KR20230123497A

KR20230123497A - IL-6 및 TNF-α를 표적화하는 면역글로불린 단일 가변도메인을 포함하는 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20230123497A
Application number: KR1020237024305A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 아스브란트; 나딘 비제만; 안 브리게; 지그리트 코르넬리스; 카렌 하이닝크; 에릭 로렌트; 하이디 로멜레레; 스하나 판 츠밤
Original assignee: 아블린쓰 엔.브이.; 사노피
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-23
Also published as: US20220356241A1; JP2023553694A; TW202239763A; US11897951B2; EP4263602A1; WO2022129572A1

Abstract

본 개시는 염증성 및/또는 자가면역 질환, 특히 류마티스 관절염을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 신규 유형의 약물을 제공한다. 구체적으로, 본 개시는 적어도 하나의 ISVD가 TNF-α에 결합하고 적어도 2개의 ISVD가 IL-6에 결합하는 것을 특징으로 하는 적어도 35개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시는 또한 핵산, 벡터 및 조성물을 제공한다.

Description

IL-6 및 TNF-α를 표적화하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드

1. 분야

본 개시는 인터루킨-6(IL-6) 및 TNF-α를 표적화하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 핵산을 포함하는 벡터, 및 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 염증성 및/또는 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이들 생성물에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 이들 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

2. 배경 기술

류마티스 관절염은 전세계적으로 약 2,500만 명의 환자에게 영향을 미치는 중증 자가면역 질환이다(GBD 2015, Lancet. 2016 Oct 8;388(10053):1545-1602). 아프고 부어오르는 관절이 류마티스 관절염의 주요 증상이다. 이것은 관절의 활막강의 염증이 관여하는 관절 염증에 의해 유발된다. 류마티스 관절염에서 염증이 생긴 활막강은 면역 세포의 침윤 및 간질 세포 활성화를 특징으로 한다(Klareskog, Catrina et al., Lancet. 2009 Feb 21;373(9664):659-72; Smolen, Aletaha et al., Nat Rev Dis Primers. 2018 Feb 8;4:18001). 특화된 세포 유형인 섬유아세포-유사 활막세포(FLS)가 이 프로세스의 주여 참여인자로 간주된다(Bartok and Firestein, Immunol Rev. 2010 Jan;233(1):233-55). FLS는 대식구 유사 활막 세포와 함께 활막의 내막 라이닝 층을 형성한다. 류마티스 관절염에서 FLS 증식 및 면역 세포의 축적은 염증을 촉발하고 류마티스 관절염의 주요 증상 중 하나인 활막 과형성으로 알려진 막 두께를 야기한다. 류마티스 관절염에서 관절 염증의 주요 매개체로서 FLS는 류마티스 관절염 치료를 위한 매력적인 표적 세포 유형을 나타낸다.

IL-6은 T 및 B 세포, 단핵구, 섬유아세포 및 활막세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 의해 분비되는 다면발현 사이토카인이다.

원래 B 세포 분화 인자로 확인된 단백질인 IL-6(Hirano et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4; EP 0257406)과 IL-6R(Yamasaki et al., 1988, Science, 241: 825-8; EP 0325474)의 상호작용은 IL-6/IL-6R 복합체의 형성을 초래한다. 이 복합체는 IL-6의 다양한 생리적 작용을 전파하는 수용체 단백질인 gp130(Taga et al., 1989, Cell, 58: 573-81; EP 0411946)에 결합한다. IL-6는 현재 무엇보다도 면역 반응, 조혈, 급성기 반응, 뼈 대사, 혈관신생 및 염증의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. IL-6 생산의 탈조절은 몇몇 자가면역 및 만성 염증성 증식 질환 프로세스의 병리에 연루되어 있다(Ishihara and Hirano, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1592: 281-96). IL-6(Klein et al., 1991, Blood, 78: 1198-204; EP 0312996), IL-6R(EP 0409607) 또는 gp130(Saito et al., 1993, J. Immunol. Methods, 163: 217-223; EP 0572118)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 IL-6 기능에 대한 효율적인 저해 효과를 나타내는 것으로 입증되었다.

선행 기술은 IL-6 관련 장애의 방지 및 치료를 위한 인간 IL-6, 인간 IL-6R 및 인간 gp130 단백질에 대한 항체 및 항체 단편을 기재한다. 예는 토실리주맙(Woo et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7: 1281-8; Nishimoto et al., 2005, Blood 106: 2627-32; Ito et al., 2004, Gastroenterology, 126: 989-96; Choy et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3143-50 참고), BE8(Bataille et al., 1995, Blood 86: 685-91; Emilie et al., 1994, Blood 84: 2472-9; Beck et al., 1994, N. Engl. J. Med. 330: 602-5; Wendling et al., 1993, J. Rheumatol. 20: 259-62 참고) 및 Centocor의 CNTO-328(Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2560; Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2608; Int. J. Cancer, 2004, 111:592-5 참고)이다. IL-6 관련 장애의 방지 및 치료를 위해 당분야에 알려진 또 다른 활성 원리는 가용성 gp130의 Fc 융합이다(Becker et al. 2004, Immunity, 21: 491-501; Doganci et al., 2005, J. Clin. Invest. 115: 313-25; Nowell et al., 2003, J. Immunol. 171: 3202-9; Atreya et al., 2000, Nat. Med. 6: 583-8 참고). IL-6R에 대한 아미노산 서열 및 나노바디(Nanobody) 그리고 이를 포함하는 폴리펩티드는 WO 08/020079에 기재되어 있다.

종양 괴사 인자 알파(TNF-α; TNF-알파)는 주로 단핵구 및 대식구에 의해 생산되지만 CD4⁺ 및 CD8⁺ 말초 혈액 T 림프구에 의해서도 분비되는 것으로 알려진 동종삼량체 사이토카인이다. TNF-α는 가용성 형태 또는 막관통 단백질로 존재할 수 있다. TNF-α의 주요 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF-α는 내인성 발열원으로 작용하며 그 생산의 조절이상은 염증성 장 질환 및 기타 염증성 질환, 예컨대 RA를 포함하는 다양한 인간 질환에 연루된다.

류마티스 관절염에 대해 현재 FDA에 의해 승인된 치료는 항-TNF-α 생물학적 제제(예컨대 Simponi®[골리무맙], Enbrel®[에타네르셉트], Remicade®[인플릭시맙] 및 Humira®[아달리무맙])를 포함한다. 그러나 이러한 항-TNF-α 치료는 소수의 환자에서만 완전한 질환 관해를 나타내었고 상당부의 비반응자가 여전히 남아 있다. 따라서, 지금까지 어떤 생물학적 제제도 류마티스 관절염을 앓고 있는 상당한 백분율의 환자에서 질환 관해와 관련하여 충분한 유효성을 갖지 못했으며 반응의 결여 또는 상실이 여전히 문제가 되고 있다.

다중 질환 요인을 표적화하는 것은 예를 들어 상이한 치료 표적에 결합하는 항체와 같은 2개의 별도 생물학적 제제의 동시 투여 또는 조합 사용에 의해 달성될 수 있다. 그러나 별도의 생물학적 제제를 공동 투여하거나 조합 사용하는 것은 실용적 관점과 상업적 관점 둘 모두에서 어려울 수 있다. 예를 들어, 별도의 제품을 두 번 주사하면 환자에게 더 불편하고 더 고통스러운 치료 요법을 초래하고 이는 순응도에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 2개의 별도 제품의 단회 주사와 관련하여 필요한 농도에서 허용 가능한 점도 및 제품 둘 모두의 적절한 안정성을 허용하는 제형물을 제공하는 것은 어렵거나 불가능할 수 있다. 또한 공동 투여 및 공동 제형물은 전체 비용을 증가시킬 수 있는 2개의 별도 약물의 제조를 필요로 한다.

2개의 상이한 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체가 항체와 같은 별도의 생물학적 제제의 공동 투여 또는 조합 사용과 관련된 이러한 제한을 해결하기 위한 하나의 전략으로 제시되었다.

이중특이적 항체 작제물은 여러 형식으로 제안되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체 형식은 2개의 항체 또는 이의 단편의 화학적 접합이 관여할 수 있다(Brennan, M, et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-83; Glennie, M. J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-2375).

그러나 이러한 이중특이적 항체 형식의 단점은 고농도에서 점도가 높아, 예를 들어 피하 투여를 어렵게 하고, 각 결합 단위가 특이적 및 고친화도 결합을 위해 2개의 가변 도메인의 상호작용을 필요로 한다는 점에서 폴리펩티드 안정성 및 제조 효율에 영향을 미친다는 것을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체 형식은 또한 잠재적으로 경쇄의 짝짓기 오류 또는 중쇄의 짝짓기 오류와 관련된 CMC(화학 제조 및 제어) 문제를 야기할 수 있다.

TNF-α 및 IL-6을 표적화하는 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체 작제물은 지금까지 임상에 적용되지 않았다.

3. 요약

류마티스 관절염 환자는 현재 이용 가능한 표준 관리 치료에 여전히 부적절하게 반응하고 있기 때문에, RA 치료를 위한 개선된 제제에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 남아 있다.

본 발명자들은 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 특히 류마티스 관절염(RA)을 치료하기 위한 신규하고 개선된 제제를 개발하였다. 이들 제제는 염증성 질환, 특히 RA와 관련된 생물학적 기전을 매개하는 인자인 IL-6 및 TNF-α를 포함하는 2개 또는 여러 개의 질환 인자를 표적화한다.

본 발명자들은 놀랍게도 단일 제제를 사용한 IL-6 및 TNF-α의 이중 표적화가 동일한 적응증에 대한 하나의 단일특이적 제제 치료법이 충분히 유효하지 않을 수 있는 류마티스 관절염 환자에서 유효한 치료를 부여할 가능성이 있음을 발견했다.

본 발명자들은 IL-6 및 TNF-α를 동시에 특이적으로 표적화하는 이중- 또는 다중-특이적 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD) 작제물)가 단일특이적 항-TNF-α 또는 단일특이적 항-IL-6 폴리펩티드와 비교하여 류마티스 관절염의 증상을 조절하는 증가된 효율을 가짐을 발견하였다. 이러한 폴리펩티드(예컨대 ISVD 작제물)는 효율적으로 제조되고(예를 들어, 미생물 숙주에서) 편리하게 투여될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드(예컨대 ISVD 작제물)는 치료될 대상체에 기존 항체(즉, 항체 작제물을 사용한 제1 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 제한된 반응성을 갖는 것으로 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리펩티드(예컨대 ISVD 작제물)는 치료될 대상체에서 연속 치료의 수가 제한될 수 있고 따라서 시간적으로 충분히 떨어져 있을 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낸다.

본 개시의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD) 작제물)는 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 적어도 하나의 ISVD는 TNF-α에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 IL-6에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에 따르면, TNF-α에 결합하는 적어도 하나의 ISVD는 인간 TNF-α(hTNF-α)에 특이적으로 결합하고 IL-6에 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 인간 IL-6(hIL-6)에 특이적으로 결합한다.

일부 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시의 폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD일 수 있다.

또한 본 개시의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산 분자, 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터, 및 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학 조성물이다.

또한 본 개시에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 (비인간) 숙주 또는 숙주 세포가 제공된다.

본 개시에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:

a. 적합한 숙주 세포 또는 (비-인간) 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 (예를 들어 무세포) 발현 시스템에서 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서,

b. 본 개시에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

또한, 본 개시는 약제로 사용하기 위한 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 RA의 치료에서 사용하기 위한 것이다.

또한, 염증성 질환, 예컨대 RA를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 본 개시에 따른 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 RA를 치료하기 위한 약제(예를 들어 약학 조성물)의 제조에서 본 개시의 폴리펩티드 또는 조성물의 용도가 추가로 제공된다.

특히, 본 개시는 하기 구현예를 제공한다:

구현예 1. 약제로서 사용하기 위한, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 각각의 상기 ISVD는, 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고;

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하며:

i. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 6과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 10과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 14와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

iv. SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 8과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

v. SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 12와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

vi. SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 16과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

vii. SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 9와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

viii. SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 13과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

ix. SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 17과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3,

제1, 제2 및 제3 ISVD는 선택적으로 N-말단으로부터 시작하는 순서로 포함되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인, 조성물.

구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함함.

구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5와 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 가짐.

구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 가짐.

구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 7. 구현예 6에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 8. 구현예 6 또는 7에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 9. 구현예 8에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 10. 구현예 9에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 다음을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물:

i. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 7과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 11과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 15와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3.

구현예 11. 구현예 9 또는 10에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 12. 구현예 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 13. 구현예 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 그 C-말단 단부에 1 내지 5개의 아미노산 잔기의 연장, 바람직하게는 단일 아미노산 잔기의 연장을 가지며, 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 글리신 또는 알라닌, 류신, 이소류신 및 발린, 더욱 바람직하게는 알라닌 및 글리신, 가장 바람직하게는 알라닌으로부터 독립적으로 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염의 치료에서 사용하기 위한, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 18. 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로서, 상기 ISVD가 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고;

a) 제1 ISVD가 IL-6에 결합하고 다음을 포함하며:

b) 제2 ISVD가 IL-6에 결합하고 다음을 포함하고:

c) 제3 ISVD가 TNF-α에 결합하고 다음을 포함하고:

ISVD는 선택적으로 N-말단으로부터 시작하는 순서로 포함되는, 폴리펩티드.

구현예 19. 구현예 18에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드:

구현예 20. 구현예 18 또는 19에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드:

구현예 21. 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드:

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 가짐.

구현예 22. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드.

구현예 23. 구현예 22에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.

구현예 24. 구현예 22 또는 23에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.

구현예 25. 구현예 24에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드.

구현예 26. 구현예 25에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 다음을 포함하는, 폴리펩티드:

구현예 27. 구현예 25 또는 26에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드.

구현예 28. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩티드.

구현예 29. 구현예 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드.

구현예 30. 구현예 18 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 그 C-말단 단부에 1 내지 5개의 아미노산 잔기의 연장, 바람직하게는 단일 아미노산 잔기의 연장을 갖고, 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 글리신 또는 알라닌, 류신, 이소류신 및 발린, 더욱 바람직하게는 알라닌 및 글리신, 가장 바람직하게는 알라닌으로부터 독립적으로 선택되는, 폴리펩티드.

구현예 31. 구현예 18 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드.

구현예 32. 구현예 18 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드.

구현예 33. 구현예 18 내지 32 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.

구현예 34. 구현예 33에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.

구현예 35. 구현예 18 내지 32 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함하는, 방법:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 구현예 33에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서

b) 구현예 18 내지 32 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

구현예 36. 구현예 18 내지 32 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 구현예 33에 따른 핵산을 포함하는 조성물.

구현예 37. 구현예 36에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인 조성물.

구현예 38. 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 39. 제37항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 방법.

구현예 40. 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서, 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물의 용도.

구현예 41. 제40항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.

구현예 42. 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로서, 각각의 상기 ISVD가 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고;

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하며:

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

구현예 43. 약제로서 사용하기 위한, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되고, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고;

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하며:

i. SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 9와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 13과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 17과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

iv. SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 150과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

v. SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 151과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

vi. SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 152와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

vii. SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 153과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

viii. SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 154와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

ix. SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 155와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3,

제1, 제2 및 제3 ISVD는 선택적으로 N-말단으로부터 시작하는 순서로 포함되는, 폴리펩티드, 또는 조성물.

구현예 44. 구현예 43에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함함.

구현예 45. 구현예 43 또는 44에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 148과 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 149와 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 가짐.

구현예 46. 구현예 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 149의 아미노산 서열을 가짐.

구현예 47. 약제로서 사용하기 위한, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되고, 각각의 상기 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고,

a) 제1 ISVD는 다음을 포함하며:

b) 제2 ISVD는 다음을 포함하고:

i. SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 160과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 161의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 161과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 162의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 162와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;

c) 제3 ISVD는 다음을 포함하고:

i. SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 150과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 151과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 152와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3,

구현예 48. 구현예 47에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 161의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 162의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함함.

구현예 49. 구현예 47 또는 48에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 159와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 148과 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 가짐.

구현예 50. 구현예 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:

a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖고;

b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 159의 아미노산 서열을 갖고;

c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 가짐.

구현예 51. 구현예 43 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 52. 구현예 51에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 53. 구현예 52에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 54. 구현예 53에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 다음을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물:

구현예 55. 구현예 53 또는 54 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 56. 구현예 53 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 57. 구현예 53 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 58. 구현예 43 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 그 C-말단 단부에 1 내지 5개의 아미노산 잔기의 연장, 바람직하게는 단일 아미노산 잔기의 연장을 가지며, 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 글리신 또는 알라닌, 류신, 이소류신 및 발린, 더욱 바람직하게는 알라닌 및 글리신, 가장 바람직하게는 알라닌으로부터 독립적으로 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 59. 구현예 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 147과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 60. 구현예 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 61. 구현예 47 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 158과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 62. 구현예 47 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 158의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 63. 제43항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염의 치료에서 사용하기 위한, 폴리펩티드 또는 조성물.

구현예 64. 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.

구현예 65. 구현예 64에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.

구현예 66. 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함하는, 방법:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 구현예 64에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서

b) 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

구현예 67. 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 구현예 64에 따른 핵산을 포함하는 조성물.

구현예 68. 구현예 67에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인 조성물.

구현예 69. 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 구현예 67 또는 68에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 70. 구현예 69에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 방법.

구현예 71. 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서, 구현예 43 내지 63 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 구현예 67 또는 68에 따른 조성물의 용도.

구현예 72. 청구항 71에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.

