JP4323317B2 - 可変領域配列のクローニング方法 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫グロブリンに由来する可変領域ポリヌクレオチド配列のクローニングに関する。
背景技術
免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖は幾つかの領域に分けられる。Ｉｇ鎖のＮ末端には可変領域がある。重鎖および軽鎖の可変領域は一体となり特定抗原を受け取るよう設計された結合部位を形成する。可変領域は、それらのアミノ酸配列が分子間で著しく異なることからそう呼ばれている。この配列の多様性が非常に多様な標的の認識を可能にしている。各可変領域は複数の比較的保存された配列領域と同時に３カ所の超可変配列領域を含んでいる。３カ所の超可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）として知られている。単離された免疫グロブリン可変領域（ＩＧＶＤｓ）、例えば重鎖可変領域（ＨＣＶＤｓ）は抗原と１：１の比率で結合でき、その結合係数は完全な抗体分子のそれと同等である。この様なＩＧＶＤｓは完全なＩｇ分子の結合親和性に近い結合親和性で結合できることから、それらをＩｇ分子またはその断片として様々に用いることができる。現在Ｉｇ分子は、例えば治療、診断、ワクチン、ホルモンまたは増殖因子活性の調整、検出、バイオセンサー、そして触媒としても用いられている。小型のＩＧＶＤｓには、例えば低分子薬物の活性の中和や薬物を結合した状態での腎臓通過性、組織および腫瘍への浸透、ウイルス表面上の小保存領域に結合してウイルスを中和すること、タンパク質の高解像度エピトープマッピング、ならびに抗原を模したＩＧＶＤｓによるワクチン接種に関して、完全抗体を凌ぐ利点があると考えられている。ある個体に由来するＩＧＶＤｓの全て、または大部分を含む混合物はレパートリーを形成すると言われている。可変領域のレパートリーのクローニングは当技術分野では周知である。最新の方法は欧州特許ＥＰ０３６８６８４に完全に記載されている。要約すると、レパートリーのクローニングに関する前記方法は、クローニングのためにポリメラーゼ連鎖反応を利用し、可変領域にフランキングする保存的ＤＮＡ配列にアニーリングする２つの種特異的プライマーを必要とする。好適なベクター内へのクローニングは、前記２つの種特異的プライマーに制限酵素部位を組込むことで容易になる。
国際特許出願ＷＯ９９／２３２２１、欧州特許ＥＰ０３６８６８４及び米国特許ＵＳ６，２９１，１６１、Vand der Linden等（J.Immunol Methods, 240,p180〜195）、Larrick JW等（Progress in Biotechnology,5,p231〜246）はＩＧＶＤをコードする遺伝子を単離する方法を開示し、ＩＧＶＤ領域にフランキングする２つの種特異的プライマーの使用を挙げている。２つの種特異的プライマーを使用するには、全ての種についてＩＧＶＤ両端をフランキングする領域の配列が既知である必要がある。幾つかの種、例えばラマではＩｇＧ配列の情報の入手は容易ではない。配列情報が入手できない場合には、その種の配列と完全には相補的ではないプライマーが用いられることが多いため、プライマーのアニーリング効率は低くなり、結果としてレパートリーの多様性はより小さくなる。実際、標的と完全には相補的でないプライマーを使用すると、レパートリーライブラリーに突然変異の発生を強制することになる。強制突然変異はＩＧＶＤｓの機能に影響することが示されており、従ってプライマーを原因とする強制突然変異の数を減らす方法は機能的レパートリーライブラリーのサイズを有意に増加させる。例えば、Kipriyanov SM等（Two amino acid mutations in an anti-human CD3 single chain Fv antibody fragment that affect the yield on bacterial secretion but not the affinity、Protein Eng.(1997)、10(4)、p445〜53）；de Haard H等（Venier zone residue 4 of mouse subgroup II kappa light chains is a critical determinant for antigen recognition、Immunotechnology、(1999)、4(3〜4)、p203〜15）；de Haard HJ等（Absolute conservation of residue 6 of immunoglobulin heavy chain variable regions of class IIA is required for correct folding、Protein Eng(1998)、11(12)、p1267〜76）；Honegger A、Pluckthun A.J（The influence of the buried glutamine or glutamate residue in position 6 on the structure of immunoglobulin variable domains、Mol Biol(2001)、309(3)、p687〜99）；Jung S等（The importance of framework residues H6、H7 and H10 in antibody heavy chains:experimental evidence for a new structural subclassification of antibody V(H) domains、J Mol Biol(2001)、309(3)、p701〜16）；Langedijk AC等（The nature of antibody heavy chain residue H6 strongly influences the stability of a VH domain lacking the disulfide bridge、J Mol Biol(1998)、283(1)、p95〜110）を参照せよ。
国際特許出願ＷＯ０１／７９４８１はポリ−ｄＴ−プライム化ｃＤＮＡ合成の産物を増幅する方法を用いたＶＨ遺伝子ライブラリーの構築方法を開示する。遺伝子の３′末端には、定常領域にアニーリングする種特異的プライマーを用いる。遺伝子の５′末端には、ＲＴ Ｃａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを用いて遺伝子開始部位に合成テール（tail）を付加する。続くステップでは非コーディング領域の除去およびクローニングに必要な制限酵素部位の作製が求められる。多くの操作ステップを包含することとは別に、方法では幾つかの連続したＤＮＡ重合を利用しており、これが不要な突然変異を導入し、ライブラリーの多様性形成を低下することが知られている。
本発明の方法はＩＧＶＤｓのレパートリークローニングに関する代替方法であり、メッセンジャーＲＮＡを含むサンプルより始まる。この新規方法は、ｍＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した後に、ＩＧＶＤ配列のアンチセンスの３′末端に、またはその近傍に位置する配列とアニーリングする種特異的プライマーを１つだけ用いる。こうして産生した２本鎖ＤＮＡはＩＧＶＤ配列と全ての定常領域とを包含している。その部分に対する制限酵素での切断が少なくともＩＧＶＤ配列の一部をコードする２本鎖ＤＮＡを産生するように配置されたもともと存在する制限部位を利用することにより、こうして産生するＩＧＶＤ断片を便利にクローニングし、そして発現することができる。１つの種特異的プライマーともともと存在する制限部位との組合せての使用はより高いライブラリーの多様性を実現するが、これは種間の配列変動への依存性が小さいからである。
さらに前記のもともと存在する制限部位を使用すると、プライマーによる強制的突然変異は３′末端に起こらなくなる。
