KR20150115106A - Zinc-ZIP8-MTF1 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골관절염의 발병과정에서 중요한 역할을 하는 Zinc-ZIP8-MTF1 축의 규명 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 ZIP8 및 MTF1은 관절 질환이 유도된 연골세포 또는 연골 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 매트릭스-분해 효소들(예컨대, MMP3, MMP9, MMP12, MMP13, ADAMTS5 등)의 발현을 유도한다. 또한, 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 ZIP8 또는 MTF1의 발현을 억제한 경우, 골관절염의 발병이 억제된다. 따라서 본 발명의 ZIP8 및 MTF1은 관절 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있으며, 이를 이용하여 관절 질환 치료제의 개발에도 이용될 수 있다.

Description

Zinc-ZIP8-MTF1 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical Compositions Comprising Inhibitors of Zinc-ZIP8-MTF1 as Active Ingredients for Preventing or Treating a Joint Diseas}
본 발명은 골관절염의 유발인자로서 ZIP8 및 MTF1의 신규한 용도에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis, OA)은 모든 관절염증의 가장 일반적인 형태이고, 큰 사회경제적 비용을 수반하는 신체적 장애(disability)의 대표적인 요인이다. 그러나 오늘날까지, 골관절염에 대한 효과적인 치료제는 개발되지 않고 있다. 골관절염은 주로 연골의 파괴에 의해 특징지어지만 관절의 모든 조직에서 병리학적인 변화를 수반하기도 한다(Bian et al., 2012; Loeser et al., 2012; Little and Hunter, 2013). 여기에는 활액막의 염증(synovial inflammation), 골극형성(osteophyte formation), 연골하 골경화증(subchondral bone sclerosis)이 포함된다. 골관절염의 발병은 동화인자(anabolic factor)와 이화인자(catabolic factor) 사이의 불균형에 의해 야기된다. 다양한 병의 위험요인들과 병리생리학적 과정들이 질병의 진행과정에 기여한다. 골관절염을 야기하는 잠정적인 메카니즘 가운데에서 관절의 불안정함, 부상을 포함하는 기계적인 스트레스들 및 노화와 같이 골관절염에 취약하게 하는 인자들이 중요하다. 이러한 인자들은 연골세포에서 생화학적인 회로들을 활성화시켜 결과적으로 매트릭스 메탈로프로데나아제(matrix metalloproteinases, MMP)와 아그레카나아제(aggrecanases, ADAMTSs)에 의해 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 분해하게 된다. 매트릭스-분해 효소들(matrix-degrading enzymes)중에서 MMP3, MMP13, ADAMTS5가 골관절염의 연골 파괴에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Blom et al., 2007; Glasson et al., 2005; Little et al., 2009).
매트릭스 분해 효소는 구조적인 구성요소로 아연(Zn2+)을 필요로 한다(Page-McCaw et al. 2007). 실제로 아연은 징크핑거(zinc finger) 및 징크클러스터(zinc cluster)와 같은 구조적인 지지대를 제공함으로써 다양한 단백질의 활성인자와 협동 활성인자로 작용을 한다(Prasad, 1995). 또한 아연이 세포내에 과도하게 축적되는 것은 명백히 세포에 유독하기도 하다. 그러므로 정상적으로 기능하는 세포는 아연의 항상성을 엄격하게 조절하는 것을 필요로 한다. 아연의 항상성은 배출자인 Slc30a family(ZNT)와 유입자인 Slc39a family(ZIP)로 이루어진 세포막의 아연 수송자들에 의해 주로 조절된다(Cousins et al., 2006). ZNT family는 포유류에서 10개의 구성원(ZNT1-ZNT10)으로 이루어져 있으며 세포로부터 아연의 배출 또는 세포기질에서 세포 사이의 소포체(intra-cellular vesicle)로의 아연의 유입을 매개한다. 아연 유입자인 ZIP family는 포유류에서 14개의 구성원(ZIP1-ZIP14)으로 이루어져 있으며 세포외액(extracellular fluid) 또는 세포 사이의 소포체로부터 세포질로의 아연의 유입을 증진시킨다. 아연 수송자는 조직 특이적인 기능을 나타내며(Liuzzi et al., 2005; Kitamura et al., 2006), 어떤 특정한 아연 수송자의 기능 이상은 장성말단피부염(acrodermatitis enteropathica) 같은 질병과 연관되어 있기도 하다(Kury et al., 2002). 아연의 유입은 다양한 세포들에서 수많은 전사인자(transcription factor)들을 조절한다. 이들 가운데 MTF1 (metal-regulatory transcription factor-1)은 다양한 타겟 유전자의 발현을 조절하는데 이로써 세포가 중금속 노출, 저산소상태(hypoxia), 산화스트레스(oxidative stress)와 같은 다양한 스트레스 조건에 적응하는 것을 조절한다. 아연이온의 항상성은 또한 저장 단백질의 금속 의존적인 전사 조절에 의해 조절되기도 한다. 예를 들어, 메탈로티오네인(metallothioneins, MT)의 유전자는 MTF1의 타겟으로 잘 알려져 있는데, 메탈로티오네인은 아연 저장 단백질로 작용하여 세포내의 아연 항상성을 조절한다. 메탈로티오네인은 또한 산화방지제로 작용하여 산화스트레스로부터 세포를 보호하기도 한다(Laity and Andrews, 2007; Colvin et al., 2010; Gunther et al., 2012).
골관절염의 발병과정에서 아연의 잠재적인 역할에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 임상적인 연구들은 골관절염 환자들의 혈청에서 아연 농도가 매우 향상되어 있다는 것을 보여주고 있으며(Ovesen et al., 2009), 노인집단에서 관절연골의 연골과 연골의 경계(tidemark) 부위에 아연의 특이한 축적이 있음을 보여주고 있기도 한다(Roschger et al., 2013). 아연과 골관절염 발병과정의 연관성은 아연이 매트릭스 분해 효소의 구조적인 구성요소로서의 측면에서 폭넓게 이해되고 있다. 하지만 골관절염의 발병과정과 진행과정에서 어떻게 아연의 항상성이 조절되며, 어떻게 아연이 관절 연골세포를 병적인 상태로 전이시키는데 기여하는지는 알려지지 않고 있다. 따라서 본 발명자들은 골관절염 발병과정에서 아연의 항상성, 항상성을 조절하는 아연 수송자들, 하위 전사인자들과 이들의 타겟 유전자의 역할을 연구하였고, Zinc-ZIP8-MTF1 축(axis)이 골관절염 발병과정에서 주요한 조절역할을 한다는 것을 발견하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 관절 질환, 특히 퇴행성관절염의 대표적인 예인 골관절염의 병인적 분자 요인 및 치료 타겟을 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포 내의 아연의 항상성(homeostasis)에 중요한 역할을 하는 ZIP8과 이와 관련된 MTF1이 골관절염의 발병과정과 밀접한 관계가 있으며, 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 관절 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 관절염의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절 질환-유발 형질전환 동물 모델을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현 억제제, 또는 ZIP8 또는 MTF1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 관절 질환, 특히 퇴행성관절염의 대표적인 예인 골관절염의 병인적 분자 요인 및 치료 타겟을 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포 내의 Zn2+의 항상성(homeostasis)에 중요한 역할을 하는 ZIP8과 이와 관련된 MTF1이 골관절염의 발병과정과 밀접한 관계가 있으며, 동물(예컨대, 인간 및 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 골관점염을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 발견하였다.
ZIP은 Slc39a(Solute-linked carrier 39a) 패밀리의 구성원들로서 아연을 비롯한 금속 이온들을 세포외에서 세포질내로 유입시키는 기능을 하는 세포막 수송자(membrane transporter)의 일종이다. 포유류에서는 14개의 구성원들이 발견되었으며 조직-특이적인 기능을 나타내고 있다. 어떤 종류의 ZIP의 기능 이상은 인간 질병과 관련되어있기도 하다. ZIP8은 이러한 ZIP family의 한 구성원으로서 인간과 마우스의 골관절염 연골에서 그 단백질 및 mRNA 발현이 현저하게 증가되어 있음이 관찰되었다(참고: 도 1f).
MTF1(metal-regulatory transcription factor)은 전사인자로서 칼슘, 아연, 구리, 은 등과 같은 중금속에 반응하여 금속의 항상성을 조절하는 것에 관련되어있는 메탈로싸이오닌(metallothionein) 및 다른 유전자들의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. MTF1은 세포가 중금속에 노출되었을 때 핵에 축적되어 금속-반응 요소(metal-responsive element, MRE)를 포함하고 있는 프로모터에 결합하여 작용한다.
본 발명은 골관절염 발병 과정에서 Zn2+의 유입, Zn2+ 유입자인 ZIP8 및 Zn2+ 의존적 전사인자인 MTF1으로 이루어진 Zn-ZIP8-MTF1 축이 중요한 조절인자임을 최초로 규명하였으며, 이를 이용하여 관절 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 증명하였다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 ZIP8 및 MTF1은 매트릭스-분해 효소들의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 증가시켰고, 보다 구체적으로는 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloprotenase, MMP)-3, MMP-9, MMP-12, MMP-13 및 ADAMTS5의 mRNA 또는 단백질 레벨을 증가시켰다(참고: 도 2a 및 f, 도 5i 및 j).
매트릭스-분해 효소들(matrix-degrading enzymes) 중에서 매트릭스 메탈로프로데나아제(matrix metalloproteinases, MMP)-3, MMP-13 및 ADAMTS-5가 골관절염의 연골 파괴에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이들은 연골세포의 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 분해하는 기능을 한다.
매트릭스 메탈로프로데나아제(MMPs)는 아연-의존적인 엔도펩티다아제이다. 이들은 모든 종류의 세포외기질을 분해할 수 있으며, 세포의 증식, 분화, 이동, 혈관생성 및 세포자살에서 중요한 역할을 하고 있다.
MMP-3는 콜라겐 타입 II, III, IV, IX 및 X, 프로테오글리칸(proteoglycans), 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 엘라스틴(elastin)을 분해하는 기능을 하며, 또한 MMP-1, MMP-7 및 MMP-9과 같은 다른 MMP를 활성화시키기도 한다. 따라서 MMP-3는 연결조직의 재구성에 있어 가장 주요한 인자로 여겨지고 있다.
MMP-9은 콜라겐 타입 IV 및 V 과 다른 세포외 기질을 분해하며 MMP-12는 엘라스틴을 분해하는 기능을 한다.
MMP-13는 인간에서 콜라게나제(collagenase) 3로 알려진 콜라겐 분해효소로서, 태아의 발달단계에서는 콜라겐 매트릭스의 재구성을 위해 필요하기 때문에 주로 골격에서 많이 발현된다. 병적인 상황에서 매우 고발현되는 것이 관찰되었는데, 암종(carcinoma), 류마티스 관절염 및 골관절염에서 이러한 현상이 일어난다.
ADAMTS5는 ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 단백질 family의 한 구성원으로서 두 개의 C-터미날 TS 모티프를 가지고 있으며, 연골의 주요한 프로테오글리칸인 아그리칸(aggrecan)을 분해하는 아그리카나제(aggrecanase)로 작용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 ZIP8 또는 MTF1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 ZIP8-인코딩 뉴클레오타이드 서열 및 MTF1-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열목록 제1서열(GenBank Accession No. NM_001135149) 및 서열목록 제3서열(GenBank Accession No. NM_008636)로 예시되어 있으며, 각 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 단백질들의 아미노산 서열은 서열목록 제2서열(GenBank Accession No. NP_001128622) 및 서열목록 제4서열(GenBank Accession No. NP_032662)에 예시되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 서열목록 제1서열(ZIP8) 또는 서열목록 제3서열(MTF1)에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNA를 포함한다.
본 발명에서 용어 "siRNA는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(ZIP8 또는 MTF1 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(ZIP8 또는 MTF1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기, 그리고 가장 바람직하게는 20-30 염기이다.
siRNA 말단 구조는 ZIP8 또는 MTF1 유전자의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로(in vitiro) 또는 인 비보(in vivo)에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명에서 ZIP8 또는 MTF1 단백질의 억제, 특히 활성을 억제하는데 이용되는 억제제는 바람직하게는 ZIP8 또는 MTF1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드, 작은 분자량의 화합물 또는 천연추출물이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 ZIP8 또는 MTF1 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. ZIP8 또는 MTF1 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 ZIP8 또는 MTF1 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
ZIP8 또는 MTF1에 특이적으로 결합하여 ZIP8 또는 MTF1의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).
