TWI826376B

TWI826376B - 與ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３及聚集蛋白聚醣結合的多肽

Info

Publication number: TWI826376B
Application number: TW107119217A
Authority: TW
Inventors: 索倫史蒂芬森; 傑拉德貝斯特; 漢斯古林; 拉斯托萊基斯; 克里斯多福萊德爾; 斯芬林德曼; 羅藍凱歐納; 羅夫剛瑟
Original assignee: 德商麥克專利有限公司; 比利時商艾柏靈斯公司
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2023-12-21
Also published as: AU2018277102A1; CN110997717A; RU2019143684A; EP3630817A1; US11813307B2; CA3064318A1; KR20200015912A; RU2019143684A3; JP2020523986A; WO2018220236A1; BR112019025147A2; MX2019014397A; TW201920291A; IL270951A; US20210008160A1; JP7249961B2

Abstract

本發明是關於結合聚集蛋白聚醣以及ADAMTS5和/或MMP13的多肽，更特別地，是關於包括或基本上由結合聚集蛋白聚醣的免疫球蛋白以及結合ADAMTS5的免疫球蛋白和/或結合MMP13的免疫球蛋白所組成的多肽(在本文亦分別稱為「本發明的多肽」以及「本發明的免疫球蛋白」)。本發明亦是關於構築體，其包括此等免疫球蛋白(例如免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)或多肽)以及編碼此等免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文亦稱為「本發明的核酸」)；關於製備此等免疫球蛋白、多肽與構築體的方法；關於表現或可表現此等免疫球蛋白或多肽的宿主細胞；關於組成物，以及更特別地關於醫藥組成物，其包括此等免疫球蛋白、多肽、構築體、核酸和/或宿主細胞；以及關於免疫球蛋白、多肽、構築體、核酸、宿主細胞和/或組成物的用途，特別是用於預防和/或治療目的，例如本文所提及之預防和/或治療目的。從本文的進一步描述，本發明的其他態樣、具體實施例、優點和應用將變得清楚。

Description

與ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ１３及聚集蛋白聚醣結合的多肽

本發明是關於與聚集蛋白聚醣以及ADAMTS5及/或MMP13結合的多肽，更特別的是關於包括以下或主要由以下所組成的多肽：結合聚集蛋白聚醣(Aggrecan)的免疫球蛋白以及結合ADAMTS5的免疫球蛋白及/或MMP13的免疫球蛋白(在本文亦分別稱為「本發明的多肽」以及「本發明的免疫球蛋白」)。本發明亦關於包括此等免疫球蛋白(例如免疫球蛋白單可變結構域(immunoglobulin single variable domain，ISVD)或多肽)以及編碼此等免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文亦稱為「本發明的核酸」)的構築體(construct)；關於製備此等免疫球蛋白、多肽與構築體的方法；關於表現或可表現此等免疫球蛋白或多肽的宿主細胞；關於組成物以及特別是關於醫藥組成物，其包括此等免疫球蛋白、多肽、構築體、核酸與/或宿主細胞；以及關於免疫球蛋白、多肽、構築體、核酸、宿主細胞、與/或組成物的用途，特別是用於預防和/或治療目的，例如本文所提及之預防和/或治療目的。根據本文的進一步描述，本發明的其他態樣、具體實施例、優點與應用將變得清楚。

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是全世界最常見的殘疾原因之一。它影響了3000萬美國人，是最常見的關節疾病。預計到2025年，將影響超過20%的美國人口。這種疾病是非系統性的，通常僅限於一些關節。然而，該疾病可發生在所有關節中，最常見的是膝蓋、臀部、手和脊柱。OA的特徵在於關節軟骨(覆蓋骨骼的軟骨)的進行性侵蝕，導致慢性疼痛和殘疾。最終，該疾病導致關節軟骨的完全破壞、下面的骨硬化、骨贅形成等，都導致喪失運動以及疼痛。骨關節炎可以定義為多種病症，其特徵在於關節症狀的組合，源自關節軟骨缺陷的跡象和鄰近組織(包括骨、肌腱和肌肉)的變化。OA最明顯的症狀是疼痛，這通常是病患尋求醫療幫助的原因。OA沒有治癒方法，亦即目前的治療方法不能抑制OA關節的結構惡化。疾病管理局限於最好姑息治療，對解決疾病進展的根本原因幾乎沒有作用。

熱烈地追求疾病修飾抗骨關節炎藥物(Disease modifying anti-osteoarthritic drugs，DMOAD)(其定義為抑制結構性疾病進展並且亦理想地改善症狀和/或功能的藥物)。DMOAD很可能在人口老齡化的慢性疾病中長期處方，因此要求對於具有多種合併症和藥物- 藥物相互作用潛力的目標人群具有極好的安全性數據。

雖然疾病起始可能是多因素的，但軟骨破壞似乎是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)不受控制的蛋白水解破壞的結果。關節軟骨中最豐富的ECM成分是膠原蛋白(最重要的膠原蛋白II)和蛋白多醣，主要是聚集蛋白聚醣(Kiani et al. 2002 Cell Research 12：19-32)。

聚集蛋白聚醣在關節軟骨的正常功能中是重要的，因為它提供了水合凝膠結構，賦予軟骨承重性質。聚集蛋白聚醣是由軟骨細胞表現的大型多模塊分子(2317個胺基酸)。其核心蛋白質由三個球狀結構域(G1、G2和G3)以及G2和G3之間的大延伸區域組成，用於糖胺聚醣鏈附著。此延伸區域包含兩個結構域(domain)，一個被硫酸角質素鏈(keratan sulfate chain)(KS結構域)取代，另一個被硫酸軟骨素鏈(chondroitin sulfate chain)(CS結構域)取代。CS結構域具有與其連接的100-150個糖胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)鏈。聚集蛋白聚醣與玻尿酸(Hyaluronan)形成大複合物，其中50-100個聚集蛋白聚醣分子經由G1結構域和鏈接蛋白(Link Protein)與一個玻尿酸分子相互作用。在攝取水時(由於GAG含量)，這些複合物形成可逆變形的凝膠，其抵抗壓縮。關節軟骨的結構、液體保留和功能與聚集蛋白聚醣的基質含量以及與完整核心蛋白質結合的硫酸軟骨素的量相關。在結構上，OA的特徵在於聚集蛋白聚醣的降解，逐漸釋放結構域G3和G2(導致軟骨的「緊縮(deflation)」並且最終釋放G1結構域和降解膠原蛋白，不可逆地破壞軟骨結構。OA發病機制中最顯著的聚集蛋白聚醣切割位置位於序列TEGE³⁷³ ↓³⁷⁴ ARGS。此切割位置位於聚集蛋白聚醣的球間結構域(interglobular domain，IGD)中，位於G1和G2結構域之間。

識別³⁷⁴ ARGS新表位(neo-epitope)的抗體導致聚集蛋白聚醣酶-1(aggrecanase-1)(其被證實為ADAMTS4)與聚集蛋白聚醣酶-2(aggrecanase-2)(其被證實為ADAMTS5)的發現。接著，其他相關的ADAMTS酶，包含ADAMTS1、-8、-9、-15和-20，顯示出具有聚集蛋白聚醣酶活性。ADAMTS16和18也是弱聚集蛋白聚醣酶。各種證據表明ADAMTS5是參與骨關節炎發病機理的主要酶。在人類軟骨外植體(explant)和軟骨細胞中，ADAMTS5的減弱(knockdown)減少了聚集蛋白聚醣的分解，表示此酶可能參與人體組織。細胞因子(cytokine)例如白細胞介素-1 (interleukin-1)和製瘤素-M(oncostatin-M)增強了酶的表現，這引起組織中的聚集蛋白聚醣分解。在OA病患的滑液和血清中檢測到ADAMTS5產生的聚集蛋白聚醣片段(Germaschewskiet al ., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22：690-697)。一些製藥公司一直在開發DMOAD。據稱這些化合物中的一些對ADAMTS5具有特異性，而其他化合物也對其他ADAMTS成員或甚至對基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)具有作用。這些對MMP的交叉抑制特別被認為是肌肉骨骼綜合症(musculoskeletal syndrome，MSS)的原因，這是由廣譜抑制劑(broad-spectrum inhibitor)引起的副作用，且涉及關節痛、肌痛、關節僵硬和肌腱炎(Santamariaet al. , 2015 Biochem J 471：391-401)。這些副作用是阻礙進一步發展的原因。Pfizer聚集蛋白聚醣酶抑制劑AGG-523用於OA的I期臨床試驗，但尚未進一步研究。其他小分子ADAMTS抑制劑也沒有進入任何進一步的臨床開發作為潛在的DMOAD (Bondesonet al., 2015 Drug Discovery 10：5-14)。Galapagos/Servier ADAMTS5抑制劑GLPG1972最近完成了I期試驗，但其療效尚未確定。事實上，儘管最近有一些專門研究DMOAD的臨床試驗，但到目前為止尚未有批准這種治療方法(El Bakaliet al., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review)6：1399)。針對ADAMTS5間隔結構域的Rottapharm單選殖株抗體(mAb)CRB0017的研究顯示在小鼠中，此mAb的關節內投予以劑量依賴性方式顯著預防疾病進展(Chiusaroliet al. , 2013 Osteoarthritis Cartilage 21：1807)。然而，沒有與全身投予進行比較，也沒有評估mAb從滑膜空間洩漏的程度。另一項研究使用mAb 12F4在小鼠中的全身投予，其證明了結構性疾病修飾和疼痛相關行為的緩解(Milleret al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35)。然而，在食蟹猴(cynomolgus monkey)中單次投予mAb 12F4引起局灶性出血，劑量依賴性增加平均動脈壓和心電導異常(更具體地，ECG上的ST升高和室性心律失常)這表示心肌缺血，持續至投予單劑量後8個月(Larkinet al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483)。同樣在這種情況下，副作用停止了mAb 12F4的進一步臨床開發。

除了ADAMTS酶之外，還有令人信服的證據表明基質金屬蛋白酶(MMPs)在與OA相關的組織破壞中具有主要作用。MMP是鋅依賴性內肽酶家族(a family of zinc-dependent endopeptidases)，參與細胞外基質的降解和組織重塑。有大約28個MMP家族成員，可分為各種亞組，包含膠原蛋白酶、明膠酶、溶基質素(stromelysin)、膜型MMP，基質溶素(matrilysin)、釉質溶解素(enamelysin)等。包括MMP1、MMP8、MMP13和MMP18的膠原蛋白酶能夠將三螺旋纖維狀膠原蛋白降解為獨特的3/4和1/4片段。此外，還顯示MMP14切割纖維狀膠原蛋白，並且有證據表明MMP2也能夠膠原蛋白水解(collagenolysis)。長期以來，MMP被認為是治療OA的有吸引力的治療標的。然而，如上所述，由於疼痛、關節僵硬副作用即MSS，開發用於治療關節炎的廣譜MMP抑制劑在臨床試驗中失敗。

難以將藥物靶向關節軟骨，進一步阻礙了關節中的治療干預(therapeutic intervention)。由於關節軟骨是無血管和淋巴組織，傳統的藥物遞送途徑(口服、靜脈內、肌內)最終依賴於藉由被動擴散將藥物從滑膜微血管(synovial capillary)轉移到軟骨。這促進了關節內(intra-articular，IA)藥物遞送的發展。雖然IA遞送避免了被動擴散的問題，但是治療性蛋白質的IA遞送受到它們從關節空間的快速清除以及最主要的軟骨內保留缺乏的限制。值得注意的是，藥物在關節中的滑膜停留時間通常小於24小時(Edwards 2011 Vet J 190：15-21；Larsen et al.,2008 J Pham Sci 97：4622-4654)。由於大多數IA注射藥物的快速清除，需要頻繁注射以維持有效濃度(Owen et al.,1994 Br J Clin Pharmacol 38：349-355)。然而，頻繁的IA注射是不被期待的，因為它們可能引起患者依從性的疼痛和不適，以及引起關節感染的風險。

仍然需要有效的DMOAD。

本發明的目的是提供抗OA的多肽和構築體，與現有技術的胺基酸序列和抗體相比，其具有改善的預防、治療和/或藥理學性質除了其它有利的性質(例如，改善的易於製備、良好的穩定性和/或降低的產品成本)之外。特別地，本發明的目的是提供抑制ADAMTS5和/或MMP13的多肽，同時在關節中保留較長時間。

理解骨關節炎不會均勻發展，並且病變進展的速度可能非常不穩定(在極端情況下，骨關節炎可能會保持穩定數十年，而在其他病患中，OA進展非常迅速，在幾個月的時間內完全破壞軟骨)，然而，本案發明人假設(不受理論束縛)這種可變疾病進展模式可能是由於各種蛋白酶的不均勻活性模式所造成。

在藉由創造性和非常規篩選、定性和組合策略鑑定來自不同家族和軟骨錨定部分(cartilage anchoring moiety)的有效蛋白酶抑制劑後，本案發明人開發了其中連接各種功能的組合。設計兩種雙特異性多肽，其包括結合聚集蛋白聚醣的軟骨錨定部分(cartilage anchoring moiety binding Aggrecan，CAP)和ADAMTS5抑制劑或MMP13抑制劑，以及包括ADAMTS5抑制劑，MMP13抑制劑和CAP結合劑(binder)的三特異性多肽。

已經證實即使沒有基準分子(benchmark molecule)(Wyeth和Pfizer)時，本發明的多肽在代表不同OA狀態的各種模型系統中仍然有效。

本案發明人能夠鑑定和重新設計即使與兩個其他部分組合時仍保持有效的CAP結合劑。還證明了本發明之多肽的CAP部分導致在關節中的保留增加。

亦證明了本發明的多肽在關節中保持穩定。

因此，本發明的多肽一態樣可廣泛用於OA病患，另一態樣可緩解(IA)給藥方案的負擔。另外，藉由在一個分子中組合各種部分，可以增加有效劑量。

據此，本發明是關於一種多肽，其選自由以下所組成的群組：(a)多肽，其包括至少2種免疫球蛋白單可變結構域(immunoglobulin single variable domain，ISVD)，其中第一ISVD特異性結合基質金屬蛋白酶(MMP)，及第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第三ISVD；(b)多肽，其包括至少2種ISVD，其中第一ISVD特異性結合具血小板反應蛋白模體(Thrombospondin motif)之A去整合素(A Disintegrin)和金屬蛋白酶(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motif，ADAMTS)，且第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第三ISVD；以及(c) 多肽，其包括至少3種ISVD，其中第一ISVD特異性結合MMP，第二ISVD特異性結合ADAMTS，以及第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第四ISVD。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中第一個ISVD特異性結合MMP，第二ISVD特異性結合ADAMTS，第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，以及第四ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，該MMP較佳為MMP13。

在一態樣，本發明提供本文所述之ISVD，其中該ISVD具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1、CDR2和CDR3如本文所定義，FR1、FR2、FR3和FR4是框架序列(framework sequences)。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中特異性結合MMP13的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成，其中(i) (a) CDR1是SEQ ID NO：8；(b)與SEQ ID NO：8具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；(ii) (c) CDR2是SEQ ID NO：10；以及(d) 與SEQ ID NO：10具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；(iii) (e) CDR3是SEQ ID NO：12；以及(f) 與SEQ ID NO：12具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；較佳為其中CDR1是SEQ ID NO：8，CDR2是SEQ ID NO：10以及CDR3是SEQ ID NO：12；甚至更佳為其中特異性結合MMP13的該ISVD是以SEQ ID NO：2表示。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該ADAMTS是ADAMTS5，較佳地其中該特異性結合ADAMTS5的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成，其中(i)(a) CDR1是SEQ ID NO：14 [GRTVSSYAMG]；以及(b) 與SEQ ID NO：14具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；(ii)(c) CDR2是SEQ ID NO：16 [GISRSAERTY]；以及(d) 與SEQ ID NO：16具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(iii)(e) CDR3是SEQ ID NO：18 [DLDPNRIFSREEYAY]；以及(f) 與SEQ ID NO：18具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；甚至更佳地，其中CDR1是SEQ ID NO：14，CDR2是SEQ ID NO：16以及CDR3 is SEQ ID NO：18；以及甚至更佳地，其中特異性結合ADAMTS5的該ISVD是以SEQ ID NO：3表示。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成，其中(i)(a)CDR1是SEQ ID NO：19；以及(b)與SEQ ID NO：19具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；(ii)(c)CDR2是SEQ ID NO：21；以及(d)與SEQ ID NO：21具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；以及(iii)(e) CDR3是SEQ ID NO：23；以及(f)與SEQ ID NO：23具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；更佳地，其中CDR1是SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21以及CDR3是SEQ ID NO：23；甚至更佳地，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD是以SEQ ID NO：4表示。

在本發明之所有態樣的較佳具體實施例中，根據本發明的免疫球蛋白單可變結構域(immunoglobulin single variable domains，ISVD)較佳係由以下所組成或基本上由以下所組成：如上文和下文所概述的4個框架區域(分別為FR1至FR4)和3個互補決定區域CDR1、CDR2和CDR3。較佳的框架序列揭露於例如下表A-2中，並可用於本發明的ISVD中。較佳地，表A-2中描述的CDR是與相同ISVD構築體的個別框架區域相符。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該ISVD經由連接子(linker)而彼此連接，該連接子較佳係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：24至40，較佳為SEQ ID NO：28 [9GS]或SEQ ID NO：35 [35GS]。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中該第一ISVD特異性結合MMP13，該第二ISVD特異性結合ADAMTS5，該第三ISVD 特異性結合聚集蛋白聚醣以及該第四ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，較佳是由SEQ ID NO：1或62表示。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中該第一ISVD特異性結合MMP13，該第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣以及該第三ISVD 特異性結合聚集蛋白聚醣，較佳是由SEQ ID NO：5或63表示。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中該第一ISVD特異性結合ADAMTS5，該第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，以及該第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，較佳是由SEQ ID NO：6或64表示。

在一態樣，本發明是關於一種構築體，其包括本文所述之多肽或基本上由本文所述之多肽組成，其另包括一或多個其他基團、殘基、部分(moiety)或結合單元(binding unit)，其係任選地經由一或多個胜肽連接子(peptidic linker)而連接。

在一態樣，本發明是關於一種核酸，其編碼如本文所述之多肽，或是如本文所述之構築體。

在一態樣，本發明是關於一種表現載體，其包括如本文所述之核酸。

在一態樣，本發明是關於一種宿主或宿主細胞，其包括如本文所述之核酸，或如本文所述之表現載體。

在一態樣，本發明是關於一種組成物，其包括如本文所述之多肽、如本文所述之構築體或是如本文所述之核酸。

在一態樣，本發明是關於一種用於產生本文所述之多肽的方法，該方法至少包括以下步驟：a)在合適的宿主細胞、宿主生物或合適的表現系統中，表現如本文所述之核酸；任選地隨後b)分離與/或純化如本文所述之多肽。

在一態樣，本發明是關於一種如本文所述之組成物，其是醫藥組成物，該組成物較佳為另包括至少一種醫藥可接受的載體、稀釋劑或賦形劑與/或佐劑，並且任選地包括一或多種其他醫藥活性多肽與/或化合物。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之組成物、如本文所述之多肽、或如本文所述之構築體，用於使用作為藥物。

在一態樣，本發明是關於一種如本文所述之組成物、如本文所述之多肽、或如本文所述之構築體，用以使用於預防以下疾病症狀或治療以下疾病：關節病和軟骨營養不良症(chondrodystrophies)、關節炎疾病(如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離)、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病(aggrecanopathies)、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤。

在一態樣，本發明是關於一種預防個體中的疾病或病症之症狀或治療疾病或病症的方法，該方法包括投予有效治療或預防以下疾病的症狀：關節病和軟骨營養不良症(chondrodystrophies)、關節炎疾病(如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離)、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病(aggrecanopathies)、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤的量的如本文所述之多肽、如本文所述之構築體、或如本文所述之組成物至該個體。

其他態樣，從本文的進一步揭露，多肽與組成物的應用與使用將變得更為清楚。在本說明書的全文中引用了一些文件。本文引用的每篇文件(包含所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)，無論上文或下文，均藉併入本文作為參考。本文中的任何內容均不被解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而先於這些公開內容。

仍然需要安全有效的OA藥物，特別是DMOAD。這些藥物應符合各種且經常相反的要求，特別是當涉及廣泛適用的形式時。這種形式應較佳地用於廣泛的病患。該形式應較佳為安全的並且不會由於頻繁投予而引起感染。此外，該形式應該較佳為病患友善的，例如允許方便的給藥方案和投予途徑，例如，系統性投予。例如，較佳為給藥時不立即從循環除去該形式。然而，延長半衰期應較佳為不引入脫靶活性(off-target activity)和副作用或限制功效。

本發明實現這些需求中的至少一個。

基於非常規篩選、定性和組合策略，本案發明人驚奇地觀察到免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)在體外、離體(ex vivo)和體內實驗中表現異常良好。

再者，本案發明人可重新設計ISVD，進一步優於比較藥物而改善OA。此外，亦證明本發明的ISVD比先前技藝化合物明顯更安全。

此外，本案發明人證明結合各種功能，包含MMP13抑制劑、ADAMTS5抑制劑和聚集蛋白聚醣結合劑，獲得了比任何一種抑制劑更好的效果。

本發明旨在提供拮抗ADAMTS(特別是ADAMTS5)的ISVD和/或拮抗與CAP結合劑(例如聚集蛋白聚醣結合劑)耦合的MMP(特別是MMP13)的ISVD之組合，其具有改善的預防、治療和/或藥理學性質，包含與先前技藝胺基酸序列和抗體相比之更安全的概況(profile)。

據此，本發明是關於選自由以下所組成的群組之多肽：(a)多肽，其包括至少2個免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)其中第一ISVD特異性結合基質金屬蛋白酶(MMP)以及第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第三 ISVD；(b)多肽，其包括至少2個ISVD的，其中第一ISVD特異性結合具血小板反應蛋白模體(Thrombospondin motif)之A去整合素(A Disintegrin)和金屬蛋白酶(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motif，ADAMTS)，且第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第三ISVD；以及(c)多肽，其包括至少3種ISVD，其中第一ISVD特異性結合MMP，第二ISVD特異性結合ADAMTS，以及第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，並且任選地包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第四ISVD。

除非另有說明或定義，否則所有使用的術語具有其在本領域中的通常含義，這對於技術人士來說是清楚的。例如，參考標準手冊，例如Sambrook et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2^nd Ed.)Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、F.Ausubel et al.(Current protocols in molecular biology,Green Publishing and Wiley Interscience,New York,1987)、Lewin(Genes II,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,1985)、Old et al.(Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering(2^nd edition)University of California Press,Berkeley,CA,1981)；Roitt et al.(Immunology(6^th Ed.)Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001)、Roitt et al.(Roitt’s Essential Immunology (10^th Ed.)Blackwell Publishing, UK, 2001)與Janewayet al. (Immunobiology (6^th Ed.)Garland Science Publishing/ Churchill Livingstone, New York, 2005)，以及本文引用的一般背景技術。

除非另有說明，否則所有未詳細描述的方法、步驟、技術和操作可以以本身已知的方式執行並且已經以本技藝技術人士清楚的方式進行。例如，再次參考本文提到的標準手冊和一般背景技術以及其中引用的其他參考文獻；以及例如以下評論：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6)：640-56, 2006)、Levin與Weiss (Mol. Biosyst. 2(1)：49-57, 2006)、Irvinget al. (J. Immunol. Methods 248(1-2)：31-45, 2001)、Schmitzet al. (Placenta 21 Suppl. A：S106-12, 2000)、Gonzaleset al. (Tumour Biol. 26(1)：31-43, 2005)，其描述了用於蛋白質工程的技術，例如親和力成熟和用於改善蛋白質(例如免疫球蛋白)的特異性和其他所需特性的其他技術。

必須注意，如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數形式「一」、「一個」和「該」包含複數指代。因此，例如，提及「試劑」包括一種或多種這樣的不同試劑，並且對「該方法」的提及包含對本領域普通技術人士已知對於本文所述方法之可以修改或替代的均等步驟和方法。

除非另有說明，否則在一系列元件之前的術語「至少」應理解為指代系列中的每個元件。本技藝技術人士將認識或能夠使用不超過常規的實驗確定本文所述的本發明具體實施方案的許多均等物。該等均等物包含在本發明中。

本文使用的術語「和/或」包含「和」、「或」以及「由所述術語連接的元素的全部或任何其他組合」的含義。

本文所用的術語「約」或「近似」是指給定值或範圍的20%、較佳為15%、更佳為10%、最佳為5%之內。

在此說明書和隨後的申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則用語「包括」和諸如「包括」的變體將被理解為暗示包括所述整數或步驟或是整數或步驟組，但不排除任何其他整數或步驟或是整數或步驟組。當在本文中使用時，或者有時在本文中與術語“具有”一起使用時，術語「包括」可以用術語「含有」或「包含」代替。

