DE69738166T2

DE69738166T2 - Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven Zentrum oder dem aktiven Spalt eines Zielmoleküls interagieren

Info

Publication number: DE69738166T2
Application number: DE69738166T
Authority: DE
Inventors: Serge Muyldermans; Lode Wyns
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2017-06-28
Also published as: EP0937140B1; JP2009040780A; ES2294799T3; DK0937140T3; WO1997049805A2; CA2258518C; EP0937140A2; AU740043B2; DE69738166D1; ATE374248T1; AU3539997A; JP2000515002A; WO1997049805A3; CA2258518A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Erkennungsmoleküle, die zum Interagieren mit der aktiven Stelle oder dem aktiven Spalt von Zielmolekülen in der Lage sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren für ihre Gestaltung und ihre Herstellung und Verwendung der Erkennungsmoleküle in Diagnose, Therapie, Impfstoffen und Verfahren zum Isolieren oder Reinigen von Zielmolekülen. Vorzugsweise werden die Erkennungsmoleküle als Enzyminhibitoren verwendet. Die Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen, diagnostische Kits, Impfstoffe und Reinigungsmaterialien, umfassend die Erkennungsmoleküle der Erfindung.
In der Theorie kann in vielen Fällen der Ausbruch von Krankheiten von viralem, bakteriellem, parasitischem oder irgendeinem anderen Ursprung durch Wechselwirken mit der enzymatischen Aktivität von pathogenen Proteinen oder mit der Erkennung von parasitischen Proteinen mit ihren Zielmolekülen verhindert werden. Darüber hinaus kann der schädlichen Wirkung von toxischen Substanzen durch Bindung von inhibierenden Molekülen an der aktiven (toxischen) Stelle entgegengewirkt werden. Weiterhin kann die Fehlfunktion von komplexen enzymatischen oder physiologischen Vorgängen, die ihren Ursprung in einer deregulierten enzymatischen Funktion oder deregulierten Proteinerkennung finden, oft durch Zugeben von Molekülen, die mit der aktiven Stelle oder den aktiven Furchen der komplexen Proteine Wechselwirken, geheilt werden.
In allen diesen Beispielen würde es vorteilhaft sein, spezifische Proteine zu haben, die die aktive Stelle (wie die katalytische Stelle in Enzymen, Furchen in Proteinen von komplexen Systemen wie Mehrfachkomponenten-Systemen oder Erkennungsstellen in Rezeptoren) dieser malignen Moleküle erkennen.
Offenbar ist heutzutage die beste vorhandene Technik, solche Moleküle zu erhalten, die eine bestimmtes Zielmolekül erkennen, die Hybridomtechnologie zum Herstellen von (monoclonalen) Antikörpern. Dennoch erlegen Antikörper ihrer Ausnutzung einige Limitierungen auf. Zum Beispiel ist bekannt, dass Antikörper, deren Struktur bis jetzt gelöst worden ist, eine Antigen-Bindungsoberfläche haben, die selbst entweder eine Furche oder Höhle oder eine flache Oberfläche bildet, (Webster et al., Current Opinion in Structural Biology, 4, 123, 1994). So kann die Antigen-Bindungsstelle der Antikörper in eine Furche oder Höhle nicht eindringen. Die katalytischen oder funktionellen Reste oder toxischen Teile der Zielproteine sind vorwiegend innerhalb eines Spalts gelegen, sodass die Erkennung ihres Substrats oder Rezeptors aufgrund der vielen Kontakte und Wechselwirkungen mit den Aminosäuren, die den aktiven Spalt bilden, sehr spezifisch wird. Dennoch sind diese Strukturen aufgrund der Tatsache, dass Spalten und Höhlen zumindest teilweise innerhalb des Moleküls liegen, nicht sehr immunogen. Sogar die breiteren Höhlen – oder Spalten der Proteine im Allgemeinen – haben den Nachteil, dass sie nicht sehr immunogen sind. Dies ist einer der Hauptgründe, warum so wenige Antikörper mit der aktiven Stelle von Proteinen Wechselwirken.
Diese (die niedrige Immunogenität der aktiven Stelle und die flache Oberfläche der Antigen-Bindungsstelle selbst) sind wahrscheinlich die zwei Hauptgründe, warum so wenige (monoclonale) Antikörper eine neutralisierende enzymatische Aktivität zu haben scheinen, zweifellos wenn sie als monovalente Fragmente (F_AB-F_V-ScF_V) wirken, und dies legt schwere Einschränkungen auf das große Potenzial von monoclonalen Antikörpern. Die wenigen neutralisierenden monoclonalen Antikörper, die verfügbar sind, scheinen an Epitope, die teilweise die aktive Stelle des Antigens überlagern, aber nicht innerhalb der aktiven Stelle zu binden, was ihnen eine größere Spezifität geben würde. Darüber hinaus entfernt eine einfache Punktmutation an der Oberfläche des Antigens (wie ein virales Hüllprotein) das Epitop des monoclonalen Antikörpers, der für das Nachweisen dieser neuen Variante nutzlos wird. Ein letzter Nachteil von Antikörpern ist ihr großes Molekulargewicht und ihre große Größe, die der schnellen Bio-Verteilung oder einer wirksamen Gewebepenetration Einschränkungen auferlegen, während das Fc von Antikörpern eine schnelle Entfernung aus dem Blut verhindert.
Angesichts des Obigen ist es eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Moleküle zu gestalten und zu konstruieren, die mit einer großen Spezifität an eine Höhle oder aktive Stelle eines Zielmoleküls binden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diese neuen Moleküle, die im Verlauf dieser Beschreibung ,Erkennungsmoleküle' genannt werden, in Diagnose, Therapie, Impfstoffen zu verwenden.
Die Anwendung offenbart auch Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von Zielmolekülen als Enzyminhibitoren und Verfahren zum Herstellen und Modifizieren der Erkennungsmoleküle zu bestimmten Zwecken.
Die Anwendung offenbart therapeutische Zusammensetzungen, diagnostische Kits, Impfstoffe und Reinigungsmaterialien, umfassend die Erkennungsmoleküle der Erfindung.
Die erste Aufgabe der Erfindung wird durch ein Erkennungsmolekül, wie in den Ansprüchen definiert, erreicht.
In solch einem Erkennungsmolekül ist die Schleifenstruktur die komplementäritätsbestimmende Region 3 (CDR3) eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, die eine Bindungsspezifität für die aktive Stelle oder den aktiven Spalt des Zielmoleküls hat oder eine modifizierte Version davon.
Die Erfindung wurde gemacht, nachdem zuerst die folgenden Prinzipien formuliert worden sind. Das Erkennungsmolekül der Erfindung sollte aus einer exponierten Schleife bestehen, die aus einer Erkennungseinheit herausragt (1). Die Schleife sollte gestaltet sein, um in eine Höhle, Furche oder einen Spalt des Zielproteins zu penetrieren. Um eine gute Affinität zu haben, muss diese Schleife so beschränkt sein, dass ihre inhärente Flexibilität eingeschränkt ist. Daher muss die Flexibilität der freien Schleife in der Abwesenheit des Zielmoleküls eingeschränkt sein. Obwohl eine eingeschränkte Schleife selbst schon eine ausreichende Affinität haben könnte, ist es ein Vorteil (aber es ist nicht unbedingt erforderlich), diese Schleife aus einer Bindungsoberfläche herausragen zu haben, um die Zahl der Kontakte mit den Aminosäuren um die aktive Stelle oder den aktiven Spalt des Zielmoleküls zu erhöhen. Daher ist das ideale Erkennungsmolekül so etwas wie die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers, überragt mit einer exponierten Schleife, die aus dieser Antigen-Bindungsoberfläche herausragt.
Es wurde jedoch von den hier genannten Erfindern in Betracht gezogen, dass die Antigen-Bindungsstelle von konventionellen Antikörpern oder Antikörperfragmenten wie Fv kein gutes Start-Gerüst für die Insertion einer exponierten Schleife ist, weil Antikörper normalerweise keine Schleifen bilden, die aus ihrer antigenen Bindungsstelle herausragen, und eine künstlich gebildete Schleife ist schwer de novo zu gestalten, weil die Schleife strukturiert und eingeschränkt sein muss und eine komplementäre Oberfläche zu der Höhle des Ziels besitzen sollte.
Darüber hinaus sind Antikörper zu groß für eine wirksame Bio-Verteilung oder Gewebepenetration, und Antikörperfragmente wie Fv sind eher instabil und leicht zu dissoziieren, besonders wenn sie in niedrigeren Konzentrationen verwendet werden.
Weiters haben die viel kleineren VH-Antikörperfragmente oder ,Einzeldomänen-Antikörper' (dAB), wie sie genannt wurden (Ward et al., Nature 341, 544–546, 1989), die von einem konventionellen Antikörper stammen, drei Haupt-Einschränkungen, nämlich einen niedrigen Expressionsertrag in Bakterien (durchschnittlich nur 0,2 mg/l Kultur), niedrige Löslichkeit in wässriger Lösung und eine reduzierte Affinität und Spezifität im Vergleich zum Eltern-Fv-Fragment.
Das Molekül der vorliegenden Erfindung sollte in die aktive Stelle des Zielproteins penetrieren, wo es mit den katalytischen Resten wechselwirkt, obwohl andere Höhlen, Furchen oder Spalte des Zielproteins auch genügen werden. Zu diesem Zweck sollte das Molekül der Erfindung eine exponierte Schleife besitzen, groß genug, um maximal zu inserieren, und so komplementär wie möglich zu der Zielprotein-Höhle. Der gute Sitz und die hohe Zahl der Kontakte des Erkennungsmoleküls mit den Resten der aktiven Stelle des Zielmoleküls sollten es für das letztere unmöglich machen, dieser Wechselwirkung durch das Erwerben von Punktmutationen zu entkommen, da diese eine schädliche Wirkung auf die korrekte Funktion des Zielmoleküls selbst haben werden. Das Erkennungsmolekül der Erfindung soll weiterhin durch eine kleine Größe für eine gute Bio-Verteilung und Gewebepenetration, einen ausreichend hohen Expressionsspiegel in bakteriellen Systemen aus wirtschaftlichen Gründen, ein gutes Löslichkeitsverhalten, eine gute Stabilität und eine lange Haltbarkeitsdauer, eine gute Affinität und Spezifität für das Zielmolekül, eine leichte Clonierung und daran anschließende Manipulation charakterisiert sein.
Die hier genannten Erfinder fanden überraschenderweise, dass all diese Forderungen erfüllt werden können, wenn ausgehend von den Schwere Kette-Antikörpern von Cameliden (Camel bactrianus, Camel dromedarius, Lama peruviana, Lama glama, Lama vicugna und Lama alpaca) begonnen wird. Cameliden enthalten eine beträchtliche Menge ihrer funktionellen Antikörper nur in der Form von Schwere Kette-Antikörpern (Hamers-Casterman et al., Nature 363, 446, 1993). Der Schwere Kette-Antikörper ist aus Homodimeren von H-Ketten zusammengesetzt und es fehlen L-Ketten. Von der Aminosäuresequenz der H-Ketten erscheint es, dass ihre N-terminale Domäne einige bemerkenswerte Aminosäuresubstitutionen beherbergt, die sie deutlich verschieden von dem konventionellen VH machen (Muyldermans et al., Prot. Enging. 7, 1129, 1994).
Um eine klare Unterscheidung zwischen dem konventionellen VH und jenem von Cameliden zu machen, wird der Schwere Kette-Antikörper des letzteren als ,VHH' (VH des Schwere Kette (Heavy-chain)-Antikörpers) identifiziert. Diese Unterscheidung ist völlig gerechtfertigt, wie aus der Tatsache ersichtlich, dass Schwere Kette-Antikörper von Cameliden deutlich verschieden von jedem anderen VH sind.
Die Tatsache, dass die Cameliden-Keimbahn sowohl einen V_H- als auch einen V_HH-Satz von Minigenen enthält, bestätigt, dass die V_HH-Domänen (erhalten nach der V_HH-D-J-Rekombination) für die Verwendung in Schwere Kette-Antikörpern, denen leichte Ketten fehlen, prädestiniert sind.
Obwohl die Aminosäuresubstitutionen in einem VHH im Vergleich zu jedem anderen VH quer durch die Primärstruktur (Sequenz) verstreut sind, sind sie im Raum in der Tertiärstruktur auf der Seite des Moleküls angehäuft, die normalerweise mit der VL-Domäne wechselwirkt (als ,frühere VL-Seite' bezeichnet). Diese Aminosäuresubstitutionen sind V37F, G44E, L45R oder L45C und W47, vorwiegend substituiert durch Gly. Offensichtlich wird von solchen Substitutionen erwartet, dass sie die ,frühere VL-Seite' des VHH hydrophiler machen, und daher werden sie die Löslichkeitseinschränkungen von den konventionell isolierten VH's, die von Mensch oder Maus erhalten wurden, auch als dAb (Einzeldomänen-Antikörper) bezeichnet, überwinden. Ward et al., Nature 341, 544 (1989), beschrieben die sogenannten dAb's.
Die Substitutionen machen auch, dass diese Region weniger wahrscheinlich an das Chaperon BiP (oder bakterielle Chaperon-Proteine) bindet, sodass erwartet wird, dass der Expressionsspiegel auch steigen könnte.
Darüber hinaus wurde angenommen, da die Schwere Kette-Antikörper von Cameliden in vivo in der Abwesenheit einer leichten Kette reifen, dass das isolierte VHH die Eltern-Affinität und Spezifität für sein Antigen des ursprünglichen Schwere Kette-Antikörpers bewahrt.
Folglich haben VHH's zu mindestens drei Hauptvorteile im Vergleich zu den isolierten VH's oder dAB's, nämlich einen besseren Expressionsertrag in Bakterien oder anderen Expressionssystemen, eine bessere Löslichkeit in wässrigen Lösungen und eine erhöhte Affinität und Spezifität.
In der Tat wurde in der Forschung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, gezeigt, dass ein VHH, wenn es in einen bakteriellen Expressionsvektor cloniert wird (pHEN4, ein Derivat des pHEN1 (beschrieben von Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19, 4133 (1991))), exprimiert werden kann, um ungefähr 10 mg/l Kultur zu ergeben. Dies sollte mit 0,2 mg/l Kultur für die bakterielle Expression von isolierten Maus-VH-Domänen verglichen werden. Der Grund dieser ungünstigen Eigenschaften von Maus-dAb's ist das Aussetzen der hydrophoben Fläche der ,früheren VL-Seite' gegenüber einem wässrigen Lösungsmittel. Das VHH könnte auch leicht ohne jegliches Zeichen einer Aggregation auf 10 mg/ml konzentriert werden, was einer ungefähr 100-mal höheren Löslichkeit als jener der Maus-VH's entspricht.
Neben der guten bakteriellen Expression und Löslichkeit wurde weiterhin gezeigt, dass das VHH resistent gegen eine Hitzedenaturierung war und bei 37°C für bis zu 1 Woche mit Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und der Antigen-Bindungskapazität gehalten werden konnte. Es wurde daher geschlossen, dass VHH stabile Moleküle sind.
Es ist möglich, gewöhnliche VH's zu kamelisieren, um sie mit den Vorteilen von VHH auszustatten. Die sogenannte ,Kamelisierung' involviert die Mutagenese von Aminosäuren an Position 44, 45 und 47, um die entsprechenden Kamel-Aminosäuren an jenen Positionen nachzuahmen. Die ,Kamelisierung' verbessert die Löslichkeit (Davies & Reichmann FERS Lett. 339, 285–290, 1994). Weiterhin verbesserte die ,Kamelisierung' der Position 37 durch eine V37F-Substitution und das Einbringen einer Disulfidbindung zwischen der CDR1 und CDR3 beträchtlich die Stabilität der isolierten Domäne.
Die Sequenzanalyse von zusätzlichen VHH-Clonen (von Kamel und Lama) legte einige bemerkenswerte zusätzliche Eigenschaften über ihre Funktionalität offen, besonders, wie sie eine spezifische Antigen-Bindungskapazität in der Abwesenheit von irgendwelchen Leichte Kette-Antigen-Bindungsschleifen bewahrten. In einem konventionellen VH ist es die CDR1 (Aminosäure 31 bis 35), die in der Sequenz hypervariabel ist und von der gefunden wurde, dass sie mit dem Antigen in Kontakt kommt. Das N-Ende vor der ersten hypervariablen Schleife (Aminosäure 26 bis 30) ist in einem konventionellen VH lösungsmittelexponiert, diese Aminosäuren sind jedoch konserviert und es wurde vorher nie berichtet, dass sie mit dem Antigen in Kontakt kommen (mit der Ausnahme der Aminosäure an der Position 30).
In den VHH von Cameliden können diese Aminosäuren an der Position 26 bis 35 als hypervariabel in der Sequenz definiert werden. Dies legt erstens nahe, dass die Aminosäuren dieser Schleife eine andere Konformation als jene annehmen können, die bis jetzt in anderen Spezies beschrieben wurde, und zweitens weist es darauf hin, dass jene Aminosäuren mit dem Antigen in Kontakt kommen könnten, d.h. die Oberfläche der Antigen-bindenden Plattform würde vergrößert sein.
Darüber hinaus wurde gefunden, dass die CDR3, die die am meisten variable Schleife in der Sequenz und in der Struktur ist, im Durchschnitt länger als jene von konventionellen VH-Domänen ist (15 Aminosäuren im Vergleich zu 9 Aminosäuren in Mäusen). Wiederum wird ein Anstieg in der Antigen-Bindungsoberfläche angenommen.
Ein Nachteil einer längeren Schleife in der Abwesenheit des Antigens bedeutet, dass die Schleife eine gewisse Flexibilität hat und mehrere verschiedene Konformationen annehmen kann, von denen eine nach der Komplexbildung mit dem Antigen fixiert wird. Diese Immobilisierung der Schleife wird eine große, negative entropische Wirkung auf die Bindung haben. Das häufige Auftreten (besonders in den längeren Schleifen) von Cysteinen gleichzeitig in der CDR1 (oder CDR2 oder Position 45 des Gerüsts 2) und der CDR3 der Cameliden-VHHs ist in Übereinstimmung mit der Bildung einer Disulfidbindung. Dies wird die konformationelle Flexibilität reduzieren, und daher wird die Antigenbindung einen weniger negativen entropischen Beitrag zu der Bindung haben.
Von den Ergebnissen von VHH kann eine Strategie für das Herstellen von funktionellen kleinen Erkennungseinheiten vorgeschlagen werden.
Die Strategie umfasst das Immunisieren eines Kamels (oder Lamas) mit dem erwünschten Antigen, sodass das Immunsystem des Tieres seine Schwere Kette- Antikörper in vivo zur Reife bringen wird. Danach werden die VHH von den Lymphocyten (Blut, Milz, Knochenmark) in einen Phagen-Displayvektor wie den pHEN4 cloniert und durch Panning mit dem Antigen selektiert. Unter Verwendung dieser Technik war die erfolgreiche Identifizierung von zwei VHH-Molekülen möglich, die an verschiedene Epitope eines Lysozyms binden, und zwei VHH-Bindemolekülen, die an Tetanustoxoid, einer an das C-Fragment und der andere außerhalb des C-Fragments, binden. Diese VHH wurden cAB-Lys2, cAB-Lys3 und cAB-TT1 beziehungsweise cAb-TT2 genannt. Siehe 2 für ihre Aminosäure- und Nucleotidsequenzen mit Kabat-Nummerierung. (cAB steht für Kamel-Einzeldomänen-Antikörper (camel single domain antibody) Fragment.)
Die cAb's sind spezifisch für ihr Antigen und binden daran mit Affinitäten von 2·10⁸, 2·10⁷, 6·10⁷ beziehungsweise 2·10⁷ M^–1. Die bakteriellen Expressionsspiegel dieser cAb's sind immer im mg/l-Kulturbereich, die cAb's sind gut gefaltet und verhalten sich in Hitzedenaturierungs-Experimenten ziemlich löslich und stabil.
Es ist möglich, ihre Affinität dadurch zu erhöhen, dass die cAb's durch die Zwischenform des Langen Kamel-Gelenks bivalent/multivalent gemacht werden. In einer ähnlichen Strategie kann das cAb-Lys3 mit dem cAb-TT2 verknüpft werden, um bispezifische Konstrukte herzustellen. Es wird gezeigt, dass cAb-TT1 und cAb-TT2 das Tetanustoxin in vivo neutralisieren. Das cAb-Lys3 inhibiert auch die Micrococcus Lysomeikticus-Zellwand-hydrolysierende Aktivität von Lysozym.
Das cAb-Lys3 wird durch Affinitätschromatographie auf Hühnereiweiß-Lysozym, das auf Sepharose CNBr immobilisiert ist, leicht gereinigt. Die Struktur des cAb-Lys3 im Komplex mit seinem Antigen (Hühnereiweiß-Lysozym) wurde durch Röntgen-Kristallographie mit 2,5 Å Auflösung bestimmt. Die Hauptbeobachtungen der cAb-Lys3-Struktur in Bezug auf die Entwicklung oder die Gestaltung von VHH als kleine Erkennungseinheiten mit der exponierten Schleifenstruktur (auch TUT'-Motiv genannt) sind die folgenden.
Die Haupt-Kettenkonformation des Kerns des VHH ist ähnlich zum VH, sodass man sich vorstellen kann, das VHH für das Umsetzen („grafting") der CDR's von anderen nützlichen konventionellen VH-Molekülen zu verwenden.
Die ,frühere VL'-Seite des cAb-Lys3 ist vollständig umgeformt und wurde aufgrund der Substitution des V37F, G44E, L45R und W47, das vorwiegend in Gly substituiert wurde, aber auch aufgrund der Umorientierung der konservierten W103, Q105 und Q39 in dieser Region im Vergleich zum VH hydrophiler.
Die H1-Schleife hat eine Konformation, die vollständig von der beschriebenen kanonischen Struktur 1 von konventionellen VH's abweicht, und die Aminosäure 29, die in den konventionellen VH-Domänen im Inneren der Domäne vergraben ist, dreht die Struktur nach Außen und kommt mit dem Antigen in Kontakt. Darüber hinaus ist die Aminosäure 28 ist im Komplex nahe zum Antigen.
Die CDR3 (24 Aminosäuren lang in cAb-Lys3) kann in zwei Teile geteilt werden, den C-Teil, der die ,frühere VL-Seite' bedeckt, und den N-Teil, der eine exponierte, zugängliche, ausgedehnte und herausragende Schleife bildet (als das ,TUT' bezeichnet). Diese Schleife wird durch eine Disulfidbindung (zur CDR1) und einen internen aromatischen Kern, der durch eine Ansammlung von Y32, Y99 und Y100c gebildet wird, stabilisiert. Das Y99 geht auch eine H-Bindung mit der Seitenkette von D95 ein.
Die Schleife an den Aminosäuren 72–75 ist nahe zum Antigen, ist aber nicht sehr gut geordnet.
Der exponierte Teil der CDR3-Schleife penetriert tief in die aktive Stelle des Lysozyms und die Spitze der Schleife wird durch Ala100 und Ser100a gebildet. Das Ser100a geht eine H-Bindung mit dem katalytischen Glu35 des Lysozyms ein.
Es wurde gefunden, dass die stabilisierte und große herausragende Schleife (das ,TUT') mit dem aktiven Spalt des Lysozyms, einer Enzymregion, die als ein ,niedrig energetisches Epitop' angesehen wird, wechselwirkt, weshalb es schwer ist, Antikörper gegen diesen Teil des Moleküls hervorzubringen. Die aktive Stelle des Enzyms oder die Höhlen der Proteinoberfläche im Allgemeinen sind aufgrund ihrer niedrigen Immunogenität oder weil die Antigen-Bindungsstelle entweder flach ist oder eine Höhle oder Furche trägt, schwer mit konventionellen Antikörpern oder Antikörperfragmenten umzusetzen, aber es wurde keine große herausragende Schleife wurde auf der Antigen-Bindungsstelle von Antikörpern beobachtet, sodass sie keine Höhlen, Spalten oder Furchen des Antigens penetrieren können.
Ein weiter Bereich von Proteinen oder anderen Molekülen kann als Zielmoleküle wirken. Eine Liste von Proteinen wird nur als ein Hinweis gegeben, welche Art von Proteinen ausgewählt werden kann. Alle anderen Proteine mit einer Höhle oder einer kleinen Furche sind gleich gut, und die Liste ist natürlich nicht limitiert.
Beispiele von Zielmolekülen sind bakterielle Toxine wie Toxisches Schock-Syndrom-Toxin 1 von S. aureus, das ein Mitglied einer großen Familie von Toxinen ist, die von S. aureus sezerniert werden und der Hauptgrund des Toxischen Schocksyndroms ist. ISST-1 hat 20–30% Sequenzidentität mit Staphylococcen-Enterotoxin B-Proteinen, Choleratoxin, Tetanustoxin. Andere Moleküle, die als Zielmoleküle ausgewählt werden können, sind Schlangengifte wie Adamalysin II, ein kleineres Protein, das eine Zink-Endopeptidase der Klapperschlage ist und aus einer hoch konservierten katalytischen Domäne besteht, oder Cardiotoxin CTX IIb (Naja mosambica), Cardiotoxin CTX V (Taiwan Cobra). Diese Cardiotoxine sind kleine Proteine in den Giften von Schlangen der Elapidae-Familie. Es ist bekannt, dass die Toxine binden und die Organisation, Integrität und Funktion der Zellmembran zerstören. Andere sind Dendrotoxin K (Schwarze Mamba), Flavoridin Neurotoxin-I und II (Asiatische Cobra). Es gibt auch eine Sequenzähnlichkeit von Adamalysin II mit der Metalloproteinase Ht-c und Ht-d mit niedrigem Molekulargewicht des Crotalus atrox, die Typ IV-Kollagen degradiert.
