ES2324280T3 - Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de unirse específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio variable de cadena pesada derivado a partir de una inmunoglobulina desprovista de forma natural de cadenas ligeras.
Description
Dominios variables de la cadena pesada de
anticuerpos frente a lipasas dietéticas humanas y sus usos.
La presente invención pertenece al campo de
biotecnología aplicada y se refiere en particular a la inhibición de
lipasa humana.
Las enfermedades cardiovasculares son la primera
causa de muerte en el Mundo Occidental. Los datos epidemiológicos y
experimentales muestran claramente que niveles de colesterol en
suero altos, más preciso niveles altos de partículas de
Lipoproteínas de Baja Densidad, que contienen colesterol muestran
una correlación marcada con la aparición de enfermedades
cardiovasculares. También es bien conocido que los productos
alimenticios que contienen grasas altas en ácidos grasos saturados
contribuyen a niveles altos de Lipoproteínas de Baja Densidad en
suero. También se ha indicado que la hidrólisis de grasas
dietéticas, liberando de ese modo ácidos grasos en el estómago y
tracto intestinal aumenta la adsorción de colesterol por las células
epiteliales del tracto intestinal y, por consiguiente, la
hidrólisis de grasas dietéticas contribuye aumentar los niveles de
Lipoproteínas de Baja Densidad en suero. En esta reacción de
hidrólisis están implicadas varias enzimas dietéticas humanas. Una
razón adicional para reducir la hidrólisis de grasas dietéticas y la
liberación posterior de ácidos grasos es evitar o reducir un
aumento de peso corporal o incluso para reducir el peso
corporal.
También, otras enzimas en el tracto
gastrointestinal pueden estar implicadas en reacciones fisiológicas
indeseables. Los ejemplos de tales enzimas, las cuales se denominan
enzimas dietéticas humanas incluyen óxidorreductasas, transferasas,
hidrolasas (por ejemplo, lipasas, enzimas proteolíticas y ureasas),
liasas, isomerasas y ligasas o sintetasas.
Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar
maneras de reducir la cantidad de ácidos grasos liberados en el
estómago y tracto intestinal, por ejemplo, inhibiendo o modulando la
actividad de enzimas dietéticas humanas.
El documento WO 98/34630 describe el uso de un
inhibidor de lipasa gastrointestinal para la preparación de
medicamentos orales para tratar o prevenir diabetes mellitus de tipo
II. Un inhibidor de lipasa gastrointestinal preferente es
tetrahidrolipstatina.
El documento WO 97/49805 se refiere a moléculas
de reconocimiento que interaccionan específicamente con el sitio
activo o hendidura de una molécula diana tal como una enzima. El
mismo describe anticuerpos desprovistos de forma natural de cadenas
ligeras y fracciones VHH de los mismos, dirigidos contra
alfa-amilasas pancreáticas y capaces de inhibir la
actividad enzimática de dichas amilasas. También se describen
composiciones terapéuticas que comprenden dichos anticuerpos.
M. Arbabi-Ghahroudi y col. (FEBS
Letters 414, páginas 521-526 (1997)) describe la
selección e identificación de fragmentos de anticuerpo de dominio
único a partir de anticuerpos de cadena pesada de camello. Se
sugiere que la generación de VHH específicos de camello puede ser
una estrategia eficaz para desarrollar inhibidores de enzimas o
receptores.
El documento WO 99/46300 describe el uso de VHH
en la preparación de productos, por ejemplo, productos alimenticios.
Se dice que los VHH son más estables en condiciones
desestabilizantes que los anticuerpos tradicionales.
Existe un deseo de identificar alternativas
naturales a tetrahidrolipostatina para la inhibición de lipasa
humana u otras enzimas dietéticas humanas. Se desea aún más la
identificación de materiales que sean capaces de inhibición parcial
de enzimas dietéticas humanas, reduciendo posiblemente con esto,
aunque sin bloquear completamente la liberación de ácidos grasos en
el tracto humano.
Aoubula y col en The Journal of Biological
Chemistry, 8, 1995 págs. 3932-3937 divulga
anticuerpos monoclonales frente a lipasa pancreática humana.
También, Bezzine y col en Biochemistry (1998),
11846-11855 describe la unión de anticuerpos
monoclonales a lipasa pancreática humana. Sin embargo, un problema
con los anticuerpos monoclonales es que estos son costosos,
difíciles de preparar y, por lo general, no son estables en las
condiciones en el tracto
humano.
humano.
Permanece la necesidad continua para el
desarrollo de procedimientos nuevos y mejorados para la inhibición o
modulación de enzimas dietéticas humanas. En particular, existe la
necesidad de desarrollar inhibidores de lipasa gastrointestinal
eficaces, que se puedan preparar de forma conveniente y que sean lo
suficientemente estables en las condiciones observadas en el tracto
humano.
Sorprendentemente se ha encontrado que se puede
usar una clase especial de anticuerpos o fragmentos de los mismos,
concretamente aquellos que están libres de forma natural de cadenas
ligeras y denominados comúnmente V_{H}H para la inhibición o
modulación de enzimas dietéticas humanas.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de unirse
específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas,
comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio
variable de cadena pesada obtenido a partir de una inmunoglobulina
desprovista de forma natural de cadenas
ligeras.
ligeras.
De acuerdo con un segundo aspecto, la invención
se refiere a un producto alimenticio o un producto farmacéutico que
comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de unirse
específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas,
comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio
variable de cadena pesada obtenido a partir de un inmunoglobulina
desprovista de forma natural de cadenas ligeras.
En un tercer aspecto la invención se refiere al
uso de un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de unirse
específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas,
comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio
variable de cadena pesada obtenido a partir de una inmunoglobulina
desprovista de forma natural de cadenas ligeras, en la preparación
de un medicamento o alimento para inhibir la actividad de una o más
lipasas dietéticas humanas en el cuerpo humano.
En un cuarto aspecto la invención se refiere al
uso de un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de unirse
específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas,
comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio
variable de cadena pesada obtenido a partir de una inmunoglobulina
desprovista de forma natural de cadenas ligeras, para el control
cosmético de peso corporal de seres humanos.
La invención se describirá adicionalmente en lo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
El término "V_{H}H" se refiere a los
anticuerpos de dominio variable de cadena pesada única del tipo que
se puede observar en mamíferos Camélidos que están desprovistos de
forma natural de cadenas ligeras; por consiguiente, se pueden
construir V_{H}H sintéticos.