ZIP8 또는 MTF1의 활성을 억제하는 작은 분자량의 화합물은 후술하는 스크리닝 방법을 통하여 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 및 골강내 주입 등으로 투여할 수 있다. 보다 바람직하게는 연골강내 주입으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
관절(joint)은 2개의 뼈가 만나는 지점으로, 통상적으로 섬유성 관절(fibrous joint), 연골성 관절(cartilagenous joint) 및 활막성 관절(synoval joint)로 분류될 수 있다. 관절 질환(joint diseases)은 포유동물(예를 들어, 인간) 관절에 영향을 미치는 질병 또는 상해로, 가장 잘 알려진 관절 질환으로 관절염이 있지만, 이 외에도 많은 질환들이 포함된다. 관절 질환은 지속적인 고통 또는 불편함, 일시적이거나 지속적인 만성 통증 또는 매우 큰 고통을 수반하며, 하나의 관절에 국한될 수 있을 뿐 아니라, 많은 부분의 골격에서도 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 관절 질환은 관절을 둘러싼 관절 연골 조직의 점진적인 변성(deterioration) 또는 파괴(destruction)를 의미한다. 관절염(arthritis)은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생긴 질환으로, 특히 골관절염(osteoarthritis, OA)은 관절염 질환들 중에서 가장 오래되고 가장 일반적인 질환들 중 하나로, 관절 연골(joints cartilage)의 파괴로 특징화되는 만성 상태를 나타내는 비염증성 관절 질환이며, 퇴행성 관절질환(degenerative joint disease), 변형성 관절증(ostoarthrosis), 비대성 관절염(hypertrophic arthritis) 또는 퇴행성관절염(degenerative arthritis)으로도 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에서는 언급하는 골관절염은 상술한 다른 명칭들과 상호 호환되어 사용될 수 있다.
퇴행성 관절 질환(degenerative joint diseases)은 무게를 함유한 관절들의 비감염성 진행성 질환(noninfectious progressive disorders)이다. 정상적인 관절 연골 조직은 부드럽고 투명한 백색을 나타내고, 콜라겐, 단백질 폴리사카라이드(polysaccharides) 및 물로 구성된 스폰지-유사 매트릭스에 임베드된 연골세포(chondrocytes)로 구성되어 있다. 초기 원발성 관절염 단계에서, 연골 조직은 불투명한 노란색으로 변하면서 국소적으로 부드러운 부위 및 거친 부위의 표면을 나타낸다. 퇴행이 진행됨에 따라서 상기 부드러운 부위(soft areas)가 점점 갈라지고 닳아서 연골 조직 내 뼈가 노출되게 된다. 이후, 상기 뼈는 리모델링을 시작하여 밀도를 증가시킨다. 최종적으로, 연골 조직에 의해 둘러쌓여졌던 골증식체(osteophytes; 신생 형성 뼈 돌출부)가 관절의 가장자리를 형성한다. 이로 인한 기계적 마모가 증대됨에 따라 연골 조직은 정비(repair)될 필요가 있지만, 손상된 연골세포는 충분한 양의 스폰지-유사 매트릭스를 생산할 수 없어서 자체적으로 이를 극복할 수 없다. 더욱이, 연골 조직은 치유를 수행하기 위한 혈액 공급도 원활하게 이루어지지 않는다. 대부분의 퇴행성 관절 질환은 기계적 불안정성(mechanical instabilities) 또는 관절 내 노화 상태의 변화로 인해 초래되며, 노인성 퇴행성 관절염(old age degenerative arthritis)을 포함한다. 젊은이들의 경우는, 손상, 타박상, 고관절 이형성증(hip dysplasia) 같은 비정상적 관절 형상(configuration) 또는 전방 십자인대 파열, 슬개골 탈구 또는 박리성 골연골염에 따른 기계적 마모에 의한 결과일 수 있다. 퇴행성 관절 질환은 무릎, 엉덩이, 어깨, 손 및 척추를 포함하는 신체의 관절 어디에서나 발생할 수 있다.
연골은 뼈의 끝 부위에 완충 기능(cushion)을 하여 관절이 쉽게 움직일 수 있도록 하는 관절의 한 부위이다. 연골의 파괴는 인접한 뼈들 간의 마모를 야기하고, 관절의 이동의 어려움으로 인한 경직(stiffness) 및 고통을 초래한다. 현재 관절염을 가지고 살아가는 사람의 수가 우리나라에서 약 200만명, 미국에서 약 2,700만 내지 3,500만 명으로 추산될 정도로 관절염은 발생빈도가 매우 높은 질환이다(Helmick, C., et al., Estimates of the Prevalence of Arthritis and Other Rheumatic conditions in the United States. Arthritis & Rheumatism, 58(1): 15-25(2008)). 불행하게도, 아직까지 발병원인에 대한 명확한 이해가 부족하기 때문에 그 치료법 또한 없는 실정이다. 실제로, 관절염은 많은 인자들(예를 들어, 나이, 비만, 상처, 관절의 과도한 사용, 유전적 원인, 등)에 의해 발병할 수 있기 때문에 발병 상황에 따라 그 치료 방법이 다양할 수 있다.
골관절염은 다음과 같은 다양한 단계로 나뉘어진다: (a) 연골이 탄력성을 잃어 상처나 이용에 의해 보다 더 쉽게 상처받는 단계; (b) 연골의 마모가 밑에 있는 뼈에 변화를 야기시키는 단계로, 뼈가 비후화되고 낭종이 발생할 수 있다. 돌기(spurs) 또는 골증식체(osteophytes)로 불리는 뼈의 증식이 영향 받은 관절에 있는 뼈의 말단에서 일어난다. 가려움과 고통을 야기한다; (c) 뼈 또는 연골의 조각이 관절강(joint space)에 느슨하게 부유하는 단계; 및 (d) 연골 파괴(breakdown)로 인해 관절막 또는 활액막에 염증을 일으키는 단계로, 연골에 손상을 입히는 사이토카인 및 효소를 추가적으로 야기시킨다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절 질환(joint diseases)의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) (i) ZIP8 단백질 또는 MTF1(metal-regulatory transcription factor-1) 단백질, 또는 (ii) ZIP8 인코딩 뉴클레오타이드 서열, MTF1 인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 두 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현 또는, 각 단백질의 활성을 분석하는 단계; 상기 시험물질이 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현 또는, 각 단백질의 활성을 억제시키면 관절 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 (i) ZIP8 단백질 또는 MTF1(metal-regulatory transcription factor-1) 단백질, 또는 (ii) ZIP8 인코딩 뉴클레오타이드 서열, MTF1 인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 두 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 처리(treatment)는 세포 또는 조직에 시험물질을 투여하여 세포 또는 조직과 시험물질의 접촉을 유도하여 시험물질의 효능을 분석 가능하게 하는 투여과정을 의미하며, 상기 용어는 투여(administration) 또는 접촉(contact)과 상호 호환되어 사용될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 구체적으로는 포유동물 세포이고, 보다 구체적으로는 관절(joint)-유래된 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 세포는 관절(joint)-유래된 세포이고, 보다 구체적으로는 가동관절(articulating joints)-유래된 세포이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 가동관절 조직은 손목, 팔꿈치, 어깨, 발목, 무릎, 엉덩이, 척추, 측두-하악 및 수근중수 관절을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 관절 조직은 대퇴골두(femoral heads), 대퇴골 관절(femoral condyles), 경골 고원부(tibial plateaus), 관골구관절(acetabulofemoral joint), 견쇄관절(acromioclavicular joint), 대퇴무릎관절(femoropatellar joint), 대퇴경골관절(femorotibial joint), 상완와관절(glenohumeral joint), 완요관절(humeroradial joint), 완척관절(humeroulnar joint), 지간관절(interphalangeal joint), 중수골관절(metacarpal joint), 요척관절(radioulnar joint) 및 발목관절(talocrural joint)로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상기 세포에 관절 질환을 유발시키는 단계(pre-a)를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, DMM 수술 같은 기계적 스트레스 또는 IL-1 같은 친-염증성 사이토카인들 또는 바이러스 주입을 통해 세포에 관절 질환의 상태를 유발함으로써 하기 단계의 분석을 보다 명확하게 실시할 수 있게 한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스는 관절내(IA) 주입 또는 복강내(IP) 주입을 통해 실시한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 시험물질은 ZIP8 또는 MTF1 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 시험물질은 화학물질, siRNA(small interference RNA), shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 앱타머 및 천연추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시료는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, 1-비드 1-화합물 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
이어, 시험물질이 처리된 세포에서 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현, 또는 이들 단백질의 활성을 측정한다. 측정결과 이들 유전자 또는 단백질의 발현 또는 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시험물질은 관절 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 스크리닝 방법에 의해 발견된 관절 질환의 예방 또는 치료용 물질은 골관절염, 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절증 또는 관절염, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 관절증(arthroses), 연골 결손(isolated chondral defect), 무릎 연골연화증(chondromalacia patellae), 활막염, 활액낭염, 외상성 삼출(traumatic effusion), 인대 결핍 관절증(ligamentous deficiency arthroses), 이단성 골연골염(osteochondritis dissecans, OCD), 슬개골 불안정성(patellar instability), 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 소년성 관절염(juvenile arthritis), 외상 후 관절염, 염증성 관절염, 감염으로 인한 관절염(septic arthritis), 낭창(lupus), 공피증(scleroderma), 건염, 섬유조직염, 섬유근육염 또는 다발성 근염의 치료 또는 예방에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 ZIP8 또는 MTF1의 발현을 분석하여 실시하는 경우, ZIP8 또는 MTF1 유전자의 발현량 변화 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press) 또는 cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, ZIP8 또는 MTF1 유전자에 특이적인 프라이머(primer) 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 ZIP8 또는 MTF1 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
또한, ZIP8 또는 MTF1 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블랏팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 보다 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, -갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟(예컨대, ZIP8 또는 MTF1 단백질)에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, ZIP8 또는 MTF1 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, -갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 ZIP8 또는 MTF1의 활성을 분석하여 실시하는 경우, ZIP8 단백질의 활성은 세포 내의 Zn2+ 레벨을 측정함으로써 분석할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 연골세포에 IL1를 처리하는 경우 ZIP8의 발현양이 증가함과 동시에 세포 내 Zn2+ 레벨이 증가하는데, Zip-siRNA를 넣어주는 경우에는 Zn2+ 증가효과가 차단된다. 따라서 어떤 시험물질이 ZIP8 단백질의 활성을 억제한다면 세포 내로의 Zn2+ 유입이 차단되어 세포 내 Zn2+ 레벨이 증가하지 않게 될 것으로 예상할 수 있다.
또한, MTF1 단백질의 활성은 상업적으로 이용 가능한 전사인자 활성 분석키트를 이용하여 MTF1의 전사 활성을 측정함으로써 분석할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 연골세포에 Ad-Zip8을 감염시킨 경우, MTF1의 전사 활성이 세배이상 증가하는 것으로 나타난다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 관절 질환의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 분리된 인간의 생물학적 시료에 있는 ZIP8 단백질 또는 ZIP8 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 MTF1 단백질 또는 MTF1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 관절 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어생물학적 시료는 인체 또는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 연골(특히, 관절 연골)의 세포 또는 조직, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 ZIP8 또는 MTF1은 연골, 특히 관절연골 시료에 포함되어 있다. 따라서 본 발명의 ZIP8 또는 MTF1은 관절염의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으므로, 관절염의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 ZIP8 또는 MTF1은 골관절염(osteoarthritis), 퇴행성관절염(degenerative joint disease), 박리성 골연골염(osteochondritis dissecans), 관절 인대손상(ligamentinjuries), 반월상 연골판 손상(meniscus injuries), 관절의 부정정렬(malalignment of joint), 무혈성 괴사증(osteonecrosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathicarthritis), 외상(trauma), 염증성 관절염(inflammatory arthritis) 또는 감염(infection)으로 인한 관절염(septic arthritis)을 예측 또는 진단하는데 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 골관절염 또는 퇴행성관절염을 예측 또는 진단하는데 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 골관절염을 매우 정확하게 예측 또는 진단하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 관절염 상태의 동정, 관절염의 단계 결정 또는 치료에 대한 관절염의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예후"는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 관절염 재발 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 관절염 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.