Andere Zielmoleküle sind zum Beispiel Rezeptoren. Rezeptoren sind biologische Makromoleküle, die ein komplementäres Biomolekül oder einen Gegenliganden binden können, was in einer Funktion resultiert (durch z.B. Signaltransduktion oder Speicherung und nachfolgende Freisetzung). Die Erkennungsmoleküle der Erfindung können als Antagonisten von Rezeptoren verwendet werden, um zum Beispiel die Signaltransduktions-Funktion davon zu blockieren. Als eine Alternative können die Erkennungsmoleküle eine agonistische Aktivität haben.
Zielmoleküle können darüber hinaus Honigbienen-Gifte wie Apamin und Tertiapin, Spinnentoxine, virale und bakterielle spezifische Proteine wie HIV-Protease, HIV-reverse Transkriptase, SIV-Protease, alkalische Protease von Pseudomonas aeruginosa, andere Proteasen wie Serin-Proteasen wie Faktor Xa oder andere Blut-Serinproteasen, RNasen und Angiogenin, Sialidasen, von denen angenommen wird, dass sie in die Pathogenese von vielen Krankheiten (Salmonella, Influenzavirus) involviert sind, wobei sie die Spaltung von Glycosidbindungen zwischen Sialinsäure und Glycokonjugaten katalysieren, Amylasen und β- Glucanasen, die die Hydrolyse von Glycosidbindungen von verschiedenen Oligosacchariden katalysieren, sein. Änderungen in der α-Amylaseaktivität weisen oft auf pankreatische Störungen hin. Die aktive Stelle des Enzyms bildet einen Spalt, der zwischen den A- und B-Domänen liegt. Die katalytischen Reste Asp300, Asp197 und Glu233 liegen am Spalt, und homologe Reste sind in einigen Amylase-Strukturen gefunden worden.
Andere Beispiele von Zielmolekülen sind Lysozym, Tetanustoxin und Carboanhydrase.
Beginnend von einem basischen Erkennungsmolekül, wie in den Ansprüchen definiert, das aus einer basischen Erkennungseinheit und einer Schleife besteht, können Strukturvariationen gemacht werden, um Erkennungsmoleküle für andere Ziele herzustellen. Darüber hinaus kann ein Selektionssystem gestaltet werden, um geeignete Kandidaten für ein erwünschtes Ziel aus einer großen Gruppe von Varianten auszuwählen.
Im Prinzip kann jedes Erkennungsmolekül als ein Ausgangspunkt für diesen Ansatz verwendet werden. Um jedoch eine weitere Immunisierung zu verhindern, kann eines der hierin beschriebenen Erkennungsmoleküle genutzt werden. Solch ein Molekül kann dann manipuliert werden, um die erwünschte Spezifität zu erhalten.
Variationen, die zu modifizierten Versionen der Schleife oder der basischen Erkennungseinheit führen, können auf verschiedenen Wegen gemacht werden. Zum Beispiel kann die abgeleitete Version der CDR3 eine mutierte CDR3 sein, in der mindestens eine ihrer natürlichen Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt ist. Oder als eine Alternative besteht die abgeleitete Version der CDR3 aus einer mutierten CDR3, in der eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren zu ihrer natürlichen Aminosäuresequenz zugefügt und/oder darin inkorporiert werden.
Ähnliche Modifikationen können an der basischen Erkennungseinheit gemacht werden. Zum Beispiel, wenn die Basis-Erkennungseinheit eine Antikörper-Typ-Struktur ist, die durch mindestens einen Teil eines Schwere Kette-Antikörpers einer Cameliden-Spezies gebildet wird, offenbart die Anmeldung eine modifizierte Version davon, die eine Version ist, in der mindestens eine ihrer natürlichen Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt ist, oder eine Version ist, in der eine oder mehrere Aminosäuren zu ihrer natürlichen Aminosäuresequenz zugefügt und/oder darin inkorporiert sind. Als eine Alternative kann die modifizierte Version der Cameliden-Spezies eine Version umfassen, die an eine zweite Aminosäurensequenz oder ein biologisch aktives Molekül fusioniert ist.
Um Erkennungsmoleküle der Erfindung zu erhalten, können verschiedene Strategien befolgt werden. Im Allgemeinen umfasst ein erstes Verfahren das Bereitstellen eines Schwere Kette-Antikörpers von Cameliden; Isolieren und Clonieren der codierenden Sequenz dafür in einem Phagen-Displayvektor; Exprimieren der codierenden Sequenz auf einem Phagen, der den Vektor beherbergt; und Auswählen des Erkennungsmoleküls, das spezifisch für das Antigen ist, durch Panning des Phagen mit dem immobilisierten Antigen.
Die erste Strategie besteht daher aus dem Immunisieren eines Kamels (oder Lamas) mit dem erwünschten Zielantigen, sodass das Immunsystem des Tiers reife Schwere Kette-Antikörper in vivo gegen dieses Immunogen erzeugt. Danach werden die VHH's von den Lymphocyten (Blut, Milz, Knochenmark) in einem Phagen-Displayvektor wie dem pHEN4 cloniert und durch Panning mit dem immobilisierten Antigen ausgewählt. Um die Bindemoleküle (Erkennungsmoleküle, die das erwünschte Antigen binden) zu eluieren, wurde eines der folgenden Verfahren ausgewählt.
Die Flution der Bindemoleküle wird durch einen pH-Schock durchgeführt, um allgemeine Bindemoleküle (nicht nur Bindemoleküle an aktive Stellen) zu erhalten. Die Flution der Bindemoleküle wird mit einem Überschuss an Substrat durchgeführt, wenn man nur die Bindemoleküle an Höhlen oder aktiven Stellen erhalten will. Durch das Aufbringen der ,allgemeinen Bindemoleküle' aus dem ersten Verfahren über einen immobilisierten Zielprotein/Substrat-Komplex und Fortfahren mit den Nicht-Bindemolekülen werden die an Höhlen bindenden Moleküle aus den allgemeinen Bindemolekülen ausgewählt.
Die Anwendbarkeit dieses allgemeinen Verfahrens, um Erkennungsmoleküle der Erfindung zu erhalten, wurde durch Erhalten der Kamel-Einzeldomänen-Antikörper (camel single-domain antibody, cAB)-Fragmente cAb-TT1-, cAb-TT2-, cAb-Lys2- und cAb-Lys3-Proteine unter Verwendung dieser Strategie bewiesen. Die Strukturanalyse des cAb-Lys3, das die längste CDR3-Schleife (24 Aminosäuren) aller Lysozym-Bindemoleküle und ein Cystein hat, das eine Disulfidbindung zwischen der CDR1 und CDR3 bildet, bewies, dass, wie erwartet, tatsächlich eine kleine Erkennungseinheit mit einer herausragenden Schleife, die in die aktive Stelle des Enzyms bindet, hergestellt wurde.
Es ist möglich, die erste Strategie für das Erhalten von Erkennungsmolekülen mit anderen ,Ziel'-Proteinen zu wiederholen, aber nicht alle Proteine sind ausreichend immunogen, um diese Strategie vollständig zu generalisieren. Daher wurde eine zweite Strategie entwickelt.
Diese Strategie verwendet ein zufällig gewähltes Erkennungsmolekül als einen Startpunkt. Der Vorteil davon ist, dass eine Immunisierung vermieden werden kann und die Tertiärstruktur des Endmoleküls im Wesentlichen schon bereitgestellt ist.
Daher umfasst ein solches zweites Verfahren im Allgemeinen das Auswählen eines zufälligen Cameliden-Schwere Kette-Antikörpers; Isolieren und Clonieren der codierenden Sequenz dafür in einem Phagen-Displayvektor; Modifizieren der codierenden Sequenz der exponierten Schleife durch zufällige Substitution von mindestens einem der Codons davon; Herstellen einer Genbank von zufällig mutierten codierenden Sequenzen in Phagen-Displayvektoren; Exprimieren der codierenden Sequenz auf Phagen, die den Vektor beherbergen; und Auswählen des Erkennungsmoleküls, das für das Antigen spezifisch ist, durch Panning des Phagen mit dem immobilisierten Antigen.
Für diese zweite Strategie wird die Kamel-Immunisierung vermieden. Zum Beispiel wird das cAb-Lys3-Protein modifiziert, um ,kleine Erkennungseinheiten' mit einem ,TUT'-Motiv für die Bindung in die Zielprotein-Spalten zu entwickeln. Zwei Wege werden ins Auge gefasst: ein erster, in dem die herausragende Schleife umgeformt wird, und zweitens ein Weg, der in einem ,Furnieren' der herausragenden cAb-Lys3-Schleife endet.
Um die Schleife umzuformen, müssen einige Schritte unternommen werden. Erstens das Einbringen von Restriktionsenzymstellen in der Nähe der Schleife. Diese Stellen helfen bei der folgenden Clonierung und Charakterisierung. Dann der Austausch der Aminosäuren der Schleife durch zufällige Codons (1 bis X). Je kleiner die Zahl X ist, umso kleiner ist die Genbank und umso kürzer ist die Ausdehnung der Schleife. Schleifen von mehr als 6–7 Aminosäuren könnten es aufgrund der experimentellen Einschränkungen in der bakteriellen Transformierungswirksamkeit schwerer machen, eine vollständige Genbank herzustellen, und die Schleife könnte auch zu flexibel werden, was in einer Polyreaktivität resultieren und weniger starke Bindemoleküle ergeben wird. Danach Austausch der Plattform um die Schleife durch Austauschen des N-terminalen Endes der Domäne, der CDR1, der CDR2 oder der Schleife um die Aminosäuren an der Position 72/75 (2, cAb-Lys3), um die Spezifität oder Affinität zu erhöhen. Die vorherigen Schritte 2 und 3 können zyklisch für die Affinitäts- und Spezifitätsreifung wiederholt werden. Alternativ können auch multivalente Konstrukte gemacht werden, um die Avidität zu erhöhen oder um bispezifische Konstrukte zu erhalten.
Für das ,Furnieren' der cAb-Lys3-CDR3-Schleife werden die folgenden Schritte durchgeführt. Zuerst das Einbringen von Restriktionsenzymstellen um die Schleife zu Clonierungs- oder Charakterisierungszwecken. Dann die Substitution der Aminosäuren, die auf der Außenseite der herausragenden Schleife des cAb-Lys3 exponiert sind. Schließlich der Austausch der Plattform um die Schleife durch Austausch des N-terminalen Endes, der CDR1, der CDR2 oder der Aminosäuren um die 72/75-Schleife, um die Spezifität oder Affinität zu erhöhen. Die Schritte 2 und 3 könnten für eine Affinitäts- und Spezifitätsreifung wiederholt werden. Alternativ können auch multivalente Konstrukte gemacht werden, um die Avidität zu erhöhen oder um bispezifische Konstrukte zu erhalten.
Es ist auch möglich, die Erkennungsmoleküle der Erfindung durch genetische Manipulations-Standardtechniken wie Expression einer DNA-Sequenz, die das Erkennungsmolekül codiert, zu produzieren. Solch ein Verfahren kann zum Beispiel die Schritte des Isolierens einer DNA-Sequenz, die das Erkennungsmolekül oder einen Vorläufer davon codiert; optionell Modifizieren des Moleküls oder des Vorläufers durch Einbringen einer oder mehrerer Basen-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen; Transferieren der so erhaltenen, optionell modifizierten DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt; und Exprimieren der DNA-Sequenz im Wirt umfassen. Der Begriff ,Vorläufer', wie hierin verwendet, soll jede Sequenz umspannen, die nicht die (vollständige) erwünschte Spezifität des Erkennungsmoleküls, das produziert werden soll, hat.
Es ist offensichtlich, dass mit diesen Ansätzen die Probleme der Immunisierung (lange Immunisierungs-Schemata, toxische Wirkungen von Immunogenen auf Camelide, niedrige Immunogenität des Zielmoleküls, Bedarf von relativ großen Mengen der Zielmoleküle für die Immunisierung) vermieden werden.
Gemäß einem anderen Aspekt davon betrifft die Erfindung die Verwendung der Erkennungsmoleküle in der Neutralisierung der biologischen Funktion des Zielmoleküls und in der Therapie. Die Erfindung betrifft daher auch eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere Erkennungsmoleküle der Erfindung und einen geeigneten Excipienten.
Abgesehen von der Neutralisierung können die Erkennungsmoleküle auch verwendet werden, um das Vorliegen des Zielmoleküls in einer Probe nachzuweisen. Als solches können die Erkennungsmoleküle für die Diagnose verwendet werden. Die Erkennungsmoleküle können analog zu konventionellen Antikörpern verwendet werden. Ähnliche diagnostische Techniken werden daher hier ohne weitere Erklärung ins Auge gefasst, weil der Fachmann sehr gut jeden vorstellbaren diagnostischen Test in Analogie zu bekannten immunologischen diagnostischen Tests gestalten können wird. Die Erfindung kann daher für das Bereitstellen von diagnostischen Testkits, umfassend ein oder mehrere Erkennungsmoleküle, verwendet werden.
Die Erkennungsmoleküle können wie konventionelle Antikörper in (passiven) Impfstoffen Anwendung finden. Dazu betrifft die Erfindung die Verwendung von einem oder mehreren Erkennungsmolekülen für die Immunisierung.
Darüber hinaus kann die Spezifität des Erkennungsmoleküls für das Zielmolekül angewendet werden, um das Zielmolekül zu isolieren oder weiter zu reinigen. Standardtrennungs- und Reingungstechniken wie Affinitätssäulen, in denen der konventionelle Antikörper oder ein anderes Bindungsmolekül durch das Erkennungsmolekül der Erfindung substituiert wird, können in Anspruch genommen werden. Die Anmeldung offenbart weiterhin ein Reinigungsmaterial, das aus einem Träger besteht, der ein oder mehrere Erkennungsmolekül(e) der Erfindung daran gebunden hat. Vorzugsweise ist der Träger ein Säulenmaterial, vorzugsweise eine Affinitätssäule.
Die Anmeldung offenbart, dass, sobald die kleine Erkennungseinheit mit dem ,TUT'-Motiv (Erkennungsmolekül der Erfindung) konstruiert ist, sie daher sofort in einer Reihe von Anwendungen verwendet werden kann, zum Beispiel an Stelle eines konventionellen monoclonalen Antikörpers, bei dem eine schnelle Entfernung aus dem Blut von überschüssigem Molekül vorteilhaft ist. Für andere Anwendungen könnte es jedoch bevorzugt sein, die Lebensdauer im zirkulierenden Blut zu verlängern. Dies kann leicht durch Clonieren der Erkennungseinheit vor den Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen von menschlichem IgG1 erreicht werden.
Die Anmeldung offenbart, dass es in einer dritten Klasse von Anwendungen nötig sein könnte, diese kleinen Erkennungseinheiten in Intrakörper umzuwandeln. Die kleine Größe und ihre Einzeldomänen-Architektur bewirken, dass sie für eine solche Verwendung geeignet sind.
Das Clonieren eines SKDEL-Motivs am Ende des Gensegments wird das Molekül innerhalb des endoplasmatischen Retikulums behalten, oder das Clonieren hinter einem nukleären Zielsignal, dem Chloroplasten-Signal, wird das Protein in den Kern, den Chloroplasten, die Mitochondrien oder jede andere ausgewählte Organelle bringen, wo es sein Ziel binden und inaktivieren sollte.
Für eine Reihe von Fällen könnte die Bindungsaktivität der Schleife auf sich selbst ausreichend für eine spezifische Wechselwirkung in dem aktiven Spalt des Zielmoleküls sein.
Die Schleife kann auch verwendet werden, um Peptidmimetika rational zu gestalten, die vorzugsweise die Eigenschaften von natürlichen Proteinen imitieren.
Die vorliegende Erfindung wird Bezug nehmend auf die folgenden Figuren und Beispiele weiter erläutert werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine schematische Darstellung eines Erkennungsmoleküls der Erfindung.
2 zeigt die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von cAb-Lys2, cAb-Lys3, cAb-TT1 und cAb-TT2.
Die 3A, 3B, 3C und 3D zeigen die Immunantwort in funktioneller Zeit für Lysozym, Carboanhydrase aus Rinder-Erythrocyten, α-Amylase. Siehe Beispiel 12.
Die 4A, 4B, 4C und 4D zeigen die Festphasen-Bindung von fraktioniertem IgG von D2/54 für RnaseA, Amylase, Lysozym und Carboanhydrase. Siehe Beispiel 13.
Die 5A, 5B, 5C und 5D zeigen die optischen Dichten von Rinder- und pankreatischer α-Amylase für verschiedene IgG's. Siehe Beispiel 14.
Die 6A, 6B, 6C und 6D zeigen die optischen Dichten für Rinder-Erythrocyten-Carboanhydrase für sich verschiedene IgG's. Siehe auch Beispiel 14.
7 zeigt das Chromatogramm, das in Beispiel 16 erhalten wurde.
8 zeigt eine Gensequenz. Siehe Beispiel 18.
Die 9 und 10 zeigen die Gensequenzen für CA04 beziehungsweise CA05. Siehe Beispiel 19.
11 zeigt eine Graphik, die die Affinitätsmessung des CA04-HIS-Konstrukts durch kompetitiven ELISA zeigt. Siehe Beispiel 20.
12 zeigt eine Graphik, die die Inhibition der Carboanhydrase zeigt. Siehe Beispiel 22.
13 ist eine Graphik, wie in Beispiel 7 erklärt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Herstellung von cAb-Lys2 und cAb-Lys3
Die Vorgehensweise, um cAb-Lys2 und cAb-Lys3 zu erhalten, ist in der Patentanmeldung WO 96 34103 , die am 31. Oktober, 1996 veröffentlicht wurde, offenbart.
BEISPIEL 2
Einbringen von Restriktionsenzymstellen in der Nähe des N-Teils der CDR3-Schleife von cAb-Lys3
Das pHEN4-αLys3 (d.h. das Plasmid von pHEN4, das das Gen für Kamel-VHH, codierend das cAb-Lys3-Protein, enthält) wurde als eine Matrize genommen, und eine PCR wurde mit den VHBACK(A4)- und den SM020-Primern durchgeführt. Eine weitere PCR wird an derselben Matrizen-DNA und mit den Primern SM019 und AM006 durchgeführt.
AM006 bindet am Anfang des Gens pIII von pHEN4:
SM019 binden an die Codons 100g bis 100m von cAb-Lys3 (die SalI-Stelle ist unterstrichen):
SM020 bindet an die Codons 100m bis 98 (die SalI-Stelle ist unterstrichen):
VHBACK(A4) bindet im PeIB-Führungssignal von pHEN4 und am Anfang der cAb-Lys3-Codons 1 bis 4 (die SfiI-Stelle ist unterstrichen):
Nach dem Verdau von beiden PCR-Fragmenten mit SalI, einer Ligierung und finalen PCR mit den VHBACK (A4)- und AM006-Primern wird ein DNA-Fragment hergestellt, das in das pHEN4, das mit SfiI und BstEII geschnitten wurde (die BstEII-Stelle tritt natürlicherweise in der Gerüstregion 4 von allen VHH-Gensegmenten auf), cloniert werden kann. Die resultierende Plasmid-DNA codiert ein cAb-Lys3, wobei Ser100a willkürlich ausgewählt ist, und in dem die Codons
des cAb-Lys3 mutiert sind. Diese stillen Mutationen beherbergen die Restriktionsenzymstelle für SalI (unterstrichen) und können für ein nachfolgendes Clonieren oder eine Clon-Charakterisierung verwendet werden. Weiterhin sind die Nucleotide der Codons für
substituiert. Diese stille Mutation bringt eine BalI-Stelle (unterstrichen) ein, die wie die SalI-Stelle für die Clonierung oder eine Clon-Selektion verwendet werden kann.
Unter Verwendung dieser Strategie wurden ungefähr 10000 individuelle Clone hergestellt, von denen ungefähr 24 individuelle Clone gepickt und individuelle gezüchtet und getrennt auf den Expressionsspiegel und die Bindung an Hühnereiweiß-Lysozym getestet wurden. Alle Clone enthielten eine Mutation an der Position 110a und den Stellen für SalI und MluI. Nur zwei banden an das Lysozym, wenn auch mit einer leicht reduzierten Affinität. Diese Mutationen haben das Ser100a durch ein Pro beziehungsweise His substituiert. Alle anderen Clone enthielten eine andere Aminosäure wie Arg, Leu oder Lys usw... und es wurde gezeigt, dass sie exprimiert wurden, aber nicht in der Lage waren, das Lysozym in einem angemessenen Ausmaß zu binden.
Dies beweist, dass es möglich ist, die Schleife mit Beibehaltung des Expressionsspiegels, aber mit einer veränderten Affinität/Spezifität gegenüber Lysozym im Vergleich zum ursprünglichen cAb-Lys3 zu mutieren.
BEISPIEL 3
Vollständige Randomisierung der ,TUT'-Schleife
Mit den Oligos VHBACK(A4) und SM021 wurde ein DNA-Fragment durch PCR auf der cAb-Lys3-Matrize hergestellt, das nach SfiI/SalI-Verdau in die pHEN4-aLys3-Mutante cloniert werden kann, die mit demselben Satz von Enzymen verdaut wurde. Die Sequenz von SM021 (die SalI-Stelle ist unterstrichen) bindet an die Codons 100m bis 100e von 96 bis 92:
Von diesen Plasmiden wurden ihre Codons, die Thr97 bis zu Glu100d codieren, entfernt und durch zufällige Codons (NNS)₆ ersetzt.
Nach der Konstruktion der Genbank in einem Phagen-Displayvektor wie dem pHEN4 werden die korrekten Bindemoleküle durch Panning mit der Elutions/Selektionsstrategie, die in der Beschreibung erklärt wurde, selektiert.
Es ist auch möglich, eine Schleife mit einer anderen Größe zu kreieren. Dann wurde die Sequenz des Primers SM021 zu einer geändert, in der die zufälligen Codons (NNS)_x mit X = 1 bis 10 oder mehr variiert werden. Je kleiner X ist, umso kleiner wird die Schleife, und je größer X ist, umso ausgedehnter wird die Schleife sein. Diese verschiedenen Genbanken, jede mit einer anderen Schleifengröße, werden verwendet, um die beste Passform für die Spalten der Zielproteine zu finden.
BEISPIEL 4
Furnieren der ,TUT'-Schleife von cAb-Lys3
Eine geringgradig verschiedene Methodik der Schleifen-Randomisierungs-Strategie stellt eine Genbank her, in der die herausragende Schleife von cAb-Lys3 nur an ihrer äußeren Oberfläche geändert wird, während die (meisten der) internen und Schleifen-strukturierenden Aminosäuren konserviert bleiben. Diese Strategie wird als ,Furnieren' bezeichnet. Die Strategie besteht aus dem Ändern des SM021-Primers durch einen SM022-Primer:
und eine PCR in Kombination mit dem Primer VHBACK(A4) mit pHEN4-αLys3 als Matrize durchzuführen. Dieser Primer lagert sich an die Codons 100m bis 92 an und randomisiert die Codons 97, 98, 100, 100a, 100b und 100d, alle anderen werden beibehalten. Die randomisierten Codons codieren Aminosäuren, von denen gefunden wurde, dass sie aus der Schleife herausschauen. Nach dem Verdau des PCR-Fragments mit SfiI und Sall wurde eine Genbank in den pHEN4-Vektor konstruiert, der mit denselben Enzymen verdaut wurde. Nach der Expression des mutierten cAb auf Phagenvirionen wurden die korrekten Bindemoleküle durch Panning mit der Elutions/Selektionsstrategie, die in Beispiel 3 erklärt wurde, selektiert.
Durch Ändern des Primers SM022 durch einen ähnlichen Primer, in dem das (SNN)₃ durch (SNN)_x (X = 1 bis 6 oder mehr, aber nicht 3) ausgetauscht wird, und Befolgen des obigen Protokolls wird eine Genbank erzeugt, in der die Spitze der herausragenden Schleife im Vergleich zur ursprünglichen Schleife verkürzt oder ausgedehnt ist. Die anderen randomisierten Positionen können auch vergrößert oder verkürzt werden, um einen ,Knopf' auf der Seite der herausragenden Schleife zu kreieren. Diese anderen Genbanken werden zum Panning mit den Zielmolekülen und zur Selektion der optimalen Bindemoleküle verwendet.
BEISPIEL 5
Modifizierung der Basis-Erkennungseinheit, die die herausragende Schleife umgibt
Sobald die Erkennungseinheit mit dem ,TUT'-Motiv konstruiert ist, kann die Affinität oder Spezifität durch (feine) Modifizierungen der basischen Erkennungseinheit (oder ,Plattform') um die ,TUT'-Schleife erhöht werden. Die drei besten Stellen für diese Modifizierungen sind am N-terminalen Ende der Erkennungseinheit, an der Schleife um die Aminosäuren 72/75 und den CDR1- oder CDR2-Regionen gelegen.