Como se usa en el presente documento, el término
"anticuerpos" se refiere a inmunoglobulinas que se pueden
obtener a partir de fuentes naturales o se pueden producir de forma
sintética, como un todo o como fragmento de anticuerpo.
Un "fragmento de anticuerpo" es una parte
de un anticuerpo entero que conserva la capacidad de mostrar
actividad de unión a antígeno. Los fragmentos de anticuerpo
funcionalizados también están incluidos en esta expresión.
El término "fragmento de anticuerpo
funcionalizado" se usa para indicar un anticuerpo o fragmento del
mismo a los cuales se unen uno o más grupos funcionales, que
incluyen enzimas y otros polipéptidos de unión, dando como
resultado productos de fusión de tal fragmento de anticuerpo con
otra molécula biofuncional.
El término "anticuerpo tradicional" se usa
para un anticuerpo que normalmente está constituido por dos cadenas
pesadas y dos ligeras o fragmentos del mismo.
El término "enzimas dietéticas humanas" se
usa para enzimas que pueden estar presentes y son fisiológicamente
activas en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, en condiciones
estomacales o en condiciones intestinales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos son moléculas proteicas que
pertenecen a un grupo de inmunoglobulinas generado por el sistema
inmune en respuesta a un antígeno. La estructura de la mayoría de
moléculas de anticuerpo se basa en una unidad que comprende cuatro
polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras
idénticas, que están enlazadas covalentemente por enlaces
disulfuro. Cada una de estas cadenas está plegada en dominios
específicos. Las regiones carboxi terminal de las cadenas tanto
pesada como ligera se conservan en secuencia y se denominan
regiones constantes, comprendiendo uno o más denominados
dominios-C. Las regiones
amino-terminal de las cadenas pesada y ligera,
también conocidas como dominios variables (V) son variables en
secuencia y determinan la especificidad del anticuerpo. Las
regiones en los dominios variables de las cadenas ligera y pesada
(V_{L} y V_{H} respectivamente) responsables de actividad de
unión a antígeno se conocen como las regiones determinantes
hipervariables o de complementariedad (CDR), mientras que las
regiones flanqueantes (FR) son responsables del plegamiento de
inmunoglobulina típico de la región V.
Los anticuerpos naturales generalmente tienen al
menos dos sitios de unión a antígeno idénticos definidos por la
asociación de las regiones variables de cadena pesada y ligera. En
general, la mayoría de los anticuerpos de origen natural necesitan
tanto un V_{H} como un V_{L} para formar y sitio de unión a
antígeno completo y conservar inmunorreactividad total.
\newpage
Más recientemente, en el documento WO 94/04678
se han descrito inmunoglobulinas capaces de mostrar las propiedades
funcionales de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas descritas
anteriormente pero que comprenden dos cadenas de polipéptido
pesadas y que, adicionalmente, están desprovistas de cadenas de
polipéptido ligeras. En el documento WO 94/25591 se describen los
procedimientos para la preparación de tales anticuerpos o fragmentos
de los mismos a gran escala que comprenden la transformación de un
moho o levadura con una secuencia de ADN expresable que codifica el
anticuerpo o fragmento.
Las inmunoglobulinas descritas en el documento
WO 94/4678, que se pueden aislar a partir del suero de Camélidos,
no dependen de la asociación de dominios variables de cadena pesada
y ligera para la formación del sitio de unión a antígeno sino que,
en su lugar, las cadenas de polipéptido pesadas solas forman de
forma natural el sitio de unión a antígeno completo. Estas
inmunoglobulinas, denominadas en lo sucesivo "inmunoglobulinas de
cadena pesada" (o V_{H}H) son, por tanto, bastante diferentes
de las cadenas pesadas obtenidas por la degradación de
inmunoglobulinas comunes (de cuatro cadenas) o por clonación directa
las cuales de ese modo contienen sólo una parte del sitio de unión
a antígeno y necesitan un compañero de cadena ligera para la
formación de un sitio de unión a antígeno completo para obtener
características de unión a antígeno óptimas.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los
V_{H}H, son capaces de inhibir enzimas dietéticas humanas, en
particular enzimas implicadas en la hidrólisis de grasas dietéticas
y, de ese modo, reducen la absorción de ácidos grasos libres
eficazmente.
De acuerdo con la invención, los V_{H}H se
usan para la inhibición de enzimas humanas implicadas en la
hidrólisis de grasas dietéticas, los ejemplos de estas enzimas son
Lipasa Pancreática Humana y Lipasa Gástrica Humana.
La Lipasa Pancreática Humana (HPL) es la lipasa
principal responsable de la conversión de lípidos en adultos,
representando el 48,5% de la hidrólisis de los triacilglicéridos. La
enzima es activa a pH neutro en el intestino delgado, donde
cataliza la hidrólisis de ácidos grasos en la posición
sn-1 y sn-3 de triacilglicéridos. La
enzima requiere un cofactor denominado colipasa para acción
lipolítica en grasas duodenales. La estructura de HPL está
constituida por un dominio aminoterminal (residuos 1 a 336) y un
dominio carboxi terminal (residuos 377 a 448) que está implicada en
unión de colipasa.
La Lipasa Gástrica Humana (HGL) pertenece a la
familia de las lipasas ácidas, que se refiere a su estabilidad y
actividad en el entorno altamente ácido del estómago. La HGL es
responsable de la hidrólisis del 17,5% de los triacilglicéridos de
la comida. La estructura de cristal de la enzima, que contiene 379
residuos de aminoácidos, revela la presencia de un dominio central
típico de la familia de alfa/beta hidrolasa y un dominio "cap",
similar a lo que se ha observado en Serina carboxipeptidasas.
Una realización preferente de la presente
invención implica la inhibición parcial de lipasas dietéticas
humanas usando V_{H}H. Preferentemente, las enzimas se inhiben
sólo parcialmente para asegurar que no ocurran deficiencias de
ingredientes importantes. Preferentemente, el nivel de inhibición
medido de acuerdo con la Figura 3, está entre el 2 y el 90%, más
preferentemente entre el 3 y 30% y lo más preferente es que esté
entre el 5 y el 20%.
A objeto de la invención, los anticuerpos se
pueden usar en su totalidad (por ejemplo, en una forma que es igual
o que se asemeja mucho a la forma natural en la fuente de Camélido).
