CN108329391A - 使用rankl结合肽抑制骨质吸收 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法。更具体地,提供这样的方法,其中将针对RANK‑L的多肽以较低的频率和/或较低的剂量施用给受试者,同时在所述受试者中在出乎意料的延长的时期中,特别是鉴于所施用的剂量,仍然保持对骨质吸收和/或破骨细胞活性的有效抑制。
Description
本申请是申请日为2012年5月29日、发明名称为“使用RANKL结合肽抑制骨质吸收”的中国专利申请No.201280025949.6的分案申请。
发明领域
本发明涉及使用针对核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L,Receptor Activatorof Nuclear factor Kappa B Ligand)的氨基酸序列在延长的时间期间内抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法。更具体地,本发明提供针对RANK-L的多肽,所述多肽在特定的剂量范围内可用于抑制RANK-L介导的骨质吸收或破骨细胞活性。
发明背景
骨的重塑(更新)是这样的过程,即通过该过程不断地吸收(去除)和形成(替换)成人骨。骨的重塑包括通过成骨细胞合成骨基质和其通过破骨细胞的再吸收。破骨细胞,来源于造血细胞,是巨噬细胞组织的独特形式,其具有再吸收骨组织的能力。成骨细胞是具有分泌骨胶原蛋白能力的特化的成纤维细胞。在连接骨形成和骨质吸收过程的这些骨细胞活动之间存在精巧的协调作用。
骨重塑由RANK-L/RANK和RANK-L诱饵受体OPG之间的平衡控制。RANK-L及其受体RANK是破骨细胞发育和活化所必需的。OPG,一种分泌的蛋白,是破骨细胞成熟和破骨细胞活化的有效抑制剂。在正常的骨体内平衡中,RANK-L和OPG参与紧密控制破骨细胞由单核细胞前体生成的细胞因子轴。RANK-L,其由成骨细胞和骨髓基质细胞表达,结合其功能受体RANK,以刺激由前体细胞分化破骨细胞和成熟的破骨细胞的增殖和活性。OPG,其由成骨细胞、基质细胞、树突细胞和巨核细胞表达,通过作用为RANK-L的可溶诱饵受体而限制该过程。
TNF家族分子RANK-L由在人染色体13q14上的单一基因(rankl)编码。RANK-L mRNA在骨和骨髓中、以及在淋巴组织(淋巴结、胸腺(thumus)、脾、胎儿肝脏和派伊尔小结(Peyer’s patches))中以最高水平表达(Anderson等,1997,Nature(自然)390:175-179;Wong等,1997,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272:25190-25194;Lacey等,1998,Cell(细胞)93:165-176;Yasuda等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95:3597-3602)。RANK-L mRNA的可变剪接允许表达为316或270个氨基酸的II型跨膜糖蛋白或243个氨基酸的可溶配体(Kong等,1999,Nature(自然)397:315-323;Nagai等,2000,BiochemBiophys.Res.Commun.(生物化学和生物物理学研究通讯)269:532-536)。另外,RANK-L可以通过金属蛋白酶、包括TNF-α转化酶由其膜结合状态释放(Lum等,1999,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)274:13613-13618)。RANK-L的所有四种同种型缔合成能够促发破骨细胞生成的三聚体分子。
RANK(NFκB的受体激活剂,还称为TRANCE-R,ODAR或TNFRSF11A),其在前破骨细胞(preosteoclastic cell)上表达,是这些细胞上关于RANK-L的唯一受体(Li等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97:1566-1571)。RANK-L激活RANK之后是其与TNF受体-相关(TRAF)家族成员的相互作用,激活核因子(NF)-κB和c-Fos,JNK,c-src和丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB(Anderson等,1997,Nature(自然)390:175-179;Hsu等,1999,Proc.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)96:3540-3545)。
OPG(护骨蛋白;“骨保护剂”;还称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF))是一种由激活的成骨细胞产生并释放的可溶的、110-kDa、二硫键连接的、同源二聚体糖蛋白(Simonet等,1997,Cell(细胞)89:309-319),具有与TNF受体家族的同源性,其作用为RANK-L的诱饵受体,且与RANK竞争结合RANK-L。因此,OPG是破骨细胞成熟和破骨细胞活化的有效抑制剂(Simonet等,1997,Cell(细胞)89:309-319;Lacey等,1998,Cell(细胞)93:165-176;Kong等,1999,Nature(自然)397:315-323),由此减少骨质吸收。
在Khosla,(2001Endocrinology(内分泌学)142:5050-5055),Holstead Jones等(2002,Ann.Rheum.Dis.(年度风湿病)61(增刊II):ii32-ii39),Bezerra等(2005,Brazilian J.Med.Biol.Res.(巴西医学生物学研究杂志)38:161-170)和McClung(2006,Current Osteoporosis Reports(当代骨质疏松症报告)4:28-33)中记述了OPG/RANK-L/RANK系统作为骨形成和破坏的介体的更详细的概述。
当在骨的重塑活动的再吸收和形成成分之间存在不平衡时(骨体内稳态的解离),发生一些骨的病症。破骨细胞和成骨细胞活性之间的不平衡可以由广泛种类的激素改变或炎性因子和生长因子的混乱引起,诸如例如改变的OPG和RANK-L之间的平衡。当骨质吸收大于骨的形成时,随着时间过去在骨中存在净损失。这最终可以导致低骨质(骨质减少)或骨质疏松。当骨形成超过再吸收时,在骨质中存在净增加(骨硬化症)。
由于较高的RANK-L、较低的OPG或二者引起的过量骨损失或破坏已经参与许多疾病状态,包括绝经后骨质疏松症(Eghbali-Fatourechi等,2003,Journal of ClinicalInvestigation(临床研究杂志)111:1221-1230;Tsangari等,2004,Bone(骨)35:334-342;Abdallah等,2005,Calcified Tissue International(国际钙化组织)76:90-97)。
在十多年以来已经可以获得降低骨折危险的药学试剂。抗分解代谢药(anticatablolic drugs)(雌激素,二膦酸盐,降钙素和选择性雌激素受体调节剂)降低骨质吸收,而同化激素类药,诸如重组的人甲状旁腺激素(PTH),增加骨的形成和骨的尺寸。二膦酸盐种类的药物是最常用于治疗骨质疏松症的一种药物。尽管该药物种类通常是非常安全的,但是口服给药是复杂的,且已经在少量百分比的临床实践患者中与胃肠不利事件相关。临床试验正评估增加静脉内二膦酸盐给药的时间间隔。
最近的发现,即OPG/RANK-L/RANK系统作为骨的疾病和病症如骨质疏松症发病机理中的关键调控因子,为治疗剂提供了特有的靶标。在实验室动物和在人类中,施用各种形式的OPG显著抑制破骨细胞活性,且提高骨强度(Bekker等,2001,J.Bone Miner.Res.(骨矿物质研究杂志)16:348-360;Campagnuolo等,2002,Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)46:1926-1936;Bezerra等,2005,Brazilian J.Med.Biol.Res.(巴西医学生物学研究杂志)38:161-170;McClung 2006,Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4:28-33)。在早期的人类研究中,针对RANK-L的完整人抗体(地舒单抗(Denosumab))减少骨的更新,且提高骨密度(Body等,2003,Cancer(癌症)97:887-892;Bekker等,2004,J.BoneMiner.Res.(骨矿物质研究杂志)19:1059-1066;McClung 2006,Current OsteoporosisReports(现代骨质疏松症报告)4:28-33;Lewiecki 2006,Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6:1041-1050;McClung等,2006,N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)354:821-831)。然而,这样的完整抗体面临完整大小抗体的缺点,如高生产成本,低稳定性,和它们的大尺寸,其例如阻碍它们接近某些隐藏的表位。
发明概述
本申请人已经发现给人受试者施用本文所述的特异性结合RANKL的多肽(本文还称为“本发明的多肽”)在所述人受试者中对骨质吸收和/或破骨细胞活性提供出乎意料地持续的、持久的作用,如通过相关生物标记(诸如CTX-1,NTX-1TRACP5b,PINP,和/或BAP)的变化观察到的。例如,可以在施用后持续至少30天测量一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记的变化。所述一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记的变化可以长时期持续,诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天,至少240天,至少270天,至少300天,至少330天,至少360天。这种作用也是快速获得的,在一些实施方案中,在施用特异性结合RANKL的多肽后8小时之前观察到生物标记的减少。
对RANK-L介导的骨质吸收和破骨细胞活性的这种出乎意料的持续、持久的作用主要是由于本发明的多肽的体内功效(IC50)引起,本发明的多肽的体内功效要比基于背景技术和临床前信息预测的功效好得多。由于本发明的多肽的这种更好的功效,导致与基于临床前建模评估的作用相比,在人受试者中观察到出乎意料地持续的、持久的对RANK-L介导的骨质吸收和破骨细胞活性的作用。因此,需要施用较少的治疗分子(即,较低的剂量),或需要实行频率较低的治疗剂分子给药,从而获得相同的对RANK-L介导的骨质吸收和破骨细胞活性的作用(通过相关的生物标记的变化观察到,所述生物标记诸如CTX-1,NTX-1,TRACP5b,PINP,和/或BAP)。
因此,本发明涉及本文所述的多肽用于在受试者中在出乎意料的持久时期内抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性的应用,特别是考虑到所施用的剂量。本发明还提供给本文所述的多肽的受试者的较低频率和/或较低剂量的施用,同时仍然保持在所述受试者中在出乎意料的持久时期内对骨质吸收和/或破骨细胞活性的有效抑制,特别是考虑到所施用的剂量。特别地,本发明提供药物活性试剂、组合物、方法和/或给药方案,其与本领域目前所用的和/或已知的试剂、组合物、方法和/或给药方案相比,具有特定的优点,包括较不频繁地给药或以较低剂量施用从而获得相等的抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性的作用的能力。
按照本发明的一个方面,提供用于在受试者中抑制骨质吸收或破骨细胞活性的方法。所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L)的多肽(也称为“本发明的多肽”)。施用的多肽的量在使用后持续至少30天有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态的标记。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约10mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述骨代谢的标记选自I型胶原的交联端肽(CTX-1),I型胶原的N-端端肽(NTX-1),抗酒石酸酸性磷酸酶同工型5b(TRACP5b),I型原胶原的N端前肽(P1NP)和骨特异性碱性磷酸酶(BAP)。在一些实施方案中,CTX-1,NTX-1,TRACP5b,P1NP和BAP中的一种或多种分别使用对CTX-1,NTX-1或TRACP5b特异性的ELISA测定;对P1NP特异性的放射性免疫测定或对BAP特异性的免疫酶学测定检测。
按照本发明的另一个方面,提供用于在受试者中抑制骨质吸收或破骨细胞活性的方法。所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽(本发明的多肽)。与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.003mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.003mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持至少30%的CTX-1血清水平持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少150天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少150天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约150天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少180天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少180天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约180天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约180天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少210天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少210天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约210天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约210天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续至少270天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低CTX-1血清水平至少30%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少30%持续至少270天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约270天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少30%,持续约270天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少约60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少约90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约30天至3个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少约30天至3个月。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少约120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续至少150天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少150天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约150天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续至少180天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续至少180天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约180天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约3个月至6个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续约3个月至6个月。在一些实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约3个月,并且所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约3个月,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约6个月至1年。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少45%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少45%持续约6个月至1年。在一些实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约6个月,并且所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少45%,持续约6个月,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少50%,持续至少30天,诸如在施用后持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,在施用后至少150天,在施用后至少180天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少50%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少50%持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,在施用后至少150天,在施用后至少180天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少60%,持续至少30天,诸如在施用后持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,在施用后至少150天,在施用后至少180天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少60%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少60%持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,在施用后至少150天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续至少30天,诸如在施用后持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少70%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少70%持续至少60天,在施用后至少90天,在施用后至少120天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少70%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少70%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少70%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少70%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少70%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少70%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少70%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少70%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少70%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少70%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少80%,持续至少30天,诸如在施用后持续至少60天,在施用后至少90天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低CTX-1血清水平至少80%,并且在施用后维持CTX-1血清水平至少80%持续至少60天,在施用后至少90天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少80%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后CTX-1减少至少80%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约60天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约0.003mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约0.003mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约60天。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约150天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约0.01mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约0.01mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约150天。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约90天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约0.03mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约0.03mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约90天。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约210天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约0.1mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约0.1mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约210天。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约210天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约0.3mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约0.3mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约210天。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约270天,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%,并且其中所述多肽施用的量少于或等于约1mg/kg/月。因此,本发明还提供本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽以少于或等于约1mg/kg/月的量施用,并且,其中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且维持在至少30%至施用后约270天。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少30%。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平至少70%。
在一些实施方案中,所述多肽以单剂量施用。
在一些实施方案中,所述多肽皮下施用。
在一些实施方案中,通过针对CTX-1的ELISA测定确定,受试者中的骨质吸收得到抑制。
在一些实施方案中,所述受试者患有骨质疏松症,例如人受试者,诸如女性人受试者,并且在一些具体的实施方案中,是绝经后女性人受试者。
按照本发明的另一个方面,提供用于在受试者中抑制骨质吸收或破骨细胞活性的方法。所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L)的多肽(本发明的多肽)。与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效减少I型胶原的N端端肽(NTX-1)至少30%,如通过尿中NTX-1与肌酸酐的比率确定的。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)尿液水平至少30%,并且在施用后维持I型胶原的N端端肽(NTX-1)尿液水平至少30%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少180天(或6个月)。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少180天(或6个月)。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约180天(或6个月),并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少10个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少10个月。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约10个月,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续至少12个月(或约360天)。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少30%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少30%持续至少12个月(或约360天)。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约12个月(或约360天),并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效减少I型胶原的N端端肽(NTX-1)至少45%,如通过尿中NTX-1与肌酸酐的比率确定的。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约30天至3个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少约30天至3个月。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少150天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少150天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约150天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约3个月至6个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续约3个月至6个月。在一些实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约3个月,并且所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约3个月,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少180天(或6个月)。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少180天(或6个月)。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约180天(或6个月),并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少210天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续至少210天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约210天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续至少6个月至1年。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少45%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少45%持续约6个月至1年。在一些实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约6个月,并且所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少45%,持续约6个月,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)至少70%,如通过尿中NTX-1与肌酸酐的比率确定的。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低NTX-1尿液水平至少70%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少70%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少70%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少70%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少70%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少70%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少70%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少70%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少70%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少90天,诸如在施用后至少120天,在施用后至少150天,在施用后至少180天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少90天,在施用后至少120天,在施用后至少150天,在施用后至少180天,持续这些中间的时间,或者如本文其他地方所述和本文描述的实施例中以及附图中所示那样更久。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,所述多肽的施用量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)-1)至少20%,作为尿液中NTX-1与肌酸酐的比率确定的。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽的施用量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)的尿液水平至少200%,并且在施用后维持I型胶原的N端端肽(NTX-1)的尿液水平至少20%持续约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少180天(或6个月)。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少180天(或6个月)。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约180天(或6个月),并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少10个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少10个月。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约10个月,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续至少12个月(或约360天)。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少20%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少20%持续至少12个月(或约360天)。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少20%,持续约12个月(或约360天),并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)至少80%,如通过尿中NTX-1与肌酸酐的比率确定的。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低NTX-1尿液水平至少80%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少80%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少80%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少80%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少80%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少80%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续约30天至3个月。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低NTX-1尿液水平至少80%,并且在施用后维持NTX-1尿液水平至少80%持续至少约30天至3个月。在一些实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后NTX-1减少至少80%,持续约30天,并且所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,受试者尿液中NTX-1与肌酸酐的比率通过关于NTX-1的ELISA测定确定。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时之前有效降低NTX-1尿液水平至少30%。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时之前有效降低NTX-1尿液水平至少45%。