本文所用的術語「序列」(例如術語如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「可變結構域序列」、「V_HH 序列」或「蛋白質序列」)通常應理解為包含相關的胺基酸序列以及編碼它們的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更有限的解釋。

根據上下文，胺基酸序列被解釋為表示單個胺基酸或兩個或更多個胺基酸的非支鏈序列(unbranched sequence)。核苷酸序列被解釋為意指3個或更多個核苷酸的非支鏈序列。

胺基酸是天然存在的蛋白質中常見的那些L-胺基酸。胺基酸殘基將根據標準的三字母或單字母胺基酸代碼表示。例如參考WO 08/020079第48頁的表A-2。含有D-胺基酸的那些胺基酸序列不被該定義所包含。含有轉譯後修飾之胺基酸的任何胺基酸序列可以描述為使用表A-2中所示的具有修飾位置(例如，羥基化或糖基化)的符號之最初轉譯的胺基酸序列，但這些修飾不應在胺基酸序列中明確顯示。可以表達為序列修飾的連接、交聯和末端帽、非肽鍵等的任何肽或蛋白質都包括在此定義中，所有這些都是該技藝已知的。

術語「蛋白質」、「肽」、「蛋白質/肽」和「多肽」在整個揭露內容中可互換使用，並且各自具有與本揭露內容相同的含義。每個術語是指由兩個或更多個胺基酸的直鏈構成的有機化合物。該化合物可具有十個或更多個胺基酸；二十五個或更多胺基酸；五十個或更多胺基酸；一百個或更多胺基酸、兩百個或更多胺基酸，甚至三百個或更多胺基酸。本技藝技術人士將理解，多肽通常包括比蛋白質更少的胺基酸，儘管沒有本技藝公認的區分多肽和蛋白質的胺基酸數量的分界點；多肽可以藉由化學合成或重組方法形成；並且蛋白質通常藉由本技藝已知的重組方法在體外或體內形成。按照慣例，多肽的一級結構中的醯胺鍵是按照寫入胺基酸的順序，其中多肽的胺末端(N-端)總是在左邊，而酸末端(C-端)則在右邊。

核酸或胺基酸序列被認為是「(基本上)分離(形式)」-例如，與獲得它的反應介質或培養介質相比-當它與通常與所述來源或介質(另一種核酸、另一種蛋白質/多肽、另一種生物成分或大分子或至少一種污染物、雜質或次要成分(minor component))相關的至少一種其它成分分離時。特別地，當核酸或胺基酸序列被純化至少2倍，特別是至少10倍，更特別是至少100倍，並且高達1000倍或更高時，被認為是「(基本上)分離的」。「(基本上)分離的」的核酸或胺基酸較佳地基本上是均質的，如使用合適的技術測定的，例如合適的色譜技術，例如聚丙烯醯胺-凝膠電泳。

當稱核苷酸序列或胺基酸序列分別「包括」另一個核苷酸序列或胺基酸序列時，或稱「基本上由」另一個核苷酸序列或胺基酸序列組成時，這可指後者核苷酸序列或胺基酸序列已經分別被併入先提到的核苷酸序列或胺基酸序列，但更通常地，這通常是指先提到的核苷酸序列或胺基酸序列分別在其序列中包括一段核苷酸或胺基酸殘基，其分別具有與後者序列相同的核苷酸序列或胺基酸序列，而不管如何實際產生或獲得先提到的序列(例如其可為本文所述之任何合適的方法)。藉由非限制實例，當稱本發明的多肽包括免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)時，這可指該免疫球蛋白單可變結構域序列已經被併入本發明的多肽之序列中，但更通常地，這通常是指本發明的多肽在其序列內包含免疫球蛋白單可變結構域的序列，無論已如何產生或獲得本發明的該多肽。同樣地，當稱核酸或核苷酸序列包括另一個核苷酸序列時，先提到的核酸或核苷酸序列較佳地使得當其表現為表現產物(例如多肽)時，由後者核苷酸序列編碼的胺基酸序列形成該表現產物的一部分(換言之，後者核苷酸序列與先前提到的更大的核酸或核苷酸序列在相同的讀框(reading frame)中)。同樣地，當稱本發明的構築體包括多肽或ISVD時，這可指該構築體至少分別包括該多肽或ISVD，但更通常地，這通常是指除了該多肽或ISVD之外，該構築體包括基團、殘基(例如胺基酸殘基)、部分與/或結合單元，無論該多肽或ISVD如何連接至該基團、殘基(例如胺基酸殘基)、部分與/或結合單元以及無論已如何產生或獲得該構築體。

「基本上由......組成」是指本發明中使用的ISVD與本發明的ISVD完全相同或對應於本發明的ISVD，具有有限數量的胺基酸殘基，例如1-20個胺基酸，例如1-10個胺基酸殘基，較佳為1-6個胺基酸殘基，如1、2、3、4、5或6個胺基酸殘基，加在胺基末端、羧基末端、或者在ISVD的胺基末端和羧基末端。

為了比較兩個或多個核苷酸序列的目的，可藉由將[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相應位置的核苷酸相同的核苷酸數]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的總數]並乘以[100%]而計算第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間「序列相同性」的百分比，其中與第一核苷酸序列相比，第二核苷酸序列中的核苷酸的每個缺失、插入、取代或添加被認為是單核苷酸(位置)的差異。或者，可以使用用於序列比對的已知計算機演算法，例如NCBI Blast v2.0，使用標準設定來計算兩個或更多個核苷酸序列之間的序列相同性程度。用於確定序列相同性程度的一些其他技術、計算機演算法和設定，例如描述於WO 04/ 037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/ 55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB 2357768中。通常，關於根據上文概述的計算方法確定兩個核苷酸序列之間的“序列相同性”的百分比，具有最大核苷酸數的核苷酸序列將被作為「第一」核苷酸序列，而另一個核苷酸序列將作為「第二」核苷酸序列。

為了比較兩個或多個胺基酸序列的目的，可藉由將[第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基數]除以[第一胺基酸序列中胺基酸殘基的總數]並乘以[100%]而計算第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間「序列相同性」的百分比，其中與第一胺基酸序列相比，第二胺基酸序列中的胺基酸殘跡的每個缺失、插入、取代或添加被認為是單胺基酸殘基(位置)的差異，亦即本文所定義之「胺基酸差異」。或者可以使用已知的計算機演算法計算兩個胺基酸序列之間的序列相同性程度，例如上述用於確定核苷酸序列的序列相同性程度的那些，再次使用標準設定。通常，關於根據上文概述的計算方法確定兩個胺基酸序列之間的“序列相同性”的百分比，具有最大胺基酸殘基數的胺基酸序列將被作為「第一」胺基酸序列，而另一個胺基酸序列將作為「第二」胺基酸序列。

再者，在確定兩個胺基酸序列之間的序列相同性程度中，該技藝技術人士可考慮所謂的「保留(conservative)」胺基酸取代，這通常可以描述為胺基酸取代，其中胺基酸殘基被具有相似化學結構的另一個胺基酸殘基取代，並且對多肽的功能、活性或其他生物學性質幾乎沒有或基本上沒有影響。這種保留胺基酸取代是本技藝熟知的，例如WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300；可以基於WO 04/037999以及WO 98/49185和其中引用的其他參考文獻的相關教導進行選擇這些取代的(較佳)類型和/或組合。

此等保留取代較佳是這樣的取代，其中下列(a)-(e)組中的一個胺基酸被同一組內的另一個胺基酸殘基取代：(a)小脂肪族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro與Gly；(b)極性、負電殘基及其(未帶電)醯胺：Asp、Asn、Glu與Gln；(c)極性、正電殘基：His、Arg與Lys；(d)大脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val與Cys；以及：(e)芳香族殘基：Phe、Tyr與Trp。特別較佳的保留取代為以下：Ala成為Gly或成為Ser；Arg成為Lys；Asn成為Gln或成為His；Asp成為Glu；Cys成為Ser；Gln成為Asn；Glu成為Asp；Gly成為Ala或成為Pro；His成為Asn或成為Gln；Ile成為Leu或成為Val；Leu成為Ile或成為Val；Lys成為Arg,成為Gln或成為Glu；Met成為Leu,成為Tyr或成為Ile；Phe成為Met,成為Leu或成為Tyr；Ser成為Thr；Thr成為Ser；Trp成為Tyr；Tyr成為Trp；和/或Phe成為Val,成為Ile或成為Leu。

應用於本文所述之多肽的任何胺基酸取代也可以基於Schulz等人開發的不同物種的同源蛋白質之間胺基酸變異頻率的分析(“Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, 1978)、基於Chou和Fasman開發的結構形成趨勢分析(Biochemistry 13：211, 1974；Adv. Enzymol., 47：45-149, 1978)、以及基於Eisenberg等人(Proc. Natl. Acad Sci. USA 81：140-144, 1984)、Kyte和Doolittle (J. Molec. Biol. 157：105-132, 1981)與Goldman等人(Ann. Rev. Biophys. Chem. 15：321-353, 1986)開發的蛋白質中疏水性模式分析，所有全文皆併入本文作為參考。在本文的描述和上文引用的一般背景技術中給出關於奈米體的一級、二級和三級結構的資訊。再者，為了此目的，例如Desmyter等人(Nature Structural Biology, 3：803, 1996)、Spinelli等人(Natural Structural Biology, 3：752-757, 1996)與Decanniere等人(Structure, 7 (4)：361, 1999)給出美洲駝(llama)的V_HH 結構域的結晶結構。可在上述引用的先前技藝中找到關於常規V_H 結構域中形成V_H /V_L 界面的一些胺基酸殘基的進一步資訊以及這些位置上潛在的駱駝化取代(camelizing substitution)。

若胺基酸序列與核酸序列的全長具有100%序列相同性(如本文所定義)，則稱他們為「完全相同」。

當比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」是指與第二序列相比，第一序列的位置上的單個胺基酸殘基的插入、缺失或取代；應理解，兩個胺基酸序列可含有一個、兩個或更多個這樣的胺基酸差異。更特別地，在本發明的ISVD與/或多肽中，術語「胺基酸差異」是指分別與(a)、(c)或(e)的CDR序列相比，(b)、(d)或(f)中指定的CDR序列的位置上的單個胺基酸殘基的插入，缺失或取代；應理解分別與(a)、(c)或(e)的CDR序列相比，(b)、(d)和(f)的CDR序列可包含一個、兩個、三個、四個或最多五個這樣的胺基酸差異。

「胺基酸差異」可為任何一個、兩個、三個、四個或最多五個取代、缺失或插入、或任何其組合，或者改善本發明的ISVD的性質，即本發明的ADAMTS5結合劑、MMP13結合劑和/或聚集蛋白聚醣結合劑，例如本發明的多肽，或者至少不會從所需的性質或從本發明的ISVD(即本發明的ADAMTS5節合劑、MMP13結合劑和/或聚集蛋白聚醣結合劑，例如包含聚集蛋白聚醣結合劑和MMP13結合劑和/或ADAMTS5結合劑)的所需性質的平衡或組合偏離太多。在這態樣，與包含一個或多個CDR序列而無該一個、兩個、三個、四個或最多五個取代、缺失或插入的多肽相比，本發明的所得多肽應至少與具有相同，大致相同或更高親和力的聚集蛋白聚醣和MMP13和/或ADAMTS5結合。親和力可以藉由本技藝已知的任何合適方法測量，但較佳係藉由實例部分中描述的方法測量。

在這態樣，如本文所示的根據(b)、(d)和/或(f)的CDR的胺基酸序列可以是分別藉由使用一種或多種本身已知的親和力成熟技術或如實例中所述親和力成熟而衍生自根據(a)、(c)和/或(e)的胺基酸序列的胺基酸序列。例如，並且取決於用於表現本發明多肽的宿主生物，這樣的缺失和/或取代可以用去除一個或多個轉譯後修飾位點(例如一個或多個糖基化位點)的方式以及在本技藝技術人士的能力範圍內(參閱實例)而設計。

本說明書中所使用的「奈米體家族(Nanobody family)」、「V_HH 家族」或「家族」是指一組具有相同長度的奈米體和/或V_HH 序列(即它們在其序列中具有相同數量的胺基酸)並且其中位置8和位置106之間的胺基酸序列(根據Kabat編號)具有胺基酸序列相同性為89%或更高。

術語「表位(epitope)」和「抗原決定位(antigenic determinant)」可互換使用，是指大分子的一部分，如被抗原結合分子識別的多肽或蛋白質，如免疫球蛋白、常規抗體、本發明的免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽，更特別是所被述分子的抗原結合位點識別。表位定義免疫球蛋白的最小結合位點，因此代表免疫球蛋白特異性標的。

識別表位的抗原結合分子(例如免疫球蛋白、常規抗體，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽)的部分稱為「互補位(paratope)」。

可「結合至」或「特異性結合至」某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或表位)、對於某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或表位)具有親和性與/或具有特異性的胺基酸序列(例如本發明的免疫球蛋白單可變結構域、抗體、多肽、或通常為抗原結合蛋白或多肽或其片段)係被稱為針對或直接針對該表位、抗原或蛋白質，或是關於這種表位、抗原或蛋白質的「結合」分子，或者被稱為「抗」表位、「抗」-抗原或「抗」-蛋白質(例如，「抗」聚集蛋白聚醣、「抗」 -MMP13和/或「抗」-ADAMTS5)。

親和力表示分子相互作用的強度或穩定性。親和力通常以K_D 或解離常數給出，其單位為mol/L(或M)。親和力也可以表示為締合常數K_A ，其等於1/K_D 並且其單位為(mol /L)^-1 (或M^-1 )。在本說明書中，兩個分子之間的相互作用之穩定性主要用它們相互作用的K_D 值表示；本技藝技術人士清楚的是鑑於K_A =1/K_D 的關係，藉由其K_D 值指定分子相互作用的強度也可用於計算相應的K_A 值。K_D 值也表徵了熱力學意義上的分子相互作用的強度，因為它與已知關係式DG=RT.ln(K_D )的結合自由能(DG)的變化有關(等效於DG=-RT.ln(K_A ))，其中R等於氣體常數，T等於絕對溫度，以及In代表自然對數。

被認為有意義(例如特異性)的生物相互作用的K_D 通常在10^-12 M(0.001nM)至10^-5 M(10000nM)的範圍內。相互作用越強，其K_D 越低。

K_D 還可以表示為複合物的解離速率常數(表示為k_off )與其締合速率(表示為k_on )的比率，(使得K_D =k_off / k_on 且K_A =k_on /k_off )。解離率k_off 具有單位s^-1 (其中s是第二個SI單位符號)。締合速率k_on 具有單位M^-1 s^-1 。締合速率可在10² M^-1 s^-1 至約10⁷ M^-1 s^-1 之間變化，接近雙分子相互作用之擴散限制的締合速率常數。藉由關係t_1/2 =ln(2)/k_off ，解離速率與給定分子相互作用的半衰期有關。解離速率可在10^-6 s^-1 (接近不可逆的複合物，具有多天的t_1/2 )與1 s^-1 (t_1/2 =0.69 s)之間變化。

抗原結合蛋白(例如ISVD)與抗原或抗原決定位的特異性結合可以以本身已知的任何合適的方式確定，包含例如飽和結合測定和/或競爭性結合測定，例如放射性-免疫測定(radio-immunoassay，RIA)、酶免疫測定(enzyme immunoassay，EIA)和夾心競爭測定，以及其在本領域本身已知的不同變體；以及本文提到的其他技術。

兩個分子之間的分子相互作用的親和力可以藉由本身已知的不同技術測量，例如眾所周知的表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)、生物感測器技術(參閱例如Ober等人，2001，Intern.Immunology 13：1551- 1559)其中一個分子固定在生物感測器晶片上，另一個分子在流動條件下通過固定的分子，產生k_on 、k_off 測量值，因此產生K_D (或K_A )值。例如，這可使用已知的BIACORE®儀器進行(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala，瑞典)。動力學排除分析(Kinetic Exclusion Assay) (KINEXA®) (Drakeet al. 2004,Analytical Biochemistry 328：35-43)測量溶液中的結合事件而不標記結合配偶體(binding partner)，並且基於動力學排除複合物的解離。亦可以使用GYROLAB^® 免疫分析系統進行溶液內親和力分析，該系統提供用於自動化生物分析和快速樣品轉迴(turnaround)的平台(Fraleyet al. 2013, Bioanalysis 5：1765-74)或ELISA。

本領域技術人士亦明白如果測量過程以某種方式影響隱含分子的固有結合親和力，例如藉由與一個分子的生物感測器上的塗層相關的偽影，則測量的K_D 可以對應於表觀K_D (apparent K_D )。再者，如果一個分子含有一個以上的另一個分子的識別位點，則可以測量表觀K_D 。在這種情況下，測量的親和力可能受兩個分子相互作用的結合性(avidity)影響。特別地，K_D 的精確測量可能是非常勞動密集的，因此，通常確定表觀K_D 值以評估兩個分子的結合強度。應該注意的是，只要所有測量都以一致的方式進行(例如保持測定條件不變)，可以使用表觀K_D 測量值作為真實K_D 的近似值，因此在本文中，應該以同等重要性或相關性處理K_D 和表觀K_D 。

術語「特異性」是指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如本發明的ISVD或多肽)分子可結合之不同類型抗原或抗原決定位的數目。抗原結合蛋白的特異性可以基於親和力和/或結合性來確定，例如如WO 08/ 020079(藉由引用併入本文)的第53-56頁所述，其還描述了用於測量抗原結合分子(例如本發明的多肽或ISVD)和相關抗原之間結合的一些較佳技術。典型地，抗原結合蛋白(例如本發明的ISVD和/或多肽)將與其抗原結合，解離常數(K_D )為10^-5 至10^-12 莫耳/升或更低，較佳為10^-7 至10^‑12 莫耳/升或更低，且更佳為10^-8 至10^-12 莫耳/升(即，締合常數(K_A )為10⁵ 至10¹² 升/莫耳或更高，較佳為10⁷ 至10¹² 升/莫耳或更高，並且更佳為10⁸ 至10¹² 升/莫耳)。任何大於10^-4 莫耳/升的K_D 值(或任何低於10⁴ 升/莫耳的K_A 值)通常被認為表示非特異性結合。較佳地，本發明的單價ISVD將結合至所欲之抗原，親和力為小於500 nM，較佳為小於200 nM，更佳為小於10 nM，例如小於500 pM，例如在10與5 pM之間或更低。請參閱WO 08/020079第53-56頁第n)段。

當ISVD和/或多肽與另一(第二)標的或抗原相比，當它以親和力結合第一抗原時(如上所述，並且適當地表示為K_D 值、K_A 值、K_off 速率與/或K_on 速率)，其被稱為對於(第一)標的或抗原具有「特異性」，相較於ISVD和/或多肽結合至第二標的或抗原，ISVD和/或多肽與第一抗原之結合的親和力為至少10倍，例如至少100倍，較佳為至少1000倍或更多倍。例如，ISVD和/或多肽可結合至第一標的或抗原，其K_D 值比ISVD和/或多肽可結合至第二標的或抗原之K_D 值低至少10倍，例如低至少100倍，較佳為低至少1000倍，或甚至更低。較佳地，當ISVD和/或多肽與第二標的或抗原相比是對於第一標的或抗原具有「特異性」時，它針對(如本文所定義)所述第一標的或抗原，但不針對所述第二標的或抗原。

抗原結合蛋白與抗原或抗原決定位的特異性結合可以用本身已知的任何合適的方式確定，包含例如飽和結合測定和/或競爭性結合測定，例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及其在本技藝中已知的不同變體；以及此處提到的其他技術。

可用以測定親和力的較佳方法為1985年Friguet等人的2步驟ELISA(酵素-連結免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay))(J. Immunol. Methods 77：305-19)。此方法建立溶液相結合平衡測量並避免可能與載體(例如塑料)上的一種分子的吸附有關的偽影(artifact)。如技術人士所明白的，解離常數可以是實際或表觀解離常數。確定解離常數的方法對於技術人士來說是清楚的，並且例如包含WO 08/020079第53-56頁提到的技術。

最後，應該注意的是，在許多情況下，有經驗的科學家可以判斷它相對於某些參考分子確定結合親和力是方便的。例如，為了評估分子A和B之間的結合強度，可以例如使用已知與B結合的參考分子C，其適當地用螢光團或發色團或其他化學部分標記，例如生物素，以便在ELISA或FACS(螢光活化細胞分選)或其他形式(用於螢光檢測的螢光團、用於光吸收檢測的發色團、用於鏈黴親合素(streptavidin)媒介的ELISA檢測的生物素(biotin))中容易檢測。典型地，參考分子C保持固定濃度，A的濃度對於B的給定濃度或量變化。結果，獲得對應於A濃度的IC₅₀ 值，在該濃度下，在沒有A的情況下測量的C的訊號減半。如果參考分子的K_D (K_{D ref} )為已知，以及參考分子的總濃度c_ref ，則相互作用A-B的表觀K_D 可由下式得到：K_D =IC₅₀ /(1+c_ref / K_Dref )。注意，如果c_ref ＜＜ K_D _ref ，則K_D » IC₅₀ 。如果對比較的結合劑以一致的方式(例如保持c_ref 固定)進行IC₅₀ 的測量，則可以藉由比較IC₅₀ 來評估分子相互作用的強度或穩定性的差異，並且該測量被判斷為等效於在本文中K_D 或表徵K_D 。

半數最大抑制濃度(IC₅₀ )也可以是化合物抑制生物或生物化學功能(例如藥理作用)的有效性的測量。該定量測量表示需要多少多肽或ISVD(例如奈米體)來抑制一半之給定的生物過程(或過程的成分，亦即酶、細胞、細胞受體、趨化性、變形、轉移，侵襲性等)。換言之，它是物質的半數最大(50%)抑制濃度(IC)(50%IC或IC₅₀ )。藉由測定抑制促效劑(agonist)最大生物反應的一半所需的濃度，可以計算給定拮抗劑(antagonist)(例如本發明的多肽或ISVD(例如奈米體))的IC₅₀ 值。可以藉由構築體劑量-反應曲線並檢查不同濃度的拮抗劑(如本發明的多肽或ISVD(例如奈米體))對逆轉促效劑活性的影響來確定藥物的K_D 。

術語一半最大有效濃度(EC₅₀ )是指在指定的暴露時間後，在基線和最大值間的一半誘導響應的化合物濃度。在本發明的上下文中，它用作多肽、ISVD(例如奈米體)其功效的測量。分級劑量響應曲線的EC₅₀ 表示化合物的濃度，其中觀察到其最大效應的50%。濃度較佳以莫耳濃度(molar)單位表示。

在生物系統中，配體濃度的微小變化通常導致響應的快速變化，遵循S形函數(sigmoidal function)。隨著配體濃度增加的響應增加開始減慢的反折點(inflection point)為EC₅₀ 。這可以藉由推導最佳擬合線而在數學上確定。在大多數情況下，依靠圖形進行估計是很方便的。如果在實例部分中提供EC₅₀ ，則設計實驗以盡可能準確地反映K_D 。換言之，EC₅₀ 值可被認為是K_D 值。術語「平均K_D 」是關於在至少1，但較佳為多於1，例如至少2次實驗中獲得的平均K_D 值。術語「平均」是指數學術語「平均」(數據之和除以數據中的項目數)。

它還與IC₅₀ 有關，IC₅₀ 是化合物抑制(50%抑制)的量度。對於競爭結合測定和功能性拮抗劑測定，IC₅₀ 是劑量-響應曲線之最常見的總結測量。對於促進劑/刺激劑測定，最常見的總結測量是EC₅₀ 。

抑制常數(K_i )為抑制劑的效力如何的指標；它是產生一半最大抑制所需的濃度。與IC₅₀ 不同，IC₅₀ 可以根據實驗條件而變化，K_i 是絕對值，通常是指藥物的抑制常數。抑制常數K_i 可以使用Cheng-Prusoff方程計算：其中[L]是配體的固定濃度。

如本文所用，本發明的多肽和/或ISVD的術語「效力(potency)」是其特定效應發生所需之本發明多肽和/或ISVD的量的函數。它是指本發明的所述多肽和/或ISVD調節和/或部分或完全抑制MMP13活性和/或調節和/或部分或完全抑制ADAMTS5活性的能力。

特別地，其可指所述多肽降低或甚至完全抑制如本文所定義的MMP13活性的能力。因此，它可指所述多肽抑制蛋白水解的能力(例如蛋白酶活性內肽酶活性)，結合受質(substrate)(例如聚集蛋白聚醣、膠原蛋白II、膠原蛋白I、膠原蛋白III、膠原蛋白IV、膠原蛋白IX、膠原蛋白X、膠原蛋白XIV和明膠。可以藉由本技藝已知的或本文描述之任何合適的測定來測量效力。

