CN105380904A - 用于制备气雾剂的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备气雾剂的方法。更具体地，本发明提供了用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中显著减少聚集体形成的量。本发明另外提供了通过本发明的方法制备的气雾剂，以及用于本发明的方法中的组合物。本发明另外涉及用于制备所述组合物的方法，包含所述组合物的容器、试剂盒和气雾剂递送系统，以及它们的用途。
Description
本申请是申请日为2011年2月11日、发明名称为“用于制备气雾剂的方法和组合物”的中国专利申请No.201180009097.7的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于制备气雾剂的方法。更具体地，本发明提供了用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中显著减少聚集体形成的量。本发明另外提供了通过本发明的方法制备的气雾剂，以及用于本发明的方法中的组合物。
本发明另外涉及用于制备所述组合物的方法，包含所述组合物的容器、试剂盒和气雾剂递送系统，以及它们的用途。
从本文中的进一步描述，会明白本发明的其它方面、实施方案、优点和应用。
背景技术
免疫球蛋白单可变结构域(如本文进一步所述)的特征在于，由单可变结构域形成抗原结合位点，其不需要与另外的结构域相互作用(例如以VH/VL相互作用的形式)来进行抗原识别。已经描述了针对宽范围的不同靶标的免疫球蛋白单可变结构域(WO04/062551、WO05/044858、WO06/040153、WO06/122825、WO07/104529、WO08/020079、WO08/074839、WO08/071447、WO08/074840、WO08/074867、WO08/077945、WO08/101985、WO08/142164、WO09/068625、WO08/142165、WO09/068627)，它们可以成为药物开发的候选物。在例如WO09/068627中，已经描述了针对IL-23的p19亚基的免疫球蛋白单可变结构域，其阻断IL-23与它的受体的相互作用。例如在WO09/147248中，已经描述了针对人呼吸道合胞病毒(hRSV)的F蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，其可以中和hRSV。
在临床前或临床开发中的大多数免疫球蛋白单可变结构域已经肠胃外地(即通过静脉内或皮下给药)施用，且已经描述了用于这些给药方法的稳定制剂(参见例如基于美国临时申请号US61/275,816(2009年9月3日提交)的PCT申请号PCT/EP2010/062972(2010年9月3日提交)，和基于美国临时申请号US61/284,502(AblynxN.V.于2009年12月18日提交)的PCT申请号PCT/EP2010/062975(2010年9月3日提交))。但是，这些递送方法具有相当低的患者接受性，因此需要可以由患者自己容易地执行的替代性的、更方便的(无针头的)给药模式。
一种可能的替代方法是，通过肺递送免疫球蛋白单可变结构域。通过吸入、口服地和/或经鼻地，可以实现肺药物递送。用于肺递送的药用装置的实例包括：定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和雾化器。传统地，已经将雾化器分类成2个主要类型：空气喷射(气动的)装置和超声装置。最近，第三类振动网孔式雾化器(vibrating-meshnebulizer)已经商业化(Newman和Gee-Turner,2005,J.Appl.Ther.Res.5:29-33)。
雾化器是开发用于肺递送的基于药用蛋白的药物的合理首选，因为大多数蛋白质经过纯化，并作为水性浓缩物进行储存。但是，货架上的水溶液的稳定性可能不能转换为雾化过程中的稳定性，蛋白质可能通过几种机理变性，所述机理包括干燥、剪切和表面效应(Charm和Wong,1970,Biotechnol.Bioeng12:1103-1109；Andrews,1991,Biochem.Soc.Trans,272S19)。例如，经证实，雾化会诱发乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性的丧失，并导致重组人粒细胞刺激因子(G-CSF)的聚集(主要由二聚体形成组成)和降解(Niven和Brain,1994,Int.J.Pharm.,104:73-85)。
WO04/041867描述了用于免疫球蛋白单可变结构域的肺递送的方法和组合物。在WO09/074634中，描述了直接肺递送结构域抗体的方法，和适用于直接肺递送的具体结构域抗体组合物。更具体地，描述了这样的组合物，所述组合物包含结构域抗体多肽和含有2％至约10％PEG1000和1.2％蔗糖(w/v)的缓冲液。这些结构域抗体组合物似乎具有这样的粘度：所述粘度允许产生具有正确尺寸的足够微滴，所述尺寸适合通过直接局部肺递送施用给受试者。上述文件都没有描述或讨论在免疫球蛋白单可变结构域的肺递送过程中的聚集体形成的减少和/或稳定性的提高。仍然需要用于通过肺途径递送完整的和有功能的免疫球蛋白单可变结构域的其它方法和组合物。
发明内容
本发明提供了一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂(也称作“本发明的气雾剂”；如本文进一步定义的)的方法(也称作“本发明的方法”或“本发明的多种方法”)，所述气雾剂具有低至不可检测的聚集水平和/或没有免疫球蛋白单可变结构域的生物活性和/或效价的显著损失。本发明的方法包括下述步骤：雾化组合物(也称作“本发明的组合物”或“本发明的多种组合物”；如本文进一步定义的)，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽(也称作“本发明的多肽”或“本发明的多种多肽”；如本文进一步定义的)。在本发明中已经证实，某些要素在将被雾化的组合物(“本发明的组合物”)中的存在和/或选择的气雾剂递送系统的使用，会显著地(且出人意料地)减少雾化材料中的聚集体形成的量，并因此减少在雾化材料中存在的本发明的多肽的生物活性和/或效价的损失。已经证实，聚集体形成的量可以减少至7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低。
在一个方面，去污剂在本发明的组合物中的存在会显著减少雾化材料中的聚集体形成的量。因此，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在一个具体方面，当本发明的多肽以低于20mg/ml的浓度(例如以5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)存在于本发明的组合物中时，去污剂在本发明的组合物中的存在会显著减少雾化材料中的聚集体形成的量。因此，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，在所述气雾剂中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如在5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度下)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂以0.001％至0.1％(v:v)、或0.01％至0.1％(v:v)，诸如约0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)或0.1％(v:v)，优选约0.04％至约0.08％(v:v)、尤其是0.04％的浓度存在于组合物中。在一个优选的方面，所述表面活性剂选自：非离子型去污剂，诸如聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆(例如)。在另一个方面，可以加入聚乙二醇(PEG)作为表面活性剂-样化合物。在还有的另一个方面，所述组合物包含如上所述的不是PEG的表面活性剂。具体地，所述组合物不包含在50mM磷酸盐缓冲液(含有1.2％(w/v)蔗糖)中的约2％至约10％PEG1000。聚集体形成的减少是出人意料的，特别是在如此低的表面活性剂的浓度下。
本发明的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)在本发明的组合物中的存在，也会显著减少雾化材料中的聚集体形成的量。因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于本发明的组合物中。
在一个具体方面，本发明的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)在本发明的组合物中的存在，会在没有表面活性剂存在下显著减少雾化材料中的聚集体形成的量。因此，在还有的另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如在25mg/mL或更高的浓度，或在50mg/mL或甚至更高的浓度下)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物不包含表面活性剂。
在一个优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/mL或甚至更高的浓度存在于所述组合物中。在一个最优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。在更高浓度(诸如在20mg/mL或更高的浓度，例如在25mg/mL或更高的浓度，或在50mg/mL或甚至更高的浓度)时的聚集体形成的减少(例如，浓度和聚集体形成之间的反相关性)是出人意料的。
将特定气雾剂递送系统(即振动网孔式或振动膜式雾化器)用于雾化本发明的组合物，也会显著减少雾化材料中的聚集体形成的量。因此，在还有的另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。使用振动网孔式或振动膜式雾化器导致的聚集体形成的减少是出人意料的。
本发明的方法优选地能够生产具有下述体积中值直径的气雾剂：1-10μm，优选1-7μm，最优选1-5μm，诸如约3、3.5或4μm。
本发明也涉及通过本发明的方法制备的气雾剂(“本发明的气雾剂”)。所述气雾剂优选地具有下述体积中值直径：1-10μm，优选1-7μm，最优选1-5μm，诸如约3、3.5或4μm。因此，在一个方面，本发明涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述雾化材料中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在一个具体方面，本发明涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如在5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述雾化材料中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂以0.001％至0.1％(v:v)或0.01％至0.1％(v:v)，诸如约0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)或0.1％(v:v)，优选约0.04％至约0.08％(v:v)、尤其是0.04％的浓度存在于所述组合物中。在一个优选的方面，所述表面活性剂选自：非离子型去污剂，诸如聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆。在另一个方面，可以加入PEG作为表面活性剂-样化合物。在另一个方面，所述表面活性剂不是PEG。具体地，所述组合物不包含在50mM磷酸盐缓冲液(含有1.2％(w/v)蔗糖)中的约2％至约10％PEG1000。
在另一个方面，本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述雾化材料中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中。
在还有的另一个方面，本发明涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述雾化材料中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中，且其中所述组合物不包含表面活性剂。
在一个优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/ml或甚至更高的浓度存在于所述组合物中。在一个最优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/ml的浓度存在于所述组合物中。
在还有的另一个方面，本发明涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，其中在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
本发明也涉及一种适合用于本发明的方法中和/或适合用于制备本发明气雾剂的组合物(“本发明的组合物”或“本发明的多种组合物”)。因此，在一个方面，本发明涉及一种适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在一个具体方面，本发明涉及一种适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如在5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度下)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂以0.001％至0.1％(v:v)或0.01％至0.1％(v:v)，诸如约0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)或0.1％(v:v)，优选约0.04％至约0.08％(v:v)、尤其是0.04％的浓度存在于所述组合物中。在一个优选的方面，所述表面活性剂选自：非离子型去污剂，诸如聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆。在另一个方面，可以加入PEG作为表面活性剂-样化合物。在还有的另一个方面，所述表面活性剂不是PEG。具体地，所述组合物不包含在50mM磷酸盐缓冲液(含有1.2％(w/v)蔗糖)中的约2％至约10％PEG1000。
在另一个方面，本发明涉及一种适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中。
在另一个方面，本发明涉及一种适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是7％或更低，优选6％或更低、5％或更低，诸如4％或更低、3％或更低、2％或更低、或甚至1％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中，且其中所述组合物不包含表面活性剂。
在一个优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/mL或甚至更高的浓度存在于所述组合物中。在一个最优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/ml的浓度存在于所述组合物中。
所述多肽(也称作“本发明的多肽”或“本发明的多种多肽”)包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域(如本文定义)或基本上由其组成。在一个方面，本发明的多肽包含一个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。在另一个方面，本发明的多肽包含2个或更多个(诸如2个或3个)免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。在另一个方面，本发明的多肽特异性地结合hRSV或IL-23。在另一个方面，本发明的多肽选自SEQIDNO:1、2和3之一。
本发明也涉及用于制备本发明的组合物的方法。所述方法至少包括下述步骤：浓缩所述多肽，并用选择的缓冲液交换它。在一个方面，所述用于制备本发明的组合物的方法另外包括下述步骤：加入浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在一个具体方面，所述用于制备本发明的组合物的方法包括下述步骤：浓缩所述多肽至低于20mg/ml的浓度(例如在5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)，且另外包括下述步骤：加入浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