在一些实施方案中,所述多肽施用的量到施用后8小时之前有效降低NTX-1尿液水平至少70%。
在一些实施方案中,所述多肽以单剂量施用。
在一些实施方案中,所述多肽皮下施用。
在一些实施方案中,所述受试者患有骨质疏松症,例如人受试者,诸如女性人受试者,并且在一些具体的实施方案中,是绝经后女性人受试者。
按照本发明的另一个方面,提供用于在受试者中抑制骨质吸收或破骨细胞活性的方法。所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L)的多肽(本发明的多肽)。与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低抗酒石酸酸性磷酸酶同工型5b(TRACP5b)的血清水平至少30%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低TRACP5b血清水平至少30%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少30%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少30%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少30%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少30%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少30%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少30%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少30%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少30%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,所述多肽的施用量有效降低抗酒石酸酸性磷酸酶同工型5b(TRACP5b)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少45%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少45%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少45%,持续约约30天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少45%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少45%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少45%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少45%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少45%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低TRACP5b血清水平至少45%,并且在施用后维持TRACP5b血清水平至少45%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.3mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后TRACP5b减少至少45%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,所述多肽以单剂量施用。
在一些实施方案中,所述多肽皮下施用。
在一些实施方案中,通过针对TRACP5b的ELISA测定确定,受试者中的骨质吸收得到抑制。
在一些实施方案中,所述受试者患有骨质疏松症,例如人受试者,诸如女性人受试者,并且在一些具体的实施方案中,是绝经后女性人受试者。
按照本发明的另一个方面,提供用于在受试者中抑制骨质吸收或破骨细胞活性的方法。所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L)的多肽(本发明的多肽)。与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型原胶原的N端前肽(P1NP)的血清水平至少30%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低P1NP血清水平至少30%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少30%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.003mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.003mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少30%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少30%持续至少约60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.003mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续约60天,并且所述多肽以少于或等于0.003mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少30%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少30%持续至少约90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少30%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少30%持续至少约120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.01mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少30%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.01mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型原胶原的N端前肽(P1NP)的血清水平至少45%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低P1NP血清水平至少45%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少45%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少45%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少45%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少45%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少45%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.03mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少45%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少45%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少45%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
按照本发明的另一个方面,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,施用的多肽的量有效降低I型原胶原的N端前肽(P1NP)的血清水平的(达)至少70%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所述多肽施用的量有效降低P1NP血清水平至少70%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少70%持续至少约30天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在一些实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续至少60天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少70%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少70%持续至少60天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续约30天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续至少90天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少70%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少70%持续至少90天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续约90天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续至少120天。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,所施用的多肽的量有效降低P1NP血清水平至少70%,并且在施用后维持P1NP血清水平至少70%持续至少120天。在一些实施方案中,所述多肽以至少0.1mg/kg的量施用。在特定实施方案中,所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。在其他实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后P1NP减少至少70%,持续约120天,并且所述多肽以少于或等于0.1mg/kg的量施用。
在一些实施方案中,所述多肽以单剂量施用。
在一些实施方案中,所述多肽皮下施用。
在一些实施方案中,通过针对P1NP的放射性免疫测定确定,受试者中的骨质吸收得到抑制。
在一些实施方案中,所述受试者患有骨质疏松症,例如人受试者,诸如女性人受试者,并且在一些具体的实施方案中,是绝经后女性人受试者。
本发明的方法可以用于预防和/或治疗患有骨疾病和/或病症的受试者,所述骨疾病和/或病症诸如例如,骨质疏松症,包括,但不限于,原发性骨质疏松症(primaryosteoporosis),内分泌性骨质疏松症(endocrine osteoporosis)(包括但不限于,甲状腺机能亢进hyperthyroidism),甲状旁腺功能亢进(hyperparathyroidism),库欣综合征(Cushing's syndrome)和肢端肥大症acromegaly)),遗传和先天形式的骨质疏松症(包括但不限于,成骨不全(osteogenesis imperfecta),高胱氨酸尿症(homocystinuria),门克斯综合征(Menkes'syndrome),赖利-戴综合征(Riley-Day syndrome)),由于肢体固定导致的骨质疏松症,糖皮质激素-诱发的骨质疏松症和绝经后骨质疏松症。
在一些实施方案中,本发明的多肽还包含一个或多个特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中,本发明的多肽具有的与重组可溶性RANKL(sRANKL)结合的表观KD为0.01-0.05nM,优选约0.04nM,如通过Biacore确定的。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白单可变结构域包含下述或由下述组成:一个或多个VHH结构域,一个或多个人源化的VHH结构域和/或一个或多个骆驼源化的VH结构域。在一些实施方案中,所述多肽包含一个或多个特异性结合RANKL的结构域抗体,一个或多个特异性结合RANKL且适于用作结构域抗体的氨基酸序列,一个或多个特异性结合RANKL的单结构域抗体,一个或多个特异性结合RANKL且适于用作单结构域抗体的氨基酸序列或一个或多个特异性结合RANKL的″dAb″s。
在一些实施方案中,本发明的多肽是包含两个以上特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域的多价构建体。在一些实施方案中,所述多价构建体包含两个特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域。
本发明优选的多肽是多价构建体,所述多价构建体包含下述或由下述组成:一个或多个免疫球蛋白单可变结构域,所述免疫球蛋白单可变结构域由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中:CDR1由SYPMG(SEQ ID NO:1)组成,CDR2由SITGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)组成,并且CDR3由YIRPDTYLSRDYRKY(SEQ ID NO:3)组成。
在一些实施方案中,所述多肽是包含US 2010/0104568的SEQ ID NO:755的多价构建体
(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS;SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中,所述多肽是包含下述或由下述组成的多价构建体:两个以上上文定义的免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中,所述多价构建体包含两个上文定义的免疫球蛋白单可变结构域或由两个上文定义的免疫球蛋白单可变结构域组成。
在一些实施方案中,所述多价构建体还包含至少一个半衰期延长结构部分。在一些实施方案中,所述至少一个半衰期延长结构部分特异性结合血清蛋白。在一些实施方案中,所述血清蛋白是血清白蛋白,并且特别是人血清白蛋白,甲状腺素结合蛋白,(人)转铁蛋白,纤维蛋白原,免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM,或WO 04/003019中列出的血清蛋白中的一种。
在一些实施方案中,至少一个半衰期延长结构部分包含免疫球蛋白单可变结构域或由免疫球蛋白单可变结构域组成。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白单可变结构域包含下述或由下述组成:VHH结构域,人源化的VHH结构域或骆驼源化的VH结构域。在一些实施方案中,所述至少一个半衰期延长结构部分包含结构域抗体,适于用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的氨基酸序列或″dAb″。
与血清白蛋白结合的优选的免疫球蛋白单可变结构域包含US 2010/0104568的SEQ ID NO:791(SEQ ID NO:14)或由US 2010/0104568的SEQ ID NO:791(SEQ ID NO:14)组成。
在一些实施方案中,本发明的多肽是多价构建体,其包含US 2010/0104568的SEQID NO:759或由US 2010/0104568的SEQ ID NO:759组成
(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS;SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中,本发明的多肽交叉阻断US 2010/0104568的SEQ ID NO:755(SEQ ID NO:10)或US 2010/0104568的SEQ ID NO:759(SEQ ID NO:12)与RANKL的结合。在一些实施方案中,本发明的多肽与RANKL的结合被US 2010/0104568的SEQ ID NO:755(SEQID NO:10)或US 2010/0104568的SEQ ID NO:759(SEQ ID NO:12)交叉阻断。
在一些实施方案中,所述至少一个半衰期延长结构部分包含一个或多个聚乙二醇分子。
在一个优选的方面,本发明的多肽为SEQ ID NO:12。因此,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.003mg/kg至约0.01mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.003mg/kg至约0.01mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少450%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中以NTX-1与肌酸的比率确定的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.01mg/kg至约0.03mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ IDNO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破
骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每两个月约0.3mg/kg至约1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每两个月约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每三个月约0.3mg/kg至约1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每三个月约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
在另一个优选的方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少30%,并且(在整个治疗期间)维持在至少30%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ ID NO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少45%,并且(在整个治疗期间)维持在至少45%。
在另一个方面中,本发明涉及用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括以每四个月约1mg/kg至约3mg/kg的量给所述受试者施用具有SEQ IDNO:12的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。因此,本发明还涉及具有SEQ ID NO:12的多肽,其用于抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,所述多肽以每四个月约1mg/kg至约3mg/kg的量施用,并且其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低至少70%,并且(在整个治疗期间)维持在至少70%。
发明详述
本发明的方法
本申请人已经发现给人受试者施用本文所述的特异性结合RANKL的多肽对所述人受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性提供出乎意料地持续的、持久的作用,如通过相关生物标记(诸如CTX-1,NTX-1,TRACP5b和P1NP)的变化所观察到的。因此,本发明涉及本文所述的多肽用于在出乎意料的持久的时间期间内抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的应用,特别是考虑到所施用的剂量。本发明还提供对受试者以较低的频率和/或较低的剂量施用本文所述的多肽,同时仍然在出乎意料地持久的时间期间保持对受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的有效抑制,特别是考虑到所施用的剂量。
有多种标记可用于测量骨代谢。在一个优选的方面中,骨代谢的标记选自I型胶原的C端端肽(也称为I型胶原的交联端肽)(CTX-1),I型胶原的N端端肽(NTX-1)和/或优选地NTX-1/肌酸酐(如在尿液中)的比率,抗酒石酸酸性磷酸酶同工型5b(TRACP5b),I型原胶原的N端前肽(P1NP)和骨特异性的碱性磷酸酶(BAP)。这些标记可以使用技术人员已知的和所用的标准方法来测量,诸如多种基于免疫学的测定,包括酶联免疫吸附测定(ELISA;还称为酶免疫测定(EIA)),放射性免疫测定或免疫酶学测定。适当时,也可以使用基于化学、比色和酶的测定。
例如,在一些实施方案中,CTX-1,NTX-1和TRACP5b中的一种或多种可以用对CTX-1,NTX-1或TRACP5b特异性的ELISA测定来测量;P1NP可以使用对P1NP特异性的放射性免疫测定来检测;BAP可以使用对BAP特异性的免疫酶学测定检测;和/或肌酸酐可以使用比色测定(诸如改进的Jaffe测定)来检测。
I型胶原的交联端肽(CTX-1)是由于破骨细胞活性释放的骨降解产物。引起临床显著的CTX-1减少(即,低于基线的70%(即,与治疗前或正常水平相比,超过30%的减少))的剂量认为是有生物学活性的。这是基于来源于由Christgau等.2000,Bone 26:505-511公布的数据的最小显著性变化。引起这种临床显著的CTX-1减少的剂量认为是有生物学活性的。
CTX-1的血清水平可以通过本文所述的和/或本领域已知的任意方法来确定。ELISA方法可以包括1型胶原C端肽(CTX-1)ELISA试剂盒(Biocomare;South SanFrancisco,CA,USA),I型胶原C端肽ELISA试剂盒(antibodies on line.com)和 ELISA(Cat.No.AC-02F1;Immunodiagnosticsystems Inc.,Boldon,Tyne&Wear,UK)。
1型胶原的N端端肽(NTX-1)是I型胶原的降解产物,其是细胞外基质的主要有机成分。因此,认为NTX-1是由破骨细胞活性导致的骨质吸收的生物标记。由于尿液中NTX-1的浓度随着尿液体积而变化,因此确定尿液中NTX-1与肌酸酐的比率,而不是NTX-1的尿液浓度,以校正这种变化。NTX-1的尿液水平可以通过本文所述的和/或本领域已知的任意方法确定。ELISA方法可以包括针对I型胶原交联的N-端肽(NTXI)的ELISA试剂盒(Biocomare;South San Francisco,CA,USA)和OSTEOMARK NTx尿液ELISA(Cat no.9006;InvernessMedical,Wampole Laboratories,Princteon,NJ,USA)。检测使用单克隆抗体和ELISA方法,通过质谱读取。例如,肌酸水平可以使用EnzyChromTM肌酸测定试剂盒(BioAssay Systems,Hayward,CA,USA)、肌酸酐测定试剂盒(Cell Biolabs,San Diego,CA,USA)或肌酸酐测试(Cat.No.03039070;Siemens Medical Solutions Diagnostics,Breda,Netherlands)确定。尿液NTx水平针对尿液肌酸酐标准化。ELISA结果以每mM的肌酸酐的骨胶原等价物的nM数(nM BCE)表示。
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)是一种来源于破骨细胞的酶,并且是破骨细胞数目的量度,因此被认为是骨质吸收的生物标记。TRACP5b的血清水平可以通过本文所述的和/或本领域已知的任意方法确定。ELISA方法可以包括人抗酒石酸酸性磷酸酶5b Elisa试剂盒(Life Sciences Advanced Technologies,Inc.,St.Petersburg,Florida,USA),抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(Pacific Biomarkers,Inc.Seattle,WA,USA)和测定ELISA(Cat.no.SB-TR201A;Immunodiagnostic Systems Inc.,Boldon,Tyne&Wear,UK)。
1型原胶原氨基端前肽(P1NP)在胶原被吸收到骨中之前由新合成的前原胶原(preprocollagen)的细胞外加工释放,并且被认为是关于骨形成的生物标记。P1NP的血清水平可以通过本文所述的和/或本领域已知的任意方法确定。测定方法可以包括竞争性RIA(UNIQTM P1NP RIA;Cat.no.Q67034;Orion Diagnostica Oy,Espoo,Finland),IDS-iSYS完整的I型原胶原氨基端前肽(完整的PINP)测定(Immunodiagnostic Systems Inc.,Boldon,Tyne&Wear,UK),或针对原胶原I N-端前肽(PINP)的ELISA试剂盒(Uscn Life ScienceInc.武汉,中国)。
骨特异性碱性磷酸酶(BAP)是一种作用为关于活性骨形成的生物标记的酶。BAP的血清水平可以通过本文所述的和/或本领域已知的任意方法确定。测定方法可以包括骨特异性的碱性磷酸酶ELISA试剂盒(antibodies-online Inc.Atlanta,Georgia,USA)或 BAP免疫酶学测定(Cat.no.AC-20F1;Immunodiagnostic Systems Inc.,Boldon,Tyne&Wear,UK)。
用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的示例性的方法包括给所述受试者施用本文所述的特异性结合RANKL的多肽,其中所述多肽的施用量有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记,诸如,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平、1型原胶原氨基端前肽(P1NP)的血清水平和/或NTX-1的尿液水平减少至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、诸如至少75%或甚至至少80%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低CTX-1和/或P1NP的血清水平和/或NTX-1的水平(如通过尿液中的NTX-1与肌酸的比率确定)至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、诸如至少75%或甚至至少80%。例如,所述多肽的施用量有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记,诸如减少CTX-1和/或P1NP的血清水平和/或NTX-1的尿液水平至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,59%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%或80%。
在另一个方面中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)的血清水平至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、诸如至少55%或至少60%。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低TRACP5b血清水平至少30%、更优选至少35%、更优选至少40%、更优选至少45%、更优选至少50%、诸如至少55%或至少60%。例如,所述多肽的施用量有效改变TRACP5b至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,59%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%或60%。
在一些实施方案中,提供用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中在施用后持续至少30天,所述多肽的施用量有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中所述多肽的施用量持续至少30天有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记。所述一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记的改变可以持续更久的时期,诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天,至少240天,至少270天,至少300天,至少330天或至少360天;例如(包括每个范围的端点)30-60天,60-90天,90-120天,120-150天,150-180天,180-210天,210-240天,240-270天,270-300天,300-330天,330-360天,30-90天,60-120天,90-150天,120-180天,150-210天,180-240天,210-270天,240-300天,300-360天,30-120天,60-150天,90-180天,120-210天,150-240天,180-270天,210-300天,240-330天,270-360天,30-150天,60-180天,90-210天,120-240天,150-270天,180-300天,210-330天,240-360天,30-180天,60-210天,90-240天,120-270天,150-300天,180-330天,210-360天,30-210天,60-240天,90-270天,120-300天,150-330天,180-360天,30-240天,60-270天,90-300天,120-330天,150-360天,30-270天,60-300天,90-330天,120-360天,30-300天,60-330天,90-360天,30-330天,60-360天和30-360天;或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月;例如30天-3个月,1-3个月,2-4个月,3-5个月,4-6个月,5-7个月,6-8个月,7-9个月,8-10个月,9-11个月,10-12个月,1-4个月,2-5个月,3-6个月,4-7个月,5-8个月,6-9个月,7-10个月,8-11个月,9-12个月,1-5个月,2-6个月,3-7个月,4-8个月,5-9个月,6-10个月,7-11个月,8-12个月,1-6个月,2-7个月,3-8个月,4-9个月,5-10个月,6-11个月,7-12个月,1-7个月,2-8个月,3-9个月,4-10个月,5-11个月,6-12个月,1-8个月,2-9个月,3-10个月,4-11个月,5-12个月,1-9个月,2-10个月,3-11个月,4-12个月,1-10个月,2-11个月,3-12个月,1-11个月,2-12个月,或1-12个月。
