，CDR2和CDR3优选地是这样的，以致所述39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M或甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或甚至优于0.5nM的IC50值。
优选地，在此类39D11-样序列中，CDR1和CDR2分别如按照a)和b)定义；或者CDR1和CDR3分别如按照a)和c)定义；或者CDR2和CDR3分别如按照b)和c)定义。更优选地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3都分别如按照a)，b)和c)定义。同样地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV:(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
例如，在此类39D11-样序列中：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)(其中CDR2和CDR3分别如按照b)和c)定义)；和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)(其中CDR1和CDR3分别如按照a)和c)定义)；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR1和CDR2分别如按照a)和b)定义)。具体地，当39D11-样序列是按照这一方面所述时：CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，并且CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)(其中CDR3按照上述c)定义)；和/或CDR1可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR2按照上述b)定义);和/或CDR2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)，并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR1按照上述a)定义)。同样地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或者优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
在一种特别优选的39D11-样序列中：CDR1包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，CDR2包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQID NO:136)；并且CDR3包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)。
在一个特别优选的方面中，“39D11-样序列”，“39D11-样ISV”或“39D11-样结构单元”是包含下述的ISV：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)或(ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQID NO:134)和/或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)仅具有3、2或1个(如本文定义)氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)或(ii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)仅具有7，6，5，4，3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)或(ii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)仅具有7，6，5，4，3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列；
其中在此类ISV中存在的构架序列进一步如本文所述，并且其中CDR1，CDR2和CDR3优选地是这样的，以致所述39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或者优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
优选地，在该特别优选的方面中所述的39D11-样序列中，CDR1和CDR2分别如按照d)和e)定义；或者CDR1和CDR3分别如按照d)和f)定义；或者CDR2和CDR3分别如按照e)和f)定义。更优选地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3都分别如按照d)，e)和f)定义。同样地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
例如，在该特别优选的方面所述的39D11-样序列中：CDR1是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)(其中CDR2和CDR3分别如按照e)和f)定义);和/或CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)(其中CDR1和CDR3分别如按照d)和f)定义)；和/或CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR1和CDR2分别如按照d)和e)定义)。具体地，当39D11-样序列是按照该方面所述时：CDR1是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，并且CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)(其中CDR3如上述f)定义)；和/或CDR1是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选地是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，并且CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR2如上述e)定义)；和/或CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)，并且CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选地是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(其中CDR1如上述d)定义)。同样地，在所述39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
在特别优选的39D11-样序列中：CDR1是氨基酸序列SYDMS(SEQID NO:134)，并且优选是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)；并且CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)。
在本文所述的所有的39D11-样序列中，FR1，FR2，FR3和FR4序列分别优选是这样的，以致综合来看，这些构架序列与39D11的构架序列(分别为SEQ ID NO’s:139，141，143和145)和/或IGE026的构架序列(分别为SEQ ID NO’s:140，142，144和146)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性。例如并且不限于，39D11-样序列中的FR1，FR2，FR3和FR4序列中的每一个分别与39D11的FR1，FR2，FR3和FR4序列和/或与IGE026的FR1，FR2，FR3和FR4序列具有0-7个，如0-5个，如1，2，3或4个(适当的)氨基酸差异。其他适当的构架序列可以基本上如WO09/068627的273-291页所述（在WO09/068627关于针对IL-23的纳米抗体所述）。例如，参考WO09/068627的表A-10至A-25，以及WO09/068627中表A-6至A-9所述的各种人源化取代。
同样地，在给定序列中存在的CDR’s与构架的组合优选是这样的，以致所得到的39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
在一个具体的方面中，39D11-样序列是与氨基酸序列39D11(SEQ IDNO:119)具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性的ISV。例如，在按照该方面所述的39D11-样序列中，CDR’s可以是按照上述特别优选的方面所述的，并且可以特别是（但不限于）SYDMS(SEQ ID NO:134)，并且优选是NYDMA(SEQ ID NO:135)(CDR1)；SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)(CDR2)；和DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，并且优选是DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)(CDR3)。同样地，优选地，在此类39D11-样ISV中存在的CDR’s和构架的组合优选是这样的，以致所得到的39D11-样ISV(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)；和/或(iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
在一个具体的方面中，任意39D11-样序列可以是39D11的人源化的和/或序列优化的变体，如本文进一步所述。与39D11的序列相比，这些可以，例如且不限于，包含一个或多个，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个，并且基本上多至所有的下述突变（的任意组合）：E1D，V5L，E6Q，F29Y，S31N，S35A或S36G，G44R，N73K，M77T或M77L，K83R，W91A，D97E，Y100eF和/或Q108L（编号按照Kabat，例如，参见WO08/020079的表A-5至A-8；并且每个字母按照标准的单字母氨基密码表示一个氨基酸残基，对于其参考WO08/020079的表A-2）。在另一个方面中，与39D11的序列相比，这些可以，例如且不限于，包含一个或多个，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个，并且基本上多至所有的下述突变（的任意组合）：E1D，V5L，E6Q，F29Y，S31N，S35A或S35G，G44R，N75K，M77T或M77L，K83R，W91Y，D97E，Y100eF和/或Q108L（编号按照Kabat，例如，参见WO08/020079的表A-5至A-8；并且每个字母按照标准的单字母氨基密码表示一个氨基酸残基，对于其参考WO08/020079的表A-2）。技术人员应该清楚，这些突变中的一些是在CDR’s中，并且能够改善39D11-样序列(与39D11相比)的ISV针对IgE的亲和性、功效、活性和/或其他生物学特性。其他适当的人源化和/或序列优化取代是技术人员所清楚的，例如，通过本文进一步公开的内容和/或通过39D11序列与人VH序列的比较（对于其，例如，同样参考WO08/020079的表A-5至A-8）。
在一个优选的方面中，所述39D11-样序列选自SEQ ID NO’s:120-133中的任一种或是与SEQ ID NO’s:120-133中的任一种具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性的ISV。优选的39D11-样序列是SEQ ID NO’s:128和129。
39D11-样序列还优选地在人IgE和食蟹猴IgE之间交叉反应，如本文进一步所述。
如已经提及的，通常，任意的“39D11-样序列”，“39D11-样序列”，“39D11-样ISV”或“39D11-样结构单元”优选是这样的，以致其：(i)以优于8.10-10M，优选地优于6.10-10M，如优于10-10M，优于5.10-11M，优于2.10-11M，或者甚至优于10-11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RI相互作用(例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中)；和/或(ii)以优于5.10-8M，优选地优于2.10-8M，如优于10-8M，优于5.10-9M，优于2.10-9M，优于10-9M，优于5.10-10M，或优于2.10-10M的IC50值抑制HuIgE/HuFc(ε)RII相互作用(例如，在实施例8所述的ELISA测定中)。
此外，任意的“39D11-样序列”，“39D11-样序列”，“39D11-样ISV”或“39D11-样结构单元”优选是这样的，以致其在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于100nM，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于1nM，或者甚至优于0.5nM的IC50值。
因此，所述“39D11-样序列”也形成本发明的一部分。
针对IgE的ISV，特别是“39D11-型序列”和“39D11-样序列”，可以进一步包含或可以不进一步包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位。如果存在，所述其他基团、残基、结构部分或结合单位可以为或可以不为所述免疫球蛋白单可变结构域(和/或存在其的多肽)提供进一步的官能性，并且可以改变或可以不改变所述免疫球蛋白单可变结构域的特性。
例如，所述其他基团、残基、结构部分或结合单位可以是一种或多种另外的氨基酸序列，以使所述多肽是（融合）蛋白或（融合）多肽。
如上文所述，可以连接另外的结合单位以形成多特异性多肽。
在上述多肽中，所述一个、两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域以及所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以直接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列时，所述接头可以也是氨基酸序列，以致所得到的多肽是融合（蛋白）或融合（多肽）。
所述一个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单位可以是任意适当的和/或需要的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以转变、改变或另外影响或可以不转变、改变或另外影响融合多肽的（生物学）特性，并且可以为或可以不为所述融合多肽增加另外的官能性。优选地，所述另外的氨基酸序列是这样的，以致其赋予所述融合多肽一种或多种需要的特性或官能性。
此类氨基酸序列的实例是技术人员所清楚的，并且通常可以包括用在基于常规抗体及其片段（包括，但不限于，ScFv’s和单结构域抗体）的肽融合体中的所有的氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson的综述(Nature Biotechnology（自然生物技术）23:1126-1136，2005)。
例如，此类氨基酸序列可以是与ISV本身相比增加（融合）多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少免疫原性或毒性，消除或减弱不理想的副作用，和/或赋予其他有利的特性和/或减少不理想的特性的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白（参见，例如WO00/27435）或半抗原分子（例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO98/22141）。
在本发明的一个具体的方面中，制备与相对应的针对IgE的ISV相比具有增加的半衰期的多肽。包含此类延长半衰期的结构部分的本发明的多肽的实例例如包括但不限于，这样的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段（如(人)血清白蛋白或其适当的片段）或连接一个或多个能够与血清蛋白结合的结合单位（诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”’s，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体），其可以结合血清蛋白如血清白蛋白(如人血清白蛋白)，血清免疫球蛋白(如IgG)，转铁蛋白或WO04/003019中列出的其他血清蛋白中的一种；包括这样的多肽，其中免疫球蛋白单可变结构域连接Fc部分(如人Fc)或其是适当的部分或片段；或包括这样的多肽，其中所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽（诸如，但不限于，WO91/01743，WO01/45746或WO02/076489中所述的蛋白和肽）。也参考WO03/002609和WO04/003019中所述的dAb’s和Harmsen等(Vaccine（疫苗）23:4926-42，2005)；参考EP0368684，以及埃博灵克斯股份有限公司的WO08/028977、WO08/043821、WO08/043822，和WO08/068280，WO09/127691，US2011/0243954与WO2011/095545。
按照本发明的一个具体的而非限制性的方面，除了所述一个、两个或更多个针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域之外，本发明的多肽可以包含至少一个针对人血清白蛋白的肽（如进一步定义的）。
通常，具有增加的半衰期的本发明的多肽优选地具有是相对应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。
通常，与相对应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身相比，具有增加的半衰期的本发明的多肽优选地具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在另一个优选而非限制性方面中，本发明的此类多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的多肽可以具有至少5天（诸如约5-10天）、优选至少9天（诸如约9-14天）、更优选至少约10天（诸如约10-15天）、或至少约11天（诸如约11-16天）、更优选至少约12天（诸如约12-18天或更多）、或超过14天（诸如约14-19天）的半衰期。
所述另外的氨基酸残基可以转变、改变或者另外影响或者可以不转变、改变或者另外影响所述（融合）多肽的其他（生物学）特性，并且可以为或者可以不为所述（融合）多肽添加另外的官能性。例如，所述氨基酸残基：
a)可以包括N-端Met残基，例如，由于在异源宿主细胞或宿主生物体内表达所致；
b)可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述（融合）多肽从宿主细胞中分泌（例如，取决于用于表达所述（融合）多肽的宿主细胞，提供所述（融合）多肽的前-（pre-）、原-（pro-）或前原-（prepro-）形式）。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述（融合）多肽的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
c)可以形成“标记”，例如允许或促进所述（融合）多肽的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除（例如，通过化学或酶促裂解），以提供所述多肽（为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所述氨基酸序列或多肽序列连接或包含可裂解的基序）。此类残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽（glutatione）残基以及myc-标记如AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQ ID NO:193)；
d)可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
因此，所述一种或多种ISVs可以用作用于制备（融合）多肽的“结合单位”、“结合结构域”或“结构单元”（这些术语可互换使用），所述（融合）多肽可以任选地包含一种或多种其他结合单位（即，针对IgE上相同的或另一个表位和/或针对一种或多种不同于IgE的抗原、蛋白或靶标）。
包含本文所述的CDR序列的ISVs特别适合用作结构单元或结合单位用于制备（融合）多肽。
因此，本发明还涉及本文所述的ISVs在制备多价多肽中的应用。用于制备多价多肽的方法包括连接ISV与至少一个另外的结合单位，任选地通过一个或多个接头连接。然后，如本文定义的ISV用作结合结构域或结合单位，以提供和/或制备包含两个（例如，在二价多肽中）、三个（例如，在三价多肽中）或更多个（例如，在多价多肽中）结合单位的多价多肽。在这一点上，如本文所述的IVS可以用作结合结构域或结合单位以提供和/或制备包含两个、三个或更多个结合单位的多价多肽，如二价或三价多肽。
结合血清白蛋白的肽
可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽通常可以如WO08/068280，WO09/127691中所述，并且特别如WO2011/095545中所述。因此，关于这些肽的一般描述，参考这些申请。
如在这些申请中提及的，这些肽可以具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度，并且是这样的，以致其能够结合到(人)血清白蛋白(中)的亚口袋（subpocket）中，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493（编号如WO09/127691的实施例8所述）。这些申请还提到这些肽可以与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合，从而增加其半衰期。
WO08/068280记述了多种此类肽，包括氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO:19)，其在WO08/068280中称为“17D12”，并且其在WO08/068280中以SEQ ID NO:3列出。
WO09/127691记述了17D2的多种改进的变体，其通常与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性(如本文定义)，并且与SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血清白蛋白。
具体地，WO09/127691所述的一些优选的肽包含：
(i)Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或
(ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；和/或
(iii)序列基序GGG；
并且优选地(i)，(ii)和(iii)中的至少任意两种，并且更优选地全部三种。
具体地，WO09/127691中所述的一些示例性的肽可以，例如，包含一种或多种下述特征：
(i)序列基序RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选为W，Y，F，S或D；和/或
(ii)序列基序GGG，优选序列基序FGGG(SEQ ID NO:24)，更优选序列基序DVFGGG(SEQ ID NO:33)，并且特别是序列基序DVFGGGT(SEQID NO:37)；
并且更优选这两个序列基序(i)和(ii)。