优选地，以0.001％至0.1％(v:v)或0.01％至0.1％(v:v)，诸如约0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.04％(v:v)、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)或0.1％(v:v)，优选约0.04％至约0.08％(v:v)、尤其是0.04％的浓度，加入所述表面活性剂。在一个优选的方面，所述表面活性剂选自：非离子型去污剂，诸如聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆。在另一个方面，可以加入PEG作为表面活性剂-样化合物。在还有的另一个方面，所述表面活性剂不是PEG。具体地，所述组合物不包含在50mM磷酸盐缓冲液(含有1.2％(w/v)蔗糖)中的约2％至约10％PEG1000。
在另一个方面，在所述用于制备本发明的组合物的方法中，将所述多肽浓缩至20mg/mL或更高的浓度，例如在25mg/mL或更高的浓度，或在50mg/mL或甚至更高的浓度。
在另一个方面，在所述用于制备本发明的组合物的方法中，将所述多肽浓缩至20mg/mL或更高的浓度，例如在25mg/mL或更高的浓度，或在50mg/mL或甚至更高的浓度，且不加入表面活性剂。
在一个优选的方面，将所述多肽浓缩至30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/ml或甚至更高的浓度。在一个最优选的方面，所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/ml的浓度存在于所述组合物中。
本发明另外提供了本发明的方法、气雾剂和组合物的用途。本发明的方法、气雾剂和组合物可以用于制备药物，所述药物通过气雾剂递送系统递送给人受试者。优选地，通过雾化(诸如通过振动网孔式雾化器)来递送所述药物。
还提供了气雾剂递送系统。所述气雾剂递送系统应当至少包括容器和与所述容器相连的气雾剂发生器，其中所述容器包含本发明的组合物。所述气雾剂递送系统可以是雾化器。在本发明的一个方面，所述气雾剂递送系统是振动网孔式雾化器。
另外提供了包含本发明的组合物的容器、试剂盒和药物单位剂量，其用于由例如保健专业人员来使用。所述包含本发明的组合物的容器、试剂盒或药物单位剂量应当适合将本发明的多肽经肺施用给人受试者。优选地，所述包含本发明的组合物的容器、试剂盒或药物单位剂量应当适合通过气雾剂递送系统(例如雾化器)将本发明的多肽施用给人受试者。在本发明的一个方面，所述雾化器是振动网孔式雾化器。
所述组合物、容器、气雾剂递送系统、雾化器、药物单位剂量和/或试剂盒可以用于预防和/或治疗中。在一个具体的方面，所述组合物、容器、气雾剂递送系统、雾化器、药物单位剂量和/或试剂盒被用于预防和/或治疗一种或多种疾病和/或病症，诸如呼吸疾病和/或病症(例如hRSV感染)。因此，本发明也涉及一种用于预防和/或治疗一种或多种疾病和/或病症(诸如一种或多种呼吸疾病)的方法，所述方法包括下述步骤：通过气雾剂递送系统，给有此需要的受试者施用本发明的组合物。在一个方面，治疗的疾病和/或病症是hRSV感染。在另一个方面，通过雾化器(诸如振动网孔式雾化器)施用所述组合物。
本发明也涉及组合物、容器、试剂盒、药物单位剂量、气雾剂递送系统和/或雾化器用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗呼吸疾病(例如hRSV感染)。
附图说明
图1.在有不同的缓冲剂(含有甘露醇作为渗透剂(osmolarityagent))存在下，RSV434的熔化温度(Tm)的比较。在0.1mg/mL，通过热迁移试验(TSA)进行测量。
图2.在有不同的缓冲剂/赋形剂组合物(以0.3M浓度使用甘氨酸和甘露醇，以0.15M浓度使用NaCl)存在下，通过雾化的RSV434(5mg/mL，通过Omron网孔式雾化器雾化)的SE-HPLC分析测定的前峰(pre-peaks)的百分比(％)。
图3:在有不同的缓冲剂/赋形剂组合物(含有吐温80和/或PEG1000)存在下，通过雾化的RSV434(5mg/mL，通过Omron网孔式雾化器雾化)的SE-HPLC分析测定的前峰的百分比(％)。
图4.与未雾化物质(REF)相比，在经由Akita2ApixnebTM雾化器(一种振动网孔式雾化器)雾化5mg/ml的RSV434溶液(雾化)以后，来自SE-HPLC分析数据的前峰形成的图示。
图5.与未雾化的参照材料相比，在经由Akita2ApixnebTM雾化器(一种振动网孔式雾化器)雾化5mg/ml的RSV434溶液以后，来自SE-HPLC分析数据的蛋白回收率的图示。
图6.经由Akita2ApixnebTM雾化器(一种振动网孔式雾化器)雾化5、25和50mg/ml的RSV434溶液以后，来自SE-HPLC分析数据的前峰形成的图示。
图7.经由喷射雾化器(一种喷射式雾化器)雾化5、25和50mg/ml的RSV434溶液以后，来自SE-HPLC分析数据的前峰形成的图示。
图8.在经由Akita2ApixnebTM雾化器雾化RSV434溶液(含有不同的蛋白浓度，且在不同的缓冲剂/赋形剂组合物的存在下)以后，通过激光衍射测量的平均微滴尺寸(表示为体积中值直径(VMD))。在X-轴上的标记表示产物代码和在表8中指出的有关的组合物。
图9.RSV434的SE-HPLC色谱图的基线区域的放大图，所述RSV434是在下述10mM磷酸盐+0.13MNaClpH7.0中：(A)不含有吐温80，50mg/mL，(B)含有0.04％吐温80，50mg/mL，(C)不含有吐温80，5mg/mL，(D)含有0.04％吐温80，5mg/mL。该图将与所有多聚形式相对应的前峰指示为“总前峰”，将与高分子量物质相对应的前峰(或前峰1)指示为“HMW物质”。可以解释色谱图(A)和(B)与色谱图(C)和(D)之间的保留时间的差异，因为(A)和(B)以0.15mL/min运行，而(C)和(D)以0.2mL/min运行。
具体实施方式
除非指明或另外定义，使用的所有术语具有它们在本领域中的通用意义，其对于熟练的技术人员是显而易见的。例如，可以参考标准手册，诸如Sambrook等,“MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)”(第二版)，1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版)(1989)；F.Ausubel等编辑，“Currentprotocolsinmolecularbiology(现代分子生物学方法)”，GreenPublishingandWileyInterscience，纽约(1987)；Lewin，“GenesII(基因II)”，JohnWiley&Sons，纽约，N.Y.，(1985)；Old等，“PrinciplesofGeneManipulation：AnIntroductiontoGeneticEngineering(基因操作原理：遗传工程入门)”，第二版，UniversityofCaliforniaPress(加利福尼亚大学出版)，Berkeley，CA(1981)；Roitt等，“Immunology(免疫学)”(第六版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等，Roitt’sEssentialImmunology(Roitt’s基础免疫学)，第十版.BlackwellPublishing，UK(2001)；和Janeway等，“Immunobiology(免疫学)”(第六版)，GarlandSciencePublishing/ChurchillLivingstone，纽约(2005)，以及本文所引用的一般背景技术。
在多肽的背景下，本文使用的术语“分离的”表示这样的多肽：其基本上不含有细胞或组织源的细胞物质或污染蛋白(所述多肽衍生自所述细胞或组织源)，或当化学合成时，基本上不含有化学前体或其它化学试剂。语言“基本上不含有细胞物质”包括这样的多肽制剂：其中所述多肽与细胞的细胞组分分离(从所述细胞分离出或重组地生产所述多肽)。因而，基本上不含有细胞物质的多肽包括这样的多肽制剂：其具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的异源蛋白、多肽、肽或抗体(也称作“污染蛋白”)。当重组地生产多肽时，它也可以基本上不含有培养基，即，培养基占所述多肽制剂的体积的少于约20％、10％或5％。当通过化学合成来生产多肽时，它优选地基本上不含有化学前体或其它化学试剂，即，它与参与多肽合成的化学前体或其它化学试剂分离开。因此，这样的多肽制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计算)的不是目标多肽的化学前体或化合物。在一个具体的实施方案中，通过多步纯化过程来纯化“分离的”多肽，所述多步纯化过程包括2个色谱步骤(例如阳离子交换和阴离子交换)、100K超滤步骤，接着是超滤/渗滤模式的缓冲液更换和浓缩步骤。
本文使用的术语“受试者”和“患者”可互换地使用。本文使用的术语“受试者”和“多个受试者”表示动物，优选哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴、黑猩猩、狒狒和人)，更优选人。在一个特定实施方案中，所述受试者是具有一种或多种疾病或病症的哺乳动物，优选人。在另一个实施方案中，所述受试者是处于发展一种或多种疾病和/或病症的风险中的哺乳动物，优选人。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指，被联邦或州政府的管理机构批准，或列在美国药典、欧洲药典或其它普遍公认的药典中，用于动物、更具体地用于人类。在该意义上，它应当与制剂的其它成分相容，且不会在受试者中引起不可接受的有害作用。它表示这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适合用于接触人类和动物的组织，且没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
根据欧洲药典，如果溶液具有290±30mOsm/kg的渗透压，则认为该溶液是“等渗的”。例如，通过蒸气压或冰冷冻型渗透压计，可以测量等渗性。
本文使用的术语“有效量”表示，足以减轻和/或改善一种或多种疾病和/或病症的严重性和/或持续时间的试剂(例如预防剂或治疗剂)的量。
本文使用的术语“治疗剂”和“多种治疗剂”表示，可以用于预防、治疗和/或控制一种或多种疾病和/或病症的任意一种或多种试剂。在本发明的上下文中，术语“治疗剂”表示含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽。在某些其它实施方案中，术语“治疗剂”表示可能用于所述组合物中的除了本发明的多肽以外的试剂。
本文使用的术语“治疗有效量”表示，足以减轻一种或多种疾病和/或病症的严重性的治疗剂(例如含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽)的量。
本文使用的术语“赋形剂”表示这样的惰性物质：其通常用作药物的稀释剂、载体、防腐剂、粘合剂或稳定剂，赋予制剂有益的物理性质，诸如增加的蛋白质稳定性、增加的蛋白质溶解度和/或降低的粘度。赋形剂的实例包括、但不限于：蛋白(例如，血清白蛋白)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸)、表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、聚山梨酯诸如吐温20和吐温80、泊洛沙姆诸如Pluronics和其它非离子型表面活性剂诸如聚(乙二醇)(PEG)),糖(例如，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和海藻糖)、多元醇(例如，甘露醇和山梨醇)、脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸酯和辛酸酯)。关于赋形剂的其它信息，参见Remington'sPharmaceuticalSciences(JosephP.Remington,第18版,MackPublishingCo.,Easton,PA)，将它整体并入本文中。
术语“可变结构域”表示，部分地或完全地负责抗原结合的、免疫球蛋白分子或抗体的部分或结构域。术语“单可变结构域”定义了这样的分子：其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成。这将单可变结构域与“常规的”免疫球蛋白或它们的片段区分开，在后者中，2个免疫球蛋白结构域、尤其是2个“可变结构域”相互作用以形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在该情况下，VH和VL两者的互补性决定区(CDR)将对抗原结合位点做出贡献，即共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。
相比而言，免疫球蛋白单可变结构域的结合位点是由单个VH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点是由不超过3个CDR形成。术语“免疫球蛋白单可变结构域”包括常规免疫球蛋白的片段，其中所述抗原结合位点是由单可变结构域形成。
通常，免疫球蛋白单可变结构域是基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补性决定区(分别是CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列的任意合适的片段(其于是通常含有形成至少CDR之一的至少一些氨基酸残基)。这样的免疫球蛋白单可变结构域和片段最优选地是这样的，以致于它们包含免疫球蛋白折叠，或能够在合适的条件下形成免疫球蛋白折叠。因此，所述免疫球蛋白单可变结构域可以包括例如：轻链可变结构域序列(例如VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，因此所述单个抗原结合域不需要与另一个可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单元，而例如对于存在于例如常规抗体和scFv片段中的可变结构域的情况，其需要与另一个可变结构域相互作用，例如通过VH/VL相互作用以形成功能性抗原结合域)。
在本发明的一个方面中，所述免疫球蛋白单可变结构域是轻链可变结构域序列(例如VL-序列)或重链可变结构域序列(例如VH-序列)；更具体地，所述单可变结构域可以是：衍生自常规的4链抗体的重链可变结构域序列，或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。
所述免疫球蛋白单可变结构域可以是：结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)、单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)、“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸序列)或(如本文定义，包括、但不限于VHH序列)[注：纳米抗体(Nanobody)和纳米抗体(Nanobodies)是AblynxN.V.的注册商标]；其它免疫球蛋白单可变结构域，或它们中的任一种的任意合适的片段。关于(单个)结构域抗体的一般描述，也参见本文引用的现有技术以及EP0368684。关于术语“dAb’s”，参见例如Ward等1989(Nature341:544-546),Holt等2003(TrendsBiotechnol.21:484-490)；以及例如WO04/068820、WO06/030220、WO06/003388和DomantisLtd.的其它公开的专利申请。还应当指出，尽管在本发明的上下文中不太优选(因为它们不是哺乳动物来源的)，但是免疫球蛋白单可变结构域可以衍生自鲨鱼的某些物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