4. 도면의 간단한 설명
도 1: HSA를 통해 포착된 F027201062에 대한 재조합 가용성 hTNF-α 및 hIL-6의 동시 결합을 나타내는 센서그램.
도 2: ISVD F027201062 및 참조 항-TNF-α mAb에 의한 Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP 리포터 검정에서 가용성 인간 및 cyno TNF-α의 저해를 나타내는 대표적 그래프(표 11의 실험 n3)로, IRR00096은 음성 대조군 ISVD이다.
도 3: ISVD F027201062 및 참조 항-IL-6 mAb1 및 mAb2에 의한 IL-6 유도된 TF-1 증식 검정에서 가용성 인간 및 cyno IL-6의 저해를 나타내는 대표적 그래프(표 12의 실험 n3)로, IRR00096은 음성 대조군 ISVD이다. LCI = 하위 신뢰도 구간, UCI = 상위 신뢰도 구간.
도 4: 항-IL-6/항-TNF-α 이중특이적 ISVD F027201062 및 대조군 ISVD F027301186에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체의 결합을 나타내는 박스 플롯.
도 5: 콜라겐-유도 관절염 모델에서의 진행성 관절염. N=13 수컷 DBA/1 마우스를 제0일 및 제21일에 100 ㎍의 아주반트화 콜라겐 II로 2회 면역화하였다. 제22일에 시작하여 마우스를 복강내 주사에 의해 주 2회 표시된 화합물로 처리하였다. 제56일 후 치료를 중단하였다. 마우스를 관절 염증의 임상 징후 및 증상에 대해 점수를 산정하였다. 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 질환 경과에 걸쳐 선택된 날짜에 대한 처리 대 음성 대조군을 비교하는 이원 ANOVA이다.
도 6: 콜라겐 유도 관절염 모델에 대한 경시적 관절염 점수 곡선 아래 면적. AUC는 치료 기간 제21일 내지 제56일, 치료-휴지기 제57일 내지 제91일 및 전체 연구 지속기간에 대해 별도로 계산하였다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 7: 콜라겐-유도 관절염 모델의 제91일에서의 혈장 중 항-콜라겐 II 항체. 콜라겐 II 특이적 역가를 콜라겐 II 코팅된 플레이트에서 ELISA에 의해 결정하였다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 8: 콜라겐-유도 관절염 모델의 제91일에서의 뒷발 중족골 관절에 대한 조직학 점수. 뒷발을 조직학을 위해 처리하였고, 절편을 연골 프로테오글리칸 가시화를 위해 헤마톡실린 및 에오신뿐만 아니라 사프라닌-O로 염색하였다. 맹검 점수 평가는 2명의 개인이 별도 수행하였다. 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 조직학 평가의 4개의 차원 모두에 대해 처리 대 음성 대조군을 비교하는 이원 ANOVA이다.
도 9: 항-IL-6, 항-TNF 및 둘 모두의 조합으로 처리된 콜라겐 유도 관절염 마우스 발로부터의 RNAseq. 도 9a; 이소형-처리 대조군 마우스 대비 제91일의 유의한 탈조절된 전사체(1.2 초과의 FC)의 벤 다이어그램. 도 9ba 및 도 9bb; CIA(왼쪽) 및 항-TNF 및 항-IL-6 조합 처리 후(오른쪽)의 주요 상향- 및 하향-조절된 경로.
도 10: 류마티스 관절염(RA)의 정량적 시스템 약리학 모델. 모델은 항-TNF-알파 비교인자 및 항-IL-6 비교인자로 처리한 후 류마티스 관절염 질환 점수 DAS28-CRP를 시뮬레이션하고 더 낮은 용량의 F027201062에서도 개선된 임상적 유효성(DAS28-CRP 기반)을 나타낸다. 도 11: 류마티스 관절염(RA 환자)으로부터의 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)와 건강한 공여자로부터의 T 세포의 공동배양. IL-17A, sIL-6R 및 항-CD3과의 공동배양 및 자극은 RA 환자로부터의 인간 관절에서 공개된 수준과 유사한 TNF-α 및 IL-6 수준을 유도한다.
도 12: F027201062와의 RA-FLS/T 세포 공동배양에서 MMP1 분비의 부가적 저해. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 다중특이적 ISVD에 대한 음성 대조군이다. 비교인자 항체 및 이의 조합을 양성 대조군으로 사용한다. 항-TNF-α 처리에 반응하는 공여자만 선택한다. 조합은 전체 용량 조합(예를 들어, 200 nM 항-인간 TNF-α + 200 nM 항-인간 IL-6)을 반영한다. F027201062 및 F027200926은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물이다. 평균±SEM, 8명의 상이한 T 세포 공여자, 3개의 기술적 복제를 나타낸다.
도 13: F027201062와의 RA-FLS/T 세포 공동배양에서 G-CSF 분비의 부가적 저해. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 다중특이적 ISVD에 대한 음성 대조군이다. 비교인자 항체 및 이의 조합을 양성 대조군으로 사용한다. 조합은 전체 용량 조합(예를 들어, 200 nM 항-인간 TNF-α + 200 nM 항-인간 IL-6)을 반영한다. F027201062 및 F027200926은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물이다. 항-TNF-α 처리에 반응하는 공여자만 선택한다. 평균±SEM, 8명의 상이한 T 세포 공여자, 3개의 기술적 복제를 나타낸다.
도 14: F027201062를 사용한 인간 아데노이드 배양에서의 CXCL13의 부가적 저해. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 F027201062(항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물)에 대한 음성 대조군이다. 비교인자 항체 및 이의 조합을 양성 대조군으로 사용한다. 조합은 전체 용량 조합(예를 들어, 200 nM 항-인간 TNF-α + 200 nM 항-인간 IL-6)을 반영한다. 평균±SEM, 4 내지 7명의 상이한 공여자, 2개의 기술 복제를 나타낸다.
도 15: 200 nM에서 F027201062를 사용한 인간 아데노이드 배양에서의 CXCL13의 부가적 저해. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 F027201062(항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물)에 대한 음성 대조군이다. 비교인자 항체 및 이의 조합을 양성 대조군으로 사용한다. 조합은 전체 용량 조합(200 nM 항-인간 TNF-α + 200 nM 항-인간 IL-6)을 반영한다. 평균±SEM, 7명의 상이한 공여자, 2개의 기술 복제를 나타낸다. 통계는 일원 ANOVA 및 터키(Tukey's) 다중 비교 시험이다. ** 0.01 미만의 p. *** 0.001 미만의 p.
도 16: 인간 전혈 검정에서 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물의 TNF-α 의존적 유효성. SEB-자극 전혈에서 MCP-1 저해의 IC50을 나타낸다. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물에 대한 음성 대조군이다. 항-hTNF-α 비교인자 항체가 양성 대조군으로 사용된다. 하기 항-TNF-α/IL-6 ISVD: F027200926, F027201029, F027201060, F027201061, F027201062를 평가하였다. 평균±SEM, 7명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 17: 인간 전혈 검정에서 항-TNF/IL-6 ISVD 작제물의 TNF-α 의존적 유효성. SEB-자극 전혈에서 CCL4의 용량 의존적 저해를 나타낸다. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물에 대한 음성 대조군이다. 항-hTNF-α 비교인자 항체가 양성 대조군으로 사용된다. F027201062는 다중특이적 항-TNF-α/IL-6 ISVD이다. 평균±SEM, 7명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 18: 인간 전혈 검정에서 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물의 TNF 의존적 유효성. SEB-자극 전혈에서 CCL4 저해의 IC50을 나타낸다. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물에 대한 음성 대조군이다. 항-hTNF-α 비교인자 항체가 양성 대조군으로 사용된다. F027201062는 다중특이적 항-TNF-α/IL-6 ISVD이다. 평균±SEM, 7명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 19: 인간 RA-FLS(류마티스 관절염 환자로부터의 섬유아세포-유사 활막세포)에서 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물의 IL-6 의존적 유효성. 이소형 대조군에 대해 정규화된 VEGF-A 분비의 저해%를 나타낸다. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물에 대한 음성 대조군이다. 항-hIL-6 비교인자 항체(양성 대조군) 및 하기 항-TNF-α/IL-6 ISVD: F027200926, F027201029, F027201060, F027201061, F027201062를 사용한 용량 의존적 저해. 평균±SEM, 3명의 상이한 류마티스 관절염 공여자를 나타내며 2개의 상이한 계대에서 시험하였다.
도 20: 인간 RA-FLS(류마티스 관절염 환자로부터의 섬유아세포-유사 활막세포)에서 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물의 IL-6 의존적 유효성. IgG1 이소형 대조군은 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 작용한다. ISVD 이소형 대조군은 항-TNF-α/IL-6 ISVD 작제물에 대한 음성 대조군이다. 항-hIL-6 비교인자 항체가 양성 대조군으로 사용된다. VEGF-A의 IC50을 항-hIL-6 비교인자 항체(양성 대조군) 및 하기 항-TNF-α/IL-6 ISVD: F027200926, F027201029, F027201060, F027201061, F027201062에 대해 나타낸다. 평균±SEM, 3명의 상이한 류마티스 관절염 공여자를 나타내며 2개의 상이한 계대에서 시험하였다.
도 21: Tg197 hTNF-α 유도 관절염 모델에서 F027201062의 유효성. 경시적 관절염 점수. 8마리의 Tg197 마우스(4마리 수컷 및 4마리 암컷)를 5주 동안 표시된 화합물의 복강내 주사로 주 2회 처리하였다. 관절염 점수를 매주 모니터링했다. 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 매주 동안 처리 대 음성 대조군을 비교하는 이원 ANOVA이다.
도 22: Tg197 hTNF-α-유도 관절염 모델에서 F027201062의 유효성. 경시적 관절염 점수 곡선 아래 면적. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 23: 발목 관절의 조직학 점수에 대한 Tg197 hTNF-α-유도 관절염 모델에서 F027201062의 유효성(동물당 n=2). 연구 완료시 희생 시, 양쪽 뒷발을 조직학을 위해 처리하고 발목 관절 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 절편 슬라이드를 맹검 방식으로 판독하고 점수를 산정하였다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 24: IL-6-유도 합토글로빈 분비. N=8 암컷 BALB/C 마우스에 표시된 화합물을 주사하였다. 8시간 후, 표시된 경우 마우스에 25 ㎍/㎏ 재조합 인간 IL-6을 복강내 주사하였다. 16시간 후 마우스에서 채혈하고 혈장을 형광측정 비드 검정을 사용하여 합토글로빈에 대해 분석했다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 25: hIL-6 트랜스제닉 마우스에서의 비장비대. N=6 내지 7마리의 57일령 내지 71일령 수컷 및 암컷 반접합성 C.B6-Tg(H2-L-IL6)1^Kish/J 마우스를 2주 지속기간 동안 표시된 화합물의 복강내 주사로 주 3회 처리했다. 희생 시 비장을 제거하고 체중을 기록했다. 야생형 한배 동물이 대조군으로 작용하였다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 26: hIL-6 트랜스제닉 마우스에서의 고감마글로불린혈증. N=6 내지 7마리의 57일령 내지 71일령 수컷 및 암컷 반접합성 C.B6-Tg(H2-L-IL6)1^Kish/J 마우스를 2주 지속기간 동안 표시된 화합물의 복강내 주사로 주 3회 처리했다. 희생 시, 마우스를 채혈하고 IgG1 및 IgG2a 이소형 면역글로불린 둘 모두를 화학발광 비드 검정에 의해 측정하였다. wt 한배 동물로부터의 혈장이 대조군으로 작용하였다. 개별 값 및 평균±SEM을 나타낸다. 통계 분석은 처리 대 음성 대조군을 비교하는 일원 ANOVA이다.
도 27: 비인간 영장류에서 F027201062의 단회 용량 약동학. 표시된 농도 및 투여 경로로 비인간 영장류에서 단회 용량 투여 후 F027201062의 혈청 농도 프로파일(그룹당 n=3마리 수컷, 나이브 게잡이 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)). 빨간색 파선은 3개의 아암 모두에서 확인된 ADA의 존재를 표시한다.
도 28: F027201062 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1).

5. 상세한 설명

본 개시는 염증성 및/또는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염(RA)을 치료하기 위한 신규 유형의 약물을 제공한다.

본 발명자들은 TNF-α 및 IL-6을 동시에 표적화하는 폴리펩티드가 시험관내 및/또는 생체내 단일특이적 항-TNF-α 또는 항-IL-6 폴리펩티드와 비교하여 류마티스 관절염의 증상을 조절하는 증가된 효율을 야기함을 발견하였다. 상기 폴리펩티드는 (예를 들어 미생물 숙주에서) 효율적으로 제조될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 치료될 대상체에 기존 항체(즉, 항체 작제물를 사용하는 1차 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 제한된 반응성을 갖는 것으로 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리펩티드는 편리하게 투여될 수 있고 치료될 대상체에서 연속 치료의 수가 제한된 채 유지되어 이러한 치료가 편리하게 시간적으로 떨어져 있을 수 있도록 충분히 긴 반감기를 나타낼 수 있다.

폴리펩티드는 적어도 이중특이적이지만, 예를 들어 삼중특이적, 사중특이적 또는 오중특이적일 수도 있다. 더욱이, 폴리펩티드는 적어도 3가이지만, 예를 들어 4가, 5가 또는 6가 등, 바람직하게는 4가일 수도 있다.

용어 "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적" 또는 "오중특이적"은 모두 용어 "다중특이적"에 속하며 각각 2개, 3개, 4개 또는 5개의 상이한 표적 분자에 대한 결합을 지칭한다. 용어 "2가", "3가", "4가", "5가" 또는 "6가"는 모두 용어 "다가"에 속하며 각각 2, 3, 4 또는 5개의 결합 단위(예컨대 ISVD)의 존재를 표시한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 삼중특이성-4가, 예컨대 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드일 수 있으며, 하나의 ISVD는 인간 TNF-α에 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 IL-6에 결합하고, 하나의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합한다(예컨대 ISVD 작제물 F027201062). 동시에, 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 ISVD가 인간 IL-6 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우 이중파라토프일 수 있다. 용어 "이중파라토프"는 동일한 표적 분자의 2개의 상이한 부분(예를 들어, 에피토프)에 대한 결합을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "제1 ISVD", "제2 ISVD", "제3 ISVD" 등은 1개, 2개 또는 3개 등의 ISVD의 존재를 표시할 뿐이지만 바람직하게는 ISVD의 서로의 상대적 위치도 표시하고, 넘버링은 본 개시의 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서 "제1 ISVD"는 바람직하게는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가까운 반면, "제2 ISVD"는 "제3 ISVD"보다 N-말단에 더 가까움 등이다. 따라서 ISVD 배열은 C-말단으로부터 고려될 때 반대이다. 넘버링이 절대적이지 않고 적어도 3개의 ISVD의 상대적 위치만 표시할 수 있기 때문에 다른 결합 단위/빌딩 블록, 예컨대 TNF-α 또는 IL-6에 결합하는 추가 ISVD 또는 또 다른 표적에 결합하는 ISVD가 폴리펩티드에 존재할 수 있음이 제외되지 않는다. 또한 다른 결합 단위/빌딩 블록, 예컨대 ISVD가 그 사이에 배치될 가능성이 배제되지 않는다. 예를 들어, 아래에 추가로 기재된 바와 같이(특히, 섹션 5.3 "(생체내) 반감기 연장" 참고), 폴리펩티드는 예를 들어 "제1 ISVD" 및 "제2 ISVD" 사이에 배치될 수도 있는, 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다.

상기에 비추어, 본 개시는 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 제공하며, 적어도 하나의 ISVD는 TNF-α에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 IL-6에 특이적으로 결합한다.

폴리펩티드의 성분, 예컨대 ISVD는 하나 이상의 적합한 링커, 예컨대 펩티드 링커에 의해 서로 연결될 수 있다.

2개 이상의 (폴리)펩티드를 연결하기 위한 링커의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 펩티드 링커를 표 A-5에 나타낸다. 종종 사용되는 펩티드 링커의 한 클래스는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 구성되고 일반적으로 펩티드 모티프, 예컨대 GGGGS(SEQ ID NO: 65) 모티프의 하나 이상의 반복을 포함하는 링커이다(예를 들어, 화학식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n을 갖고, 식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상일 수 있음). 이러한 GS 링커의 종종 사용되는 일부 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, SEQ ID NO: 68), 15GS 링커(n=3) 및 35GS 링커(n=7)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; and Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330]이 참조된다.

본 개시의 폴리펩티드에서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 성분을 서로 연결하기 위한 9GS 링커의 사용이 선택될 수 있다.

한 구현예에서, TNF-α에 특이적으로 결합하는 ISVD는 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 구성이 화합물의 효능을 유의하게 증가시킬 뿐만 아니라 화합물의 최적 제조에 중요한 몇몇 특성, 예컨대 용해도 및 발현 수준을 개선할 수 있음을 발견했다.

또한 한 구현예에서, IL-6에 특이적으로 결합하는 ISVD 중 하나는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단, 바람직하게는 N-말단에 위치한다.

따라서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하는 순서로 하기를 포함하거나 이로 구성된다: IL-6에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 본원에 정의된 바와 같이 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 선택적 결합 단위, IL-6에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD. 바람직한 구현예에서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 결합 단위는 ISVD이다.

일부 구현예에서 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하는 순서로 하기를 포함하거나 이로 구성되는 것으로 제공된다: IL-6에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 링커, 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 ISVD, 링커, IL-6에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD, 링커 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 ISVD. 일부 구현예에서, 링커는 9GS 링커이다.

폴리펩티드의 이러한 구성은 증가된 제조 수율, 우수한 CMC 특성뿐만 아니라 최적화된 기능성 및 면역 반응의 조절과 관련하여 더 강력한 효능을 제공할 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 120 ㎎/㎖, 예컨대 적어도 130 ㎎/㎖, 예컨대 적어도 140 ㎎/㎖, 바람직하게는 적어도 145 ㎎/㎖의 용해도를 나타낸다.

일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 인간 혈청에서 기존 항체에 의해 감소된 결합을 나타낸다. 이를 위해, 한 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD(바람직하게는 적어도 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 ISVD)에서, 또는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89에 류신(L)을 갖는다(Kabat 넘버링에 따름). 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 C-말단 ISVD의 C-말단에서 자연 발생, 비자연 발생 또는 이의 혼합물인 1개 내지 5개의 아미노산 연장, 예컨대 단일 알라닌(A) 연장을 갖는다. ISVD의 C-말단은 VTVSS(SEQ ID NO: 81)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 ISVD(바람직하게는 적어도 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 ISVD)에서 또는 각각의 ISVD에서 위치 110에 라이신(K) 또는 글루타민(Q)을 갖는다(Kabat 넘버링에 따름). 또 다른 구현예에서, ISVD는 적어도 하나의 ISVD(바람직하게는 적어도 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 ISVD)에서 또는 각각의 ISVD에서 위치 112에 라이신(K) 또는 글루타민(Q)을 갖는다(Kabat 넘버링에 따름). 일부 구현예에서, ISVD의 C-말단은 단일 알라닌의 첨가 후 폴리펩티드의 C-말단이 예를 들어 서열 VTVSSA(SEQ ID NO: 90), VKVSSA(SEQ ID NO: 91), VQVSSA(SEQ ID NO: 92), VTVKSA(SEQ ID NO: 93), VTVQSA(SEQ ID NO: 94), VKVKSA(SEQ ID NO: 95), VKVQSA(SEQ ID NO: 96), VQVKSA(SEQ ID NO: 97), 또는 VQVQSA(SEQ ID NO: 98)를 갖도록 하는 VKVSS(SEQ ID NO: 82), VQVSS(SEQ ID NO: 83), VTVKS(SEQ ID NO: 84), VTVQS(SEQ ID NO: 85), VKVKS(SEQ ID NO: 86), VKVQS(SEQ ID NO: 87), VQVKS(SEQ ID NO: 88), 또는 VQVQS(SEQ ID NO: 89)이다. 한 구현예에서, 서열은 VKVSSA(SEQ ID NO: 91)이다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89에 류신(L)을(Kabat 넘버링에 따름), 선택적으로 적어도 하나의 ISVD(바람직하게는 적어도 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 ISVD)의 위치 110에서 라이신(K) 또는 글루타민(Q), 바람직하게는 K를 갖고(Kabat 넘버링에 따름), C-말단 ISVD의 C-말단에 자연 발생, 비자연 발생, 또는 이의 혼합인 1개 내지 5개의 아미노산 연장, 예컨대 단일 알라닌(A) 연장을 갖는다(그에 의해, 폴리펩티드의 C-말단은 예를 들어 서열 VTVSSA(SEQ ID NO: 90), VKVSSA(SEQ ID NO: 91) 또는 VQVSSA(SEQ ID NO: 92)를 가짐. 이에 관한 추가 정보에 대해서는, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, WO2012/175741 및 WO2015/173325를 참고한다. 연장에 사용되는 아미노산 잔기는 바람직하게는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터, 보다 바람직하게는 글리신 및 알라닌으로부터, 가장 바람직하게는 알라닌으로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, 연장은 단일 아미노산 잔기로 구성된다.

