CN115381953B - Zip1在抑制瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Zip1在抑制瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的应用。本发明的实验证明干扰Zip1表达可抑制瑞芬太尼诱发的痛觉过敏。因此本发明的研究成果为临床提供一种瑞芬太尼诱发的痛觉过敏的新治疗方案。

Description

Zip1在抑制瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Zip1在抑制瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的应用。

背景技术

阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid-inducedhyperalgesia，OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ-阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil-induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85％。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7％，累计输注量超过30μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8％。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05～0.3μg/kg/min的速度输注60～90min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

发明内容

本发明提供了抑制Zip1的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

进一步，所述阿片类药物是瑞芬太尼。

进一步，抑制Zip1的试剂包括抑制Zip1表达的试剂、抑制Zip1活性的试剂。

进一步，抑制Zip1表达的试剂包括抑制Zip1基因mRNA表达的试剂和/或抑制Zip1蛋白表达的试剂。

进一步，抑制Zip1基因mRNA表达的试剂包括利用基因敲除技术、反义核苷酸技术、RNAi技术抑制Zip1基因表达过程中使用的试剂。

进一步，所述基因敲除技术包括CRISPR技术、锌指酶ZFN技术、TALEN技术。

进一步，RNAi技术抑制Zip1基因表达过程中使用的试剂包括如下：双链RNA、短发夹RNA或微小RNA。

抑制Zip1活性的试剂包括抑制Zip1上游蛋白分子活性的试剂、抑制Zip1蛋白活性的试剂、抑制Zip1下游蛋白分子活性的试剂。

优选地，抑制Zip1活性的试剂是抑制Zip1蛋白活性的试剂。

进一步，痛觉过敏包括机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物组合物，所述药物组合物包括抑制Zip1的试剂。

优选地，抑制Zip1的试剂包括抑制Zip表达的试剂，抑制Zip1活性的试剂。

优选地，抑制Zip1表达的试剂包括抑制Zip1基因mRNA表达的试剂和/或抑制Zip1蛋白表达的试剂。

优选地，抑制Zip1表达的试剂包括利用基因敲除技术、反义核苷酸技术、RNAi技术抑制Zip1基因表达过程中使用的试剂。

“反义核苷酸”指含有与编码目标基因的mRNA互补的序列的核酸。反义核苷酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶基因的mRNA 100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核苷酸可以根据目标基因序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。

优选地，基因敲除技术使用的是CRISPR技术；

更优选地，CRISPR技术使用的是CRISPR/Cas系统。

如本文所用的术语“CRISPR/Cas”、“CRISPR系统”或“CRISPR-Cas系统”统称为参与表达或指导CRISPR相关基因(Cas)活性的转录本和其他元素，包括编码Cas基因的核酸、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如活性部分tracrRNA)，tracr-mate序列(在内源性CRISPR系统的背景下包含“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复)，引导序列(gRNA，例如用于引导Cas的RNA，例如Cas9；CRISPR RNA和反式激活(tracer)RNA或单个引导RNA(sgRNA))或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。CRISPR-Cas任选地是II类单体Cas蛋白，例如II型Cas或V型Cas。II型Cas蛋白可以是Cas9蛋白，例如来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)，新弗朗西斯菌(Francisella novicida)，内氏放线菌(a.Naesulndii)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis.Optiona)的Cas9。优选地，Cas9来自化脓性链球菌。V型Cas蛋白可能具有RNA加工活性。V型Cas蛋白可能是Cas12a(也称为Cpf1)Cas蛋白，如来自Lachnospiraceae细菌的Cas12a(Lb-Cas12a))或来自Acidaminococcus sp.BV3L6(as-Cas12a)。CRISPR系统也可以是CRISPR-Cpf1系统，其中Cas9等Cas被Cpf1取代。CRISPR系统的典型特征在于促进在靶序列位点形成CRISPR复合物的元件。

这里使用的术语“gRNA”或“引导RNA”是指与特定DNA序列(例如crRNA)杂交的RNA分子，并且还包括与称为tracrRNA的CRISPR-Cas蛋白结合的蛋白结合片段。gRNA还可以包括直接重复序列。引导RNA中与特定DNA序列杂交的部分在本文中称为核酸靶向序列，或crRNA或间隔区序列。根据上下文可以理解，gRNA也可以指编码gRNA的相应DNA序列或由其表示。由于靶特定部分或crRNA可以与不同的tracrRNA结合，因此本文提供的引导序列最小限度地包括crRNA序列。

术语“crRNA”也称为“间隔物序列”或包括本文使用的间隔物序列，指的是与靶序列形成或能够形成RNA-DNA双链的gRNA部分。该序列可以是互补的或对应于特定的CRISPR靶序列。CrRNA/间隔区序列的核苷酸序列可以确定CRISPR靶序列，并且可以被设计成靶向期望的CRISPR靶位点。CrRNA也可以指从上下文中理解的编码crRNA的相应DNA序列或由其表示。

在本发明的具体实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas9系统。

本发明中的药物组合物可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂如粘合剂、填料、润滑剂和崩解剂制备。

优选地，所述粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、西黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，Nos.2208，2906，2910)、微晶纤维素及其混合物。

优选地，所述填料包括但不限于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、乳糖、微晶纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。

优选地，所述润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、硫酸月桂酯钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。

优选地，所述崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。

本发明中抑制Zip1的试剂或药物组合物可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，抑制Zip1的试剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如抑制Zip1的试剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