具体地，本发明的多肽可以包含一个或多个纳米抗体或其合适的片段。关于VHH’s和纳米抗体的进一步描述，参见Muyldermans2001(ReviewsinMolecularBiotechnology74:277-302)的综述文章；以及下述专利申请，它们作为一般背景技术来提及：VrijeUniversiteitBrussel的WO94/04678、WO9504079和WO9634103；Unilever的WO9425591、WO9937681、WO0040968、WO0043507、WO00/65057、WO01/40310、WO01/44301、EP1134231和WO02/48193；VlaamsInstituutvoorBiotechnologie(VIB)的WO97/49805，WO01/21817，WO03/035694，WO03/054016和WO03/055527；AlgonomicsN.V.和AblynxN.V.的WO03/050531；NationalResearchCouncilofCanada(加拿大国家研究委员会)的WO01/90190；InstituteofAntibodies的WO03/025020(＝EP1433793)；以及AblynxN.V.的WO04/041867、WO04/041862、WO04/041865、WO04/041863、WO04/062551、WO05/044858、WO06/40153、WO06/079372、WO06/122786、WO06/122787和WO06/122825，AblynxN.V.的其它公开的专利申请。也参考在这些申请中提及的其它现有技术，尤其是在国际申请WO06/040153的第41-43页上提及的参考文献列表，所述列表和参考文献通过引用并入本文。如在这些参考文献中所述，通过一个或多个“标志残基”在一个或多个框架序列中的存在，可以具体地表征纳米抗体(尤其是VHH序列和部分地人源化的纳米抗体)。在例如WO08/101985和WO08/142164中，可以发现纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其它修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和用于增加纳米抗体和它们的制剂的半衰期的不同修饰。
在纳米抗体中的氨基酸残基的总数可以是在110-120的范围内，优选是在112-115的范围内，最优选是113。但是，应当指出，纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)在它们的长度和/或尺寸方面没有特别限制，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本文所述的其它要求，且也优选地适用于本文所述的目的。
因而，在本发明的意义上，术语“免疫球蛋白单可变结构域”包括衍生自非人源(优选地骆驼类)的多肽，优选骆驼类重链抗体。如前所述，可以将它们人源化。此外，该术语包括衍生自非骆驼类源(例如小鼠或人)的多肽，其已经如前所述“骆驼源化”。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”也包括不同起源的可变结构域，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼类可变结构域；以及完全人的、人源化的或嵌合的可变结构域。例如，本发明包括骆驼类可变结构域和人源化的骆驼类可变结构域或骆驼源化的可变结构域，例如Ward等(参见例如WO94/04678和Davies和Riechmann(1994,FEBSLett.339:285-290)和(1996,ProteinEng.9:531-537))所述的骆驼源化的dAb。此外，本发明包括融合的可变结构域，例如多价的和/或多特异性的构建体(关于含有一个或多个VHH结构域的多价的和多特异性的多肽和它们的制备，也参见Conrath等2001(J.Biol.Chem.276:7346-7350)以及例如WO96/34103和WO99/23221)。
本发明提供的免疫球蛋白单可变结构域优选地是基本上分离的形式(如本文定义)，或形成多肽(也称作“本发明的多肽”)的一部分，所述多肽可以包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成，且可以任选地另外包含一个或多个其它的氨基酸序列(全部任选地经由一个或多个合适的接头相连)。例如，但不限于，可以将一个或多个免疫球蛋白单可变结构域用作这样的多肽中的结合单元，所述多肽可以任选地含有一个或多个可以充当结合单元(即针对一种或多种其它靶标)的其它氨基酸序列，从而分别提供本发明的单价的、多价的或多特异性的多肽，如例如WO08/101985、WO08/142164、WO09/068625、WO09/068627和WO08/020079所述。这样的蛋白或多肽也可以是基本上分离的形式(如本文定义)，并且本发明的方法、气雾剂和组合物同样适用于免疫球蛋白单可变结构域，以及含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
根据本发明，术语“免疫球蛋白单可变结构域”可以包括构建体，所述构建体包含2个或更多个抗原结合单元，所述抗原结合单元是上述的免疫球蛋白单可变结构域的形式。例如，可以连接2个(或更多个)具有相同或不同的抗原特异性的免疫球蛋白单可变结构域，以形成例如二价、三价的或多价的构建体。通过组合具有2种或更多种特异性的免疫球蛋白单可变结构域，可以形成双特异性构建体、三特异性构建体等。例如，根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以包含2个或3个相同的免疫球蛋白单可变结构域、或2个针对靶标A的免疫球蛋白单可变结构域和一个针对靶标B的免疫球蛋白单可变结构域，或基本上由它们组成。技术人员可以容易地预见到的这样的构建体及其改变形式，其都被包括在本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”内，且也称作“本发明的多肽”或“本发明的多种多肽”。
如在WO08/020079的第53页上的段落m)中进一步所述，可以(特异性地)结合特定抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对它们具有亲和力和/或特异性的氨基酸序列(诸如纳米抗体、抗体、本发明的多肽，或一般地，结合抗原的蛋白或多肽或其片段)，被称作“抗”或“针对”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
本文使用的“气雾剂”表示，液体以细颗粒形式分散在气体中的悬浮液(即含有微小颗粒的细雾或喷雾)。本文使用的术语“颗粒”表示液体，例如，微滴。经由嘴和/或经由鼻，可以吸入用于将本发明的多肽递送至肺的药用气雾剂。在肺递送中，认为产生小于大约5或6微米的颗粒，是实现作为细颗粒级分(FPF)的沉积(即在呼吸性细支气管和肺泡区域中)所必需的(O’Callaghan和Barry,1997,Thorax52:S31-S44)。在气雾剂中的粒度可以表示为体积中值直径(VMD)。所述“体积中值直径”被定义为这样的气雾剂的几何粒径：其中气雾剂体积中的50％大于该值，且50％小于该值。“总气体动力学中位数直径(MMAD)”被定义为这样的几何平均空气动力直径：其中按重量计算50％的颗粒小于该值，且50％大于该值。当气雾剂颗粒的密度是1g/cm3时，VMD和MMAD相等。本发明的气雾剂优选地具有下述体积中值直径：1-10μm，优选1-7μm，最优选1-5μm，诸如约3、3.5或4μm。
在本发明中使用的“气雾化”是指，通过将本发明的组合物转化成小颗粒或微滴，生成气雾剂。这通常通过气雾剂递送系统(如进一步定义的)来实现。
在本发明的上下文中，术语“雾化”是指，通过(机械地)破碎大量液体来生产微滴。生产的微滴将形成细雾或喷雾，其形成气雾剂。
在本发明中使用的术语“雾化器”和“雾化”表示，通过雾化器(如本文进一步定义的)将液体转化成雾或细喷雾。
术语“雾化材料”或“气雾化材料”是已经经历过气雾化过程的材料(诸如包含一种或多种免疫球蛋白单可变结构域的组合物)。该材料仍然可以是气雾剂(如本文定义)的形式。该材料还可以已经转化回为大量液体，所述液体通过合并在气雾剂中存在的不同微滴来进行收集。
本文使用的术语“稳定性”和“稳定的”表示，在雾化包含所述多肽的组合物以后，对本发明的包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽的聚集的抗性。除了这方面以外和/或额外地，本发明的“稳定的”组合物在雾化以后保留生物活性。通过聚集程度(通过例如SE-HPLC、亚可见颗粒计数、分析超速离心、动态光散射、OD320/OD280比率测量、弹性光散射等来测量)，和/或通过相对于尚未雾化的参照组合物的生物活性的百分比(通过例如ELISA、Biacore等来测量)，可以评估所述多肽的稳定性。
在本发明中使用的“聚集”或“聚集体形成”是指，聚集体的形成。在本发明的上下文中，“聚集体”包括由本发明的多肽的超过一个相同亚基(或单体)组成的任意颗粒，也包括寡聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等等。所述聚集体可以具有不同的尺寸，包括高分子量聚集体以及低分子量聚集体。本文使用的高分子量(缩写为HMW)聚集体通常由超过4个单体单元组成，诸如五聚体；低分子量聚集体通常由4个或更少的单体单元组成，诸如二聚体、三聚体和/或四聚体。
本文使用的短语“低至不可检测的聚集水平”表示，样品含有不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、或不超过0.5％(按重量计算)的蛋白聚集。
在本发明的方法、气雾剂和组合物中，小于7％(更优选地小于6％、小于5％、甚至更优选地小于4％、小于3％、小于2％、或最优选地小于1％)的本发明的多肽在雾化过程中形成聚集体(如本文定义)。通过本领域已知的不同的分析方法和/或免疫学方法，可以评估雾化材料中的聚集体形成，所述方法包括、但不限于：例如，尺寸排阻层析(SE-HPLC)、亚可见颗粒计数、分析超速离心(AUC)、动态光散射(DLS)、静态光散射(SLS)、弹性光散射、OD320/OD280、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素诱导的蛋白解折叠技术、固有的色氨酸荧光和/或示差扫描量热法技术。通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)，可以测定本发明的多肽和蛋白杂质的分子尺寸分布和相对量。SE-HPLC方法是技术人员已知的，且也描述在实施例部分中。
在分析超速离心中，使用紫外线吸收和/或干涉光学折射率敏感的系统，通过光学检测系统可以实时监测旋转中的样品。这允许操作人员观察样品浓度相对于旋转轴分布(profile)的演化，该演化是作为施加的离心力场的结果。使用现代仪器，可以将这些观察结果电子地数字化和存储，用于进一步的数学分析。在这些仪器上通常进行2类实验：沉降速度实验和沉降平衡实验。
沉降速度实验的目的是，解释沉降的整个时程，并报告溶解的大分子的形状和摩尔质量以及它们的尺寸-分布(Perez-Ramirez和Steckert,2005,TherapeuticProteins:MethodsandProtocols.C.M.Smales和D.C.James,编Vol.308:301-318.HumanaPressInc,Totowa,NJ,美国)。该方法的尺寸分辨率与颗粒半径的平方大致成比例，通过调节实验的转子速度，可以覆盖从100Da至10GDa的尺寸范围。还可以使用沉降速度实验来如下研究大分子物质之间的可逆化学平衡：通过监测大分子复合物的数目和摩尔质量，通过从多信号分析(利用每种组分光谱信号的差异)获得关于复合物组成的信息，或通过跟踪大分子系统的沉降速率的组成相关性，如在Gilbert-Jenkins理论中所述。
沉降平衡实验仅与最终的实验稳态有关，其中通过与浓度梯度相反的扩散来平衡沉降，导致独立于时间的浓度分布。通过玻耳兹曼分布来表征在离心力场中的沉降平衡分布。该实验对大分子的形状是不敏感的，并直接地报告大分子的摩尔质量，且对于化学反应混合物，直接地报告化学平衡常数。
从分析超速离心可以得到的信息的种类包括：大分子的总体形状，大分子的构象变化，和大分子样品的尺寸分布。对于存在与不同的非共价复合物的化学平衡的大分子(诸如蛋白)而言，可以研究复合物的数目和亚基化学计量学以及平衡常数(也参见ScottD.J.,HardingS.E.和RoweA.J.AnalyticalUltracentrifugationTechniquesandMethods,RSCPublishing)。
动态光散射(也称作光子关联光谱或准弹性光散射)是一种物理学中的技术，其可以用于测定在溶液中的小颗粒的尺寸分布曲线。当一束光穿过胶态分散系时，颗粒或微滴会在所有方向散射一些光。当颗粒与光的波长相比而言非常小时，散射光的强度在所有方向是均匀的(瑞利散射)；对于更大的颗粒(超过大约250nm直径)，所述强度是角度依赖性的(米氏散射)。如果光是相干的且单色的，如来自激光，例如，使用合适的检测器(诸如能够在光子计数模式下运行的光电倍增管)，可能观察到散射强度的时间依赖性的波动。
这些波动源自下述事实：所述颗粒足够小，以致于发生随机的热(布朗)运动，并且它们之间的距离因此不断地变化。在照射区内的邻近颗粒所散射的光的相长和相消干涉，会在检测器平面处产生强度波动，由于它源自颗粒运动，它含有关于该运动的信息。强度波动的时间依赖性分析因此可以产生颗粒的扩散系数，在已知介质的粘度的情况下，经由StokesEinstein方程式，从所述扩散系数可以计算出所述颗粒的流体动力学半径或直径(也参见BerneB.J.和PecoraR.DynamicLightScatteringWithApplicationstoChemistry,BiologyandPhysics,DoverPublications)。
通过PAMASSVSS-C(小容积注射器系统-C)仪器(PArtikelMess-undAnalyseSystemeGMBH)，也可以测量聚集，所述仪器是用于低粘度流体的粒度分布分析仪。它使用光遮蔽原理来检测在1μm-200μm尺寸范围内的亚可见的(sub-visible)颗粒。通过每个容器的总计数，定义小和大体积肠胃外制剂的欧洲药典(EP<2.9.19微粒污染:亚可见的颗粒(ParticulateContamination:sub-visibleparticles))的验证标准/指定的范围：
-对于>10μm的颗粒，不超过6000计数/容器
-对于>25μm的颗粒，不超过600计数/容器
OD320/OD280之比也是浊度或微粒在样品中的存在的量度。在一个优选的方面，本发明的组合物的OD320/OD280之比应当是0.05或更低，优选0.01或更低，诸如0.005或更低。
通过弹性光散射，也可以测量特定气雾剂中的多肽的聚集体形成的趋势。通过温度诱发的变性(例如在90°的角度测量)，可以在荧光分光光度计(例如激发和发射波长500nm)中测量弹性光散射。优选地，最大散射将停留在吸收检测限内。散射应当是1000abs.或更低，优选750abs或更低，诸如500abs或更低。
例如，通过SE-HPLC或通过分光光度计测量方法，可以检测回收的本发明的多肽在雾化材料中的蛋白含量。
在雾化另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂的组合物以后，在雾化含有浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的本发明多肽的组合物以后，和/或当使用振动网孔式雾化器来雾化所述组合物时，已经观察到本发明的多肽的显著减少的聚集体形成。
因此，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中：
-所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在于所述组合物中；和/或
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在还有的另一个方面中，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽,和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在还有的另一个方面中，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物不包含表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
除了这方面以外和/或额外地，在本发明的方法、气雾剂和组合物中，已经观察到雾化材料中的本发明多肽的效价和/或生物活性的极微小损失至无损失。
生物制剂的效价和/或生物活性描述了所述生物制剂的实现确定的生物学效应的具体能力或性能。本文使用的术语“生物活性”或“多种生物活性”表示免疫球蛋白单可变结构域的活性，包括、但不限于，免疫球蛋白单可变结构域与目标靶标的特异性结合能力，该活性通过不同的免疫学试验(包括、但不限于ELISA)和/或通过表面等离子体共振(Biacore)来测量。在一个实施方案中，与参照组合物(其没有被雾化)相比，在雾化本发明的组合物以后，在雾化材料中存在的免疫球蛋白单可变结构域保留至少50％、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或甚至99％或更多的特异性地结合目标靶标的能力，这通过本领域技术人员已知的或本文所述的免疫学试验来测量。例如，可以使用基于ELISA的试验，比较在雾化所述免疫球蛋白单可变结构域以后和没有雾化所述免疫球蛋白单可变结构域时的免疫球蛋白单可变结构域的特异性地结合它的靶标的能力。
通过不同的试验，包括任意合适的体外试验、基于细胞的试验、体内试验和/或本身已知的动物模型或它们的任意组合(取决于涉及的具体的疾病或病症)，可以评估本发明的多肽的效价和生物活性。合适的体外试验是技术人员清楚的，例如包括：ELISA；FACS结合试验；Biacore；竞争结合试验(PerkinElmer,Massachusetts,USA；FMAT)。例如，SEQIDNO:2和3会与hRSV的F蛋白相互作用，并阻断F蛋白与它的受体的相互作用。SEQIDNO:1会与IL-23相互作用，并阻断该配体与它的受体的相互作用。例如，通过ELISA、Biacore、可以测定SEQIDNO:1、2和3用于阻断各自配体/受体相互作用的效价。