Alternativamente, se puede usar cualquiera de los fragmentos de
estos anticuerpos, por ejemplo, V_{H}H. Si se usan fragmentos
entonces se prefiere que estos fragmentos comprendan una o más
secuencias que sean iguales o se asemejen mucho a las regiones CDR
en los V_{H}H naturales. Particularmente, preferentemente estos
fragmentos comprenden una secuencia que es igual o que se parece
mucho a la región CDR3 de un V_{H}H natural.
En una realización preferente particular, los
V_{H}H (que incluyen V_{H}H enteros o fragmentos de los mismos)
de acuerdo con la presente invención se caracterizan por un CDR3
seleccionado entre las siguientes clases:
(I) ARSLX_{1}X_{2}TPTSYDY
(II) RGGLTQYSEHDY
(III) TGAEGHY
(IV) TDMGRYGTSEW
en la que X_{1} es V o E y X_{2} es Q o
L.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos preferentes de V_{H}H de la
primera clase son HGL#1 y HGL#16. Los ejemplos preferentes de
V_{H}H de la segunda clase son HGL#4 y HGL#10. Los ejemplos
preferentes de V_{H}H de la tercera clase son HGL#8 y HGL#9. Un
ejemplo preferente de V_{H}H de la cuarta clase es HGL#11.
\newpage
En otra realización preferente particular, los
V_{H}H de acuerdo con la presente invención se caracterizan por un
CDR3 seleccionado entre las siguientes clases:
(a) DVRPYRTSRYLEX_{3}
(b) QVRVRFSSDYTNY
(c) LlRRKFTSEYNEY
(d) LlTRWDKSVNDY
(e) RRSNYDRSWGDY
(f) LlSSYDGSWNDY
(g) HITPAGSSNYVYGY
(h) DIRKRFTSGYSHY
en la que X_{3} es V o L o I
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (a) es
HPL#12, HPL#14 y HPL#30
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (b) es
HPL#19
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (c) es
HPL#18
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (d) es
HPL#13
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (e) es
HPL#11
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (f) es
HPL#22
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (g) es
HPL#15
Un ejemplo de un V_{H}H de clase (h) es
HPL#17
\vskip1.000000\baselineskip
Los V_{H}H de acuerdo con la presente
invención se pueden usar para la inhibición de la actividad de
lipasas dietéticas humanas. Sorprendentemente se ha observado que
los V_{H}H con frecuencia son más estables que anticuerpos
tradicionales en condiciones similares a las del tracto
gastrointestinal. En particular, los V_{H}H preferentes de
acuerdo con la invención tienen una estabilidad (como se mide en el
Ejemplo 4.3) de al menos el 75% después de 1 hora.
Los V_{H}H de acuerdo con la presente
invención se pueden administrar a seres humanos de cualquier forma
deseable. En una primera realización preferente de la invención los
V_{H}H se pueden usar en composiciones farmacéuticas. Estas
composiciones normalmente comprenden además de los V_{H}H un
material de vehículo adecuado. Por ejemplo, los V_{H}H se pueden
incorporar en medicinas para uso oral tales como comprimidos,
cápsulas, licores medicinales, polvos, pero otras formas de
aplicación, por ejemplo, como una inyección, aplicaciones tópicas,
etc. pueden ser igualmente adecuadas.
En una segunda realización preferente de la
invención los V_{H}H se pueden usar en productos alimenticios.
Los ejemplos de productos alimenticios adecuados son margarinas y
otras pastas para untar pan, aliños, bebidas que incluyen zumos de
fruta y té y café, productos de panadería tales como galletas,
bizcochos, pan, pizza, etc., salsas que incluyen salsas calientes o
frías, materiales dulces congelados, por ejemplo, sorbete o helado,
productos lácteos, por ejemplo, postres, yogurt, queso, etc.,
productos de cereales, por ejemplo, cereales de desayuno, dulces
tales como pastillas, piruletas, tabletas, chocolate, etc.
Típicamente, una ingesta adecuada por comida de
anticuerpos podría ser de manera que la proporción molar de
anticuerpo a la enzima dietética pertinente esté entre 10:1 y 1:10.
Está dentro de la capacidad del especialista adaptar la
concentración de anticuerpos en el producto de manera que se
consuman esas cantidades.
La presente invención se puede entender más
completamente con referencia a la siguiente descripción, cuando se
lea junto con los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 muestra la titulación de anticuerpos
en suero para la llama inmunizada con Lipasa Pancreática Humana en
ELISA sobre reconocimiento enzimático (A) y sobre inhibición de
actividad de lipasa (B);
\newpage
La Figura 2 analiza la eficacia de fragmentos
V_{H}H individuales para reconocer Lipasa Pancreática Humana
(determinado con ELISA) (2A) y para inhibir actividad de lipasa
(2B);
La Figura 3 muestra la titulación de anticuerpos
en suero de la llama inmunizada con Lipasa Gástrica Humana sobre el
reconocimiento enzimático (3A) y sobre inhibición de lipasa
(3B).
La Figura 4 es un mapa de restricción del
fagémido pUR5071.
La Figura 5 muestra la reactividad cruzada de
HPL18 con PPL.
La invención se puede aplicar al uso de
cualquier dominio variable de inmunoglobulina, que forma un sitio
unión a antígeno completo. La inmunoglobulina se puede obtener a
partir de fuentes naturales o producirse sintéticamente.
Preferiblemente, la invención se refiere al uso de dominios
variables de cadena pesada obtenidos a partir de una
inmunoglobulina desprovista de cadenas ligeras, más adecuadamente a
partir de una inmunoglobulina desprovista de forma natural de
cadenas ligeras tales como las que se pueden obtener a partir de
células linfoides, especialmente linfocitos de sangre periférica,
células de médula ósea o células esplénicas obtenidas de Camélidos
como se ha descrito en el documento WO 94/04678 (Casterman y
col).
Una ventaja principal del uso de unidades de
unión de dominio único, que son dominios variables de cadena pesada
obtenidos de Camélidos, es su estabilidad inusual frente a pH
extremo, degradación por proteasas, concentraciones altas de sales
y temperaturas altas, que hace a estos fragmentos adecuados para
aplicación en productos alimenticios y para ser eficaces en el
tracto gastrointestinal. Otro beneficio de unidades de unión de
dominio único es que estas moléculas se pueden producir fácilmente
y de forma conveniente económicamente a gran escala, por ejemplo,
usando un huésped eucariota inferior transformado como se ha
descrito en el documento WO 94/25591 (Unilever). El mismo describe
un sistema de producción que suministra cantidades altas de
fragmentos de anticuerpos secretados con un grado bajo de impurezas
presente en la fracción secretada, posibilitando de ese modo
procedimientos de procesamiento aguas abajo sencillos para
purificación.
