TW202239763A - 包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 - Google Patents

包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 Download PDF

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Abstract

本文提供了一種用於治療患有炎性疾病和/或自體免疫疾病以及特別是類風濕性關節炎的受試者的新型藥物。具體地，本文提供了包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的多肽，其特徵在於至少一個ISVD與TNF-α結合並且至少兩個ISVD與IL-6結合。本文還提供了核酸、載體和組成物。

Description

包含靶向IL-6和TNF-α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
本文涉及靶向介白素-6（IL-6）和TNF-α的多肽。本文還涉及編碼所述多肽的核酸分子和包含所述核酸的載體，以及包含所述多肽、核酸或載體的組成物。本文還涉及用於治療患有炎性疾病和/或自體免疫疾病的受試者的方法中的這些產物。此外，本文涉及一種產生這些產物的方法。
類風濕性關節炎是一種嚴重的自體免疫疾病，其影響全球約2500萬患者（GBD 2015, Lancet. 2016年10月8日;388(10053):1545-1602）。類風濕性關節炎的主要症狀是關節疼痛和腫脹。這是由關節炎症引起的，所述關節炎症涉及關節滑膜腔的炎症。類風濕性關節炎中這種發炎的滑膜腔以免疫細胞浸潤和基質細胞啟動為特徵（Klareskog, Catrina等人, Lancet. 2009年2月21日;373(9664):659-72；Smolen, Aletaha等人, Nat Rev Dis Primers. 2018年2月8日;4:18001）。一種特化細胞類型即成纖維細胞樣滑膜細胞（Fibroblast-like synoviocytes，FLS）被認為是該過程的關鍵參與者（Bartok和Firestein, Immunol Rev. 2010年1月;233(1):233-55）。FLS與巨噬細胞樣滑膜細胞一起形成滑膜的內膜層。在類風濕性關節炎中，FLS增殖和免疫細胞的積累引發炎症並導致膜增厚，稱為滑膜增生-類風濕性關節炎的主要症狀之一。作為類風濕性關節炎中關節炎症的關鍵介導物，FLS代表了對於類風濕性關節炎治療的有吸引力的目標細胞類型。
IL-6是由多種細胞類型分泌的多效性細胞因子，所述細胞類型包括T細胞和B細胞、單核細胞、成纖維細胞和滑膜細胞。
IL-6是一種最初被鑒定為B細胞分化因子的蛋白質（Hirano等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4；EP 0257406），其與IL-6R（Yamasaki等人, 1988, Science, 241: 825-8；EP 0325474）一起導致IL-6/IL-6R複合物的形成。該複合物與傳遞IL-6的各種生理作用的受體蛋白gp130（Taga等人, 1989, Cell, 58: 573-81；EP 0411946）結合。目前已知IL-6參與免疫反應、造血、急性期反應、骨代謝、血管生成和炎症的調節，等等。IL-6產生的失調與某些自體免疫和慢性炎性增殖性疾病過程的病狀有關（Ishihara和Hirano, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1592: 281-96）。與IL-6（Klein等人, 1991, Blood, 78: 1198-204；EP 0312996）、IL-6R（EP 0409607）或gp130（Saito等人, 1993, J. Immunol. Methods, 163: 217-223; EP 0572118）特異性結合的多肽被證明對IL-6功能展現出有效的抑制作用。
現有技術描述了針對人IL-6、針對人IL-6R和針對人類gp130蛋白的抗體和抗體片段，以用於預防和治療IL-6相關障礙。例子是托珠單抗（參見Woo等人, 2005, Arthritis Res. Ther. 7: 1281-8；Nishimoto等人, 2005, Blood 106: 2627-32；Ito等人, 2004, Gastroenterology, 126: 989-96；Choy等人, 2002, Arthritis Rheum. 46: 3143-50）、BE8（參見Bataille等人, 1995, Blood 86: 685-91；Emilie等人, 1994, Blood 84: 2472-9；Beck等人, 1994, N. Engl. J. Med. 330: 602-5；Wendling等人, 1993, J. Rheumatol. 20: 259-62）以及Centocor的CNTO-328（參見Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2560；Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2608；Int. J. Cancer, 2004, 111:592-5）。業內已知的用於預防和治療IL-6相關障礙的另一種活性成分是可溶性gp130的Fc融合物（參見Becker等人 2004, Immunity, 21: 491-501；Doganci等人, 2005, J. Clin. Invest. 115: 313-25；Nowell等人, 2003, J. Immunol. 171: 3202-9；Atreya等人, 2000, Nat. Med. 6: 583-8）。WO 08/020079中描述了針對IL-6R的胺基酸序列和奈米抗體以及包含它們的多肽。
腫瘤壞死因子α（TNF-α；TNF-alpha）是一種同三聚體細胞因子，其主要由單核細胞和巨噬細胞產生，但已知也由CD4 +和CD8 +周邊血液T淋巴細胞分泌。TNF-α可以作為可溶形式或作為跨膜蛋白存在。TNF-α的主要作用是調節免疫細胞。TNF-α充當內源性熱原，並且其產生的調節異常與多種人類疾病有關，包括炎性腸病和其他炎性疾病，如RA。
FDA目前批准的用於類風濕性關節炎的治療包括抗TNF-α生物製劑（如Simponi® [戈利木單抗]、Enbrel® [依那西普]、Remicade® [英夫利昔單抗]和Humira® [阿達木單抗]）。然而，這些抗TNF-α治療僅在少數患者中顯示完全疾病緩解，並且仍存在大部分無反應者。因此，迄今為止還沒有生物製劑在大多數患有類風濕性關節炎的患者中展現出關於疾病緩解的足夠功效，並且反應的缺乏或喪失仍然是個問題。
靶向多種疾病因子可以例如通過兩種單獨的生物製劑（例如與不同的治療目標結合的抗體）的共同投予或組合使用來實現。然而，從實用和商業兩個角度來看，共同投予或組合使用單獨的生物製劑可能具有挑戰性。例如，單獨產品的兩次注射給患者帶來了更加不便和更痛苦的治療方案，這可能對依從性產生負面影響。關於兩種單獨產品的單次注射，提供允許兩種產品在所需濃度下可接受的粘度和合適的穩定性的配製品可能是困難或不可能的。另外，共同投予和共同配製需要產生兩種單獨的藥物，這可能增加總成本。
已經提出了能夠與兩種不同抗原結合的雙特異性抗體作為解決與單獨生物製劑（如抗體）的共同投予或組合使用相關的此類局限的一種策略。
已經提出了多種形式的雙特異性抗體構建體。例如，雙特異性抗體形式可以涉及兩種抗體或其片段的化學綴合（Brennan, M等人, Science, 1985. 229(4708): 第81-83頁；Glennie, M. J.等人, J Immunol, 1987. 139(7): 第2367-2375頁）。
然而，此類雙特異性抗體形式的缺點包括：在高濃度下的高粘度使得例如皮下投予具有挑戰性，並且在於每個結合單元需要兩個可變結構域相互作用以進行特異性高親和力結合，對多肽穩定性和產生效率具有影響。此類雙特異性抗體形式也可能潛在地導致與輕鏈錯配或重鏈錯配有關的CMC（化學、製造和控制）問題。
迄今為止，還沒有針對TNF-α和IL-6的多特異性（如雙特異性）抗體構建體進入臨床。
由於類風濕性關節炎患者目前對可用的標準護理治療仍反應不足，因此對於RA的治療的改善藥劑仍有未滿足的醫療需求。
本案發明人已經開發了用於治療炎性疾病和/或自體免疫疾病，如特別是類風濕性關節炎（RA）的新型和改善的藥劑。這些藥劑靶向包括IL-6和TNF-α在內的兩種或多種疾病因素，這些因素介導與炎性疾病、特別是RA相關的生物學機制。
發明人驚人地發現用單一藥劑雙重靶向IL-6和TNF-α具有在類風濕性關節炎患者中賦予有效治療的潛力，其中針對相同適應症的單一單特異性藥劑療法可能不夠有效。
本案發明人發現與單特異性抗TNF-α或單特異性抗IL-6多肽相比，同時特異性地靶向IL-6和TNF-α的雙特異性或多特異性多肽（例如免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）構建體）具有增加的調節類風濕性關節炎症狀的效率。可以高效地產生（例如在微生物宿主中）並方便地投予此類多肽（如ISVD構建體）。此外，可以證實此類多肽（如ISVD構建體）對在待治療的受試者中預先存在的抗體（即，在第一次用所述抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）具有有限的反應性。在一些實施例中，此類多肽（如ISVD構建體）在待治療的受試者中展現出足夠長的半衰期，使得可以限制連續治療的次數並且因此可以在時間上充分間隔開。
本文的多肽（例如免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）構建體）包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中至少一個ISVD與TNF-α特異性結合，並且至少兩個ISVD與IL-6特異性結合。根據一些實施例，與TNF-α特異性結合的所述至少一個ISVD與人類TNF-α（hTNF-α）結合，並且與特異性IL-6結合的所述至少兩個ISVD與人IL-6（hIL-6）結合。
根據一些優選實施例，本文的多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述結合單元可以是與血清蛋白，例如與人類血清蛋白如人類血清白蛋白結合的ISVD。
還提供了能夠表現本文的多肽的核酸分子、包含所述核酸的核酸或載體，以及包含所述多肽、所述核酸或所述載體的組成物。在一些實施例中，所述組成物是醫藥組成物。
還提供了包含編碼根據本文的多肽的核酸或載體的（非人類）宿主或宿主細胞。
還提供了一種用於產生根據本文的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a.   在合適的宿主細胞或（非人類）宿主生物體或另一個合適的（例如無細胞）表現系統中表現核酸；任選地接著進行： b.   分離和/或純化根據本文的多肽。
此外，本文提供了所述多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸或載體的組成物，所述多肽或組成物用作藥物。在一些實施例中，所述多肽或組成物用於治療炎性和/或自體免疫疾病，如RA。
另外，提供了一種治療炎性疾病如RA的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據本文的多肽或組成物。在一些實施例中，所述方法還包括投予一或多種另外的治療劑。
還提供了本文的多肽或組成物在製備用於治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如RA的藥物（如醫藥組成物）中的用途。
特別地，本文提供了以下實施例：
實施例 1.      一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，所述多肽或組成物用作藥物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD包含 iv.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD包含 vii.  具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述第一ISVD、第二ISVD和第三ISVD任選地以從N末端開始的順序被包含在內。
實施例2. 根據實施例1所述的用於所述用途的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例3. 根據實施例1或2所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b)  所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例4. 根據實施例1至3中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
實施例5. 根據實施例1至4中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
實施例6. 根據實施例1至5中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例7. 根據實施例6所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分以及可與血清蛋白結合的小蛋白或肽。
實施例8. 根據實施例6至7中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
實施例9. 根據實施例8所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
實施例10.     根據實施例9所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
實施例11.     根據實施例9至10中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
實施例12.     根據實施例9至11中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性。
實施例13.     根據實施例9至12中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
實施例14.     根據實施例1至13中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽在其C末端具有1至5個胺基酸殘基的延伸，優選單個胺基酸殘基的延伸，其中所述胺基酸殘基獨立地選自天然存在的胺基酸，優選獨立地選自甘胺酸或丙胺酸、白胺酸、異白胺酸和纈胺酸，更優選丙胺酸和甘胺酸，最優選丙胺酸。
實施例15.     根據實施例1至14中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性。
實施例16.     根據實施例1至15中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
實施例17.     根據實施例1-16中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，所述多肽或組成物用於治療炎性和/或自體免疫疾病，如類風濕性關節炎。
實施例18.     一種多肽，所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD與IL-6結合並且包含 i.     具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD與IL-6結合並且包含 iv.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD與TNF-α結合並且包含 vii.  具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述ISVD任選地以從N末端開始的順序被包含在內。
實施例19.     根據實施例18所述的多肽，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
實施例20.     根據實施例18或19中任一項所述的多肽，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
實施例21.     根據實施例18至20中任一項所述的多肽，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
實施例22.     根據實施例18至21中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例23.     根據實施例22所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分以及可與血清蛋白結合的小蛋白或肽。
實施例24.     根據實施例22至23中任一項所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
實施例25.     根據實施例24所述的多肽，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
實施例26.     根據實施例25所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的ISVD包含： i.    具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
實施例27.     根據實施例25至26中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
實施例28.     根據實施例25至27中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性。
實施例29.     根據實施例25至28中任一項所述的多肽，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
實施例30.     根據實施例18至29中任一項所述的多肽，其中所述多肽在其C末端具有1至5個胺基酸殘基的延伸，優選單個胺基酸殘基的延伸，其中所述胺基酸殘基獨立地選自天然存在的胺基酸，優選獨立地選自甘胺酸或丙胺酸、白胺酸、異白胺酸和纈胺酸，更優選丙胺酸和甘胺酸，最優選丙胺酸。
實施例31.     根據實施例18至30中任一項所述的多肽，其中所述多肽的胺基酸序列包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性。
實施例32.     根據實施例18至31中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。
實施例33.     一種核酸，所述核酸包含編碼根據實施例18至32中任一項所述的多肽的核苷酸序列。
實施例34.     一種宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞包含根據實施例33所述的核酸。
實施例35.     一種用於產生根據實施例18至32中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a)   在合適的宿主細胞或宿主生物體或另一合適的表現系統中表現根據實施例33所述的核酸；任選地接著進行： b)  分離和/或純化根據實施例18至32中任一項所述的多肽。
實施例36.     一種組成物，所述組成物包含至少一種根據實施例18至32中任一項所述的多肽或根據實施例33所述的核酸。
實施例37.     根據實施例36所述的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例38.     一種治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如類風濕性關節炎的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據實施例18至32中任一項所述的多肽或根據實施例36至37中任一項所述的組成物。
實施例39.     根據請求項37所述的方法，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
實施例40.     根據實施例18至32中任一項所述的多肽或根據實施例36至37中任一項所述的組成物用於製備治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如類風濕性關節炎的醫藥組成物中的用途。
實施例41.     根據請求項40所述的多肽或組成物的用途，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
實施例42.     一種多肽，所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD包含 iv.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD包含 vii.  具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述ISVD任選地以從N末端開始的順序被包含在內。
實施例43.     一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，所述多肽或組成物用作藥物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD包含 iv.   具有SEQ ID NO: 150的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 150具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 151具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.   具有SEQ ID NO: 152的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 152具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD包含 vii.  具有SEQ ID NO: 153的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 153具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 154的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 154具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.   具有SEQ ID NO: 155的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 155具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述第一ISVD、第二ISVD和第三ISVD任選地以從N末端開始的順序被包含在內。
實施例44.     根據實施例43所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 150的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 152的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 154的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 155的胺基酸序列的CDR3。
實施例45.     根據實施例43或44中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 148大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 149大於90%同一性的序列同一性。
實施例46.     根據實施例43至45中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 148的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 149的胺基酸序列。
實施例47.     一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，所述多肽或組成物用作藥物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 160的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 160具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 161的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 161具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 162的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 162具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD包含 i.     具有SEQ ID NO: 150的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 150具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 151具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 152的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 152具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 其中所述第一ISVD、第二ISVD和第三ISVD任選地以從N末端開始的順序被包含在內。
實施例48.     根據實施例47所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 160的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 161的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 162的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 150的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 151的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 152的胺基酸序列的CDR3。
實施例49.     根據實施例47或48中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 159大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 148大於90%同一性的序列同一性。
實施例50.     根據實施例47至49中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 159的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 148的胺基酸序列。
實施例51.     根據實施例43至50中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
實施例52.     根據實施例51中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
實施例53.     根據實施例52所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
實施例54.     根據實施例53所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
實施例55.     根據實施例53或54中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
實施例56.     根據實施例53至55中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性。
實施例57.     根據實施例53至56中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