WO2011/095545记述了WO09/127691中所述的肽的一些甚至进一步改善的变体，与WO09/127691中所述的肽相比，其进一步包含上文提及的Arg(R)残基（按照WO08/068280，WO09/127691和WO2011/095545中所用的编号方式，其在位置3）的上游（如WO2011/095545中定义的），并且特别是上文提及的RXWD基序的上游，其为2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基（并且对于其余部分一个或多个更多的适合的氨基酸残基，如例如在WO2011/095545中所示例的），其中所述至少一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其中所述至少一个芳香氨基酸残基可以特别地选自W，Y和/或F。优选地，所述位置3上游的氨基酸区段优选是这样的，以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。特别地，WO2011/095545中所述的结合白蛋白的肽可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。更特别地，所述氨基酸残基区段可以包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。可以存在于位置3上游的所述氨基酸残基区段的一些非限制性的实例在SEQ ID NO’s:72-92中给出（WO2011/095545的SEQID NO’s:78-98）。
WO2011/095545进一步描述了，在本文所述的肽中，下述是可能的，并且甚至可能是有利的：(i)用苏氨酸(T)残基替代位置8的天冬氨酸(D)残基（例如，但不限于，在位置14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中）；和/或(ii)用另一种氨基酸残基替代位置14的苏氨酸(T)残基，如(例如但不限于)A，N或D。
例如，可以存在于WO2011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些序列基序为：
-如WO2011/095545中所述的在位置3上游的氨基酸残基区段（也参见本文前述段落）。例如，这可以是WO2011/095545的SEQ ID NO’s:78-98的序列（在本文中为SEQ ID NO’s:72-92）中的一种，或是与这些序列中的至少一种具有2个或仅有1个“氨基酸差异”——如WO2011/095545中定义的——的序列；
其与下述序列基序中的一种组合：
-氨基酸序列RXWDXDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:23；在本文中为SEQ ID NO:93)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
-氨基酸序列RXWDXDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ ID NO:24；在本文中为SEQ ID NO:94)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:25；在本文中为SEQ ID NO:95)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPG(WO2011/095545的SEQ ID NO:26；在本文中为SEQ ID NO:96)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:27；在本文中为SEQ ID NO:97)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
-选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGG(WO2011/095545的SEQID NO:28；在本文中为SEQ ID NO:98)；RDWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:29；在本文中为SEQ ID NO:99)；RSWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:30；在本文中为SEQ ID NO:100)或RYWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:31；在本文中为SEQ ID NO:101)；并且特别选自RDWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:28；在本文中为SEQ ID NO:98)；RSWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:29；在本文中为SEQ ID NO:99)或RYWDFDVFGGG(WO2011/095545的SEQ ID NO:30；在本文中为SEQ ID NO:100)；
-选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGT(WO2011/095545的SEQID NO:32；在本文中为SEQ ID NO:102)；RDWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ ID NO:33；在本文中为SEQ ID NO:103)；RSWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ ID NO:34；在本文中为SEQ ID NO:104)或RYWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ IDNO:35；在本文中为SEQ ID NO:105)；并且特别地选自RDWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ ID NO:33；在本文中为SEQ ID NO:103)；RSWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ IDNO:34；在本文中为SEQ ID NO:104)或RYWDFDVFGGGT(WO2011/095545的SEQ ID NO:35；在本文中为SEQ ID NO:105)；
-选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:36；在本文中为SEQ ID NO:106)；RDWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:37；在本文中为SEQ ID NO:107)；RSWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:38；在本文中为SEQ ID NO:108)或RYWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ IDNO:39；在本文中为SEQ ID NO:109)；并且特别是选自RDWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:37；在本文中为SEQ ID NO:107)；RSWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQID NO:38；在本文中为SEQ ID NO:108)或RYWDFDVFGGGTP(WO2011/095545的SEQ ID NO:39；在本文中为SEQ ID NO:109)；
-选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQ ID NO:40；在本文中为SEQ ID NO:110)；RDWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQ ID NO:41；在本文中为SEQ ID NO:111)；RSWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQ ID NO:42；在本文中为SEQ ID NO:112)或RYWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQID NO:43；在本文中为SEQ ID NO:113)；并且特别是选自RDWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQ ID NO:41；在本文中为SEQ ID NO:111)；RSWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQID NO:42；在本文中为SEQ ID NO:112)或RYWDFDVFGGGTPV(WO2011/095545的SEQ ID NO:43；在本文中为SEQ ID NO:113)。
因此，可以存在于WO2011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些其他的（非限制性的）序列基序为：
-WO2011/095545的SEQ ID NO’s:24-27(在本文中为SEQ ID NO’s:94-97)或WO2011/095545的32-43(在本文中为SEQ ID NO’s:102-113)的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置14的苏氨酸(T)残基被另一种氨基酸残基(优选但不限于，A，N或D)替代；
-WO2011/095545的SEQ ID NO’s:23-43(在本文中为SEQ ID NO’s:93-113)的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置8的天冬氨酸(D)被苏氨酸(T)替代；
-WO2011/095545的SEQ ID NO’s:24-27(在本文中为SEQ ID NO’s:94-97)或WO2011/095545的32-43(在本文中为SEQ ID NO’s:102-113)的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中(i)位置14的苏氨酸(T)残基被另一种氨基酸残基(优选但不限于，A，N或D)替代，并且(ii)位置8的天冬氨酸(D)被苏氨酸(T)替代。
还如WO2011/095545中所述，所有这些序列基序都可以包含一种或多种其他适当的取代，如（例如且不限于）WO2011/095545的表I中列出的一种或多种取代。
WO2011/095545和WO09/127691还描述了其中所述的两种或更多种（如两种）肽（其可以是相同的或不同的）可以彼此连接（直接连接或通过适当的接头连接，所述接头例如，GS-接头，如本文中SEQ ID NO:164的9GS接头），从而提供两个（或更多个）所述结合血清白蛋白的肽的“串联重复”。这些申请还提及这些肽能够与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合，从而增加其半衰期。
如所提及的，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的一种或多种肽通常可以如WO08/068280，WO09/127691中所述，并且特别如WO2011/095545中所述。
因此，在一个方面中，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽可以是总长度为5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15，20，25或30个氨基酸残基的肽（作为单一重复），其是这样的，以致其能够结合到(人)血清白蛋白中的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493（编号如WO09/127691的实施例8所述）。
特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）可以是这样的肽，以致所述肽与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性(如本文定义)，并且与SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血清白蛋白。
更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）可以是这样的肽，以致所述肽包含：
(i)Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或
(ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；和/或
(iii)序列基序GGG；
并且优选地还包含：
(iv)在所述Arg(R)残基的上游的：2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基（并且对于其余部分一个或多个更多的适合的氨基酸残基），其中所述至少一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其中所述至少一个芳香氨基酸残基可以特别地选自W，Y和/或F。特别地，所述位置3上游的氨基酸区段优选是这样的，以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且特别地可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且更特别地可以包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。例如，在存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽中(作为单一重复或串联重复)，位置3上游的氨基酸区段可以选自WO2011/095545的SEQ ID NO’s:78-98(在本文中为SEQ ID NO’s:72-92)。
甚至更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽(作为单一重复或串联重复)可以是这样的肽：
a)其具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度（作为单一重复）；并且
b)其是这样的，以致其能够结合到(人)血清白蛋白中的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且
c)其与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性(如本文定义)；并且
d)其是这样的，以致与SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血清白蛋白；并且
e)其包含一个或多个下述序列基序：DYDV(SEQ ID NO:20)，YDVF(SEQ ID NO:21)，DVFG(SEQ ID NO:22)，VFGG(SEQ ID NO:23)，FGGG(SEQ ID NO:24)和/或GGGT(SEQ ID NO:25)，并且特别是一个或多个序列基序：DYDVF(SEQ ID NO:26)，YDVFG(SEQ ID NO:27)，DVFGG(SEQ ID NO:28)，VFGGG(SEQ ID NO:29)，FGGGT(SEQ ID NO:30)，DYTVF(SEQ ID NO:44)，YTVFG(SEQ ID NO:45)或TVFGG(SEQ IDNO:46)；并且特别是一个或多个序列基序：DYDVFG(SEQ ID NO:31)，YDVFGG(SEQ ID NO:32)，DVFGGG(SEQ ID NO:33)，VFGGGT(SEQID NO:34)，DYTVFG(SEQ ID NO:47)，YTVFGG(SEQ ID NO:48)或TVFGGG(SEQ ID NO:49)，甚至更特别地是一个或多个序列基序：DYDVFGG(SEQ ID NO:35)，YDVFGGG(SEQ ID NO:36)，DVFGGGT(SEQ ID NO:37)；DYTVFGG(SEQ ID NO:50)，YTVFGGG(SEQ ID NO:51)，TVFGGGT，(SEQ ID NO:52)，DVFGGGA(SEQ ID NO:53)，DVFGGGN(SEQ ID NO:54)，DVFGGGD(SEQ ID NO:55)，TVFGGGA(SEQ ID NO:56)，TVFGGGN(SEQ ID NO:57)或TVFGGGD(SEQ ID NO:58)，如一个或多个序列基序：DYDVFGGG(SEQ ID NO:38)，YDVFGGGT(SEQ ID NO:39)；DYDVFGGGT(SEQ ID NO:40)；DYTVFGGG(SEQ IDNO:59)，YTVFGGGT(SEQ ID NO:60)，YDVFGGGA(SEQ ID NO:61)，YDVFGGGN(SEQ ID NO:62)，YDVFGGGD(SEQ ID NO:63)；YTVFGGGA(SEQ ID NO:64)，YTVFGGGN(SEQ ID NO:65)或YTVFGGGD(SEQ ID NO:66)；
f)在e)所述的序列基序上游，例如，在位置3-6，其包含序列基序RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但优选是W，Y，F，S或D；和/或
g)在所述序列基序RXWD上游，其包含：2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基（并且对于其余部分一个或多个更多的适合的氨基酸残基），其中所述至少一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其中所述至少一个芳香氨基酸残基可以特别地选自W，Y和/或F。特别地，所述位置3上游的氨基酸区段优选是这样的，以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且其可以在位置3上游特别包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且更特别地可以包含(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使所述W或Y残基中的至少一个能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。例如，在存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）中，在位置3上游的氨基酸区段可以选自WO2011/095545的SEQ ID NO’s:78-98（SEQ ID NO’s:72-92）。
甚至更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽(作为单一重复或串联重复)可以是这样的肽：
i)其具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度（作为单一重复）；并且
ii)其是这样的，以致其能够结合到(人)血清白蛋白中的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；并且
iii)其与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性(如本文定义)；并且
iv)其是这样的，以致与SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血清白蛋白；
并且包含：
v)在位置3上游的如WO2011/095545中所述的且特别是如上述g)所述的氨基酸残基区段。这可以是，例如，本文的SEQ ID NO’s:72-92的序列中的一种，或是与这些序列中的至少一种具有2个或仅有1个“氨基酸差异”——如WO2011/095545中定义的——的序列。
其与下述序列基序中的一种组合：
vi)氨基酸序列RXWDXDVFGGG(SEQ ID NO:93)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
vii)氨基酸序列RXWDXDVFGGGT(SEQ ID NO:94)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
viii)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTP(SEQ ID NO:95)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
ix)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPG(SEQ ID NO:96)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
x)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(SEQ ID NO:97)，其中第一个（从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F；
xi)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGG(SEQ ID NO:98)；
RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO:99)；RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO:100)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO:101)；并且特别是选自：
RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO:98)；RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO:99)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO:100)；
xii)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGT(SEQ ID NO:102)；
RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:103)；RSWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:104)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:105)；并且特别是选自：
RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:103)；RSWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:104)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO:105)；
xiii)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTP(SEQ ID NO:106)；
RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO:107)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ IDNO:108)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO:109)；并且特别是选自：
RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO:107)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ IDNO:108)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO:109)；
xiv)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTPV(SEQ ID NO:110)；
RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO:111)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQID NO:112)或RYWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO:113)；并且特别是选自：RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO:111)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO:112)或RYWDFDVFGGGTPV(本文中的SEQ ID NO:113)。
因此，可以存在于WO2011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些其他的（非限制性）序列基序为：
i)SEQ ID NO’s:94-97或102-113的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置14的苏氨酸(T)残基被另一种氨基酸残基(优选但不限于，
A，N或D)替代；
ii)SEQ ID NO’s:93-113的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置8的天冬氨酸(D)被苏氨酸(T)替代；
iii)SEQ ID NO’s:94-97或SEQ ID NO’s:102-113的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中(i)位置14的苏氨酸(T)残基被另一种氨基酸残基(优选但不限于，A，N或D)替代，并且(ii)位置8的天冬氨酸(D)被苏氨酸(T)替代。
可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）的一些优选的但非限制性的实例是WO09/127691的SEQ ID NO’s:2-115或147-157的序列。
可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）的一些非限制性的实例是WO2011/095545的SEQ ID NO’s:54-74或103-108的序列。
可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽（作为单一重复或串联重复）的一些特别优选的但非限制性的实例是SEQ IDNO’s:1-8的序列。SEQ ID NO’s:9-18是可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述肽的串联重复的一些优选的但非限制性的实例。
本发明的多肽
在本发明的抗-IgE多肽中，所述一个或多个（如一个或两个）针对IgE的ISV’s（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）和所述一个或多个（如一个或两个）结合血清白蛋白的肽可以适当地彼此连接，直接连接或通过一个或多个适当的间隔臂或接头连接。例如，所述接头可以是“GS接头”（即，基本上由G和S残基组成的接头），如SEQ ID NO’s:162-171中的一种接头，其中9GS，20GS，30GS和35GS接头可能是特别适合的。在一些情形中，20GS接头的使用可能优于9GS接头，原因在于在一些情形中，与通过9GS接头连接的结合白蛋白的肽相比，通过20GS接头连接的结合白蛋白的肽表现出改善的（即，较少的）对（蛋白水解）降解的敏感性。
例如，并且不限于，本发明的抗-IgE多肽可以包含：
-单个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）和如本文所述的单个结合白蛋白的肽；它们可以直接或通过适当的接头彼此连接；
-单个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）和两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽（它们可以是相同的或不同的，并且它们可以直接或通过适当的接头（如SEQ ID NO:164的9GS接头）彼此连接）的串联重复；它们可以直接或通过适当的接头彼此连接；
-单个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）和两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽（它们可以如本文所述，并且它们可以是相同的或不同的）；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
-两个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和如本文所述的单个结合白蛋白的肽；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
-两个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和由两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽（它们可以是相同的或不同的，并且它们可以直接或通过适当的接头彼此连接）形成的串联重复；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
-两个针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽（它们可以如本文所述，并且它们可以是相同的或不同的）；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接。
本发明的所述抗-IgE多肽的一些非限制性的实例可以示例性表示如下：其中“[肽]”表示如本文所述的结合血清白蛋白的肽，“[肽-肽]”表示两个如本文所述的结合血清白蛋白的肽（它们可以是相同的或不同的，并且它们可以直接或通过适当的接头连接）的串联重复，“[抗-IgE]”表示针对IgE的ISV（并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列），“-”表示适当的接头（这是可选的），N端在左手侧，C端在右手侧。应该注意到，当下述示例性表示的多肽分别包含两个结合血清白蛋白的肽或两个针对IgE的ISV’s时，这些可能是相同的或不同的。
[肽]-[抗-IgE]
[肽-肽]-[抗-IgE]
[抗-IgE]-[肽]
[抗-IgE]-[肽-肽]
[肽]-[抗-IgE]-[肽]
[肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]
[肽-肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]
[抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽]
[抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽-肽]
[抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]
[抗-IgE]-[肽-肽]-[抗-IgE]
[肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽]
[抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]-[肽]
[肽]-[抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]
[肽]-[抗-IgE]–[肽]-[抗-IgE]-[肽]
从上文应该清楚，所述抗-白蛋白肽可能位于N端，可能位于C端，或者可能是接头的一部分；或者，当存在多于一个结合白蛋白的肽时，可以是其任意适当的组合。在一个优选的但非限制性的方面中，结合白蛋白的肽位于C端（例如，比较实施例15中给出的结果）。
优选地，本发明的抗-IgE多肽包含一个或两个、且更优选地仅一个针对IgE的ISV和仅一个结合血清白蛋白的肽（或一个由两个结合血清白蛋白的肽形成的串联重复）。
如提及的，在这些多肽和构建体中存在的针对IgE的ISV优选是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列，其中IGE026/IGE0045(SEQ ID NO:128)是特别优选的实例。针对血清白蛋白的肽优选地选自SEQ ID NO’s:1-8的“单一重复”肽或SEQ ID NO’s:9-18的“串联重复”肽。存在的接头（如果有一些的话）优选地选自SEQ ID NO’s:162-171，其中特别优选9GS，20GS，30GS和35GS。
在一个具体而非限制性的方面中，本发明的多肽是这样的，以致，当在实施例16所述的保存稳定性测定中检测时，对于在25°C保存1月后（在实施例16给出的进一步的条件下）的所述多肽，在SE-HPLC上的前峰（pre-peak）少于10%，优选地少于5%；和/或对于在40°C保存1月后（在实施例16给出的进一步的条件下）的所述多肽，在SE-HPLC上的前峰少于20%，优选地少于10%。例如，参考表19的比较结果。
本发明的抗-IgE多肽的一些优选的但非限制性的实例在SEQ IDNO’s:147-161中给出（还参见表A-9）。本发明还涉及选自SEQ ID NO’s:147-161的任一种的多肽，或与SEQ ID NO’s:147-161的任一种具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性的多肽。
在这些中，IGE109(IGE66G02E1D-20GS-NEXP001-9GS-NEXP002)(SEQ ID NO:155)是特别优选的。因此，本发明的一个具体方面涉及与SEQ ID NO:155具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性的多肽。所述多肽优选地如本文进一步所述，并且优选地按照本文提及的优选方面所述。
如本文已经提及，与本领域已经记述的抗-IgE纳米抗体（如WO04/041867中所述的那些）相比，39D11及其如本文所述的变体(如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列)通常还可能具有多种优点。基于本文记载的公开内容和数据，这些通常是技术人员应该清楚的，并且例如，但不限于，这些可以是：
-39D11，39D11-型序列和39D11-样序列在人IgE与食蟹猴IgE之间交叉反应(如本文进一步所述)；
-39D11，39D11-型序列和39D11-样序列可以具有提高的潜力(参见，例如实验部分记载的数据)；
-39D11，39D11-型序列和39D11-样序列可以阻断人和食蟹猴IgE二者与高亲和力IgE受体(Fc(ε)RI)和低亲和力受体(Fc(ε)RII)的相互作用（分别参见实施例6，7和8）；并且通常在针对人受体和食蟹猴受体的亲和力之间具有理想的“平衡”；和/或
-39D11，39D11-型序列和39D11-样序列在针对人高亲和力IgE受体和低亲和力IgE受体的亲和力之间具有理想的“平衡”（同样参见实验部分记载的数据）；
或者任意或所有前述的任意组合。
这意味着，本文所述的39D11，39D11-型序列，特别是39D11-样序列可能不仅用于本文所述的本发明的抗-IgE多肽（即，在包含至少一个所述结构单元和至少一个WO08/068280，WO09/127691和WO2011/095545所述的结合白蛋白的肽的构建体中），而且其本身或作为其他多肽、蛋白或其他化合物或构建体的成分或结构单元具有优点。例如，但不限于，本文所述的39D11，39D11-型序列，特别是39D11-样序列可以用于WO04/041867和/或WO04/041865所述的类型的多肽中（即，替代其中所述的一种抗-IgE纳米抗体）。所述多肽还可以是半衰期延长的，例如，通过乙二醇化或使用结合血清白蛋白的纳米抗体（包括WO04/041867，WO04/041865或WO06/122787中记述的那些，尽管那么应该认识到，所述多肽可能具有有限的保存稳定性，如本文所述）。
因此，在一些其他的方面中，本发明还涉及：
-这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个（如一个或两个）39D11、39D11-型序列(如本文定义)，特别是39D11-样序列(如本文定义)；并且更特别是这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个（如一个或两个）39D11-样序列(如本文定义)，其为39D11的人源化的和/或序列优化的变体，如SEQ ID NO’s:120-133中的变体的一种（其中SEQ ID NO’s:128和129是特别优选的实例）。例如，所述蛋白或多肽还可以包含两个或三个所述针对IgE的ISV’s（其可以是相同的或不同的），它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接。其也可以是半衰期延长的（例如，通过乙二醇化）或另外修饰的（例如，通过WO09/068627中通常所述的一些修饰进行）；
-（融合）蛋白、多肽、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个（如一个或两个）(i)39D11，39D11-型序列(如本文定义)，特别是39D11-样序列(如本文定义)；并且更特别是这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个（如一个或两个）39D11-样序列(如本文定义)，其为39D11的人源化的和/或序列优化的变体，如SEQ ID NO’s:120-133中的变体的一种（其中SEQ ID NO’s:128和129是特别优选的实例）；和(ii)至少一个其他氨基酸序列、蛋白、(多)肽、结合结构域、结合单位、基团、残基或结构部分；它们适当地通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接。例如，如其他氨基酸序列可以是另一种针对IgE（例如，针对IgE上相同或不同的部分或表位）或针对另一种靶标（如例如血清白蛋白或另一种血清蛋白，以提供增加的半衰期，或针对另一种治疗靶标，以提供双特异性构建体）的ISV（如另一种纳米抗体）。例如，所述多肽等可以一般如WO04/041867和/或WO04/041865中所述（或者如WO09/068627中所述，但是包含针对IgE的ISV，而不是针对WO09/068627中所用的IL-23的亚基的ISV’s），并且可以例如是二价的（或多价的）、二互补位的（多互补位的）和/或双特异性的（或多特异性的）构建体（这些术语如WO09/068627一般所述）。同样地，在所述蛋白或多肽中，所述39D11-样序列通常可以如本文进一步所述，并且优选按照本文所述的优选方面所述。包含39D11-样序列的双特异性抗-IgE/抗-白蛋白双特异性纳米抗体构建体的一些非限制性的实例在SEQ ID NO’s:175-182(表A-10)中给出。
在另一个方面中，本发明涉及编码本文所述的一种针对IgE的氨基酸序列或多肽的核酸。例如，所述核酸可以是遗传构建体的形式，如例如在WO04/041867，WO04/041865或WO09/068627中一般所述。
本发明还涉及制备本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
本发明的多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，技术人员将从本文的进一步描述而清楚这些方式。例如，本发明的多肽可以以本身已知的用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段（包括但不限于，(单)结构域抗体和ScFv片段）的方式来制备。一些优选的但非限制性的用于制备多肽和核酸的方法包括本文所述的方法和技术。
本发明的多肽通常可以通过这样的方法来制备，所述方法至少包括下述步骤：适当地连接针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个其他结合单位，如所述一个或多个针对血清白蛋白的肽，它们任选地通过一个或多个适当的接头连接。所述免疫球蛋白单可变结构域和肽（以及接头）可以通过本领域已知的和如本文进一步所述的方法偶联。优选的技术包括连接编码所述免疫球蛋白单可变结构域和肽(以及接头)的核酸序列，从而制备表达所述多肽的遗传构建体。用于连接氨基酸或核酸的技术是技术人员所清楚的，并且同样参考标准手册，如上文提及的Sambrook等和Ausubel等，以及下述实施例。
因此，本发明的多肽可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，并且回收所表达的本发明的多肽。所述方法可以以本身已知的方式进行，所述方式是技术人员所清楚的，例如，基于本文进一步所述的方法和技术。
因此，用于制备本发明的多肽的方法可以包括下述步骤：
-在适宜的宿主细胞或宿主生物体（本文还叫作“本发明的宿主”）中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码本发明所述的多肽的核酸（本文还叫作“本发明的核酸”），
任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
-在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的多肽；
任选地接着进行：
-分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
因此，本发明还涉及编码本文所述的ISV或多肽的核酸或核苷酸序列（还称为“本发明的核酸”）。本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选是双链DNA的形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA，cDNA或合成的DNA（如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA）。
按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，所述载体诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
基于关于本文所述的ISV或多肽的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方式制备或获得，和/或可以从适当的天然来源分离。并且，技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少两个编码免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，也可以以适当的方式连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或更多个天然存在的和/或合成的序列（或者其两个或更多个部分）组合，引入引起截断的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点（例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区），和/或通过使用一个或多个“错配”引物的PCR反应的方法引入突变。这些以及其他技术应该是技术人员所清楚的，并且也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，其存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，所述元件诸如例如一个或多个适宜的调节元件（诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等）和本文提到的其他遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于整合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体（例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中）。
在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括：
a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
b)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
并且任选地还有
c)一个或多个本身已知的其他遗传构建体元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思（如本文进一步所述）；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其他元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因和/或可以促进或增加转化或整合（效率）的元件。用于所述遗传构建体的这些和其他适宜的元件对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体的类型；要用的宿主细胞或宿主生物体；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式（例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达）；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其他元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，则所述启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”（其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子）。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本文所述的ISV或多肽。适当的宿主或宿主细胞是技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌、原核或真核细胞或细胞系，或者任何适当的真菌、原核或真核生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌（Escherichia coli）菌株；变形菌属（Proteus）菌株，例如奇异变形菌（Proteus mirabilis）菌株；假单胞菌属（Pseudomonas）菌株，例如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，例如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌株或短芽孢杆菌（Bacillus brevis）菌株；链霉菌属（Streptomyces）菌株，例如浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans）菌株；葡萄球菌属（Staphylococcus）菌株，例如肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）菌株；以及乳球菌属（Lactococcus）菌株，例如乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属（Trichoderma），例如Trichoderma reesei；脉孢菌属（Neurospora），例如粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）；粪壳属（Sordaria），例如大孢粪壳（Sordaria macrospora）；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉（Aspergillus niger）或酱油曲霉（Aspergillus sojae）；或其他丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属（Saccharomyces），例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），例如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）；毕赤酵母属（Pichia），例如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）或甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）；汉逊酵母属（Hansenula），例如多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）；克鲁维酵母属（Kluyveromyces），例如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）；Arxula，例如Arxula adeninivorans；亚罗酵母属（Yarrowia），例如解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）；