La invención también proporciona células huésped
y vectores de expresión que posibilitan niveles altos de producción
y secreción de las proteínas de unión.
Los dominios variables de cadena pesada
obtenidos a partir de una inmunoglobulina desprovista de forma
natural de cadenas ligeras que tienen una especificidad antigénica
determinada se pueden obtener de forma conveniente seleccionando
genotecas de expresión de fragmentos clonados de genes que codifican
inmunoglobulinas de Camélidos generados usando técnicas
convencionales, como se ha descrito, por ejemplo, en el documento
EP-A-0584421 y el Ejemplo 1. Los
procedimientos preferentes que se tienen que enriquecer para que los
dominios de unión reconozcan la enzima dietética humana, limitando
de ese modo el número de clones, que se tienen que seleccionar para
la identificación de fragmentos inhibidores, son expresión de
levadura (documento WO 94/01567 de Unilever) o expresión de
fago.
Las proteínas de unión a antígeno inhibidoras de
enzima se pueden preparar transformando un huésped incorporando un
gen que codifique el polipéptido como se ha expuesto anteriormente y
expresando dicho gen en dicho huésped.
De forma adecuada, el huésped o los huéspedes se
pueden seleccionar entre bacterias procariotas, tales como
bacterias Gram negativas, por ejemplo, Escherichia coli y
bacterias Gram positivas, por ejemplo, Bacillus subtilis y
en particular bacterias de ácido láctico, eucariotas inferiores
tales como levaduras, por ejemplo, que pertenecen al género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia o
mohos tales como los pertenecen al género Aspergillus o
Trichoderma.
Los huéspedes preferentes para uso con respecto
a la presente invención son los mohos y levaduras eucariotas
inferiores.
Las técnicas para sintetizar genes,
incorporándolos en huéspedes y expresando genes en huéspedes son
conocidas en la técnica y el especialista sería fácilmente capaz de
aplicar la invención usando conocimiento general común.
Las proteínas para uso de acuerdo con la
invención se pueden recuperar y purificar usando técnicas
convencionales tales como cromatografía de afinidad, cromatografía
de intercambio iónico o cromatografía de filtración en gel.
La actividad de unión de las proteínas de unión
preparadas de acuerdo con la invención se puede medir de forma
conveniente mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica
tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA),
radioinmunoensayo (RIA) o con biosensores.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a
modo de ilustración. Las técnicas usadas para la manipulación y
análisis de materiales de ácidos nucleicos se realizaron como se ha
descrito en (Sambrook y col., 1990), a menos que se indique en
contra.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se purificó Lipasa Pancreática Humana (HPL) como
se ha descrito por De Caro A., Figarella, C., Amic, J., Michel, R.
& Guy, O. (1977). Biochim. Biophys. Acta 490(2),
411-419.
Una llama se inmunizó con una HPL en emulsión
oleosa obtenida mezclando 2 ml de antígeno en agua y 3 ml de Specol
(Bokhout, B.A., Van Gaalen, C & Van der Heijden, P.J. (1981)
Vet. Immunol. Inmmunopath. 2, 491-500.
Por inmunización, se inyectaron 4 veces 1,25 ml
de agua en emulsión oleosa, conteniendo dicho 1,25 ml 200 \mug de
enzima. Cada inmunización implicó cuatro inyecciones, dos de las
inyecciones fueron subcutáneas y las otras dos intermuscular. La
segunda inmunización se realizó cuatro semanas después de la primera
inyección, la tercera inmunización 8 semanas después de la primera
inyección y la cuarta inmunización 12 semanas después de la primera
inyección. La respuesta inmune se supervisó mediante titulación de
muestras de suero en dos ensayos diferentes. En el primer ensayo
los anticuerpos de suero que reconocen HPL se cuantificaron en ELISA
(Figura 1A) y en el otro el título de anticuerpos inhibidores se
determinó en un ensayo de actividad enzimática (Figura 1B).
Para ELISA, HPL biotinilada in vitro
(preparada como se ha descrito en el párrafo 2.2) se inmovilizó
directamente a través de estreptavidina. Se aplicó como
recubrimiento estreptavidina a 5 \mug/ml en Solución Salina
Tamponada con Fosfato (PBS) durante dos horas a temperatura
ambiente en placas maxi-sorb (NUNC). La solución de
recubrimiento se retiró y, después de lavar con el 0,05% v de
Tween-20 en PBS (PBST), los pocillos se bloquearon
durante 30 minutos a temperatura ambiente con una solución de leche
desnatada al 4% p preparada en PBS. La estreptavidina recubierta
capturó a la HPL biotinilada durante 16 horas a 4ºC a partir de una
solución con una concentración de 2,5 \mug/ml de enzima de PBST,
seguido de lavado de la placa con PBTS para retirar HPL biotinilada
libre.
Se ensayaron muestras de suero en diluciones
seriadas (en solución de leche desnatada al 2% en PBST).
Posteriormente, los anticuerpos de llama unidos se detectaron con
antisuero policlonal de conejo anti-llama (obtenido
inmunizando ratones con inmunoglobulinas de llama purificadas a
través de columnas de Proteína A y Proteína G
(Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans,
S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E. B., Bendahman, N &
Hamers, R. (1993). Nature 363(6428),
446-448) e inmunoglobulinas de cerdo
anti-conejo (DAKO) conjugadas con peroxidasa de
rábano picante. Finalmente, la actividad enzimática de peroxidasa
se determinó con tetrametil-benzidina y peróxido de
urea como sustratos y se midió la densidad óptica a 450 nm después
de la terminación de la reacción mediante la adición de
H_{2}SO_{4}.
El título de anticuerpos inhibidores se
determinó en el ensayo LIPASE-PS (Sigma
Diagnostics), en el que la hidrólisis enzimática de
1,2-diglicérido en 2-monoglicérido y
ácido graso se puede medir cinéticamente en un espectofotómetro a
una longitud de onda de 550 nm. Para este ensayo se mezclaron 5
\mul (diluido) de suero con 10 \mul de agua destilada y 5
\mul de HPL (aproximadamente 250 unidades de lipasa/ml). De esta
mezcla se añadieron 5 \mul a 150 \mul de solución de sustrato
(Reactivo de Sustrato LIPASE-PS) usando los
pocillos de una placa de microtitulación como recipientes de
reacción. Después de incubar la placa durante 8 minutos a 37ºC, se
añadió solución Activadora (50 \mul/pocillo) y se midió el
desarrollo de color cinéticamente durante un periodo de 10 minutos
a 550 nm y 37ºC, según lo cual un cambio en la intensidad de color
implicó actividad enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN de llama a partir de sus linfocitos
usando una muestra de sangre tomada 8 semanas después de la primera
inmunización. En ese momento la llama tuvo el título más alto de
anticuerpos de reconocimiento de HPL medido mediante ELISA.