在其他实施方案中,提供用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中,在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低I型胶原的交联端肽(CTX-1)的血清水平。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低CTX-1的血清水平。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低30%-80%或更多,诸如至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47,48,59,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80%。CTX-1血清水平的减少可以持续更久的时期,诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天,至少240天,至少270天,至少300天,至少330天或至少360天;例如(包括每个范围的端点)30-60天,60-90天,90-120天,120-150天,150-180天,180-210天,210-240天,240-270天,270-300天,300-330天,330-360天,30-90天,60-120天,90-150天,120-180天,150-210天,180-240天,210-270天,240-300天,270-330天,300-360天,30-120天,60-150天,90-180天,120-210天,150-240天,180-270天,210-300天,240-330天,270-360天,30-150天,60-180天,90-210天,120-240天,150-270天,180-300天,210-330天,240-360天,30-180天,60-210天,90-240天,120-270天,150-300天,180-330天,210-360天,30-210天,60-240天,90-270天,120-300天,150-330天,180-360天,30-240天,60-270天,90-300天,120-330天,150-360天,30-270天,60-300天,90-330天,120-360天,30-300天,60-330天,90-360天,30-330天,60-360天,和30-360天;或持续至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月;例如30天-3个月,1-3个月,2-4个月,3-5个月,4-6个月,5-7个月,6-8个月,7-9个月,8-10个月,9-11个月,10-12个月,1-4个月,2-5个月,3-6个月,4-7个月,5-8个月,6-9个月,7-10个月,8-11个月,9-12个月,1-5个月,2-6个月,3-7个月,4-8个月,5-9个月,6-10个月,7-11个月,8-12个月,1-6个月,2-7个月,3-8个月,4-9个月,5-10个月,6-11个月,7-12个月,1-7个月,2-8个月,3-9个月,4-10个月,5-11个月,6-12个月,1-8个月,2-9个月,3-10个月,4-11个月,5-12个月,1-9个月,2-10个月,3-11个月,4-12个月,1-10个月,2-11个月,3-12个月,1-11个月,2-12个月或1-12个月。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240,270或280天,CTX-1减少至少30%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240或270天,CTX-1减少至少40%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180或190天,CTX-1减少至少45%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150或180天,CTX-1减少至少50%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120或150天,CTX-1减少至少60%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90或120天,CTX-1减少至少70%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60或90天,CTX-1减少至少80%。
在其他实施方案中,提供用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中,在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低I型胶原的N端端肽(NTX-1)的水平。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低NTX-1的尿液水平。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,NTX-1的水平降低30%-80%或更多,诸如减少至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47,48,59,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80%。NTX-1水平的减少可以持续更久的时期,诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天,至少240天,至少270天,至少300天,至少330天,或至少360天;例如(包括每个范围的端点)30-60天,60-90天,90-120天,120-150天,150-180天,180-210天,210-240天,240-270天,270-300天,300-330天,330-360天,30-90天,60-120天,90-150天,120-180天,150-210天,180-240天,210-270天,240-300天,270-330天,300-360天,30-120天,60-150天,90-180天,120-210天,150-240天,180-270天,210-300天,240-330天,270-360天,30-150天,60-180天,90-210天,120-240天,150-270天,180-300天,210-330天,240-360天,30-180天,60-210天,90-240天,120-270天,150-300天,180-330天,210-360天,30-210天,60-240天,90-270天,120-300天,150-330天,180-360天,30-240天,60-270天,90-300天,120-330天,150-360天,30-270天,60-300天,90-330天,120-360天,30-300天,60-330天,90-360天,30-330天,60-360天和30-360天;或者持续至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月;例如30天-3个月,1-3个月,2-4个月,3-5个月,4-6个月,5-7个月,6-8个月,7-9个月,8-10个月,9-11个月,10-12个月,1-4个月,2-5个月,3-6个月,4-7个月,5-8个月,6-9个月,7-10个月,8-11个月,9-12个月,1-5个月,2-6个月,3-7个月,4-8个月,5-9个月,6-10个月,7-11个月,8-12个月,1-6个月,2-7个月,3-8个月,4-9个月,5-10个月,6-11个月,7-12个月,1-7个月,2-8个月,3-9个月,4-10个月,5-11个月,6-12个月,1-8个月,2-9个月,3-10个月,4-11个月,5-12个月,1-9个月,2-10个月,3-11个月,4-12个月,1-10个月,2-11个月,3-12个月,1-11个月,2-12个月或1-12个月。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240,270,300,330或360天,NTX-1减少至少30%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240,270,300,330或360天,NTX-1减少至少40%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240或250天,NTX-1减少至少45%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210或240天,NTX-1减少至少50%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180或210天,NTX-1减少至少60%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,150或180天,NTX-1减少至少70%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60或90天,NTX-1减少至少80%。
在其他实施方案中,提供用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)的血清水平。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低TRACP5b的血清水平。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,TRACP5b的血清水平降低30%-80%或更多,诸如减少至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47,48,59,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60%。TRACP5b血清水平的减少可以持续更久的时期,诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天;例如(包括每个范围的端点)30-60天,60-90天,90-120天,120-150天,150-180天,180-210天,30-90天,60-120天,90-150天,120-180天,30-120天,60-150天,90-180天,120-210天,30-150天,60-180天,90-210天,30-180天,60-210天,30-210天;或持续至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月;例如30天-3个月,1-3个月,2-4个月,3-5个月,4-6个月,5-7个月,1-4个月,2-5个月,3-6个月,4-7个月,1-5个月,2-6个月,3-7个月,1-6个月,2-7个月或1-7个月。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210天,TRACP5b减少至少30%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150天,TRACP5b减少至少40%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150天,TRACP5b减少至少45%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60天,TRACP5b减少至少50%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30天,TRACP5b减少至少60%。
在其他实施方案中,提供用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低1型原胶原氨基端前肽(P1NP)的血清水平。因此,本发明还涉及本发明的多肽,其用于抑制RANK-L介导的骨质吸收和/或破骨细胞活性,其中在施用后持续至少约30天,所述多肽的施用量有效降低P1NP的血清水平。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,P1NP的血清水平降低至少30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47,48,59,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80%。P1NP血清水平的减少可以持续更久的时期,诸如诸如至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少180天,至少210天,至少240天,至少270天,至少300天,至少330天或至少360天;例如(包括每个范围的端点)30-60天,60-90天,90-120天,120-150天,150-180天,180-210天,210-240天,240-270天,270-300天,300-330天,330-360天,30-90天,60-120天,90-150天,120-180天,150-210天,180-240天,201-270天,240-300天,270-330天,300-360天,30-120天,60-150天,90-180天,120-210天,150-240天,180-270天,210-300天,240-330天,270-360天,30-150天,60-180天,90-210天,120-240天,150-270天,180-300天,210-330天,240-360天,30-180天,60-210天,90-240天,120-270天,150-300天,180-330天,210-360天,30-210天,60-240天,90-270天,120-300天,150-330天,180-360天,30-240天,60-270天,90-300天,120-330天,150-360天,30-270天,60-300天,90-330天,120-360天,30-300天,60-330天,90-360天,30-330天,60-360天和30-360天;或者持续至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月;例如30天-3个月,1-3个月,2-4个月,3-5个月,4-6个月,5-7个月,6-8个月,7-9个月,8-10个月,9-11个月,10-12个月,1-4个月,2-5个月,3-6个月,4-7个月,5-8个月,6-9个月,7-10个月,8-11个月,9-12个月,1-5个月,2-6个月,3-7个月,4-8个月,5-9个月,6-10个月,7-11个月,8-12个月,1-6个月,2-7个月,3-8个月,4-9个月,5-10个月,6-11个月,7-12个月,1-7个月,2-8个月,3-9个月,4-10个月,5-11个月,6-12个月,1-8个月,2-9个月,3-10个月,4-11个月,5-11个月,1-9个月,2-10个月,3-11个月,4-12个月,1-10个月,2-11个月,3-12个月,1-11个月,2-12个月或1-12个月。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240,270或300天,P1NP减少至少30%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180,210,240或270天,P1NP减少至少40%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180或210天,P1NP减少至少45%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180或210天,P1NP减少至少50%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150,180或210天,P1NP减少至少60%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90,120,150或180天,P1NP减少至少70%。
在特定的实施方案中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续多至30,60,90或120天,P1NP减少至少80%。
在一些所述的实施方案中,到施用所述多肽后8小时,诸如到施用所述多肽后9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时,获得CTX-1和/或NTX-1的减少。
在一些所述的实施方案中,到施用所述多肽后2天,诸如到施用所述多肽后3,4或5天,获得TRACP5b的减少。
在一些实施方案中,为了获得本文所述的出乎意料的持久和持续的作用,特异性结合RANKL的多肽以约0.001mg/kg至约10mg/kg的量施用。在一些实施方案中,剂量范围(包括每个啊范围的端点的值)包括0.003-10mg/kg,诸如0.003-3mg/kg,0.003-1mg/kg,0.003-0.3mg/kg,0.003-0.1mg/kg,0.003-0.03mg/kg,0.003-0.01mg/kg,0.01-10mg/kg,0.01-3mg/kg,0.01-1mg/kg,0.01-0.3mg/kg,0.01-0.1mg/kg,0.01-0.03mg/kg,0.03-10mg/kg,0.03-3mg/kg,0.03-1mg/kg,0.03-0.3mg/kg,0.03-0.1mg/kg,0.1-10mg/kg,0.1-3mg/kg,0.1-1mg/kg,0.1-0.3mg/kg,0.3-10mg/kg,0.3-3mg/kg,0.3-1mg/kg,1-10mg/kg,1-3mg/kg和3-10mg/kg。在一些实施方案中,具体的剂量包括0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mg/kg。
需要的剂量可以便利地以单剂量出现或作为以适当的时间间隔施用的分剂量出现,例如,作为多个每月一次的剂量,例如,一个每月一次的剂量(Q1M),二个每月一次的剂量(Q2M),三个每月一次的剂量(Q3M)或四个每月一次的剂量(Q4M)等。
在优选的方面中,本发明的多肽以每月约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。
在另一个优选的方面中,本发明的多肽以每两个月约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
在另一个优选的方面中,本发明的多肽以每三个月约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
在另一个优选的方面中,本发明的多肽以每三个月约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
优选地,本发明的多肽为SEQ ID NO:12。
提供用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用约0.003mg/kg的量的本发明的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低30%,并且在施用后维持至少30%持续至少30天。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平被减少并且维持在至少40%,诸如至少45%,至少50%,更优选至少60%或甚至至少70%或更多。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天或至少120天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低45%,并且在施用后持续至少60天维持在至少45%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.1mg/kg至1mg/kg或更多的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%,至少50%,更优选至少60%,至少70%或甚至至少80%。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少210天或甚至至少270天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的CTX-1水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天或甚至至少150天维持在至少45%。
提供用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者以约0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用本发明的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,NTX-1的水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%,更优选至少50%或甚至至少60%或更多。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天或至少90天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,NTX-1水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天维持在至少45%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.1mg/kg至1mg/kg或更多的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,NTX-1水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,NTX-1水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%,至少50%,更优选至少60%或者甚至至少70%。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少210天或甚至至少270天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,尿液中的NTX-1水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天或甚至至少150天维持在至少45%。
提供用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者以约0.003mg/kg的量施用本发明的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且维持在至少30%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天维持在至少30%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.1mg/kg或更多的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,TRACP5b的血清水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天或甚至至少90天维持在至少30%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.3mg/kg至1mg/kg或更多的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,TRACP5b的血清水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%,至少50%,或者甚至至少60%或更多。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天或甚至至少120天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的TRACP5b水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天或甚至至少90天维持在至少45%。
提供用于抑制受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者以约0.003mg/kg至约0.01mg/kg的量施用本发明的多肽,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,P1NP的血清水平降低并维持在至少40%。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天或甚至至少90天维持在至少30%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.03mg/kg的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,P1NP的血清水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%或更多。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天,或甚至至少150天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天或甚至至少90天维持在至少45%。
在另一个具体的方面中,本发明的多肽以约0.1mg/kg至1mg/kg或更多的量施用,其中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续至少30天维持在至少30%。在一些实施方案中,与治疗前或正常水平相比,P1NP的血清水平降低并维持在至少40%,诸如至少45%,至少50%,更优选至少60%,至少70%或甚至至少80%或更多。在一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低30%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天,至少150天,至少210天,或甚至至少270天维持在至少30%。在另一个具体的方面中,与治疗前或正常水平相比,血清中的P1NP水平降低45%,并且在施用后持续多至至少60天,至少90天,至少120天或甚至至少150天维持在至少45%。
在优选的方面中,本发明的多肽为SEQ ID NO:12。
本发明的多肽
免疫球蛋白单可变结构域
除非另外指明,术语“免疫球蛋白序列”—用在本文中不管是指重链抗体还是指常规的4链抗体—用作通用术语,包括完整大小的抗体,其单个链,以及其所有的部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段,分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外,术语“序列”用在本文中(例如,在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)一般应该理解为包括相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列,除非上下文需要更狭义的解释。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”可与“单可变结构域”互换使用,定义这样的分子,其中,抗原结合位点存在于单免疫球蛋白结构域上并且由单免疫球蛋白结构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规的”免疫球蛋白或其片段分开,在“常规的”免疫球蛋白或其片段中两个免疫球蛋白结构域,特别是两个可变结构域,相互作用形成抗原结合位点。典型地,在常规免疫球蛋白中,重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情形中,VH和VL二者的互补决定区(CDRs)将组成(contribute)抗原结合位点,即,总共6个CDRs将参与抗原结合位点的形成。相反,免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH或VL结构域形成。因此,免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点是由不超过三个CDRs形成的。
因此,术语“免疫球蛋白单可变结构域”和“单可变结构域”不包含常规的免疫球蛋白或其片段(其需要至少两个可变结构域的相互作用才能形成抗原结合位点)。然而,这些术语确实包含常规免疫球蛋白的片段,其中所述抗原结合位点是由单可变结构域形成的。
通常,单可变结构域是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列;或者所述氨基酸序列的任意适当的片段(那么其通常将包含形成至少一个CDR’s的氨基酸残基中的至少一些)。这样的单可变结构域和片段是最优选的,以致其包含免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。因此,例如,单可变结构域可以包含轻链可变结构域序列(例如,VL-序列)或其适当的片段;或重链可变结构域序列(例如VH-序列或VHH序列)或其适当的片段;只要其能够形成单一抗原结合单位(即,功能性抗原结合单位,其基本上由单可变结构域组成,以使所述单一抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用形成功能性抗原结合单位,例如,如例如在常规抗体和scFv片段(其需要与另外的可变结构域相互作用–例如通过VH/VL相互作用–才能形成功能性抗原结合结构域)中存在的可变结构域的情形)。
在本发明的一个实施方案中,免疫球蛋白单可变结构域是轻链可变结构域序列(例如VL-序列)或重链可变结构域序列(例如VH-序列);更具体地,免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
例如,单可变结构域或免疫球蛋白单可变结构域(或适于用作免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列)可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸序列),″dAb″或dAb(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文所定义,并且包括但不限于VHH序列);其它单可变结构域,或它们中任一种的任何适当的片段。对于(单)结构域抗体的概括描述,参考上文引用的现有技术,以及参考EP 0368684。对于术语“dAb’s”,例如,参考Ward等(1989,Nature(自然)341(6242):544-6),参考Holt等(2003,TrendsBiotechnol.(生物技术趋势)21(11):484-490;以及例如参考WO 04/068820,WO 06/030220,WO 06/003388与Domantis有限公司(Domantis Ltd.)的其它公布的专利申请。还应该注意到,尽管由于它们不是哺乳动物来源的,在本发明的情形中较不优选,但是单可变结构域可以来源于某些鲨鱼(shark)物种(例如,所谓的“IgNAR结构域”,参见例如WO 05/18629)。
特别地,所述免疫球蛋白单可变结构域可以是(如本文所定义)或其适当的片段。[注意: 和为埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标]。对于纳米抗体的概括描述,参考下文进一步的描述,以及本文引用的现有技术,诸如例如记述在WO 08/020079(第16页)中。
可以考虑免疫球蛋白序列、免疫球蛋白单可变结构域以及特别是纳米抗体的氨基酸序列和结构—然而不限于此—包含四个构架区或“FR’s”,其在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”;“构架区2”或“FR2”;“构架区3”或“FR3”;和“构架区4”或“FR4”;所述构架区由三个互补决定区或“CDR’s”中断,其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”;“互补决定区2”或“CDR2”;和“互补决定区3”或“CDR3”。
免疫球蛋白单可变结构域中,并且特别是纳米抗体中,氨基酸残基总数可以在110-120区间,优选112-115,并且最优选113。然而,应该注意免疫球蛋白单可变结构域且特别是纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别限制它们的长度和/或大小,只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层要求,并且还优选地适于本文所述的目的。
