CN102781959A

CN102781959A - 能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽

Info

Publication number: CN102781959A
Application number: CN2011800083085A
Authority: CN
Inventors: 希尔德·阿迪·皮埃雷特·勒韦兹; 卡罗·布东
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2011-02-03
Publication date: 2012-11-14
Also published as: EP2531523A1; WO2011095545A1; JP2013518853A; CA2788993A1; AU2011212442A1

Abstract

本发明涉及能够结合血清蛋白的氨基酸序列；涉及包含所述氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成的化合物、蛋白、多肽、融合蛋白或构建体；涉及编码所述氨基酸序列、化合物、蛋白、多肽、融合蛋白或构建体的核酸；涉及包含所述氨基酸序列、化合物、蛋白、多肽、融合蛋白或构建体的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述氨基酸序列、化合物、蛋白、多肽、融合蛋白或构建体的应用。

Description

能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽

发明领域

本发明涉及能够结合血清蛋白的氨基酸序列；涉及包含所述氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成的肽；涉及包含所述氨基酸序列的化合物和构建体(如融合蛋白和多肽)；涉及编码所述氨基酸序列、肽、融合蛋白或多肽的核酸；涉及包含所述氨基酸序列、肽构建体、化合物、融合蛋白或多肽的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述氨基酸序列、肽构建体、化合物、融合蛋白或多肽的应用。

本发明的其他方面、实施方案、优势和应用将通过本文的进一步描述而变得清楚。

发明背景

国际申请WO 09/127691，名称为“Peptides capable of binding to serumproteins and compounds，constructs and polypeptides comprising the same(能够结合血清蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽)”，描述了一类能够结合血清白蛋白的肽，所述肽能够与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗实体连接或融合，从而增加其半衰期。

关于WO 09/127691中公开的肽的描述，参考WO 09/127691的说明书、权利要求书、附图和序列表，通过引用将其结合于此。通过举例说明的方式(并且不是通过限制WO 09/127691或本申请的方式)，例如，WO09/127691中描述的一些示例性的肽包含下述特征中的一种或多种：

(i)Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或

(ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；和/或

(iii)序列模体GGG；

并且优选地包含(i)，(ii)和(iii)中的至少任意两项并且更优选地所有三项。

特别地，例如，WO 09/127691中描述的一些示例性的肽可以包含下述特征中的一种或多种：

(i)序列模体RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选是W，Y，F，S或D；和/或

(ii)序列模体GGG，优选序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)，更优选序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，并且特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；

并且最优选包含这些序列模体(i)和(ii)二者。

此外，尽管WO 09/127691中声明本申请不限于任何关于来自WO09/127691的氨基酸序列于何处(即，与哪个表位)和怎样(即，通过哪些氨基酸残基)结合人血清白蛋白的具体(或完整)的解释或假说，但是其提到，通过晶体结构和建模数据，关于来自WO 09/127691的肽中之一(WO 09/127691中的SEQ ID NO：143)与人血清白蛋白的结合相互作用已经进行了许多观察。这些记述在WO 09/127691第84-89页的实施例8中，并且再次通过引用结合于此。

国际申请WO 08/068280，名称为“Peptides capable of binding to serumprotein(能够结合血清蛋白的肽)”，描述了用于产生能够结合血清蛋白的肽的方法，所述肽可以结合或融合于治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体从而增加其半衰期。SEQ ID NO：1是利用WO 08/068280所述的方法产生的肽的一个实例(在此处提及作为参照)。

发明概述

本发明的一个目的是提供与WO 08/068280和WO 09/127691中描述的氨基酸序列相比具有改善的特性的氨基酸序列。特别地，本发明的一个目的是提供这样的氨基酸序列：

-与下述氨基酸序列相比，其更好地(如本文定义)结合人血清白蛋白，所述氨基酸序列为：WO 08/068280(且特别地，好于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其来自WO 08/068280)和WO 09/127691(且特别地，好于59F2(WO 09/127691：SEQ ID NO：149/在本申请中为SEQ ID NO：76)；59H12(WO 09/127691：SEQ ID NO：155/在本申请中为SEQ ID NO：77)；和/或59C2(WO 09/127691：SEQ ID NO：156/在本申请中为SEQ ID NO：75)中描述的氨基酸序列；

和/或

-能够特异性结合(如本文定义)人血清白蛋白，并且还能够特异性结合来自至少一个其他哺乳动物物种的血清白蛋白(如来自小鼠、大鼠、兔、狗或灵长类动物物种如狒狒或恒河猴的血清白蛋白)，并且特别能够特异性结合人血清白蛋白和来自食蟹猴的血清白蛋白；

和/或

-能够结合(人)血清白蛋白并且与WO 08/068280和WO 09/127691中描述的相比，具有其他用于药用的改善的特性，如提高的稳定性、提高的蛋白酶抗性等；

和/或

-当与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合时，与WO 08/068280和WO 09/127691中描述的氨基酸序列相比(当与相同治疗剂连接或融合时)，提供血清半衰期或其他药理学相关性质的更大的增加。

本发明的目的还在于提供这样的氨基酸序列，其可以与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合，从而使得到的化合物或构建体与包含WO 08/068280和WO 09/127691中描述的氨基酸序列之一的相应化合物或构建体相比具有提高的半衰期。

本发明的一个目的是提供这样的氨基酸序列，其是WO 08/068280和WO 09/127691中所述的结合血清蛋白的氨基酸序列的替代品，且特别是一种改善的替代品。

一般而言，本发明通过提供本文所述的氨基酸序列实现该目标。这些氨基酸序列能够结合于(并且特别地，如本文定义，特异性结合于)血清白蛋白(并且特别是人血清白蛋白)，并且能够用作用于与治疗性化合物(如治疗性蛋白或多肽)连接或融合从而增加其半衰期的小肽或肽结构部分。这些氨基酸序列(其在本文也称为“本发明的氨基酸序列”)在本文中进一步定义。

特别地，按照本发明，已经发现，通过靠近WO 09/127691所述的肽的N-末端提供一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)(的片段)可以进一步改善WO 08/068280和WO 09/127691中所述的结合血清白蛋白的肽。靠近肽的N-末端的这些一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)可以如本文进一步所述。

因此，本发明的氨基酸序列通常是基于WO 09/127691中所述的肽，但是除了WO 09/127691中所述的氨基酸残基和/或序列模体之外，还在靠近所述肽的N-末端具有所述一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)(的片段)，如本文进一步所述。

特别地，在本发明的氨基酸序列中，这些一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)(的这种片段)可以相对于WO 09/127691中所述的肽的位置3(按WO 09/127691和本文进一步所述编号)靠近肽的N-末端提供。在本文中这也称为所述位置3的“上游”。

例如，这些氨基酸(的这种片段)可以相对于(优选)存在于WO09/127691中所述肽的位置3的Arg(R)残基的位置提供到靠近肽的N-末端(如在WO 09/127691中所述，其可以特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基)。如果存在这样的Arg残基，则在本申请的说明书和权利要求书中，所述一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)也可以说是在所述Arg (R)残基的“上游”。

当本发明的氨基酸序列包含RXWD模体(motif)时(其对于本发明的氨基酸序列是优选的，如同对于09/127691中所述的肽是优选的)，所述一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)同样可以(并且优选地)相对于所述RXWD模体靠近肽的N-末端提供。同样地，如果存在这样的模体，则在本申请的说明书和权利要求书中，所述一个或多个氨基酸残基(或一个或多个氨基酸残基的组合)也称为在所述RXWD模体的“上游”。

并且，当氨基酸残基片段在本文中称为是在某个残基(如位置3的R)、某个位置(如位置3)或某个模体(如RXWD模体)的“上游”时，所述氨基酸片段优选直接在所述残基、位置或模体之前(即，与其直接连接并且基本上与其邻接)(尽管不排除在所述片段与残基/位置/模体之间存在1、2或3个氨基酸残基)。优选地，“位置3的上游”的氨基酸片段的最后一个氨基酸是在位置0、1或2处(按下述编号)，并且优选是在位置2处。

因此，一般地，本文所述的为本发明的氨基酸序列提供改善的特性(与WO 08/068280和WO 09/127691中所述的结合血清白蛋白的肽相比)的氨基酸片段通常在位置3的上游(编号方式如下文所示，其与WO09/127691中所用的编号方式相对应)。

通过举例说明的方式，术语“靠近(towards)N-末端”和“上游”通过本发明的下述氨基酸序列(克隆EXPGMP 89D03，SEQ ID NO：72)解释：

WWEQDRDWDFDVFGGGTP

可以看出，本发明的这一氨基酸序列包含RXWD模体(下划线表示)，以及DVFGGG模体(SEQ ID NO：15；同样下划线表示)，其位于RXWD模体的“靠近C-末端”或“下游”。本发明的这一氨基酸序列还包含(举例说明)与WO 09/127691中所述的肽相比为本发明的氨基酸序列提供改善的特性(如本文所述)的所述一个或多个氨基酸残基中一些的实例。认为这些示例性的氨基酸残基(WWEQD；SEQ ID NO：96)在RXWD模体的“靠近N-末端”或“上游”(还应该注意到，如在WO 09/127691中所述，前段中引用的Arg(R)残基通常是存在于序列模体RXWD中的Arg(R)残基)。

从该实例也可以看出，在本发明的氨基酸序列中提供改善的特性(即，与WO 09/127691中所述的肽相比)的RXWD模体上游的一个或多个氨基酸残基还可以替代WO 09/127691中所述的肽中在RXWD模体上游的一个或多个氨基酸残基(例如，在来自WO 09/127691的序列SEQ ID NO：143中，其为三个丙氨酸残基，AAA)。

在本发明中，使用与WO 09/127691和WO 08/068280中相同的氨基酸残基编号方式。这种编号方式进一步描述在WO 09/127691和WO08/068280中，并且在整个本申请说明书中进一步使用和举例说明。按照这种编号方式，Arg(R)残基位于位置3处，Arg(R)残基上游的氨基酸残基位于位置1和2处。例如，参考WO 09/127691第15页表1(如其中提及，替代位置3处的优选的Arg残基，WO 09/127691的肽可以在位置3处替代性地包含L，F，Y，W，P，T，S，M，A，D，I，K，Q或V，并且这同样适用于本发明的氨基酸序列)。

还应该注意，本发明的氨基酸序列通常在位置3上游包含多于两个氨基酸残基。参考上述示例性序列SEQ ID NO：1，这些氨基酸残基按下述编号：

为了进一步举例说明和澄清本说明书中的氨基酸残基和本发明的氨基酸序列的这种编号方式，图III是显示下述氨基酸序列的比对的表格：SEQ ID NO：1(参照)，59C2(SEQ ID NO：75，参照)，80B10(SEQ ID NO：56，本发明)；89D03(SEQ ID NO：72，本发明)，89D03V1(SEQ ID NO：103，本发明)，89D03V1VG(SEQ ID NO：106，本发明)和89D03V3(SEQ IDNO：105，本发明)。当方格为空白时，在该表格中所示例的序列中不存在氨基酸残基。

一般地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基(并且对于其余部分一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。

特别地，所述至少一个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述至少一个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处和位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691中所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，该氨基酸残基片段包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(subpocket)(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493(如WO 09/127691的实施例8所述进行编号)。对于其余部分(即，在位置3处以及位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

在一个非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，该氨基酸残基片段包含：(i)至少两个疏水氨基酸残基；(ii)至少两个芳族氨基酸残基；和/或(iii)至少一个疏水氨基酸残基和至少芳族氨基酸残基。同样地，所述一个或多个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述一个或多个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个疏水氨基酸残基；(ii)至少两个芳族氨基酸残基；和/或(iii)至少一个疏水氨基酸残基和至少芳族氨基酸残基，以使至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。同样地，所述一个或多个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述一个或多个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

上述氨基酸序列优选在位置-2，-1，0，1和/或2处(按上述编号)包含至少一个疏水氨基酸残基或芳族氨基酸残基，并且特别是在位置-2，-1和/或0处包含至少一个疏水氨基酸残基或芳族氨基酸残基。

本发明的氨基酸序列进一步优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(亲和力是使用本发明的氨基酸序列本身测量或使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(如本文用作实例的纳米抗体2D3)测量。例如，参考下述实施例2)(如使用Biacore确定的)。

在一个具体的但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基(和同样地，对于其余部分，一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。对于其余部分(即，在位置3处以及位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基，以使至少一个所述W或Y残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

在另一个具体的但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基(和同样地，对于其余部分，一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使至少一个所述W或Y残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

优选地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含1、2或3个W残基。特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含1、2或3个W残基，以使至少一个所述W残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

一般地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基(和对于其他部分，一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。

特别地，所述至少一个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述至少一个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

在一个非限制性方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个疏水氨基酸残基；(ii)至少两个芳族氨基酸残基；和/或(iii)至少一个疏水氨基酸残基和至少芳族氨基酸残基。同样地，所述一个或多个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述一个或多个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个疏水氨基酸残基；(ii)至少两个芳族氨基酸残基；和/或(iii)至少一个疏水氨基酸残基和至少芳族氨基酸残基，以使至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。同样地，所述一个或多个疏水氨基酸残基可以选自L，I，V和/或M和/或所述一个或多个芳族氨基酸残基可以选自W，Y和/或F。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

本发明的所有氨基酸序列优选是这样的，以致它们以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

在一个具体的但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基(和同样地，对于其余部分，一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个W残基和/或至少一个Y残基，以使至少一个所述W或Y残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

在另一个具体的但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基(和同样地，对于其余部分，一个或多个其他适合的氨基酸残基，如例如本文所示例的)。对于其余部分(即，在位置3处以及在位置3的更下游处)，本发明的氨基酸序列可以如WO 09/127691所述(适用相同的优选方面和特征)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含：(i)至少两个W残基；(ii)至少两个Y残基；和/或(iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使至少一个所述W或Y残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

优选地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含1，2或3个W残基。特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置3的上游包含含有3，4，5，6或7个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含1，2或3个W残基，以使至少一个所述W残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

同样地，上述氨基酸序列优选地在位置-2，-1，0，1和/或2处(按上述编号)包含至少一个W或Y残基，并且特别是在位置-2，-1和/或0处包含至少一个W或Y残基。

通常，应该注意，除了上述段落提及的位置3上游的氨基酸残基片段之外，本发明的氨基酸序列可以在所述2-10(优选3，4，5，6或7)个氨基酸残基的片段的(更)上游包含一个或多个其他氨基酸残基。然而，尽管本发明的范围并不排除，但是这既不是必需的也不是必要的。

可以存在于本发明的氨基酸序列中的位置3上游的适当的氨基酸片段的一些优选的但非限制性的实例可见于下表II中列出的肽。例如，位置3上游的氨基酸序列的一部分可以是下述序列中的一种：LWYML，LWYLY，YWWER，AWYDY，WWNWR，EWWWR，VDWFY，RDWFL，DWWNR，YGDWF，WWTWG，PIDFW，WWTSD，QKLYW，KWWEI，WWSTP，LFWWE，WWLQE，WWEQD，NQLIV，WWELD(分别见于SEQ ID NO’s 78-98)；或是与这些序列之一具有3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列(条件是其仍然满足上述特征)。特别优选存在带下划线序列中的一种或与这些序列之一具有2或1个氨基酸差异(如本文定义)的氨基酸序列(条件是其仍然满足上述特征)。

肽的另一部分(在位置3处和更下游处)可以特别如WO 09/127691中所述(适用相同的优选方面和特征)。例如，肽在位置3处和更下游处的部分可以例如与来自WO 09/127691的SEQ ID NOs：2-115和147-157的序列之一的位置3处和更下游处的肽的部分(参见WO 09/127691中表II)相同、或基本上相同。

因此，按照第一方面，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)具有至少50％，优选至少65％，更优选至少70％，甚至更优选至少75％，如至少80％，如至少90％，但并非100％的序列同一性(如本文定义)；并且其：

b)与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)相比，更好地结合于人血清白蛋白；

并且其：

c)在位置3上游处包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

本发明的另一个方面涉及这样的氨基酸序列，其：

a)与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)具有不超过9个，优选不超过8个，特别是不超过7个，如6，5，4，3，2或1个氨基酸差异(如本文定义)；

并且其：

在还有的另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含一个或多个下述序列模体：DYDV(SEQ ID NO：2)，YDVF(SEQ ID NO：3)，DVFG(SEQ ID NO：4)，VFGG(SEQ ID NO：5)，FGGG(SEQ ID NO：6)和/或GGGT(SEQ ID NO：7)；

b)具有5-50个，优选7-40个，更优选10-35个，如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度；

c)与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)相比，更好地结合于人血清白蛋白；

并且其：

d)在位置3上游处包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)；

所述氨基酸序列不是序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ IDNO：1)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含一个或多个下述序列模体：DYDVF(SEQ ID NO：8)，YDVFG(SEQ ID NO：9)，DVFGG(SEQ ID NO：10)，VFGGG(SEQ ID NO：11)和/或FGGGT(SEQ ID NO：12)；

并且其：

所述氨基酸序列不是序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ IDNO：1)。优选地，这样的氨基酸序列如本文进一步所述。例如，其优选地还包含序列模体RXWD(即，在前述序列模体的上游，例如，在位置3-6处)，如本文进一步所述。

如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以用苏氨酸(T)残基替换位置8处的天冬氨酸(D)残基(例如，但不限于，在位置14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中)。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是可以包含序列模体DYTVF(SEQ IDNO：126)，YTVFG(SEQ ID NO：127)或TVFGG(SEQ ID NO：128)来分别替换序列模体DYDVF(SEQ ID NO：8)，YDVFG(SEQ ID NO：9)，DVFGG(SEQ ID NO：10)。所述氨基酸序列可以如本文进一步所述，并且按照一个具体的但非限制性的方面，可以在位置14处包含除苏氨酸之外的氨基酸残基(例如，A，N且特别是D)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含一个或多个下述序列模体：DYDVFG(SEQ ID NO：13)，YDVFGG(SEQ ID NO：14)，DVFGGG(SEQ ID NO：15)和/或VFGGGT(SEQ ID NO：16)；

b)具有6-50个，优选7-40个，更优选10-35个，如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度；

并且其：

如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以用苏氨酸(T)残基替换位置8处的天冬氨酸(D)残基(例如，但不限于，在位置14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中)。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是可以包含序列模体DYTVFG(SEQ IDNO：129)，YTVFGG(SEQ ID NO：130)或TVFGGG(SEQ ID NO：131)来分别替换序列模体DYDVFG(SEQ ID NO：13)，YDVFGG(SEQ ID NO：14)或DVFGGG(SEQ ID NO：15)。所述氨基酸序列可以如本文进一步所述，并且按照一个具体的但非限制性的方面，可以在位置14处包含除苏氨酸之外的氨基酸残基(例如，A，N且特别是D)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含一个或多个下述序列模体：DYDVFGG(SEQ ID NO：17)，YDVFGGG(SEQ ID NO：18)和/或DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；

b)具有7-50个，优选8-40个，更优选10-35个，如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度；