Se tomó una muestra de sangre de aproximadamente
150 ml y se obtuvo una población de linfocitos enriquecida a través
de centrifugación en un gradiente discontinuo Ficoll Paque
(Pharmacia). A partir de estas células se aisló ARN total por
extracción con tiocianato de guanidio de acuerdo con Chomczynski, P.
& Sacchi, N. (1987), Anal. Biochem. 162(1),
156-159. Después de la síntesis de la primera cadena
de ADNc usando MMLV-RT (Gibco-BRL)
y cebadores de oligonucleótidos aleatorios (Pharmacia), se
amplificaron fragmentos de ADN que codificaban V_{H}H y parte de
la región de bisagra larga o corta por PCR usando tres cebadores
específicos como se ha descrito en el Ejemplo II.2.1 del documento
WO99/46300.
Los fragmentos de ADN generados por PCR se
digirieron con PstI (que coinciden con los codones 4 y 5 del
dominio de V_{H}H, que codifica los aminoácidos
L-Q) y NotI (introducido en el extremo 5' de los
cebadores de oligonucleóticos específicos de bisagra, que coinciden
con la secuencia de aminoácidos
A-A-A). Los productos de PCR
digeridos se clonaron en el vector fagémido pUR5071 (Figura 4) como
fragmentos génicos que codifican el dominio V_{H}H que incluye la
región de bisagra fusionada a la proteína del gen III del
bacteriófago de E. coli M13. Se construyó una primera
genoteca de expresión con 1,5 x 10^{7} clones que contenían los
fragmentos V_{H}H obtenidos de la bisagra corta y una segunda
genoteca de 6,2 x 10^{7} clones con V_{H}H obtenido de bisagra
larga, en el vector fagémido pUR5071.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon partículas de fago que exponían
fragmentos V_{H}H por infección de células de E. coli que
tenían el fagémido con fago auxiliar VCS-M13 de
acuerdo con Marks, J. D. y col (1991) J. Mol. Biol. 222,
581-597.
Los fragmentos V_{H}H libres se retiraron por
precipitación de fagos a partir del sobrenadante del cultivo con
PEG6000, evitando de ese modo una competición perturbadora entre
fago unido y fragmentos V_{H}H libres. La captura "en
solución" de fago de E. coli que exponía fragmentos de
anticuerpo específicos de HPL se realizó con lipasa biotinilada
in vitro (EZ link NHS-biotin) acoplada
covalentemente a grupos NH2 libres de la lipasa de acuerdo con las
instrucciones del distribuidor; la proporción molar entre biotina y
lipasa fue 15 a 1. Para la selección se usó Lipasa Pancreática
Humana 15 nM y 40 nM en la primera ronda y 0,6 nM y 3 nM en la
segunda ronda. El domino carboxi terminal se preparó mediante
proteolisis con quimiotripsina y se purificó con HPLC de fase
inversa. La lipasa se biotiniló y se usó para selección de la
genoteca inmune (bisagra corta y bisagra larga combinada) a 15 y 70
nM durante la primera ronda y a 1 y 3 y 15 nM durante la segunda
ronda. Durante la fase de unión de la selección se usaron
"condiciones de aplicación" (inclusión de ácido cólico 5,3 mM
y desoxicolato 36 mM). Las partículas de fago unidas, a través de
sus fragmentos de anticuerpo expuestos, a la lipasa biotinilada o
el péptido de dominio carboxi terminal se extrajeron de la solución
con perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal) (véase
(Hawkins, T. DNA Seq. 1992; 3(2) 65-9).
Después del lavado, el fago se eluyó con trietilamina.
Clones de E. coli individuales obtenidos
después de dos rondas de selección se cultivaron en pocillos de
placas de microtitulación y se indujo la producción de fragmentos
V_{H}H mediante la adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
0,1 mM. Después de 16 horas de cultivo, el sobrenadante de cultivo
de los clones se analizó en ELISA para determinar la presencia de
fragmentos V_{H}H, que se unen específicamente a HPL biotinilada
inmovilizada indirectamente, usando una placa recubierta con
estreptavidina como un control negativo. Los fragmentos V_{H}H
unidos se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo anti-
V_{H}H de llama, seguido de incubación con anticuerpos
policlonales de cabra anti-conejo conjugados a
peroxidasa de rábano picante (BIORAD) o con anticuerpo monoclonal
de ratón anti-myc ATCC myc 1-9E
10-2 seguido de incubación con
anti-ratón de conejo policlonal conjugado a
peroxidasa de rábano picante (DAKO). La etiqueta de myc- está
codificada en el vector de expresión de fago, que da como resultado
la adición de esta secuencia peptídica al extremo carboxilo de los
fragmentos V_{H}H.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad inhibidora de lipasa de los
fragmentos V_{H}H se demostró en un ensayo de actividad enzimática
(Sigma). Se identificaron diferentes clones anti- HPL por su patrón
de identificación genética HinFI característico (Marks y col., como
anteriormente), para lo que se amplificó el inserto que codificaba
V_{H}H con el cebador M13REV y gen III. El producto de PCR
resultante se digirió con la enzima de restricción HinFI, cuyo sitio
de reconocimiento se encuentra frecuentemente dentro de genes de
anticuerpo. Los clones representativos se cultivaron en escala de 5
ml y las células se recolectaron después de un tiempo de inducción
relativamente corto de 3,5 horas a 37ºC. Se proporcionó un choque
osmótico resuspendiendo e incubando las células sedimentadas en 0,5
ml de PBS enfriado con hielo durante dos a dieciséis horas a 4ºC. Se
retiraron esferoplastos por centrifugación y el sobrenadante, que
contenía las proteínas periplasmáticas, se ensayó en ELISA en
diluciones seriadas para unión de HPL biotinilada y en el ensayo de
enzima lipasa para determinar su capacidad de inhibir la enzima.