关于VHH’s及纳米抗体的进一步的描述,参考Muyldermans的综述论文((2001,Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74:277-302));以及参考下述专利申请,提及这些作为一般背景技术:Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678,WO95/04079和WO 96/34103;Unilever的WO 94/25591,WO 99/37681,WO 00/40968,WO 00/43507,WO 00/65057,WO 01/40310,WO 01/44301,EP 1134231和WO 02/48193;VlaamsInstituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805,WO 01/21817,WO 03/035694,WO03/054016和WO 03/055527;Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531;加拿大国家研究委员会(the National Research Council of Canada)的WO 01/90190;抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020(=EP 1 433793);以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041867,WO 04/041862,WO04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551,WO 05/044858,WO 06/40153,WO 06/079372,WO06/122786,WO 06/122787和WO 06/122825,以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其他公布的专利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术,特别是在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表,该列表和参考文献通过引用结合于此。如在这些参考文献中所述,纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。关于纳米抗体的进一步的描述,包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化,以及其他修饰,部分或片段,衍生物或“纳米抗体融合体”,多价构建体(包括接头序列的一些非限制性的实例)和提高纳米抗体的半衰期的不同的修饰以及其制剂,例如,可见于WO 08/101985和WO 08/142164。
因此,通常,纳米抗体可以进一步定义为WO 08/142164中所述的氨基酸序列(第30页第5行至第31页第7行和第108页第26行至第140页第15行)。
因此,在本发明的意思内,术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源的多肽,优选来源于骆驼科动物的多肽,优选骆驼重链抗体。其可以被人源化,如之前所述。并且,该术语包括来源于非骆驼科动物来源的多肽,例如来源于小鼠或人的多肽,其已被“骆驼源化”,如之前所述。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”包括不同来源的免疫球蛋白序列,包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物的免疫球蛋白序列。其还包括完全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白序列。例如,其包含骆驼科动物的免疫球蛋白序列和人源化的骆驼科动物的免疫球蛋白序列,或骆驼源化的免疫球蛋白单可变结构域,例如骆驼源化的dAb,如Ward等(参见,例如WO 94/04678)以及Davies和Riechmann(1994,FEBS 339:285-290;1995,Biotechnol.13:475-479;1996,Prot.Eng.9:531-537)所述。
然而,应该注意,本发明不限制本发明所用的免疫球蛋白序列(或用来表达其的核苷酸序列)的来源,也不限制产生或获得所述免疫球蛋白序列或核苷酸序列的方式。因此,本发明的免疫球蛋白序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本发明的一个具体而非限制性的方面中,免疫球蛋白序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列,包括但不限于,“人源化的”(如本文定义)免疫球蛋白序列(诸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列,特别是部分或完全人源化的VHH序列或纳米抗体),“骆驼源化的”(如本文定义)免疫球蛋白序列以及已经通过下列技术获得的免疫球蛋白序列:诸如亲和力成熟(例如,由合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植、镶盖术(veneering)、组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段、利用重叠的引物进行的PCR装配以及熟练的技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术;或前述任一项的任何适当的组合。例如,参考标准手册,以及进一步描述和本文提及的现有技术。
类似地,本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的序列,并且例如,可以是通过PCR从适当的天然存在的模板(例如,从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列,已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列,已经通过向天然存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术,诸如错配PCR)而制备的核苷酸序列,已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列,或已经利用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
针对RANKL的免疫球蛋白单可变结构域(以及包含其的多肽)已经记述在US 2010/0104568和WO 08/142164中。
例如,优选的针对RANK-L的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中:
-CDR1选自由下列各项组成的组:
a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:200);
b)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:200)具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列;
c)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:200)具有3,2或1个氨基酸差异的氨基酸序列;
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组:
d)SEQ ID NO 2的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:324);
e)与SEQ ID NO 2的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:324)具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列;
f)与SEQ ID NO 2的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:324)具有3,2或1个氨基酸差异的氨基酸序列;
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组:
g)SEQ ID NO:3的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:448);
h)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:448)具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列;
i)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:448)具有3,2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
当免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体包含一个或多个b)和/或c)所述的氨基酸序列时:
i)在b)和/或c)所述的氨基酸序列中的任意氨基酸取代是优选的,并且与a)所述的相对应的氨基酸序列比较,优选是保守氨基酸取代,(如本文定义);
和/或
ii)与a)所述的相对应的氨基酸序列比较,b)和/或c)所述的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代,没有氨基酸缺失或插入;
和/或
iii)b)和/或c)所述的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术通过亲和力成熟方式来源于a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
类似地,当免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体包含一个或多个e)和/或f)所述的氨基酸序列时:
i)在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任意氨基酸取代是优选的,并且与d)所述的相对应的氨基酸序列比较,优选是保守氨基酸取代,(如本文定义);
和/或
ii)与d)所述的相对应的氨基酸序列比较,e)和/或f)所述的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代,没有氨基酸缺失或插入;
和/或
iii)e)和/或f)所述的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术通过亲和力成熟方式来源于d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
并且,类似地,当免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体包含一个或多个h)和/或i)所述的氨基酸序列时:
i)在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任意氨基酸取代是优选的,并且与g)所述的相对应的氨基酸序列比较,优选是保守氨基酸取代,(如本文定义);
和/或
ii)与g)所述的相对应的氨基酸序列比较,h)和/或i)所述的氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代,没有氨基酸缺失或插入;
和/或
iii)h)和/或i)所述的氨基酸序列可以是使用本身已知的一种或多种亲和力成熟技术通过亲和力成熟方式来源于g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个优选的而非限制性的方面中,所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的CDR序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO:572)的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性,优选至少80%的氨基酸同一性,更优选至少90%的氨基酸同一性,诸如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100%的氨基酸同一性。这种氨基酸同一性程度可以通过例如确定所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4(US 2010/0104568的SEQ ID NO:572)之间的氨基酸同一性的程度(以本文所述的方式)而确定,其中忽视形成构架区的氨基酸残基。
在另一个优选的而非限制性的方面中,所述CDR序列与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3(US 2010/0104568的SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:324和/或SEQ ID NO:448)具有大于80%,优选大于90%,更优选大于95%,诸如99%或更多的序列同一性。
特别地,所述免疫球蛋白单可变结构域可以是这样的:CDR1选自SEQ ID NO:1;和/或CDR2选自SEQ ID NO:2;和/或CDR3选自SEQ ID NO:3。更优选地,用在本发明的多肽中的免疫球蛋白单可变结构域可以基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中:
a)CDR1选自SEQ ID NO:1;
b)CDR2选自SEQ ID NO:2;并且
c)CDR3选自SEQ ID NO:3。
用于本发明的方法中的优选的免疫球蛋白单可变结构域包括SEQ ID NO:4(US2010/0104568的SEQ ID NO:572)和/或选自由下列各项组成的组的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体:与SEQ ID NO:4具有大于80%,优选大于90%,更优选大于95%,诸如99%或更多的序列同一性的氨基酸序列。
人源化的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以是如前述段落中关于免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体概括定义的氨基酸序列,但是其中存在至少一个这样的氨基酸残基(并且特别地,在至少一个构架残基中),所述氨基酸残基是和/或对应人源化的取代。基于本文公开的内容,对于熟练的技术人员,一些优选的、而非限制性的人源化取代(及其适当的组合)将变得清楚。另外,或者备选地,通过比较天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列,可以确定其它潜在有用的人源化取代,此后,可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以本身已知的任何方式,如本文进一步所述),并且可以检测所得到的人源化的VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其它需要的特性。以这种方式,通过利用有限的试验和误差程度,熟练的技术人员可以确定其它适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外,基于前述内容,免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。
因此,在一个具体而非限制性的方面中,所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以是人源化的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体,其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中CDR1-CDR3如本文定义并且其中所述人源化的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体包含至少一个人源化的取代(如本文定义),并且特别是在至少一个其构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化的取代。
一些特别优选的人源化的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体是SEQ ID NO:4的纳米抗体(US 2010/0104568的SEQ ID NO:572)的人源化变体。
这样的人源化变体的一些优选的而非限制性的实例是SEQ ID NO’s:5-11(US2010/0104568的SEQ ID NO’s:750-756)的人源化的纳米抗体。因此,本发明还涉及具有这样的氨基酸序列的人源化的纳米抗体,所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s:5-11组成的组,或选自由与SEQ ID NO’s:5-11氨基酸序列中的至少之一具有大于80%、优选大于90%、更优选大于95%、如99%或更多序列同一性的氨基酸序列组成的组(其中与相对应的SEQID NO’s:5-11的序列相比较,选自后一组氨基酸序列的氨基酸序列可以包含较多数量或较少数量的人源化取代,只要它们保留存在于相对应的SEQ ID NO’s:5-11序列中的至少一个人源化的取代),其中特别优选SEQ ID NO:10。
特别地,用在本发明的方法中的免疫球蛋白单可变结构域可以是:
-针对(如本文定义)RANK-L并且与SEQ ID NO’s:4-11的氨基酸序列(US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:572和750-756)具有至少80%,优选至少85%,诸如90%或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列可以进一步是这样的,以致它们中和RANK与RANK-L的结合;和/或与RANK竞争与RANK-L结合;和/或针对RANK-L上的相互作用位点(诸如RANK或OPG结合位点);
-交叉阻断SEQ ID NO’s:4-11(US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:572和750-756)的至少一种氨基酸序列与RANK-L的结合和/或与SEQ ID NO’s:4-11(US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:572和750-756)的至少一种氨基酸序列竞争与RANK-L结合的氨基酸序列。同样地,这些氨基酸序列可以进一步是这样的,以致它们中和相关配体与RANK-L的结合;和/或与所述相关配体竞争与RANK-L的结合;
和/或针对RANK-L上的相互作用位点(如本文定义)(诸如RANK或OPG结合位点);所述氨基酸序列可以如本文进一步所述(且可以例如是纳米抗体);以及包含一种或多种所述氨基酸序列的本发明的多肽(其可以如本文进一步所述,且可以例如是如本文所述的双特异性和/或二互补位多肽),和编码所述氨基酸序列和多肽的核酸序列。所述氨基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配体。
按照本发明的一个非限制性的而优选的方面,所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的,以致:
-所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以以10-5至10-12摩尔/升或更小,优选10-7至10-12摩尔/升或更小并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即以105至1012升/摩尔或更大,并且优选107至1012升/摩尔或更大,并且更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))与RANK-L结合;
和/或是这样的,以致:
-所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以以102M-1s-1–约107M-1s-1,优选103M-1s-1-107M-1s-1,更优选104M-1s-1-107M-1s-1,诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与RANK-L结合;
和/或是这样的,以致它们:
-所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以以1s-1(t1/2=0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体),优选10-2s-1-10-6s-1,更优选10-3s-1-10-6s-1,诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与RANK-L结合。
优选地,所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的,以致:本发明的单价免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(或包含仅一个本发明的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体的多肽)优选是这样的,以至其将以小于500nM,优选小于200nM,更优选小于10nM,诸如小于500pM的亲和力与RANK-L结合。
本发明的多肽
用在本发明的方法中的免疫球蛋白单可变结构域和纳米抗体优选地基本上采用分离形式、或形成多肽(在本文中称为“本发明的多肽”)的一部分,其可以包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体或基本上由其组成,并且其可以任选地还包含一个或多个其它氨基酸序列(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。术语“免疫球蛋白单可变结构域”还可以包括本发明所述的多肽。例如,并且不限于,一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以用作在这样的多肽内的结合单位,所述多肽可以任选地包含可以作为结合单位的一个或多个其它氨基酸序列,以便分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽,全如本发明所述。这样的多肽还可以采用基本上分离的形式。
通常,包含单个免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体的多肽或基本上由其组成的多肽在本文中称为“单价”多肽或“单价构建体”。包含两个以上免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的多肽或基本上由其组成的多肽在本文中称为“多价”蛋白或多肽或称为“多价构建体”。
按照一个具体而非限制性的方面,本发明的多肽包含下述或基本上由下述组成:至少两个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体,诸如两个或三个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体。如本文进一步所述,与包括单一的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体或基本上由其组成的多肽相比较,所述多价构建体可以提供某些优点,如提高很多的对于RANK-L的抗体亲抗原性(avidity)。基于本文的公开内容,熟练的技术人员应该清楚所述多价构建体;所述多价纳米抗体构建体的一些优选的但非限制性的实例是US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:625,631,637,640-645,649,655,661,667,673,676-681,685,691,761,772和766(二价)和US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:697,703,709,712-717,721,727和759(三价)的构建体。
按照另一个具体的而非限制性的方面,本发明的多肽包含下述或基本上由下述组成:至少一个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体和至少一个其他结合单位(即,针对另一个表位、抗原、靶标、蛋白或多肽),所述其他结合单位优选也是一种免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体。所述多肽在本文还称为“多特异性的多肽”,或称为“多特异性的构建体”,且与相对应的单价免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体相比较,这些可以提供某些优点(一些优选的、但非限制性的多特异性构建体将通过本文的进一步讨论变得清楚)。基于本文的公开内容,熟练的技术人员应该清楚所述多特异性的构建体;所述多特异性纳米抗体构建体的一些优选的、但非限制性的实例是US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:697,703,709,712-717,721,727和759的构建体。
在另一个方面中,本发明的多肽可以包含下述或基本上由下述组成:一个或多个免疫球蛋白单可变结构域,并且任选地还包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位。熟练的技术人员通过本文进一步的公开内容将清楚,所述其他基团、残基、结构部分、结合单位或氨基酸序列可以或可以不为所述免疫球蛋白单可变结构域(和/或为其所存在于其中的多肽)提供进一步的官能性,且可以或可以不修饰所述免疫球蛋白可变结构域的特性。
例如,所述其他基团、残基、结构部分或结合单位可以是一个或多个额外的氨基酸序列,以致所述化合物或构建体是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中,所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地,所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组:结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、″dAb″’s、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
备选地,例如,所述基团、残基、结构部分或结合单位可以是化学基团、残基、结构部分,其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如,并且不限于,所述基团可以连接到一个或多个本发明的多肽上,以提供本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的“衍生物”。
如本文进一步所述,本发明的多肽可以包含两个以上针对RANK-L的免疫球蛋白单可变结构域。通常,与单免疫球蛋白单可变结构域相比,这样的多肽将以增加的抗体亲抗原性与RANK-L结合。例如,所述多肽可以包含两个针对RANK-L的相同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(confirmation)(在适用情形中)(其可以是或可以不是相互作用位点)的免疫球蛋白单可变结构域;或者包含至少一个“第一”免疫球蛋白单可变结构域,其针对RANK-L的第一个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用情形中)(其可以是或可以不是相互作用位点);和至少一个“第二”免疫球蛋白单可变结构域,其针对与所述第一个不同的第二个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用情形中)(且其同样可以是或可以不是相互作用位点)。优选地,在所述本发明的“二互补位(biparatopic)”多肽中,至少一个免疫球蛋白单可变结构域针对相互作用位点(如本文定义),尽管本发明在其最广泛意义上不限于此。例如,在WO 08/142164中进一步描述了本发明的多肽的实例。
因此,在一个特别的方面中,本发明的多肽可以包含两个以上针对RANK-L上RANK结合位点的免疫球蛋白单可变结构域;或包含至少一个针对RANK-L上RANK结合位点的“第一”免疫球蛋白单可变结构域;和至少一个“第二”免疫球蛋白单可变结构域,其针对与所述第一个不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象,且其不是RANK-L上的RANK结合位点。
本发明的多肽可以结合RANK-L的两个或三个亚基也在本发明的范围内。在一个优选而非限制性的方面中,本发明的多肽结合RANK-L三聚体的两个或三个亚基。
具体地,按照这一优选的实施方案,本发明涉及这样的多肽,其包含下述或基本上由下述组成:两个以上分别针对RANK-L上(且特别是在RANK-L三聚体上)的表位的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体,所述RANK-L上的表位位于和/或形成RANK-L三聚体受体结合位点的一部分,其中所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体以这样的方式彼此连接,以致所述多肽能够同时与单一RANK-L三聚体上的两个以上的受体结合位点结合(换言之,能够分子内结合在RANK-L三聚体上的至少两个RANK-L受体结合位点)。在该实施方案中,所述两种以上免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体优选如上文定义,且最优选是纳米抗体(以致所述多肽是多价纳米抗体构建体)。此外,在该实施方案中,所述两种以上的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以是相同的或不同的;且可以针对RANK受体结合位点之内的不同表位,但是优选是针对相同的表位。本发明该实施方案的一些优选的但非限制性的构建体为US2010/0104568的SEQ ID NO’s:625,631,637,640-645,649,655,661,667,673,676-681,685,691,697,703,709,712-717,721,727,759,761,772和766。
在上述化合物或构建体中,所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域以及所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔体连接。例如,当所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列时,所述接头可以也是氨基酸序列,以致所得到的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
在本发明的具体实施方案中,所述两个以上的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体通常将通过一个或多个适当的接头连接,所述接头是这样的,以致每个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以结合在同一RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。适当的接头将特别依赖于与所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体结合的在RANK-L三聚体上的表位(之间的距离),且基于本文的公开内容,任选地在进行一些有限程度的常规实验之后,对于熟练的技术人员将是清楚的。例如,当两个以上的免疫球蛋白单可变结构域是(单)结构域抗体或纳米抗体时,适当的接头可以选自本文所述的接头,但是具有这样的接头长度,其是这样的,以致所述两个以上的(单)结构域抗体或纳米抗体可以分别结合在同一RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。
更优选地,在这一优选的方面中,所述接头或间隔体是优选长度为1-50个或更多个氨基酸、更优选5-30个氨基酸、诸如约9-20个氨基酸的氨基酸序列。在一个优选而非限制性的实施方案中,所述接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基组成(如下文进一步所述)。例如,一种适当的接头是US 2010/0104568所述的GS9接头,其包含9个氨基酸残基,2010/0104568所述的GS15接头,其包含15个氨基酸残基,2010/0104568所述的GS20接头,其包含20个氨基酸残基,和2010/0104568所述的GS30接头,其包含30个氨基酸残基,或者本领域中已知的任意其他的接头,诸如例如在表A-1中所述。
表A-1:接头的序列表
在另一个实施方案中,所述至少两个针对RANK-L的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体彼此通过另一个结构部分(任选地通过一个或两个接头)连接,诸如通过另一种蛋白或多肽连接。在该实施方案中,在所述至少两个抗-RANK-L免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的N-端和C-端之间具有优选距离(即,如上文提及)可能是理想的,例如以致所述蛋白或多肽仍然可以进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。在该实施方案中,所述至少两个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体可以直接与所述另一结构部分连接,或使用适当的接头或间隔体连接,同样只要仍然可以获得优选的距离和/或需要的分子内结合。所述结构部分可以是任何适当的结构部分,其不降低(太多)所述多肽与RANK-L的结合和/或所述多肽进一步需要的生物学或药理学特性。因此,所述结构部分可以是基本上无活性的,或可以是有生物学活性的,且因此可以或可以不提高所述多肽的理想特性和/或可以赋予所述多肽一种或多种额外需要的特性。例如,且不限于,所述结构部分可以提高所述多肽的半衰期,和/或可以减少其免疫原性或提高任何其他需要的特性。在一个优选的实施方案中,所述结构部分可以是另一种免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(包括但不限于针对RANK-L的第三免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体,尽管这不是必需的且通常较不优选),且特别是提高所述多肽的半衰期的另一种免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体,诸如针对血清蛋白、例如针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体。所述构建体的一些非限制性的实例为US 2010/0104568的SEQ ID NO’s:697,703,709,712-717,721,717和759的构建体。