例如，在一个实施方案中，Biacore动力学分析使用表面等离子体共振(SPR)技术来实时监测大分子相互作用，并用于测定本发明组合物的多肽与它们的靶标的结合速率和解离速率。Biacore动力学分析包括：分析靶标与在它们的表面上固定了本发明的多肽的芯片的结合和解离。典型的Biacore动力学研究包括：将250μL不同浓度的多肽试剂(在含有0.005％吐温20的HEPES-缓冲的盐水(HBS)缓冲液中)注射到传感器芯片表面上，所述表面上已经固定了抗原。在BIAcore3000系统中，将所述配体固定在羧甲基化的葡聚糖上(在金表面上)，同时随着第二种配偶体(分析物)在所述固定的配体表面上流动而捕获它。所述固定的配体是显著有弹性的，并维持它们的生物活性。可以从固定的配体剥离结合的分析物，而不影响它的活性，以允许在相同的固定的表面上的许多次结合和再生循环。经由SPR可高灵敏度地实时检测相互作用。因为相同的亲和力可能反映不同的结合速率和解离速率，所以该仪器胜过大多数其它亲和力测量方法，因为它测量结合速率(ka)和解离速率(kd)。浓度测定实验也是可行的。
在本发明的方法、气雾剂和组合物中，已经观察到雾化材料中的本发明多肽的效价和/或生物活性的极微小损失至无损失，这通过不同的免疫学试验(包括例如，酶联免疫吸附试验(ELISA))和表面等离子体共振来评估，所述试验测量所述多肽的特异性地结合它的抗原的能力。在雾化以后，在本发明的组合物中存在的多肽保留所述多肽在雾化之前的最初生物活性(例如，结合IL-23、hRSV的能力)的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或甚至超过99.5％。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述多肽结合IL-23。在雾化包含所述结合IL-23的多肽的本发明的组合物以后，至少80％(至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％)的所述多肽保留它们的与IL-23的结合活性。
在另一个具体实施方案中，所述多肽结合hRSV。在雾化包含所述结合hRSV的多肽的本发明的组合物以后，至少80％(至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％)的本发明的多肽保留它们的与hRSV的结合活性。
用于测定在雾化材料中存在的所述多肽的效价和/或生物活性的其它合适的体外和体内模型是技术人员清楚的，且取决于要预防和/或治疗的目标疾病和/或病症。适用于测试SEQIDNO:1的效价和/或生物活性的动物模型，描述在例如WO09/068627和WO09/147248中。例如可以如下测定SEQIDNO:2的中和hRSV的效价和/或生物活性：在体外，例如在hRSV微量中和试验中(参见例如WO09/147248)，和在体内，例如在用于研究RSV的棉鼠模型中(Murphy等,1988,VirusRes.11:1-15)。
在雾化另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂的组合物以后，在雾化含有浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的本发明多肽的组合物以后，和/或当使用振动网孔式雾化器来雾化所述组合物时，已经观察到本发明的多肽的效价的极微小损失至无损失。
因此，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中保留了免疫球蛋白可变结构域的最初生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中：
-所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；
-含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在于所述组合物中；和/或
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中保留了免疫球蛋白可变结构域的最初生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中保留了免疫球蛋白可变结构域的最初生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在还有的另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中保留了免疫球蛋白可变结构域的最初生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
在还有的另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中保留了免疫球蛋白可变结构域的最初生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物不包含表面活性剂；和/或在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
因此，在通过本发明的方法得到的雾化材料中，优选地：
-小于7％(更优选地小于6％、小于5％、甚至更优选地小于4％、小于3％、小于2％或最优选地小于1％)的本发明的多肽形成聚集体(如本文定义)；
-至少80％(至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％)的本发明的多肽保留它与它的靶标中的至少一种(优选地所有)的结合活性(例如通过ELISA和/或Biacore进行评估)。
用于本发明的方法和组合物中的、包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成的多肽可以是治疗性的或预防性的，且可以用于治疗和/或控制一种或多种疾病。在一个具体的方面，所述多肽包含一个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。在另一个方面，所述多肽包含至少2个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。在另一个具体方面，所述多肽包含至少3个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。
用于本发明的方法和组合物中的、包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成的多肽可以识别任意靶标，优选与一种或多种疾病有关的靶标。在一个方面，本发明的多肽会识别与一种或多种呼吸疾病有关的靶标。在另一个方面，所述多肽特异性地识别hRSV。在另一个方面，所述多肽特异性地识别IL-23。在一个优选的方面，在本发明的多肽中使用的免疫球蛋白单可变结构域选自：WO09/068627(例如WO09/068627的SEQIDNO:2578、2584和/或2585)、WO2010/139808(例如US61/265,014的SEQIDNO:142)和WO08/028977(例如WO08/028977的SEQIDNO:62)。本发明的优选多肽也可以选自：SEQIDNO:1、2和3。
在本发明的组合物中存在的本发明的多肽的浓度可以是，为受试者提供希望效果的任意多肽浓度。所述多肽的浓度应当至少使得：通过肺给药，可以将有效量的多肽递送给受试者。在一个优选的方面，本发明的多肽的浓度是1-200mg/mL，诸如约1mg/mL、约2mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约80mg/mL、约90mg/mL或约100mg/mL或更高。在某些实施方案中，本发明的多肽的浓度可以是110mg/mL或更高、120mg/mL或更高、130mg/mL或更高、140mg/mL或更高、150mg/mL或更高或甚至200mg/mL或更高。
在一个具体的方面，本发明的多肽在本发明的组合物中的浓度是20mg/mL或更高，例如25mg/mL或更高或50mg/mL或甚至更高。本发明人已经证实，与具有低于20mg/ml的多肽浓度的组合物相比，包含20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高，或50mg/mL或甚至更高)的量的本发明多肽的组合物在气雾化以后会表现出显著减少的聚集体形成。因此，在一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中。本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述含有一个或多个单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中。在一个具体方面，本发明的多肽在本发明的组合物中的浓度是30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/mL或甚至更高。本发明另外涉及这样的组合物，所述组合物适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述含有一个或多个单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度(例如以25mg/mL或更高的浓度，或以50mg/mL或甚至更高的浓度)存在于所述组合物中。
除了本发明的多肽在本发明的组合物中的浓度以外和/或额外地，表面活性剂在本发明的组合物中的存在也对雾化材料中的聚集体形成具有积极作用。与雾化不含有表面活性剂的组合物相比，在雾化包含表面活性剂的组合物以后，聚集体形成显著减少。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物还包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。本发明另外涉及这样的组合物，所述组合物适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在雾化含有浓度低于20mg/ml(例如在5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的本发明多肽的组合物以后，表面活性剂在本发明的组合物中的存在对雾化材料中的聚集体形成的积极作用是最显著的。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，在所述气雾剂中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物还包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。本发明另外涉及这样的组合物，所述组合物适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度低于20mg/ml(例如5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％(v:v)的表面活性剂。
在有表面活性剂存在下，含有浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的本发明多肽的本发明组合物中的雾化材料的聚集体形成减少不太显著。另外，在有表面活性剂存在下，高分子量聚集体在这些组合物的雾化材料中的相对量增加。
因此，在还有的另一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物不包含表面活性剂。本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中所述组合物不包含表面活性剂。本发明另外涉及这样的组合物，所述组合物适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度)的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述组合物不包含表面活性剂。
表面活性剂是指包含疏水部分和亲水部分的表面活化剂。在一个优选的方面，所述表面活性剂是非离子型。某些示例性的非离子型表面活性剂包括(但不限于)：脂肪醇，聚山梨酯(包括但不限于聚山梨酯80(吐温80)和聚山梨酯20(吐温20))，TritonX-100，聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物和壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。可以用于本发明的组合物中的其它表面活性剂包括(但不限于)：磷酸甘油酯，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)，诸如天然存在的表面活性剂，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。其它示例性的表面活性剂包括：二磷脂酰甘油(DPPG)，十六醇，聚氧乙烯-9-月桂基醚，表面活性的脂肪酸，诸如棕榈酸或油酸，三油酸山梨坦(司盘85)，甘胆酸盐，枯草菌脂肽，泊洛沙姆，脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如三油酸山梨坦，泰洛沙泊和磷脂。在一个具体的方面，所述表面活性剂选自：吐温20、吐温80或泊洛沙姆。其它化合物诸如聚乙二醇(PEG)具有表面活性剂样性质，因为它们作用于空气-水界面。在本发明的一个方面，所述表面活性剂不是PEG。具体地，所述组合物不包含在50mM磷酸盐缓冲液(含有1.2％(w/v)蔗糖)中的约2％至约10％的PEG1000。表面活性剂的浓度范围可以是在0.001％至1％(v:v)之间(优选所述组合物的0.001％至0.1％(v:v)，或0.01％至0.1％(v:v)，诸如约0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)、0.1％(v:v)、0.5％(v:v)或1％(v:v)，优选约0.04％至0.08％(v:v))。在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂是吐温20或吐温80，其浓度是所述组合物的0.001％(v:v)、0.005％(v:v)、0.01％(v:v)、0.02％(v:v)、0.04％、0.05％(v:v)、0.08％(v:v)、0.1％(v:v)、0.5％(v:v)或1％(v:v)，优选0.04％至0.08％(v:v)，尤其是0.04％(v:v)。
具有这些特征的本发明的优选组合物的一个实例包含0.01％(v:v)吐温80、0.02％(v:v)吐温80、0.04％(v:v)吐温80或0.08％(v:v)吐温80。
包含在本发明的组合物中的载体优选地是水性载体，例如蒸馏水、MilliQ水或注射用水(WFI)。本发明的组合物的pH通常不应当等于在所述组合物中存在的本发明特定多肽的等电点，且其范围可以是约5.5至约7.5、或约6.0至约7.5，优选约6.5-7.5，最优选约6.5-7.0，诸如pH6.0、pH6.5或pH7.0，尤其是pH7.0。
可以用药学上可接受的任意缓冲剂缓冲所述组合物。用于本发明的组合物中的优选缓冲液包括(但不限于)：PBS、磷酸盐缓冲液、TrisHCl、组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液，例如组氨酸pH6.0-6.5、磷酸盐缓冲液pH7.0、TrisHClpH7.5和柠檬酸盐缓冲液/磷酸盐缓冲液pH6.5，尤其是磷酸盐(NaH2PO4/Na2HPO4)缓冲液pH7.0。
在本发明的组合物中存在的缓冲剂的浓度范围可以是1mM-100mM、5mM-100mM、5mM-75mM、5mM-50mM、10mM-50mM。在一个具体的方面，在本发明的组合物中的缓冲剂的浓度是1mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。优选地，所述浓度是10-50mM，诸如10mM或50mM，尤其是10mM。
本领域技术人员应当理解，本发明的组合物可以与人血液等渗或稍微低渗，即本发明的组合物具有与人血液基本上相同的或稍微更低的渗透压。这样的等渗的或稍微低渗的组合物通常具有下述渗透压：约240mOSm/kg至约320mOSm/kg，诸如约240mOSm/kg或更高、250mOSm/kg或更高或260mOSm/kg或更高。