并且其：

如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以用苏氨酸(T)残基替换位置8处的天冬氨酸(D)残基(例如，但不限于，在位置14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中)。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是可以包含序列模体DYTVFGG(SEQ IDNO：132)，YTVFGGG(SEQ ID NO：133)或TVFGGGT(SEQ ID NO：134)来分别替换序列模体DYDVFGG(SEQ ID NO：17)，YDVFGGG(SEQ IDNO：18)或DVFGGGT(SEQ ID NO：19)。所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。

此外，如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以用另一种氨基酸，如(例如，并且不限于)A，N或D替换位置14处的苏氨酸(T)残基。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是例如，可以包含序列模体DVFGGGA(SEQ ID NO：135)，DVFGGGN(SEQ IDNO：136)或DVFGGGD(SEQ ID NO：137)来替换序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)。

在位置8处的天冬氨酸(D)残基替换为苏氨酸(T)残基且在位置14处的苏氨酸残基替换为另一种氨基酸(例如，但不限于，A，N且特别是D)，这两者也是可能的。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是例如，可以包含序列模体TVFGGGA(SEQ ID NO：138)，TVFGGGN(SEQ ID NO：139)或TVFGGGD(SEQ ID NO：140)来替换序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含一个或多个下述序列模体：DYDVFGGG(SEQ ID NO：20)和/或YDVFGGGT (SEQ ID NO：21)；

b)具有8-50个，优选9-40个，更优选10-35个，如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度；

并且其：

所述氨基酸序列不是序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ IDNO：1)。优选地，这样的氨基酸序列如本文进一步所述。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)包含下述序列模体：DYDVFGGGT(SEQ ID NO：23)；

b)具有9-50个，优选9-40个，更优选10-35个，如约15，20，25或30个氨基酸残基的总长度；

并且其：

如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以将位置8处的天冬氨酸(D)残基替换为苏氨酸(T)残基(例如，但不限于，在位置14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中)。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是可以包含序列模体DYTVFGGG(SEQ IDNO：141)或YTVFGGGT(SEQ ID NO：142)来分别替换序列模体DYDVFGGG(SEQ ID NO：20)和/或YDVFGGGT(SEQ ID NO：21)。

此外，如本文进一步所述，在本发明的上述氨基酸序列中可以用另一种氨基酸，如(例如，并且不限于)A，N或D替换位置14处的苏氨酸(T)残基。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是例如，可以包含序列模体YDVFGGGA(SEQ ID NO：143)，YDVFGGGN(SEQ IDNO：144)或YDVFGGGD(SEQ ID NO：145)来替换序列模体YDVFGGGT(SEQ ID NO：21)。

在位置8处的天冬氨酸(D)残基替换为苏氨酸(T)残基且在位置14处的苏氨酸残基替换为另一种氨基酸(例如，但不限于，A，N且特别是D)，这两者也是可能的。在这样的情形中，所述氨基酸序列可以如上文所述，但是例如，可以包含序列模体YTVFGGGA(SEQ ID NO：146)，YTVFGGGN(SEQ ID NO：147)或YTVFGGGD(SEQ ID NO：148)来替换序列模体YDVFGGGT(SEQ ID NO：21)。

本发明的氨基酸序列(如本文进一步所述)优选地(至少)包含：

(i)Arg(R)残基，特别能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或

(iii)序列模体GGG；

并且优选地包含(i)，(ii)和(iii)中的至少任意两项并且更优选地所有三项；并且另外在所述Arg残基的上游包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使所述至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493(如WO 09/127691的实施例8所述进行编号)。特别地，本发明的氨基酸序列在所述Arg残基的上游可以包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

本发明的氨基酸序列(如本文进一步所述)优选地(至少)包含：

(iii)序列模体RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选是W，Y，F，S或D；和/或

(iv)序列模体GGG，优选序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)，更优选序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)(或备选地，序列模体TVFGGG(SEQ ID NO：131)，且特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)(或备选地是序列模体SEQ ID NO’s：134-139之一)；

并且最优选地包含这些序列模体(i)和(ii)两者；在所述RXWD模体的上游，包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使所述至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493(如WO 09/127691的实施例8所述进行编号)。特别地，本发明的氨基酸序列在所述RXWD模体的上游可以包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

同样地，本文所述的本发明的所有氨基酸序列优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

例如，本发明的优选氨基酸序列还可以包含序列模体DAFGGG(SEQID NO：44)来替换序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)。类似地，在位置8处具有苏氨酸(T)的序列模体中(例如，SEQ ID NO’s：126-148的序列模体之一)，位置9处的缬氨酸(V)可以替换为丙氨酸(A)，以提供-作为非限制性实例-序列模体TAFGGG(SEQ ID NO：149)，即，替代序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)或序列模体TVFGGG(SEQ ID NO：131)。此外，例如，本发明的优选氨基酸序列还可以包含序列模体DVFGGGS(SEQ ID NO：45)或DAFGGGT(SEQ ID NO：46)来替换序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)。基于本文公开的内容(如表II中提及的序列)，技术人员将清楚可以存在于本发明的氨基酸序列中的其他类似的序列模体。

因此，在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

a)与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)具有至少50％，优选至少65％，更优选至少70％，甚至更优选至少75％，如至少80％，如至少90％，但并非100％的序列同一性(如本文定义)；

c)包含Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；并且其

d)在所述Arg残基的上游包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使所述至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493(如WO 09/127691的实施例8所述进行编号)。

特别地，本发明的该氨基酸序列在所述Arg残基的上游可以包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

该氨基酸序列优选地还包含：(i)序列模体RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选是W，Y，F，S或D；和/或(ii)序列模体GGG，优选序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)，更优选序列模体DVFGGG(SEQ IDNO：15)(或备选地，序列模体TVFGGG(SEQ ID NO：131)，且特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)(或备选地是序列模体SEQ ID NO’s：134-139之一)；并且最优选地包含这些序列模体两者。

上述氨基酸序列还优选地如本文进一步所述。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

c)包含Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；

并且其

d)在位置3(和/或所述W残基)上游处包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

该氨基酸序列优选地还包含：(i)序列模体RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选是W，Y，F，S或D；和/或(ii)序列模体GGG，优选序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)，更优选序列模体DVFGGG(SEQ IDNO：15)(或备选地，序列模体TVFGGG(SEQ ID NO：131)，且特别是序列模体序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)(或备选地是序列模体SEQ IDNO’s：134-139之一)；并且最优选地包含这些序列模体两者。

上述氨基酸序列还优选地如本文进一步所述。

在另一个方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列，其：

c)包含Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；

d)包含Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；

并且其

e)在所述Arg残基的上游包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使所述至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493(如WO 09/127691的实施例8所述进行编号)。

特别地，本发明的所述氨基酸序列在所述Arg残基的上游可以包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

同样地，这些氨基酸序列还优选地如本文进一步所述。例如，本发明的上述氨基酸序列同样优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

可以存在于本发明的氨基酸序列中的一些优选的但非限制性的序列模体为：

-在位置3上游的如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。例如，这可以是序列SEQ ID NO’s78-98中的一种(或与这些序列中的至少一个具有2个或仅有1个“氨基酸差异”的序列----如本文定义，条件是它们(优选地)仍满足本文所述的(优选)方面)。

-氨基酸序列RXWDXDVFGGG(SEQ ID NO：23)，其中第一个X所示的(从N-末端开始)氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个X所示的氨基酸残基选自Y或F。

-氨基酸序列RXWDXDVFGGGT(SEQ ID NO：24)，其中第一个X所示的(从N-末端开始)氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个X所示的氨基酸残基选自Y或F。

-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTP(SEQ ID NO：25)，其中第一个X所示的(从N-末端开始)氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个X所示的氨基酸残基选自Y或F。

-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPG(SEQ ID NO：26)，其中第一个X所示的(从N-末端开始)氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个X所示的氨基酸残基选自Y或F。

-氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(SEQ ID NO：27)，其中第一个X所示的(从N-末端开始)氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个X所示的氨基酸残基选自Y或F。

-选自RYWDYDVFGGG (SEQ ID NO：28)；RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO：29)；RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO：30)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列；且特别是选自RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO：28)；RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO：29)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO：30)的氨基酸序列。

-选自RYWDYDVFGGGT(SEQIDNO：32)；RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：33)；RSWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：34)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列；且特别是选自RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：33)；RSWDFDVFGGGT(SEQ IDNO：34)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列。

-选自RYWDYDVFGGGTP(SEQ ID NO：36)；RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：37)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ IDNO：38)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列；且特别是选自RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：37)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：38)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列。

-选自RYWDYDVFGGGTPV(SEQ ID NO：40)；RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：41)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQID NO：42)或RYWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：43)的氨基酸序列；且特别是选自RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：41)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：42)或RYWDFDVFGGGTPV(SEQID NO：43)的氨基酸序列。

同样地，SEQ ID NO’s：23-43的所有序列模体可以包含一个或多个如本文所述的取代，诸如(例如，并且不限于)下表I列出的一个或多个取代。

因此，可以存在于本发明的氨基酸序列中的一些其他(非限制性的)序列模体为：

-按照SEQ ID NO’s：24-27或32-43中的任一种序列模体的氨基酸序列，其中位置14处的苏氨酸(T)残基已被另一种氨基酸残基(优选，但不限于，A，N或D)替换；

-按照SEQ ID NO’s：23-43中的任一种序列模体的氨基酸序列，其中位置8处的天冬氨酸(D)已被苏氨酸(T)替换；

-按照SEQ ID NO’s：24-27或32-43中的任一种序列模体的氨基酸序列，其中：(i)位置14处的苏氨酸(T)残基已被另一种氨基酸残基(优选，但不限于，A，N或D)替换，并且(ii)位置8处的天冬氨酸(D)已被苏氨酸(T)替换；

同样地，这些其他序列模体可以包含一个或多个其他适当的取代，诸如(例如，并且不限于)下表I列出的一个或多个取代。

在本发明上下文中，在下列情形中认为本发明的氨基酸序列与SEQID NO：1的氨基酸序列相比“更好地结合”血清白蛋白(如人血清白蛋白或来自其他哺乳动物物种的血清白蛋白，如食蟹猴的血清白蛋白)(且特别地，好于SEQ ID NO：75，76和/或77中的至少一个且优选好于SEQID NO：75，76和/或77中的全部)：

-当其以比SEQ ID NO：1的氨基酸序列更高(且特别地，高于SEQ IDNO：75，76和/或77中的至少一个且优选高于SEQ ID NO：75，76和/或77中的全部)的特异性结合所述血清白蛋白时；和/或

-当其以比SEQ ID NO：1的氨基酸序列更高(且特别地，高于SEQ IDNO：75，76和/或77中的至少一个且优选高于SEQ ID NO：75，76和/或77中的全部)的亲和力(如本文定义，并且表示为K_D，K_A，k_on或k_off速率，并且使用本文所述的方法中的一种确定)结合所述血清白蛋白时；和/或

-当其以比SEQ ID NO：1的氨基酸序列更高(且特别地，高于SEQ IDNO：75，76和/或77中的至少一个且优选高于SEQ ID NO：75，76和/或77中的全部)的亲合力(avidity)(即，当本发明的氨基酸序列用作多联体(concatamer)时)结合所述血清白蛋白(即，当其以可比较的多联体形式使用时)时；和/或

-当包含一个或多个本发明的所述氨基酸序列的本发明的化合物(如本文定义)以比包含一个或多个SEQ ID NO：1的氨基酸序列的本发明的相应的化合物更高的特异性、亲和力和/或亲合力结合所述血清白蛋白(且特别地，高于SEQ ID NO：75，76和/或77中的至少一个且优选高于SEQID NO：75，76和/或77中的全部)时，例如，所述特异性、亲和力和/或亲合力如使用实施例2所用的BIAcore^TM测量所确定。例如，并且非限制性地，当其中相关氨基酸序列与纳米抗体2D3(SEQ ID NO：47)(任选地通过适当的接头)融合的融合蛋白以比其中纳米抗体2D3与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)(任选地通过相同的适当的接头)融合的相对应的融合蛋白更高的特异性、亲和力和/或亲合力结合血清白蛋白时(例如，如使用实施例2所用的BIAcore^TM测量所确定)，认为本发明的氨基酸序列更好地结合血清白蛋白。为了这种比较的目的，例如(但不限于)，相关的氨基酸序列可以(任选地通过相同的适当的接头连接)连接到2D3的C端。实施例2给出了所有这些的具体而非限制性的实例。

特别地，如本文所述的“结合”可以使用WO 09/127691的实施例3或实施例9所述的溶液结合竞争测定法确定，或者，当所述氨基酸序列以与纳米抗体2D3的融合体表达时，如在WO 09/127691的实施例7或10中所述或如本文的实施例2所述，以在WO 09/127691的这些实施例中和/或在下述实施例2中描述的Biacore测定法确定。

如本文提及，本发明的氨基酸序列进一步优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)(亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或使用本发明的氨基酸序列与另外的蛋白或肽(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体测量)。

表II和SEQ ID NO’s：54-74中给出了本发明的氨基酸序列的一些非限制性的实例。其中，特别优选以优于30nM的亲和力与血清白蛋白结合的那些序列(其本身和/或作为与2D3的融合体)(如SEQ ID NO’s：56，59，64，68，69，70，71，72或74的氨基酸序列中的一种)、且特别是以等于或优于20nM的亲和力与血清白蛋白结合的那些序列(其本身和/或作为与2D3的融合体)(如SEQ ID NO’s：56，59，68，70，72或74的氨基酸序列中的一种)。

下述段落提供本发明的氨基酸序列在位置3的下游(并且包括位置3)和更下游的部分的一些优选的但非限制性的方面、特征、氨基酸残基、序列模体和实例的描述。同样地，所述序列的这些部分可以与本文所述的位置3的上游部分/序列组合，从而提供本发明的氨基酸序列。通常，本文提及的对于本发明的氨基酸序列在位置3下游(并且包括位置3)的部分的优先选择和本文提及的对于本发明的氨基酸序列在位置3上游的部分的优先选择都适用。因此，在特别优选的本发明的氨基酸序列中，本发明的氨基酸序列在位置3下游(并且包括位置3)的部分是按照其优选的描述/方面(如本文列出的)，并且本发明的氨基酸序列在位置3上游(并且包括位置3)的部分是按照其优选的描述/方面(如本文列出的)。基于此，技术人员能够将位置3上游和下游的序列的优选方面组合为单一的、优选的本发明的氨基酸序列。

也如WO 09/127691中所述，一般地，与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)相比，本发明的氨基酸序列将在位置3的下游(并且包括位置3)的部分中包含(在本文提出的总的限定中)一个或多个“氨基酸差异”(如本文定义)，从而使得到的本发明的氨基酸序列与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)相比，更好地结合(如本文定义)人血清白蛋白。例如，所述取代可以是在位置3处的R和/或在位置5处的W，如在WO 09/127691中所述。

一般地，并且在本文提出的总的限定中，与SEQ ID NO：1的序列比较，所述氨基酸差异可以在一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代。通常，与SEQ ID NO：1的序列比较，本发明的氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代(如本文提及的那些)；和任选地还包含一个或多个氨基酸插入和/或一个或多个氨基酸缺失。

基于本文的公开内容，适合的取代，插入和/或缺失(及其组合)对于技术人员是清楚的，并且例如包括在WO 09/127691中所述的肽(参见，例如，在WO 09/127691的SEQ ID NOs：2-115和SEQ ID NO’s：147-157中和图1)中存在的取代、插入和/或缺失中的一个或多个，或这些取代、插入和/或缺失的任何适合的组合。

下表I中列举可以在本发明的氨基酸序列的位置3处和更下游(与SEQ ID NO：1的氨基酸序列比较)存在的一些优选、但非限制性的可能的取代的实例(应该理解，本发明的氨基酸序列，在本文提出的限定中，可以包含一个或多个其他适合的氨基酸取代、插入或缺失)。

应该注意，在本发明的最优选的氨基酸序列中，位置3最优选地是R，位置5是W(优选地与位置6的D组合)；位置7优选地是F(但也可以是Y或W)；位置15是P并且位置16是V。

通过比较，在SEQ ID NO：1的序列中，位置3是S；位置5是S；位置7是Y；位置15是D，位置15是D；位置16是F。

本发明的最优选的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的序列共有下列残基：在位置4的Y(尽管，在本发明的序列中，这也可以是F，W，S或D)；在位置6的D；在位置8-13的DVFGGG模体(尽管在本发明的优选序列中这也可以是DAFGGG)，和在位置14的T；以及在位置17的G。

表I：可以在本发明的氨基酸序列中存在的可能的取代的实例(从位置3和更下游开始，其中位置3上游的氨基酸残基如本文进一步所述)。

任选地，基于本文和WO 09/127691中的公开内容，技术人员也将能够通过有限的试错试验(trail-and-error)的方式，例如通过测试包含目的取代、插入和/或缺失的候选氨基酸序列对人血清白蛋白的结合，例如使用本文以及WO 09/127691的实施例2和/或实施例3和/或本文的实施例2所述的测定法确定其他(或另外的)适合的取代、插入和/或缺失(或其组合))(其中接着可以将所述候选氨基酸序列任选地与SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或来自WO 09/127691的一个或多个氨基酸序列进行比较)。

同样地，从位置3以及更下游开始，本发明的氨基酸序列优选地如本文进一步所述。因此，例如，所述氨基酸序列优选地包含：(i)Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn (N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或(ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；和/或(iii)序列模体GGG；并且优选地(i)，(ii)和(iii)中的至少任意两项并且更优选地所有三项。具体地，所述氨基酸序列优选(至少)包含：(i)序列模体RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选是W，Y，F，S或D；和/或(ii)序列模体GGG，优选是序列模体FGGG(SEQ IDNO：6)，更优选是序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，并且特别地是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且最优选地是这些序列模体(i)和(ii)两者。

一般地，当与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)相比，本发明的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代时，这些可以是保守氨基酸取代(如本文定义)或非保守氨基酸取代(技术人员应该理解，适合的非保守氨基酸取代通常将更可能提高，或进一步提高与人血清白蛋白的结合)。

取代还可以是一种或多种这样的取代，即，当本发明的氨基酸序列或肽在宿主生物体中表达(按原样表达或作为本发明的化合物或多肽的一部分表达)时，所述取代允许和/或促进、或防止和/或减少本发明的氨基酸序列或肽的翻译后修饰。技术人员应该清楚，所述翻译后修饰(以及能够允许/促进或防止/减少其的取代)将取决于其中表达所述氨基酸序列、肽、化合物或多肽的宿主生物体(并且在一些情形中，还取决于表达系统)。所述翻译后修饰的一些非限制性的实例是(酶/蛋白水解)裂解、氧化事件、焦谷氨酸形成、磷酸化、和/或天冬氨酸或天冬酰胺的异构化或脱酰胺化(所有这些通常是不需要的，因此在本发明中，可以在本发明的肽中引入防止或减少此类翻译后修饰的突变)、以及糖基化(其可能是不需要的，在这样的情形中可以引入防止或减少糖基化的突变，例如，去除糖基化位点；或者在一些情形中其可能是需要的，在这样的情形中，可以引入允许或促进糖基化的突变，例如，通过引入糖基化位点)。同样地，技术人员应该清楚，可能发生的翻译后修饰取决于所用的宿主生物体和表达系统，并且技术人员能够选择适当的突变，任选地在有限的试错试验后选择。