La selección con lipasa biotinilada o su dominio
carboxi terminal dio como resultado el aislamiento de clones, que
producen fragmentos V_{H}H inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando enzima HPL biotinilada se seleccionaron
190 fragmentos V_{H}H inhibidores, 8 de los mismos se
secuenciaron, estos fragmentos se codifican HPL#11, HPL#12, HPL#13,
HPL#15, HPL#18 y HPL#19.
Usando el dominio carboxi terminal de HPL se
seleccionaron 95 fragmentos V_{H}H inhibidores de lipasa, 6 se
secuenciaron, dando como resultado una nueva clase representada por
HPL#22.
Con respecto a la longitud de CDR3, que es la
región más importante de unión al antígeno, los anticuerpos se
pueden agrupar en tres clases, como se muestra en las siguientes
secuencias de aminoácidos, en las que las regiones CDR respectivas
se indican en negritas, siendo CDR1 la primera cadena en negritas,
etc. HPL#12, HPL#18 y HPL#19 se caracterizan por una región CDR3 que
tiene una longitud de 13 aminoácidos, HPL#11, HPL#13 y HPL#22 se
caracterizan por una región CDR3 de 12 aminoácidos y HPL#15 se
caracteriza por una región CDR3 de 14 aminoácidos.
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Las secuencias codificantes de V_{H}H de
clones HPL#11, HPL#13, HPL#15, HPL#17, HPL#18 y HPL#19 se digirieron
con PstI y BstEII a partir de los vectores fagémidos de
E. coli pUR5084, pUR5082, pUR5095, pUR5080, pUR5086 y
pUR5087, respectivamente y se clonaron en el plásmido episomal de
S. cerevisiae pUR4547 (depositado en la CBS, Baarn, Los
Países Bajos como CBS100012) para la secreción de fragmentos
V_{H}H, obteniendo de ese modo pUR5091, pUR05090, pUR1403,
pUR5088, pUR5092 y pUR5093 respectivamente. La secreción de
fragmentos V_{H}H con secuencias de etiqueta carboxi terminal se
consiguió clonando en el plásmido pUR4585, que es idéntico al
plásmido pUR4547 excepto que codifica la etiqueta myc para la
detección con anticuerpo monoclonal myc 1 - 9E10.2 (ATCC) y el
extremo de hexahistidina para purificación con IMAC. Las
construcciones de plásmido pUR5099, pUR5098, pUR5097, pUR5096,
pUR5263 y pUR5264 se prepararon codificando los fragmentos V_{H}H
marcados de HPL#11, HPL#13, HPL#15, HPL#17, HPL#18 y HPL#19
respectivamente.
Los plásmidos parentales tanto pUR4547 como
pUR4585 contienen el promotor GAL7 para expresión inducible
del producto génico de V_{H}H, los marcadores seleccionables bla
(\beta-lactamasa) para distinguir transformantes
en E. coli por resistencia al antibiótico ampicilina y Leu2d
(\beta-isopropilmalato deshidrogenasa) para
selección de S. cerevisiae transformado y un origen de
replicación de E. coli. La secreción se consigue fusionando
la secuencia de líder SUC2 con el extremo amino el producto
de V_{H}H de acuerdo con Harmsen, M. M. y col (1993) Gene 125,
115-123.
Los clones HPL#14 y HPL#16, que carecen del
sitio BstEII, se clonaron como fragmentos de
PstI/NotI (que incluyen su región de bisagra) en el
plásmido de secreción pUR1400, que es idéntico a pUR4585 excepto con
el sitio de clonación NotI adicional situado entre el sitio
BstEII y la etiquetas myc/hexahistidina. De esta manera se
obtuvieron las construcciones de plásmido pUR5265 y pUR5266 que
contenían los genes de V_{H}H de los clones HPL#14 y HPL#16
respectivamente.
Los transformantes en E. coli que
contenían las construcciones de lanzadera de S. cerevisiae
con los genes de V_{H}H se identificaron mediante selección de PCR
usando cebadores M13REV y M13U para amplificación del inserto que
codifica V_{H}H y mediante análisis de enzima de restricción en
ADN plasmídico. Se usó ADN plasmídico purificado con el kit
Quick-prep (Qiagen) para transformación de S.
cerevisiae cepa VWK18gal1::URA3, ura3,leu2 mediante el
procedimiento de acetato de litio descrito por Gietz, R. D. y col
(1995) Yeast 11(4), 355-360.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se cultivaron dos clones de cada construcción
durante 24 horas a 30ºC en medio YNB (Nitrógeno de Levadura al
0,67% sin aminoácidos (Difio)) que contenía glucosa al 2%. Para la
expresión génica de V_{H}H ambos pre-cultivos se
diluyeron 1/10 en 1 ml de medio YPD (extracto de levadura al 1%,
peptona al 2%, glucosa al 2% y galactosa al 2%) para inducción del
promotor GAL 7 y se cultivaron durante 48 horas a 30ºC usando
placas de cultivo de 8 pocillos para el cultivo. La producción de
V_{H}H en la fracción de medio de estos clones se examinó
mediante análisis en un gel de poliacrilamida teñido con azul de
Coomassie. Sus características funcionales se confirmaron en ELISA
en HPL biotinilada inmovilizada indirectamente y en el ensayo de
actividad enzimática de lipasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de confirmar las características de
unión e inhibidoras observadas anteriormente con los fragmentos
V_{H}H producidos por E. coli, los transformantes de S.
cerevisiae se indujeron en matraces agitadores de 250 ml usando
30 ml de medio de cultivo como se ha descrito en la sección 3.1. A
continuación de 48 horas de la inducción, la fracción de medio se
separó de las células por centrifugación. Para purificación a través
de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) 12 ml de
cada fracción de medio se ajustaron a NaH_{2}PO_{4} 50 mM (pH
8,0), Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y NaCl 100 mM y se
añadieron a 1 ml de material de columna TALON (CLONTECH). Los
fragmentos V_{H}H marcados con hexahistidina se unieron a los
iones metálicos inmovilizados de forma discontinua rotando el
material de columna sobre sí mismo durante 30 minutos; se realizó el
lavado del material de la columna con tampón de sonicación y la
elución con imidazol 100 mM (Sigma) de acuerdo con las instrucciones
del distribuidor (CLONTECH). Después de retirar el imidazol por
diálisis frente a PBS, se determinó la cantidad de V_{H}H
purificado midiendo la densidad óptica a 280 nm usando el
coeficiente de extinción molar calculado. El análisis en un gel de
proteína teñido con Coommassie confirmó la pureza y la cantidad
medida de V_{H}H. Se purificaron entre 100 y 500 \mug de
fragmento de anticuerpo a partir de 12 ml de cultivo.