본 발명의 마커는 관절염에서 고발현되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 고발현은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 하여, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 2-5배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 고발현으로 판정하고 관절염이 발병 또는 발생했다고 판정한다.
본 발명의 방법은 상술한 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현량을 분석하는 과정을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 스크리닝 방법과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 방법을 이용한 진단 또는 예후 분석에서 ZIP8 또는 MTF1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 경우, 이용되는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)는 ZIP8 또는 MTF1 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 관절 연골(articular cartilage) 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 관절 질환 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다. 이러한 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 관절염 여부를 판단할 수 있다. 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) 및 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 관절 질환 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절 질환 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 관절 연골세포 또는 연골 조직)보다 강하게 나오는 경우에는 관절 질환으로 진단된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 관절 질환 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 실시간(real-time) PCR을 이용하여 실시한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) ZIP8-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 MTF1-인코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked) 되어 있는 전사조절서열을 포함하는 발현 컨스트럭트가 도입된 인간을 제외한 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 발현벡터를 수정란에 마이크로인젝션하여 형질전환된 수정란을 수득한 후, 대리모(예컨대, 마우스)의 자궁에 착상시키고 다음 세대 동물(예컨대, 마우스)을 수득하여 PCR 유전형검사를 통해 형질전환된 동물을 제작한다.
본 발명은 관절 질환을 유발하기 위한 표적인자인 ZIP8 또는 MTF1 를 포함하는 재조합 발현벡터(발현 컨스트럭트)를 이용하여 형질전환된 동물(구체적으로는, 마우스)를 제조하고, 이를 관절 질환을 연구하기 위한 동물모델 시스템으로 제공한다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 서열목록 제 1서열(ZIP8) 또는 서열목록 제 3서열(MTF1)에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 간략하게는, 본 발명의 재조합 발현벡터는 (a) 목적하는 발현대상물질-인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트; (b) 상기 컨스트럭트에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하고, 보다 구체적으로는 (a) 서열목록 제 2서열(ZIP8)의 아미노산 서열 또는 서열목록 제 4서열(MTF1)의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트; 및 (b) 상기 컨스트럭트에 작동적으로 연결된(operatively linked) 전사조절서열을 포함하며, 보다 더 구체적으로는, (a) 서열목록 제 2서열(ZIP8)의 아미노산 서열 또는 서열목록 제 4서열(MTF1)의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트; (b) 상기 컨스트럭트에 작동적으로 연결된(operatively linked) 전사조절서열; 및 (c) 동물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하고, 가장 구체적으로는 (a) 서열목록 제 1서열(ZIP8) 또는 서열목록 제 3서열(MTF1)에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트; (b) 상기 컨스트럭트에 작동적으로 연결된(operatively linked) Col2a1의 프로모터 및 인핸서 서열; 및 (c) 동물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 재조합 발현벡터이다.
본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 서열목록 제 1서열(ZIP8) 또는 서열목록 제 3서열(MTF1)에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 세포(예를 들어, 연골세포) 또는 조직(예를 들어, 본 발명에서 형질전환된 마우스의 연골조직)에서 mRNA 또는 단백질 레벨의 발현이 증가하기 때문에, 동물(예컨대, 마우스)에서 관절 질환과 관련된 연구에 유용성을 갖는다. 또한, ZIP8 또는 MTF1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변형도 본 발명에 속한다는 것은 당업자에게 자명하다. 즉, 목적단백질의 검출을 위해 표지인자가 융합된 변형체들도 본 발명의 범위에 속한다는 것은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 목적단백질의 검출을 위해 목적단백질에 융합될 수 있는 단백질은 GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), 루시퍼라제 또는 이의 변이체들(예컨대, EGFP, ECFP, EYFP, ERFP, EBFP, 등)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 전사조절서열 또는 프로모터는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 발현벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 언급되는 용어 작동적으로 결합된(operatively linked)은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 전사조절서열은 인핸서(enhancer)를 추가적으로 포함한다.
본 발명에 있어서, ZIP8 또는 MTF1 유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 결합된 전사조절서열은 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포, 보다 더 구체적으로는 인간 또는 마우스 세포, 가장 구체적으로는 연골세포에서 작동하여 ZIP8 또는 MTF1 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, Col2a1 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터(예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터(예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 구체적으로는, Col2a1 프로모터이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로모터는 연골세포-특이적인 프로모터이며, 보다 구체적으로는 인핸서(enhancer)를 추가적으로 포함하고, 가장 구체적으로는 연골세포-특이적인 Col2a1의 인핸서를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 컨스트럭트는 상기 프로모터 및 ZIP8 또는 MTF1 -인코딩 뉴클레오타이드 서열 사이에 인트론 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 ZIP8 또는 MTF1-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트는 전사조절서열-ZIP8 또는 MTF1 -인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열의 구조를 갖는다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 골관절염의 발병과정에서 중요한 역할을 하는 Zinc-ZIP8-MTF1 축의 규명 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 ZIP8 및 MTF1은 관절 질환이 유도된 연골세포 또는 연골 조직에서 발현이 증가하고, 다양한 매트릭스-분해 효소들(예컨대, MMP3, MMP9, MMP12, MMP13, ADAMTS5 등)의 발현을 유도한다.
(C) 또한, 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 ZIP8 또는 MTF1의 발현을 억제한 경우, 골관절염의 발병이 억제된다.
(c) 따라서, 본 발명의 ZIP8 및 MTF1은 관절 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있으며, 이를 이용하여 관절 질환 치료제의 개발에도 이용될 수 있다.
도 1은 병적 상태에 있는 연골 세포와 OA 연골에서 아연 유입을 매개하는 ZIP8이 상향 조절되어 있다는 것을 보여주는 결과이다.
도 1a는 IL1를 처리한 관절의 연골세포에서 qRT-PCR을 이용하여 금속 이온 수송자들의 mRNA 레벨을 측정한 결과이다(n = 10). 삽입된 것은 IL1를 처리한 연골세포에서 ZIP8의 웨스턴블랏팅 결과이다.
도 1b는 연골세포를 Ad-C 또는 Ad-Zip8로 감염시킨 연골세포를 지시된 농도의 ZnCl2, FeCl2, MnCl2 또는 CdCl2를 처리한 후에 Zn2+, Fe3+, Mn2+, Cd2+의 세포 내 레벨을 측정한 결과이다.
도 1c는 ZnCl2 또는 IL1를 처리한 연골세포에서 컨트롤이나 Zip8 siRNA를 넣거나 넣지 않고 세포내의 Zn2+ level을 이미지하고 정량한 결과이거나, Ad-Zip8로 감염시킨 연골세포에 금속 킬레이터인 CaEDTA 또는 TPEN을 넣거나 넣지 않고 세포내의 Zn2+ level을 이미지하고 정량한 결과이다(n = 512).
도 1d는 Ad-Zip8로 감염시킨 연골세포에 치료용 ZIP8항체를 넣거나 넣지 않고 세포내의 Zn2+ 레벨을 정량한 결과이다.
도 1e 및 1f는 연골을 알시안 블루(alcian blue) 또는 사프란닌-O(safranin-O)로 염색한 결과, 형광단으로 Zn2+를 이미징하거나 정량한 결과, ZIP8을 면역염색으로 검침한 결과 및 qRT-PCR로 ZIP8 mRNA를 정량한 결과이며, 각 결과들은 도 1e는 인간의 OA 연골에서, 도 1f는 DMM 수술에 의해 유도된 마우스 OA 연골에서 실험한 결과이다(n 8).
스케일바: 50 . 측정값들은 평균 표준오차로 표현됨(*P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 2는 ZIP에 의해 매개된 아연의 유입이 연골세포에서 매트릭스 분해 효소들의 상향조절을 유도한다는 결과이다.
도 2a 및 b는 Ad-C 또는 Ad-Zip8을 감염시킨 연골세포에서 CaEDTA 또는 TPEN을 넣거나 넣지않고, 또는 100의 ZnCl2, FeCl2, MnCl2 및 1의 CdCl2를 처리하거나 처리하지 않은 상태에서의 mRNA 레벨을 qRT-PCR을 사용하여 정량한 결과이다(n 6).
도 2c는 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 감염시킨 세포에서 표시된 농도의 철 킬레이터인 Zn/DFO, 2,2-bipyridy1 또는 망간 킬레이터인 para-aminosalicylic acid (PAS)를 넣거나 넣지 않고 각각 표시된 mRNA를 검침한 결과이다(n = 4).
도 2d는 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 감염시킨 연골세포에서 1 TPEN 또는 1의 표시된 금속이온을 넣거나 넣지않은 상태에서 매트릭스 분해 효소들의 mRNA 레벨을 측정한 결과이다(n = 5).
도 2e는 IL1를 처리한 연골세포에서 컨트롤 또는 Zip8 siRNA 및 TPEN 또는 CaEDTA를 넣거나 넣지 않은 상태에서, ZIP8과 매트릭스 분해 효소들의 mRNA 레벨을 측정한 결과이다.
도 2f는 매트릭스 분해 효소들의 발현을 웨스턴블랏팅으로 조사한 결과이다.
측정값들은 평균 표준오차로 표현됨(*P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 3은 연골 조직에서 ZIP8의 과발현이 마우스에서 OA 발병을 일으킨다는 것을 보여주는 결과이다.
도 3a는 마우스에 IA 방법으로 Ad-eGFP 를 주입하고(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간), 처음 주입 후 21일째에 마우스를 희생시켰다. 형광현미경으로 GFP를 관찰하고, GFP-파지티브 연골세포를 정량화한 결과이다(n = 5).
도 3b는 Ad-C 또는 Ad-Zip8을 TPEN을 넣거나 넣지 않은 상태로 IA 방법으로 마우스에 주입한 다음, 연골에서 ZIP8, MMP3, MMP13를 면역염색 방법으로 검침하고, Zn2+을 형광단을 사용하여 이미징한 결과이다.
도 3c는 마우스에 IA 방법으로 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 주입하고(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간), 처음 주입 후 21일째에 마우스를 희생시켰다. 면역 염색방법으로 반월상 연골(meniscus), 인대(ligament), 활액막(synovium)에서 ZIP8 단백질을 검출한 결과이다.
도 3d는 연골의 파괴를 사라핀-O로 염색에 의해 검침한 결과이며, 도 3e는 OARSI 등급에 의해 정량화한 결과이다(n 13). 도 3f는 마우스에 IA 방법으로 Ad-Zip8를 단독으로 또는 TPEN (0.1 / 체중)과 함께 주입하였다(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간). 처음 주입 후 21일째에 마우스를 희생시켰다. 활액막염을 사라핀-O/헤마톡실린 염색 방법(safranin-O/hematoxylin staining)으로 관찰한 후 정량화한 결과이다(n 13).
도 3g는 마우스의 섬유아세포와 유사한 활막세포(fibroblast-like synoviocyte)를 일차 배양하여, Ad-C (800 MOI) 또는 Ad-Zip8 (표시된 MOI)로 감염시킨 후, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 표시된 mRNA를 RT-PCR로 검출한 결과이다(n = 4).
도 3h는 마우스에 IA 방법으로 Ad-Zip8를 주입하고(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간), 처음 주입 후 8주째에 마우스를 희생시켰다. 연골의 파괴, 연골하 골경화증 및 골극의 성숙도를 사라핀-O 염색방법으로 분석하고 정량화한 결과이다(n = 10).
도 3i는 12주된 와일드 타입 마우스와 Zip8 TG 마우스에서 얻은 연골 절편을 ZIP8, MMP3, MMP13에 대해 면역 염색한 결과와 Zn2+을 형광단을 사용하여 이미징한 결과이다.
도 3j는 Col2a1-Zip8 TG 마우스와 와일드타입 마우스의 반월상 연골(meniscus), 인대(ligament), 활액막(synovium)에서 면역 염색방법으로 ZIP8 단백질을 검출하였다.
도 3k는 12개월된 Col2a1-Zip8 TG 마우스와 와일드 타입에서 자발적인 연골의 파괴를 사라핀-O 염색방법으로 조사한 결과이다. TG 마우스는 OARSI 등급 1에서 6까지 다양한 정도의 연골 파괴를 보여주었으나, 와일드 타입은 OA와 연관되어 있는 현상들을 나타내지 않았다(n = 16).
도 3l은 12주된 와일드 타입 마우스와 Zip8 TG 마우스에서 자발적인 연골의 파괴를 보여주는 결과이다(n = 16).