實施例58.     根據實施例43至57中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽在其C末端具有1至5個胺基酸殘基的延伸，優選單個胺基酸殘基的延伸，其中所述胺基酸殘基獨立地選自天然存在的胺基酸，優選獨立地選自甘胺酸或丙胺酸、白胺酸、異白胺酸和纈胺酸，更優選丙胺酸和甘胺酸，最優選丙胺酸。
實施例59.     根據實施例43至46中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 147大於90%的序列同一性。
實施例60.     根據實施例43至46中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 147的胺基酸序列或由其組成。
實施例61.     根據實施例47至50中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽的胺基酸序列包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 158大於90%的序列同一性。
實施例62.     根據實施例47至50中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 158的胺基酸序列或由其組成。
實施例63.     根據實施例43-62中任一項所述的用於所述用途的多肽或組成物，所述多肽或組成物用於治療炎性和/或自體免疫疾病，如類風濕性關節炎。
實施例64.     一種核酸，所述核酸包含編碼根據實施例43至63中任一項所述的多肽的核苷酸序列。
實施例65.     一種宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞包含根據實施例64所述的核酸。
實施例66.     一種用於產生根據實施例43至63中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a)   在合適的宿主細胞或宿主生物體或另一合適的表現系統中表現根據實施例64所述的核酸；任選地接著進行： b)  分離和/或純化根據實施例43至63中任一項所述的多肽。
實施例67.     一種組成物，所述組成物包含至少一種根據實施例43至63中任一項所述的多肽或根據實施例64所述的核酸。
實施例68.     根據實施例67所述的組成物，所述組成物是醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
實施例69.     一種治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如類風濕性關節炎的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的根據實施例43至63中任一項所述的多肽或根據實施例67或68中任一項所述的組成物。
實施例70.     根據實施例69所述的方法，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
實施例71.     根據實施例43至63中任一項所述的多肽或根據實施例67或68中任一項所述的組成物用於製備治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如類風濕性關節炎的醫藥組成物中的用途。
實施例72.     根據請求項71所述的多肽或組成物的用途，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
本文提供了一種用於治療炎性疾病和/或自體免疫疾病如類風濕性關節炎（RA）的新型藥物。
本案發明人發現，與單特異性抗TNF-α或抗IL-6多肽相比，同時靶向TNF-α和IL-6的多肽在體外和/或體內導致調節類風濕性關節炎的症狀的增加的效率。可以高效地產生所述多肽（例如在微生物宿主中）。此外，可以證實此類多肽對在待治療的受試者中預先存在的抗體（即，在第一次用所述抗體構建體治療之前存在於受試者中的抗體）具有有限的反應性。在一些實施例中，此類多肽可以方便地投予並且在待治療的受試者中展現出足夠長的半衰期以使得保持有限的連續治療次數並且因此這些治療可以方便地在時間上間隔開。
所述多肽是至少雙特異性的，但也可以是例如三特異性、四特異性或五特異性的。此外，所述多肽是至少三價的，但也可以是例如四價的、五價的或六價的等，優選四價的。
術語「雙特異性」、「三特異性」、「四特異性」或「五特異性」均落在術語「 多特異性」範圍內，並且分別是指與兩種、三種、四種或五種不同的目標分子結合。術語「 二價」、「 三價」、「 四價」、「 五價」或「 六價」均落在術語「 多價」範圍內，並且分別表示存在兩個、三個、四個或五個結合單元（如ISVD）。例如，所述多肽可以是三特異性四價的，如包含四個ISVD或由其組成的多肽，其中一個ISVD與人類TNF-α結合，兩個ISVD與人IL-6結合並且一個ISVD與人類血清白蛋白結合（如ISVD構建體F027201062）。這種多肽可以同時是雙互補位的，例如在兩個ISVD結合人IL-6上的兩個不同表位的情況下。術語「 雙互補位」是指與同一目標分子的兩個不同部分（例如表位）結合。
如本文所用，術語「第一ISVD」、「第二ISVD」、「第三ISVD」等僅指示一個、兩個或三個ISVD等的存在，但還優選地指示ISVD彼此的相對位置，其中編號從本文的多肽的N末端開始。因此，「第一ISVD」優選地比「第二ISVD」更靠近N末端，而「第二ISVD」比「第三ISVD」更靠近N末端，等等。因此，當從C末端考慮時，ISVD排列是相反的。由於編號不是絕對的，並且可以僅指示所述至少三個ISVD的相對位置，因此不排除多肽中可能存在其他結合單元/構建塊，如與TNF-α或IL-6結合的另外的ISVD，或者與另一個目標結合的ISVD。此外，不排除可以在其間放置其他結合單元/構建塊（如ISVD）的可能性。例如，如下文進一步所述（具體參見第5.3節「（體內）半衰期延長」），所述多肽還可以包含與人類血清白蛋白結合的另一個ISVD，其甚至可以位於例如「第一ISVD」與「第二ISVD」之間。
鑒於上述，本文提供了一種包含至少三個ISVD或由其組成的多肽，其中至少一個ISVD與TNF-α特異性結合並且至少兩個ISVD與IL-6特異性結合。
所述多肽的組分如ISVD可以通過一或多個合適的連接子（如肽連接子）彼此連接。
使用連接子連接兩個或更多個(多)肽是業內熟知的。表A-5中顯示了示例性肽連接子。一類常用的肽連接子稱為「Gly-Ser」或「GS」連接子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序的一或多個重複，所述肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 65）基序（例如，具有式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此類GS連接子的一些經常使用的例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 68）、15GS連接子（n = 3）和35GS連接子（n = 7）。可以參考例如Chen等人, Adv. Drug Deliv. Rev. 2013年10月15日; 65(10): 1357–1369；以及Klein等人, Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330。
在本文的多肽中，在一些實施例中，可以選擇使用9GS連接子將多肽的組分彼此連接。
在一個實施例中，與TNF-α特異性結合的ISVD位於所述多肽的C末端處。發明人驚人地發現，這樣的配置可以顯著增加化合物的效力以及改善對於化合物的最佳生產而言重要的某些特徵，如溶解度和表現水準。
同樣在一個實施例中，一個與IL-6特異性結合的ISVD位於所述多肽的C末端或N末端處，優選在N末端處。
因此，在一些實施例中，所述多肽按照從所述多肽的N末端開始的順序包含以下項或由以下項組成：與IL-6特異性結合的第一ISVD，如本文所定義為所述多肽提供增加的半衰期的任選結合單元；與IL-6特異性結合的第二ISVD；以及與TNF-α特異性結合的第三ISVD。在優選實施例中，為所述多肽提供增加的半衰期的結合單元是ISVD。
條件是在一些實施例中，所述多肽按照從所述多肽的N末端開始的順序包含以下項或由以下項組成：與IL-6特異性結合的第一ISVD、連接子、與人類血清白蛋白（HSA）結合的ISVD、連接子、與IL-6特異性結合的第二ISVD、連接子和與TNF-α特異性結合的ISVD。在一些實施例中，所述連接子是9GS連接子。
所述多肽的此類構型可以提供增加的產物產量、良好的CMC特徵以及關於免疫反應調節的最佳化的功能性和更強效力。
因此，在一些實施例中，所述多肽展現出至少120 mg/ml，如至少130 mg/ml，如至少140 mg/ml，優選至少145 mg/ml的溶解度。
在一些實施例中，本文的多肽展現出與人類血清中預先存在的抗體的降低的結合。為此，在一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD（優選在至少位於所述多肽的C末端處的ISVD中）或每個ISVD中具有胺基酸位置11處的纈胺酸（V）以及胺基酸位置89（根據Kabat編號）處的白胺酸（L）。在另一個實施例中，所述多肽在C末端ISVD的C末端具有1至5個胺基酸（天然存在的、非天然存在的或其混合物）的延伸，如單個丙胺酸（A）延伸。ISVD的C末端可以是VTVSS（SEQ ID NO: 81）。在另一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD（優選在至少位於所述多肽的C末端處的ISVD中）或每個ISVD中具有位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在另一個實施例中，所述ISVD在至少一個ISVD（優選在至少位於所述多肽的C末端處的ISVD中）或每個ISVD中具有位置112（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在一些實施例中，所述ISVD的C末端是VKVSS（SEQ ID NO: 82）、VQVSS（SEQ ID NO: 83）、VTVKS（SEQ ID NO: 84）、VTVQS（SEQ ID NO: 85）、VKVKS（SEQ ID NO: 86）、VKVQS（SEQ ID NO: 87）、VQVKS（SEQ ID NO: 88）或VQVQS（SEQ ID NO: 89），使得在添加單個丙胺酸後，所述多肽的C末端例如具有序列VTVSSA（SEQ ID NO: 90）、VKVSSA（SEQ ID NO: 91）、VQVSSA（SEQ ID NO: 92）、VTVKSA（SEQ ID NO: 93）、VTVQSA（SEQ ID NO: 94）、VKVKSA（SEQ ID NO: 95）、VKVQSA（SEQ ID NO: 96）、VQVKSA（SEQ ID NO: 97）或VQVQSA（SEQ ID NO: 98）。在一個實施例中，所述序列是VKVSSA（SEQ ID NO: 91）。在另一個實施例中，所述多肽在每個ISVD中具有胺基酸位置11處的纈胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L）（根據Kabat編號），任選地在至少一個ISVD（優選在至少位於所述多肽的C末端處的ISVD中）中的胺基酸位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q），優選K，並且在C末端ISVD的C末端具有1至5個胺基酸（天然存在的、非天然存在的或其混合物）的延伸，如單個丙胺酸（A）延伸（使得所述多肽的C末端例如具有序列VTVSSA（SEQ ID NO: 90）、VKVSSA（SEQ ID NO: 91）或VQVSSA（SEQ ID NO: 92））。關於在這方面的進一步資訊，參見例如通過引用以其整體併入於此的WO 2012/175741和WO 2015/173325。用於延伸的胺基酸殘基優選獨立地選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸，更優選甘胺酸和丙胺酸，以及最優選丙胺酸。優選地，所述延伸由單個胺基酸殘基組成。
在另一個實施例中，本文的多肽包含具有與SEQ ID NO: 1大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性的胺基酸序列或由其組成，其中四個ISVD的CDR分別如以下章節「5.1免疫球蛋白單可變結構域」和「5.3（活體內）半衰期延長」中示出的項目A至D（或A'至D'，如果使用Kabat定義）所定義，其中特別地： •           與IL-6特異性結合的第一ISVD具有含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； •           IL-6特異性結合的第二ISVD具有含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3； •           與TNF-α特異性結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3；並且 •           與人類血清白蛋白結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3， 或者可替代地如果使用Kabat定義： •           與IL-6特異性結合的第一ISVD具有含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； •           與IL-6特異性結合的第二ISVD具有含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3； •           與TNF-α特異性結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3；並且 •           與人類血清白蛋白結合的ISVD具有含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
在一些實施例中，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或由其組成。在一個實施例中，所述多肽由SEQ ID NO: 1的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，本文的多肽對人類TNF-α和人IL-6具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。 5.1 免疫球蛋白單可變結構域
術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISVD）可與「單可變結構域」互換使用，定義了其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如單株抗體）或其片段（如Fab、Fab'、F（ab'） 2、scFv、二scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用形成抗原結合位點。通常，在常規的免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）相互作用形成抗原結合位點。在這種情況下，V H和V L二者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。
鑒於以上定義，常規4鏈抗體（如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；業內已知的）的抗原結合結構域或者源自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab') 2片段、Fv片段（如二硫化物連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（業內全部已知的）將通常不被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，不是一個（單個）免疫球蛋白結構域發生與相應抗原表位的結合，而是一對（締合的）免疫球蛋白結構域（如輕鏈和重鏈可變結構域）即免疫球蛋白結構域的V H-V L對發生與相應抗原表位的結合，其共同地與相應抗原表位結合。
相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下與抗原表位特異性地結合。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點由單個V H、單個V HH或單個V L結構域形成。
因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V L序列）或其合適的片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V H序列或V HH序列）或其合適的片段；只要它能夠形成單個抗原結合單元（即，基本上由單可變結構域組成的功能性抗原結合單元，使得單個抗原結合結構域不需要與另一個可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）可以是例如重鏈ISVD，如V H、V HH，包括駝類化V H或人類化V HH。根據一些實施例，免疫球蛋白單可個變結構域（ISVD）是V HH，包括駝類化V H或人類化V HH。重鏈ISVD可以源自常規的四鏈抗體或重鏈抗體。
例如，免疫球蛋白單可變結構域可以是單個結構域抗體（或適合用作單個結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）或Nanobody®（如本文所定義，並且包括但不限於V HH）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適的片段。
特別地，免疫球蛋白單可變結構域可以是Nanobody®（如V HH，包括人類化V HH或駝類化V H）或其合適的片段。Nanobody®、Nanobodies®和Nanoclone®是Ablynx N.V.的注冊商標。
「V HH結構域」也稱為V HH、V HH抗體片段和V HH抗體，最初已被描述為「重鏈抗體」的（即「無輕鏈抗體」的；Hamers-Casterman等人 Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。選擇術語「V HH結構域」以便將這些可變結構域與存在於常規4鏈抗體中的重鏈可變結構域（在本文中稱為「V H結構域」）和存在於常規4鏈抗體中的輕鏈可變結構域（在本文中稱為「V L結構域」）區分開來。對於V HH的進一步描述，參考了Muyldermans的綜述文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001），以及作為一般背景技術提及的以下專利申請：布魯塞爾自由大學（Vrije Universiteit Brussel）的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；比利時弗蘭德生物技術研究院（Vlaams Instituut voor Biotechnologie，VIB）的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大國家研究院（National Research Council of Canada）的WO 01/90190；抗體研究所（Institute of Antibodies）的WO 03/025020（= EP 1433793）；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，將其每一個通過引用以其整體併入於此。
通常，免疫球蛋白的產生涉及對實驗動物進行免疫，融合免疫球蛋白產生細胞以產生雜交瘤，並針對所需特異性進行篩選。可替代地，可以通過篩選幼稚的或合成的文庫，例如通過噬菌體展示來生成免疫球蛋白。
免疫球蛋白序列（如Nanobodies®）的生成已經在各種出版物（其中WO 94/04678, Hamers-Casterman等人 1993 and Muyldermans等人 2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）可以作為例證，將其通過引用以其整體併入於此）中被廣泛地描述。在這些方法中，用靶抗原對駱駝科動物進行免疫，以便誘導針對所述靶抗原的免疫反應。對從所述免疫獲得的Nanobodies庫進一步篩選結合靶抗原的Nanobodies。
在這些情況下，抗體的產生需要純化的抗原用於免疫和/或篩選。可以從天然來源或在重組產生過程中純化抗原。
免疫球蛋白序列的免疫和/或篩選可以使用此類抗原的肽片段進行。
可以使用不同來源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝免疫球蛋白序列。本文還包括完全人類、人類化或嵌合序列。例如，本文包括駱駝免疫球蛋白序列和人類化駱駝免疫球蛋白序列或駝類化結構域抗體，例如由Ward等人（參見例如WO 94/04678和Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994和Prot. Eng., 9:531-537, 1996，其每一個通過引用以其整體併入於此）描述的駝類化dAb。此外，本文還使用融合的免疫球蛋白序列，例如形成多價和/或多特異性構建體（對於含有一或多個V HH結構域的多價和多特異性多肽及其製劑，還參考Conrath等人, J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350, 2001以及例如WO 96/34103和WO 99/23221，將其每一個通過引用以其整體併入本文）以及包含標記或其他功能部分（例如毒素、標記、放射化學物質等，其可衍生自本文的免疫球蛋白序列）的免疫球蛋白序列等。
「人類化V HH」包含與天然存在的V HH結構域的胺基酸序列對應但是已經被「人類化」的胺基酸序列，即通過將所述天然存在的V HH序列（並且特別是架構序列）的胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基用來自人類的常規4鏈抗體（例如，上文所示）的V H結構域中的一或多個相應位置處存在的一或多個胺基酸殘基替代而人類化。這可以以本身已知的方式進行，所述方式例如基於本文的進一步描述和在文獻（例如WO 2008/020079）中對於熟習此項技術者來說是清楚的。此外，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類人類化V HH，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
「駝類化V H」包含與天然存在的V H結構域的胺基酸序列對應但是已經被「駝類化」的胺基酸序列，即通過將來自常規4鏈抗體的天然存在的V H結構域的胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基用重鏈抗體的V HH結構域中的一或多個相應位置處存在的一或多個胺基酸殘基替代而駝類化。這可以以本身已知的方式進行，所述方式例如基於本文的進一步描述和文獻（例如WO 2008/020079）對於熟習此項技術者來說是清楚的。如本文所定義，此類「駝類化」取代可以插入形成和/或存在於V H-V L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科標誌殘基處（參見例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann, 1994和1996, 同上）。在一些實施例中，用作產生或設計駝類化V H的起始材料或起點的V H序列是來自哺乳動物的V H序列或人類的V H序列，如V H3序列。然而，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得這種駝類化V H，並且因此並不嚴格限於使用包含天然存在的V H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
應注意，一或多個免疫球蛋白序列可以彼此連接和/或與其他胺基酸序列連接（例如經由二硫橋）以提供也可能有用的肽構建體（例如Fab'片段、F(ab’)2片段、scFv構建體、「雙抗體」和其他多特異性構建體）。例如參考Holliger和Hudson, Nat Biotechnol. 2005年9月;23(9):1126-36的綜述。通常，當將多肽旨在用於投予至受試者（例如用於預防、治療和/或診斷目的）時，其可以包含所述受試者中非天然存在的免疫球蛋白序列。
免疫球蛋白單可變結構域序列的結構的非限制性例子可以被認為由四個架構區（「FR」）構成，其在業內和本文中分別被稱為「架構區1」（「FR1」）；「架構區2」（「FR2」）；「架構區3」（「FR3」）；和「架構區4」（「FR4」）；所述架構區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在業內和本文中分別被稱為「互補決定區1」（「CDR1」）；「互補決定區2」（「CDR2」）；和「互補決定區3」（「CDR3」）。
如WO 08/020079（通過引用併入本文）的第58和59頁的q)段中進一步描述的，免疫球蛋白單可變結構域的胺基酸殘基可以根據Kabat等人（“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD，公佈號91）給出的V H結構域的通用編號進行編號，如應用於Riechmann和Muyldermans, 2000的文章（J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195；參見例如該出版物的圖2）中的來自駱駝的V HH結構域。應注意，如業內熟知的，對於V H結構域和V HH結構域-每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可以不對應由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數（即，根據Kabat編號的一或多個位置可能不會在實際序列中被佔用，或者實際序列可以含有比Kabat編號允許的數目更多的胺基酸殘基）。這意味著，通常，根據Kabat的編號可以對應於或可以不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。V H結構域和V HH結構域中的胺基酸殘基總數通常在110至120，常常在112與115之間的範圍內。然而應注意，較小和較長的序列也可能適合於本文中描述的目的。
在本申請中，除非另有說明，否則CDR序列是根據Kontermann和Dübel（2010年版, Antibody Engineering, 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, 第3章, 第33至51頁）中描述的AbM編號來確定。根據此方法，FR1包含位置1至25處的胺基酸殘基，CDR1包含位置26至35處的胺基酸殘基，FR2包含位置36至49處的胺基酸，CDR2包含位置50至58處的胺基酸殘基，FR3包含位置59至94處的胺基酸殘基，CDR3包含位置95至102處的胺基酸殘基，並且FR4包含位置103至113處的胺基酸殘基。
CDR區的確定也可以根據不同方法進行。在根據Kabat的CDR測定中，免疫球蛋白單可變結構域的FR1包含位置1至30處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR1包含位置31至35處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR2包含位置36至49處的胺基酸，免疫球蛋白單可變結構域的CDR2包含位置50至65處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR3包含位置66至94處的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的CDR3包含位置95至102處的胺基酸殘基，並且免疫球蛋白單可變結構域的FR4包含位置103至113處的胺基酸殘基。
在這種免疫球蛋白序列中，架構序列可以是任何合適的架構序列，並且合適的架構序列的例子對於熟習此項技術者將是清楚的，例如基於標準手冊以及本文中提及的進一步公開和現有技術。
架構序列可以是免疫球蛋白架構序列或者（例如通過人類化或駝類化）衍生自免疫球蛋白架構序列的架構序列的合適組合。例如，架構序列可以是衍生自輕鏈可變結構域（例如V L序列）和/或重鏈可變結構域（例如V H序列或V HH序列）的架構序列。在一個實施例中，架構序列是衍生自V HH序列的架構序列，其中所述架構序列可以任選地被部分或完全人類化；或者是已經駝類化的常規V H序列（如本文所定義）。
特別地，如本文公開的ISVD序列中存在的架構序列可以含有一或多個標誌殘基（如本文定義），使得ISVD序列是Nanobody®（如V HH，包括人類化V HH或駱駝化V H）。此類架構序列（合適組合）的一些非限制性例子將從本文的進一步公開中變得清楚。
同樣，如本文針對免疫球蛋白序列的一般描述，也可以使用任何前述的合適片段（或片段的組合），如含有一或多個CDR序列的片段，其適當地側接一或多個架構序列和/或經由一或多個架構序列連接（例如，以與這些CDR和架構序列相同的順序可以出現在衍生所述片段的全尺寸免疫球蛋白序列中）。