한 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 4개의 ISVD의 CDR은 각각 아래에서 섹션 "5.1 면역글로불린 단일 가변 도메인" 및 "5.3 (생체내) 반감기 연장"에 제시된 항목 A 내지 D(또는 Kabat 정의를 사용하는 경우 A' 내지 D')에 정의된 바와 같고, 특히 다음과 같거나:

· IL-6에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· IL-6에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· TNF-α에 특이적으로 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가짐,

대안적으로 Kabat 정의를 사용하는 경우, 다음과 같다:

· IL-6에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· IL-6에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· TNF-α에 특이적으로 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가짐.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구현예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성된다.

일부 구현예에서 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNF-α 및 인간 IL-6에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도, 심지어 더 큰 결합 친화도를 갖고, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

5.1 면역글로불린 단일 가변 도메인

"단일 가변 도메인"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"(ISVD)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인 상에 존재하고 이에 의해 형성되는 면역글로불린 분자를 정의한다. 이는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "통상적인" 면역글로불린(예를 들어, 모노클로날 항체) 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, 디-scFv)과 별도로 설정하며, 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로 통상적 면역글로불린에서는 중쇄 가변 도메인(V_H)과 경쇄 가변 도메인(V_L)이 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, V_H 및 V_L 둘 모두의 상보성 결정 영역(CDR)이 항원 결합 부위에 기여할 것이다. 즉, 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다.

상기 정의의 관점에서, 통상적 4-쇄 항체(예컨대, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당분야에 알려져 있음) 또는 Fab 단편, F(ab')₂단편, Fv 단편, 예컨대 디설피드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 이러한 통상적 4-쇄 항체로부터 유래된 디아바디(모두 당분야에 알려짐)의 항원-결합 도메인은 일반적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 간주되지 않을 것이며, 이러한 경우 항원의 각 에피토프에 대한 결합은 일반적으로 하나의(단일) 면역글로불린 도메인에 의해서가 아니라 한 쌍의 (결합) 면역글로불린 도메인, 예컨대 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 즉 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는 면역글로불린 도메인의 V_H-V_L 쌍에 의해 발생할 것이기 때문이다.

대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 V_H,단일 V_HH 또는 단일 V_L 도메인에 의해 형성된다.

이와 같이, 단일 가변 도메인은 단일 항원 결합 단위(즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록 하는, 본질적으로 단일 가변 도메인으로 구성된 기능적 항원 결합 단위)를 형성할 수 있는 한, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_L-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.

면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 예를 들어 중쇄 ISVD, 예컨대 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_H, V_HH일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_HH이다. 중쇄 ISVD는 통상적 4쇄 항체 또는 중쇄 항체로부터 유래될 수 있다.

예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 Nanobody®(본원에 정의된 바와 같고, V_HH를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이의 임의의 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.

특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Nanobody®(예컨대 인간화 V_HH 또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. Nanobody®, Nanobodies® 및 Nanoclone®은 Ablynx N.V.의 등록 상표이다.

V_HH, V_HH 항체 단편 및 V_HH 항체로도 알려진 "V_HH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"(Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993))의 항원 결합 면역글로불린 가변 도메인으로 기재되었다. 용어 "V_HH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상적 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "V_H 도메인"으로 지칭됨) 및 통상적 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "V_L 도메인"으로 지칭됨)과 구별하기 위해 선택되었다. V_HH의 추가 설명에 대해, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Muyldermans의 리뷰 논문(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)뿐만 아니라 일반 배경 기술로 언급되는 하기 특허 출원을 참조한다: WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103(Vrije Universiteit Brussel); WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193(Unilever); WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527(Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)); WO 03/050531(Algonomics N.V. and Ablynx N.V.); WO 01/90190(the National Research Council of Canada); WO 03/025020(= EP 1433793)(the Institute of Antibodies); 뿐만 아니라 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 및 WO 06/122825(Ablynx N.V).

전형적으로, 면역글로불린의 생성은 실험 동물의 면역화, 하이브리도마를 생성하기 위한 면역글로불린 생산 세포의 융합 및 원하는 특이성에 대한 스크리닝이 관여한다. 대안적으로, 면역글로불린은 예를 들어 파지 디스플레이에 의한 나이브 또는 합성 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성될 수 있다.

면역글로불린 서열, 예컨대 Nanobodies®의 생성은 다양한 간행물에 광범위하게 기재되어 있으며, 그 중 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 문헌[WO 94/04678, Hamers-Casterman et al. 1993 및 Muyldermans et al. 2001 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)]이 예시될 수 있다. 이들 방법에서 낙타류는 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 상기 표적 항원으로 면역화된다. 상기 면역화로부터 수득된 나노바디 레퍼토리가 표적 항원에 결합하는 나노바디에 대해 추가로 스크리닝된다.

이러한 경우 항체 생성은 면역화 및/또는 스크리닝을 위한 정제된 항원을 필요로 한다. 항원은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 제조 과정에서 정제될 수 있다.

면역글로불린 서열에 대한 면역화 및/또는 스크리닝은 이러한 항원의 펩티드 단편을 사용하여 수행될 수 있다.

마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타류 면역글로불린 서열을 포함하는 상이한 기원의 면역글로불린 서열이 사용될 수 있다. 본 개시는 또한 완전 인간, 인간화 또는 키메라 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 낙타류 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타류 면역글로불린 서열, 또는 낙타화 도메인 항체, 예를 들어 Ward 등(예를 들어 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, WO 94/04678 및 Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994 및 Prot. Eng., 9:531-537, 1996 참고)에 의해 기재된 낙타화 dAb를 포함한다. 또한, 본 개시는, 예를 들어 다가 및/또는 다중특이적 작제물을 형성하는(하나 이상의 V_HH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 이의 제조에 대해서는, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001뿐만 아니라 예를 들어 WO 96/34103 및 WO 99/23221 또한 참고) 융합된 면역글로불린 서열 그리고 본 개시의 면역글로불린 서열로부터 유도 가능한 태그 또는 다른 기능적 모이어티, 예를 들어 독소, 표지, 방사성화학물질 등을 포함하는 면역글로불린 서열도 사용한다.

"인간화 V_HH"는 자연 발생 V_HH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "인간화"된 아미노산 서열을, 즉 상기 자연 발생 V_HH 서열의 아미노산 서열에서(및 특히 프레임워크 서열에서) 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 통상적 4-쇄 항체(예를 들어, 위에 표시된)로부터의 V_H 도메인에서 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 포함한다. 이는, 예를 들어 본원의 추가 설명 및 문헌(예를 들어, 그 전체가 참조로 포함된, WO 2008/020079)에 기반하여, 그 자체로 당업자에게 명확할 알려진 방식으로 수행될 수 있다. 다시, 이러한 인간화 V_HH는 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고 따라서 시작 물질로서 자연 발생 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드로 엄격히 제한되지 않음이 주지되어야 한다.

"낙타화 V_H"는 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "낙타화"된 아미노산 서열, 즉 통상적 4-쇄 항체로부터의 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 V_HH 도메인에서 상응하는 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 포함한다. 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 문헌(예를 들어 WO 2008/020079)에 기반하여, 그 자체로 당업자에게 명확할 알려진 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 "낙타화" 치환은 본원에 정의된 바와 같이 V_H - V_L 계면 및/또는 소위 낙타과 특징 잔기를 형성하고/하거나 이에 존재하는 아미노산 위치에 삽입될 수 있다(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann (1994 및 1996), 상기 문헌 참고). 일부 구현예에서, 낙타화 V_H를 생성하거나 설계하기 위한 시작 물질 또는 시작점으로 사용되는 V_H 서열은 포유류로부터의 V_H 서열, 또는 인간의 V_H 서열, 예컨대 V_H3 서열이다. 그러나, 이러한 낙타화 V_H는 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고 따라서 시작 물질로서 자연 발생 V_H 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드에 엄격히 제한되지 않음이 주지되어야 한다.

하나 이상의 면역글로불린 서열이 서로 및/또는 다른 아미노산 서열로(예를 들어 디설피드 가교를 통해) 연결되어 또한 유용할 수 있는 펩티드 작제물(예를 들어 Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 작제물, "디아바디" 및 기타 다중특이적 작제물)을 제공할 수 있음이 주지되어야 한다. 예를 들어 문헌[Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36)]의 리뷰가 참조된다. 일반적으로, 폴리펩티드가 대상체로의 투여를 위해(예를 들어, 예방적(prophylactic), 치료적 및/또는 진단적 목적을 위해) 의도될 때, 이는 상기 대상체에서 자연 발생하지 않는 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다.

면역글로불린 단일 가변 도메인 서열 구조의 비제한적 예는 당분야 및 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1"("FR1"); "프레임워크 영역 2"("FR2"); "프레임워크 영역 3"("FR3"); 및 "프레임워크 영역 4"("FR4")로 지칭되는 4개의 프레임워크 영역("FR")으로 이루어지고; 이 프레임워크 영역은 당분야 및 본원에서 각각 "상보성 결정 영역 1"("CDR1"); "상보성 결정 영역 2"("CDR2"); 및 "상보성 결정 영역 3"("CDR3")으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역("CDR")에 의해 단속되는 것으로 간주될 수 있다.

WO 08/020079(본원에 참조로 포함됨)의 58 및 59페이지 단락 q)에 추가로 기재된 바와 같이, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 잔기는 논문[Riechmann and Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; 예를 들어 이 간행물의 도 2 참고)]에서 낙타류로부터의 V_HH 도메인에 적용된 바와 같이, 문헌[Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)]에 의해 주어진 V_H 도메인에 대한 일반적 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다. (V_H 도메인 및 V_HH 도메인에 대해 당분야에 잘 알려져 있기 때문에) 각각의 CDR에서 아미노산 잔기의 총 수는 다를 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음이 주지되어야 한다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용된 것보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음). 이는 일반적으로 Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수도 상응하지 않을 수도 있음을 의미한다. V_H 도메인 및 V_HH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115 범위일 것이다. 그러나 본원에 기재된 목적을 위해 더 작거나 더 큰 서열이 또한 적합할 수 있음이 주지되어야 한다.

본 출원에서, 달리 표시되지 않는 한, CDR 서열은 문헌[Kontermann and D

bel (Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51)]에 기재된 바와 같은 AbM 넘버링에 따라 결정되었다. 이 방법에 따르면, FR1은 위치 1 내지 25에서 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26 내지 35에서 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36 내지 49에서 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50 내지 58에서 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 59 내지 94에서 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95 내지 102에서 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103 내지 113에서 아미노산 잔기를 포함한다.

CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. Kabat에 따른 CDR 결정에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR1은 위치 1 내지 30에서 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR1은 위치 31 내지 35에서 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR2는 위치 36 내지 49에서 아미노산을 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR2는 위치 50 내지 65에서 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR3은 위치 66 내지 94에서 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은 위치 95 내지 102에서 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR4는 위치 103 내지 113에서 아미노산 잔기를 포함한다.

이러한 면역글로불린 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 추가 개시 및 선행 기술에 기반하여 당업자에게 명확할 것이다.

프레임워크 서열은 면역글로불린 프레임워크 서열(의 적합한 조합) 또는 (예를 들어 인간화 또는 낙타화에 의해) 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어, V_L-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH 서열)로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 한 구현예에서, 프레임워크 서열은 V_HH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열(상기 프레임워크 서열은 선택적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화되었을 수 있음)이거나 낙타화된 통상적 V_H 서열(본원에 정의된 바와 같음)이다.

특히, 본원에 개시된 바와 같은 ISVD 서열에 존재하는 프레임워크 서열은 ISVD 서열이 Nanobody®, 예컨대 인간화 V_HH 또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH이도록 하는, 하나 이상의 특징 잔기(본원에 정의된 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열(의 적절한 조합)의 일부 비제한적 예는 본원의 추가 개시로부터 명확해질 것이다.

다시, 면역글로불린 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 하나 이상의 프레임워크 서열로 적합하게 측접되고/되거나 이에 의해 연결된 임의의 전술한 것들의 적합한 단편(또는 단편의 조합), 예컨대 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편을 또한 사용할 수 있다(예를 들어, 이들 CDR 및 프레임워크 서열과 동일한 순서로 단편이 유래된 전체 크기의 면역글로불린 서열에서 발생할 수 있음).

그러나, 본 개시가 ISVD 서열(또는 이를 발현하기 위해 사용된 뉴클레오티드 서열)의 기원이나 ISVD 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성 또는 수득되는(또는 생성 또는 수득된) 방식에 대해 제한되지 않음이 주지되어야 한다. 따라서, ISVD 서열은 (임의의 적합한 종으로부터의) 자연 발생 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 구체적인, 그러나 비제한적인 측면에서, ISVD 서열은 "인간화"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(예컨대, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분적으로 또는 완전히 인간화된 V_HH 서열), "낙타화"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열뿐만 아니라 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작), CDR 이식, 베니어링, 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 조합, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기술과 같은 기술에 의해 수득된 면역글로불린 서열; 또는 임의의 전술한 것들의 임의의 적합한 조합을 포함하지만 이에 의해 제한되지 않는 자연 발생 서열(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 서열이다.

유사하게, 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있으며, 예를 들어 적합한 자연 발생 주형(예를 들어, 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(및 특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열, 자연 발생 뉴클레오티드 서열로 돌연변이를 도입하여 제조된 뉴클레오티드 서열(미스매치 PCR과 같은 그 자체로 알려진 임의의 적합한 기술을 사용), 중첩 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 그 자체로 알려진 DNA 합성을 위한 기술을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

전술된 바와 같이, ISVD는 Nanobody® 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. Nanobodies®(Nanobody® 및 Nanobodies®는 Sanofi Company인 Ablynx N.V.의 등록 상표임)의 일반적인 설명에 대해서는 아래의 추가 설명뿐만 아니라 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다. 그러나 이와 관련하여, 본 발명의 기재 및 선행 기술이 주로 소위 "V_H3 클래스"의 Nanobodies®(즉, V_H3 클래스의 인간 생식계열 서열과 고도의 서열 상동성을 갖는 Nanobodies®, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29)를 기재하였음이 주지되어야 한다. 그러나 가장 넓은 의미에서 본 개시는 일반적으로 임의의 유형의 Nanobody®를 사용할 수 있고, 예를 들어 그 전체가 참조로 포함된 WO 2007/118670에 기재된 바와 같이, 소위 "V_H4 클래스"에 속하는 Nanobodies®(즉, V_H4 클래스의 인간 생식계열 서열과 고도의 서열 상동성을 갖는 Nanobodies®, 예컨대 DP-78)를 또한 사용함이 주지되어야 한다.

일반적으로, Nanobodies®(특히 (부분적으로) 인간화 V_HH 서열 및 낙타화 V_H 서열을 포함하는 V_HH 서열)는 하나 이상의 프레임워크 서열(다시 본원에 추가로 설명된 바와 같음)에서 하나 이상의 "특징 잔기"(본원에 기재된 바와 같음)의 존재를 특징으로 할 수 있다. 따라서 일반적으로 Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열로 정의될 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

식 중, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하고, 하나 이상의 특징 잔기는 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

특히, Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

식 중, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하고, 프레임워크 서열은 본원에서 추가로 정의된 바와 같다.

보다 특히, Nanobody®는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

식 중, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하고, 여기서

Kabat 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 아래 표 X에 언급된 특징 잔기로부터 선택된다.

본원에 표시된 FR은 적합하게는 표 A-2(또는 Kabat 넘버링에 대한 표 A-2.1)에 표시된 바와 같은 FR, 바람직하게는 동일한 클론(즉, 동일한 줄에 나타낸 FR)으로부터 선택될 수 있으며, 선택적으로 본원에 기재된 바와 같은 특정 위치에서 아미노산을 갖는다.

[표 X]

Nanobodies®에서의 특징 잔기

일부 구현예에서, 위치 11에서 특징 잔기는 L이다. 일부 구현예에서, 위치 37에서 특징 잔기는 F⁽¹⁾또는 Y이다. 일부 구현예에서, 위치 44에서 특징 잔기는 G⁽²⁾또는 Q⁽³⁾이다. 일부 구현예에서, 위치 45에서 특징 잔기는 L⁽²⁾또는 R⁽³⁾이다. 일부 구현예에서, 위치 47에서 특징 잔기는 F⁽¹⁾, L⁽¹⁾또는 W⁽²⁾이다. 일부 구현예에서, 위치 83에서 특징 잔기는 K이다. 일부 구현예에서, 위치 84에서 특징 잔기는 P이다. 일부 구현예에서, 위치 103에서 특징 잔기는 W이다. 일부 구현예에서, 위치 104에서 특징 잔기는 G이다. 일부 구현예에서, 위치 108에서 특징 잔기는 Q 또는 L이다.

또한, 위치 1에 N-말단 글루탐산(E)을 갖는 ISVD가 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 경우, 글루탐산은 바람직하게는 아스파르트산(D)으로 치환된다. 따라서 예를 들어 SEQ ID NO: 3, 4 또는 5가 폴리펩티드의 N-말단에 있는 경우, 위치 1에서 E는 D로 변경될 수 있다. 반대로 예를 들어 SEQ ID NO: 2가 폴리펩티드의 N-말단에 존재하지 않는 경우, 위치 1의 D에서 E로 변경될 수 있다.

본 개시는 특히 TNF-α 또는 IL-6에 특이적으로 결합할 수 있는 ISVD를 사용한다. 본 개시의 맥락에서, 특정 표적 분자"에 결합하는"은 항체 및 이의 각각의 항원의 맥락에서 이해되는 바와 같이 당분야에서 일반적 의미를 갖는다.

본 개시의 폴리펩티드는 TNF-α에 결합하는 하나 이상의 ISVD 및 IL-6에 결합하는 2개 이상의 ISVD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 TNF-α에 결합하는 1개의 ISVD 및 IL-6에 결합하는 2개의 ISVD를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 ISVD는 그 표적 분자를 기능적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 TNF-α와 TNFR(TNF 수용체) 사이의 상호작용을 차단할 수 있거나 IL-6과 IL-6R(인터루킨 6 수용체) 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 TNF-α에 특이적으로 결합하고 TNFR과의 그 상호작용을 저해하는 적어도 하나의 ISVD, 및 IL-6에 특이적으로 결합하고 IL-6R과의 그 상호작용을 기능적으로 차단하는 2개의 ISVD를 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 IL-6에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하고, 그 중 하나는 IL-6과 IL-6R의 상호작용을 기능적으로 차단한다.

본 개시에서 사용된 ISVD는 폴리펩티드가 TNF-α 및 IL-6에 특이적으로 결합할 수 있도록, 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 본 개시의 폴리펩티드의 일부를 형성한다.

따라서, 본 개시의 폴리펩티드에서 사용된 바와 같은 적어도 3개의 ISVD에 대한 표적 분자는 TNF-α 및 IL-6이다. 예는 포유동물 TNF-α 및 IL-6이다. 인간 TNF-α(Uniprot 접근 P01375) 및 인간 IL-6(Uniprot 접근 P05231)이 사용될 수 있지만, 다른 종으로부터의 버전, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 비인간 영장류, 예컨대 게잡이 원숭이(본원에서 "cyno"로도 지칭됨), 또는 낙타류, 예컨대 라마 또는 알파카로부터의 TNF-α 및 IL-6도 본 개시에 적합할 수 있다.

본 개시에서 사용될 수 있는 TNF-α 또는 IL-6에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 하기 항목 A 내지 C에 기재된 바와 같고:

A. 인간 IL-6에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 6과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 10과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 14와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3,

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적인 예는 표 A-2의 작제물 17C04에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 A에서 정의된 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 17C04의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2, 표 A-1 및 A-2 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

또한, 한 구현예에서, 인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 선택적으로 CDR은 이전 항목 A에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, IL-6에 특이적으로 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는다.