通过使用张力调节剂，可以调节组合物的张力。“张力调节剂”是这样的药学上可接受的惰性物质：其可以加入所述组合物中，以提供所述组合物的等渗性。在本发明的组合物中的一种优选的张力调节剂是赋形剂。用于本发明的组合物中的优选赋形剂可以选自：糖、多元醇、表面活性剂和盐。在一个方面，通过加入糖/多元醇或无机盐，调节本发明的组合物的渗透压。糖/多元醇可以包括(但不限于)：蔗糖和乳糖，以及糖衍生物，包括糖醇和糖酸。多元醇和糖醇可以包括(但不限于)：甘露醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨醇和甘油。其它示例性的糖包括(但不限于)：海藻糖、甘氨酸、麦芽糖、棉子糖等。该赋形剂的浓度范围可以是约1％至10％(w:v)，优选约2.5％至10％(w:v)，更优选约5％至10％(w:v)，例如5％(w:v)、7.5％(w:v)、8％或10％(w:v)。非限制性地，用于调节本发明组合物的渗透压的无机盐包括：NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2，尤其是NaCl。无机盐的浓度范围可以是10mM-200mM、10mM-150mM、50mM-150mM、100mM-150mM或100mM-120mM。在一个具体的方面，在本发明制剂中可以包括的盐(优选NaCl)的浓度可以是约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约150mM或约200mM。
具有这些特征的本发明优选组合物的一个实例包含10mM磷酸盐(NaH2PO4/Na2HPO4)缓冲液pH7.0和130mMNaCl。因此，在一个方面，本发明的组合物包含10mM磷酸盐(NaH2PO4/Na2HPO4)缓冲液pH7.0、130mMNaCl和如上所述的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽。在一个具体方面，本发明的组合物包含10mM磷酸盐(NaH2PO4/Na2HPO4)缓冲液pH7.0、130mMNaCl和具有SEQIDNO:2的多肽。在另一个方面，本发明的组合物包含10mM磷酸盐(NaH2PO4/Na2HPO4)缓冲液pH7.0、130mMNaCl和浓度为20mg/mL或更高(例如25mg/mL或更高的浓度，或50mg/mL或甚至更高的浓度，优选50mg/ml的浓度)的具有SEQIDNO:2的多肽。
其它药学上可接受的载体也可以用于本申请的制剂中。本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指，参与运送或运输药物(例如预防剂或治疗剂)的药学上可接受的物质、组合物或运载体，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种载体必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容，且对患者无害。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和用于药物制剂中的其它无毒的相容物质。
通过给本发明的多肽提供高热稳定性来表征本发明的组合物。例如，通过测定熔化温度例如Tm，可以评价热稳定性。适用于测定熔化温度的技术是已知的，包括例如热迁移试验(TSA)，例如如本文所述。更具体地，与其它制剂相比，本发明的组合物会导致本发明的多肽的Tm的升高，这通过TSA测定。在实验部分的表3中例证了该效应。
根据本发明，在宽泛的pH值范围内，例如5.5至6.5(对于柠檬酸盐缓冲液)和7.0至7.5(对于磷酸盐缓冲液)，本发明的组合物对Tm具有积极影响。对于在pH7.0-7.5(尤其是7.0±0.2)的磷酸盐缓冲液，可以观察到对Tm的最有利效应。
如本说明书的实验部分所证实的，通过TSA测定的Tm用作本发明多肽的稳定性的有价值的指示。升高的Tm也指示其它物理化学参数的增加的稳定性，且因此可以指示本发明的特别优选的实施方案。
用于生产在本发明组合物中存在的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽的一般方法是技术人员已知的，和/或已经在本领域中有所描述。可以在技术人员已知的任意宿主中生产免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽。例如，但不限于，可以在原核宿主(包括大肠杆菌)或真核宿主中生产免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，所述真核宿主是例如选自昆虫细胞、哺乳动物细胞的真核宿主和下述的低等真核宿主：所述低等真核宿主包括酵母诸如毕赤酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、Botryoascus、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)，优选巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)。在例如WO94/04678、WO94/25591和WO08/142164中，已经描述了免疫球蛋白单可变结构域在原核生物和低等真核宿主(诸如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris))中的生产。关于一般培养技术和方法(包括合适的培养基和条件)明确地参考这些申请的内容。这些文件的内容通过引用并入。基于本申请和公知常识，技术人员还可以设计适用于在不同宿主中表达本发明的多肽的遗传构建体。本发明也涉及本领域描述的条件和遗传构建体，例如在下述文献中描述的一般培养方法、质粒、启动子和前导序列：WO94/25591，WO08/020079，Gasser等2006(Biotechnol.Bioeng.94:535)；Gasser等2007(Appl.Environ.Microbiol.73:6499)；或Damasceno等2007(Microbiol.Biotechnol.74:381)。
更具体地，用于表达和/或生产含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽的方法至少包括下述步骤：
a)在使所述宿主或宿主细胞将繁殖的条件下，培养宿主或宿主细胞；
b)在使所述宿主或宿主细胞表达和/或生产所述多肽的条件下，维持所述宿主或宿主细胞；
c)从培养基中分离和/或纯化分泌的多肽。
为了生产/获得所述多肽的表达，通常可以在表达/生产(希望的)多肽的条件下保持、维持和/或培养转化的宿主细胞或转化的宿主生物体。合适的条件是技术人员清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及控制(相关的)核苷酸序列的表达的调控元件。此外，参见在上面提及的手册和专利申请。
通常，合适的条件可以包括：使用合适的培养基，存在合适的食物来源和/或合适的营养物，使用合适的温度，任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，当本发明的核苷酸序列处于诱导型启动子的控制下时)；所有这些可以由技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式表达，以瞬时方式表达，或者仅在适当地诱导时表达。
然后可以从宿主细胞/宿主生物体中和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离本发明的多肽，其中使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备)色谱法和/或电泳技术、示差沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备免疫学技术(即，使用针对要分离的多肽的抗体)。
在本发明中，通过常规方式，可以从培养基中去除宿主。例如，通过离心或过滤，可以去除宿主。通过从培养基中去除宿主所得到的溶液也称作培养物上清液或澄清的培养物上清液。通过标准方法，可以从培养物上清液中纯化本发明的多肽。标准方法包括，但不限于：色谱法，包括尺寸排阻层析、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法和亲和层析。这些方法可以单独进行，或与其它纯化方法(例如沉淀或凝胶电泳)组合地进行。基于公知常识，技术人员可以为本发明的多肽设计纯化方法的适当组合。关于具体实例，参见本文引用的文献。
在一个示例性的实施方案中，通过在蛋白A上的亲和层析、离子交换色谱法和尺寸排阻层析的组合，可以从培养物上清液中纯化本发明的多肽。提及的任何“纯化步骤”包括、但不限于这些具体的方法。
更具体地，可以从培养物上清液中纯化本发明的多肽，其中使用这样的方法：其中将澄清的上清液(通过离心得到)捕获在柱的任意组合上，所述柱选自(但不限于)亲和层析树脂诸如蛋白A树脂、阳离子交换色谱(CIEC)或阴离子交换色谱(AIEC)(使用例如Poros50HS(POROS)、SOURCE30S或SOURCE15S(GEHealthcare)、SP琼脂糖(GEHealthcare)、CaptoS(GEHealthcare)、CaptoMMC(GEHealthcare)或Poros50HQ(POROS)、SOURCE30Q或SOURCE15Q(GEHealthcare)、Q琼脂糖(GEHealthcare)、CaptoQ和DEAE琼脂糖(GEHealthcare))、尺寸排阻层析(SE-HPLC)(使用例如Superdex75或Superdex200(GEHealthcare))、疏水相互作用色谱(HIC)(使用例如辛基、丁基琼脂糖或等效物)，任选地还包括切向流过滤(TFF)步骤。可以使用柱的任意组合来纯化本发明的多肽，例如蛋白A树脂，接着是阳离子交换色谱法或2个阳离子交换色谱步骤。
本发明也提供了用于制备包含本发明多肽的本发明组合物的方法。更具体地，本发明提供了用于制备这种多肽的组合物的方法，所述方法包括：使用例如具有适当的分子量(MW)截止值(例如，对于单可变结构域，5kD截止值；对于包含2个单可变结构域的二价多肽，10kD截止值；或对于包含3个单可变结构域的三价多肽，15kD截止值)的半透性膜，浓缩含有纯化的多肽的级分至最终的多肽浓度，并渗滤和/或超滤以进行缓冲液更换，并使用相同的膜将多肽级分进一步浓缩进选择的缓冲液中。
在最终的渗滤/超滤步骤以后，可以加入表面活性剂(例如吐温20、吐温80或泊洛沙姆)，其浓度范围为所述组合物的0％至1％，优选0.001％至0.1％，或0.01％至0.1％，诸如约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.04％、0.05％、0.08％、0.1％、0.5％或1％，优选0.04％至0.08％，尤其是0.04％。
通过不同的灭菌方法，包括无菌过滤、辐射等，可以将本发明的组合物灭菌。在一个具体的实施方案中，使用预灭菌的0.2微米滤器，将所述多肽组合物过滤除菌。
优选地，在气密密封的容器中提供本发明的组合物。液体组合物可以包含1mL至20mL的量，优选约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL或20mL的量。
通过制备含有用于一次使用的组合物等分试样的瓶子，可以将本发明的组合物制成单位剂型。例如，每瓶的液体组合物的单位剂量可以含有1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL或20mL所述组合物。所述药物单位剂型应当适用于通过气雾剂对多肽的肺递送。
通过本领域众所周知的或本文描述的标准临床技术，可以确定本发明组合物有效预防、治疗和/或控制特定疾病或病症的量。从衍生自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线，可以外推出有效剂量。就本发明包括的多肽组合物而言，使用按千克(kg)计的患者体重乘以要按mg/kg施用的剂量，可以进一步计算施用给患者的剂量。对于剂量计算而言也有用的是，达到肺的施用剂量的百分比和/或达到全身循环的施用剂量的百分比(取决于要预防和/或治疗的疾病，和药物的预防活性和/或治疗活性在体内的定位)。
然后，通过将需要的mg剂量除以多肽组合物的浓度，确定要施用的需要的体积(mL)。通过合并根据需要的多个管形瓶的内容物，得到最终的计算的需要的体积。
本发明也包括完成的包装的和标记的药物产品。该制品或试剂盒包括在适当罐或容器(诸如气密密封的玻璃瓶或其它容器)中的适当单位剂型。所述单位剂型应当适合通过气雾剂的肺递送。优选地，所述制品或试剂盒另外包括如何在气雾剂递送系统中使用组合物的说明书。所述说明书可以另外含有建议医师、技术员或患者如何适当地预防或治疗目标疾病或病症的信息材料。换而言之，所述制品包括说明资料(means)，其指示或提示用于气雾剂递送系统中的给药方案，包括但不限于实际剂量、监测规程和其它监测信息。
与任何药物产品一样，可以设计包装材料和容器，以保护产品在贮存和运输过程中的稳定性。
本发明的组合物、容器、药物单位剂量和试剂盒应当适合通过肺给药(即气雾化)来递送本发明的多肽。因此，本发明的组合物、容器、药物单位剂量和试剂盒应当适合用于气雾剂递送系统(如本文进一步定义的)。因此，本发明也涉及本发明的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于通过气雾化递送给人受试者。在一个方面，本发明的组合物被用于制备药物，所述药物用于通过雾化(优选在振动网孔式雾化器中)递送给人受试者。
本发明也提供了气雾剂递送系统，其可以用于本发明的方法(用于制备气雾剂)中，和/或用于通过气雾化来递送本发明的组合物。本发明的气雾剂递送系统可以包括：含有本发明的组合物的容器，和与所述容器相连的气雾剂发生器。所述气雾剂发生器被构造和安排以产生本发明组合物的气雾剂。非限制性地，气雾剂发生器包括雾化器、机械泵和加压容器。
在一个方面，所述气雾剂递送系统可以包括：含有本发明组合物的加压容器。所述加压容器通常具有与计量阀连接的执行机构，所以执行机构的激活会造成在容器内的预定量的组合物以气雾剂的形式从容器中分发出去。这类加压容器在本领域被公知为推进剂驱动的定量吸入器(pMDI或简称MDI)。MDI通常包括执行机构、计量阀和加压容器，所述加压容器保存微粉化的药物悬浮液或溶液、液化的推进剂和表面活性剂(例如，油酸、三油酸山梨坦、卵磷脂)。加压的定量吸入器(pMDI)是世界上最常用的吸入器。当打开阀门(通常在推进剂罐上向下按)从而允许液体推进剂喷出罐时，产生气雾剂。通常，药物或治疗剂被包含在悬浮于液体推进剂中的小颗粒(通常直径为几微米)中，但是在有些制剂中，药物或治疗剂可以溶解在推进剂中。随着气雾剂离开装置，所述推进剂快速地蒸发，产生小的药物或治疗剂颗粒，所述颗粒被吸入。在这样的pMDI中使用的推进剂包括、但不限于氢氟烷烃(HFA)。在历史上，这些MDI通常使用含氯氟烃(CFC)作为推进剂，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷和二氯四氟甲烷。较新的推进剂可以包括：1,1,1,2-四氟乙烷和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷。其它溶剂或赋形剂也可以与pMDI一起使用，诸如乙醇、抗坏血酸、偏亚硫酸钠、甘油、三氯叔丁醇和西吡氯铵。这样的pMDI可以另外包括附加装置，例如，隔离物、保持室和其它改进。
SonikLDI气雾化技术(DrugDeliveryTechnology,Montville,NJ,美国)主要用于递送液体药物，偶尔用于递送粉末。专有的喷嘴由压缩气体(通常是二氧化碳(CO2))驱动，以在每次致动该装置时递送一致的药物喷发。在压缩气体离开SonikLDI喷嘴的主要喷射器以后，会形成反射的压缩和折射冲击波链。所述喷嘴将液体药物导入冲击室内的冲击波链中，以产生一致的且高质量的气雾剂喷发。在离开SonikLDI喷嘴以后，气雾剂/气流被迫向下穿过放大室，在这里第二次气雾化过程会造成可吸入颗粒的增加和残余喷雾的减少。使用CO2作为驱动推进剂，主要因为它是廉价的，且可以容易地压缩储存在一次性使用的罐中。与MDI不同，在气雾化瞬间之前，SonikLDI气雾化技术不混合推进剂和药物。这种延迟的方案允许将液体(或粉末)药物储存在密封的泡罩中，并减轻制剂稳定性的开发负担。该技术适用于许多构型：呼吸致动的气雾剂保持室，紧凑的低速直接经口进入，预包装的单位剂量药物，和由患者或临床医师填充的储存装置。
在本发明的另一个方面，所述气雾剂递送系统可以是雾化器。雾化器会产生含有药物的液体微滴雾以便于吸入。在本发明中使用的“雾化”是指，将液体转化成细喷雾。雾化器会混合药物和压缩空气，以产生细雾，患者通过面罩或吸嘴吸入所述细雾。就儿童而言，雾化是将药物施用至肺的最简单的且最有效的方式之一。使用适合婴儿的适当尺寸的面罩或用于大龄儿童和成年人的吸嘴，患者可正常地简单地呼吸，直到所有药物已经被吸入。雾化的另一个优点是，特别对于低龄儿童，它不需要专门的技术来使药物进入肺中。
雾化器通常分成2类：超声雾化器和喷射雾化器。因为可利用小型压缩空气泵，所以用于雾化的空气喷射雾化器被认为是便携的，但是它们是相对较大的且不便的系统。超声雾化器具有更易便携的优势，因为它们通常不需要压缩空气源。
借助于穿过狭窄的“文丘里管(venturi)”喷嘴的高速气体，空气喷射雾化器将液体转化成气雾剂。在雾化器贮器中的流体被沿着输送管吸上来，并作为细丝出现，所述细丝由于表面张力而收缩成气雾剂微滴。在雾化器内的挡板会去除较大的微滴。压缩空气压力会影响在气流中的微滴尺寸。在20-30psig的空气压力下，质量中位直径范围通常是2-5μm。喷射雾化器的实例包括(但不限于)：PariLCJetPlus(PARIGmbh,德国),HudsonTUp-draftII(HudsonRCI,Kernen,德国),Raindrop(PuritanBennett,Boulder,CO,美国)。