技术人员还应该清楚，在需要防止或减少某些翻译后修饰的情形中，可以通过在不能进行此类翻译后修饰的宿主或宿主生物体中表达本发明的氨基酸序列、肽、化合物或多肽而实现。例如，在需要防止或减少糖基化的情形中，可以在细菌菌株如大肠杆菌(E.Coli)或在宿主生物体的糖基化缺陷突变体中表达本发明的氨基酸序列、肽、化合物或多肽(任选地，与本文所指出的一种或多种取代组合，尽管这可能不是必需的)，所述宿主生物体否则将会糖基化本发明的氨基酸序列、肽、化合物或多肽中的特定位点。

例如，并且非限制性地，在本发明的一个方面中，本发明的氨基酸序列、肽、化合物或多肽可以在适当的酵母菌株中表达，所述酵母菌株如适当的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，适当的曲霉菌属(Aspergillus)菌株和特别是适当的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株(优选的)。例如，这可以是适于表达、制备或生产要用于给药于人的蛋白或(多)肽的任意适当的酿酒酵母、曲霉菌属或毕赤酵母菌属(Pichia)菌株(优选的)，并且技术人员清楚其实例(包括，例如，并且非限制性地，它们的适当的蛋白酶缺陷菌株)。

因此，作为本发明中可以防止或减少的翻译后修饰的一个非限制性的实例，当位置14处存在苏氨酸(T)残基时并且当在位置14处的所述苏氨酸残基在目标宿主生物体(如巴斯德毕赤酵母菌株)中易于磷酸化时，防止或减少所述磷酸化可以是可能的或合乎需要的，例如，通过用在所述宿主生物体中较不易于或(基本上)不易于磷酸化的氨基酸残基替换苏氨酸来进行。例如，并且非限制性地，当宿主生物体是巴斯德毕赤酵母菌株时，位置14处的苏氨酸(T)可以替换为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)残基。其中位置14处的苏氨酸已被这样替代的本发明的氨基酸序列的一些优选的但非限制性的实例为89D03V1(SEQ ID NO：103，其包含突变14T→14A)，89D03V2(SEQ ID NO：104，其包含突变14T→14N)和89D03V3(SEQ ID NO：105，其包含突变14T→14A和另外的突变8D→8T)。

备选地，可以通过在在其中不磷酸化(或较小程度磷酸化)所述苏氨酸残基的另一种宿主生物体或毕赤酵母属菌株中表达所述氨基酸序列/肽(或包含其的化合物)而防止或减少所述磷酸化。SEQ ID NO’s：103-108给出了对磷酸化较不敏感的本发明的氨基酸序列的一些优选的但非限制性的实例。

可以通过引入适合的氨基酸取代、插入和/或缺失(或其组合)来提供本发明的其他氨基酸序列，如本文和/或WO 09/127691中进一步所述。同样地，这些可以是保守氨基酸取代(如本文定义)或非保守氨基酸取代(技术人员应该理解适合的保守氨基酸取代将通常更可能确保保持或甚至改善对人血清白蛋白的有利的结合)。

从本文的公开内容，清楚的是与SEQ ID NO：1的序列比较，从位置3向前以及更下游处，本发明的氨基酸序列优选地在位置4，6，7，8，9，10，12，13，14或17不包含氨基酸取代或缺失(并且优选地也没有插入)；或与SEQ ID NO：1的序列比较仅含有有限数目(即3个、2个或优选地仅1个)氨基酸取代或缺失(其然后优选地是如本文定义的保守取代)。由在WO09/127691的实施例4中所述的丙氨酸扫描实验可见，对于此的原因是，清楚的是引入氨基酸取代或缺失(尽管本发明的范围不排除)可能带来减少与人血清白蛋白结合的增加的风险。

在另一个优选的但非限制性方面中，从位置3向前以及更下游处，本发明的氨基酸序列优选地包含至少一个脯氨酸残基，如1，2，3或4个脯氨酸残基。特别地，本发明的氨基酸序列可以在位置1，2，3，5，11，15，16或18(并且特别在3，5，15，16和/或18)中的一个或多个(如任意一个，两个，三个或四个)包含一个或多个脯氨酸残基。脯氨酸残基也可以紧挨这些位置插入或在这些位置的附近插入。

根据一个优选的但非限制性的方面，与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，从位置3向前以及更下游处，本发明的氨基酸序列可以包含一个或多个(如任意两个，任意三个，任意四个或全部五个)的下列氨基酸取代：

-在SEQ ID NO：1的位置3处的丝氨酸残基(S)被选自精氨酸(R)，脯氨酸(P)，芳族氨基酸残基(F，Y，W或H；特别是F，Y或W)或疏水氨基酸残基(L，I，V或M)的氨基酸残基取代；

和/或

-在SEQ ID NO：1的位置5处的丝氨酸残基(S)被选自精氨酸(R)，脯氨酸(P)或芳族氨基酸残基(F，Y，W或H；特别是F，Y或W)的氨基酸残基取代；

和/或

-在SEQ ID NO：1的位置15处的天冬氨酸残基(D)被选自脯氨酸(P)或小氨基酸残基(A，G，S或T)的氨基酸残基取代；

和/或

-在SEQ ID NO：1的位置16处的苯丙氨酸残基(F)被脯氨酸(P)，疏水性氨基酸残基(L，I，V或M)，或小的氨基酸残基(A，G，S或T)取代；

和/或

-在SEQ ID NO：1的位置18的脯氨酸残基(P)保持不变或被(部分)带负电的氨基酸残基(D，E，Q或N)或小的氨基酸残基(A，G，S或T)取代；

和任选地一个或多个其他适合的氨基酸插入、缺失和/或取代(如本文进一步所述)。

在本发明的氨基酸序列的特别优选的亚类中，与在SEQ ID NO：1的位置3处的丝氨酸残基(S)相比较，在位置3处的丝氨酸残基(S)被精氨酸(R)取代。这些氨基酸序列可以包含如本文所述的一个或多个其他氨基酸插入、缺失和/或取代。

特别地，从位置3向前以及更下游处，在位置3处具有R的本发明的氨基酸序列中：

-在SEQ ID NO：1的位置5处的丝氨酸残基(S)被选自脯氨酸(P)或芳族氨基酸残基(F，Y，W或H；特别是F，Y或W)的氨基酸残基取代；和/或

-在SEQ ID NO：1的位置15处的天冬氨酸残基(D)被选自脯氨酸(P)或小的氨基酸残基(A，G，S或T)的氨基酸残基取代；和/或

-在SEQ ID NO：1的位置16处的苯丙氨酸残基(F)被脯氨酸(P)，疏水氨基酸残基(L，I，V或M)，或小的氨基酸残基(A，G，S或T)取代；和/或

-在SEQ ID NO：1的位置18处的脯氨酸残基(P)保持不变或被(部分地)带负电的氨基酸残基(D，E，Q或N)或小的氨基酸残基(A，G，S或T)取代；

以及任选地一个或多个其他适合的氨基酸插入、缺失和/或取代(如本文进一步所述)。

在本发明的氨基酸序列中一些优选的氨基酸序列是SEQ ID NO：54-77的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2-115和/或SEQ ID NO’s：54-77的氨基酸序列之一具有不超过3个，如3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列(其中所述氨基酸差异优选地如本文关于本发明的氨基酸序列一般所述)。

在本发明的氨基酸序列中一些更优选的氨基酸序列是表II的氨基酸序列，其以优于30nM，优选等于或优于20nM的亲和力结合人血清白蛋白(本身和/或作为与2D3的融合体)；或是与这些氨基酸序列之一具有不超过3个，如3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列(其中所述氨基酸差异优选地如本文和/或WO 09/127691中一般所述)，并且其同样以优于30nM，优选等于或优于20nM的亲和力结合人血清白蛋白(本身和/或作为与2D3的融合体)。

同样地，本发明的上述氨基酸序列全部优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

本发明的氨基酸序列还可以以这样的肽的形式提供和/或使用，其中所述氨基酸序列在C端，N端或两端连接于小的侧翼序列(例如不超过10个、优选不超过5个氨基酸残基)。例如，这些可以存在，原因在于本发明的氨基酸序列(或其中存在所述氨基酸序列的本发明的化合物)已经通过表达相应的核苷酸序列而获得，其中编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列在编码限制性位点或形成克隆位点部分的小核苷酸序列(其导致在表达的肽中存在侧翼序列)之后(即，所述小核苷酸序列在5’-末端)和/或之前(即，所述小核苷酸序列在3’-端)。所述侧翼序列的实例是氨基酸序列GSA和AAA。

本文所述的氨基酸序列可以以“非约束”形式(“non-constrained”format)(即，不包含任何二硫键)结合血清白蛋白，并且可以有利地以所述非约束形式使用。然而，包含在本发明的范围内的是本文所述的氨基酸序列以“约束”形式(例如以肽的形式存在，其中本发明的氨基酸序列侧邻两个在它们之间可以形成二硫键的侧翼序列)提供和/或使用(对于其进一步的描述，参考PCT/EP2007/063348)。

本发明的氨基酸序列优选地是这样的，以致其以不(显著)减少血清白蛋白分子的半衰期的方式结合血清白蛋白(并且特别是人血清白蛋白)。

优选地，本发明的氨基酸序列结合血清白蛋白或其至少一部分、片段、表位或结构域；和特别地结合人血清白蛋白或其至少一部分、片段、表位或结构域。当本发明的氨基酸序列结合(人)血清白蛋白时，其优选地能够结合血清白蛋白上不参与(人)血清白蛋白与FcRn的结合的氨基酸残基；和/或能够结合血清白蛋白上不形成(人)血清白蛋白的结构域III的部分的氨基酸残基。参考WO 06/0122787。

一般地，本发明的氨基酸序列是这样的，以致它们比SEQ ID NO：1的氨基酸序列更好地结合人血清白蛋白。优选地，本发明的氨基酸序列是这样的，以致它们与SEQ ID NO：75，76和/或77的氨基酸序列(其是取自WO 09/127691的参照化合物)中至少一个且优选所有三种相比，同等好地或更好地结合人血清白蛋白。如所述，“结合”如本文所述可以具体地使用WO 09/127691中的实施例3或实施例9中所述的溶液结合竞争测定法确定；或者，当氨基酸序列如WO 09/127691中的实施例7或10所述表达为与纳米抗体2D3的融合体时，以这些实施例中或本文的实施例2中所述的Biacore测定法确定。

本发明的氨基酸序列优选具有12-35个氨基酸残基，如15-32个氨基酸残基，例如15-27个且特别是17，18，19，20，21，22，23，24或25个氨基酸残基的总尺寸。

此外，优选地，本发明的氨基酸序列是这样的，即当它们连接或融合于治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体时，与其中所述治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相对应的化合物或构建体相比，并且优选地与包含SEQID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，不是本发明的氨基酸序列)的相对应的化合物或构建体相比，这样得到的本发明的化合物(如本文定义)具有更长的半衰期(如本文定义)。这可以特别地通过将本发明的氨基酸序列以如WO 09/127691的实施例6或实施例10所述的方式融合于纳米抗体2D3(也参见下述实施例2)，接着通过如WO 09/127691的实施例7或实施例13中所述确定药物代谢动力学模式(也参见下述实施例2)来进行确定。

特别地，在优选的方面中，本发明的氨基酸序列是这样的，即，当它们连接或融合于治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体时，这样得到的本发明的化合物(如本文定义)与其中所述治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合于SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种的相应化合物或构建体(其是取自WO 09/127691的参照化合物)相比，具有相似的或更长的半衰期(如本文定义)。

本发明的氨基酸序列优选地还与来自除人之外的至少一个哺乳动物物种的血清白蛋白具有交叉反应性(如本文定义)；特别地，与来自食蟹猴的血清白蛋白具有交叉反应性。

一般地，本发明的氨基酸序列也优选是这样的，即它们与SEQ IDNO：1的肽和/或与SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种(其是取自WO 09/127691的参照化合物)竞争，和/或是这样的，即它们交叉阻断(如本文定义)SEQ ID NO：1的肽与人血清白蛋白的结合和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种与人血清白蛋白的结合。

本发明的氨基酸序列(且特别地，它们的序列自位置3以及更下游的部分)优选是这样的，即它们可以与人血清白蛋白的一个或多个下列氨基酸残基结合(编号如实施例8中所述)：Asn(N)133；Pro(P)134；Asn(N)135；Leu(L)136；Leu(L)139；Arg(R)141；Tyr(Y)162；Glu(E)165；Ile(I)166；His(H)170；Phe(F)173；Phe(F)181；Gly(G)213；Lys(K)214；Ser(S)217；Gln(Q)483；和/或Lys(K)543；和/或是这样的，即它们可以与SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种竞争与这些氨基酸残基中的一个或多个的结合；和/或是这样的，即它们可以交叉阻断SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种与这些氨基酸残基中的一个或多个的结合。

更特别地，本发明的氨基酸序列(且特别地，它们的序列自位置3以及更下游的部分)优选是这样的，即它们可以结合于人血清白蛋白上的表位，所述表位包含：(i)包含残基Asn(N)133；Pro(P)134；Asn(N)135；Leu(L)136；Leu(L)139和Arg(R)141的氨基酸残基片段；和/或(ii)包含残基Tyr(Y)162；Glu(E)165；Ile(I)166；His(H)170；Phe(F)173；Phe(F)181的氨基酸残基片段；和/或(iii)包含残基Gly(G)213；Lys(K)214和Ser(S)217的氨基酸残基片段；和/或是这样的，即它们可以与SEQ IDNO：1的氨基酸序列和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种竞争与这些氨基酸残基片段之一的结合；和/或是这样的，即它们可以交叉阻断SEQ ID NO：1的氨基酸序列与这些氨基酸残基片段中的一个或多个的结合和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种与这些氨基酸残基片段中的一个或多个的结合。

甚至更特别地，本发明的氨基酸序列优选是这样的，即它们可以结合于人血清白蛋白上的疏水性亚口袋，所述疏水性亚口袋包含(特别地)残基Leu(L)139，Glu(E)165，Ile(I)166，His(H)170，Phe(F)173，Phe(F)181，Gly(G)213，Lys(K)214，Ser(S)217和Gln(Q)483；和/或是这样的，即它们可以与SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种竞争与该亚口袋的结合；和/或是这样的，即它们可以交叉阻断SEQ ID NO：1的氨基酸序列与该亚口袋的结合和/或SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的至少一个且优选所有三种与该亚口袋的结合。

并且，本发明的氨基酸序列(且特别地，它们的序列在位置3上游的部分)优选进一步是这样的，以致其可以结合人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个(编号如实施例8所示)：D131，N133，N135，V442，S443，P445，T446，E449，L484，L487，H488，K490，T491，V493和/或I547，并且特别是人血清白蛋白上的疏水亚口袋(形成人血清白蛋白上的疏水亚口袋的一个或多个氨基酸序列)，所述人血清白蛋白上的疏水亚口袋包括氨基酸V442，S443，T446，E449，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493；和/或是这样的，以致它们可以与表II提及的氨基酸序列中的至少一个(且特别是SEQ ID NO’s：56，59，68，69，70，71，72和/或74的序列中的至少一个)竞争与这些氨基酸残基中的一个或多个的结合；和/或是这样的，以致它们可以交叉阻断表II提及的氨基酸序列中的至少一个(且特别是SEQ ID NO’s：56，59，68，69，70，71，72和/或74的序列中的至少一个)与人血清白蛋白上这些氨基酸残基中的一个或多个的结合。

因此，本发明还涉及可以结合人血清白蛋白的氨基酸序列，并且其是这样的，以致它们如前述段落中关于竞争结合人血清白蛋白和/或关于交叉阻断与人血清白蛋白的结合所述。同样地，所述氨基酸序列可以如本文进一步所述.

在一个具体的方面中，本发明不包含在PCT/EP2007/063348的图4或图8中提及的氨基酸序列。

本发明的氨基酸序列(或包含至少一个所述氨基酸序列的本发明的化合物，如本文进一步所述)优选是这样的，即它们可以这样结合血清白蛋白，并且特别是结合人血清白蛋白：

-其解离常数(K_D)在10^-5-10^-12摩尔/升以下的范围内，优选地在10^-7-10^-12摩尔/升以下的范围内，并且更优选地在10^-8-10^-12摩尔/升的范围内(即，其缔合常数(K_A)在10⁵-10¹²升/摩尔以上的范围内，并且优选地在10⁷-10¹²升/摩尔以上的范围内，并且更优选地在10⁸-10¹²升/摩尔的范围内)，以致所述解离常数与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ IDNO：1)结合人血清白蛋白的解离常数相比更好(即，更小/更低)；和/或

-其k_on-速率在10²M^-1s^-1到约10⁷M^-1s^-1范围内，优选地在10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1范围内，更优选地在10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1范围内，如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1范围内，以致所述k_on-速率与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)结合人血清白蛋白的k_on-速率相比更好(即，更高)；

和/或

-其k_off速率在1s^-1(t_1/2＝0.69s)-10^-6s^-1之间(假设具有多天的t_1/2的接近不可逆的复合物)，优选地在10^-2s^-1-10^-6s^-1范围内，更优选地在10^-3s^-1-10^-4s^-1范围内，如在10^-4s^-1-10^-6s^-1的范围内，以致所述k_off-速率与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)与人血清白蛋白结合的k_off-速率相比更好(即，更高)。

优选地，本发明的氨基酸序列(或包含一种所述氨基酸序列的本发明化合物，如本文进一步所述)是这样的，即其以小于1000nM，优选地小于500nM，优选地小于200nM，优选地优于50nM，更优选地优于30nM，如等于或优于20nM的亲和力结合人血清白蛋白，同样地，使用WO09/127691的实施例3或实施例9所述的溶液结合竞争测定法确定；或者，当所述氨基酸序列以与纳米抗体2D3的融合体表达时，如在WO09/127691的实施例7或10中所述，以这些实施例中和/或在本文实施例2中所述的Biacore测定法确定。

本发明的氨基酸序列(以及包含其的本发明的化合物，如本文定义)优选是这样的，即它们以这样的方式结合或否则缔合于人血清白蛋白，即当所述氨基酸序列(或化合物)结合于或否则缔合于人中的人血清白蛋白时，其显示的血清半衰期是人中人血清白蛋白的天然半衰期的至少约50％(如约50％-70％)，优选地至少60％(如约60％-80％)，或优选地至少70％(如约70％-90％)，更优选地至少80％(如约80％-90％)，或优选地至少约90％。

本发明的氨基酸序列可以以条件式方式结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)(如在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请PCT/EP2007/060850中所述)，即从而使：

a)它们在第一生物学条件下以10^-5摩尔/升以下的解离常数(K_D)结合人血清白蛋白分子；和

b)它们在第二生物学条件下以这样的解离常数(K_D)结合人血清白蛋白，所述解离常数与在所述第一生物学条件下所述氨基酸序列结合所述期望的分子的解离常数至少10倍不同(并且特别是10倍多)，其中，所述第一和第二生物学条件可以如在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请PCT/EP2007/060850中所述。特别地，如在国际申请PCT/EP2007/06085中所述，所述第一生物学条件和第二生物学条件可以在pH上不同，其中所述第一生物学条件可以包含大于7.0的生理学pH，例如大于7.1的pH或大于7.2的pH，如在7.2-7.4范围内的pH；并且所述第二生物学条件可以包含低于7.0的生理学pH，例如低于6.7的pH或低于6.5的pH，如在6.5-6.0范围内的pH(或反之亦然)。