IL-6에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 A)과 같이 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, 일부 구현예에서, ISVD는 작제물 17C04와 비교하여 인간 IL-6에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 바람직하게는 적어도 동일한 결합 친화도, 또는 심지어 더 큰 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

B. 인간 IL-6에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 8과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 12와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 16과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3,

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2에서 작제물 6B12에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 B에서 정의된 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 6B12의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4, 표 A-1 및 A-2 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

또한, 한 구현예에서, 인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 선택적으로 CDR은 이전 항목 B에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, IL-6에 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는다.

IL-6에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 B)과 같이 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, 일부 구현예에서, ISVD는 작제물 6B12와 같이 인간 IL-6에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도, 또는 심지어 더 큰 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

C. 인간 TNF-α에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 9와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 13과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 17과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3,

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는다.

TNF-α에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적인 예는 표 A-2에서 작제물 6C11에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 C에 정의된 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 6C11의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5, 표 A-1 및 A-2 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

또한, 한 구현예에서, 인간 TNF-α에 특이적으로 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5와 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 선택적으로 CDR은 이전 항목 C에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, TNF-α에 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는다.

TNF-α에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 C)과 같이 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, ISVD는 작제물 6C11과 비교하여 인간 TNF-α에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도, 또는 심지어 더 큰 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

일부 구현예에서, 상기 항목 A 내지 C 하에 정의된 바와 같은 각각의 ISVD가 본 개시의 폴리펩티드에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 항목 A 내지 C 하에 정의된 각각의 ISVD를 포함하는 본 개시의 이러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드와 같이 인간 TNF-α 및 인간 IL-6에 대한 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도 또는 심지어 더 큰 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

상기 항목 A 내지 C에서 언급된 SEQ ID NO:는 AbM 정의에 따른 CDR 정의에 기반한다(표 A-2 참고). Kabat 정의(표 A-2.1 참고)에 따라 동일한 CDR을 정의하는 SEQ ID NO:가 마찬가지로 상기 항목 A 내지 C에서 사용될 수 있음이 주지된다.

따라서, AbM 정의를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 본 개시에서 사용될 수 있는 TNF-α 또는 IL-6에 특이적으로 결합하는 특정 ISVD는 또한 하기 항목 A' 내지 C'에 제시된 Kabat 정의를 사용하여 기재될 수 있다:

A'. 인간 IL-6에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 33과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 37과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2.1에서 작제물 17C04에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 A'에 정의된 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 17C04의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2, 표 A-1 및 A-2.1 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

B'. 인간 IL-6에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 35와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 39와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 IL-6에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2.1에서 작제물 6B12에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 B'에 정의된 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 6B12의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4, 표 A-1 및 A-2.1 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

C'. 인간 TNF-α에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 36과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 40과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2.1에서 작제물 6C11에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 C'에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 6C11의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5, 표 A-1 및 A-2.1 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성" 백분율은 [제2 아미노산 서열의 상응하는 위치에서 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산될 수 있고, 제2 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 (제91 아미노산 서열과 비교하여) 단일 아미노산 잔기(즉, 단일 위치)에서의 차이로 간주된다.

일반적으로, 본원에 상기 개략된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성" 백분율을 결정하기 위해, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열로 취해질 것이며, 다른 아미노산 서열은 "제2" 아미노산 서열로 취해질 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 "아미노산 차이"는 참조 서열에 대한 단일 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산 차이는 치환이다. 주어진 참조 서열과 더 적은 아미노산 차이가 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, CDR이 주어진 SEQ ID NO: 1과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 경우, 1개의 아미노산 차이가 바람직하다.

일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 구현예에서, 이러한 보존적 치환은 하기 그룹 (a) 내지 (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이의 (비하전) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.

일부 구현예에서, 보존적 치환은 하기와 같다: Ala을 Gly 또는 Ser로; Arg을 Lys으로; Asn을 Gln 또는 His으로; Asp를 Glu로; Cys을 Ser으로; Gln을 Asn으로; Glu를 Asp로; Gly을 Ala 또는 Pro으로; His을 Asn 또는 Gln으로; Ile을 Leu 또는 Val으로; Leu을 Ile 또는 Val으로; Lys을 Arg, Gln 또는 Glu로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp를 Tys으로; Tyr을 Trp으로; 및/또는 Phe을 Val, Ile 또는 Leu으로.

5.2 특이성

용어 "특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 특정 결합 단위, 예컨대 ISVD가 충분히 높은 친화도로 결합할 수 있는 동일한 유기체로부터의 상이한 표적 분자, 예컨대 항원의 수를 지칭한다(아래 참고). "특이성 ^{", "} 특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 본원에서 "선택성", "선택적으로 결합하는" 또는 "선택적 결합"과 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에 따르면, 결합 단위, 예컨대 ISVD는 이의 지정된 표적에 특이적으로 결합한다.

결합 단위의 특이성/선택성은 친화도에 기반하여 결정될 수 있다. 친화도는 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 표시한다. 친화도는 일반적으로 몰/리터(또는 M) 단위를 갖는, KD 또는 해리 상수로 주어진다. 친화도는 또한 1/KD과 같고 (몰/리터)^-1(또는 M^-1) 단위를 갖는 결합 상수, KA로 표현될 수 있다.

친화도는 모이어티와 표적 분자 상 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 작을수록 표적 분자와 표적화 모이어티 사이의 결합 강도가 강하다.

전형적으로, 본 개시에서 사용되는 결합 단위(예컨대 ISVD)는 (실온에서) 10^-5 내지 10^-12몰/리터 이하, 예컨대 10^-7 내지 10^-12 몰/리터 이하, 보다 구체적으로 예컨대 10^-8내지 10^-12 몰/리터의 해리 상수(KD)를 가지며(즉, 결합 상수(KA) 10⁵내지 10¹² 리터/몰 이상, 예컨대 10⁷ 내지 10¹² 리터/몰 이상, 보다 구체적으로 예컨대 10⁸ 내지 10¹²리터/몰을 가짐) 이의 표적에 결합할 것이다.

10^-4 몰/리터 초과의 임의의 KD 값(또는 10⁴리터/몰 미만의 임의의 KA 값)은 일반적으로 비특이적 결합을 표시하는 것으로 간주된다.

특이적으로 간주되는, 생물학적 상호작용, 예컨대 항원에 대한 면역글로불린 서열의 결합에 대한 KD는 전형적으로 10^-5 몰/리터(10000 nM 또는 10 μM) 내지 10^-12 몰/리터(0.001 nM 또는 1 pM) 이하의 범위이다.

따라서, 특이적/선택적 결합은 (동일한 측정 방법, 예를 들어 SPR을 사용하여) 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 10^-5 내지 10^-12몰/리터 이하의 KD 값으로 TNF-α 및/또는 IL-6에 결합하고 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 관련 사이토카인에 결합함을 의미할 수 있다. TNF-α에 대한 관련 사이토카인의 예는 TNF 슈퍼패밀리 구성원 FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL이다. IL-6에 대한 관련 사이토카인의 예는 IL-6 패밀리 구성원 IL-11, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 카디오트로핀 1(CT-1), 카디오트로핀 유사 사이토카인(CLC) 및 IL-27이다. 따라서, 한 구현예에서, 폴리펩티드에 포함된 적어도 하나의 ISVD는 10^-5내지 10^-12몰/리터 이하의 KD 값으로 TNF-α에 결합하고 10^-4몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 FASL, TNFβ, LIGHT, TL-1A, RANKL에 결합하고, 폴리펩티드에 포함된 적어도 2개의 ISVD는 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 IL-6에 결합하고 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 IL-11, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 카디오트로핀 1(CT-1), 카디오트로핀 유사 사이토카인(CLC), IL-27에 결합한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드와 비교하여 인간 TNF-α 및 인간 IL-6에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도, 또는 심지어 더 높은 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

특정 종으로부터의 특정 표적에 대한 특이적 결합은 결합 단위가 상이한 종으로부터의 유사한 표적에도 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 인간 TNF-α에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 게잡이 원숭이로부터의 TNF-α에도 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다. 마찬가지로, 예를 들어 인간 IL-6에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩티드)가 게잡이 원숭이("cyno")로부터의 IL-6에도 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다.

그 지정된 표적에 대한 결합 단위의 특이적 결합은 스캐챠드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 방사면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 당분야에 그 자체로 알려진 이의 상이한 변형; 뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.

해리 상수는 당업자에게 명확할 바와 같이 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 아래 언급된 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 10^-4 몰/리터 또는 10^-3 몰/리터(예를 들어, 10^-2 몰/리터)를 초과하는 해리 상수를 측정하는 것이 가능하지 않을 수 있음이 또한 명확할 것이다. 선택적으로, 또한 당업자에게 명확할 바와 같이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 관계식 [KD = 1/KA]에 의해 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(KA)에 기반하여 계산될 수 있다.

2개의 분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 그 자체로 알려진 상이한 기술, 예컨대 잘 알려진 표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센서 기술(예를 들어 Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559 참고)을 통해 측정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경 검출에 의해 실시간 생체특이적 상호작용을 분석할 수 있도록 하는 광학 현상을 지칭하며, 하나의 분자가 바이오센서 칩 상에 고정화되고 다른 분자가 유동 조건 하에 고정화된 분자 위로 통과되어 k_on, k_off 측정 및 따라서 K_D(또는 K_A) 값을 산출한다. 이는, 예를 들어 잘 알려진 BIAcore® 시스템(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 수행될 수 있다. 추가의 설명에 대해서는 문헌[Jonsson et al. (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26), Jonsson et al. (1991 Biotechniques 11: 620-627), Johnsson et al. (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131), 및 Johnsson et al. (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)]을 참고한다.

생체분자 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 또 다른 잘 알려진 바이오센서 기술은 생물층 간섭계(BLI)이다(예를 들어, Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217 참고). 본원에 사용된 용어 "생물층 간섭계" 또는 "BLI"는 2개의 표면: 내부 참조층(기준 빔) 및 바이오센서 팁 상의 고정화된 단백질층(신호 빔)으로부터 반사된 빛의 간섭 패턴을 분석하는 무표지 광학 기술을 지칭한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 변화는 파장 이동(nm)으로 보고되는 간섭 패턴의 이동을 유발하며, 그 크기는 바이오센서 팁 표면에 결합된 분자 수의 직접적인 척도이다. 상호작용이 실시간으로 측정될 수 있기 때문에, 결합 및 해리 속도 그리고 친화도가 결정될 수 있다. BLI는 예를 들어 잘 알려진 Octet® Systems(ForteBio, Pall Life Sciences, Menlo Park, USA)을 사용하여 수행될 수 있다.

대안적으로, 친화도는 KinExA® 플랫폼(Sapidyne Instruments Inc, Boise, USA)을 사용하여 역학적 배제 검정(KinExA)에서 측정될 수 있다(예를 들어 Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43 참고). 본원에 사용된 용어 "KinExA"는 변형되지 않은 분자의 실제 평형 결합 친화도 및 동역학을 측정하기 위한 용액 기반 방법을 지칭한다. 항체/항원 복합체의 평형화된 용액이 항원(또는 항체)으로 미리 코팅된 비드가 있는 컬럼 위로 통과되어 유리 항체(또는 항원)가 코팅된 분자에 결합할 수 있도록 한다. 이렇게 포획된 항체(또는 항원)의 검출은 항체(또는 항원)에 결합하는 형광 표지된 단백질로 달성된다.

GYROLAB® 면역검정 시스템은 자동화된 생체분석 및 신속한 샘플 처리를 위한 플랫폼을 제공한다(Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74).

5.3 (생체내) 반감기 연장

폴리펩티드는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된(생체내) 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 생체내 반감기 연장은, 예를 들어 폴리펩티드가 투여 후 포유류, 예컨대 인간 대상체에서 증가된 반감기를 갖는 것을 의미한다. 반감기는 예를 들어 t1/2베타로 표현될 수 있다.

기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위의 유형은 일반적으로 제한되지 않으며 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

보다 구체적으로, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단위는 ISVD이다.

예를 들어, WO 04/041865(그 전체가 참조로 포함됨)는 상기 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 다른 단백질에 연결될 수 있는(예컨대 원하는 표적에 결합하는 하나 이상의 다른 Nanobodies®) 혈청 알부민(특히 인간 혈청 알부민에 대해)에 결합하는 Nanobodies®를 기재한다

국제 출원 WO 06/122787(그 전체가 참조로 포함됨)은 (인간) 혈청 알부민에 대한 다수의 Nanobodies®를 기재한다. 이러한 Nanobodies®는 Alb-1(그 전체가 참조로 포함된, WO 06/122787에서 SEQ ID NO: 52)로 불리는 Nanobody® 및 이의 인간화 변이체, 예컨대 Alb-8(그 전체가 참조로 포함된, WO 06/122787에서 SEQ ID NO: 62)을 포함한다. 다시, 이들은 치료 단백질 및 폴리펩티드 그리고 다른 치료 실체 또는 모이어티의 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있다.

더욱이, WO2012/175400(그 전체가 참조로 포함됨)은 Alb-23으로 불리는 Alb-1의 추가로 개선된 버전을 기재한다.

한 구현예에서, 폴리펩티드는 Alb-1, Alb-3, Alb-4, Alb-5, Alb-6, Alb-7, Alb-8, Alb-9, Alb-10 및 Alb-23으로부터 선택된 혈청 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 WO2012/175400의 7 내지 9페이지에 나타낸 바와 같은 Alb-8 또는 Alb-23, 또는 그 변이체 및 각각 전체가 본원에 참조로 포함된, WO2012/175741, WO2015/173325, WO2017/080850, WO2017/11085172, WO2018/104444, WO2018/134235, WO2018/134234에 기재된 알부민 결합제를 포함한다. 혈청 알부민 결합제의 일부 비제한적 예를 또한 표 A-4에 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 항목 D에 기재된 바와 같은 추가 성분을 포함한다:

D. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 7과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 11과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

iii. SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 15와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3;

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2의 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 D에서 정의된 바와 같은 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 ALB23002의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3, 표 A-1 및 A-2 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

항목 D는 또한 Kabat 정의를 사용하여 다음과 같이 기재될 수 있다:

D'. 인간 혈청 알부민에 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 34와 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR1;

ii. SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 38과 2 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2; 및

일부 구현예에서, CDR1은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 비제한적 예는 표 A-2.1에서 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을(이전 항목 D'에 정의된 바와 같은 CDR에 더하여), 예컨대 작제물 ALB23002의 전체 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3, 표 A-1 및 2.1 참고)을 갖는 ISVD를 갖는다.

또한 한 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 선택적으로 CDR은 이전 항목 D에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD가 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 D)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, ISVD는 작제물 ALB23002와 같이 인간 혈청 알부민에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 적어도 동일한 결합 친화도, 또는 심지어 더 큰 결합 친화도를 가지며, 결합 친화도는 동일한 방법, 예컨대 SPR을 사용하여 측정된다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD가 C-말단 위치를 가질 때 이는 C-말단 알라닌(A) 또는 글리신(G) 연장을 나타내고 SEQ ID NO: 52, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62 및 63으로부터 선택될 수 있다(아래 표 A-4 참고). 한 구현예에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 C-말단 위치 이외의 또 다른 위치를 갖고(즉, 본 개시의 폴리펩티드의 C-말단 ISVD가 아님) SEQ ID NO: 3, 50, 51, 54 및 56으로부터 선택된다(아래 표 A-4 참고).

5.4 핵산 분자

본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 또한 제공된다.

"핵산 분자"("핵산"과 상호교환적으로 사용됨)는 뉴클레오티드 서열을 형성하기 위해 포스페이트 골격을 통해 서로 연결된 뉴클레오티드 단량체 사슬이다. 핵산은 예를 들어 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 제조 목적에 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포가 또한 본 개시에 포괄된다.

핵산은 예를 들어 DNA, RNA 또는 이의 하이브리드일 수 있으며 또한 PNA와 같은 (예를 들어 화학적으로) 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 단일 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA일 수 있다.

본 개시의 핵산은 그 자체로 알려진 방식으로 제조 또는 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 자연 발생 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 변이가 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하기 위해 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발을 거칠 수 있다. 또한, 당업자에게 명확할 바와 같이, 핵산을 제조하기 위해, 또한 몇몇 뉴클레오티드 서열, 예컨대 표적화 모이어티를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 암호화하는 핵산이 적합한 방식으로 함께 연결될 수 있다.

핵산을 생성하는 기술은 당업자에게 명확할 것이며 예를 들어 자동화된 DNA 합성; 부위 지정 돌연변이유발; 2개 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 2개 이상의 부분) 조합, 절단된 발현 생성물의 발현을 야기하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들어, 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 분해 및/또는 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위해) 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

5.5 벡터

또한 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은 벡터는 유전 물질을 세포로 운반하기에 적합한 비히클이다. 벡터는 네이키드 핵산, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA 또는 더 큰 구조로 포매된 핵산, 예컨대 리포솜 또는 바이러스 벡터를 포함한다.

벡터는 일반적으로 예를 들어 하나 이상의 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등과 같은 하나 이상의 조절 요소에 선택적으로 연결된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 벡터는 발현 벡터, 즉 예를 들어 벡터가 (예를 들어 인간) 세포로 도입될 때, 적합한 조건 하에 암호화된 폴리펩티드 또는 작제물을 발현하기에 적합한 벡터일 수 있다. DNA 기반 벡터의 경우, 이는 일반적으로 전사(예를 들어, 프로모터 및 폴리A 신호) 및 번역(예를 들어, 코작 서열)에 대한 요소의 존재를 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터에서, 상기 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소는 서로 "작동 가능하게 연결"되며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있는 경우, 상기 프로모터는 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다(상기 코딩 서열은 상기 프로모터"의 제어 하에" 있는 것으로 이해되어야 함). 일반적으로 두 개의 뉴클레오티드 서열이 작동 가능하게 연결될 때, 이들은 동일한 배향에 있고 일반적으로 동일한 판독 프레임에 있을 것이다. 요구되지 않을 수도 있지만, 이들은 또한 보통 본질적으로 연속적일 것이다.

일부 구현예에서, 벡터의 임의의 조절 요소는 이들이 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 한다.

예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동 가능"해야 하며, 이는 예를 들어 상기 프로모터가 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 코딩 서열)의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.

5.6 조성물

본 개시는 또한 본 개시의 적어도 하나의 폴리펩티드, 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다.

5.7 숙주 유기체

본 개시는 또한 본 개시의 폴리펩티드, 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 및/또는 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 관한 것이다.

적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명확하고, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체이다. 구체적인 예는 HEK293 세포, CHO 세포, 대장균 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주는 피치아 파스토리스이다.

5.8 폴리펩티드의 방법 및 용도

본 개시는 또한 본 개시의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키는 단계, 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 단계, 선택적으로 이어서 하나 이상의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 방법은 다음을 포함할 수 있다:

a) 적합한 발현 시스템(예를 들어, 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 발현 시스템)에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서

b) 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

생산 목적에 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 구체적인 예는 HEK293 세포, CHO 세포, 대장균 또는 피치아 파스토리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주는 피치아 파스토리스이다.

본 개시의 폴리펩티드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 개시의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물(예컨대 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 조성물)은 약제로서 유용하다.

따라서, 본 개시는 약제로 사용하기 위한 본 개시의 폴리펩티드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 개시의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한 염증성 및/또는 자가면역 질환의 (예방적 또는 치료적) 치료에서 사용하기 위한 본 개시의 폴리펩티드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 개시의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 (예방적 및/또는 치료적) 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 본 개시의 폴리펩티드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 개시의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

추가로, 약학 조성물, 예컨대 염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 개시의 폴리펩티드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 개시의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

염증성 및/또는 자가면역 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 화농 땀샘염 및 사르코이드증일 수 있다. 바람직하게는 염증성 및/또는 자가면역 질환은 류마티스 관절염이다.