1. Das N-terminale Ende des VHH befindet sich nahe den Antigen-bindenden Schleifen. Diese Stelle kann als die Stelle, die zuvor erwähnt wurde, verwendet werden, aber die inserierten Aminosäuren werden nicht eingeschränkt sein. Sie ist vielmehr ein Fusionsprodukt, das erhalten werden wird. Daher ist diese Stelle eine gute Stelle für das Inserieren von ganzen Domänen und für das Konstruieren von Molekülen mit Bispezifität.
2. Umgestalten der 72/75-Schleife für das Erhöhen der Antigen-Bindungs-Oberfläche und die Modulierung der Affinität/Spezifität durch Inserieren/Einbringen von neuen funktionellen Eigenschaften. Diese Stelle ist eine gute Stelle, um Mutationen einzubringen (Randomisierungen), wie bei Insertionen und Deletionen von einer oder zwei Aminosäuren an dieser Position in Kamel- und Lama-VHH-Clonen beobachtet wurde. Diese Stelle kann durch drei Aminosäuren ausgedehnt werden, während die Faltung sowie ihre Antigen-Bindungsaktivität noch bewahrt werden. Die Struktur des cAb-Lys3 in dieser Region ist aufgrund der Rest-Flexibilität in dieser Region im Kristall auch nicht sehr gut sichtbar. Daher wird angenommen, dass diese Region eine geeignete Stelle ist, um eine Deletion und Insertionen unterzubringen. Das Vorliegen der Restriktionsenzymstelle BspHI um die Codons 81 bis 82a
in Kombination mit einem Oligonucleotid ermöglicht das Mutagenisieren dieser Region mit einer PCR-basierenden Technologie und Standard-Clonierungstechniken. Z.B. wird eine Primerbindung an den Codons 67 bis 82b (die BspHI-Stelle ist unterstrichen):
zusammen mit dem VHBACK(A4)-Primer in einer PCR-Reaktion auf pHEN4-αLys3 ein Fragment erzeugen, das in pHEN4-αLys3 cloniert werden kann, das mit BspHI und SfiI verdaut wurde. Die hergestellte Genbank wird das cAb-Lys3-Protein codieren, in dem die Codons 72 bis 75 durch (XXX)_x substituiert sind. Abhängig von der Größe des Wesens des (X)(X)_x können Codons zwischen den Codons 72 und 75 eingebracht, deletiert oder substituiert werden.