然而，优选地，本发明的氨基酸序列可以以“基本不依赖于pH”的方式结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)(如在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请PCT/EP2007/060849中所述，并且如本文进一步定义)。

在一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列优选地与来自至少一个其他哺乳动物物种，如来自小鼠、兔、大鼠或灵长类动物的血清白蛋白具有交叉反应性(如本文定义)。特别地，本发明的氨基酸序列可以与来自灵长类动物的血清白蛋白具有交叉反应性，并且优选地至少与食蟹猴血清白蛋白具有交叉反应性，所述灵长类动物选自由来自猕猴属(Macaca)的猴子(如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))组成的组。此外，当本发明的氨基酸序列与来自所述灵长类动物物种的血清白蛋白具有交叉反应性时，其优选地是这样的，即当其与所述灵长类动物中的血清白蛋白分子结合或缔合时，其显示的血清半衰期为所述灵长类动物中所述血清白蛋白的天然半衰期的至少约50％(如约50％-70％)，优选地至少约60％(如约60％-80％)，或优选地至少约70％(如约70％-90％)，更优选地至少约80％(如约80％-90％)，或优选地至少约90％。

本发明还涉及包含至少一个本发明的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分的化合物或构建体(在本文也称为“本发明的化合物”)。这些化合物或构建体可以如本文进一步所述，并且可以例如是这样的多肽或蛋白构建体，其包含本发明的至少一个氨基酸序列或基本由其组成，所述氨基酸序列任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂连接至少一个治疗性结构部分。所述多肽或蛋白构建体可以例如(但不限于)是融合蛋白，如本文进一步所述。

本发明的所述化合物可以包含一个、两个、三个或更多个本发明的氨基酸序列，其任选地通过一个或多个适合的接头(如本文所述)适当地连接所述至少一个治疗性结构部分(并且任选地彼此连接)。此外，当本发明的化合物包含两个，三个或更多个本发明的氨基酸序列时，这些可以是相同的或不同的。

在一个具体的方面中，本发明的所述化合物可以包含一个本发明的氨基酸序列，其任选地通过一个或多个适当的接头(如本文所述)适当地连接所述至少一个治疗性结构部分。例如，在这样的情形中，当所述治疗性结构部分是蛋白或多肽(从而使本发明得到的化合物是融合蛋白)时，本发明的氨基酸序列可以连接于所述治疗性结构部分的C端或所述治疗性结构部分的N端(同样，任选地通过适合的接头连接)。

在另一个具体方面，所述本发明的化合物可以包含两个本发明的氨基酸序列，其任选地通过一个或多个适合的接头(如本文所述)适当地连接所述至少一个治疗性结构部分(并且任选地彼此连接)。

更具体地，本发明的所述化合物可以包含两个本发明的氨基酸序列，所述氨基酸序列分别适当地连接所述至少一个治疗性结构部分(即，在所述治疗性结构部分的不同连接位点)，所述连接也任选地通过适合的接头进行。例如，在这种情形中，当所述治疗性结构部分是蛋白或多肽(从而使本发明得到的化合物是融合蛋白)时，本发明的一个氨基酸序列可以例如连接于所述治疗性结构部分的C端(同样，任选地通过适合的接头连接)，并且本发明的一个氨基酸序列可以例如连接于所述治疗性结构部分的N端(同样，任选地通过适合的接头连接)。

备选地，所述本发明的化合物可以包含彼此连接(同样，任选地通过适合的接头连接)的本发明的两个(或两个以上)氨基酸序列从而形成“串联重复”，所述串联重复接着可以适当地连接所述至少一个治疗性结构部分(同样，任选地通过适合的接头连接)。例如，在这样的情形中，当所述治疗性结构部分是蛋白或多肽(从而使本发明得到的化合物是融合蛋白)时，本发明的两个或多个氨基酸序列的串联重复可以连接于所述治疗性结构部分的C-端或所述治疗性结构部分的N端(同样，任选地通过适合的接头连接)。

基于本文的公开内容，本发明的两个或更多个氨基酸序列和一个或多个治疗性结构部分的其他适合的组合(同样，任选地通过适合的接头连接)对于技术人员是清楚的。

在另一个方面中，本发明的化合物包含两个以上(如两个，三个或四个)治疗性结构部分(其可以是相同的或不同的)，和一个或多个(如两个，三个，四个或更多个)本发明的氨基酸序列(其也可以是相同的或不同的)，其中两个以上(如两个，三个或四个)治疗性结构部分和/或一个或多个(如两个，三个，四个或更多个)本发明的氨基酸序列可以适当地彼此连接(同样，任选地通过一个或多个适合的接头连接)，从而形成本发明的化合物。例如，在本发明的所述化合物中，所述两个以上的治疗性结构部分可以适当地彼此连接(同样，任选地通过一个或多个适合的接头连接)，并且一个或多个本发明的氨基酸序列(和/或本发明的两个以上氨基酸序列的一个或多个串联重复，如本文所述)可以连接于(同样，任选地通过一个或多个适合的接头)任何(或全部)治疗性结构部分。

此外，在另一个方面中，用于将两个以上的治疗性结构部分彼此连接的一个或多个接头可以包含一个或多个本发明的氨基酸序列，并且包含一个或多个本发明的氨基酸序列的这样的接头(任选地包含将本发明的氨基酸序列彼此连接和/或将其与一个或多个治疗性结构部分连接的一个或多个其他的连接氨基酸序列)形成本发明的另外的方面。

例如，当本发明的化合物包含两种治疗性结构部分(其可以是相同的或不同的)时，本发明上述化合物可能的但非限制性构型的一些实例是：

[TM]-[L]-[AA]-[L]-[TM]

[AA]-[L]-[TM]-[L]-[TM]

[TM]-[L]-[TM]-[L]-[AA]

[TM]-[L]-[AA]-[L]-[AA]-[TM]

[AA]-[L]-[TM]-[L]-[TM]-[L]-[AA]

[AA]-[L]-[AA]-[TM]-[L]-[TM]

[TM]-[L]-[TM]-[L]-[AA]-[AA]

[AA]-[L]-[TM]-[L]-[AA]-[L]-[TM]-[L]-[AA]

[AA]-[L]-[TM]-[L]-[AA]-[L]-[AA]-[L]-[TM]-[L]-[AA]

其中“[TM]”指治疗性结构部分，“[L]”指接头(其在每种情形中是任选的)，并且“[AA]”指本发明的氨基酸序列。基于本文的公开内容，其他适合的构型对于技术人员是清楚的。同样地，在这些构建体中，当存在两个以上的接头和/或本发明的氨基酸序列时，这些可以是相同的或不同的。同样地，当所述治疗性结构部分和接头是蛋白或(多肽)时，上述构建体可以是融合蛋白或融合构建体(例如，其可以通过适当表达相应的核酸或核苷酸序列适当地获得)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的多肽构建体，其包含两个以上(并且特别是两个或三个，并且优选地是两个)本发明的氨基酸序列，其中在所述多肽中存在的两个以上的本发明的氨基酸序列可以是相同的或不同的；其中所述两个以上的本发明的氨基酸序列可以直接彼此连接，或通过适合的接头彼此连接(如本文进一步所述)。本发明的所述“串联重复”构建体同样可以以与本发明的单一氨基酸序列相同的方式连接一个或多个治疗性结构部分。在一些情形中，串联重复的应用可以提供针对人血清白蛋白的提高的(甚至进一步提高的)亲和性(与本发明的单一氨基酸序列的应用比较)和/或为包含所述串联重复的本发明的化合物提供提高的(甚至进一步提高的)半衰期(与包含本发明的单一氨基酸序列的本发明的化合物比较)。所述串联重复的应用和包含所述串联重复的本发明的化合物的非限制性实例在实施例14中给出。此外，如本文所述，所述串联重复构建体可以用作接头。

所述串联重复优选地包含两个以上的优选的本发明的氨基酸序列(其可以是相同的或不同的)，和特别地是特别优选的本发明的氨基酸序列，如(例如)表II中提及的那些，且特别是表II中提及的以小于30nM且优选小于20nM的亲和力结合(其本身和/或作为与2D3的融合体)的那些。本发明还涉及这样的化合物和构建体，其包含所述串联重复(其同样可以是融合蛋白)；涉及编码所述融合蛋白的所述串联重复的核苷酸序列或核酸，并且涉及所述串联重复的应用(例如延长半衰期和/或作为接头)。

因此，在另一个方面中，本发明涉及这样的多肽构建体，其包含两个以上(并且具体地，两个或三个，并且优选地两个)本发明的氨基酸序列，其中在所述多肽中存在的两个以上的本发明的氨基酸序列可以是相同的或不同的；并且其中所述两个以上的本发明的氨基酸序列可以直接彼此连接，或通过适合的接头彼此连接(如本文进一步所述)；并且其中存在的每个氨基酸序列：

a)是SEQ ID NO：54-74的氨基酸序列中的一种；或

b)与SEQ ID NO：54-74中至少一个氨基酸序列具有至少65％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少75％，如至少80％，例如至少85％或至少90％的序列同一性；和/或

c)与SEQ ID NO：54-74中至少一个氨基酸序列具有不超过6个，优选地不超过5个，特别是不超过4个，如3个、2个或1个氨基酸差异(如本文定义)；

并且优选地：

d)以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

同样地，在所述串联重复中存在的氨基酸序列可以如本文进一步所述，并且所述串联重复可以以本文所述的方式连接一个或多个治疗性结构部分。

因此，在另一个方面中，本发明涉及这样的多肽构建体，其包含两个以上(并且特别是两个或三个，并且优选地两个)本发明的氨基酸序列，其中在所述多肽中存在的两个以上的本发明的氨基酸序列可以是相同的或不同的；并且其中所述两个以上的本发明的氨基酸序列可以直接彼此连接，或通过适合的接头彼此连接(如本文进一步所述)；并且其中存在的每个氨基酸序列：

a)是SEQ ID NO’s：56，59，64，68，69，70，71，72或74的氨基酸序列中的一种；并且优选是SEQ ID NO’s：56，59，68，70，72或74的氨基酸序列中的一种；

b)与SEQ ID NO’s：56，59，64，68，69，70，71，72或74的氨基酸序列中的至少一个，且优选与SEQ ID NO’s：56，59，68，70，72或74的氨基酸序列中的一个具有至少65％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少75％，如至少80％，例如至少85％或至少90％的序列同一性；和/或

c)与SEQ ID NO’s：56，59，64，68，69，70，71，72或74的氨基酸序列中的至少一个，且优选与SEQ ID NO’s：56，59，68，70，72或74的氨基酸序列中的一个具有不超过6个，优选地不超过5个，特别是不超过4个，如3个、2个或1个氨基酸差异(如本文定义)；

并且优选地：

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

存在于本发明的化合物中的至少一个治疗性结构部分优选地包含一种氨基酸序列或基本由一种氨基酸序列组成，并且可以特别地包含下述或基本由下述组成：免疫球蛋白序列或其抗原结合片段(例如，抗体或其抗原结合片段)，如免疫球蛋白可变结构域或其抗原结合片段(例如，V_H-结构域，V_L-结构域，V_HH-结构域或其抗原结合片段)；或含有其的蛋白或多肽(例如，scFv构建体)。关于这些构建体，例如参考Holliger和Hudson的综述，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36及其中所引用的其他现有技术。

根据一个具体的但非限制性的方面，所述治疗性结构部分包含(单)结构域抗体、“dAb”、或纳米抗体

或基本上由(单)结构域抗体、“dAb”、或纳米抗体

组成，并且优选包含纳米抗体或基本由纳米抗体组成(所述纳米抗体，如在WO 08/142164以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其他申请中所述，可以是V_HH，人源化V_HH或骆驼源化V_H如骆驼源化的人V_H)。

当一个或多个治疗性结构部分针对一个或多个药物相关靶标时，它们可以针对任何本身已知的适当靶标。例如，当治疗性结构部分包含(单)结构域抗体、“dAb”、或纳米抗体

或基本上由(单)结构域抗体、“dAb”、或纳米抗体

组成时，它可以例如是dAb或纳米抗体

IGN-γ(参见例如WO 04/041863)，IgE(参见例如WO 04/041867)，EGFR(参见例如WO05/044858；WO 07/066106或WO 07/080392)；vWF(参见例如WO04/062551或WO 06/1222825)；IGF-IR(参见例如WO 07/042289)；IL-6(参见例如WO 07/110219)；IL-6R(参见例如WO 08/020079)；GPCR’s(参见例如WO 08/074839)；趋化因子(参见例如WO 08/077945)；VEGF或其受体(参见例如WO 07/080392；WO 08/101985；WO 08/149147；WO08/149146；或WO 08/149150)；RANK-L(参见例如WO 08/142164)；IL-R1(参见例如WO 06/059108；WO 07/063311；WO 07/063308；或WO08/149149)；TNF-R1(参见例如WO 06/038027；WO 07/049017；WO08/149148或WO 08/149144)；IL-4或IL-13(参见例如WO 07/085815)；CD40L (参见例如WO 06/030220)。

所述治疗性结构部分还可以是具有已知治疗和/或药学作用的其他蛋白质或肽，如，例如并且非限制性地，GLP-1；胰岛素；EPO；人生长激素(例如，促生长素(somatropin))；干扰素，白细胞介素和(其他)细胞因子和/或用于癌症治疗的蛋白质药物。

在本发明的化合物中，一个或多个本发明的氨基酸序列可以直接连接于所述至少一个治疗性结构部分或可以通过一个或多个合适的接头或间隔臂连接于所述至少一个治疗性结构部分。例如基于本文的其他公开内容，合适的接头对于熟练技术人员来说将是显而易见的。一些优选的但非限制性的接头是在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请WO 08/020079的第127和128页提及的那些，并且包括其中提及的“gly-ser接头”。

当一个或多个治疗性结构部分是氨基酸序列时，所述接头或间隔臂优选地包含氨基酸序列或基本上由氨基酸序列组成，从而使得到的化合物或构建体基本上由(融合)蛋白或(融合)多肽(本文也称作“本发明的多肽”)组成。

在另一个方面中，本发明涉及包含至少一个本发明的氨基酸序列(如本文进一步所述)的本发明的化合物(如本文进一步所述)，其中所述本发明的化合物以优于100nM，优选优于50nM，更优选优于30nM，如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白。

在另一个方面中，本发明涉及包含至少一个本发明的氨基酸序列(如本文进一步所述)的本发明的化合物(如本文进一步所述)，其中所述本发明的化合物与相对应的化合物相比，具有更长的半衰期(如本文定义)，所述相对应的化合物不包含所述氨基酸序列，而是包含相同拷贝数的SEQ ID NO：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种。在另一个方面中，本发明涉及包含至少两个本发明的氨基酸序列的本发明的化合物。在另一个方面中，本发明涉及包含至少两个本发明的氨基酸序列的至少一个串联重复(如本文定义)的本发明的化合物。优选地，所述本发明的化合物与相对应的化合物相比，具有更长的半衰期(如本文定义)，所述相对应的化合物不包含所述氨基酸序列，而是包含相同拷贝数的SEQ ID NO：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种。

本发明的一些其他方面涉及下列肽。同样地，将所述肽结合到在本文中以其最广泛意义应用的术语“本发明的氨基酸序列”的含义中；并且这些肽优选地如本文关于本发明的氨基酸序列进一步所述。此外，同样地，按照下述方面所述的肽可以包含如本文所述的一种或多种取代，如(例如，并且不限于)表I列出的一种或多种取代。

因此，形成本发明的方面的一些其他的(非限制性的)肽为：

-按照下述方面(中的一个或多个)的肽，其包含序列模体SEQ IDNO’s：24-27或32-43中的一个，其中在位置14处的苏氨酸(T)残基已被替换为另一种氨基酸残基(优选但不限于，A，N或D)；

-按照下述方面(中的一个或多个)的肽，其包含序列模体SEQ IDNO’s：15，17-22或23-43中的一个，其中在位置8处的天冬氨酸(D)已被替换为苏氨酸(T)；

-按照下述方面(中的一个或多个)的肽，其包含序列模体SEQ IDNO’s：24-27或32-43中的一种，其中(i)在位置14处的苏氨酸(T)残基已被替换为另一种氨基酸残基(优选但不限于，A，N或D)，并且(ii)在位置8处的天冬氨酸(D)已被替换为苏氨酸(T)；

并且同样地，所述肽优选地如本文关于本发明的氨基酸序列进一步所述。特别地，如本文进一步所述，这些肽可以分别包含来自SEQ ID NO’s：131-148的相对应序列模体中的一种以分别替代SEQ ID NO’s：15，17-22或23-43的序列模体中的一种(例如，并且非限制性地，序列模体SEQ IDNO：131替代序列模体SEQ ID NO：15，或序列模体SEQ ID NO’s：134-139中的一种替代序列模体SEQ ID NO：19)。同样地，这些肽可以包含一种或多种其他适当的取代，如----例如并且不限于----表I列出的一种或多种取代。此外，同样地，这些肽结合到在本文中以其最广泛意义应用的术语“本发明的氨基酸序列”的含义中。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含Arg(R)残基；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含：这样的Arg(R)残基，所述Arg(R)残基能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133&Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含Trp(W)残基；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含：这样的Trp(W)残基，所述Trp(W)残基其能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含：Arg(R)残基；Trp(W)残基；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含：Arg(R)残基；芳族氨基酸残基，其能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用；和序列模体DVFGGG(SEQID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含：这样的Arg(R)残基，其能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133&Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用；Trp(W)残基，其能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用；和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，特别是序列模体DVFGGGT(SEQID NO：19)；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含氨基酸序列RXWDXDVFGGG(SEQ ID NO：23)，其中(自N-末端)第一个由X所示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X所示的氨基酸残基选自Y或F；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白，并且包含氨基酸序列RXWDXDVFGGGT(SEQ ID NO：24)，其中(自N-末端)第一个由X所示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X所示的氨基酸残基选自Y或F；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含氨基酸序列RXWDXDVFGGGTP(SEQ ID NO：25)，其中(自N-末端)第一个由X所示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X所示的氨基酸残基选自Y或F；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPG(SEQ ID NO：26)，其中(自N-末端)第一个由X所示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X所示的氨基酸残基选自Y或F；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(SEQ ID NO：27)，其中(自N-末端)第一个由X所示的氨基酸残基选自Y，S或D；并且第二个由X所示的氨基酸残基选自Y或F；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含选自下列各项的氨基酸序列：RYWDYDVFGGG(SEQID NO：28)；RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO：29)；RSWDFDVFGGG(SEQID NO：30)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO：31)；并且特别是选自RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO：29)；RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO：30)或RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含选自下列各项的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGT(SEQID NO：32)；RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：33)；RSWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：34)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：35)；并且特别是选自RDWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：33)；RSWDFDVFGGGT(SEQ IDNO：34)或RYWDFDVFGGGT(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含选自下列各项的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTP(SEQ ID NO：36)；RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：37)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：38)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ IDNO：39)；并且特别是选自RDWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：37)；RSWDFDVFGGGTP(SEQ ID NO：38)或RYWDFDVFGGGTP(SEQ IDNO：39)的氨基酸序列；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含选自下列各项的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTPV(SEQ ID NO：40)；RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：41)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：42)或RYWDFDVFGGGTPV(SEQ IDNO：43)；并且特别是选自RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：41)；RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO：42)或RYWDFDVFGGGTPV(SEQ IDNO：43)的氨基酸序列；并且在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并且包含序列模体RXWD(其中X选自W，Y，F，S或D)和序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)；并且其在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并包含序列模体RXWD(其中X选自W，Y，F，S或D)和序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)或DAFGGG(SEQ ID NO：192)；并且其在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白并包含序列模体RXWD(其中X选自W，Y，F，S或D)和序列模体DVFGGGT(SEQ ID NO：19)，DVFGGGS(SEQ ID NO：45)或DAFGGGT(SEQ ID NO：46)；并且其在位置3(和/或所述R残基)上游包含如本文所述的氨基酸残基片段(包括所述氨基酸残基片段的优选方面，也如本文所述)。