본 개시의 맥락에서 언급된 바와 같은 "대상체"는 임의의 동물, 예컨대 포유류일 수 있다. 포유류 중에서 인간과 비인간 동물이 구분될 수 있다. 비인간 동물은 예를 들어 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 가축(예를 들어, 소, 말, 양, 염소 또는 돼지 동물), 또는 연구 목적 및/또는 항체 생산을 위해 일반적으로 사용되는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 비인간 영장류, 예컨대 게잡이 원숭이 또는 낙타류, 예컨대 라마 또는 알파카)일 수 있다.

예방적 및/또는 치료적 목적의 맥락에서, 대상체는 임의의 동물, 보다 구체적으로는 임의의 포유류, 예컨대 인간 대상체일 수 있다.

물질(폴리펩티드, 핵산 분자 및 벡터 포함) 또는 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 장(예컨대 경구 또는 직장) 또는 비경구(예를 들어, 피부하, 설하, 협측, 비강, 관절내, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경피 또는 경점막) 투여에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예컨대 근육내, 피하 또는 피내 투여가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 피하 투여가 사용된다.

유효량의 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물은 의도된 치료 결과를 제공하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.

하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 1개 초과 용량이 투여되는 경우, 용량은 폴리펩티드, 조성물, 핵산 분자 또는 벡터의 효과를 최대화하기 위해 적합한 간격으로 투여될 수 있다.

[표 A-0]

F027201062 구성

[표 A-1]

4가 폴리펩티드 F027201062 내에서 확인된 상이한 1가 VHH 빌딩 블록의 아미노산 서열("ID"는 본원에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 A-2]

AbM 넘버링에 따른 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 A-2.1]

Kabat 넘버링에 따른 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 A-3]

선택된 다가 폴리펩티드의 아미노산 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 A-4]

혈청 알부민 결합 ISVD 서열("ID"는 본원에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 A-5]

링커 서열("ID"는 본원에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO를 지칭함)

6. 실시예

6.1 실시예 1: 야생형 항-IL-6 2가 또는 이중파라토프 ISVD 작제물의 생성 및 시험관내 특성규명.

1가 항-IL-6 ISVD IL6006B06, IL006B12, IL6007G04, IL6007G05, IL6007G09, IL6010A06, IL6013F12 및 IL6017C04(WO2007104529에 기재됨)는 항-IL-6 참조 mAb 1(IL-6에 대한 벤치마크 모노클로날 항체)와 비교하여 TF-1 증식 검정에서 조사할 때 충분한 IL-6 차단능을 나타내지 않았다. 효능을 개선하기 위한 시도로, 항-IL-6 ISVD를 이중파라토프 ISVD 작제물로 형식화했다. 작제물의 빌딩 블록은 가요성 35GS 또는 9GS(GlySer) 링커에 의해 유전적으로 연결된다. ISVD는 대장균에서 FLAG3-HIS6 태그 단백질로 발현하였다. 발현은 자동-유도를 통해 수행하였고 30℃에서 하룻밤 계속되도록 하였다. 세포 배양을 회전침강시킨 후, 펠릿을 동결-해동하고 dPBS 중 재현탁하여 주변세포질 추출물을 제조하였다. 이들 추출물을 니켈 IDA/NTA 컬럼(Genscript - Atoll)을 사용하는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)의 시작 물질로 사용하였다. ISVD는 200 mM Na-아세테이트(pH 4)로 컬럼으로부터 용출하고 트리스 HCl(pH 8)로 중화한 후 dPBS 쪽으로 탈염시켰다.

항-IL-6 ISVD의 저해 효능을 TF-1 세포의 IL-6 매개 증식을 모니터링하는 세포 기반 검정에서 결정하였다. 이를 위해 TF-1 세포를 10% FBS 및 1% Na-피루베이트가 보충된 RPMI 1640, 글루타맥스, HEPES 배지(Gibco)에서 배양하였다. TF-1 세포를 성장 배지 중 웰당 12.500개 세포로 시딩하였다. 정제된 항-IL-6 ISVD 또는 참조 화합물의 연속 희석물을 첨가했다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 75 pM의 인간 IL-6(R&D 시스템 카탈로그 번호 200-IL-200|206-IL)을 첨가하였다. 72시간 후, TF-1 세포의 증식을 EnVision 다중표지 판독기(Perkin Elmer) 상에서 CellTiter-Glo(Promega #G7571)로 결정했다.

몇몇 이중파라토프 작제물은 인간 IL-6에 대해 개선된 효능을 나타냈고 항-hIL-6 참조 mAb 1의 효능과 유사한 효능에 도달했다(표 1).

또한, 가요성 35GS(GlySer) 링커에 의해 유전적으로 연결된 2가 항-IL-6 ISVD를 생성하고 THP-1 세포에서 IL-6 유도 pSTAT3 생성을 모니터링하는 제2 세포 기반 검정에서 이의 효능을 평가했다. 이를 위해 THP-1 세포를 글루타맥스+ 및 10% 열 불활성화 FBS가 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 흰색 96웰 플레이트로 시딩하기 전에, 배지를 HBSS로 교환하고, 세포를 100,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 정제된 항-IL-6 ISVD 또는 참조 항-IL-6 mAb1의 연속 희석물을 300 pM hIL-6(R&D 시스템 카탈로그 번호 200-IL-200|206-IL)과 함께 첨가하고 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 회전 침강시키고 용해시켰다. 용해된 세포 상청액 16 ㎕를 pSTAT3 및 전체 STAT3에 대한 HTRF 검출 항체 혼합물(PHOSPHO-STAT3(TYR705) 키트, Cisbio #62AT3PE)과 혼합했다. 이 키트를 사용하여 pSTAT3(Tyr705)을 Eu3+-크립테이트(공여자)로 표지된 하나 및 d2(수용체)로 표지된 제2 항체인 2개의 상이한 특이적 항체를 사용하는 샌드위치 검정 형식으로 검출한다. 염료가 가까이 근접해 있을 때, 광원을 사용한 공여체의 여기는 수신체를 향한 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 촉발하고, 이는 결과적으로 특정 파장(665 nm)에서 형광을 발한다. 특정 신호는 pSTAT3에 비례하여 양성적으로 조절된다. pSTAT를 EnVision 다중표지 판독기(Perkin Elmer) 상에서 665 nm에서의 흡광도를 측정하여 및 총 STAT3는 620 nM에서의 흡광도를 측정하여 정량했다.

2가 작제물은 1가 항-IL-6 ISDV와 비교하여 효능이 유의하게 증가하지 않았지만, 이중파라토프 항-IL-6 ISVD는 1가 또는 2가 작제물과 비교하여 유의한 효능 증가를 나타내었다(표 2).

이 실행으로부터, 11개의 이중파라토프 항-IL-6 ISVD를 항-TNF-α ISVD와 커플링하기 위해 선택하였다: IL6013F12-IL6006B06, IL6006B06-IL6017C04, IL6013F12-IL6007G09, IL6006B06-IL6006B12, IL6006B06-IL6010A06, IL6017C04-IL6007G09, IL6006B12-IL6013F12, IL6010A06-IL6007G09, IL6006B12-IL007G09, IL6007G09-IL6006B12 또는 IL6017C04-IL6006B12.

[표 1]

TF1 증식 검정에서 참조 항-IL-6 mAb 1과 비교하여 1가 및 이중파라토프 항-IL-6 ISVD의 IC50의 배율 차이. BB=빌딩 블록

[표 2]

THP1 pSTAT3 검정에서 참조 항-IL-6 mAb 1과 비교하여 1가, 2가 및 이중파라토프 항-IL-6 ISVD의 IC50의 배율 차이. BB=빌딩 블록

6.2 실시예 2: 항-IL-6 1가 ISVD의 서열 최적화

항-IL-6 ISVD IL6006B12 및 IL6017C04를 추가로 서열 최적화하였다.

서열 최적화는 ISVD의 하나 이상의 (원하는) 특성을 개선하기 위해 서열에서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다.

이러한 서열 최적화의 일부 예가 본원의 추가 설명에서 언급되며 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다:

인간화로 불리는 프로세스인, 인간 VH3-JH 생식계열 공통 서열과 더 동일한 Nanobody® 서열을 산출하기 위한 모 야생형 Nanobody® 서열의 치환. 이를 위해 Nanobody®와 인간 VH3-JH 생식계열 공통 서열 간에 상이한 FR에서의 소위 특징 잔기를 제외한 특정 아미노산을 단백질 구조, 활성 및 안정성이 온전하게 유지되도록 하는 방식으로 인간 대응부로 변경한다.

낙타화로 정의되는, ISVD의 안정성을 증가시키기 위한 라마 생식계열을 향한 치환. 이를 위해 모 야생형 Nanobody® 아미노산 서열을 Nanobody®의 라마 IGHV 생식계열 아미노산 서열에 대해 정렬한다(라마 IGHV 생식계열에 대한 Nanobody®의 BlastP 분석으로부터 상위 히트로 확인됨).

보관 하의 장기 안정성 또는 특성을 개선하는 치환, 원하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현 수준을 증가시키는 치환 및/또는 다시 원하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 의존하는 (원하지 않는) 번역 후 변형(들)(예컨대, 글리코실화 또는 인산화)을 제거하거나 감소시키는 치환. N-말단 피로글루타메이트 형성을 피하기 위해, 표준적으로 효능 또는 안정성에 영향을 미치지 않으면서 E1D 돌연변이가 다가 나노바디의 N-말단 빌딩 블록에 도입된다. 따라서 빌딩 블록의 서열 최적화 동안, E1D 돌연변이는 일관되게 도입되지 않는다.

임의의 기존 자연 발생 항체 활성의 결합을 최소화하기 위해 위치 11에서 Val으로의 및 위치 89에서 Leu으로의 돌연변이.

항-IL-6 ISVD IL6006B12의 서열 최적화는 모 ISVD IL6006B12와 비교하여 5개의 아미노산 치환(즉, L11V, S52aG, S60A, K83R, V89L)을 포함하는 최종 서열 최적화 변이체 F027201040을 생성했다. 항-IL-6 ISVD IL6017C04의 서열 최적화는 모 ISVD IL6017C04와 비교하여 6개의 아미노산 치환(즉, E1D, L11V, A14P, D16G, K83R, V89L)을 포함하는 최종 서열 최적화 변이체 F027200921을 생성했다.

서열 최적화 변이체를 PCR 중첩 연장 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드로부터 조립하였다. 변이체를 대장균에서 발현하고 IMAC 및 탈염에 의해 정제하였다. F027201040을 표면 플라스몬 공명에 의해 그 hIL-6 결합능에 대해, F027200921을 TF1 증식 검정에서 그 중화 활성에 대해 평가하였다. 두 변이체 모두의 단량체 거동을 크기 배제-HPLC(SE-HPLC)로 모니터링했다. 변이체의 열 안정성을 Lightcycler(Roche)를 사용하여 열 이동 검정(TSA)에서 시험하였다. 이 검정에서 모 ISVD 및 이의 변이체를 사이프로 오렌지(sypro orange)의 존재 하에 상이한 pH에서 인큐베이션하고 온도 구배를 적용한다. ISVD가 변성하기 시작하면, 사이프로 오렌지가 결합하고 측정된 형광이 갑자기 증가하여, 이러한 용융 온도를 특정 pH에 대해 결정할 수 있다. 결과를 표 3 및 표 4에 요약한다.

[표 3]

항-IL-6 ISVD IL6006B12의 서열 최적화 변이체 F027201040의 분석 결과

F027201040은 모 ISVD IL006B12와 비교하여 SPR에서 IL-6으로의 결합에 대해 유사한 오프율을 나타내었다. F027201040의 Tm은 모 ISVD IL006B12에 비해 7℃ 더 높다. F027201040에 대한 프레임워크 영역에서의 프레임워크 동일성%는 AbM 정의(Antibody Engineering, Vol2 by Kontermann &

(Eds), Springer Verlag Heiderlberg Berlin, 2010)에 기반하여 88% 및 Kabat 정의에 기반하여 86%이다.

[표 4]

항-IL-6 ISVD IL6017C04의 서열 최적화 변이체의 분석 결과

TF1 증식 검정에서 F027200921의 효능은 WT 서열과 비교하여 유사하다. F027200921의 Tm은 모 ISVD F027200921보다 1℃ 더 낮다. F027200921에 대한 프레임워크 영역의 프레임워크 동일성%는 AbM 정의에 따라 88% 및 Kabat 정의에 따라 86%이다.

[표 5]

ISVD IL6006B12 및 IL017C04의 서열 최적화 버전의 아미노산 서열

6.3 실시예 3: 다중특이적 ISVD 작제물 생성

3개의 항-TNFα VHH 빌딩 블록(TNF06C11(WO2017081320), TNF01C02(WO2015173325, SEQ ID NO: 327) 및 VHH#3(WO2004041862)), 및 6개의 항-IL-6 VHH 빌딩 블록(IL6006B06, IL006B12, IL6007G04, IL6007G05, IL6007G09, IL6010A06, IL6013F12 및 IL6017C04, WO2007104529) 그리고 항-HSA VHH 빌딩 블록 ALB23002(WO2017134234, SEQ ID NO: 10/WO2018131234 참고)를 포함하는 데이터-유도 다중특이적 조작 및 형식화 캠페인으로부터 TNFα 및 IL-6에 결합하는 ISVD-함유 폴리펩티드 F027201062(SEQ ID NO: 1)의 확인을 초래하였다. 빌딩 블록의 상이한 위치/배향을 적용하였고 상이한 매개변수(효능, 교차 반응성, 발현 등)에 있어서 중요한 것으로 입증되었다. 기존 항체의 결합을 가능한 한 많이 최소화하기 위해 모든 작제물에 대해 빌딩 블록 간 링커를 9GS로 유지했다.

87개의 작제물을 포함하는 패널(표 6)을 소규모 생산을 위해 피치아 파스토리스에서 형질전환하였다. ISVD 발현의 유도는 메탄올을 단계적으로 첨가함으로써 일어났다. 분비된 ISVD를 포함하는 정화된 배지를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 이어 탈염을 통한 정제를 위한 시작 물질로 사용했다. 정제한 샘플을 발현 평가 및 기능적 특성규명을 위해 사용하였다. 후자의 경우, 시험관내 TF-1 세포의 TNFα-유도 NFκB 활성화의 저해 및 IL-6 유도 증식의 저해를 검정함으로써 효능을 결정하였다(실시예 8 및 9에 기재된 바와 같음).

또한 ISVD 발현 수준을 정화 배지에서 모니터링했다. 작제물을 하기 발현 수준 기준에 따라 분류하였다: 낮음 = 50 ㎍/㎖ 미만, 중간 = 51 내지 100 ㎍/㎖, 높음 = 101 ㎍/㎖ 초과(표 6).

[표 6]

표 6: 이의 각각의 발현 수준, Nfkb-리포터 검정에서의 IC50, TF1 증식 검정에서의 IC50 그리고 인간 및 cyno TNF-알파 및 IL-6 간 효능 차이를 각각 포함하는, 평가된 87개의 상이한 다중특이적 ISVD 형식의 목록. BB = 빌딩 블록, ALB = ALB23002. nd = 결정되지 않음.

발현 수준 기준: 낮음 = 50 ㎍/㎖ 미만, 중간 = 51 내지 100 ㎍/㎖, 높음 = 101 ㎍/㎖ 초과

일부 작제물은 결합가, 사용된 ISVD 빌딩 블록 및 ISVD 빌딩 블록의 상대적 위치에 따라 손상된 효능 및 발현을 나타내었다. 항-TNFa ISVD TNF006C11, 2가 TNF001C02 및 2가 VHH#3E를 포함하는 이중특이적 ISVD는 참조 항-TNFa mAb(TNF-알파에 대한 벤치마크 모노클로날 항체)와 유사한 효능을 나타낸 반면 1가 TNF001C02를 포함하는 ISVD는 참조 항-TNFa mAb보다 5 내지 25배 덜 강력했다. 2가 VHH#3E를 포함하는 모든 ISVD는 낮은 발현 수준을 나타냈고 따라서 선택 배제하였다.

항-IL-6 ISVD IL6006B06을 포함하는 모든 이중특이적 ISVD는 손상된 효능을 나타내었고, 6B06-6B12 조합이 가장 적은 효능을 수행하였다. 항-IL-6 ISVD IL6013F12를 포함하는 모든 이중특이적 ISDV는 피치아 파스토리스에서 발현 시 분해를 나타내었고 따라서 제조할 수 없었다. 이중파라토프 항-IL-6 ISVD 10A06-7G09, 17C04-7G09, 17C04-6B12, 6B12-7G09 및 7G09-6B12를 포함하는 나머지 이중특이적 ISVD는 항-IL-6 참조 mAb 1과 유사한 일반적 효능을 나타내었지만, 7G09-6B12에 있어서는 cyno IL-6에 대한 교차 반응성이 크게 손상되었다.

이후, 큰 패널을 두 표적 모두(인간 및 cyno)에 대해 강력한 것으로 입증되고 예비 수율 추정치에 기반하여 높은 발현 수준의 가능성을 가진, 7개의 ISVD 작제물: F027200809, F027200812, F027200817, F027200927, F027201060, F027201061 및 F027201062로 구성된, 더 작은 다중특이적 작제물 패널로 축소하였다. 3개의 추가 ISVD 작제물 F027200925, F027200926, F027201029를 주로 높은 발현 수준의 가능성에 기반하여 선택하였다. 그러나, 후자의 3개의 작제물은 하나의 표적에 대해 높은 효능을 나타낸 반면, 다른 표적에 대해서는 단지 중간 정도의 효능을 나타내었다(표 7a).

ISVD 작제물 F027200927 및 F027200925의 구성을 표 7b에 제공한다.

표 7c 및 7d는 각각 ISVD 작제물 F027200927 및 F027200925의 각각의 개별 빌딩 블록 서열을 제공한다.

표 7e, 7f, 7g 및 7h는 ISVD 작제물 F027200927 및 F027200925의 각각의 개별 빌딩 블록에 존재하는 3개의 CDR 영역 및 4개의 프레임워크 영역의 서열을 제공한다(AbM 및 Kabat 넘버링 둘 모두에 따라). 마지막으로, 표 7i는 ISVD 작제물 F027200927 및 F027200925의 전체 아미노산 서열을 제공한다.