Zum Beispiel könnte das Einbringen von Arg Gly Asp an dieser Stelle das Protein in ein Integrin umwandeln oder die Randomisierung oder der Einschluss von Cystein oder Histidinen in dieser Region könnte die Chelatbildung von Metallen an dieser Stelle ermöglichen, um ein Metallo-Protein herzustellen. Wenn man eine Subdomäne oder eine Domäne eines Enzyms an dieser Position inkorporieren will, wird nahe gelegt, die Struktur des ,neuen' Proteins zu analysieren, um die Aminosäuren zu finden, die die gewünschte Domäne mit einer Orientierung und Entfernung einschließen, die zur Orientierung und Entfernung der Aminosäuren 72 und 75 im VHH äquivalent sind. Wenn die Struktur unbekannt ist oder keine Aminosäure diese Anforderung erfüllt, dann ist es ratsam, ein kurzes Verküpferpeptid einzubringen, das es erlauben wird, die Differenz zu überspannen, sodass der inserierten Domäne keine unerwünschten Einschränkungen auferlegt werden, die die Faltung, Stabilität und Funktion des chimären Proteins inhibieren würden. In ähnlicher Weise kann das Ändern der CDR1- oder CDR2-Aminosäuren durchgeführt werden, um die Affinität und Spezifität der Erkennungseinheit mit ,TUT'-Motiv zu erhöhen.
BEISPIEL 6
Steigerung der Lebensdauer der Erkennungseinheit mit ,TUT'-Motiv
Die kleinen Einzeldomänen-Proteine der Erfindung haben eine gute Gewebepenetration, eine gute Bio-Verteilung und eine schnelle Entfernung aus dem Blut. Für manche Anwendungen (Virus-Neutralisation) ist es jedoch günstig, eine längere Lebensdauer im Blut zu haben. Um die Lebensdauer im Blut zu verlängern, kann das Protein mit dem ,TUT'-Motiv stromaufwärts der Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen von IgG1 wie dem IgG1 des Menschen cloniert werden. Dies kann durch Standard-Clonierungstechniken durchgeführt werden. Die BstEII-Stelle, die in Mensch und cAb-Lys3- oder anderen Camel- und Lama-VHH-Gensegmenten auftritt, ist eine gute Stelle für das Aneinander-Ligieren der zwei Genfragmente. Der pHEN4-Expressionsvektor kann für eine bakterielle Expression dieser Konstrukte verwendet werden, wohingegen der pCDNA-3-Vektor für eine endgültige Expression in Säuger-Zelllinien verwendet werden kann. Dies ist kein Problem, da berichtet wird, dass solche Konstrukte (ohne CH1 und leichte Ketten) in beiden Systemen gut exprimiert werden, und funktionelle Proteine in diesen Systemen erhalten werden.
BEISPIEL 7
Intrakörper
Um mit den Zielproteinen, die normalerweise an inneren zellulären Positionen gelegen sind und/oder dort wirken, zu interagieren, ist es nötig, die kleine Erkennungseinheit mit dem ,TUT'-Motiv in dieses zelluläre Kompartiment (Cytosol, Kern, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien oder Chloroplast) zu bringen. Die Transformation des Gensegments der kleinen Erkennungseinheit mit dem ,TUT'-Motiv hinter einem geeigneten Promotor und/oder Lokalisationssignal oder ausgedehnt mit den SKDEL-Codons für die Zielausrichtung im endoplasmatischen Retikulum ermöglicht nach Belieben die Expression und Steuerung des gestalteten Moleküls zu dem Zellkompartiment.
Der cAb-TT2 wurde hinter den CMV-Promotor und ein Chloroplasten-Leadersignal cloniert. Die Transformation dieses Konstrukts in Tabak-Pflanzen zeigte, dass die Konstrukte exprimiert wurden und funktionsfähig waren, wie durch ELISA gemessen. Zwei Gramm Blätter der transgenen Pflanze werden in einem Mörser in 2,5 ml PBS, 20% Glycerin, 300 μl 10 mM PMSF (Phenylsulfonylfluorid) gemahlen. Nach einem Entsalzen über eine PD10-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) verwenden wir 100 μl Extrakt, 10 μl Extrakt + 90 μl Wasser und zweifache Verdünnungen in einem ELISA. Als eine Kontrolle wurde eine nicht-transformierte Pflanze verwendet. Das Beschichten der Mikrotiter-Vertiefungen erfolgt mit 100 μl 6,5 μg/ml Tetanustoxoid. Das Blockieren erfolgt mit 1% Casein in PBS, und der Nachweis des gebundenen Pflanzen-cAb-TT2 erfolgt mit Kaninchen-anti-Kamel-IgG und Ziege-anti-Kaninchen-alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma); Paranitrophenyiphosphat ist das Substrat, und die Ablesung erfolgt bei 405 nm nach 15 Minuten. So sind unsere kleinen Erkennungseinheiten mit ,TUT'-Motiv für die Entwicklung als Intrakörper nützlich.
BEISPIEL 8
Peptidmimetika
Sobald eine ,TUT'-Schleife gefunden und charakterisiert ist, ist es möglich, sie chemisch als ein eingeschränktes Peptid zu synthetisieren. Dieses Peptid bindet spezifisch und mit einer guten Affinität in der Höhle des Zielproteins, da zahlreiche Kontakte gebildet werden. Die 11 Aminosäuren (von Asp95 bis Cys100e) begründen eine Oberfläche von ungefähr 500 Å² des Kontakts mit dem Spalt der aktiven Stelle von Lysozym. Diese Menge ist zweifellos ausreichend für das Herstellen von spezifischen Bindemolekülen von Oligopeptiden. Daher wird die Synthese des Oligopeptids wie ,CGDSTIYASYYEGS' (die unterstrichene Sequenz ist der herausragende Schleifenteil des cAb-Lys3, und die zwei Cys an den Enden dienen, um die Peptid-Konformation durch Disulfidbindungs-Bildung einzuschränken) verwendet, um die spezifische Bindung an das Lysozym-Enzym zu testen. In einem folgenden Schritt ist es durch organische Chemie möglich, Peptidanaloge basierend auf diesem Peptid mit ähnlichen Bindungscharakteristika zu synthetisieren.
Die Bindung von charakterisierten ,TUT's an andere molekulare Spalten wie jene von Enzymen oder Rezeptormolekülen kann verwendet werden, um geeignete Peptidmimetika gemäß dieser Strategie zu gestalten.
BEISPIEL 8A
Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen cAb-TT2
Die Produktion von monoclonalen Antikörpern (MAbs) wurde durch eine Injektion in die Fußsohlen des cAb-TT2 (5 μg) ohne Marker in komplettem Freundschem Adjuvans in eine 4–6 Wochen alte weibliche BALB/cxC57/B/L, F1-Maus erhalten. Nach acht Tagen wird die Maus getötet, und die poplitealen Lymphknoten werden entfernt. Die Zellen werden mechanisch freigesetzt und einmal in DMEM-Medium gewaschen.
Die Myelom-Partnerzellen (NSO) werden in log-Phasen-Wachstum in DMEM gehalten. Die Zellen werden einmal gewaschen und gezählt. Die Lymphknotenzellen und die NSO-Zellen werden in einem 5 zu 1-Verhältnis gemischt und mit 50% Polyethylenglycol (PEG 4000) in DMEM fusioniert. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und sanft in vorgewärmtem Medium (DMEM-20% fötales Kälberserum, enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und Streptomycin und Penicillin als Antibiotika) resuspendiert. Die Zellen werden in 250 ml DMEM übertragen und in Mikroplatten zu ungefähr 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung dispensiert. Die Kulturen werden für zehn Tage bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert.
Nach zehn Tagen wird das Auftreten von Hybridclonen aufgezeichnet. Insgesamt 227 Kolonien wurden beobachtet, und ihre Überstände werden in einem ELISA getestet. Gereinigtes cAb-TT2 (zu 1 μg/ml in PBS) wird über Nacht an die Vertiefungen der Mikrotiterplatten adsorbiert. Die Platten werden gewaschen, mit 1% Casein-PBS blockiert und mit den Kulturüberständen der Hybridomzellen für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen werden wieder mit PBS-Tween20 (0,1%) gewaschen und mit Ziege-anti-Maus-Immunglobulin, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist (Sigma), für eine zusätzliche Stunde inkubiert. Nach dem endgültigen Waschen wurde das Enzym mit p-Nitrophenylphosphat, gelöst in 1 M Diethanolamin, ergänzt mit 1 mM MgSO₄ und mit HCl auf pH 9,8 eingestellt, nachgewiesen. Die Farbentwicklung wird bei 405 nm überwacht.
Von den 227 Hybridkolonien zeigten etwa 10% (24) eine positive Antwort im ELISA. Von diesen wurden 20 für eine weitere Analyse selektiert. Die Isotyp-Klassen- und Unterklassen-Typisierung zeigte, dass 20 Clone die IgG-Isotypen hatten (IgG1-Typ, IgG2a und IgG2b), wohingegen die verbleibenden vier zu der IgM-Klasse gehörten.
Das Testen der Reaktivität von 20 selektierten monoclonalen IgG-Antikörpern mit cAb-TT2-Spezifität gegen gereinigtes Kamel-IgG1 (d.h. konventionelle Kamel-Antikörper mit leichten Ketten), -IgG2 oder -IgG3 (d.h. Schwere Kette-Isotypen von Kamel), drei Kamel-VHH mit unbekannten Spezifitäten (cAb-VHH9, cAb-VHH16 und cAb-VHH21) oder cAb-lys1, cAb-TT1 und cAb-TT2 wies darauf hin, dass mit dem cAb-TT2, dem ursprünglichen Antigen für das Züchten der monoclonalen Antikörper, starke Antworten erhalten werden. Zwei monoclonale Antikörper (23G8 und 9A9) erkennen schwach andere VHH-Domänen sowie Kamel-IgG1. Der Überstand von Hybridom 18C11-, 21A3- und 3G2-mAbs gibt eine dazwischenliegende Antwort (50% der maximalen Antwort) auf Kamel-IgG1, und mAb 15A11 erkennt zwei andere nicht verwandte VHHs (cAb-lys1 und cAb-VHH21) zu einem geringeren Ausmaß (20% der maximalen Bindung). Daher scheinen die meisten der anti-cAb-TT2-mAbs monospezifisch für cAb-TT2 zu sein, was auf eine separate idiotypische Spezifität hinweist.
BEISPIEL 9
Immunisierungen mit den Erkennungseinheiten mit ,TUT'-Motiv
Die cAb-TT2-Injektion in die Fußsohle führte in der BALG/c-Maus zu der Erzeugung von 24 Hybriden (von 227 getesteten Hybriden) mit Bindungsaktivität gegen cAb-TT2. Von all diesen 24 monoclonalen Antikörpern konnten nur zwei schwach an andere Kamel-VHHs binden, wohingegen die Bindung an das cAb-TT2 für alle getesteten Clone stark war. Daher sind die erzeugten monoclonalen Antikörper höchstwahrscheinlich anti-idiotypische monoclonale Antikörper.
Von den Experimenten von Zanetti (Nature 355, 476 (1992)) ist bekannt, dass die Aminosäuren, die an der CDR3 des VH vorhanden sind, immunogen sind und dass es möglich ist, eine Maus mit einem Proteinkonstrukt, das durch Inserieren eines Plasmodium-Epitops in die CDR3 von VH erhalten wurde, gegen Malaria zu immunisieren. Analog dazu wird erwartet, dass in den erwähnten Konstrukten die herausragende Schleife auf den kleinen Erkennungseinheiten eine gute Stelle für das Inserieren anderer Schleifen für in vivo-Immunisierungen ist.
Es wurde realisiert, dass, sobald ein ,TUT' gegen ein bestimmtes Enzym oder Rezeptormolekül identifiziert ist, es verwendet werden kann, um monoclonale Antikörper herzustellen. Es wird erwartet, dass die anti-idiotypischen monoclonalen Antikörper die katalytische Stelle des ursprünglichen Enzyms oder Rezeptors nachahmen werden. Diese Strategie kann verwendet werden, um Abzyme herzustellen, da das ,TUT' den ,Übergangsstatus des Substrats' ersetzt, das verwendet wird, um Antikörper mit katalytischer Aktivität zu entwickeln. Das Design und die Synthese eines stabilen ,Übergangsstatus des Substrats' ist oft schwierig oder unmöglich. Diese Strategie würde diese Synthese-Schwierigkeiten umgehen.
BEISPIEL 10
Strukturanalyse von cAb-Lys3, co-kristallisiert mit seinem Antigen Lysozym
Dieses Beispiel ist in der 1 im Artikel „Nature Structural Biology", Band 3, Nr. 9 vom September 1996 gezeigt.
BEISPIEL 11
Immunisierungs-Protokolle
Vier verschiedene Dromedare (Camelus dromedarius) werden für Immunisierungen mit verschiedenen Antigenen oder verschiedenen Mengen des Antigens verwendet.
Dromedar 1
Antigene:

Rinder-RNase A zu 0,1 mg
Carboanhydrase zu 0,1 mg
b-Lactamase zu 1 mg
Lysozym zu 1 mg

Hepatitis B-Oberflächenantigen Serotyp Ay zu 0,25 mg wird in ungefähr 0,5 ml Kochsalzlösung zusammen mit zwei zusätzlichen Pflanzenenzymen in einem Volumen von 2 ml gemischt.

Tag 0:	Nimm 20 ml Serum
	Injiziere Antigengemisch, emulgiert mit CFA (gleiches Volumen),
	subcutan
Tag 7	Nimm 20 ml Serum
Tag 14	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan = Röhrchen TAG
	14
Tag 21	Nimm 20 ml Serum
Tag 28	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan = TAG 28
Tag 31	Nimm 20 ml Blut (für Lymphocyten-Präp.)
Tag 35	Nimm 20 ml Serum
Tag 54	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan = TAG 54
Tag 57	Nimm 50 ml Blut (für Lymphocyten-Präp.)
Tag 61	Nimm 50 ml Serum

Dromedar 2
Antigene:

Rinder-RNase A zu 1 mg
Carboanhydrase zu 1 mg
Lysozym zu 1,4 mg
a-Amylase zu 1 mg
werden in ungefähr 0,25 ml Kochsalzlösung gemischt.

Tag 0:	Nimm 20 ml Serum
	Injiziere Antigen, gemischt und emulgiert mit CFA (gleiches Volumen),
	subcutan
Tag 7	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 14	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 21	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 28	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 31	Nimm 20 ml Blut
Tag 35	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 42	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 49	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 54	Nimm 20 ml Serum
	Auffrischung mit Antigen, gemischt in IFA, subcutan
Tag 57	Nimm 50 ml Blut
Tag 61	Nimm 50 ml Serum

Dromedar 3
Antigene:

Rinder-RNase A zu 1 mg
Carboanhydrase zu 1 mg
b-Lactamase zu 0,1 mg
Lysozym zu 0,1 mg
TAT zu 0,5mg
Hepatitis B-Oberflächenantigen Serotyp Ad zu 0,25 mg wird in ungefähr 2,7 ml Kochsalzlösung gemischt.

Tag 0:	Nimm 20 ml Serum, nimm 20 ml Blut (für Präparation von
	Lymphocyten)
	Injiziere Antigengemisch zusammen mit CFA (gleiches Volumen),
	subcutan
Tag 7	Nimm 20 ml Serum
Tag 14	Auffrischung mit Antigengemisch in IFA, subcutan
Tag 21	Nimm 20 ml Serum
Tag 28	Auffrischung mit Antigengemisch in IFA, subcutan
Tag 31	Nimm 20 ml Blut (für Lymphocyten-Präparation)
Tag 35	Nimm 20 ml Serum
Tag 54	Auffrischung mit Antigengemisch in IFA, subcutan
Tag 57	Nimm 50 ml Blut (für Lymphocyten-Präparation)

Dromedar 4
Antigen:

TAT
wird gemischt und verwendet, um neutralisierende Antikörper herzustellen. Alle Injektionen werden intramuskulär durchgeführt.

Tag 0:	Nimm 20 ml Serum
	Injiziere 0,12 mg Cocktail + 2 ml PBS + 2 ml IFA
Tag 2	Sensibilisiere mit 0,24 mg Cocktail + 2 ml PBS + 2 ml IFA
Tag 4	Sensibilisiere mit 0,36 mg Cocktail + 2 ml PBS + 2 ml IFA
Tag 7	Sensibilisiere mit 0,48 mg Cocktail + 2 ml 0,07 M Natriumphosphat + 2
	ml 0,07 M CaCl₂
Tag 9	Nimm 20 ml Serum
	Sensibilisiere mit 0,96 mg Cocktail + 2 ml 0,07 M Natriumphosphat + 2
	ml 0,07 M CaCl₂
Tag 11	Sensibilisiere mit 1,50 mg Cocktail + 2,5 ml 0,07 M Natriumphosphat +
	2,5 ml CaCl₂
Tag 14	Sensibilisiere mit 1,98 mg Cocktail + 3 ml Natriumphosphat + 3 ml
	CaCl₂
Tag 16	Sensibilisiere mit 1,32 mg Cocktail + 2 ml Natriumphosphat + 2 ml
	CaCl₂
Tag 18	Sensibilisiere mit 1,74 mg Cocktail + 2,5 ml Natriumphosphat + 2,5 ml
	CaCl₂
Tag 21	Sensibilisiere mit 2,16 mg Cocktail + 3 ml Natriumphosphat + 3 ml
	CaCl₂
Tag 24	Sensibilisiere mit 1,80 mg Cocktail + 3 ml Natriumphosphat + 3 ml CFA
Tag 31	Nimm 20 ml Blut und 20 ml Serum
Tag 65	Auffrischen mit 0,54 mg Cocktail + 2 ml Natriumphosphat + 2 ml CaCl₂
Tag 72	Auffrischen mit 1,08 mg Cocktail + 2 ml Natriumphosphat + 2 ml CaCl₂
Tag 75	Auffrischen mit 1,62 mg Cocktail + 2,5 ml Natriumphosphat + 2,5 ml
	CaCl₂
Tag 79	Nimm 50 ml Blut
Tag 82	Nimm 50 ml Serum

BEISPIEL 12
Immunantwort als Funktion der Zeit
In Kamel 2 (D2) sind verschiedene Antigene injiziert worden, wie in Beispiel 11 beschrieben. Blut wurde gewonnen, und nach der Koagulation wurde das Serum entfernt.
Maxisorb-Platten wurden über Nacht bei 4°C wie folgt jeweils beschichtet mit:

– Lysozym (3 μg/ml in PBS)
– Carboanhydrase aus Rinder-Erythrocyten (4 μg/ml in PBS)
– Pankreatische α-Amylase des Schweins (3 μg/ml in PBS)
– RNase A

Das Vorgehen für die Immobilisierung des Enzyms schloss 30 Minuten Vorbehandlung der Maxisorb-Platte mit 0,25% Gluteraldehyd bei Zimmertemperatur ein. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die RNase A dann zu 10 μg/ml in PBS zugefügt und weiter über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Platten wurden für mindestens 2 h bei Zimmertemperatur mit 1% Casein in PBS blockiert.
Die Seren wurden in 0,1% Casein/PBS verdünnt. 100 μl der verdünnten Seren wurden zu den einzelnen Vertiefungen zugefügt und für 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert.
Gebundene IgGs wurden mit einem polyclonalen Kaninchen-anti-Kamel-IgG-Serum (1/1000 in 0,1% Casein/PBS), gefolgt von einem Ziege-anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (1/1000 Verdünnung in 0,1% Casein/PBS) nachgewiesen. Zwischen jedem Schritt wurden die Vertiefungen 5 × mit 200 μl PBS/0,1% Tw20 gewaschen.
100 μl p-Nitrophenylphosphat zu 2 mg/ml in ELISA-Puffer (10% Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, enthaltend 0,5 mM MgCl₂) wurden zugefügt, und die CD wurde nach 20 Minuten mit einem Labsystems Multiscan RC ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm gemessen. Die optischen Dichten wurden nicht um den Hintergrund korrigiert.
BEISPIEL 13
Festphasen-Bindung von fraktioniertem IgG von D2/54
1. Fraktionierung von IgG
1 ml Serum eines Kamels Tag 54 wurde auf Protein G/A fraktioniert. Die Proteinkonzentrationen wurden spektrophotometrisch bei 278 nm unter der Annahme eines ε_1% = 13,5 bestimmt.
2. Beschichten von Maxisorb-Platten
Das Beschichten wurde jeweils über Nacht in einem kalten Raum durchgeführt mit:

– Lysozym Sigma 16876 (3 μg/ml in PBS)
– Carboanhydrase aus Rinder-Erythrocyten Sigma C3934 (4 μg/ml PBS)
– Pankreatische α-Amylase des Schweins A6255 (3 μg/ml in PBS)
– RNase A.

Das Vorgehen für die Immobilisierung des Enzyms schloss eine 30 Minuten-Vorbehandlung der Maxisorb-Platte mit 0,25% Glutaraldehyd ein. Nach dem Waschen mit Wasser wurde dann die RNaseA zu 10 μg/ml in PBS zugefügt und weiter über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Platten wurden für mindestens 2 h bei Zimmertemperatur mit 1% Casein in PBS blockiert.
3. Nachweis von gebundenem IgG
Gereinigte IgG's wurden individuell an den individuellen, immobilisierten Antigenen im Bereich von 5000–39 ng/ml getestet. Die Verdünnungen wurden in 0,1% Casein/PBS gemacht.
100 μl der verdünnten Antikörperlösung wurden zu den einzelnen Vertiefungen zugefügt, und nach einer 1 h-Inkubation wurden die gebundenen IgG's mit selbst gemachtem Gesamt-Kaninchenserum mit anti-Kamel-IgG und danach mit anti-Kaninchen-alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma Nr. 8025) nachgewiesen. Diese Reagenzien wurden in 0,1% Casein/PBS verdünnt und wurden in einer 1:1000-Verdünnung verwendet. Zwischen jedem Schritt wurden die Vertiefungen 5x mit 200 μl PBS/0,1% Tw20 gewaschen.
Schließlich wurden 100 μl p-Nitrophenylphosphat zu 2 mg/ml in ELISA-Puffer (10% Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, enthaltend 0,5 mM MgCl₂) zugefügt, und die OD wurde nach 10 Minuten mit einem Labsystems Multiscan RC ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm gemessen.
Die optischen Dichten wurden nicht um den Hintergrund korrigiert.
BEISPIEL 14
Einige Epitope von Kamel-Schwere Kette-IgGs sind Höhlen
Um zu zeigen, dass ein Schwere Kette-IgG mit einer langen CDR3-Schleife vorzugsweise an Höhlen, Schluchten oder Spalten, die auf der Oberfläche von natürlichem Protein vorhanden sind, bindet, wurden einige Bindungsexperimente durchgeführt.
Da aktive Stellen von Enzymen vorzugsweise in dem größten Spalt gelegen sind, sind die Schwere Kette-Antikörper besonders für die Entwicklung von Inhibitoren geeignet.
Von den Bindungsexperimenten mit α-Amylase oder Carboanhydrase in der Anwesenheit oder Abwesenheit von kompetitiven Inhibitoren schien es, dass eine wesentliche Fraktion der Schwere Kette-IgGs an die aktive Stelle bindet.
1. Pankreatische Rinder-α-Amylase
Die Bindung an ein Festphasen-Enzym von fraktioniertem IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 (Bereich 2500-19,5 ng:ml) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM Acarbose (Pseudoheptasaccharid mit Ki 10^–6 M).
Pankreatische Rinder-α-Amylase wurde über Nacht zu 1,5 μg/ml in PBS auf Maxisorb-Platten bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit 1% Casein in PBS blockiert. Gebundene Kamel-Immunglobuline wurden mit Kaninchen-anti-Kamel-Antiserum (R17 1/1000-Verdünnung), gefolgt von Ziege-anti-Kaninchen-AP-Konjugat (Sigma 1/1000-Verdünnung) nachgewiesen. Zwischen jedem Schritt wurden die Vertiefungen 5x mit 200 μl PBS/0,1% Tw20 gewaschen.
Schließlich wurden 100 μl p-Nitrophenylphosphat zu 2 mg/ml in ELISA-Puffer (10% Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, enthaltend 0,5 mM MgCl₂) zugefügt, und die CD wurde nach 10 Minuten mit einem Labsystems Multiscan RC ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm gemessen. Die optischen Dichten wurden nicht um den Hintergrund korrigiert.
Aus diesen Experimenten kann geschlossen werden, dass ein wesentlicher Teil der Amylase-spezifischen Schwere Kette-Antikörper an die oder nahe bei der aktiven Stelle des Enzyms bindet. Noch wichtiger ist die Beobachtung, dass die Bindung der IgG1-Unterklasse an das Antigen nicht durch den Inhibitor beeinflusst wird.
2. Rinder-Erythrocyten-Carboanhydrase
Die Bindung an ein Festphasen-Enzym von fraktioniertem IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM Dorzolamid (kompetitiver Inhibitor mit Ki im nanomolaren Bereich).
Die Carboanhydrase wurde über Nacht zu 4 μg/ml in PBS bei 4°C auf Maxisorb-Platten beschichtet. Die Platten wurden mit 1% Casein in PBS blockiert. Gebundene Kamel-Immunglobuline wurden mit Kaninchen-anti-Kamel-Antiserum (R17 1/1000-Verdünnung), gefolgt von Ziege-anti-Kaninchen-AP-Konjugat (Sigma, 1/1000-Verdünnung) nachgewiesen. Zwischen jedem Schritt wurden die Vertiefungen 5x mit 200 μl PBS/0,1% Tw20 gewaschen.
Schließlich wurden 100 μl p-Nitrophenylphosphat zu 2 mg/ml in ELISA-Puffer (10% Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, enthaltend 0,5 mM MgCl₂) zugefügt, und die OD wurde nach 10 Minuten mit einem Labsystems Multiscan RC ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm gemessen. Die optischen Dichten wurden nicht um den Hintergrund korrigiert.
Aus diesen Experimenten kann geschlossen werden, dass Bindemoleküle an die aktive Stelle für dieses Enzym nur in der IgG3-Unterklasse vorhanden sind.
BEISPIEL 15
Hemmung der pankreatischen Amylase durch VHH von D2/61-IgG3
Basierend auf der Beobachtung, dass der kompetitive Inhibitor Acarbose in der Lage war, um die Bindung der Schwere Kette-Antikörper an ein Festphasen-Enzym zu konkurrieren, wurde das folgende Experiment ausgeführt, das zeigt, dass ein Teil dieser Antikörper die enzymatische Aktivität des Enzyms inhibiert. Um eine Immunpräzipitation als Grund der reduzierten enzymatischen Aktivität auszuschließen, da zu erwarten war, dass die fraktionierten Antikörper polyreaktiv und polyclonal sind, wurden VHH-Fragmente der IgG3-Fraktion hergestellt.
Diese VHH von der IgG3-Fraktion von D2/61 wurden durch Behandlung mit S. aureus-V8-Endoglu-Proteinase (Boehringer) in 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8, (1/50 Gew./Gew. Enzym/Protein) für 2 h hergestellt. Die Wirksamkeit der Spaltung wurde durch SDS-PAGE verfolgt. Nach einer Dialyse gegen PBS wurden nicht-verdautes Material und Fc-Fragmente durch Protein G-Chromatographie entfernt. Der Durchfluss der Säule enthielt die VHH-Fragmente (siehe Beispiel 16).
Die enzymatische Restaktivität wurde unter Verwendung des Ecoline^® 25 Amylase-Tests (Merck-CNPG3-Verfahren) bestimmt. Die gebrauchsfertige Substratlösung wurde zehnfach mit PBS verdünnt, um die KSCN-Konzentration auf 90 mM zu senken, um eine chaotrop induzierte Dissoziation zu vermeiden.
Pankreatische α-Amylase aus Schwein (Sigma A-6255) wurde in 0,1% Casein-PBS auf eine Konzentration von 1,5 μg/ml verdünnt, und 50 μl dieser Lösung wurden mit 100 μl des gereinigten VHH-Fragments inkubiert (Proteinkonzentration 200 μg/ml). Nach einer Vorinkubation für 60 Minuten wurde die enzymatische Aktivität durch Zufügen eines Teils des Gemisches zu der zehnfach verdünnten Substratlösung bestimmt. Die enzymatische Aktivität war aus dem Anstieg in der OD405 nm während 5 Minuten berechnet. Die enzymatische Aktivität wurde auf 65% im Vergleich zu der enzymatischen Aktivität reduziert, die in der Abwesenheit von VHH-Fragmenten gemessen wurde, was somit zeigt, dass inhibitorische Antikörper vorhanden sind.
BEISPIEL 16
Verdau und Reinigung von VHH von IgG3 D2/61
VHH von der IgG3-Fraktion (1,72 mg/ml) einer Kamel 2-Blutentnahme am Tag 61 (D2/61) wurden durch Behandlung mit S. aureus-VB-Endoglu-Proteinase in 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8 (1/50 Gew./Gew. Enzym/Protein-Verhältnis) für 2 h hergestellt. Die Wirksamkeit der Spaltung wurde durch SDS-PAGE verfolgt. Nach einer Dialyse gegen PBS wurden nicht-verdautes Material und Fc-Fragmente durch Protein G-Chromatographie entfernt. Der Durchfluss der Säule enthielt die VHH-Fragmente. Die Proteinkonzentration der VHH-Spitzenfraktion VHH (200 μg/ml) wurde spektrophotometrisch unter der Annahme von E1% = 20 bestimmt. Diese Fraktion wurde für Inhibierungstests verwendet.
Verdau der IgG3-Fraktion von D2/61 mit S. aureus-V8-Protease bei einem pH-Wert von 8 in 0,1 M NH₄HCO₃ bei einem 1/50 Gew./Gew. Enzym/Protein-Verhältnis für 2 h.