-昆虫来源的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目（lepidoptera）的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾（Spodoptera）SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属（Drosophila）的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草（tobacco）植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）的所有其他宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO94/29457；WO96/34103；WO99/42077；Frenken等(Res Immunol.149:589-99，1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，同前所述；van der Linden(J.Biotechnol.（生物技术杂志）80:261-70，2000)；Joosten等.(Microb.CellFact.2:1，2003)；Joosten等.(Appl.Microbiol.Biotechnol.（应用微生物生物技术）66:384-92，2005)；以及本文所引用的其它参考文献。
在另一个方面中，本发明涉及这样的宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达（或在适当的环境中能够表达）本文所述的针对IgE的ISV’s、氨基酸序列或多肽中的一种；和/或包含编码其的核酸。所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例可以如WO04/041867，WO04/041865或WO09/068627中一般所述。例如，包含至少一个如本文所述的抗-IgE结构单元和至少一个WO08/068280，WO09/127691和WO2011/095545所述的结合白蛋白的肽的多肽可以有利地在酵母菌种，如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达、生产或制备。也参见WO2011/095545，其也描述了在毕赤酵母属和其他宿主/宿主细胞中表达/生产包含WO2011/095545的结合白蛋白的肽的多肽。
本文所述的ISV’s和多肽也可以表达为所谓的“内抗体（intrabodies）”，如例如在WO94/02610，WO95/22618和US7,004,940；WO03/014960中所述；在Cattaneo和Biocca(“Intracellular Antibodies:Development andApplications（细胞内抗体：开发和应用）”Landes和Springer-Verlag，1997)中；以及在Kontermann(Methods（方法）34:163-170，2004)中所述。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适当的技术是技术人员所清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。同样参考上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本文所述的ISV或多肽的步骤，例如，使用特异性抗体进行。
转化的宿主细胞（其可以是稳定的细胞系的形式）或宿主生物体（其可以是稳定的突变系或株系的形式）形成本发明的其他方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者（至少）能够表达（例如，在适宜的条件下）本文所述的ISV或多肽（并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中）。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本文所述的ISV’s或多肽的表达，通常可以在（需要的）ISV或多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的（相关）核苷酸序列表达的调节元件。再次，参见在上文关于本发明的遗传构建体的段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物（例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中）；所有这些可以由熟练的技术人员选择。此外，在这样的条件下，所述ISV’s或多肽可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
熟练的技术人员还应该清楚，取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，ISV或多肽可以（首先）以不成熟的形式（如上文提及）产生，其然后可以进行翻译后修饰。并且，也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，所述ISV或多肽可以被糖基化。
然后，本文所述的ISV或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如（制备级）层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术（例如，使用与本发明的多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列）和/或制备级免疫学技术（即，使用针对要被分离的ISV或多肽的抗体）进行。
本发明还涉及产品或组合物，所述产品或组合物含有或包含至少一种本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物（即，针对IgE/包含至少一种本文所述的针对IgE的ISV），和任选地一种或多种本身已知的此类组合物的其他成分，即，这取决于所述组合物的目的用途。所述产品或组合物可以例如是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或诊断应用的产品或组合物（也如本文所述）。所述产品或（药物）组合物的一些优选的但非限制性的实例通常可以如WO04/041867，WO04/041865，WO09/068627或WO2011/095545中所述。
本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物或包含其的组合物在体外（例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或多细胞生物体中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的人中）调节（如WO09/068627中一般定义）IgE和/或与IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应或更一般地是与IgE相关和/或由IgE介导的任何疾病或病症（的方法或组合物）中的应用。
本发明还涉及用于在体外（例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或多细胞生物体中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的人中）调节IgE和/或与IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应的方法，所述方法至少包括下述步骤：使IgE与本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物或者与包含其的组合物以适于调节IgE（或与IgE相关的目的或需要的作用、机制或反应）的方式和量接触。
本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物在制备用于在体外（例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或多细胞生物体中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的人中）调节IgE或与IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应的组合物（诸如，但不限于，本文进一步所述的药物组合物或制剂）中的应用。
本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，其用于治疗。
特别地，本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物用于治疗疾病或病症的应用，所述疾病或病症可以通过给有此需要的受试者施用（药物有效量的）本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物（或适当的包含其的组合物）得到预防或治疗。
更具体地，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，其用于与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的治疗，或者更一般地，用于与IgE相关和/或由IgE介导的任意疾病或病症的治疗。此类“IgE介导的”疾病或病症是技术人员所清楚的，并且，例如，可以包括但不限于：这样的病况，如哮喘（asthma），变应性鼻炎（allergic rhinitis），枯草热（hay fever），结膜炎（conjunctivitis），湿疹（eczema），荨麻疹（utricaria），食物过敏（food allergies）和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态反应（allergic reactions），如针对昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的变态反应，以及针对药物的变态反应；并且更一般地是与过敏性超敏反应和/或（特应性）变态反应（(atopic)allergy）相关的任何疾病或病症。
例如，目前Genentech销售称为奥马珠单抗的针对IgE的单克隆抗体用于IgE介导的病症。考虑所述ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，以及包含其的组合物可以用于预防或治疗与在本申请的优先权日期前已经核准的和/或在本申请的优先权日期后将要核准的适用奥马珠单抗的相同的疾病和病症。根据本文记载的其他描述和数据，技术人员还应该清楚，与奥马珠单抗相比，所述ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，以及包含其的组合物具有实质性优点（例如，参见实验部分，其中使用奥马珠单抗（获自商业来源）和通过用木瓜蛋白酶消化商业奥马珠单抗得到的Fab作为参比化合物）。通常，对于药物应用，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以配制成药物制剂或组合物，其包含至少一种本文所述的ISV或多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，以及任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药（诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注），局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式――取决于给药方式，其可以是固体、半固体或液体――以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
通常，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术（并且特别参见WO04/041862，WO04/041863，WO04/041865，WO04/041867和WO08/020079），以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences），第18版，Mack出版公司，美国(1990)，Remington，the Science and Practiceof Pharmacy（雷明顿，制药科学和实践），第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005)；或治疗抗体手册（Handbook of Therapeutic Antibodies）(S.Dubel，Ed.)，Wiley，Weinheim，2007(例如，参见第252-255页)。
例如，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段（包括ScFv’s和双抗体）和其它药物活性蛋白的任何方式配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药（例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药）或适于局部（即，透皮的或皮内）给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，WO08/020079中第143页提到的那些。通常优选水性溶液或混悬液。
因此，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以全身施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接掺入患者日常饮食的食物。对于口服治疗剂给药，本发明的ISV’s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、口含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽。当然，它们在所述组合物和制剂中的百分数可以变化，并且可以便利地为所给单位剂型的约2-约60重量％。本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以便获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂和甜味剂或调味剂，例如WO08/020079中第143-144页提及的那些。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，其还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、紫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含本文所述的ISV’s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药用的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以结合在缓释制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配制成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用，如在WO08/020079中第144和145页进一步所述。
对于局部给药，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体，如WO08/020079中第145页进一步所述。
通常，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度为约0.1-25重量-%，优选地约0.5-10重量-%。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度为约0.1-5重量-%，优选地约0.5-2.5重量-%。
需要用于治疗的本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物的量不但随着所选的特定的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白或构建体而变化，而且随着给药途径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于护理医生或临床医生的判断力。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为以适当的时间间隔施用的分剂量（例如，作为每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量）而提供。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的给药；诸如从吸入器多次吸入，或者通过施用多滴到眼睛中。
给药方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少两周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences（雷明顿药物科学）(Martin，E.W.，第4版)，Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害，并且通常包含对被治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。特别地，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过调节IgE、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导进行治疗的疾病或病症，所述方法包括对有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。特别地，所述药物有效量可以是足以调节IgE、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导的量；和/或提供足以调节IgE、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物的水平的量。
此外，本发明涉及预防和/或治疗可以通过对患者施用本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物进行预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
更具体地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和病症组成的组的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
在上述方法中，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，和/或包含其的药物组合物，可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内（例如，静脉内、皮下、肌内或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径）、鼻内、经皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的给药途径和用于所述给药的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其它因素。
本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，这取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或病症，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的所述特定的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，要用的特定的给药途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一个或多个药物有效量或剂量施用一种或多种本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，或者一种或多种包含其的组合物。给药的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治疗的具体疾病或病症，要用的特定的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物的功效，具体的给药途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用（例如，通过输注）或者在一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的途径施用的针对相同靶标的相当的常规抗体或抗体片段的通常施用的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物。然而，使用两种或更多种本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物也在本发明范围之内。
本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物还可以与一种或多种其它药物活性化合物或成分（principles）组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以引起或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本文所述的ISV’s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以与其它药物活性化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分用于或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，结果可以获得或可以不获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的给药途径或者通过不同的给药途径在基本上相同的时间或在不同时间（例如，基本上同时地、连续地、或者按照交替方案）施用。当所述物质或成分通过相同的给药途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以引起或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
按照本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或病症的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。
在另一个方面中，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物在制备用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的药物组合物中的应用；和/或在一种或多种本文提及的治疗方法中的应用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物在制备用于预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽而得到预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的应用。