特別地，它可指所述多肽和/或ISVD的能力，以減少或甚至完全抑制如本文所定義的ADAMTS5活性，和/或如本文所定義的MMP13活性。可以藉由本技藝已知的或本文描述之任何合適的測定來測量效力。如本文所使用，「聚集蛋白聚醣酶活性」定義為聚集蛋白聚醣的蛋白水解切割。

在飽和多肽濃度下，本發明多肽的「功效」測量效應本身的最大強度。效果表示可從本發明的多肽實現的最大響應。它指多肽產生所需(治療)效果的能力。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至ADAMTS5，K_D 為在1E^-07 M與1E^-13 M之間，例如在1E^-08 M與1E^-12 M之間，較佳最高為1E^-07 M，較佳為低於1E^-08 M或1E^-09 M，或甚至低於1E^‑10 M，例如5E^-11 M、4E^-11 M、3E^‑11 M、2E^-11 M、1.7E^-11 M、1E^‑11 M、或甚至5E^-12 M、4E^-12 M、3E^‑12 M、1E^-12 M，例如由Gyrolab or KinExA確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至MMP13，K_D 為在1E^-07 M與1E^-13 M之間，例如在1E^-08 M與1E^-12 M之間，較佳為最高1E^-07 M，較佳為低於1E^-08 M或1E^-09 M，或甚至低於1E^‑10 M，例如5E^-11 M、4E^-11 M、3E^‑11 M、2E^-11 M、1.7E^-11 M、1E^‑11 M、或甚至5E^-12 M、4E^-12 M、3E^‑12 M、1E^-12 M，例如由Gyrolab or KinExA確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至聚集蛋白聚醣，K_D 為在1E^-07 M與1E^-13 M之間，例如在1E^-08 M與1E^-12 M之間，較佳為最高1E^-07 M，較佳為低於1E^-08 M或1E^-09 M，或甚至低於1E^‑10 M，例如5E^-11 M、4E^-11 M、3E^‑11 M、2E^-11 M、1.7E^-11 M、1E^‑11 M、或甚至5E^-12 M、4E^-12 M、3E^‑12 M、1E^-12 M，例如由Gyrolab or KinExA確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至ADAMTS5，解離率小於5E^-04 s^-1 ，例如小於1E^-04 s^-1 或5E^-05 s^-1 ，或甚至小於1E^-05 s^-1 ，例如由SPR確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至MMP13，解離率小於5E^-04 s^-1 ，例如小於1E^-04 s^-1 或5E^-05 s^-1 ，或甚至小於1E^-05 s^-1 ，例如由SPR確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽結合至聚集蛋白聚醣，解離率小於5E^-04 s^-1 ，例如小於1E^-04 s^-1 或5E^-05 s^-1 ，或甚至小於1E^-05 s^-1 ，例如由SPR確定。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽調節ADAMTS5活性與/ 或MMP13活性，EC₅₀ 在1E^-07 M與1E^-12 M之間，例如在1E^-08 M與 1E^-11 M之間，例如藉由結合ELISA(用於確定ADAMTS5活性)而確定或例如競爭ELISA、競爭TIMP-2 ELISA、螢光肽測定、螢光膠原蛋白測定或膠原蛋白水解測定(用於確定MMP13活性)。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽抑制ADAMTS5活性與/ 或MMP13活性，IC₅₀ 在1E^-07 M與1E^-12 M之間，例如在1E^-08 M與 1E^-11 M之間，例如藉由人類FRET測定或人類AlphaLISA(用於確定ADAMTS5活性)確定或例如競爭ELISA、競爭TIMP-2 ELISA、螢光肽測定、螢光膠原蛋白測定或膠原蛋白水解測定(用於確定MMP13活性)。

在一態樣，本發明是關於本文所述的多肽，其中該多肽抑制ADAMTS5與/或MMP13的酶活性，IC₅₀ 最高1E^-07 M，較佳為1E^‑08 M、5E^‑09 M、或4E^-9 M、3E^-9 M、2E^-9 M，1E^-9 M。

若胺基酸序列(例如ISVD或多肽)對於不同抗原或抗原決定位(例如不同種類補乳動物的ADAMTS5，例如人類ADAMTS5、牛ADAMTS5、大鼠ADAMTS5、豚鼠ADAMTS5、小鼠 ADAMTS5或食蟹猴 ADAMTS5，或是例如不同種類哺乳動物的 MMP13，例如人類MMP13、狗MMP13、牛MMP13、大鼠MMP13、豬MMP13、小鼠MMP13、兔MMP13、食蟹猴MMP13、與/或恒河猴MMP13或例如不同種類哺乳動物的聚集蛋白聚醣，例如人類聚集蛋白聚醣、狗聚集蛋白聚醣、牛聚集蛋白聚醣、大鼠聚集蛋白聚醣、豬聚集蛋白聚醣、小鼠聚集蛋白聚醣、兔聚集蛋白聚醣、食蟹猴聚集蛋白聚醣、與/或恒河猴聚集蛋白聚醣)具有特異性(如本文所定義)，則稱為對兩種不同抗原或抗原決定位為具有「交叉反應性」。應當理解，ISVD或多肽可以被認為是交叉反應的，儘管對兩種不同抗原的結合親和力可以不同，例如藉由因子，2、5、10、50、100或甚至更多，只要它對於這些不同的抗原或抗原決定位具有特異性(如本文所定義)。

ADAMTS5也稱為ADAMTS11、ADMP-2或Aggrecanase-2。可以在例如下表B-1中所示的UniProt存取號(accession number)中找到ADAMTS5的相關結構資訊(參閱表B)。

「人類ADAMTS5(Human ADAMTS5)」是指包括SEQ ID NO：67胺基酸序列的ADAMTS5。在一態樣，本發明的多肽特異性結合Human sapiens 、 Mus musculus 、 Cavia Porcellus 、 Bos taurus 、 Macaca mulatta 與/或Rattus norvegicus 的ADAMTS5，較佳為人類ADAMTS5，較佳為SEQ ID NO：67。

MMP13也稱為CLG3或膠原蛋白酶(Collagenase)3、MANDP1、MMP-13、基質金屬肽酶(Matrix metallopeptidase)13或MDST。可以在例如下表B-2中所示的UniProt存取號中找到MMP13的相關結構資訊(參閱表B)。

「人類MMP13(Human MMP13)」是指包括SEQ ID NO：66胺基酸序列的MMP13。在一態樣，本發明的多肽特異性結合Human sapiens 、 Mus musculus 、 Canis lupus 、 Bos taurus 、 Macaca mulatta 、Rattus norvegicus 、Gallus gallus 與/或P.troglodytes 的MMP13，較佳為人類MMP13，較佳為SEQ ID NO：66。

聚集蛋白聚醣(Aggrecan)也稱為聚集蛋白聚醣1、ACAN、AGC1、AGCAN、CSPGCP、MSK16、SEDK、軟骨特異性蛋白多醣核心蛋白(cartilage-specific proteoglycan core protein，CSPCP)或硫酸軟骨素蛋白聚醣1(chondroitin sulfate proteoglycan 1，CSPG1)。聚集蛋白聚醣在人類是由ACAN基因編碼，其位於染色體Chr 15：q26.1。可以在例如下表B-3中所示的UniProt存取號中找到聚集蛋白聚醣的相關結構資訊(參閱表B)。

「人類聚集蛋白聚醣(Human Aggrecan)」是指包括SEQ ID NO：68胺基酸序列的聚集蛋白聚醣。在一態樣，本發明的多肽特異性結合Human sapiens 、Mus musculus 、Bos taurus 、Macaca mulatta 、Pan troglodytes 、Gallus gallus 、Canis lupus 、Sus scrofa 、Oryctolagus cuniculus 與/或Rattus norvegicus 的聚集蛋白聚醣，較佳為人類聚集蛋白聚醣，較佳為SEQ ID NO：68。

術語「(交叉)阻斷」、“「被(交叉)阻斷」、“「正在(交叉)阻斷」、「競爭性結合」、「(交叉)-競爭」、「正在(交叉)-競爭」和「(交叉)-競爭」在本文中可互換使用，意指免疫球蛋白、抗體、ISVD、多肽或其他結合劑干擾其他免疫球蛋白、抗體、ISVD、多肽或結合劑與給定標的結合的能力。免疫球蛋白、抗體、ISVD、多肽或其他結合劑能夠干擾另一種與標的之結合的程度，以及因此是否可以說根據本發明的交叉阻斷，可以使用競爭結合測定來確定，其在本領域是常見的，例如藉由在競爭ELISA中篩選針對噬菌體上展示的ISVD之純化的ISVD。特別合適的定量交叉阻斷測定包括ELISA。

用於確定針對標的(交叉)阻斷的免疫球蛋白、抗體、ISVD、多肽或其他結合劑是否能夠(交叉)阻斷、競爭性結合或如本文所定義的(交叉)競爭性的其他方法可以藉由基於SPR的「夾心測定(sandwich assay)」評估，例如在實例部分中描述的。其他合適的方法描述於例如Xiao-Chi Jia等人(Journal of Immunological Methods 288：91-98, 2004)、Miller等人(Journal of Immunological Methods 365：118-125, 2011)所著內容中。

「ADAMTS5活性」和「ADAMTS5的活性」(這些術語在本文中可互換使用)包含但不限於酶活性，例如蛋白水解，例如蛋白酶活性(也稱為蛋白酶或肽酶活性)和內肽酶活性，以及外部位點的活性，例如識別和/或結合受質，例如藉由類解整合素結構域(disintegrin-like domain)、中心血小板反應蛋白I型(central thrombospondin type I-like(TS))重複、富含半胱胺酸的結構域(cysteine-rich domain)、間隔區和/或另外的TS模體(motif)。ADAMTS5活性包含受質(例如玻尿酸結合硫酸軟骨素蛋白聚醣(hyaluronan-binding chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG)細胞外蛋白質，例如聚集蛋白聚醣、多功能蛋白聚醣(Versican)、短蛋白聚糖(Brevican)、神經聚醣(Neurocan)、核心蛋白聚醣(Decorin)和二聚醣(Biglycan))的結合和/或蛋白水解。如本文所用，蛋白質水解是藉由在多肽鏈中將胺基酸連接在一起的肽鍵水解而使蛋白質分解成較小的多肽或胺基酸。

「MMP13活性」和「藉由MMP13的活性」(這些術語在本文中可互換使用)包含但不限於蛋白酶水解，例如蛋白酶活性(也稱為蛋白酶或肽酶活性)和內肽酶活性，在另一態樣，並且例如藉由類凝血酶結構域(Hemopexin-like domain)和肽聚醣結合結構域(peptidoglycan binding domain)而結合受質。MMP13活性包含結合與/或蛋白質水解受質，例如聚集蛋白聚醣、膠原蛋白II、膠原蛋白I、膠原蛋白III、膠原蛋白IV、膠原蛋白IX、膠原蛋白X、膠原蛋白XIV和明膠。如本文所用，蛋白質水解是藉由在多肽鏈中將胺基酸連接在一起的肽鍵水解而使蛋白質分解成較小的多肽或胺基酸。

在本發明的內文中，「調節」通常是指改變ADAMTS5和/或MMP13的活性，如使用合適的體外、細胞的或體內測定(例如本文提及的那些)測量的。特別地，「調節」可以表示降低或抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性，或者增加ADAMTS5和/或MMP13的活性，如使用合適的體外、細胞的或體內測定(例如，諸如本文所述的那些)所測量的，在相同條件下但不存在本發明的ISVD或多肽的情況下，與相同測定中ADAMTS5和/或MMP13的活性相比，改變至少1%，較佳至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%或90%或更多。

據此，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽調節ADAMTS5和/或MMP13的活性，較佳為抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性。

據此，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽抑制ADAMTS5的蛋白酶活性，例如抑制受質(例如聚集蛋白聚醣、多功能蛋白聚醣(Versican)、短蛋白聚糖(Brevican)、神經聚醣(Neurocan)、核心蛋白聚醣(Decorin)和/或二聚醣(Biglycan))的蛋白質水解。

據此，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽阻斷ADAMTS5結合至受質(例如聚集蛋白聚醣、多功能蛋白聚醣(Versican)、短蛋白聚糖(Brevican)、神經聚醣(Neurocan)、核心蛋白聚醣(Decorin)和/或二聚醣(Biglycan))，其中該受質較佳為聚集蛋白聚醣。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該多肽阻斷ADAMTS5結合至聚集蛋白聚醣至少20%，例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更多，例如藉由ELISA所測定的。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該多肽拮抗或抑制ADAMTS5的活性，例如(i)蛋白酶活性，較佳為如聚集蛋白聚醣、多功能蛋白聚醣(Versican)、短蛋白聚糖(Brevican)、神經聚醣(Neurocan)、核心蛋白聚醣(Decorin)和/或二聚醣(Biglycan)的切割，較佳為聚集蛋白聚醣的切割；較佳為拮抗ADAMTS5的聚集蛋白聚醣酶活性；(ii)結合受質至ADAMTS5，例如ADAMTS5的外部位點(exosite)，例如類解整合素結構域(disintegrin-like domain)、中心血小板反應蛋白I型(central thrombospondin type I-like(TS))重複、富含半胱胺酸的結構域(cysteine-rich domain)、間隔區和/或另外的TS模體(motif)。

據此，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽抑制MMP13的蛋白酶活性，例如抑制受質(例如聚集蛋白聚醣、膠原蛋白II、膠原蛋白I、膠原蛋白III、膠原蛋白IV、膠原蛋白IX、膠原蛋白X、膠原蛋白XIV和/或明膠)的蛋白質水解。

據此，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽阻斷MMP13結合至受質(例如聚集蛋白聚醣、膠原蛋白II、膠原蛋白I、膠原蛋白III、膠原蛋白IV、膠原蛋白IX、膠原蛋白X、膠原蛋白XIV和/或明膠)，其中該膠原蛋白較佳為膠原蛋白II。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中該多肽阻斷MMP13結合至膠原蛋白與/或聚集蛋白聚醣至少20%，例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更多，例如由基於ELISA競爭測定所確定的(參考Howeset al. 2014 J. Biol. Chem. 289：24091-24101)。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該多肽拮抗或抑制MMP13的活性，例如(i)蛋白酶活性，較佳為聚集蛋白聚醣與/或膠原蛋白的切割，其中該膠原蛋白較佳為膠原蛋白II；(ii)膠原蛋白結合至類凝血酶結構域(Hemopexin-like domain)。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該多肽抑制ADAMTS5和/或MMP13的蛋白酶活性，較佳為至少5%，例如10%、20%、30%、40%、50%或甚至更高，例如至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高，如本技藝中已知的任何合適的方法所確定的，例如藉由競爭測定或是實例部分所描述的方法。

儘管ADAM、ADAMTS和MMP共享與聚集蛋白聚醣的結合位點，其在序列和整體形狀上非常相似，例如，ADAMTS4和ADAMTS5的催化結構域具有高度的序列相似性，但發明人能夠鑑定ISVD，如實例中所示，是目標特異性的。目標特異性亦避免或至少限制肌肉骨骼症候群(musculoskeletal syndrome)，這是由廣譜抑制劑引起的副作用。

在一態樣，本發明是關於ADAMTS5結合劑，例如本發明的ISVD與多肽，其中該ADAMTS5結合劑不會結合ADAMTS4、ADAMTS1、ADAMTS15、MMP1與/或MMP14 (膜型)。較佳地，本發明是關於本文所定義的多肽，其中結合ADAMTS5的該ISVD不會結合ADAMTS4、MMP1或MMP14。

在一態樣，本發明是關於MMP13結合劑，例如本發明的ISVD與多肽，其中該MMP13結合劑不會結合MMP1與/或MMP14 (膜型)。較佳地，本發明是關於本文所定義的多肽，其中結合MMP13的該ISVD不會結合MMP1或MMP14。

除非另有說明，術語「免疫球蛋白」和「免疫球蛋白序列」-無論是否在本文中用於指重鏈抗體或常規的4-鏈抗體-用作通用術語以包含全長抗體、其各別鏈以及其所有部分、結構域或片段(包含但不限於抗原結合結構域或片段，分別例如V_HH 結構域或V_H /V_L 結構域)。

如本文所用的術語(多肽或蛋白質的)「結構域」是指折疊的蛋白質結構，其具有獨立於蛋白質其餘部分且保留其三級結構的能力。通常，結構域負責蛋白質的離散功能性質，並且在許多情況下可以添加、去除或轉移至其他蛋白質而不喪失蛋白質和/或結構域的其餘部分的功能。

如本文所用的術語「免疫球蛋白結構域」是指抗體鏈的球狀區域(例如，常規4-鏈抗體或重鏈抗體的鏈)，或基本上由這樣的球狀區域組成的多肽。免疫球蛋白結構域的特徵在於它們保留抗體分子的免疫球蛋白折疊特性，其由排列在兩個β-折疊中的約7個反平行β-鏈的兩層夾心組成，任選地藉由保守的二硫鍵穩定。

本文所用的術語「免疫球蛋白可變結構域」是指基本上由四個「框架區域(framework region)」組成的免疫球蛋白結構域，在本技藝和下文中分別稱為「框架區域1」或「FR1」；稱為「框架區域2」或「FR2」；稱為「框架區域3」或「FR3」；以及稱為「框架區域4」或「FR4」；這些框架區域被三個「互補決定區域」或「CDR」中斷，這些區域在本技藝和本文中分別稱為「互補決定區域1」或「CDR1」；稱為「互補決定區域2」或「CDR2」；以及稱為「互補決定區域3」或「CDR3」。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜帶抗原結合位點賦予抗體對抗原的特異性。

術語「免疫球蛋白單可變結構域」(在本文中縮寫為「ISVD」或「ISV」)與「單可變結構域」可互換使用，定義了其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成的分子。這將免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白或其片段區分開，其中兩個免疫球蛋白結構域(特別是兩個可變結構域)相互作用以形成抗原結合位點。通常，在常規免疫球蛋白中，重鏈可變結構域(V_H )和輕鏈可變結構域(V_L )相互作用以形成抗原結合位點。在後一種情況下，V_H 和V_L 的互補決定區域(CDR)將有助於抗原結合位點，亦即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。

鑒於上述定義，常規4-鏈抗體(例如該技藝中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫鍵連結的Fv或scFv片段)或衍生自此常規4-鏈抗體的雙功能抗體(diabody)(皆為該技藝中已知的)的抗原結合結構域通常不會被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，通常不會藉由一個(單個)免疫球蛋白結構域而是藉由一對(相關的)免疫球蛋白結構域(例如輕和重鏈可變結構域)發生與抗原各自表位的結合，亦即藉由免疫球蛋白結構域的V_H -V_L 對，其共同結合個別抗原的表位。

相對地，ISVD能夠特異性結合抗原的表位而不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對。ISVD的結合位點由單個V_HH 、V_H 或V_L 結構域形成。因此，ISVD的抗原結合位點由不超過三個CDR形成。

因此，單可變結構域可為輕鏈可變結構域序列(例如V_L -序列)或其合適的片段；或重鏈可變結構域序列(例如V_H -序列或V_HH 序列)或其合適的片段；只要其可形成單一抗原結合單元(亦即功能性抗原結合單元，其基本上由單可變結構域組成，因而單一抗原結合結構域不需要與另一可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元)。

在本發明的一具體實施例中，ISVD為重鍵可變結構域序列(例如V_H -序列)；更具體而言，ISVD可為衍生自於常規四鏈抗體的重鏈可變結構域序列，或是衍生自於重鏈抗體的重鏈可變結構域序列。

例如，ISVD可為(單)結構域抗體(或是適合作為(單)結構域抗體的胺基酸)、「dAb」或sdAb(或是適合作為dAb的胺基酸)或是奈米體(如本文所定義，並包含但不限於VHH)；其他單可變結構域或其中任何一者的任何合適的片段。

特別地，ISVD可為奈米體®(如本文所定義)或是其合適的片段。[注意：Nanobody®、Nanobodies®與Nanoclone®註冊為Ablynx N.V.的商標。]對於奈米體的一般描述，參考以下的進一步描述，以及本文引用的先前技藝，例如，在WO 08/020079(第16頁)中描述者。

「V_HH 結構域」，也稱為VHH、V_H H結構域，VHH抗體片段和VHH抗體最初被描述為「重鏈抗體」(亦即「沒有輕鏈的抗體」；Hamers-Castermanet al. 1993 Nature 363：446-448)的抗原結合免疫球蛋白(可變)結構域。選擇術語「V_HH 結構域」以區分這些可變結構域與常規4-鏈抗體(本文稱為「V_H 結構域」或「VH結構域」)中存在的重鏈可變結構域和來自存在於常規4-鏈抗體(本文中稱為「V_L 結構域」或「VL結構域」)中的輕鏈可變結構域。關於VHH和奈米體的進一步描述，參考Muyldermans的綜述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302, 2001)，以及作為一般背景技術提及的以下專利申請案：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079與WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/ 40310、WO 01/44301、EP 1134231與WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)的WO 97/ 49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016與WO 03/055527；Algonomics N.V.與Ablynx N.V.的WO 03/050531；National Research Council of Canada的WO 01/90190；the Institute of Antibodies 的WO 03/025020 (= EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/ 041867、WO 04/ 041862、WO 04/041865、WO 04/ 041863、WO 04/ 062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787與WO 06/ 122825以及Ablynx N.V.的其他公開的專利申請案。亦參考這些申請中提到的其他先前技藝，特別是參考國際申請WO 06/040153的第41-43頁提到的參考文獻列表，該列表和參考文獻併入本案作為參考。如這些參考文獻中所述，奈米體(特別是VHH序列和部分人源化的奈米體)尤其可以藉由在一個或多個框架序列中存在一個或多個「標記殘基(Hallmark residue)」來表徵。奈米體的進一步描述，例如可在WO 08/101985和WO 08/142164中找到包含奈米體的人源化和/或駱駝化以及其他修飾、部分或片段、衍生物或「奈米體融合」、多價構築體(包含連接子序列的一些非限制性實例)和不同修飾以增加奈米體的半衰期及其製備。對於奈米體進一步的一般描述，參考本文引用的先前技藝，例如在WO 08/020079(第16頁)所描述的。

特別地，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑中存在的框架序列(framework sequence)，例如本發明的ISVD與/或多肽，可含有一或多個標記殘基(Hallmark residue)(例如WO 08/ 020079(表A-3至A-8)中所描述的)，因而本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13是奈米體(Nanobody)。由本文的進一步揭露內容，這些框架序列的(合適的組合)的一些較佳但非限制性的實例將變得清楚(參閱例如表A-2)。通常，奈米體(特別是V_HH 序列和部分人源化奈米體)尤其可以藉由在一個或多個框架序列中存在一個或多個「標記殘基」來表徵(例如，進一步描述於WO 08/020079，第61頁，第24行至第98頁第3行)。如本文所用，在任何SEQ ID NO的上下文中「由...表示」等同於「包含或由所述SEQ ID NO組成」，並且較佳地等同於「由所述SEQ ID NO組成」。

更特別地，本發明提供聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑包括至少一免疫球蛋白單可變結構域，其為具有(一般)結構的胺基酸序列：其中FR1至FR4分別是指框架區域1至4，以及其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區域1至3，並且　　i) 與SEQ ID NO：2、3或4(參閱表A-1)的至少一個胺基酸序列具有至少80%、更佳為90%，甚至更佳為95%的胺基酸相同性，其中為了確定胺基酸相同性程度，忽略了形成CDR序列的胺基酸殘基。在這態樣，亦參考表A-2，其中列出了SEQ ID NO：2、3和4的免疫球蛋白單可變結構域的框架1序列(SEQ ID NO：7)、框架2序列(SEQ ID NO：9、15和20)、框架3序列(SEQ ID NO：11、17和22)和框架4序列(SEQ ID NO：13)；或　　ii) 表A-2中描述的框架序列的組合；以及其中：　　iii) 較佳地，根據Kabat編號，位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的一個或多個胺基酸殘基係選自標記殘基，例如，如WO 08/020079的表A-3至表A-8中所提及的。

本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑(例如本發明的ISVD與/或多肽)亦可含有以下共同未決的美國臨時申請案中描述的特定突變/胺基酸殘基，皆標題為「改良的免疫球蛋白可變結構域(Improved immunoglobulin variable domains)」：2014年5月16日申請的US 61/994552；2014年6月18日申請的US 61/ 014,015；2014年8月21日申請的US 62/040,167；和2014年9月8日申請的US 62/047,560(皆讓渡給Ablynx N.V.)。

特別地，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑(例如本發明的ISVD與/或多肽)可合適地含有(i)在位置112的K或Q；或(ii)在位置110的K或Q與位置11的V組合；或(iii)在位置89的T；或(iv)在位置89的L與在位置110的K或Q；或(v)在位置11的V和在位置89的L；或(i)至(v)的任何合適的組合。