この方法では全ての種について３′末端プライマーのアニーリングを最適化する必要がないこと、そして操作の工程数が明らかに少ないことから、従来の方法に比べ大幅に費用−時間が節約される。
発明の目的および詳細な説明
本発明は免役グロブリン可変領域（ＩＧＶＤ）配列のクローニングの効率的方法に関する。遺伝子レベルでは、重鎖が３種類の遺伝子セグメント：即ち「未再配列」ＶＨ遺伝子（Ｎ−末端の３つのフレームワーク領域、最初の２つの全ＣＤＲと第３ＣＤＲのはじめの部分をコードしている）、多様性（ＤＨ）セグメント（第３ＧＤＲの中央部分をコードしている）および結合セグメント（ＪＨ）（第３ＣＤＲの最後の部分と第４フレームワーク領域をコードしている）から組み立てられた「再配列」遺伝子でコードされていることは周知である。Ｂ細胞の成熟の過程で、この遺伝子は各未再配列ＶＨ遺伝子が一つのＤＦＩ遺伝子と１つのＪＨ遺伝子と連結するように再配置する。再配置した遺伝子がＶＨ−ＤＨＪＨに対応する。この再配置遺伝子はＩｇ鎖の定常領域をコードする遺伝子に連結する。免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する分子の可変重鎖領域の少なくとも一部分を構成するＩＧＶＤのレパートリーは、本発明による方法を包含する工程の最終産物である。あるいは、免役グロブリンスーパーファミリーに由来する分子の軽鎖可変領域の少なくとも一部分を構成するＩＧＶＤのレパートリーは、本発明による方法を包含する工程の最終産物である。あるいはＩＧＶＤのレパートリーは、免役グロブリンスーパーファミリーに由来する分子の重鎖可変領域の少なくとも一部分および免役グロブリンスーパーファミリーに由来する分子の可変軽鎖ドメインの少なくとも一部分から成る。用語「レパートリー」とは、免役グロブリンに関する場合、ある動物に認められるほぼ同一または類似の様々な範囲の特異性を持つ抗体の集まりを意味する。
発明の第一実施態様では、ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列のクローニング方法を提供し、前記方法は（ａ）ｍＲＮＡを含むサンプルを提供する工程、（ｂ）第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施する工程、（ｃ）アンチセンス鎖のＩＧＶＤ開始点に、またはその近傍にある部位とハイブリダゼーションできる第一プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを生成する工程、（ｄ）制限部位に向けられた制限酵素による切断で機能的なＩＧＶＤ断片をコードする２本鎖ＤＮＡが生成するように配置された制限部位に特異的な制限酵素で前記２本鎖ＤＮＡを切断する工程、（ｅ）生じたＩＧＶＤ配列をベクターにクローニングする工程、を含む。
発明によれば、ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列は重鎖可変領域（ＨＣＶＤ）ポリヌクレオチド配列または軽鎖可変領域（ＬＣＶＤ）ポリヌクレオチド配列である。ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列のレパートリーは、ＨＣＶＤポリヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列を含む。
工程（ｄ）の切断により生じたＩＧＶＤ２本鎖ＤＮＡの断片は完全長のＩＧＶＤのヌクレオチド残基数より少なくとも、または多くとも、もしくは正確に同じでもよいが、しかしいずれの場合も生成した断片は抗原に結合できる。
即ち、本発明の方法は単離したｍＲＮＡより開始できる。ｍＲＮＡは免役グロブリンを産生することが特に知られている細胞または細胞株より、既知の方法で単離できるだろう。ｍＲＮＡはオリゴ−ｄＴクロマトグラフィーまたは当分野周知の他の方法を用いて他ＲＮＡより分離してもよい。次にｍＲＮＡを鋳型にして、逆転写酵素と好適プライマー（本明細書では「ユニバーサルプライマー」と呼ぶ）とを用いてｃＤＮＡの相補鎖を合成し、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ２重鎖を得る。好適ユニバーサルプライマーはオリゴ−ｄＴを含み、あるいはランダムプライマーのセットを含むこともできる。
２本鎖ＤＮＡはｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ２重鎖より、種特異的プライマーを用い作られる。発明の方法によれば、種特異的プライマーは１種類の種特異的プライマーまたは種特異的プライマーの混合物である。種特異的プライマーはＩＧＶＤ配列のアンチセンス鎖の３′末端に、またはその近傍に位置する配列にアニーリングする。用語「に、またはその近傍に」とは、プライマーがＩＧＶＤ配列のＮ末端をコードするポリヌクオチド配列にアニーリングすることを意味する。理想的には、プライマーはＩＧＶＤ配列のアンチセンス鎖の３′末端「に」アニーリングする。場合によっては、プライマーはＨＣＶＤ配列のアンチセンスの３′末端の「近傍」にアニーリングするが、この場合はＩＧＶＤ配列に属さない余分のＤＮＡもセンス鎖の５′末端にクローニングされることになる。上記プライマーへのアニーリングは、前記プライマーが核酸にハイブリダイゼーション可能な条件の下で起こる。本明細書では、用語「種特異的」とは、プライマーがある特定の種、例えばマウス、ヒト、ラクダといった種のＩＧＶＤ配列アンチセンス鎖の３′末端にある配列、またはその近傍の配列にアニーリングするようデザインされていることを意味する。さらに前記種特異的プライマーは、重鎖可変領域遺伝子のファミリー全てから演繹したコンセンサスポリヌクレオチド配列を持つ単一プライマーの１つでよいが、また既知ＩＧＶＤ配列の様々なファミリーに相補的になるようデザインされた複数の各種配列から成っても良い。プライマーは、例えばヌクレオチドの多様性または制限酵素部位の導入などの理由から、プライマーがアニーリングする標的配列に対し正確に相補的である配列を持たないことから、アニーリング混合液の条件を調整してプライマーが２本鎖の核酸にアニーリングできるようにする必要があることもある。この作業は当業者に周知である。種特異的プライマーは制限酵素認識部位を包含する配列を含むと有利である。制限酵素により認識される配列は、２本鎖の核酸にアニーリングするプライマーの一部である必要はないが、アニーリングしない延長物として提供されてもよい。１またはそれ以上の制限部位を持つプライマーまたはプライマーの組合せの使用には、ＤＮＡを少なくとも１つの制限酵素で切断して３′または５′にオーバーハングを持つヌクレオチドまたは平滑端を生ずることができるという利点がある。本発明の重要な要素は、ＩＧＶＤ配列が単一の種特異的プライマーだけで単離されることである。
発明の種特異的プライマーを用い作成した２本鎖ｃＤＮＡは、種特異的プライマーとｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成開始に用いた部位までの間の領域を含んでいる。即ちそれは少なくともＩＧＶＤおよび全定常領域を含む。こうして作られた２本鎖ｃＤＮＡは以下記載のようにしてクローニングに用いられる。あるいはクローニング前に、それを種特異的プライマーと、ＩＧＶＤ配列のセンス鎖の３′末端より下流の部位に結合する種特異的でない第２プライマーとを用い増幅してもよい。第２プライマーはＩＧＶＤ配列のセンス鎖の３′末端下流にあるコンセンサス領域にアニーリングし、かつ全ての種にわたって存在する（即ち種特異的でない）配列を含むことができる。あるいは、第２プライマーは発明によるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を開始するのに用いる配列（ユニバーサルプライマー）を含む。ｃＤＮＡ合成をランダムプライマーのセットを用いて行った場合には、第２プライマーは上記ランダムプライマーの混合物を含む。あるいは、第２プライマーはオリゴｄＴを含む配列である。