更特别地，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症、特别是用于预防和治疗本文列出的一种或多种所述疾病或病症的药物组合物中的应用。
同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本文所述的ISV’s、氨基酸序列、纳米抗体或多肽还可以适当地与一种或多种其它活性成分如本文提及的那些组合。
定义
除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子克隆：实验室手册）(第2版)Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press（冷泉港实验室出版社），1989)，F.Ausubel等.(Current protocols in molecular biology（现代分子生物学方法），Green Publishing&Wiley Interscience，NewYork，1987)，Lewin(Genes II（基因II），John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1985)，Old等.(Principles of Gene Manipulation:An Introduction toGenetic Engineering（基因操作原理：基因工程导言）(第2版)University ofCalifornia Press，Berkeley，CA，1981)；Roitt等.(Immunology（免疫学）(第6版)Mosby/Elsevier，Edinburgh，2001)，Roitt等.(Roitt’s EssentialImmunology（Roitt基础免疫学）(第10版)Blackwell Publishing，UK，2001)，和Janeway等.(Immunobiology（免疫生物学）(第6版)Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，New York，2005)，以及本发明所引用的一般背景技术。
熟练的技术人员应该清楚，除非另外指明，没有特别详细描述的所有方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经以本身已知的方式进行。例如，同样参考标准手册和本文提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考文献；以及例如下述综述：Presta(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56，2006)，Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57，2006)，Irving等.(J.Immunol.Methods（免疫学方法杂志）248(1-2):31-45，2001)，Schmitz等.(Placenta21Suppl.A:S106-12，2000)，Gonzales等.(TumourBiol.26(1):31-43，2005)，其描述了用于蛋白质工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的技术。
术语“序列”用在本文中（例如，在如“免疫球蛋白序列”，“抗体序列”，“可变结构域序列”，“VHH序列”，“多肽序列”或“蛋白序列”的术语中）通常应该理解为包含相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更局限的解释。
核酸或氨基酸被认为是“（以）基本上分离的（形式存在）”――例如，与其从中获得的反应介质或培养基相比――此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分（诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分）分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸或氨基酸是“基本上分离的”。当使用适当的技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离的形式存在”的核酸或氨基酸优选地基本上是均质的。
当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含核苷酸或氨基酸残基的片段，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管最先提及的序列实际上是怎样产生或获得的(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为多肽包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可以意指所述免疫球蛋白单可变结构域序列已经结合在所述多肽的序列内，但是更通常地，这一般意指所述多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不管所述多肽是怎样产生或获得的。此外，当认为核酸或核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核酸或核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核酸或核苷酸序列相同的阅读框内)。
“基本上由ISV组成的”多肽意指所述免疫球蛋白单可变结构域与所述多肽完全相同，或者与所述多肽相对应，其具有添加到所述免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端的有限数目的核酸或氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基。
出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一个缺失、插入、取代或添加――与第一氨基酸序列相比――都视作在单一氨基酸残基（位置）上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。备选地，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的计算机算法使用标准设置进行计算，所述算法诸如NCBI Blast v2.0。例如，在WO04/037999，EP0967284，EP1085089，WO00/55318，WO00/78972，WO98/49185和GB2357768中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一个氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB335768，WO98/49185，WO00/46383和WO01/09300中可知；并且可以基于WO04/037999以及WO98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择此类取代的（优选）类型和/或组合。
所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其（不带电荷的）酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基:His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基:Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基:Phe，Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本文所述的氨基酸序列和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指，与考虑的CDR序列相比，在具体的CDR序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。
“氨基酸差异”可以是任意一个、两个、三个、四个、五个、六个或最多七个取代、缺失或插入，或其任意组合，其改善多肽的特性或者其至少不使本文所述的多肽的理想的特性或理想的特性的平衡或组合减少太多。在这一方面，与包含所述一个或多个CDR序列而没有所述一个、两个、三个、四个、五个、六个或最多七个取代、缺失或插入的多肽相比，所产生的本发明的多肽应该至少以相同的、大约相同的或更高的亲和力结合IgE，所述亲和力通过表面等离子体共振测量。
在这一方面，所考虑的氨基酸序列可以是通过使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术进行亲和力成熟而来源于具体的氨基酸序列的氨基酸序列。
例如，并且取决于用来表达所述多肽的宿主生物体，可以以这样的方式设计所述缺失和/或取代，即，去除一个或多个翻译后修饰的位点（如一个或多个糖基化位点），这在本领域技术人员的能力范围之内。
认为能够“结合”或“特异性结合”、对特定表位、抗原或蛋白（或者对其至少一部分、片段或表位）“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽（如本发明的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽、或通常是抗原结合分子或其片段）是“针对”（“against”或“directed against”）所述表位、抗原或蛋白的或关于所述表位、抗原或蛋白是“结合”分子，或者认为是“抗”-表位、“抗”-抗原或“抗”-蛋白的（例如，“抗”-IgE-的）。
术语“（交叉）阻断（(cross)-block）”、“被（交叉）阻断（(cross)-blocked）”、“（交叉）阻断（(cross)-blocking）”、“竞争性结合”、“（交叉）竞争（(cross)-compete）”、“（交叉）竞争（(cross)-competing）”和“（交叉）竞争（(cross)-competition）”在本文可以互换使用，用来意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂与给定靶标的结合的能力。免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种对靶标的结合的程度，且因此其能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用BIAcore机器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂之间对于它们与所述靶标的结合的竞争。
以下概括描述用于确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否交叉阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的BIAcore测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂一起使用。按照供应商的建议使用BIAcore机器（例如，BIAcore3000）。因此，在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将靶蛋白（例如IgE）偶联到CM5BIAcore芯片上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上（易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量）。将两种待检测它们彼此交叉阻断的能力的测试结合试剂（称为A*和B*）以结合位点1：1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设结合试剂的分子量是所述结合试剂的总分子量除以所述结合试剂上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每种结合试剂的浓度应该足够高，足以易于饱和所述结合试剂关于捕获在BIAcore芯片上的靶标分子的结合位点。在所述混合物中的结合试剂处于相同的摩尔浓度（基于结合），且所述浓度典型地为1.00–1.5微摩尔（基于结合）。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中和相同的浓度。将测试混合物通过靶标-包被的BIAcore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的结合试剂。典型地，这通过用30mM HCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。再次处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的结合试剂。然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合，并且是每种结合试剂在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则这两种结合试剂是彼此交叉阻断的。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是一种将在上述BIAcore交叉阻断测定法中与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂的最大理论结合（如上文定义）的80%-0.1%(例如，80%-4%)，特别地是最大理论结合的75%-0.1%(例如，75%-4%)，且更特别地是最大理论结合的70%-0.1%(例如，70%-4%)。上述BIAcore测定法是用来确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否是按照本发明彼此交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5BIAcore芯片上的靶标结合（这通常在靶标上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生）。在这样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式确定。以这种特定的形式，抗-His抗体将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表面，并被所述抗-His抗体捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后，新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His抗体包被的表面上。除了使用N端His-标记的靶标给出的实例之外，可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析（例如，HA标记和抗-HA抗体；FLAG标记和抗-FLAG抗体；生物素标记和链霉抗生物素蛋白）。
以下概括描述用于确定针对靶标(例如IgE)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否交叉阻断或如本文所定义那样能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂中的任一种一起使用。本测定法的一般原理是使得针对所述靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂包被到ELISA平板的孔上。将过量的量的第二潜在的交叉阻断的、抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽添加到溶液中（即，不与ELISA平板结合）。然后向孔中加入有限量的靶标。所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽和溶液中的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽竞争与有限量的靶标分子的结合。洗涤平板，以去除未与包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽结合的过量的靶标，且还去除第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽以及在所述第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽和靶标之间形成的任何复合物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的条件下所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽将能够引起所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第一免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽如Ab-X作为固定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的量的第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽即Ab-Y添加到该ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板的过程中，每孔Ab-Y靶标结合位点的摩尔比每孔所用的Ab-X靶标结合位点的摩尔至少10倍高。然后，加入靶标，以致每孔加入的靶标的摩尔比用于包被每孔的Ab-X靶标结合位点的摩尔至少25倍低。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标的试剂，以测量由所述包被的抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽（在该情形中为Ab-X）特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽（在该情形中为Ab-X）、第二溶液相免疫球蛋白或多肽（在该情形中为Ab-Y）、仅有靶标缓冲剂（即，无靶标）和靶标检测试剂的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽（在该情形中为Ab-X）、仅有第二溶液相免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽缓冲剂（即，无第二溶液相免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽）、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽用作包被免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽和哪种用作第二（竞争剂）免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽导致的任何假象（例如，Ab-X与Ab-Y之间对于靶标的显著不同的亲和力），该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽，Ab-Y是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽，Ab-X是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的条件下（即，阳性对照孔）获得的靶标检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够引起靶标检测信号（即，由所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽结合的靶标的量）减少60%-100%,特别地70%-100%,且更特别地80%-100%，则Ab-X和Ab-Y被定义为是交叉阻断的。
用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否如本文定义那样交叉阻断、能够交叉阻断、竞争性结合或是交叉竞争性的其他方法记述在，例如，Xiao-Chi Jia等.(Journalof Immunological Methods（免疫学方法杂志）288:91–98，2004)，Miller等.(Journal of Immunological Methods（免疫学方法杂志）365:118–125，2011)中，和/或是本文中记述的方法(例如，参见实施例6，7，8，9，10)。
本发明的多肽的“半衰期”通常可以如WO08/020079中的57页段o)中所述和如本文提及那样定义，是指所述多肽的血清浓度在体内减少50%所花费的时间，例如，由于所述多肽的降解和/或通过天然机制对所述多肽的清除或螯合（sequestration）导致减少。本发明的多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物代谢动力学分析确定。适当的技术对于本领域技术人员应该是清楚的，并且例如，通常如WO08/020079中第57页段o)中所述。在WO08/020079中第57页段o)中还提到，半衰期可以用参数如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如，参考标准手册，如Kenneth等.(Chemical Stability of Pharmaceuticals:AHandbook for Pharmacists（药物的化学稳定性：药剂师手册），John Wiley&Sons Inc，1986)以及M Gibaldi和D Perron("Pharmacokinetics（药物代谢动力学）"，Marcel Dekker，第2修改版，1982)。术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO08/020079中第57页段o)中定义，并且特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
除非另外指明，术语“免疫球蛋白”－－不管其在本文中用来指重链抗体还是常规的4-链抗体――用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、及其所有部分、结构域或片段（包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域）。
术语(多肽或蛋白的)“结构域”用在本文中是指折叠的蛋白结构，其具有独立于所述蛋白的其余部分保持其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白的独立的功能特性，并且在多种情形中可以添加、去除或转移到其他蛋白上，而不失去所述蛋白的其余部分和/或所述结构域的功能。
术语“免疫球蛋白结构域”用在本文中是指抗体链（诸如例如，常规4-链抗体或重链抗体的链）的球状区域，或是基本上由所述球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于，其保留抗体分子特有的免疫球蛋白折叠，其由以两个β-折叠排列的约7个反向平行的β-链的两层夹心组成，任选地通过保守的二硫键稳定。
术语“免疫球蛋白可变结构域”用在本文中意指基本上由四个“构架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述四个构架区在本领域和本文下文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区通过三个“互补决定区”或“CDRs”中断，所述互补决定区在本领域和本文下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。正是免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原-结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”可与“单可变结构域”和“ISV”互换使用，其定义这样的分子，其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域中并且由单个免疫球蛋白结构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规的”免疫球蛋白或其片段分开，在“常规的”免疫球蛋白或其片段中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点。典型地，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这一情形中，VH与VL二者的互补决定区(CDRs)将促成抗原结合位点，即，总共有6个CDRs将参与抗原结合位点的形成。