도 3m 및 n은 12주된 와일드 타입 마우스와 Zip8 TG 마우스에서 연골하 골경화증(f)과 활액막염(g)을 보여주는 결과이다(n = 16).
도 3o는 18에서 20 주된 DMM 수술을 한 와일드 타입 마우스와 Zip8 TG 마우스에서 연골의 파괴를 보여주는 결과이다(n = 12).
도 3p는 의수술 또는 DMM-수술을 한 Col2a1-Zip8 TG 마우스 및 와일드 타입(18-20 주령)에서 활액막염과 연골하 골경화증을 분석하고 정량화한 결과이다. 스케일바: 50 . 측정값들은 평균 표준오차로 표현됨(*P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 4는 마우스에서 Zip8의 유전적인 제거가 OA 발병을 차단한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 4a는 DMM수술 또는 모의 수술을 한 Zip8 fl/f 및 연골세포 특이적인 CKO 마우스에서 얻은 연골 절편을 사라핀-O로 염색한 결과이다. 연골의 파괴는 OARSI 등급에 의해 정량화하였다(n = 10).
도 4b는 Zip8 fl/fl 및 Zip8-CKO 마우스에서 DMM 또는 모의 수술을 한 다음, 연골 절편에서 CRE, ZIP8, MMP3, MMP13에 대해 면역 염색 방법으로 검침한 결과이다.
도 4c 및 d 는 Zip8 fl/fl 및 Zip8-CKO 마우스에서 분리된 연골세포를 1차 배양하고 IL1를 처리한 다음 형광단을 사용하여 Zn2+를 이미징하고 정량한 결과이며, 도 4c는 ZIP8의 mRNA 레벨을, 도 4d는 매트릭스 분해요소들의 mRNA 레벨을 qRT-PCR로 분석한 결과이다(n4).
도 4e는 DMM 또는 모의 수술을 한 Zip8 fl/fl 및 Zip8-CKO 마우스에서 활액막염을, 도 4f는 연골하 골경화증과 골극 형성을 보여주는 결과이다(n = 10).
스케일바: 50 . 측정값들은 평균 표준오차로 표현됨(*P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 5는 ZIP8에 의해 매개된 아연의 유입이 MTF1의 활성화를 통해 매트릭스 분해 효소들을 상향 조절함을 보여주는 결과이다.
도 5a는 일차배양한 관절의 연골세포에 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 2시간 동안 주입하고(800 MOI) 추가로 24시간 동안 배양하였다. 표시된 전사인자들의 전사활성을 전사인자 분석 키트(Cignal 45-Pathway Reporter Array)로 분석한 결과이다.
도 5b는 연골세포를 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 2시간 동안 주입하고(800 MOI) 추가로 24시간 동안 표시된 농도의 SC-514(NFB 억제), pifithrin-(p53 억제) 또는 tanshinone A(API억제)가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 배양하였다. 표시된 유전자의 mRNA 레벨을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 5c는 연골세포에 미리 100 nM의 컨트롤 siRNA (C-siRNA) 또는 표시된 농도의 각각 Nrf1, Nrf2, Cebpa 또는 Cebpb를 타겟팅하는 siRNA를 처리한 후, Ad-C 또는 Ad-Zip8(800 MOI)로 두 시간동안 감염시키고 다시 24시간 동안 배양하였다. 표시된 유전자의 mRNA 레벨을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 5d는 컨트롤 또는 Mtf1-siRNA가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 Ad-C 또는 Ad-Zip8)로 감염시키거나, 또는 ZnCl2를 처리한 연골세포에서 mRNA 레벨을 분석한 결과이다.
도 5e는 연골세포를 Ad-C 또는 Ad-Zip8로 감염시킨 다음, 표시된 농도의 mithramycin A(SP1 억제제)가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 24시간 동안 배양하였다. 표시된 mRNA를 RT-PCR로 검출하고 qRT-PCR로 정량화한 결과이다(n 6).
도 5f는 MTF1에 대해 면역염색한 다음 핵에 위치한 MTF1을 가진 세포들을 정량한 결과이다.
도 5g는 연골세포에 ZnCl2를 처리하거나 Ad-C, Ad-Zip8 또는 Ad-Mtf1을 TPEN을 넣거나 넣지 않은 상태로 감염시킨 후에 리포터 유전자 분석방법에 의해 MTF1의 전사 활성을 정량화한 결과이다(n = 9).
도 5h는 연골세포에 아무것도 처리하지 않거나 Ad-C(800 MOI) 또는 표시된 MOI에서 Ad-Mtf1 또는 Ad-Zip8fh 2시간 동안 감염시킨 후, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 또는, 연골세포에 표시된 농도의 ZnCl2 또는 CdCl2를 24시간 동안 처리하였다. MTF1 mRNA 및 단백질 레벨을 RT-PCR 및 웨스턴 블랏팅으로 각각 분석한 결과이다.
도 5i는 Ad-C 또는 Ad-Mtf1 (n5)을 감염시킨 연골세포에서 CaEDTA 또는 TPEN 을 넣거나 넣지 않은 상태에서 mRNA 레벨을 측정한 결과이다.
도 5j는 MTF1과 매트릭스 분해 효소들의 단백질 레벨을 측정한 결과이다. 도 5k는 컨트롤 또는 Mtf1-siRNA가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 Ad-C 또는 Ad-Zip8)로 감염시키거나, 또는 ZnCl2를 처리한 연골세포에서 mRNA 레벨을 분석한 결과이다.
도 5l은 연골세포에 표시된 금속 이온을 24시간 동안 처리하였다. MTF1이 핵에 위치하는 것을 면역 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5m은 연골세포에 표시된 금속 이온을 24시간 동안 처리하고, MTF1의 전사 활성을 분석한 결과이다(n = 4).
도 5n은 연골세포를 Ad-C 또는 Ad-Zip8(800 MOI)로 감염시킨 다음, TPEN (1 uM) 또는 표시된 금속 이온과 미리 배양한 TPEN을 처리하거나 처리하지 않았다. 전사 활성을 리포터 유전자 분석방법으로 분석한 결과이다(n = 4).
측정값들은 평균 표준오차로 표현됨 (*P < 0.01, **P < 0.001).
도 6는 마우스의 OA 발병에서 MTF1이 이화작용의 조절인자임을 보여주는 결과이다.
도 6a는 인간의 OA 연골에서 MTF1 단백질과 전사체의 레벨을 각각 면역염색, qRT-PCR로 조사한 결과이다(n = 10).
도 6b 및 d는 마우스를 Ad-C 또는 Ad-Mtf1으로 감염시킨 다음, 도 6b는 연골 절편에서 MTF1, MMP3, MMP13에 대해 면역 염색한 결과이며, 도 6d는 사라핀-O 염색과 연골 파괴를 측정한 결과이다(n 14).
도 6c 및 6e는 마우스에 IA 방법으로 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 주입하고(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간), 처음 주입 후 21일째에 마우스를 희생시켰다. 도 6c는 면역 염색방법으로 반월상 연골(meniscus), 인대(ligament), 활액막(synovium)에서 ZIP8 단백질을 검출하고, MTF1 단백질 발현을 연골, 반월상 연골, 인대, 활액막에서 면역 염색방법 의해 분석한 결과이다.
도 6e는 Ad-C- 또는 Ad-Mtf1을 주입한 마우스의 무릎 관절에서 활액막염의 대표적인 이미지를 보여주는 것이다 (n 14).
도 6f는 마우스의 섬유아세포와 유사한 활막세포(fibroblast-like synoviocyte)를 일차 배양하여, Ad-C (800 MOI) 또는 Ad-Mtf1 (표시된 MOI)로 감염시킨 후, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 표시된 mRNA를 RT-PCR로 검출한 결과이다(n = 4).
도 6g는 마우스에 IA 방법으로 Ad-Mtf1을 주입하고(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간), 처음 주입 후 8주째에 마우스를 희생시켰다. 무릎 연골에서 연골의 파괴, 연골하 골경화증 및 골극의 형성을 사라핀-O 염색방법으로 분석한 결과이다(n = 10).
도 6h 및 i는 DMM 또는 모의 수술을 한 Mtf1 fl/fl 및 Mtf1-CKO 마우스에서 연골 절편을 얻은 다음, 도 6h는 사라핀-O 염색과 연골 파괴를 측정한 결과이며(n = 10), 도 6i는 CRE, MTF1, MMP3, MMP13에 대해 면역 염색을 한 결과이다.
도 6j는 DMM 또는 모의 수술을 한 Mtf1 fl/fl 및 Mtf1-CKO 마우스에서 연골하 골경화증/골극 형성 및 활액막염을 관찰한 결과이다(n = 10).
도 6k는 Mtf1fl/fl 마우스에 IA 방법으로 Ad-C 또는 Ad-Cre를 주입하고(1 x 109 PFU), 1주일 후, Ad-C를 주입한 마우스에 다시 IA 방법으로 Ad-C 또는 Ad-Zip8를 주입하였다(1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩, 3주간). Ad-Cre-주입한 마우스에 Ad-Zip8 (1 x 109 PFU) 또는 Ad-Cre (1 x 109 PFU)를 일주일에 한 번씩 3주간 추가로 주입하였다. 마우스는 첫 번째 주입 후, 28일째 희생시켰다. 연골 파괴와 활액막염을 사라핀-O염색방법으로 분석하고 정량화하고(n = 10), CRE 및 MTF1 단백질을 면역염색 방법으로 검출한 결과이다.
도 6l은 Zip8 fl/fl 마우스에 IA 방법으로 Ad-C 또는 Ad-Cre를 주입하였다. Ad-C 주입한 마우스에 Ad-C 또는 Ad-Mtf1 (1 x 109 PFU, 일주일에 한 번씩)를 세 차례 추가적으로 IA 방법으로 주입하였다. Ad-Cre-주입한 마우스에 Ad-Mtf1 (1 x 109 PFU) 또는 Ad-Cre (1 x 109 PFU)를 3주 동안 추가로 주입하였다. 마우스는 첫 번째 주입 후, 28일째 희생시켰다. 연골 파괴와 활액막염을 사라핀-O 염색방법으로 분석하고 정량화하고(n = 10), CRE 및 ZIP8 단백질을 면역염색 방법으로 검출한 결과이다.
도 6m은 모의 수술 및 DMM-수술을 한 마우스에 낮은 농도의 Zn2+ (<0.5 mg zinc/kg), 적정 농도의 Zn2+ (30 mg zinc/kg) 또는 높은 농도의 Zn2+ (300 mg zinc/kg)을 먹이로 공급한 후에, 각각의 마우스로부터 무릎 관절 절편을 준비하였다. 연골 파괴를 사라핀-O 염색방법으로 분석하고 정량화한 결과이다(n = 10). 도 6n은 모의 수술 및 DMM-수술을 한 마우스에 일주일에 두 차례씩 PBS 또는 ZnCl2 (5 / 체중)를 복강내에 주사하였고, 수술 후 6주 째에 마우스를 희생시켰다. 무릎 관절 절편을 사라핀-O 염색방법으로 염색하여 연골의 파괴정도를 분석한 결과이다(n = 10).
스케일바: 50 . 측정값들은 평균 표준오차로 표현됨(*P <0.001).
도 7은 마우스에서 Mt1 및 Mt2의 이중 넉아웃이 OA 발병을 촉진시킨다는 것을 보여주는 결과이다.
도 7a는 Ad-Zip8 또는 Ad-Mtf1을 감염시키거나 ZnCl2를 처리한 연골세포에서 MT1 및 MT2의 mRNA 레벨을 측정한 결과이다(n 6).
도 7b는 ZnCl2를 처리하거나 Ad-Zip8, Ad-Mtf1 또는 Ad-Mt2을 감염시킨 연골세포에서 MT1/MT2 단백질을 검침한 결과이다.
도 7c 내지 e는 DMM 또는 모의 수술을 한 와일드 타입 및 Mt1 -/- Mt2 -/- 이중 넉아웃 마우스에서 연골의 파괴(c), 활액막염(d), 골극 형성 및 연골하 골경화증(e)를 보여주는 결과이다(n = 13).
스케일바: 50 . 측정값들은 평균 표준오차로 표현됨 (*P < 0.005, **P < 0.001).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
인간 OA 연골조직
4등급 ICRS(International Cartilage Repair Society grade 4) 인간 OA 연골조직은 인공관절(arthroplasty) 수술을 받은 개인들(51세부터 72세까지)로부터 얻었다. 상기 물질들의 이용은 원광대학교 병원의 IRB(Institutional Review Board)에 의해 승인되었으며, 모든 개인들이 수술 전에 동의서(full written informed consent)를 제공하였다.