在本发明的一个具体的方面中,与相对应的本发明的多肽相比,多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步的公开内容,所述多肽的一些优选而非限制性的实例对于熟练的技术人员将变得清楚,并且例如包括下列各项:已经被化学修饰以增加其半衰期(例如,通过聚乙二醇化方式)的本发明的多肽;包括至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发明的多肽;或包括至少一个与增加本发明的免疫球蛋白单可变结构域的半衰期的至少一个结构部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容,包括所述半衰期延长结构部分的本发明的多肽的实例对于熟练的技术人员将变得清楚;并且例如,包括,但不限于,这样的多肽,其中所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(诸如,例如,结构域抗体,适合用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体,适合用作单结构域抗体的氨基酸序列,“dAb”’s,适合用作dAb的氨基酸序列,或可以结合血清蛋白如血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白如IgG或运铁蛋白的纳米抗体;参考本发明进一步的描述和提及的参考文献);这样的多肽,其中免疫球蛋白单可变结构域连接Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段;或这样的多肽,其中所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如,但不限于,记述在WO 91/01743,WO 01/45746,WO 02/076489中的蛋白和肽。还参考WO03/002609和WO 04/003019中所述的dAb’s,和参考Harmsen等(Vaccine(疫苗)23:4926-42,2005);参考EP 0368684以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 08/028977,WO08/043821,WO 08/043822,以及WO 08/068280)。
通常,用在本发明的方法中的具有增加的半衰期的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(或包含其的化合物、构建体或多肽)优选地具有是相对应的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍,如至少5倍,例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如,与相对应的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体本身相比,用在本发明的方法中的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加了超过1小时,优选超过2小时,更优选超过6小时,诸如超过12小时,或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中,用在本发明的方法中的所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如,用在本发明的方法中的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
本发明优选的多肽包含一个或多个针对RANK-L的免疫球蛋白单可变结构域,例如,根据SEQ ID NO’s:4-11所述,特别是SEQ ID NO:10,其与至少一个适于延长所述构建体的血清半衰期(优选T1/2β)的结合结构域或肽组合。在这些构建体中,“血清白蛋白结合结构域或肽”可以是能够增加所述构建体的半衰期(优选T1/2β)(与不具有所述血清-白蛋白结合肽或结合结构域的相同构建体相比)的任意适合的血清-白蛋白结合肽或结合结构域。具体地,适于延长血清半衰期的多肽序列是能够结合具有长血清半衰期的血清蛋白的多肽序列,所述血清蛋白诸如血清白蛋白,运铁蛋白(transferring),IgG等,特别是血清白蛋白。之前已经描述了能够结合血清白蛋白的多肽序列,并且特别可以是本申请人在WO 08/068280中(且特别是在WO 09/127691和WO 2011/095545中,二者均由本申请人申请)所述的血清白蛋白结合肽,或结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域(诸如结合血清白蛋白的纳米抗体;例如Alb-1或Alb-1的人源化的形式,诸如Alb-8,对于其参考例如WO 06/122787和表A-2)。
表A-2:结合白蛋白的纳米抗体的优选的而非限制性的实例
优选的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域包括SEQ ID NOs:13-15。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:14(US 2010/0104568的SEQID NO:791)或由SEQ ID NO:14(US 2010/0104568的SEQ ID NO:791)组成。
因此,在一个实施方案中,本发明涉及包含两个以上分别针对RANK-L上(例如在RANK-L三聚体上)的表位的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的多价多特异性构建体,所述RANK-L上的表位位于和/或形成受体结合位点的一部分,并且所述免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体通过至少一个提供增加的半衰期的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体(且任选地通过一个或多个适当的接头)彼此连接,以使所述多肽在与RANK-L三聚体结合时,能够抑制或减少RANK受体结合和/或由所述RANK-L三聚体介导的信号转导。所述多肽可以是这样的,以致所述前述两个以上的免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体分别可以结合RANK-L三聚体上的不同的受体结合位点。
特别地,在该实施方案中,所述多肽可以包含三价双特异性纳米抗体,其包含两个分别针对RANK-L上(且特别是RANK-L三聚体上)的表位的纳米抗体,所述表位位于和/或形成受体结合位点的一部分,其中所述纳米抗体通过提供增加的半衰期的第三纳米抗体(例如,针对血清蛋白如人血清白蛋白的纳米抗体)彼此连接,其中前述两个纳米抗体中的每一个可以直接与所述第三纳米抗体连接或通过一个或多个适当的接头与所述第三纳米抗体连接,以使所述多肽在与RANK-L三聚体结合时能够抑制或减少RANK受体结合和/或由所述RANK-L三聚体介导的信号转导。所述多肽可以是这样的,以使所述提及的两种纳米抗体可以分别结合RANK-L三聚体上的不同的受体结合位点。同样,用于本发明的该实施方案中的特别优选的纳米抗体显示在SEQ ID NO:4(US 2010/0104568的SEQ ID NO:572),及其人源化的变体和其他变体(诸如例如SEQ ID NO:10(US 2010/0104568的SEQ ID NO:755))中;和本文所述的针对人血清白蛋白的纳米抗体。本发明的该实施方案的优选的而非限制性的构建体是SEQ ID NO:12(US 2010/0104568的SEQ ID NO:759)。
例如,按照本发明的该优选方面所述的其他多肽可以选自由这样的多肽组成的组:所述多肽与SEQ ID NO:12的多肽(US 2010/0104568的SEQ ID NO:759)具有大于80%,优选大于90%,更优选大于95%,诸如99%或更多的“序列同一性”(如本文定义),其中包含在所述多肽中的纳米抗体优选如本文进一步所定义。
在一些实施方案中,在本发明的方法中施用的(本发明的)多肽(即,特异性结合RANKL的多肽)具有这样的结合重组可溶性RANKL(sRANKL)的表观KD(如通过Biacore测定确定的):0.005-0.1nM,诸如0.005-0.05nM,0.01-0.1nM,0.01-0.05nM,包括每个范围的端点值,诸如0.005nM,0.006nM,0.007nM,0.008nM,0.009nM,0.01nM,0.011nM,0.012nM,0.013nM,0.014nM,0.015nM,0.016nM,0.017nM,0.018nM,0.019nM,0.02nM,0.021nM,0.022nM,0.023nM,0.024nM,0.025nM,0.026nM,0.027nM,0.028nM,0.029nM,0.03nM,0.031nM,0.032nM,0.033nM,0.034nM,0.035nM,0.036nM,0.037nM,0.038nM,0.039nM,0.04nM,0.041nM,0.042nM,0.043nM,0.044nM,0.045nM,0.046nM,0.047nM,0.048nM,0.049nM,0.05nM,0.06nM,0.07nM,0.08nM,0.09nM或0.1nM,并且优选约0.04nM。
例如,在ELISA或FACS中,关于本发明的纳米抗体(以及包含其的多肽)与RANK-L结合的EC50值优选为1μM-1pM,更优选为1nM-1pM,并且更优选为100pM-1pM。例如,在NF-κB测定或TRAP测定中,关于本发明的纳米抗体(以及包含其的多肽)与RANK-L结合的IC50值优选为1μM-1pM,更优选为1nM-1pM,并且更优选为100pM-1pM(如在WO 2008/142164中所述)。
在本发明的另一个方面中,本发明的多肽优选地针对RANK-L上与地舒单抗的表位或US 2010/0104568的SEQ ID NO:755的表位重叠的表位。本发明的氨基酸序列和多肽与RANK-L上同地舒单抗的表位或US2010/0104568的SEQ ID NO:755的表位重叠的表位的结合可以抑制和/或防止地舒单抗或US 2010/0104568的SEQ ID NO:755与RANK-L的结合。因此,本发明的多肽可以作用为地舒单抗或US 2010/0104568的SEQ ID NO:755与RANK-L结合的竞争性或非竞争性抑制剂(例如,在ELISA中,在测定中,在TRAP测定中和/或在NFκB测定中)。
可用于本文所述的方法中的多肽的另外的实例记述在WO 08/142164,US 2010/0104568A1和US 2011/0002929A1中。
尽管使用免疫球蛋白单可变结构域,且特别是如本文定义的纳米抗体和本发明的多肽是更优选的,但是,清楚的是,基于本文的描述,熟练的技术人员也将能够以类似的方式设计和/或产生可以用在本发明的方法中的其他多肽,并且特别是针对RANK-L的(单)结构域抗体,以及包含所述(单)结构域抗体的多肽。
例如,熟练的技术人员还将清楚,将上文提及的用于纳米抗体的一个或多个CDR’s“移植到”所述(单)结构域抗体或其他蛋白支架(包括,但不限于,人支架或非免疫球蛋白支架)上可能是可行的。用于这种CDR移植的适宜的支架和技术是熟练的技术人员所清楚的,并且是本领域公知的,参见,例如US 7,180,370,WO 01/27160,EP 0605522,EP 0460167,US7,054,297,Nicaise等(2004,Protein Science(蛋白质科学)13:1882-1891),Ewert等(2004,Methods(方法)34(2):184-199),Kettleborough等(1991,Protein Eng.(蛋白质工程)4(7):773-783),O’Brien和Jones(2003,Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207:81-100),Skerra J.(2000Mol.Recognit.(分子识别)13:167-187),和Saerens等(2005,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)352(3):597-607),以及其中引用的其他参考文献。例如,可以以相似的方式应用本身已知的关于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术,以提供包括一个或多个本文所述的纳米抗体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白。
通常,在本发明的这一方面中,用在本发明的方法中的多肽可以是包含至少一个氨基酸残基片段(stretch)的任意多肽,其中所述氨基酸残基片段具有与本文所述的至少一个CDR序列的序列相对应的氨基酸序列。所述多肽可以或可以不包含免疫球蛋白折叠。例如,并且不限于,这样的多肽可以是适当的免疫球蛋白序列片段,所述片段包括至少一个所述CDR序列,但是其不够大,不足以形成(完整的)免疫球蛋白折叠(例如,同样参考WO 03/050531中所述的“派遣片段(Expedite fragments)”)。备选地,这样的多肽可以是适当的“蛋白支架”,所述蛋白支架包括与这样的CDR序列相对应(即,作为其抗原结合位点的一部分)的至少一个氨基酸残基片段。用于呈递氨基酸序列的适当的支架对于熟练的技术人员将是清楚的,并且例如,包括,但不限于,基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即,除了本文已经描述的免疫球蛋白序列之外),来源于蛋白质A结构域的蛋白支架(诸如AffibodiesTM),淀粉酶抑肽(tendamistat),纤连蛋白,脂笼蛋白,CTLA-4,T-细胞受体,设计的锚蛋白重复,avimers和PDZ结构域(Binz等,2005,Nat.Biotech(自然生物技术),23:1257),和基于DNA或RNA的结合部分,包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等,2006,Comb.Chem.High Throughput Screen(组合化学高通量筛选)9(8):619-32)。
用在本发明的方法中的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备,通过本文的进一步描述这将是熟练的技术人员所清楚的。例如,本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体和多肽可以以用于制备抗体、特别是用于制备抗体片段(包括,但不限于,(单)结构域抗体和ScFv片段)的本身已知的任意方式进行制备。用于制备所述免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选的而非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚,用于制备本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下述步骤:
i)在适宜的宿主细胞或宿主生物体(在本文中还称为“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中,表达编码所述本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体或多肽的核酸,任选地接着进行:
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体或多肽。
特别地,这样的方法可以包括下列步骤:
i)在某种条件下培养和/或维持宿主,所述条件是这样的,以致所述宿主表达和/或生产至少一种本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体和/或多肽;任选地接着进行:
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体或多肽。
按照一个优选而非限制性的实施方案,本发明的多肽在细菌细胞中产生,特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞中产生。按照另一个优选的而非限制性的实施方案,本发明的多肽在酵母细胞中产生,特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞中产生。按照另一个优选的而非限制性实施方案,本发明的多肽在哺乳动物细胞中产生,特别是在人细胞或人细胞系的细胞中产生,更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中产生。
对于工业规模的生产,用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗剂的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株,其适用于大规模表达/生产/发酵,并且特别适用于大规模药物表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是熟练的技术人员所清楚的。
备选地,哺乳动物细胞系,特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,可以用于大规模表达/生产/发酵,并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。
接下来,本发明的多肽则可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离,这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术,诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如,使用与本发明的多肽融合的特异性的、可切割的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即,使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。
通常,对于制药用途,本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物,其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药,和任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。
因此,在另一个方面中,本发明涉及一种药物组合物,其包含至少一种本发明的多肽,以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即,适于药用),以及任选地一种或多种其它活性物质,当施用给受试者(例如,人,诸如骨质疏松患者,例如绝经后的女性)时,其在持久的时间阶段内抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性和/或有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记,诸如与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,诸如30天至3个月,3个月至6个月或6个月至1年,I型胶原交联端肽(CTX-1)的血清水平减少至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,诸如至少75%,或甚至至少80%。
通常,本发明的多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用,例如,关于其的参考文献参见上文引用的一般背景技术(并且特别参见WO 04/041862,WO 04/041863,WO04/041865,WO 04/041867,WO 08/020079和WO 2011/026945),以及参见标准手册,诸如雷明顿制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第18版,Mack出版公司,美国(1990)或雷明顿,制药科学和实践(Remington,the Science and Practice ofPharmacy),第21版,Lippincott Williams和Wilkins(2005);或治疗抗体手册(theHandbook of Therapeutic Antibodies)(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007(例如,参见第252-255页)。
例如,本发明的多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的,并且例如,包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)的制剂。
例如,用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如,用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于,无菌水以及水性缓冲液和溶液,诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank's溶液;水油(wateroils);甘油;乙醇;二醇诸如丙二醇,或者以及矿物油,动物油和植物油例如花生油、大豆油,及它们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的多肽还可以通过输注或注射进行皮下、静脉内或腹膜内施用。本发明的多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备,任选地与无毒表面活性剂和/或一种或多种缓冲剂成分混合。分散液还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌的水溶液或分散液或者无菌粉剂,其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散液,任选地包封在脂质体中。在所有情形中,在制备和保存条件下,最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质,例如,其包括水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性,例如,通过形成脂质体,在分散剂的情形中通过保持需要的粒度或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得,例如,对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情形中,优选地包括等渗剂,例如,糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
然而,本发明还包括可以通过进一步加工液体制剂而获得的产品,诸如冷冻的、冻干的或喷雾干燥的产品。当重构时,这些固体产物可以变成液体制剂,如本文所述(但不限于此)。因此,在其最广泛意义上,术语“制剂”包含液体和固体制剂二者。然而,应该理解固体制剂可以来源于液体制剂(例如,通过冷冻、冷冻-干燥或喷雾-干燥),并且因此具有关于本文的液体制剂所指定的特征所限定的特点。本发明不排除产生背离例如在冷冻-或喷雾干燥之前的初始组合物的组合物的重构。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的多肽结合在适当的溶剂中,当需要时,与上文列举的各种其它成分一起结合,然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
用于肠胃施用本发明所述的多肽、免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的优选的制剂记述在WO 2011/026945中。
通常,本发明的多肽在液体组合物诸如注射或输注制剂或洗液中的浓度为约0.1-25重量-%,优选地约0.5-10重量-%,但是,量不限于这些范围,并且取决于可以以适当的体积施用的较高或较低的剂量的需要,可以是较高或较低的重量百分数。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度为约0.1-5重量-%,优选地约0.5-2.5重量-%。
如本文在工作实施例中所证明的,已经使用了0.65mg/mL,2.17mg/mL,6.5mg/mL,21.7mg/mL和65mg/mL的浓度。因此,预测也可以使用具有在这些浓度之间(以及在这些值之外,即,比这些值高或低)的值的其他浓度。例如,可以使用0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69或70mg/mL的浓度。
为了获得本文所述的出乎意料的持久和持续的作用,本发明的多肽以约0.003mg/kg至约10mg/kg的量施用。示例性的剂量范围(包括在每个范围的端点的值)包括0.003-10mg/kg,诸如0.003-3mg/kg,0.003-1mg/kg,0.003-0.3mg/kg,0.003-0.1mg/kg,0.003-0.03mg/kg,0.003-0.01mg/kg,0.01-10mg/kg,0.01-3mg/kg,0.01-1mg/kg,0.01-0.3mg/kg,0.01-0.1mg/kg,0.01-0.03mg/kg,0.03-10mg/kg,0.03-3mg/kg,0.03-1mg/kg,0.03-0.3mg/kg,0.03-0.1mg/kg,0.1-10mg/kg,0.1-3mg/kg,0.1-1mg/kg,0.1-0.3mg/kg,0.3-10mg/kg,0.3-3mg/kg,0.3-1mg/kg,1-10mg/kg,1-3mg/kg和3-10mg/kg。示例性的剂量包括0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mg/kg。
本领域普通技术人员仅利用本文的教导中给出的常规实验可以确定在所给剂量范围内的必要的修改。参见,Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)(Martin,E.W.,ed.4),Mack Publishing Co.,Easton,PA。在任意并发症的情形中,剂量还可以由个体医师进行调整。
治疗应用
因此,本发明涉及预防和/或治疗至少一种骨疾病和/或病症的方法,所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、和/或包含其的药物组合物。更具体地,本发明涉及本文所述的多肽,其用于治疗骨疾病和/或病症。
本发明的方法和给药时间方案可以用于预防和治疗骨疾病和/或病症。在本发明的内容中,术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病,而且通常包括预防所述疾病的发作,减缓或逆转疾病进程,防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作,减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状,减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间,和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加,防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害,以及通常对被治疗的患者有益的任何药理作用。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种与RANK-L、与其生物学或药学活性、和/或与其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法,所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。特别地,本发明涉及一种用于预防和/或治疗可以通过调节RANK-L、其生物学或药学活性、和/或其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导而治疗的至少一种疾病或病症的方法,所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。特别地,所述药用有效量可以是足以改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记的量,诸如:
-与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,I型胶原交联端肽(CTX-1)的血清水平减少至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,诸如至少75%或甚至至少80%;
-与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,通过尿液中NTX-1与肌酸酐的比率确定,I型胶原的N端端肽(NTX-1)水平减少至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,诸如至少75%或甚至至少80%;
-与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,抗酒石酸酸性磷酸酶异构体5b(TRACP5b)的血清水平减少至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,诸如至少75%或甚至至少80%;
-与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,I型原胶原N端前肽(P1NP)的血清水平减少至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%,更优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,诸如至少75%或甚至至少80%。
待治疗的受试者可以是人。如熟练的技术人员应该清楚的,待治疗的受试者特别是患有本文所提及的疾病和/或病症或处于本文所提及的疾病和/或病症的危险中的人。例如,所述受试者可以是患有骨质疏松症或处于骨质疏松症的危险中的人,并且特别是女人,更特别地是绝经后的女人。
本发明的方法和给药时间方案可以用于以比其他治疗剂更低的剂量和/或更低的给药频率预防和治疗骨疾病和/或病症。通常,“骨疾病和/或病症”可以定义为这样的疾病和/或病症:其分别可以通过对需要所述方法的受试者(即,患有所述疾病和/或病症或具有至少其一种症状和/或具有引起或发展所述疾病和/或病症的危险)适当地施用本发明的多肽或包含其(且特别地,其药物活性量)和/或已知的针对RANK-L或RANK-L参与的生物学途径或机制的活性成分(principle active)(且特别地,其药物活性量)的组合物来进行预防和/或治疗。
骨疾病和/或病症包括与骨形成和吸收调控相关的疾病和/或病症。以净骨损失(骨质吸收超过骨形成)为特征的骨疾病和/或病症也称为骨质疏松病症,包括骨量减少(ostopenia),骨质疏松症和骨质溶解,并且特征在于过量的和/或不需要的由RANK-L介导的信号传导。本发明的方法和给药时间方案在持久的时间阶段内和/或以较低的剂量和/或较低的给药频率调节、并且特别是抑制和/或防止RANK-L与RANK的结合,其作用为拮抗剂并且通常将用于预防和/或治疗以净骨损失为特征的骨疾病和/或病症。
基于本文的公开内容,熟练的技术人员应该清楚所述骨疾病和/或病症的实例,并且例如,所述骨疾病和/或病症的实例包括下述疾病和/或病症:骨质疏松症(McClung2006,Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4:28-33),包括,但不限于,原发性骨质疏松症,内分泌性骨质疏松症(包括但不限于,甲状腺机能亢进,甲状旁腺功能亢进(Anandarajah和Schwarz 2006,J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97:226-232),库欣综合征,和肢端肥大症),遗传和先天形式的骨质疏松症(包括但不限于,成骨不全,高胱氨酸尿症,门克斯综合征,赖利-戴综合征),由于肢体固定导致的骨质疏松症,糖皮质激素-诱发的骨质疏松症(Locklin等.2001,Bone 28(增刊):S80;McClung 2006,CurrentOsteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4:28-33;Anandarajah和Schwarz 2006,J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97:226-232)和绝经后骨质疏松症(McClung 2006,Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4:28-33)。
本发明的范围内还包括使用本发明的方法和给药时间方案预防和/或治疗与RANK-L/RANK/OPG途径的失衡相关的其它疾病和病症。所述疾病和病症包括但不限于骨质疏松症。
因此,本发明的一些实施方案提供针对RANK-L的多肽、特别是针对人RANK-L的多肽在受试者中出乎意料地持久的抑制骨质吸收和/或破骨细胞活性中的应用。具体地,本发明的一些实施方案提供所述多肽用于人中的预防、治疗和/或诊断应用的用途,并且特别是用于对受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的出乎意料持久的抑制的用途。
更具体地,本发明的一些实施方案提供所述多肽用于防止、预防、治疗、减轻和/或诊断人中与RANK-L相关的和/或由RANK-L介导的一种或多种疾病、病症或病况(诸如本文提及的疾病、病症和病况)的用途,且特别是用于对受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的出乎意料持久的抑制的用途,诸如用于治疗或预防骨质疏松症的用途。