２本鎖ｃＤＮＡは当業界周知の方法により増幅されるだろう。実施態様の一つでは、増幅方法は次の工程を含む：（ａ）ｃＤＮＡを含むサンプルを変性して２本の鎖に分離する工程、（ｂ）上記サンプルに種特異的プライマーおよび第２プライマーを、上記プライマーが核酸にハイブリダイゼーション可能な条件の下にアニーリングする工程、（ｃ）アニーリングしたサンプルにＤＮＡポリメラーゼ酵素を、デオキシヌクレオシド３リン酸存在下に、プライマー伸長が起こる条件の下に加える工程、および（ｄ）伸長したプライマーが配列より分離する条件の下にサンプルを変性する工程。方法は工程（ｂ）から（ｄ）を複数回繰り返す工程（ｅ）を更に含むと良い。
変性工程（ｄ）は、例えばサンプルを加熱すること、尿素またはグアニジンといったカオトロピック剤の使用、またはｐＨのイオン強度を変更することにより実施できるだろう。復帰が容易なことから加熱での実施が好ましい。加熱により変性する場合には、サイクル毎に補充する必要がないことから熱安定型ＤＮＡポリメラーゼを使用することが通常である。産物である２本鎖ｃＤＮＡは、例えばアガロースゲルを用いたゲル電気泳動により、混合物より分離されるだろう。あるいは、２本鎖ｃＤＮＡを精製せずに使用し、以下記載の方法によりクローニングしてもよい。
増幅後、本発明記載の特異的−特異的プライマーおよび発明の第２プライマーを用いて得た２本鎖ｃＤＮＡは、少なくともＩＧＶＤおよび定常領域の一部を含む。
発明の別の実施態様では、２本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅工程によりｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ２重鎖より作られる。増幅に使用する鋳型は、第一鎖ｃＤＮＡ合成後に好適ユニバーサルプライマーを用い作成したｃＤＮＡ／ｍＲＮＡである。鋳型の増幅に用いるプライマーは種特異的プライマーおよび上記の第２プライマーである。ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ２重鎖は当業者に周知の方法または上記実施例に従い増幅してよい。増幅後、特異的−特異的プライマーと発明の第２プライマーを用い作成した２本鎖ｃＤＮＡは少なくともＩＧＶＤおよび定常領域の一部を含む。
発明者は驚くべきことにＩＧＶＤと定常領域との結合部分（より正確にはフレームワークＩＶ（４）領域の３′末端）（再配列ＩＧＶＤ内）に存在する特有の制限部位を利用すると、そうして作成されたライブラリーの多様性が従来のものに比べ遙かに高いことを見いだした。ヒトおよびラクダでは、好適制限部位がＢｓｔＥＩＩ−制限部位であることが判明している。従って、発明により作られる２本鎖ｃＤＮＡは適当な制限酵素、例えばヒトおよびラクダの場合にはＢｓｔＥＩＩ、および種特異的プライマーがコードする制限酵素により切断されるだろう。追加の工程として、得られた制限酵素断片を例えばアガロースゲル電気泳動により分離し、そして単離してもよい。２本鎖ｃＤＮＡを発現ベクター内に容易にクローニングでき、機能的ＩＧＶＤが発現できるような制限部位を選択することが好ましい。
２本鎖ＤＮＡの中に位置する別の制限部位を、この部分に対する制限酵素を用いて切断し、機能的ＩＧＶＤ断片をコードする２本鎖ＤＮＡの生成に利用することも発明の一部である。好ましい制限部位の例は上記の如くＢｓｔＥＩＩである。その他制限部位を発明に従い用いてもよい。部位は当業者により、周知の方法を用いスクリーニングされるだろう。例えば発明に従い作成した２本鎖ＤＮＡのレパートリーライブラリーを、結合アッセイおよび制限酵素のコレクションとを用い、好適制限酵素部位についてスクリーニングしてもよい。消化により生じた断片をクローニングし、結合について試験する。好ましく配置した制限部位が１またはそれ以上存在することは、切断産物が機能的ＩＧＶＤ断片を発現するにより実証される。制限部位はＩＧＶＤの３′末端方向、好ましくはＩＧＶＤと定常領域の結合部部分に配置する。上記制限部位での切断により生じたＩＧＶＤ２本鎖ＤＮＡの断片は、完全長ＩＧＶＤより少ないか、多いか、または正確に同数のヌクレオチド残基を包含するだろうが、いずれの場合も生じた断片は抗原と結合できる。
あるいはＩＧＶＤのレパートリークローニングに関する本発明の方法は、ｃＤＮＡを含むサンプルから開始して実施できる。上記ｃＤＮＡはリンパ細胞に由来するのが好ましい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する方法は当業者に周知である。第一（アンチセンス）鎖の逆転写は、好適なユニバーサルプライマーを利用して、いずれかの方法で実行できる。例えば、de Haard HJ等（(1999)、A Large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies J Biol Chem 274、18218〜18230）を参照。ｃＤＮＡは種特異的プライマーおよび前記のユニバーサルプライマーの様な第二プライマーを用い増幅されるだろう。産物は例えばゲル電気泳動により混合物から分離されるだろう。あるいは産物は精製することなく用い、適当なクローニングベクターに直接挿入してもよい。いずれの場合も、前記のようにＩＧＶＤと定常領域との間にある固有の制限を利用する。
別の方法では、種特異的プライマーの使用を省略できる。ユニバーサルプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した後、ＤＮＡ配列同士の連結に関する周知の各種方法を用いて、合成配列（アダプター配列とも呼ばれる）をＤＮＡ鎖の５′末端に取り付ける。ＲＴ ＣａｐＥｘｔｅｎｓｉｏｎは一例であり、参照により本明細書に組み込まれたとする国際特許出願ＷＯ０１／１７９４８１に記載されている。合成配列またはアダプター配列はクローニングに用いることができる制限部位を１またはそれ以上含んでいると有利である。この様にすると、ＢｓｔＥＩＩ（フレームワーク４内にある）およびｃＤＮＡに結合したアダプターによりコードされている制限酵素による切断により、例えばヒトまたはラクダの可変重鎖のレパートリーを単離できる。生じた制限断片は例えばアガロースゲル電気泳動により分離し、単離でき、続いて適当なベクターにクローニングできる。即ち代替方法は、（１）ｍＲＮＡを含むサンプルを提供すること、（２）ｃＤＮＡ合成を実施すること、（３）少なくとも１つの制限酵素を含むアダプター配列をＤＮＡの５′末端に取り付けること、（３ａ）場合によってアダプター配列およびユニバーサル配列をプライマーとして用いて配列を増幅すること、（４）得られたＤＮＡをＢｓｔＥＩＩおよび前記アダプターにコードされる制限酵素により切断すること、ならびに（５）得られたヒトまたはラクダＩＧＶＤ配列をベクター内にクローニングすることを含む、ヒトまたはラクダの免疫グロブリンＩＧＶＤ配列をクローニングする技術を提供する。
本明細書で言う「ベクター」とは、細胞内にあるポリヌクレオチド複製の自立的単位として振る舞う（即ちそれ自身の制御の下に複製できる）、または宿主細胞の染色体内への挿入により複製が可能となり、それに他のポリヌクレオチドセグメントを結合することで結合したセグメントを複製および／または発現する、例えばプラスミド染色体、ウイルスのような遺伝的要素を意味する。好適ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージおよびコスミッドが挙げられるが、これらに限定しない。「発現ベクター」は希望する宿主細胞内へのベクターの連結または挿入の実施、および結合したセグメントの発現の実施に必要なポリヌクレオチド配列を含むだろう。かかる配列は宿主生物によって異なる；その様な配列としては、転写をもたらすプロモーター配列、転写を促進するエンハンサー配列、リボソーム結合部位配列ならびに転写および翻訳終止配列を挙げられる。あるいは発現ベクターは、宿主細胞ＤＮＡ配列内にベクターを連結または組み込むことなく、その中にコードされている可変重鎖のレパートリーのような産物遺伝子産物を直接発現することもきる。