然而，應注意，本文關於ISVD序列的起源（或用於表現所述ISVD序列的核苷酸序列的起源），以及關於產生或獲得（或者已經產生或獲得）所述ISVD序列或核苷酸序列的方式不受限制。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列。在特定但非限制性的方面，ISVD序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於「人類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（諸如部分或完全人類化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，並且特別是部分或完全人類化的V HH序列）、「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列，以及通過諸如以下的技術獲得的免疫球蛋白序列：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合衍生自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝，以及熟習此項技術者熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或任何前述的任何適當組合。
類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或者合成的或半合成的序列，並且可以是例如通過PCR從合適的天然存在的模板分離的序列（例如從細胞分離的DNA或RNA）、已經從文庫（並且特別是，表現文庫）分離的核苷酸序列、已經通過將突變引入天然存在的核苷酸序列製備的核苷酸序列（使用本身已知的任何合適的技術，如錯配PCR）、已經通過使用重疊引物的PCR製備的核苷酸序列，或者已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。
如上所述，ISVD可以是Nanobody®或其合適的片段。對於Nanobodies®（Nanobody®和Nanobodies®是Ablynx N.V.（Sanofi Company）的注冊商標）的一般描述，參考以下進一步描述以及本文引用的現有技術。然而，在這方面，應注意，此描述和現有技術主要描述了所謂的「V H3類」的Nanobodies®（即與如DP-47、DP-51或DP-29的V H3類的人種系序列具有高度序列同源性的Nanobodies®）。然而，應注意，本文在其最廣泛的意義上通常可以使用任何類型的Nanobody®，並且例如還使用屬於所謂的「V H4類」的Nanobodies®（即與如DP-78的V H4類的人類種系序列具有高度序列同源性的Nanobodies®），關於例子描述於通過引用以其整體併入本文的WO 2007/118670中。
通常，Nanobodies®（特別是V HH序列，包括（部分）人類化V HH序列和駝類化V H序列）的特徵可以是在一或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常可以將Nanobody®定義為具有（一般）結構的免疫球蛋白序列 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一或多個是如本文進一步所定義的。
特別地，Nanobody®可以是具有（一般）結構的免疫球蛋白序列 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述架構序列是如本文進一步所定義的。
更特別地，Nanobody®可以是具有（一般）結構的免疫球蛋白序列 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中：
根據Kabat編號，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的胺基酸殘基中的一或多個選自下表X中提及的標誌殘基。
本文所示的FR可以適當地選自如表A-2（或表A-2.1，關於Kabat編號）中所示的FR，優選來自相同的殖株（clone）（即，同一行中顯示的FR），任選地在特定位置處具有如本文所述的胺基酸。
表 X ： Nanobodies® 中的標誌殘基
位置 人類 V H3 標誌殘基
11 L、V；主要是L L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I
37 V、I、F；通常是V F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P
44 (8) G E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I
45 (8) L L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V
47 (8) W、Y F (1)、L (1)或W (2) G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D
83 R或K；通常是R R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H
84 A、T、D；主要是A P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E
103 W W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C
104 G G、A、S、T、D、P、N、E、C、L
108 L、M或T；主要是L Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H
注意：(1)   特別地但非排他地，與位置43至46處的KERE或KQRE組合。 (2)   通常為位置44至47處的GLEW。 (3)   通常為位置43至46處的KERE或KQRE，例如為位置43至47的KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，諸如以下的序列也是可能的：TERE（例如TEREL）、TQRE（例如TQREL）、KECE（例如KECEL或KECER）、KQCE（例如KQCEL）、RERE（例如REREG）、RQRE（例如RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如QEREG）、QQRE,（例如QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如KGREG）、KDRE（例如KDREV）。一些其他可能的序列包括例如DECKL和NVCEL。 (4)   具有位置44至47的兩個GLEW以及位置43至46處的KERE或KQRE。 (5)   通常為天然存在的V HH結構域的位置83至84處的KP或EP。 (6)   特別地但非排他地，與位置44至47處的GLEW組合。 (7)   前提是當位置44至47為GLEW時，還含有103處的W的（非人類化）V HH序列中的位置108總是Q。 (8)   GLEW基團還含有位置44至47處的GLEW樣序列，例如像GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。
在一些實施例中，位置11處的標誌殘基是L。在一些實施例中，位置37處的標誌殘基是F(1)或Y。在一些實施例中，位置44處的標誌殘基是G(2)或Q(3)。在一些實施例中，位置45處的標誌殘基是L(2)或R(3)。在一些實施例中，位置47處的標誌殘基是F(1)、L(1)或W(2)。在一些實施例中，位置83處的標誌殘基是K。在一些實施例中，位置84處的標誌殘基是P。在一些實施例中，位置103處的標誌殘基是W。在一些實施例中，位置104處的標誌殘基是G。在一些實施例中，位置108處的標誌殘基是Q或L。
此外，當在位置1處具有N末端麩胺酸（E）的ISVD位於所述多肽的N末端時，所述麩胺酸優選被天門冬胺酸（D）取代。因此，例如，如果SEQ ID NO: 3、4或5在所述多肽的N端，則位置1處的E可以改變為D。相反，如果例如在所述多肽的N末端不存在SEQ ID NO: 2，則位置1處的D可以改變為E。
本文尤其使用可與TNF-α或IL-6特異性結合的ISVD。在本文的上下文中，「與某種目標分子結合」具有業內如在抗體及其相應抗原的情境中所理解的常見含義。
本文的多肽可以包含與TNF-α結合的一或多個ISVD以及與IL-6結合的兩個或更多個ISVD。例如，所述多肽可以包含一個與TNF-α結合的ISVD和兩個與IL-6結合的ISVD。
在一些實施例中，所述至少一個ISVD可以在功能上阻斷其目標分子。例如，靶向部分可以阻斷TNF-α與TNFR（TNF受體）之間的相互作用，或者可以阻斷IL-6與IL-6R（介白素6受體）之間的相互作用。因此，在一個實施例中，本文的多肽包含與TNF-α特異性結合並抑制其與TNFR相互作用的至少一個ISVD，以及與IL-6特異性結合並在功能上阻斷其與IL-6R的相互作用的兩個ISVD。因此，在優選實施例中，本文的多肽包含兩個與IL-6特異性結合的ISVD，其中一個在功能上阻斷IL-6與IL-6R的相互作用。
本文中使用的ISVD形成本文的多肽的一部分，所述多肽包含至少三個ISVD或由其組成，使得所述多肽可以與TNF-α和IL-6特異性地結合。
因此，如在本文的多肽中使用的所述至少三個ISVD的目標分子是TNF-α和IL-6。例子是哺乳動物TNF-α和IL-6。雖然可以使用人類TNF-α（Uniprot登錄號P01375）和人IL-6（Uniprot登錄號P05231），但來自其他物種的形式也適用於本文，例如來自小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物（如食蟹猴（本文也稱為「 cyno」）或駱駝科動物（如美洲駝或羊駝）的TNF-α和IL-6。
可用於本文的與TNF-α或IL-6特異性結合的ISVD的具體例子如以下項目A至C中所述：
A.    與人IL-6特異性結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。
與人IL-6特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體17C04所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目A中定義的CDR），如具有構建體17C04的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 2，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人IL-6特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 2大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR任選地如前述項目A中所定義。在一些實施例中，與IL-6特異性結合的ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
當與IL-6特異性結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目A）時，在一些實施例中，與構建體17C04相比，所述ISVD對人IL-6具有至少一半結合親和力、優選至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
B.     與人IL-6特異性結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
與人IL-6特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體6B12所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目B中定義的CDR），如具有構建體6B12的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 4，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人IL-6特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 4大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR任選地如前述項目B中所定義。在一些實施例中，與IL-6結合的ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
當與IL-6結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目B）時，在一些實施例中，與構建體6B12相比，所述ISVD對人IL-6具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
C.     如下ISVD，其與人類TNF-α特異性地結合並且包含 i.     具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
與人類TNF-α特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體6C11所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目C中定義的CDR），如具有構建體6C11的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和A-2）。
此外，在一個實施例中，與人類TNF-α特異性結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 5大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR任選地如前述項目C中所定義。在一些實施例中，與TNF-α結合的ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
當與TNF-α特異性結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目C）時，與構建體6C11相比，所述ISVD對人類TNF-α具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
在一些實施例中，如上述項目A至C所定義的每一個ISVD被包含在本文的多肽中。在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，包含如上述項目A至C所定義的每一個ISVD的本文的這種多肽對人類TNF-α和人IL-6具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
上述項目A至C中提及的SEQ ID NO是基於根據AbM定義的CDR定義（參見表A-2）。注意，根據Kabat定義（參見表A-2.1）定義相同CDR的SEQ ID NO同樣可以用於上述項目A至C。
因此，可如上所述使用AbM定義在本文中使用的與TNF-α或IL-6特異性結合的特定ISVD也可以如以下項目A’至C’中所述使用Kabat定義進行描述：
A’.   與人IL-6特異性結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 33具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 37具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。
與人IL-6特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體17C04所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目A'中定義的CDR），如具有構建體17C04的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 2，參見表A-1和A-2.1）。
B'.    與人IL-6特異性結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 39具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
與人IL-6特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體6B12所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目B中定義的CDR），如具有構建體6B12的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 4，參見表A-1和表A-2.1）。
C’.   如下ISVD，其與人類TNF-α特異性地結合並且包含 i.     具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 36具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 40具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3， 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
與人類TNF-α特異性結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體6C11所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目C'中定義的CDR），如具有構建體6C11的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 5，參見表A-1和表A-2.1）。
第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的「 序列同一性」的百分比可以如下進行計算：([ 第一胺基酸序列中胺基酸殘基與第二胺基酸序列中相應位置處的胺基酸殘基相同的數量]/[ 第一胺基酸序列中胺基酸殘基的總數量])× 100%，其中與第一胺基酸序列相比在第二胺基酸序列中胺基酸殘基的每個缺失、插入、取代或添加被視為單個胺基酸殘基處（即單個位置處）的差異。
通常，出於根據上文概述的計算方法確定兩個胺基酸序列之間「序列同一性」的百分比的目的，將具有最大胺基酸殘基數量的胺基酸序列作為「第一」胺基酸序列，並將另一個胺基酸序列作為「第二」胺基酸序列。
如本文所用，「胺基酸差異」是指單個胺基酸殘基相對於參考序列的缺失、插入或取代。在一些實施例中，所述胺基酸差異是取代。通常優選與給定參考序列具有較少胺基酸差異。例如，當CDR與給定的SEQ ID NO具有2或1個胺基酸差異時，優選1個胺基酸差異。
在一些實施例中，所述胺基酸取代是保守取代。在一些實施例中，此類保守取代是其中以下 (a) - (e) 組中的一個胺基酸被同一組中的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a) 小的脂族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 極性、帶負電荷的殘基及其（不帶電荷的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 極性、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及 (e) 芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。
在一些實施例中，所述保守取代如下：Ala變成Gly或變成Ser；Arg變成Lys；Asn變成Gln或變成His；Asp變成Glu；Cys變成Ser；Gln變成Asn；Glu變成Asp；Gly變成Ala或變成Pro；His變成Asn或變成Gln；Ile變成Leu或變成Val；Leu變成Ile或變成Val；Lys變成Arg,變成Gln或變成Glu；Met變成Leu,變成Tyr或變成Ile；Phe變成Met,變成Leu或變成Tyr；Ser變成Thr；Thr變成Ser；Trp變成Tyr；Tyr變成Trp；和/或Phe變成Val、變成Ile或變成Leu。 5.2 特異性
術語「 特異性」、「 特異性地結合」或「 特異性結合」是指特定結合單元（如ISVD）可以以足夠高的親和力（參見下文）結合的來自同一生物的不同目標分子（如抗原）的數量。「 特異性」、「 特異性地結合」或「 特異性結合」在本文中與「 選擇性」、「 選擇性地結合」或「 選擇性結合」可互換使用。根據一些實施例，結合單元（如ISVD）與其指定的目標特異性地結合。
可以基於親和力確定結合單元的特異性/選擇性。親和力表示分子相互作用的強度或穩定性。親和力通常通過KD或解離常數給出，單位為莫耳/公升（或M）。親和力也可以表示為締合常數KA，其等於1/KD並且具有（莫耳/公升） -1（或M -1）的單位。
親和力是部分與目標分子上結合位點之間的結合強度的量度：KD值越小，目標分子與靶向部分之間的結合強度越強。
通常，本文中使用的結合單元（如ISVD）將以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低，如10 -7至10 -12莫耳/公升或更低，更特別地如10 -8至10 -12莫耳/公升的解離常數（KD）（即以10 5至10 12公升/莫耳或更高，如10 7至10 12公升/莫耳或更高，並且更特別地如10 8至10 12公升/莫耳的締合常數（KA））與其目標（在室溫下）結合。
大於10 -4莫耳/公升的任何KD值（或小於10 4公升/莫耳的任何KA值）通常被認為指示非特異性結合。
被認為具有特異性的生物學相互作用（諸如免疫球蛋白序列與抗原的結合）的KD通常在10 -5莫耳/公升（10000 nM或10µM）至10 -12莫耳/公升（0.001 nM或1 pM）或更低的範圍內。
因此，特異性/選擇性結合可能意味著，使用相同的測量方法（例如SPR），結合單元（或包含其的多肽）以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與TNF-α和/或IL-6結合，並以大於10 -4莫耳/公升的KD值與相關細胞因子結合。TNF-α的相關細胞因子的例子是TNF超家族成員FASL、TNFβ、LIGHT、TL-1A、RANKL。IL-6的相關細胞因子的例子是IL-6家族成員IL-11、睫狀神經營養因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、抑瘤素M（OSM）、心肌營養素1（CT-1）、心肌營養素樣細胞因子（CLC）和IL-27。因此，在實施例中，多肽中包含的至少一個ISVD以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與TNF-α結合而以大於10 -4莫耳/公升的KD值與相同物種的FASL、TNFβ、LIGHT、TL-1A、RANKL結合，並且多肽中包含的至少兩個ISVD以10 -5至10 -12莫耳/公升或更低的KD值與IL-6結合而以大於10-4莫耳/公升的KD值與相同物種的IL-11、睫狀神經營養因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、抑瘤素M（OSM）、心肌營養素1（CT-1）、心肌營養素樣細胞因子（CLC）、IL-27結合。
因此，在一些實施例中，與由SEQ ID NO: 1的胺基酸組成的多肽相比，本文的多肽對人類TNF-α和人IL-6具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
與來自特定物種的特定目標的特異性結合並不排除結合單元也可以與來自不同物種的類似目標特異性地結合。例如，與人類TNF-α的特異性結合並不排除結合單元（或包含所述結合單元的多肽）也可以與來自食蟹猴的TNF-α特異性地結合。同樣，例如，特異性結合人IL-6不排除結合單元或包含所述結合單元的多肽也可以特異性地結合來自食蟹猴（「cyno」）的IL-6。
結合單元與其指定目標的特異性結合可以以本身已知的任何合適方式來確定，所述方式包括但不限於Scatchard分析和/或競爭性結合測定，諸如放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）和三明治競爭測定法，以及它們在業內本身已知的不同變體；以及本文提及的其他技術。
如熟習此項技術者將清楚的，解離常數可以是實際的或表觀的解離常數。用於確定解離常數的方法對熟習此項技術者將是清楚的，並且例如包括以下提及的技術。在這一方面，還將清楚的是，可能無法測量大於10 -4mol/L或10 -3mol/L（例如為10 -2mol/L）的解離常數。任選地，如熟習此項技術者也清楚的，（實際或表觀）解離常數可以基於（實際或表觀）締合常數（KA）通過關係[KD = 1/KA]來計算。
可以經由本身已知的不同技術（如熟知的表面電漿共振（SPR）生物感測器技術）來測量兩個分子之間的分子相互作用的親和力（參見例如Ober等人 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）。如本文所用，術語「表面電漿共振」是指光學現象，其允許通過檢測生物感測器基質中蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用，其中一個分子被固定在生物感測器晶片上，並且另一個分子在流動條件下通過所固定的分子，從而產生k on、k off測量值，並因此產生K D（或K A）值。例如，這可以使用熟知的BIAcore®系統（BIAcore International AB，一家GE Healthcare公司，烏普薩拉，瑞典和皮斯卡塔韋，新澤西州）進行。關於進一步說明，請參見Jonsson等人（1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26）、Jonsson等人（1991 Biotechniques 11: 620-627）、Johnsson等人（1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131）以及Johnsson等人（1991, Anal. Biochem. 198: 268-277）。
另一種熟知的確定生物分子相互作用的親和力的生物感測器技術是生物膜干涉法（BLI）（參見例如Abdiche等人 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217）。如本文所用，術語「生物膜干涉測量法」或「BLI」是指無標籤光學技術，其分析從以下兩個表面反射的光的干涉圖案：內部參考層（參考光束）和生物感測器尖端上的固定化蛋白質層（訊號光束）。與生物感測器尖端結合的分子的數量變化導致干涉圖案的偏移，報告為波長偏移（nm），其大小是與生物感測器尖端表面結合的分子的數量的直接量度。由於可以即時測量相互作用，因此可以確定締合和解離速率以及親和力。例如，BLI可以使用熟知的Octet®系統（ForteBio, Pall Life Sciences的部門, 門洛派克, 美國）進行。
可替代地，可以在動力學排除測定（KinExA）中測量親和力（參見例如Drake等人 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43），使用KinExA®平臺（Sapidyne Instruments Inc，美國博伊西）。如本文所用，術語「KinExA」是指測量未修飾分子的真實平衡結合親和力和動力學的基於溶液的方法。使抗體/抗原複合物的平衡溶液通過具有用抗原（或抗體）預包被的珠的柱，從而允許游離的抗體（或抗原）與被包被的分子結合。用結合抗體（或抗原）的螢光標記的蛋白完成了對如此捕獲的抗體（或抗原）的檢測。
GYROLAB®免疫測定系統為自動化生物分析和快速樣品周轉提供了平臺（Fraley等人 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。 5.3 （活體內）半衰期延長
所述多肽還可以包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供了增加的（體內）半衰期。體內半衰期延長意指例如所述多肽在投予後在哺乳動物如人受試者中具有增加的半衰期。半衰期可以表示為例如t1/2β。
基團、殘基、部分或結合單元的類型通常不受限制並且可以例如選自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可與血清蛋白結合的結合單元、Fc部分和可與血清蛋白結合的小蛋白質或肽。
更具體地，為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元可以選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。在一些實施例中，所述結合單元可以與人類血清白蛋白結合。在一些實施例中，所述結合單元是ISVD。
例如，WO 04/041865（通過引用以其整體併入）描述了與血清白蛋白（並且特別是針對人類血清白蛋白）結合的Nanobodies®，其可以與其他蛋白質（如與所需目標結合的一或多個其他Nanobodies®）連接，以增加所述蛋白質的半衰期。