如在所述共同未決的美國臨時申請案中所述，當本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑(例如本發明的ISVD和/或多肽)含有根據(i)至(v)之一的突變(或其合適的組合)時：　　在位置11的胺基酸殘基較佳為選自L、V或K(且最佳為V)；及/或　　在位置14的胺基酸殘基較佳為合適地選自A或P；及/或　　在位置41的胺基酸殘基較佳為合適地選自A或P；及/或　　在位置89的胺基酸殘基較佳為合適地選自T、V或L；及/或　　在位置108的胺基酸殘基較佳為合適地選自Q或L；及/或　　在位置110的胺基酸殘基較佳為合適地選自T、K或Q；及/或　　在位置112的胺基酸殘基較佳為合適地選自S、K或Q。

如在所述共同未決的美國臨時申請案中所述，所述突變有效地預防或減少所謂的「預先存在的抗體」結合至本發明的免疫球蛋白和化合物。為達此目的，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑(例如本發明的ISVD與/或多肽)亦可含有(任選地結合該突變)C-端延伸(X)n(其中n為1至10，較佳為1至5，例如1、2、3、4或5)(並且較佳為1或2，例如1)；以及各個X為(較佳為天然存在的)胺基酸殘基，這是獨立選擇的且較佳獨立地選自由丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)或異白胺酸(I)組成的群組，參閱例如美國臨時申請以及WO 12/175741。特別地，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑(例如本發明的ISVD與/或多肽)當其形成蛋白質、多肽或其他化合物或包括其之構築體的C終端時，可含有C-端延伸(參閱例如美國臨時申請以及WO 12/175741)。

本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑可為以任何合適的方法且由任何合適得來源所得到的免疫球蛋白，例如免疫球蛋白單可變結構域，並且例如可為天然存在的V_HH 序列(亦即衍生自駱駝科之合適的物種)或是合成的或半合成的胺基酸序列，包含但不限於「人類化的」(如本文所定義的)奈米體或VHH序列，「駱駝化的」(如本文所定義的)免疫球蛋白序列(以及特別駱駝化的重鏈可變結構域序列)，以及已由例如親和力成熟(例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始)、CDR移植、鑲飾、組合來自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引子的PCR組裝，以及技術人士熟知的用於工程化免疫球蛋白序列的類似技術等技術獲得的奈米體；或如本文進一步描述的任何前述的任何合適組合。再者，當免疫球蛋白包括V_HH 序列時，該免疫球蛋白可為合適地人類化，如本文進一步所述，以提供一種或多種本發明的其他(部分或完全)人類化的免疫球蛋白。同樣地，當免疫球蛋白包括合成的或半合成的序列(例如部分人類化的序列)時，該免疫球蛋白可任選地被進一步合適地人類化，同樣地如本文所述，同樣地以提供一種或多種本發明的其他(部分或完全)人類化的免疫球蛋白。

「結構域抗體」，也稱為「Dab」和「dAbs」(術語「結構域抗體」和「dAbs」被GlaxoSmithKline公司集團用作商標)已在例如Ward等人的EP 0368684(Nature 341：544-546,1989)、Holt等人(Tends in Biotechnology 21：484-490,2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公開的專利申請案中描述。結構域抗體基本上相當於非駱駝化的哺乳動物之VH或VL，特別是人類4-鏈抗體。為了結合表位作為單抗原結合結構物，亦即分別未與V_L 或V_H 結構域配對，需要對這種抗原結合性質進行特異性選擇，例如，藉由使用人類單V_H 或V_L 結構域序列庫。與V_HH 一樣，結構域抗體具有約13至約16kDa的分子量，並且如果完全衍生自人類序列，則不需要人類化，例如用於人體治療。

亦應注意，雖然在本發明的上下文中因為它們不是哺乳動物來源而非較佳，但是單可變結構域可以衍生自某些種類的鯊魚(例如，所謂的「IgNAR結構域」，參閱例如WO 05/18629)。

本發明特別關於ISVD，其中該ISVD係選自由VHH、人類化得VHH與駱駝化的VH組成的群組。

根據Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」，US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)給出的V_H 結構域的一般編號，將VHH結構域的胺基酸殘基進行編號，如應用於來自駱駝科動物的VHH結構域，如例如Riechmann和Muyldermans(J.Immunol. Methods 231：25-38,1999)的圖2所示，均為本技藝已知的。用於編碼V_H 結構域的胺基酸殘基的其他方法，該等方法也可以以類似的方式應用於VHH結構域，是本技藝已知的。然而，在本說明書、申請專利範圍與圖式中，除非另有說明，否則將依照如上所述之根據Kabat應用於VHH結構域的編號。

應注意-如本技藝眾所周知的V_H 結構域和VHH結構域-每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可以不對應於由Kabat編號所示的胺基酸殘基的總數(亦即，根據Kabat編號的一個或多個位置可能不會在實際序列中被佔用，或者實際序列可能含有比Kabat編號允許的數量更多的胺基酸殘基)。這是指通常，根據Kabat的編號可能或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。VH結構域和VHH結構域中胺基酸殘基的總數將通常在110至120的範圍中，通常在112至115之間。然而，應該注意，更小和更長的序列也可適用於本文所述的目的。

關於CDR，如本領域眾所周知的，有多種慣例定義和描述VH或VHH片段的CDR，例如Kabat定義(其基於序列可變性並且是最常用的)以及Chothia定義(其基於結構環區域的位置)。例如，參考網址http：//www.bioinf. org.uk/abs/。出於本說明書和申請專利範圍的目的，CDR最佳是基於Abm定義(其基於Oxford Molecular的AbM抗體模型軟體)來定義，因為這被認為是Kabat和Chothia定義之間的最佳折衷(參閱http：//www.bioinf.org.uk/abs/)。如本文所用，FR1包括位置1-25的胺基酸殘基，CDR1包括位置26-35的胺基酸殘基，FR2包括位置36-49的胺基酸，CDR2包括位置50-58的胺基酸殘基，FR3包括位置59-94的胺基酸殘基，CDR3包括位置95-102的胺基酸殘基，以及FR4包括位置103-113的胺基酸殘基。

在本發明的含義中，術語「免疫球蛋白單可變結構域」或「單可變結構域」包括衍生自非人類來源的多肽，較佳為駱駝科，較佳為駱駝科重鏈抗體。它們可以是人類化的，如本文所述。再者，該術語包括衍生自非駱駝科來源的多肽，例如本文所述之已經「駱駝化」的小鼠或人。

因此，ISVD(例如結構域抗體與奈米體(包含VHH結構域))可進行人類化(humanization)。特別地，人類化的ISVD(例如奈米體(包含VHH結構域))可為ISVD，其通常如本文所定義的，但其中存在至少一個胺基酸殘基(並且特別是在至少一個框架殘基中)，其是和/或對應於人類化取代(如本文所定義)。藉由比較天然存在的V_HH 序列的框架區域的序列與一個或多個密切相關的人類V_H 序列的相應框架序列，可確定潛在有用的人類化取代，之後如此確定的一或多個潛在有用的人類化取代(或其組合)可被引入所述V_HH 序列(以本身已知的任何方式，如本文進一步描述的)，並且可測試所得的人類化V_HH 序列對標的之親和力、穩定性、易於表現與表現量和/或其他所欲之性質。以此種方式，藉由有限程度的試驗和錯誤，技術人士可基於本文的揭露內容而確定其他合適的人類化取代(或其合適的組合)。再者，基於前述內容，ISVD(的框架區域)，例如奈米體(包含VHH結構域)可為部分人類化的或完全人類化的。

本發明之另一特別較佳ISVD種類包括具有胺基酸序列(其對應於天然存在的V_H 結構域之胺基酸序列)的ISVD，但其已經被「駱駝化(camelized)」，亦即藉由將常規4-鏈抗體的天然存在的V_H 結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基替換為發生在重鏈抗體之V_HH 結構域的相應位置上一個或多個胺基酸殘基。這可用本身已知的方式進行，這對於本領域技術人士來說是清楚的，例如基於本文的描述。此「駱駝化」取代較佳插入在形成和/或存在於V_H -V_L 界面的胺基酸位置，以及/或插入在所謂的駱駝科標記殘基處，如本文所定義(亦參閱例如WO 94/04678以及Davies與Riechmann (1994 and 1996))。較佳地，用作產生或設計駱駝化免疫球蛋白單可變結構域的起始材料或起始點之V_H 序列較佳是來自哺乳動物的V_H 序列，更佳是人類的V_H 序列，例如V_H 3序列。然而，應注意，本發明之此駱駝化免疫球蛋白單可變結構域可用本身已知的任何合適方式獲得，因而不嚴格受限於使用包括天然存在的V_H 結構域作為起始材料的多肽所獲得的多肽。參考Davies和Riechmann (FEBS 339：285-290, 1994；Biotechnol. 13：475-479, 1995；Prot. Eng. 9：531-537, 1996)以及Riechmann和Muyldermans (J. Immunol. Methods 231：25-38, 1999)。

例如，再次如本文進一步描述的，「人類化」和「駱駝化」皆可以藉由提供分別編碼天然存在的V_HH 結構域或V_H 結構域的核苷酸序列，而後以本身已知的方式改變一個或多個密碼子而進行，以這種方式使得新核苷酸序列分別編碼本發明的「人類化」或「駱駝化」ISVD。而後可用本身已知的方式表現該核酸，以提供本發明之所欲的ISVD。或者，分別基於天然存在的V_HH 結構域或V_H 結構域的胺基酸序列，可以分別設計本發明之所欲的人類化或駱駝化ISVD的胺基酸序列，而後使用本身已知的肽合成技術從頭開始合成。再者，基於天然存在的V_HH 結構域或V_H 結構域的胺基酸序列或核苷酸序列，可分別設計編碼本發明所欲之人類化或駱駝化ISVD的核苷酸序列，然後使用本身已知的核酸合成技術而從頭開始合成，之後可用本身已知的方式表現由此獲得的核酸，以提供本發明所欲之ISVD。

可以藉由在一或多個CDR的胺基酸序列中引入一或多個改變而對ISVD(例如結構域抗體和奈米體(包括VHH結構域和人類化VHH結構域))也進行親和力成熟(affinity maturation)，與各自的母體分子(parent molecule)相比，這些改變導致所得的ISVD對其各自抗原有改善的親和力。本發明之親和力成熟的ISVD分子可以藉由本技藝已知的方法製備，例如，如Marks等人(Biotechnology 10：779-783, 1992)、Barbas等人(Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91：3809-3813, 1994)、Shier等人(Gene 169：147-155, 1995)、Yelton等人(Immunol. 155：1994-2004, 1995)、Jackson等人(J. Immunol. 154：3310-9, 1995)、Hawkins等人(J. MoI. Biol. 226：889 896, 1992)、Johnson與Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)所述。

從ISVD(例如V_H 、V_L 、V_HH 、結構域抗體或奈米體)開始設計/選擇和/或製備多肽的過程在本文中也稱為「格式化」所述ISVD；並且作為多肽之一部分的ISVD被稱為「格式化的」多肽或是「於格式化的」多肽。基於本文的揭露內容，技術人士將清楚可將ISVD格式化的方法實例以及此格式化的實例；以及此格式化的免疫球蛋白單可變結構域形成了本發明的另一態樣。

較佳的CDR如表A-2所描述。

特別地，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的MMP13，其中　　(i) CDR1是SEQ ID NO：8；以及與SEQ ID NO：8具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；　　(ii) CDR2是SEQ ID NO：10；以及與SEQ ID NO：10具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；以及　　(iii) CDR3是SEQ ID NO：12；以及與SEQ ID NO：12具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列。

特別地，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的MMP13，其中CDR1是SEQ ID NO：8，CDR2是SEQ ID NO：10以及CDR3是SEQ ID NO：12。

特別地，本發明是關於如本文所述之ISVD，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的ADAMTS5，其中　　(i) CDR1是SEQ ID NO：14 [GRTVSSYAMG]；以及與SEQ ID NO：14具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；　　(ii) CDR2是SEQ ID NO：16 [GISRSAERTY]；以及與SEQ ID NO：16具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；以及　　(iii) CDR3是SEQ ID NO：18 [DLDPNRIFSREEYAY]；以及與SEQ ID NO：18具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列。

特別地，本發明是關於如本文所述之ISVD，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的ADAMTS5，其中CDR1是SEQ ID NO：14，CDR2是SEQ ID NO：16以及CDR3是SEQ ID NO：18。

特別地，本發明是關於如本文所述之ISVD，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的聚集蛋白聚醣，其中　　(i) CDR1是SEQ ID NO：19；以及與SEQ ID NO：19具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；　　(ii) CDR2是SEQ ID NO：21；；以及與SEQ ID NO：21具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列；以及　　(iii) CDR3是SEQ ID NO：23；以及與SEQ ID NO：23具有1、2或3個胺基酸差異的胺基酸序列。

特別地，本發明是關於如本文所述之ISVD，其中該ISVD特異性結合基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)組成的聚集蛋白聚醣，其中CDR1是SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21，以及CDR3是SEQ ID NO：23。

特別地，本發明是關於如本文所述之多肽，其中特異性結合MMP13的該ISVD是SEQ ID NO：2。

特別地，本發明是關於如本文所述之多肽，其中特異性結合ADAMTS5的該ISVD是SEQ ID NO：3。

特別地，本發明是關於如本文所述之多肽，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD是SEQ ID NO：4。

在另一較佳具體實施例中，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5與/或MMP13結合劑包括至少兩個CDR1序列，至少兩個CDR2序列以及至少兩個CDR3序列，各自獨立選自於下表：

在上述聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑中，序列的順序較佳為CDR1a-CDR2a-CDR3a-連接子-CDR1b-CDR2b-CDR3b，其中連接子是長於5個胺基酸的多肽，適合將第一組CDR(CDR1a-CDR2a-CDR3a)連接至第二組(CDR1b-CDR2b-CDR3b)。較佳地，連接子是選自於以下表C，並且連接子最佳是具有根據SEQ ID NO：35的胺基酸序列。在較佳具體實施例中，聚集蛋白聚醣、ADAMTS5和/或MMP13結合劑包括來自上表的所有九個CDR序列，其中CDR序列和連接子多肽具有以下順序：CDR1a-CDR2a-CDR3a-連接子1-CDR1b-CDR2b-CDR3b-連接子2-CDR1c-CDR2c-CDR3c，其中連接子1和連接子2各自為至少5個胺基酸的多肽，並且其中連接子1和連接子2的多肽序列彼此相同或彼此不相同。較佳地，連接子1和連接子2各自彼此獨立選自下表C，並且最佳地，該等連接子至少一個(較佳為兩個)具有根據SEQ ID NO：35的胺基酸序列。

在另一較佳具體實施例中，本發明的聚集蛋白聚醣、ADAMTS5與/或MMP13結合劑較佳地包括至少下表所列的CDR序列：

在前述具體實施例中，CDR序列的順序可為CDR1a-CDR2a-CDR3a-連接子1-CDR1b-CDR2b-CDR3b-連接子2-CDR1c-CDR2c-CDR3c-連接子3-CDR1d-CDR2d-CDR3d；其中連接子1、連接子2和連接子3各自為至少5個胺基酸的多肽，並且其中連接子1、連接子2和連接子3的多肽序列彼此相同或彼此不同。較佳地，連接子1、連接子2和連接子3彼此獨立地選自下表C，並且最佳地，至少一個(較佳為全部三個)連接子具有根據SEQ ID NO：35的胺基酸序列。應當理解，在上述兩個表的上下文中概述的較佳具體實施例中，CDR序列可以通過本文其他地方描述的框架序列而彼此連接，並且較佳地，表A-2中揭露的那些框架序列可以使用在這態樣。應當理解，但非限制，本發明的免疫球蛋白單可變結構域可用作製備多肽的「建立單元(builing block)」，其可以任選地含有一或多個可作為建立單元之其他免疫球蛋白單可變結構域。

本技藝需要更有效的治療方法來治療影響關節軟骨的疾病，例如骨關節炎。即使在關節內投予時，用於治療受影響的軟骨的大多數藥物停留時間(residence time)是不足夠的。不受理論束縛，本案發明人假設治療藥物(例如本發明的構築體、多肽和ISVD)的功效可以藉由將治療藥物耦合至關節中將「錨定(anchor)」藥物的部分來調節，因此增加藥物的保留(retention)，但不應破壞所述治療藥物的功效(此部分在本文中也表示為「軟骨錨定蛋白(cartilage anchoring protein)」或「CAP」)。這種錨定概念不僅可以藉由降低毒性和副作用來調節藥物的功效，還可以調節患病關節的操作特異性，從而擴大可能有用的藥物之數量。

預期用於臨床使用的分子的形式包括一個或兩個建立單元(building block)(例如ISVD，結合MMP13和/或ADAMTS5)，以及具有這種保留作用模式的一個或多個建立單元(例如ISVD)，以及可能的其他部分。在本發明中證實這種形式保留MMP13和/或ADAMTS5結合和治療效果，例如，抑制活性以及保留性質(retention property)。具有保留作用模式的一或多個建立單元(例如ISVD)可為在MMP13和/或ADAMTS5涉及的疾病(例如關節炎疾病、骨關節炎、脊柱上頜骨發育不良、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、類風濕性關節炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病)中具有保留效應(「CAP建立單元」)的任何建立單元。

「CAP建立單元」用於引導、錨定和/或保留其他(例如治療性)建立單元，例如在期望的位點(例如在關節中)結合MMP13和/或ADAMTS5的ISVD，其中所述其他(例如治療性)建立單元是發揮其作用，例如結合和/或抑制MMP13和/或ADAMTS5。

再次不受理論束縛，本案發明人進一步假設儘管聚集蛋白聚醣在影響關節軟骨的各種病症中被高度糖基化並降解，聚集蛋白聚醣結合劑(例如結合聚集蛋白聚醣的ISVD)可能潛在地具有錨定功能。再者，鑑於在藥物可以進入臨床之前所需的各種動物模型中的成本和廣泛測試，這種聚集蛋白聚醣結合劑應優先具有廣泛的交叉反應性，例如，聚集蛋白聚醣結合劑應該與各種物種的聚集蛋白聚醣結合。

使用各種巧妙的免疫、篩选和定性方法，本案發明人能夠鑑定具有優異選擇性、穩定性和特異性特徵的各種聚集蛋白聚醣結合劑，這使得能夠在關節中延長保留與活性。

在一態樣，本發明是關於減少和/或抑制組成物、多肽或構築體從關節外流的方法，其中該方法包括投予醫藥活性量之至少一本發明的多肽、根據本發明的構築體或根據本發明的組成物至有需要的人。

在本發明中，術語「降低和/或抑制外流」是指降低和/或抑制組成物、多肽或構築體從關節內向外流出至外部。較佳地，相較於在相同條件下但沒有本發明的聚集蛋白聚醣結合劑(例如結合聚集蛋白聚醣的ISVD)下在關節中前述組成物、多肽或構築體的外流，外流被減少和/或抑制至少10%，例如至少20%、30%、40%或50%或甚至更多，例如至少60%、70%、80%、90%或甚至100%。

接著MMP13和/或ADAMTS5涉及涉及的疾病(例如關節炎疾病、骨關節炎、脊柱頜骨發育不良、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、類風濕性關節炎、剝脫性骨軟骨炎和聚集性疾病，預期本發明的聚集蛋白聚醣粘合劑也可用於影響軟骨的各種其他疾病)，預期本發明的聚集蛋白聚醣結合劑也可用於影響軟骨的各種其他疾病，例如關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病(如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離)、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病和復發性多軟骨炎(在本文中通常表示為「聚集蛋白聚醣相關疾病」)。

所述CAP建立單元，例如 ISVD結合聚集蛋白聚醣，較佳地結合至軟骨組織(如軟骨和/或半月板)。在一較佳態樣，CAP建立單元對於其他物種是交叉反應性的並且特異性結合人類聚集蛋白聚醣(SEQ ID NO：68)、狗聚集蛋白聚醣、牛聚集蛋白聚醣、大鼠聚集蛋白聚醣中的一或多種；豬聚集蛋白聚醣；小鼠聚集蛋白聚醣、兔聚集蛋白聚醣；食蟹猴聚集蛋白聚醣和/或恒河猴聚集蛋白聚醣。例如在(UniProt)存取號中可以找到聚集蛋白聚醣的相關結構資訊，如上表B-3中所述。

較佳的CAP建立單元是結合聚集蛋白聚醣(較佳為人類聚集蛋白聚醣，較佳為如表B所示之由SEQ ID NO：68表示的聚集蛋白聚醣)的ISVD。

因此，本發明涉及根據本發明的多肽或構築體，其另包括至少一個CAP建立單元。

因此，本發明涉及根據本發明的多肽或構築體，其另包括至少一種特異性結合聚集蛋白聚醣的ISVD，較佳地該ISVD是由SEQ ID NO：4表示。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其包括特異性結合聚集蛋白聚醣的至少2種ISVD。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其包括特異性結合聚集蛋白聚醣的至少2種ISVD，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該至少2種ISVD可為相同或是不同。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其包括特異性結合聚集蛋白聚醣的至少2種ISVD，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該至少2種ISVD是由SEQ ID NO：4表示。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其包括特異性結合聚集蛋白聚醣的ISVD，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD特異性結合至人類聚集蛋白聚醣[SEQ ID NO：68]。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD特異性結至人類聚集蛋白聚醣(SEQ ID NO：68)、狗聚集蛋白聚醣、牛聚集蛋白聚醣、大鼠聚集蛋白聚醣、豬聚集蛋白聚醣、小鼠聚集蛋白聚醣、兔聚集蛋白聚醣、食蟹猴聚集蛋白聚醣、與/或恒河猴聚集蛋白聚醣)。

在一態樣，本發明是關於本文所述之多肽，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD較佳結合至軟骨組織，如軟骨和/或半月板。

應理解，本發明的ISVD、多肽和構築體較佳是穩定的。可藉由本技藝技術人士已知的常規測定來測量本發明的多肽，構建體或ISVD的穩定性。典型的測定包括(不限制)測定，其中測定該多肽、構築體或ISVD的活性，而後在滑液(synovial fluid)中培養所欲之一段時間，而後再次測定活性。

在一態樣，本發明是關於本發明之ISVD、多肽或構築體，其具有在37℃下於滑液(SF)中具有至少7天(例如至少14天、21天、1個月、2個月或甚至3個月)的穩定性。

可通過本技藝技術人士已知的常規測定來測量治療建立單元的所需活性(例如，本發明的多價多肽或構築體中之結合MMP13和/或ADAMTS5的ISVD)。典型的測定包含(不限制)GAG釋放測定，如實例部分中所詳述。

本發明的多肽(在本文亦表示為「奈米體構築體(Nanobody construct)」)係選自於由以下所組成的群組：　　(a) 包括至少2種免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)的多肽，包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第一ISVD以及特異性結合基質金屬蛋白酶(MMP)的第二ISVD；　　(b) 包括至少2種ISVD的多肽，包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第一ISVD以及特異性結合A去整合素和金屬蛋白酶與血小板反應蛋白模體(Thrombospondin motif)(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs，ADAMTS)的第二ISVD；以及　　(c) 包括至少3種ISVD的多肽，包括特異性結合聚集蛋白聚醣的第一ISVD、特異性結構ADAMTS的第二ISVD以及特異性結合MMP的第三ISVD。

在本發明的多肽中，ISVD可直接連接或經由連接子而連接。甚至更特別地，本發明的多肽包括C-端延伸。如本文將詳述的，C-端延伸基本上防止/去除了人類個體/病患的大多數樣品中預先存在的抗體/因子之結合。C-端延伸是存在於最後一個(大多數位在C-端的)ISVD的最後一個胺基酸殘基(通常是絲胺酸殘基)的C-端。

如下文進一步詳述，ISVD可以衍生自V_HH 、V_H 或V_L 結構域，然而，選擇ISVD使得它們不在本發明的多肽中形成V_H 和V_L 結構域的互補對。奈米體、V_HH 和人類化的V_HH 是不尋常的，因為它們衍生自不具有輕鏈的天然駱駝科動物抗體，並且實際上這些結構域不能與駱駝科輕鏈結合以形成互補的V_HH 和V_L 對。因此，本發明的多肽不包括互補的ISVD和/或形成互補的ISVD對，例如互補的V_H /V_L 對。

通常，包括單個建立單元、單個ISVD或單個奈米體或基本上由單個建立單元、單個ISVD或單個奈米體組成的多肽或構築體將分別稱為「單價」多肽和「單價」構築體。包括兩個或更多個建立單元(例如ISVD)的多肽或構築體亦將稱為「多價」多肽或構築體，以及存在此多肽或構築體的建立單元/ISVD在本文中亦將稱為「多價形式(multivalent format)」。例如，「二價」多肽可包括兩個ISVD，任選地經由連接子序列而連接，而「三價」多肽可包括三個ISVD，任選地經由兩個連接子序列而連接；而「四價」多肽可包括四個ISVD，任選地經由三個連接子序列而連接等等。