本发明的一些实施方案提供所述多肽,其用于制备用于预防和/或治疗人中与RANK-L相关的和/或由RANK-L介导的一种或多种疾病、病症或病况(诸如本文提及的疾病、病症和病况)。
在另一个方面中,本发明涉及本发明的多肽,其用于预防和/或治疗至少一种骨疾病和/或病症;和/或用于本文提及的一种或多种治疗方法中。
在另一个方面中,本发明涉及本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种骨疾病和/或病症的药物组合物中的用途;和/或在制备用于本文提及的一种或多种治疗方法中的药物组合物中的用途。
具体地,本发明的多肽可以与用于或能够用于预防和/或治疗本文提及的疾病和/或病症的其他药物活性化合物或成分(principles)组合使用,其结果是可以获得或可以不获得增效作用。此类化合物和成分、以及用于施用其的途径、方法和药物制剂或组合物的实例是临床医师所清楚的。
特别地,本发明的药物组合物可以包括一种或多种本发明的多肽,和至少一种另外的治疗剂,所述治疗剂选自骨形态发生因子,转化生长因子-β(TGF-β),白介素-1(IL-1)抑制剂,IL-1ra,KineretTM,TNFα抑制剂,可溶的TNFα受体,EnbrelTM,抗-TNFα抗体,RemicadeTM,D2E7抗体,甲状旁腺激素,甲状旁腺激素的类似物,甲状旁腺激素相关蛋白,甲状旁腺激素相关蛋白的类似物,前列腺素,双膦酸盐,阿仑膦酸盐(alendronate),氟化物,钙,非类固醇抗炎药(NSAID),COX-2抑制剂,CelebrexTM,VioxxTM,免疫抑制剂,氨甲喋呤,来氟米特(leflunomide),丝氨酸蛋白酶抑制剂,分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI),IL-6抑制剂,针对IL-6的抗体或纳米抗体,IL-8抑制剂,针对IL-8的抗体或纳米抗体,IL-18抑制剂,IL-18结合蛋白,针对IL-18的抗体或纳米抗体,白介素-1转化酶(ICE)调控剂,成纤维细胞生长因子(FGF),FGF调控剂,PAF拮抗剂,角质化细胞生长因子(KGF),KGF-相关的分子,KGF调控剂,基质金属蛋白酶(MMP)调控剂,氧化氮合酶(NOS)调控剂,糖皮质激素受体调控剂,谷氨酸受体调控剂,脂多糖(LPS)水平的调控剂,去甲肾上腺素,去甲肾上腺素模拟物,和去甲肾上腺素调控剂,如例如在US 2004/00335353中所述。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时,它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如,基本上同时地、连续地、或者按照交替方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时,它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用,这是熟练的技术人员所清楚的。
此外,当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时,每一物质或成分可以以相同的量施用,并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用,并且所述组合应用可以引起或可以不引起增效效应。然而,当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时,还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量,同时仍然获得理想的治疗作用。例如,这可以用于避免、限制或减少当以一种或多种所述物质或成分的常规用量使用时与所述一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用,同时仍然获得理想的药物或治疗效果。
定义
除非另外指明或限定,所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思,其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如,参考标准手册,如Sambrook等,″Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)″(第2版),Vols.1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)(1989);F.Ausubel等,eds.,″Currentprotocols in molecular biology(现代分子生物学方法)″,Green Publishing&WileyInterscience,New York(1987);Lewin,“Genes II”,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,(1985);Old等.,“Principles of Gene Manipulation:An Introduction to GeneticEngineering(基因操作原理:基因工程导言)”,第2版,University of California Press,Berkeley,CA(1981);Roitt等.,“Immunology(免疫学)”(第6版),Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001);Roitt等.,Roitt’s Essential Immunology(Roitt基础免疫学),第10版.Blackwell Publishing,UK(2001);和Janeway等.,“Immunobiology(免疫生物学)”(第6版),Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York(2005),以及本发明所引用的一般背景技术。
熟练的技术人员应该清楚,除非另外指明,没有特别详细描述的所有方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行或已经以本身已知的方式进行。例如,同样参考标准手册和本文提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考文献;以及例如下述综述:Presta(2006,Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56);Levin和Weiss(2006,Mol.Biosyst.2(1):49-57);Irving等.(2001,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志),248(1-2):31-45);Schmitz等.(2000,Placenta,21Suppl.A:S106-12),Gonzales等.(2005,Tumour Biol.26(1):31-43),其描述了用于蛋白质工程的技术,诸如亲和力成熟和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的技术。
核酸序列或氨基酸序列被认为是“(以)基本上分离的(形式存在)”――例如,与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养基相比――此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸,另一种蛋白/多肽,另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地,当它已被纯化至少2倍,特别是至少10倍,更特别地至少100倍,并且达到1000倍或更多时,认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时,诸如适当的层析技术,诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,“以基本上分离的形式存在”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的
当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列,或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时,这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中,但是更通常地,这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含核苷酸或氨基酸残基的片段,其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列,而不管最先提及的序列实际上是怎样产生或获得的(例如,其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式,当认为本发明的纳米抗体或多肽包含CDR序列时,这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体或多肽内,但是更通常地,这一般意指本发明的纳米抗体或多肽在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基片段,而不管所述本发明的纳米抗体或多肽是怎样产生或获得的。还应该注意到,当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时,它优选地具有与最先提及的氨基酸序列中基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之,最先提及的氨基酸序列优选是这样的,以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如,当认为本发明的纳米抗体或多肽分别包含CDR序列或构架序列时,在所述纳米抗体或多肽中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使作用。此外,当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时,最先提及的核苷酸序列优选是这样的,以致当它被表达成表达产物(例如,多肽)时,由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之,后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
“基本上由……组成”意指最先提及的核酸序列或氨基酸序列与后一种序列完全相同,或者与后一种序列相对应,其具有添加到所述核酸或氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端的有限数目的核酸或氨基酸残基,诸如(编码)1-20个氨基酸残基,例如(编码)1-10个氨基酸残基并且优选地(编码)1-6个氨基酸残基,诸如(编码)1,2,3,4,5或6个氨基酸残基。
对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或针对其至少的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽或通常是抗原结合蛋白或多肽或其片段)被认为是“针对(“against”或“directed against”)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力,表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD),是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量:KD值越小,抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地,亲和力还可以表示为亲和常数(KA),其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如,基于本文进一步的公开内容),取决于目的特异性抗原,亲和力可以以本身已知的方式确定。抗体亲抗原性是抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗原性与抗原决定簇与其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地,抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即,以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常被认为指示非特异性结合。优选地,本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定,其包括,例如,斯卡查德分析和/或竞争结合检测,诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定,及其在本领域中本身已知的不同的变化;以及本文提及的其它技术。
熟练的技术人员应该清楚,解离常数可以是实际的或表观解离常数。确定解离常数的方法对于熟练的技术人员应该是清楚的,并且例如,包括本文提及的技术。在这一点上,还应该清楚,不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如,10-2摩尔/升)的解离常数。任选地,熟练的技术人员应该清楚,可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD=1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为KD或解离常数给出,其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为缔合常数KA,其等于1/KD,并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中,两个分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示;熟练的技术人员应该清楚,考虑到KA=1/KD的关系,通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG=RT.ln(KD)(等价于DG=-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关,所以KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度,在所述关系式中,R等于气体常数,T等于绝对温度,并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如,特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强,其KD越低。KD也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比率(以致KD=koff/kon和KA=kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1–约107M-1s-1之间变化,对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2=ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s-1(t1/2=0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术测量,诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如,参见Ober等,2001,Intern.Immunology(国际免疫学)13:1551-1559),其中将一个分子固定在生物传感器芯片上,另一个分子在流动条件下经过所固定的分子,产生kon,koff测量值以及因此产生KD(或KA)值。例如,这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
熟练的技术人员还应该理解,如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和力,例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响,则测量的KD可以与表观KD相对应。此外,如果一个分子含有多于一个针对另一个分子的识别位点,则可以测量表观KD。在这样的情形中,所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。
可以用来评估亲和力的另一个方法是Friguet等(1985,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志),77:305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量,并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。
然而,KD的准确测量可能是非常费力的,并且作为结果,通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到,只要所有的测量以一致的方式(例如,保持测定条件不变)进行,表观KD测量就可以用作真实KD的近似值,并且因此在本文件中,应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后,应该注意到,在许多情形中,有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如,为了评估分子A和B之间的结合强度,例如,人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团基团或生色团基团或其它化学结构部分标记的参照分子C,诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团,用于光吸收检测的生色团,用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地,参照分子C保持为固定的浓度,并且A的浓度关于B的给定浓度或量变化。结果,对应于A的浓度获得IC50值,此时在不存在A的条件下关于C所测量的信号减半。假定已知参照分子的KD,即KD ref,以及参照分子的总浓度cref,则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KD:KD=IC50/(1+cref/KD ref)。注意,如果cref<<KD ref,则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如,保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量,则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估,并且在本发明的整个内容中,认为该测量等价于KD或等价于表观KD。
本发明的化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述化合物或多肽的血清浓度在体内减少50%所花费的时间,例如,由于化合物或多肽的降解和/或通过天然机制对所述化合物或多肽的清除或螯合(sequestration)而减少。本发明的化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定,诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域熟练的技术人员应该是清楚的,并且例如,通常可以包括下列步骤:将适当剂量的本发明的化合物或多肽适当施用给温血动物(即,施用给人或另一种适当的哺乳动物,诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物,例如来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如,并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)));从所述动物收集血液样品或其它样品;确定在所述血液样品中的本发明的化合物或多肽的水平或浓度;并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的化合物或多肽的水平或浓度已经减少50%的时间。例如,参考下述实验部分,以及标准手册,诸如诸如Kenneth,A等:Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(药物的化学稳定性:药剂师手册)和Peters等,Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(药物动力学分子:实践方法)(1996)。还参考″Pharmacokinetics(药物代谢动力学)″,M Gibaldi&D Perron,MarcelDekker出版,2nd修改版(1982)。
熟练的技术人员还应该清楚(例如,参见WO 04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献),半衰期可以用参数如t1/2-α,t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中,“半衰期增加”是指在这些参数中的任何一种的增加,诸如这些参数的任何两种,或基本上所有这三种参数的增加。当用于本文时,“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加,具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
为了比较两种以上的核苷酸序列的目的,第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数如WO 08/142164中第58-60页e)和g)点所定义。
为了比较两种以上的氨基酸序列的目的,第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数如WO 08/142164中第58-60页f),g)和h点所定义。
术语“抗原决定簇”是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)并且更特别是由所述分子的抗原-结合位点识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用。
术语“交叉阻断(cross-block)”,“被交叉阻断(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”在本文可以互换使用,并且具有WO 08/142164第69-72上s)点所述的意思。
纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“Sequence of proteins ofimmunological interest(免疫学目的蛋白的序列)”,美国公众健康服务中心(US PublicHealth Services),NIH Bethesda,MD,出版No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号,这种编号方式在Riechmann和Muyldermans(2000,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)240(1-2):185-195(例如,参见本公布的图2))的文章中用于来自骆驼科动物的VHH结构域;或参考本文。按照这种编号方式,纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基,纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基,纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸,纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基,纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基,纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基,以及,纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面,应该注意――如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的――在每一个CDR中的氨基酸残基的总数可以不同,并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即,在实际序列中,按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不被占据,或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着,通常,按照Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而,通常可以认为,按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR’s中的氨基酸残基的数目,按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点,并且反之亦然,按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点,并且反之亦然,按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点,并且反之亦然,以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点,并且反之亦然。]。
如果与治疗前的水平相比或与正常水平相比,给受试者施用本发明的多肽导致所述标记水平的减少x%,则认为本发明的多肽减少标记水平(诸如例如CTX-1,NTX-1,TRACP5b或P1NP)达“至少x%”或标记水平“相对治疗前或正常水平减少至少x%”。这意指,与所述标记在治疗之前的水平相比或与所述标记的正常水平相比,该标记在被治疗的受试者中的水平低x%。因此,当将所述标记在治疗之前的水平或所述标记的正常水平设定为100%时,所述标记在被治疗的受试者中的水平(该标记水平减少)将是所述标记的治疗前水平或正常水平的100%-x%。因此,该标记在被治疗的受试者中的这些水平也被认为是“基线的100%-x%”。例如,如果认为本发明的多肽“减少CTX-1血清水平至少30%”或“与治疗前或正常水平相比减少CTX-1血清水平至少30%”,则在被治疗的受试者中的CTX-1血清水平将比治疗前的CTX-1水平或CTX-1的正常水平低30%。因此,当将治疗前的CTX-1水平或CTX-1的正常水平设定为100%时,CTX-1在被治疗的受试者中的水平(减小的CTX-1水平)将为治疗前CTX-1水平或正常CTX-1水平的70%(100%-30%)。因此,在被治疗的受试者中的CTX-1的这些水平也被认为是“基线的70%”。
如果与治疗前的标记水平相比或与所述标记的正常水平相比,维持减少的所述标记的水平低x%,则认为本发明的多肽维持标记(诸如例如CTX-1,NTX-1,TRACP5b或P1NP)的水平“在至少x%”。因此,所述标记的水平维持为“基线的100%-x%”。例如,如果维持减少的血清CTX-1水平比治疗前的CTX-1水平或比正常的CTX-1水平低30%,则认为本发明的多肽维持CTX-1的血清水平“在至少30%”。因此,所述CTX-1水平维持为“基线的70%”。
给出附图和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明,并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围,除非本文中另外明确指明。
现在将通过下述非限制性的实施例和附图的方式进一步描述本发明。
附图简述
图1:开放的两区室药物代谢动力学模型(open two-compartmentalpharmacokinetic model),具有从中央区室的线性和非线性的清除。CLNON-RANKL是线性的非RANKL介导的清除率,Vc是中央区室的体积,Vt是边缘区室的体积,CLd是区室间流,CLRANKL是非线性RANKL介导的清除率(Vmax是最大代谢速率,Km是对应50%Vmax的ALX-0141浓度)。皮下施用后的吸收速率常数和生物利用度分别表示为ka和F。
图2:开放的单区室药物代谢动力学模型,具有来自皮下空间的平行的一级吸收和来自中央区室的线性与非线性的清除。CLNON-RANKL/F是关于皮下生物利用度校正的线性的非RANKL介导的清除率,V/F是关于皮下生物利用度校正的中央区室的体积,F1是用ka1吸收的剂量分数,F2是用ka2吸收的剂量分数,其中ka1和ka2分别是快和慢一级吸收速率常数,CLRANKL/F是关于皮下生物利用度校正的非线性RANKL介导的清除率(Vmax是最大代谢速率,Km是对应50%Vmax的ALX-0141浓度)。
图3:药物代谢动力学。ALX-0141的几何平均血浆浓度相对于时间的曲线。(a)线性刻度;(b)半对数刻度。
图4:药物代谢动力学–血清CTX-1的变化。在ALX-0141治疗的受试者中,在给药后8小时内观察到血清CTX-1水平的快速减少。显示ALX-0141对血清CTX-1水平(基线的%)的剂量依赖性、持续长久的抑制作用。数值为平均值±SEM,对于安慰剂n=11,对于每个ALX-0141治疗组n=6。
图5:药物代谢动力学–尿液NTX-1/肌酸酐的变化。在ALX-0141治疗的受试者中,在给药后8小时内观察到尿液NTX-1/肌酸酐水平的快速减少。显示ALX-0141对尿液NTX-1/肌酸酐水平(基线的%)的剂量依赖性、持续长久的抑制作用。数值为平均值±SEM,对于安慰剂n=11,对于每个ALX-0141治疗组n=6。
图6:在绝经后健康女性志愿者中,皮下给药ALX-0141或安慰剂后的算术平均CTX-1血清浓度(基线的%)。
图7:在绝经后健康女性志愿者中,皮下给药ALX-0141或安慰剂后的尿液中的算术平均NTX-1/肌酸酐比率(基线的%)。
图8:在绝经后健康女性志愿者中,皮下给药ALX-0141或安慰剂后的算术平均TRACP5b血清浓度(基线的%)。
图9:在绝经后健康女性志愿者中,皮下给药ALX-0141或安慰剂后的算术平均P1NP血清浓度(基线的%)。
图10:在绝经后健康女性志愿者中,皮下给药ALX-0141或安慰剂后的算术平均BAP血清浓度(基线的%)。
图11:在健康的绝经后健康妇女中,在单次皮下给药(a)0.003,(b)0.01,(c)0.03,(d)0.1,(e)0.3和(f)1mg/kg的ALX-0141后,观察到的(显示数据点的线)ALX-0141血浆浓度-时间曲线和基于模型的(较浅的线,没有显示数据点)对ALX-0141血浆浓度-时间曲线的模拟。
图12:在健康的绝经后健康妇女中,在单次皮下给药(a)0.003,(b)0.01,(c)0.03,(d)0.1,(e)0.3,和(f)1mg/kg的ALX-0141后,观察到的(显示数据点的线)血清CTX-1-时间曲线和基于模型的(较浅的线,没有显示数据点)对血清CTX-1-时间曲线的模拟。
实施例
缩写列表:
实施例1:使用ALX-0141进行的毒理学研究
在单次给药毒性研究中,ALX-0141作为0,0.02,2,20和50mg/kg体重(b.w)ALX-0141的单次皮下剂量和20mg/kg的单次静脉内推注剂量施用给雄性和雌性食蟹猴。ALX-0141的序列表示为SEQ ID NO:12(US 2010/0104568的SEQ ID NO:759)。
在给药前和在选定的给药后时间点,从所有的动物收集用于药物代谢动力学(PK)、抗-药物抗体(ADA)和药效学(PD)分析目的的血液样品。使用验证的方法出于PK,PD和ADA目的分析样品,不同的是CTX-1的确定,其中使用人商业试剂盒,证实该试剂盒与食蟹猴CTX-1交叉反应。
在重复给药毒性研究中,ALX-0141以0,0.2,2,20和50mg/kg体重(b.w)的ALX-0141皮下剂量在2周内分6次(第1,3,5,8,10和12个测试日)施用给雄性和雌性食蟹猴。
采集毒物动力学(toxicokinetic)样品直至第15个研究日(即,在第一次剂量施用后14天)。三个组(0,2和50mg/kg)包括恢复期,其中每个性别另外2只动物进行治疗并且进行取样至99天(即,直至给药后98天)。
在给药前和在选定的给药后时间点,对所有动物收集用于PK,ADA和PD目的的血液样品。使用验证的方法出于PK,PD和ADA目的分析样品,不同的是CTX-1的确定,其中使用人商业试剂盒,显示该试剂盒与食蟹猴CTX-1交叉反应。
实施例2:临床前数据
对在食蟹猴中使用ALX-0141的单次给药毒性研究(如实施例1所述)中产生的数据进行药物代谢动力学(PK)和药效学(PD)建模。使用来自2-周重复给药毒性研究的数据来验证单次给药数据是否能够准确地预测重复给药的药物代谢动力学(即,验证ALX-0141PK的时间-依赖性)。
食蟹猴ALX-0141血浆浓度的药物代谢动力学建模
通过针对具有来自中央区室的线性和非线性清除和一级吸收(皮下施用)的开放的两区室药物代谢动力学模型拟合数据来捕获ALX-0141在食蟹猴中的非线性药物代谢动力学行为。结构模型显示在图1中。
线性清除机制可能与ALX-0141的不饱和的和非RANKL介导的去除相关,并且对应于ALX-0141的缓慢且非特异性的蛋白水解降解。非线性的和RANKL-介导的清除过程是一种可饱和的清除机制;最可能表示ALX-0141与膜结合的RANKL的结合和随后的内在化以及清除。
使用迭代重加权(iterative re-weighting)其中为预测的血浆浓度,将在单次皮下和静脉内给药ALX-0141后所有获得的单个血浆浓度数据同时针对模型(WinNonlin Professional Software Version 5.1(Pharsight Corporation,MountainView California,USA))进行拟合。