國際申請WO 06/122787（通過引用以其整體併入）描述了針對（人類）血清白蛋白的多種Nanobodies®。這些Nanobodies®包括稱為Alb-1（通過引用以其整體併入的WO 06/122787中的SEQ ID NO: 52）及其人類化變異體如Alb-8（通過引用以其整體併入的WO 06/122787中的SEQ ID NO: 62）的Nanobody®。同樣，這些可以用於延長治療性蛋白質和多肽以及其他治療性實體或部分的半衰期。
此外，WO 2012/175400（通過引用以其整體併入）描述了Alb-1的進一步改善形式，稱為Alb-23。
在一個實施例中，所述多肽包含選自Alb-1、Alb-3、Alb-4、Alb-5、Alb-6、Alb-7、Alb-8、Alb-9、Alb-10和Alb-23的血清白蛋白結合部分。在一些實施例中，所述多肽包含如WO 2012/175400的第7-9頁所示的Alb-8或Alb-23或其變異體，以及WO 2012/175741、WO 2015/173325、WO 2017/080850、WO 2017/085172、WO 2018/104444、WO 2018/134235、WO 2018/134234中描述的白蛋白結合物，其每一個通過引用以其整體併入本文。表A-4中還顯示了血清白蛋白結合物的一些非限制性例子。在一些實施例中，本文的多肽包含如項目D中所述的其他組分：
D.    與人類血清白蛋白結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3； 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列。
與人類血清白蛋白結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2中對於構建體ALB23002所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目D中定義的CDR），如具有構建體ALB23002的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 3，參見表A-1和A-2）。
也可以使用Kabat定義將項目D描述為：
D'.    與人類血清白蛋白結合並包含以下項的ISVD i.     具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 34具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 38具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3； 在一些實施例中，CDR1具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列，並且CDR3具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列。
與人類血清白蛋白結合的這種ISVD的非限制性例子具有如表A-2.1中對於構建體ALB23002所示的一或多個或全部架構區（以及如前述項目D’中定義的CDR），如具有構建體ALB23002的完整胺基酸序列的ISVD（SEQ ID NO: 3，參見表A-1和A-2.1）。
此外，在一個實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD的胺基酸序列可以具有與SEQ ID NO: 3大於90%，如大於95%或大於99%的序列同一性，其中CDR任選地如前述項目D中所定義。在一些實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
當與人類血清白蛋白結合的這種ISVD在至少一個CDR中具有相對於相應參考CDR序列的2或1個胺基酸差異（上述項目D）時，與構建體ALB23002相比，所述ISVD對人類血清白蛋白具有至少一半結合親和力、至少相同的結合親和力、或甚至更高的結合親和力，其中使用相同的方法（如SPR）測量結合親和力。
當與人類血清白蛋白結合的這種ISVD具有C末端位置時，其展現出C末端丙胺酸（A）或甘胺酸（G）延伸並且可以選自SEQ ID NO: 52、53、55、57、58、59、60、61、62和63（參見下表A-4）。在一個實施例中，與人類血清白蛋白結合的ISVD具有不同於C末端位置的另一位置（即不是本文的多肽的C末端ISVD）並且選自SEQ ID NO: 3、50、51、54和56（參見下表A-4）。 5.4 核酸分子
還提供了一種編碼本文的多肽的核酸分子。
「核酸分子」（可與「核酸」互換使用）是經由磷酸酯骨架彼此連接以形成核苷酸序列的核苷酸單體的鏈。核酸可以用於轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，例如用於多肽的表現和/或產生。用於產生目的的合適的宿主或宿主細胞對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物體。包含編碼本文的多肽的核酸的宿主或宿主細胞也包括在本文中。
核酸可以是例如DNA、RNA或其雜合體，並且還可以包含（例如化學地）修飾的核苷酸，如PNA。其可以是單鏈或雙鏈DNA。例如，本文的核苷酸序列可以是基因組DNA、cDNA。
本文的核酸可以以本身已知的方式製備或獲得，和/或可以從合適的天然來源中分離。編碼天然存在的(多)肽的核苷酸序列可以例如進行定點誘變，以便提供編碼具有序列變異的多肽的核酸分子。同樣，如熟習此項技術者將清楚的，為了製備核酸，也可以以合適的方式將數個核苷酸序列，諸如至少一個編碼靶向部分的核苷酸序列和例如編碼一或多個連接子的核酸連接在一起。
用於產生核酸的技術對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如包括但不限於自動化DNA合成；定點誘變；組合兩個或更多個天然存在的和/或合成的序列（或其兩個或更多個部分），引入導致截短的表現產物表現的突變；引入一或多個限制性位點（例如，以產生可能易於使用合適的限制性酶消化和/或連接的盒和/或區域），和/或借助使用一或多個「錯配」引物的PCR反應引入突變。 5.5 載體
還提供了一種包含編碼本文的多肽的核酸分子的載體。如本文所用的載體是適用於將遺傳物質攜帶到細胞中的運載體。載體包括裸核酸（如質體或mRNA）或嵌入到更大結構（如脂質體或病毒載體）中的核酸。
載體通常包含至少一種核酸，其任選地與一或多個調節元件（例如像一或多個合適的啟動子、增強子、終止子等）連接。所述載體是表現載體，即適用於在合適的條件下（例如當所述載體被引入（例如人）細胞中時）表現編碼的多肽或構建體的載體。對於基於DNA的載體，其通常包括用於轉錄（例如啟動子和polyA信號）和轉譯（例如Kozak序列）的元件的存在。
在一些實施例中，在所述載體中，所述至少一種核酸和所述調節元件彼此「可操作地連接」，這通常意指它們彼此之間具有功能關係。例如，如果啟動子能夠啟動或以其他方式控制/調節編碼序列的轉錄和/或表現，則所述啟動子被認為與編碼序列「可操作地連接」（其中，所述編碼序列應理解為「在所述啟動子的控制下」）。通常，當兩個核苷酸序列可操作地連接時，它們將在相同的方向上並且通常也在相同的閱讀框中。它們通常也基本上是連續的，儘管這也可能不是必需的。
在一些實施例中，所述載體的任何調節元件使得它們能夠在預期的宿主細胞或宿主生物體中提供其預期的生物學功能。
例如，啟動子、增強子或終止子在預期的宿主細胞或宿主生物體中應是「可操作的」，這意味著例如所述啟動子應能夠啟動或以其他方式控制/調節與其可操作地連接的核苷酸序列（例如編碼序列）的轉錄和/或表現。 5.6 組成物
本文還提供了一種組成物，所述組成物包含至少一種本文的多肽、至少一種編碼本文的多肽的核酸分子或至少一種包含這種核酸分子的載體。所述組成物可以是醫藥組成物。所述組成物還可以包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。 5.7 宿主生物體
本文還涉及宿主細胞或宿主生物體，所述宿主細胞或宿主生物體包含本文的多肽、編碼本文多肽的核酸，和/或包含編碼本文多肽的核酸分子的載體。
合適的宿主細胞或宿主生物對熟習此項技術者將是清楚的，並且是例如任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌（ Escherichia coli）或巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）。在一些實施例中，所述宿主是巴斯德畢赤酵母。 5.8 多肽的方法和用途
本文還提供了一種用於產生本文的多肽的方法。所述方法可以包括用編碼所述多肽的核酸轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，在宿主中表現所述多肽，任選地隨後進行一或多個分離和/或純化步驟。具體地，所述方法可以包括： a)   在合適的表現系統（例如，合適的宿主細胞或宿主生物體或另一個表現系統）中表現編碼所述多肽的核酸序列；任選地接著進行： b)  分離和/或純化所述多肽。
用於產生目的的合適的宿主或宿主生物體對熟習此項技術者將是清楚的，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞系或任何合適的真菌、原核或真核生物體。具體例子包括HEK293細胞、CHO細胞、大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母。在一些實施例中，所述宿主是巴斯德畢赤酵母。
本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物-如所述多肽或包含所述多肽的組成物-可用作藥物。
因此，本文提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物，其用作藥物。
還提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物，其用於（預防性或治療性）治療炎性疾病和/或自體免疫疾病。
還提供了一種治療炎性疾病和/或自體免疫疾病（預防性和/或治療性）方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物。
還提供了本文的多肽、如所述的核酸分子或載體、或包含本文的多肽、核酸分子或載體的組成物在製備醫藥組成物（如用於治療炎性疾病和/或自體免疫疾病的醫藥組成物）中的用途。
所述炎性疾病和/或自體免疫疾病可以是例如類風濕性關節炎、化膿性汗腺炎和結節病。優選地，所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
如在本文的上下文中提及的「受試者」可以是任何動物，如哺乳動物。在哺乳動物中，可以將人類和非人動物區分開。非人動物可以是例如伴侶動物（例如狗、貓）、家畜（例如牛、馬、綿羊、山羊或豬動物）或通常用於研究目的和/或用於產生抗體的動物（例如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、山羊、綿羊、馬、豬、非人靈長類動物（如食蟹猴）或駱駝科動物（如美洲駝或羊駝））。
在預防和/或治療目的的上下文中，所述受試者可以是任何動物，並且更具體地是任何哺乳動物，如人受試者。
包括多肽、核酸分子和載體、或組成物的物質可以通過任何合適的投予途徑投予至受試者，例如通過腸內（諸如口服或直腸）或腸胃外（如表皮、舌下、頰、鼻、關節內、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、經皮或經粘膜）投予。可以使用腸胃外投予，如肌內、皮下或皮內投予。在一些實施例中，使用皮下投予。
可以將有效量的多肽、如所述的核酸分子或載體，或者包含所述多肽、核酸分子或載體的組成物投予於受試者，以便提供預期的治療結果。
可以投予一或多個劑量。如果投予多於一個劑量，則可以以合適的間隔投予劑量，以使所述多肽、組成物、核酸分子或載體的作用最大化。
表 A-0 ： F027201062 配置
名稱 構建塊 1 連接子  構建塊 2 連接子  構建塊 3 連接子  構建塊 4
F027201062 17C04 9GS ALB23002 9GS 6B12 9GS 6C11+A*
* 單個丙胺酸的 C 末端延伸
表 A-1 ：在四價多肽 F027201062 內鑒定的不同單價 V HH 構建塊的胺基酸序列（「 ID 」是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
17C04（抗hIL-6） 2 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSNYAMAWFRQAPGKEREFVAVISYAGGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAVDSPLIATHPRGYDYWGQGTLVTVSS
ALB23002（抗HSA） 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
6B12（抗hIL-6） 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISGSVGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCVRSSWFDCGVQGRDLGNEYDYRGQGTLVTVSS  
6C11（抗hTNF-α） 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVKVSS
表 A-2 ：根據 AbM 編號的 CDR 和架構的序列（ 「 ID 」 是指給出的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
17C04 2 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 18 GRTFSNYAMA 6 WFRQAPGKEREFVA 21 VISYAGGRTY 10 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 25 VDSPLIATHPRGYDY 14 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GFTFRSFGMS 7 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTL 11 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 26 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
6B12 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GFTLAYYAIG 8 WFRQAPGKEREGVS 23 CISGSVGTTY 12 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCVR 27 SSWFDCGVQGRDLGNEYDY 16 RGQGTLVTVSS 31
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTAS 20 GFTFSTADMG 9 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTY 13 YDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 28 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
表 A-2.1 ：根據 Kabat 編號的 CDR 和架構的序列（ 「 ID 」 是指給出的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
17C04 2 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFS 41 NYAMA 33 WFRQAPGKEREFVA 21 VISYAGGRTYYADSVKG 37 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 45 VDSPLIATHPRGYDY 14 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFR 42 SFGMS 34 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTLYADSVKG 38 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 46 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
6B12 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTLA 43 YYAIG 35 WFRQAPGKEREGVS 23 CISGSVGTTYYADSVKG 39 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCVR 47 SSWFDCGVQGRDLGNEYDY 16 RGQGTLVTVSS 31
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFS 44 TADMG 36 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTYYDEPVKG 40 RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 48 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
表 A-3 ：選擇的多價多肽的胺基酸序列（ 「 ID 」 是指給出的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
F027201062 1 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSNYAMAWFRQAPGKEREFVAVISYAGGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAVDSPLIATHPRGYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISGSVGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCVRSSWFDCGVQGRDLGNEYDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVKVSSA
表 A-4 ：結合血清白蛋白的 ISVD 序列（ 「 ID 」 是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
Alb8 50 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb23 51 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb129 52 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb132 53 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb11 54 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb11 (S112K)-A 55 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA
Alb82 56 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb82-A 57 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb82-AA 58 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA
Alb82-AAA 59 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA
Alb82-G 60 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG
Alb82-GG 61 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
Alb82-GGG 62 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG
Alb23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb223 63 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
表 A-5 ：連接子序列（ 「 ID 」 是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
3A連接子 64 AAA
5GS連接子 65 GGGGS
7GS連接子 66 SGGSGGS
8GS連接子 67 GGGGSGGS
9GS連接子 68 GGGGSGGGS
10GS連接子 69 GGGGSGGGGS
15GS連接子 70 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS連接子 71 GGGGSGGGGSGGGGSGGS
20GS連接子 72 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS連接子 73 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS連接子 74 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS連接子 75 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS連接子 76 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1鉸鏈 77 EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1鉸鏈 78 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
美洲駝上部長鉸鏈區 79 EPKTPKPQPAAA
G3鉸鏈 80 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
6 實例 6.1 實例 1 ：野生型抗 IL-6 二價或雙互補位 ISVD 構建體的生成和體外表徵。
與抗IL-6參考mAb 1（針對IL-6的基準單株抗體）相比，當在TF-1增殖測定中檢查時單價抗IL-6 ISVD IL6006B06、IL006B12、IL6007G04、IL6007G05、IL6007G09、IL6010A06、IL6013F12和IL6017C04（描述於WO 2007104529）未顯示出足夠的IL-6阻斷能力。為了提高效力，將抗IL-6 ISVD格式化為雙互補位ISVD構建體。所述構建體中的構建塊通過可撓性35GS或9GS（GlySer）連接子進行遺傳連接。ISVD在大腸桿菌中表現為FLAG3-HIS6標記的蛋白質。經由自動誘導進行表現並允許在30ºC下持續ON。旋轉細胞培養物後，通過凍融沈澱物並重懸於dPBS中來製備周質提取物。這些提取物用作使用Nickel IDA/NTA管柱（Genscript - Atoll）進行固定化金屬親和層析（IMAC）的起始材料。用200 mM醋酸鈉（pH 4）從管柱洗脫ISVD，用TrisHCl（pH 8）中和，然後對dPBS進行脫鹽。
在監測IL-6介導的TF-1細胞增殖的基於細胞的測定中測定抗IL-6 ISVD的抑制效力。為此，將TF-1細胞在補充有10% FBS和1%丙酮酸鈉的RPMI 1640、麩醯胺酸（glutamax）、HEPES培養基（Gibco）中培養。將TF-1細胞以每孔12.500個細胞接種在生長培養基中。添加純化的抗IL-6 ISVD或參考化合物的稀釋系列。在37ºC下培育30 min後，添加75 pM人IL-6（R&D systems目錄號200-IL-200|206-IL）。72小時後，在EnVision Multilabel讀取器（Perkin Elmer）上用CellTiter-Glo（Promega #G7571）測定TF-1細胞的增殖。
某些雙互補位構建體顯示出改善的抗人IL-6效力，並達到了與抗hIL-6參考mAb 1的效力相似的效力（表1）。
另外，生成了通過可撓性35GS（GlySer）連接子遺傳連接的二價抗IL-6 ISVD，並在第二個基於細胞的測定中評價了它們的效力，監測了IL-6在THP-1細胞中誘導的pSTAT3生成。為此，在補充有麩醯胺酸+和10%熱滅活的FBS的RPMI1640培養基中培養THP-1細胞。在接種至白色96孔盤之前，將培養基更換為HBSS，以100.000個細胞/孔的密度接種細胞。將純化的抗IL-6 ISVD或參考抗IL-6 mAb1的稀釋系列與300 pM hIL-6（R&D systems目錄號200-IL-200|206-IL）一起添加並在37ºC下培育20分鐘。隨後，將細胞離心並裂解。將16 µl裂解的細胞上清液與用於pSTAT3和總STAT3的HTRF檢測抗體混合物（PHOSPHO-STAT3（TYR705）KIT, Cisbio #62AT3PE）混合。使用此套組，使用2種不同的特異性抗體（一種用Eu3+-穴狀化合物（供體）標記且另一種用d2（接受者）標記）以夾心式測定形式檢測pSTAT3（Tyr705）。當染料非常接近時，用光源激發供體會觸發朝向接受者的螢光共振能量轉移（FRET），所述接受者轉而發出特定波長（665 nm）的螢光。特定信號與pSTAT3成比例正向調節。pSTAT是在EnVision Multilabel閱讀器（Perkin Elmer）上通過測量665 nm處的吸收來定量並且總STAT3是通過測量620 nm處的吸收來定量。
雖然與單價抗IL-6 ISDV相比，二價構建體的效力沒有顯著增加，但與單價或二價構建體相比，雙互補位抗IL-6 ISVD顯示出顯著的效力增加（表2）。
從該實驗中，選擇11個雙互補位抗IL-6 ISVD以偶聯至抗TNF-α ISVD：IL6013F12-IL6006B06、IL6006B06-IL6017C04、IL6013F12-IL6007G09、IL6006B06-IL6006B12、IL6006B06-IL6010A06、IL6017C04-IL6007G09、IL6006B12-IL6013F12、IL6010A06-IL6007G09、IL6006B12-IL007G09、IL6007G09-IL6006B12或IL6017C04-IL6006B12。
表 1 ：在 TF1 增殖測定中，與參考抗 IL-6 mAb 1 相比，單價和雙互補位抗 IL-6 ISVD 的 IC50 倍數差異。BB= 構建塊
ISVD ID BB1 連接子 BB2 IC50 抗 IL-6 ISVD/IC50 參考抗 IL-6 mAb1 的比率
A007100001 10A06 2909
A007100002 13F12 70
A007100003 17C04 107
A007100005 6B12 77
A007100008 7G09 1489
A007100009 6B06 7
F027200055 7G04 35GS 13F12 5 – 7
F027200062 6B12 35GS 6B06 5 – 9
F027200064 17C04 35GS 7G09 1 – 3
F027200066 10A06 35GS 6B12 2
F027200067 13F12 35GS 6B06 1 – 3
F027200069 10A06 35GS 6B06 2 – 4
F027200070 13F12 35GS 6B12 1 – 2
F027200071 17C04 35GS 6B12 2
F027200072 6B12 35GS 17C04 2
F027200073 6B12 35GS 13F12 2
F027200075 10A06 35GS 7G09 2
F027200076 13F12 35GS 7G09 5
F027200077 13F12 35GS 7G05 6 – 7
F027200078 17C04 35GS 6B06 1 – 2
F027200079 17C04 35GS 7G05 4 – 9
F027200080 6B06 35GS 13F12 2 – 3
F027200081 6B06 35GS 6B12 4 – 6
F027200082 7G05 35GS 17C04 4 – 7
F027200084 7G09 35GS 6B12 2
F027200085 6B06 35GS 17C04 3 – 8
F027200113 6B06 9GS 10A06 2 – 3