同样地，本发明的所有上述氨基酸序列优选是这样的，以致其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白(如使用Biacore确定的)，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

此外，当上述肽据说包含序列模体RXWD时，则(i)在该模体中的Arg(R)残基能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用；和/或(ii)在该模体中的Trp(W)残基能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用；并且优选地应用(i)和(ii)两者。

如所提及的，所有的这些肽可以如本文关于本发明的氨基酸序列进一步所述。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其特异于(如本文定义)人血清白蛋白，所述肽包含：

a)序列模体RXWD(其中X可以是任何氨基酸，但是最优选地选自W，Y，F，S或D)，其中(i)该模体中的Arg(R)残基能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用；和/或(ii)该模体中的Trp(W)残基能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用；和优选地应用(i)和(ii)两者；并且

b)在RXWD模体上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基片段，所述氨基酸残基片段包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(到)(人)血清白蛋白的亚口袋(中)，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

该肽优选地还包含序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)，更优选地序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)，和甚至更优选地序列模体DVGGGGT(SEQID NO：19)。此外，同样地，位置3上游的氨基酸残基片段可以如本文进一步所述，并且优选地按照本文所述的优选方面之一所述。

(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

在另一个方面中，本发明涉及这样的肽，其与SEQ ID NO：1的肽和/或与肽59F2(WO 09/127691：SEQ ID NO：149/本文中为SEQ ID NO：76)；59H12(WO 09/127691：SEQ ID NO：155/本文中为SEQ ID NO：77)；和/或59C2(WO 09/127691：SEQ ID NO：156/本文中为SEQ ID NO：75)中的一种或多种竞争结合人血清白蛋白，和/或交叉阻断(如本文定义)SEQ ID NO：1的肽与人血清白蛋白的结合和/或肽59F2(WO 09/127691：SEQ ID NO：149)；59H12(WO 09/127691：SEQ ID NO：155)；和/或59C2中的一种或多种与人血清白蛋白的结合；并且其以优于100nM、优选优于50nM、更优选优于30nM、如等于或优于20nM的亲和力(表示为K_D)结合人血清白蛋白，亲和力使用本发明的氨基酸序列本身测量或(优选)使用本发明的氨基酸序列与另一个蛋白或肽的融合体(例如，与纳米抗体(如本文用作实例的纳米抗体2D3)的融合体)测量。

所述肽可以如本文进一步所述。此外，并且特别地，上述肽可以分别与表II中所述的至少一个肽竞争与人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个的结合(编号如实施例8所示)：

-Asn(N)133；Pro(P)134；Asn(N)135；Leu(L)136；Leu(L)139；Arg(R)141；Tyr(Y)162；Glu(E)165；Ile(I)166；His(H)170；Phe(F)173；Phe(F)181；Gly(G)213；Lys(K)214；Ser(S)217；Gln(Q)483；和/或Lys(K)543；更特别是与人血清白蛋白上的表位的结合，所述表位包含：(i)包含残基Asn(N)133；Pro(P)134；Asn(N)135；Leu(L)136；Leu(L)139和Arg(R)141的氨基酸残基片段；和/或(ii)包含残基Tyr(Y)162；Glu(E)165；Ile(I)166；His(H)170；Phe(F)173；Phe(F)181的氨基酸残基片段；和/或(iii)包含残基Gly(G)213；Lys(K)214和Ser(S)217的氨基酸残基片段；甚至更特别地与人血清白蛋白上的疏水亚口袋的结合，所述疏水亚口袋包括(特别是)以下残基：残基Leu(L)139，Glu(E)165，Ile(I)166，His(H)170，Phe(F)173，Phe(F)181，Gly(G)213，Lys(K)214，Ser(S)217和Gln(Q)483；

和/或

-(人)血清白蛋白中氨基酸(亚口袋)片段，其包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

本发明还涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽的核苷酸序列或核酸(在本文还称为“本发明的核苷酸序列”或“本发明的核酸”)。

本发明还涉及包含本发明的核苷酸序列或核酸和/或表达(或能够表达)本发明的氨基酸序列或本发明的多肽的宿主或宿主细胞。

本发明还涉及制备本发明的氨基酸序列和化合物的方法，所述方法如本文进一步所述。

本发明还涉及这样的组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸序列或本发明的化合物；和任选地一种或多种其他适合的成分或组分。特别地，本发明涉及这样的药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸序列、本发明的化合物或本发明的核酸；和任选地至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂。

本发明还涵盖用于制备本发明的构建体和化合物的一些其他方法，所述方法一般包括将至少一个本发明的氨基酸序列与至少一个治疗性结构部分连接的步骤，所述连接任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂进行。这可以以本身已知的任何适合的方式进行，例如根据所用的接头(如果有的话)以本身已知的任何适合的方式进行，并且可以例如包括本领域本身已知的化学连接技术，例如通过形成一个或多个共价键。所述一个或多个本发明的氨基酸序列和一个或多个治疗性结构部分可以如本文进一步所述。同样地，所述一个或多个本发明的氨基酸序列优选地包含本文所述的二硫键。

本发明还涉及通过上述任一种方法得到的化合物或构建体；并且还涉及这样的药物组合物，其包含至少一种所述化合物或构建体以及任选地至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂。

本发明还涉及本发明的氨基酸序列的应用。一般地，这些应用通常包括本身已知的关于可以一般地结合血清蛋白，和特别是结合血清白蛋白的结合单位、结合结构域或氨基酸序列的任何应用。这样的应用对于技术人员是清楚的，并且不仅包括增加治疗性结构部分、实体或药物的半衰期；还(或另外)将治疗性结构部分、实体或药物定向于身体或组织的部分，在所述身体或组织的该部分存在血清白蛋白和/或血清白蛋白在体内积累，所述身体或组织的部分如炎症部位或关节。

本发明还涉及多肽或蛋白构建体或融合蛋白的治疗应用，并且涉及包含所述多肽或蛋白构建体或融合蛋白的药物组合物。

发明详述

在本申请的说明书、实施例和权利要求书中：

a)除非在本文中另外指出(例如，在实施例8中)，在本发明的氨基酸序列中的氨基酸残基和位置将参照在AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)中的相应氨基酸残基和位置编号。

b)除非在本文中(例如，在实施例8中)另外指出，氨基酸取代将参照在氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)中的相应位置存在的氨基酸残基提及。例如，S3R指与氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO：1)比较，在位置3处的丝氨酸残基S被取代为精氨酸(R)。

c)除非另外指出或定义，使用的所有术语具有它们在本领域中的一般含义，这些对于技术人员是清楚的。例如，参考在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 08/020079的第46页的段落a)中提及的标准手册，WO 08/020079题为“Amino acid sequence directed against IL-6R andpolypeptides comprising the same for the treatment ofdiseases and disordersassociated with Il-6mediated signalling(用于治疗与Il-6介导的信号传导相关的疾病和病症针对IL-6R的氨基酸的序列和包含其的多肽)”。

d)除非另外指出，术语“免疫球蛋白序列”、“序列”、“核苷酸序列”和“核酸”如在WO 08/020079的第46页上的段落b)中所述。

e)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经这样进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的一般背景技术，和参考其中所引用的其他参考文献；以及例如，参考下述综述：Presta，高级药物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)2006，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，分子生物系统(Mol.Biosyst.)2006，2(1)：49-57；Irving等.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等.，Placenta，2000，21增刊A，S106-12，Gonzales等，肿瘤生物学(TumourBiol.)，2005，26(1)，31-43，其描述用于蛋白质工程的技术，诸如亲和性成熟和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性以及其他所需特性的技术；

f)氨基酸残基按照标准的三字母或单字母的氨基酸密码表示，如在表A提及的；

表A：单字母和三字母氨基酸密码

g)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以如在WO 08/020079的第49页上的段落c)中所述(结合在本文中作为参考)而计算或确定，如通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算或确定，其中与第一核苷酸序列相比，在第二核苷酸序列中的核苷酸的每一个缺失、插入、取代或添加都视作在单一核苷酸(位置)上的差异；或使用也在WO 08/020079的第49页上的段落c)中所述的适合的计算机算法或技术(结合在本文中作为参考)来计算或确定。

h)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中的氨基酸残基的每一个缺失、插入、取代或添加都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本文所定义的“氨基酸差异”。

备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。

通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。

此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其他生物学特性具有很小或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO 04/037999，GB-A-3357768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其他参考文献的相关教导而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。

所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一种氨基酸被同组内的另一种氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。

应用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和高级酶学(Adv.Enzymol.)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，美国国家科学院学报(Proc.Nad.Acad Sci.USA)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.)157：105-132，1981，以及Goldman等，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.)15：321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本说明书中描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自然结构生物学(Nature Structural Biology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(Natural Structural Biology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama)的V_HH结构域的晶体结构。关于在常规V_H结构域中形成V_H/V_L界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其他信息可以在上文引用的现有技术中找到。

i)如果在氨基酸序列和核酸序列的全长有100％的序列同一性(如本文所定义)，则认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”。

j)当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两个氨基酸序列可以包含1个、2个或更多个这样的氨基酸差异。

k)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这具有在WO 08/020079的第51-52页上的段落i)中所给出的含义。

l)术语“以基本上分离的形式”具有在WO 08/020079的第52和53页上的段落j)中给出的含义。

m)术语“结构域”和“结合结构域”具有在WO 08/020079的第53页上的段落k)中给出的含义。

n)术语“抗原决定簇”和“表位”，其也可以在本文交替使用，具有在WO 08/020079的第53页上的段落l)中给出的含义。

o)如在WO 08/020079的第53页上的段落m)中所述，对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体

抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“抗(against)”或者“针对(directed against)”或“特异于”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。

p)术语“特异性”和“特异于”具有在WO 08/020079的第53-56页上段落n)中给出的含义；并且此处提及是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体

或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以基于亲和性和/或亲合力而确定，如在WO 08/020079的第53-56页中所述(结合在本文作为参考)，其还描述了用于测量在抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合的一些优选的技术。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列和/或化合物)将以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(K_A))而结合它们的抗原。任何大于10⁴摩尔/升的K_D值(或任何小于10⁴M^-1(升/摩尔)的K_A值)通常被认为指示非特异性结合。优选地，本发明的氨基酸序列或化合物将以小于1000nM、优选地小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM，如小于500pM的亲和力与所需的血清蛋白结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变体；以及本发明提及的其他技术。

如对于技术人员清楚的并且在WO 08/020079的第53-56页上所述，解离常数可以是实际或表观的解离常数。用于确定解离常数的方法对于技术人员是清楚的，并且例如包括在WO 08/020079的第53-56页上提及的技术。

q)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)而减少。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析来确定。适当的技术对于本领域的技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；从所述动物收集血液样品或其他样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及Dennis等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)277：35035-42(2002)，以及标准手册，诸如Kenneth，A等：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists(药物的化学稳定性：药剂师手册)和Peters等，Pharmacokineteanalysis：APractical Approach(药物动力学分子：实践方法)(1996)。还参考“Pharmacokinetics(药物动力学)”，M Gibaldi和D Perron，MarcelDekker出版，第2综述版(2nd Rev.edition)(1982)。

熟练的技术人员还应该清楚(例如，参见WO 04/003019的第6页和第7页以及其中引用的其他参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种或基本上所有这三种参数的增加。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。

r)在本发明的上下文中，“调节”(“modulating”或“to modulate”)通常意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的活性，该活性使用适当的体外、细胞或体内测定法测量。特别地，“调节”(“modulating”或“to modulate”)可以意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的(相关或目的)生物学活性，该活性使用适当的体外、细胞或体内测定法(其通常将取决于涉及的靶标或抗原)测量，与在相同条件但不存在本发明的构建体的条件下，在相同测定中的所述靶标或抗原的活性相比较，减少或抑制、或增加至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。

熟练的技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本发明的构建体的条件下相比较，对靶标或抗原对其配体、结合配偶体、缔合成同源多聚体或异源多聚体形式的配偶体、或底物中的一种或多种的亲和性、亲合力、特异性和/或选择性施加改变(其可以是增加或减少)；和/或对所述靶标或抗原对于介质或环境(所述靶标或抗原存在于其中)中的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在，等等)的敏感性施加改变(其可以是增加或减少)。技术人员应该清楚，取决于所涉及的靶标或抗原，这同样可以以任何适当的方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法来确定。

“调节”还可以意指对涉及所述靶标或抗原(或其中包括其底物、配体、或途径，如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性施加改变(即，取决于所述靶标或抗原和所需的生物学或生理学作用，分别作为激动剂、作为拮抗剂或作为逆激动剂的活性)。同样，技术人员应该清楚，取决于所涉及的靶标或抗原，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法(体外且通常是细胞或体内测定法)确定。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的构建体的相同测定法中的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。

例如，调节还可以包括所述靶标或抗原的别构调节；和/或减少或抑制所述靶标或抗原与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与所述靶标或抗原的结合。调节还可以包括激活所述靶标或抗原或其中涉及所述靶标或抗原的机制或途径。例如，调节还可以包括对以下施加改变：所述靶标或抗原的折叠或构象，或所述靶标或抗原折叠的能力，改变其构象(例如，在与配体结合时)的能力，与其他(亚)单位缔合的能力，或解聚的能力。例如，调节还可以包括对所述靶标或抗原转运其他化合物的能力或作为其他化合物(诸如离子)的通道的能力施加改变。

调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于制药学和药学目的，通常应该是以可逆的方式。

s)关于靶标或抗原，术语在所述靶标或抗原上的“相互作用位点”意指在所述靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段，其是所述靶标或抗原的用于结合配体、受体或其他结合配偶体的位点、催化位点、裂解位点、别构相互作用的位点、参与多聚体化(如同源(二)聚体化或异源(二)聚体化)的位点；或是在所述靶标或抗原上的所述靶标或抗原的生物学作用或机制所涉及的任何其他位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段。更一般地，“相互作用位点”可以是在所述靶标或抗原上的本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合(以致调节(如本文定义)所述靶标或抗原(和/或其中涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用))的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基片段。

t)与第二靶标或抗原相比较，当与第一抗原结合的亲和力(如上述，且适当表示为K_D值、K_A值、k_off-速率和/或k_on-速率)是所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合的亲和力的至少10倍、如至少100倍、且优选至少1000倍、且多至10,000倍或更多时，认为这样的氨基酸序列或多肽是对第一靶标或抗原“特异性的”。例如，所述第一抗原可以以比所述氨基酸序列或多肽与所述第二靶标或多肽结合的K_D至少10倍小、如至少100倍小、且优选至少1000倍小、如10,000倍小或者甚至更小的K_D值结合所述靶标或抗原。优选地，当氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原相比较对第一靶标或抗原是“特异性的”时，它针对(如本文定义)所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。

u)如果氨基酸序列特异于(如本文定义)两种不同的抗原或抗原决定簇(如来自两种不同哺乳动物物种的血清白蛋白，如人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白)，则认为该氨基酸序列对于这些不同抗原或抗原决定簇二者是“交叉反应性”的。

v)“基本上不依赖pH”的结合在本文通常意指在动物或人体细胞内存在的pH值下(如本文进一步所述)，氨基酸序列对血清蛋白(如血清白蛋白)的缔合常数(K_A)是在所述细胞外存在的pH值下所述氨基酸序列对相同血清蛋白的缔合常数(K_A)的至少5％，如至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，如甚至更优选至少70％，如至少80％或90％或更多(或甚至大于100％，如大于110％，大于120％或甚至130％或更多，或甚至大于150％，或甚至大于200％)。备选地，“基本上不依赖pH”的结合在本文通常意指在动物或人体细胞内存在的pH值下(如本文进一步所述，例如5.5左右的pH，例如5.3-5.7)，氨基酸序列对血清蛋白(如血清白蛋白)的k_off速率(通过Biacore测量----例如，参见实验2)是在所述细胞外存在的pH值如pH 7.2-7.4下所述氨基酸序列对相同血清蛋白的k_off速率的至少5％，如至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，如甚至更优选至少70％，如至少80％或90％或更多(或甚至大于100％，如大于110％，大于120％或甚至130％或更多，或甚至大于150％，或甚至大于200％)。所谓“在动物或人体细胞内存在的pH值”意指可能在细胞内，且特别是在参与血清蛋白再循环的细胞内存在的pH值。特别地，“在动物或人体细胞内存在的pH值”意指可能存在于参与血清蛋白的再循环(例如，作为胞饮作用、内吞作用、胞转作用、胞外分泌和吞噬作用或类似的摄入或内化到所述细胞内的机制)的(亚)细胞区室或小泡内如内涵体、溶酶体或胞饮泡内的pH值。

w)术语“交叉阻断(cross-block)”，“被交叉阻断的(cross-blocked)”和“交叉阻断的(cross-blocking)”在本文可以互换使用，用来意指氨基酸序列或其他结合试剂(如本发明的纳米抗体

多肽、或化合物或构建体)干扰本发明的其他氨基酸序列或结合试剂与给定靶标的结合的能力。本发明的氨基酸序列或其他结合试剂能够干扰另一种对相关靶标的结合的程度，且因此其是否能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量氨基酸序列或其他结合试剂之间它们与靶标的结合的竞争。