通过在激动后机械地振动的陶瓷压电晶体，超声雾化器使用集中在液体室中的高频超声波(即，100kHz和更高)产生气雾剂(Dennis等,1992,J.Med.Eng；Tech.16:63-68；O'Doherty等,1992,Am.Rev.Respir.Dis.146:383-88)。在空气-流体界面处产生流体的喷泉。从喷泉的下部区域产生小微滴，同时从顶点处产生大微滴。在某些情况下，叶轮将颗粒吹出雾化器，或气雾剂被患者直接吸入。超声雾化器能够实现比空气喷射雾化器更大的输出，由于该原因，超声雾化器经常被用于气雾剂药物疗法中。超声雾化器的实例包括(但不限于)：MabisMistII(AllergyAsthmaTechologyLLC)，DeVilbiss压缩机雾化器系统，DeVilbiss可重复使用的喷射雾化器(DeVilbissHealthcare,Somerset,宾夕法尼亚州,美国)，Kun-88(K-Sonic,台北,台湾)，SUN345(Siemens,ElemaAB,Solna,瑞典)。
在空气喷射雾化器和超声雾化器中，在雾化器中的挡板捕集和再循环大的(主要的)气雾剂微滴，同时小的(次要的)微滴被释放用于吸入。在任一类雾化器中，药物通常被包含在溶液(在雾化器中的液体)中，所以产生的微滴含有在溶液中的药物。
超声雾化器通常不适用于递送悬浮液(Taylor和McCallion,2002,见:Swarbrick,Boylan(编),EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,第2版，MarcelDekker,Inc.,纽约,第2840-2847页)和脂质体(Elhissi和Taylor,2005,J.DrugDeliv.Sci.Technol.15:261-265)，且由于在雾化过程中产生热，所以它们可能降解不稳定的物质诸如蛋白(Niven等人,1995,Pharm.Res.12:53-59)。
振动网孔式雾化器可以克服空气喷射雾化器和超声雾化器的缺点。振动网孔装置采用带穿孔的平板，所述平板振动以便产生气雾剂。震动元件的活化会振动多孔平板，造成本发明的组合物被牵拉穿过多个孔，以产生具有确定的微滴(即颗粒)尺寸范围的低速气雾剂。这些雾化器在雾化过程中不会加热流体，且已经被证实适用于递送悬浮液(Fink,和Simmons,2004.Chest126:816S)和易损坏的结构诸如脂质体(Wagner,2006,J.LiposomeRes.16:113-125)和核酸(Lentz,2006,J.AerosolMed.19:372-384)。振动网孔式雾化器分为被动式和主动式振动网孔装置(Newman,2005,J.Appl.Ther.Res.5:29-33)。被动式振动网孔装置(例如OmronMicroAirNE-U22雾化器)采用带穿孔的平板，所述平板具有最高达6000微米尺寸的孔。与传感器触角相连的振动压电晶体会诱发位于它前面的穿孔平板的“被动”振动，导致流体穿过孔挤出和产生气雾剂。主动式振动网孔装置(例如AeronebPro雾化器)可以采用“微泵”系统，该系统包括由平板(其具有最多可达1000个拱形孔)和振动元件(其在施加电流后收缩和扩张)组成的气雾剂发生器。这会导致网上下移动数微米，从而挤出流体并产生气雾剂。振动网孔式雾化器的其它实例包括：(PARIGmbH,德国；也参见US5,586,550)，(Aerogen,Inc.,Sunnyvale,加利福尼亚；也参见US5,586,550、US5,938,117、US6,014,970、US6,085,740、US6,205,999)。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。本发明也涉及一种气雾剂，所述气雾剂包含通过雾化组合物可得到的液体微滴，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。本发明另外涉及一种振动网孔式雾化器，其包括容器和与所述容器相连的气雾剂发生器，其中所述容器包含本发明的组合物。
本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒可以施用给受试者，以预防、治疗和/或控制一种或多种具体的疾病和/或病症。在一个具体的方面，将本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒施用给受试者，以预防、治疗和/或控制一种或多种呼吸疾病和/或病症。
使用本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒可以治疗、抑制或预防的呼吸疾病和/或病症可以包括：肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、嗜曙红细胞增多性肺浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺动脉栓塞症、胸膜疾病、纵隔疾病、膈膜疾病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌疾病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺病、肺孢子虫病(pneumocytosis)、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓塞、肺部炎症、肺组织细胞增生症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病、韦格纳氏肉芽肿病和非小细胞肺癌。在一个具体的方面，将本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒施用给受试者，以预防、治疗和/或控制病毒性肺感染和更具体的hRSV感染。
在另一个方面，本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒被用于通过气雾化通过肺给药来全身递送本发明的多肽。因此，可以将本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒施用给受试者，以预防、治疗和/或控制与靶标有关的任何疾病和/或病症，本发明的多肽(存在于所述组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒中)与所述靶标特异性地结合。例如，但非限制性地，所述组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒可以用于预防、治疗和/或控制与异源二聚的细胞因子和它们的受体有关的疾病和/或病症，包括炎症和炎性病症诸如肠疾病(结肠炎、局限性回肠炎、炎性肠病(IBD))、感染性疾病、银屑病、癌症、自身免疫疾病(诸如多发性硬化(MS))、carcoidis、移植排斥、囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、病毒感染、普通可变型免疫缺陷。
在本发明的范围内还包括，使用本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒预防和/或治疗如上所述的一种或多种疾病和/或病症。
本发明的组合物、容器、气雾剂递送系统、药物单位剂量和/或试剂盒还可以有利地与一种或多种其它疗法(例如，一种或多种其它预防剂或治疗剂)，优选可用于预防、治疗和/或控制(相同或另一种)疾病和/或病症的疗法联合使用。治疗剂或预防剂包括、但不限于：小分子、合成药物、肽、多肽、蛋白、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸，包括、但不限于，反义核苷酸序列、三股螺旋、RNAi和编码生物学上有活性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、其它免疫球蛋白单可变结构域、合成的或天然的无机分子、模仿试剂和合成的或天然的有机分子。已知可用于、或已经用于、或目前正在被用于预防、治疗和/或控制与特定疾病或病症有关的一种或多种症状的任何疗法(例如，预防剂或治疗剂)，可以与本文所述的根据本发明的本发明组合物联合使用。
本发明的组合物可以与一种或多种其它疗法(例如，一种或多种其它预防剂或治疗剂)并行地施用给哺乳动物，优选人。术语“并行地”并不限于在完全相同的时间施用预防剂或治疗剂/疗法，而是指，本发明的组合物和其它药剂/疗法按次序并在特定时间间隔内施用给哺乳动物，使得在所述组合物中包含的多肽可以与其它药剂/疗法一起起作用，以提供与以其它方式施用它们相比增加的益处。例如，本发明的组合物和一种或多种其它预防剂或治疗剂可以同时地或在不同的时间点以任意次序顺序地施用；但是，如果不是同时施用，它们应当在时间上充分接近地施用，从而提供希望的治疗或预防效果。
当与其它疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)联合使用时，本发明的组合物和其它疗法可以加合地或协同地起作用。本发明预见到，通过相同的或不同的给药途径(例如，肺和肠胃外)，与其它疗法(例如，预防剂或治疗剂)联合施用本发明的组合物。
现在将通过下述非限制性的优选方面和实施例进一步描述本发明：
方面
1.用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中：
-所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％的表面活性剂；
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在于所述组合物中；和/或
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
2.方面1的方法，其中聚集体形成的量是5％或更低，优选4％或更低，诸如3％或更低、2％或更低或甚至1％或更低。
3.方面1或2中任一个的方法，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％的表面活性剂，优选0.001％至约0.1％、或约0.01％至约0.1％，诸如约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.08％或0.1％，优选约0.01％。
4.方面1-3中任一个的方法，其中所述表面活性剂选自：非离子型去污剂。
5.方面1-4中任一个的方法，其中所述表面活性剂选自：聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆，或其中加入PEG作为表面活性剂-样化合物。
6.方面3-5中任一个的方法，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以低于20mg/mL的浓度存在。
7.方面1-5中任一个的方法，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在。
8.方面1或2中任一个的方法，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在，且其中所述组合物不包含表面活性剂。
9.方面1-8中任一个的方法，其中所述多肽包含一个免疫球蛋白单可变结构域。
10.方面1-8中任一个的方法，其中所述多肽包含2个或更多个免疫球蛋白单可变结构域，诸如2个或3个免疫球蛋白单可变结构域。
11.方面1-10中任一个的方法，其中所述多肽特异性地结合RSV或IL-23。
12.方面11的方法，其中所述多肽选自：SEQIDNO:1、2和3之一。
13.方面1-12中任一个的方法，其中在雾化器中雾化所述组合物。
14.方面13的方法，其中所述雾化器是振动网孔式雾化器。
15.方面1-14中任一个的方法，其中所述气雾剂具有下述体积中值直径：1-10μm，优选1-7μm，最优选1-5μm，诸如约3、3.5或4μm。
16.包含通过雾化组合物可得到的液体微滴的气雾剂，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，且其中：
-所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％的表面活性剂；
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在于所述组合物中；和/或
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物。
17.方面16的气雾剂，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是5％或更低，优选4％或更低，诸如3％或更低、2％或更低或甚至1％或更低。
18.方面16或17中的任一个的气雾剂，其中所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％的表面活性剂，优选0.001％至约0.1％或约0.01％至约0.1％，诸如约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.08％或0.1％，优选约0.01％。
19.方面16-18中的任一个的气雾剂，其中所述表面活性剂选自：非离子型去污剂。
20.方面16-19中的任一个的气雾剂，其中所述表面活性剂选自：聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆，或其中加入PEG作为表面活性剂-样化合物。
21.方面18-20中的任一个的气雾剂，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以低于20mg/mL的浓度存在。
22.方面16-20中的任一个的气雾剂，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在。
23.方面16或17中的任一个的气雾剂，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在，且其中所述组合物不包含表面活性剂。
24.方面16-23中的任一个的气雾剂，其中所述多肽包含一个免疫球蛋白单可变结构域。
25.方面16-23中的任一个的气雾剂，其中所述多肽包含2个或更多个免疫球蛋白单可变结构域，诸如2个或3个免疫球蛋白单可变结构域。
26.方面16-25中的任一个的气雾剂，其中所述多肽特异性地结合RSV或IL-23。
27.方面26的气雾剂，其中所述多肽选自：SEQIDNO:1、2和3之一。
28.方面16-27中的任一个的气雾剂，其中在雾化器中雾化所述组合物。
29.方面28的气雾剂，其中所述雾化器是振动网孔式雾化器。
30.方面16-29中的任一个的气雾剂，其中所述气雾剂具有下述体积中值直径：1-10μm，优选1-7μm，最优选1-5μm，诸如约3、3.5或4μm。
31.一种适合用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，在所述气雾剂中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和浓度为1mg/mL至200mg/mL的含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中：
-所述组合物另外包含浓度为0.001％至1％的表面活性剂；和/或
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在于所述组合物中。
32.方面31的组合物，其中聚集体形成的量是5％或更低，优选4％或更低，诸如3％或更低、2％或更低或甚至1％或更低。
33.方面31或32中的任一个的组合物，其包含浓度为0.001％至1％，优选0.001％至约0.1％，或约0.01％至约0.1％，诸如约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.08％或0.1％，优选约0.01％的表面活性剂。
34.方面31-33中的任一个的组合物，其中所述表面活性剂选自：非离子型去污剂。
35.方面34的组合物，其中所述表面活性剂选自：聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆，或其中加入PEG作为表面活性剂-样化合物。
36.方面33-35中的任一个的组合物，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以低于20mg/mL的浓度存在。
37.方面31-35中的任一个的组合物，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以25mg/mL或更高的浓度存在。
38.方面31或32中的任一个的组合物，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以20mg/mL或更高的浓度存在，且其中所述组合物不包含表面活性剂。
39.方面31-38中的任一个的组合物，其中所述多肽包含一个免疫球蛋白单可变结构域。