表 2 ：在 THP1 pSTAT3 測定中，與參考抗 IL-6 mAb 1 相比，單價、二價和雙互補位抗 IL-6 ISVD 的 IC50 倍數差異。BB= 構建塊
ISVD ID BB1 連接子 BB2 IC50 抗 IL-6 ISVD/IC50 參考抗 IL-6 mAb1 的比率
A007100001 10A06 27
A007100002 13F12 86
A007100003 17C04 14
A007100005 6B12 14
A007100008 7G09 8
A007100009 6B06 22
F027200029 13F12 35GS 13F12 49
F027200030 17C04 35GS 17C04 14
F027200031 6B06 35GS 6B06 25
F027200032 6B12 35GS 6B12 46
F027200035 7G09 35GS 7G09 6
F027200036 10A06 35GS 10A06 13
F027200062 6B12 35GS 6B06 4
F027200064 17C04 35GS 7G09 2
F027200064 17C04 35GS 7G09 2
F027200067 13F12 35GS 6B06 7
F027200069 10A06 35GS 6B06 3
F027200073 6B12 35GS 13F12 6
F027200082 7G05 35GS 17C04 4
F027200084 7G09 35GS 6B12 1
F027200089 7G09 35GS 13F12 6
6.2 實例 2 ：抗 IL-6 單價 ISVD 的序列最佳化
進一步最佳化了抗IL-6 ISVD IL6006B12和IL6017C04的序列。
序列最佳化涉及替代所述序列中的一或多個特定胺基酸殘基，以改善ISVD的一或多種（所需）特性。
這種序列最佳化的一些例子在本文的進一步描述中提及，並且例如而不限於：
親本野生型Nanobody®序列中的取代產生與人類VH3-JH種系共有序列更相同的Nanobody®序列，此過程稱為人類化。為此，將FR中的在Nanobody®與人類VH3-JH種系共有序列之間不同的特定胺基酸（所謂的標誌殘基除外）以使得蛋白質結構、活性和穩定性保持不變的方式改變為人對應物。
取代為美洲駝種系以增加ISVD的穩定性，這被定義為駝類化。為此，將親本野生型Nanobody®胺基酸序列與Nanobody®的美洲駝IGHV種系胺基酸序列進行比對（鑒定為來自Nanobody®針對美洲駝IGHV種系的BlastP分析的最高命中）。
改善儲存過程中的長期穩定性或特性的取代，增加在所需宿主細胞或宿主生物中表現水準的取代，和/或同樣取決於所需的宿主細胞或宿主生物而消除或降低一或多種（不需要的）轉譯後修飾（如糖基化或磷酸化）的取代。為了避免N末端焦麩胺酸形成，通常在不影響效力或穩定性的情況下將E1D突變引入多價奈米抗體的N末端構建塊中。因此，在構建塊的序列最佳化過程中，不會始終引入E1D突變。
位置11處突變為Val和位置89處突變為Leu，以使得結合任何天然存在的預先存在的抗體的活性最小化。
抗IL-6 ISVD IL6006B12的序列最佳化產生了最終序列最佳化的變異體F027201040，與親本ISVD IL6006B12相比，其包含5個胺基酸取代（即L11V、S52aG、S60A、K83R、V89L）。抗IL-6 ISVD IL6017C04的序列最佳化產生了最終序列最佳化的變異體F027200921，與親本ISVD IL6017C04相比，其包含6個胺基酸取代（即E1D、L11V、A14P、D16G、K83R、V89L）。
使用PCR重疊延伸方法從寡核苷酸組裝序列最佳化的變異體。所述變異體在大腸桿菌中表現並通過IMAC和脫鹽純化。通過表面電漿共振評價F027201040的hIL-6結合能力、F027200921在TF1增殖測定中的中和活性。通過尺寸排阻HPLC（SE-HPLC）監測兩個變異體的單體行為。使用Lightcycler（Roche）在熱位移測定（TSA）中測試變異體的熱穩定性。在該測定中，將親本ISVD及其變異體在存在sypro橙的情況下於不同pH下培育，並施加溫度梯度。當ISVD開始變性時，sypro橙結合並且所測量的螢光突然增加，如此可以測定針對特定pH的熔解溫度。結果總結於表3和表4中。
表 3 ：抗 IL-6 ISVD IL6006B12 的序列最佳化變異體 F027201040 的分析結果
ISVD ID 一或多個突變 k off hIL-6 (1/s) pH 7 下 TSA ， Tm （ ºC ） SE-HPLC ，主峰 %
IL6006B12 - 6.5E-05 72 100
F027201040 L11V、S52aG、S60A、K83R、V89L 5.9E-05 79 100
與親本ISVD IL006B12相比，F027201040顯示出在SPR中與IL-6結合的相似解離速率。F027201040的Tm比親本ISVD IL006B12高7ºC。基於AbM定義（參見Kontermann和Dübel (編輯) Antibody Engineering, 第2卷, Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010），對於F027201040的架構區中的架構同一性%為88%，並且基於Kabat定義為86%。
表 4 ：抗 IL-6 ISVD IL6017C04 的序列最佳化變異體的分析結果
ISVD ID 一或多個突變 TF-1 增殖測定 hIL-6 IC50 (M) pH 7 下 TSA ， Tm （ ºC ） SE-HPLC ，主峰 %
IL6017C04 - 3.8E-08 85 99
F027200921 E1D、L11V、A14P、D16G、K83R、V89L 5.5E-08 84 95
F027200921在TF1增殖測定中的效力與WT序列相似。F027200921的Tm比親本ISVD F027200921低1ºC。基於AbM定義，對於F027200921的架構區中的架構同一性%為88%，並且基於Kabat定義為86%。
表 5 ： ISVD 的 IL6006B12 和 IL017C04 序列最佳化形式的胺基酸序列
ISVD ID ISVD 描述 序列
F027200921 IL6017C04（E1D、L11V、A14P、D16G、K83R、V89L） DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSNYAMAWFRQAPGKEREFVAVISYAGGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAVDSPLIATHPRGYDYWGQGTLVTVSS
F027201040 IL6006B12（L11V、S52aG、S60A、K83R、V89L） EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISGSVGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCVRSSWFDCGVQGRDLGNEYDYRGQGTLVTVSS
6.3 實例 3 ：多特異性 ISVD 構建體生成
與TNFα和IL-6結合的含有ISVD的多肽F027201062（SEQ ID NO: 1）的鑒定源自資料驅動的多特異性工程化和格式化活動，其中包括三個抗TNFα VHH構建塊（TNF06C11（WO 2017081320）、TNF01C02（WO 2015173325，SEQ ID NO: 327）和VHH#3（WO 2004041862））以及六個抗IL-6 VHH構建塊（IL6006B06、IL006B12、IL6007G04、IL6007G05、IL6007G09、IL6010A06、IL6013F12和IL6017C04，WO 2007104529）和抗HSA VHH構建塊ALB23002（參見WO 2017134234，SEQ ID NO:10/WO 2018131234）。應用了構建塊的不同位置/取向，並證明這些對於不同參數（效力、交叉反應性、表現等）是至關重要的。對於所有構建體，構建塊之間的連接子保持為9GS，以盡可能最小化預先存在的抗體的結合。
在巴斯德畢赤酵母中轉化包含87種構建體的組（表6）用於小規模生產。通過逐步添加甲醇發生ISVD表現的誘導。將具有分泌的ISVD的澄清培養基用作起始材料以經由蛋白A親和層析純化，接著進行脫鹽。純化的樣品用於表現評價和功能表征。對於後者，通過測定體外TNFα誘導的NFκB啟動的抑制和IL-6誘導的TF-1細胞增殖的抑制來測定效力（如實例8和9中所述）。
另外，在澄清培養基中監測ISVD表現水準。根據以下表現水準標準對構建體進行分類：低 = ＜50 µg/ml，中等 = 51-100 µg/ml，高 = ＞101 µg/ml（表6）。
表 6 ：評價的 87 種不同多特異性 ISVD 形式關於其各自的表現水準、 Nfkb 報告物測定中的 IC50 、 TF1 增殖測定中的 IC50 以及在人與食蟹猴 TNF- α 和 IL-6 之間的效力差異的列表。BB = 構建塊，ALB = ALB23002。nd = 未測定。 表現水準標準：低 = ＜50 µg/ml，中等 = 51-100 µg/ml，高 = ＞101 µg/ml
ISVD 構建體 ID 構建體中的抗 IL-6 雙互補位 ISDV BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 連接子 4 BB5 表現水準 hTNF-α Nfkb 測定 (IC50, M) IC50 食蟹猴 TNFα/hTNFα 比率 hIL-6 TF1 增殖測定 (IC50, M) IC50 食蟹猴 IL-6/hIL-6 比率
F027200926 10A06-7G09 1C02 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 高 4.53E-10 5.9 5.86E-11 1.2
F027200927 10A06-7G09 6C11 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 高 5.93E-11 4.3 7.12E-11 1.0
F027200928 10A06-7G09 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 1C02 高 7.88E-10 4.2 6.89E-11 1.0
F027200929 10A06-7G09 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 高 8.58E-11 3.2 7.38E-11 1.0
F027200930 10A06-7G09 10A06 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS 1C02 9GS ALB 中等 2.98E-11 3.4 7.23E-11 1.0
F027200158 13F12-6B06 1C02 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 6B06 高 1.02E-09 3.3
F027200159 13F12-6B06 6C11 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 6B06 中等 1.30E-10 3.9 3.73E-10 2.4
F027200162 13F12-6B06 13F12 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 1C02 中等 1.04E-09 4.0 2.87E-10 2.5
F027200163 13F12-6B06 13F12 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 6C11 低 1.31E-10 3.6 3.02E-10 2.4
F027200178 13F12-6B06 13F12 9GS 6B06 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 中等 7.8E-11 2.1 4.37E-10 2.2
F027200181 13F12-6B06 13F12 9GS 6B06 9GS VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 低 7.01E-11 3.6 3.14E-10 1.9
F027200202 13F12-6B06 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 13F12 9GS 6B06 中等 8.55E-11 3.2 5.52E-10 2.7
F027200205 13F12-6B06 VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 9GS 13F12 9GS 6B06 中等 8.75E-11 4.6 9.43E-10 2.9
F027200160 13F12-7G09 6C11 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 7G09 高 1.21E-10 3.2 3.41E-10 0.9
F027200161 13F12-7G09 1C02 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 7G09 高 6.34E-10 3.7 2.68E-10 0.8
F027200191 13F12-7G09 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 13F12 9GS 7G09 中等 5.47E-11 3.4 3.05E-10 1.0
F027200195 13F12-7G09 VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 9GS 13F12 9GS 7G09 低 6.46E-11 4.1 3.30E-10 1.0
F027200208 13F12-7G09 13F12 9GS 7G09 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 中等 8.02E-11 3.4 3.80E-10 1
F027200209 13F12-7G09 13F12 9GS 7G09 9GS VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 低 7.24E-11 5.5 3.19E-10 1
F027200214 13F12-7G09 13F12 9GS 7G09 9GS ALB 9GS 6C11 中等 2.02E-10 2.6 3.68E-10 1
F027200771 13F12-7G09 13F12 9GS 7G09 9GS ALB 9GS 1C02 高 7.88E-10 7.2 3.57E-10 0.7
F027201024 17C04-6B06 17C04 9GS 6B06 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 高 1.71E-11 3.8 2.86E-10 1.3
F027201025 17C04-6B06 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 17C04 9GS 6B06 高 1.64E-11 4.5 2.85E-10 1.3
F027201026 17C04-6B06 6C11 9GS ALB 9GS 17C04 9GS 6B06 中等 8.52E-11 2.2 3.03E-10 1.2
F027201027 17C04-6B06 17C04 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 6C11 中等 6.03E-11 2.5 3.17E-10 0.6
F027201028 17C04-6B06 17C04 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 6C11 低 6.10E-11 3.1 2.93E-10 1.1
F027201029 17C04-6B06 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 6B06 中等 6.85E-11 2.0 3.47E-10 0.6
F027201030 17C04-6B06 17C04 9GS 1C02 9GS 6B06 9GS 1C02 9GS ALB 中等 1.91E-11 4.2 3.08E-10 0.6
F027201031 17C04-6B06 1C02 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS 6B06 9GS ALB 中等 2.08E-11 3.3 3.08E-10 0.9
F027201058 17C04-6B12 17C04 9GS 1C02 9GS 6B12 9GS 1C02 9GS ALB 高 4.029E-11 2.3 1.55E-10 0.6
F027201059 17C04-6B12 1C02 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS 6B12 9GS ALB 中等 4.155E-11 2.2 1.35E-10 0.7
F027201062 17C04-6B12 17C04 9GS ALB 9GS 6B12 9GS 6C11 中等 9.784E-11 2.0 1.34E-10 0.5
F027200204 17C04-7G09 VHH#3E 9GS 17C04 9GS VHH#3E 9GS 7G09 9GS ALB 中等 6.37E-11 5.9 7.71E-11 0.7
F027200212 17C04-7G09 17C04 9GS VHH#3E 9GS 7G09 9GS VHH#3E 9GS ALB 低 8.10E-11 5.5 8.21E-11 1
F027200216 17C04-7G09 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 1C02 中等 1.44E-09 6.9 8.90E-11 1
F027200809 17C04-7G09 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 高 1.41E-10 2.3 6.82E-11 0.9
F027200812 17C04-7G09 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 中等 2.06E-10 1.7 7.2E-11 0.7
F027200817 17C04-7G09 1C02 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS ALB 高 6.80E-11 1.6 6.44E-11 1.1
F027200818 17C04-7G09 17C04 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS 1C02 9GS ALB 高 8.91E-11 2.1 8.29E-11 0.9
F027200823 17C04-7G09 1C02 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 高 1.55E-09 4.5 7.81E-11 0.8
F027200153 6B06-10A06 6C11 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 10A06 高 1.39E-10 2.7 1.03E-09 2.5
F027200165 6B06-10A06 6B06 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 1C02 中等 9.94E-10 5.2 5.98E-10 3.9
F027200167 6B06-10A06 6B06 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 6C11 中等 1.71E-10 3.1 1.27E-09 2.5
F027200168 6B06-10A06 6B06 9GS ALB 9GS 10A06 9GS 6C11 中等 1.40E-10 3.3 9.66E-10 1.6
F027200169 6B06-10A06 6B06 9GS ALB 9GS 10A06 9GS 1C02 中等 1.18E-09 3.7 3.82E-10 2.1
F027200179 6B06-10A06 6B06 9GS 10A06 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 中等 7.59E-11 2.0 5.83E-10 2.5
F027200183 6B06-10A06 6B06 9GS 1C02 9GS 10A06 9GS 1C02 9GS ALB 中等 1.03E-10 2.4 4.61E-10 1.6
F027200185 6B06-10A06 6B06 9GS VHH#3E 9GS 10A06 9GS VHH#3E 9GS ALB 低 7.43E-11 4.1 5.98E-10 1.8
F027200192 6B06-10A06 VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 9GS 6B06 9GS 10A06 低 6.85E-11 4.3 8.16E-10 1.9
F027200196 6B06-10A06 VHH#3E 9GS 6B06 9GS VHH#3E 9GS 10A06 9GS ALB 低 7.31E-11 5.8 5.50E-10 1.5
F027200201 6B06-10A06 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 6B06 9GS 10A06 中等 6.80E-11 3.5 6.98E-10 3.0
F027200218 6B06-10A06 1C02 9GS 6B06 9GS 1C02 9GS 10A06 9GS ALB 低 1.02E-10 3.4 7.41E-10 2
F027200219 6B06-10A06 6B06 9GS 10A06 9GS VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 低 7.30E-11 9.6 5.85E-10 2.5
F027200782 6B06-10A06 1C02 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 10A06 中等 9.53E-10 3.32 3.27E-10 3.0
F027200925 6B06-10A06 6C11 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 10A06 高 6.43E-11 4.1 6.1E-10 2.8
F027200154 6B06-17C04 6C11 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 17C04 低 1.64E-10 2.8 4.15E-10 2.1
F027200155 6B06-17C04 1C02 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 17C04 高 1.15E-09 3.1 4.05E-10 2.2
F027200187 6B06-17C04 6B06 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 中等 5.64E-11 2.7 3.43E-10 2.6
F027200189 6B06-17C04 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 6B06 9GS 17C04 中等 5.31E-11 3.1 4.91E-10 2.2
F027200193 6B06-17C04 VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 9GS 6B06 9GS 17C04 低 5.95E-11 4.7 4.23E-10 1.8
F027200210 6B06-17C04 6B06 9GS 17C04 9GS VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 低 7.20E-11 4.8 3.23E-10 2
F027200213 6B06-17C04 6B06 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 1C02 中等 1.53E-09 9.5 2.94E-10 2
F027200215 6B06-17C04 6B06 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 6C11 中等 2.39E-10 2.7 3.02E-10 2
F027200156 6B06-6B12 1C02 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 6B12 中等 1.10E-09 3.5 3.05E-09 9.9
F027200157 6B06-6B12 6C11 9GS ALB 9GS 6B06 9GS 6B12 中等 1.24E-10 4.0 3.33E-09 7.1
F027200164 6B06-6B12 6B06 9GS 6B12 9GS ALB 9GS 1C02 中等 1.12E-09 5.4 2.40E-09 10.3
F027200166 6B06-6B12 6B06 9GS 6B12 9GS ALB 9GS 6C11 中等 1.60E-10 3.3 2.25E-09 10.0
F027200180 6B06-6B12 6B06 9GS 6B12 9GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 中等 7.13E-11 2.9 3.55E-09 2.4
F027200188 6B06-6B12 6B06 9GS 6B12 9GS VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 低 5.58E-11 4.4 2.68E-09 2.7
F027200190 6B06-6B12 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 9GS 6B06 9GS 6B12 低 7.93E-11 3.2 2.77E-09 2.9
F027200194 6B06-6B12 VHH#3E 9GS ALB 9GS VHH#3E 9GS 6B06 9GS 6B12 低 6.47E-11 4.3 2.36E-09 4.4
F027200170 6B12-13F12 6B12 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 6C11 中等 1.09E-10 4.1 9.04E-11 1.2
F027200171 6B12-13F12 6B12 9GS ALB 9GS 13F12 9GS 1C02 中等 8.42E-10 4.5 1.02E-10 1.0
F027200172 6B12-13F12 6C11 9GS 6B12 9GS ALB 9GS 13F12 中等 8.64E-11 4.5 1.12E-10 1.7
F027200173 6B12-13F12 1C02 9GS 6B12 9GS ALB 9GS 13F12 中等 6.27E-10 4.4 1.15E-10 1.7
F027200184 6B12-13F12 6B12 9GS 1C02 9GS 13F12 9GS 1C02 9GS ALB 中等 1.04E-10 2.1 1.06E-10 2.6
F027200186 6B12-13F12 6B12 9GS VHH#3E 9GS 13F12 9GS VHH#3E 9GS ALB 低 6.51E-11 4.8 2.05E-10 3.0
F027200197 6B12-13F12 VHH#3E 9GS 6B12 9GS VHH#3E 9GS 13F12 9GS ALB 低 7.72E-11 5.9 2.56E-10 2.8
F027200198 6B12-13F12 1C02 9GS 6B12 9GS 1C02 9GS 13F12 9GS ALB 低 7.77E-11 2.6 2.51E-10 3.2
F027201056 6B12-7G09 1C02 9GS 6B12 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS ALB 低 3.426E-11 2.2 1.44E-10 0.5
F027201057 6B12-7G09 6B12 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS 1C02 9GS ALB 中等 1.9E-10 2.0 5.77E-10 0.4
F027201060 6B12-7G09 6B12 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 中等 9.995E-11 1.8 1.27E-10 0.4