本发明涉及的药物组合物的剂量水平取决于成分活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。

本发明涉及的药物组合物剂型可以是药学上可接受的任意一种剂型，包括但不限于粉剂、注射剂、胶囊、片剂、缓释剂、口服液。

本发明涉及的药物组合物的给药途径可以是一种或多种任何可能的途径，根据患者状况和其他重要参数，这些途径包括口服、注射、呼吸道、皮肤、直肠和经粘膜。

本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前面所述的抑制Zip1的试剂。

本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定紊乱、病症或疾病如改善、缓和、减轻和/或延迟其一个或多个症状的化合物或组合物的量。

本发明术语“施用”表示，使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种，向主体物理引入包含治疗剂的药物组合物。优选地，所述施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。本文中使用的短语“胃肠外施用”是指，通常通过注射进行的除了肠内和局部施用以外的施用模式，包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。

本发明的“受试者”可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪类(例如猪)、羊类(例如羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴子或者猿)、猴类(例如绒猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或者人类。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

附图说明

图1显示Zip1表达对瑞芬太尼输注后切口痛觉敏感的影响结果图，A：不同组机械性刺激诱发的缩爪频率PWF(％)；B：不同组热刺激的缩爪潜伏期PWL(sec)n＝10；***P<0.001，与NS组相比；$$$P<0.001，与RI组相比；two-way ANOVA；

图2显示Zip1表达结果图，其中A：免疫印迹图；B：柱状统计图；n＝10；***P<0.001，与NS组相比；$$$P<0.001，与RI组相比；one-way ANOVA。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例Zip1与瑞芬太尼诱发的痛觉过敏相关性研究

一、实验步骤

1、实验分组：雄性C57BL6小鼠30只，1月龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为3组(n＝10)：

对照质粒+生理盐水组(NS组)，在注射瑞芬太尼之前30天，显微镜下暴露小鼠L4和L5背根神经节，使用微量注射器注射CRISPR/Cas9对照质粒(SANTA CRUZ，sc-418922，美国)，每个背根神经节分别1μ1，30天后经腹腔持续输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min。

对照质粒+瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：在注射瑞芬太尼之前30天，显微镜下暴露小鼠L4和L5背根神经节，使用微量注射器注射CRISPR/Cas9对照质粒(SANTA CRUZ，sc-418922，美国)，每个背根神经节分别1μ1，30天后经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型。

ZIP KO+瑞芬太尼+切口痛组(Z+RI组)：在注射瑞芬太尼之前30天，显微镜下暴露小鼠L4和L5背根神经节，使用微量注射器注射Zip1 CRISPR/Cas9KO质粒(SANTA CRUZ，sc-424394，美国)每个背根神经节分别1μ1，用于敲减L4和L5DRG的Zip1表达，30天后经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型。

2、切口痛模型制作

参照文献方法制备切口痛模型。小鼠吸入2％七氟醚麻醉，消毒左后足，从足底近端0.2cm处向趾部做长约0.5cm的纵行切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵行分离至骨膜，保持肌肉起止和附着完整。按压止血后，以4-0丝线缝合皮肤。切口皮肤不能重叠、内翻、裂开。术后伤口用碘伏消毒，并涂抹少量红霉素软膏预防感染。

3、行为学实验

于输注瑞芬太尼前24h(T0)、输注停止后2、6、24和48h(T1-4)时测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足频率(PWF)，实验室温度18～22℃，安静。采用红外足底测痛仪(IICT Life Science 390)测定PWL，记录从左后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为PWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，PWL上限定设置为20s。将大鼠置于20cm×20cm×20cm的金属笼内，30min后，以BSEVF3von Frey纤维丝0.4g(Harvard Apparatus公司，美国)刺激右后足2、3趾骨间，垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫时压力，连续测定10次，间隔1min，取缩足频率为PWF(％)。

4、Western Blot

于最后1次行为学测定结束后，处死小鼠，取L4-5背根神经节，采用Western Blot法测定蛋白的表达。L3-5背根神经节组织加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。使用Zip1 PolyclonalAntibody(ThermoFisher Invitrogen，PA5-21066，US)按照说明书的指南进行实验测定Zip1的表达。

5、统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

(1)瑞芬太尼输注加剧了术后机械和热痛觉过敏

与对照质粒+生理盐水(NS)组输注相比，对照质粒+瑞芬太尼+切口痛(RI)组以1μg·kg^-1·min^-1的速度输注60分钟，从2h到48h，导致缩足频率(PWF)显著升高和缩足潜伏期(PWL)显着降低(所有P<0.001，图1)。这些结果表明，以1μg·kg^-1·min^-1的速度输注瑞芬太尼可增加阿片类药物引起的切口痛热和机械性痛觉过敏。瑞芬太尼输注和切口疼痛模型引起的切口引起的热痛和机械痛的超敏反应可从2小时持续到48小时。

(2)瑞芬太尼输注和切口增加了背根神经节Zip1的表达

在瑞芬太尼和切口疼痛模型后48h，处死小鼠去背根神经节，在Western Blot结果发现Zip1蛋白表达明显增加(P<0.001，图2)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与背根神经节中Zip1表达增加有关。

(3)Zip1敲减明显降低瑞芬太尼切口痛诱发的机械痛觉过敏和热痛觉过敏

转染Zip1 Crispr/Cas9 KO质粒可以减低背根神经节Zip1的蛋白表达水平(P<0.001，图2)。另外，背根神经节Zip1敲减可以明显的降低瑞芬太尼切口痛诱发的机械痛觉过敏和热痛觉过敏，提示敲减Zip1的潜在镇痛特性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (3)

1.抑制Zip1的试剂在制备预防或治疗瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用；所述抑制Zip1的试剂是通过基因敲除技术抑制Zip1表达的试剂，所述基因敲除技术是CRISPR/Cas9技术。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，痛觉过敏包括机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型是药剂学上可以接受的任何药物剂型。