在多價多肽中，該兩個或更多個ISVD可為相同或是不同，並且可針對相同的抗原或是抗原決定位(例如針對相同部分或表位，或是針對不同部位或表位)或是可針對不同的抗原或抗原決定位；或是其任何合適的組合，例如針對聚集蛋白聚醣。含有至少兩個建立單元(例如ISVD)的多肽與構築體將亦稱為「多特異性(multispecific)」多肽與構築體，其中至少一建立單元是針對第一抗原(例如聚集蛋白聚醣)且至少一建立單元是針對第二抗原(例如不同於聚集蛋白聚醣，例如針對ADAMTS5)，以及存在於此多肽與構築體中的建立單元(例如ISVD)在本文中將亦稱為「多特異性形式(multispecific format)」。因此，例如本發明的雙特異性(bispecific)多肽是包括針對第一抗原(例如聚集蛋白聚醣)的至少一ISVD與針對第二抗原(亦即例如不同於聚集蛋白聚醣，例如針對ADAMTS5)的至少一另一ISVD之多肽，而本發明的三特異性(trispecific)多肽是包括針對第一抗原(例如聚集蛋白聚醣)的至少一ISVD、針對第二抗原(亦即例如不同於聚集蛋白聚醣，例如針對ADAMTS5)的至少一另一ISVD之多肽與針對第三抗原(亦即不同於聚集蛋白聚醣與ADAMTS5，例如針對MMP)的至少另一ISVD等等。

在一態樣，本發明是關於一種多肽，其包括至少2種ISVD，其中至少一ISVD特異性結合MMP，較佳為MMP13，更佳為該一ISVD是由SEQ ID NO：2胺基酸序列表示。

在一態樣，本發明是關於一種多肽，其包括至少2種ISVD，其中至少一ISVD特異性結合ADAMTS，較佳為ADAMTS5，更佳為該一ISVD是由SEQ ID NO：3胺基酸序列表示。

在一態樣，本發明是關於一種多肽，其包括至少2種ISVD，其中至少一ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣，較佳該一ISVD是由SEQ ID NO：4胺基酸序列表示。

「多互補位(Multiparatopic)」多肽與「多互補位(Multiparatopic)」構築體(例如「雙互補位」多肽或構築體以及「三互補位」多肽或構築體包括兩個或多個建立單元或基本上由兩個或多個建立單元組成，其各自具有不同的互補位(paratope)。

本發明的一或多個ISVD可作為此多肽或構築體中的建立單元，以分別提供本發明之單價、多價或多互補位的多肽或構築體，皆如本文中所述。

因此，本發明亦關於多肽與構築體，其分別為多價多肽或多價構築體，例如雙價或三價多肽或構築體，其包括本發明之兩種或更多種的ISVD或基本上由本發明之兩種或更多種的ISVD組成(關於含有一或多種VHH結構域的多價與多特異性多肽及其製備，亦參考Conrath等人(J. Biol. Chem. 276：7346-7350, 2001)以及例如WO 96/34103, WO 99/23221與WO 2010/115998)。

在另一態樣，本發明的多價多肽或構築體可為本發明之雙特異性多肽或構築體，其包括針對聚集蛋白聚醣的第一ISVD(例如奈米體)，以及針對第二抗原(例如ADAMTS5或MMP13)的第二ISVD(例如奈米體)，其中該第一與第二ISVD(例如奈米體)可任選地經由連接子序列(如本文所定義)而連接；而本發明的多價多肽或構築體亦可為本發明之三特異性多肽或構築體，其包括針對ADAMTS5的第一ISVD(例如奈米體)、針對第二抗原(例如聚集蛋白聚醣)的第二ISVD(例如奈米體)，以及針對第三抗原(例如MMP13)的第三ISVD(例如奈米體)，其中該第一、第二與第三ISVD(例如奈米體)可任選地經由一或多個且特別是兩個連接子序列而連接。

本發明另關於一種多價多肽，其包括或(基本上)由結合ADAMTS5(較佳為人類ADAMTS5)的至少一ISVD(或其合適的片段)以及一額外的ISVD(例如結合聚集蛋白聚醣的ISVD)組成。

根據本發明特別較佳的雙價、雙特異性多肽或構築體及四價、三特異性多肽或構築體是本文所述與表A-1 (例如SEQ ID NO：1、5、6、62、63或64)中所述之實例中所示的那些。

存在本發明之多價多肽或構築體中的二或更多種ISVD可由輕鏈可變結構域序列(例如V_L -序列)或是重鏈可變結構域序列(例如V_H -序列)組成；它們可由重鏈可變結構域序列(其衍生自常規四鏈抗體)組成或是由重鏈可變結構域序列(其衍生自重鏈抗體)組成。在一較佳態樣，它們由結構域抗體(或適合作為結構域抗體的胺基酸)、單結構域抗體(或適合作為單結構域抗體的胺基酸)、「dAb」(或適合作為dAb的胺基酸)、Nanobody®(包含但不限於V_HH )、人類化V_HH 序列、駱駝化V_H 序列；或已由親和力成熟而獲得的V_HH 序列組成。該二或更多種免疫球蛋白單可變結構域可由部分或完全人類化奈米體或是部分或完全人類化VHH組成。

在特別較佳態樣，本發明的多肽或構築體包括或由四或更多種ISVD組成，其中至少兩種ISVD是針對聚集蛋白聚醣。應當理解，該針對聚集蛋白聚醣的至少兩種ISVD可相同或不同，可針對聚集蛋白聚醣的相同表位或不同表位，可屬於相同的表位區(epitope bin)或不同表位區，及/或可結合至聚集蛋白聚醣的相同或不同結構域。

相對親和力可取決於多肽中的ISVD之位置。應理解可根據該技藝技術人士之需要而選擇本發明之多肽中的ISVD順序(位向，orientation)。各個ISVD的順序以及多肽是否包括連接子是設計選擇的問題。與其他位向(orientation)相比，具有或不具有連接子的一些位向可提供較佳的結合特徵。例如，在本發明的多肽中，第一ISVD(例如ISVD 1)與第二ISVD(例如ISVD 2)的順序(從N端至C端)：(i) ISVD 1 (例如奈米體1)- [連接子]- ISVD 2 (例如奈米體2)- [C-端延伸]；(ii) ISVD 2 (例如奈米體2)- [連接子]- ISVD 1 (例如奈米體1)- [C-端延伸]；(其中方框之間的部分(亦即連接子與C端延伸)是任選的)。所有位向都包含在本發明中。可藉常規篩選(例如實例部分所例示的)而輕易鑑定含有ISVD(其提供所欲之結合特性)之位向的多肽。

在較佳的順序中，結合聚集蛋白聚醣的ISVD是位在多肽的C端側。特別較佳的順序由N端至C端：結合ADAMTS5的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，或結合MMP13的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，其中方框之間的部分是任選的。另一特別較佳的順序是從N端至C端：結合ADAMTS5的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，或是結合MMP13的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，其中方框之間的部分是任選的。例如，較佳的順序是從N端至C端：結合MMP13的ISVD- [連接子]-結合ADAMTS5的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，其中方框之間的部分是任選的。例如，特別較佳的順序是從N端至C端：結合MMP13的ISVD- [連接子]-結合ADAMTS5的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [連接子]-結合聚集蛋白聚醣的ISVD- [C-端延伸]，其中方框之間的部分是任選的。

在另一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其中該多肽與SEQ ID NO：1、5、6、62、63或64中的任一者具有至少80%、90%、95%或100%的序列相同性。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：1 (ALX-1011)、SEQ ID NO：5 (MMP13-CAP-CAP)，以及SEQ ID NO：6 (ATS5-CAP-CAP)、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63與SEQ ID NO：64。

在本發明的特定態樣，與不含該部分之本發明的相應構築體或多肽相比，本發明的構築體或多肽可具有賦予增加的半衰期的部分。基於本文的進一步揭露內容，本發明的此類構築體和多肽的一些較佳但非限制性實例對於本技藝技術人士將變得清楚，並且例如包括已經化學修飾以增加其半衰期(例如藉由聚乙二醇化(pegylation))之本發明的ISVD或多肽；包括至少一額外結合位點以結合血清蛋白質(例如血清白蛋白)之本發明的多肽或構築體；或本發明之多肽，其包括本發明的至少一ISVD，其連接到至少一部分(並且特別是至少一胺基酸序列)，其增加本發明之胺基酸序列的半衰期。基於本文的進一步揭露內容，本發明的構築體以及包含此半衰期延長部分或ISVD之本發明的多肽的實例對於技術人士而言將變得清楚；以及例如包含多肽(但不限於此)，其中本發明的一種或多種ISVD適當地連接至一種或多種血清蛋白質或其片段(例如(人類)血清白蛋白或其合適的片段)或是連接至一或多個結合單元，其可結合至血清蛋白質(例如，結構域抗體、適合作為結構域抗體的免疫球蛋白單可變結構域、單結構域抗體、適合作為結構域抗體的ISVD、dAb、適合作為dAb的ISVD、或可結合至血清蛋白質(例如血清白蛋白(例如人類血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(例如IgG)或運鐵蛋白(transferrin))的奈米體，參考本文提及的進一步描述和參考文獻)；多肽，其中本發明的胺基酸序列連接至Fc部分(例如人類Fc)或合適部分或其片段；或多肽，其中本發明之一或多個免疫球蛋白單可變結構域適合連接至一或多個小蛋白質或胜肽，其可結合至血清蛋白質，例如WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/ 068280、WO2009/127691及PCT/EP2011/051559中所描述的蛋白質與胜肽。

在一態樣，本發明提供本發明的多肽與構築體，其中該構築體或該多肽另包括血清蛋白質結合部分或血清蛋白質。較佳地，該血清蛋白質結合部分結合血清白蛋白，例如人類血清白蛋白。

在一態樣，本發明是關於如本文所述之多肽，其包括結合血清白蛋白的ISVD。

通常，相較於本發明的相應構築體或多肽本身的半衰期(亦即沒有賦予增加的半衰期的部分)，本發明之具有增加的半衰期的構築體或多肽較佳具有至少1.5倍、較佳為至少2倍(例如至少5倍，例如至少10倍或超過20倍)的半衰期。例如，相較於本發明的相應構築體或多肽本身的半衰期(亦即沒有賦予增加的半衰期的部分)，本發明之具有增加的半衰期的構築體或多肽可具有半衰期，例如在人類為增加超過1小時，較佳為超過2小時，更佳為超過6小時，例如超過12小時或甚至超過24、48或72小時。

在本發明的較佳態樣，相較於本發明的相應構築體或多肽本身(亦即沒有賦予增加的半衰期的部分)，本發明的構築體與本發明的多肽具有血清半衰期，例如在人類為增加超過1小時，較佳為超過2小時，更較佳為超過6小時，例如超過12小時，或甚至超過24、48或72小時。

在本發明的另一較佳態樣，本發明之此構築體與多肽在人類展現血清半衰期至少約12小時，較佳為至少24小時，更佳為至少48小時，甚至更佳為至少72小時或更久。例如，本發明的構築體或多肽可具有半衰期為至少5天(例如約5至10天)，較佳為至少9天(例如約9至14天)，更佳為至少約10天(例如約10至15天)，或至少約11天(例如約11至16天)，更較佳為至少約12天(例如約12至18天或更久)，或超過14天(例如約14至19天)。

在本發明的特定較佳態樣，本發明提供本發明之構築體與本發明之多肽，其除了結合聚集蛋白聚醣的一或多個建立單元和結合ADAMTS5和/或MMP13的一或多個建立單元之外，還包括結合血清白蛋白的至少一建立單元，例如結合血清白蛋白(如本文所述的人血清白蛋白)的ISVD。較佳地，結合血清白蛋白的該ISVD包括或基本上由四個框架區域(分別為FR1至FR4)組成與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)，其中CDR1是SFGMS、CDR2是SISGSGSDTLYADSVKG以及CDR3是GGSLSR。較佳地，結合人類血清白蛋白的該ISVD是選自於由以下所組成的群組：Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11 (S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG、Alb92或Alb223 (參閱表D)。

在一具體實施例中，本發明是關於本發明的構築體，例如包括血清蛋白質結合部分的多肽，其中該血清蛋白質結合部分是基於非抗體的多肽。

在一態樣，本發明是關於本文所述之構築體，其包括至少一ISVD或多肽以及一或多個其他的基團、殘基、部分或建立單元。該一或多個其他的基團、殘基、部分或建立單元較佳係選自於由以下所組成的群組：聚乙二醇分子、血清蛋白質或其片段、可結合血清蛋白質的結合單位、Fc部分、以及可結合血清蛋白質、其他胺基酸殘基、標籤或其他功能部分(例如毒素、標記、放射性化學物質等)的小蛋白質或胜肽。

在具體實施例中，如下所述，本發明是關於本發明的構築體，例如包括賦予半衰期延長的部分之多肽，其中該部分是PEG。因此，本發明亦是關於包括PEG之本發明的構築體或多肽。

其他胺基酸殘基可或可不變化、改變或以其他方式影響本發明的多肽之其他(生物學)性質，並且可或可不向本發明的多肽添加其他功能。例如，該等胺基酸殘基：　　a) 可包括N端Met殘基，例如在異源(heterologous)宿主細胞或宿主生物中表現的結果；　　b) 可形成訊號序列或前導序列，其在合成時引導多肽從宿主細胞的分泌(例如，取決於用以表現本發明的多肽之宿主細胞，而提供本案的多肽之預-、前-、或預前-形式)。合適的分泌前導胜肽對於技術人士來說是清楚的，並且可以如本文進一步描述的。通常，這種前導序列將與多肽的N-端連接，儘管本發明在其最廣泛的意義上不限於此；　　c) 可形成「標籤(tag)」，例如允許或促進多肽純化的胺基酸序列或殘基，例如使用針對該序列或殘基的親和力技術。而後，可移除該序列或殘基(例如藉由化學或酵素切割)以提供多肽(為達此目的，該標記可經由可切割的連接子序列而任選地連接至胺基酸序列或多肽序列或包含可切割的部分)。此等殘基的一些較佳但非限制性的實例是多個組胺酸(histidine)殘基、麩胱甘肽(glutathione)殘基和myc標籤(myc-tag)，例如 AAAEQKLISEEDLNGAA；　　d) 可為已經官能化和/或可作為官能基連接位點的一個或多個胺基酸殘基。合適的胺基酸殘基與官能基對於技術人士而言是清楚的，並且包含但不限於本文提及的胺基酸殘基和官能基用於本發明的多肽之衍生物。

本發明亦包括含有本發明多肽和/或ISVD的構築體，其另包含其他功能部分，例如毒素、標記、放射性化學物質等。

其他基團、殘基、部分或結合單元可以是例如化學基團、殘基、部分，其本身可為或可不為生物活性和/或藥理學活性的。例如，這些基團可以與本發明的一或多種ISVD或多肽連接，以提供本發明的多肽或構築體之「衍生物」，但不以此為限。

據此，從最廣泛的意義上說，本發明亦包括構築體和/或多肽，它們是本發明的構築體和/或多肽的衍生物。通常可以藉由修飾，特別是藉由化學和/或生物學((例如，酶促)修飾本發明的構築體和/或多肽及/或形成本發明的多肽之一或多個胺基酸殘基來獲得此等衍生物。

此等修飾的實例，以及多肽序列內可以用這種方式(亦即在蛋白質主鏈上但較佳在側鏈上)修飾的胺基酸殘基的實例，可用於引入此等修飾的方法和技術，此等修飾的潛在用途和優點對於技術人士而言是清楚的(亦參閱Zangi等人Nat Biotechnol 31(10)：898-907, 2013)。

例如，此修飾可涉及引入(例如藉由共價連接或是以任何其他合適的方式)一或多個(官能)基團、殘基或部分至本發明的多肽中或是本發明的多肽上，以及特別是賦予本發明的構築體和/或多肽一或多種所欲之或功能的一或多種官能團、殘基或部分。此等官能基團的實例對於技術人士而言將是清楚的。

例如，此修飾可包括引入(例如藉由共價結合獲以任何其他合適的方式)一或多個功能部分，其增加本發明的構築體或多肽之半衰期、溶解度和/或吸收，其降低本發明的構築體或多肽之免疫原性和/或毒性，其消除或減弱本發明的構築體或多肽之任何不想要有的副作用，以及/或其賦予本發明的構築體或多肽之其他有利性質和/或降低所不欲之性質；或者前述兩種或更多種的任何組合。此等功能部分及引入它們的技術之具體實施例對於技術人士而言將是清楚的，並且實例通常可包括上文引用的一般背景技術中提及的所有功能部分和技術，以及本身已知的用於修飾醫藥蛋白質的功能部分和技術，特別是用於修飾抗體或抗體片段(包含ScFv與單結構域抗體)的功能部分和技術，例如，參考Remington(Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)。此等功能部分可例如直接(例如共價地)與本發明的多肽連接，或任選地經由合適的連接子或間隔物而連接，這對於技術人士而言也將是清楚的。

一具體實例是本發明的多肽或構築體之衍生物，其中本發明的該多肽或構築體已經被化學修飾以增加其半衰期(例如藉由聚乙二醇化(pegylation))。這是用於增加醫藥蛋白質的半衰期和/或降低其免疫原性之最廣泛使用的技術之一，並且包括附接合適的藥理學上可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可使用任何合適形式的聚乙二醇化(pegylation)，例如該技藝中用於抗體與抗體片段(包含但不限於(單)結構域抗體與ScFv)的聚乙二醇化(pegylation)，參考例如Chapman (Nat. Biotechnol. 54：531-545, 2002)、Veronese與Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54：453-456, 2003)、Harris與Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2：214-221, 2003)以及WO 04/060965。用於蛋白質聚乙二醇化的各種試劑也是可商業取得的，例如來自美國的Nektar Therapeutics。

較佳地，使用定點聚乙二醇化(site-directed pegylation)，特別是經由半胱胺酸殘基(參閱例如Yang等人(Protein Engineering 16：761-770,2003))。例如，為未達此目的，PEG可附接至本發明的多肽中天然存在的半胱胺酸(cysteine)殘基，可修飾本發明的構築體或多肽以合適地引入一或多個半胱胺酸(cysteine)殘基用於附接PEG，或是用於付接PEG之包括一或多個半胱胺酸(cysteine)殘基的胺基酸序列可融合至本發明的構築體或多肽之N-和/或C-端，所有皆使用本技藝技術人士已知的蛋白質工程技術。

較佳地，對於本發明的構築體或多肽，所使用的PEG之分子量為超過5000，例如超過10,000且小於200,000，例如小於100,000；例如在20,000-80,000的範圍中。

另一種通常較非較佳的修飾包括N-連接或O-連接的糖化作用(glycosylation)，通常作為共轉譯和/或轉譯後修飾的一部分，這取決於用於表現本發明的多肽之宿主細胞。

另一種修飾可以包括引入一或多種可偵測標記或其他訊號產生基團或部分，這取決於本發明的多肽或構築體之預期用途。用於附接、使用和偵測它們的合適標籤與技術對於技術人士而言是清楚的，例如包含(但不限於)螢光標記(例如螢光素(fluorescein)、異硫氰酸酯(isothiocyanate)、玫瑰紅(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻藍蛋白(phycocyanin)、異藻藍蛋白(allophycocyanin)，鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)、以及螢光胺(fluorescamine)和螢光金屬，例如來自鑭系的¹⁵² Eu或其他金屬)、磷光標記、化學發光標記或生物發光標記(例如魯米那(luminal)、異魯米諾(isoluminol)、芳香吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑(imidazole)、吖啶鹽(acridinium salt)、草酸酯(oxalate ester)、二氧雜環丁烷(dioxetane)或GFP及其類似物)、放射性同位素(例如³ H、¹²⁵ I、³² P、³⁵ S、¹⁴ C、⁵¹ Cr、³⁶ Cl、⁵⁷ Co、⁵⁸ Co、⁵⁹ Fe以及⁷⁵ Se)、金屬、金屬螯合物(metal-chelate)或金屬陽離子(例如金屬陽離子，例如^99m Tc、¹²³ I、¹¹¹ In、¹³¹ I、⁹⁷ Ru、⁶⁷ Cu、⁶⁷ Ga與⁶⁸ Ga，或其他金屬或金屬陽離子，其特別適合用於體內、體外或原位診斷與成像，例如 (¹⁵⁷ Gd、⁵⁵ Mn、¹⁶² Dy、⁵² Cr與⁵⁶ Fe))以及發色團與酶(例如蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase)、葡萄球菌核酸酶，δ-V-類固醇異構酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶(triose phosphate isomerase)、生物素抗生物素蛋白過氧化物酶(biotinavidin peroxidase)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、天冬醯胺酶(asparaginase)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶(urease)、過氧化氫酶(catalase)、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶(glucose-VI-phosphate dehydrogenase)、葡糖澱粉酶(glucoamylase)和乙酰膽鹼酯酶(acetylcholine esterase))。其他合適的標記對於技術人士而言是清楚的，並且例如包含可以使用NMR或ESR光譜法偵測的部分。

本發明的此等標記的多肽和構築體可例如用於體外、體內或原位測定(包含本身已知的免疫測定，如ELISA、RIA、EIA和其他「夾心測定」等，以及體內診斷與成項目的，取決於特定標記的選擇。

如本技術人士所清楚的，另一種修飾可涉及引入螯合基團，例如螯合上述的金屬或金屬陽離子之一。合適的螯合基團例如包含(但不限於)二乙基-三胺五乙酸(diethyl-enetriaminepentaacetic acid，DTPA)或乙二胺四乙酸(ethylene-diaminetetraacetic acid，EDTA)。

另一修飾可包括引入功能部分，其為具體結合對(例如生物素-(鏈黴)抗生物素蛋白(biotin-(strept) avidin)結合對)的一部分。此功能部分可用以連接本發明的多肽至另一蛋白質、多肽或化學化合物，其是結合至結合對的另一半，亦即經由結合對的形成。例如，本發明的構築體或多肽可與生物素結合(conjugate)，並且連接至與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白共軛的另一蛋白質、多肽、化合物或載體。例如，本發明的此共價構築體或多肽可作為報告子(reporter)，例如在診斷系統中，其中可偵測的訊號產生劑共軛至抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。例如，此結合對亦可用以將本發明的構築體或多肽結合至載體，包含適合醫藥目的之載體。一非限制實例是Cao與Suresh (Journal of Drug Targeting 8：257, 2000)所描述的微脂體配方(liposomal formulation)。此結合對亦可用於將治療活性劑結合至本發明的多肽。

其他的潛在化學與酶修飾對於技術人士而言將是清楚的。此等修飾亦可被引入用於研究目的(例如，研究功能-活性關係)。例如參考Lundblad與Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26：143-151, 1997)。

較佳地，構築體、多肽與/或衍生物使得它們結合至聚集蛋白聚醣與ADAMTS5與/或MMP13，具有親和力(適當地測量和/或表示為K_D 值(實際或表觀)、K_A 值(實際或表觀)、k_on -速率或締合速率和/或k_off 或解離速率，或者作為IC₅₀ 值，如本文進一步所描述的)，其如本文所定義(例如，如對本發明之多肽所定義的)。

本發明的此等構築體和/或多肽及其衍生物亦可基本上為分離形式(isolated form)(如本文所定義)。

在一態樣，本發明是關於本發明的構築體，其包括或基本上由根據本發明之ISVD或根據本發明之多肽組成，並且其另包括一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元，其經由一或多個胜肽連接子而任選地連接。

在一態樣，本發明是關於本發明的構築體，其中一或多個其他的基團、殘基、部分或結合單元是選自由以下所組成的群組：聚乙二醇分子、血清蛋白質或其片段、可結合血清蛋白質的結合單位、Fc部分、以及可結合血清蛋白質的小蛋白質或胜肽。

在本發明的構築體中，例如本發明的多肽，二或多個建立單元(例如ISVD)以及任選地一或多個其他基團、藥物、劑、殘基、部分或結合單元可直接彼此連接(例如，如WO 99/23221中所描述)及/或可經由一或多個合適的間隔物或連接子或其任何組合而彼此連接。用於多價與多特異性多肽中之合適的間隔物或連接子對於技術人士而言將是清楚的，並且通常可為該技藝中用於連接胺基酸序列的連接子或間隔物。較佳地，該連接子或間隔物適合用於建立製藥用途所用之構築體、蛋白質或多肽。

例如，本發明的多肽可為例如三價的三特異性多肽，其包括一個建立單元(例如結合聚集蛋白聚醣的ISVD、ISVD結合ADAMTS5，以及潛在的另一建立單元(例如結合MMP13的第三ISVD))，其中該第一、第二和第三建立單元(例如ISVD)可任選地經由一或多個(特別是2個)連接子序列連接。再者，本發明提供本發明的構築體或多肽，其包括結合聚集蛋白聚醣的第一ISVD以及可能的結合聚集蛋白聚醣的第二ISVD和/或可能的第三ISVD ADAMTS5和/或可能的結合MMP13的第四ISVD，其中該第一ISVD和/或該第二ISVD和/或可能的該第三ISVD和/或可能的該地四ISVD經由連接子而連接，特別是經由3個連接子。