F027201061 6B12-7G09 6C11 9GS 6B12 9GS ALB 9GS 7G09 高 7.125E-11 2.5 1.47E-10 0.7
F027200981 7G09-6B12 1C02 9GS 7G09 9GS 1C02 9GS 6B12 9GS ALB nd nd 1.86E-10 59.7
F027200983 7G09-6B12 7G09 9GS 1C02 9GS 6B12 9GS 1C02 9GS ALB nd nd 1.38E-10 42.7
F027200987 7G09-6B12 7G09 9GS ALB 9GS 6B12 9GS 6C11 中等 nd 1.43E-10 29.4
F027200989 7G09-6B12 6C11 9GS 7G09 9GS ALB 9GS 6B12 中等 nd 1.27E-10 38.3
取決於化合價、使用的ISVD構建塊以及ISVD構建塊的相對位置，一些構建體顯示出受損的效力和表現。包含抗TNFa ISVD TNF006C11、二價TNF001C02和二價VHH#3E的雙特異性ISVD顯示出與參考抗TNFa mAb（針對TNF-α的基準單株抗體）相似的效力，而包含單價TNF001C02的ISVD的效力比參考抗TNFa mAb低5到25倍。所有包含二價VHH#3E的ISVD都顯示出低表現水準，因此被取消選擇。
包含抗IL-6 ISVD IL6006B06的所有雙特異性ISVD均顯示出效力受損，且6B06-6B12組合表現最差。包含抗IL-6 ISVD IL6013F12的所有雙特異性ISDV在巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）中表現後均顯示出降解，因此無法製造。包含雙互補位抗IL-6 ISVD 10A06-7G09、17C04-7G09、17C04-6B12、6B12-7G09和7G09-6B12的其餘雙特異性ISVD通常顯示出與抗IL-6參考mAb 1相似的效力，但是7G09-6B12對食蟹猴IL-6的交叉反應性大大受損。
隨後，將大組削減成多特異性構建體的較小組，所述組由七個ISVD構建體即F027200809、F027200812、F027200817、F027200927、F027201060、F027201061和F027201062組成，基於初步產量估計證明這些ISVD構建體對兩種目標（人類和食蟹猴）均有效並且具有高表現水準的潛力。選擇了另外三個ISVD構建體即F027200925、F027200926、F027201029，主要基於它們的高表現水準的潛力。然而，後三個構建體對一個目標顯示出高效力，而對另一個目標只有中等效力（表7a）。
ISVD構建體F027200927和F027200925的配置在表7b中給出。
表7c和表7d分別提供了ISVD構建體F027200927和F027200925的每個單獨構建塊的序列。
表7e、表7f、表7g和表7h提供了存在於ISVD構建體F027200927和F027200925（二者均根據AbM和Kabat編號）中每個單獨構建塊中的三個CDR區和四個架構區的序列。最後，表7i提供了ISVD構建體F027200927和F027200925的完整胺基酸序列。
表 7a ：對於 10 種抗 TNFa/ 抗 IL-6 雙特異性 ISVD 的選擇組相比於參考化合物在 Nfkb 測定中的人和食蟹猴 TNFa 以及在 TF1 增殖測定中的人和食蟹猴 IL-6 的中和的 IC50 值。ALB = ALB23002，BB= 構建塊
ISVD 構建體 ID BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 連接子 4 BB5 hTNF-α Nfkb 測定 (IC50, pM) IC50 參考抗 TNF-α mAb/Nb 比率 食蟹猴 TNF-α NFkb 測定 (IC50, pM) hIL-6 TF1 增殖測定 (IC50, pM) IC50 參考抗 IL-6 mAb1/Nb 比率 食蟹猴 IL-6 TF1 增殖測定 (IC50, pM)
F027200809 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 141 0.91 329 68 1.7 61
F027200812 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 206 0.62 360 72 1.7 54
F027200817 1C02 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS ALB 68 0.50 108 64 1.6 69
F027200925 6C11 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 10A06 64 1.43 265 610 14.8 1710
F027200926 1C02 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 453 5.20 2670 59 1.5 72
F027200927 6C11 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 59 4.20 254 71 1.8 72
F027201029 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 6B06 69 0.83 139 347 5.3 209
F027201060 06B12 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 100 0.67 176 127 2.3 49
F027201061 6C11 9GS 06B12 9GS ALB 9GS 7G09 71 0.91 176 147 2.7 101
F027201062 17C04 9GS ALB 9GS 06B12 9GS 6C11 98 0.67 193 134 2.4 65
表 7b ： F027200927 和 F027200925 配置
名稱 構建塊 1 連接子 構建塊 2 連接子 構建塊 3 連接子 構建塊 4
F027200927 6C11 9GS 10A06 9GS ALB23002 9GS 7G09+A*
F027200925 6C11 9GS 6B06 9GS ALB23002 9GS 10A06+A*
* 單個丙胺酸的 C 末端延伸
表 7c ：在四價多肽 F027200927 內鑒定的不同單價 V HH 構建塊的胺基酸序列（「 ID 」是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
6C11（抗hTNF-α） 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVKVSS
10A06（抗hIL-6） 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVSTINWAGSRGYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAASAGGFLVPRVGQGYDYWGQGTLVTVSS
ALB23002（抗HSA） 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
7G09（抗hIL-6） 149 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSLDYYGVGWFRQAPGKEREGVSCISSSEGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDLSDYGVCSRWPSPYDYWGQGTLVKVSS
表 7d ：在四價多肽 F027200925 內鑒定的不同單價 V HH 構建塊的胺基酸序列（「 ID 」是指如本文所用的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
6C11（抗hTNF-α） 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVKVSS
6B06（抗hIL-6） 159 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGIIFSINAMGWYRQAPGKQRELVADIFPFGSTEYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCHSYDPRGDDYWGQGTLVTVSS
ALB23002（抗HSA） 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
10A06（抗hIL-6） 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVSTINWAGSRGYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAASAGGFLVPRVGQGYDYWGQGTLVTVSS
表 7e ：根據 AbM 編號的四價多肽 F027200927 的單獨 V HH 構建塊的 CDR 和架構序列（「 ID 」是指給定的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTAS 20 GFTFSTADMG 9 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTY 13 YDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 28 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
10A06 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GRTFSSYVMG 150 WFRQAPGKEREFVS 156 TINWAGSRGY 151 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 25 SAGGFLVPRVGQGYDY 152 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GFTFRSFGMS 7 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTL 11 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 26 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
7G09 149 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GFSLDYYGVG 153 WFRQAPGKEREGVS 23 CISSSEGDTY 154 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAT 157 DLSDYGVCSRWPSPYDY 155 WGQGTLVKVSS 32
表 7f ：根據 AbM 編號的四價多肽 F027200925 的單獨 V HH 構建塊的 CDR 和架構序列（「 ID 」是指給定的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTAS 20 GFTFSTADMG 9 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTY 13 YDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 28 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
6B06 159 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GIIFSINAMG 160 WYRQAPGKQRELVA 163 DIFPFGSTE 161 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCHS 164 YDPRGDDY 162 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GFTFRSFGMS 7 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTL 11 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 26 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
10A06 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 19 GRTFSSYVMG 150 WFRQAPGKEREFVS 156 TINWAGSRGY 151 YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 25 SAGGFLVPRVGQGYDY 152 WGQGTLVTVSS 29
表 7g ：根據 Kabat 編號的四價多肽 F027200927 的單獨 V HH 構建塊的 CDR 和架構序列（「 ID 」是指給定的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFS 44 TADMG 36 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTYYDEPVKG 40 RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 48 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
10A06 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFS 169 SYVMG 165 WFRQAPGKEREFVS 156 TINWAGSRGYYADSVKG 166 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 45 SAGGFLVPRVGQGYDY 152 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFR 42 SFGMS 34 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTLYADSVKG 38 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 46 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
7G09 149 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSLD 175 YYGVG 167 WFRQAPGKEREGVS 23 CISSSEGDTYYADSVKG 168 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAT 170 DLSDYGVCSRWPSPYDY 155 WGQGTLVKVSS 32
表 7h ：根據 Kabat 編號的四價多肽 F027200925 的單獨 V HH 構建塊的 CDR 和架構序列（「 ID 」是指給定的 SEQ ID NO ）
構建塊 ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 ID
6C11 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFS 44 TADMG 36 WFRQAPGKGREFVA 24 RISGIDGTTYYDEPVKG 40 RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRS 48 PRYADQWSAYDY 17 WGQGTLVKVSS 32
6B06 159 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGIIFS 173 INAMG 171 WYRQAPGKQRELVA 163 DIFPFGSTEYADSVKG 172 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCHS 174 YDPRGDDY 162 WGQGTLVTVSS 29
ALB23002 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFR 42 SFGMS 34 WVRQAPGKGPEWVS 22 SISGSGSDTLYADSVKG 38 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI 46 GGSLSR 15 SSQGTLVTVSS 30
10A06 148 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFS 169 SYVMG 165 WFRQAPGKEREFVS 156 TINWAGSRGYYADSVKG 166 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA 45 SAGGFLVPRVGQGYDY 152 WGQGTLVTVSS 29
表 7i ：選擇的多價多肽 F027200927 和 F027200925 的胺基酸序列（ 「 ID 」 是指給定的 SEQ ID NO ）
名稱 ID 胺基酸序列
F027200927 147 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVSTINWAGSRGYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAASAGGFLVPRVGQGYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSLDYYGVGWFRQAPGKEREGVSCISSSEGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCATDLSDYGVCSRWPSPYDYWGQGTLVKVSSA
F027200925 158 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGIIFSINAMGWYRQAPGKQRELVADIFPFGSTEYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCHSYDPRGDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVSTINWAGSRGYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAASAGGFLVPRVGQGYDYWGQGTLVKVSSA
在巴斯德畢赤酵母中進行了包含11種ISVD構建體的組的較大規模的2L和5L生產，以進行表現產量測定，評估生物物理學特性。已證實，需要抗IL-6構建塊與抗TNF-α構建塊的特定組合以獲得高表現產量以及足夠的溶解度和生物物理學穩定性。這在表8中舉例說明。例如，除了第三個位置上的一個構建塊外在組成上非常相似的構建體F027201062和F027200812顯示出顯著不同的表現和溶解度曲線。
表 8 ： 10 種抗 TNFa/ 抗 IL-6 雙特異性 ISVD 的選擇組在最高濃度下的表現產量、溶解度和生物物理特性。ALB = ALB23002，BB= 構建塊, SVP顯微鏡下可見的顆粒，HMW = 高分子量，nd = 未測定
ISVD 構建體 ID BB1 連接子 1 BB2 連接子 2 BB3 連接子 3 BB4 連接子 4 BB5 2 L 發酵罐的表現產量（ g/L ） 溶解度（ mg/ml ）
F027200809 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 3.6 ＜50
F027200812 17C04 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 2.5 ＜50
F027200817 1C02 9GS 17C04 9GS 1C02 9GS 7G09 9GS ALB 3.5 132
F027200925 6C11 9GS 6B06 9GS ALB 9GS 10A06     6.7 124
F027200926 1C02 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09     5.4 141 HMW形成 5ºC
F027200927 6C11 9GS 10A06 9GS ALB 9GS 7G09 5.1 112 相分離和凝膠形成
F027201029 6C11 9GS 17C04 9GS ALB 9GS 6B06     6.4 152 凝膠形成
F027201060 06B12 9GS ALB 9GS 7G09 9GS 6C11 6.5 153 凝膠形成
F027201061 6C11 9GS 06B12 9GS ALB 9GS 7G09 4.9 152 凝膠形成
F027201062 17C04 9GS ALB 9GS 06B12 9GS 6C11 5.1 149
最後，選擇ISVD構建體F027201062進行進一步表徵，因為它在效力和CMC特徵（例如溶解度和表現）方面具有良好的綜合性能。 實例 4 ：多特異性 ISVD 構建體：與 TNF- α 、 IL-6 和血清白蛋白的結合親和力
F027201062對人類和食蟹猴TNF-α和IL-6以及人類、食蟹猴和小鼠血清白蛋白（SA）的親和力（表示為平衡解離常數（KD））在Gyrolab xP工作站（Gyros）上借助溶液內親和力測量來定量。
在KD控制的測量下，將TNF-α或IL-6（範圍為1.3 µM - 0.1 pM）或人或食蟹猴SA（範圍為13 µM - 1 pM）或小鼠SA（範圍為133 µM -30 pM）的系列稀釋液以及固定量的F027201062（在TNF-α的情況下為80 pM、在IL-6的情況下為20 pM、在人和食蟹猴SA的情況下為300 pM以及在小鼠SA的情況下為600 pM）混合以允許相互作用並培育48或72小時（在IL-6和TNF-α的情況下）或2小時（在SA的情況下）以達到平衡。
在受體控制的測量下，將TNF-α或IL-6（範圍為1.3 µM - 0.1 pM）或人和食蟹猴SA（範圍為13 µM - 1 pM）或小鼠SA（範圍為133 µM -30 pM）的系列稀釋液以及固定量的F027201062（在TNFα的情況下為30 nM、在IL-6的情況下為5 nM、在人和食蟹猴SA的情況下為1 µM以及在小鼠SA的情況下為2 µM）混合以允許相互作用並培育48或72小時（在IL-6和TNFα的情況下）或2小時（在SA的情況下）以達到平衡。
生物素化人類TNF-α/IL-6/血清白蛋白被捕獲在Gyrolab Bioaffy 1000 CD的微結構中，所述微結構含有珠的柱並用作分子探針以從平衡溶液捕獲游離F027201062。使TNF-α/IL-6/血清白蛋白和F027201062的混合物（含有游離TNF-α/IL-6/血清白蛋白、游離F027201062和TNF-α/IL-6/血清白蛋白-F027201062複合物）流過珠，並捕獲少量百分比的游離F027201062，其與游離ISVD構建體濃度成比例。然後注射螢光標記的抗VHH抗體ABH0086-Alexa647以標記任何捕獲的F027201062，並在沖洗掉過量的螢光探針後，測定螢光的變化。使用Gyrolab Analysis軟體完成稀釋系列的擬合，其中分析KD控制和受體控制的曲線以確定KD值。結果（表9）證實多特異性ISVD構建體以高親和力結合人類/食蟹猴IL-6和人類/食蟹猴TNF-α。
表 9 ： F027201062 與人類和食蟹猴 TNF- α 和 IL-6 以及人類、食蟹猴和小鼠血清白蛋白（ SA ）的結合親和力。
抗原    人類 K D(pM) 食蟹猴 K D(pM) 小鼠 K D(pM)
TNF-α n=1 5.7 53.8 /
n=2 5.2 23.7
n=3 9.9 25.9
IL-6 n=1 7.3 13.7 /
n=2 5.3 3.0
n=3 3.0 6.2
SA n=1 7600 6700 58500
n=2 6400 4900 62200
n=3 6200 6100 56000
6.4 實例 5 ：多特異性 ISVD 構建體與膜結合 TNF α 的結合
在表現人膜TNFα的HEK293H細胞上使用流式細胞術證明F027201062與膜結合的TNFα的結合。簡言之，用PBS中的4%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定細胞（以增加對膜結合的TNFα的檢測）。隨後，將細胞以1 × 10 4個細胞/孔的密度接種，並在不存在或存在30 µM HSA的情況下與從100 nM開始直到0.5 pM的F027201062或抗TNFα參考mAb的稀釋系列一起培育，在室溫下持續24小時。將細胞洗滌3次，隨後與抗VHH mAb（ABH00119）在4ºC下一起培育30 min，再次洗滌，並且與山羊抗小鼠或抗人PE標記的抗體在4ºC下一起培育30 min。將樣品洗滌並重懸於FACS緩衝液（含10% FBS和0.05%疊氮化鈉的D-PBS，補充有5 nM TOPRO3）中。然後在iQuescreener上分析細胞懸浮液。使用GraphPad Prism計算EC50值。F027201062和抗TNFα參考mAb的EC50值是可比較的（表10）。
表 10 ：與抗 hTNF α 參考 mAb 相比，在 24 小時的培育後， F027201062 對膜表現的 TNF α 的結合親和力。
條件 +HSA -HSA
n = 1 2 3 1 2 3
樣品 ID F027201062
EC50 (M) 3.10E-10 2.90E-10 3.60E-10 1.20E-10 1.80E-10 1.70E-10
樣品 ID 參考抗 TNFa mAb
EC50 (M) 3.3E-11 2.93E-11 1.95E-11 3.8E-11 nd 9.80E-12
6.5 實例 6 ：多特異性 ISVD 構建體與 TNF- α 和 IL-6 選擇性地結合
通過SPR（Proteon XPR36）評估與TNF-α和IL-6相關人類目標的結合的不存在。作為IL-6相關的細胞因子或共用gp130受體的細胞因子，評估了人IL23、IL27、CNTF、抑瘤素M（OSM）和IL11。測試作為TNFα相關細胞因子的TNF超家族成員人類FASL、TNFβ、LIGHT、TL-1A、RANKL。
為此，使用胺偶聯將目標以25 μg/mL固定在proteon GLC感測器晶片上持續200 s，其中注射EDC/NHS 80秒用於啟動，並注射1 M乙醇胺HCl 150秒用於失活（ProteOn Amine Coupling Kit，目錄號176-2410）。將啟動、失活和配體注射期間的流速設為30 µl/min。通過從每種配體的pI減去約1.5來選擇10 mM乙酸鹽固定緩衝液的pH。接下來，將300 nM的F027201062注射2分鐘，並以45 µL/min的流速解離600 s。使用PBS（pH 7.4） + 0.005% Tween 20作為運行緩衝液。作為陽性對照，注射0.3 μM α-IL11 Ab、α-OSM Ab、α-CNTF Ab、α-IL27 Ab、α-IL27A Ab、α-IL23 p19 Ab、α-hFASL Ab、0.3 μM α-hTNFβ Ab、0.5μM α-hLIGHT Ab、0.3μ M α-hTL-1A Ab和0.5 µM α-hRANKL VHH。
F027201062和陽性對照與固定化目標之間的相互作用是通過檢測折射率的增加來測量，所述折射率的增加是由於結合後晶片上的品質變化而發生的。
所有陽性對照確實與其各自的目標結合。未檢測到ISVD構建體F027201062與人類TRAIL、CD30L、CD40L、FASL、TNF、LIGHT、TL-1A、RANKL、IL23、IL27、CNTF、抑瘤素M和IL11的結合。 6.6 實例 7 ：多特異性 ISVD 構建體與 hIL-6 、 hTNFa 和 HSA 的同時結合
使用Biacore 8K+儀器測定ISVD構建體F027201062是否可以與重組可溶性hTNF-α和hIL-6同時結合。為此，經由胺偶聯將HSA固定在CM5感測器晶片上至約1600 RU的水準。將100 nM的F027201062以10 μΙ/min在HSA表面上注射2 min，以經由ALB23002構建塊捕獲ISVD構建體。隨後以45 µl/min的流速注射100 nM hIL-6、hTNF-α或hOX40L或者100 nM IL-6 + 100 nM TNFα、100 nM IL-6 + 100 nM OX40L或100 nM TNF-α + 100 nM OX40L的混合物2分鐘，隨後進行後續600秒的解離步驟。通過將HCI（100 mM）以45 μΙ/min注射2分鐘來再生HSA表面。傳感圖（圖1）展現出ISVD構建體F027201062可以同時結合hIL-6和hTNF-α，如在HSA上捕獲後回應單位的增加所顯示：從僅hTNF-α增加約150 RU，從僅hIL-6增加約120 RU，並且對於IL-6和TNF-α混合物增加約340 RU。 6.7 實例 8 ：多特異性 ISVD 構建體在體外對 TNF- α 誘導的 NFkB 啟動的抑制