考虑到上述定义，常规4-链抗体（如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子；本领域中是已知的）或来源于所述常规4-链抗体的Fab片段，F(ab')2片段，Fv片段，如二硫键连接的Fv或scFv片段，或双抗体(均为本领域已知的)的抗原-结合结构域通常不被认为是免疫球蛋白单可变结构域，原因在于，在这些情形中，与抗原的各个表位结合通常不通过一个（单个）免疫球蛋白结构域发生，而是通过一对（缔合的）免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域发生，即，通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对发生，它们共同结合所述各个抗原的表位。
相反，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的条件下特异性结合抗原的表位。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH、VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDRs形成。
因此，所述单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其适当的片段；只要其能够形成单抗原结合单位(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单位，以使所述单抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单位)。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或是来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适于用作(单)结构域抗体的氨基酸)，"dAb"或dAb(或适于用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文定义，并且包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任意一种的任何适当的片段。
特别地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是(如本文定义)或其适当的片段。[注意： 和为埃博灵克斯股份有限公司的注册商标]关于纳米抗体的一般描述，参考下文的进一步描述，以及本文引用的现有技术，如例如，在WO08/020079(第16页)中所述。
"VHH结构域"，还称为VHHs，VHH结构域，VHH抗体片段，和VHH抗体，最初被描述为"重链抗体"（即，“缺乏轻链的抗体”；Hamers-Casterman等.Nature（自然）363:446-448，1993）的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域。已经选择术语"VHH结构域"来将这些可变结构域与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域（其在下文中叫作“VH结构域”或“VH结构域”）区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域（其在下文中叫作“VL结构域”或“VL结构域”）区分。关于VHH’s和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述论文(Reviews inMolecular Biotechnology（分子生物技术综述）74:277-302，2001)，以及参考下述作为一般背景技术提到的专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO94/04678，WO95/04079和WO96/34103；Unilever的WO94/25591，WO99/37681，WO00/40968，WO00/43507，WO00/65057，WO01/40310，WO01/44301，EP1134231和WO02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO97/49805，WO01/21817，WO03/035694，WO03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司（Ablynx N.V.）的WO03/050531；加拿大国家研究委员会（NationalResearch Council of Canada）的WO01/90190；抗体研究所（Institute ofAntibodies）的WO03/025020(=EP1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO04/041867，WO04/041862，WO04/041865，WO04/041863，WO04/062551，WO05/044858，WO06/40153，WO06/079372，WO06/122786，WO06/122787和WO06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司的其他公布的专利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术，特别是在国际申请WO06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。如在这些参考文献中所述，纳米抗体（特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体）可以特别地特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。关于纳米抗体的进一步的描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合体”，多价构建体（包括接头序列的一些非限制性的实例）和增加纳米抗体的半衰期的不同的修饰以及其制剂，例如，可见于WO08/101985和WO08/142164。关于纳米抗体的进一步的一般描述，参考本文引用的现有技术，如例如，记述在WO08/020079（第16页）中。
"结构域抗体（Domain antibodies）"，还称为"Dab"s，"结构域抗体（Domain Antibodies）"，和"dAbs"(术语"结构域抗体"和"dAbs"被GlaxoSmithKline集团公司（GlaxoSmithKline group of companies）用作商标)已经记述在，例如，EP0368684，Ward等.(Nature（自然）341:544-546，1989)，Holt等.(Tends in Biotechnology（生物技术趋势）21:484-490，2003)和WO03/002609中，以及在，例如WO04/068820，WO06/030220，WO06/003388中，和在Domantis Ltd.的其他公布的专利申请中。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物、特别是人4-链抗体的VH或VL结构域。为了结合作为单抗原结合结构域的表位，即，不分别与VL或VH结构域配对，需要对所述抗原结合特性的特异性选择，例如，通过使用人单VH或VL结构域序列的文库进行。如同VHHs，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且，如果来源于完整的人序列，对于例如在人中的治疗应用，不需要人源化。
还应该注意到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的而在本发明的情形中较不优选，但是单可变结构域可以来源于某些鲨鱼（shark）物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”,参见例如WO05/18629)。
因此，在本发明的意思内，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源的多肽，优选来源于骆驼科动物的多肽，优选骆驼重链抗体。其可以被人源化，如之前所述。并且，该术语包括来源于非骆驼科动物来源的多肽，例如来源于小鼠或人的多肽，其已被“骆驼源化”，如例如，记述在Davies和Riechmann(FEBS339:285-290，1994；Biotechnol.13:475-479，1995；Prot.Eng.9:531-537，1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods（免疫学方法杂志）231:25-38，1999)中。
VHH结构域的氨基酸残基按照Kabat等(“Sequence of proteins ofimmunological interest（免疫学感兴趣的蛋白的序列）”,美国公众健康服务中心（US Public Health Services）,NIH Bethesda,MD,出版No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，如例如在Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)231:25-38，1999)的图2所示，这种编号方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域。本领域中已知用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法，所述方法也可以以类似的方式用于VHH结构域。然而，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另外指明，遵循用于上述VHH结构域的Kabat所述的编号方式。
应该注意----关于VH结构域和VHH结构域在本领域是公知的----每个CDRs中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与Kabat编号方式所示的氨基酸残基的总数相对应（即，在实际序列中，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不被占据，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基）。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。VH结构域和VHH结构域中氨基酸残基的总数通常在110-120的范围内，通常在112-115的范围内。然而，应该注意，更短或更长的序列也可以适用于本文所述的目的。
CDR区的确定也可以按照不同的方法进行。在Kabat所述的CDR确定中，VHH的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49的氨基酸，VHH的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域)可以进行人源化。特别地，人源化的免疫球蛋白单可变结构域，如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是通常如前述段落中定义的免疫球蛋白单可变结构域，但是其中存在至少一个是人源化取代和/或对应于人源化取代的氨基酸残基(特别地，在至少一个构架残基中)。可以这样确定潜在有用的人源化取代：通过比较天然存在的VHH序列的构架区的序列与一种或多种密切相关的人VH序列的相对应的构架序列，之后可以向所述VHH序列中引入这样确定的一个或多个潜在有用的人源化取代（或其组合）（以本身已知的任何方式，如本文进一步所述），并且可以检测所得到的人源化的VHH序列针对靶标的亲和力，稳定性，表达的容易性和水平，和/或其它需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试验和误差程度，熟练的技术人员可以确定其它适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，免疫球蛋白单可变结构域，诸如纳米抗体（包括VHH结构域）(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。
免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化的VHH结构域)，还可以通过在一个或多个CDRs的氨基酸序列中引入一个或多个改变而进行亲和力成熟，与各自的母体分子相比，所述改变使得所产生的免疫球蛋白单可变结构域针对其各自的抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单可变结构域分子可以通过本领域已知的方法制备，例如，如Marks等.(Biotechnology（生物技术）10:779-783，1992)，Barbas等.(Proc.Nat.Acad.Sci，USA（美国国家科学院学报）91:3809-3813，1994)，Shier等.(Gene（基因）169:147-155，1995)，Yelton等.(Immunol.（免疫学）155:1994-2004，1995)，Jackson等.(J.Immunol.（免疫学杂志）154:3310-9，1995)，Hawkins等.(J.MoI.Biol.（分子生物学杂志）226:889896，1992)，Johnson与Hawkins(Affinitymaturation of antibodies using phage display（使用噬菌体展示的抗体亲和力成熟），Oxford University Press（牛津大学出版社），1996)所述。
由免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体或纳米抗体起始设计/选择和/或制备多肽的方法在本文中还称为“格式化(formatting)”所述免疫球蛋白单可变结构域；并且组成多肽的一部分的免疫球蛋白单可变结构域被认为是“格式化的”或采用所述多肽的“格式”。基于本发明的公开内容，熟练的技术人员将清楚免疫球蛋白单可变结构域可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的另一个方面。
例如，并不限于，一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以用作“结合单位”、“结合结构域”或“结构单元”（这些术语可互换使用）来制备多肽，所述多肽任选地可以包含一个或多个可以作为结合单位的免疫球蛋白单可变结构域或肽（即，针对IgE上相同的或另一个表位和/或针对一个或多个不同于IgE的其他抗原、蛋白或靶标）。
单价多肽仅包含一个结合单位(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)或基本上仅由一个结合单位(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)组成。包含两个以上结合单位(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)的多肽在本文中还称为“多价”多肽，并且存在于所述多肽中的结合单位/免疫球蛋白单可变结构域在本文中还称为是“单价形式”的。例如，“二价”多肽可以包含两个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过一个接头序列连接，而“三价”多肽可以包含三个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过两个接头序列连接；等等。
在多价肽中，所述两个以上的免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的，并且可以是针对相同的抗原或抗原决定簇(例如，针对相同的部分或表位或针对不同的部分或表位)，或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任意适当的组合。包含至少两个结合单位的多肽(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)，其中至少一个结合单位是针对第一抗原(即，IgE)并且至少结合单位是针对第二抗原(即，不同于IgE)，也称为“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的所述结合单位(如例如，免疫球蛋白单可变结构域)在本文中也称为是“多特异性形式”的。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，IgE)的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第二抗原(即，不同于IgE)的其他免疫球蛋白单可变结构域，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，IgE)的免疫球蛋白单可变结构域，至少一个针对第二抗原(即，不同于IgE)的其他免疫球蛋白单可变结构域，和至少一个针对第三抗原(即，不同于IgE和第二抗原)的其他免疫球蛋白单可变结构域；等等。
通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。现在将通过非限制性实验部分和附图来进一步举例说明本发明，其中：
附图图例
图1:39D11的多种人源化的和序列优化的变体与39D11比较的序列比对。
图2:39D11的多种人源化的和序列优化的变体与人源化变体IgE009比较的序列比对。
图3:PK/PD研究的研究设计。
图4:游离IgE的血浆水平。在单次注射赋形剂、IgE109或Xolair后随时间的游离IgE的水平。图上的数据表示每组动物的中值。
实验部分
实施例1:免疫
四头美洲驼(No.002，No.004，No.193，No.197)用50-100微克剂量的人IgE(Scripps Laboratories，San Diego，CA，Cat#I0224)(美洲驼002和004)或50-100微克的人IgEκ链(Diatec，Oslo，挪威)免疫4-6次。各次免疫之间的时间间隔在1-5周之间变化。对于动物002和004，蛋白配制在Stimmune佐剂(Cedi Diagnostics，Lelystad，荷兰)中，或对于动物193和197，配制在完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)(Difco，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)中。
在免疫之前、在免疫方案过程中和在免疫结束后，获得来自美洲驼002，004，193和197的血样的血清。将人IgE以2微克/ml包被在NuncMaxisorb平板上，用在PBS中的1%的酪蛋白封闭，并且用免疫之前和免疫之后的美洲驼血清的连续稀释液温育。使用HRP缀合的山羊-抗-美洲驼IgG(Bethyl Labs，Montgomery，TX)和TMB发色原按照标准方法检测平板固定的美洲驼IgG。光学密度值的比较清楚地显示免疫在所有四头动物中都诱导了针对IgE的体液免疫应答。
使用Ficoll-Hypaque按照供应商的使用说明由血样制备外周血单核细胞。从这些细胞和从淋巴结提取的总RNA用作RT-PCR的起始材料来扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆到来源于pUC119的噬菌粒载体中，所述载体包含LacZ启动子，大肠杆菌噬菌体pIII蛋白编码序列，针对氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因，和携带数个限制性位点的多克隆位点。与编码序列在一个阅读框内，所述载体编码C端c-myc标记和(His)6标记。信号肽是gen3前导序列，其将表达的 转移到周质中。噬菌体按照标准方案制备(Phage Display of Peptides andProteins:A Laboratory Manual（肽和蛋白的噬菌体展示：实验室手册），Academic Press；第1版(1996年10月28日))，并且在过滤除菌后在后续使用之前保存在4℃。总之，构建了4个噬菌体文库(002，004，193和197)，所述文库大小为3.5x106-28x106，并且插入的百分数为96-100%。
实施例2：选择结合IgE的纳米抗体
制备食蟹猴IgE-Fc片段，并且用作鉴定具有人和食蟹猴IgE交叉反应性的IgE-特异性的纳米抗体的工具。从来自2只雄性和2只雌性食蟹猴的外周血单形单核细胞（monomorphonuclear cells）提取RNA。食蟹猴IgE序列(SEQ ID NO:173)使用不同的引物(SEQ ID NO’s:189-192)通过RT-PCR扩增。将得到的片段克隆到克隆载体中并且测序。将食蟹猴IgEc(ε)2-c(ε)3-c(ε)4片段克隆在来源于pCIneo的表达载体中，所述载体包含人巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子/启动子区，SV40晚期聚腺苷酸化信号，针对氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因，多克隆位点和鼠Igκ轻链前导序列。与食蟹猴IgE-Fc编码序列在同一阅读框中，所述载体编码C端(His)10标记。顺式作用的病毒DNA元件，即，oriP基因座允许在表达埃巴病毒核抗原-1的HEK-EBNA细胞中的附加型复制。收集培养物上清，并且使用阳离子交换(Source30S)，然后通过亲和纯化(His TrapTMFF)和脱盐(Desalting26/10Hiprep，所有柱来自GE Healthcare)纯化食蟹猴IgE Fc。
制备人高亲和力IgE受体Fc(ε)RIα(gene bank P12319)的Fc融合体作为工具。合成人FcεRIα，并作为与人IgG Fc片段的融合体克隆到表达载体中。生成稳定转染的CHO细胞(ATCC)，并且收集培养物上清。然后使用蛋白质A(Mabselect sure；GE Healthcare)纯化人Fc(ε)RI(α)Fc片段。
利用噬菌体展示富集IgE-特异性的纳米抗体。按照标准方法由从美洲驼No.002，004，193和197获得的文库制备噬菌体。噬菌体文库用于对平板固定的食蟹猴IgE Fc的两轮(R1/R2)选择。食蟹猴IgEc(ε)2-c(ε)3-c(ε)4-Fc以0.2-2微克/ml的浓度固定在Nunc Maxisorp ELISA平板上。使用胰蛋白酶洗脱或Fc(ε)RIα洗脱回收平板固定的噬菌体。分析R1/R2选择的输出物(output)的富集系数（相对于对照，在洗脱物中存在的噬菌体数量（#））。基于这些参数，选择最好的选择用于进一步的分析。挑取单个菌落并且培养在96深孔平板（1ml体积）中，并且通过加入IPTG诱导纳米抗体表达。按照标准方法制备周质提取物。纳米抗体表达为含有C端c-myc以及6His标记的融合蛋白。
实施例3：在α筛选测定中筛选阻断IgE的纳米抗体
为了筛选具有人/食蟹猴交叉反应性的阻断IgE的纳米抗体，分析周质提取物阻断人IgE(Diatec，Oslo，挪威)或食蟹猴IgE c(ε)2-c(ε)3-c(ε)4与人Fc(ε)RI(α)-Fc的相互作用的能力。为了这一目的，设置两个α筛选测定（放大的发光邻近效应均相测定(Amplified Luminiscent ProximityHomogeneous Assay)；Perkin Elmer，Waltman，MA）。简言之，通过链霉抗生物素蛋白供体珠子捕获0.05nM生物素酰化的hIgE或0.1nM生物素酰化的食蟹猴IgE c(ε)2-c(ε)3-c(ε)4，并且通过抗-hFc-接受体珠子捕获0.05nM Fc(ε)RI。