마우스 및 실험적 OA
웅성 마우스(C57BL/6, Col2a1-Zip8 TG, Zip8 +/-, Zip8 fl/fl, Zip8 fl/fl Col2a1-Cre, Mtf1 +/-, Mtf1 fl/fl, Mtf1 fl/fl Col2a1-Cre, Mt1 -/- Mt2 -/-)를 본 OA 연구에 이용하였다. 연골세포-특이적인 Zip8 TG(Col2a1-Zip8) 마우스를 Col2a1 프로모터 및 인핸서를 이용하여 제조하였다. Zip8 +/- 마우스를 The European 마우스 Mutant Archive로부터 구입하였다. 이 연구과제에 사용된 Mtf1 마우스 계통은 Wellcome Trust Sanger Institute에서 만들어진 ES 세포 클론으로부터 만들어졌으며 KOMP Repository and the 마우스 Biology Program at the University of California, Davis에 의해 마우스로 발달하였다. 각각 Zip8 fl/fl 와 Mtf1 fl/fl 마우스를 만들기 위하여 Zip8 +/- 및 Mtf1 +/- 마우스를 Actb-Flp1 TG 마우스(The Jackson Laboratory)와 교배하였다. 그리고 연골세포에 특이적인 CKO 마우스(Zip8 fl/fl;Col2a1-Cre 와 Mtf1 fl/fl;Col2a1-Cre)를 만들기 위해 이들 마우스를 Col2a1-Cre TG 마우스 (The Jackson Laboratory)와 교배하였다. Mt1 -/- Mt2 -/- double-KO 마우스는 The Jackson Laboratory로부터 구입하였다. 인브레드 계통인 129S1/SvImJ를 Mt1 -/- Mt2 -/- 이중 넉아웃 마우스에 대한 대조군으로 사용하였다. 이 연구에서 사용된 모든 마우스는 정상적인 골격의 발달을 보여주었다. 동물들은 병원체-부재(pathogen-free) 조건 하에서 사육하였다. 모든 실험들은 광주과기원 동물실험윤리위원회(animal care and use committee)에 의해 승인되었다. 실험적 OA는 DMM 수술로 유도하였으며 모의 수술(sham operation)을 대조군으로 실시하였다. 조직학적 분석을 위해 DMM 수술 후 8주 째에 무릎 관절을 준비하였다. 하지만 Col2a1-Zip8 TG 마우스 및 Mt1 -/- Mt2 -/- double-KO 마우스를 포함하는 연구에서는 수술 후 기간을 6주에 맞추었다. 실험적 OA는 10주 내지 12주-령의 웅성 마우스에 Ad-Zip8 또는 Ad-Mtf1(10 l의 총 용량에 1109 PFUs)을 일주일에 한 번씩 3주 동안 IA(intra-articular) 주입하여 유도하였다. 공벡터 아데노바이러스(Ad-C)를 IA 방법으로 주입하여 대조군으로 사용하였다. 마우스는 조직학적 및 생화학적 분석을 위한 첫 번째 IA 주입 후 3주 또는 8주째에 희생시켰다. 지시되어 있는 곳에서는 마우스에 0.1 mg/kg의 TPEN을 함께 주입하였다.
조직학 및 면역조직학 분석
동결건조된 인간 OA 연골조직을 10 의 두께로 절편화시켜 파라포름알데하이드에 고정하였다. 설페이트 프로테오글라이칸(sulfate proteoglycan)을 알시안 블루(alcian blue) 염색으로 검출하였다. 인간 ZIP8은 면역염색을 통해 검출하였다. 마우스 연골조직 파괴는 사프라닌(safranin)-O 염색으로 조사하였다. 간략하게는, 무릎 관절 조직을 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 0.5 M EDTA로 칼슘을 제거한 후, 파라핀에 임베드(embed)하였다. 파라핀 블락을 5 두께로 절편화하였다. 연속 절편들을 40 간격으로 전체 관절로부터 얻었다. 상기 절편들은 자일렌으로 탈파라핀화시키고 등급 에탄올로 수화시킨 후 사프라닌-O로 염색하였다. 연골조직 파괴는 만킨스 방법을 이용하여 2명의 관찰자(blinded observers)에 의해 스코어링하였다(Glasson et al., 2010). 활막염(synovitis)은 사프라닌-O 및 헤마톡실린 염색으로 조사하여 이전에 기재된 방법에 따라 정량하였다(Yang et al., 2010). 골극의 발달은 사프라닌-O 염색에 의해 구별하였고 골극의 성숙도는 이전에 기재된 방법에 따라 정량화하였다(Oh et al., 2012). 연골하 골경화증은 연골하 골판의 두께를 측정함으로써 결정하였다(Zhen et al., 2013). 연골절편의 면역 염색에 사용된 항체들은 다음과 같다. 인간 연골조직 절편에서 ZIP8 및 MTF1은 각각 Proteintech (20459-1-AP) 및 Novus (NBP1-86380)에서 구입한 항체로 검출하였다. 마우스 관절조직 절편에서 면역 염색을 위해 다음의 항체들을 사용하였다: anti-CRE는 Covance (MMS-106P), anti-MMP3는 Epitomics (1908-1), anti-MMP13는 Epitomics (1923-1), anti-MTF1는 Novus (NBP1-86380), anti-MT1/MT2는 Novus (NBP1-97493), and anti-ZIP8는 Santa Cruz Biotechnology (SC-133415)로부터 각각 구입하였다. 웨스턴블랏팅을 위해 ADAMTS5 항체는 Thermo Scientific (PA5-14350), ERK1 항체는 BD Biosciences (610408), MMP3 항체(1908-1) 및MMP13 항체(1923-1)는 Epitomics, MTF1 항체는 Novus (NBP1-86380), ZIP8 항체는 Santa Cruz Biotechnology(SC-133415)에서 구입하였다.
관절 연골세포의 1차 배양
연골세포를 이전에 기재된 방법에 따라 마우스의 대퇴골 관절(femoral condyles) 및 경골 고원부(tibial plateaus)로부터 분리하였다(Yang et al., 2010, Ryu et al., 2012, Oh et al., 2012). 연골세포는 10% 태아 상태의 소의 혈청과 항생제들로 보충된 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium)에서 단일층(monolayer)으로 유지하였으며, 각 실험에서 지시된 바와 같이 배양 2일 차 세포들에 처리하였다.
아데노바이러스, 연골세포 감염 및 IA 주입
마우스 Zip8(Ad-Zip8)과 Mtf1(Ad-Mtf1)을 발현하는 아데노바이러스는 Vector Biolabs.로부터 구입하였다. 마우스 관절 연골세포는 2일 동안 배양하여 지시된 MOI(multiplicity of infection)의 공벡터 바이러스(Ad-C), Ad-Zip8, 또는 Ad-Mtf1로 2시간 동안 감염시키고 24시간 동안 배양시킨 후에 이어지는 분석에 사용하였다.
아연 이온의 이미징과 정량
세포내의 아연이온은 아연이온에 선택적인 형광단인 FluoZin-3 AM(Invitrogen)을 사용하여 검출하였다. 일차 배양한 관절의 연골세포와 연골조직의 냉동 절편을 0.02% 및 0.1% Pluronic F-127(Invitrogen)을 넣은 상태에서 각각 1과 5 FluoZin-3 AM 으로 37에서 30분간 처리하였다. 그리고 세포들을 Ca2+와 Mg2+가 없는 PBS(phosphate-buffered saline)로 씻어주고 37에서 30분간 추가로 배양하였다. 세포 내의 아연이온의 이미지는 형광 현미경을 사용하여 얻었으며 파퓰레이션-와이드 형광세기는 Spectramax Gemini 마이크로플레이트 형광 리더기(Molecular Devices)를 사용하여 여기는 488 nm, 컷-오프는 515 nm, 발광은 530 nm에서 측정하였다.
MTF1 활성 리포터 유전자 분석 및 면역염색
MTF1 리포터 유전자 분석키트는 SABiosciences에서 구입하였고, 연골세포는 MRE(metal response element)와 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제로 구성된 리포터 컨스트럭트로 Lipofectamine 2000(Invitrogen)를 사용하여 6시간 동안 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 Ad-Mtf1 or Ad-Zip8으로 2시간 동안 감염시키거나 금속 이온을 처리하였다. 처리 후 24시간이 지나 세포들을 수확하였고, 불파리(firefly) 루시퍼라아제 및 레닐라(renila) 루시퍼라아제 활성을 이중 루시퍼라아제 분석 시스템(Promega)을 이용하여 측정하였다. 면역염색을 위해서 세포를 얼음을 사용하여 차갑게한 4% 파라포름알데하이드(pH 7.4)로 고정시킨 후, 0.2% Triton X-100을 첨가한 PBS를 사용하여 투과할 수 있는 상태로 만들고(permeabilization) 이어서 Image-iT FX Signal Enhancer (Invitrogen)와 10% 염소 혈청/0.1% 소의 혈청을 포함하고 있는 PBS로 차단하였다. MTF1은 면역 형광 현미경을 사용하여 검침하였다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 얻었으며 각 조건마다 적어도 200개의 세포들을 여러 위치에서 조사하여 핵내의 MTF1에 긍정적인 세포들(nuclear MTF1-positive cells)을 정량하였다.
RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction), 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), siRNA 및 ZIP8에 대한 치료용 항체
총 RNA는 TRI 시약(Molecular Research Center Inc.)을 이용하여 1차 배양된 연골세 추출하였다. 무릎 관절로부터 RNA를 분리하기 위해, 연골조직을 칼로 긁어서 연골을 제거하고 TRI 시약과 Purelink RNA mini kit (Ambion)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 역전사시켜 얻은 cDNA를 PCR로 증폭하였다. PCR 프라이머 및 실험 조건은 표 1에 요약되어 있다.