40.方面31-38中的任一个的组合物，其中所述多肽包含2个或更多个免疫球蛋白单可变结构域，诸如2个或3个免疫球蛋白单可变结构域。
41.方面31-40中的任一个的组合物，其中所述多肽特异性地结合RSV或IL-23。
42.方面41的组合物，其中所述多肽选自：SEQIDNO:1、2和3之一。
43.方面1-15中的任一个的方法、方面16-30中的任一个的气雾剂或方面31-42中的任一个的组合物，其中所述组合物中的水性载体是蒸馏水、MilliQ级水或注射用水(WFI)。
44.方面1-15中的任一个的方法、方面16-30中的任一个的气雾剂或方面31-42中的任一个的组合物，其中所述组合物被缓冲至pH5.5-7.5，优选pH7.0。
45.方面44的方法、气雾剂或组合物，其中所述组合物用选自下述的缓冲液缓冲：PBS、磷酸盐缓冲液、TrisHCl、组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。
46.方面45的方法、气雾剂或组合物，其中所述组合物中的缓冲液具有下述浓度：10-100mM，优选10-50mM，诸如10mM或20mM，尤其是10mM。
47.方面1-15中的任一个的方法、方面17-30中的任一个的气雾剂或方面31-42中的任一个的组合物，其中所述组合物是等渗的或稍微低渗的。
48.方面47的方法、气雾剂或组合物，其中所述组合物具有290±60mOsm/kg的渗透压。
49.方面47或48中的任一个的方法、气雾剂或组合物，其中已经如下调节所述组合物的渗透压：加入糖或盐，优选NaCl，尤其是130mMNaCl。
50.用于制备方面31-42中的任一个的组合物的方法，所述方法至少包括下述步骤：浓缩所述多肽，并用选择的缓冲液交换它。
51.方面50的方法，所述方法另外包括下述步骤：加入浓度为0.001％至1％，优选0.001％至约0.1％，或约0.01％至约0.1％，诸如约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.08％或0.1％，优选约0.01％的表面活性剂。
52.方面50或52中的任一个的方法，其中所述表面活性剂选自：非离子型去污剂。
53.方面52的方法，其中所述表面活性剂选自：聚山梨酯(例如吐温20和吐温80)和泊洛沙姆，或其中加入PEG作为表面活性剂-样化合物。
54.方面51-53中的任一个的方法，其中所述多肽被浓缩至低于20mg/mL的浓度。
55.方面50-53中的任一个的方法，其中所述多肽被浓缩至20mg/mL或更高的浓度。
56.方面50的方法，其中所述多肽被浓缩至20mg/mL或更高的浓度，且其中没有加入表面活性剂。
57.方面31-42中的任一个的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于通过气雾化递送给人受试者。
58.根据方面57的组合物的用途，其用于制备通过雾化来递送给人受试者的药物。
59.根据方面58的组合物的用途，其用于制备通过在振动网孔式雾化器中雾化来递送给人受试者的药物。
60.一种容器，其含有根据方面31-42中的任一个的组合物。
61.一种试剂盒，其包含：一个或多个根据方面60的容器，和在气雾剂递送系统中施用所述组合物的使用说明书。
62.方面61的试剂盒，其中所述气雾剂递送系统是雾化器。
63.方面62的试剂盒，其中所述雾化器是振动网孔式雾化器。
64.一种气雾剂递送系统，其包含容器、与所述容器相连的气雾剂发生器，其中所述容器含有方面31-42中的任一个的组合物。
65.方面64的气雾剂递送系统，它是雾化器。
66.方面65的雾化器，它是振动网孔式雾化器。
67.用于治疗中的根据前述方面中的任一个的组合物、容器、试剂盒、气雾剂递送系统或雾化器。
68.根据方面67的组合物、容器、试剂盒、气雾剂递送系统或雾化器，其中所述治疗是呼吸疾病的治疗。
69.用于预防和/或治疗一种或多种疾病和/或病症的方法，所述方法包括：通过气雾化，给有此需要的受试者施用根据方面31-42中的任一个的组合物。
70.方面69的方法，所述方法用于预防和/或治疗一种或多种呼吸疾病，所述方法包括：通过气雾化，给有此需要的受试者施用根据方面31-42中的任一个的组合物。
71.根据方面70的方法，其中所述呼吸疾病是RSV感染。
72.方面69-71中任一个的方法，其中通过雾化施用所述组合物。
73.方面72的方法，其中通过振动网孔式雾化器施用所述组合物。
74.根据前述方面中的任一个的组合物、容器、试剂盒、气雾剂递送系统或雾化器用于制备药物的用途，所述药物用于治疗呼吸疾病。
75.根据方面74的用途，其中所述呼吸疾病是RSV感染。
实施例
实施例1：纳米抗体P23IL0075的雾化器递送
已经在WO2009/068627中将
23IL0075(SEQIDNO：1；EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKGRELVATINSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCQTSGSGSPNFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTLSSYAMGWFRQAPGKGREFVARISQGGTAIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKDPSPYYRGSAYLLSGSYDSWGQGTLVTVSS)
描述为SEQIDNO：2622。23IL0075由3个人源化的重链羊驼抗体的可变结构域组成：结合IL23p19的不同表位的119A3v16和81A12v5，和结合HSA的ALB8。在这两种纳米抗体中的亚基都用9G/S接头头尾融合。
在Omron袖珍雾化器MicroAIR(属于振动网孔式雾化器)中测试了P23IL0075。在该装置中，使用各种各样的不同的制剂缓冲液，在4mg/ml下测试了P23IL0075。通过使用尺寸排阻层析(SE-HPLC)比较雾化之前和之后的样品，测试样品对雾化过程的稳定性。
在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)+0.01％吐温80、PBS+0.04％吐温80、10mM组氨酸pH6+10％蔗糖+0.01％吐温80和10mM组氨酸pH6+10％蔗糖+0.04％吐温80中，测试了P23IL0075。使用Omron袖珍雾化器MicroAIR，雾化0.5ml的每种溶液。将5微升蛋白样品注射到SE-HPLC(TSKgelG2000SWXL)柱之上。以0.2ml/min，在SE-HPLC上进行蛋白分离达70分钟。使用3.25mMNa2HPO4+6.75mMNaH2PO4+0.3M精氨酸HCl+0.005％NaN3pH6作为流动相。通过紫外线(吸光度280nm)在线检测，进行洗脱的蛋白质物质的检测。
在表1中的结果表明，测试的所有4种不同制剂的雾化后SE-HPLC曲线呈现出与参照样品相比稍微增加的前峰，并指示可溶性聚集体的相对量的微小增加。从相对于参照样品的雾化后总峰面积，计算出雾化以后的蛋白回收率。在表1中的结果表明，在组氨酸/蔗糖中配制的雾化样品具有与输入物质相当的量的P23IL0075。这提示，所述物质在雾化时不会经历显著的降解或碎裂。
吐温-80以剂量依赖性的方式增加回收率，并且将P23IL0075稳定化而防止聚集和降解。在含有0.04％吐温-80的组氨酸/蔗糖制剂中，在雾化以后，P23IL0075纳米抗体的回收率是100％，并观察到最低量的可溶性的聚集体(3％)。在仅含有0.01％吐温-80的类似制剂中，在雾化以后，P23IL0075的回收率是90％，可溶性的聚集体的百分比是4.8％。这些数据指示，在雾化以后，吐温-80以浓度依赖性的方式具有防止聚集的稳定化作用。
表1与参照样品(相同制剂，没有雾化)相比，在Omron袖珍雾化器MicroAIR中雾化以后，P23IL0075(4mg/mL，在不同的制剂缓冲液中)的SE-HPLC分析数据的总结
实施例2：不同的雾化器装置和蛋白浓度对纳米抗体RSV420的雾化的影响
RSV420具有下述序列：
EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS(SEQIDNO：3).
在分别属于喷射式和网孔式雾化器的JET和AKITA2APIXNEBTM雾化器(Activaero)中，测试RSV420。在上述装置中，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中在不同的浓度(约1、5和20mg/mL)下，测试RSV420。通过使用尺寸排阻层析(SE-HPLC)比较雾化之前和之后的样品，测试样品对雾化过程的稳定性。
如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中。经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
观察到，通过网孔式或喷射式雾化器的雾化，会诱导个别的(discreet)多聚形式的RSV420，当经由SE-HPLC进行分析时，可作为前峰显现。表2报告了雾化以后来自样品的SE-HPLC分析的积分(integrations)数据；具体地，显示了来自使用喷射式(JET)或网孔式雾化器(AKITA2APIXNEBTM)雾化的不同RSV420浓度(5.32mg/ml和22.90mg/ml)的SE-HPLC数据(％寡聚体)中的前峰的相对量。
从这些结果显而易见，与网孔式雾化器相比，当使用喷射式雾化器时，多聚形式的量远远更多(多达前峰的45％)；此外，当雾化含有较高浓度的蛋白的溶液时，这些副产物的形成不太明显。具体地，当经由网孔式雾化器雾化RSV420在PBS中的溶液(浓度为约20mg/mL)时，气雾剂中通过SE-HPLC分析可见的前峰的相对量最多为2％。
表2使用不同的雾化器装置和不同的蛋白浓度时，在雾化的RSV420中的寡聚体的百分比(来自SE-HPLC数据)
实施例3：不同的缓冲剂/赋形剂组合对纳米抗体RSV434的雾化的影响
在WO2010/139808中已经将
RSV434(SEQIDNO：2；DVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS)
描述为SEQIDNO：142。RSV434由重链羊驼抗体的3个可变结构域组成。在这两种纳米抗体中的亚基都用15G/S接头头尾融合。
首先，通过测量RSV434在表现出pH3.8-7.0的pH范围的缓冲剂/赋形剂组合物中的熔化温度(Tm)，分析RSV434在所述不同组合物中的稳定性。经由示差扫描量热法(DSC)或热迁移试验(TSA)，测量该参数，其定义了溶液中的50％蛋白解折叠时的温度。
对于DSC实验，在待测缓冲液中使所有样品达到0.5mg/mL的浓度。将样品(400μl)加样至96-孔板上，DSC设置如下：最终蛋白浓度0.5mg/mL；起始温度35℃；结束温度95℃；扫描速率1℃/min.；冷却速率：EXP；反馈模式：无；过滤周期4；扫描前恒温器：10min.；扫描后恒温器：0min。每个分析还包括2个缓冲液运行，以建立稳定的基线。在减去基线以后，得到温度自记曲线。
DSC结果指示，在中性pH时，Tm值更高(参见表3)。
表3经由DSC测定在不同的缓冲剂/赋形剂组合物(缓冲液浓度20mM)中的RSV434(0.5mg/mL)的Tm
| RSV 434所在的缓冲液 | 熔化温度(℃) |
| 柠檬酸盐pH 3.8 | 57.2 |
| 乙酸盐pH 3.8 | 57.3 |
| 柠檬酸盐+NaCl pH 5.5 | 64.7 |
| 乙酸盐+NaCl pH 5.5 | 64.8 |
| Bis-Tris pH 6.5 | 66.3 |
| Tris pH 7.0 | 66.6 |
| PBS | 67.0 |
| 磷酸钠pH 7.0 | 67.9 |
接着，通过经由热迁移试验(TSA)测量RSV434在不同缓冲液中的熔化温度(Tm)，分析RSV434在选择的pH范围为6.0-7.5的缓冲剂/赋形剂组合物中的稳定性(参见图1；所有指示的缓冲液另外含有0.3M甘露醇)。
可以在Q-PCR装置中以高通量方式(96-孔板)进行热迁移试验(TSA)，以评价缓冲液(对)、离子强度、pH和赋形剂对蛋白的热稳定性的影响。该试验产生Tm值，其指示在测试的缓冲液中的热稳定性。简而言之，该试验跟踪当蛋白发生热解折叠时荧光染料(诸如Sypro橙)的信号变化。当将Sypro橙加入适当地折叠的蛋白溶液中时，它会暴露于水性环境中，它的荧光信号被猝灭。当温度升高时，该蛋白发生热解折叠，并暴露它的疏水核心区。Sypro橙然后结合该疏水区并去猝灭，这导致荧光信号的增加。在含有待测缓冲剂、0.1mg/mL的蛋白样品和10xSypro橙的溶液上进行该试验。该程序由下述步骤组成：以4.4℃/s的变化速率，加热至37℃，并保持10s；以0.01℃/s的连续变化速率(66次获取/℃)，加热至90℃；和以2.2℃/s的变化速率，冷却至37℃，并保持10s。
另外，在雾化以后通过SE-HPLC进一步分析不同的缓冲剂/赋形剂组合物对RSV434的稳定性的影响。
在有不同的赋形剂存在下，经由手持网孔式雾化器OmronMicroAir，雾化纳米抗体RSV434的5mg/ml溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在下述缓冲液中以5mg/ml配制RSV434：10mM磷酸钠pH7.0，50mM磷酸钠pH7.0，10mM磷酸盐pH7.5，50mM磷酸盐pH7.5，10mMTRISpH7.5，50mMTRISpH7.5，10mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5，50mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5。向每种溶液中，还加入甘氨酸或甘露醇(至0.3M终浓度)或氯化钠(至0.15M终浓度)作为渗透剂(参见表4和图2)。如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中。经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
表4报告了SE-HPLC分析雾化之前和之后的样品的积分数据；具体地，显示了前峰和后峰的相对量以及产物主峰。已经观察到，通过网孔式或喷射式雾化器的雾化，会诱导个别的多聚形式的RSV434，这可能是由于在气雾化过程中分子向空气-水界面的暴露所导致。前峰的总量代表这种多聚形式的形成。总回收率栏报告了雾化以后回收的物质的百分比，这是基于雾化以后和以前的总面积之比。
从这些结果显而易见，在大多数测试的条件下，多聚形式的量高于10％；少数缓冲剂/赋形剂组合物导致更低的多聚化，例如，10mM磷酸钠pH7.0/0.15MNaCl，50mM磷酸盐pH7.5/0.15MNaCl，10mMTRISpH7.5/0.3M甘氨酸，50mMTRISpH7.5/0.3M甘氨酸，50mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5/0.15MNaCl。关于蛋白回收率，所有含有TRIS的组合具有更好的性能。
表4与未雾化物质(REF)相比，经由Omron袖珍雾化器MicroAIR雾化以后(雾化)，在不同的制剂缓冲液中的RSV434(5mg/mL)的SE-HPLC分析数据的总结
实施例4：表面活性剂和选择的缓冲剂/赋形剂组合物对纳米抗体RSV434的雾化的影响
在有选择的缓冲液和表面活性剂存在下，经由手持网孔式雾化器OmronMicroAir，雾化5mg/ml的纳米抗体RSV434溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
在第一组实验中，以5mg/ml在下述缓冲液中配制RSV434：0.9％NaCl(盐水)，10mMTRISpH7.5/0.3M甘氨酸，10mM磷酸钠pH7.5/0.15MNaCl，50mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5/0.15MNaCl。在第二组实验中，以5mg/ml在下述缓冲液中配制RSV434：0.9％NaCl(盐水)，PBS，10mM磷酸钠pH7.0/0.14MNaCl，10mM磷酸钠pH7.5/0.145MNaCl，10mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5/0.133MNaCl。在不加入或加入0.04％聚山梨酯80(吐温80)和/或0.02％聚乙二醇(PEG)1000的情况下，测试这些缓冲液条件中的每一种。如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中。经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg每种样品。
表5报告了来自对雾化之前和之后的第一组实验样品的SE-HPLC分析的积分数据；具体地，显示了前峰和后峰的相对量以及产物主峰。前峰的总量代表多聚形式的形成。总回收率栏报告了雾化以后回收的物质的百分比，这是基于雾化以后和以前的总面积之比。图3显示了前峰的百分比，其是通过SE-HPLC分析雾化以后的第二组实验样品来测量的。