分析单独纳米抗体克隆的稀释的周质提取物。使用已知抑制人IgE/Fc(ε)RI(α)Fc相互作用的奥马珠单抗Fab片段作为阳性对照。测定在Envisionα筛选选项适配的多模式读取仪（Envision alphascreen optionfitted multimode reader）(Perkin Elmer，Waltman，MA)中读取。如果周质提取物的存在使得接受体珠子的荧光信号减少，则单独克隆被评分为推定的HuIgE/HuFc(ε)RI(α)Fc相互作用或食蟹猴IgEc(ε)2-c(ε)3-c(ε)4/HuFc(ε)RI(α)Fc相互作用抑制性的。当针对人IgE检测时，所有四种文库包含非阻断和阻断的克隆，但是只有文库197回收食蟹猴交叉反应性的中和纳米抗体。选择食蟹猴交叉反应性的抑制性纳米抗体并且测序。序列分析揭示出1个家族（命名为家族12），其细分为两个亚家族12.1（包括克隆39D11，39D8，42D7和42G5；分别为SEQ ID NO’s:119，115，116和117）和12.2(克隆36G5；SEQ ID NO:118)和一种独特的克隆(39B02；SEQ ID NO:114)。相应的DNA序列在SEQ ID NO’s:183-188中给出。这种低的多样性表明产生并且鉴定阻断IgE与Fc(ε)RI(α)的相互作用的食蟹猴-交叉反应性的纳米抗体是非常困难的。
实施例4：结合IgE的纳米抗体的解离速率确定
通过表面等离子体共振在Biacore T100仪器上确定单独的抑制性纳米抗体克隆周质提取物的解离速率常数(koff)。将人IgE(Diatec，Oslo，挪威)以3100RU的密度，胺-偶联到CM5传感器芯片上。剩余的反应性基团使用乙醇胺灭活。在周质提取物的单一稀释液中评估纳米抗体结合和解离速率。奥马珠单抗Fab片段以100nM的单一浓度进行检测。每种样品以45μl/min的流速注入2分钟，以允许与芯片-结合的抗原结合。接着，在芯片上以相同的流速传送不含周质提取物的结合缓冲液，以允许结合的纳米抗体的自发解离。通过注入再生溶液(4.5M MgCl2)而去除在监测的解离阶段后保持结合的分析物。每个亚家族和所述独特的克隆39B2（全部选择用于纯化和更详细的分析）的最佳代表的数据显示在表1中。
表1：纳米抗体(周质提取物)的解离速率值。
克隆 解离速率人IgE(s-1) 解离速率食蟹猴IgE(s-1)
39D8 2.24E-03 1.22E-03
42D7 2.25E-03 1.09E-03
39D11 2.39E-03 1.32E-03
36G5 1.11E-02 3.28E-03
42G5 2.83E-02 5.76E-03
39B2 7.96E-02 5.69E-04
实施例5：结合IgE的纳米抗体的表达和纯化
所选的纳米抗体在大肠杆菌（E.coli）的周质空间中表达为c-myc、His6-标记的蛋白，培养体积为250mL。通过加入1mM IPTG在高密度培养物中诱导表达，并且允许在37oC继续培养4小时。在离心细胞培养物后，通过冷冻-解冻沉淀物而制备周质提取物，并且重悬在dPBS中。这些提取物用作起始材料来使用HisTrap粗制柱(GE Healthcare)进行亲和层析。用250mM咪唑将纳米抗体从所述柱上洗脱下来，然后针对dPBS脱盐。
实施例6：在α筛选中的HuIgE或食蟹猴IgE Fc(ce2-ce3-ce4) /HuFc(ε)RI(α)Fc的相互作用的抑制
然后使用上文所述的相同的α筛选测定来分析纯化的纳米抗体的连续稀释液它们阻断HuIgE或食蟹猴IgE Fc(ce2-ce3-ce4)与HuFc(ε)RI(α)Fc的相互作用的能力。数据显示在表2和3中，并且表明，与阳性对照Fab（通过用木瓜蛋白酶消化商业获得的奥马珠单抗而获得）相比，除39B2外的所有纳米抗体都具有相似的或更好的功效。
表2:通过α筛选确定的人IgE受体Fc(ε)RI(α)与抗-IgE纳米抗体竞争结合人IgE的IC50值，其95%的置信区间(CI95)和250nM纳米抗体的抑制百分数。NA:不适用的。
表3:通过α筛选确定的人IgE受体Fc(ε)RI(α)与抗-IgE纳米抗体竞争结合食蟹猴IgE Fc(Ce2-ce3-ce4)的IC50值，其95%的置信区间(CI95)和250nM纳米抗体的抑制百分数。NA:不适用的。
实施例7：在ELISA中的HuIgE或食蟹猴IgE/HuFc(ε)RI相互作用的抑 制
分析纳米抗体阻断HuIgE(Diatec，Oslo，挪威)或食蟹猴IgE(血浆)与Fc(ε)RI的相互作用的能力。为了这一目的，ELISA平板用Fc(ε)RI(0.1微克/ml)包被，然后封闭。连续的纳米抗体稀释液用50pM HuIgE或1/50食蟹猴血浆稀释液预先温育，然后将所述预先温育的混合物加入到Fc(ε)RI包被的ELISA平板中。通过使用山羊抗-人IgE-HRP(KPL，Gaithersburg，MD)来检测HuIgE或食蟹猴IgE与固定的Fc(ε)RI的结合。推定的IgE/Fc(ε)RI相互作用抑制剂的存在将导致减少的OD信号。结果显示在表4和5中。
表4:通过ELISA确定的Fc(ε)RI(α)与抗-IgE纳米抗体竞争结合人IgE Fc(Ce2-ce3-ce4)的IC50值，其95%的置信区间和500nM纳米抗体的抑制百分数。
表5:通过ELISA确定的人IgE受体Fc(ε)RI(α)与抗-IgE纳米抗体竞争结合食蟹猴IgE Fc(Ce2-ce3-ce4)的IC50值，其95%的置信区间和500nM纳米抗体的抑制百分数。NA:不适用的。
实施例8：在ELISA中抑制HuIgE/HuFc(ε)RII的相互作用
分析纳米抗体它们阻断HuIgE(Diatec，Oslo，挪威)与重组的Fc(ε)RII(R&D Systems，Minneapolis，MN)的相互作用的能力。为了这一目的，ELISA平板用Fc(ε)RII包被，然后封闭。纳米抗体的连续稀释液用20nMHuIgE预先温育，然后将所述预先温育的混合物加入到Fc(ε)RII包被的ELISA平板中。通过使用山羊抗-人IgE-HRP(KPL，Gaithersburg，MD)来检测HuIgE与固定的Fc(ε)RII的结合。推定的HuIgE/Fc(ε)RII相互作用抑制剂的存在将导致减少的OD信号。数据显示在表6中，并且表明所有三种检测的纳米抗体阻断IgE与Fc(ε)RII的结合。与参比Fab相比，纳米抗体39D11和36G5具有相似的效能和功效（100%阻断），而纳米抗体39B2在500nM的纳米抗体浓度的效能低10倍，并且仅达到约80%的阻断。
表6:通过ELISA确定的人IgE受体Fc(ε)RII与抗-IgE纳米抗体竞争结合人IgE的IC50值，其95%的置信区间。
克隆 IC50(M) CI95
39D11 1.291e-008 6.846e-009至2.436e-008
36G5 1.996e-008 1.115e-008至3.571e-008
39B2 1.527e-007 6.977e-008至3.344e-007
参比Fab 1.547e-008 9.281e-009至2.580e-008
实施例9:在α筛选中的HuIgE/奥马珠单抗的相互作用的抑制
分析纳米抗体它们阻断HuIgE(Diatec，Oslo，挪威)与奥马珠单抗相互作用的能力。为了这一目的，设置α筛选测定(Perkin Elmer，Waltham，MA)。简言之，将单独纳米抗体的连续稀释液系列与0.1nM生物素酰化的huIgE，0.1nM奥马珠单抗，链霉抗生物蛋白包被的供体珠和抗-人Fc纳米抗体偶联的接受体珠一起温育。使用已知为抑制HuIgE/奥马珠单抗相互作用的参比Fab片段作为阳性对照。测定在Envisionα筛选选项适配的多模式读取仪(Perkin Elmer，Waltman，MA)中读取。如果其存在使得接受体珠子的荧光信号减少，则单独克隆被评分为推定的HuIgE/奥马珠单抗相互作用抑制剂。结果显示在表7中，并且表明除39B2之外所有检测的纳米抗体都与奥马珠单抗竞争与IgE的结合。纳米抗体抑制曲线的底部平台水平（最大抑制%为79.9%）显著高于参比Fab或IgE（最大抑制%分别为96.9和99.6），这表明奥马珠单抗和纳米抗体表位只是部分重叠的。
表7:通过α筛选确定的奥马珠单抗与抗-IgE纳米抗体竞争结合人IgE的IC50值，其95%的置信区间和250nM纳米抗体的抑制百分数。NA:不适用的。
实施例10：在FACS中的HuIgE/HuFc(ε)RI和HuFc(ε)RII的相互作用的 抑制
在FACS竞争测定中检测纳米抗体39D11和36G5抑制IgE与RBLFc(ε)RI(α)稳定转染物上的Fc(ε)RI和Raji细胞上的Fc(ε)RII的结合的能力。为了这一目的，向细胞中加入纳米抗体的连续稀释液，然后加入人IgE(对于RBL Fc(ε)RI测定是7.5nM；对于Raji细胞测定是10nM)。推定的相互作用抑制剂的存在将导致减少的MCF信号。表8中的数据表明，两种纳米抗体都阻断IgE与Fc(ε)RI和Fc(ε)RII的结合，与阳性参比Fab相当。所有三种检测的分子在1μM的浓度达到大于90%的抑制。
表8:通过FACS确定的抗-IgE纳米抗体与Fc(ε)RI或Fc(ε)RII(分别表达在转染的RBL上和内源性表达在Raji细胞上)竞争结合人IgE的IC50值及其95%的置信区间。
实施例11：在脱颗粒测定中的抑制
测定设置是基于xCELLigence RTCA仪器(Roche)提供的方案。该系统测量在整合在组织培养E平板底部的交叉指型微电极之间的电阻抗。实时阻抗测量提供关于细胞形态状态的定量信息，包括脱颗粒，无需结合标记。转染了Fc(ε)RIα的RBL细胞在E平板中培养过夜，并且用抗-DNP嵌合的IgE(50ng/ml；Serotec)敏化1小时。然后，通过加入NIP-BSA(50ng/ml；Biosearch Technologies)引发脱颗粒。可以在测量阻抗的xCELLigence系统上实时检测嗜碱性粒细胞的激活/脱颗粒（在8小时的过程中每分钟测量）。每孔的最大细胞指数信号用来计算EC50和IC50值。显示与上清中的组胺释放的相关性（LDN组胺研究ELISA）。
在脱颗粒测定中检测纳米抗体39D08，39D11，36G5和39B2它们抑制IgE-介导的脱颗粒的能力。为了这一目的，将纳米抗体或对照抗体的连续稀释液与人IgE预先温育，然后加入到细胞中。结果显示在表9中。纳米抗体39B2在500nM的纳米抗体浓度只达到25%的脱颗粒阻断，而另外3种纳米抗体和参比Fab在这一浓度阻断大于95%。与参比Fab对照相比，纳米抗体的效能弱3-至40-倍。
表9:通过阻抗检测确定的抗-IgE纳米抗体或对照Fab阻断RBL-Fc(ε)RI(α)转染的细胞的IgE-介导的脱颗粒的IC50值，及其95%的置信区间。
克隆 IC50(nM) CI95(nM)
奥马珠单抗 2.858 1.662至4.917
39D08 18.52 14.00至24.50
39D11 18.72 12.38至28.32
36G5 112.2 43.61至288.4
参比Fab 5.768 3.900至8.530
实施例12：亲和力确定
通过表面等离子体共振(SPR)在Biacore3000仪器上确定各个纳米抗体的亲和力常数。简言之，将人IgE(Diatec，Oslo，挪威)或食蟹猴IgE Fc(Ce2-ce3-ce4)胺偶联在CM5传感器芯片上。剩余的反应性基团用乙醇胺灭活。以不同的浓度注入纳米抗体。每种样品以45μl/min的流速注入以允许与芯片-结合的抗原结合，然后以相同的流速注入不含纳米抗体的结合缓冲液，以允许自发解离。通过注入再生溶液(4.5M MgCl2)而去除在监测的解离阶段后保持结合的分析物。在不同浓度下的结合曲线用来计算动力学参数kon-值(ka)，koff-值(kd)和KD。由于观察到两相相互作用，因此使用异源配体拟合来确定动力学参数。得到的结果显示在表10中。
表10:抗-IgE纳米抗体与人IgE和食蟹猴IgE Fc结合的动力学参数。
实施例13：39D11的序列优化和亲和力成熟
A.序列优化：序列分析
IgE-特异性的纳米抗体39D11是在筛选过程中鉴定的最有效的食蟹猴交叉反应性纳米抗体。选择其并且进一步进行序列优化和亲和力成熟。
基于39D11序列与VH3-23/JH5人种系的比对，决定产生4种变体：IGE009，IGE010，IGE011和IGE012(分别为SEQ ID NO’s:120-123)。所有变体都包含三个突变：V5L，K83R和Q108L。在变体IGE011和IGE012中，包含独特突变W91Y。在所有四种变体中，位置77的甲硫氨酸被苏氨酸(IGE009和IGE011)或亮氨酸(IGE010和IGE012)取代。序列优化的变体与39D11的序列比对显示在图1中。
B.在效能测定中表征四种39D11人源化变体
所述四种变体先在脱颗粒测定中检测，以评估引入的突变对抑制IgE-介导的脱颗粒的能力的影响。表11显示获得的计算IC50值。这些结果表明引入突变W91Y是对效能有害的，并且导致较高的解离速率，排除了变体IGE011和IGE012。因为其具有最高的与人种系序列的构架同一性百分数，所以选择变体IGE009进行亲和力成熟。
表11:在竞争α筛选、解离速率确定和脱颗粒测定中测量的39D11人源化变体的效能分析。
C.通过易错PCR方法进行IGE009的亲和力成熟
通过在易错条件下扩增IGE009并且将片段克隆到噬菌体展示载体中而产生易错文库。获得的文库使用浓度逐渐减少(10-0.001nM)的生物素酰化的人IgE进行多轮溶液中的淘选（panning）。在ProteOn上分析来自噬菌体选择的输出的解离速率。相对于39D11，对于最好的克隆，检测到提高多至6倍的解离速率。序列分析鉴定对解离速率有积极作用的突变（在构架和CDR’s中）。这些突变为：E6Q；F29Y；G30D；S31N或S31P；S35G或S35A；G44R；N75K；D97E和Y100eF。
将这些突变包括在组合文库中。将获得的文库再使用1nM生物素酰化的人IgE进行溶液中的淘选。在ProteOn上分析来自噬菌体选择的输出的解离速率并且分析序列。组合序列分析和解离速率分析，结果，设计7种包含不同的有益突变组合的变体(IGE025-IGE030，SEQ ID NO’s:127-133)，并且在毕赤酵母中表达为与HSA-特异性纳米抗体ALB8的融合体(SEQ ID NO’s:177-182)，以提高构建体的体内半衰期。制备包含母体IgE-特异性纳米抗体39D11或其人源化变体IGE009的相似的Nb-9GS-ALB8形式(分别为构建体IGE020和IGE019，SEQ ID NO’s:175和176)作为对照。亲和力成熟的变体与39D11和IGE009的比对分别显示在图1和2中。
D.在BIAcore上确定10种亲和力成熟的双特异性变体的解离速率
在BIAcore上分析解离速率。结合曲线和解离速率显示在表12中。在BIAcore上的解离速率分析显示，与IGE009相比，亲和力成熟的变体的解离速率减少（针对人IgE多至25倍，并且针对食蟹猴IgE-Fc多至15倍）。结合模式仍然是双相的，但是在亲和力成熟后，快速解离速率的百分数显著减少（针对人IgE必然地）。
表12:亲和力成熟格式化的抗-IgE纳米抗体对人IgE和食蟹猴IgE-Fc的结合的动力学参数
E.在亲和力成熟的双特异性变体的脱颗粒测定中的体外效能分析
在存在或不存在纯化的人血清白蛋白(Sigma，A8763)的条件下，在脱颗粒测定中检测亲和力成熟的变体。计算的IC50s和CI95显示在表13中。得到的结果清楚地表明在脱颗粒测定中多种变体优于奥马珠单抗。HSA的结合不影响所述纳米抗体构建体的效能。
表13:通过阻抗检测确定的抗-IgE纳米抗体或对照Mab/Fab阻断RBL-Fc(ε)RI(α)转染的细胞的IgE-介导的脱颗粒的IC50值，及其95%的置信区间。
F.使用KinExA方法的IGE026和IGE027的亲和力确定
使用KinExA技术在溶液中确定纳米抗体IGE026，IGE027和39D11对人IgE的亲和力。与39D11的亲和力相比，所获得的纳米抗体IGE026和IGE027的亲和力提高30-50倍（表14）。
表14:关于IgE结合的KD值。
构建体 KD(pM) CI95(pM)
39D11 624 350-788
IGE026 19 13-25
IGE027 12 5-6
G.针对血清白蛋白的结合亲和力
在使用低密度白蛋白固定(500RU)的条件下通过SPR(Biacore3000)分析格式化的纳米抗体与血清白蛋白的结合。以45μl/min的流速注入滴定系列的纳米抗体(2.5-200nM)。确定亲和力常数并且列在表15中。包含HSA-特异性的纳米抗体ALB8用于比较。通常，观察到较低的亲和力。
表15:格式化的纳米抗体针对血清白蛋白的KD值
实施例14：以NExpedite肽融合体表达和纯化IGE纳米抗体
上述实施例1-13举例说明了抗-IgE纳米抗体(包括39D11，39D11-型序列和39D11-样序列)本身或在用作结构单元以提供多价、多特异性的和/或二互补位的构建体时的有利特性。
在实施例14-17中，本发明的抗-IgE纳米抗体与按照本发明是优选的半衰期延长肽组合。
按照本发明的这一优选方面，不是使用ALB8来提高IgE纳米抗体的体内半衰期，IGE026/ALB8的结合IgE的纳米抗体结构单元，即，IgE66G02(SEQ ID NO’s:128或129)，在其N-或C-端通过短的或长的GlySer-接头遗传融合一个或多个结合HSA的NExpedite肽，产生15种变体(IGE100-105，IGE107-113，EXP476，EXP483，SEQ ID NO’s:147-161)。将构建体克隆到来源于pPICZa(Invitrogen)的内部巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达载体中，所述载体包含：AOX1启动子，用于在巴斯德毕赤酵母中的密切调节的、甲醇诱导的表达；针对ZeocinTM的抗性基因；多克隆位点和α因子分泌信号。所述构建体的表达和纯化基本上如US2011/0243954的实施例20所述那样进行。
实施例15：IGE-NExpedite纳米抗体的表征
研究N-或C-端NExpedite肽对纳米抗体IgE66G02的IgE-阻断特征的影响以及所述纳米抗体对NExpedite肽的HSA结合特征的影响。
A.在α筛选中抑制HuIgE/HuFc(ε)RI(α)Fc的相互作用
在存在或不能存在HSA的条件下，使用与上述（实施例6）相同的α筛选测定，分析纯化的纳米抗体与NExpedite肽融合体的连续稀释液它们阻断HuIgE与HuFc(ε)RI(α)Fc的相互作用的能力。数据显示在表16中。与相对应的单价抗-IgE纳米抗体结构单元，即IgE66G02(在表16中称为IgE045)相比，所有的纳米抗体-NExpedite构建体都具有相似的效能。然而，存在HSA时，所有在纳米抗体的N端包含NExpedite结构部分的构建体的IC50增加4-12倍。HSA对效能的负面作用取决于下述而不同：(i)NExpedite肽与纳米抗体之间的接头长度，和(ii)NExpedite肽的数目。相反，对于NExpedite结构部分位于纳米抗体的C端的纳米抗体-NExpedite融合体没有观察到对HSA结合的影响。尽管如此，与阳性对照Fab相比，所有构建体都具有更好的效能。
表16:在α筛选中确定的人IgE受体Fc(ε)RI(α)与IGE-NExpedite纳米抗体之间对结合人IgE的竞争的IC50值。95%CI:95%的置信区间。
B.在脱颗粒测定中的抑制
在存在或不存在HSA的条件下，在上述脱颗粒测定中检测所有IGE-NExpedite纳米抗体（见实施例11）。数据显示在表17中。所得到的结果与在HuIgE/HuFc(ε)RI(α)Fcα筛选中得到的数据一致。除了IGE103之外，所有化合物具有与IgE045相比相似的效能。当NExpedite肽位于其C端时，HSA的结合不影响所述纳米抗体的效能。在该脱颗粒测定中也观察到HSA复合对IGE102-103-104和105的效能的负面影响，但是所述影响较不明显。
表17:通过阻抗检测确定的IGE-NExpedite纳米抗体或对照Mab阻断IgE-介导的RBL-Fc(ε)RI(α)转染细胞的脱颗粒的IC50值及其95%的置信区间。
C.在α筛选中抑制HSA/NExpedite的相互作用
对于所有IGE-NExpedite纳米抗体，在α筛选中研究所述纳米抗体对NExpedite肽的HSA结合特征的影响。简言之，将接受体珠子(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)按照供应商的使用说明用9GS接头与EXP413（即，包含WO09/068625的SEQ ID NO:2112的构建体）缀合（以下称为与EXP89D3连接的“Nb2112”）（即Nb2112-9GS-EXP89D3）。在存在或不存在hIgE的条件下，将纯化的IGE-NExpedite纳米抗体用3.4pMbio-HSA温育，然后加入EXP413缀合的接受体珠子和链霉抗生物素供体珠子(Perkin Elmer)。通过使用680nm的激发波长和520nm的发射波长在EnVision多标记平板读取仪(Perkin Elmer)上读取平板而测量荧光。荧光信号的减少表示IGE-NExpedite纳米抗体阻断bio-HSA与Nb2112-9GS-EXP89D03的结合。在该测定中包括EXP413，EXP486(Nb2112-9GS-EXP89D3-9GS-EXP89D3)和EXP553(Nb2112-20GS-NEXP001-9GS-NEXP002)作为阳性对照。数据显示在表18中。如果单个NExpedite肽位于IGE纳米抗体(IGE102，IGE103)的N端，则IC50显著增加，这表明所述纳米抗体妨碍NExpedite肽与HSA的结合。注意到针对IGE104和IGE105（其具有融合在IGE纳米抗体的N端的两个NExpedite肽）的IC50’s，与EXP486的IC50相似，然而，由于在该α筛选测定中在EXP413与EXP486之间没有观察到清楚的效能差异，因此不包括这些数据。相反，当NExpedite结构部分位于IGE纳米抗体的C端时，IC50’s与其各自的Nb2112-NExpedite对照的IC50’s相当：将EXP476和IGE100与EXP413比较，将EXP483，IGE101和IGE107与EXP486比较，将IGE109与EXP553比较。此外，hIgE与所述纳米抗体的结合不影响NExpedite肽的HSA结合。
表18:在α筛选中确定的Nb2112-9GS-EXP89D3与IGE-NExpedite纳米抗体之间对HSA结合的竞争的IC50值及其95%的置信区间。
实施例16：保存稳定性：比较IgE-NExpedite构建体和包含结合白蛋白的 纳米抗体的构建体
比较代表性的IgE-NExpedite构建体与相对应的构建体的保存稳定性，在相对应的构建体中，结合白蛋白的NExpedite肽替换为结合白蛋白的纳米抗体(Alb-8)。所用的构建体为IGE026/ALB-8(SEQ ID NO:178)和IGE109(SEQ ID NO:155)。
所述构建体以50mg/ml配制在D-PBS缓冲液中，并且在塑料PCR管中在指定温度在暗处保存1月。
然后，使用SE-HPLC确定前峰的百分数（对应形成的二聚体的量）。对于IgE026/ALB-8，使用aBioSep SEC-2000柱(Phenomenex)，D-PBS作为运行缓冲液以0.2ml/min的流速进行SE-HPLC。注入10μg物质，使用Chromeleon软件分析数据。对于IGE109，使用SEC-5柱(Agilent)，10mM磷酸钠(pH7.5)，125mM精氨酸.HCl，10%乙醇作为运行缓冲液，以0.5ml/min的流速进行SE-HPLC。注入10μg物质，并且用Chromeleon软件分析数据。结果显示在表19中。
表19:在指定温度保存1月后在SE-HPLC上的前峰的百分数。
还确定其余三种IgE-NExpedite构建体，即EXP483(SEQ ID NO:161)，IGE100(SEQ ID NO:147)和IGE101(SEQ ID NO:148)的保存稳定性。使用与上述用于IGE109的相同的SE-HPLC方案。结果显示在表20中。
表20:在指定温度保存后在SE-HPLC上的前峰的百分数。
实施例17：在食蟹猴中对IgE109的体内PK/PD分析
在食蟹猴中单次给药IgE或Xolair后的不同时间点测量PK，PD和免疫原性标记，筛选中到高的IgE血浆水平。使用公布的针对Xolair的模型（Hayashi等，British Journal of Clinical Pharmacology（英国临床药理学杂志），2006）进行建模分析，产生对体内KD的确定。
A.研究设计
在本研究中，6组食蟹猴（每组3只）接受单次赋形剂、IgE109或Xolair的给药(表21)。赋形剂、不同量的IgE109(0.5和1mg/kg)或Xolair(0.5和1mg/kg)的单次给药通过皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)施用，如表21所示。
在研究开始之前，确定所有研究动物中的血浆IgE水平。在单次给药赋形剂、IgE109或Xolair后，每天监测动物，并且在预先确定的不同时间点从股静脉收集血样（见图3）。
表21：关于PK/PD研究的动物处理组。NA:不适用的。S.c.:皮下注射，i.v.:静脉内注射。每只动物的剂量体积是基于最近的动物体重测量。
组1 组2 组3 组4 组5 组6
药物 赋形剂 IgE109 IgE109 IgE109 Xolair Xolair
量(mg/kg) NA 0.5 0.5 1 0.5 1
给药途径 s.c. s.c. i.v. i.v. i.v. i.v.