1. Molekulargewichtsmarker
2. Unverdautes IgG3
3. Verdau nach 2 h mit Endo-Glu-Protease V8
4-5-6. Durchfluss durch die Protein G-Sepharose-Säule.
7-8-9. Flution der Protein G-Sepharose mit Glycin/HCl, pH 2,7.

BEISPIEL 17
Präparation von periphären Blutlymphocyten
4 Dromedare werden verwendet. Es werden ungefähr 7 ml Blut (in EDTA) von jedem Dromedar gewonnen und bei 4°C transportiert. Das Blut wird mit demselben Volumen steriles PBS verdünnt und auf 50 ml Röhrchen (Wak Chemie) geschichtet. Die Röhrchen werden bei 1000 g für 20 Minuten (2200 Upm) bei 20°C zentrifugiert.
Die Flüssigkeit über dem Netz wird in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen übertragen (Um die Blutplättchen zu eliminieren, ist es besser, den Überstand zu entfernen und nur die Lymphocyten zu gewinnen, die sich unmittelbar über dem Netz in einer Bande ansammeln).
Die Zellen werden bei 2500 Upm für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 0,5 ml PBS resuspendiert. Nach der Verdünnung von einem 10 μl-Aliquot in 300 μl PBS werden die Zellen gezählt. Jede Fraktion enthielt ungefähr 3·10⁷ Zellen/ml, von denen nur eine Minderheit rote Blutzellen waren. 5 Röhrchen von je 100 ml wurden in Eppendorf-Röhrchen aliquotiert und bei 2500 UpM 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, und das Pellet wird bei –80°C gefroren. Jedes Röhrchen enthält ungefähr 3·10⁶ Zellen.
BEISPIEL 18
VHH-Genbank-Konstruktion von peripherem Blut
Lymphocyten und Panning
mRNA-Herstellung
Die gefrorenen Lymphocyten (2 Röhrchen, je 5 × 10⁶ Lymphocyten/Röhrchen), die von Dromedar 2 (D2) am Tag 54 gewonnen wurden, wurden verwendet, um mRNA mit dem Micro-FastTrack-Kit (Invitrogen) zu isolieren. Die mRNA wurde von der festen Unterlage mit Oligo-T in 20 μl Wasser eluiert. Ein Gesamtertrag von 1,5 μg mRNA wurde erhalten, wie spektrophotometrisch gemessen wurde (OD260 nm von 1 entspricht 35 μg mRNA/ml).
cDNA-Herstellung
Die cDNA wurde von 1,5 μg mRNA mit dem cDNA Cycle Kit (Invitrogen) gemäß den Empfehlungen des Kit-Herstellers hergestellt. Die cDNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und durch Ethanol-Präzipitierung gereinigt. Die cDNA wurde in einem Gesamtvolumen von 100 μl Wasser resuspendiert.
PCR-Amplifizierung von VHH
Die VHHs wurden unter Verwendung von 1 μl der cDNA-Probe, die als Matrize in einer PCR verwendet wird, unter Verwendung des für zwei Gene spezifischen Primers CH2FORTA4 und einem äquimolaren Gemisch der Primer SM017 und SM018 in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Boehringer) im bereitgestellten Puffer amplifiziert. Die Denaturierung erfolgte bei 94°C für 1 Minute, die Anlagerung bei 55°C für 1 Minute und die Elongation bei 72°C für 1 Minute. Dieser Zyklus wurde 35-mal wiederholt.
Das am reichlichsten vorhandene Amplifizierungsprodukt hatte eine Größe zwischen 360 und 420 bp, wie nach der Gelelektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel in TBE und 0,5 μg Ethidiumbromid/ml gesehen wurde.
Dieses PCR-Produkt wurde als Matrize für eine erneute Re-Amplifizierung mit den geschachtelten PCR-Primern A4SHORT (enthaltend eine SfiI-Stelle, unterstrichen, die 15 Nucleotide an seinem 3'-Ende überlappen mit den 15 Nucleotiden am 5'-Ende von SM017 und SM018) und FRWRK4FOR (NotI-Stelle unterstrichen), verwendet.
Das Amplifizierungsprodukt von 20 Röhrchen wurde gemischt und durch Geneclean (Bio 101, Inc.) gereinigt und über Nacht bei 37°C mit 50 Einheiten NotI und 50 Einheiten SfiI (Gibco BRL) in einem Gesamtvolumen von 200 μl verdaut. Das verdaute Material wurde wieder durch Geneclean gereinigt.
pHEN4-Vektor-Herstellung
Die Region rund um die mehrfache Clonierungsstelle des pHEN1-Phagemid-Vektors (Hoogenboom et al., Nucleic acid Research, 19, 4133–4137, 1992) wurde modifiziert, sodass sie jetzt eine SfiI- und NcoI-Stelle im pe1B-Leadersignal und eine NotI-Stelle enthielt, die dem Hämagglutinin-Marker vorausgeht (8) (Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8095–8099, 1990).

PeIB-Leadersignal: 40-105
HA-Marker: 157–186
gen pIII: beginnt bei 199

Das Phagemid (40 μg) wurde über Nacht mit SfiI und NotI gespalten. Der Clonierungsvektor wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und Geneclean gereinigt. Das geschnittene pHEN4 wurde aus der Glasmilch (Geneclean) mit 40 μl Wasser eluiert.
VHH-Vektorligierung
Der gereinigte, mit Sfi und Not verdaute Vektor und das gereinigte VHH-Sfi-Not-Fragment wurden auf ein Agarosegel aufgetragen, um die Konzentration der Proben durch Ethidiumbromid-Fluoreszenz zu schätzen. Basierend auf diesen Schätzungen wurden 40 μl (20 μg) des Vektors und 40 μl VHH (5 μg) gemischt (erwartetes molares Verhältnis von 1/4) und über Nacht bei 16°C in einem Gesamtvolumen von 100 μl in 1 × Ligierungspuffer und 30 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) ligiert. Die DNA wurde danach durch Phenolisierung und Ethanol-Präzipitierung in der Anwesenheit von 0,4 M LiCl gereinigt. Das DNA-Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und schließlich in 100 μl Wasser resuspendiert.
Elektrokompetente Zellen
Für die Herstellung von elektrokompetenten Zellen wurde eine Vorkultur einer isolierten TG1-E. coli-Kolonie auf einer Minimal-Medium-Platte begonnen. 1 ml dieser Vorkultur wurde in 100 ml 2 × TY-Medium, ergänzt mit MgSO₄, übertragen und bei 18°C gezüchtet, bis eine OD von 0,5 (600 nm) erreicht wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3000 UpM, 10 min) geerntet und mehrfach (mindestens fünfmal) mit Wasser gewaschen. Das endgültige Zellpellet wurde in 1 ml 7% DMSO resuspendiert, und Aliquots von 50 μl wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert. Es wurde eine Transformierungseffizienz von mehr als 5 × 10⁸/μg pUC erreicht.
Transformierung und Genbank-Konstruktion.
Ein Aliquot von 1 μl der ligierten DNA-Probe wurde zu 50 μl elektrokompetenten TG1-Zellen in 2 mm-Elektroporationsküvetten (EUROGENTEC, Belgien) zugefügt, die auf Eis gehalten wurden. Nach der Elektrotransformierung (2,5 kV, 25 μF, 200 Ohm) werden die Zellen unmittelbar in 1 ml SOC-Medium überführt und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. 70 dieser Röhrchen wurden gemischt und auf insgesamt 50 große (24,3 cm × 24,3 cm) LB-Agarplatten, enthaltend 100 μg Ampicillin/ml, plattiert, um auf die transformierten Zellen zu selektieren, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Mindestens 5 × 10⁶ individuelle Transformanten wurden erhalten, und diese wurden von den Platten mit 2 × TY-Medium geschabt, durch Zentrifugation mit 2 × TY gewaschen und schließlich in 100 ml 2 × TY, 100 μg/ml Ampicillin, 1% Glucose und 50% Glycerin resuspendiert. Die bakterielle Suspension wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80°C eingefroren.
M13K07-Helferphasen-Herstellung
Eine Vorkultur von E. coli-Zellen, enthaltend M13K07, wird verwendet, um 1 Liter 2 × TY-Medium, ergänzt mit 70 μg/ml Kanamycin, zu beimpfen, und wird über Nacht bei 37°C unter starkem Schütteln inkubiert. Die Bakterien werden durch zwei Zentrifugationen (15 Minuten bei 8000 Upm) entfernt. Die bakteriellen Zellen, die im Überstand verbleiben, werden durch eine 30 Minuten-Inkubation bei 55°C hitzeinaktiviert. Der Überstand wird durch einen 0,2 μ-Filter gefiltert. Die Phagen können durch PEG-Präzipitation konzentriert werden. Zu diesem Zweck werden 1/5 Volumen von 2,5 M NaCl, 20% PEG 8000 (200 ml) zu dem 1 Liter Überstand zugefügt und das Gemisch für mindestens 1 Stunde auf Eis gehalten.
Die Probe wird für 40 Minuten bei 5000 UpM oder 15–20 Minuten bei 13000 UpM zentrifugiert. Das M13K07-Pellet wird in sterilem PBS (10 ml) resuspendiert. Die Konzentration der Phagen kann spektrophotometrisch bestimmt werden (OD 1 bei 260 nm entspricht 4 × 10¹⁰ Phagen/ml), oder der Titer kann durch Zugabe von Reihenverdünnungen in 10 ml MgCl₂ zu exponentiell wachsenden TG1-Zellen und Plattieren der Zellen auf LB-Platten, enthaltend 70 μg/ml Kanamycin, bestimmt werden. (M13K07 trägt das Kanamycin-Resistenzgen). Die Phagen werden auf einen Titer von mindestens 10¹² Phagen/ml gebracht.
Phagenrettung und Panning
1. Phagenrettung
Die Zellen, die transformiert sind oder die pHEN4-Rekombinanten tragen, werden in 2 × TY, Ampicillin (100 μg/ml), 1% Glucose gezüchtet. Die Zellen werden pelletiert, sobald die Kultur eine CD von 0,6 (600 nM) erreicht. Das Zellpellet wird in 2 × TY-Medium gewaschen und in demselben Medium, ergänzt mit Ampicillin (100 μg/ml), resuspendiert. Die Zellen werden mit M13K07 bei einer Multiplizität der Infektion von 10 bis 20 infiziert. Nach einer Inkubationsdauer von 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Zellsuspension auf 70 μg Kanamycin/ml gebracht und über Nacht bei 37°C unter starkem Schütteln inkubiert.
Die Viruspartikel und Virionen werden durch zuerst Entfernen der bakteriellen Zellen durch einen Zentrifugationsschritt (5000 UpM, 15 Minuten) und Filtration durch einen 0,4 oder 0,2 μm-Filter gereinigt. Die Phagen werden durch Zugeben von ¼ Volumen einer PEG-Lösung (20% PEG, 2,5 M NaCl) und Inkubation auf Eis für mindestens eine Stunde präzipitiert. Die Phagen werden durch eine 30 Minuten-Zentrifugation bei 15000 UpM pelletiert. Gelegentlich wurde ein zusätzlicher Präzipitationsschritt durch Resuspension der Phagen in ungefähr 1 ml PBS und Zugeben von 0,25 ml PEG-Lösung eingeschlossen. Nach der Inkubation auf Eis für 30 Minuten können die Phagen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13000 UpM in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletiert werden. Die Phagen werden in PBS resuspendiert (100 μl). Die Konzentration der Phagen wird durch UV-Absorption (260 nm) gemessen, eine CD von 1 entspricht einer Phagenkonzentration von 22 × 10¹⁰ Phagen/ml oder einer Konzentration von 44 × 10¹⁰ Phagemid-Virionen/ml. Die Phagen/Phagemide werden mit PBS, 0,1% Casein auf eine Konzentration von 10¹²/ml gebracht und für das Panning verwendet.
2. Panning
Zwei Verfahren wurden für das Panning verwendet. In einem Verfahren wurden Nunc-Immunoröhrchen (Nunc maxisorp, startubes) verwendet, um die Antigene über Nacht bei 4°C zu beschichten (1 ml Amylase (100 μg/ml PBS) oder 1 ml Carboanhydrase (100 μl/ml PBS), 1 ml Lysozym (200 μg/ml PBS) oder 1 ml RNase A (100 μg/ml TBS/CaCl₂ in 0,25% Glutaraldehyd)). Die Röhrchen wurden vor der Inkubation mit den geretteten Virionen zehnmal mit sterilem PBS gewaschen. Nach einer Stunde Inkubation werden die nicht gebundenen Virionen und Phagen durch mindestens 10 Waschschritte mit sterilem PBS, Tween entfernt. Die gebundenen Virionen und Phagen werden durch Zugabe von 1 ml Triethylamin (0,1 M) und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur eluiert, mit 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4, neutralisiert, 2 ml exponentiell wachsende TG1-Zellen werden zugefügt, und nach einer Inkubationsdauer von 20 Minuten werden die Zellen auf LB/Ampicillin-Platten plattiert. Am nächsten Tag werden die Kolonien von den Platten geschabt und können nach Rettung mit M13K07 für die nächste Runde des Panning verwendet werden.