Los resultados de las mediciones de ELISA se
proporcionan en la Figura 2A.
\vskip1.000000\baselineskip
Levaduras que comprendían pUR5099, pUR5097,
pU5263 y pUR5264 que codifican los dominios de V_{H}H de HPL#11,
HPL#15, HPL#18 y HPL#19 respectivamente se cultivaron e indujeron en
un litro de medio YPD. Las células se retiraron por centrifugación
y la fracción de medio que contenía el fragmento de anticuerpo se
concentró cinco veces con una unidad de diálisis (Hemophan fiber
dialyzer GFSplus 12, Gambro, Breda9). HPL#11, HPL#15 y HPL#18 se
purificaron por cromatografía de afinidad en proteína A sefarosa
(Pharmacia).
HPL#19, que no se unió a la proteína A, se
purificó con IMAC, produciendo 3,7 mg de V_{H}H por litro de
cultivo. Después de diálisis frente a PBS, las fracciones se pueden
usar para experimentos de inhibición en jugos intestinales.
\vskip1.000000\baselineskip
Una llama macho se inmunizó con Lipasa Gástrica
Humana purificada como se ha descrito en Moreau, H. y col (1992) J.
Mol. Biol. 225(1), 147-153 de acuerdo con el
procedimiento indicado anteriormente y se realizó la titulación de
muestras de sangre en enzima biotinilada en ELISA como se ha
descrito en el Ejemplo 1. (Figura 3A).
El título de anticuerpos inhibidores se
determinó en un ensayo enzimático, en el que se usó éster de
resorufina de ácido
1,2-0-dilauril-rac-glicero-3-glutárico
(DGGR, Boehringer Mannheim) como sustrato cromogénico. Para el
ensayo se preincubaron 5 \mul de solución de HGL (0,1 mg/ml) con
10 \mul de muestra de suero (diluida) en el pocillo de una placa
de microtitulación. La reacción se inició mediante la adición de 165
\mul de tampón que contenía MES 100 mM pH 6,0 y NaCl 0,6 M y 20
\mul de solución de DGGR (1 mg/ml en solución de dioxano/Thesit
(1:1)). La cinética de la conversión enzimática se midió a 572 nm
durante un periodo de 30 minutos a 37ºC con un espectrofotómetro
Spectramax. Con este ensayo el título de anticuerpos inhibidores de
enzimas se determinó en muestras de suero tomadas después de
diferentes intervalos de tiempo (Figura 3B).
Se aisló ARN de los linfocitos de una muestra de
sangre tomada 9 semanas después del inicio de la inmunización. Se
preparó ADNc con cebador aleatorio y se usó para la amplificación de
fragmentos V_{H}H obtenidos de bisagra corta y bisagra larga, que
se clonaron el vector de fagémido pU5071. Se construyó un genoteca
obtenida de bisagra corta, que contiene 5,4 x 10^{7} clones y una
genoteca obtenida de bisagra larga con 4,5 x 10^{7} clones.
Se realizaron selecciones con Lipasa Gástrica
Humana biotinilada 20 y 60 nM en la primera ronda y posteriormente
con lipasa 1 ó 6 nM durante la segunda ronda de acuerdo con el
procedimiento descrito en el párrafo 2.2. Durante la primera ronda
se usaron condiciones fisiológicas (PBS), mientras que en la segunda
ronda se imitaron las condiciones del estómago disminuyendo el pH a
4,5 con tampón de acetato de sodio 25 mM e inclusión de proteasas
pepsina. De esta manera los fragmentos de anticuerpo resistentes a
ácido y proteasa se recuperaron a partir de la genoteca.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los sobrenadantes de cultivo de clones
individuales cultivados e inducidos en placas de microtitulación se
analizaron en ELISA en HGL inmovilizada indirectamente y en el
ensayo de actividad enzimática. Aproximadamente del 30 al 60% de los
fragmentos de anticuerpo que reconocen enzima demostraron que
inhiben la enzima.
Las secuencias de 8 segmentos de genes se
proporcionan más adelante, según las cuales las regiones CDR se
indican en negritas. Los segmentos de gen que codifican V_{H}H se
podrían clasificar en cuatro grupos de acuerdo con la longitud de su
CDR3 (véase más adelante). Los cuatro grupos son: HGL#1 y HGL#16;
HGL#4 y HGL#10; HGL#8, HGL#9 y HGL#15 y HGL#11.
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\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los clones HGL#1, HGL#8, HGL#9,
HGL#10, HGL#11 y HGL#16 los fragmentos de genes que codifican
V_{H}H se digirieron con PstI y BstEll a partir del
vector de expresión de fago pUR5071. Los fragmentos de ADN se
clonaron en el plásmido episomal de S. cerevisiae pUR4547,
que dirige la secreción de dominios de V_{H}H sin etiquetas. De
esta manera se obtuvieron pUR5251, pUR5252, pUR5253, pUR5254,
pUR5255, pUR5256 codificando los dominios de V_{H}H de los clones
HGL#1, HGL#8, HGL#9, HGL#10, HGL#11 y HGL#16 respectivamente. Los
fragmentos de PstI/BstEII también se clonaron en el
plásmido episomal de S. cerevisiae pUR4585, que es
responsable de la secreción del dominio de V_{H}H que contiene una
etiqueta myc y una hexahistidina en su extremo carboxilo. Se
obtuvieron los clones codificados pUR5257, pUR5258, pUR5259,
pUR5260, pUR5261 y pUR5262 que contenían los insertos codificantes
de V_{H}H de los clones HGL#1, HGL#8, HGL#9, HGL#10, HGL#11 y
HGL#16 respectivamente.
Los fragmentos V_{H}H se purificaron con IMAC
(de acuerdo con el procedimiento descrito en el párrafo 3.2) usando
12 ml de sobrenadante de cultivo de los clones inducidos que
contenían la etiqueta de hexahistidina. El rendimiento se determinó
midiendo la densidad óptica a 280 nm usando el coeficiente de
extinción molar calculado.
La eficacia del reconocimiento de HGL se
determinó para cada anticuerpo individual con ELISA usando enzima
recubierta indirectamente (Figura 4A) y el grado de inhibición con
el ensayo enzimático (Figura 4B).