ある実施態様では、ｍＲＮＡを含むサンプルは、刺激を受けてｍＲＮＡの産生が促進されたリンパ細胞より得る。リンパ細胞、特にＢリンパ細胞は免疫グロブリンを合成でき、これら細胞は一般に免疫グロブリン鎖に翻訳できるｍＲＮＡを持っている。リンパ細胞は免疫した、または免疫していない動物から得ることができる。一般には、ｍＲＮＡ供給源は末梢血液細胞、骨髄細胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞（Ｂ−リンパ細胞または形質細胞のような）、少なくとも１種類の自己免疫疾患または癌にかかっている患者、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、リューマチ関節炎、抗リン脂質症候群または血管炎の様な自己免疫疾患に罹っている患者を包含する。
別の実施態様では、本発明の方法の一部を形成する第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダムプライミングまたはオリゴｄＴ−プライミングを介して実施できる。いずれのプライミング法も当業者に周知であり、詳しい説明は必要ない。
別の実施態様では、種特異的プライマーは少なくとも１種類の制限酵素についてのコードを持つ。即ちプライマーを含む配列により少なくとも１個の制限酵素部位をコードできるが、この場合上記制限酵素部位は各ＩＧＶＤ配列のアンチセンス鎖の３′末端とアニーリングする必要はない。
別の実施態様では、ＩＧＶＤはラクダ科の動物より得ることができる。上記の科の免疫グロブリンについては、軽鎖ポリペプチド鎖を欠くことがしられている。従ってラクダ由来のＩＧＶＤ配列はＨＣＶＤであり、ＶＨＨと表す。「ラクダ」には、旧世界ラクダ（Camelus bactrianusおよびCamelus dromadeius）および新世界ラクダ（例えばLama paccos、Lama glama、Llama guanacoeおよびLama vicugna）が含まれる。欧州特許ＥＰ０６５６９４６はラクダの免疫グロブリンの単離および使用を記載しており、参照により本明細書に取り込まれる。
別実施態様の本発明の方法では、ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列のレパートリーを含む発現ライブラリーを提供する。別実施態様の本発明の方法は、上記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列はＨＣＶＤポリヌクレオチド配列である。別の実施態様である本発明の方法では、前記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列はＬＣＶＤポリヌクレオチド配列である。別実施態様の本発明の方法では、前記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列はＨＣＶＤポリヌクレオチド配列およびＬＣＶＤポリヌクレオチド配列である。即ち本発明により得る産物である、ＩＧＶＤ配列をコードするｃＤＮＡは、発現ベクター内に直接クローニングできる。宿主は前核生物でも真核生物でもよいが、細菌が好ましい。種特異的プライマー内およびベクター内の制限酵素部位の選択、ならびにベクターのその他特徴より、完全なＩＧＶＤ配列の発現が可能となるだろう。
望まれれば、ＩＧＶＤの遺伝子に突然変異を誘導し、発現するＩＧＶＤの性質を改良し、例えばＩＧＶＤの発現収率または可溶性を高め、ＩＧＶＤの親和性を改良し、あるいは他の分子が共有結合もしくは非共有結合する第２部位を導入する。特に補体成分あるいは細胞表面上のレセプターの様なエフェクター機能を持つ分子との結合に関する第２部位を誘導することが望まれるだろう。即ち一般には軽鎖可変領域とＩＧＶＤとの相互作用域に存在する疎水性残基をより親水性の残基を突然変異させて可溶性を改良することができるだろう；ＣＤＲループ内の残基を突然変異させて抗原結合を向上できるだろう；その他ループまたはベータシート部分にある残基を突然変異させて新たな結合活性を誘導できるだろう。突然変異としては単独点突然変異、多点突然変異またはより大きな変化を挙げることができ、様々な組換え体ＤＮＡの方法、例えば遺伝子合成、部位指定突然変異導入、またはポリメラーゼ連鎖反応により導入できる。従って別の実施態様では、本発明の方法はＩＧＶＤｓをコードする配列を多様化するのに用いられるだろう。例えばこれは増幅ステップの間に突然変異誘発性ヌクレオチド３リン酸を用いて、標的領域全体に点突然変異を散在させることで達成できるだろう。あるいはこの様な点突然変異は、増幅サイクルを数多く実施することで導入されるが、これはＤＮＡポリメラーゼが持つ自然発生誤り率を原因とする間違いが、特に高濃度のヌクレオシド３リン酸を用いた時に増幅するからである。
組換え体ＤＮＡ技術によるＩｇ分子操作に関する基礎技術は、当業界で多く記載されている（例えば、Antibody Engineering、A practical approach、ed.J.McCafferty、H.R.Hoongenboom and D.J.Chiswellを参照せよ）。
本発明の実施態様の一つは、免疫グロブリン可変領域（ＩＧＶＤ）をコードするポリヌクレオチド配列をクローニングする方法である：
（ａ）ｍＲＮＡを含むサンプルを提供する工程、
（ｂ）ユニバーサルプライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施する工程、
（ｃ）アンチセンス鎖上の各ＩＧＶＤ配列の３′末端に、または近傍にある部位とハイブリダイゼーションできる第一プライマーを用いて第二鎖ＤＮＡ合成を実施し、２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ｄ）その部分に対する制限酵素での切断が機能的ＩＧＶＤ断片をコードする２本鎖ＤＮＡを生ずる様に配置された制限部位に特異的な酵素を用いて２本鎖ＤＮＡを切断する工程、および
（ｅ）生じた可変領域断片配列をベクター内にクローニングする工程。
本発明の別の実施態様は、工程（ｃ）で作製した２本鎖ＤＮＡを、前記第一プライマーおよび前記ユニバーサルプライマーを用いて引き続き増幅する上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、工程（ｃ）が前記第一プライマーと前記ユニバーサルプライマー、および工程（ｂ）の産物の鋳型としての使用を含む増幅工程である上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、ユニバーサルプライマーがオリゴ−ｄＴ配列を含む上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、ユニバーサルプライマーが一組のランダムプライマーの配列を含む上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、前記第一プライマーが酵素制限部位を少なくとも一つコードしている、上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、前記サンプルがリンパ細胞由来のｍＲＮＡを含む上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、工程（ｄ）の制限部位がＢｓｔＥＩＩである上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、前記ｍＲＮＡがヒトに由来する上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、前記ｍＲＮＡがラクダに由来する上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、前記ベクターが少なくともＩＧＶＤポリヌクレオチド配列部分を発現できる発現ベクターである、上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、上記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列である、上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、上記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列である、上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、上記ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が重鎖可変領域および軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列である、上記の方法である。