Für das zweite Verfahren wurden 4 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für das Immobilisieren des Antigens verwendet (wie oben, aber mit 100 μl Volumen/Vertiefung). Das Waschen der Vertiefungen, die Inkubation mit den Phagen/Phagemiden und die Flution, Neutralisierung und TG1-Infektion sind, wie oben beschrieben. Der Hintergrund wird durch Zugeben von Viruspartikeln in die Vertiefungen, die nur mit dem blockierenden Agens (1% Casein in PBS) beschichtet sind, gemessen. Die Ergebnisse für die vier verschiedenen Antigene waren:

1. Runde	EINGABE	ELUIERT	HINTERGRUND
Amylase	4 × 10¹⁰	0,06 × 10⁶	0,025 × 10⁶
Carboanhydrase	4 × 10¹⁰	0,06 × 10⁶	0,025 × 10⁶
Lysozym	4 × 10¹⁰	0,1 × 10⁶	0,025 × 10⁶
RNase A	4 × 10¹⁰	0,06 × 10⁶	0,025 × 10⁶
2. Runde	EINGABE	ELUIERT	HINTERGRUND
Amylase	4 × 10¹¹	1,3 × 10⁶	0,27 × 10⁶
Carboanhydrase	4 × 10¹¹	1,3 × 10⁶	0,056 × 10⁶
Lysozym	4 × 10¹¹	0,26 × 10⁶	0,2 × 10⁶
RNase A	4 × 10¹¹	1,3 × 10⁶	0,048 × 10⁶
3. Runde
Amylase	4 × 10¹¹	2,8 × 10⁶	0,08 × 10⁶
Carboanhydrase	1 × 10⁸	0,05 × 10⁶	0,008 × 10⁶
Lysozym	1 × 10¹¹	0,5 × 10⁶	0,016 × 10⁶
RNase A	1 × 10¹¹	2,8 × 10⁶	0,004 × 10⁶

Selektion von individuellen Bindemolekülen
Nach der letzten Runde des Panning werden die Antigen-Bindemoleküle durch zufälliges Auswählen von 24 individuellen Clonen von der Platte und Züchten der Zellen in 2 × TY mit 100 μg Ampicillin/ml selektiert. Zwei Protokolle wurden verwendet, um das Vorliegen von Antigen-bindendem VHH nachzuweisen. Entweder wurde die VHH-Expression mit 1 mM IPTG induziert, wenn die Zellen die exponentielle Wachstumsphase erreichten, oder die Zellen wurden mit dem M13K07-Helferphagen infiziert. In der ersteren Strategie könnte die Antigen-Bindungskapazität des cAb in einem ELISA der Kulturüberstände mit einem monoclonalen anti-HA-Marker-Antikörper (Clon BBBB BAbCo) überprüft werden. In der zweiten Strategie werden die Virionen, die Antigen-Bindemoleküle auf ihrer Spitze haben, durch ELISA mit dem ante-M13-Nachweis-Kit (Pharmacia) gescreent.
Im ELISA-Experiment oder im Phagen-ELISA zeigten wir, dass 23 der 24 Clone von den Panning-Versuchen mit Carboanhydrase an die Carboanhydrase banden. Diese Clone wurden CA01 bis CA24 nummeriert. Für die Panning-Versuche mit RNase A wurden alle 24 Clone als positiv bewertet, diese werden als RN01 bis RN24 bezeichnet. Die Plasmid-DNA der Clone RN01 bis RN12 wurde hergestellt und die Insertion wurde sequenziert. RN02 und RN06 sind identisch, und RN06 wurde als Bezugnahme genommen. Alle anderen Clone sind identisch mit dem RN05-Clou, der als Bezugnahme für den zweiten Satz genommen wurde.
Für die Carboanhydrase wurden 12 Clone (CA01–CA12) sequenziert. Die Sequenz von CA01=CA06=CA07=CA09=CA12, die Clone CA04 und CA10 waren einzigartig und die Clone CA02, CA03, CA05, CA08 und CA08 waren identisch mit der Ausnahme des Vorliegens einer stillen Mutation in der CDR3 für CA05 und einer anderen ersten Aminosäure (die durch den PCR-Primer verursacht wurde). So traten mindestens 4 verschiedene Sätze von Clonen auf, von denen CA04, CA05, CA06, CA10 als die Bezugs-Clone genommen werden.
Die Nucleotidsäuresequenz von CA04 und CA05 ist im Beispiel 19 angegeben. Es kann gesehen werden, dass sowohl der CA04- und als auch der CA05-Clon tatsächlich ein VHH sind, der von einem Schwere Kette-Antikörper und nicht von einem konventionellen Antikörper (mit einer leichten Kette) stammt. Das Vorliegen der Schlüsselmarker Ser11 (Codon 31-33nc), Phe37 (Codon 109-111nc), Glu44-Arg45 (Condons 130-135nc) und Gly47 (Codon 139-141nc) beweist diese Aussage. Das Vorliegen einer möglichen Disulfidbrücke zwischen CDR1 und CDR3 in beiden Fällen, wie durch das Vorliegen von zusätzlichen Cysteinen angezeigt (Codons 97-99nc und Codon 313-315 für CA04 oder 319-321nc für CA05), wird auch häufig in Kamel-VHHs beobachtet. Die lange CDR3 von 18 Aminosäuren für CA04 (Codons 295-348nc) und von 19 Aminosäuren (Codons 289-345nc) für CA05 zeigt, dass beide cAbs eine lange dritte hypervariable Schleife haben, die ähnlich zu jener von cAb-lys3 ist.
Es wird im Beispiel 18a gezeigt werden, dass CA04 in die aktive Stelle der Carboanhydrase bindet, während CA05 dies nicht tut. Dies heißt nicht, dass die lange Schleife von CA05 nicht in die Furchen des Antigens binden kann, da aus der Kristallstruktur der Carboanhydrase bekannt ist, dass die aktive Stelle für dieses Enzym nur die zweitgrößte Furche des Enzyms ist. Die größte ist am anderen Ende der aktiven Stelle gelegen, und es könnte sein, dass die lange CDR3-Schleife des CA05 in diese Furche bindet.
Drei Verfahren wurden für das Panning verwendet. Im ersten Verfahren werden Nunc-Immunröhrchen (Bezugn.) verwendet, um die Antigene (Amylase, Carboanhydrase, Lysozym und RNase A) zu beschichten. Die Röhrchen wurden vor der Inkubation mit den geretteten Virionen zehnmal mit sterilem PBS gewaschen. Nach einer Inkubation für eine Stunde werden die nicht gebundenen Virionen und Phagen durch mindestens 10 Waschschritte mit sterilem PBS, Tween, entfernt. Die gebundenen Virionen und Phagen werden durch Zugabe von 1 ml Triethylamin (0,1 M) und Inkubieren für 5 Minuten bei Zimmertemperatur eluiert, mit 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4, neutralisiert. 2 ml der exponentiell wachsenden TG1-Zellen werden zugegeben, und nach einer Inkubationsdauer von 20 Minuten werden die Zellen auf LB/Ampicillin-Platten plattiert. Am nächsten Tag werden die Kolonien von den Platten geschabt und können für die nächste Runde des Panning nach einer Rettung mit M13K07 verwendet werden.
Für das zweite Verfahren wurden 4 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für das Immobilisieren der Antigene verwendet. Die Flution erfolgt mit 100 μl Triethylamin.
BEISPIEL 18a
Bindung des Kamel-Einzeldomäne-Antikörpers CA04 in die aktive Stelle der Carboanhydrase

Alle 24 Clone, die nach dem Panning mit Carboanhydrase isoliert wurden, wurden mit 1 mM IPTG induziert. Die exprimierten Kamel-Einzeldomäne-VHHs (cAbs) wurden vom Periplasma extrahiert und in einem ELISA-Experiment verwendet, in dem die Carboanhydrase in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte immobilisiert war. Die periplasmatisch extrahierten Proteine (100 μl) wurden in der Anwesenheit von 50 μl PBS oder 50 μl einer 2% Lösung aus Dorzolamid (TRUSOPT^R) oder einer 50 μl Acetazolamid-Lösung (DIAMOX^R-Cyanamid) inkubiert. Die zwei letzteren Wirkstoffe binden in die aktive Stelle der Carboanhydrase. Nach einer Stunde Inkubation werden die Vertiefungen mit PBS, Tween, gewaschen, mit 1/5000 BABCO-anti-HA-Antikörper in 0,1% Casein, PBS, für eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert, gewaschen und mit Kaninchen-anti-Maus-alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma) in einer 1/1000-Verdünnung inkubiert. Das Substrat ist pures Nitrophenylphosphat (2 mg/ml), und die Ablesungen wurden nach 10 Minuten bei 405 nm durchgeführt. (Tabelle)

CLONE/INHIBITOR	KEINE	Dorzolamid	Acetazolamid
CA01	0.75	0.143	0.17
CA02	1.04	0.85	0.90
CA03	1.04	0.86	0.94
CA04	0.74	0.22	0.26
CA05	0.85	0.75	0.77
CA06	0.62	0.25	0.27
CA07	0.87	0.23	0.28
CA08	1.22	1.06	1.120
CA09	0.83	0.17	0.23
CA10	0.68	0.64	0.64
CA11	1.00	0.93	0.92
CA12	0.79	0.14	0.18
CA13	0.89	0.15	0.19
CA14	0.68	0.13	0.30
CA15	0.22	0.12	0.14
CA16	0.88	0.46	0.47
CA17	0.48	0.12	0.13
CA18	0.73	0.13	0.17
CA19	0.74	0.13	0.17
CA20	0.74	0.13	0.17
CA21	0.84	0.15	0.20
CA22	0.84	0.15	0.19
CA23	1.04	0.99	1.01
CA24	1.13	1.09	1.15