HEK293_NFκB-NLucP細胞是表現TNF受體的細胞，其被在NFκB依賴性啟動子控制下的編碼Nano螢光素酶的報告物構建體穩定轉染。所述細胞與可溶人和食蟹猴TNF-α的培育導致NFκB介導的Nano螢光素酶基因表現。使用添加到細胞上的以1 : 50比率與裂解緩衝液混合的Nano-Glo螢光素酶底物來測量Nano螢光素酶發光。樣品在搖床上混合5 min以獲得完全裂解。將Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP細胞以20000個細胞/孔接種於白色組織培養（TC）處理的具有透明底部的96孔盤中的正常生長培養基中。將F027201062或抗TNF-α參考mAb的稀釋系列添加到25 pM人類或70 pM食蟹猴TNF-α中，並在30 µM HSA存在下於37ºC下與細胞培育5小時。
F027201062以濃度依賴性方式抑制人和食蟹猴TNF-α誘導的NFκB啟動，其中平均IC50為53 pM（對於人類TNF-α）和158 pM（對於食蟹猴TNF-α），與參考化合物抗hTNF-α mAb是可比的（表11，圖2）。陰性對照ISVD即IRR00096未顯示抑制。
表 11 ：相比於抗 TNFα 參考 mAb ，在 Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP 報告物測定中， F027201062 介導的人類和食蟹猴 TNFα 中和的 IC50 和 IC90 值。
F027201062
人類 TNF-α 食蟹猴 TNF-α  
n=1 n=2 n=3 n=1 n=2 n=3  
IC50 (M) 7.57E-11 2.57E-11 5.86E-11 1.60E-10 8.37E-11 2.30E-10  
IC90 (M) 3.61E-10 2.70E-10 4.60E-10 6.98E-10 7.50E-10 1.45E-09  
抗 TNF-α 參考 mAb
人類 TNF-α 食蟹猴 TNF-α  
n=1 n=2 n=3 n=1 n=2 n=3  
IC50 (M) 5.54E-11 5.92E-11 5.90E-11 8.45E-11 1.05E-10 1.28E-10  
IC90 (M) 2.97E-10 4.09E-10 3.42E-10 4.38E-10 8.85E-10 8.40E-10  
6.8 實例 9 ：多特異性 ISVD 構建體對 IL-6 誘導的 TF-1 細胞增殖的抑制
在監測IL-6介導的TF-1細胞增殖的基於細胞的測定中測定F027201062的抑制效力。為此，將TF-1細胞在添加有10% FBS和1%丙酮酸鈉的RPMI 1640、麩醯胺酸（glutamax）、HEPES培養基（Gibco）中培養。將TF-1細胞以每孔12.500個細胞接種在生長培養基中。添加純化的抗IL-6 ISVD或參考化合物的稀釋系列。在37ºC下培育30 min後，添加75 pM人IL-6（R&D systems目錄號200-IL-200|206-IL）或食蟹猴IL-6（Evotek，目錄號APP-7634）。72小時後，在EnVision Multilabel讀取器（Perkin Elmer）上用CellTiter-Glo（Promega #G7571）測定TF-1細胞的增殖。
F027201062以濃度依賴性方式抑制人類和食蟹猴IL-6誘導的TF-1細胞增殖，其中平均IC50為34 pM（對於人IL-6）和56 pM（對於食蟹猴IL-6），這與抗IL-6參考mAb 1是可比較的並且優於抗IL-6 參考mAb 2（表12，圖3）。
表 12 ：與抗 IL-6 參考化合物相比， F027201062 介導的對人和食蟹猴 IL-6 誘導的 TF-1 細胞增殖的抑制的 IC50 和 IC90 值
F027201062
人 IL-6 食蟹猴 IL-6  
n=1 n=2 n=3 n=1 n=2 n=3  
IC50 (M) 1.36E-10 4.62E-11 4.23E-11 6.46E-11 5.92E-11 4.34E-11  
IC90 (M) 3.75E-10 9.63E-11 8.10E-11 2.15E-10 1.97E-10 1.68E-10  
參考抗 IL-6 mAb1
人 IL-6 食蟹猴 IL-6  
n=1 n=2 n=3 n=1 n=2 n=3  
IC50 (M) 不確定 2.78E-11 3.30E-11 3.19E-11 3.06E-11 3.18E-11  
IC90 (M) 不確定 4.48E-11 5.70E-11 7.50E-11 7.45E-11 7.08E-11  
參考抗 IL-6 mAb2
人 IL-6 食蟹猴 IL-6  
n=1 n=2 n=3 n=1 n=2 n=3  
IC50 (M) 1.55E-10 5.51E-11 5.73E-11 7.86E-11 5.85E-11 5.47E-11  
IC90 (M) 1.54E-09 7.35E-10 3.80E-10 5.06E-10 4.58E-10 3.48E-10  
6.9 實例 10 ：與預先存在的抗體結合的多特異性 ISVD 構建體
使用ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories, Inc.）在正常人類血清（n = 96）中評估了ISVD構建體F027201062對預先存在的抗體的反應性。將PBS/Tween（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，0.005% Tween20）用作運行緩衝液，並且在25ºC下進行實驗。
ISVD經由ALB23002構建塊與固定在晶片上的HSA結合而被捕獲在晶片上。為了固定HSA，用EDC/NHS（流速30 μl/min）啟動ProteOn GLC感測器晶片的配體道，並將HSA以100 μl/ml注射在pH 4.5的ProteOn乙酸鹽緩衝液中，以實現大約2500 RU的固定化水準。固定後，用乙醇胺鹽酸鹽（流速30 μl/min）使表面失活。
隨後，將ISVD構建體以45 μl/min注射在HSA表面上持續2 min，以實現大約800 RU的ISVD捕獲水準。將含有預先存在的抗體的樣品以14,000 rpm離心2分鐘，並將上清液在PBS-Tween20（0.005%）中以1 : 10稀釋，然後以45 μl/min注射2分鐘，接著進行隨後的400秒解離步驟。在每個迴圈後（即在新的ISVD捕獲和血液樣品注射步驟之前），通過將HCl（100 mM）以45 μl/min注射2分鐘來再生HSA表面。在通過減去 1) ISVD-HSA解離和 2) 與參考配體道的非特異性結合的兩次參比後，獲得顯示預先存在的抗體結合的傳感圖。通過將報告點設置為125秒（締合結束後5秒）來測定預先存在的抗體的結合水準。相對於參考ISVD在125秒時的結合水準，計算預先存在的抗體結合的降低百分比。
與對照的未最佳化五價ISVD構建體F027301186相比，針對通過在每個構建塊中引入突變L11V和V89L以及C末端丙胺酸減少預先存在的抗體結合進行最佳化的四價ISVD構建體F027201062顯示出與預先存在的抗體的結合顯著減少（圖4）。 6.10 實例 11 ：用鼠抗 TNF- α 和抗 IL-6 替代抗體的組合持續長期緩解鼠膠原蛋白誘導的關節炎
類風濕性關節炎是一種攻擊周圍關節的破壞性自體免疫疾病。膠原蛋白誘導的關節炎（CIA）小鼠模型正在重現所述糜爛性疾病。為了引發針對關節組分的免疫反應，將易感DBA/1小鼠用100 µg輔助雞膠原蛋白II免疫兩次。針對膠原蛋白II產生的免疫反應將擴散到內源性關節軟骨並導致臨床上明顯的關節炎。在第21天進行第二次免疫後，進行性關節炎變得明顯，表現為腳踝和足掌腫脹、紅斑並且有時還表現為關節僵硬。通過如下表13中詳述的評分系統對四隻足掌中的每隻足掌的關節炎嚴重程度進行臨床評估。
表 13 用於確定關節炎表型嚴重程度的關節炎評分系統
關節炎得分 1 特徵
0 未檢測到臨床症狀
1 輕度 腳踝或足掌腫脹
2 中度 腳踝和足掌腫脹、輕度紅斑
3 重度 腳踝和足掌嚴重腫脹、嚴重紅斑、關節僵硬
1圖5中在y軸上的關節炎得分：單獨爪得分的總和。最大總分 4 x 3 = 12。
為了評估組合的TNF和IL-6阻斷對疾病嚴重程度和進展的影響，用針對鼠TNF、鼠IL-6或二者的組合的阻斷抗體治療N=13隻免疫雄性DBA/1小鼠。每週兩次通過腹膜內注射對小鼠進行治療，從第一次免疫後第22天開始並持續至第55天。如圖5所示，臨床關節炎從第21天開始逐漸發展。與單獨使用同種型對照抗體或抗muIL-6治療的小鼠相比，用抗muTNF或抗muTNF和抗muIL-6的組合治療的小鼠具有延遲和較不嚴重的關節炎進展。在第55天停止治療後，在單獨使用抗muTNF治療的小鼠中可觀察到疾病反彈，迅速達到與同種型對照或抗muIL-6可比較的嚴重程度。然而，用抗muTNF和抗muIL-6的組合治療的小鼠沒有反彈成關節炎進展並且儘管停止治療也保持反應。圖6顯示了整個研究持續時間內、治療期內和脫離治療期內的隨時間而變的關節炎得分曲線下面積的分析。後者被組合治療顯著抑制，表明了對疾病進展的持續影響。
該模型中的關節炎是通過對膠原蛋白II疫苗的抗體反應引發的。在d91，通過ELISA測定抗膠原蛋白II抗體的血漿水準。如圖7所示，所有治療都降低了抗膠原蛋白II抗體滴度，其中抗muTNF和抗muIL-6二者治療的小鼠中的數值降低最大。
在第91天處死小鼠後收集後足掌，並處理蹠骨關節以用於關節炎的組織學評價。蘇木精和伊紅以及番紅-O染色切片的評分是在0-5的範圍內以設盲方式跨越4個方面進行（表14）。
表 14 ：關節炎組織學評分系統
組織學得分 * 特徵
炎症 1 免疫細胞對滑膜和/或鄰近區域的浸潤最少 2 輕度浸潤、少於3個受累關節 3 中度浸潤，3-4個受累關節、結締組織腫脹 4 在大多數關節中嚴重浸潤 5 在所有關節中非常嚴重的浸潤
血管翳形成 1 周圍區域中血管翳形成最少、僅1個受累關節 2 輕度血管翳形成、1-3個關節 3 中度血管翳形成、1-3個關節 4 在大多數關節中嚴重的血管翳形成、關節變形 5 在所有關節中非常嚴重的血管翳形成、關節變形
軟骨破壞 1 最少的蛋白聚糖損失（番紅-O染色）、僅1個受累關節 2 蛋白聚糖損失、多達3個受累關節 3 許多關節處大部分蛋白聚糖丟失 4 嚴重的蛋白聚糖損失、粗糙的表面、壞死的軟骨細胞 5 沒有剩餘的軟骨
骨破壞 1 僅在高放大倍數下可見的最小骨吸收 2 低放大倍數下可見的輕度骨吸收 3 在某些皮質表面的中度骨吸收 4 所有皮質表面的嚴重骨吸收 5 骨變形
*關節炎得分在圖8中的y軸上。
如圖8所示，在用抗muTNF和抗muIL-6的組合治療的小鼠中，實現了血管翳形成和骨破壞的組織學得分相對於同種型對照抗體的統計學上顯著的改善。
總之，這些資料表明組合治療阻斷TNF以及IL-6炎性途徑二者的治療效力最高。重要的是，即使在沒有積極治療的情況下，組合治療也能產生持續的反應。 6.11 實例 12 ：來自用抗 TNF- α 、抗 IL6 和組合的抗 TNF- α /IL6 治療的 CIA （膠原蛋白誘導的關節炎）模型的 RNA-seq 資料分析
使用RNAeasy套組（Qiagen）純化來自CIA小鼠前足掌組織樣品的總RNA，並在柏林ATLAS Biolabs GmbH的NovaSeq平臺（Illumina）上進行2x51-6600萬個讀段的配對末端測序。使用OmicsSoft studio套裝軟體10.01.118版（Qiagen）對RNA-seq原始資料進行生物資訊學分析。使用OmicSoftGenCode.V19作為基因模型，小鼠B.38作為參考基因組且OSA4作為比對物，將RNA-seq讀段（fastq文件）針對小鼠基因組作圖。
差異表現的基因（ DEG ）的威恩分析
圖9（A）中的卞氏圖表顯示了CIA模型中從抗TNF-α、抗IL6和組合抗TNF-α/IL6治療鑒定的DEG的重疊。通過使用DESeq2統計檢定（Love, M.I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 2014;15(12):550）比較來自用標準常規抗TNF-α抗體（n = 13個樣品）、標準常規抗IL6抗體（MP5-20F3；n = 13）和組合的抗TNF-α/抗IL-6抗體（n = 13）治療的RNA-seq樣品組與來自同種型治療（IgG對照；n = 13）的樣品來確定DEG。根據Benjamini-Hochberg（BH-FDR），log2倍數變化＞ 1、2且調整後的p值 ＜ 0,05的DEG被認為是顯著的。從DEG的數量來看，威恩分析表明了組合的抗TNF-α/IL-6治療相對於用抗TNF-α或抗IL-6的單一治療的累加作用。
差異表現的基因（ DEG ）的途徑作圖
圖9（B）中的途徑圖顯示了使用來自Ingenuity（Qiagen）和MetaCore（Clarivate）的組合籌畫生物知識庫對DEG進行基因組富集分析所得的前20個經典途徑。使用DESeq2通過比較來自同種型治療的樣品（IgG對照組，n = 13）與未治療的無膠原蛋白誘導的關節炎的樣品（未治療組，n = 4）來確定來自膠原蛋白誘導的關節炎（CIA）的DEG。使用DESeq2通過比較來自抗TNF-α/IL-6的樣品（XT.3 + MP5-20F3；n = 13）與來自同種型治療的樣品（IgG對照組，n = 13）來確定來自組合的抗TNF-α/IL-6治療的DEG。兩張圖中的代謝和免疫訊號傳導途徑顯示膠原蛋白誘導的關節炎和組合的抗TNF-α/IL6治療在不同的錯誤發現率（FDR）下的相反得分。 6.12 實例 13 ：類風濕性關節炎的定量系統藥理學（ QSP ）模型預測 F027201062 在較低劑量下增加的緩解（與抗 hTNF- α 和抗 hIL-6 參考 mAb 相比）
申請人開發了一種專有的類風濕性關節炎（RA）定量系統藥理學模型，該模型考慮了血液和滑膜中的相關組織、細胞和介導物。所包含的生物相互作用的機制細節通過廣泛的體外資料進行了參數化，所述體外資料來自內部和公開的外部來源。之後，所述模型通過使用甲胺蝶呤、JAK抑制劑、抗IL-6R、抗IL-6、抗TNF治療的各種研究的臨床資料進行了測試和驗證。
基於該模型，在52週的治療時間內，模擬了患有中度至嚴重類風濕性關節炎的普通患者由於滑膜中疾病活動降低而導致的DAS28-CRP降低。奈米抗體F027201062能夠同時結合TNF-α和IL-6，並且實現了與每2週20 mg劑量的單一療法相比更高的DAS28-CRP降低，並預測參考患者在24週後實現DAS28-CRP緩解。奈米抗體模擬考慮了從動物和體外資料預測的人藥動學。對於目標結合，來自細胞測定的體外IC50資料與公佈的抗hTNF和抗hIL-6比較物mAb的目標結合參數一起用於計算奈米抗體的目標結合參數（圖10）。 6.13 實例 14 ：抗 TNF-α 和抗 IL-6 在人類 RA -FLS/T 細胞共培養模型中對 MMP-1 和 G-CSF 的累加功效
開發了類風濕性關節炎的體外模型，其類比患者關節中TNF-α和IL-6的濃度。簡言之，將來自類風濕性關節炎患者的成纖維細胞樣滑膜細胞（RA-FLS）與來自健康人類供體的CD4+ T細胞共培養。另外的刺激誘導TNF-α和IL-6的內源性分泌。用抗hTNF-α和抗hIL-6參考mAb治療部分降低了MMP-1和G-CSF的分泌，而組合以及F027201062實現了更強的最大抑制。
下面描述了反映IL-6跨信號傳導的測定的詳細方案：
將RA-FLS以10.000個細胞/孔的密度以96孔形式接種在具有生長補充劑（Pelobiotech）的滑膜細胞基礎培養基中。第二天，使用Ficoll梯度離心從健康人供體的血液分離出PBMC。使用磁分離（陰性選擇）從PBMC分離出CD4+ T細胞。
將RA-FLS培養基用具有相應濃度的同種型對照、比較物抗體和ISVD的培養基（從200 nM以1 : 10稀釋，6種濃度，一式三份）代替。IgG1同種型對照用作比較物抗體的陰性對照，而VHH IRR00119用作ISVD同種型陰性對照。抗人類TNF-α和抗人IL-6參考抗體用作比較物。此外，將兩種比較物的全劑量的組合用作另外的陽性對照並顯示累加功效。在該模型中評價了以下ISVD構建體：F027200926和F027201062。所有構建體的板內位置在三次重複實驗之間變化以避免板效應。
之後將100.000個CD4+ T細胞（在具有生長補充劑的滑膜細胞基礎培養基中）添加到FLS。最後，用100 ng/ml人重組IL-17A、100 ng/ml sIL-6R和100 ng/ml可溶性抗CD3刺激該共培養物48 h。48 h後將細胞離心並收集上清液並在-20ºC下儲存。使用Luminex技術測量MMP-1和G-CSF水準。對抗hTNF-α比較物mAb沒有反應的供體（其無法證明ISVD構建體的累加功效和雙重靶向）被排除在外。
在用IL-17A、sIL-6R和抗CD3刺激48 h後測量TNF-α和IL-6的內源性分泌。受刺激的共培養物誘導了增加的TNF-α（沒有低於檢測限的刺激）和IL-6分泌。受刺激的共培養物分泌4.4 pg/ml IL-6和7977 pg/ml TNF-α（8個供體的平均值，圖11）。這些值與從不同出版物收集的人類風濕性關節炎關節的中值是可比較的：24 ± 21pg/ml TNF-a和13400 ± 12700 pg/ml IL-6。
為了評價ISVD對MMP-1和G-CSF的功效，將來自一個供體的RA-FLS與8種不同的人供體T細胞一起培育。我們沒有觀察到兩種同種型對照對MMP-1分泌的劑量依賴性作用。抗hTNF-α參考mAb部分降低了MMP-1分泌。抗hIL-6參考mAb比抗hTNF-α比較物mAb更有效，而兩種抗體的組合顯示出最高的功效。兩種ISVD構建體與比較物抗體組合（以200 nM Ab1 + 200 nM Ab2投藥）具有相似的有效性，並顯示出劑量依賴性作用（圖12，8個供體）。對於G-CSF獲得了相似的結果（圖13，8個供體）。 6.14 實例 15 ：人腺樣體模型中抗 TNF- α 和抗 IL-6 對 CXCL13 的累加功效
我們評價了F027201062在由濾泡輔助T細胞（Tfh）和生髮中心B細胞組成的人咽扁桃體（腺樣體）模型中的累加功效。簡言之，我們用低溫保存的淋巴細胞進行了高密度淋巴聚集體培養。用突變的百日咳毒素刺激該培養物以誘導AIM（啟動誘導標記物）反應（Schmidt, A.等人 2020 Complex human adenoid tissue-based ex vivo culture systems reveal anti-inflammatory drug effects on germinal center T and B cells. EBioMedicine 53, 102684, doi:10.1016/j.ebiom.2020.102684）。用抗hTNF-α和抗hIL-6參考mAb治療部分降低了CXCL13的分泌，而組合以及F027201062實現了更強的最大抑制。
下面描述了詳細的方案：
將來自手術的腺樣體組織收集在4ºC下RPMI培養基（無補充劑）中。手術後將組織進一步如下處理。將腺樣體來源的組織和細胞在含有15%（v/v）FBS（合格的熱滅活的Gibco胎牛血清）和補充劑（0.1 mM MEM非必需胺基酸、1 mM MEM丙酮酸鈉、50 μg/ml慶大黴素、2.5 μg/ml兩性黴素B、0.3 μg/ml替凱西林、0.01 μg/ml克拉維酸鹽）的RPMI培養基中培養。將組織用PBS洗滌兩次，並在具有CMT培養基（含有15%（v/v）FBS（合格的熱滅活的Gibco胎牛血清）和補充劑（0.1 mM MEM非必需胺基酸、1 mM MEM丙酮酸鈉、50 μg/ml慶大黴素、2.5 μg/ml兩性黴素B、0.3 μg/ml替凱西林、0.01 μg/ml克拉維酸鹽）的RPMI培養基（具有l-麩醯胺酸））的培養皿中切開。丟棄帶血的燒灼組織。剩餘的組織和切割培養基常規過濾，同時通過浸入CMT培養基中的40 µm細胞篩檢程式用注射器柱塞進行機械破壞。然後將懸浮細胞在CMT培養基中洗滌（500 x g, 5 min），計數並以12.5 - 100個Mio細胞/ml吸收在10% DMSO/90% FCS中以用於低溫保存。
實驗當天，將低溫保存的腺樣體懸浮細胞解凍，然後在96U孔盤中以1 × 10 6個細胞/孔培養。細胞未受刺激或者用終濃度為1 µg/ml的百日咳毒素突變體（PT；酶解無效的點突變體，測試為高度純化和低內毒素，List Biological Laboratories via Biotrend）進行刺激。在指示的情況下，將培養物用以下化合物處理：具有相應濃度的同種型對照、比較物抗體和ISVD的培養基（從200 nM以1 : 10稀釋，4-5種濃度，一式兩份）。IgG1同種型對照用作比較物抗體的陰性對照，而VHH IRR00119用作ISVD同種型陰性對照。抗人類TNF-α和抗人IL-6參考抗體用作比較物。此外，將兩種比較物的全劑量的組合用作另外的陽性對照並顯示累加功效。在此模型中評價了以下ISVD構建體：F027201062。刺激後18 h，將細胞離心，收集上清液並在-20ºC下儲存。通過ELISA測定CXCL13水準。
為了評價ISVD對MMP-1和G-CSF的功效，評價了多達7個腺樣體供體（取決於測試濃度）。抗hTNF-α和抗hIL-6參考mAb部分降低了CXCL13分泌。抗hTNF-α和抗hIL-6的組合以劑量依賴性方式完全抑制百日咳毒素誘導的CXCL13增加。F027201062與兩種比較物抗體的組合具有相似的功效（圖14，4-7個供體）。
在高濃度下的最大功效（對於200 nM可獲得所有7個供體的資料），然後我們使用具有Tukey校正的單因子變異數分析評價了比較物抗體組合和F027201062相比於單特異性抗hTNF-α和抗hIL-6比較物抗體的累加作用。在等莫耳劑量（200 nM）下，F027201062比抗hTNF-α比較物抗體（p值：0.0002）和抗hIL-6比較物抗體（p值：0.0077）顯著更有效。在F027201062與200 nM抗hTNF-α參考抗體和200 nM抗hIL-6參考抗體的組合之間沒有顯著和名義差異（圖15，7個供體）。 6.15 實例 16 ：不同 ISVD 構建體在人類全血測定中的抗 TNF- α 功效
我們分析了阻斷人類全血（一種更加生理的狀態）中TNF-a的功效。用SEB刺激人類全血以分泌內源性TNF-a，並用不同濃度的抗hTNF-a參考抗體、不同的ISVD和相應的同種型對照處理。
詳情：將來自健康人供體的血液吸入存在作為抗凝劑的肝素鈉[17 IU/ml]的真空采血管（BD #368480）中。在無菌水中將SEB重構為儲備溶液[1 mg/ml]，並製備含有SEB的工作溶液。準備好陰性IgG1對照抗體、抗hTNF-α比較物抗體（陽性對照）、陰性對照VHH IRR00119和多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027200926、F027201029、F027201060、F027201061和F027201062的工作溶液。
將在培養基[RPMI-1640（來自Gibco）+ 10%人類AB血清（來自Sigma；訂購號H3667）+ 1% PenStrep]中的在13 pM至200 nM最終濃度之間的抗體和ISVD構建體系列稀釋液以10 µL添加到96孔V底微型盤中。向96孔盤中人血與抗體或ISVD構建體的預培育混合物的每個孔中添加10 μl在培養基中的SEB。最後，將80 µL人類血添加到每個孔中。將樣品溫和地混合，將盤用無菌蓋密封，並且將板在37ºC、5% CO2、95% rH下培育6h。培育後，添加200 μl PBS，並將血樣以2000 x g離心15 min。收穫血漿上清液並將其在新的96孔微型盤中在-80ºC下儲存，以用於通過ELISA進一步分析。根據製造商提供的方案，使用ELISA（Invitrogen）測定MCP-1的水準。使用Luminex技術（R&D）測定CCL4水準。對於每個供體，在圖16和圖18中使用Speed中的XLfit程式擬合劑量反應曲線並計算IC50值。報告了所有7個供體的幾何平均值。顯示的資料是基於7個人類血液供體。
將人類全血與陰性對照IgG1同種型抗體或陰性VHH IRR00119一起培育沒有導致對SEB誘導的MCP-1釋放的任何抑制（資料未顯示）。相比之下，將人類全血與單特異性抗TNF-α單株參考抗體一起培育誘導了對SEB誘導的MCP-1釋放的強抑制，其中IC50為2.8 nM（圖15）。人類全血與多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027201062一起培育抑制MCP-1分泌的程度相似，其中IC50為3.2 nM。多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027200926、F027201029、F027201060、F027201061抑制MCP-1釋放，其中IC50值分別為8.9 nM、1 nM、3.8 nM、4.1 nM和3.5 nM（圖16）。此處報告的IC50值是基於幾何平均值，而圖16顯示了所有7個供體的平均值。
抗hIL-6比較物抗體不誘導MCP-1的任何抑制，證明所述測定僅依賴於TNF-α。與單獨的抗hTNF-α相比，抗hTNF-α和抗hIL-6比較物抗體的累加功效的缺乏進一步加強了這一點（圖16）。
使用第二個趨化因子讀出CCL4（圖17和圖18）進一步評價了針對TNF-a的功效。分析的重點是比較物抗體和作為ISVD構建體的F027201062。將人類全血與單特異性抗TNF-α單株參考抗體一起培育誘導了對SEB誘導的CCL4釋放的強劑量依賴性抑制，其中IC50為0.96 nM（圖17和圖18）。人類全血與多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027201062一起培育抑制CCL4分泌的程度相似，其中IC50為0.92 nM（圖17和圖18）。此處報告的IC50值是基於幾何平均值，而圖18顯示了所有7個供體的平均值。
抗hIL-6比較物抗體不誘導CCL4的任何抑制，證明所述測定僅依賴於TNF-α（圖17）。與單獨的抗hTNF-α相比，抗hTNF-α和抗hIL-6比較物抗體的累加功效的缺乏進一步加強了這一點（圖17和圖18）。 6.16 實例 17 ：不同 ISVD 構建體在來自類風濕性關節炎患者的人成纖維細胞樣滑膜細胞中的 IL-6 功效
我們分析了在類風濕性關節炎患者的原代成纖維細胞樣滑膜細胞（RA-FLS）中阻斷IL-6的功效。將RA-FLS用IL-17A和可溶性IL-6R刺激，因為它們缺乏膜結合的IL-6R。與TF-1增殖測定相對照，該FLS測定由此反映了IL-6跨信號傳導。RA-FLS不分泌人類TNF-α，因此所述系統僅依賴於IL-6。然後用不同濃度的抗hIL-6參考抗體、不同的ISVD和相應的同種型對照處理受刺激的RA-FLS。
更詳細的方案：
將RA-FLS以10.000個細胞/孔的密度以96孔形式接種在具有生長補充劑（Pelobiotech）的滑膜細胞基礎培養基中。第二天，將RA-FLS培養基用具有相應濃度的同種型對照、比較物抗體和ISVD的培養基（從200 nM以1 : 10稀釋，6種濃度，一式兩份）代替。IgG1同種型對照用作比較物抗體的陰性對照，而VHH IRR00119用作ISVD同種型陰性對照。將抗人IL-6參考抗體用作比較物。在該模型中評價了以下ISVD構建體：F027200926、F027201029、F027201060、F027201061和F027201062。
所有構建體的盤內位置在兩次重複實驗之間變化以避免盤效應。最後，將RA-FLS用100 ng/ml人類重組IL-17A和100 ng/ml sIL-6R刺激24 h。24 h後將細胞離心，並收集上清液並在-80ºC下儲存。使用Luminex技術測量VEGF-A水準。在三個不同的類風濕性關節炎供體中進行測量，並在兩個不同的階段中對每個供體進行測量。
RA-FLS與陰性對照IgG1同種型抗體或陰性對照VHH IRR00119的培育未阻斷IL-17A/sIL-6R誘導的VEGF-A分泌（資料未顯示）。相比之下，RA-FLS與單特異性抗IL-6參考抗體的培育誘導了IL-17A/sIL-6R誘導的VEGF-A釋放的強劑量依賴性抑制，其中IC50為0.67 nM（圖19和20）。RA-FLS與多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027201062的培育抑制VEGF-A分泌的程度略低，其中IC50為2 nM。多特異性抗TNF-α/抗IL-6 ISVD構建體F027200926、F027201029、F027201060、F027201061抑制VEGF-A釋放，其中IC50值分別為2 nM、1 nM、1.4 nM、2.9 nM和2.7 nM（圖20）。此處報告的IC50值是基於幾何平均值，而圖20顯示了所有供體和階段的平均值。
抗hTNF-α比較物抗體不誘導VEGF-A的任何抑制，證明所述測定僅依賴於IL-6（圖19）。與單獨的抗IL-6相比，抗hTNF-a和抗hIL-6比較物抗體的累加功效的缺乏進一步加強了這一點（圖19）。 6.17 實例 18 ：在人類 TNF- α 轉基因 Tg197 多關節炎模型中對 F027201062 的評價。
將F027201062在TNF驅動的進行性多關節炎的Tg197小鼠模型中進行了譜分析（Keffer, J.等人 Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J(1991) 10, 4025-4031）。在這些小鼠中，將修飾的人類TNF-α基因作為轉基因插入小鼠中。以使轉錄的mRNA更穩定的方式修飾人基因，並且由此導致TNF-α的過表現以及在所有四隻爪子中具有100%外顯率的自發性進行性關節炎。如果不治療，那麼體徵和症狀在約6週齡時變得明顯，並且不斷增加，直到從約10週齡起所述體徵和症狀導致明顯的瀕死和死亡。通過評分系統對關節炎的嚴重程度進行了臨床評估，如以下表15中所詳述。