[표 7a]

선택된 10개의 항-TNFa/항 IL-6 이중특이적 ISVD 패널 대 참조 화합물에 대한 Nfkb 검정에서의 인간 및 cyno TNFa 및 TF1 증식 검정에서 인간 및 cyno IL-6의 중화에 대한 IC50 값. ALB = ALB23002, BB=빌딩 블록

[표 7b]

F027200927 및 F027200925 구성

^* 단일 알라닌의 C-말단 연장

[표 7c]

4가 폴리펩티드 F027200927 내에서 확인된 상이한 1가 VHH 빌딩 블록의 아미노산 서열("ID"는 본원에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7d]

4가 폴리펩티드 F027200925 내에서 확인된 상이한 1가 VHH 빌딩 블록의 아미노산 서열("ID"는 본원에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7e]

AbM 넘버링에 따른 4가 폴리펩티드 F027200927의 개별 VHH 빌딩 블록의 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7f]

AbM 넘버링에 따른 4가 폴리펩티드 F027200925의 개별 VHH 빌딩 블록의 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7g]

Kabat 넘버링에 따른 4가 폴리펩티드 F027200927의 개별 VHH 빌딩 블록의 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7h]

Kabat 넘버링에 따른 4가 폴리펩티드 F027200925의 개별 VHH 빌딩 블록의 CDR 및 프레임워크에 대한 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

[표 7i]

선택된 다가 폴리펩티드 F027200927 및 F027200925의 아미노산 서열("ID"는 주어진 SEQ ID NO를 지칭함)

발현 수율 결정, 생물리적 특성 평가를 위해 11개의 ISVD 작제물을 포함하는 패널의 피치아 파스토리스에서의 더 큰 규모의 2 L 및 5 L 생산을 수행하였다. 항-IL-6 빌딩 블록과 항-TNF-α 빌딩 블록의 특정 조합이 높은 발현 수율뿐만 아니라 충분한 용해도 및 생물리적 안정성을 얻기 위해 필요하다는 것이 실증되었다. 이를 표 8에 예시한다. 예를 들어, 제3 위치 상의 하나의 빌딩 블록을 제외하고 조성이 매우 유사한 작제물 F027201062 및 F027200812는 유의하게 상이한 발현 및 용해도 프로파일을 나타낸다.

[표 8]

선택된 10개의 항-TNFa/항 IL-6 이중특이적 ISVD 패널에 대한 최고 농도에서의 발현 수율, 용해도 및 생물리적 특성. ALB = ALB23002, BB=빌딩 블록, SVP 눈에 보이지 않는 입자, HMW = 고분자량, nd = 결정되지 않음

마지막으로, ISVD 작제물 F027201062를 효능 및 CMC 특성(예를 들어, 용해도 및 발현)에 대한 그 조합된 우수한 성능으로 인해 추가 특성규명을 위해 선택하였다.

실시예 4: 다중특이적 ISVD 작제물: TNF-α, IL-6 및 혈청 알부민에 대한 결합 친화도

인간 및 게잡이원숭이 TNF-α 및 IL-6 그리고 인간, cyno 및 마우스 혈청 알부민(SA)에 대한 F027201062의 평형 해리 상수(KD)로 표현되는 친화도를 Gyrolab xP 워크스테이션(Gyros) 상의 용액-중 친화도 측정에 의해 정량하였다.

KD-제어 측정 하에 TNF-α 또는 IL-6(1.3 μM 내지 0.1 pM 범위) 또는 인간 또는 cyno SA(13 μM 내지 1 pM 범위) 또는 마우스 SA(133 μM 내지 30 pM 범위)의 연속 희석물 및 고정량의 F027201062(TNF-α의 경우 80 pM, IL-6의 경우 20 pM, 인간 및 cyno SA의 경우 300 pM, 및 마우스 SA의 경우 600 pM)를 혼합하여 상호작용하도록 하고 48시간 또는 72시간(IL-6 및 TNF-α의 경우) 또는 2시간(SA의 경우) 동안 인큐베이션하여 평형에 도달시켰다.

수용체-제어 측정 하에 TNF-α 또는 IL-6(1.3 μM 내지 0.1 pM 범위) 또는 인간 및 cyno SA(13 μM 내지 1 pM 범위) 또는 마우스 SA(133 μM 내지 30 pM 범위)의 연속 희석물 및 고정량의 F027201062(TNFα의 경우 30 nM, IL-6의 경우 5 nM, 인간 및 cyno SA의 경우 1 μM, 및 마우스 SA의 경우 2 μM)를 혼합하여 상호작용하도록 두고 48 또는 72시간(IL-6 및 TNFα의 경우) 또는 2시간(SA의 경우) 동안 인큐베이션하여 평형에 도달시켰다.

바이오틴화된 인간 TNF-α/IL-6/혈청 알부민을 Gyrolab Bioaffy 1000 CD의 마이크로구조에서 포착하였였고, 이를 비드 컬럼을 함유하고 평형화된 용액으로부터 유리 F027201062를 포착하기 위한 분자 탐침으로 사용한다. TNF-α/IL-6/혈청 알부민과 F027201062(유리 TNF-α/IL-6/혈청 알부민, 유리 F027201062 및 TNF-α/IL-6/혈청 알부민 - F027201062 복합체 함유)의 혼합물이 비드를 통해 흐르게 하고, 작은 백분율의 유리 F027201062를 포착하였으며 이는 유리 ISVD 작제물 농도와 비례한다. 그런 다음 형광 표지된 항-VHH 항체, ABH0086-Alexa647을 주입하여 임의의 포착된 F027201062를 표지하고 과량의 형광 탐침을 헹궈낸 후 형광 변화를 결정했다. 연속 희석물의 피팅을 Gyrolab 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, KD- 및 수용체-제어 곡선을 분석하여 KD 값을 결정했다. 결과(표 9)는 다중특이적 ISVD 작제물이 인간/cyno IL-6 및 인간/cyno TNF-α에 높은 친화도로 결합한다는 것을 실증한다.

[표 9]

인간 및 cyno TNF-α 및 IL-6 그리고 인간, cyno 및 마우스 혈청 알부민(SA)에 대한 F027201062의 결합 친화도.

6.4 실시예 5: 막 결합된 TNFα에 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

막 결합된 TNFα에 대한 F027201062의 결합을 HEK293H 세포를 발현하는 인간 막 TNFα 상에서 유세포 측정을 사용하여 실증하였다. 간략하게, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드 및 0.1% 글루타르알데히드로 고정하였다(막 결합된 TNFα의 검출을 증가시키기 위해). 이어서, 세포를 1 x 10⁴개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 100 nM부터 시작하여 최대 0.5 pM까지, F027201062 또는 항-TNFα 참조 mAb의 연속 희석물과 함께 30 μM HSA의 부재 또는 존재 하에 실온에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 3회 세척한 후 항-VHH mAb(ABH00119)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척하고 염소 항-마우스 또는 항-인간 PE 표지 항체와 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 샘플을 세척하고 FACS 완충액(5 nM TOPRO3이 보충된 10% FBS 및 0.05% 나트륨 아지드가 포함된 D-PBS)에서 재현탁했다. 그런 다음 세포 현탁액을 iQuescreener 상에서 분석했다. EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 계산하였다. F027201062 및 항-TNFα 참조 mAb에 대한 EC50 값은 필적한다(표 10).

[표 10]

항-hTNFα 참조 mAb 와 비교하여, 24시간 인큐베이션 후 막 발현된 TNFα에 대한 F027201062의 결합 친화도.

6.5 실시예 6: 다중특이적 ISVD 작제물이 TNF-α 및 IL-6에 선택적으로 결합함

TNF-α 및 IL-6 관련 인간 표적에 대한 결합의 부재를 SPR(Proteon XPR36)을 통해 평가하였다. IL-6 관련 사이토카인 또는 gp130 수용체를 공유하는 사이토카인으로서 인간 IL23, IL27, CNTF, 온코스타틴 M(OSM) 및 IL11을 평가하였다. TNF 슈퍼패밀리 구성원 인간 FASL, TNF β, LIGHT, TL-1A, RANKL을 TNFα에 대한 관련 사이토카인으로 시험했다.

이를 위해 표적을 아민 커플링을 사용하여 200초 동안 25 ㎍/㎖으로 proteon GLC 센서 칩 상에 고정화했으며, 활성화를 위해 EDC/NHS를 80초 동안 주입하고 탈활성화를 위해 1 M 에탄올아민 HCl을 150초 동안 주입했다(ProteOn 아민 커플링 키트. cat. 176-2410). 활성화, 탈활성화 및 리간드 주입 동안 유속을 30 ㎕/분으로 설정하였다. 10 mM 아세테이트 고정화 완충액의 pH는 각 리간드의 pI에서 약 1.5를 빼서 선택했다. 다음으로, 300 nM의 F027201062를 2분 동안 주입하고 45 ㎕/분의 유속으로 600초 동안 해리하도록 두었다. 실행 완충액으로 PBS(pH7.4) + 0.005% Tween 20을 사용했다. 양성 대조군으로서 0.3 μM α-IL11 Ab, α-OSM Ab, α-CNTF Ab, α-IL27 Ab, α-IL27A Ab, α-IL23 p19 Ab, α-hFASL Ab, 0.3 μM α-hTNFβ Ab, 0.5 μM α-hLIGHT Ab, 0.3 μM α-hTL-1A Ab 및 0.5 μM α-hRANKL VHH를 주입하였다.

F027201062 및 양성 대조군과 고정화된 표적 사이의 상호작용을 결합 시 칩 상 질량 변화의 결과로 발생하는 굴절률의 증가를 검출하여 측정했다.

모든 양성 대조군은 이의 각각의 표적에 결합했다. 인간 TRAIL, CD30L, CD40L, FASL, TNF, LIGHT, TL-1A, RANKL, IL23, IL27, CNTF, 온코스타틴 M 및 IL11에 대한 ISVD 작제물 F027201062의 결합은 검출되지 않았다.

6.6 실시예 7: hIL-6, hTNFa 및 HSA에 대한 다중특이적 ISVD 작제물의 동시 결합

ISVD 작제물 F027201062가 재조합 가용성 hTNF-α 및 hIL-6에 동시에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 Biacore 8K+ 장치(instalment)를 사용했다. 이를 위해 HSA를 약 1600 RU 수준으로 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩 상에 고정화하였다. ALB23002 빌딩 블록을 통해 ISVD 작제물을 포착하기 위해 100 nM의 F027201062를 HSA 표면 위로 10 ㎕/분으로 2분 동안 주입했다. 이어서 100 nM의 hIL-6, hTNF-α 또는 hOX40L을 주입하거나 100 nM IL-6 + 100 nM TNFα, 100 nM IL-6 + 100 nM OX40L 또는 100 nM TNF-α + 100 nM OX40L의 혼합물을 2분 동안 45 ㎕/분의 유속으로 주입한 후, 600초의 후속 해리 단계를 거쳤다. HSA 표면은 45 ㎕/분으로 HCl(100 mM)을 2분 주입하여 재생시킨다. 센서그램(도 1)은 HSA 상 포착 후 반응 단위의 증가로 나타난 바와 같이 ISVD 작제물 F027201062가 hIL-6 및 hTNF-α에 동시에 결합할 수 있음을 실증한다: hTNF-α 단독으로부터 약 150 RU 증가, hIL-6 단독으로부터 약 120 RU 증가 그리고 IL-6 및 TNF-α 혼합물에 대하여 약 340 RU 증가.

6.7 실시예 8: 시험관내 TNF-α-유도 NFkB 활성화의 다중특이적 ISVD 작제물 저해

HEK293_NFκB-NLucP 세포는 NFκB 의존적 프로모터의 제어 하에 나노(Nano) 루시퍼라제를 암호화하는 리포터 작제물로 안정적으로 형질감염된 TNF 수용체 발현 세포이다. 가용성 인간 및 cyno TNF-α와 세포의 인큐베이션은 NFκB 매개된 나노 루시퍼라제 유전자 발현을 초래하였다. 나노 루시퍼라제 발광을 세포 상으로 첨가된 1:50 비로 용해 완충액과 혼합된 나노-글로(Nano-Glo) 루시페라제 기질을 사용하여 측정하였다. 완전한 용해를 수득하기 위해 샘플을 진탕기 상에서 5분 동안 혼합했다. Glo response™ HEK293_NFκB- NLucP 세포를 투명한 바닥을 갖는 흰색 조직 배양(TC) 처리된 96-웰 플레이트에서 일반 성장 배지 중 20000개 세포/웰로 시딩했다. F027201062 또는 항-TNF-α 참조 mAb의 연속 희석물을 25 pM 인간 또는 70 pM cyno TNF-α에 첨가하고 30 μM HSA의 존재 하에 37℃에서 5시간 동안 세포와 인큐베이션하였다.

F027201062는 농도 의존적 방식으로 인간 및 cyno TNF-α-유도 NFκB 활성화를 저해했으며, 평균 IC50은 참조 화합물 항-hTNF-α mAb에 필적하는 53 pM(인간 TNF-α의 경우) 및 158 pM(cyno TNF-α의 경우)이었다(표 11, 도 2). 음성 대조군 ISVD인 IRR00096은 저해를 나타내지 않았다.

[표 11]

항-TNFα 참조 mAb 대비 Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP 리포터 검정에서 인간 및 cyno TNFα에 대한 F027201062 매개된 중화의 IC50 및 IC90 값.

6.8 실시예 9: TF-1 세포의 IL-6 유도된 증식의 다중특이적 ISVD 작제물 저해

F027201062의 저해 효능을 TF-1 세포의 IL-6 매개 증식을 모니터링하는 세포 기반 검정에서 결정하였다. 이를 위해 TF-1 세포를 10% FBS 및 1% Na-피루베이트가 첨가된 RPMI 1640, 글루타맥스, HEPES 배지(Gibco)에서 배양하였다. TF-1 세포를 성장 배지 중 웰당 12.500개의 세포로 시딩하였다. 정제된 항-IL-6 ISVD 또는 참조 화합물의 연속 희석물을 첨가했다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 75 pM의 인간 IL-6(R&D systems 카탈로그 번호 200-IL-200|206-IL) 또는 cyno IL-6(Evotek, 카탈로그 번호 APP-7634)을 첨가하였다. 72시간 후, TF-1 세포의 증식을 EnVision 다중표지 판독기(Perkin Elmer) 상에서 CellTiter-Glo(Promega #G7571)로 결정했다.

F027201062는 항-IL-6 참조 mAb 1과 필적하고 항-IL-6 참조 mAb 2보다 우수한 34 pM(인간 IL-6의 경우) 및 56 pM(cyno IL-6의 경우)의 평균 IC50으로 농도 의존적 방식으로 TF-1 세포의 인간 및 cyno IL-6 유도된 증식을 저해하였다(표 12, 도 3).

[표 12]

항-IL-6 참조 화합물과 비교하여 TF-1 세포의 인간 및 cyno IL-6 유도된 증식의 F027201062 매개된 저해의 IC50 및 IC90 값

6.9 실시예 10: 기존 항체에 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

ISVD 작제물 F027201062의 기존 항체 반응성을 ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 일반 인간 혈청(n=96)에서 평가했다. PBS/Tween(인산염 완충 식염수, pH7.4, 0.005% Tween20)을 실행 완충액으로 사용하고 실험을 25℃에서 수행했다.

ISVD를 칩 상에 고정화된 HSA에 대한 ALB23002 빌딩 블록의 결합을 통해 칩 상에 포착한다. HSA를 고정화하기 위해 ProteOn GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS(유속 30 ㎕/분)로 활성화하고 HSA를 ProteOn 아세테이트 완충액 pH 4.5 중 100 ㎕/㎖로 주입하여 대략 2500 RU의 고정화 수준으로 만든다. 고정화 후, 표면을 에탄올아민 HCl(유속 30 ㎕/분)으로 탈활성화한다.

이후, ISVD 작제물을 HSA 표면 위로 45 ㎕/분으로 2분 동안 주입하여 대략 800 RU의 ISVD 포착 수준으로 만든다. 기존 항체를 함유하는 샘플을 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상청액을 PBS-Tween20(0.005%) 중 1:10으로 희석한 후 45 ㎕/분으로 2분 동안 주입하고 이어서 후속 400초 해리 단계를 거친다. 각 주기 후(즉, 새로운 ISVD 포착 및 혈액 샘플 주입 단계 전) HSA 표면을 45 ㎕/분으로 HCl(100 mM)을 2분 주입하여 재생시킨다. 기존 항체 결합을 나타내는 센서그램은 1) ISVD-HSA 해리 및 2) 참조 리간드 레인에 대한 비특이적 결합을 빼서 이중 참조 후에 수득한다. 기존 항체의 결합 수준은 보고 지점을 125초(결합 종료 후 5초)로 설정하여 결정한다. 기존 항체 결합의 감소 백분율을 참조 ISVD의 125초에서의 결합 수준에 대비하여 계산한다.

각 빌딩 블록의 돌연변이 L11V 및 V89L 그리고 C-말단 알라닌의 도입에 의해 감소된 기존 항체 결합에 대해 최적화된 4가 ISVD 작제물 F027201062는 대조군 비최적화 5가 ISVD 작제물 F027301186과 비교하여 기존 항체에 대해 실질적으로 더 작은 결합을 나타낸다(도 4).

6.10 실시예 11: 쥣과 항-TNF-α 및 항-IL-6 대리물 항체의 조합을 사용한 쥣과 콜라겐-유도 관절염의 지속된 장기 관해

류마티스 관절염은 말초 관절을 공격하는 파괴적 자가면역 질환이다. 콜라겐-유도 관절염(CIA) 마우스 모델은 미란성 질환을 재현한다. 관절 성분에 대한 면역 반응을 촉발하기 위해, 취약한 DBA/1 마우스를 100 ㎍ 아주반트화 닭 콜라겐 II로 2회 면역화했다. 콜라겐 II에 대한 면역 반응은 내인성 관절 연골로 확산되어 임상적으로 명백한 관절염을 야기할 것이다. 제21일에 2차 면역화 후, 발목 및 발 부종, 홍반, 때로는 관절강직에 의해 진행성 관절염이 명백해졌다. 관절염 중증도를 아래 표 13에 상세히 기재된 바와 같은 점수산정 시스템에 의해 4개의 발 각각에 대해 임상적으로 평가하였다.

[표 13]

관절염 표현형 중증도를 결정하기 위한 관절염 점수산정 시스템

¹ 도 5의 y-축 상 관절염 점수: 개별 발 점수의 합, 최대 합 점수는 4 x 3 = 12임.

질환 중증도 및 진행에 대한 조합된 TNF 및 IL-6 차단의 영향을 평가하기 위해, N=13 면역화 수컷 DBA/1 마우스를 쥣과 TNF, 쥣과 IL-6 또는 둘 모두의 조합에 대한 차단 항체로 처리하였다. 마우스를 1차 면역화 후 제22일에 시작하여 제55일까지 주 2회 복강내 주사로 처리하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 임상적 관절염이 제21일부터 계속 점진적으로 진행된다. 항-muTNF 또는 항-muTNF와 항-muIL-6의 조합으로 처리된 마우스는 이소형 대조군 항체 또는 항-muIL-6 단독으로 처리된 마우스보다 지연되고 중증이 덜한 관절염 진행을 가졌다. 제55일에 치료를 중단하면 항-muTNF 단독으로 치료한 마우스에서 질환 반동을 관찰할 수 있었으며, 이소형 대조군 또는 항-muIL-6에 필적하는 중증도 수준에 빠르게 도달했다. 그러나, 항-muTNF와 항-muIL-6 둘 모두의 조합으로 처리된 마우스는 관절염 진행으로 반등하지 않았고 치료 중지에도 불구하고 반응을 유지했다. 도 6은 전체 연구 지속기간, 치료 기간 및 치료-휴지 기간에 대한 경시적 관절염 점수 곡선 아래 면적의 분석을 나타낸다. 후자는 조합 치료에 의해 유의하게 억제되어, 질환 진행에 대한 지속적 영향을 표시하였다.

이 모델의 관절염은 콜라겐 II 백신접종에 대한 항체 반응에 의해 개시된다. d91에 항콜라겐 II 항체의 혈장 수준을 ELISA에 의해 결정했다. 도 7에 도시된 바와 같이, 모든 처리는 항-muTNF 및 항-muIL-6 둘 모두로 처리된 마우스에서 가장 큰 수치적 감소를 가지며, 항-콜라겐 II 항체 역가를 감소시켰다.