PCR 프라이머 서열 및 조건
유전자 가닥 프라이머 서열 크기
(bp) 		AT
() 		기원
Adamts4 S
AS		 5-CATCCGAAACCCTGTCAACTTG-3
5-GCCCATCATCTTCCACAATAGC-3		 281 58 마우스
Adamts5 S
AS		 5-GCCATTGTAATAACCCTGCACC-3
5-TCAGTCCCATCCGTAACCTTTG-3		 292 58 마우스
Cre S
AS		 5- CAATGCTGTTTCACTGGTTATGCG -3
5- AGCTACACCAGAGACGGAAATCCATC -3		 364 58 재조합
GAPDH S
AS		 5-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3
5-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3		 300 62 인간
Gapdh S
AS		 5-TCACTGCCACCCAGAAGAC-3
5-TGTAGGCCATGAGGTCCAC-3		 450 58 마우스
Mmp2 S
AS		 5-CCAACTACGATGATGAC-3
5-ACCAGTGTCAGTATCAG-3		 233 60 마우스
Mmp3 S
AS		 5-TCCTGATGTTGGTGGCTTCAG-3
5-TGTCTTGGCAAATCCGGTGTA-3		 102 58 마우스
Mmp9 S
AS		 5-ACCACATCGAACTTCGA-3
5-CGACCATACAGATACTG-3		 212 58 마우스
Mmp12 S
AS		 5-CCCAGAGGTCAAGATGGATG-3
5-GGCTCCATAGAGGGACTGAA-3		 482 60 마우스
Mmp13 S
AS		 5-TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGG-3
5-CATCCACATGGTTGGGAAGTTCT-3		 473 58 마우스
Mmp14 S
AS		 5-GTGCCCTAGGCCTACATCCG-3
5-TTGGGTATCCATCCATCACT-3		 580 62 마우스
Mmp15 S
AS		 5-GAGAGATGTTTGTGTTCAAGGG-3
5-TGTGTCAATGCGGTCATAGGG-3		 260 62 마우스
Mt1 S
AS		 5-CAACTGCTCCTGCTCCACCG-3
5-CCCTGGGCACATTTGGAGCAG-3		 132 58 마우스
Mt2 S
AS		 5-AGCCCTGGGAGCACTTCGCAC-3
5-ACCCCAACTGCTCCTGTGCCTC-3		 138 58 마우스
MTF1 S
AS		 5-TCTGGAACTGTTTATGATAGG-3
5-CTGAGGCTGTAAGAGGTAAGG-3		 446 58 인간
Mtf1 S
AS		 5-GTTTTAATGGTGATGCAGAGTCCGTC-3
5-GGGATTATTAGTTAGGACAGAGTTGGC-3		 461 62 마우스
Mtf1 S
AS		 5-CCAGTGCACCTTTGAGGGATG-3
5-TCACACTCAAATGGCTTCTCCTT-3		 189 62 마우스
(KO)
Zip1 S
AS		 5-AGTAGGGCTGGAAGTGAAGC-3
5-GAAGACCAGGACACAAGCAC-3		 484 62 마우스
Zip2 S
AS		 5-ATGACTGCTGAAGCTCTGGA-3
5-TGAACACCACAAGCCCCTTA-3		 436 58 마우스
Zip3 S
AS		 5-TGGTGGGTTTCTTCCTCACT-3
5-GGTGACAAACAGGAAGGTGC-3		 566 62 마우스
Zip4 S
AS		 5-AAGATGGGCCTTGTAGCCAT-3
5-ACTGCTAGAGCCACGTAGAG-3		 427 64 마우스
Zip5 S
AS		 5-ATTGACAGCCGTGTTTGCAT-3
5-GAGGGGCTAGAGATGGTGAG-3		 523 58 마우스
Zip6 S
AS		 5-GTCACACGGTTGCTGGTAAA-3
5-AAGCTCTTTCTGGGCTCACT-3		 361 62 마우스
Zip7 S
AS		 5-CTTCGTGCTGTTCCTCATCC-3
5-CCACGAAAGGAAGCACCAAT-3		 576 58 마우스
ZIP8 S
AS		 5-ACGATTGCCTGGATGATAACGCTC-3
5-GGTAATGAGTAGAATGGCTGTGAATCC-3		 450 64 인간
Zip8 S
AS		 5-GAACAATTGCCTGGATGATCACGC-3
5-AAGCCGGTTAACATCCCTGCATTC-3		 430 62 마우스
Zip8 S
AS		 5-CTAAGAAAGCACAACGCAAAGCC-3
5-CCAATAGCGAGTCCCACGAAATAAG-3		 167 62 마우스
(KO)
Zip9 S
AS		 5-GTGTGTCCCTTGTATTGGGC-3
5-CACTTCAGGGAGGACATGGA-3		 473 62 마우스
Zip10 S
AS		 5-AGACCAGAGTGAAGACGACC-3
5-AGTGCAACAAGGAACGTGAG-3		 360 62 마우스
Zip11 S
AS		 5-CCTTCTTCACCTGGGCAATG-3
5-AAGCCCAGTGCTACCTATCC-3		 401 62 마우스
Zip12 S
AS		 5-TCATCGCTCTGTCACTCCAA-3
5-CATGGAGCCCAAGGTTAGGA-3		 515 58 마우스
Zip13 S
AS		 5-AACTGGGGCTATGGGTCATC-3
5-GGTAACACATTCACCAGGGC-3		 535 62 마우스
Zip14 S
AS		 5-ATTGTCAACTCCATGTCTGTGCAGG-3
5-CTGTCGTTCTTCTCATCCTCCTGG-3		 464 64 마우스
Znt1 S
AS		 5-TGATCGTGGTCGTGAATGCCTTG-3
5-CGAATTCAGGCTGGATGGTGGTAG-3		 486 61 마우스
Znt2 S
AS		 5-ATTCATGTGATTGGGGACCTTCTGC-3
5-TCTCAATCTGGATGGTCATGGTGTG-3		 403 64 마우스
Znt3 S
AS		 5-CTTCCTCCGCCTGCTTCATAGTG-3
5-TAAGTAAGCGTCAGGGCCCACAG-3		 498 58 마우스
Znt4 S
AS		 5-AAGCATGGTATCTAGTGGACACAAC-3
5-CACTTCTTGTCTGTAACTCTGGAGC-3		 487 61 마우스
Znt5 S
AS		 5-TCTCTCATCATGCCTTTCACCACAG-3
5-ACGCCATAGAACAACTCCACAAAGG-3		 509 61 마우스
Znt6 S
AS		 5-TGCTAGAAGTCCGAAATGAACAC-3
5-CTATATGGCCTTGTCTGTGTGTTC-3		 394 58 마우스
Znt7 S
AS		 5-TCATGATGGCAGAGGCAATTACAC-3
5-TCAGAAGGAGTCGAGAGAGCATTG-3		 409 61 마우스
Znt8 S
AS		 5-GATGTACAAGCTAATGCCAGTG-3
5-CTGAATGGTAAGAGAGTGAAGATC-3		 429 61 마우스
Znt9 S
AS		 5-GTTATTCTATTGGAGGACACTGCAG-3
5-GGCTTCTAATTGTTCAGGAGTCTTC-3		 414 61 마우스
Znt10 S
AS		 5-CCGAGAATGAACCAGAAGAGACGACG-3
5-TGCTGGCATCCTGGTATTCCGTG-3		 435 64 마우스
약어: AT, 어닐링 온도; S, 센스; 및 AS, 안티센스
전사체의 레벨은 qRT-PCR을 사용하여 정량하였다. Zip8과 Mtf1을 목표로 하는 siRNA는 Dharmacon으로부터 구입하였으며 Lipofectamine 2000을 사용하여 형질전환 하였다. 비-타겟팅(scrambled) siRNA를 음성대조군으로 사용하였다. 연골세포는 siRNA와 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 6시간 동안 배양하는 방법으로 형질전환 하였으며, 위에 기재한 방법에 따라 아데노바이러스로 감염시켰다. ZIP8의 기능 저해를 목표로 하는 치료용 항체는 Santa Cruz와 MyBioSourcet사로부터 구입하였으며, 연골세포에 24 시간동안 처리하여 주었다.
웨스턴 블랏팅
총 세포 용해물을 용해 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris, 5 mM NaF)을 이용하여 제조하였고 ZIP8, MTF1, ERK와 같은 세포내 단백질의 검출에 이용하였다. 분비된 단백질(MMP3, MMP13, ADAMTS5)은 900 의 혈청-부재 조건 배지(conditioned medium)를 TCA(trichloroacetic acid) 침전시킨 후 검출하였다. 모든 용해 완충액은 프로테아제 억제제들 및 포스파타제 억제제들(Roche)의 칵테일을 포함하였다. 항체들에 대한 정보들은 다음과 같다. 인간 연골조직 절편에서 ZIP8 및 MTF1은 각각 Proteintech (20459-1-AP) 및 Novus (NBP1-86380)에서 구입한 항체로 검출하였다. 마우스 관절조직 절편에서 면역 염색을 위해 다음의 항체들을 사용하였다: anti-CRE는 Covance (MMS-106P), anti-MMP3는 Epitomics (1908-1), anti-MMP13는 Epitomics (1923-1), anti-MTF1는 Novus (NBP1-86380), anti-MT1/MT2는 Novus (NBP1-97493), and anti-ZIP8는 Santa Cruz Biotechnology (SC-133415)로부터 각각 구입하였다. 웨스턴블랏팅을 위해 ADAMTS5 항체는 Thermo Scientific (PA5-14350), ERK1 항체는 BD Biosciences (610408), MMP3 항체(1908-1) 및MMP13 항체(1923-1)는 Epitomics, MTF1 항체는 Novus (NBP1-86380), ZIP8 항체는 Santa Cruz Biotechnology(SC-133415)에서 구입하였다.
통계 분석
OARSI 등급과 같은 서수 등급 시스템에 기반하여 정량된 데이터는 비모수(non-parametric) 통계학적 방법들을 이용하여 분석하였다. 상대적인 배수 변화(fold changes)로 표시된 qRT-PCR 데이터는 먼저 샤피로-윌크(Shapiro-wilk) 검정을 이용하여 정규 분포(normal distribution)을 확인한 후 쌍대 비교(pair-wise comparisons) 및 다중 비교(multi-comparisons)를 위해 각각 Students t-검정 및 사후검정(post hoc test)을 포함하는 ANOVA(analysis of variance)를 이용하였다. 통계적으로 유의성은 0.05 레벨의 확률로 받아들여졌다(P < 0.05).
실험결과
아연의 유입 매개체인 ZIP8은 병적 상태에 있는 연골세포 및 OA 연골에서 상향조절된다
OA 발병과정에서 아연의 항상성의 역할, 그리고 관련된 조절 유전자들을 밝히기 위해, 우선 본 발명자들은 마우스의 관절 연골세포의 일차 배양에서 금속 이온 수송자들(transporter)-배출자인 Slc30a family(ZNT)와 유입자인 Slc39a family(ZIP)-의 발현레벨을 조사하였다. 조사된 수송자들 가운데에서 ZNT9과 ZIP7 mRNA가 연골세포에서 상대적으로 높게 발현이 된 반면에 다른 나머지 수송자들은 거의 발현되지 않았다 (도 1a). 그러나 관절의 연골에서 이화작용을 증진시키는 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 인터루킨(IL)1을 처리한 후에는 ZIP8의 발현레벨이 현저하게 증가하였으며, 결과적으로 ZIP8이 ZNT와 ZIP family 구성원 가운데 가장 지배적으로 발현되는 수송자가 되었다 (도 1a). 이러한 결과는 본발명명자들로 하여금 OA 발병과정에서 ZIP8의 역할을 조사하게 하였다. ZIP8은 Zn2+, non-transferrin bound Fe2+, Mn2+, Cd2+를 수송하는 것으로 알려져 있다(Dalton et al., 2005; Wang et al., 2012). 그러므로 본 발명자들은 마우스 관절의 연골세포에서 ZIP8 수송자가 이러한 금속 이온들을 수송하는지를 조사하였다. 연골세포에서 ZIP8의 과발현은 현저한 Zn2+ 유입을 야기한 반면에(도 1B, 1C), Fe2+, Mn2+, Cd2+의 세포 내 수준은 ZIP8 하나만의 과발현에 의해서는 영향을 받지 않았다(도 1b). 하지만 각각의 금속 이온을 보충하는 어떤 범위 내에서는 ZIP8이 효과적으로 이러한 금속 이온들의 유입을 이끌어내었는데 본 발명의 실험 조건에서는 Zn2+이 명백하게 가장 효율적으로 ZIP8에 의해 수송되었다. 이는 ZIP8에 의한 각각의 금속 이온의 수송 효율성이 세포내의 미세한 환경적인 측면에 의해 결정된다는 것을 제시해준다. 그래서 본 발명자는 ZIP8에 의한 Zn2+ 유입의 조절을 더 깊이 연구하였다. ZIP8에 의해 매개된 아연 유입의 증가는 세포에 불투과적인 금속 이온 킬레이터(chelator)인 calcium-saturated EDTA (CaEDTA) 또는 세포에 투과적인 킬레이터인 TPEN[N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine]에 의해 차단되었다 (도 1c). ZIP8의 전사체와 단백질 레벨을 모두 증가시키는 IL1는 연골세포에서 아연의 유입을 일으켰으며 이런 유입은 Zip8을 small interfering RNA(siRNA)로 하향 조절하는 것에 의해 또는 금속 이온 킬레이터인 CaEDTA나 TPEN에 의해 차단되었다(도 1c). 또한, 연골세포에 Ad-Zip8을 감염시킨 다음, 연골세포에 ZIP8에 대한 항체를 넣고 24시간 배양한 후에 아연의 유입을 정량적으로 측정한 결과, ZIP8에 의한 아연 유입 증가 효과가 억제되었다(도 1d).
병적인 조건에서(예, IL1에 노출)의 연골세포에서 ZIP8과 아연 유입의 상향 조절은 ZIP8에 의해 매개된 아연 유입이 OA 발병과정과 연관되어 있을 가능성을 제시해준다. 이러한 가능성을 인간과 마우스 모델의 OA 연골에서 ZIP8의 발현과 아연 레벨을 조사하여 평가하였다. OA에 영향을 받는 인간 연골의 손상은 alcian blue staining에 기초하여 확립하였다(도 1e). 또한 본 발명자들은 OA 마우스 모델로 DMM(destabilization of the medial meniscus) 수술을 이용하였고, 이를 속임수로 작동하는 관절(sham-operated joint)에서 정상적인 연골과 비교하였다(Glasson et al., 2007). 인간의 OA 연골과 유사하게 마우스 OA 연골은 아연과 ZIP8 단백질과 mRNA 발현의 현저한 증가를 보여주었다(도 1f).