一些特別較佳的連接子包含該技藝中用於連接抗體片段或抗體結構域的連接子。這些包含上述所引用的一般背景技術中所提及的連接子，以及例如該技藝中用以構築體雙體抗體(biabpdy)與ScFv片段(然而，在這態樣，應注意在雙體抗體中以及在ScFv片段中，所使用的連接子序列應具有長度、一定程度的靈活性(flexibility)和其他性質，使相關的V_H 和V_L 結構域在一起形成完整的抗原結合位點，對本發明的多肽中使用的連接子的長度或靈活性沒有特別限制，因為每個ISVD(例如奈米體)本身形成完整的抗原結合位點)的連接子。

例如，連接子可為合適的胺基酸序列，並且特別是1至50個，較佳為1至30個(例如1至10個)胺基酸殘基之間的胺基酸序列。此等胺基酸序列的一些較佳實例包含gly-ser連接子，例如(gly_x ser_y )₂ 形式，例如(gly₄ ser)₃ 或(gly₃ ser₂ )₃ ，如WO 99/42077中所述，以及本文所提及之Ablynx的申請案(參閱例如WO 06/040153和WO 06/122825)中所述之GS30、GS15、GS9與GS7連接子，以及類鉸鏈區域(hinge-like region)，例如天然存在的重鏈抗體或類似序列的鉸鏈區(如WO 94/04678中所述)。較佳的連接子係如表C中所描述。

一些特別較佳的連接子為GS9 (亦參閱WO 06/122825中的SEQ ID NO：84)和GS35，以及聚-丙胺酸(例如AAA)和連接子GS30(亦參閱WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)。

其他合適的連接子通常包括有機化合物或聚合物，特別是適合用於醫藥用途的蛋白質中的那些。例如，聚(乙二醇)部分已用於連接抗體結構域，參閱例如WO 04/081026。

本發明的範圍包括所用連接子的長度、靈活性程度和/或其他性質(儘管不是關鍵的，但因為它通常用於ScFv片段中使用的連接子)可能對本發明構築體的最終性質具有一些影響，例如，本發明的多肽包含但不限於化學激活素(chemokine)或一或多種其他抗原的親和力、特異性或結合性(avidity)。基於本文的揭露內容，技術人士將可任選地在一些有限的常規實驗之後決定使用於本發明的特定構築體(例如本發明的多肽)中的理想連接子。

例如，在本發明的多價多肽(其包括針對聚集蛋白聚醣與另一標的(例如ADAMTS5和/或MMP13)之建立單元、ISVD或奈米體)中，連接子的長度與靈活性較佳使得多肽中之本發明的每個建立單元(例如ISVD)結合至其同源標的(cognate target)，例如每一個標的上的抗原決定位。同樣地，基於本文的揭露內容，技術人士將可任選地在一些有限的常規實驗之後決定使用於本發明的特定構築體(例如本發明的多肽)中的理想連接子。

以下亦在本發明的範圍中：所使用的連接子賦予本發明的構築體(例如本發明的多肽)一或多種其他有利的性質或功能且/或提供一個或多個位點用於衍生物的形成和/或官能基團的附接(例如，如本文所述，用於本發明的ISVD之衍生物)。例如，含有一或多個帶電胺基酸殘基的連接子可提供改良的親水性質，而形成或含有小表位或標籤的連接子可用於偵測、辨識與/或純化之目的。同樣地，基於本文的揭露內容，技術人士將可任選地在一些有限的常規實驗之後決定使用於本發明的特定多肽中的理想連接子。

最後，當使用二或多種連接子於構築體中(例如本發明的多肽)中時，這些連接子可為相同或是不同的。同樣地，基於本文的揭露內容，技術人士將可任選地在一些有限的常規實驗之後決定使用於本發明的特定構築體或多肽中的理想連接子。

通常，為了易於表現和生產，本發明的構築體(例如本發明的多肽)將是直鏈多肽(linear peptide)。然而，從最廣泛的意義而言，本發明不限於此。例如，當本發明的構築體(例如本發明的多肽)包括多個建立單元、ISVD或奈米體中的三個，可能藉由使用具有三個或更多個「臂(arm)」的連接子來連接它們，每個「臂」連接至建立單元、ISVD或奈米體，以提供「星形」構築體。儘管通常非較佳，但也可以使用圓形構築體。

據此，本發明是關於本發明的構築體，例如本發明的多肽，其中該ISVD直接彼此連接或是經由連接子而連接。

據此，本發明是關於本發明的構築體，例如本發明的多肽，其中第一ISVD與/或第二ISVD與/或可能結合血清白蛋白的ISVD是經由連接子而連接。

據此，本發明是關於本發明的構築體，例如本發明的多肽，其中該連接子是選自由以下連接子所組成的群組：9GS、35GS、3A、5GS、7GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、聚-A(poly-A)、8GS、40GS、G1鉸鏈(hinge)、9GS-G1鉸鏈(hinge)、美洲駝上部長鉸鏈區域(llama upper long hinge region)以及G3鉸鏈(hinge)，例如表C(SEQ ID NO：28、35、24-27、29-34與36-40)所示。

據此，本發明是關於本發明的構築體，例如本發明的多肽，其中該多肽是選自於由以下所組成的群組：SEQ ID NO：62-64、1、5與6。

本發明進一步關於用於製備本文所述之構築體、多肽、ISVD、核酸、宿主細胞及組成物的方法。

本發明的多價多肽通常可由以下方法製備，該方法包括至少任選地經由一或多個合適的連接子而將本發明的ISVD和/或單價多肽適當地連接至一或多個其他的ISVD之步驟，以提供本發明的多價多肽。本發明的多肽亦可藉由以下方法製備，該方法通常包括至少提供編碼本發明的多肽之核酸、以合適的方式表現該核酸以及回收本發明之該表現的多肽之步驟。這些方法可用本身已知的方式進行，這對於技術人士而言是清楚的，例如基於本文進一步描述的方法和技術。

本發明用於製備多價多肽的方法可包括至少以合適的方式將本發明的二或多個ISVD與例如一或多個連接子連接在一起之步驟。本發明的ISVD(與連接子)可藉由該技藝中任何已知的方法與如本文進一步所描述者而耦合。較佳的技術包含連接編碼本發明的ISVD(與連接子)之核酸序列以製備表現多價多肽的遺傳構築體(genetic construct)。用於連接胺基酸或核酸的技術對於技術人士而言是清楚的，並且再次參考標準手冊，例如Sambrook等人和Ausubel等人所著，如上所述，以及如以下的實例所述。

據此，本發明亦是關於本發明的ISVD用於製備本發明的多價多肽之用途。製備多價多肽的方法將包括任選地經由一或多個連接子，將本發明的ISVD連接至本發明的至少另一ISVD。而後，本發明的ISVD作為結合結構域或建立單元以提供與/或製備多價多肽，其包括2 (例如二價多肽)、3(例如三價多肽)、4(例如四價)或更多個(例如多價多肽)建立單元。在這態樣，本發明的ISVD可作為結合結構與或建立單元以提供與/或製備本發明的多價(例如二價、三價或四價)多肽，其包括2、3、4或更多個建立單元。

據此，本發明亦是關於本發明的ISVD多肽(如本文所述)用於製備多價多肽之用途。製備多價多肽的方法將包括任選地經由一或多個連接子，將本發明的ISVD連接至本發明的至少另一ISVD。

可用本身已知的方式，如本領域技術人士從本文的進一步描述中將清楚的，製備本發明的多肽和核酸。例如，本發明的多肽可用本身已知的任何方式製備用於抗體的製備，特別是用於抗體片段(包含但不限於(單)結構域抗體和ScFv片段)的製備。用於製備多肽和核酸的一些較佳但非限制性的方法包含本文所述的方法與技術。

生產本發明之多肽的方法可包括以下步驟：在合適的宿主細胞或宿主生物體(在本文亦稱為「本發明的宿主」)或是在另一合適的表現系統表現編碼本發明的該多肽之核酸(在本文亦稱為「本發明的核酸」)；任選地而後分離與/或純化所得到之本發明的該多肽。

特別地，此方法可包括以下步驟：在使得本發明的該宿主表現和/或生產至少一種本發明之多肽的條件下培養和/或維持本發明的宿主；任選地而後分離和/或純化由此獲得的本發明的多肽。

據此，本發明亦是關於編碼本發明之多肽、ISVD或構築體的核酸或核苷酸序列(在本文亦稱為「本發明的核酸」)。

本發明的核酸可為單股或雙股DNA或RNA之形式。根據本發明的一具體實施例，本發明的核酸基本上為分離形式，如本文所定義。本發明的核酸亦可為存在於載體(例如表現載體，例如質體、黏接質體(cosmid)或YAC)中與/或為載體之一部分的形式，同樣地其基本上可為分離形式。據此，本發明亦是關於包括本發明之核酸或核苷酸序列的表現載體。

基於本文所給的關於本發明之多肽的資訊，可用本身已知的方式製備或獲得本發明的核酸，和/或可以從合適的天然來源分離。再者，如技術人士所清楚的，為了製備本發明的核酸，還有幾種核苷酸序列，例如編碼本發明的ISVD之至少兩種核酸以及例如編碼一種或多種連接子的核酸，可用合適的方式連接在一起。用於產生本發明的核酸之技術對於技術人士而言將是清楚的，並且可例如包含(但不限於)自動的DNA合成；定點突變；結合兩種或更多種天然存在的和/或合成的序列(或其兩個或更多個部分)，引入導致截短的表現產物表現的突變；引入一個或多個限制位點(例如，使用合適的限制酶產生易於消化和/或連接的盒(cassette)和/或區域)，以及/或藉由使用一個或多個「錯配」引子(primer)的PCR反應而引入突變。這些和其他技術對於技術人士而言將是清楚的，並且再次參考如上所述之標準手冊(例如Sambrook等人和Ausubel等人)以及以下的實例。

在較佳但非限制性的具體實施例，本發明的遺傳構築體包括　　a) 本發明的至少一核酸；　　b) 可操作地連接至一或多個調節元件(regulatory element)，例如啟動子和任選地合適的終止子；並且亦任選地　　c) 本身已知的遺傳構築體之一或多種其他元件；　　其中術語「調節元件(regulatory element)」、「啟動子」、「終止子」與「可操作地連接」在本技藝中具有它們通常的含義。

可通常藉由將本發明的核苷酸序列與上述一種或多其他元件適當地連接來提供本發明的遺傳構築體，例如使用如上所述之一般手冊(例如Sambrook等和Ausubel等人)中描述的技術。

本發明的核酸與/或本發明的遺傳構築體可用以轉型(transform)宿主細胞或宿主生物，亦即用於表現與/或生產本發明的多肽。合適的宿主或宿主細胞對於技術人士而言將是清楚的，並且例如可為任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或(非人類)真核生物以及本身已知的所有其他的宿主細胞或(非人類)宿主，用於表現與生產抗體及抗體片段(包含但不限於(單)結構域抗體與ScFv片段)，這對於技術人士而言將是清楚的。亦參考上文引用的一般背景技術，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol.149：589-99,1998)；Riechmann和Muyldermans (1999)，同上；van der Linden (J.Biotechnol.80：261-70,2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2：1,2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66：384-92,2005)；以及本文引用的其他參考文獻。此外，本發明的多肽亦可在無細胞表現系統中表現和/或生產，並且此等系統的合適實例對於技術人士而言將是清楚的。用於轉型(transforming)本發明之宿主或宿主細胞的合適技術對於技術人士而言是清楚的，並且可取決於預期的宿主細胞/宿主生物和待使用的遺傳構築體。再次參考上述手冊和專利申請案。所轉型的(transformed)宿主細胞(其可為穩定細胞株之形式)或宿主生物(其可為穩定突變株或系之形式)形成本發明的其他態樣。據此，本發明是關於宿主或宿主細胞，其包括根據本發明的核酸或根據本發明的表現載體。較佳地，這些宿主細胞或宿主生物使得它們表現或(至少)可表現(例如在合適條件下)本發明的多肽(以及在宿主生物的情況下：在其至少一個細胞、部分、組織或器官中)。本發明亦包含本發明的該宿主細胞或宿主生物之其他世代、子代(progeny)與/或後代(offspring)，其可例如藉由細胞分裂或是有性或無性繁殖而獲得。

為了生產/獲得本發明的多肽，所轉型的宿主細胞或轉型的宿主生物通常可被保持、維持與/或培養表現/產生本發明之(所欲的)多肽的條件下。合適的條件對於技術人士而言將是清楚的，並且通常將取決於所使用的宿主細胞/宿主生物以及控制本發明之(相關)核苷酸序列之表現的調節元件。同樣地，參考上述關於本發明之遺傳構築體的段落中提到的手冊和專利申請案。

而後，可從宿主細胞/宿主生物與/或從培養基分離本發明的多肽，其中使用本身已知的蛋白質分離與/或純化技術，例如(製備)色層分析和/或電泳技術、差異沉澱技術、親和力技術(例如，使用與本發明多肽融合的特異性、可切割的胺基酸序列)和/或製備免疫學技術(亦即使用針對待分離的多肽之抗體)，例如培養該宿主細胞或宿主生物。

在一態樣，本發明是關於生產根據本發明的構築體、多肽或ISVD之方法，其包括至少以下步驟：(a)在合適的宿主細胞或宿主生物中或在另一合適的表現系統中，表現根據本發明核酸序列；任選地而後(b)分離與/純化根據本發明的該構築體、多肽或ISVD。

在一態樣，本發明是關於一種組成物，其包括根據本發明的構築體、多肽、ISVD或核酸。

如上所述，仍然需要安全有效的OA藥物。首先，本案發明人識別非常有效的軟骨錨定蛋白，亦即結合聚集蛋白聚醣的ISVD，其作為建立單元以設計也結合ADAMTS5和/或MMP13的分子。所得分子在受試者中具有增加的保留，並且可系統性投予(administered systemically)，同時保持活性。本案發明人接著證實ADAMTS5抑制劑與MMP13抑制劑的組合在改善OA態樣比單獨抑制任一種標的更有效。再者，本發明的多肽和構築體比先前技藝的化合物更顯著有效。

因此，相較於習知技藝胺基酸序列與抗體，本發明提供具有改善的預防性、治療性和/或藥理學性質(包含更安全概況)之組成物、構築體與/或多肽。

在一態樣，本發明是關於一種治療或預防個體中的疾病或病症之方法，例如其中涉及ADAMTS5與/或MMP13活性，該方法包括投予有效量之根據本發明的組成物、多肽和/或構築體至該個體，以治療或預防該疾病(的症狀)或病症。

在一態樣，本發明關於根據本發明的組成物、根據本發明的多肽、和/或根據本發明的構築體使用作為藥物。

在另一態樣，本發明是關於根據本發明的組成物、多肽和/或構築體的用途，用於製備預防和/或治療至少ADAMTS5和/或MMP13相關疾病(例如OA)之醫藥組成物；以及/或用於本文所述之治療方法中的一或多種。

本發明亦是關於根據本發明的組成物、多肽和/或構築體的用途，用於製備預防和/或治療至少一疾病或病症之醫藥組成物，可藉由調節ADAMTS(較佳為抑制ADAMTS5的活性)而預防和/或治療該至少一疾病或病症。

本發明亦是關於根據本發明的組成物、多肽和/或構築體的用途，用於製備預防和/或治療至少一疾病或病症之醫藥組成物，可藉由調節MMP (較佳為抑制MMP13的活性)而預防和/或治療該至少一疾病或病症。

本發明亦是關於根據本發明的ISVD、多肽、組成物與/或構築體的用途，用於製備醫藥組成物以預防和/或治療至少一疾病、病症或狀態，其可藉由投予本發明的ISVD、多肽、組成物和/或構築體至病患而被預防和/或治療。

本發明進一步是關於本發明的ISVD、組成物、多肽和/或構築體或是包括其之醫藥組成物，用於預防和/或治療至少ADAMTS5相關疾病和/或MMP13相關疾病。

預期本發明的ADAMTS5結合劑可用於影響軟骨的各種疾病，例如關節病和軟骨營養不良、關節炎疾病，例如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病性關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出、腰椎間盤退化性疾病，退化性關節病和復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎和聚集性疾病以及非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)(本文中通常表示為「ADAMTS5相關疾病」)，較佳為OA。

預期本發明的MMP13結合劑可用於影響軟骨的各種疾病，例如關節病和軟骨營養不良、關節炎疾病，例如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病性關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病、慢性牙周炎和腹主動脈瘤(本文中通常表示為「MMP13相關疾病」)，較佳為OA。

在一態樣，本發明是關於根據本發明的組成物、ISVD、多肽和/或構築體，用於治療或預防ADAMTS5相關疾病和/或MMP13相關疾病(例如關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病，如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤，較佳為OA)的症狀。

在一態樣，本發明是關於治療關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病，如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤，或預防上述疾病之症狀，較佳為OA)的方法，其中該方法包括投予醫藥活性量的根據本發明之至少一組成物、免疫球蛋白、多肽和/或構築體至有需要的個體。

在一態樣，本發明是關於根據本發明的ISVD、多肽、組成物和/或構築體的用途，用於製備醫藥組成物以治療或預防疾病或病症，例如關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病，如骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤，較佳為OA。

亦預期藉由與聚集蛋白聚醣結合，本發明的ISVD、構築體和/或多肽可降低或抑制絲胺酸蛋白酶家族的成員、組織蛋白酶(cathepsin)、基質金屬蛋白酶(除MMP13之外的MMP，例如MMP20)以及降解的聚集蛋白聚醣中的ADAMTS4(聚集蛋白聚醣酶-1)和/或ADAMTS11的活性。

在本發明的內容中，術語「預防和/或治療」不僅包括預防和/或治療疾病，通常亦包括預防疾病的發作、減緩或逆轉疾病的進展、預防或減緩與疾病相關的一或多種症狀的發作、減少和/或減輕與疾病相關的一或多種症狀、降低嚴重性和/或疾病的持續時間和/或與其相關的任何症狀和/或防止疾病的嚴重程度和/或與其相關的任何症狀的進一步增加、預防、減少或逆轉由疾病引起的任何生理損害以及通常任何對受治療的病患有益的藥理作用。

劑量方案將由主治醫師和臨床因素決定。如在醫學領域中眾所周知的，任何一名病患的劑量取決於許多因素，包含病患的體型、體重、體表面積、年齡、待投予的特定化合物、所用多肽(包含抗體)的活性、投予的時間和途徑、一般健康以及與其他療法或治療的組合。蛋白質醫藥活性物質可用每劑量1g至100 mg/kg體重的量存在；然而，亦可設想低於或高於該示例性範圍的劑量。如果方案是連續輸注，則其可在每分鐘每千克體重為1 pg至100 mg的範圍中。

本發明的ISVD、多肽或構築體可用例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50 pg/ml的濃度使用，以抑制和/或中和ADAMTS5和/或MMP13的活性至少約50%，較佳為75%，更佳為90%、95%或至多99%，最佳約100%(基本上完全)，如藉由本技藝已知的方法測定。

通常，治療方案將包括以一種或多種醫藥有效量或劑量投予一或多種本發明的多肽和/或構築體或一種或多種包含其的組成物。臨床醫生可再次基於上述因素而決定待投予的具體量或劑量。本發明組成物、構築體和/或多肽的有用劑量可藉由比較它們的體外活性和動物模型中的體內活性來決定。將用於小鼠和其他動物中的有效劑量外推至人類的方法是本領域已知的；例如，參閱US 4,938,949。

通常，取決於待治療之特定疾病、病症或狀態、待使用之本發明的具體多肽和/或構築體的效力、具體的投予途徑以及使用的具體醫藥配方或組成物，臨床醫生將能夠決定合適的劑量方案。

用於治療所需之本發明的組成物、構築體和/或多肽的量將不僅隨選擇的特定組成物、多肽和/或構築體而異，亦隨投予途徑、所治療病症的性質與患者的年齡和狀態而異，將最終由主治醫師或臨床醫生決定。再者，本發明的組成物、構築體和/或多肽的劑量根據標的細胞、組織或器官而變化。

所欲之劑量可方便地以單劑量或非較佳的方式呈現，作為以適當間隔投予的分劑量，例如，每天兩次、三次、四次或更多的次劑量(sub-dose)。次劑量本身可以進一步分成例如許多離散的鬆散間隔投予。

投予方案可包含長期的日常治療。「長期」是指至少兩週且較佳為幾週、幾個月或幾年的持續時間。本技藝的普通技術人士僅使用本文教導的常規實驗即可決定此劑量範圍內的必要修飾。參閱Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA。如果出現任何併發症，也可由個別醫生調整劑量。已經顯示組成物、多肽和構築體非常穩定並且在延長的時間內保持有效。

通常在上述方法中，將使用本發明的組成物、多肽和/或構築體。然而，結合使用二或更多種本發明的組成物、多肽和/或構築體(例如，SEQ ID NO：5和6的組合，SEQ ID NO：63和64，SEQ ID NO：5和64，或SEQ ID NO：63和6)是在本發明的範圍內。

本發明的組成物、多肽和/或構築體可與一或多種其他的醫藥活性化合物或原理組合使用，亦即作為組合的治療方案，其可或可不造成協同效果。

醫藥組成物異可包括至少一其他的活性劑，例如一或多種其他的抗體或其抗原結合片段、胜肽、蛋白質、核酸、有機與無機分子。

同樣地，基於上述引用的因素和其專家判斷，臨床醫生將能夠選擇此其他化合物或原理，以及合適的組合治療方案。

特別地，本發明的組成物、多肽和/或構築體可與其他的醫藥活性化合物或原理(其可用於預防和/或治療本文所述之疾病、病症與狀態)組合使用，結果，可能會或可能不會獲得協同效應。臨床醫生將清楚此等化合物和原理的實例，以及用於投予它們的途徑、方法和醫藥配方或組成物。

當二或更多種物質或原理(例如包括具有抑制ADAMTS5的ISVD之多肽和具有抑制MMP13的ISVD之另一多肽的組成物)作為組合治療方案的一部分時，例如SEQ ID NO：5和6的組合、SEQ ID NO：63和64、SEQ ID NO：5和64、或SEQ ID NO：63和6的組合，它們可以經由相同的投予途徑或經由不同的投予途徑，基本上同時或在不同時間(例如基本上同時、連續、或根據交替方案)投予。當物質或原理經由相同的投予途徑而同時投予時，它們可以用不同的醫藥配方或組成物或組合的醫藥配方或組成物的一部分投予，這對技術人士而言將是清楚的。

再者，當二或多種活性物質或原理(例如包括具有抑制ADAMTS5的ISVD之多肽和具有抑制MMP13的ISVD之另一多肽的組成物)作為組合治療方案的一部分時，每種物質或原理可用相同的量和根據與該化合物或原理本身使用時相同的方案投予，並且這種組合使用可或可不產生協同效應。然而，當該二或更多種活性物質或原理的組合使用導致協同效應時，亦可減少一種、多種或所有待投予之物質或原理的量，同時仍然實現所欲之治療作用。例如，這可用於避免、限制或減少與使用一或多種物質或原理相關之任何不想要有的副作用，當它們以其通常的量使用時，同時仍然獲得所欲之醫藥或治療效果。

對於所涉及的疾病、病症或狀態，可用本身已知的任何方式決定和/或遵循根據本發明所使用的治療方案的有效性，這對臨床醫生而言將是清楚的。在適當的情況下，臨床醫生將亦可根據具體情況改變或修飾特定的治療方案，以達到所欲之治療效果，以避免、限制或減少不想要有的副作用，及/或在一態樣實現所欲之治療效果與另一態樣避免、限制或減少所不欲之副作用之間實現適當的平衡。

通常，依照治療方案，直到達到所欲之治療效果且/或只要保持所欲之治療效果。同樣地，這可由臨床醫生決定。

因此，在另一態樣，本發明是關於一種醫藥組成物，其含有本發明的至少一構築體或本發明的至少一多肽以及至少一合適的載體、稀釋劑或賦形劑(亦即適合用於醫藥用途)，以及任選地一或多個其他的活性物質。在一特定態樣，本發明是關於一種醫藥組成物，其包括根據本發明的至少一組成物、構築體或多肽，較佳為SEQ ID NO：1和62、或SEQ ID NO：5和6的組合、SEQ ID NO：63和64、SEQ ID NO：5和64、或SEQ ID NO：63和6的至少其中之一，以及至少一合適的載體、稀釋劑或賦形劑(亦即適合用於醫藥用途)，以及任選地一或多個其他的活性物質。

待治療的個體可為任何溫血動物，但特別是哺乳動物，以及更特別為人類。在獸醫應用中，待治療的個體包含為商業目的而飼養或作為寵物飼養的任何動物。如技術人士所清楚的，待治療的個體特別是患有本文提及的疾病、病症和狀態或具有其風險的人。因此，在本發明的較佳具體實施例中，包括本發明之多肽的醫藥組成物適用於醫學或診斷。較佳地，醫藥組成物適用於人類醫學，但它們亦可用於獸醫目的。