以下一般地描述用于确定氨基酸序列或其他结合试剂是否是按照本发明所述的交叉阻断或能够交叉阻断的适当的Biacore测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列或其他结合试剂一起使用。按照供应商的建议操作Biacore机器(例如，Biacore 3000)。因此，在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学，将靶蛋白偶联到CM5Biacore芯片上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上(易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。将两种待检测它们彼此交叉阻断的能力的测试氨基酸序列(称为A*和B*)以结合位点1∶1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设氨基酸序列的分子量是氨基酸序列的总分子量除以所述氨基酸序列上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每种氨基酸序列的浓度应该足够高，足以易于饱和所述氨基酸序列关于捕获在Biacore芯片上的靶标分子的结合位点。在所述混合物中的氨基酸序列处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述浓度典型地为1.00-1.5微摩尔(基于结合位点)。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中和相同的浓度。将测试混合物通过靶标-包被的Biacore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片，在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的氨基酸序列。典型地，这通过用30mM HCl处理芯片60秒来完成。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。再次处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的氨基酸序列。然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合，且为每种氨基酸序列在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则该两种氨基酸序列彼此交叉阻断。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的氨基酸序列或其他结合试剂是这样的一种，即，其在上述Biacore交叉阻断测定法中与靶标结合，以致在该测定法过程中且在存在本发明的第二氨基酸序列或其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种氨基酸序列或结合试剂的最大理论结合(正如上文定义)的80％-0.1％(例如，80％-4％)，特别地是最大理论结合的75％-0.1％(例如，75％-4％)，且更特别地是最大理论结合的70％-0.1％(例如，70％-4％)。上述Biacore测定法是用来确定氨基酸序列或其他结合试剂彼此是否是按照本发明交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的氨基酸序列或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5Biacore芯片上的靶标结合(这通常在靶标上的相关结合位点由于与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在这样的情形中，交叉阻断可以使用带标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式来确定。以这种特定的形式，抗-His氨基酸序列将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表面，并被抗-His氨基酸序列捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His氨基酸序列包被的表面上以外。除了使用N端His-标记的靶标给出的实例之外，还可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，HA标记与抗-HA抗体；FLAG标记与抗-FLAG抗体；生物素标记与链霉抗生物素蛋白)。

下述一般描述用于确定针对靶标的氨基酸序列或其他结合试剂是否如本文所定义那样交叉阻断或能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列(或其他结合试剂，如本发明的多肽)一起使用。本测定法的一般原理是使得针对所述靶标的氨基酸序列或结合试剂包被到ELISA平板的孔上。将过量的第二、潜在的交叉阻断性的抗-靶标氨基酸序列添加到溶液中(即，不与ELISA平板结合)。然后将有限量的靶标添加到孔中。所述包被的氨基酸序列和溶液中的氨基酸序列竞争结合有限量的靶标分子。洗涤平板，以去除未与包被的氨基酸序列结合的过量的靶标，且还去除第二、溶液相氨基酸序列以及在所述第二、溶液相氨基酸序列和靶标之间形成的任何复合物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二、溶液相的氨基酸序列的条件下所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的氨基酸序列的氨基酸序列将能够引起所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第一氨基酸序列如Ab-X作为固定的氨基酸序列的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的第二氨基酸序列即Ab-Y添加到该ELISA平板中，以使得在包被所述ELISA平板的过程中，每孔Ab-Y靶标结合位点的摩尔数是每孔所用的Ab-X靶标结合位点的摩尔数的至少10倍高。然后，加入靶标，以致每孔加入的靶标的摩尔是用于包被每孔的Ab-X靶标结合位点的摩尔的至少25倍低。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标的试剂，以测量由所述包被的抗-靶标氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、第二溶液相氨基酸序列(在该情形中为Ab-Y)、仅有靶标缓冲剂(即，无靶标)和靶标检测试剂的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、仅有第二溶液相氨基酸序列缓冲剂(即，无第二溶液相氨基酸序列)、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种氨基酸序列用作包被氨基酸序列和哪种用作第二(竞争剂)氨基酸序列导致的任何假象(例如，Ab-X和Ab-Y之间对于靶标的显著不同的亲和性)，该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-Y是在溶液中的竞争氨基酸序列，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-X是在溶液中的竞争氨基酸序列。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标氨基酸序列的条件下(即，阳性对照孔)获得的靶标检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标氨基酸序列能够引起靶标检测信号(即，由所述包被的氨基酸序列结合的靶标的量)减少60％-100％，特别地70％-100％，且更特别地80％-100％，则Ab-X和Ab-Y被定义为是交叉阻断的。

x)给出的任何附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该以任何方式被解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求书的范围，除非本文中另外明确指明。

关于重链抗体及其可变结构域的一般描述，其中特别参考本文引用的现有技术，参考Muyldermans在Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74(2001)，277-302中的综述论文；以及参考下述专利申请，其作为一般背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(the NationalResearch Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(the Institute ofAntibodies)的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其他公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的其他现有技术，并且特别参考在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。

本发明的氨基酸序列可以以本身已知的方式进行制备。例如，所需的氨基酸序列可以通过肽合成或通过适当地表达编码所述氨基酸序列的核酸进行制备。所需的核苷酸序列可以通过本身已知的核酸合成技术进行制备。

用于制备本发明的氨基酸序列或多肽的一种方法通常包括至少下列步骤：

a)表达本发明的核苷酸序列或核酸；

和任选地还包括：

b)分别分离这样表达的本发明的氨基酸序列或本发明的多肽。

用于制备本发明的氨基酸序列或多肽的另一种方法通常包括至少下列步骤：

a)在这样的条件下培养或维持如本文所述的宿主或宿主细胞，所述条件使所述宿主或宿主细胞产生本发明的氨基酸序列或多肽；

和任选地还包含：

b)分别分离这样得到的本发明的氨基酸序列或本发明的多肽。

如果本发明的氨基酸序列以约束形式使用(即，包含在侧邻本发明的氨基酸序列的侧翼序列之间的二硫键)，则上述方法还可以包括形成这样的二硫键的另外的步骤，如在PCT/EP2007/063348中进一步所述。

本发明还涉及通过上述方法得到的氨基酸序列、化合物、构建体或多肽。

本文公开的氨基酸序列可以以作为融合配偶体从而增加治疗性结构部分如蛋白、化合物(包括，但不限于小分子)或其他治疗性实体的半衰期的优势使用。

因此，在另一个方面中，本发明提供这样的氨基酸序列，其可以用作连接或融合于治疗性化合物的小肽或肽结构部分，从而增加其半衰期，并且提供包含所述肽或肽结构部分的构建体和融合蛋白，所述氨基酸序列可以以这样的方式结合血清蛋白，即，当本发明的氨基酸序列、构建体或融合蛋白结合血清蛋白分子时，血清蛋白分子的半衰期没有被(显著)的减少(即，与所述氨基酸序列、构建体或融合蛋白没有结合其时的血清蛋白分子的半衰期比较)。在本发明的这个方面，所谓“没有显著减少”意为所述血清蛋白分子的半衰期(如使用本身已知的适合的技术测量的)没有减少超过50％，优选地没有减少超过30％，甚至更优选地没有减少超过10％，如没有减少超过5％，或基本上根本没有减少。

在另一个优选而非限制性方面中，本发明的氨基酸序列优选地是这样的，以致它们以这样的方式结合或否则缔合人血清白蛋白，即当所述氨基酸序列结合于或否则缔合人血清白蛋白时，所述氨基酸序列在人中显示至少约9天(如约9-14天)，优选地至少约10天(如约10-15天)，或至少约11天(如约11-16天)，更优选地至少约12天(如约12-18天或更多)，或超过14天(如约14-19天)的血清半衰期。

在另一个方面中，本发明提供多肽或蛋白构建体，其包含本文公开的氨基酸序列，或基本由其组成。

本发明还涉及这样的化合物或构建体，其包含至少一个本发明的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分(在本文还称为“本发明的化合物”)。

例如，但不限于，本发明的化合物可以包括至少一个治疗性结构部分，其连接一个、两个、三个、四个或更多个本发明的氨基酸序列。例如，当所述治疗性结构部分是蛋白或多肽时，一个或多个本发明的氨基酸序列可以连接在所述蛋白或多肽的C端(直接或通过适合的间隔臂或接头连接)；连接在所述蛋白或多肽的N-端(同样直接或通过适合的间隔臂或接头连接)；或连接在C端和N端两端。当本发明的化合物包含两个以上的本发明的氨基酸序列时，这些氨基酸序列可以是相同的或不同的。

所述治疗性结构部分还可以连接(在其C-端，其N-端，或两端，并且同样直接或通过适合的间隔臂或接头连接)包含至少两个(如两个，三个或四个)本发明的氨基酸序列(其可以是相同的或不同的)的多聚体或多联体，所述至少两个(如两个，三个或四个)本发明的氨基酸序列可以直接彼此连接，或通过适合的接头或间隔臂连接。所述(二价、三价或多价)多聚体或多联体(和编码其的核苷酸序列，以及包含其的本发明的化合物)形成本发明的另一方面，并且与本发明的单体氨基酸序列相比，以更高的亲合力结合血清白蛋白。

此外，当本发明的化合物包含两个以上治疗性结构部分时，这些治疗性结构部分的每个(或两个)可以连接于一个或多个本发明的氨基酸序列，如本文进一步所述。此外，所述两个或更多个治疗性结构部分可以通过接头彼此连接，所述接头包含一个或多个本发明的氨基酸序列(和任选地另外的连接氨基酸序列)或基本由其组成，并且所述接头(以及包含其的本发明的化合物)形成本发明的另一个方面。

在一个方面中，所述治疗性结构部分针对所需的抗原或靶标，所述治疗性结构部分能够结合所需的抗原(并且具体地能够特异性结合所需的抗原)，和/或能够与所需的靶标相互作用。在另一个实施方案中，所述至少一个治疗性结构部分包含治疗蛋白或多肽，或基本由其组成。在另一个实施方案中，所述至少一个治疗性结构部分包含免疫球蛋白或免疫球蛋白序列(包括但不限于免疫球蛋白的片段)、如抗体或抗体片段(包括但不限于ScFv片段或Fab片段)，或基本由免疫球蛋白或免疫球蛋白序列(包括但不限于免疫球蛋白的片段)、如抗体或抗体片段(包括但不限于ScFv片段或Fab片段)组成。在又一个实施方案中，所述至少一个治疗性结构部分包含抗体可变结构域、如重链可变结构域或轻链可变结构域，或基本由抗体可变结构域、如重链可变结构域或轻链可变结构域组成。

在一个优选的，但非限制性的方面中，所述一种或多种治疗性结构部分或实体可以是一个或多个结合单位(如在PCT/EP2007/063348中所定义的)或结合结构域(如本文定义)，即能够结合所需的靶标、抗原或抗原决定簇(如治疗相关靶标)的结合单位或结构域。因此，本发明的化合物可以是单价、二价、双特异性、多价或多特异性构建体(如在PCT/EP2007/063348中所定义)。所述结合单位可以通常包含基于支架的结合单位或结构域，如基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即，除了本发明已经描述的免疫球蛋白序列之外)，来源于蛋白质A结构域的蛋白支架(诸如Affibodies^TM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，高亲和性多聚体(avimers)和PDZ结构域(Binz等，Nat.Biotech(自然生物技术)2005，卷23：1257)，和基于DNA或RNA的结合结构部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等，Comb Chem High Throughput Screen(组合化学高通量筛选)20069(8)：619-32)。

本发明的氨基酸序列还可以连接于：在国际申请WO 05/118642(Domantis Ltd.)中或国际申请06/059106(Domantis Ltd.)中所提及的“多肽药物”之一；如连接于WO 05/118642的第45-50页提及的多肽药物之一；白介素1受体的拮抗剂(见WO 05/118642的第11-12页)，包括IL-1ra的功能变体；鞘脂激活蛋白(saporins)(见WO 05/118642的第12-14页)；在WO 05/118642的表8中列举的抗癌肽；和促胰岛素药剂或其类似物如GLP-1或GLP-1类似物(见06/059106)。

在一个优选的方面中，所述至少一个治疗性结构部分包含至少一个结构域抗体或单结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

或基本由至少一个结构域抗体或单结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

组成。因此，例如，在本发明的化合物中，一个或多个本发明的氨基酸序列可以融合或连接于一个或多个结构域抗体、单结构域抗体、“dAb’s”或纳米抗体

从而使得到的本发明的化合物是单价、二价、多价、双特异性或多特异性构建体(其中术语“单价”、“二价”、“多价”、“双特异性”和“多特异性”如在PCT/EP2007/063348中或在上文提及的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的专利申请中所述)。

因此，本发明的一个实施方案涉及包含至少一个本发明的氨基酸序列和至少一个免疫球蛋白序列，如结构域抗体、单结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

的蛋白或多肽构建体或融合蛋白，或基本由至少一个本发明的氨基酸序列和至少一个免疫球蛋白序列，如结构域抗体、单结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

组成的蛋白或多肽构建体或融合蛋白。

一般地，本发明的化合物优选地具有超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时，如超过12小时，和例如约1天、2天、1周、2周或3周，并且优选地不超过2个月的半衰期，尽管后者可以是较不重要的。

优选地，包含至少一个本发明的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分的本发明的化合物或多肽优选地具有是治疗性结构部分本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与治疗性结构部分本身比较，本发明的化合物或多肽可以具有增加超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时，如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。

在本发明优选的但非限制性的方面中，与治疗性结构部分本身比较，所述本发明的化合物或多肽具有增加超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时，如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。

本发明还涉及编码本文中所述氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的核苷酸序列或核酸。本发明还包括遗传构建体，其包括上述核苷酸序列或核酸，和一个或多个关于遗传构建体的本身已知的元件。所述遗传构建体可以是质粒或载体的形式。所述和其他遗传构建体是本领域技术人员已知的。

本发明还涉及包含所述核苷酸序列或核酸，和/或表达(或能够表达)本文中所述氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的宿主或宿主细胞。而且，所述宿主或宿主细胞是本领域技术人员已知的。

本发明通常还涉及用于制备本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的方法，所述方法包括在这样的条件下培养或维持本文中所述的宿主细胞，在所述条件下，所述宿主细胞产生或表达如本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，且任选地，还包括分离由此产生的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体。同样地，通常可以如本文中所述的埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的共同待审专利申请，诸如WO 04/041862或WO 06/122825中所述地进行所述方法。

在一个具体的但非限制性的实施方案中，氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体可以在适当的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株(如例如但不限于，蛋白酶-缺陷菌株或另外适当的菌株)中表达。如所提及，当使用巴斯德毕赤酵母时，可以有利地使用在位置14处(或其附近)不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列，原因在于这一残基可能是易于磷酸化的(这取决于所用的具体的毕赤酵母菌株)。

因此，在一个方面中，本发明用于表达氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(如本文所述)的方法可以包括下述步骤a)：表达本发明的核苷酸序列或核酸，其中所述核苷酸序列或核酸在适当的酵母菌株中(特别地，在适当的毕赤酵母属菌株中，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株中)表达，并且其中所述本发明的核苷酸序列或核酸编码本发明的氨基酸序列(或包含其的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体)，其不包含当在所述酵母菌株中表达时易于磷酸化的苏氨酸残基。例如，所述本发明的氨基酸序列或肽在位置14处包含丙氨酸(A)，天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)残基(或任何其他适当的氨基酸残基，例如，谷氨酰胺(Q)，谷氨酸(E)，甘氨酸(G)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，苯丙氨酸(F)，脯氨酸(P)，色氨酸(W)或缬氨酸V)，例如，替换苏氨酸残基，如例如在SEQ ID NO’s：7，16，19，21，22，24-27，和32-43的序列模体的情形中。例如，如本文进一步所述，它们可以适当地包含SEQ ID NO’s：135-140或143-148的序列模体中的一种。

在一个甚至更具体的方面中，本发明用于表达氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(如本文所述)的方法可以包括下述步骤a)：表达本发明的核苷酸序列或核酸，其中所述核苷酸序列或核酸在适当的酵母菌株中(特别地，在适当的毕赤酵母属菌株中，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株中)表达，并且其中所述本发明的核苷酸序列或核酸编码本发明的氨基酸序列(或包含其的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体)，其包含SEQ ID NO’s：126-148的序列模体中的至少一个，并且特别是SEQ ID NO’s：132-148的序列模体中的一种(其中所述氨基酸序列同样可以如本文进一步所述)。

在位置14处(或周围)不包含苏氨酸的氨基酸序列的一些优选的但非限制性的实例在SEQ ID NO’s：104-108中给出，并且SEQ ID NO’s：111-125给出一些包含其的基于5F7纳米抗体(用作纳米抗体的实例)的构建体的实例。

在另一个方面中，本发明用于表达氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(如本文所述)的方法可以包括下述步骤a)：表达本发明的核苷酸序列或核酸，其中所述核苷酸序列或核酸在表现出减少的磷酸化(即，当用于表达本发明的氨基酸序列或包含其的化合物时)、且特别是减少的(即，基本上没有)苏氨酸(T)残基的磷酸化的适当的酵母菌株中(特别地，在适当的毕赤酵母属菌株中，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株中)表达；或者其中所述核苷酸序列或核酸在已被遗传修饰从而表现出减少的(即，基本上没有)磷酸化(即，当用于表达本发明的氨基酸序列或包含其的化合物时)、且特别是减少的苏氨酸(T)残基的磷酸化的适当的酵母菌株中(特别地，在适当的毕赤酵母属菌株中，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株中)表达。本发明的这一方面通常可以用来表达本发明的任意氨基酸序列(或包含其的化合物)，包括但不限于，包含易于磷酸化的苏氨酸(T)残基的本发明的氨基酸序列(包括但不限于，在位置14处具有苏氨酸(T)残基的本发明的氨基酸序列)。

在包括步骤a)的本发明的方法中，所述步骤a)为：在这样的条件下培养或维持如本文所述的宿主或宿主细胞，所述条件使所述宿主或宿主细胞产生本发明的氨基酸序列或多肽，适用同样的考虑。因此，所述步骤a)可以包括：在这样的条件下培养或维持如本文所述的宿主或宿主细胞，所述条件使所述宿主或宿主细胞产生本发明的氨基酸序列或多肽，其中所述宿主或宿主细胞是适当的酵母菌株(特别地，适当的毕赤酵母属菌株，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株)，并且其中所述本发明的氨基酸序列或多肽不包含当在所述酵母菌株中表达时易于磷酸化的苏氨酸(T)残基。备选地，所述步骤a)可以包括在这样的条件下培养或维持如本文所述的宿主或宿主细胞的步骤，所述条件使所述宿主或宿主细胞产生本发明的氨基酸序列或多肽，其中所述宿主或宿主细胞是适当的酵母菌株(特别地，适当的毕赤酵母属菌株，如适当的巴斯德毕赤酵母菌株)，其表现出减少的(即，基本上没有)磷酸化或已被遗传修饰从而表现出减少的(即，基本上没有)磷酸化。

在上述情形中，“基本上没有”磷酸化意指关于在本发明的氨基酸序列中所包含的氨基酸残基，表达后得到的产物中小于5重量％、优选小于3重量％、如小于2重量％、小于1重量％、或小于0.5重量％被磷酸化。

用于分离和纯化本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的方法可以以任何本身已知的适当的方式进行，这将是技术人员所清楚的。同样也参考WO 09/127691和WO08/068280。