本発明の別の実施態様は、上記の方法により得ることができる、ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列のレパートリーを含む発現ライブラリーである。
本発明の別の実施態様は、上記の方法により得た、ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列のレパートリーを含む発現ライブラリーである。
本発明の別の実施態様は、上記の方法により得ることができるＩＧＶＤポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施態様は、上記の方法により得たＩＧＶＤポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施態様は、上記の発現ライブラリーまたは上記のＩＧＶＤポリヌクレオチドの使用に基づく診断アッセイである。
本発明の別の実施態様は、上記診断アッセイより得た診断報告である。
本発明の別の実施態様は、上記クローン化配列の一つを発現後に得たポリペプチドの、医薬品の製造のための使用である。
実施例
１．抗−ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）Ｙ殻タンパク質ＶＨＨのレパートリーライブラリーの構築
ａ．免疫化
ヘキサヒスチジンペプチドをカルボキシル末端に付けたポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）Ｙ殻タンパク質（ＰＶＹＣＰ−Ｈｉｓ8）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で組換え体的に発現した。第１日目にヒトコブラクダ「４８」にＰＶＹＣＰ−Ｈｉｓ6１mg含むフロイント完全アジュバントを注射した。第８、１５、２２，２９および３６日目に、ＰＶＹＣＰ−Ｈｉｓ6を１mg用量含むフロイント不完全アジュバントを注射した。最後のＰＶＹＣＰ−Ｈｉｓ6ブーストから１週間後に、免役したヒトコブラクダから血液５０mlを採取した。
ｂ．リンパ細胞、ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ調製
末梢血リンパ細胞（ＰＢＬ′ｓ）をＵＮＩ−ＳＥＰ ＭＡＸＩチューブ（Ｗａｋ Ｃｈｅｍｉｅ Ｍｅｄｉｃａ）を用いてメーカープロトコールに従い単離し、１０7細胞に小分けし、そして−８０℃に貯蔵した。ｍＲＮＡは１０7個のＰＢＬ′ｓより、Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ Ｍｉｃｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い単離した。このｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴをプライマーに用いたＲＴ−ＰＣＲに鋳型として用い、ｃＤＮＡの第一鎖を合成した（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
ｃ．ライブラリーの構築
以下の全てのＰＣＲ増幅ではＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、いずれの場合も３分間の初回変性期の最後の１分間にポリメラーゼを加えて「ホットスタート」を実施した。ＶＨＨレパートリーを増幅するために、３種類のＰＣＲ増幅を連続して実施した。Ｌ３ｂ（ＩｇＧリーダー配列にアニーリングする５′−ＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴ−３′（配列番号１））およびオリゴ−ｄＴ（ＩｇＧコード配列の下流に位置するポリＡ配列にアニーリングする）をプライマーに使用する最初のＰＣＲでは（ＰＣＲ１）、合成したヒトコブラクダのｃＤＮＡ２μlを鋳型に用いた。鋳型を３分間、９４℃で変性した後、９４℃の変性２０秒間、５２℃のプライマーアニーリング１分間および７２℃、３分間の伸長ステップのサイクルを３３回繰り返した。ＶＨＨｓは１．２％アガロースゲル電気泳動でＶＨｓから分離した。ＶＨＨｓに相当する断片（予想サイズ１．２〜１．３kb）をゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＤＮＡ濃度を決定した。ＰＣＲ１で得た精製鋳型５ピコグラムと、
ＳＭ１７
Figure 0004323317
および
ＳＭ１８
Figure 0004323317
の等モル混合物を上流プライマーに、そしてオリゴ−ｄＴを下流プライマーに用いるネステッドＰＣＲ（ＰＣＲ２）により５′末端にＮｃｏ１制限部位（プライマー配列内太字）を導入した。鋳型を３分間、９４℃で変性した後、９４℃で２０秒、４８℃で１分、７２℃で３分のサイクルを２５回行った。さらに７２℃、１０分間の伸長を追加して増幅を終了した。増幅した１．２〜１．３kbの２０個の断片をゲル精製（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、ＤＮＡ濃度を決定した。
５′末端にＳｆｉＩ制限部位（プライマー配列内太字）を導入するために、ＰＣＲ２精製物５μgを鋳型にして、Ａ４ｓｈｏｒｔ
Figure 0004323317
を上流プライマーとし、そしてオリゴ−ｄＴを用いる第３ＰＣＲ（ＰＣＲ３）を実施した。このＰＣＲの実験条件はＰＣＲ２の条件と同一であった。ＰＣＲ３で得た増幅断片はＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ３増幅産物約５ｐｇをＳｆｉＩおよびＢｓｅＥＩＩで二重消化した、なお、後者の制限部位はヒトコブラクダＶＨＨｓのフレームワーク４の中に存在している。制限断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、約３８０ｂｐのサイズの断片を切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。総容積５００μl当たり高濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２０単位／μl、Ｐｒｏｍｅｇａ）２μlを用いて、ＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ消化したＶＨＨレパートリー約３５０ngをファージミドｐＨＥＮ４（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７）約１２００ngの対応する制限部位に連結した。１４℃で一晩インキュベーションした後、連結反応物をフェノールで２回、続いてクロロホルムで１回精製した。０．１容積量の５ＭのＬｉＣｌおよび２．５倍容積量の冷１００％エタノールを加え、続いて−２０℃で３０分間インキュベーションしてＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡを沈殿させてから７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡ沈殿物を風乾してから水８０μlに溶解した。０．１cmのキュベットの中で、新鮮に調製したＴＧ１エレクトロ用コンピテント細胞と混合した精製した連結構築体５μl（それぞれベクター５０ng当量を含んでいる）を用い、Ｅ．ｃｏｌｉパルサー（Ｂｉｏｒａｄ）を使って２．５Ｍオーム、１，８kvで１２回形質転換を行った（Sambrook and Russell 2001 Molecular Cloning A laboratory manual third edition, Cold spring harbor Laboratory press Cols spring harbor, New York, Page 1, 120-1, 121）。我々はＳＯＣ培地１mlを各エレクトロポレーションに用いて形質転換ＴＧ１細胞を回収した。形質転換ＴＧ１細胞は、軽く振とうしながら１時間３７℃でインキュベーションした。ｐＨＥＮ４−内在ＴＧ１細胞はＬＢ−Ａｐ１００−２％グルコースプレートを使って選別した。１０9個の形質転換細胞のライブラリーを得た。フレームワーク１およびフレームワーク４に合わせたプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、我々は挿入体含有クローンのライブラリー中での存在を実証した。試験した９３個のコロニーの全てがフレームワーク１〜フレームワーク４増幅ＶＨＨに相当するサイズの断片を持つ挿入体を含有していた。