再者，在此醫藥組成物中，本發明的一或多種組成物、多肽和/或構築體、或編碼它們的核苷酸、及/或包括其的醫藥組成物，亦可適當地與一或多種其他活性原理(例如本文提到的那些)組合。

本發明亦是關於一種使用於體外(例如在體外或細胞測定)或體內(例如在單一細胞或多細胞生物，以及特別在哺乳動物中，以及更特別在人類，例如在有本發明的疾病、病症或狀態之風險或患有本發明的疾病、病症或狀態的人中)的組成物(例如無限制，如本文進一步描述的藥物組成物或製備)。

應理解，除非另有明確說明，否則提及治療包括以建立的症狀之治療和預防性治療。

通常，對於醫藥用途，本發明的組成物、構築體、多肽和/或ISVD可配製成醫藥製備或組成物，其包括至少一種本發明的構築體、多肽和/或ISVD與至少一種醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，以及任選地一或多種醫藥活性多肽和/或化合物。藉由非限制性實例，此配方可以是適合口服投予、腸胃外投予(例如藉由關節內、靜脈內、肌肉內或皮下注射或靜脈內輸注)、局部投予、藉由吸入、皮膚貼片、植入、栓劑等的形式，其中胃腸外給藥是較佳的。此等合適的投予形式-其可為固體、半固體或液體-取決於投予的方式-以及其製備中所使用的方法與載體，這對於技術人士而言將是清楚的，並且進一步描述於本文。此醫藥配方或組成物在本文中通常稱為「醫藥組成物」。

作為示例性賦形劑，可提及崩解劑、結合劑、填充劑和潤滑劑。崩解劑的實例包含洋菜(agar-agar)、褐藻膠(algin)、碳酸鈣、纖維素、膠體二氧化矽、膠(gum)、矽酸鋁鎂、甲基纖維素和澱粉。結合劑的實例包含微晶纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。填充劑的實例包含碳酸鈣、磷酸鈣、三鹼硫酸鈣、羧甲基纖維素鈣、纖維素、糊精、右旋糖、果糖、乳糖醇、乳糖、碳酸鎂、氧化鎂、麥芽糖醇、麥芽糖糊精、麥芽糖、山梨糖醇、澱粉、蔗糖、糖和木糖醇。潤滑劑的實例包含洋菜、油酸乙酯、月桂酸乙酯、甘油、棕櫚酸硬脂酸甘油酯、氫化植物油、氧化鎂、硬脂酸鹽、甘露醇、泊洛沙姆(poloxamer)、乙二醇、苯甲酸鈉、十二烷基硫酸鈉、硬脂醯鈉(sodium stearyl)、山梨糖醇和滑石(talc)。常用的穩定劑、防腐劑、潤濕劑和乳化劑、一致性改善劑(consistency-improving agent)、風味改善劑、用於改變滲透壓的鹽、緩衝物質、增溶劑、稀釋劑、軟化劑(emollient)、著色劑和掩蔽劑以及抗氧化劑被考慮作為醫藥佐劑。

合適的載體包含但不限於碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃蓍膠(tragacanth)、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂、水、醇、多元醇、甘油、植物油等。

通常，可用本身已知的任何合適的方式，調配和投予本發明的構築體、多肽與/或ISVD。參考例如上述引用的一般背景技術(以及特別是WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867與WO 08/020079)並且參考標準手冊，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington、the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (參閱例如第252-255頁)。

在特定態樣，本發明是關於醫藥組成物，其包括根據本發明的至少一組成物、構築體、多肽、ISVD或核酸，並且其另包括至少一醫藥可接受的載體、稀釋與/或佐劑，並且任選地包括一或多種其他的醫藥活性多肽與/或構築體。

本發明的組成物、構築體、多肽和/或ISVD可用本身已知的任何方式調配和投予，用於常規抗體和抗體片段(包含ScFv和雙抗體)以及其他醫藥活性蛋白質。此等配方和製備它們的方法對於技術人士而言將是清楚的，並且例如包含較佳用於腸胃外投予(例如關節內、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、腔內、動脈內、鞘內鼻內或支氣管內投予)的製備以及用於局部(亦即穿皮或皮內)投予的製備。

腸胃外投予的製備可為例如適合輸注或注射的無菌溶液、懸浮液、分散液或乳液。用於此等製備的合適載體或稀釋劑例如包含但不限於WO 08/020079的第143頁中提到的那些。通常，水溶液或懸浮液將是較佳的。

本發明的組成物、構築體、多肽和/或ISVD也可使用已知的基因治療方法投予，參閱例如美國專利第5,399,346號，其藉由引用併入其基因治療遞送方法。使用基因治療遞送方法，用編碼本發明的構築體、多肽和/或ISVD的基因轉染的原代細胞可另外用組織特異性啟動子轉染以標定特定器官、組織、移植物、腫瘤或細胞並且可另外用訊號和穩定序列轉染用於次細胞定位表現(subcellularly localized expression)。

根據本發明的其他態樣，本發明的組成物、構築體和/或多肽可用於體內與體外的其他應用。例如，本發明的組成物、構築體和/或多肽可用於診斷目的，例如在設計用於偵測和/或定量ADAMTS5和/或MMP13的存在及/或純化ADAMTS5和/或MMP13的測定中。亦可在特定疾病的動物模型中測試組成物、多肽和/或構築體，並進行毒理學、安全性和劑量研究。

最後，本發明是關於一種套組(kit)，其包括根據本發明的至少一組成物、多肽或構築體、編碼該成分的至少一核酸序列、本發明的載體或載體系統、以及/或根據本發明的宿主細胞。預期該套組可用不同的形式提供，例如作為診斷套組。

現在將藉由以下非限制性的較佳態樣、具體實施例和圖式，進一步描述本發明。

本申請案中引用的所有參考文獻(包含參考文獻、公告的專利、公開的專利申請案和共同審查中的專利申請案)的全部內容經由引用明確地併入本文，特別是用於上文引用的教導。

序列揭露在說明書的主體中，並根據WIPO標準ST.25揭露在個別序列表中。用特定數字指定的SEQ ID在說明書的主體與個別序列表中應該是相同的。舉例而言，SEQ ID no：1在說明書的主體和個別序列表中應該定義相同的序列。序列揭露在說明書的主體中，並根據WIPO標準ST.25揭露在個別序列表中。用特定數字指定的SEQ ID在說明書的主體與個別序列表中應該是相同的。舉例而言，SEQ ID no：1在說明書的主體和個別序列表中應該定義相同的序列。如果說明書主體中的序列定義與個別序列表之間存在差異(例如，如果說明書主體中的SEQ ID no：1錯誤地對應於個別序列表中的SEQ ID no：2)，則申請案中的特定序列(特別是具體具體實施例)之編號，應理解為本申請案主體中的序列編號，而不是對個別序列表的編號。換言之，藉由將個別序列表更正為在申請案(其包含說明內容、實例、圖式與申請專利範圍)主體中的序列及其名稱來解決說明書主體中的序列定義/名稱與個別序列表之間的差異。

6 實例

不受理論束縛，發明人假設抑制ADAMTS5和MMP13可能更有效，其中　　(1) 抑制更廣泛範圍的OA誘導與維持蛋白酶；　　(2) 可標定更廣泛範圍的病患，例如無需要將病患分為不同組別；以及　　(3) 可治療更廣泛範圍的疾病發展。

為了病患友好(patient friendliness)，抑制劑較佳是在關節中延長期間保留且活化。

據此，發明人著手單離和定性特異性結合MMP13的ISVD、特異性結合ADAMTS5的ISVD以及特異性結合聚集蛋白聚醣的ISVD。接著，以不同形式(format)組合ISVD且在體外、離體(ex vivo)與體內模式中測試。

實例 1 MMP13 ISVD

1.1 抗 MMP13 的 ISVD 62C02

在篩選超過10E7個選殖株後，在螢光胜肽分析、膠原蛋白水解分析與螢光膠原蛋白分析中辨識對MMP13具特異性的ISVD 62C02。

簡而言之，人類、食蟹猴、大鼠、狗和牛MMP13螢光胜肽分析以及人類MMP1和MMP14螢光胜肽分析設定如下。活化的MMP與螢光胜肽受質Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems #ES001)及1/5稀釋的周質萃取物或純化的奈米體/正控制組(positive control)的稀釋系列(總體積= 20 µl於分析緩衝液50 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、0.01% Tween20)在37°C培養2小時。螢光的線性增加(v0-在15和45分鐘培養之間)用於酶活性的測量，並且用式100-100(存在測試奈米體時v0/存在負控制組(negative control)奈米體(Cablys)時v0)計算%抑制。

膠原蛋白水解分析的設定簡述如下：250 ng/ml免疫級人類膠原蛋白II(Chondrex #20052)與5 nM活化的MMP13於100µl分析緩衝液(50 mM Tris-Cl pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、0.01% Tween-20)中一起培養。在35°C培養1.5小時之後，以EDTA (10 µl的30 mM原液(stock))中和反應。MMP13切割的膠原蛋白進一步以彈性蛋白酶(elastase在38℃)降解20分鐘，以避免降解的膠原蛋白II再次黏著(re-annealing)(提供於第二型膠原蛋白偵測套組(Type II Collagen Detection kit) (Chondrex #6009)之10 µl的1/3稀釋原液)。經由ELISA偵測剩餘的完整膠原蛋白(提供於第二型膠原蛋白偵測套組(Chondrex #6009)之試劑)。

螢光膠原蛋白分析的設定實質上如下：100 µg/ml DQ™來自牛皮的第I型膠原蛋白(螢光素結合物(fluorescein conjugate)；分子探針(Molecular Probes #D-12060批次1149062)與10 nM活化的 MMP13及純化的奈米體/正控制組之稀釋系列一起於40 µl分析緩衝液(50 mM Tris-Cl pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM CaCl₂ 、0.01% Tween-20)中在37°C培養2小時。螢光的線性增加(v0-在15和45分鐘培養之間)用於酶活性的測量，並且用式100-100(存在測試奈米體時v0/存在負控制組(negative control)奈米體(Cablys)時v0)計算%抑制。

為了進一步定性ISVD 62C02，將此ISVD重新選殖株至載體pAX129中，轉形到大腸桿菌中，並根據標準流程(例如Maussanget al. 2013 J Biol Chem 288：29562-72)表現與純化。接著，將此ISVD用於各種功能性體外分析。TIMP-2(其為非選擇性的MMP抑制劑)作為這些分析中的正控制組。小分子藥物MSC2392891A用作為正比較物(positive comparator)。表1.1中給出了酶分析中效力(potency)的概述。

總結，相對於比較藥物MSC2392891A，ISVD 62C02在所有測定中表現更好。

1.2 抗 MMP13 的 ISVD 62C02 是選擇性的 (selective)

為了決定ISVD 62C02對於MMP13的選擇性，使用MMP1與MMP14的螢光胜肽分析。MMP1和MMP14是兩個密切相關的MMP家族成員。在這些分析中，TIMP-2用作為正控制組。使用如實例1.1中所述的類似設定。

證實ISVD 62C02是高度選擇性的，顯示沒有MMP1或MMP14抑制(數據未顯示)。

實例 2 ADAMTS5 ISVD

2.1 抗 ADAMTS5 的 ISVD 02F03

同樣在這種情況下，篩選超過10E7個選殖株，以辨識特異性結合ADAMTS5的ISVD 02F03。經由基於FRET和AlphaLISA分析，進一步定性ISVD 02F03對於抑制ADAMTS5媒介的聚集蛋白聚醣之切割。

簡而言之，藉由結合ELISA而測試ISVD 02F03的周質萃取物與重組人類ADAMTS5的結合。接著，確認ISVD 02F03能在基於FRET的人類ADAMTS5酶分析中阻止ADAMTS5媒介的聚集蛋白聚醣之切割。在基於FRET的分析之後，用生物素化的43聚體之聚集蛋白聚醣寡肽作為受質，進行基於AlphaLISA (Perkin Elmer, Waltham, MA, US)的人類ADAMTS5分析。在ADAMTS5切割此受質後，釋放生物素化的ARGSV新表位產物，並且可以藉由鏈親和素-AlphaScreen供體珠和在抗小鼠IgG披覆的AlphaLISA受體珠上捕獲的α-新表位(「ARGSV」)抗體而偵測，導致在雷射激發時產生發光AlphaScreen訊號。為了測定ISVD 02F03阻止ADAMTS5媒介的受質切割之能力，以ISVD 02F03濃度的函數分析訊號的減少，並且計算IC₅₀ 值。

抑制ADAMTS4活性和ADAMTS5活性的小分子MSC2310852A作為正控制組。

結果總結在表2.1.1中。

雖然與二價mAb 12F4相當，但ISVD 02F03顯示出比小分子MSC2310852A更好的效力。

此外，進一步評估ISVD 02F03在離體分析中阻斷軟骨降解的能力，其中與生化分析相比，受質存在於更接近生理條件的條件中。簡而言之，從牛膝關節新鮮製備牛軟骨外植體晶片(直徑4 mm)，並在IL-1α存在下於96孔盤中培養以誘導軟骨降解。作為軟骨/聚集蛋白聚醣降解的測量，經由異染性染料1,9二甲基亞甲基藍(在633 nm發射)培養5天(37℃，7.5% CO2)後，在上清液中偵測到醣胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)的釋放。包含硫酸軟骨素作為分析標準。藉由不含化合物(0%)與存在MSC2310852A (100%效果)的IL-1α誘導的控制組定義功效(efficacy)。

結果總結在表2.1.2中。

在此體外分析中，ISVD 02F03顯示出比二價mAb 12F4更好的效力，亦即IC₅₀ 低約50倍。

最初在Biacore T100儀器上經由基於SPR的解離速率分析評估物種交叉反應性。測試多肽與人類、食蟹猴(「cyno」)、豚鼠、小鼠和牛ADAMTS5的結合。為此，使用EDC和NHS經由胺耦合而將重組ADAMTS5固定在CM5晶片上。將純化的ISVD 02F03以100 nM的濃度注射2分鐘，並使其以45 μl/min的流速解離15分鐘。通過使用BIA評估軟體將1：1相互作用模型(Langmuir模型)擬合到各個解離曲線上來測定每個ADAMTS5的解離速率。作為參考，在每個實驗中測定人類ADAMTS5的解離速率作為參考。

結果總結在表2.1.3中。

ISVD 02F03顯示出與人類、食蟹猴、豚鼠和牛ADAMTS5相當的解離速率(交叉反應性)。

2.2 ISVD 02F03 的選擇性

為了確認ISVD 02F03對ADAMTS5的選擇性，經由基於FRET的分析和人類ADAMTS4 Alpha LISA，以個別的酶評估MMP1、MMP14和ADAMTS4的酶活性之抑制。

將活化的人類MMP1或MMP14在室溫下與10 μl稀釋系列的ISVD 02F03一起培養30分鐘。在培養之後，加入20 µl的個別5 µM或2.5 µM螢光胜肽受質(Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2螢光MMP受質(R&D Systems cat #ES001))。在Tecan Infinite M1000讀盤儀上，於37℃每分鐘監測ISVD 02F03防止MMP1-和MMP14-媒介的切割之能力達2小時。

儘管天然抑制劑TIMP2和TIMP3抑制MMP1和MMP14活性，但ISVD 02F03未顯示任何抑制(數據未顯示)。

為了評估對人類ADAMTS4的抑制，進行了類似於人類ADAMTS5 AlphaLISA的分析，基本上如實例2.1中所述，但使用人ADAMTS4 (R&D Systems, Minneapolis, US；cat # 4307-AD)。為了測定ISVD 02F03防止人ADAMTS4媒介的受質切割之能力，在ISVD 02F03濃度的函數中分析訊號的降低並且計算IC₅₀ 值。

儘管小分子MSC2310852A抑制人類ADAMTS4活性，但ISVD 02F03或mAb 12F4未顯示任何抑制活性(數據未顯示)。在WO 2011/002968中描述了單株抗體mAb 12F4(H4L0)對ADAMTS4具有選擇性。

實例 3 聚集蛋白聚醣 ISVD

3.1 抗聚集蛋白聚醣的 ISVD 114F08(anti-Aggrecan ISVD 114F08 )

經過大量的篩選活動後，單離和辨識對於聚集蛋白聚醣具特異性的ISVD 114F08。用重組的人類聚集蛋白聚醣(G1-IGD-G2結構域，R＆D Systems＃1220-PG)免疫美洲駝，並給出特異性和高血清效價(titer)。然而，只有一小部分單離的奈米體滿足結合聚集蛋白聚醣的G1結構域且顯示出廣泛的物種交叉反應性的兩個要求。經過艱苦嘗試之後，辨識了各種家庭成員顯示出基本上相似的特徵(參閱表3.1A至表3.1C的CDR中的序列變化)。最後，選擇ISVD 114F08(「C0101PMP114F08」)進行進一步定性。

表3.1.1提供了結構域映射(domain-mapping)和物種交叉反應數據的概述。

在初步篩選後，經由ELISA初步評估結合、測定解離速率和物種交叉反應性，對ISVD 114F08進行進一步定性。

ISVD 114F08的家族成員的CDR中的序列變化性是描述於下表3.1A、3.1B與3.1C中。使用選殖株114F08的CDR的胺基酸序列作為參考，對比所有其他家族成員的CDR(CDR1開始在Kabat位置26，CDR2開始在Kabat位置50，以及CDR3開始在Kabat位置95)。

3.2 離體牛軟骨保留 ( Ex vivobovine cartilage retention )

由於沒有用於評估軟骨保留的已建立的分析，本案發明人開發了使用牛軟骨的離體軟骨保留分析。

在多肽相對較短地暴露於軟骨(在關節內注射後可預期)後，測定包括ISVD 114F08的多肽在軟骨中保留較長時間的能力。通常每個奈米體樣品用4個軟骨盤進行分析；在多肽培養(t₀ )後立即分析2個盤以測定結合的多肽之初始量；洗滌後(t_1-5 _天 )分析2個盤。保留程度定義為在t_1-5 _天和t₀ 偵測到的多肽量的比率。藉由目視檢查Western轉印進行此比率的測定，給出0-6的分數，其中0表示無保留，6表示完全保留(full retention)。由2個不活化(inactive) ISVD ALB26組成的虛擬構築體C0101030(「30」)顯示無結合。

結果總結顯示在表3.2中。

發現包括ISVD 114F08的多肽在軟骨中保留得非常好(分數為5-6)。這包含具有ISVD 114F08的一個和兩個結合單元的構築體。

3.3 結合特性 (Binding characteristic)- ELISA

基於離體牛軟骨保留數據，在ELISA中對於來自人類、食蟹猴、大鼠、狗和牛的聚集蛋白聚醣之重組G1-IGD-G2區域進一步定性ISVD 114F08，以測定其物種交叉反應性(亦參閱實例3.1)並且對於重組的人類神經聚醣(Neurocan)和短蛋白聚糖(Brevican)進一步定性ISVD 114F08，以測定其選擇性。測定的EC₅₀ 值列於表3.3中。

3.4 組織特異性

以上證實本發明的多肽在體外與聚集蛋白聚醣特異性結合並且離體結合軟骨。此外，這些多肽也應較佳地結合至關節的軟骨，而不是結合至關節中的其他組織。

使用與離體軟骨結合分析相同的設定以評估包括ISVD 114F08的多肽與滑液膜(synovial membrane)、肌腱和外肌膜(epimysium)的結合。在與多肽ON培養之後，在短暫洗滌組織(30分鐘)後進行多肽釋放和西方轉印(Western Blot)分析。

結果總結在表3.4中。

結果顯示相較於關節中發現的其他組織，包括ISVD 114F08的一個或兩個結合單位的多肽顯示與軟骨有較佳的結合。

3.5 奈米 體在牛滑液中的穩定性

由於各種原因，包含病患的便利性和安全性，較佳是多肽在滑膜(synovium)中維持較長時間的穩定。

據此，藉由將多肽在牛SF中於37℃培養最多7天，以評估包括ISVD 114F08的多肽在滑液(Synovial Fluid，SF)中的穩定性。

結果總結在表3.5中。

沒有偵測到任何構築體的降解。

實例 4 多肽

藉由使用35GS連接子(M-C-C)遺傳連接抗MMP13的ISVD 62C02與兩種抗聚集蛋白聚醣的ISVD 114F08來形成多肽754。多肽754-9與多肽754相似，但現在使用9GS連接子。所得的胺基酸序列分別在表A-1中顯示為SEQ ID NO：5和63。

藉由使用35GS連接子(A-C-C)遺傳連接抗ADAMTS5的ISVD 2F03與兩種抗聚集蛋白聚醣的ISVD 114F08來形成多肽954。多肽954-9(參閱「973」)與多肽954相似，但現在使用9GS連接子。所得的胺基酸序列分別在表A-1中顯示為SEQ ID NO：6和64。

藉由使用35GS連接子(M-A-C-C)遺傳連接抗MMP13的ISVD 62C02、抗ADAMTS5的ISVD 2F03與兩種抗聚集蛋白聚醣的ISVD 114F08來形成多肽949。多肽949-9與多肽949相似，但現在使用9GS連接子。所得的胺基酸序列分別在表A-1中顯示為SEQ ID NO：1和62。

實例 5 多肽對不同物種的 ADAMTS5 、 MMP13 和聚集蛋白聚醣的親和力

5.1 多肽 949 對人類、食蟹猴和大鼠 ADAMTS5 的親和力

使用KinExA測定多肽949對人類、食蟹猴和大鼠ADAMTS5的溶液中親和力。將固定濃度的20 pM(終濃度)多肽949用人類、食蟹猴或大鼠ADAMTS5的16點1/2.2連續稀釋劑量響應曲線平衡24小時，每次從20 nM開始，最後一點是空白組(=無ADAMTS5)。在樣品緩衝液(PBS + 0.1% BSA + 0.02%NaN₃ )中製備所有稀釋液。為了測試聚集蛋白聚醣的干擾，在選定的實驗中，在2 nM的濃度(=超過100x多肽949的K_D ，請見下文)，將重組聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2添加至預培養中。

接著，將預培養的混合物(ADAMTS5 DRC + 20 pM多肽949 ± 聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2)經由KinExA的自動進樣器注射到填充有人類ADAMTS5-結合的(conjugated)聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)珠的管柱上，以捕獲在珠上游離的(free)奈米體構築體(Nanobody construct)。使用識別多肽949的Alexa Fluor (AF)647標記的抗奈米體工具偵測捕獲的奈米體構築體。將游離奈米體構築體百分比作為ADAMTS5濃度的函數作圖，並使用KinExA Pro軟體v3.6.5擬合以決定K_D 。

表5.1中呈現的結果顯示多肽949對人類ADAMTS5的親和力在沒有G1-IGD-G2時為32.69 pM，而在聚集蛋白聚醣存在下為26.56 pM。基於CI對K_D 值的重疊，聚集蛋白聚醣的存在不會干擾多肽949對ADAMTS5的親和力。對食蟹猴和大鼠ADAMTS5的親和力分別為24.35 pM和25.17 pM，證實多肽949對兩種物種的結合交叉反應性，因為兩者的K_D 值均落在人類K_D 的CI內。

5.2 藉由多肽 949 對人類、食蟹猴和大鼠 ADAMTS5 的功能抑制

使用基於FRET的動力學分析，研究C010100949對人類、食蟹猴和大鼠ADAMTS5的功能抑制。使用FRET分析緩衝液(在MilliQ中，50 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM CaCl2*2H₂ 0、5%甘油、0.1% CHAPS)進行此分析。從50 nM(終濃度)開始，用11點(第12點=空白組)1/1.7多肽949的連續稀釋DRC混合與平衡10 nM(終濃度)固定濃度的個別物種ADAMTS5。接著，添加30 µM(終濃度)的物種特異性螢光ADAMTS5受質。藉由ADAMTS5酶促切割此受質(用淬滅體(quencher)(2,4-二硝基苯基(2,4-dinitrophenyl)，Dnp)和螢光染料(胺苯甲酸(aminobenzoic acid)，Abz)標記的聚集蛋白聚醣胜肽)，並且使用Tecan F200微盤讀取器，每分鐘動態測量所得螢光(激發波長340 nm/發射波長430 nm)達2小時。使用GraphPad Prism軟體，藉由使每條進展曲線的線性部分用直線(Y =斜率* X + Y-截距)擬合，分析獲得的進展曲線(螢光訊號與反應時間的函數)。將得到的斜率或反應速度(v_i )相對於所有空白樣品(未抑制的反應速度，v₀ )的平均斜率常態化，繪製為多肽949濃度的函數並且擬合不對稱的5-參數邏輯(5-parameter logistics，5PL)曲線擬合，以獲得抑制曲線。