剂量体积(mL/kg) 1 1 1 1 1 1
B.抗-IgE纳米抗体对游离IgE水平的影响
与赋形剂组的恒定的游离IgE水平相比，在药物给药后早至1小时，对所有浓度的IgE109施用观察到游离IgE水平的降低(图4)。在两个Xolair组中也观察到游离IgE水平的降低。
基于药物代谢动力学（PK，游离的和总的IgE109与总的Xolair）和药效学（PD，游离的和总的IgE）标记的建模分析允许确定IgE109和Xolair的体内KD。
贯穿本申请引用的所有参考文献（包括文献、授权的专利、公布的专利申请和同时待审的专利申请）的完整内容通过引用明确结合于此，特别是关于本文中引用的教导。
序列
表A-1:IgE序列。
表A-2:结合IgE的纳米抗体的氨基酸序列。
表A-3:结合IgE的纳米抗体的DNA序列。
表A-4:序列优化的结合IgE的纳米抗体的序列。
表A-5:一些优选的“39D11样序列”的CDR和FR序列。
表A-6:用于本发明的多肽的结合血清白蛋白的肽
表A-7:存在于结合血清白蛋白的肽中的序列基序。
名称 SEQ ID NO: 序列
序列基序 20 DYDV
序列基序 21 YDVF
序列基序 22 DVFG
序列基序 23 VFGG
序列基序 24 FGGG
序列基序 25 GGGT
序列基序 26 DYDVF
序列基序 27 YDVFG
序列基序 28 DVFGG
序列基序 29 VFGGG
序列基序 30 FGGGT
序列基序 31 DYDVFG
序列基序 32 YDVFGG
序列基序 33 DVFGGG
序列基序 34 VFGGGT
序列基序 35 DYDVFGG
序列基序 36 YDVFGGG
序列基序 37 DVFGGGT
序列基序 38 DYDVFGGG
序列基序 39 YDVFGGGT
序列基序 40 DYDVFGGGT
序列基序 41 DAFGGG
序列基序 42 DVFGGGS
序列基序 43 DAFGGGT
序列基序 44 DYTVF
序列基序 45 YTVFG
序列基序 46 TVFGG
序列基序 47 DYTVFG
序列基序 48 YTVFGG
序列基序 49 TVFGGG
序列基序 50 DYTVFGG
序列基序 51 YTVFGGG
序列基序 52 TVFGGGT
序列基序 53 DVFGGGA
序列基序 54 DVFGGGN
序列基序 55 DVFGGGD
序列基序 56 TVFGGGA
序列基序 57 TVFGGGN
序列基序 58 TVFGGGD
名称 SEQ ID NO: 序列
序列基序 59 DYTVFGGG
序列基序 60 YTVFGGGT
序列基序 61 YDVFGGGA
序列基序 62 YDVFGGGN
序列基序 63 YDVFGGGD
序列基序 64 YTVFGGGA
序列基序 65 YTVFGGGN
序列基序 66 YTVFGGGD
序列基序 67 TAFGGG
序列基序 68 GGGTPVG
序列基序 69 GGGAPVG
序列基序 70 GGGNPVG
序列基序 71 GGGDPVG
序列基序 72 LWYML
序列基序 73 LWYLY
序列基序 74 YWWER
序列基序 75 AWYDY
序列基序 76 WWNWR
序列基序 77 EWWWR
序列基序 78 VDWFY
序列基序 79 RDWFL
序列基序 80 DWWNR
序列基序 81 YGDWF
序列基序 82 WWTWG
序列基序 83 PIDFW
序列基序 84 WWTSD
序列基序 85 QKLYW
序列基序 86 KWWEI
序列基序 87 WWSTP
序列基序 88 LFWWE
序列基序 89 WWLQE
序列基序 90 WWEQD
序列基序 91 NQLIV
序列基序 92 WWELD
序列基序 93 RXWDXDVFGGG
序列基序 94 RXWDXDVFGGGT
序列基序 95 RXWDXDVFGGGTP
序列基序 96 RXWDXDVFGGGTPG
序列基序 97 RXWDXDVFGGGTPGG
序列基序 98 RYWDYDVFGGG
序列基序 99 RDWDFDVFGGG
名称 SEQ ID NO： 序列
序列基序 100 RSWDFDVFGGG
序列基序 101 RYWDFDVFGGG
序列基序 102 RYWDYDVFGGGT
序列基序 103 RDWDFDVFGGGT
序列基序 104 RSWDFDVFGGGT
序列基序 105 RYWDFDVFGGGT
序列基序 106 RYWDYDVFGGGTP
序列基序 107 RDWDFDVFGGGTP
序列基序 108 RSWDFDVFGGGTP
序列基序 109 RYWDFDVFGGGTP
序列基序 110 RYWDYDVFGGGTPV
序列基序 111 RDWDFDVFGGGTPV
序列基序 112 RSWDFDVFGGGTPV
序列基序 113 RYWDFDVFGGGTPV
表A-8：接头序列。
名称 SEQ ID NO： 序列
5GS 162 GGGGS
6GS 163 SGGSGGS
9GS 164 GGGGSGGGS
10GS 165 GGGGSGGGGS
15GS 166 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS 167 GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS 168 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS 169 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS 170 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS 171 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
表A-9：本发明的一些抗-IgE多肽的序列。
表A-10:Alb-8纳米抗体和与Alb-8纳米抗体的融合蛋白的序列。
表A-11：用于扩增食蟹猴IgE序列的引物。
名称 SEQ ID NO： 序列
O-2.09IgE-Fc 189 GTCAACAAAACCTTTGGCGTC
O-2.10IgE-Fc 190 TTTACCGGGATTTACAGACAC
O-2.42IgE-Fc 191 ACGACAGCACCAAGAAGTGTGC
O-2.43IgE-Fc 192 CGCCAGAGAAGCTAGAGAGC

Claims (35)

1.免疫球蛋白单可变结构域，其(i)与39D11(SEQ ID NO:119)竞争结合(人)IgE；和/或(ii)与39D11结合(人)IgE上相同的表位；和/或(iii)交叉阻断39D11与(人)IgE的结合。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域，其包含以下或基本上由以下组成：
a)包含以下或基本上由以下组成的CDR1：(i)氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)和/或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)或(ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)和/或氨基酸序列NYDMA(SEQ IDNO:135)仅具有3、2或1个(如本文定义的)氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
b)包含以下或基本上由以下组成的CDR2：(i)氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)或(ii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，至少94%，或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)仅具有7、6、5、4、3、2或1个(如本文定义的)氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
c)包含以下或基本上由以下组成的CDR3：(i)氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)或(ii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，至少92%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)仅具有7、6、5、4、3、2或1个(如本文定义的)氨基酸差异的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其中CDR1包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO:134)，优选地，氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:135)，CDR2包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO:136)，并且CDR3包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO:137)，优选地，氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其与氨基酸序列39D11(SEQ ID NO:119)具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其为39D11的人源化的和/或序列优化的变体，所述变体包含选自以下的一个或多个突变（与SEQ ID NO:119相比）：E1D，V5L，E6Q，F29Y，S31N，S35A或S35G，G44R，N75K，M77T或M77L，K83R，W91Y，D97E，Y100eF和/或Q108L，按照Kabat编号。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其选自：SEQ ID NO’s:120-133中的任一个，或与SEQ ID NO’s:120-133中的任一个具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性的免疫球蛋白单可变结构域。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其选自SEQ ID NO’s:128和129。
8.蛋白、多肽、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：适当地通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接的(i)至少一个(如一个或两个)根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域和(ii)至少一个其他氨基酸序列、蛋白、(多)肽、结合结构域、结合单位、基团、残基或结构部分。
9.根据权利要求8所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其与权利要求1-7中任一项所述的相对应的免疫球蛋白单可变结构域本身相比，具有增加的半衰期。
10.根据权利要求9所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中与权利要求1-7中任一项所述的相对应的免疫球蛋白单可变结构域本身相比，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位为所述蛋白、多肽、构建体或化合物提供增加的半衰期。
11.根据权利要求10所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中为所述蛋白、多肽、构建体或化合物提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选自由以下组成的组：血清蛋白或其片段，能够结合血清蛋白的结合单位，Fc部分，和能够结合血清蛋白的小蛋白或肽。
12.根据权利要求11所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中为所述蛋白、多肽、构建体或化合物提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由以下组成的组：能够结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)的结合单位或血清免疫球蛋白(如IgG)。
13.多肽、蛋白、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：
a)一个或多个(如一个或两个)针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域；和
b)一个或多个(如一个或两个，包括但不限于串联重复的)针对(人)血清白蛋白的肽，所述肽能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。
14.根据权利要求13所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：
a)一个或多个(如一个或两个)根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域；和
b)一个或多个(如一个或两个，包括但不限于串联重复的)针对(人)血清白蛋白的肽，所述肽能够结合到(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。
15.根据权利要求13或14任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其中所述一个或多个针对(人)血清白蛋白的肽选自SEQ ID NO’s:1-18中的任一个。
16.根据权利要求15所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其选自：SEQ ID NO’s:147-161中的任一个，或与SEQ ID NO’s:147-161中的任一个具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性的多肽。
17.根据权利要求16所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其为SEQID NO:155。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域作为结合结构域或结合单位在制备根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物中的应用。
19.核酸或核苷酸序列，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域；或编码根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物。
20.根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列，其是遗传构建体的形式。
21.根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列的应用，所述核酸或核苷酸序列编码根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，或用于制备编码根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物的遗传构建体。
22.宿主或宿主细胞，其表达或者在适当的环境下能够表达根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域、根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物；和/或其包含根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列或根据权利要求19所述的遗传构建体。
23.组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，或根据权利要求19和20中任一项所述的核酸或核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的组合物，其为药物组合物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其为药物组合物，还包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，并且其任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
26.制备根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域、根据权利要求8-17中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达系统中，表达根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列，或根据权利要求20所述的遗传构建体；
任选地接着：
b)分离和/或纯化这样获得的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽。
27.制备根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在使得所述宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽的条件下培养和/或维持根据权利要求22所述的宿主或宿主细胞；
任选地接着：
b)分离和/或纯化这样获得的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽。
28.制备根据权利要求13-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物的方法，所述方法至少包括下述步骤：连接至少一个根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个针对(人)血清白蛋白的肽以及任选地一个或多个接头。
29.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于治疗。
30.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗至少一种与IgE相关、与IgE的增加水平和/或过量产生相关或与异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症。
31.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗能够通过调节IgE、其生物学活性或药理学活性和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导而治疗的至少一种疾病或病症。
32.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗哮喘，变应性鼻炎，枯草热，结膜炎，湿疹，荨麻疹，食物过敏和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态反应，如针对昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的那些变态反应，以及针对药物的变态反应；并且更一般地是与过敏性超敏反应和/或（特应性）变态反应相关的任何疾病或病症。
33.用于预防和/或治疗至少一种与IgE相关、与IgE的增加水平和/或过量产生相关或与异常的对IgE的敏感性（如超敏性）相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：对有此需要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
34.用于预防和/或治疗能够通过调节IgE、其生物学活性或药理学活性和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导而治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括：对有此需要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
35.用于预防和/或治疗以下疾病或病症的方法：哮喘，变应性鼻炎，枯草热，结膜炎，湿疹，荨麻疹，食物过敏和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态反应，如针对昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的那些变态反应，以及针对药物的变态反应；并且更一般地是与过敏性超敏反应和/或（特应性）变态反应相关的任何疾病或病症，所述方法包括：对有此需要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
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