ｄ．ファージディスプレイおよびバイオパンニングによるＰＶＹＣＰ特異的結合体の単離
ｐＨＥＮ４へのＶＨＨレパートリーのクローニングにより、我々はファージＭ１３先端部にある線毛との融合タンパク質として単一ＶＨＨｓのライブラリーを発現できた。ライブラリーのレスキューおよびＰＶＹＣＰ−Ｈｉｓ6（１００μg／ml）でコーティングされたイムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）状の結合体の選別は、Ghahroudi等（(1997), FEBS Letters 414:521-526）の記載通りに行った。２回目のパンニング後に、我々はＰＶＹＣＰ−特異的結合体を単離できた。
２．単一の種特異的プライマーを用い得たライブラリー多様性と、２つの種特異的プライマーを用い得たライブラリー多様性の比較
ａ．免疫化
ラマ（Llama glama）をヒトの標的ＩｇＥ、癌胚抗原（ＣＥＡ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）で免疫した。免疫化のために、標的物は適当な動物用のアジュバント（Ｓｐｅｃｏｌｌ，ＣＥＤＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂ．Ｖ．）を使って乳液に調剤した。ダブルスポットで抗原カクテルを首の筋中に注入投与した。動物に各抗原を週１回の割合で１００から２５μg含む乳剤を、６回注射した。免疫化の様々な時点で、動物から血液サンプル１０mlを採取し、血清を調製した。抗原特異的体液性免疫反応の誘導は、免疫化抗原を標的としたＥＬＩＳＡ実験に血清サンプルを用いて確認した。最終免疫から５日後に血液サンプル１５０mlを採取した。このサンプルから一般的な重鎖抗体（ＨｃＡｂｓ）を分画して（Lauwereys M, et al(1998) Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibodies, EMBO J 17, 3512-3520.）、ＥＬＩＳＡに使用したところ、ＨｃＡｂｓが抗原特異的体液性免疫反応の原因であることが明らかになった。末梢血リンパ細胞（ＰＢＬｓ）を、ラマの重鎖免疫グロブリンの遺伝子供給源として、１５０mlの血液サンプルよりＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離し、５×１０８ＰＢＬｓを得た。最大の抗体多様性は、サンプル採取したＢリンパ細胞の数に等しいと予想されるが、それはＰＢＬｓ数の約１０％である（５×１０７）。ラマの重鎖抗体画分は最大Ｂリンパ細胞数の２０％である。従って、サンプル１５０mlの最大ＨｃＡｂｓ多様性は１０７分子種と計算される。全ＲＮＡ（約４００μg）をこれら細胞から、酸グアニジンチオシアネート抽出法（Chomczynski P and Sacchi N(1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162, 156-159）を用いて単離した。
ｂ．免疫ライブラリーの構築
ｉ）２つのＩｇＧ起源プライマーを使ったレパートリーの増幅
全ＲＮＡ１００μgより、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）とヘキサヌクレオチドランダムプライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を前述（de Haard H et al., Venier zone residue 4 of mouse subgroup II kappa light chains is a critical determinant for antigen recognition、Immunotechnology、(1999)、4(3〜4)、p203〜15）の様に用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿の組合せを用いて精製し、続いて鋳型として用いＶＨＨレパートリーを特異的に増幅した。レパートリーは２つのＩｇＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使って、ヒンジ依存的な方法で増幅した。単回ＰＣＲ反応では、縮重フレームワーク１（ＦＲ１）プライマーＡＢＬＯ１３
Figure 0004323317
に重鎖可変領域遺伝子セグメントの増幅に特異的であることが知られている短
Figure 0004323317
または長
Figure 0004323317
ヒンジプライマーを組合せた。
Ｐｓｔｌ（太字）およびＮｏｔ１（太字下線付き）制限部位をそれぞれＦＲ１およびヒンジプライマー内に導入し、クローニングできるようにした。続いてＤＮＡ断片をＰｓｔ１−Ｎｏｔ１消化したファージミドベクターｐＡＸ００４内に連結したが、このベクターはｐＨＥＮ１と同一である（Hoogenborm HR, et al. (1991). Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains, Nucleic Acids Res 19:4133-4137）が、それぞれ精製および検出用にカルボキシル末端の（Ｈｉｓ）6−およびｃ−ｍｙｃ−タグをコードしている。連結混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎフィルター（ＹＭ−５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って脱塩し、大腸菌ＴＧ１細胞内にエレクトロポレーションして１．８×１０７クローンを含有するライブラリーを得た。形質転換細胞をアンピシリン１００μg／mlおよびグルコースを２％含むＬＢの入った一枚の２０×２０cmのプレート内で一晩、３７℃で増殖した。２×ＴＹ培地を用いてコロニーをプレートから掻き取り、２０％グリセロール内、−８０℃に貯蔵した。
品質管理として、ライブラリー毎に２４クローンについて、ベクターをベースとしたプライマーの組合せを用いたＰＣＲにより挿入体含有コロニーの割合を検証した。この分析より、クローンの９５％がＶＨＨをコードした挿入体を含有することが判明した。これら２４クローンの増幅ＶＨＨ断片についてＨＩｎｆ１フィンガープリント分析を行い、多様性を調べたところ全てのクローンが実際には異なっていることが示された。
ｉｉ）オリゴ−ｄＴプライマーと１つのＩｇＧ起源プライマーを用いたレパートリーの増幅