結果總結在圖1中，圖1是結果的代表性圖解說明。結果顯示多肽949(「C010100949」)對來自所有測試物種的ADAMTS5的酶活性為劑量依賴性且完全抑制，證實它們都被奈米體構築體完全功能性抑制。

5.3 多肽 949 對人類、食蟹猴和大鼠 MMP13 的親和力

使用基於FRET的動力學測定，研究多肽949對來自不同物種的MMP13之功能活性以及酶抑制常數(K_I )。所有的稀釋液在測定緩衝液(50 mM Tris (pH 7.5)、100 mM NaCl、10 mM CaCl₂ *2H₂ 0、0.01% Tween20)中製成。將從9 µM (終濃度)開始的多肽949的1/3連續稀釋的11點(第12點=空白組)DRC以各個物種之恆定濃度為0.2 nM的物種催化結構域(cd)MMP-13或0.2至20 nM(名義濃度(nominal concentration))活化的前-MMP13平衡。接著，向所有槽中加入恆定濃度為22 µM(終濃度)的螢光MMP受質。此基於膠原蛋白的受質含有通用的MMP切割序列脯胺酸-亮胺酸-甘胺酸-亮胺酸(PLGL)，並用螢光染料(Mca和淬滅劑Dpa)標記。活性酶(未被奈米體構築體結合)能夠切割受質，導致螢光染料釋放並造成螢光訊號(激發波長320 nm/發射波長405 nm)，而中和(奈米體構築體結合的)酶則不能。在加入受質後一分鐘內開始，使用Tecan F200板讀取器，每分鐘動態測量螢光，總共120個循環(2小時)。

使用GraphPad Prism軟體，藉由用直線(Y =斜率* X + Y-截距)擬合每條進展曲線的線性部分，分析獲得的進展曲線(螢光訊號與反應時間的函數)。將得到的斜率或反應速度(v_i )相對於所有空白樣品的平均斜率(未抑制的反應速度，v₀ )常態化，繪製為多肽949濃度的函數並且擬合不對稱的5-參數邏輯(5PL)曲線擬合，以獲得抑制曲線。

在這些分析條件下，獲得的IC₅₀ 值等於抑制常數K_I 。

定量分析的結果總結在表5.3中。每個交互作用重複進行二到六次獨立實驗。基於6個獨立的重複實驗，決定多肽949對人類cdMMP13的抑制常數為27.86 nM(95% CI：25.67-30.23 nM)。基於3個獨立重複的實驗，決定活化的人類前-MMP13(pro-MMP13)的K_I 為2.92 nM(95%CI：0.61-14.02nM)。對於食蟹猴和大鼠MMP13的K_I 值強烈對應於催化結構域以及活化的pro-MMP13二者的人類K_I ，表示多肽949對食蟹猴和大鼠MMP13的交叉反應性。

在進行測量K_I 的實驗中，同時評估多肽949對人類、食蟹猴和大鼠cdMMP13以及活化的pro-MMP13的功能抑制(參閱上文)。圖2是結果的代表性圖解說明。這些結果證實奈米體構築體949對所有測試物種cdMMP13和pro-MMP13形式的酶活性為劑量依賴且完全功能性抑制。

5.4 多肽 949 對人類、食蟹猴和大鼠重組聚集蛋白聚醣 G1-IGD-G2 的親和力

在ProteOn XPR36相互作用陣列儀器(BioRad，系列n°670BR6176)上使用表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)進行多肽949對人類、食蟹猴和大鼠重組聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2的親和力測定。簡而言之，將重組聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2(「配體」)藉由胺耦合而固定在GLC感測器晶片(Biorad cat＃176-5011)的配體道(ligand lane)上，在10 mM醋酸鹽pH4.5中濃度為10 µg/mL且流速為100 µL/min，目標是400個共振單位(resonance unit，RU)的固定水平。沿著感測器晶片的分析物道(analyte lane)以45 µL/min的連續流速在不同濃度(0.5-1-2-4-6-10nM)下注射多肽949 (「C010100949」；「分析物」)2分鐘在1x HBS-P + pH 7.4中作為運行緩衝液(GE Healthcare cat＃R-1006-71)。解離時間為10分鐘。在每一樣品注射之後，以10 mM甘胺酸pH 1.5再生表面。聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2和多肽949之間的相互作用被偵測為耐火指數的增加，其由於多肽949與聚集蛋白聚醣結合而在晶片上發生質量變化而發生。折射率的此種變化引起反射光的強度和角度的變化，其即時定量測量並且作為響應單位(response unit，RU)對感測器圖(sensorgram)上的時間繪製。使用ProteOn Manager 3.1.0版本3.1.0.6軟體和「kinetic Langmuir k_a /k_d simultaneous」模式從獲得的感測器圖計算動力學常數。

結果總結在表5.4中。基於2至4個獨立重複的實驗，對於人類、食蟹猴和大鼠，多肽949對於捕獲的聚集蛋白聚醣G1-IGD-G2之平均結合親和力(K_D )分別測定為14.0 pM、16.0 pM和16.6 pM。

由於多肽949的CAP建立單元的作用模式(mode of action，MoA)僅依賴於聚集蛋白聚醣結合(其藉由基於SPR的親和力測定直接反映)，因此CAP建立單元的進一步功能分析是不相關的。從這些SPR數據可以得出結論：多肽949展現出對食蟹猴和大鼠聚集蛋白聚醣的完全交叉反應性，與人類相比沒有親和力差異。

實例 6 在牛外植體模式中抑制離體軟骨降解

在牛軟骨外植體測定中測試多肽949(M-A-C-C：62C02-2F03-114F08-114F08)用於抑制軟骨降解。

簡而言之，將多肽與牛軟骨外植體一起培養，所述牛軟骨外植體用IL-1α培養5天以誘導類OA(OA-like)軟骨降解過程。在5天中，主要發生聚集蛋白聚醣的降解，而膠原蛋白降解僅在約兩週後(即在本文所述的實驗終止後)發生。在實驗結束時，定量從降解軟骨釋放到培養上清液中的GAG(主要來自於聚集蛋白聚醣)。與參考小分子抑制劑相比，計算多肽抑制GAG釋放的功效，其在這些條件下完全抑制IL-1α刺激的GAG釋放。

結果如圖3中所示。

可以看出，多肽949(圖中的NB949)以劑量依賴性方式完全抑制牛軟骨降解。

實例 7 在人類外植體模式中抑制離體軟骨降解

在人類軟骨外植體測定中測試多肽949(M-A-C-C：62C02-2F03-114F08-114F08)對於軟骨降解的抑制。簡而言之，將多肽與人軟骨外植體一起培養，所述外植體用IL-1β+制瘤素(Oncostatin) M (OSM)培養7天。在7天中，隨之而來主要聚集蛋白聚醣降解，而膠原蛋白降解僅在約兩週後(亦即在本文所述的實驗終止後)發生。在實驗結束時，定量從降解軟骨釋放到培養上清液中的GAG(主要來自聚集蛋白聚醣)。基於負控制組水平(=從沒有額外刺激的外植體釋放GAG)和IL-1β + OSM水平計算IC50，作為最大GAG損失的測量。GAG顯示為每個個別外植體的每mg軟骨的GAG釋放(以µg計)。

結果如圖4中所示。

數據顯示奈米體構築體以劑量依賴性方式抑制人OA軟骨中的GAG釋放，計算的IC₅₀ 為0.03724 µM。

實例 8 CAP 離體延伸抑制軟骨降解的多肽之功效

為了評估CAP部分的作用，其作用將多肽錨定到軟骨，將上述牛外植體測定修飾為包含軟骨外植體與多肽培養步驟(1h)後的洗滌步驟(參閱圖5，上部)。在洗滌步驟之後，藉由添加IL-1α而起始軟骨降解。在另外培養7天後，定量培養上清液中的GAG釋放。作為控制組，包括ADAMTS5抑制多肽581，其不含CAP結合部分(SEQ ID NO：65)。

結果如圖5所示。

實驗顯示控制組多肽581(亦即不含CAP結合部分的多肽)在抑制ADAMTS5態樣幾乎沒有功效。這與省略洗滌步驟的測定形成鮮明對比。在另一態樣，即使在充分洗滌後，多肽949仍然有功效。鑑於GAG釋放是由ADAMTS5驅動的，而不是在目前的測定條件下由MMP13驅動，此結果強烈表示CAP結合部分確實作用將多肽錨定到軟骨，並且CAP結合部分並不影響ADAMTS5 ISVD的功效。

實例 9 多肽 949 在牛軟骨滑膜共培養體系統中的效果

已知OA不僅涉及軟骨，還在由滑液膜(滑膜)與來自關節軟骨的外植體組成的牛模型中，測試了多肽949。簡而言之，軟骨外植體和滑膜以1/1的比例共培養28天，定期更換培養基。每週一次，在共培養物的上清液中測定C2M(Col II降解)和C3M(Col III降解)。

結果(如AUC =曲線下面積)如圖6所示。

數據顯示，軟骨外植體與滑膜的共培養誘導C2M(左圖)和C3M(右圖)的釋放。以3種不同濃度(1nM、10nM、100nM)培養多肽949。與參考分子Wyeth (MSC2310852A-1)相比，評估多肽949的效果。數據顯示例示性多肽949以及參考化合物強烈抑制C2M和C3M釋放。

實例 10 軟骨保留研究

為了確定奈米體構築體在體內的保留，使用例示性多肽949設計大鼠軟骨保留研究。由於多肽949具有4個建立單元(M-A-C-C)，因此假設各自具有兩個聚集蛋白聚醣結合劑和一種標的特異性ISVD多肽754和954基本上表現相似。

開發基於ELISA的配體結合測定，以定量大鼠軟骨中的局部奈米體構築體濃度，同時開發配體結合測定(MSD平台)以定量循環中的奈米體構築體。

結果如圖7所示。

總結，在IA投予後，例示性多肽949體內保留在軟骨中長達112天，而全身性濃度(systemic concentration)(低pg/ml範圍)僅在健康大鼠的第一個取樣時間點(IA注射後2小時)可偵測到，而在稍後的時間點(14天及以後)沒有多肽可被偵測到。

因此，包括抗聚集蛋白聚醣的ISVDs 114F08的構築體是穩定的並保留在體內模型中。

實例 11 大鼠體內 MMT DMOAD 研究 1

為了證實多肽754 (M-C-C；「奈米體754」)、多肽954 (A-C-C；「奈米體954」)與多肽949 (M-A-C-C，「奈米體949」)的體內功效，使用大鼠之手術誘導的半月板撕裂(Medial Meniscal Tear，MMT)模型。簡而言之，將大鼠進行單膝手術而誘導類OA(OA-like)症狀。在手術後3天開始藉由單次IA注射治療。手術後3天，用以下劑量投予動物：載體(緩衝液)、多肽754 (300 µg/大鼠)、多肽949 (4、40或400 µg/大鼠)以及多肽954 (300 µg/大鼠)。

在手術後第42天進行組織病理學檢查。測定內側脛骨軟骨退化寬度和內側脛骨總軟骨退化寬度，以及軟骨退化的減少百分比。每一組，使用20隻動物。

內側脛骨軟骨退化寬度的結果如圖8所示。

結果證實相較於載體，42天後所有奈米體建體顯著降低了內側脛骨軟骨寬度。這些結果進一步暗示　　(a) CAP部分對於構築體的活性沒有負面影響；　　(b) CAP部分致使構築體的保留；　　(c) 所有構築體對於軟骨寬度具有正效果；以及　　(d) ADAMTS5抑制劑和MMP13抑制劑的組合總體上表現出最大的效果，例如多肽949 。

實例 12 確認大鼠體內 MMT DMOAD 研究 2

基本上以不同的劑量方案重複實例11 (DMOAD研究1)中描述的體內功效研究。再者，在DMOAD研究1，手術後3天僅出現輕度OA。因此，現在在MMT模型中於OA的更晚期階段評估多肽，而在手術後7天開始治療。簡而言之，在手術後第42天測量內側脛骨軟骨退化寬度(µm)。同樣地，多肽949 用於舉例說明ADAMTS5和MMP13抑制劑的組合效果。

在第一系列的實驗中(每組由20隻動物組成)，每組在手術後7天接受單次IA注射(400 µg、800 µg、載體)。在治療結束時，接受400 µg多肽949的組顯示內側脛骨軟骨退化寬度減少21%，而800 µg組顯示減少16%(參閱圖9)。這些結果確認構築體的功效。

在第二系列的實驗(同樣的，每組由20隻動物組成)，每組在手術後第7天與第10天接受兩次IA注射(200 µg、400 µg、800 µg、載體)。在治療結束時，接受200 µg多肽949的組顯示脛骨寬度減少14%，800 µg組顯示減少31%，而400 µg組顯示減少35%(圖9)。

實例 13 體內症狀益處 (Symptomatic benefitin vivo )

為了評估多肽提供症狀益處的能力，使用大鼠手術OA模型。簡而言之，在第0天對大鼠進行ACLt和tMx手術以誘導OA。在ACLt和tMx手術模型(用內側半月板切除術擴展的前十字韌帶切斷)中，在第1週和第8週以不同濃度(100 µg、400 µg和1000µg)IA投予構築體。一組大鼠用Tanezumab (Pfizer)(抗神經生長因子(NGF)mAb)治療IA，其作為該研究中症狀緩解的正對照組。在第2、5、9與13週，經由步態分析(在CatWalk上)以及關節直徑的減小來決定症狀益處。

結果如圖10所示。

用多肽進行的關節內治療導致症狀益處高達43%。

實例 14 CAP 結 合劑在健康和骨關節炎大鼠的體內保留是相似的

在具體實施例10中證實在健康大鼠的軟骨保留研究中，在關節內(I.A.)注射後直至112天，本發明的多肽在軟骨中是可測量的。由於軟骨組成物可對全身性循環(systemic circulation)中的軟骨結合和吸收產生影響，因此藉由及時追蹤多肽的血清水平，在患病的骨關節炎和健康大鼠中比較本發明多肽的體內藥物動力學。

特別地，使用如實例10所述之手術誘導的大鼠半月板撕裂(Medial Meniscal Tear，MMT)模式，但有一些修飾。簡而言之，本發明的多肽耦合至抗MMP13的ISV以及抗ADAMTS5的ISV(稱為「949」、「0949」或「C010100949」奈米體)。將大鼠進行單膝手術以誘導類OA(OA-like)症狀(OA-組)。每個治療組(健康與OA)包含15隻動物，並且在第7天或是手術(MMT)後7天接受單次I.A.注射400 µg/30µl奈米體。在第0天、第7天(0h =劑量前樣品)、第8天(在治療後不同時間直至24小時)、第9天(治療後48小時)、d10(治療後3天)、d14(治療後7天)、d21(治療後14天)和d42(治療後35天)，從經麻醉的大鼠收集血清樣品。所收集的血清樣品用於基於電化學發光(electrochemoluminescence，ECL)的總PK測定形式，決定多肽濃度，然後進行非隔室分析(non-compartmental analysis)。

多肽在健康和OA大鼠血清中的保留係如圖11所示。

結果證實可見在健康老鼠與OA老鼠中，多肽的血清濃度無明顯差別。因此，這些結果支持軟骨降解對於本發明的多肽之藥物動力學沒有影響。

圖 1 ：在基於FRET的酶活性分析中藉由多肽949(「C010100949」，SEQ ID NO：1)對物種ADAMTS5的功能性抑制。V_i ：抑制酶反應的速度(進展曲線斜率)；V₀ ：不受抑制的反應的速度。每個點代表技術重複測量的平均值。誤差線：技術重複的標準偏差。此圖為3個獨立實驗之代表。

圖 2 ：在基於FRET的酶活性分析中藉由多肽949對人、食蟹猴(cynomolgus)和大鼠MMP13的功能性抑制。左：多肽949(ALX-1011)對物種cdMMP13的抑制。右：抑制物種活化的proMMP13(多肽949稱為C010100949)。V_i ：抑制酶反應的速度(進展曲線斜率)，V₀ ：未抑制反應的速度。Cd：催化結構域；pro：活化的pro-MMP13。每個點代表技術重複測量的平均值。誤差線：技術重複的標準偏差。圖為至少兩個獨立實驗之代表。

圖 3 ：多肽949(「NB949」)在牛軟骨外植體分析中的功效。與參考小分子聚集蛋白聚醣酶抑制劑(AGG-523，Wyeth)(其在這些條件下，完全抑制IL-1α刺激的GAG釋放，其設定為100%，未誘導的軟骨設定為0%)相比，計算功效(efficacy)。

圖 4 ：多肽949在人軟骨外植體分析中的功效。與參考小分子聚集蛋白聚醣酶抑制劑(AGG-523，Wyeth)(其在這些條件下，完全抑制IL-1α刺激的GAG釋放，其設定為100%，未誘導的軟骨設定為0%)相比，計算功效(efficacy)。

圖 5 ：多肽之CAP介導的軟骨錨定(CAP-mediated cartilage anchorage of polypeptides)在牛外植體分析中的效果。

圖 6 ：多肽949(「C010100949」或「MAC949」)抑制共培養物中C2M(Col II降解=結構)和C3M(Col III降解=與症狀相關)的釋放。

圖 7 ：軟骨保留(cartilage retention)：在大鼠的不同時間點的局部奈米體(Nanobody)構築體濃度。

圖 8 ：不同組中內側脛骨實質軟骨退化寬度(medial tibial substantial cartilage degeneration width)。

圖 9 ：內側脛骨實質軟骨退化寬度(medial tibial substantial cartilage degeneration width)。

圖 10 ：藉由狹窄走道(catwalk)進行步態(gait)分析

圖 11 ：每個關節(右膝)接受400μg奈米體構築體的單次關節內注射之骨關節炎大鼠和健康大鼠中第一次多肽劑量後的血清濃度(以ng/ml計的平均濃度)對時間(h)。點代表健康動物的個別濃度；三角形代表OA動物的個別濃度；以及線代表平均濃度。

<110> 德商麥克專利有限公司(Merck Patent GmbH) 比利時商艾伯靈司公司(Ablynx N.V.)

<120> 與ADAMTS5、MMP13及聚集蛋白聚醣結合的多肽

<130> MEPAT.0105

<140> TW107119217

<141> 2018-06-04

<150> EP17174404.8

<151> 2017-06-02

<160> 68

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 593

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 14

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 16

<210> 17

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 17

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 19

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 22

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 23

<210> 24

<400> 24 000

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 25

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 26

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 28

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 29

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 30

<210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 31

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 32

<210> 33

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 33

<210> 34

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 34

<210> 35

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 35

<210> 36

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 36

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 37

<210> 38

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 38

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 39

<210> 40

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 40

<210> 41

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 41

<210> 42

<211> 427

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 42

<210> 43

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 43

<210> 44

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 44

<210> 45

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 45

<210> 46

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 46

<210> 47

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 47

<210> 48

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 48

<210> 49

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 49

<210> 50

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 50

<210> 51

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 51

<210> 52

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 52

<210> 53

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 53

<210> 54

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 54

<210> 55

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 55

<210> 56

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 56

<210> 57

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 57

<210> 58

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 58

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 60

<210> 61

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 61

<210> 62

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 62

<210> 63

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 63

<210> 64

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 64

<210> 65

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 65

<210> 66

<211> 471

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 66

<210> 67

<211> 930

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 67

<210> 68

<211> 2415

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸序列

<400> 68

Claims

一種多肽，其選自由以下所組成的群組：(a)包括至少2種免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)的多肽，其中第一ISVD特異性結合基質金屬蛋白酶13(MMP13)以及第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣；以及(b)包括至少3種ISVD的多肽，其中第一ISVD特異性結合基質金屬蛋白酶13(MMP13)，第二ISVD特異性結合ADAMTS5，以及第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣；其中特異性結合MMP13的該ISVD包括3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)，其中(i)CDR1是SEQ ID NO：8；(ii)CDR2是SEQ ID NO：10；以及(iii)CDR3是SEQ ID NO：12；其中特異性結合ADAMTS5的該ISVD包括3個互補決定區域(分別為CRD1至CDR3)，其中(i)CDR1是SEQ ID NO：14[GRTVSSYAMG]；(ii)CDR2是SEQ ID NO：16[GISRSAERTY]；以及(iii)CDR3是SEQ ID NO：18[DLDPNRIFSREEYAY]；其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD包括3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)，其中(i)CDR1是SEQ ID NO：19或根據SEQ ID NO：19之胺基酸序列，其中SEQ ID NO：19中在位置7的N已經改變為S；及/或在位置9的V已經改變為M； (ii)CDR2是SEQ ID NO：21或根據SEQ ID NO：21之胺基酸序列，其中SEQ ID NO：21中在位置1的T已經改變為A；SEQ ID NO：21中在位置3的S已經改變為R；SEQ ID NO：21中在位置4的S已經改變為T；SEQ ID NO：21中在位置8的A已經改變為T；及/或SEQ ID NO：21中在位置9的N已經改變為D；以及(iii)CDR3是SEQ ID NO：23或根據SEQ ID NO：23之胺基酸序列，其中SEQ ID NO：23中在位置4的H已經改變為R；及/或SEQ ID NO：23中在位置8的V已經改變為D。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽包括特異性結合聚集蛋白聚醣的其他ISVD。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中第一ISVD特異性結合MMP13，第二ISVD特異性結合ADAMTS5，第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣以及第四ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中特異性結合MMP13的該ISVD包括或由SEQ ID NO：2組成。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中特異性結合ADAMTS5的該ISVD包括或由SEQ ID NO：3組成。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中在特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD中CDR1是SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21以及CDR3是SEQ ID NO：23。
如申請專利範圍第6項之多肽，其中特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD包括或由SEQ ID NO：4組成。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中該ISVD經由連接子而彼此連接。
如申請專利範圍第8項之多肽，其中該連接子是選自由SEQ ID NO：24至40所組成的群組。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中該第一ISVD特異性結合MMP13，該第二ISVD特異性結合ADAMTS5，該第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣以及第四ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣。
如申請專利範圍第10項之多肽，其中該多肽包括或由SEQ ID NO：1或62組成。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中該第一ISVD特異性結合MMP13，該第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣以及該第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣。
如申請專利範圍第1項之多肽，其中該第一ISVD特異性結合ADAMTS5，該第二ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣以及該第三ISVD特異性結合聚集蛋白聚醣。
如申請專利範圍第10項之多肽，其中(i)特異性結合MMP13的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與該3個互補決定區域CDR1至CDR3所組成；以及/或(ii)特異性結合ADAMTS5的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與該3個互補決定區域CDR1至CDR3所組成；以及/或(iii)特異性結合聚集蛋白聚醣的該ISVD基本上由4個框架區域(分別為FR1至FR4)與該3個互補決定區域CDR1至CDR3所組成。
一種構築體，其包括或基本上由如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽組成，並且其另包括結合血清白蛋白之結合單元。
如申請專利範圍第15項之構築體，其中該結合血清白蛋白之結合單元係經由一或多個胜肽連接子而連接。
一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽或如申請專利範圍第15或16項之構築體。
一種表現載體，其包括如申請專利範圍第17項之核酸。
一種宿主或宿主細胞，其包括如申請專利範圍第17項之核酸或如申請專利範圍第18項之表現載體。
一種組成物，其包括如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽或如申請專利範圍第15或16項之構築體，或如申請專利範圍第17項之核酸。
一種用於生產如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽之方法，該方法至少包括以下步驟：a)在合適的宿主細胞、宿主生物或合適的表現系統中，表現如申請專利範圍第17項所述的核酸；隨後b)分離與/或純化如申請專利範圍第1至14項中任一項所述的多肽。
如申請專利範圍第20項之組成物，其是醫藥組成物。
如申請專利範圍第22項之組成物，其進一步包括至少一醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑與/或佐劑。
如申請專利範圍第23項之組成物，其中該組成物包括一或多種其他醫藥活性多肽與/或化合物。
如申請專利範圍第22至24項中任一項之組成物、如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽或如申請專利範圍第15或16項之構築體，使用作為藥物。
如申請專利範圍第22至24項中任一項之組成物、如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽或如申請專利範圍第15或16項之構築體，用於治療關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病、骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病(aggrecanopathy)、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤或預防上述疾病之症狀。
一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之多肽、如申請專利範圍第15或16項之構築體或如申請專利範圍第22至24項中任一項之組成物在製備用於預防個體中的疾病或病症之症狀或治療該疾病或病症之藥物的用途，該預防或該治療包括投予有效治療或預防關節病和軟骨營養不良症、關節炎疾病、骨關節炎、類風濕性關節炎、痛風性關節炎、銀屑病關節炎、創傷性破裂或脫離、軟骨發育不全、肋軟骨炎、脊柱上頜骨發育不良、脊柱椎間盤突出症、腰椎間盤退化性疾病、退化性關節病、復發性多軟骨炎、剝脫性骨軟骨炎、聚集性疾病、NASH、慢性牙周炎和腹主動脈瘤之症狀的量之該多肽、該構築體或該組成物至該個體。