从报告的结果可以看出：吐温80和PEG1000两者具有减少雾化以后多聚物的量的有益效果。在盐水和50mM柠檬酸盐/磷酸盐pH6.5/0.15MNaCl溶液的情况下，吐温80似乎具有更好的性能。另一方面，PEG1000似乎总是会增加雾化以后的蛋白回收率。
实施例5：不同浓度的聚山梨酯(吐温)80对纳米抗体RSV434的雾化的影响
在有选择的缓冲液和表面活性剂存在下，经由网孔式雾化器AkitaApixneb(Activaero)雾化5mg/ml的纳米抗体RSV434的溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在有不同浓度的吐温80(0、0.005％、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％)存在下，以5mg/ml在10mM磷酸钠pH7.5/0.14MNaCl中配制RSV434。如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中；一式三份地测试每种配制条件。经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
图4报告了从雾化之前和之后的样品的SE-HPLC分析得到的前峰的相对量。前峰的总量代表多聚形式的形成。图5显示了吐温80对总蛋白回收率的影响，这是基于雾化之前和之后的样品的SE-HPLC分析。
从得到的数据可以得出结论：在经由网孔式雾化器雾化以后，多聚形式的相对量依赖于去污剂(具体地，吐温80)在起始溶液中的浓度。0.08％吐温80的使用会产生最低的前峰百分比(图4)和最高的面积回收率(图5)。
使用含有0.08％或0.04％吐温80的雾化溶液，得到最高的蛋白回收率。
实施例6：不同浓度的聚乙二醇(PEG)1000和PluronicF68(泊洛沙姆188；LutrolF68)对纳米抗体RSV434的雾化的影响
在有选择的缓冲液和表面活性剂存在下，经由网孔式雾化器AkitaApixneb(Activaero)，雾化5mg/ml的纳米抗体RSV434的溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在有不同浓度的PEG1000(0.02％、0.04％)或PluronicF68(0.001％、0.02％、0.04％)存在下，以5mg/ml在10mM磷酸钠pH7.0/0.13MNaCl中配制RSV434。如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中；经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
表6报告了来自雾化之前和之后的样品的SE-HPLC分析的积分数据；具体地，显示了前峰的相对量以及产物主峰。前峰的总量代表多聚形式的形成。总回收率栏报告了雾化以后回收的物质的百分比，这是基于雾化以后和以前的总面积之比。作为参照，报告了来自之前在相同实验条件下进行的实验的数据，其中使用RSV434在10mM磷酸钠pH7.0/0.14MNaCl中的溶液，没有加入表面活性剂。
数据清楚地表明，浓度为0.04％的PEG1000、特别是浓度为0.04％的PluronicF-68在减少经由网孔式雾化器雾化以后的多聚形式形成方面的有益作用。相同的赋形剂也允许在相同过程之后更高的物质回收率。
表6.与未雾化物质(REF)相比，在经由AkitaApixneb雾化器雾化以后(雾化)，含有不同赋形剂的RSV434的5mg/ml溶液的SE-HPLC分析数据的总结
实施例7：聚乙二醇(PEG)1000、PluronicF68(泊洛沙姆188；LutrolF68)和聚山梨酯(吐温)80对经由喷射式雾化器的纳米抗体RSV434的雾化的影响。
在有选择的表面活性剂存在下，经由喷射式雾化器AkitaJet(Activaero)，雾化纳米抗体RSV434的5mg/ml溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在有PEG1000(0.04％)、PluronicF68(0.04％)或吐温80(0.04％、0.08％)存在下，以5mg/ml在10mM磷酸钠pH7.0/0.13MNaCl中配制RSV434。如下雾化每种溶液：给雾化器装入2ml液体，并经由含有30mlPBS的空气采样器，收集雾化的物质；雾化以后，从空气采样器中收集溶液，并稀释至50ml；经由OD280测量，测定蛋白浓度，并经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
表7报告了来自雾化之前和之后的样品的SE-HPLC分析的积分数据结果；具体地，显示了前峰的相对量以及产物(主峰)纯度。前峰的总量代表多聚形式的形成。
在经由喷射式雾化器雾化的情况下，浓度为0.04％的PEG1000和浓度为0.04％的PluronicF-68似乎也会减少雾化以后的多聚形式的形成，但不是以相关的方式。就该目的而言，吐温80的使用似乎更有效；更高表面活性剂浓度(0.08％替代0.04％)的使用不会导致较高分子量形式(前峰)的形成的显著减少。
表7.与未雾化物质(REF)相比，在经由AkitaJet雾化器雾化以后(雾化)，含有不同赋形剂的5mg/mlRSV434溶液的SE-HPLC分析数据的总结
实施例8：蛋白浓度对纳米抗体RSV434的雾化的影响
在有选择的缓冲液和吐温80(作为表面活性剂)的存在下，经由网孔式雾化器AkitaApixneb(Activaero)雾化3种不同浓度的纳米抗体RSV434溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在有或没有0.04％吐温80存在下，以5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml，在盐水(0.9％NaCl)中或在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中配制RSV434。
如下雾化每种溶液：给雾化器装入500μl液体，并将雾化的物质收集在50ml聚丙烯试管中；经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
图6报告了雾化以后的样品的SE-HPLC分析所得到的前峰的相对量。前峰的总量代表多聚形式的形成。显然，RSV434的多聚形式的形成与蛋白浓度逆相关。在较高的蛋白浓度(25和50mg/ml)下，缓冲液和表面活性剂对多聚体形成的影响似乎是可忽略不计的。
实施例9：蛋白浓度对纳米抗体RSV434经由喷射式雾化器的雾化的影响
在有选择的缓冲液和吐温80(作为表面活性剂)的存在下，经由喷射式雾化器AkitaJet(Activaero)，雾化3种不同浓度的纳米抗体RSV434溶液。然后经由尺寸排阻层析，分析雾化之前和之后的样品。
简而言之，在有或没有0.04％吐温80存在下，以5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml，在10mM磷酸钠(NaH2PO4/Na2HPO4)+0.13MNaClpH7.0中或在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中配制RSV434。
如下雾化每种溶液：给雾化器装入2ml液体，并经由含有30mlPBS的空气采样器，收集雾化的物质；雾化以后，从空气采样器中收集溶液，并稀释至50ml；经由OD280测量，测定蛋白浓度，并经由SE-HPLC，使用TSK凝胶SuperSW3000(流速0.15ml/min，运行时间35分钟，流动相3.9mMKH2PO4+6.1mMNa2HPO4+0.4MNaClpH7.0；检测设定在280nm)，分析雾化之前和之后的10μg的每种样品。
图7报告了从雾化之前和之后的样品的SE-HPLC分析得到的前峰的相对量。前峰的总量代表多聚形式的形成。
仅在低纳米抗体浓度(5mg/ml)，吐温80在减少多聚物的百分比中的作用是更相关的。
实施例10：选择的缓冲液对纳米抗体RSV434的气雾剂微滴尺寸的影响
选择的缓冲液是：NaH2PO4/Na2HPO410mMpH7.0+NaCl0.13M，含有或不含有吐温800.04％(w:v)；和PBS缓冲液，含有或不含有吐温800.04％(w:v)。PBS的组成是：10.14mMNa2HPO4,1.76mMKH2PO4,2.67mMKCl和136.9mMNaCl，pH7.8。将NaCl的浓度调至0.13M(替代以前的实验中的0.14M)，以便确保得到等张溶液(约290mOsm/kg)。
使用Akita2Apixneb雾化器装置，对如表8所述配制的RSV434样品进行雾化实验，以便测定平均微滴尺寸(图8)。所述雾化器使用具有4μm网孔尺寸的膜，所以在雾化以后应当实现4μm或更低的粒度。
从图8报告的数据显而易见，不同制剂的微滴尺寸(体积中值直径或VMD，通过激光衍射测定)是可再现的，且适合递送至肺深处(约4μm，对于浓度为50mg/mL的制剂而言是3.8μm)。
表8样品代码、组成和浓度的描述
实施例11：蛋白浓度对纳米抗体RSV434的雾化物质中形成的聚集体的分子量的影响
在NaH2PO4/Na2HPO410mMpH7.0+NaCl0.13M中配制的浓度为5和50mg/mL的RSV434溶液上，进行额外的雾化实验(一式三份地)，所述溶液含有下述浓度的表面活性剂：0、0.02％w/v和0.04％w/v。
与以前的实验中一样，雾化每种样品，不同之处在于使用玻璃容器(100ml瓶子)进行收集操作。
雾化以后的样品的SE-HPLC分析，允许定量RSV434的多聚形式(前峰)的相对量(参见表9)。
当纳米抗体是在50mg/mL的浓度下时，没有观察到吐温80对雾化以后的多聚形式的百分比的显著影响。在较低的浓度(5mg/mL)下，吐温80(0.02％和0.04％w/v)的存在使雾化的物质中的总前峰百分比减半。
详细地分析SE-HPLC色谱图，还可能确定前峰区域中的高分子量(HMW)物质的相对量(参见表9和图9)；RSV434的HMW聚集体对应着在尺寸排阻层析中检测到的具有超过约200kDa的分子量的聚集体。结果清楚地表明，在50mg/mL下，在不含有吐温80的制剂中，形成更少的HMW物质。在5mg/ml下，没有观察到差异。
表9.浓度为50mg/mL和5mg/mL的RSV434在雾化之前和之后的总前峰百分比(％)和高分子量(HMW)物质的百分比(％)(从SE-HPLC色谱图的积分数据计算出-参见图9)(n＝3)
等同方案
前面的书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明不通过所提供的实施例限定范围，因为实施例意图仅作为对本发明一个方面的例证，任何功能上等同的实施方案都在本发明的范围内。除本文展示和描述的那些以外，本领域技术人员从前面的描述会明白本发明的各种修改，它们落入后附权利要求的范围内。本发明的优点不一定被本发明的每个实施方案包括在内。
贯穿本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，都通过引用整体并入本文，特别是关于本文提及的用途或主题。
Claims (25)
1.用于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的方法，其中聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述方法包括下述步骤：雾化组合物，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中：
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL至200mg/mL的浓度存在于所述组合物中；
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物，并且
其中所述免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成，其中所述组合物不包含表面活性剂或表面活性剂样化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽含有两个或三个免疫球蛋白单可变结构域。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述多肽特异性结合RSV。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽是SEQIDNO:2。
5.包含通过雾化组合物可得到的液体微滴的气雾剂，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，并且其中：
-所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL至200mg/mL的浓度存在于所述组合物中；
-在振动网孔式雾化器中雾化所述组合物，并且
其中所述免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成。
6.根据权利要求5所述的气雾剂，其中所述组合物不包含表面活性剂。
7.根据权利要求5或6所述的气雾剂，其中所述多肽含有两个或三个免疫球蛋白单可变结构域。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的气雾剂，其中所述多肽特异性结合RSV。
9.根据权利要求8所述的气雾剂，其中所述多肽是SEQIDNO:2。
10.组合物用于制备药物的用途，所述组合物适合于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂，所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，所述药物用于通过在振动网孔式雾化器中雾化来递送给人受试者，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL至200mg/mL的浓度存在于所述组合物中，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成。
11.根据权利要求10所述的组合物的用途，其中所述组合物不包含表面活性剂。
12.根据权利要求10或11所述的组合物的用途，其中所述多肽含有两个或三个免疫球蛋白单可变结构域。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物的用途，其中所述多肽特异性结合RSV。
14.根据权利要求13所述的组合物的用途，其中所述多肽是SEQIDNO:2。
15.一种试剂盒，其包括：一个或多个容器，所述容器含有适合于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，并且所述试剂盒包括将所述组合物用于在振动网孔式雾化器中给药的使用说明书，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL至200mg/mL的浓度存在于所述组合物中，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述组合物不包含表面活性剂。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中所述多肽含有两个或三个免疫球蛋白单可变结构域。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，其中所述多肽特异性结合RSV。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述多肽是SEQIDNO:2。
20.一种振动网孔式雾化器，其包含：容器，与所述容器相连的气雾剂发生器，其中所述容器含有适合于制备免疫球蛋白单可变结构域的气雾剂的组合物，所述气雾剂中的聚集体形成的量是6％或更低，所述聚集体形成的百分比是通过SE-HPLC测定的，所述组合物包含水性载体和含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述含有一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以50mg/mL至200mg/mL的浓度存在于所述组合物中，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上，且由单个免疫球蛋白结构域形成。
21.根据权利要求20所述的振动网孔式雾化器，其中所述组合物不包含表面活性剂。
22.根据权利要求20或21所述的振动网孔式雾化器，其中所述多肽含有两个或三个免疫球蛋白单可变结构域。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的振动网孔式雾化器，其中所述多肽特异性结合RSV。
24.根据权利要求23所述的振动网孔式雾化器，其中所述多肽是SEQIDNO:2。
25.根据权利要求10-13中任一项所述的组合物、根据权利要求15-19中任一项所述的试剂盒或根据权利要求20-24中任一项所述的雾化器在制备用于治疗呼吸疾病的药物中的用途。
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