ＰＣＲの鋳型として、全ＲＮＡ１００μgからオリゴ−ｄＴをライマーにしてｃＤＮＡを調製した（de Haard H et al., Venier zone residue 4 of mouse subgroup II kappa light chains is a critical determinant for antigen recognition、Immunotechnology、(1999)、4(3〜4)、p203〜15）。実施例１記載の３回の連続したＰＣＲ増幅を行う方法でＶＨＨを増幅した。オリゴ−ｄＴおよび免疫グロブリンシグナル配列にアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲ１からは、１６５０ｂｐおよび１３００ｂｐの２つの断片が増幅されたが、後者はＣＨ１欠損ＨｃＡｂ遺伝子に由来する産物であった（図２参照）。この断片をゲルから切り出し、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＮｃｏｌ−制限部位を導入したＦＲ１プライマーを使って再増幅した。再増幅した１３００ｂｐ断片をゲルから切り出し、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｆｉＩ−制限部位を導入するＡ４ｓｈｏｒｔプライマーを用いて３回目の増幅（ＰＣＲ３）に用いた。増幅したＶＨＨ内在断片約１０μgをＳｆｉｌ−ＢｓｔＥＩＩで二重消化した。アガロースゲル電気泳動より、我々はＰＣＲ３産物の９０％以上が内部にＢｓｔＥＩＩ制限部位を持つと見積もった（図３参照）
第二の方法では、ＳｆｉＩおよびＮｃｏ１制限部位を導入する一組のＦＲ１プライマー（表１）をオリゴ−ｄＴプライマーと直接組合せて用い、再増幅のステップを回避した。
Figure 0004323317
あるいは、１種類の縮重ＦＲ１プライマーＡＢＬ０１３をオリゴ−ｄＴプライマーと組合せて用いラマのＶＨＨレパートリーを増幅した。実施例１のＰＣＲ１に記載の様に１ステップＰＣＲ増幅を行い、ラマのＶＨＨレパートリーを回収した。ゲル精製したＰＣＲ産物をＳｆｉＩ（またはＡＢＬ０１３を用いた時はＰｓｔ１）およびＢｓｔＥＩＩで消化した。９０％を越える精製ＰＣＲ産物がＢｓｔＥＩＩで内部消化されたことから、ＢｓｔＥＩＩ−部位は重鎖由来ＶＨＨをコードするＤＮＡ−断片のＦＲ４内に多く生じている。
ＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ消化断片３００ngをファージミドベクターｐＡＸ００４内に連結した。連結反応物を、全反応容積３００μl中にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１０単位を用い、１６時間、室温でインキュベーションした。リガーゼ２単位を追加してさらに２時間、室温でインキュベーションした後、連結混合液を２回のフェノールおよびクロロホルムによる抽出とそれに続くエタノール沈殿を行い精製した。沈殿したＤＮＡをさらに７０％エタノールで洗浄して風乾し、ＨＰＬＣ等級の水５０μlに溶解した。精製連結混合液を５つに等量分割し、５個の０．２cmキュベットを用い、マイクロパルサー（Ｂｉｏｒａｄ）を使ってエレクトロ用コンピテント大腸菌ＴＧ１細胞２００μlの中に１．８kvで別々にエレクトロポレーションした。各キュベット内の形質転換細胞は２×ＴＹ１mlを使って回収した。ｐＡＸ００４含有ＴＧ１細胞を、アンピシリン１００μg／mlおよびグルコース２％を含むＬＢ培地の入った１枚の２０×２０cmのプレートで選別し、１．４×１０７クローンのライブラリーを得た。ｉ）と同タイプの品質管理を行ったところ、クローンの１００％が適当なサイズの挿入体を含有していることが示され、多様なレパートリーの存在が確認された。
ｃ．抗原特異的ファージの力価測定
ｂ．ｉおよびｂ．ｉｉで記載の両ライブラリーについて、ファージを調製した。ポリクローナルファージレパートリーをレスキューするために、ライブラリーを３７℃、アンピシリン１００μg／mlおよびグルコース２％を含む２×ＴＹで対数期（ＯＤ６００＝０．５）まで増殖し、続いてＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを３０分間、３７℃で重複感染した。感染細胞を５分間、４０００rpmで沈殿してからアンピシリン１００μg／mlおよびカナマイシン２５μg／mlを含む２×ＴＹに再浮遊した。一晩３７℃、２５０rpmでインキュベーションしてビリオンを調製した。一晩培養したものを１５分間、４５００rpmの遠心分離にかけ、３０分間氷上でインキュベーションしてファージを１／５の容量の［２０％ポリエチレングリコール、１．５ＭのＮａＣｌ］溶液で沈降させた。ファージを１５分間、４５００rpm、４℃で遠心分離にかけて沈殿した。ＰＢＳ中にファージを再懸濁した後、最大速度で１分間遠心分離して細胞破壊物を微量遠心チューブ内で沈殿させた。ファージを含有する上清を新しいチューブに移し、再度同様にファージを沈殿した。濃縮したファージをＰＢＳに溶解し、上記同様にして残存細胞破壊物から分離した。ファージの力価は、対数増殖期のＴＧ１細胞に感染させてから選択培地にプレーティングして決定した。両ライブラリーから単離した抗原特異的ＶＨＨ断片の力価は、ファージＥＬＩＳＡを用い比較した。ファージを抗原コーティングした（１μg／ml）Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートに、２×１０10ファージ／mlから２倍希釈系列で加えた。結合したファージは、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗−Ｍ１３とインキュベーションし、続いて発色させて検出した。試験した全ての抗原について、ファージを単一のＩｇＧ特異プライマーを用い増幅したレパートリーを発現するライブラリーからレスキューした時に、抗原特異的ファージ力価は有意に高かった（図１）。
ｄ．標的抗原による免疫ライブラリーの選択およびスクリーニング
ｂ．ｉｉ記載のライブラリー（単一の種特異的プライマーおよびオリゴ−ｄＴプライマーにより増幅したＶＨＨレパートリー）より、ファージをｃ記載の様にレスキューした。抗原特異的結合体を、ファージディスプレイの原理および５μg／mlの濃度のＴＮＦα、ｖＷＦ、ＣＥＡまたはＩＬ−６をコーティングした固相上での単回バイオパンニングを利用して選択した（Marks JD, et al(1991) By-psssing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J. mol.Biol.222, 581-597., 1991およびHawkins RE, et al(1992) Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226, 889-896）。レスキューしたファージをそれぞれの固定化抗原と２時間インキュベーションした後、非特異的ファージを洗い流すと同時に特異的ファージは２０分間かけてｐＨショックで溶出し（０．１Ｍグリセリン、ｐＨ２．５）、続いて１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．５で中和した。対数増殖期の大腸菌細胞に溶出ファージを感染させ、選択培地上にプレーティングした。各抗原について、４８クローンを拾い上げ、詳しく特性解析した。
これら４８個のクローンの培養上清を、それらクローンを対数増殖期になるまでアンピシリン１００μg／mlおよび０．１％グルコースを含む２×ＴＹ中に増殖して調製した。続いて１mMのＩＰＴＧを加えて一晩３７℃、２５０rpmでインキュベーションし、ＶＨＨ−遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の発現を誘導した。ＶＨＨ発現クローンの特異性を、生の培養上清を用いて、抗原コーティング（１μg／ml）したマイクロウエルと、コーティングしていないマイクロウエル（バックグランド）のＥＬＩＳＡで検証した。２０分の発色後のシグナルがバックグランドの２倍の例を陽性例とし、さらに詳しい特性分析を行った。
ｅ．レパートリークローニング法の多様性の評価
ｂ．ｉに記載のライブラリー（２つの免疫グロブリン特異的プライマーを用い増幅したレパートリー）より、ファージをｃ記載の様にしてレスキューした。ＩｇＥおよびＣＥＡに対する抗原特異的結合体を、ｄ記載と同一条件で単回パンニングを行い、固相コーティング免疫チューブ（５μg／ml）上で選択した。４８個のクローンの上清を上記ＥＬＩＳＡでスクリーニングして、同定済みの全種類のＨｉｎｆＩプロフィールに対応する代表的なクローンの配列を決定したところ、１つのＩｇＧ特異的プライマーを用い作製されたライブラリーより単離された１４例の抗ＩｇＥ−結合体の内１２例と、８例の抗−ＣＥＡ結合体の内６例が、２つのＩｇＧ特異的プライマーを用い作製したライブラリーでは同定できなかった。