제91일에 마우스를 희생시킨 후 뒷발을 수집하고 관절염의 조직학적 평가를 위해 중족골 관절을 처리하였다. 헤마톡실린 및 에오신뿐만 아니라 사프라닌-O 염색된 절편의 점수산정을 맹검 방식으로 0 내지 5의 척도에서 4차원에 걸쳐 수행하였다(표 14).

[표 14]

관절염 조직학 점수산정 시스템

^* 도 8의 y-축 상 관절염 점수.

도 8에 나타낸 바와 같이, 항-muTNF 및 항-muIL-6의 조합으로 처리된 마우스에서의 판누스 형성 및 뼈 파괴에 대한 조직학 점수에서 이소형 대조군 항체에 비해 통계적으로 유의한 개선이 달성되었다.

종합하면, 이러한 데이터는 TNF뿐만 아니라 IL-6 염증 경로 둘 모두를 차단하는 조합 처리의 가장 높은 치료 효능을 제시한다. 중요하게는, 조합 치료는 활성 치료의 부재 하에서도 지속적인 반응을 야기했다.

6.11 실시예 12: 항-TNF-알파, 항-IL6 및 조합된 항-TNF-알파/IL6로 처리된 CIA(콜라겐 유도된 관절염) 모델로부터의 RNA-seq 데이터 분석

CIA의 마우스 앞발 조직 샘플로부터의 총 RNA를 RNAeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고 ATLAS Biolabs GmbH(Berlin)의 NovaSeq 플랫폼(Illumina) 상에서 2x5100만 내지 6600만 판독의 페어드-엔드 시퀀싱을 수행했다. RNA-seq 미가공 데이터의 생물정보학 분석은 OmicsSoft studio 소프트웨어 패키지 버전 10.01.118(Qiagen)을 사용하여 수행하였다. 마우스 게놈에 대한 RNA-seq 판독(fastq 파일)의 맵핑을 참조 게놈으로 마우스 B.38 및 정렬체로 OSA4를 갖는 OmicSoftGenCode.V19를 유전자 모델로 사용하여 수행하였다.

차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 벤 분석

도 9a의 벤 다이어그램은 CIA 모델에서 항-TNF-알파, 항-IL6 및 조합된 항-TNF-알파/IL6 처리로부터 확인된 DEG의 중첩을 나타낸다. DEG는 DESeq2 통계 시험(Love, M.I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 2014;15(12):550)을 사용하여 표준 통상적 항-TNF-알파 항체(n=13 샘플), 표준 통상적 항-IL6 항체(MP5-20F3; n=13) 및 조합된 항-TNF-알파/항-IL-6 항체(n=13) 처리로 처리한 RNA-seq 샘플 그룹을 이소형 처리 샘플(IgG 대조군; n=13)과 비교함으로써 결정하였다. 벤자민-호크베르그(BH-FDR)에 따라 log2 변화 배율 1,2 초과 및 조정된 0,05 미만의 p-값인 DEG가 유의한 것으로 간주되었다. DEG 수치로부터, 벤 분석은 항-TNF-알파 또는 항-IL-6을 사용한 단일 처리에 비해 조합된 항-TNF-알파/IL-6 처리의 부가적 효과를 표시한다.

차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 경로 맵핑

도 9ba 및 도 9bb의 경로 맵은 Ingenuity(Qiagen) 및 MetaCore(Clarivate)의 조합된 선별 생물학 지식 기반을 사용하여 DEG의 유전자 세트 농축 분석으로부터의 상위 20개의 정규 경로를 나타낸다. 콜라겐 유도된 관절염(CIA)으로부터의 DEG를 DESeq2를 사용하여 이소형 처리(IgG 대조군, n=13)로부터의 샘플과 콜라겐 유도된 관절염이 없는 미처리 샘플(비그룹, n=4)을 비교하여 결정하였다. 조합된 항-TNF-알파/IL-6 처리로부터의 DEG를 DESeq2를 사용하여 항-TNF-알파/IL-6(XT.3 + MP5-20F3; n=13)로부터의 샘플과 이소형 처리(IgG 대조군 그룹, n=13)로부터의 샘플을 비교하여 결정하였다. 두 맵 모두의 대사 및 면역 신호전달 경로는 상이한 위 발견 비율(FDR)로 콜라겐 유도된 관절염 및 조합된 항-TNF-알파/IL6 처리로부터의 역 점수를 나타낸다.

6.12 실시예 13: 류마티스 관절염에 대한 정량적 시스템 약리학(QSP) 모델이 F027201062에 대해 더 낮은 용량에서 증가된 관해를 예측함(항-hTNF-α 및 항-hIL-6 참조 mAb와 비교함).

본 출원인은 류마티스 관절염(RA)의 독점적 정량 시스템 약리학 모델을 개발했으며, 이는 혈액 및 활막의 관련 조직, 세포 및 매개체를 고려한다. 포함된 생물학적 상호작용의 기계론적 상세사항을 내부 및 공개된 외부 소스 둘 모두로부터의 광범위한 시험관내 데이터로 매개변수화하였다. 그 후, 모델은 메토트렉세이트, JAK 저해제, 항-IL-6R, 항-IL-6, 항-TNF 치료를 사용한 다양한 연구로부터의 임상 데이터로 시험하고 검증하였다.

이 모델에 기반하여, 활막에서 질환 활성 감소로 인한 DAS28-CRP의 감소를 52주의 처리 기간 동안 중등도 내지 중증 류마티스 관절염을 갖는 평균 환자에 대해 시뮬레이션하였다. 나노바디 F027201062는 TNF-α 및 IL-6에 동시에 결합할 수 있었고 2주마다 20 ㎎의 용량으로 단일치료법에 비해 DAS28-CRP의 더 큰 감소를 달성했으며 참조 환자가 24주 후 DAS28-CRP 관해를 달성할 것으로 예측했다. Nanobody 시뮬레이션은 동물 및 시험관내 데이터로부터 예측된 인간 약동학을 고려했다. 표적 결합의 경우, 항-hTNF 및 항-hIL-6 비교인자 mAb에 대해 공개된 표적 결합 매개변수와 함께 세포 검정으로부터의 시험관내 IC50 데이터를 사용하여 나노바디의 표적 결합 매개변수를 계산했다(도 10).

6.13 실시예 14: MMP-1 및 G-CSF에 대한 인간 RA-FLS/T 세포 공동배양 모델에서 항-TNF-α 및 항-IL-6의 부가적 유효성

류마티스 관절염에 대한 시험관내 모델을 개발하여 환자의 관절에서 TNF-α 및 IL-6 농도를 모방했다. 요약하면, 류마티스 관절염 환자(RA-FLS)로부터의 섬유아세포 유사 활막세포를 건강한 인간 공여자로부터의 CD4+ T 세포와 공동배양했다. 추가 자극이 TNF-α 및 IL-6의 내인성 분비를 유도했다. 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 참조 mAb를 사용한 처리는 MMP-1 및 G-CSF의 분비를 부분적으로 감소시킨 반면, 조합뿐만 아니라 F027201062는 더 강력한 최대 저해를 달성했다.

IL-6 트랜스-신호전달을 반영하는 검정의 상세한 프로토콜을 아래에 기재한다.

RA-FLS를 성장 보충물(Pelobiotech)을 포함하는 활막세포 기본 배지에서 96웰 형식으로 10,000개 세포/웰의 밀도로 시딩했다. 다음날 PBMC를 Ficoll 구배 원심분리를 사용하여 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리하였다. 자기 분리(음성 선택)를 사용하여 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 단리하였다.

RA-FLS 배지를 각각의 농도(200 nM로부터 1:10 희석, 6개의 농도, 3벌)로 이소형 대조군, 비교인자 항체 및 ISVD를 포함하는 배지로 대체하였다. IgG1 이소형 대조군을 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 사용한 반면, VHH IRR00119는 ISVD 이소형 음성 대조군으로 사용하였다. 항-인간 TNF-α 및 항-인간 IL-6 참조 항체를 비교인자로 사용하였다. 또한, 두 비교인자 모두의 전체 용량의 조합을 추가적인 양성 대조군으로 사용하여 부가적 유효성을 나타내었다. 하기 ISVD 작제물: F027200926 및 F027201062를 이 모델에서 평가하였다. 플레이트 효과를 피하기 위해 모든 작제물의 플레이트내 위치를 3벌 간에 변화시켰다.

이후 100,000개의 CD4+ T 세포(성장 보충물을 포함하는 활막세포 기본 배지 중)를 FLS에 첨가한다. 마지막으로, 이 공동배양을 48시간 동안 100 ng/㎖ 인간 재조합 IL-17A, 100 ng/㎖ sIL-6R 및 100 ng/㎖ 가용성 항-CD3로 자극하였다. 48시간 후 세포를 원심분리하고 상청액을 수집하여 -20℃에서 보관했다. MMP-1 및 G-CSF 수준을 Luminex 기술을 사용하여 측정하였다. 항-hTNF-α 비교인자 mAb와 반응하지 않은 공여자는 제외하였다(ISVD 작제물의 부가적 유효성 및 이중 표적화를 입증할 가능성 없음).

TNF-α 및 IL-6의 내인성 분비를 IL-17A, sIL-6R 및 항-CD3로 48시간 자극 후 측정하였다. 자극한 공동배양은 TNF-α(자극 없이는 검출 한계 미만) 및 IL-6의 분비 증가를 유도했다. 자극한 공동배양은 4.4 pg/㎖ IL-6 및 7977 pg/㎖ TNF-α를 분비했다(8명의 공여자의 평균 값, 도 11). 이 값은 상이한 간행물로부터 수집한 인간 류마티스 관절염 관절로부터의 중앙값: 24 ± 21 pg/㎖ TNF-a 및 13400 ± 12700 pg/㎖ IL-6과 필적한다.

MMP-1 및 G-CSF에 대한 ISVD 유효성 평가를 위해, 1명의 공여자로부터의 RA-FLS를 8명의 상이한 인간 공여자 T 세포와 인큐베이션하였다. 본 발명자들은 MMP-1 분비에 대해 두 이소형 대조군 모두의 용량 의존적 효과를 관찰하지 못했다. 항-hTNF-α 참조 mAb는 MMP-1 분비를 부분적으로 감소시켰다. 항-hIL-6 참조 mAb는 항-hTNF-α 비교인자 mAb보다 더 유효한 반면, 두 항체 모두의 조합이 가장 높은 유효성을 나타냈다. 두 ISVD 작제물은 모두 비교인자 항체 조합(200 nM Ab1 + 200 nM Ab2 투약)과 유사하게 유효했고 용량 의존적 효과를 나타냈다(도 12, 8명의 공여자). G-CSF에 대해서도 유사한 결과를 얻었다(도 13, 8명의 공여자).

6.14 실시예 15: CXCL13에 대한 인간 아데노이드 모델에서 항-TNF-α 및 항-IL-6의 부가적 유효성

본 발명자들은 여포 헬퍼 T 세포(Tfh) 및 배 중심 B 세포로 구성된 인간 인두 편도(아데노이드) 모델에서 F027201062의 부가적 유효성을 평가했다. 간략하게, 본 발명자들은 동결보존된 림프구로 고밀도 림프 응집체 배양을 수행했다. 이 배양을 돌연변이된 백일해 독소로 자극하여 AIM(활성화 유도 마커) 반응을 유도하였다(Schmidt, A. et al. 2020 Complex human adenoid tissue-based ex vivo culture systems reveal anti-inflammatory drug effects on germinal center T and B cells. EBioMedicine 53, 102684, doi:10.1016/j.ebiom.2020.102684). 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 참조 mAb를 사용한 처리는 CXCL13의 분비를 부분적으로 감소시킨 반면, 조합뿐만 아니라 F027201062는 더 강력한 최대 저해를 달성했다.

상세한 프로토콜을 아래에 기재한다:

수술로부터의 아데노이드 조직을 4℃에서 RPMI 배지(보충물 없음)에서 수집했다. 조직을 하기와 같이 수술 후 추가 처리하였다. 아데노이드-유래 조직 및 세포를 15%(v/v) FBS(Gibco 우태 혈청, 적격, 열 불활성화) 및 보충물(0.1 mM MEM-비필수 아미노산, 1 mM MEM 나트륨-피루베이트, 50 ㎍/㎖ 겐타마이신, 2.5 ㎍/ml 암포테리신 B, 0.3 ㎍/㎖ 티카르실린, 0.01 ㎍/㎖ 클라불라네이트)을 함유하는 RPMI 배지(l-글루타민 포함)에서 배양하였다. 조직을 PBS로 2회 세척하고 15%(v/v) FBS(Gibco 우태 혈청, 적격, 열 불활성화) 및 보충물(0.1 mM MEM-비필수 아미노산, 1 mM MEM 나트륨-피루베이트, 50 ㎍/㎖ 겐타마이신, 2.5 ㎍/㎖ 암포테리신 B, 0.3 ㎍/㎖ 티카르실린, 0.01 ㎍/㎖ 클라불라네이트)을 함유하는 CMT 배지(RPMI 배지(l-글루타민 포함))으로 디쉬에서 절제하였다. 피가 묻은 소작된 조직을 폐기하였다. 잔여 조직 및 절단 배지는 CMT 배지에 침지된 40 μm 세포 스트레이너를 통해 주사기 플런저로 기계적으로 파쇄하면서 일상적으로 스트레이닝하였다. 이어서, 현탁 세포를 CMT 배지(500 xg, 5분)에서 세척하고, 계수하고 동결 보존을 위해 12.5 내지 100개의 Mio 세포/㎖로 10% DMSO/90% FCS에서 취했다.

실험 당일에, 동결보존된 아데노이드 현탁 세포를 해동한 후 96U-웰 플레이트에서 1×10⁶개 세포/웰로 배양하였다. 세포를 자극하지 않은 상태로 두거나 백일해 독소 돌연변이체(PT; 효소적으로 불활성인 점 돌연변이체, 고도로 정제되고 낮은 내독소 시험을 거침, Biotrend를 통한 List Biological Laboratories)로 1 ㎍/㎖ 최종 농도로 자극했다. 표시된 경우, 배양을 하기 화합물: 각각의 농도(1:10 희석, 200 nM로부터, 4 내지 5개의 농도, 2벌)의 이소형 대조군, 비교인자 항체 및 ISVD로 처리하였다. IgG1 이소형 대조군을 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 사용한 반면, VHH IRR00119는 ISVD 이소형 음성 대조군으로 사용하였다. 항-인간 TNF-α 및 항-인간 IL-6 참조 항체를 비교인자로 사용하였다. 또한, 두 비교인자 모두의 전체 용량의 조합을 추가 양성 대조군으로 사용하여 부가적 유효성을 나타내었다. 하기 ISVD 작제물: F027201062를 이 모델에서 평가하였다. 자극 18시간 후, 세포를 원심분리 하고 상청액을 수집하여 -20℃에서 보관했다. CXCL13 수준을 ELISA에 의해 결정하였다.

MMP-1 및 G-CSF에 대한 ISVD 유효성의 평가를 위해, 최대 7명의 아데노이드 공여자를 평가했다(시험한 농도에 따라). 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 참조 mAb는 CXCL13 분비를 부분적으로 감소시켰다. 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 둘 모두의 조합은 백일해-독소 유도된 CXCL13의 증가를 용량 의존적 방식으로 완전히 저해하였다. F027201062는 두 비교인자 항체 모두의 조합과 유사하게 유효했다(도 14, 4 내지 7명의 공여자).

고농도에서의 최대 유효성에 초점을 맞추고(200 nM에 대해 모든 7명의 공여자에 대한 데이터가 이용 가능함), 이어서 본 발명자들은 비교인자 항체 조합 및 F027201062 대 단일특이적 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 비교인자 항체의 부가적 효과를 터키 보정을 포함하는 일원 ANOVA를 사용하여 평가하였다. F027201062는 항-hTNF-α 비교인자 항체(p-값: 0.0002) 및 항-hIL-6 비교인자 항체(p-값: 0.0077)보다 등몰 용량(200 nM)에서 유의하게 더 유효했다. F027201062와 200 nM 항-hTNF-α 참조 및 200 nM 항-hIL-6 참조 항체의 조합 사이에는 유의한 명목상 차이는 없다(도 15, 7명의 공여자).

6.15 실시예 16: 인간 전혈 검정에서 상이한 ISVD 작제물의 항-TNF-α 유효성

본 발명자들은 보다 생리적 질병인 인간 전혈에서 TNF-a를 차단하는 유효성을 분석하였다. 인간 전혈을 SEB로 자극하여 내인성 TNF-a를 분비시키고 상이한 농도의 항-hTNF-a 참조 항체, 상이한 ISVD 및 상응하는 이소형 대조군으로 처리하였다.

상세하게, 항응고제로서 Na-헤파린[17 IU/㎖]의 존재 하에 건강한 인간 공여자로부터의 혈액을 진공 혈액채취관(BD #368480)으로 채취했다. SEB를 멸균수 중 스톡 용액[1 ㎎/㎖]으로 재구성하였고, SEB를 포함하는 작업 용액을 제조하였다. 음성 IgG1 대조군 항체, 항-hTNF-α 비교인자 항체(양성 대조군), 음성 대조군 VHH IRR00119 및 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027200926, F027201029, F027201060, F027201061 및 F027201062의 작업 용액을 제조하였다.

배지[RPMI-1640(Gibco) + 10% 인간 AB-혈청(Sigma, 주문 번호 H3667) + 1% PenStrep 중 최종 농도 13 pM 내지 200 nM의 항체 및 ISVD 작제물의 연속 희석물을 10 ㎕로 96웰 V-바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 배지 중 SEB 10 ㎕를 96웰 플레이트에 인간 혈액과 항체 또는 ISVD 작제물의 사전-인큐베이션 혼합물의 각 웰에 첨가했다. 마지막으로, 80 ㎕의 인간 혈액을 각 웰에 첨가했다. 샘플을 부드럽게 혼합하고 플레이트를 멸균 뚜껑으로 밀봉하고 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% rH에서 6시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 200 ㎕ PBS를 첨가하고 혈액 샘플을 2000 x g에서 15분 동안 원심분리했다. 혈장 상청액을 수확하여 ELISA에 의한 추가 분석을 위해 새로운 96웰 마이크로플레이트에 -80℃에서 보관했다. MCP-1 수준을 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 ELISA(Invitrogen)를 사용하여 결정하였다. CCL4 수준을 Luminex 기술(R&D)을 사용하여 결정하였다. Speed의 XLfit 프로그램을 사용하여 용량 반응 곡선을 피팅하고 모든 공여자에 대한 도 16 및 도 18의 IC50 값을 계산하였다. 공여자 7명 모두의 기하평균을 보고한다. 나타낸 데이터는 7명의 인간 혈액 공여자에 기반한다.

인간 전혈과 음성 대조군 IgG1 이소형 항체 또는 음성 대조군 VHH IRR00119의 인큐베이션은 SEB-유도 MCP-1 방출의 어떠한 저해도 야기하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 인간 전혈과 단일특이적 항-TNF-α 모노클로날 참조 항체의 인큐베이션은 2.8 nM의 IC50을 가지며 SEB-유도 MCP-1 방출의 강력한 저해를 유도하였다(도 15). 인간 전혈과 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027201062의 인큐베이션은 3.2 nM의 IC50을 가지며 유사한 정도로 MCP-1 분비를 저해하였다. 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027200926, F027201029, F027201060, F027201061은 각각 8.9 nM, 1 nM, 3.8 nM, 4.1 nM 및 3.5 nM의 IC50 값을 가지며 MCP-1 방출을 저해했다(도 16). 본원에 보고한 IC50 값은 기하평균에 기반하는 반면, 도 16은 모든 7명의 공여자의 평균을 나타낸다.