ALX-0141在食蟹猴中的估算的PK参数以充分的精确度估算,并且列在表B-1中。
开放的两区室药物代谢动力学模型(具有来自中央区室的平行线性非RANKL-介导的清除率(CLNON-RANKL)和非线性可饱和RANKL-介导的清除率(CLRANKL)和一级的吸收(皮下施用))用来充分描述ALX-0141在食蟹猴中的非线性PK。
在低ALX-0141浓度(C<<<Km)处,CLRANKL的贡献占优势,而在较高的、RANKL-饱和的血浆浓度处,整体CL主要由CLNON-RANKL控制。
估测的CLRANKL和CLNON-RANKL的值表明,与非RANKL-介导的途径相比,通过RANKL-介导的成分的清除更有效(约5.6-倍)。然而,如由CLRANKL途径的低的Km-值(0.149μg/mL;3.6nM)所示,RANKL-介导的清除容易被饱和。
估测的稳定状态分布体积表明ALX-0141从中央区室外侧分布到组织的间隙空间中。
在饱和RANKL-介导的途径的ALX-0141浓度处,估测的ALX-0141的半衰期为8.5天,即与关于食蟹猴血清白蛋白所报道的相似。
ALX-0141的非线性RANKL-介导的成分在整体清除中的显著作用解释了在较低的剂量水平时暴露(Cmax-和AUC-值)的大于剂量比例性的增加。在较高剂量水平时,暴露与剂量成比例增加,原因在于此时整体清除主要由线性非RANKL介导的途径控制。
由于基于单次给药数据可以充分预测重复给药的药物代谢动力学,因此,ALX-0141展示出不依赖于时间的药物代谢动力学。在猴子中,ALX-0141的(单次给药)皮下绝对生物利用度几乎是完全的(96%)。
半机械化PK/PD建模(食蟹猴ALX-0141血浆浓度和血清CTX-1浓度)
由于在获得的ALX-0141血浆浓度和对CTX-1水平的作用之间没有直接的关系,因此,认为ALX-0141给药对血清CTX-1水平的作用在本质上是间接的。因此,利用间接响应模型来描述静脉内和皮下施用的ALX-0141对血清CTX-1的生理学更新(physiologicalturnover)的药理学作用。
该模型与之前用于抗-RANKL单克隆抗体地舒单抗的模型(Peterson M.,StouchB.,Chen D.等.2004,A PK/PD Model Developed in cynomolgus Monkeys PredictsConcentrations and Effects of AMG 162,A Fully Human Monoclonal AntibodyAgainst RANKL,in Healthy Postmenopausal Women(在食蟹猴中开发的PK/PD模型预测AMG 162(一种针对RANKL的完全人的单克隆抗体)在健康绝经后妇女中的浓度和作用).AAPS Annual Meeting,Baltimore,MD,2004年11月7-11日;摘要)类似,并且描述了由对血清CTX-1产生的抑制导致的药物响应。在该间接响应模型中,CTX-1的变化率(响应,R)通过下述描述:
其中,kin,0-级合成速率;R,血清CTX-1水平,Imax,最大抑制(1<Imax<0);C,ALX-0141的浓度;n,浓度-响应形状因子;和kout,血清CTX-1一级消除速率常数。
使用药物代谢动力学函数作为间接响应PK/PD模型的输入函数,将在单次静脉内和皮下给药后获得的所有可用的单个血清CTX-1数据同时针对模型(WinNonlinProfessional Software Version 5.1,Pharsight Corporation,Mountain ViewCalifornia,USA)进行拟合。
使用半机械化PK/PD模型(间接响应模型)充分捕获静脉内和皮下施用的ALX-0141对猴子中血清CTX-1的生理学更新的药效学作用。
PK/PD建模表明,ALX-0141是食蟹猴中血清CTX-1产生的有力的抑制剂(IC50为约22ng/mL或0.54nM)。另外,ALX-0141能够几乎完全地抑制血清CTX-1产生(Imax≈73%)。
实施例3:对人按比例放大:在人中的ALX-0141PK/PD模拟
将开发用来描述食蟹猴中的ALX-0141浓度和相对应的血清CTX-1水平的时间曲线的PK/PD模型对人按比例放大,以辅助在人研究中的前者的剂量选择。类似的方法之前成功地用于基于食蟹猴数据来模拟地舒单抗的人PK/PD。(Peterson M.,Stouch B.,Chen D.等.2004,A PK/PD Model Developed in cynomolgus Monkeys Predicts Concentrationsand Effects of AMG 162,A Fully Human Monoclonal antibody Against RANKL,inHealthy Postmenopausal Women(在食蟹猴中开发的PK/PD模型预测AMG 162(一种针对RANKL的完全人的单克隆抗体)在健康绝经后妇女中的浓度和作用).AAPS AnnualMeeting,Baltimore,MD,2004年11月7-11日;摘要)。
为了这一目的,使用标准的异速增长方程(Boxenbaum H.1984,InterspeciesPharmacokinetic Scaling and the Evolutionary-Comparative Pardigm.DrugMetab.Rev.15(5&6):1071-1121),将在食蟹猴中估测的CLNON-RANKL、分布体积(Vc和Vt)和吸收速率常数(ka)针对人按比例放大。对于CLRANKL,假设食蟹猴与人之间的Km-值是相似的,而由于人中骨更新的代谢速率低3倍,因此,认为人中的Vmax-值是食蟹猴中的Vmax-值的三分之一(FDA.1994,Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents usedin the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis(关于用于预防或治疗绝经后骨质疏松症的药剂的临床前和临床评估的指南))。
由于生物利用度不能按比例放大,因此,使用两个合理的F值(即,0.8和1.0)进行预测。用于模拟ALX-0141血浆浓度-时间曲线的PK参数列在表B-2中。
为了模拟皮下施用后人中ALX-0141浓度的时间曲线,将按比例放大的药物代谢动力学参数与之前所述的开放的两区室药物代谢动力学模型(具有来自中央区室的平行线性非RANKL-介导的清除率(CLNON-RANKL)和非线性RANKL-介导的清除率(CLRANKL)和一级吸收(皮下施用))组合。
然后,将预测的人ALX-0141浓度用作间接PK/PD响应模型(抑制合成)的输入函数,从而预测人中的血清CTX-1时间曲线。
血清CTX-1的基线值(R0)和一级的消除速率常数(kout)取自参考文献(GloverS.J.,Garnero P.,Naylor K.,Rogers A.和Eastell R.2008,Establishing a referencerange for bone turnover markers in young,healthy women(建立年轻健康妇女中的骨更新标记的参照范围).Bone 42:623-630;Holford N,Pillai G,Kaila N,Collins W,RoyS,Cremers S,Trechsel U,Bouisset F,Steimer J-L.2006年6月,PKPD model forcathepsin K inhibition with balicatib and changes in bone turnoverbiomarkers,in particular NTx(关于balicatib对组织蛋白酶K的抑制的PKPD模型和骨更新生物标记、特别是NTx的变化).PAGE(Population Approach Group Europe),Bruges(B),14-16)。假设最大作用值(Imax)和ALX-0141浓度在食蟹猴和人之间是相似的,而相对于猴子,在人中对应于最大作用的一半的浓度(IC50)低六倍。后者与下述二者的组合有关:由于骨更新的代谢速率的差异(与猴子相比,人中低3倍)(FDA 1994,Guidelines forpreclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention ortreatment of postmenopausal osteoporosis(关于用于预防或治疗绝经后骨质疏松症的药剂的临床前和临床评估的指南))导致在人中的有效浓度比在猴子中低3倍,以及相对于食蟹猴RANKL,ALX-0141对人RANKL的结合的2倍高的亲和力。
在表B-3中,列出了用于模拟ALX-0141血清CTX-1浓度-时间曲线的PD参数。
模拟的PD曲线表明在单次皮下给药ALX-0141后血清CTX-1的剂量-依赖性的抑制,这与表述对血清CTX-1合成的抑制作用的间接响应模型一致。根据该模型,对血清CTX-1的抑制将取决于ALX-0141的剂量。最大程度的血清CTX-1抑制将随着施用的剂量增加至其最大作用(Imax)-值;预测剂量的进一步增加不会进一步增加该作用,但是将延长恢复至基线的时间。
实施例4:临床数据
4.1方法
4.1.1设计
在1组2名健康绝经后女性受试者(接受0.003mg/kg的ALX-0141或安慰剂单次皮下(s.c.)给药(1名药物(verum)和1名安慰剂))和5组8名健康绝经后女性受试者(接受0.01,0.03,0.1,0.3和1mg/kg的ALX-0141或安慰剂的单次皮下给药(对于每组,6名药物(verum)和2名安慰剂))中进行双盲、安慰剂对照的、单次递增剂量I期研究。为计算取样时间的目的,治疗日定为第1天。
在给药前、在给药后8,12,24,48,72,96,120和144小时收集血浆样品,在第14,30,60天和在随访(第90天)一天一次收集血浆样品,并且如果合适地,在另外的每月随访访视时收集血浆样品,以定量药物和生物标记CTX-1的水平。
4.1.2方法和评估
*如果在第90天CTX-1水平还没有恢复到基线水平的70%,则再进行每月一次的随访,并且重复,直到CTX-1水平恢复至基线的70%。在第420天,所有受试者的CTX-1水平恢复至基线水平的至少70%,并且对于任一受试者不再需要另外的随访访视。
4.1.3受试者
在本研究中总共招募42名受试者。所有的受试者都是健康的绝经后女性志愿者。绝经后女性群体是本药物的期望靶标群体。
加入的主要标准
年龄 :最大80岁,端点包含在内
人体质量指数(BMI):18-36kg/m2,端点包含在内
性别 :女
受试者 :健康的绝经后女性志愿者
用药研究
1.活性物质 :ALX-0141,为41kD的三聚体构建体,具有两个通过靶向人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体连接的靶向RANKL的纳米抗体结构单元。
活性 :抗-RANKL(抗-NFκB配体受体激活剂)
适应证 :骨损失
强度 :0.65mg/mL(1组),2.17mg/mL(2组),6.5mg/mL(3组):21.7mg/mL(4组)和65mg/mL(5和6组)
剂型 :皮下注射
2.安慰剂 :视觉上匹配的用药
评价标准
PK :血浆ALX-0141浓度,PK参数
PD :血清中的P1NP,CTX-1,BAP和TRACP5b浓度,和尿液中的肌酸酐,CTX-1和NTX-1浓度
安全性 :AEs,局部耐受性,生命体征,12-导线ECG,临床实验室,体检,免疫原性,血清中的25-羟基维生素D,WBC的免疫分型
4.1.4分析
通过检测血清中的CTX-1、TRACP5b、P1NP和BAP浓度和尿液中的NTX-1/肌酸酐浓度比率来研究ALX-0141的PD作用。CTX-1,TRACP5b和NTX-1参与骨质吸收,而P1NP和BAP参与骨形成。
使用的生物标记测定如下:
4.1.5统计学
使用NONMEM通过非线性混合作用建模对ALX-0141血浆浓度和血清CTX-1水平建模。对每个结构参数设置个体间差异(IIV),并且作为关于各个参数的差异的平方根x100进行计算。对于残差差异(residual variability)采用指数误差模型(以log级别叠加)。NONMEM内使用的估算方法为FOCEI。
对于该群体分析使用来自31名绝经后女性志愿者的数据。
4.2药物代谢动力学
4.2.1血浆中的浓度数据
通过验证的ELISA方法进行ALX-0141的药物浓度测量。治疗的几何平均ALX-0141血浆浓度-时间曲线(线性和半对数刻度)显示在图3中。
在皮下施用0.003mg/kg ALX-0141(n=1)后,在给药后48h观察到可检测的ALX-0141血浆水平。平均来说,在0.01mg/kg的剂量水平时,在24小时内可在血浆中检测到ALX-0141。在0.03mg/kg至1mg/kg的ALX-0141的剂量水平时,在8小时内可在血浆中检测到ALX-0141。发现几何平均ALX-0141血浆浓度逐渐升高,在0.003mg/kg至0.03mg/kg范围内的剂量水平时,在给药后3-6天达到最大平均血浆浓度,在较高的剂量水平(0.1mg/kg至1mg/kg)时,在1.5-2天达到最大平均血浆浓度。ALX-0141的平均血浆浓度随剂量增加而增加。在达到峰值血浆浓度后,平均血浆浓度非常逐步地下降。平均来说,在最高剂量水平时,直至第60天(0.1mg/kg和0.3mg/kg)或第90天(1mg/kg),平均ALX-0141血浆浓度仍然高于LLOQ(0.0102μg/mL)。在较低的剂量水平时,ALX-0141血浆浓度直至第7天(0.003mg/kg 1,n=1)、第14天(0.01mg/kg)或第30天(0.03mg/kg)都可检测到。
4.2.1血浆中的药物代谢动力学参数
ALX-0141血浆PK参数的总结显示在表B-4中。
中值tmax在给药后1.5-6天范围内,并且与较低的剂量水平(0.003mg/kg至0.03mg/kg)(3-6天)相比,在较高的剂量水平(0.1mg/kg至1mg/kg)趋向于更短(1.5-2天)。几何平均半衰期仅可以针对较高的给药组(0.1mg/kg,0.3mg/kg和1mg/kg ALX-0141)可靠地计算,并且为12.0-20.6天。在单次皮下剂量施用ALX-0141后,Cmax,AUC0-last和AUC0-inf值随剂量增加而增加。在0.1mg/kg至1mg/kg的剂量范围内,Cmax和AUC值以与剂量成比例的方式增加,而在0.01mg/kg至0.1mg/kg范围内的较低剂量,似乎Cmax和AUC0-last比剂量成比例增加的稍微多一些。
4.2.3药物代谢动力学分析
在健康的绝经后妇女中,通过开放的单区室模型(具有两个来自皮下区室的一级吸收速率和来自中央区室的线性的(非靶标相关的)和非线性的(靶标相关的)清除率)充分表征ALX-0141的药物代谢动力学。结构模型显示在图2中,并且PK参数估测值列在表B-5中。
靶标介导的有效性是非RANKL-介导的途径的约4倍,但是容易被饱和。
体重是关于分布体积的决定性共变量。
以良好的精确度(25.2%以下)估测最终PK模型的整体全部的结构参数。关于V(22.2%)和F1(36.5%),个体间差异(IIV)为低至中等。关于ka1和ka2(分别为170和144%),关于CL(53%)和关于Km(135%)发现较大的个体间差异。估测关于残差的标准偏差是0.11,具有良好的精确度(13.7%)。
4.3药效学
通过测量参与骨质吸收和/或骨形成的CTX-1、TRACP5b、P1NP和BAP的血清浓度和尿液NTX-1/肌酸酐比率来研究ALX-0141的PD作用。CTX-1、TRACP5b、P1NP和BAP的平均血清浓度表示为基线的百分数,显示在图4和6(CTX-1)、图8(TRACP5b)、图9(P1NP)和图10(BAP)中。平均尿液NTX-1/肌酸酐浓度比率显示在图5和7中。PD参数的总结显示在表B-6中。
4.3.1CTX-1
CTX-1是由于破骨细胞活性导致释放的骨降解产物,并且视为是骨质吸收的生物标记。在绝经后健康女性志愿者中皮下给药ALX-0141或安慰剂后,CTX-1的平均血清浓度(作为基线的%)显示在图4和6中。CTX-1从基线的变化显示在表B-7中。
在皮下给药ALX-0141后,对于所检测的全部6个剂量水平,在给药后8h(第一取样时间点)内观察到CTX-1的快速减少。关于用ALX-0141治疗(主动治疗)后的CTX-1血清浓度的平均最低值在所研究的各剂量水平之间在基线的8.8%(0.3mg/kg,N=6)与50.7%(0.003mg/kg,n=1)之间变化,并且随剂量增加而降低(图6)。然而,似乎在0.1mg/kg或更高的剂量水平达到几乎最大的作用。在本研究中,可以认为0.003mg/kg的剂量水平是BED。在最低的3个剂量水平时,在已经达到最低点后和在第90天之前,CTX-1血清浓度开始增加,而在最高的3个剂量水平(0.1mg/kg,0.3mg/kg,1mg/kg)时,直至第90天,平均CTX-1血清浓度都保持在接近最低点的低水平,并且此后开始逐渐升高。1组中ALX-0141治疗的受试者(0.003mg/kg)在第60天显示出与基线接近的CTX-1血清浓度,即,在基线-30%的界限(margin)内。在最初计划的90天随访内,关于其他ALX-0141剂量组的平均CTX-1值没有达到基线的70%的截点。低的CTX-1水平在几乎所有ALX-0141-治疗的受试者中持续超过90天,并且在用0.01mg/kg以上治疗的一些受试者中持续大约1年,这表明在单次皮下ALX-0141注射后的持续长久的PD作用。
4.3.2NTX-1
NTX-1是I型胶原的降解产物,其是细胞外基质的主要有机成分。因此,认为NTX-1是由破骨细胞活性导致的骨质吸收的生物标记。由于尿液中的NTX-1浓度随尿液体积变化,因此确定尿液中NTX-1与肌酸酐的比率,而不是确定NTX-1的尿液浓度,从而校正这种变化。在绝经后健康女性志愿者中皮下给药ALX-0141或安慰剂后的平均尿液NTX-1/肌酸酐浓度比率(作为基线的%)显示在图5和7中。从基线的NTX-1/肌酸比率的变化显示在表B-8中。
在皮下给药ALX-0141后,观察到NTX-1/肌酸酐浓度比率的快速减小,在第4天(0.003mg/kg,n=1),第6天(0.3mg/kg,n=6),第14天(0.01mg/kg[n=6]和0.03mg/kg[n=6])和第60天(0.1mg/kg[n=6]和1mg/kg[n=6])达到最低点。在所研究的剂量范围内,关于尿液NTX-1/肌酸酐比率的平均最低值在基线的64.8%(0.003mg/kg,n=1)至16.1%(1mg/kg,n=6)之间变化,并且随剂量增加而减小。在用0.01mg/kg和0.03mg/kg治疗后,直至第30天,平均NTX-1/肌酸酐浓度比率保持为低的,并且此后开始升高,到第120天约为基线的70%。在用0.1mg/kg,0.3mg/kg或1mg/kg治疗后,直至第60天(0.1mg/kg)或第90天(0.3mg/kg和1mg/kg),尿液中的NTX-1/肌酸酐比率保持为低的。此后,NTX-1/肌酸酐水平又开始升高,但是在第120天仍然保持远低于基线。二十二名受试者在他们的最后一次个人随访时具有仍然低于基线的80%的NTX-1/肌酸酐比率。在安慰剂治疗组中,在整个研究期间,NTX-1/肌酸酐比率的水平保持与基线接近(80-120%)。
4.3.3TRACP5b
TRACP5b是一种来源于破骨细胞的酶,并且是破骨细胞数目的量度,并且因此被视为骨质吸收的生物标记。在绝经后健康女性志愿者中皮下给药ALX-0141或安慰剂后的TRACP5b算术平均血清浓度(作为基线的百分数)显示在图8中。TRACP5b血清浓度显示出与CTX-1血清水平相似的曲线。
在皮下给药ALX-0141后,在给药后2-4天内,TRACP5b血清浓度开始降低。在大约14天后达到几乎最大作用,在第30天(0.003mg/kg,0.01mg/kg,0.03mg/kg,0.1mg/kg和1mg/kg)或在第60天(0.3mg/kg)达到最低点。在所研究的剂量水平之间,关于TRACP5b血清浓度的平均最低值在基线的70.1%(0.003mg/kg,n=1)至39.1%(0.3mg/kg,n=6)之间变化。并且随剂量增加而减小。直至第60天(0.003mg/kg,0.01mg/kg,0.03mg/kg和0.1mg/kg)和第90天(0.3mg/kg和1mg/kg),TRACP5b血清浓度几乎没有改变,并且接近已经在第14天达到的水平。此后,TRACP5b水平逐渐升高,并且对于所有受试者在最后一次随访时恢复至基线水平的至少80%(关于使用80%的原因在于在安慰剂-治疗的受试者中,最低值几乎达不到低于80%的值;这表明随时间≤20%的降低是在正常的变化之内的)。使用0.3mg/kg和1mg/kgALX-0141达到最强的TRACP5b血清浓度降低。在用安慰剂治疗的受试者中没有观察到TRACP5b水平的降低。尽管基于个体TRACP5b和CTX-1浓度的比较,TRACP5b血清浓度表现出与CTX-1血清浓度相比相似的曲线,但是没有迹象表明TRACP5b浓度直接影响CTX-1血清浓度。
4.3.4P1NP
P1NP在胶原被结合到骨中之前由新合成的前原胶原的细胞外加工释放,并且被认为是关于骨形成的生物标记。在绝经后健康女性志愿者中在皮下给药ALX-0141或安慰剂后的P1NP算术平均血清浓度(作为基线的百分数)显示在图9中。
在皮下施用ALX-0141后,在所研究的剂量范围之间,在第14天-第30天直至第60天,P1NP血清水平开始降低。在第60-第150天之间达到最低值。通常,治疗剂量越高,P1NP血浆浓度的降低越强,并且P1NP血浆浓度的降低时间越久。然而,在0.1mg/kg ALX-0141的剂量水平时,似乎达到几乎最大的作用。在所研究的剂量水平之间,P1NP的平均最低值在基线的60.4%(0.01mg/kg,n=6)至21.2%(1mg/kg,基于n=5)之间变化。大部分受试者在其最后一次随访时他们的P1NP血清浓度没有恢复至基线的80%(使用80%的原因在于,在安慰剂-治疗的受试者中,最低值几乎达不到低于80%的值;这表明随时间≤20%的降低是在正常变化之内的)。这些数据表明与对CTX-1和TRACP5b的作用相比,对P1NP的作用被强烈地延迟了。在安慰剂治疗的受试者中没有观察到对P1NP的作用。
4.3.5BAP
BAP是作用为活性骨形成的生物标记的一种酶。在绝经后健康女性志愿者中,在皮下给药ALX-0141或安慰剂后的BAP的算术平均血清浓度(作为基线的%)显示在图10中。
用0.003mg/kg ALX-0141(n=1)治疗后没有从基线的明显的变化,并且在安慰剂治疗的受试者中,BAP血清浓度趋向于增加。用0.01mg/kg至1mg/kg ALX-0141治疗后,从第30天起,BAP血清浓度趋向于降低。BAP血清水平的这种降低不如P1NP血清水平的降低明显。在用0.01mg/kg和0.03mg/kg治疗后第60天,以及在用0.1mg/kg,0.3mg/kg和1mg/kg治疗后第90天,达到最低点。在所研究的剂量范围之间,关于BAP的平均最低值在基线的85.3%(0.003mg/kg,n=1)至58.3%(1mg/kg,n=6)之间变化,并且随剂量增加而降低。在用0.01mg/kg和0.03mg/kg ALX-0141治疗后,从第60天起,BAP血清浓度趋向于增加,并且在第90天接近基线水平。在用0.1mg/kg,0.3mg/kg和1mg/kg治疗后,在第120天,BAP血清浓度保持为低的(0.1mg/kg和0.3mg/kg)或仍在降低(1mg/kg)。在受试者之间,在最后一次随访时BAP血清浓度有变化,大部分受试者显示出恢复至基线的至少80%的BAP水平。这些数据表明,与P1NP相似,与CTX-1和TRACP5b相比,对BAP的作用被强烈地延迟了。
4.3.6结论
以0.003mg/kg至1mg/kg范围内的剂量水平单次皮下施用ALX-0141导致CTX-1和TRACP5b血清浓度以及尿液NTX-1/肌酸酐浓度比率的快速降低,这表明骨质吸收的减少。这种抑制作用趋向于是剂量依赖性的,并且是持续长久的。
对于CTX-1,似乎以0.1mg/kg ALX-0141达到(几乎)最大抑制作用,对于TRACP5b血清浓度和NTX-1/肌酸酐浓度比率,似乎以0.3mg/kg ALX-0141达到(几乎)最大抑制作用。
在0.003mg/kg至1mg/kg的ALX-014的剂量水平单次皮下施用ALX-0141导致P1NP血清浓度的逐渐降低,这表明骨形成减少的趋势。这种抑制作用趋向于是剂量-依赖性的,在大约第90天至第150天达到最低点。对于P1NP血清浓度,似乎以0.1mg/kg达到最大抑制作用。
与P1NP曲线相似,但是以较小的程度,在检测的最高剂量水平(0.1mg/kg,0.3mg/kg和1mg/kg ALX-0141)时似乎出现BAP血清浓度的剂量-依赖性的逐渐降低的趋势。
综上所述,施用的最低剂量(0.003mg/kg)似乎是生物学有效的,而0.1mg/kg的生物学作用似乎与0.3mg/kg和1mg/kg的生物学作用接近。因此,可以认为0.003mg/kg的剂量水平是BED。与抗-吸收剂的预测作用一致,ALX-0141表现出对骨质吸收标记的强抑制作用和在骨形成标记的减少中的中等作用。
4.3.7药效学分析
抑制血清CTX-1产生的间接PK/PD模型充分捕获所观察到的血清CTX-1时间曲线。
在该间接响应模型中,CTX-1的变化率(响应,R)通过下述描述:
其中,kin,0-级合成速率;R,血清CTX-1水平,Imax,最大抑制(1<Imax<0);C,ALX-0141的浓度;n,浓度-响应形状因子;和kout,血清CTX-1一级消除速率常数。
整体上最终PK/PD模型的所有结构参数以<88%的精确度估测(参见表B-9)。关于Imax(6.4%)、关于(22.1%)以及关于kin(46.4%),个体间差异(IIV)是低至中等的。残差以良好的精确度(12.1%)估测为32.1%。
确定ALX-0141是血清CTX-1产生的有力的抑制剂,如通过其为0.674ng/ml或16.4pM的低IC50-值所证实的。
该剂量水平被鉴定为关于响应的0级产生速率(血清CTX-1)的决定性共变量。
所述模型的预测性能通过视觉预测检验(Visual Predictive Check)得到证实。
4.4讨论
基于来自猴子的临床前数据,ALX-0141的临床药物代谢动力学得到非常充分的预测,以异速生长的方式(allometrically)按比例放大,并且与关于骨重塑差异的合理假设结合(见图11)。
出乎意料地,在绝经后妇女中观察到的血清CTX-1-时间曲线证明在人中基本上要比基于临床前信息预测的曲线更持续(见图12)。
观察到的与基于模型的血清CTX-1-时间曲线的模拟之间的这种差异归因于下述:相对于基于临床前数据预测的功效(3.7ng/ml或89pM)(见表B-3),ALX-0141在体内的估测功效为5.4-倍高(IC50为0.674ng/ml或16.4pM)(见表B-9)。
4.5结论
在健康绝经后妇女中,单次皮下施用多至1mg/kg的ALX-0141是安全的,并且是充分耐受的。没有死亡或治疗-相关的严重不利事件(SAEs)发生,并且没有达到最大耐受剂量(MTD)。
观察到暴露(Cmax和AUC)的剂量依赖性的增加。由于可饱和靶标-依赖性CL成分,PK模型是非线性的。对于0.1-1mg/kg的组,观察到12.0-20.6天的血清半衰期。
ALX-0141表现出对关于骨质吸收的血清CTX-1和尿液NTX-1/肌酸酐生物标记的统计学显著性的抑制。与基于临床前信息预测的相比,这种作用是出乎意料地持久和持续的。
在单次皮下ALX-0141注射后的生物标记抑制作用的持续时间随剂量增加,在1mg/kg给药后达到360天的最大持续时间。
已经使用的术语和表述用作说明书的术语,并且没有限制,在使用此类术语和表述时,没有排除所显示的和所描述的特征或其部分的任何等价物的意图,应该认识到在本发明的范围内可能有多种修改。
本文公开的所有参考文献通过引用结合,特别是用于教导上文引用的,包括可用于本文所述的方法中的特定的多肽和多肽的特性。
表格
表B-1:在食蟹猴中的ALX-0141的药物代谢动力学参数。
表B-2:在人中的ALX-0141以异速生长的方式按比例放大的药物代谢动力学参数。
表B-3:用在血清CTX-1浓度的PK/PD模拟中的ALX-0141药效学参数。
表B-4:ALX-0141血浆PK参数
a单次观察
b有限的数据,因此没有描述统计学可用
cn=2
表B-5:在健康绝经后妇女中的PK参数估测值
(a)精确度以s.e.除以参数估测值×100计算。
(b)关于受试者间和残差差异二者的%CV是作为差异的平方根×100得到的近似值。
(c)加合随机作用模型用于F1,因此报告估测的SD。
表B-6:在绝经后女性受试者中用ALX-0141单次皮下治疗后的PD参数的总结
除了0.003mg/kg组之外(由于对于该组N=1),对于所有数据显示算术平均值(SD)。
NA:不合适的
$仅在最低点低于预先确定的阈值时给出:对于CTX-1为基线的70%,对于其他PD参数为基线的80%。
*最低的平均值与基线比较。集合所有治疗组的安慰剂治疗的受试者的结果。除了CTX-1血清浓度和0.003mg/kg剂量组,该表仅显示基于N≥5的平均最低点水平。
#CTX-1水平:ng/mL;TRACP5b:mU/mL;P1NP和BAP:μg/L;NTX-1/肌酸酐比例:μmol/mol
表B-7:CTX-1从基线的变化(%)
值:平均值(SE),*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0001;安慰剂值:最后的值接后(LastValue Carried Forward)
1150d+180d,2210d+270d+300d,3单次观察,4300–420天
表B-8:NTX-1/肌酸从基线的变化(%)
值:平均值(SE),*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0001;安慰剂值:最后的值接后1150d+180d,2210d+270d+300d,3单次观察,4300-420天
表B-9:在健康绝经后妇女中的PD参数估测值。
(a)精确度以s.e.除以参数估测值×100计算。
(b)关于受试者间和残差差异二者的%CV是作为差异的平方根×100得到的近似值。
(c)为统一而固定。
(d)在较低的剂量(0.003和0.01mg/kg),对kin的典型的分次剂量作用。
本发明的方面
方面A-1:用于抑制受试者中的骨质吸收或破骨细胞活性的方法,所述方法包括给所述受试者施用特异性结合核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)的多肽,其中所述多肽的施用量在施用后持续至少30天有效改变一种或多种骨代谢和/或骨内稳态标记。
方面A-2:方面A-1所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面A-3:方面A-1和A-2中任一项所述的方法,其中所述骨代谢标记选自:I型胶原交联端肽(CTX-1),I型胶原N端端肽(NTX-1),抗酒石酸酸性磷酸酶异构体5b(TRACP5b),I型原胶原N端前肽(P1NP)和骨特异性的碱性磷酸酶(BAP)。
方面A-4:方面A-3所述的方法,其中所述CTX-1,NTX-1,TRACP5b,P1NP和BAP中的一种或多种分别使用对CTX-1,NTX-1或TRACP5b特异性的ELISA测定;对P1NP特异性的放射性免疫测定,或对BAP特异性的免疫酶学测定检测。
方面A-5:方面A-1至A-4中任一项所述的方法,其中所述多肽包含一个或多个特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-6:方面A-1至A-5中任一项所述的方法,其中所述多肽与重组可溶性RANKL(sRANKL)结合的表观KD为0.01-0.05nM,优选约0.04nM,如通过Biacore测定的。
方面A-7:方面A-1至A-6中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含下述或由下述组成:一个或多个VHH结构域,一个或多个人源化的VHH结构域和/或一个或多个骆驼源化的VH结构域。
方面A-8:方面A-1至A-7中任一项所述的方法,其中所述多肽包含:一个或多个特异性结合RANKL的结构域抗体,一个或多个特异性结合RANK且适合用作结构域抗体的氨基酸序列,一个或多个特异性结合RANKL的单结构域抗体,一个或多个特异性结合RANKL且适合用作单结构域抗体的氨基酸序列,或一个或多个特异性结合RANKL的″dAb″s。
方面A-9:方面A-1至A-8中任一项所述的方法,其中所述多肽是包含两个以上特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域的多价构建体。
方面A-10:方面A-9所述的方法,其中所述多价构建体包含两个特异性结合RANKL的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-11:方面A-5至A-10中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成,其中CDR1选自SEQ ID NO:1,CDR2选自SEQ ID NO:2,并且CDR3选自SEQ ID NO:3。
方面A-12:方面A-5至A-11中任一项所述的方法,其中所述多价构建体包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12或者由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12组成。
方面A-13:方面A-5至A-12中任一项所述的方法,其中所述多价构建体还包含至少一个半衰期延长结构部分。
方面A-14:方面A-13所述的方法,其中所述至少一个半衰期延长结构部分特异性结合血清蛋白。
方面A-15:方面A-14所述的方法,其中血清蛋白是血清白蛋白,且特别是人血清白蛋白,甲状腺素结合蛋白,(人)运铁蛋白,纤维蛋白原,免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM,或WO04/003019中列出的血清蛋白中的一种。
方面A-16:方面A-13至A-15中任一项所述的方法,其中至少一个半衰期延长结构部分包含免疫球蛋白单可变结构域或由免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面A-17:方面A-16所述的方法,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含下述或由下述组成:VHH结构域,人源化的VHH结构域或骆驼源化的VH结构域。
方面A-18:方面A-16或A-17任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成。