연골세포에서 ZIP8에 의해 매개되는 아연 이온의 유입은 매트릭스 분해 효소들(matrix-degrading enzyme)의 상향 조절을 유도한다
OA 연골에서 ZIP8의 발현 증가와 아연 레벨의 향상은 이들이 OA 발병과정에 관련되어있을 가능성을 제시해준다. OA 연골세포의 특징은 MMPs 와 ADAMTSs와 같은 아연과 결합한 매트릭스-분해 효소들의 생산이 증가되는 것이다. 그러므로 본 발명자들은 ZIP에 의해 유도된 세포 내의 아연 유입이 매트릭스 분해 효소들의 발현을 일으키는데 충분한지를 조사하였다. 아데노바이럴(Adenoviral) Zip8 발현 컨스트럭트(Ad-Zip8)를 연골세포에 주입한 결과, 이러한 효소들 가운데 MMP3, MMP9, MMP12, MMP13, ADAMTS5이 현저하게 상향 조절되었으며 이러한 효과는 CaEDTA 또는 TPEN에 의한 금속 이온 킬레이션에 의해 차단되었다(도 2a). 이러한 결과와 일치하게 연골세포에 ZnCl2를 처리한 경우에는 MMP3, MMP9, MMP12,MMP13이 상향 조절되었으며, 반면에 CdCl2나 MnCl2를 처리한 경우에는 매트릭스 분해 효소들의 뚜렷할만한 발현을 일으키지 않았다(도 2b). FeCl2를 처리한 경우에는 매트릭스 분해 효소들의 적절한 발현을 일으키었다. 하지만 철과 아연/DFO 또는 2,2-bipyridyl과의 각각의 킬레이션은 Ad-Zip8에 의해 유도된 매트릭스 분해 효소들의 발현에 영향을 미치지는 않았는데(도 2c), 이는 ZIP8이 외부에서의 FeCl2의 보충 없이는 철의 유입을 일으키지 않는다는 사실과 일치한다. 또한 ZnCl2을 TPEN과 함께 미리 배양한 경우, ZIP8에 의해 매개되는 매트릭스 분해 효소들의 발현에 대한 TPEN의 차단 효과가 없어졌다. 반면에 FeCl2, CdCl2, MnCl2는 ZIP8에 의해 매개되는 매트릭스 분해 효소들의 상향조절에 대한 TPEN 차단에 중요한 영향을 미치지 않았다(도 2d). 종합적으로 이러한 결과들은 ZIP8에 의해 수송되는 금속 이온 중에서 아연이 매트릭스 분해 효소들의 발현 조절에 매우 중요한 역할을 하고 있다는 것을 제시해 준다. ZIP8이 조절하는 매트릭스 분해 효소들 가운데에서 MMP3, MMP13, ADAMTS5이 OA 연골 파괴에 중요한 영향을 미치는 인자들이다(Blom et al., 2007; Glasson et al., 2005; Little et al., 2009). 실제로 IL1에 의한 이러한 효소들의 상향조절은 특정한 siRNA에 의한 Zip 유전자의 넉다운이나 CaEDTA, TPEN에 의한 금속 이온 킬레이션에 의해 차단된다(도 2e, 2f). 종합적으로 이러한 결과들은 ZIP8에 의해 매개되는 아연의 유입이 매트릭스 분해 효소들을 상향조절하는 역할을 함으로써 연골세포에서의 이화 기능에 영향력을 미친다는 것을 제시한다.
마우스의 연골조직에서 ZIP8의 과발현은 OA 발병과정을 야기한다
마우스의 무릎 관절에 Ad-Zip8을 IA(intra-articular)주입 방법으로 주입하여 OA 발병과정에서 ZIP8에 의해 매개되는 아연 유입의 역할을 직접적으로 조사하였다. 본 발명자들은 이전에 아데노바이러스 시스템이 효과적으로 유전자를 마우스의 관절 조직에 전달한다는 것을 보여준 바 있으며(Yang et al., 2010, Ryu et al., 2011 and 2012; Oh et al., 2012), 또한 Ad-eGFP를 주입함으로써 이 시스템을 사용한 유전자 전달을 확인하였다 (도 3a). Ad-Zip8 주입은 연골, 관절의 반월판(meniscus), 인대, 윤활막에서 ZIP8의 과발현을 일으키었다(도 3b 및 3c). Ad-Zip8를 주입하고 3주 후에 연골조직의 연골세포들은 아연, MMP3, MMP13의 현저한 증가 (도 3b)와 함께 동시에 연골의 파괴(도 3d 및 3e)를 나타내었다. Ad-Zip8의 주입은 또한 활액막염(synovitis)를 일으키었다 (도 3f). 이러한 결과와 일치하게 일차 배양된 마우스의 섬유세포와 유사한 윤활막세포에서 ZIP8의 과발현은 다양한 이화 인자들의 상향 조절을 일으키었는데, 여기에는 매트릭스 분해 효소, 사이토카인, 케모카인들이 포함된다(도 3g). 추가적으로, Ad-Zip8에 의해 유도된 MMP 발현, 연골 파괴, 활액막염은 TPEN을 동시에 주입함으로써 현저하게 차단되었다. 골극의 발달이나 연골하 뼈경화증과 같은 다른 명백한 OA 특징들은 Ad-Zip8 주입이 이루어진 후 3주때까지 관찰되지 않았다. 그러나 IA 주입후 8주 후에는 관절 조직들이 더 심각한 연골의 파괴와 함께 골극의 형성과 연골하 골경화증을 나타내었다(도 3h). 종합적으로, 이러한 결과들은 ZIP8에 의해 매개되는 아연 유입이 OA 발병과정에서 이화 조절인자로 작용한다는 것을 보여준다.
연골세포에서 특이하게 Zip8을 과발현하는 형질전환 마우스(Col2a1-Zip8)를 이용하여 OA 발병과정에서 ZIP8에 의해 매개되는 아연 유입의 생체적 역할이 더 밝혀졌는데, 여기에서 Zip8의 발현은 마우스 Col2a1의 프로모터와 인핸서 부분에 의해 유도되었다. Col2a1-Zip8 형질전환 마우스는 관절조직의 연골과 반월판에서 ZIP8의 현저한 발현 증가를 보여주었으나 윤활막과 인대에서는 그렇지 않았다(도 3i 및 3j). Zip8 형질 전환 마우스는 또한 연골 조직에서 아연, MMP3, MMP13의 증가된 레벨을 보여주었다(도 3i). 이러한 결과와 일치하게 나이가 든(12개월된) Zip8 형질 전환 마우스는 OARSI 등급이 1에서 6 범위이면서(도 3k), 자발적인 연골의 파괴를 보여주었으며(도 3l), 와일드 타입 마우스와 비교하여 연골하 골경화증을 나타내었다(도 3m). 하지만 Zip8 형질전환 마우스에서 활액막염은 관찰되지 않았다 (도 3n). 추가적으로, 어린 Zip8 형질전환 마우스(10-12 주된)에서 DMM 수술은 OA 연골의 파괴와 연골하 골경화증을 현저하게 향상시켰으며(도 3o), 반면에 활액막염과 골극의 발달은 영향을 받지 않았다(도 3p). Zip8 형질전환 마우스는 연골 조직에서 ZIP8 과발현이 충분히 OA 발병과정을 야기할 수 있다는 생각을 확실하게 지지해준다.
마우스에서 Zip8 넉아웃은 실험적인 OA 발병과정을 억제한다
다음으로 본 발명자들은 Zip8 넉아웃 마우스를 이용하여 OA 발병과정에서 ZIP8의 이화작용의 역할을 확인하였다. 마우스에서 Zip8 유전자를 모두 제거하는 것(Zip8 -/-)은 배아상태에서 치명적이기 때문에 (Galvez Peralta et al., 2012), 본 발명자들은 연골세포에 특이적인 조건적인 넉아웃 마우스(conditional KO)인 Zip8-CKO (Zip8 fl/fl;Col2a1-Cre)를 사용하여 OA 발병과정에 있어서 Zip8 넉아웃의 영향을 평가하였다. Zip8-CKO 마우스는 DMM 수술에 뒤따르는 OA 연골 파괴에 있어 현저한 감소를 보여주었으며(도 4a), 연골조직에서 ZIP8 발현차단, 아연이온의 유입 차단, MMP3와 MMP13의 발현차단이 수반되었다(도 4b). 이러한 결과와 일치하게 Zip8-CKO 마우스에서 분리된 일차 배양된 연골세포에서 IL1에 의해 유도된 아연 이온의 유입과 MMP3, MMP13, ADAMTS5의 발현이 감소되었다(도 4c, 4d). DMM을 시술한 Zip8-CKO 마우스는 연골의 파괴와 함께 연골하 골경화증의 현저한 차단을 보여준 반면에 활액막염과 골극형성은 영향을 받지 않았다.(도 4e, 4f). 이러한 결과들은 종합적으로 Zip8을 유전적으로 제거하는 것이 마우스에서 실험적인 OA 발병과정을 차단한다는 것을 제시해준다. Zip8 CKO 마우스와 유사하게 Zip8 +/- 마우스 역시 DMM 수술에 따르는 OA 연골 파괴와 연골하 골경화증이 감소되는 것을 보여주었다.
ZIP8에 의해 매개되는 아연 이온의 유입은 MTF1의 전사 활성을 증진시킴으로써 매트릭스를 분해하는 효소들을 상향조절한다
다음으로, ZIP8이 매개하는 아연 이온의 유입이 어떠한 조절 메카니즘에 의해 이화작용 인자들의 발현과 OA 발병과정을 매개하는지를 밝히었다. 이를 위해 본 발명자들은 전사 인자 분석 키트(array kit)를 사용하여, 연골세포에서 ZIP8이 매개하는 아연 이온의 유입에 의해 활성화되는 전사인자들을 찾아내었다. 조사된 37개의 전사인자들 가운데에서, Ad-Zip8을 감염시킨 후에 MTF1, NRF1, NRF2, NF-B, SP1, p53, C/EBP, AP1이 전사 활성에 있어 3배 이상의 증가를 보이었다(도 5a). p53, AP1, NF-B의 약물학적인 차단 또는 siRNA에 의해 매개된 Nrf, Cebpb 유전자의 넉다운은 Ad-Zip8에 의해 유도된 매트릭스 분해 효소들의 상향조절에 어떠한 중요한 영향도 미치지 않았다(도 5b 및 5c). 하지만 Mtf1을 siRNA로 넉다운하거나 SP1을 mithramycin-A로 차단시킨 경우에는 매트릭스 분해 효소들의 상향조절히 현저하게 약화되었다(도 5d 및 5e). 이와 같은 관찰 결과와 MTF1이 중금속에 노출된 조건하에서 세포의 적응에 있어 가장 중요한 전사 조절인자라는 사실(Laity and Andrews, 2007; Gunther et al., 2012)에 기초하여, 본 발명자들은 ZIP8에 의해 유도되는 OA 발병과정에서의 기능적인 특징들을 밝히기 위해 MTF1을 선택하였다. Ad-Zip8 감염은 MTF1이 핵에 위치하는 것(nuclear localization)을 증진시켰으며(도 5f) 그것의 전사 활성을 현저하게 증가시켰는데(도 5g), 이는 MTF1의 발현 없이 일어났다(도 5h). 특히, Ad-Mtf1 감염은 매트릭스 분해 효소들(MMP3, MMP9, MMP12, MMP13, and ADAMTS5)의 발현과 CaEDTA or TPEN에 의해 차단되는 효과를 현저하게 증가시켰다(도 5i 및 5j). 추가적으로, ZIP8 또는 아연 이온이 유도하는 매트릭스 분해 효소들의 상향조절은 Mtf1의 siRNA를 이용한 넉다운에 의해 현저하게 감소하였다(도 5d 및 5k). ZIP8에 의해 조절되는 금속 이온들 가운데에서 아연이온이 MTF1을 핵에 위치시키는것(nuclear localization)과 MTF1의 전사 활성을 조절함에 있어 가장 효과적이었으며, 철과 망간 이온은 MTF1의 활성에 아무런 영향도 미치지 않았다(도 5l 및 5m). 비록 카드늄이온이 MTF1의 어느 정도의 활성을 일으켰지만(도 5m), MMP12 발현을 일정 수준 유도한 것(도 2b) 이외에는 매트릭스 분해 효소들의 발현에는 중요한 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 아연 이온에 의존적인 MTF1의 활성과는 달리 카드늄 이온에 의해 유도되는 MTF1 활성화는 매트릭스 분해 효소들의 발현을 일으키지 않는다는 것을 제시해준다. 이러한 차이는 MTF1이 금속에 특이적인 방법으로 목표 유전자의 발현을 조절한다는 사실을 반영하는 것일 수도 있다(Gunther et al., 2012). 또한, ZnCl2와 함께 TPEN을 미리 배양하는 경우 MTF1의 전사 활성에 대한 TPEN의 차단 효과를 제거하였다. 하지만 FeCl2, CdCl2, MnCl2의 경우에는 그렇지 않았다(도 5n). 종합적으로, 이러한 결과들은 ZIP8에 의해 매개되는 아연 이온의 유입이 MTF1의 전사 활성을 증진시키며 이는 결과적으로 연골세포에서 매트릭스 분해 효소들의 발현을 상향조절한다는 것을 제시해준다.