항-hIL-6 비교인자 항체는 MCP-1의 어떠한 저해도 유도하지 않아서 검정이 TNF-α에만 의존함을 입증하였다. 이는 항-hTNF-α 단독과 관련하여 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 비교인자 항체를 사용하는 부가적 유효성의 결여에 의해 추가로 강화된다(도 16).

TNF-a에 대한 유효성을 제2 케모카인 판독인 CCL4를 사용하여 추가로 평가하였다(도 17 및 도 18). 분석은 비교인자 항체 및 ISVD 작제물로서 F027201062에 초점을 맞췄다. 인간 전혈과 단일특이적 항-TNF-α 모노클로날 참조 항체의 인큐베이션은 0.96 nM의 IC50을 가지며 SEB-유도 CCL4 방출의 강력한 용량 의존적 저해를 유도하였다(도 17 및 도 18). 인간 전혈과 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027201062의 인큐베이션은 0.92 nM의 IC50을 가지며 유사한 정도로 CCL4 분비를 저해하였다(도 17 및 18). 본원에 보고된 IC50 값은 기하평균에 기반한 반면, 도 18은 모든 7명의 공여자의 평균을 나타낸다.

항-hIL-6 비교인자 항체는 CCL4의 어떠한 저해도 유도하지 않아서 검정이 TNF-α에만 의존함을 입증하였다(도 17). 이는 항-hTNF-α 단독과 관련하여 항-hTNF-α 및 항-hIL-6 비교인자 항체를 사용하는 부가적 유효성의 결여에 의해 추가로 강화된다(도 17 및 도 18).

6.16 실시예 17: 류마티스 관절염 환자로부터의 인간 섬유아세포-유사 활막세포에서 상이한 ISVD 작제물의 IL-6 유효성

본 발명자들은 류마티스 관절염 환자로부터의 일차 섬유아세포 유사 활막세포(RA-FLS)에서 IL-6을 차단하는 유효성을 분석했다. RA-FLS를 이의 막 결합 IL-6R의 결여로 인해 IL-17A 및 가용성 IL-6R로 자극하였다. 따라서 TF-1 증식 검정과 달리, 이 FLS 검정은 IL-6 트랜스-신호전달을 반영한다. RA-FLS는 인간 TNF-α를 분비하지 않으므로 시스템은 IL-6에만 의존한다. 이어서, 자극한 RA-FLS를 상이한 농도의 항-hIL-6 참조 항체, 상이한 ISVD 및 상응하는 이소형 대조군으로 처리하였다.

보다 상세한 프로토콜:

RA-FLS를 성장 보충물을 포함하는 활막세포 기본 배지(Pelobiotech) 중 96웰 형식으로 10,000개 세포/웰의 밀도로 시딩했다. 다음날 RA-FLS 배지를 각각의 농도(200 nM로부터 1:10 희석, 6개의 농도, 2벌)로 이소형 대조군, 비교인자 항체 및 ISVD를 포함하는 배지로 대체하였다. IgG1 이소형 대조군을 비교인자 항체에 대한 음성 대조군으로 사용한 반면 VHH IRR00119는 ISVD 이소형 음성 대조군으로 사용하였다. 항-인간 IL-6 참조 항체를 비교인자로 사용하였다. 하기 ISVD 작제물: F027200926, F027201029, F027201060, F027201061 및 F027201062를 이 모델에서 평가하였다.

플레이트 효과를 피하기 위해 2벌 간에 모든 작제물의 플레이트 내 위치를 다르게 하였다. 마지막으로, RA-FLS를 100 ng/㎖ 인간 재조합 IL-17A 및 100 ng/㎖ sIL-6R로 24시간 동안 자극하였다. 24시간 후 세포를 원심분리하고 상청액을 수집하여 -80℃에서 보관한다. VEGF-A 수준을 Luminex 기술을 사용하여 측정한다. 측정은 3명의 상이한 류마티스 관절염 공여자에서 그리고 이들 각각에 대해 2개의 상이한 계대로 수행한다.

RA-FLS와 음성 대조군 IgG1 이소형 항체 또는 음성 대조군 VHH IRR00119의 인큐베이션은 IL-17A/sIL-6R 유도된 VEGF-A 분비를 차단하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, RA-FLS와 단일특이적 항-IL-6 참조 항체의 인큐베이션은 0.67 nM의 IC50을 가지며 IL-17A/sIL-6R 유도된 VEGF-A 방출의 강력한 용량 의존적 저해를 유도했다(도 19 및 도 20). RA-FLS와 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027201062의 인큐베이션은 2 nM의 IC50을 가지며 VEGF-A 분비를 약간 더 낮은 정도로 저해하였다. 다중특이적 항-TNF-α/항-IL-6 ISVD 작제물 F027200926, F027201029, F027201060, F027201061은 각각 2 nM, 1 nM, 1.4 nM, 2.9 nM 및 2.7 nM의 IC50 값을 가지며 VEGF-A 방출을 저해했다(도 20). 본원에 보고한 IC50 값은 기하평균에 기반하는 반면, 도 20은 모든 공여자 및 계대의 평균을 나타낸다.

항-hTNF-α 비교인자 항체는 VEGF-A의 어떠한 저해도 유도하지 않아서, 검정이 IL-6에만 의존함을 입증하였다(도 19). 이는 항-IL-6 단독과 관련하여 항-hTNF-a 및 항-hIL-6 비교인자 항체를 사용하는 부가적 유효성의 결여에 의해 추가로 강화된다(도 19).

6.17 실시예 18: 인간 TNF-α 트랜스제닉 Tg197 다발관절염 모델에서 F027201062의 평가.

F027201062를 TNF-구동 진행성 다발관절염의 Tg197 마우스 모델에서 프로파일링하였다(Keffer, J. et al. Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J (1991) 10, 4025-4031). 이들 마우스에서, 변형된 인간 TNF-α 유전자를 트랜스유전자로서 마우스로 삽입하였다. 인간 유전자를 전사된 mRNA를 보다 안정적으로 만드는 방식으로 변형하였고, 따라서 TNF-α의 과발현 및 100% 침투로 네 발 모두에서 자발적인 진행성 관절염을 야기했다. 징후 및 증상은 약 6주령에 보이기 시작했고 치료하지 않고 방치하면 약 10주령부터 게속 심각한 빈사 상태와 사망률을 야기할 때까지 지속적으로 증가한다. 관절염 중증도를 아래 표 15에 상세히 기재된 바와 같은 점수산정 시스템에 의해 임상적으로 평가하였다.

[표 15]

¹ 도 21의 y-축 상에 표시된 바와 같은 관절염 점수.

관절염은 인간 TNFα의 저해에 대한 치료제로의 처리에 민감했다(Shealy, D. J. et al. Anti-TNF-alpha antibody allows healing of joint damage in polyarthritic transgenic mice. Arthritis Res 4 (2002), R7, doi:10.1186/ar430).

용량 의존적 유효성을 확립하기 위해, 상이한 용량의 F027201062를 관절염의 가시적 징후 및 증상을 갖는 6주령의 동물에 치료적 방식으로 주 2회 복강내 주사에 의해 투여하였다(그룹당 n=8마리 동물). 인간 골수종 혈청으로부터 정제된 인간 IgG1(BioXcell #BE0297)을 음성 대조군으로 사용하고 항-인간 TNF 참조 mAb를 양성 대조군으로 사용하여 관절염을 억제했다. 또한, 항-hTNF 단일특이적 나노바디 RA15627569를 제2 양성 대조군으로 사용하였다. F027201062는 각각 체중의 3 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏의 4개의 상이한 용량 강도로 투여하였다. 치료를 11주령까지 계속하였다. 임상적 관절염 점수를 주 1회 결정하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, F027201062로의 처리는 경시적 임상 관절염 점수의 용량 의존적 억제를 초래하였다. 인간 IgG1 음성 대조군 항체로 처리한 동물은 제11주까지 1.571±0.1086의 평균 관절염 점수를 나타냈다. 항-hTNFα 참조 mAb뿐만 아니라 항-hTNF 나노바디 RA15627569는 각각 0.5156±0.0898 및 0.2344±0.0156의 제11주 평균 점수를 가지며 관절염 진행을 억제했다. F027201062의 용량 증가는 제11주에 1.203±0.0943(3 ㎎/㎏), 0.8214±0.161(10 ㎎/㎏), 0.3393±0.0592(30 ㎎/㎏) 및 0.25±0.0579(100 ㎎/㎏)의 평균 점수를 가지며 관절염 진행을 감소시켰다. 통계 분석은 시간 및 처리에 대한 이원 ANOVA에 의해 수행되었고 본페로니-보정 그룹별(groupwise) 비교를 수행하였다(도 21).

Tg197 관절염 모델에서 전반적인 관절염 억제를 곡선 아래 면적(AUC, 도 22)으로 분석하였다. 3 ㎎/㎏보다 큰 용량의 F027201062는 일원 ANOVA에 이어 Bonferroni-보정 그룹별 비교로 분석할 때 항-hTNF 참조 mAb뿐만 아니라 항-hTNF 나노바디 RA15627569에 필적하는 정도로 관절염 진행을 유의하게 억제했다.

처리 완료 시, 뒷다리 발목 관절을 조직학을 위해 처리하고 절편을 표 16에 개략한 점수산정 시스템으로 관절염의 구조적 징후에 대해 평가하였다.

[표 16]

발목 관절에서 관절염 표현형 점수산정을 위한 누적 조직병리적 기준

¹ 도 23의 y-축 상 표시된 바와 같은 관절염 점수.

조직학 점수산정 결과를 도 23에 도시한다. 구조적 관절염 및 관절 파괴는 더 고용량에서 F027201062에 의해 유의하게 억제되었다.

결론적으로, 결과는 항-hTNF 참조 mAb 및 항-hTNF 나노바디 RA15627569와 필적하는 정도로 F027201062에 의한 관절염 징후 및 증상의 용량 의존적 억제뿐만 아니라 구조적 진행의 저해를 실증한다.

6.18 실시예 19: hIL-6 유도된 합토글로빈 생체내 모델에서 F027201062의 평가

생체내 IL-6의 저해를 기계론적 약력학 마우스 모델에서 조사하였다. 암컷 BALB/c 마우스에 F027201062, 참조 항-hIL-6 mAb 또는 비히클을 복강내 경로를 통해 주사하였다. 8시간 후, 마우스에 PBS 또는 25 ㎍의 재조합 인간 IL-6을 주사했다. 16시간 후 마우스를 채혈하여 혈장을 제조했다. IL-6 유도된 급성기 반응물 합토글로빈을 형광 비드-커플링 검정에 의해 혈장 샘플에서 측정하였다. 도 24에 도시한 바와 같이, F027201062의 1 ㎎/㎏뿐만 아니라 3 ㎎/㎏ 용량 둘 모두는 참조 항-hIL-6 mAb와 유사하게 IL-6-유도 혈장 합토글로빈을 완전히 억제하였다.

6.19 실시예 20: hIL-6 트랜스제닉 비장비대 모델에서 F027201062의 평가

IL-6의 생체내 저해를 hIL-6 과발현의 트랜스제닉 마우스 모델에서 추가로 시험하였다. C.B6-Tg(H2-L-IL6)1^Kish/J계통(Suematsu S et al., 1992: Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t (12;15) in interleukin 6 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1):232-5)은 H-2Ld 주조직 적합성 프로모터의 제어 하에 인간 IL-6을 과발현한다. 생후 약 7 내지 10주령에 형질세포증 및 후속 고글로불린혈증과 같은 림프증식성 변화가 명백해진다(Suematsu S et al., 1989: IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 86(19):7547-51).

약 2 내지 2.5월령 수컷 및 암컷 반접합성 C.B6-Tg(H2-L-IL6)1^Kish/J 마우스를 F027201062, 참조 항-hIL-6 mAb 또는 비특이적 대조군 나노바디를 사용하여 주 3회 복강내 주사에 의해 처리하였다. 2주 후, 마우스를 희생시키고 비장비대 및 고감마글로불린혈증을 결정하였다. 비-트랜스제닉 야생형 한배 마우스가 대조군으로 작용하였다.

F027201062뿐만 아니라 항-hIL-6 참조 mAb 둘 모두가 이 모델에서 비장비대를 유의하게 감소시킨다(도 25). 형질세포증 억제와 일치하게, IgG1 및 IgG2a의 혈장 수준이 또한 F027201062뿐만 아니라 항-hIL-6 mAb 처리에 의해 억제된다(도 26).

6.20 실시예 21: 비인간 영장류에서 F027201062의 단회 용량 약동학

연구의 목적은 비인간 영장류에서 단회 용량 투여 후 F027201062의 약동학을 조사하는 것이었다. 이 비-GLP 연구를 위해, 총 9마리의 수컷 나이브 게잡이 원숭이(마카카 파시쿨라리스)를 사용하였다. 표 17의 체계에 따라 동물에 투약하였다.

[표 17]

NHP PK 연구의 투약 체계.

혈액을 원심분리(+4℃에서 10분 동안 대략 1500 g) 전에 실온에서 유지하여 응고하도록 두었다(최대 90분). 생성된 혈청을 표지된 폴리프로필렌 튜브로 디캔팅하고 -65℃ 이하로 설정한 냉동고에 보관했다. 개발한 비-검증 일반 ELISA 방법을 사용하여 샘플을 측정했다.

약동학 프로필을 도 27에 제공한다. IV 투여 후, 제거율은 0.273 ℓ/h/㎏이었고 분포 부피(Vss)는 0.0464 ℓ/㎏이었다. 약동학은 ADA에 의해 영향을 받았다. 모든 투약 전 나이브, ADA 음성 동물은 360 h 및 672 h에 양성으로 시험되었다.

7 산업상 이용가능성

본원에 기재된 폴리펩티드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터 및 조성물은 예를 들어 염증성 및/또는 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체의 치료에서 사용될 수 있다.

본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전 이의 개시에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명이 이의 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 추가 변형이 가능하고 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적응을 포괄하고, 본 발명이 속하는 분야 내에서 알려진 또는 관례적인 관행 내에 있고 본원에 앞서 제시된 본질적인 특징에 적용될 수 있고 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 본 개시로부터의 이러한 일탈을 포함하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Ablynx NV Sanofi <120> POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING IL-6 AND TNF-慣 <130> 242 216 <150> US63/167,925 <151> 2021-03-30 <150> EP20 306 612.1 <151> 2020-12-18 <160> 177 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027201062 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Asp Ser Pro Leu Ile Ala Thr His Pro Arg Gly Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 145 150 155 160 Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 180 185 190 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln 225 230 235 240 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 260 265 270 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr 275 280 285 Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly 290 295 300 Val Ser Cys Ile Ser Gly Ser Val Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 305 310 315 320 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 325 330 335 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 340 345 350 Cys Val Arg Ser Ser Trp Phe Asp Cys Gly Val Gln Gly Arg Asp Leu 355 360 365 Gly Asn Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 385 390 395 400 Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 405 410 415 Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Asp Met Gly Trp Phe Arg 420 425 430 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Ser Gly Ile 435 440 445 Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 450 455 460 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 465 470 475 480 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Ser Pro Arg Tyr Ala 485 490 495 Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys 500 505 510 Val Ser Ser Ala 515 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 17C04 <400> 2 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Asp Ser Pro Leu Ile Ala Thr His Pro Arg Gly Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB23002 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B12 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Val Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Ser Trp Phe Asp Cys Gly Val Gln Gly Arg Asp Leu Gly 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6C11 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala 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<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 152 Ser Ala Gly Gly Phe Leu Val Pro Arg Val Gly Gln Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 153 Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Tyr Gly Val Gly 1 5 10 <210> 154 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 154 Cys Ile Ser Ser Ser Glu Gly Asp Thr Tyr 1 5 10 <210> 155 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 155 Asp Leu Ser Asp Tyr Gly Val Cys Ser Arg Trp Pro Ser Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 156 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 156 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser 1 5 10 <210> 157 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 157 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr 35 <210> 158 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027200925 <400> 158 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 130 135 140 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser 145 150 155 160 Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 165 170 175 Leu Val Ala Asp Ile Phe Pro Phe Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser 180 185 190 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 195 200 205 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 210 215 220 Cys His Ser Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 245 250 255 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser 260 265 270 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly 275 280 285 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser 290 295 300 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 325 330 335 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr 340 345 350 Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 355 360 365 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 370 375 380 Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 385 390 395 400 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe 405 410 415 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Thr Ile Asn Trp 420 425 430 Ala Gly Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 435 440 445 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 450 455 460 Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Gly 465 470 475 480 Gly Phe Leu Val Pro Arg Val Gly Gln Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 485 490 495 Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Ala 500 505 <210> 159 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B06 <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Phe Pro Phe Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ser Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 160 Gly Ile Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly 1 5 10 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 161 Asp Ile Phe Pro Phe Gly Ser Thr Glu 1 5 <210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 162 Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr 1 5 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 163 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 164 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 164 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Leu Tyr Tyr Cys His Ser 35 <210> 165 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 165 Ser Tyr Val Met Gly 1 5 <210> 166 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 166 Thr Ile Asn Trp Ala Gly Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 167 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 167 Tyr Tyr Gly Val Gly 1 5 <210> 168 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 168 Cys Ile Ser Ser Ser Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 169 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp 20 25 30 <210> 170 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 170 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr 20 25 30 <210> 171 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 171 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 172 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 172 Asp Ile Phe Pro Phe Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 173 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 173 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser 20 25 30 <210> 174 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 174 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys His Ser 20 25 30 <210> 175 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 175 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp 20 25 30 <210> 176 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027200921 <400> 176 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Asp Ser Pro Leu Ile Ala Thr His Pro Arg Gly Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 177 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027201040 <400> 177 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Val Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Ser Trp Phe Asp Cys Gly Val Gln Gly Arg Asp Leu Gly 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims

폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 각각의 상기 ISVD는, 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 제1 ISVD는 IL-6에 결합하고 다음을 포함하고:
i. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 6과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;
ii. SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 10과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및
iii. SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 14와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;
b) 제2 ISVD는 IL-6에 결합하고 다음을 포함하고:
iv. SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 8과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;
v. SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 12와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및
vi. SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 16과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3;
c) 제3 ISVD는 TNF-α에 결합하고 다음을 포함함:
vii. SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 9와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;
viii. SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 13과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및
ix. SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 17과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함함.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4와 90% 초과의 서열 동일성을 갖고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5와 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 가짐.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다음과 같은, 폴리펩티드 또는 조성물:
a) 상기 제1 ISVD가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖고;
b) 상기 제2 ISVD가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖고;
c) 상기 제3 ISVD가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 가짐.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제6항에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제7항에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩티드 또는 조성물.
제8항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 다음을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물:
i. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 7과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1;
ii. SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 11과 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR2; 및
iii. SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 15와 2 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3.
제8항 또는 제9항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1과 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.
제14항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 폴리펩티드 또는 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
제16항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 제16항에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이어서
b) 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 제16항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
제19항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트를 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약학 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인 조성물.
염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 약학 활성량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제19항 또는 제20항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 방법.
염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는, 제19항 또는 제20항에 따른 조성물의 용도.
제23항에 있어서, 염증성 및/또는 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.