方面A-19:方面A-13至A-16中任一项所述的方法,其中所述至少一个半衰期延长结构部分包含结构域抗体,适于用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体,适于用作单结构域抗体的氨基酸序列或″dAb″。
方面A-20:方面A-13所述的方法,其中所述至少一个半衰期延长结构部分包含一个或多个聚乙二醇分子。
方面A-21:方面A-5至A-11中任一项所述的方法,其中所述多肽交联阻断SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12与RANKL的结合。
方面A-22:方面A-5至A-11中任一项所述的方法,其中所述多肽与RANKL的结合被SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12交叉阻断。
方面A-23:方面A-1至A-22中任一项所述的方法,其中所述多肽作为单剂量施用。
方面A-24:方面A-1至A-23中任一项所述的方法,其中所述多肽通过皮下施用。
方面A-25:方面A-1至A-24中任一项所述的方法,其中所述受试者患有骨质疏松症。
方面B-1:方面A-1至A-25中任一项所述的方法,其中所述骨代谢标记是I型胶原交联端肽(CTX-1)。
方面B-2:方面B-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90,120,150,180,210或270天,所述多肽的施用量有效减少CTX-1血清水平至少30%。
方面B-3:方面B-2所述的方法,其中所述多肽以约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。
方面B-4:方面B-3所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-5:方面B-2所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
方面B-6:方面B-5所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-7:方面B-6所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-8:方面B-7所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-9:方面B-2所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-10:方面B-9所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约150天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-11:方面B-10所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约180天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-12:方面B-11所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约210天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-13:方面B-12所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约270天,CTX-1的血清水平减少至少30%。
方面B-14:方面B-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90,120,150或180天,和/或30天至3个月,3个月至6个月,或6个月至1年,所述多肽的施用量有效降低I型胶原交联端肽的血清水平至少45%。
方面B-15:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
方面B-16:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面B-17:方面B-16所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
方面B-18:方面B-15至B-17中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-19:方面B-16和B-17中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-20:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面B-21:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面B-22:方面B-20和B-21中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-23:方面B-20和B-21中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约30天至3个月,CTX-1减少至少45%。
方面B-24:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-25:方面B-24所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-26:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-27:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
方面B-28:方面B-26和B-27中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约3个月至6个月,CTX-1减少至少45%。
方面B-29:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面B-30:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面B-31:方面B-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
方面B-32:方面B-29,B-30和B-31中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约150天,CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-33:方面B-32所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约180天(或6个月),CTX-1的血清水平减少至少45%。
方面B-34:方面B-29,B-30和B-31中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少6个月至1年,CTX-1减少至少45%。
方面B-35:方面B-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90或120天,所述多肽的施用有效减少CTX-1血清水平至少70%。
方面B-36:方面B-35所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面B-37:方面B-36所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,CTX-1的血清水平减少至少70%。
方面B-38:方面B-35所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-39:方面B-38所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,CTX-1的血清水平减少至少70%。
方面B-40:方面B-39所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,CTX-1的血清水平减少至少70%。
方面B-41:方面B-40所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,CTX-1的血清水平减少至少70%。
方面B-42:方面B-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60或90天,所述多肽的施用量有效减少至少80%的CTX-1血清水平。
方面B-43:方面B-42所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-44:方面B-42所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面B-45:方面B-43和B-44中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,CTX-1的血清水平减少至少80%。
方面B-46:方面B-45所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,CTX-1的血清水平减少至少80%。
方面B-47:方面B-1至B-46中任一项所述的方法,其中到施用后8小时之前,所述多肽的施用量有效减少I型胶原交联端肽(CTX-1)的血清水平至少45%。
方面B-48:方面B-1至B-47中任一项所述的方法,其中通过针对CTX-1的ELISA测定确定所述受试者中的骨质吸收得到抑制。
方面B-49:方面B-1至B-48中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,CTX-1减少至少50%。
方面B-50:方面B-1至B-49中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少60天,CTX-1减少至少50%。
方面B-51:方面B-1至B-50中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少90天,CTX-1减少至少50%。
方面B-52:方面B-1至B-51中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少120天,CTX-1减少至少50%。
方面B-53:方面B-1至B-52中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少150天,CTX-1减少至少50%。
方面B-54:方面B-1至B-53中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少180天,CTX-1减少至少50%。
方面B-55:方面B-1至B-54中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,CTX-1减少至少60%。
方面B-56:方面B-1至B-55中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少60天,CTX-1减少至少60%。
方面B-57:方面B-1至B-56中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少90天,CTX-1减少至少60%。
方面B-58:方面B-1至B-57中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少120天,CTX-1减少至少60%。
方面B-59:方面B-1至B-58中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少150天,CTX-1减少至少60%。
方面B-60:方面B-1至B-59中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,CTX-1减少至少70%。
方面B-61:方面B-1至B-60中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少60天,CTX-1减少至少70%。
方面B-62:方面B-1至B-61中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少90天,CTX-1减少至少70%。
方面B-63:方面B-1至B-62中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少120天,CTX-1减少至少70%。
方面B-64:方面B-1至B-63中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30天,CTX-1减少至少80%。
方面B-65:方面B-1至B-64中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少60天,CTX-1减少至少80%。
方面B-66:方面B-1至B-65中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少90天,CTX-1减少至少80%。
方面C-1:方面A-1至A-25中任一项所述的方法,其中所述骨代谢标记为I型胶原N端端肽(NTX-1)。
方面C-2:方面C-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30,60,90,120或180天,和/或至少10个月或至少12个月,以尿液中的NTX-1与肌酸酐的比率确定,所述多肽的施用量有效减少NTX-1至少30%。
方面C-3:方面C-2所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
方面C-4:方面C-3所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-5:方面C-4所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-6:方面C-2所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面C-7:方面C-6所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-8:方面C-2所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-9:方面C-8所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-10:方面C-2所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面C-11:方面C-10所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约180天(或6个月),NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-12:方面C-10所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约10个月,NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-13:方面C-10所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约1年(12个月;360天),NTX-1的水平减少至少30%。
方面C-14:方面C-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少30,60,90,120,180或210天和/或30天至3个月,3个月至6个月,或6个月至1年,其中所述多肽的施用量有效减少NTX-1至少45%。
方面C-15:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-16:方面C-15所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
方面C-17:方面C-15和C-16中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-18:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面C-19:方面C-18所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-20:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-21:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面C-22:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面C-23:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于0.03mg/kg的量施用。
方面C-24:方面C-20,C-21,C-22和C-23中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天至3个月,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-25:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-26:方面C-25所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-27:方面C-26所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-28:方面C-27所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约150天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-29:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-30:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-31:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于0.3mg/kg的量施用。
方面C-32:方面C-29,C-30和C-31中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续约3个月至6个月,NTX-1减少至少45%。
方面C-33:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面C-34:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-35:方面C-14所述的方法,其中所述多肽以少于或等于1mg/kg的量施用。
方面C-36:方面C-33,C-34和C-35中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约180天(或6个月),NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-37:方面C-33,C-34和C-35中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约210天,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-38:方面C-33,C-34和C-35中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约6个月至1年,NTX-1的水平减少至少45%。
方面C-39:方面C-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90或120天,所述多肽的施用量有效减少至少70%的NTX-1水平。
方面C-40:方面C-39所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-41:方面C-40所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,NTX-1的水平减少至少70%。
方面C-42:方面C-39所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-43:方面C-42所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,NTX-1的水平减少至少70%。
方面C-44:方面C-43所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,NTX-1的水平减少至少70%。
方面C-45:方面C-39所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面C-46:方面C-45所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,NTX-1的水平减少至少70%。
方面C-47:方面C-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60或90天,所述多肽的施用量有效减少至少80%的NTX-1水平。
方面C-48:方面C-47所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面C-49:方面C-47所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-50:方面C-47所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面C-51:方面C-48和C-49中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,NTX-1的水平减少至少80%。
方面C-52:方面C-49和C-50中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天至3个月,NTX-1的水平减少至少80%。
方面C-53:方面C-47所述的方法,其中所述多肽以约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
方面C-54:方面C-53所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,NTX-1的水平减少至少80%。
方面C-55:方面C-54所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,NTX-1的水平减少至少80%。
方面C-56:方面C-1至C-55中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少90天,NTX-1减少至少20%。
方面C-57:方面C-1至C-56中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少120天,NTX-1减少至少20%。
方面C-58:方面C-1中C-57中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少150天,NTX-1减少至少20%。
方面C-59:方面C-1至C-58中任一项所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少180天,NTX-1减少至少20%。
方面C-60:方面C-1至C-59中任一项所述的方法,其中到施用后8小时之前,所述多肽的施用量有效降低NTX-1水平至少45%。
方面C-61:方面C-1至C-60中任一项所述的方法,其中所述受试者中尿液中NTX-1与肌酸酐的比率通过针对NTX-1的ELISA测定来确定。
方面C-1至C-61所述的方法可以特别是方面B-1至B-66中任一项所述的方法。
方面D-1:方面A-1至A-25中任一项所述的方法,其中所述骨代谢标记为抗酒石酸酸性磷酸酶异构体5b(TRACP5b)。
方面D-2:方面D-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90或120天,所述多肽的施用量有效降低TRACP5b血清水平至少30%。
方面D-3:方面D-2所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面D-4:方面D-3所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,TRACP5b的血清水平减少至少30%。
方面D-5:方面D-4所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,TRACP5b的血清水平减少至少30%。
方面D-6:方面D-2所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面D-7:方面D-6所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,TRACP5b的血清水平减少至少30%。
方面D-8:方面D-2所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面D-9:方面D-8所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,TRACP5b的血清水平减少至少30%。
方面D-10:方面D-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60或90天,所述多肽的施用量有效降低TRACP5b血清水平至少45%。
方面D-11:方面D-10所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面D-12:方面D-11所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,TRACP5b的血清水平减少至少45%。
方面D-13:方面D-10所述的方法,其中所述多肽以约0.3mg/kg至约3mg/kg的量施用。
方面D-14:方面D-13所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,TRACP5b的血清水平减少至少45%。
方面D-15:方面D-14所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,TRACP5b的血清水平减少至少45%。
方面D-1至D-15所述的方法可以特别是方面B-1至B-66和/或C-1至C-61中任一项所述的方法。
方面E-1:方面A-1至A-25中任一项所述的方法,其中所述骨代谢标记是I型原胶原的N端前肽(P1NP)。
方面E-2:方面E-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60,90或120天,所述多肽的施用量有效降低P1NP血清水平至少30%。
方面E-3:方面E-2所述的方法,其中所述多肽以约0.003mg/kg至约0.03mg/kg的量施用。
方面E-4:方面E-3所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,P1NP的血清水平减少至少30%。
方面E-5:方面E-4所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,P1NP的血清水平减少至少30%。
方面E-6:方面E-5所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,P1NP的血清水平减少至少30%。
方面E-7:方面E-2所述的方法,其中所述多肽以约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的量施用。
方面E-8:方面E-7所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约120天,P1NP 1的血清水平减少至少30%。
方面E-9:方面E-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60或90天,所述多肽的施用量有效减少P1NP血清水平至少45%。
方面E-10:方面E-9所述的方法,其中所述多肽以约0.03mg/kg至约0.3mg/kg的量施用。
方面E-11:方面E-10所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,P1NP的血清水平减少至少45%。
方面E-12:方面E-11所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,P1NP的血清水平减少至少45%。
方面E-13:方面E-12所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,P1NP的血清水平减少至少45%。
方面E-14:方面E-1所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30,60或90天,所述多肽的施用量有效减少P1NP血清水平至少70%。
方面E-15:方面E-14所述的方法,其中所述多肽以约0.1mg/kg至约1mg/kg的量施用。
方面E-16:方面E-15所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约30天,P1NP的血清水平减少至少70%。
方面E-17:方面E-16所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约60天,P1NP的血清水平减少至少70%。
方面E-18:方面E-17所述的方法,其中,与治疗前或正常水平相比,在施用后持续至少约90天,P1NP的血清水平减少至少70%。
方面E-1至e-18所述的方法可以特别为方面B-1至B-66,C-1至C-61和/或D-1至D-15中任一项所述的方法。
Claims (6)
1.骨代谢和/或骨内稳态标记,其选自I型胶原交联端肽(CTX-1),I型胶原N端端肽(NTX-1),抗酒石酸酸性磷酸酶同工型5b(TRACP5b),I型原胶原N端前肽(P1NP)和骨特异性碱性磷酸酶(BAP)。
2.SEQ ID NO:13、14或15的多肽。
3.SEQ ID NOs:16至31中任一项的多肽。
4.SEQ ID NO:10或12的多肽。
5.SEQ ID NO:12的多肽在制备用于抑制人受试者中的骨质吸收和/或破骨细胞活性的药物中的应用,其中
-所述多肽以每月0.003mg/kg至0.01mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每两个月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每两个月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每两个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每三个月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每三个月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每三个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每四个月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每四个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每四个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,CTX-1的血清水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每月0.01mg/kg至0.03mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每两个月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每两个月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每两个月0.3mg/kg至1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每三个月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每三个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每三个月0.3mg/kg至1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%;
-所述多肽以每四个月0.03mg/kg至0.1mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少30%,并且在整个治疗期间保持在至少30%;
-所述多肽以每四个月0.1mg/kg至0.3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少45%,并且在整个治疗期间保持在至少45%;
-所述多肽以每四个月1mg/kg至3mg/kg的量施用,并且与治疗前或正常水平相比,NTX-1的尿水平降低至少70%,并且在整个治疗期间保持在至少70%,
其中所述受试者是绝经后妇女,并且所述受试者患有骨质疏松症。
6.根据权利要求5所述的应用,其中所述多肽通过皮下施用。
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