在一个特别优选的但非限制性的实施方案中，分离/纯化本发明的氨基酸序列或本发明的多肽的步骤至少包括使用亲和性基质的亲和纯化/层析步骤，所述亲和性基质对存在于本发明的所述化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白或多价或多特异性的构建体中的本发明的氨基酸序列是特异性的。例如，所述亲和性基质可以包含适当的树脂，其连接(以本身已知的方式，并且任选使用适当的接头)至少一个针对/特异于本发明的氨基酸序列的配体、结合结构域或结合单位。所述配体可以是本身已知的任何适当的配体(尽管在一些情形中，由于白蛋白或白蛋白的片段可能不提供所需的针对本发明的氨基酸序列的特异性，因此使用白蛋白或白蛋白的片段较不优选)，并且，例如，在优选的方面中，可以是已经针对本发明的氨基酸序列(如在所述本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中存在的氨基酸序列)或其所需的(抗原性)片段、表位或决定簇产生的V_HH或纳米抗体，例如，通过用所述本发明的氨基酸序列免疫骆驼科动物，从所述骆驼科动物得到V_HH免疫文库，关于V_HH对所述本发明的氨基酸序列的特异性筛选所述免疫文库(例如，使用噬菌体展示或另外适当的筛选技术)并且得到/表达/分离一种或多种对所述本发明的氨基酸序列特异的V_HH，然后，可以将其与适当的树脂连接，从而提供适用于本发明的这一方面的亲和性树脂。前述各步骤可以都以本身已知的方式进行和/或使用本身已知的技术进行。例如，用于产生针对本发明的氨基酸序列的V_HH的适当的技术记述在WO 08/020079第59页提及的现有技术中，和国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表中，所述现有技术和参考文献通过引用结合于此。

针对本发明的氨基酸序列的亲和性树脂及其在分离或纯化本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中的应用形成本发明的其他方面。

在本发明的一个具体方面中，所述亲和性基质包括针对/特异于本发明的氨基酸序列的部分、表位或抗原决定簇的配体、结合结构域或结合单位(如V_HH)，所述本发明的氨基酸序列的部分、表位或抗原决定簇位于本发明的氨基酸序列的C-端或靠近本发明的氨基酸序列的C-端(例如，在GGG模体下游的一个或多个位置处)。

因此，本发明的一些其他方面为：

-本发明的氨基酸序列，其在GGG模体的下游在位置11-13处，包含由亲和性基质所识别的部分、表位或抗原决定簇(至少一个配体、结合结构域或结合单位)；

-包含所述本发明的氨基酸序列的本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体；

-配体、结合结构域或结合单位，其针对、识别和/或能够特异性结合在本发明的氨基酸序列中存在的部分、表位或抗原决定簇(即，最优选在(C-端)GGG模体的下游在位置11-13处)。如提及，例如但非限制性地，所述配体可以是已经针对所述本发明的氨基酸序列(或针对包含基本上相同部分、表位或抗原决定簇的另一种本发明的氨基酸序列)产生的V_HH；

-亲和性基质，其针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列(包含至少一个针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列的配体、结合结构域或结合单位)；并且特别是这样的亲和性基质，即，其针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列中在GGG模体下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇(包含至少一个针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列中在GGG模体下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇的配体、结合结构域或结合单位)；

-用于分离和/或纯化本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(即，其包含至少一个本发明的氨基酸序列)的方法，所述方法包括至少一个下述步骤：使所述本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(包含其的组合物或混合物)与亲和性基质接触，所述亲和性基质针对、识别和/或能够特异性结合包含在所述本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中的本发明的氨基酸序列(包含至少一个针对、识别和/或能够特异性结合包含在所述本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中的本发明的氨基酸序列的配体、结合结构域或结合单位)；并且特别是与这样的亲和性基质接触，所述亲和性基质针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列中在GGG模体下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇(包含至少一个针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列中在GGG模体下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇的配体、结合结构域或结合单位)；

-亲和性基质在分离和/或纯化包含所述氨基酸序列的本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中的应用，所述亲和性基质针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列(且特别是在所述氨基酸序列中(C-末端)GGG下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇)(包含至少一个针对、识别和/或能够特异性结合本发明的氨基酸序列(且特别是在所述氨基酸序列中(C-末端)GGG下游在位置11-13处存在的部分、表位或抗原决定簇)的配体、结合结构域或结合单位)。

例如(并且不限于)，所述部分、表位或抗原决定簇可以包含氨基酸残基VG，其位于GGG模体下游在位置11-13处(例如，并且非限制性地，在位置16和17处，或者更下游)。因此，例如并且不限于，所述本发明的氨基酸序列可以包含序列模体GGGTPVG(SEQ ID NO：150)，GGGAPVG(SEQ ID NO：151)，GGGNPVG(SEQ ID NO：152)或GGGDPVG(SEQ ID NO：153)中的一种。包含这样的包含氨基酸残基VG的抗原决定簇的本发明的氨基酸序列的一些非限制性的实例在SEQ IDNO’s：106-108中给出，并且包含所述氨基酸序列的本发明的化合物的一些非限制性的实例在SEQ ID NO’s：114-116中给出。此外，SEQ ID NO’s：117-125给出包含本发明的二聚体氨基酸序列的本发明的化合物的一些非限制性的实例，所述本发明的二聚体氨基酸序列包含靠近C-端的基于VG的抗原决定簇(即，仅在二聚体C-端的本发明的肽中，并且不在上游肽中)。包含在SEQ ID NO’s：117-125的化合物中的本发明的二聚体氨基酸序列各自形成本发明的氨基酸序列的其他实例，并且因此形成本发明的其他方面。

本发明还包括包含本发明的氨基酸序列、化合物或多价和多特异性化合物的医学用途和治疗方法，其中所述医学用途或方法的特征在于所述药物适合于以这样的时间间隔施用，所述时间间隔是人血清白蛋白天然半衰期的至少约50％。

本发明还涉及用于延长或增加治疗剂(即治疗性结构部分、化合物、蛋白质或其他治疗性实体)的血清半衰期的方法。所述方法包括使所述治疗剂与任意前述氨基酸序列相接触，以使所述治疗剂与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体结合或否则缔合。在一些实施方案中，所述治疗剂是生物学治疗剂，优选地是肽或多肽，在该情形中，接触所述治疗剂的步骤可以包括通过使所述肽或多肽与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体相连接，而制备融合蛋白。

这些方法可以进一步包括在治疗剂与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体结合或缔合后，向受试者施用所述治疗剂。在该方法中，所述治疗剂的血清半衰期是治疗剂本身半衰期的至少1.5倍，或与治疗剂本身的半衰期相比增加至少1小时(如至少6小时，优选地至少12小时，更优选地至少1天，如超过2天，或甚至5天以上)。在一些优选的实施方案中，所述治疗剂的血清半衰期是相应治疗性结构部分本身半衰期的至少2倍、至少5倍、至少10倍或超过20倍。在其他优选的实施方案中，所述治疗剂的血清半衰期与相应治疗性结构部分本身的半衰期相比，增加超过2小时，超过6小时或超过12小时。

在上述方法中，治疗剂的血清半衰期优选地增加或延长从而使所述血清半衰期(即，这样得到的本发明化合物的血清半衰期)与包含治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体的血清半衰期相比，并且优选地与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，代替本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体的血清半衰期相比更长。优选地，与包含治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应化合物或构建体的血清半衰期相比，并且优选地与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，代替本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，本发明的化合物的血清半衰期至少5％更长，优选地至少10％更长，更优选地至少25％更长，或甚至更优选地至少50％更长，如超过100％更长或提高得更多。

例如，在所述方法中，与包含治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应化合物或构建体的半衰期相比，并且优选地与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，代替本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，本发明化合物的血清半衰期可以是所述相应化合物或构建体半衰期的至少1.1倍，如至少1.2倍，更优选地至少1.5倍，和/或与包含治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应化合物或构建体的半衰期相比，并且优选地与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，代替本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，可以增加至少1小时(如至少6小时，优选至少12小时，更优选至少1天，如超过2天，或甚至超过5天以上)。在一些优选的实施方案中，与包含治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应化合物或构建体的半衰期相比，并且优选地与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，代替本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，本发明化合物的血清半衰期是所述相应化合物或构建体半衰期的至少2倍、至少3倍或至少5倍。

在另一个方面中，本发明涉及用于改进治疗剂的方法，所述方法使所述治疗剂的所需的治疗水平，在适当施用所述治疗剂以获得所述需要的治疗水平后，维持一段延长的时期。

所述方法包括使所述治疗剂与任意前述的氨基酸序列相接触，从而使所述治疗剂与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体结合或以另外缔合。在一些实施方案中，所述治疗剂是生物学治疗剂，优选地是肽或多肽，在该情形中，接触所述治疗剂的步骤可以包括通过使所述肽或多肽与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体相连接，而制备融合蛋白。

这些方法可以进一步包括在治疗剂与本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体结合或否则缔合后，向受试者施用该治疗剂，从而在所述施用后获得需要的治疗水平。在该方法中，所述治疗剂在所述施用后维持所需的治疗水平的时间是治疗剂本身半衰期的至少1.5倍，或与治疗剂本身的半衰期相比增加至少1小时。在一些优选的实施方案中，所述治疗剂在所述施用后维持所需的治疗水平的时间是相应治疗性结构部分本身半衰期的至少2倍、至少5倍、至少10倍或超过20倍。在其他优选的实施方案中，所述治疗剂在所述施用后维持所需的治疗水平的时间与相应治疗性结构部分本身的半衰期相比，增加超过2小时，超过6小时或超过12小时。

优选地，增加所述治疗剂在所述施用后维持所需的治疗水平的时间，这样可以以本文中关于本发明化合物定义的频率施用所述治疗剂。

在上述方法中，维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间优选地增加或延长，从而使所述血清半衰期(即，这样得到的本发明化合物的血清半衰期)与包含所述治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间相比，优选与包含SEQID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，而不是本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比更长。优选地，与包含所述治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间相比，优选与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，而不是本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，所述治疗剂维持所需的治疗水平的时间是至少5％更长，优选地至少10％更长，更优选地至少25％更长，或甚至更优选地至少50％更长，诸如超过100％更长，或甚至提高得更多。

例如，在所述方法中，与包含所述治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间相比，优选与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，而不是本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间可以是至少1.1倍，如至少1.2倍，更优选地至少1.5倍，和/或与包含所述治疗剂和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间相比，优选与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，而不是本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，可以增加至少1小时(如至少6小时，优选至少12小时，更优选至少1天，如超过2天，或甚至超过5天以上)。在一些优选的实施方案中，与包含所述治疗剂和SEQID NO：1的氨基酸序列的相应的化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间相比，优选与包含SEQ ID NO’s：75，76和/或77的氨基酸序列中的一种(即，而不是本发明的氨基酸序列)的相应化合物或构建体相比，维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间是所述相应化合物或构建体维持所述治疗剂的所需的治疗水平的时间的至少2倍、至少3倍或至少5倍。

在另一方面中，本发明涉及本发明的化合物(如本文中定义)制备药物的用途，所述药物增加和/或延长患者血清中所述化合物或构建体中治疗剂的水平，以致能够以与单独治疗剂相比更低的剂量施用所述化合物或构建体中的所述治疗剂(即，在基本相同的施用频率下)。

本发明还涉及药物组合物，其包括至少一种如本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，和任选地，至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂。所述制剂、载体、赋形剂和稀释剂通常可以如埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的共同待审专利申请，诸如WO 04/041862或WO 06/122825中所述。

然而，由于本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体具有增加的半衰期，所以优选地将它们施用到循环中。因此，可以以容许所述氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体进入循环的任何合适方式，诸如静脉内、通过注射或输注，或以任何其他合适方式(包括口服施用、经由皮肤施用、鼻内施用、通过肺的施用等)施用它们。而且，还例如由WO04/041862或WO 06/122825的教导，技术人员应该清楚合适的施用方法和途径。

因此，在另一方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种能够通过使用如本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体预防或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，和/或药物活性量的包括所述本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的药物组合物。如技术人员应该清楚的，能够通过使用如本文中描述的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体预防或治疗的疾病和病症通常与能够通过使用本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中存在的治疗性结构部分预防或治疗的疾病和病症相同。

在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，通常还包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，预防或减缓一种或多种与疾病相关症状的发作，减轻和/或缓解一种或多种与疾病相关的症状，减轻疾病和/或其任意相关症状的严重性和/或持续时间，和/或预防疾病和/或其任意相关症状严重性的进一步增加，预防、降低或逆转由疾病导致的任何生理学损伤，和通常任何有益于被治疗的患者的药理学作用。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，和更特别地是人。如技术人员应该清楚的，待治疗的受试者应该具体地是患有本文中提及的疾病和病症或处于本文中提及的疾病和病症危险中的人。

更具体地，本发明涉及治疗方法，其中施用本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体的频率是所述哺乳动物中血清白蛋白的天然半衰期(即在人的情形中，人血清白蛋白天然半衰期)的至少50％，优选地至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％和最优选地至少90％。

属于本发明范围内的对哺乳动物具体施用频率是在如上定义的所述哺乳动物中血清白蛋白天然半衰期的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或至少100％。

换言之，属于本发明范围内的具体施用频率是每4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18或19天。

非限制性地，上文提到的施用频率特别适合于维持在利用所述氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体治疗(任选地，在施用意欲建立所述需要的血清水平的一次或多次(起始)剂量后)的受试者血清中的所述氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体的所需的水平。如技术人员应该清楚的，所述需要的血清水平可以特别依赖于使用的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体和/或待治疗的疾病。临床医生或医师应该能够选择需要的血清水平，和选择向待治疗受试者施用的剂量和/或量，从而在以本文中提到的频率施用本发明的氨基酸序列、化合物、融合蛋白或构建体时，在所述受试者中获得和/或维持需要的血清水平。

在本发明的一个非限制性的方面中，本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体经由肺施用/递送(即，通过吸入、气管内施用或其他用于肺递送的适当方法和/或装置)。为了这一目的，例如，本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体可以适当地配制(使用本身已知的一种或多种适当的载体、稀释剂、赋形剂或添加剂)成适于施用到肺/通过肺施用的制剂，例如，以气雾剂形式(或适于和/或意欲作为气雾剂递送的形式)，以适于和/或意欲通过吸入施用的形式，以适于和/或意欲施用到肺中的(干)粉剂形式，或以适于和/或意欲使用喷雾器施用(即，到肺/通过肺施用)的形式，或以适于和/或意欲用于气管内施用的形式。为了这一目的，制剂可以任选地包括在适当的容器(holder)中(例如，容器还包括泵、阀或其他能够递送单位剂量的制剂的装置)，或制剂可以以多部件试剂盒(kit-of-parts)的形式，其具有用于肺递送的装置，如吸入器或喷雾器。

当本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体施用至肺或通过肺施用时，在用于肺递送的动物模型中[其中，用于提供半衰期延长的包含WO 09/127691所述的肽(本发明的氨基酸序列/肽是相对于其的改进，如本文所述)的活性成分的肺-至-系统递送与相似化合物的肺-至-系统施用相比较，其中所述延长的半衰期由存在针对血清白蛋白的纳米抗体(如Alb-1或其人源化变体，如Alb-8，例如，参见WO 2006/122787)提供]，已经发现，其中存在本发明的氨基酸序列/肽(即，用于提供增加的半衰期)的活性成分的肺递送，与通过肺途径类似施用包含用于半衰期延长的结合血清白蛋白的纳米抗体的相似活性成分时相比，可以导致更高的所施用的活性成分的血清浓度。例如，参考埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2011年1月31日提交的美国专利申请13/018,047的实施例23所示的数据。

因此，在另一个方面中，本发明涉及药物组合物(包括诊断组合物)、制备物或制剂，其包含本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，适于和/或意欲用于本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的肺-至-系统施用(即，通过施用到肺将其递送到循环中)。

本发明还涉及预防或治疗人受试者(即，需要所述治疗的受试者)中的疾病的方法，其中将适于预防或治疗所述疾病的本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体(或其适于肺施用的制剂)施用至受试者的肺和/或通过受试者的肺施用。

在另一个方面中，本发明涉及用于施用至肺或通过肺施用的、且特别是用于肺-至-系统递送的本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体。

本发明还涉及本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，其已经被配制用于施用到肺或通过肺施用，并且特别是用于肺-至-系统递送。

本发明还涉及用于施用到肺或通过肺施用，并且特别是用于肺-至-系统递送的一种药物组合物(包括诊断组合物)，其包含至少一种本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体。

因此，本发明的肽在意欲用于通过肺施用的本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体中的应用还可以提供用于肺递送包含纳米抗体的活性成分(且特别是肺-至-系统递送)的方法(如埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 2003/055527和WO2010/081856中所述的方法)的改善的备选方案(例如，通过使用本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白或多价或多特异性构建体进行WO2003/055527和WO 2010/081856中所述的方法，或另外通过使用任何本身已知的用于肺递送的适当的方法、技术、制剂和装置施用本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白或多价或多特异性构建体至肺和/或通过肺施用)。

此外，在本领域中还记述在活性成分中使用结合血清白蛋白的结合结构域或结合单位可以提供增加的对关节、组织或肿瘤的渗透。由于与已经由于存在针对血清白蛋白的纳米抗体而提供延长的半衰期的相似的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体相比较，本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体具有更小的尺寸，所以还预测本发明的化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体与相对应的基于纳米抗体的活性成分相比可能具有改善的对关节、组织或肿瘤的渗透。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫治疗，和特别是用于被动免疫治疗的方法，所述方法包括向患有本文中提及疾病和病症或处于本文中提及疾病和病症危险中的受试者施用药物活性量的本发明的融合蛋白或构建体，和/或药物活性量的包括所述本发明的融合蛋白或构建体的药物组合物。

按照适于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或病症的治疗方案，施用所述氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体和/或包括所述氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的组合物。临床医生通常应该能够根据各种因素确定合适的治疗方案，所述因素诸如待预防或治疗的疾病或病症，待治疗疾病的严重性和/或其症状的严重性，待使用的具体的本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，待使用的具体给药途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、总体状态，和临床医生熟知的类似因素。

通常，所述治疗方案应该包括以一种或多种药物有效量或剂量，施用一种或多种本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，或一种或多种包括所述本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的组合物。临床医生也可以根据以上列出的因素确定具体的待施用量或剂量。

通常，为了预防和/或治疗目的疾病和病症(即，通常通过使用所述治疗性实体本身治疗或预防的那些疾病和病症)，并根据待治疗的具体疾病或病症，待使用的具体氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体的功效和/或半衰期，使用的具体给药途径和具体药物制剂或组合物，通常应该以这样的量，在一天中连续地(例如通过输注)作为单次日剂量或作为多个分剂量施用本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体，所述量是1克-0.01微克/kg体重/天，优选地0.1克-0.1微克/kg体重/天，诸如约1，10，100，1000或2000微克/kg体重/天。临床医生通常也能够根据本文中提到的因素确定合适的日剂量。还应该清楚的是，在具体情形中，例如，基于以上列出的因素和他的专业判断，临床医生可以选择偏离这些量。通常，可以由对基本通过相同途径施用的针对相同靶标的类似常规抗体或抗体片段通常施用的量获得一些关于待施用量的指导，然而考虑亲和力/亲合力、功效、生物分布、半衰期和技术人员熟知的类似因素中的差别。

通常，在以上方法中，使用本发明的单一氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体。然而，组合使用两种或更多种本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体也属于本发明的范围(例如作为单独的制剂或在单一制剂中组合)。

本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体还可以与一种或多种其他药物活性化合物或成分组合使用，即作为组合的治疗方案使用，其可以引起或可以不引起协同功效。而且，临床医生能够基于以上列出的因素和他的专业判断，选择这些其他化合物或成分，以及合适的组合治疗方案。