MTF1은 마우스에서 ZIP8에 의해 유도되는 OA 발병과정을 매개한다
다음으로 본 발명자들은 OA 발병과정에서 MTF1의 생체 내 역할을 조사하였다. 인간 연골 조직에서, MTF1 mRNA와 단백질 모두 관절 연골의 손상되지 않은 부분과 비교하였을 때 OA의 영향을 받은 연골조직에서 높은 수준으로 검침되었다(도 6a). MTF1의 생체 내에서의 역할은 마우스에 Ad-Mtf1을 IA 방법으로 주입함으로써 밝혀졌는데, 이것은 관절 조직에서 MTF1의 과발현을 일으키었다(도 6b 및 6c). 연골 조직의 연골세포에서 MTF1, MMP3, MMP13의 발현 레벨은 Ad-Mtf1을 주입하고 3주 후에 현저하게 향상되었으며(도 6b) 연골의 파괴를 수반하였다(도 6d). 또한 Ad-Mtf1을 IA 방법으로 주입하는 것은 윤활막의 염증을 일으키었으며(도 6e), 섬유아세포와 유사한 윤활막세포에서 MTF1의 과발현은 다양한 이화 인자들의 상향조절을 일으키었는데 이러한 이화인자에는 매트릭스 분해 효소, 사이토카인, 케모카인들이 포함되었다(도 6f). Ad-Zip8의 주입과 유사하게, 마우스에서 Ad-Mtf1의 주입은 IA 주입 후 8주가 경과한 후에 골극 형성과 연골하 골경화증을 일으키었으며 더 심각한 연골의 파괴를 동반하였다(도 6g).
본 발명자들은 또한 Mtf1-KO 마우스를 이용하여 OA 발병과정에서 MTF1의 기능을 확인하였다. 연골세포에 특이적인 CKO 마우스 (Mtf1 fl/fl ;Col2a1-Cre)는 DMM 수술에 뒤따르는 OA 연골 파괴가 중요하게 감소되어 있는 것을 보여주었으며(도 6h), MTF1, MMP3, MMP13 발현의 감소가 수반되었다(도 6i). 또한 DMM 수술을 한 Mtf1-CKO 마우스는 활액막염이나 골극형성에 중요한 영향 없이도 연골하 골경화증이 차단되는 것을 보여주었다(도 6j). 추가적으로, DMM 수술을 한 Mtf1+/- 마우스 역시 연골 파괴와 연골하 골경화증, MMP3와 MMP13의 발현이 감소되어 있는 것을 보여주었다. ZIP8의 기능을 매개하는 MTF1의 역할을 더 밝히기 위하여, 본 발명자들은 관절 조직에서 국소적으로 Mtf1을 제거하기 위해 Mtf1 fl/fl 마우스에 Ad-Zip8 과 Ad-Cre을 IA 방법으로 동시에 주입하였다. 이러한 Mtf1의 국소적인 제거는 Ad-Zip8에 의해 유도되는 연골의 파괴와 활액막염을 현저하게 차단시켰다(도 6k). 대조적으로, Zip8 fl/fl 마우스에서 Ad-Cre 의 주입에 의한 Zip8의 국소적인 제거는 Ad-Mtf1에 의해 유도되는 연골의 파괴나 활액막염에 영향을 미치지 않았다(도 6l). 이러한 결과는 MTF1이 OA 발병과정에서 ZIP8의 하위 매개체(downstream mediator)이며 ZIP8에 의해 활성화된 MTF1이 연골세포에서 매트릭스 분해 효소들을 상향 조절함으로써 OA 연골 파괴에서 이화작용의 조절 인자로 작용한다는 생각을 명백하게 지지해준다.
마지막으로, 본 발명자들은 음식물을 통한 아연의 공급이 외과적으로 유도된 OA에 미치는 영향을 연구하였다. 낮은 양의 아연의 섭취는 DMM에 의해 유도된 OA 연골 파괴에 영향을 미치지 않았는데, 이는 아마도 아연의 양이 미량이었기 때문일 것이다 (<0.5 zinc/kg). 그러나 높은 양의 아연을 섭취한 마우스에서는 DMM 수술에 뒤따르는 연골의 파괴가 더 많이 일어났다 (도 6m). 이러한 결과와 일치하게, ZnCl2의 복강내 투여는 DMM에 의해 유도되는 연골의 파괴를 증가시켰다(도 6n). 이를 종합해보면, 이러한 관찰 결과들은 아연 레벨이 OA 발병과정과 파지티브하게 관계(positive relation)되어 있다는 것을 나타내며, 이는 ZIP8에 의해 매개되는 아연 이온의 유입과 MTF1의 활성화가 OA 발달과정을 지원한다는 본 발명의 발견들과 일치된다.
마우스에서 MT 유전자들의 넉아웃은 OA 연골의 파괴를 증진시킨다
MTF1의 잘 알려진 목표물인 MT는 아연 이온을 저장하는 단백질로 기능함으로서 아연 이온의 항상성을 조절하며 또한 산화방지제로 작용함으로서 산화 스트레스로부터 세포를 보호한다(Laity and Andrews, 2007; Colvin et al., 2010; Fukada et al., 2011). 그러므로 본 발명자들은 OA 발병과정에서 MT의 가능한 기능들을 밝혀내었다. 일차 배양한 연골세포를 Ad-Zip8이나 Ad-Mtf1로 감염시키커나 ZnCl2를 처리한 경우, 밀접하게 관련되어 있는 MT1과 MT2 단백질을 인코드하고 있는 Mt1 과 Mt2의 발현이 현저하게 증가하였다(도 7a 및 7b). OA 발병과정에서 MT1/MT2의 생체 내에서의 중요성은 Mt1-/-Mt2-/- double-KO 마우스를 사용하여 밝혀내었다. 와일드타입 마우스와 비교하였을때, DMM 수술을 한 Mt1-/-Mt2-/- double-KO 마우스는 OA 연골 파괴(도 7c)및 활액막염이나 골극 형성 없는 연골하 골경화증 (도 7d 및 7e)이 현저하게 증가되는 것을 보여주었다(도 7c). 반면에 DMM에 의해 유도된 골극에는 큰 영향을 미치지 않았으며 활액막염은 일어나지 않았다. 이러한 결과들은 ZIP8에 의해 매개되는 아연 이온 유입에 의한 MTF1 활성화가 매트릭스 분해 효소들을 상향 조절하여 이화 작용의 연쇄반응(catabolic cascade)을 활성화시키는 반면에, MTF1에 의한 MT1 과 MT2 단백질의 상향조절이 네거티브 피드백(negative feedback)을 형성하여 아연 연쇄반응에 의해 유도되는 OA 발병과정을 경감시킨다는 것을 종합적으로 제시하여 준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 어떤 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
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465 470 475 480 His Gln Glu Phe Leu Pro His Pro Gln Ala Pro Pro Gln Thr Ile Val 485 490 495 Pro Gly Leu Ser Val Val Ala Gly Ala Pro Ala Ser Ala Ala Thr Val 500 505 510 Ala Ser Ala Val Ala Ala Pro Ala Pro Pro Gln Ser Thr Thr Glu Pro 515 520 525 Leu Pro Ala Met Val Gln Thr Leu Pro Leu Gly Ala Asn Ser Val Leu 530 535 540 Thr Asn Asn Pro Thr Ile Thr Ile Thr Pro Thr Pro Asn Thr Ala Ile 545 550 555 560 Leu Gln Ser Ser Leu Val Met Gly Glu Gln Asn Leu Gln Trp Ile Leu 565 570 575 Asn Gly Ala Thr Ser Ser Pro Gln Asn Gln Glu Gln Ile Gln Gln Ala 580 585 590 Ser Lys Val Glu Gln Val Tyr Phe Ala Thr Ala Val Pro Val Ala Ser 595 600 605 Gly Thr Gly Ser Ser Val Gln Gln Ile Gly Leu Ser Val Pro Val Ile 610 615 620 Ile Ile Lys Gln Glu Glu Ala Cys Gln Cys Gln Cys Ala Cys Arg Asp 625 630 635 640 Ser Ala Lys Glu Arg Ala Ala Gly Arg Arg Lys Gly Cys Ser Ser Pro 645 650 655 Pro Pro Pro Glu Pro Asn Pro Gln Pro Pro Asp Gly Pro Ser Leu Gln 660 665 670 Leu Pro Pro 675

Claims (14)

  1. (i) ZIP8 유전자의 발현 또는 단백질 억제제, 또는 (ii) MTF1 유전자의 발현 또는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절 질환(joint diseases)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분으로서의 억제제는 매트릭스-분해 효소의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 매트릭스-분해 효소는 매트릭스 메탈로프로테나아제(matrix metalloproteinase, MMP)-3, MMP-9, MMP-12, MMP-13 또는 ADAMTSADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)-5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 관절 질환은 골관절염, 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절증 또는 관절염, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 관절증(arthroses), 연골 결손(isolated chondral defect), 무릎 연골연화증(chondromalacia patellae), 활막염, 활액낭염, 외상성 삼출(traumatic effusion), 인대 결핍 관절증(ligamentous deficiency arthroses), 이단성 골연골염(osteochondritis dissecans, OCD), 슬개골 불안정성(patellar instability), 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 소년성 관절염(juvenile arthritis), 외상 후 관절염, 염증성 관절염, 감염으로 인한 관절염(septic arthritis), 낭창(lupus), 공피증(scleroderma), 건염, 섬유조직염, 섬유근육염 또는 다발성 근염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 다음의 단계를 포함하는 관절 질환(joint diseases)의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) (i) ZIP8 단백질 또는 MTF1(metal-regulatory transcription factor-1) 단백질, 또는 (ii) ZIP8 인코딩 뉴클레오타이드 서열, MTF1 인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 두 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현, 또는 단백질의 활성을 분석하는 단계; 상기 시험물질이 ZIP8 또는 MTF1의 유전자 또는 단백질의 발현, 또는 단백질의 활성을 감소시키면 관절 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세포는 관절(joint)-유래된 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 관절 질환은 골관절염, 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절증 또는 관절염, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 관절증(arthroses), 연골 결손(isolated chondral defect), 무릎 연골연화증(chondromalacia patellae), 활막염, 활액낭염, 외상성 삼출(traumatic effusion), 인대 결핍 관절증(ligamentous deficiency arthroses), 이단성 골연골염(osteochondritis dissecans, OCD), 슬개골 불안정성(patellar instability), 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 소년성 관절염(juvenile arthritis), 외상 후 관절염, 염증성 관절염, 감염으로 인한 관절염(septic arthritis), 낭창(lupus), 공피증(scleroderma), 건염, 섬유조직염, 섬유근육염 또는 다발성 근염인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 관절 질환 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 분리된 인간의 생물학적 시료에 있는 ZIP8 단백질 또는 ZIP8 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 MTF1 단백질 또는 MTF1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 관절 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
  9. (a) ZIP8-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 MTF1-인코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked) 되어 있는 전사조절서열을 포함하는 발현 컨스트럭트가 도입된 인간을 제외한 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 전사조절서열은 프로모터 및 인핸서(enhancer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 프로모터 및 인핸서는 각각 제II형 콜라게나제(Col2a1)의 프로모터 및 인핸서인 것을 특징으로 하는 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 형질전환 관절 질환 동물 내의 ZIP8 또는 MTF1은 매트릭스-분해 효소의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 매트릭스-분해 효소는 MMP-3, MMP-9, MMP-12 또는 MMP-13 또는 ADAMTS5인 것을 특징으로 하는 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 형질전환 관절 질환-유발 동물 모델.

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