表 15 ：用於確定關節炎表型嚴重程度的關節炎評分系統
關節炎得分 1 特徵
0 / 無疾病 沒有關節炎（正常外觀，小鼠可以支撐其重量緊貼至倒置或傾斜表面（如線柵或籠蓋）一段時間，全身柔韌性/逃避性正常，抓力最大）
0.5 / 輕度疾病 關節炎發作（輕度關節腫脹，所有其他參數如上）
1 / 輕度至中度疾病 輕度至中度（關節因腫脹而變形，足掌發炎，所有其他參數如上）
1.5 / 中度疾病 中度關節炎（關節-足掌腫脹、變形+尾指向內變形，短暫支撐緊貼至倒置或傾斜表面（如線柵或籠蓋），全身柔韌性降低，抓力降低）
2 / 中度至重度疾病 中度至重度關節炎（重度關節、足掌和手指腫脹，關節-腿部變形，無法支撐緊貼至倒置或傾斜表面（如線柵或籠蓋），無全身柔韌性，無抓力，攀爬/進食受影響，嘗試移動時開始搖晃，但能向前移動）
2.5 / 重度疾病 重度關節炎（如上文的2 + 前足掌的手指變形，小鼠運動受損，搖晃，不願意移動）
3 / 極重疾病 極重關節炎（俯屈時檢測到強直，並且運動嚴重受損，小鼠瀕死，不再搖晃，向一側傾斜時不能容易地轉身/翻轉）。
1關節炎得分如圖21中的y軸上所示。
關節炎對針對抑制人類TNFα的治療劑的治療敏感（Shealy, D. J.等人 Anti-TNF-alpha antibody allows healing of joint damage in polyarthritic transgenic mice. Arthritis Res 4(2002), R7, doi:10.1186/ar430）。
出於建立劑量依賴性功效的目的，以治療性方式通過每週兩次腹膜內注射，向患有關節炎的明顯體徵和症狀的6週齡動物投予不同劑量的F027201062（每組n=8隻動物）。將從人骨髓瘤血清純化的人IgG1（BioXcell #BE0297）用作陰性對照，並將抗人類TNF參考mAb用作抑制關節炎的陽性對照。另外，抗hTNF單特異性奈米抗體RA15627569用作第二個陽性對照。分別以3 mg/kg體重、10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg的四種不同劑量強度投予F027201062。持續治療直至11週齡。每週一次確定臨床關節炎得分。如圖21所示，用F027201062進行治療導致臨床關節炎得分隨時間推移的劑量依賴性抑制。到第11週，用人類IgG1陰性對照抗體治療的動物的平均關節炎得分發展到1.571 ± 0.1086。抗hTNFα參考mAb以及抗hTNF奈米抗體RA15627569抑制關節炎進展，其中第11週平均得分分別為0.5156 ± 0.0898和0.2344 ± 0.0156。漸增劑量的F027201062降低關節炎進展，其中第11週的平均得分為1.203 ± 0.0943（3 mg/kg）、0.8214 ± 0.161（10 mg/kg）、0.3393 ± 0.0592（30 mg/kg）和0.25 ± 0.0579（100 mg/kg）。通過對於時間和治療的雙因子變異數分析進行統計分析，並進行Bonferroni校正的分組比較（圖21）。
通過曲線下面積（AUC，圖22）分析Tg197關節炎模型中關節炎的總體抑制。當通過單因子變異數分析進行分析然後進行Bonferroni校正的分組比較時，大於3 mg/kg的劑量的F027201062顯著抑制關節炎進展，其抑制程度與抗hTNF參考mAb以及抗hTNF奈米抗體RA15627569是可比較的。
在治療完成後，對後肢踝關節進行處理以供組織學分析，並使用表16中概述的評分系統評價切片的關節炎結構體徵。
表 16 ：用於對踝關節中的關節炎表型進行評分的累積組織病理學標準
得分 1 疾病 標準
0 正常 無可檢測病狀
1 輕度 滑膜增生並且存在多形核浸潤物。可能存在輕度肌腱炎。
2 中度 血管翳和纖維組織形成以及局灶性軟骨下骨侵蝕
3 中度-重度 軟骨破壞和骨侵蝕
4 重度 廣泛軟骨破壞和骨侵蝕。骨輪廓結構喪失
1關節炎得分如圖23的y軸所示。
組織學評分的結果描繪於圖23中。在較高劑量下，F027201062顯著抑制結構性關節炎和關節破壞。
總之，結果表明F027201062對關節炎體徵和症狀的劑量依賴性抑制，以及對結構進展的抑制，其抑制程度與抗hTNF參考mAb以及抗hTNF奈米抗體RA15627569是可比較的。 6.18 實例 19 ：在 hIL-6 誘導的觸珠蛋白體內模型中評價 F027201062
在機械藥效動力學小鼠模型中研究了體內IL-6的抑制。向雌性BALB/c小鼠通過腹膜內途徑注射F027201062即參考抗hIL-6 mAb或媒劑。八小時後，向小鼠注射PBS或25 µg重組人IL-6。十六小時後，將小鼠放血，並製備血漿。通過螢光珠偶聯測定測量血漿樣品中的IL-6誘導的急性期反應物觸珠蛋白。如圖24所示，1 mg/kg以及3 mg/kg劑量的F027201062完全抑制IL-6誘導的血漿觸珠蛋白（plasma haptoglobin），這類似於參考抗hIL-6 mAb。 6.19 實例 20 ：在 hIL-6 轉基因脾腫大模型中評價 F027201062
在hIL-6過表現的轉基因小鼠模型中進一步測試了IL-6的體內抑制。C.B6-Tg（H2-L-IL6）1 Kish/J品系（Suematsu S等人, 1992: Generation of plasmacytomas with the chromosomal translocation t (12;15) in interleukin 6 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1):232-5）在H-2Ld主要組織相容性啟動子的控制下過表現人IL-6。在大約7到10週齡時，淋巴組織增生變化如漿細胞增多症和隨後的高球蛋白血症變得明顯（Suematsu S等人, 1989: IgG1 plasmacytosis in interleukin 6 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 86(19):7547-51）。
通過腹膜內注射F027201062即參考抗hIL-6 mAb或非特異性對照奈米抗體每週三次治療約2-2.5個月大的雄性和雌性半合子C.B6-Tg(H2-L-IL6)1 Kish/J小鼠。兩週後，處死小鼠並測定脾腫大和高丙種球蛋白血症。非轉基因野生型同窩出生小鼠用作對照。
在該模型中，F027201062以及抗hIL-6參考mAb二者均顯著減少脾腫大（圖25）。與抑制漿細胞增多症一致，F027201062以及抗hIL-6 mAb治療還抑制IgG1和IgG2a的血漿水準（圖26）。 6.20 實例 21 ： F027201062 在非人靈長類動物中的單劑量藥動學
本研究的目的是研究F027201062在非人靈長類動物中單劑量投予後的藥動學。對於這項非GLP研究，總共使用了9隻雄性未治療食蟹猴（cynomolgus monkey）（食蟹猴（ Macaca fascicularis））。根據表17中的方案對動物投藥。
表 17 ： NHP PK 研究的投藥方案。
階段 動物 ID 投藥途徑 劑量水平 (mg/kg) 劑量濃度 (mg/mL) 劑量體積 (mL/kg)
1 001M-003M IV 3 3 1
2 004M-006M SC 3 3 1
3 007M-009M SC 30 30 1
在離心（約1500 g，在+4ºC下10分鐘）之前，將血液保持在室溫下以允許凝血（最多90分鐘）。將所得血清倒入標記的聚丙烯管中並在設定為≤-65ºC的冰箱中儲存。使用開發的未經驗證的通用ELISA方法測量樣品。
藥動學曲線在圖27中給出。IV投予後，清除率為0.273 L/h/kg並且分佈體積（Vss）為0.0464 L/kg。藥動學受ADA影響。所有投藥前未治療、ADA陰性動物在360 h和672 h測試為陽性。 7 工業實用性
所述多肽、編碼其的核酸分子、包含本文所述的核酸和組成物的載體可以用於例如治療患有炎性疾病和/或自體免疫疾病的受試者。
提供本文所討論的出版物僅僅是因為它們的公開在本申請的提交日期之前。本文中的任何內容都不應視為承認本發明因在先發明而無權早於此類出版物。
儘管已經結合本發明的具體實施例對本發明進行了描述，但應當理解能夠對本發明進行進一步的修改，並且本申請旨在涵蓋總體上遵循本發明的原理，並且包括屬於本發明所屬領域內的已知或慣常實踐的且可以應用於上文所述的和如下在所附申請專利範圍之內的實質特徵的與本文的此類偏離的對本發明進行的任何變動、使用或改編。
無
圖 1：顯示了重組可溶性hTNF-α和hIL-6與經由HSA捕獲的F027201062的同時結合的傳感圖。
圖 2：代表圖（表11中的實驗n3），其顯示了ISVD F027201062和作為陰性對照ISVD的參考抗TNF-α mAb即IRR00096在Glo response™ HEK293_NFκB-NLucP報告物測定中對可溶性人類和食蟹猴TNF-α的抑制。
圖 3 ：代表圖（表12中的實驗n3），其顯示了ISVD F027201062和作為陰性對照ISVD的參考抗IL-6 mAb1和mAb2即IRR00096在IL-6誘導的TF-1增殖測定中對可溶性人類和食蟹猴IL-6的抑制。LCI = 下信賴區間，UCI = 上信賴區間。
圖 4 ：箱形圖，其顯示了存在於96個人類血清樣品中的預先存在的抗體與抗IL-6/抗TNF-α雙特異性ISVD F027201062和對照ISVD F027301186的結合。
圖 5 ：膠原蛋白誘導的關節炎模型中的進行性關節炎。將N=13隻雄性DBA/1小鼠在第0天和第21天用100 μg輔助膠原蛋白II免疫兩次。從第22天開始，通過腹膜內注射每週兩次用所注射的化合物治療小鼠。第56天後停止治療。對小鼠進行關節炎症的臨床體徵和症狀評分。顯示了平均值±SEM。統計分析是雙因子變異數分析（2-way ANOVA），其具有整個疾病過程中所選擇天數的治療與陰性對照的比較。
圖 6 ：膠原蛋白誘導的關節炎模型的隨時間而變的關節炎得分曲線下的面積。分別計算治療期第21天至第56天、脫離治療期第57天至第91天以及整個研究持續時間的AUC。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析（1-way ANOVA），其具有治療與陰性對照的比較。
圖 7 ：膠原蛋白誘導的關節炎模型的第91天血漿中的抗膠原蛋白II抗體。在膠原蛋白II包被的板中通過ELISA測定膠原蛋白II特異性滴度。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 8 ：膠原蛋白誘導的關節炎模型的第91天後足掌蹠骨關節的組織學得分。對後足掌進行組織學處理，並將切片用蘇木精和伊紅以及番紅-O染色以用於軟骨蛋白聚糖視覺化。由兩個人單獨地進行得分的設盲評估。顯示了平均值±SEM。統計分析是雙因子變異數分析，其對組織學評估的所有4個方面進行治療與陰性對照的比較。
圖 9 ：來自用抗IL-6、抗TNF和兩者的組合治療的膠原蛋白誘導的關節炎小鼠足掌的RNAseq。a) 在第91天顯著失調的轉錄物（FC＞1.2）對同種型治療的對照小鼠的卞氏圖表。b) 在CIA中（左）以及用抗TNF和抗IL-6組合治療後（右）的主要上調和下調途徑。
圖 10：類風濕性關節炎（RA）的定量系統藥理學模型。模型類比用抗TNF-α比較物和抗IL-6比較物治療後的類風濕性關節炎疾病得分DAS28-CRP，並且顯示出改善的臨床功效（基於DAS28-CRP），即使以較低劑量的F027201062也是如此。 圖 11 ：來自類風濕性關節炎（RA患者）的成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）與來自健康供體的T細胞的共培養。與IL-17A、sIL-6R和抗CD3的共培養和刺激誘導與來自RA患者的人關節中的公佈水準相似的TNF-α和IL-6水準。
圖 12 ：在RA-FLS/T細胞共培養物中用F027201062累加性抑制MMP1分泌。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是多特異性ISVD的陰性對照。比較物抗體和它們的組合用作陽性對照。僅選擇對抗TNF-α治療有反應的供體。組合反映全劑量組合（例如200 nM抗人類TNF-α + 200 nM抗人IL-6）。F027201062和F027200926是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體。顯示了是平均值±SEM，8種不同的T細胞供體，3個技術重複實驗。
圖 13 ：在RA-FLS/T細胞共培養物中用F027201062累加性抑制G-CSF分泌。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是多特異性ISVD的陰性對照。比較物抗體和它們的組合用作陽性對照。組合反映全劑量組合（例如200 nM抗人類TNF-α + 200 nM抗人IL-6）。F027201062和F027200926是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體。僅選擇對抗TNF-α治療有反應的供體。顯示了是平均值±SEM，8種不同的T細胞供體，3個技術重複實驗。
圖 14 ：在人腺樣體培養物中用F027201062累加性抑制CXCL13。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是對於F027201062（抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體）的陰性對照。比較物抗體和它們的組合用作陽性對照。組合反映全劑量組合（例如200 nM抗人類TNF-α + 200 nM抗人IL-6）。顯示了平均值±SEM，4至7種不同的供體，2個技術重複實驗。
圖 15 ：在人腺樣體培養物中用200 nM下的F027201062累加性抑制CXCL13。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是對於F027201062（抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體）的陰性對照。比較物抗體和它們的組合用作陽性對照。組合反映全劑量組合（200 nM抗人類TNF-α + 200 nM抗人IL-6）。顯示了平均值±SEM，7種不同的供體，2個技術重複實驗。統計學是單因子變異數分析和Tukey多重比較檢定。** p ＜ 0.01。*** p ＜ 0.001。
圖 16 ：抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體在人類全血測定中的TNF-α依賴性功效。顯示了在SEB刺激的全血中MCP-1抑制的IC50。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體的陰性對照。抗hTNF-α比較物抗體用作陽性對照。評價了以下抗TNF-α/IL-6 ISVD：F027200926、F027201029、F027201060、F027201061、F027201062。顯示了平均值±SEM，7種不同的供體。
圖 17 ：抗TNF/IL-6 ISVD構建體在人類全血測定中的TNF-α依賴性功效。顯示了在SEB刺激的全血中CCL4的劑量依賴性抑制。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體的陰性對照。抗hTNF-α比較物抗體用作陽性對照。F027201062是一種多特異性抗TNF-α/IL-6 ISVD。顯示了平均值±SEM，7種不同的供體。
圖 18 ：抗TNF/IL-6 ISVD構建體在人類全血測定中的TNF-α依賴性功效。顯示了在SEB刺激的全血中CCL4抑制的IC50。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體的陰性對照。抗hTNF-α比較物抗體用作陽性對照。F027201062是一種多特異性抗TNF-α/IL-6 ISVD。顯示了平均值±SEM，7種不同的供體。
圖 19：抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體在人類RA-FLS（來自類風濕性關節炎患者的成纖維細胞樣滑膜細胞）中的IL-6依賴性功效。顯示了針對同種型對照的VEGF-A分泌的抑制%。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體的陰性對照。使用抗hIL-6比較物抗體（陽性對照）和以下抗TNF-α/IL-6 ISVD的劑量依賴性抑制：F027200926、F027201029、F027201060、F027201061、F027201062。顯示了在兩個不同的階段中測試的平均值±SEM，3種不同的類風濕性關節炎供體。
圖 20：抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體在人類RA-FLS（來自類風濕性關節炎患者的成纖維細胞樣滑膜細胞）中的IL-6依賴性功效。IgG1同種型對照用作對比物抗體的陰性對照。ISVD同種型對照是抗TNF-α/IL-6 ISVD構建體的陰性對照。抗hIL-6比較物抗體用作陽性對照。顯示了抗hIL-6比較物抗體（陽性對照）和以下抗TNF-α/IL-6 ISVD對於VEGF-A的IC50：F027200926、F027201029、F027201060、F027201061、F027201062。顯示了在兩個不同的階段中測試的平均值±SEM，3種不同的類風濕性關節炎供體。
圖 21 ：F027201062在Tg197 hTNF-α驅動的關節炎模型中的功效。隨時間而變的關節炎得分。通過腹膜內注射指示化合物每週兩次治療八隻Tg197小鼠（4隻雄性和4隻雌性），持續5週。每週監測關節炎得分。顯示了平均值±SEM。統計分析是每週的雙因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 22 ：F027201062在Tg197 hTNF-α驅動的關節炎模型中的功效。隨時間而變的關節炎得分曲線下的面積。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 23 ：F027201062在Tg197 hTNF-α驅動的關節炎模型中對踝關節組織學得分的功效（每只動物，n = 2）。在研究完成處死後，對兩隻後爪進行組織學處理，並將踝關節切片用蘇木精和伊紅染色。以設盲的方式讀取切片載玻片並評分。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 24 ：IL-6誘導的結合珠蛋白分泌。向N = 8隻雌性BALB/C小鼠注射指示化合物。8小時後，如果有指示，則向小鼠腹膜內注射25 μg/kg重組人IL-6。16小時後，將小鼠放血，並使用螢光珠測定分析血漿中的觸珠蛋白。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 25 ：hIL-6轉基因小鼠中的脾腫大。將N = 6-7隻年齡在57與71天之間的雄性和雌性半合子C.B6-Tg(H2-L-IL6)1 Kish/J小鼠用指示化合物腹膜內注射每週治療三次，持續2週。處死後，取出脾臟並記錄重量。野生型同窩出生動物用作對照。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 26 ：hIL-6轉基因小鼠中的高丙種球蛋白血症。將N = 6-7隻年齡在57與71天之間的雄性和雌性半合子C.B6-Tg(H2-L-IL6)1 Kish/J小鼠用指示化合物腹膜內注射每週治療三次，持續2週。處死後，將小鼠放血並通過化學發光珠測定測量IgG1和IgG2a兩種同種型免疫球蛋白。來自野生型同窩出生動物的血漿用作對照。顯示了單獨值和平均值±SEM。統計分析是單因子變異數分析，其具有治療與陰性對照的比較。
圖 27 ：F027201062在非人靈長類動物中的單劑量藥動學。F027201062在非人靈長類動物中以指示濃度和投予途徑單劑量投予後的血清濃度曲線（每組n = 3隻雄性、未治療食蟹猴（cynomolgus monkey）（食蟹猴（ Macaca fascicularis））。紅色虛線指示在所有三個組中確認存在ADA。
圖 28：F027201062胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）。
無。
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無。

Claims (24)

  1. 一種多肽、包含所述多肽的組成物、或包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸的組成物，其中所述多肽包含至少三個免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或由其組成，其中每個所述ISVD包含任選地經由一或多個肽連接子連接的三個互補決定區（分別為CDR1至CDR3）；並且其中： a)   第一ISVD與IL-6結合並且包含 i.     具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.    具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.   具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14具有2或1個胺基酸差異的CDR3； b)  第二ISVD與IL-6結合並且包含 iv.   具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有2或1個胺基酸差異的CDR1； v.    具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 vi.   具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 16具有2或1個胺基酸差異的CDR3；和 c)   第三ISVD與TNF-α結合並且包含 vii.  具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有2或1個胺基酸差異的CDR1； viii. 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 13具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 ix.   具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 17具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
  2. 如請求項1所述的多肽或組成物，其為醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
  3. 如請求項1或2所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD包含具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR3； b) 所述第二ISVD包含具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR3；並且 c)   所述第三ISVD包含具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 2大於90%的序列同一性； b)  所述第二ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 4大於90%的序列同一性；並且 c)   所述第三ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 5大於90%同一性的序列同一性。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的多肽或組成物，其中： a)   所述第一ISVD具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列； b)  所述第二ISVD具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列；並且 c)   所述第三ISVD具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的多肽或組成物，其中所述多肽還包含任選地經由一或多個肽連接子連接的一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其中與沒有所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元的相應多肽相比，所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元為所述多肽提供增加的半衰期。
  7. 如請求項6所述的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元選自可與血清白蛋白（如人類血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（如IgG）結合的結合單元。
  8. 如請求項7所述的多肽或組成物，其中為所述多肽提供增加的半衰期的所述結合單元是可與人類血清白蛋白結合的ISVD。
  9. 如請求項8所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含 i.    具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有2或1個胺基酸差異的CDR1； ii.   具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有2或1個胺基酸差異的CDR2；和 iii.  具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15具有2或1個胺基酸差異的CDR3。
  10. 如請求項8或9所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD包含具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR3。
  11. 如請求項8至10中任一項所述的多肽或組成物，其中與人類血清白蛋白結合的所述ISVD的胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 3大於90%的序列同一性。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的多肽或組成物，其中所述多肽包含具有與SEQ ID NO: 1大於90%的序列同一性的胺基酸序列或由其組成。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的多肽或組成物，所述多肽或組成物用作藥物。
  14. 如請求項1至12中任一項所述的多肽或組成物，所述多肽或組成物用於治療炎性疾病和/或自體免疫疾病。
  15. 如請求項14所述的用於所述用途的多肽或組成物，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
  16. 一種核酸，所述核酸包含編碼如請求項1至15中任一項所述的多肽的核苷酸序列。
  17. 一種宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞包含如請求項16所述的核酸。
  18. 一種用於產生如請求項1至15中任一項所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步驟： a)   表現如請求項16所述的核酸；任選地接著進行： b)  分離和/或純化所述多肽。
  19. 一種組成物，所述組成物包含至少一種如請求項1至15中任一項所述的多肽或如請求項16所述的核酸。
  20. 如請求項19所述的組成物，其為醫藥組成物，所述醫藥組成物還包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且任選地包含一或多種其他醫藥活性多肽和/或化合物。
  21. 一種治療炎性疾病和/或自體免疫疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的如請求項1至15中任一項所述的多肽或如請求項19或20所述的組成物。
  22. 如請求項21所述的方法，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
  23. 如請求項1至15中任一項所述的多肽或如請求項19至20中任一項所述的組成物用於製備治療炎性疾病和/或自體免疫疾病的醫藥組成物中的用途。
  24. 如請求項23所述的多肽或組成物的用途，其中所述炎性疾病和/或自體免疫疾病是類風濕性關節炎。
TW110147362A 2020-12-18 2021-12-17 包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽 TW202239763A (zh)

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