特别地，本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体可以与其他药物活性化合物或成分组合使用，所述药物活性化合物或成分用于或能够用于预防和/或治疗能够用本发明的氨基酸序列、化合物、蛋白质、多肽、融合蛋白、或多价或多特异性构建体预防或治疗的疾病和病症，且作为其结果，可以获得或可以不获得协同功效。

临床医生应该清楚地，可以以关于所涉及的疾病或病症本身已知的任何方式，确定和/或跟踪按照本发明使用的治疗方案的效力。临床医生还能够，在适当时和或在个案基础上，改变或改进具体的治疗方案，从而获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在一方面获得理想治疗效果和另一方面避免、限制或减少不希望有的副作用之间获得适当的平衡。

通常，应该遵从所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或尽量长地维持理想治疗效果。而且，这可以由临床医生确定。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，和更特别是人。如技术人员应该清楚的，待治疗的受试者应该特别是患有本文中提及的疾病和病症或处于本文中提及的疾病和病症危险中的人。

现在将通过下述非限制性实验部分和非限制性附图进一步举例说明本发明，其中图I显示本说明书中引用的序列，图II显示实施例2B中得到的BIAcore结果，图III显示一些参照序列和本发明的一些氨基酸序列的比对。

实验部分

实施例1：本发明的氨基酸序列的实例

在下表II中给出了本发明的氨基酸序列的一些非限制性实例，其为SEQ ID NO’s：54-74。作为与纳米抗体2D3的融合体来测定与人血清白蛋白的结合(参见实施例2，和本文提及的WO 09/127691的其他实施例)。

表II：一些优选的但非限制性的本发明的氨基酸序列

表II：续

实施例2：构建纳米抗体-加速融合蛋白(Nanobody-Expedite fusion protein)并且分析与人血清白蛋白的结合：

实施例2A：构建2D3-加速融合体：

通过适当的接头序列并且使用下述C-端标记：

AAAEQKLI SEEDLNGAAH HHHHH[SEQ ID NO：49]

将本发明的氨基酸序列(如表II中的一种肽)基因融合在纳米抗体2D3的C-端：

EVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQVPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRNNANNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNWRDAGTTWFEKSGSAGQGTQVTVSS[SEQ ID NO：47]

适当的接头序列的非限制性实例是GGGGSGGGS[SEQ ID NO：53](其包含Gly4Ser-Gly3Ser接头，本文中还称为9GS)；GGGGSGGGSA[SEQ ID NO：48](其包含Gly4Ser-Gly3Ser接头，在C-端具有侧翼氨基酸残基A)和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO：109](本文中还称为20GS)。

使用表面等离振子共振分析来测定得到的融合蛋白与人血清白蛋白的结合。为此目的，在大肠杆菌(E.coli)TG1细胞中表达融合蛋白。通过IMAC/SEC来纯化融合蛋白并在BIAcore^TM 3000中评估与HSA的结合，评估是通过在CM5芯片上注射1μM和5μM的所述融合蛋白来进行的，所述CM5芯片包被了～7000RU人血清白蛋白(Sigma，99％纯)和2460RU的不相关的蛋白抗原(参照)。通过胺偶联进行芯片(CM5)的包被，使用NHS/EDC进行活化和使用乙醇胺进行灭活(Biacore胺偶联试剂盒)。使用HBS-EP作为流动缓冲液，速率为10μl min^-1。注射20μl样品历时120s。注射2D3纳米抗体作为对照。结果在上表II中提及。

例如，通过Gly4Ser-Gly3Ser(“9GS”)接头序列(SEQ ID NO：53)制备作为肽80B10(SEQ ID NO：56)和纳米抗体2D3(SEQ ID NO：47)的融合体的纳米抗体构建体。得到的纳米构建体(称为2D3-9GS-EXP80B10或EXP 424)的序列为：

EVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQVPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRNNANNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNWRDAGTTWFEKSGSAGQGTQVTVSSGGGGSGGGSYWWERRDWDFDVFGGGTP[SEQ ID NO：99].

本发明其他氨基酸序列(如表II中提及的那些)与纳米抗体(如2D3)的融合体或纳米抗体构建体可以以类似的方式制备，同样任选地使用适当的接头来制备。在实施例2B和2C中给出其另外的一些非限制性的实例。

此外，替代本发明的单一肽，包含两个或更多个(如两个或三个)本发明的肽的本发明的氨基酸序列(如表II中提及的两个肽，其可以是相同的或不同的，并且其可以直接彼此连接或通过一个或多个适当的接头连接，所述接头如SEQ ID NO：48或53的接头)可以与纳米抗体连接。例如，纳米抗体可以与两个这样的肽连接，所述两个肽是相同的并且其通过接头彼此连接，以形成串联重复。其一些非限制性的实例也在下述实施例2B和2C中给出。

实施例2B：构建5F7-加速融合体：

通过适当的接头序列(如SEQ ID NO：53的9GS接头序列)，作为单价肽或作为串联重复序列(其中两个本发明的肽)，将本发明的氨基酸序列(如表II中的一种肽)基因融合到纳米抗体5F7的C-端：

EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSS[SEQ IDNO：100]

。

例如，5F7这样连接于单价形式的89D03(SEQ ID NO：72)。得到的纳米抗体构建体(称为5F7-9GS-EXP89D03或EXP413)为：

EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSWWEQDRDWDFDVFGGGTP[SEQ IDNO：101]

5F7也连接于串联重复形式的89D03(SEQ ID NO：72)(其中两个89D03肽通过9GS接头彼此连接)。得到的纳米抗体构建体的序列(称为5F7-9GS-EXP89D03-9GS-EXP89D03或EXP486)为：

EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSWWEQDRDWDFDVFGGGTPGGGGSGGGSWWEQDRDWDFDVFGGGTP[SEQ ID NO：102]

在BIAcore^TM 3000中，通过在包被～920RU人血清白蛋白(Sigma，99％纯)或食蟹猴血清白蛋白(～900RU)的CM5芯片上注射200nM和1μM的所述融合蛋白，比较SEQ ID NO：101和102的单价和串联重复构建体的结合。结果显示在图2中。观察到与单一加速构建体EXP413相比较，串联加速构建体EXP486有略高的反应和明显的亲合力作用。数据显示与人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白的结合模式是非常相似的。

本发明的其他构建体的一些非限制性的实例(使用5F7作为代表性的纳米抗体的实例)在SEQ ID NO’s：110-125中给出。在这些构建体中，5F7通过20GS接头(SEQ ID NO：109)连接于本发明的单一肽(其中所述肽分别是SEQ ID NO：72，103，104，105，106，107或108的肽中的一种)或连接于通过9GS接头(SEQ ID NO：53)彼此连接的本发明的两个肽的串联体。

在SEQ ID NO’s：110-116的构建体中，使用在C-末端包含VG序列的本发明的肽，VG序列可以用作用于亲和性纯化的(C-端)标记(的一部分)(例如，使用基于已经针对包含所述标记的本发明的肽产生的基于V_HH的亲和性基质进行纯化，如本文进一步所述)。类似地，在SEQ ID NO’s117-125的构建体中，使用包含两个本发明的肽(其是相同的或不同的，并且其通过9GS接头连接)的本发明的氨基酸序列，其中在串联体的C-末端的本发明的肽在C-末端包含所述VG序列。

实施例3：本发明的氨基酸序列与人血清白蛋白的相互作用的计算机(in silico)建模

对于在本发明的氨基酸序列中的位置3处的氨基酸残基的相互作用，以及位置3下游的其他氨基酸残基的相互作用，参考WO 09/127691的实施例8，其通过引用结合于此。

进行可以(并且优选)在位置3上游存在的一些优选的氨基酸残基(即，除了WO 09/127691的实施例8中提及的位置3下游的那些以外)的潜在的相互作用的建模，使用ICM-Pro(Molsoft)和Discovery Studio(Accelrys)进行，其使用基于Momany等(Momany等.J.Phys.Chem.(物理化学杂志)1975，79，2361-2381)所述的参数的力场。

为了本文公开的目的，关于人血清白蛋白，参考Genbank登记号AAA98797(Minghetti等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)261(15)，6747-6757(1986)；SEQ ID NO：144.)给出的序列----还参考WO 09/127691的实施例8。

建模研究的结果总结在表III中，其在第二列中示例了可能在第一列中列出的位置存在的与第三列中提到的人血清白蛋白上的氨基酸残基相互作用的一些优选的氨基酸残基。位置的编号同样如上文提及。下划线所示的残基形成人血清白蛋白上的小的亚口袋，其中可能存在疏水或芳族残基。可以看出，尽管本发明不限于任何具体的解释或假说，但是在表III中所示的建模数据与上表II所示的结合研究的结果之间存在相关性。

表III：可能在靠近本发明的氨基酸序列的N-端存在的一些优选的氨基酸残基(与人血清白蛋白相互作用)的建模

同样地，不限于任何具体的解释或假说，基于建模数据可以得到下述观察：

-当本发明的氨基酸序列在位置3下游(并且包括位置3)的部分经历WO 09/127691的实施例8所示的相互作用时，该肽的N-端部分紧密接近人血清白蛋白上的疏水和芳族残基：例如，L487，L485+残基，其具有显著的脂肪族贡献(aliphatic contribution)(例如K490)。这些似乎形成疏水亚口袋的一部分，其特别包含表III中的一个或多个带下划线的氨基酸残基。因此推测，优选地，本发明的氨基酸序列在靠近N-末端包含一个或多个能够与人血清白蛋白上的这些残基进行相互作用的氨基酸残基(诸如，例如，在表III第二列中提到的残基)。

-在人血清白蛋白上的该亚口袋还似乎包含一些带部分正电荷的残基(例如，K490和H488)。因此推测，优选地，本发明的氨基酸序列在靠近N-末端可能还包含(或另外包含)一个或多个能够与人血清白蛋白上的这些残基进行相互作用的带(部分)负电荷的和/或芳族的氨基酸残基。

-本发明的氨基酸的N-端部分可能还与人血清白蛋白上的一些带部分负电荷的残基(如D131和N133)紧密接近。因此推测，本发明的氨基酸序列在靠近N-末端还可能包含(或另外包含)一个或多个能够与人血清白蛋白上的这些残基进行相互作用的带(部分)正电荷的氨基酸残基。

实施例4：在雄性食蟹猴中的药物代谢动力学曲线

按照下述方案，在约3至4岁龄的雄性食蟹猴中分析下述纳米抗体构建体(以下分别还称为“构建体”或“测试项”)的药物代谢动力学曲线：2D3-9GS-EXP80B 10(EXP424)，5F7-9GS-EXP89D03(EXP413)和5F7-9GS-EXP89D03-9GS-EXP89D03(EXP486)，并且与2D3对照(以下称为“对照”或“阴性对照”)相比较。结果在下表IV中列出。

将构建体和对照各自注射在三只猴子中。构建体和对照均通过静脉内输注以2mg/kg的剂量施用。在给药前，施用后5min，20min，1h，2h，4h，8h和16h，以及输注开始后的第2，3，5，7，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54和57个测试日，采集血液样品。为了在每次取样时对每只动物获取至少0.25mL血清，每次取样时抽取足够体积的全血并在37℃温育1小时后分离血清。将血清样品在-80℃保存。

使用下列ELISA测定法(还参见WO 09/127691的实施例7，13和14，其中使用基本上相同的方法)，分别对血清样品检测构建体和对照的血清水平。

在37℃用PBS中的重组人ErbB2/Fc嵌合体(Chimera)，CF(R&DSystems(R&D系统)，Minneapolis)包被96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc，Wiesbaden，德国)历时1小时，对于阴性对照用3μg/mL，对测试项用4.5μg/mL。将孔吸干并于室温(RT)用SuperBlock

T20PBS (Pierce，Rockford，IL)封闭30分钟。在此封闭步骤后，用PBS-0.05％吐温20洗涤孔。

在未包被(聚丙烯)平板中进行标准品、QC样品和测试样品稀释物的制备。

标准曲线和QC-样品：在PBS 0.1％酪蛋白中制备所需各种浓度的溶液并掺入100％猴血清。为了制备标准品和QC样品，在PBS-0.1％酪蛋白中制备纯的猴血清稀释液的1/10稀释物。

测试样品：估计测试样品的稀释倍数，并从1/10到1/500变化。在第一步中将样品在PBS 0.1％酪蛋白中1/10稀释，如果需要，进一步稀释于包含10％猴血清的PBS 0.1％酪蛋白中。在2个孔中，将这些样品稀释物在具有10％猴血清的PBS 0.1％酪蛋白中进一步连续1/5稀释。

将标准品、QC样品和测试样品的各个1/5稀释液转移到包被的板上并于室温(RT)温育1小时。之后洗涤板并以在PBS 0.1％酪蛋白中1μg/mL的量加入针对蛋白A纯化并去除Her2/Fc的兔多克隆抗-VHH K1，并于室温温育1小时。在洗涤后，向板中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(Dakocytomation，丹麦)在PBS 0.1％酪蛋白中的1/2000稀释液，并于室温温育30分钟。这种酶催化与底物sTMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，SDT试剂，布鲁塞尔，比利时)的化学反应，其导致比色变化。在15分钟后使用HCl(1N)终止反应后，使用450nm光波长通过分光光度计测量颜色强度，测定反应产物的光密度。

使用Microsoft Excel 2007计算每个剂量组和每个取样时间点的平均血清浓度。如果有二分之一的值小于LLOQ，则将BQL值设为零，并且计算平均值；如果平均值小于LLOQ，则报告BQL，否则报告平均值。如果两个值都低于LLOQ，则报告BQL。对于药物代谢动力学分析，由于所有的实际取样时间都在方案规定的指定时间的5％内，因此使用指定时间。

使用WinNonlin Pro 5.1(Pharsight Corporation，USA；2006)，将个体血清浓度-时间曲线进行非房室分析(non-compartmental analysis，NCA)(模型201；静脉内推注注射)。使用lin up/log down法则估算曲线下面积(AUC)。将LLOQ值处理为缺失，除了当其被包括在高于LLOQ的两个值之间时以外，那么它们被设定为0。通过基于两个第一数据点的反算(back-calculation)估计在0时间点的浓度(C0)。使用末期的log-线性部分的非0浓度-时间数据的log-线性回归，自动(最佳拟合)计算终末清除半衰期(t1/2)。关于λz的确定，考虑三个点的最小值。

估测下述主要药物代谢动力学参数：在0时间点的预测的血清浓度(C₀)；外推到无穷大的血清浓度-时间曲线下面积(AUC_inf)，机体总清除率(CL)，稳态表观分布容积(Vd_ss)，和终末半衰期(t_1/2，终末)。

在表IV中，汇集了在以2mg/kg体重的单次静脉内(推注)剂量给药后在雄性食蟹猴中EXP413，EXP424和EXP486的平均(+/-s.d.；n＝3)血清浓度-时间曲线，以及相对应的主要药物代谢动力学参数。

EXP424的平均(n＝3)预测的剂量-标准化最大血清水平(dose norm.C₀)为54,1μg/ml。对于EXP413(59,2μg/ml)和EXP486(53,9μg/ml)计算了相似的值。

EXP424的平均(n＝3)估算的清除率和Vd_ss值分别为28.3mL/天*.kg和69mL/kg。对于包含连接于单价形式的89D03(SEQ ID NO：72)的纳米抗体5F7的EXP413，相应的值为19,4mL/天*kg和48,7mL/kg，包含串联重复形式的89D03(SEQ ID NO：72)(其中两个89D03肽通过9GS接头彼此连接)的EXP486的那些值达到10,3mL/天*kg和59,3mL/kg。

关于EXP424的估算的平均半衰期(t_1/2终末)为37,6小时或1，6天。关于EXP413的平均半衰期为31,2小时或1，3天，并且对于EXP486为84,5小时或3，5天。

表IV：在雄性食蟹猴中分别静脉内推注给药2mg/kg EXP424，EXP413和EXP486后，EXP424，EXP413和EXP486的主要药物代谢动力学参数(平均值+/-SD，n＝3)。

所用的术语和表述仅是用作描述的术语，并非限制，并且在使用所述术语和表述时，并无意排除显示和描述的特征的任何等价物或其部分，因此，要意识到各种更改在本发明的范围内是可能的。

本文公开的所有参考文献结合作为参考，特别是关于上述提及的教导。

Claims

1.氨基酸序列，其包含：

a)Arg(R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn(N)133和Asn(N)135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro(P)134和Leu(L)136残基的主链氧原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或

b)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R)138残基形成静电相互作用的Trp(W)残基；和/或

c)序列模体GGG；

并且优选地包含(i)，(ii)和(iii)中的至少任意两项并且更优选地所有三项；

并且另外在所述Arg残基的上游包含至少一个疏水和/或芳族氨基酸残基，以使所述至少一个所述疏水和/或芳族氨基酸残基可以结合(人)血清白蛋白的亚口袋或结合到(人)血清白蛋白的亚口袋中，所述亚口袋包含(至少)人血清白蛋白的下列氨基酸残基中的一个或多个：V442，S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493。

2.根据权利要求1所述的氨基酸序列，其包含序列模体RXWD(其中X选自W，Y，F，S或D)和序列模体FGGG(SEQ ID NO：6)；并且优选序列模体DVFGGG(SEQ ID NO：15)或TVFGGG(SEQ ID NO：131)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列是这样的，以致当其与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体连接或融合时，与其中所述治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列连接或融合的相对应的化合物或构建体相比，这样得到的化合物具有更长的半衰期；并且优选地，与其中所述治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗性实体与SEQ ID NO：75，76和/或77的氨基酸序列之一连接或融合的相对应的化合物或构建体相比，这样得到的化合物具有相同或更长的半衰期。

4.根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与来自食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))的血清白蛋白的交叉反应性。

5.化合物或构建体，其包含至少一个根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分。

6.化合物或构建体，其包含至少两个根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分。

7.化合物或构建体，其包含至少一个串联重复和至少一个治疗性结构部分，所述串联重复含有至少两个根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列。

8.化合物或构建体，其包含至少一个根据前述权利要求中任一项所述的氨基酸序列和至少一个治疗性结构部分，其中本发明的所述化合物与相应化合物相比具有更长的半衰期(如本文定义)，所述相应化合物包含代替所述氨基酸序列的氨基酸序列AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ IDNO：1)；并且本发明的所述化合物优选地与相应化合物相比具有相等或更长的半衰期(如本文定义)，所述相应化合物包含代替所述氨基酸序列的SEQ ID NO’s：75，76或77的氨基酸序列之一。

9.根据权利要求7或8所述的化合物或构建体，其是融合蛋白或多肽。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的化合物或构建体，其中所述至少一个治疗性结构部分优选地包含免疫球蛋白序列或其抗原结合片段，如免疫球蛋白可变结构域或其抗原结合片段；或所述至少一个治疗性结构部分优选地基本上由免疫球蛋白序列或其抗原结合片段，如免疫球蛋白可变结构域或其抗原结合片段组成。

11.根据权利要求13所述的化合物或构建体，其中所述至少一个治疗性结构部分优选地包含(单)结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

或基本上由(单)结构域抗体、“dAb”或纳米抗体

组成。