３．ヒト免疫グロブリンレパートリー増幅
ａ．ヒト免疫グロブリンレパートリーの増幅
２名のヒト供血者の血液はベルギー赤十字の血液銀行より得た。ＰＢＬｓを単離し、全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡ１００μgを用いてオリゴ−ｄＴプライマーによるｃＤＮＡ合成を行い（de Haard H et al., Venier zone residue 4 of mouse subgroup II kappa light chains is a critical determinant for antigen recognition、Immunotechnology、(1999)、4(3〜4)、p203〜15）、続いてこれを鋳型として免疫グロブリン重鎖および軽鎖の増幅を行った。
ヒトＶＨレパートリーはオリゴ−ｄＴを、ヒトＶＨ遺伝子の異なるファミリーのＦＲ１とアニーリングする５種類のオリゴヌクレオチド（セット）（表２）を組合せて用い増幅した。
Figure 0004323317
ＰＣＲ１についての記載（実施例１参照）と同一条件を適用した時、各プライマーの組合せについて、ＩｇＧ分子の予想サイズに対応する約１．６kbの断片が増幅された。同じ増幅反応では更にＩｇＭ増幅産物の計算サイズに対応する約２．１kbの断片も合成された。１．６kbおよび２．１kb断片がそれぞれＩｇＧおよびＩｇＭに相当するか検証するために、ゲル精製した断片各１ngを、ネステッドＰＣＲを使って再増幅した。増幅反応条件はＰＣＲ２（実施例１）に同じでで、適当な（セットの）ＦＲＰ１プライマーおよびＣＨ１領域にアニールするＩｇＧ−（５′−ＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴ−３′）またはＩｇＭ特異的プライマー（５′−ＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴ−３′）を用いた。実際には、１．６kbのゲル精製断片を鋳型に用いた時、適当なＦＲ１とＩｇＧ−特異的ＣＨ１プライマーとの組合せでは予想サイズ０．６５kbの断片のみが増幅されたが、ＩｇＭ−特異的ＣＨ１プライマーとの組合せでは増幅しなかった。これとは逆に２．１kbのゲル精製断片を鋳型にした時は、適当なＦＲ１とＩｇＭ−特異的ＣＨ１プライマーとの組合せを用いた時に、予想サイズ０．６７kbの断片が単独増幅された。予想通り、ＦＲ１とＩｇＧ−特異的ＣＨ１プライマーの組合せはＰＣＲ産物を産生しなかった。ゲル精製した１．６kb（または２．１kb）断片をＢｓｔＥＩＩとインキュベーションしアガロースゲル電気泳動にかけたところ、０．３８（０．３８）および１．２２（１．７２）kbの余分な断片２本が生じた。６例のヒトＪ−遺伝子中５例に特有のＢｓｔＥＩＩ制限部位が存在することから、この１．６および２．１kbの断片はそれぞれＩｇＧおよびＩｇＭに相当することが示唆された。未消化断片の量より、我々は９０％を越えるＩｇＧまたはＩｇＭ増幅産物が内部ＢｓｔＥＩＩ制限部位を持つと予測し、このことがそれをＶＨレパートリークローニングの好適候補にしている。ＶＨレパートリーはオリゴ−ｄＴと、ＶＨレパートリークローニングに使用可能なＳｆｉＩのような特有の制限部位を導入するＦＲ１プライマーのセットとの組合せにより増幅できる。
オリゴ−ｄＴでプライムしたｃＤＮＡを用い、ＰＣＲ１に記載の条件（実施例１参照）を適用して行ったＰＣＲより、ヒトＶＬレパートリーが増幅する可能性が示された。レパートリーの多様性率を最大化するために、それぞれ６および４種類のプライマーセット（表３）をオリゴ−ｄＴと組合せて用い、ＶλおよびＶκレパートリーを増幅した。全てのプライマーの組合せで予想された約０．８２kbのサイズの断片が増幅した。
Figure 0004323317
Figure 0004323317
実施例２による、１つの種特異的プライマーを使用した場合と２つの種特異的プライマーを使用し調製したファージの力価の比較。 実施例２による、１つの種特異的プライマーを使用した場合と２つの種特異的プライマーを使用し調製したファージの力価の比較。 実施例２によるＶＨＨのｃＤＮＡレパートリーより得た２つの断片（１６５０および１３００）の増幅を示すアガロースゲル電気泳動。 ＢｓｔＥＩＩで制限消化した結果を示すアガロースゲル電気泳動。実施例２による９０％を越える増幅断片が内部ＥｓｔＥＩＩ部位を含んでいた。
符号の説明
図１：−▲−２種類のＩｇＧ由来プライマー；・・・▲・・・実験ブランク、２プライマー法；−■−１つのＩｇＧプライマーとオリゴ−ｄＴの組合せ；・・・■・・・実験ブランク、１プライマー法。

Claims (13)

  1. 免疫グロブリン可変領域（ＩＧＶＤ）をコードするポリヌクレオチド配列をクローニングする方法であって、前記方法が、
    （ａ）ｍＲＮＡを含むサンプルを提供する工程、
    （ｂ）ユニバーサルプライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施する工程、
    （ｃ）アンチセンス鎖上の各ＩＧＶＤ配列の３′末端に、またはその近傍にある部位とハイブリダイゼーションできる種特異的プライマーを用い第二鎖ＤＮＡ合成を実施し、２本鎖ＤＮＡを産生する工程、
    （ｄ）もともと存在する制限部位に向けられた制限酵素での切断が機能的ＩＧＶＤ断片をコードする２本鎖ＤＮＡを産生する様に配置された制限部位に特異的な制限酵素、及び上記種特異的プライマーがコードする制限部位に特異的な制限酵素で２本鎖ＤＮＡを切断する工程、および
    （ｅ）得られた可変領域断片配列をベクター内にクローニングする工程、
    を含む方法。
  2. 工程（ｃ）で産生した２本鎖ＤＮＡを、種特異的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて引き続き増幅する、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ｃ）が種特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーの使用、ならびに工程（ｂ）の産物を鋳型として使用することを含む増幅工程である、請求項１に記載の方法。
  4. ユニバーサルプライマーがオリゴ−ｄＴの配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ユニバーサルプライマーが一組のランダムプライマーの配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. サンプルがリンパ細胞由来のｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 工程（ｄ）の制限部位がＢｓｔＥＩＩである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ｍＲＮＡがヒト由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ｍＲＮＡがラクダ由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ベクターがＩＧＶＤポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を発現できる発現ベクターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ＩＧＶＤポリヌクレオチド配列が重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列および軽鎖可変領域ポリヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
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