Der Clon CA15 bindet nicht an Carboanhydrase oder ist ein schwaches Bindemolekül.
Der Clon CA16 wird durch sowohl Dorzolamid als auch Acetazolamid nur teilweise verdrängt.
Die Bindung von cAb CA02, CA03, CA05, CA08, CA10, CA11, CA23 und CA24 wird durch die an die aktive Stelle bindenden Wirkstoffe nicht verdrängt.
Die cAbs der Clone CA01, CA04, CA06, CA07, CA09, CA12, CA13, CA14, CA17, CA18, CA19, CA20, CA21, CA22 werden sowohl durch das Dorzolamid als auch das Acetazolamid verdrängt. Diese cAbs werden daher als Bindemoleküle der aktiven Stelle angesehen. Das Verhältnis der Bindemoleküle der aktiven Stelle ist 14 von 24 Clonen. Aus den Sequenzierungsdaten des CA01 bis CA12 wissen wir, dass es mindestens zwei verschiedenen Gruppen (CA04, CA06) unter den Bindemolekülen der aktiven Stelle gibt.
BEISPIEL 19
Erneute Clonierung und Expression von Bindemolekülen mit His6-Marker und cAb-Charakterisierung
Erneute Clonierung in pHEN6.
Der HA-Marker und das M13 pIII-Gen zwischen dem NotI- und EcoRI-Gen von pHEN4 wurde durch sechs His-Codons ersetzt. Innerhalb der SfiI- und NotI-Stellen wurde ein cAb-Lys 3-Gen inseriert (wobei das letzte Ser-Codon ,AGC' des VHH durch ,TCACGC' ersetzt wird, dies wird ein zusätzliches Ser-Arg-Dipeptid einbringen). Die folgende Sequenz wird für pHEN6-Lys3 erhalten (Figur).
Das Plasmid pHEN6-Lys3 wird mit HindIII und BstEII unter optimalen Puffer- und Temperaturbedingungen für die Enzyme (Gibco-BRL) verdaut. Das cAb-Lys3-enthaltende Fragment wird weiter durch einen zusätzlichen Verdau mit NcoI gespalten. Die linearisierte Plasmid-DNA wird durch Phenolisierung und Ethanol-Präzipitation in der Anwesenheit von 0,4 M LiCl gereinigt. Die DNA wird in 20 μl Wasser resuspendiert, 3 μl werden verwendet, um die Konzentration durch Fluoreszenz in einem Agarosegel zu schätzen, und das verbleibende Material wird auf eine Konzentration von 100 ng/μl gebracht.
Das pHEN4-CA04 und das pHEN4-CA05 werden in ähnlicher Weise durch HindIII und NotI verdaut. Das cAb-CA04- und das cAb-CA05-enthaltende Fragment werden aus dem Agarosegel mit Geneclean gereinigt. Ungefähr 100 ng dieser Fragmente (geschätzt aus der Fluoreszenz im Agarosegel) werden mit 100 ng des HindIII-NotI-geschnittenen pHEN6-Vektors gemischt und in einem Gesamtvolumen von 10 μl mit 2,5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) über Nacht bei Zimmertemperatur ligiert. Die ligierte DNA (2 μl) wird mit elektrokompetenten WK6-Zellen gemischt und auf LB/Ampicillin-Platten plattiert. Die pHEN6-CA04- oder pHEN6-CA05-enthaltenden Kolonien werden durch Kolonie-PCR mit dem universellen Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsprimer (Standard-PCR-Bedingungen) gescreent. Das Schneiden des PCR-Fragments mit Eco81I und die Auftrennung der resultierenden Fragmente auf einem 5%-Acrylamidgel ermöglicht die Identifizierung und Unterscheidung zwischen den Rest-pHEN6-Lys3- und pHEN6-CA04- oder pHEN6-CA05-Clonen aufgrund der größeren CDR3 der cAb-Lys3-Insertion.
Die Plasmide der positiv bewerteten Kolonien wurden mit dem alkalischen Lyse-Verfahren hergestellt und als eine Matrize für das Didesoxy-Sequenzieren verwendet. Die Sequenz des pHEN6-CA04 und pHEN6-CA05 zwischen den HindIII- und EcoRI-Stellen ist in den Figuren angegeben (das cAb-CA04 und cAB-CA05 sind fettgedruckt, und der his6-Marker ist unterstrichen).
Proteinexpression und -Reinigung
Eine über Nacht-Kultur von WK6-Zellen, die frisch mit dem Plasmid pHEN6-CA04 und pHEN6-CA05 transformiert wurden, wurde verwendet, um 8 Liter TB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 0,1% Glucose, zu beimpfen. Nach dem Züchten bei 37°C und wenn die Kultur ein Absorptionsvermögen von 0,75–1,0 bei 600 nm erreichte, wurde die Expression durch die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert, und die Zellkultur wurde für zusätzliche 16 Stunden bei 28°C fortgeführt. Die periplasmatischen Fraktionen wurden im Wesentlichen gemäß Skerra und Plückthun (Science 240, 1038–1041, 1988) hergestellt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 g für 10 Minuten bei 4°C geerntet und in 1% des ursprünglichen Volumens in eiskaltem TES-Puffer (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M Saccharose) resuspendiert. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden die Zellen durch die Zugabe von 1,5 Volumen-% eines eiskalten, ¼-verdünnten TES-Puffers einem milden osmotischen Schock ausgesetzt. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden die Zellen zweimal bei 13000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert, und PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM zu den 200 ml Überstand, der die periplasmatische Fraktion ausmachte, zugefügt.
Diese periplasmatische Fraktion wurde durch Ultrafiltration in einer Amicon-Zelle (Millipore-Filter mit einer MG-Ausschlussgrenze von 5 kDa) zehnfach konzentriert, bevor sie auf eine 2 ml-Ni-NTA-Affinitätssäule (Qiagen) gebunden wurde. Nach dem Waschen mit 40 ml 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin-Puffer wurde der 6xHis-markierte Einzeldomäne-Antikörper mit 40 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M Imidazol in demselben Puffer eluiert. Die Fraktionen, die cAb-CA04 beziehungsweise cAb-CA05 enthielten, wurden gepoolt, durch Ultrafiltration zehnfach konzentriert, und das Imidazol wurde durch Leiten über eine Superdez-75 (Pharmacia)-Säule unter Verwendung von PBS-Puffer entfernt. 1,5 mg reines Protein wurden erhalten (spektrophotometrisch bei 280 nm gemessen) und durch Ultrafiltration auf eine Konzentration von 3 mg/ml konzentriert.
BEISPIEL 20
Affinitätsmessung des CA04-HIS-Konstrukts durch kompetitiven ELISA
Transformierte TG1-Zellen wurden mit IPTG für die Produktion von löslichem Protein induziert. Nach dem Ernten der Zellen von 40 ml Kultur wurde die periplasmatische Fraktion hergestellt. Kurz, das Pellet wurde in eiskaltem TES (1,2 ml 50 mM TRIS, pH 5, mM EDTA, 20% Saccharose) resuspendiert und für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand entfernt, und das Pellet wurde in 1,2 ml gekühltem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde für weitere 30 Minuten auf Eis belassen. Nach der Zentrifugation bei 14000 UpM wurde der Überstand gewonnen und in folgenden Eindungs- und Kompetitions-Tests verwendet.
Sowohl für Eindungs- als auch Kompetitions-Tests wurde Carboanhydrase auf Maxisorb-Platten (Nunc) in einer Konzentration von 1 μg/ml in PBS (100 μl über Nacht bei 4°C) beschichtet. Die Platten wurden mit 200 μl 1% Casein in PBS für 2 h bei Zimmertemperatur blockiert. Für den Kompetitions-Test wurden Gemische des Überstands in einer 1/100-Verdünnung in 0,1% Casein/PBS mit freiem Antigen, das in der Konzentration zwischen 1–10⁴ nM variierte, hergestellt. 100 μl dieser Gemische wurden zu verschiedenen Vertiefungen der Platte zugefügt. Nach 2 h wurde gebundenes CA04-HIS mit einem monoclonalen Histidin-Marker-spezifischen Antikörper (Dianova, dia900, monoclonaler Maus-Antikörper IgG1, anti-(His)₆-Marker) und danach mit Kaninchen-anti-Maus-alkalische Phosphatase-Konjugat nachgewiesen. Beide sekundären Reagenzien wurden in einer Verdünnung von 1/1000 in 0,1% Casein/PBS verwendet. Das Substrat (100 μl 2 mg/ml Paranitrophenylphosphat in ELISA-Puffer) wurde zugefügt, und nach 15 Minuten wurde die CD bei 405 nm gemessen. Aus der Darstellung der CD 405 nm gegen die Konzentration von freiem Antigen wurde eine Kd von 50 nM geschätzt.
BEISPIEL 21
Affinitätsmessung und kinetische Analyse der CA04: Carboanhydrase-Wechselwirkung
Die kon, koff und Kd der CA04-Carboanhydrase-Wechselwirkung wurden mit einem IAsys-Biosensor-Instrument bestimmt.
Eine IAsys-Carboxymethyldextran-Küvette (CMD) wurde verwendet, um die Wechselwirkung zu verfolgen. Das Antigen wurde auf der Küvette durch elektrostatische Absorption in der CMD-Matrix und durch die nachfolgende kovalente Reaktion der Lysyl-Gruppen mit den aktivierten Carboxyl-Gruppen auf dem CMD-Polymer immobilisiert. Die Aktivierung der Carboxyl-Gruppen wurde durch die EDC/NHS-Kopplungs-Chemie (Johnson et al) unter Verwendung eines EDC/NHS-Kopplungs-Kits (Affinity Sensors) erreicht.
Nach einer 7 Minuten-Aktivierung der CMD-Küvette wurde die Küvette mit 10 mM NaAc-Puffer gewaschen. 100 μg/ml Carboanhydrase wurden zu der Küvette zugefügt und für 10 Minuten reagieren gelassen. Nach dem Waschen der Küvette mit PBS wurden die verbleibenden aktivierten Carboxyl-Gruppen danach durch Zugabe von 1 M Ethanolamin, pH 8,0, desaktiviert. Nach der Desaktivierung wurden einige Waschschritte mit 10 mM NaOH durchgeführt, um jegliche Carboanhydrase zu entfernen, die nicht kovalent gebunden war. Die Berechnung der Menge an immobilisiertem Antigen ergab einen Wert von 6 ng/mm². Die Stöchiometrie der Bindung wurde durch Zugabe einer sättigenden Menge von CA04 zu der Küvette gemessen und war gleich 0,4.
Alle Experimente wurden in PBS bei 27°C und einer Rühr-Einstellung von 100 durchgeführt. Die Regenerierungs-Bedingungen wurden optimiert. Ein Waschschritt für eine Minute mit 10 mM NaOH wurde verwendet.
Die Bindungsspuren für verschiedene Konzentrationen von CA04 (2·10^-8 bis 1,5·0^-7M) wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und bis zum Äquilibrium laufen gelassen. Die Kurven wurden mit einem einzelnen Exponential unter Verwendung von FASTfit (Affinity Sensors) angepasst. Grundlinien-Korrekturen wurden in Betracht gezogen. Die resultierenden Konstanten von pseudo-erster Ordnung, die aus diesen Anpassungen erhalten wurden, wurden gegen die Konzentration von CA04 dargestellt. Die kon wurde durch lineare Regression bestimmt und ergab einen Wert von 6,2·10⁵ M^-1s^-1. Der Wert wird aufgrund des Auftretens von Massentransport-Einschränkungen als eine untere Grenze festgesetzt. Dies wurde durch eine Darstellungsableitung des Signals gegen das Signal für eine hohe Konzentration von CA04 gesehen, das eine signifikante Krümmung zeigte.
Dissoziierungsphasen, wo die Küvette nach der Zugabe von sättigenden Mengen von CA04 mit PBS gewaschen wird, wurden in der Anwesenheit von 0,6 μM Carboanhydrase (in dreifacher Ausführung) verfolgt. Die Kurven wurden unter Verwendung der FASTfit-Software (Affinity Sensors) angepasst. Die Kurven wurden auf ein doppeltes Exponential angepasst, in dem die langsamere Phase so interpretiert wurde, dass sie das Ergebnis einer Wiederbindung ist, während die schnellere die tatsächliche Ablösungsrate reflektiert. Dieser Wert ist gleich 0,02 s^-1.
Die Berechnung der Kd basierte auf den kinetischen Analyse-Erträgen eines Werts gleich 32 nM.
Der Kd-Wert wurde auch durch Darstellen der Gleichgewichtswerte gegen die Konzentration von CA04 (3·10^-8 bis 1·10^1-7M) bestimmt und wieder unter Verwendung von FASTfit (Affinity Systems) auf ein hyperbolisches Verhältnis angepasst. Der Kd-Wert, der aus dieser Analyse erhalten wurde, war gleich 60 nM.
BEISPIEL 22
Hemmung der Rinder-Erythrocyten-Carboanhydrase durch Ca04-His
Die Carboanhydrase (Sigma.C-3934) wurde in PBS gelöst, und die Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch bei 280 nm unter Verwendung von E1%=19 bestimmt.
Die Konzentration des gereinigten CA04-His wurde spektrophotometrisch unter Verwendung eines berechneten Extinktionskoeffizienten von E1%=17 (PcGene) bestimmt. Das Enzym wurde in einer festgelegten Endkonzentration von 2,3 μM mit variablen Mengen von CA04-His (Bereich 1–8 μM) in einem konstanten Volumen von 60 μl gemischt. Nach einer Vorinkubation für 15 Minuten bei Zimmertemperatur wurden 945 μl PBS und 5 μl Paranitrophenylacetat (2% Lösung in absolutem Ethanol) zugefügt (Pocker Y. und Stone J.T., Biochemistry, 6, 1967, 668–678). Das Reaktionsgemisch wurde sofort in eine Küvette transferiert, und der Anstieg in der OD405nm wurde für mindestens 5 Minuten bei Zimmertemperatur überwacht. Die enzymatischen Geschwindigkeiten wurden auf eine spontane Hydrolyse des Substrats korrigiert. Eine Restaktivität wurde relativ zu der enzymatischen Aktivität, die in der Abwesenheit von CA04-HIS gemessen wurde, berechnet.
BEISPIEL 23
In vivo-Neutralisation von Tetanustoxin

Der in vivo-Neutralisationstest von Tetanustoxin wird durchgeführt, wie durch Simpson et al. (J. Pharm. Exp. Therapeutics 254, 98–103, 1990) beschrieben. 64 NMRI-Mäuse (männlich und weiblich) im Alter von 8–12 Wochen werden zufällig in 8 Gruppen (4 Männchen und 4 Weibchen) eingeteilt. In die Mäuse werden i.p. Tetanustoxin (RIT, Smith Kline Beecham, Rixensart, Belgien), Antikörper-Fragmente oder beides injiziert, wie folgt:

Gruppe 1	PBS + cAb-TT1
Gruppe 2	PBS + cAb-TT2
Gruppe 3	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50)
Gruppe 4	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50) + cAb-TT1 (4 μg)
Gruppe 5	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50) + cAb-TT1 (40 μg)
Gruppe 6	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50) + cAb-TT2 (4 μg)
Gruppe 7	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50) + cAb-TT2 (40 μg)
Gruppe 8	PBS + Tetanustoxin (10 × LD50) + nicht spezifischer cAb-VHH21 (40 μg)

Das Gesamtvolumen der Injektion ist in allen Fällen 0,1 ml. Das Gemisch von VHHs und Tetanustoxin wird vor der Injektion für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Mäuse werden für zwei Wochen beobachtet.

Claims

Molekül zur Verwendung in der Therapie, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein V_HH ist, das aus
einer der folgenden Proteinsequenzen besteht:
Molekül wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Neutralisierung der biologischen Funktion des biologisch aktiven Zielmoleküls.
Verwendung eines Moleküls, das eine V_HH-Domäne einer schweren Kette eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung pankreatischer Störungen.
Molekül zur Verwendung in der Therapie, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül ein virusspezifisches Protein ist.
Molekül zur Verwendung in der Therapie, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül ein spezifisches bakterielles Protein ist, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein VHH eines Ig ist, das ohne leichte Kette ist, bestehend aus der Sequenz von αTT1 oder αTT2 wie in Anspruch 1 definiert.
Verwendung eines Moleküls, das eine V_HH-Domäne einer schweren Kette eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch Salmonella oder Influenza-Virus verursachten Infektion.
Molekül wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Hemmung der Aktivität eines Enzyms.
Molekül nach Anspruch 7, wobei die CDR3-Schleife mit den katalytischen Resten des Enzyms wechselwirkt.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül ein Enzym ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIV-Protease, HIV-reverse Transkriptase, SIV-Protease, alkalische Protease von Pseudomonas aeruginosa, Faktor Xa, einer RNase, Angiogenin, einer Sialidase, einer Amylase, einer beta-Glucanase und Carboanhydrase, zur Verwendung in der Hemmung der Aktivität des Enzyms.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette- Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül eine Protease ist, zur Verwendung in der Hemmung der Aktivität der Protease, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein V_HH eines Ig ist, das ohne leichte Kette ist, bestehend aus der Sequenz von αTT1 oder αTT2 wie in Anspruch 1 definiert.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere-Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül ein Lysozym ist, zur Verwendung in der Hemmung der Aktivität des Lysozyms, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein V_HH eines Ig ist, das ohne leichte Kette ist, bestehend aus der Sequenz von αLYS2 oder αLYS3 wie in Anspruch 1 definiert.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül eine toxische Substanz ist, zur Verwendung in der Hemmung des schädlichen Effekts toxischer Substanzen durch Wechselwirken mit Aminosäureresten, die Teil der toxischen Stelle der toxischen Substanz sind, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein VHH eines Ig ist, das ohne leichte Kette ist, bestehend aus der Sequenz von αTT1 oder αTT2 wie in Anspruch 1 definiert.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette- Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül eine toxische Substanz ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Toxisches-Schock-Syndrom-Toxin 1 aus Staphylococcus aureus, einem Enterotoxin B-Protein aus Staphylokokken, einem Choleratoxin, einem Schlangengift, Adamalysin II der Klapperschlange, Cardiotoxin CTX IIb aus Naja Mosambica, Cardiotoxin CTX V der Taiwan-Kobra, Dendrotoxin der Schwarzen Mamba, Flavoridin-Neurotoxin-I und -II der Asiatischen Kobra, Metalloproteinase niedrigen Gewichts Ht-c und Ht-d aus Crotalus atrox, einem Honigbienengift, Apamin, Tertiapin und einem Spinnengift, zur Verwendung in der Hemmung des schädlichen Effekts toxischer Substanzen durch Wechselwirken mit Aminosäureresten, die Teil der toxischen Stelle der toxischen Substanz sind.
Molekül, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das biologisch aktive Zielmolekül ein bakterielles Toxin ist, zur Verwendung in der Hemmung des schädlichen Effekts des bakteriellen Toxins durch Wechselwirken mit Aminosäureresten, die Teil der toxischen Stelle des bakteriellen Toxins sind, mit der Maßgabe, dass das Molekül nicht ein VHH eines Ig ist, das ohne leichte Kette ist, bestehend aus der Sequenz von αTT1 oder αTT2 wie in Anspruch 1 definiert.
Molekül nach Anspruch 14, wobei das bakterielle Toxin Tetanustoxin ist.
Verwendung eines Moleküls, das eine V_HH-Domäne einer schweren Kette eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten parasitischen Ursprungs.
Molekül zur Verwendung in der Therapie, das eine V_HH-Domäne eines Schwere Kette-Antikörpers eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, wobei das Zielmolekül ein Rezeptor ist.
Verwendung eines Moleküls, das eine V_HH-Domäne einer schweren Kette eines Cameliden ist, umfassend eine CDR3-Schleife eines Schwere Kette-Antikörpers einer Camelidenart, wobei die CDR3-Schleife aus der Antigen-Bindungsstelle herausragt und die Reste des aktiven Zentrums eines biologisch aktiven Zielmoleküls erkennt und damit wechselwirkt, zur Herstellung diagnostischer Testkits.
Molekül wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Immunisierung.