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de las propiedades de inhibición de
los anticuerpos de acuerdo con la invención se puede realizar de
acuerdo con el procedimiento descrito en Carriere y col en
Gastroenterology 1993: 105: 876-888.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti-HGL8
(Ejemplo 4) y anti-HPL18 (Ejemplo 3) se ensayaron
para determinar inhibición de captación de grasas en un modelo
animal. Para asegurar la inhibición de lipasa máxima en este ensayo
inicial, los inhibidores de lipasa gástrica y pancreática se
ensayaron en combinación.
Se ensayó la reactividad cruzada de
anti-HPL18 con lipasa pancreática porcina (PPL)
(Figura 5). En lugar del patrón de HPL suministrado con el ensayo
de lipasa, se usó PPL (Fluka nº 62300; lipasa de páncreas de cerdo;
20 U/mg). La lipasa se disolvió en PBS (4 mg/ml) y se centrifugó (2
min, 15600 x g). El sobrenadante se diluyó (70 \mul de
sobrenadante + 930 \mul de PBS) y se usó como patrón de PPL como
se ha descrito para HPL. La reactividad cruzada de
anti-HGL8 con lipasa gástrica porcina se ensayó por
transferencia de western usando extractos gástricos de cerdo.
A lechones macho de aproximadamente 15 kg se
suministraron cantidades diferentes de anticuerpos
anti-HGL y anti-HPL como parte de
una dieta alta en grasa. Como un control, cada animal también
recibió una dieta sin adición de fragmento de anticuerpo. La dosis
de fragmento de anticuerpo se eligió de manera que hubiera
suficiente anticuerpo presente para inhibir toda la lipasa gástrica
o pancreática, basándose en la suposición de que los lechones
producían aproximadamente la misma cantidad de lipasa de tracto GI
que los seres humanos: 25 mg de HGL y 250 mg de HPL por comida.
Como no se conocía la estabilidad in vivo de los fragmentos
de anticuerpo, se eligió una segunda dosis de anticuerpo basándose
en un exceso de fragmento con respecto a lipasas.
Se insertaron catéteres yugulares bajo anestesia
en tres lechones macho de aproximadamente 15 kg. Se dejó que los
lechones se recuperaran durante 6 días. Durante este tiempo se
suministraron 120 g dos veces al día (bigbatterikorrel
ID-Leystad, Los Países Bajos). En la tarde anterior
al suministro del alimento de ensayo, el suministro se limitó a 60
g. Para permitir que los lechones se acostumbraran a extracto de
levadura adicional en sus dietas, después del día 2 el alimento se
complementó mediante adición de un sobrenadante de fermentación de
S. cerevisiae obtenido a partir de S. cerevisiae
gal1LEU (una cepa prototrófica que no expresa fragmentos de
anticuerpos inhibidores de lipasa) a un nivel del 4%. También
después del día 2, el nivel de grasa en el alimento se aumentó
mediante la adición de aceite de girasol al 5% (C1000).
Los anticuerpos se prepararon a partir de los
sobrenadantes de los transformantes de S. cerevisiae
apropiados mediante concentración con una unidad de diálisis
(Hemophan fiber dialyzer GFSplus 12, Gambro, Breda) seguido de
secado por congelación. La concentración de anticuerpo se ajustó de
manera que el alimento se pudiera preparar mediante la adición de 10
ml de solución que contenía anticuerpo. Las dosis de anticuerpo
proporcionadas se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron muestras de sangre de un catéter
yugular en intervalos de 30 minutos prolongándose de
1-6 horas después de la alimentación. Como es común
para estos tipos de estudios (Reitzma y col, 1994), la cantidad
total de triglicéridos (TG) se determinó como el área bajo la curva
de concentración de TG o FFA con respecto al tiempo. De esta manera
se midió la concentración cumulativa de los 11 puntos de tiempo
entre 1-6 horas. Los resultados se muestran en la
Tabla 2.
En dos de los tres animales, hubo una reducción
marcada en los niveles de triglicéridos sanguíneos cuando los
animales recibieron alimento que contenía la combinación de
anticuerpo inhibidor de lipasa en comparación con la comida de
control. Esto indica que los anticuerpos, de hecho, inhibieron la
digestión y captación de grasas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> UNILEVER N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE ANTICUERPOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> F7526-EP
(VL;ff;HLJ/JVT)seqlis05Jul00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00200930.6-2116
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-03-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
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<400> 3
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\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 13
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> lama sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> lama sp.
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<400> 9
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<400> 10
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\hskip1cm
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<211> 13
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<212> PRT
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<400> 11
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\hskip1cm
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<400> 13
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<400> 15
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\hskip1cm
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<400> 16
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\hskip1cm
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<210> 17
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> lama sp.
\newpage
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
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<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> lama sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
Claims (11)
1. Un anticuerpo o fragmento del mismo, capaz de
unirse específicamente a una o más lipasas dietéticas humanas,
comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un dominio
variable de cadena pesada derivado a partir de una inmunoglobulina
desprovista de forma natural de cadenas ligeras.
2. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 1, capaz de unirse específicamente a
lipasa pancreática Humana.
3. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 2, que comprende 3 regiones CDR, por
lo cual CDR3 tiene una de las siguientes secuencias:
DVRPYRTSRYLEX_{3}, QVRVRFSSDYTNY, LlRRKFTSEYNEY, LlTRWDKSVNDY,
RRSNYDRSWGDY, LlSSYDGSWNDY, HITPAGSSNYVYGY o DIRKRFTSGYSHY, en la
que X_{3} es V o L o I.
4. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una de las secuencias
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 1, capaz de unirse específicamente a
lipasa gástrica Humana.
6. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 5, que comprende 3 regiones CDR, por
lo cual CDR3 tiene una de las siguientes secuencias:
ARSLX_{1}X_{2}TPTSYDY, RGGLTQYSEHDY, TGAEGHY, TDMGRYGTSEW; en la
que X_{1} es V o E y X_{2} es Q o L.
7. Un anticuerpo o fragmento del mismo, de
acuerdo con la reivindicación 6, que tiene una de las
secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un producto alimenticio que comprende un
anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones 1-7.
9. Un producto farmacéutico que comprende un
anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones 1-7.
10. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo
de acuerdo con la reivindicación 1-7 en la
preparación de un medicamento o alimento para inhibir la actividad
de una o más enzimas dietéticas humanas en el cuerpo humano.
11. Uso de un producto alimenticio de acuerdo
con la reivindicación 8 para el control cosmético de peso corporal
de seres humanos.
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